BRPI0806321A2 - métodos para identificação da estabilidade de metilenoaminas orgánicas na presença de amina oxidase sensìvel à semicarbazida e para determinação do perfil da mesma - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA IDENTIFICAçãO DA ESTABILIDADE DE METILENOAMINAS ORGáNICAS NA PRESENçA DE AMINAOXIDASE SENSìVEL à SEMICARBAZIDA E PARA DETERMINAçãO DO PERFIL DA MESMA. A presente invenção refere-se a métodos para determinar a estabilidade de metilenoamina, compostos similares à metilenoamina ou compostos contendo uma porção de metilenoamina na presença de amina oxidase sensível à semicarbazida (SSAO) ou uma amostra biológica contendo atividade de SSAO. Os métodos descritos podem ser configurados em um formato de ensaio para aplicações de classificação de alta produção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DE METILENOAMINAS ORGÂNICAS NA PRESENÇA DE AMINA OXIDASE SENSÍVEL À SEMI- CARBAZIDA".

A presente invenção refere-se a métodos para determinação da estabilidade de metilenoamina, compostos similares à metilenoamina, ou compostos contendo uma porção de metilenoamina na presença de amina oxidase sensível à semicarbazida (SSAO), ou uma amostra biológica con- tendo atividade de SSAO. Os métodos descritos podem ser configurados em um formato de ensaio para aplicações de classificação de alta produção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Amina oxidases sensíveis à semicarbazida (SSAO) são ampla- mente distribuídas nos tecidos, particularmente vasos sangüíneos, sugerindo um papel para esta enzima para inativar circulação de metilenoaminas (L- yles, Prog. Brain Res., 106:293-303, 1995). Muitos investigadores têm focali- zado seus esforços na descoberta de um Iigante endógeno para SSAO e na procura de inibidores desta enzima (Precious et al., Biochem. Pharmacol., 37:707-713, 1988; Crosbie and Callingham, J. Neural Transm. Suppl., 41:427-432, 1994; Elliot et al., Biochem. Pharmacol. 38:1507-1515, 1989; Boomsma et al., Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol., 126:69-78, 2000;Yraola et al., J. Med. Chem. 49:6197-6208; WO 02/066669). Outros têm pesquisado papéis fisiológicos alternativos de SSAO. Por exemplo, SSAO, também denominada proteína de adesão vascular -1 (VAP-1), tem sido mostrada ser regulada superiormente sob condições inflamatórias e para mediar a ligação de linfócitos (WO 98/53049). A presente invenção utili- za a atividade de enzima de SSAO para medir a estabilidade metabólica de agente de testes em células e amostra biológicas.

A estabilidade metabólica de agentes de teste tem se tornado um fator crítico no desenvolvimento de fármaco; desse modo, a presente invenção soluciona o problema de identificação potencial de agentes de tes- te que são submetidos a metabolismo por SSAO. Os avanços na química, biologia molecular e tecnologia de alta produção têm proporcionado progra- mas de descoberta de fármacos com a capacidade de classificar um número enorme de compostos contra um grande número de alvos para identificar compostos de condutor. Estes condutores em seguida suportam seleção mais criteriosa para identificar aqueles compostos com ótimas propriedades "similares a fármaco" (isto é, estabilidade físico-química, solubilidade, segu- rança, eficácia, disposição in vivo adequadas). Esforços significantes são dirigidos à identificação e eliminação de compostos (ou classes de compos- to) que são mais provavelmente para ter propriedades "similares a fármaco" em estágios anteriores de descoberta. As três razões principais de um fár- maco falhar durante ensaios clínicos são falta de eficácia, efeitos adversos inaceitáveis, e propriedades de ADME desfavoráveis (absorção, distribuição, metabolismo, excreção). Portanto, o sucesso final de um composto não é somente definido por sua atividade e potência biológica, mas também por suas ADME/propriedades de toxicidade. Como um resultado, programas de otimização de condutor têm incorporado classificações para selecionar fár- macos com ADME/propriedades de toxicidade desejáveis para intensificar a probabilidade que novos compostos de condutor terão sucesso na clínica. A transformação metabólica de moléculas de fármaco representa um proces- so-chave pelo qual fármacos são removidos do corpo. Dada a distribuição ampla de SSAO em muitos compartimentos corpóreos, acredita-se que SSAO pode ser uma enzima importante que contribui para uma deficiência metabólica potencial dos fármacos. Desse modo, a presente invenção usa métodos de determinação da estabilidade metabólica de agentes de teste expostos a SSAO. Métodos direcionados para determinação do metabolismo de um fármaco, ou outro agente de teste, por enzimas envolvidas em bio- transformação, em particular SSAO, têm implicações importantes para de- senvolvimento de fármaco.

Em estudos in vitro, o composto A (Patente dos Estados Unidos 6.977.263 B) foi incubado com plasma de várias espécies incluindo ser hu- mano. O composto A foi observado ser mais estável em plasma humano em comparação a ovelha, porquinho-da-índia, rato, e camundongo até uma ho- ra. Adicionalmente, nenhum metabolismo significante ou degradação foi ob- servado para o composto em plasma humano até 4 horas com ou sem semi- carbazida. Contudo, dados farmacocinéticos a partir do estudo "primeiro no homem" mostraram que o mesmo composto foi rapidamente metabolizado, e a uma extensão maior do que aquela demonstrada in vitro usando-se plas- ma de humano e de outras espécies. Estudos subsequentes confirmaram que SSAO ligada à membrana foi principalmente responsável pelo metabo- lismo do composto no homem. Estes dados indicam que SSAO solúvel en- contrada no plasma humano não possui o mesmo nível de atividade de en- zima e/ou especificidade de substrato como a SSAO ligada à membrana sob condições fisiológicas. Portanto, conforme ilustrado pelo composto A, a me- dição da estabilidade de plasma humano não é predita de estabilidade de SSAO no homem e, desse modo, é de utilidade limitada na seleção de agen- tes farmacêuticos como candidatos clínicos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 mostra a seqüência de aminoácido de SSAO humana (Acesso no Banco de Gene No. Q16853; SEQ ID NO: 1).

Figura 2 mostra a seqüência de nucleotídeo de SSAO humana (Acesso no Banco de Gene No. NM_00374; SEQ ID NO: 2).

Figura 3 mostra a estrutura química do composto A.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Todas as publicações aqui citadas são, desse modo, incorpora- das por referência. A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado conforme comu- mente compreendido a um técnico no assunto ao qual esta invenção perten- ce.

A terminologia usada neste relatório descritivo e nas reivindica- ções em anexo é para a proposta de concretizações particulares somente e o uso no relatório descritivo não é limitado para estar limitando a invenção. As formas singulares de uma palavra são pretendidas para incluírem as for- mas plurais, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Por exemplo, as formas singulares de "um", "uma" e "o" são pretendidas para incluírem as formas plurais também. Adicionalmente, referência a um agente pode incluir uma mistura de dois ou mais agentes. Desse modo, o termo "um agente" inclui uma pluralidade de agentes, incluindo misturas e/ou enantiô- meros destes. Deve também ser notado que o termo "ou" é geralmente em- pregado em seu sentido incluindo "e/ou", a menos que o conteúdo mencione claramente de outro modo. Será adicionalmente compreendido que os ter- mos "compreende" e/ou "compreendendo," quando usados neste relatório descritivo, especificam a presença de características, etapas, elementos, e/ou componentes citados, mas não impedem a presença ou adição de um ou mais outras características, etapas, elementos, componentes, e/ou gru- pos destes.

Além disso, de acordo com a presente invenção, pode ser em- pregada biologia molecular convencional, microbiologia, DNA recombinante e técnicas analíticas dentro da técnica. Tais técnicas são explanadas total- mente na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecu- lar Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (aqui "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e Il (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription and Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Cur- rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); A Hand- book of Bioanalysis and Drug Metabolism, G. Evans (2004).

Uma concretização da presente invenção é um método de identi- ficação de estabilidade metabólica de um agente de teste devido a metabo- lismo catalisado de amina oxidase sensível à semicarbazida (SSAO), o mé- todo compreendendo: (a) cultura de células que expressam SSAO; (b) adi- ção de um agente de teste às células; (c) incubação do agente de teste com as células por um período de tempo predeterminado; (d) medição da quanti- dade do agente de teste remanescente na presença das células compreen- dendo SSAO expressa no período de tempo predeterminado; e (e) compara- ção da quantidade do agente de teste no período de tempo predeterminado à quantidade de agente de teste em um controle para determinar um valor no qual o valor identifica a estabilidade metabólica no agente de teste na presença de células compreendendo SSAO expressa.

Um técnico no assunto reconhecerá que o método pode ser efe- tuado usando-se o lisato de célula ao invés das células. Desse modo, uma concretização da presente invenção é um método de identificação da estabi- lidade metabólica de um agente de teste devido ao metabolismo catalisado de amina oxidase sensível à semicarbazida (SSAO)1 o método compreen- dendo: (a) cultura de células que expressam SSAO; (b) lisação das células para formar um lisato de célula; (c) adição de um agente de teste ao lisato de célula; (d) incubação do agente de teste com o Iisato de célula por um período de tempo predeterminado; (e) medição da quantidade do agente de teste remanescente na presença do lisato de célula compreendendo SSAO expressa no período de tempo predeterminado; e (f) comparação da quanti- dade do agente de teste no período de tempo predeterminado à quantidade de agente de teste em um controle para determinar um valor no qual o valor identifica a estabilidade metabólica do agente de teste na presença de Iisato de célula compreendendo SSAO expressa. Outra concretização combina as etapas (b) e (c) em uma etapa única.

Uma concretização adicional da presente invenção é um método de identificação da estabilidade metabólica de um agente de teste devido ao metabolismo catalisado de SSAO em uma amostra biológica, o método compreendendo: (a) obtenção de uma amostra biológica compreendendo SSAO; (b) adição de um agente de teste à amostra biológica; (c) incubação do agente de teste com a amostra biológica por um período de tempo prede- terminado; (d) medição da quantidade do agente de teste no período de tempo predeterminado; e (e) comparação da quantidade do agente de teste no período de tempo predeterminado à quantidade de agente de teste em um controle para determinar um valor no qual o valor identifica a estabilidade metabólica do agente de teste na presença de uma amostra biológica com- preendendo SSAO. Uma concretização da presente invenção usa cultura de célula primária ou linhagens de célula que são comercialmente disponíveis. Como um exemplo não-limitativo, células que podem ser usadas são disponíveis a partir de American Tissue Culture Company. Em uma concretização, células de CHO são usadas. As células podem ser procarióticas ou eucarióticas. O escopo da invenção não é limitado pelo tipo de células usado.

Uma amostra biológica pode incluir, mas não é limitada a, tecido ou fluidos, seções de tecidos, tais como biópsia e amostras de autópsia, e seções congeladas tomadas para propostas histológicas. Tais amostras in- cluem sangue, saliva, tecido, células de cultura, (por exemplo, culturas pri- márias, explantes, e células transformadas), partes de ou órgãos totais (por exemplo, fígado, pulmão, íleo, artéria, cordão umbilical), fezes, urina, etc. Uma amostra biológica pode ser obtida de um organismo eucariótico, inclu- indo de mamíferos, tais como um primata, por exemplo, chimpanzé, macaco ou ser humano, vaca, cão, gato, um roedor, por exemplo, porquinho-da- índia, rato, camundongo, coelho, ou um pássaro, réptil, ou peixe. Em exem- plo não-limitativo de uma concretização da presente invenção é investigar se um agente de teste particular ou composto tem maior risco de deficiência metabólica ou, inversamente, é metabolicamente estável em um comparti- mento de tecido versus outros compartimentos de tecido, por exemplo, se um composto tem maior estabilidade metabólica no fígado comparada ao pulmão. Adicionalmente, uma amostra biológica pode ser processada para proporcionar uma suspensão de seus componentes celulares, ou usada para cultura primária dos componentes celulares.

Uma concretização da invenção é usar uma amostra biológica de um indivíduo humano ou não-humano para quantificar a estabilidade me- tabólica de um agente de teste. Uma amostra biológica pode ser uma amos- tra de órgão derivada de um ou mais órgãos de animais não-humanos ou humanos, uma amostra de tecido derivada de um ou mais tecidos de ani- mais não-humanos ou humanos, bem como amostras de célula, derivadas de uma ou mais células de animais não-humanos ou humanos, ou de cultu- ras de célula. Para experimentação animal, as amostras biológicas podem compreender tecidos órgãos-alvo obtidos, por exemplo, após necropsia ou biópsia, ou podem ser fluidos corpóreos, tal como sangue. Para uso clínico, as amostras podem compreender fluidos corpóreos, similares a sangue, so- ro, plasma, urina, fluido sinovial, fluido espinhal, fluido cerebroespinhal, sê- men ou linfa, bem como tecidos corpóreos obtidos por biópsia. Uma referên- cia ou controle é compreendido pelo técnico no assunto. Uma referência ou controle pode incluir, mas não é limitado a, uma amostra biológica de um indivíduo não-adoentado no qual o indivíduo é um animal não-humano ou humano. Adicionalmente, uma referência ou controle pode ser uma amostra biológica de um indivíduo não-tratado. Alternativamente, uma referência ou controle pode ser do mesmo indivíduo antes, durante e após tratamento. Uma referência ou controle pode ser do mesmo indivíduo, mas é uma célula diferente, amostra de tecido ou órgão do que a fonte de célula, tecido ou ór- gão usada para identificar a estabilidade metabólica do agente de teste. Uma referência ou controle não tem que ser uma amostra biológica, mas pode ser uma amostra com uma quantidade desconhecida de atividade de SSAO. Uma referência ou controle pode ser um agente que não é metaboli- zado por SSAO, ou que é metabolizado por SSAO com uma quantidade co- nhecida de deficiência de SSAO.

A presente invenção proporciona métodos para identificação da estabilidade metabólica ou deficiência metabólica de agentes de teste. O termo "agente de teste", conforme aqui usado, descreve qualquer molécula, por exemplo, proteína, composto orgânico de não-proteína, ou farmacêutico, com a capacidade de ser afetada por ou afetando a atividade de enzima de SSAO. Estas não são restrições particulares como para os agentes de teste que podem ser ensaiados. Em uma concretização da invenção, um agente de teste é um composto. Exemplos de agentes de teste incluem agentes simples ou bibliotecas de moléculas químicas de peso molecular pequeno, médio ou alto. Um agente pode ser na forma de uma biblioteca de agentes de teste, tal como uma biblioteca combinatorial ou randomizada, que propor- ciona uma faixa suficiente de diversidade, ou, inversamente, estão limitados a estruturas ou características similares. Os agentes podem ser opcional- mente ligados a um coparticipante de fusão, exemplo, compostos-alvo, com- postos de livramento, compostos de dimerização, compostos de estabiliza- ção, compostos endereçáveis, e outras porções funcionais. Convencional- mente, novas entidades químicas com propriedades úteis são geradas pela identificação de um agente de teste (denominado um "composto de condu- tor" ou um "condutor") com alguma propriedade ou atividade desejável, por exemplo, inibição da atividade ou modulação. O composto de condutor é, em seguida, usado como uma armação para criar variantes do composto de condutor, e, adicionalmente, avaliar a propriedade e atividade daqueles compostos variantes. Um técnico no assunto apreciará a utilidade de usar a presente invenção para otimizar a seleção de composto pela identificação da estabilidade metabólica e, desse modo, a deficiência metabólica de compos- tos de condutor potenciais, e identificação ou seleção daqueles compostos com deficiência mínima para metabolismo de SSAO.

A SSAO da presente invenção é SSAO de comprimento total ou um fragmento desta que retém atividade de enzima total ou parcial. A ativi- dade de enzima parcial pode ser 30% da atividade de enzima total, ou maior, por exemplo, 40% ou 50%. Um exemplo não-limitativo é uma SSAO isolada de uma espécie outra do que humana. Exemplos não-limitativos de outras espécies incluem roedores, tais como ratos, camundongos e porquinhos-da- índia, ou primatas não-humanos, tais como macacos ou chimpanzés. Um exemplo não-limitativo adicional é SSAO humana de comprimento total, con- forme descrito em SEQ ID NO: 1, ou fragmentos desta tendo atividade de metilenoamina oxidase.

Estabilidade metabólica ou deficiência metabólica são termos da técnica pelo técnico no assunto. Estabilidade metabólica se refere à suscep- tibilidade ou extensão a qual um agente de teste ou uma molécula de fárma- co suporta metabolismo sob uma dada condição. Desse modo, quanto mais alta a extensão de metabolismo, mais baixa a estabilidade metabólica. A es- tabilidade metabólica é um de vários determinantes maiores na definição da biodisponibilidade oral e folga sistêmica de um fármaco, composto ou agente de teste. Como uma ilustração não-limitativa, após um fármaco ser adminis- trado oralmente, ele primeiro encontra enzimas metabólicas no lúmen gas- trointestinal, bem como no epitélio intestinal. Após ele ser absorvido na cor- rente sangüínea através do epitélio intestinal, ele é distribuído ao fígado via a veia portal. Um fármaco pode ser efetivamente removido por metabolismo intestinal ou hepático antes dele alcançar circulação sistêmica, um processo conhecido como primeiro metabolismo de passagem. A estabilidade ou defi- ciência de um fármaco para metabolismo dentro do fígado, bem como teci- dos extra-hepáticos determinarão por último a concentração de fármaco en- contrada na circulação sistêmica, e afetam sua meia-vida e tempo de resi- dência dentro do corpo. O tipo de biotransformações tipicamente referido como metabolismo de Fase I inclui oxidação, redução, e hidrólise, que ser- vem principalmente para aumentar a hidrofilicidade e intensifica a excreção de um fármaco por descerramento ou incorporação de um grupo funcional polar na molécula (OH, SH, NH2, ou CO2H). As reações de Fase II ou rea- ções de conjugação adicionalmente aumentam a polaridade de um fármaco pela modificação de um grupo funcional para formar O- ou N- glucuronidas, sulfato ésteres, alfa-carboxiamidas e adutos de glutationila. Uma concretiza- ção da presente invenção é a estabilidade metabólica ou deficiência metabó- lica de um fármaco, composto ou agente de teste para metabolismo por SSAO.

Uma concretização da invenção seleciona as amostras biológi- cas mais relevantes e outras espécies para examinar a estabilidade metabó- lica de tecido ao metabolismo de SSAO. Por exemplo, metabolismo baseado em fígado é responsável pela folga metabólica de muitos fármacos assim de interesse no primeiro metabolismo de passagem pode focalizar no metabo- lismo hepático e, as vezes, intestinal. A presença ubíqua de SSAO em teci- dos e fluidos biológicos e sua atividade particularmente alta em muitos teci- dos, tais como pulmão e vasos sangüíneos, torna imperativo usar as amos- tras biológicas apropriadas em adição a ou no lugar de fígado para examinar a estabilidade metabólica do agente de teste na presença de SSAO. Em adi- ção ao metabolismo intestinal e ao primeiro metabolismo de passagem, a exposição de um agente de teste objeto ao SSAO pode ser limitada pelo primeiro metabolismo de passagem nos locais outros do que tecidos intesti- nal e hepático, tais como veias portais, vasos sangüíneos, e pulmões. Um agente de teste pode demonstrar estabilidade metabólica diferente contra formas diferentes de SSAO. Amostras biológicas diferentes podem conter formas diferentes de SSAO. Um exemplo não-limitativo é que um agente de teste pode mostrar estabilidade metabólica relativa contra a forma solúvel de SSAO em plasma humano, mas instabilidade metabólica mais alta contra SSAO ligada à membrana em tecidos. Adicionalmente, uma espécie animal pode mostrar atividade de SSAO solúvel muito mais alta ou mais baixa em plasma do que o nível de atividade de SSAO solúvel encontrado em huma- no, sob condições de ensaio comparáveis.

Uma concretização da invenção usa vários inibidores químicos para inibir várias formas de atividades de amina oxidase e atribuir a instabili- dade metabólica observada como, ou SSAO catalisada, ou monoamina oxi- dase (MAO)-A, ou metabolismo catalisado de MAO-B. Um exemplo não- limitativo é a adição de hidralazina como um inibidor de amina oxidase não- discriminante, clorgilina como um inibidor de MAO-A específico, pargilina como um MAO-A misturado e inibidor de MAO-B, semicarbazida e bromoeti- Iamina como inibidores de SSAO específicos.

Outro exemplo não-limitativo da invenção é determinar a estabi- lidade metabólica de um agente de teste em indivíduos tratados com um fármaco ou uma combinação de fármacos para determinar se existe uma mudança na estabilidade metabólica do agente de teste em tais indivíduos comparada a indivíduos de controle. Um técnico no assunto apreciará a utili- dade de obtenção de amostras biológicas de indivíduos humanos ou não- humanos que sofrem de uma ou mais doenças, ou foram manipulados para induzir um ou mais estados de doença, cirurgicamente ou geneticamente alterados ou pré-tratados com um fármaco, composto ou agente de teste. Um exemplo não-limitativo inclui o uso da invenção para determinar a estabi- Iidade metabólica de um agente de teste em órgãos que podem ser com- prometidos pela doença comparado a órgãos de não-doença. Como um e- xemplo não-limitante adicional, a estabilidade metabólica de um composto pode ser avaliada no tecido do pulmão de um indivíduo humano que sofre de asma, e comparado à estabilidade metabólica do composto em tecido de pulmão saudável de um indivíduo de idade equiparada ou de controle. Outro exemplo não-limitativo seria estudar a estabilidade metabólica de um com- posto em uma amostra biológica tal como em fígado "jovem" comparado a fígado "velho" ou "de idade", onde "jovem", "velho" e "de idade" são defini- dos pelas espécies particulares sob investigação.

Uma concretização da invenção usa uma população de célula homogênea ou uma amostra biológica. Uma concretização alternativa da invenção usa uma população de célula heterogênea ou uma combinação de mais do que uma amostra biológica. As células ou amostra biológica podem ser de qualquer tipo e em qualquer proporção para completar os métodos da invenção.

Uma concretização da invenção usa uma célula recombinante que expressa SSAO. Um vetor de expressão recombinante da invenção compreende uma molécula de ácido nucleico em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira. Desse modo, um vetor de expressão recombinante da presente invenção pode incluir uma ou mais seqüências regulatórias, selecionadas com base nas células hospedei- ras a serem usadas para expressão, que é operavelmente ligada ao ácido nucleico a ser expresso. Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operavelmente ligado" é pretendido para significar que a seqüência de nu- cleotídeo de interesse é ligada à(s) sequência(s) regulatória(s) em uma ma- neira que permite(m) expressão da seqüência de nucleotídeo (por exemplo, em um sistema de transcrição/translação in vitro, ou em uma célula hospe- deira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo "seqüên- cia regulatória" é pretendido para incluir promotores, intensificadores e ou- tros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenila- ção). Tais seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Às seqüências regulatórias incluem aquelas que dirigem expressão constitutiva da seqüência de nucleotídeo em muitos tipos de células hospedeiras (por exemplo, seqüências regulatórias específi- cas de tecido). Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que o dese- nho do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha de célula hospedeira a ser transformada, do nível de expressão de proteína de- sejado, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para produzir proteínas ou peptídeos codificados por ácidos nucleicos conforme descrito aqui.

O termo "sobreexpressão", conforme aqui usado, se refere à expressão de um polipeptídeo em um nível que é maior do que o nível nor- mal de expressão do polipeptídeo em uma célula que normalmente expressa o polipeptídeo, ou em uma célula que não expressa normalmente o polipep- tídeo. Por exemplo, a expressão do polipeptídeo pode ser 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70, 80%, 90%, 100%, ou mais, conforme comparado à ex- pressão do polipeptídeo em uma célula tipo selvagem que expressa nor- malmente o polipeptídeo. Mutantes, variantes, ou análogos do polipeptídeo de interesse, podem ser sobreexpressos.

Conforme aqui usado, o termo expressão "transiente" se refere à expressão de molécula(s) de ácido nucleico exógeno que são separadas a partir dos cromossomos da célula. A expressão transiente geralmente alcan- ça seu máximo em 2-3 dias após introdução do ácido nucleico exógeno e, subseqüentemente, declina.

Conforme aqui usado, o termo expressão "estável" se refere à expressão de molécula(s) de ácido nucleico exógeno que se torna uma parte integrada do(s) cromossomo(s) da célula. Em geral, vetores para expressão de genes incluem um ou mais marcadores de seleção.

As técnicas de cultura de célula para cultura primária transfor- mada, não-transformada, e amostras biológicas, são bem-conhecidas na técnica. As amostras biológicas ou células cultivadas podem ser armazena- das até que requeridas para uso. O meio usado para cultura pode ser espe- cificamente designado ou comprado de fontes comerciais.

Uma concretização da invenção envolve a lisação das células. As células podem ser Iisadas pela adição de um detergente contendo tam- pão lise. Contudo, a invenção não é limitada ao uso de detergente no tam- pão Iise mas pode incluir qualquer método que é apropriado para lisação de células. Por exemplo, as células podem ser Iisadas por exposição a tampão hipertônico, sonicação ou congelamento/descongelmento. Estes e outros métodos de lisação de células são bem conhecidos aos técnicos no assunto.

Uma concretização da invenção usa um controle. Um controle é um termo da técnica bem compreendido pelos técnicos no assunto. Um con- trole apropriado pode ser dependente dos parâmetros de ensaio, ou da questão experimental sob investigação. Um controle pode ser um conjunto particular de condições de ensaio, ou a adição ou eliminação de um compos- to particular para o ensaio. Portanto, um exemplo não-limitativo de um con- trole é uma condição onde um agente de teste é incubado na ausência de células ou lisato de células que expressam SSAO. Um controle pode ser considerado um controle positivo em que as condições de ensaio ou com- posto de controle adicionado proporcionam a resposta antecipada. Por e- xemplo, se o agente sob investigação é esperado ser metabolizado, um con- trole positivo seria um composto que é metabolizado por SSAO. Adicional- mente, um controle positivo pode ser um composto que é metabolizado por SSAO em subprodutos metabólicos conhecidos. Um exemplo não-limitativo de um controle positivo é a adição de benzilamina. Um controle pode tam- bém ser um controle negativo. Um controle negativo pode ser um conjunto particular de condições de ensaio, ou a adição ou eliminação de um compos- to particular para o ensaio que não proporcionaria a resposta antecipada.

Por exemplo, se o agente sob investigação é esperado ser metabolizado, então um controle negativo seria esperado não ser metabolizado. Um exem- plo não-limitativo de um controle negativo é a adição de ácido benzóico que não tem um grupo metilenoamina, e não é metabolizado por SSAO. Um e- xemplo não-limitativo de um conjunto particular de condições de ensaio co- mo um controle negativo pode ser a adição de um inibidor tendo como alvo atividade de enzima de SSAO, tal como hidralazina, no qual a atividade de SSAO é inibida. Um controle pode ser um controle de "veículo". Por exem- plo, se o agente de teste é dissolvido em DMSO, então o controle de veículo seria DMSO sem agente de teste. Um controle pode simplesmente ser o uso de dados históricos.

Uma concretização da presente invenção é medição da quanti- dade do agente de teste incubado na presença de SSAO no período de tempo predeterminado e comparação da quantidade do agente de teste no período de tempo predeterminado à quantidade de agente de teste em um controle para determinar a estabilidade metabólica do agente de teste na presença de SSAO. É prontamente aparente a um técnico no assunto que a estabilidade metabólica de agente de teste pode ser medida pelo desapare- cimento do agente de teste, ou, alternativamente, pela medição do apareci- mento de um ou mais metabolitos do agente de teste. Uma concretização adicional da presente invenção é medir o aparecimento de um ou mais me- tabolitos do agente de teste em adição a ou no lugar de medição da quanti- dade de agente de teste.

A quantidade de agente de teste ou o aparecimento de um ou mais metabolitos do agente de teste pode ser medida por qualquer número de técnicas disponíveis a um técnico no assunto. Exemplos não-limitativos incluem espectrometria de massa, cromatografia líquida de alta pressão (H- PLC), cromatografia líquida/espectrometria de massa, cromatografia líqui- da/espectrometria de massa/espectrometria de massa e cromatografia líqui- da/detecção radiomática. Adicionalmente, a quantidade de agente de teste ou o aparecimento de um ou mais metabolitos do agente de teste podem ser medidos pelo uso de moléculas indicadoras, tais como radioisótopos, coran- tes fluorescentes ou anticorpos. A presente invenção não é limitada pelo mé- todo de medição do agente de teste ou qualquer um ou mais metabolitos do agente de teste.

O agente de teste pode ser etiquetado com um radioisótopo, tal como, mas não limitado a, 3H ou 14C. Desse modo, uma concretização da invenção é um método de identificação da estabilidade metabólica de um agente de teste radioetiquetado devido ao metabolismo catalisado de amina oxidase sensível à semicarbazida (SSAO), o método compreendendo: (a) cultura de células que expressam SSAO; (b) adição de um agente de teste radioetiquetado às células; (c) incubação do agente de teste radioetiquetado com as células por um período de tempo predeterminado; e (d) medição da quantidade do agente de teste radioetiquetado remanescente na presença das células compreendendo SSAO expressa no período de tempo predeter- minado no qual a percentagem de agente de teste radioetiquetado que não foi metabolizada identifica a estabilidade metabólica do agente de teste ra- dioetiquetado na presença de células compreendendo SSAO expressa. Um técnico no assunto reconhecerá que o método pode ser efetuado usando-se Iisato de células ao invés das células. Adicionalmente, a presente invenção não é limitada pelo uso de radioisótopos, mas pode usar quaisquer meios disponíveis na técnica para etiquetar o agente de teste.

Uma concretização adicional da presente invenção é um método de identificação da estabilidade metabólica de um agente de teste radioeti- quetado devido ao metabolismo de SSAO catalisada em uma amostra bioló- gica, o método compreendendo: (a) obtenção de uma amostra biológica compreendendo SSAO; (b) adição de um agente de teste radioetiquetado à amostra biológica; (c) incubação do agente de teste radioetiquetado com a amostra biológica por um período de tempo predeterminado; e (d) medição da quantidade do agente de teste radioetiquetado no período de tempo pre- determinado no qual a percentagem de agente de teste radioetiquetado que não foi metabolizado identifica a estabilidade metabólica do agente de teste na presença de uma amostra biológica compreendendo SSAO.

O técnico no assunto pode apreciar a utilidade de comparação da estabilidade metabólica de um agente de teste em células ou Iisatos de célula à estabilidade metabólica do agente de teste em amostras biológicas. Desse modo, uma concretização da presente invenção inclui um método de determinar o perfil de estabilidade metabólica de um agente de teste, o mé- todo compreendendo (a) obtenção do valor de estabilidade metabólica do agente de teste incubado na presença de células ou Iisato de célula compre- endendo SSAO expressa e (b) obtenção do valor de estabilidade metabólica do agente de teste incubado na presença de uma amostra biológica com- preendendo SSAO expressa, no qual o valor de estabilidade metabólica do agente de teste na presença das células ou lisato de célula compreendendo SSAO expressa é comparado ao valor de estabilidade metabólica do agente de teste na presença da amostra biológica compreendendo SSAO, propor- cionando o perfil de estabilidade metabólica do agente de teste.

Refinamentos tais como uso da presente invenção com métodos de classificação de alta produção (HTS) estão bem dentro do conhecimento e capacidade do técnico no assunto e são concretizações consideradas da invenção. Uma concretização da invenção é o uso em métodos de classifi- cação de alta produção (HTS). HTS é o teste automático simultâneo de mi- lhares de compostos químicos distintos em ensaios designados para mode- lar mecanismos biológicos ou aspectos de patologias de doença. Mais do que um composto, por exemplo, uma pluralidade de compostos, pode ser testada simultaneamente. Em uma concretização, o termo método de classi- ficação de HTS se refere a ensaios que testam a estabilidade metabólica de um composto em uma pluralidade de amostras biológicas ou uma pluralida- de de compostos em uma ou mais amostras biológicas.

Uma concretização da presente invenção compreende uma série de receptáculos que podem receber células, lisatos de células, amostras corpóreas ou outros materiais tais como metilenoamina ou agente de teste similar à metilenoamina sob investigação. Uma série de receptáculos pode ser qualquer número de receptáculos de pelo menos um ou mais do que um receptáculo adequado para retenção de materiais dentro do escopo da in- venção. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, frascos, pratos de cultura, lâminas, tubos, tais como tubos de 1,5 mL, placas de 12 poços, pla- cas de 96 poços, placas de 384 poços e placas de microtitulação miniaturi- zadas com talvez 4000 receptáculos (Pedido de Patente dos Estados Unidos 20050255580). A série de receptáculos pode ser emendável para a adição de uma cobertura protetora, prevenindo, desse modo, contra entrada de con- taminantes ou evaporação de conteúdos.

Uma característica adicional dos receptáculos é que o receptá- culo pode permitir análise. Exemplos não-limitativos incluem análise por es- pectrometria de massa ou HPLC. Contudo, não existe uma limitação para receptores que podem ser usados dentro do escopo da presente invenção, dado que as amostras podem ser transferidas para um recipiente adicional para análise adicional. Um exemplo não-limitativo é modificar o método tal que o método adicionalmente compreende provisão de uma segunda série de receptáculos na qual uma ou mais etapas são realizadas na segunda sé- rie de receptáculos.

Sistemas de manuseio de líquido, equipamento analítico, tais como leitoras de fluorescência ou contadores de cintilação e robóticos para cultura de célula e manipulação de amostra são bem conhecidos na técnica. Sistemas mecânicos, tais como braços robóticos, ou dispositivos de "cherry- picking" são disponíveis ao técnico no assunto. Leitoras de placa comerciais são disponíveis para analisar placas de 96 poços e de 384 poços conven- cionais. Leitoras de amostra única, amostra múltipla ou amostra de placa são disponíveis que analisam poços predeterminados e geram relatos de dados brutos. Os dados brutos podem ser transformados e apresentados em uma variedade de modos.

Uma concretização adicional da presente invenção é um kit compreendendo pelo menos um elemento de um sistema de ensaio para realizar os métodos aqui descritos, e instruções para uso. Desse modo, os componentes do sistema de ensaio podem ser providos separadamente, ou podem ser providos juntos em tal kit. Os componentes do sistema de ensaio podem ser preparados e incluídos em um kit de acordo com métodos que maximizam a estabilidade dos componentes individuais. Tais métodos são familiares àqueles técnicos no assunto. Por exemplo, as células do sistema de ensaio podem ser providas como uma suspensão, ou as células podem ser congeladas ou liofilizadas. Os componentes adicionais do sistema de ensaio podem também ser incluídos, tais como tampões, recipientes para mistura dos componentes de ensaio, tais como placas de microtitulação ou tubos de teste. O sistema de ensaio pode ser provido na forma de um kit que inclui instruções para realização do ensaio e instruções para manuseio e interpretação de dados.

A presente invenção é adicionalmente descrita nos exemplos seguintes, que não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindica- ções. Conquanto a invenção tenha sido descrita e exemplificada em detalhe suficiente para aqueles técnicos nesta área técnica para produzir e usar, vá- rias alternativas, modificações e aperfeiçoamentos devem ser aparentes sem fugir do espírito e escopo da invenção. Um técnico no assunto apreciará que a presente invenção é bem adaptada para efetuar o objetivo e obter as finalidade e vantagens mencionadas, bem como aquelas inerentes na mes- ma. Os exemplos que se seguem são descrições de concretizações e não são pretendidos como limitações no escopo da invenção. Modificações na mesma e outros usos ocorrerão àqueles técnicos no assunto. Estas modifi- cações estão envolvidas dentro do espírito da invenção, e são definidas pelo escopo das reivindicações.

A presente invenção descrita ilustrativamente aqui pode ser pra- ticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou Iimita- ções, que não são especificamente aqui descritos. Os termos e expressões que foram empregados são usados como termos de descrição, e não de li- mitação, e não há intenção que no uso de tais termos e expressões de ex- clusão de quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções destas, mas é reconhecido que várias modificações são possí- veis dentro do escopo da invenção reivindicada. Desse modo, deve ser compreendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita pelas concretizações e características opcionais, modificação e va- riação dos conceitos aqui descritos podem ser feitas por aquele técnico no assunto, e que tais modificações e variações são consideradas estarem den- tro do escopo desta invenção conforme definida pelas reivindicações em anexo.

Exemplo 1

A. Clonagem e Expressão de SSAO Humana

1) De modo a facilitar a produção de constructo de expressão, um plasmídeo de SSAO de comprimento total pDONR221 inicial foi gerado conforme segue:

Uma primeira PCR foi realizada usando-se os iniciadores espe- cíficos de gene mostrados abaixo. O iniciador de avanço tinha metade do local att (Invitrogen) e uma seqüência Kozak mostrada em negrito. O inicia- dor reverso tinha a metade restante do local att mostrado em negrito. PCR foi realizada usando-se cordão umbilical humano como o gabarito de DNA (preparado de RNA comprado de Biochain e kit Il superescripte de RT-PCR de Invitrogen):

Iniciadores de Clonagem Iniciais:

Avanço (SEQ ID NO: 3):

5'-AAAAGCAGGCTTAGGAATGAACCAGAAGACAATCCTC-3'

Reverso (SEQ ID NO: 4):

5'-CAAGAAAGCTGGGTCCTAGTTGTGAGAGAAGCCCC-3'

Uma segunda PCR foi, em seguida, efetuada usando-se os ini- ciadores universais mostrados abaixo. O iniciador de avanço e o iniciador reverso incluem seqüências de local att (mostradas em negrito) e sequên- cias de vetores.

Seqüências de Iniciador Universais:

Avanço (SEQ ID NO: 5):

5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGGA-3'

Reverso (SEQ ID NO: 6):

5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'

Este segundo produto de PCR foi clonado em pDONR221 usan- do-se a reação BP de Invitrogen. Usando-se este vetor de entrada como ga- barito, seis variações de constructos de expressão de SSAO humana foram preparadas; três formas (uma de comprimento total e duas truncadas) sem etiquetas e três etiquetas 6xHIS com carboxil-terminal para facilitar a purifi- cação da enzima.

2} A SSAO de comprimento total:

As seqüências mostradas em negrito no iniciador de avanço e nos iniciadores reversos indicam seqüência de local de att.

Seqüências de Iniciador para Clonagem de SSAO de Compri- mento total Não-Etiquetado:

Avanço (SEQ ID NO: 7): 5'-AAAAGCAGGCTTAGGAATGAACCAGAAGACAATCCTC-3' Reverso (SEQ ID NO: 8):

5'-

CAAGAAAGCTGGGTCCTAGTTGTGAGAGAAGCCCCCGTGG-3'

Para adicionar 3' 6xHIS antes do códon de parada, os seguintes iniciadores foram usados:

As seqüências mostradas em negrito no iniciador de avanço e no iniciador reverso indicam seqüência de local att, as seqüências sublinha- das no iniciador reverso indicam e etiqueta 6xHIS.

Seqüências de Iniciador para Clonagem de SSAO de Compri- mento total com etiqueta 6xHIS C-terminal:

Avanço (SEQ ID NO: 9):

5'-AAAAGCAGGCTTAGGAATGAACCAGAAGACAATCCTC-3' Reverso (SEQ ID NO: 10):

5'-

CAAGAAAGCTGGGTCCTAATGGTGATGGTGATGGTGGTTGTGAGAGAA GCCCCCGTGG-3'

3) T1 (Gly27-Asn763) representando a enzima que falta na regi- ão de ancoragem de membrana:

As seqüências mostradas em negrito no iniciador de avanço e no iniciador reverso indicam a seqüência de local att, seqüências sublinha- das no iniciador de avanço indicam Met N-terminal adicional.

Seqüências de Iniciador para Clonagem de SSAO Não- Etiquetada, N-terminal, Truncada:

Avanço (SEQ ID NO: 11):

5-

AAAAGCAGGCTTAGGAATGGGCAGGGGTGGAGATGGGGGTG-3' Reverso (SEQ ID NO: 12):

5-CAAGAAAGCTGGGTCCTAGTTGTGAGAGAAGCCCC-3'

Para adicionar 3' 6xHIS antes do códon de parada, os seguintes iniciadores são usados:

As seqüências mostradas em negrito no iniciador de avanço e no iniciador reverso indicam seqüência de local att, seqüências sublinhadas no iniciador de avanço indicam Met N-terminal adicional, e as seqüências sublinhadas no iniciador reverso indicam a etiqueta 6xHIS.

Seqüências de Iniciador para Clonagem de SSAO de etiqueta 6xHIS N-terminal Truncada, C-terminal: Avanço (SEQ ID NO: 13): 5'-

AAAAGCAGGCTTAGGAATGGGCAGGGGTGGAGATGGGGGTG-3' Reverso (SEQ ID NO: 14): 5'-

CAAGAAAGCTGGGTCCTAATGGTGATGGTGATGGTGGTTGTGAGAGAA GCCCCCGTGG-3'

4) T2 (Met211-Asn763) representando o domínio catalítico puta- tivo.

As seqüências mostradas em negrito no iniciador de avanço e no iniciador reverso indicam a seqüência de local att, e as seqüências subli- nhadas no iniciador de avanço indicam Met N-terminal adicional.

Seqüências de Iniciador para Clonagem de domínio catalítico de SSAO não-etiquetada:

Avanço (SEQ ID NO: 15): 5'-AAAAGCAGGCTTAGGAATGACCACGGCTCCCCGTGGTC-

3'

Reverso (SEQ ID NO: 16):

5'-CAAGAAAGCTGGGTCCTAGTTGTGAGAGAAGCCCC-3'

Para adicionar 3' 6xHIS antes do códon de parada, os seguintes iniciadores foram usados:

As seqüências mostradas em negrito no iniciador de avanço e no iniciador reverso indicam seqüência de local att, as seqüências sublinha- das no iniciador de avanço indicam Met N-terminal adicional, as seqüências sublinhadas no iniciador reverso indicam a etiqueta 6xHIS.

Seqüências de Iniciador para Clonagem de domínio catalítico de SSAO com etiqueta 6xHIS C-terminal: Avanço (SEQ ID NO: 17):

5'-AAAAGCAGGCTTAGGAATGACCACGGCTCCCCGTGGTC-

3'

Reverso (SEQ ID NO: 18): 5'-

CAAGAAAGCTGGGTCCTAATGGTGATGGTGATGGTGGTTGTGAGAGAA GCCCCCGTGG-3'

Os constructos de expressão foram preparados por clonagem destes produtos de PCR no vetor pCDNA5-FRT-Para-DEST (Invitrogen, Ga- teway System®). A seqüência de DNA de avanço e reversa de cada cons- tructo foi confirmada incluindo seqüências expressas e pelo menos 100 pa- res bases ou lados destas. As linhagens de célula estáveis para Flp-In CHO, Flp-In CHO T-Rex1 e Flp-In HEK 293 (Invitrogen, Flp-In system®) foram ge- radas usando-se estes 6 constructos de acordo com as instruções do fabri- cante. As células foram cotransfectadas com o vetor regulatório pOG44, e cada um dos constructos pCDNA5-FRT-Para-DEST usando Lipfectamina (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Desse modo, 18 li- nhagens de célula foram geradas: SSAO de comprimento total CHO Flp-ln; SSAO de comprimento total CHO Flp-In com etiqueta 6xHIS C-terminal; SSAO CHO Flp-In T1; SSAO CHO Flp-In T1 com etiqueta 6xHIS C-terminal; SSAO CHO Flp-In T2; SSAO CHO Flp-In T2 com etiqueta 6xHIS C-terminal; SSAO de comprimento total CHO T-Rex Flp-ln; SSAO de comprimento total CHO T-Rex Flp-ln etiqueta 6xHIS C-terminal; SSAO CHO T-Rex Flp-ln T1; SSAO CHO T-Rex Flp-ln T1 com etiqueta 6xHIS C-terminal ; SSAO CHO T- Rex Flp-ln T2; SSAO CHO Flp-ln T2 com etiqueta 6xHIS C-terminal; SSAO de comprimento total HEK 293 Flp-ln; SSAO de comprimento total HEK 293 Flp-ln com etiqueta 6xHIS C-terminal; SSAO HEK 293 Flp-ln T1; SSAO HEK 293 Flp-ln T1 com etiqueta 6xHIS C-terminal ; SSAO HEK 293 Flp-ln T2; SSAO HEK 293 Flp-ln T2 com etiqueta 6xHIS C-terminal.

Células CHO aderentes foram cultivadas a 37 °C, 5% de CO2 em meio contendo HanYs F12, 10% de soro bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, 1% de Penicilina/Estreptomicina, 300 μΜ de higromicina B. Células aderen- tes HEK 293 foram cultivadas a 37 °C, 5% de CO2 em D-MEM (alta glicose), 10% de soro bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, e 200 μΜ de higromicina B. Transformantes estáveis foram identificados por perda de resistência à zeo- cina. Uma vez que as células estavam 80% confluentes, a expressão de SSAO foi induzida pela adição de Tetraciclina a 1 μς/ιηΙ-. Em seguida a 18 horas, as células foram colhidas usando-se um tratamento de tripsina de 3 minutos, à temperatura ambiente. As células foram lavadas 3 vezes em so- lução salina tamponada de fosfato antes de congelamento instantâneo em nitrogênio líquido.

Para a preparação de Iisato de célula para teste de atividade, pelotas de célula congeladas foram ressuspensas em tampão de Iisato con- tendo 10 mM de Tris-HCI (pH 7,2), 150 mM de NaCI, 1,5 mM de MgCI2, 1% v/v de NP-40 e incubadas por 15 minutos em gelo. O Iisato foi removido por centrifugação 800 χ g por 10 minutos, 4 °C, e armazenado em alíquotas a - 80 0C até uso. As proteínas foram determinadas usando-se Reagente de Proteína Pierce Coomassie, de acordo com as instruções do fabricante.

B. Teste da Proteína Recombinante para Atividade Enzimática (i). Preparação da Amostra.

Para cada ensaio efetuado, 1 ml_ de Iisato de célula (1,5 mg/mL de proteína) foi misturado com benzilamina a 2000 ng/mL de concentração final. Em cada ponto de tempo correspondente, 20 μΙ_ da mistura de incuba- ção foram transferidos para um tubo de micro centrífuga (1,7 mL) e mistura- dos com 50 μΙ_ de acetonitrila. Os tubos foram misturados em vórtice breve- mente para assegurar mistura completa e, em seguida, centrifugados a 10.000 χ g por 5 minutos. O sobrenadante foi removido, e 50 μΙ_ foram trans- feridos a um frasco autoamostrador e misturados com 50 μΙ_ de água antes da análise de LC/MS/MS. A benzilamina que permanece no Iisato foi anali- sada com método de LC/MS/MS.

(ii). Análise

Análise de LC/MS/MS foi realizada com um espectrômetro de massa PE Sciex API 3000 sob as seguintes condições listadas abaixo e nas

Tabelas 1 e 2: Coluna analítica: Júpiter C-4, 5 μΜ, 50 χ 2,1 mm

Temperatura da coluna: ambiente

Taxa de fluxo: 0,2 mL/min

Volume de injeção: 15 μL

Tabela 1: Gradiente de Fase Móvel

<table>table see original document page 25</column></row><table>

A solução A foi 90% de metanol em água, a solução B foi 10 mM de tampão de acetato de amônio, pH 7,0

Válvula de desvio: 0-1,5 min para perda, 1,5-5 min para detec- tor de MS

Tabela 2: LC/MS/MS

<table>table see original document page 25</column></row><table>

(iii) Resultados de lisato de célula de análise de LC/MS/MS são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3: Atividade Enzimática de SSAO em Linhagens de Célula que Ex- pressam SSAO de Comprimento Total ou Truncada

<table>table see original document page 25</column></row><table> <table>table see original document page 26</column></row><table>

Os lisatos ativos de CHO Flp-In, CHO Flp-In T-Rex ou HEK293 Flp-In que expressam SSAO de comprimento total (não-etiquetada) foram subseqüentemente testados e atividade confirmada (Tabela 4). Desde que as linhagens de célula de SSAO ativa foi a CHO Flp-In que expressa SSAO 5 de comprimento total (não-etiquetada), esta preparação foi usada para teste de atividade subsequente. Tabela 4: Atividade Enzimática de SSAO em Linhagens de Célula que Ex- pressam SSAO de Comprimento Total

<table>table see original document page 27</column></row><table>

Exemplo 2

Otimização das Condições de Ensaio de LCMS/MS

O ensaio Amplex Red (um ensaio comercialmente disponível), foi usado inicialmente para medir a atividade específica do SSAO humana recombinante. Amplex Red é um derivado incolor não-fluorescente de di- hidroresorufin. Na presença de amina oxidases e SSAO1 o Amplex Red rea- ge com H2O2 para produzir o produto altamente fluorescente, resorufin. Re- sorufin tem uma excitação máxima a 563 nm e emissão máxima a 587 nm, e o ensaio pode ser quantificado pela leitura da placa de microtitulação a 587 nm. A atividade específica de SSAO recombinante foi determinada para ser 280 pmol/min/mg de proteína e esta foi determinada para ser equivalente à atividade específica de SSAO encontrada em tecido de pulmão humano. Para ensaios subsequentes para moldar compostos no ensaio de LC/MS/MS, SSAO humana recombinante (rhSSAO) foi usada nesta ativida- de específica definida.

O ensaio de LC/MS/MS conforme descrito acima foi usado para avaliar a susceptibilidade do composto A a metabolismo por rhSSAO. A es- trutura química do composto A é mostrada na Figura 3 (a Patente dos Esta- dos Unidos 6.977.263 B2 genericamente envolve moléculas e métodos de produção das mesmas). O composto A mostrado na Tabela 5 foi incubado a 37 °C com rhSSAO (tendo uma atividade específica definida que é compatí- vel com aquela encontrada em tecidos humanos conforme descrito acima) por 4 horas inicialmente ou por 24 horas. No tempo zero e tempo 4 horas (ou 24 horas), uma alíquota da amostra foi removida e resfriada rapidamente com acetonitrila. As amostras foram, em seguida, analisadas por LC/MS/MS para medir a quantidade de composto original remanescente a 24 horas comparada àquela presente no tempo zero.

Os valores mostrados na Tabela 5 são percentagens de com- posto original remanescente nos vários tempos indicados seguindo incuba- ção com rhSSAO.

Tabela 5: Percentagem de Composto Original Remanescente Seguindo In- cubação com rhSSAO

<table>table see original document page 28</column></row><table>

Exemplo 3

Teste de Estabilidade Metabólica do Composto A nas Preparações de So- brenadante de Homogenatos de Tecido Animal e Humano (i) Tecidos usados

Os seguintes tecidos foram usados: pulmão, fígado e íleo de porquinho-da-índia, macaco cynomolgus, e humano; artéria de porquinho- da-índia e macaco; e cordão umbilical de humano.

(ii) Preparação de tecido

Tecidos foram processados para obter subrenadantes. Breve- mente, os tecidos excisados foram enxaguados imediatamente com quanti- dades copiosas de solução salina fisiológica (pré-resfriadas a 4°C) para re- mover sangue. Os tecidos reunidos foram homogeneizados em tampão de fosfato de sódio a 0,01 M resfriado a pH 7,4 (10 ml_ por g de tecido) com um Polytron. O homogenato foi tratado com Triton X-100 a uma concentração adicionada de cerca de 1% sob sacudimento brando contínuo por 2 horas a 4°C e, em seguida, centrifugado (4 °C, 15 minutos, 3000 χ g). O sobrena- dante foi cuidadosamente separado e aliquotado em porções de 2 ml_ e congelado a aproximadamente -80°C até uso.

(iii) Otimização de condições de incubação com composto de teste

Todas as incubações foram conduzidas a 37 0C usando-se um banho de água preaquecido. Composto teste M radioetiquetado 14C- foi incubado a 1 ou 10. Incubações preliminares foram realizadas para cada combinação de tecido/composto para selecionar as durações de incubação apropriadas. As durações de incubação de 1,5 a 6 horas foram então usa- das. O volume de incubação suficiente foi usado para permitir pelo menos cinco amostras em série durante a duração de incubação. Alíquotas indivi- duais (1 ml_) tomadas a partir da mistura de incubação foram imediatamente resfriadas rapidamente com dois volumes de acetonitrila, e as misturas res- friadas rapidamente foram secadas por congelamento. As amostras secadas por congelamento foram, ou reconstituídas imediatamente para análise de amostra, ou armazenadas a aproximadamente -80°C até análise. A recons- tituição foi realizada com uma mistura de 500 L (90% a 20 mM de acetato de amônio, pH 4,0 e 10% de metanol (v/v)). L do após centrifugação, 100 amostras reconstituídas foram injetadas para separação cromatográfica lí- quida de alto desempenho (HPLC), seguido por detecção radiomática.

(iv) Análise de dados e cálculos

Amostras reconstituídas de incubações foram analisadas por HPLC, seguido por detecção radiomática. A identidade do composto teste e respectivos benzilaldeído e metabolitos ácidos foi verificada pela equipara- ção dos tempos de retenção com os padrões de referência do composto ori- ginal e seus respectivos metabolitos. A quantidade do composto teste rema- nescente é calculada como a percentagem da radioatividade do pico original na radioatividade total do radiocromatograma de uma amostra reconstituída. A percentagem de composto teste remanescente versus tempo de incuba- ção mostrou cinéticas de primeira ordem quando plotada em uma escala linear de log. A taxa constante de primeira ordem foi calculada para incuba- ções individuais como a inclinação entre o Iogaritmo do composto teste re- manescente versus tempo baseado na análise de regressão linear de míni- mo quadrado.

(v) Resultados de estabilidade metabólica de composto teste em prepara- ções de tecido

A constante de taxa de primeira ordem (1/h) para a degradação metabólica do composto teste é listada na Tabela 6. Assumindo-se que o metabolismo seguido de cinéticas de Michaelis-Menten, a aproximação a cinéticas de primeira ordem M implicou que K para até 10m » M para a reação enzimática. 1 0

Tabela 6: Estabilidade metabólica do Composto A nas Preparações de Teci- do

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Conforme mostrado na Tabela 6, a presente invenção demons- tra uma boa correlação entre os dados do tecido e o perfil metabólico clínico observado do composto A. Comparado ao uso somente de medições de es- tabilidade de plasma humano, a presente invenção pode refletir melhor a estabilidade de SSAO humana de um agente farmacêutico sob condições fisiológicas, e é uma ferramenta predita mais relevante para guiar a seleção de e o desenvolvimento farmacêutico de candidatos clínicos. LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> sanofi-aventis US LLC

ADEDOYIN, Adedayo

ANGELASTRO, Michael R

BICK, Julie Ann

CAIRNS, Jennifer

HUANG, Yongqing

LIANG, Guyan

LIM, Heng-Keang

<120> MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DE METILENOAMINAS OR-

GÂNICAS NA PRESENÇA DE AMINA OXIDASE SENSÍVEL À SEMICARBAZIDA <130> US2005/172 WO PCT

<160> 18

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 763

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 1

Met Asn Gln Lys Thr Ile Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Val Ile Thr 15 10 15

Ile Phe Ala Leu Val Cys Val Leu Leu Val Gly Arg Gly Gly Asp Gly

20 25 30

Gly Glu Pro Ser Gln Leu Pro His Cys Pro Ser Val Ser Pro Ser Ala 25 35 40 45

Gln Pro Trp Thr His Pro Gly Gln Ser Gln Leu Phe Ala Asp Leu Ser

50 55 60

Arg Glu Glu Leu Thr Ala Val Met Arg Phe Leu Thr Gln Arg Leu Gly 65 70 75 80

Pro Gly Leu Val Asp Ala Ala Gln Ala Arg Pro Ser Asp Asn Cys Val

85 90 95

Phe Ser Val Glu Leu Gln Leu Pro Pro Lys Ala Ala Ala Leu Ala His 100 105 110

Leu Asp Arg Gly Ser Pro Pro Pro Ala Arg Glu Ala Leu Ala Ile Val 115 120 125

Phe Phe Gly Arg Gln Pro Gln Pro Asn Val Ser Glu Leu Val Val Gly 130 135 140

Pro Leu Pro His Pro Ser Tyr Met Arg Asp Val Thr Val Glu Arg His 145 150 155 160

Gly Gly Pro Leu Pro Tyr His Arg Arg Pro Val Leu Phe Gln Glu Tyr 165 170 175

Leu Asp Ile Asp Gln Met Ile Phe Asn Arg Glu Leu Pro Gln Ala Ser 180 185 190

Gly Leu Leu His His Cys Cys Phe Tyr Lys His Arg Gly Arg Asn Leu 195 200 205

Val Thr Met Thr Thr Ala Pro Arg Gly Leu Gln Ser Gly Asp Arg Ala 210 215 220

Thr Trp Phe Gly Leu Tyr Tyr Asn Ile Ser Gly Ala Gly Phe Phe Leu 225 230 235 240

His His Val Gly Leu Glu Leu Leu Val Asn His Lys Ala Leu Asp Pro 245 250 255

Ala Arg Trp Thr Ile Gln Lys Val Phe Tyr Gln Gly Arg Tyr Tyr Asp 260 265 270

Ser Leu Ala Gln Leu Glu Ala Gln Phe Glu Ala Gly Leu Val Asn Val 275 280 285

Val Leu Ile Pro Asp Asn Gly Thr Gly Gly Ser Trp Ser Leu Lys Ser 290 295 300

Pro Val Pro Pro Gly Pro Ala Pro Pro Leu Gln Phe Tyr Pro Gln Gly 305 310 315 320

Pro Arg Phe Ser Val Gln Gly Ser Arg Val Ala Ser Ser Leu Trp Thr 325 330 335

Phe Ser Phe Gly Leu Gly Ala Phe Ser Gly Pro Arg Ile Phe Asp Val 340 345 350

Arg Phe Gln Gly Glu Arg Leu Val Tyr Glu Ile Ser Leu Gln Glu Ala Leu Ala Ile Tyr Gly 370

Val Asp Gly Gly Phe 385

Gly Val Asp Cys Pro 405

Leu Glu Ser Gln Ala 420

Glu Gln Asn Gln Gly 435

Ser His Tyr Phe Gly 450

Met Ser Thr Leu Leu 465

Pro Ser Gly Ala Ile 485

Ser Ala Phe Leu Phe 500

Glu His Thr Leu Gly 515

Asp Leu Asp Val Ala 530

Val Phe Val Pro Met 545

Arg Leu Gln Val Thr 565

Phe Leu Val Gly Ser 580

His Ser Asn Lys Trp 595

Ser Phe Ala Gly Glu

32

360

Gly Asn Ser Pro Ala Ala 375

Gly Met Gly Lys Tyr Thr 390 395

Tyr Leu Ala Thr Tyr Val 410

Pro Lys Thr Ile Arg Asp 425

Leu Pro Leu Arg Arg His 440

Gly Leu Ala Glu Thr Val 455

Asn Tyr Asp Tyr Val Trp 470 475

Glu Ile Arg Phe Tyr Ala 490

Gly Ala Thr Gly Lys Tyr 505

Thr Val His Thr His Ser 520

Gly Leu Glu Asn Trp Val 535

Ala Val Pro Trp Ser Pro 550 555

Arg Lys Leu Leu Glu Met 570

Ala Thr Pro Arg Tyr Leu 585

Gly His Pro Arg Gly Tyr 600

Pro Leu Pro Gln Asn Ser

365

Met Thr Thr Arg Tyr 380

Thr Pro Leu Thr Arg 400

Asp Trp His Phe Leu 415

Ala Phe Cys Val Phe 430

His Ser Asp Leu Tyr 445

Leu Val Val Arg Ser 460

Asp Thr Val Phe His 480

Thr Gly Tyr Ile Ser 495

Gly Asn Gln Val Ser 510

Ala His Phe Lys Val 525

Trp Ala Glu Asp Met 540

Glu His Gln Leu Gln 560

Glu Glu Gln Ala Ala 575

Tyr Leu Ala Ser Asn 590

Arg Ile Gln Met Leu 605

Ser Met Ala Arg Gly 610 615 620

Phe Ser Trp Glu Arg Tyr Gln Leu Ala Val Thr Gln Arg Lys Glu Glu 625 630 635 640

Glu Pro Ser Ser Ser Ser Val Phe Asn Gln Asn Asp Pro Trp Ala Pro 645 650 655

Thr Val Asp Phe Ser Asp Phe Ile Asn Asn Glu Thr Ile Ala Gly Lys

660 665 670

Asp Leu Val Ala Trp Val Thr Ala Gly Phe Leu His Ile Pro His Ala 675 680 685

Glu Asp Ile Pro Asn Thr Val Thr Val Gly Asn Gly Val Gly Phe Phe 690 695 700

Leu Arg Pro Tyr Asn Phe Phe Asp Glu Asp Pro Ser Phe Tyr Ser Ala 705 710 715 720

Asp Ser Ile Tyr Phe Arg Gly Asp Gln Asp Ala Gly Ala Cys Glu Val 725 730 735

Asn Pro Leu Ala Cys Leu Pro Gln Ala Ala Ala Cys Ala Pro Asp Leu

740 745 750

Pro Ala Phe Ser His Gly Gly Phe Ser His Asn 755 760

<210> 2

<211> 2292

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgaaccaga agacaatcct cgtgctcctc attctggccg tcatcaccat ctttgccttg 60 gtttgtgtcc tgctggtggg caggggtgga gatgggggtg aacccagcca gcttccccat 120 tgcccctctg tatctcccag tgcccagcct tggacacacc ctggccagag ccagctgttt 180 gcagacctga gccgagagga gctgacggct gtgatgcgct ttctgaccca gcggctgggg 240 ccagggctgg tggatgcagc ccaggcccgg ccctcggaca actgtgtctt ctcagtggag 300 ttgcagctgc ctcccaaggc tgcagccctg gctcacttgg acagggggag ccccccacct 360 gcccgggagg cactggccat cgtcttcttt ggcaggcaac cccagcccaa cgtgagtgag 420 ctggtggtgg ggccactgcc tcacccctcc tacatgcggg acgtgactgt ggagcgtcat 4 80 ggaggccccc tgccctatca ccgacgcccc gtgctgttcc aagagtacct ggacatagac 54 0

cagatgatct tcaacagaga gctgccccag gcttctgggc ttctccacca ctgttgcttc 600

tacaagcacc ggggacggaa cctggtgaca atgaccacgg ctccccgtgg tctgcaatca 660

ggggaccggg ccacctggtt tggcctctac tacaacatct cgggcgctgg gttcttcctg 72 0

caccacgtgg gcttggagct gctagtgaac cacaaggccc ttgaccctgc ccgctggact 780

atccagaagg tgttctatca aggccgctac tacgacagcc tggcccagct ggaggcccag 84 0

tttgaggccg gcctggtgaa tgtggtgctg atcccagaca atggcacagg tgggtcctgg 900

tccctgaagt cccctgtgcc cccgggtcca gctccccctc tacagttcta tccccaaggc 960

ccccgcttca gtgtccaggg aagtcgagtg gcctcctcac tgtggacttt ctcctttggc 1020

ctcggagcat tcagtggccc aaggatcttt gacgttcgct tccaaggaga aagactagtt 1080

tatgagataa gcctccaaga ggccttggcc atctatggtg gaaattcccc agcagcaatg 114 0

acgacccgct atgtggatgg aggctttggc atgggcaagt acaccacgcc cctgacccgt 12 00

ggggtggact gcccctactt ggccacctac gtggactggc acttcctttt ggagtcccag 1260

gcccccaaga caatacgtga tgccttttgt gtgtttgaac agaaccaggg cctccccctg 1320

cggcgacacc actcagatct ctactcgcac tactttgggg gtcttgcgga aacggtgctg 1380

gtcgtcagat ctatgtccac cttgctcaac tatgactatg tgtgggatac ggtcttccac 144 0

cccagtgggg ccatagaaat acgattctat gccacgggct acatcagctc ggcattcctc 1500

tttggtgcta ctgggaagta cgggaaccaa gtgtcagagc acaccctggg cacggtccac 1560

acccacagcg cccacttcaa ggtggatctg gatgtagcag gactggagaa ctgggtctgg 162 0

gccgaggata tggtctttgt ccccatggct gtgccctgga gccctgagca ccagctgcag 1680

aggctgcagg tgacccggaa gctgctggag atggaggagc aggccgcctt cctcgtggga 174 0

agcgccaccc ctcgctacct gtacctggcc agcaaccaca gcaacaagtg gggtcacccc 1800

cggggctacc gcatccagat gctcagcttt gctggagagc cgctgcccca aaacagctcc 1860

atggcgagag gcttcagctg ggagaggtac cagctggctg tgacccagcg gaaggaggag 192 0

gagcccagta gcagcagcgt tttcaatcag aatgaccctt gggcccccac tgtggatttc 1980

agtgacttca tcaacaatga gaccattgct ggaaaggatt tggtggcctg ggtgacagct 204 0

ggttttctgc atatcccaca tgcagaggac attcctaaca cagtgactgt ggggaacggc 2100

gtgggcttct tcctccgacc ctataacttc tttgacgaag acccctcctt ctactctgcc 2160

gactccatct acttccgagg ggaccaggat gctggggcct gcgaggtcaa ccccctagct 2220

tgcctgcccc aggctgctgc ctgtgccccc gacctccctg ccttctccca cgggggcttc 2280

tctcacaact ag 2292

<210> 3 <211> 37

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> iniciador de clocagem inicial

<400> 3

aaaagcaggc ttaggaatga accagaagac aatcctc

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de clonagem inicial

<400> 4

caagaaagct gggtcctagt tgtgagagaa gcccc

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador universal - avanço

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt agga

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> iniciador universal - reverso

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc

<210> 7 <211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de iniciador de avanço para clonagem de SSAO de com-

primento com 6xHIS etiquetada C-terminal <400> 7

aaaagcaggc ttaggaatga accagaagac aatcctc 37

<210> 8 <211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de iniciador de reverso para clonagem de SSAO de com-

primento com 6xHIS etiquetada C-terminal <400> 8

caagaaagct gggtcctagt tgtgagagaa gcccccgtgg 40

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüências de iniciador reverso para clonagem de SSAO de compri-

mento total com etiqueta 6xHIS C-terminal <400> 9

aaaagcaggc ttaggaatga accagaagac aatcctc 37

<210> 10 <211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüências de iniciador reverso para clocagem de SSAO de compri- mento total com etiqueta 6xHIS C-terminal

<400> 10

caagaaagct gggtcctaat ggtgatggtg atggtggttg tgagagaagc ccccgtgg 58

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüências de iniciador de avanço para clonagem de SSAO não- etiquetada N-terminal truncada

<400> 11

aaaagcaggc ttaggaatgg gcaggggtgg agatgggggt g 41

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüências de iniciador reverso para clonagem de SSAO não- etiquetada N-terminal truncada

<400> 12

caagaaagct gggtcctagt tgtgagagaa gcccc 3 5

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüências de iniciador de avanço para clonagem de SSAO N- terminal truncada de etiqueta 6xHIS C-terminal

<400> 13

aaaagcaggc ttaggaatgg gcaggggtgg agatgggggt g 41

<210> 14

<211> 58 <212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüências de iniciador reverso para clocagem de SSAO N-terminal truncada de etiqueta 6xHIS C-terminal

<400> 14 caagaaagct gggtcctaat ggtgatggtg atggtggttg tgagagaagc ccccgtgg 58

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüências de iniciador de avanço para clonagem de domínio cata- lítico de SSAO não-etiquetada

<400> 15

aaaagcaggc ttaggaatga ccacggctcc ccgtggtc 38

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüências de iniciador reverso para clonagem de domínio catalí- tico de SSAO não-etiquetada

<400> 16

caagaaagct gggtcctagt tgtgagagaa gcccc 35

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüências de iniciador de avanço para clonagem de domínio cata-

lítico de SSAO com etiqueta 6xHIS C-terminal <400> 17

aaaagcaggc ttaggaatga ccacggctcc ccgtggtc 38

<210> 18 <211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüências de iniciador reversa para clonagem de domínio catai tico de SSAO com etiqueta 6xHIS C-terminal

<400> 18

caagaaagct gggtcctaat ggtgatggtg atggtggttg tgagagaagc ccccgtgg 58

Claims (17)

1. Método de identificação de estabilidade metabólica de um a- gente de teste devido ao metabolismo catalisado de amina oxidase sensível à semicarbazida (SSAO)1 o método compreendendo: a) cultura das células que expressam SSAO; b) adição de um agente de teste às células; c) incubação do agente de teste com as células por um período de tempo predeterminado; d) medição da quantidade do agente de teste remanescente na presença das células compreendendo SSAO expressa no período de tempo predeterminado; e e) comparação da quantidade do agente de teste no período de tempo predeterminado à quantidade de agente de teste em um controle para determinar um valor no qual o valor identifica a estabilidade metabólica do agente de teste na presença de células compreendendo SSAO expressa.

2. Método de identificação de estabilidade metabólica de um a- gente de teste radioetiquetado devido ao metabolismo catalisado de amina oxidase sensível à semicarbazida (SSAO), o método compreendendo: a) cultura das células que expressam SSAO; b) adição de um agente de teste radioetiquetado às células; c) incubação do agente de teste radioetiquetado com as células por um período de tempo predeterminado; e d) medição da quantidade do agente de teste radioetiquetado remanescente na presença das células compreendendo SSAO expressa no período de tempo predeterminado; no qual a percentagem de agente de tes- te radioetiquetado que foi metabolizada identifica a estabilidade metabólica do agente de teste radioetiquetado na presença das células compreendendo SSAO expressa.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que as células que expressam SSAO são produzidas por transfecção transiente ou estável das células com DNA que codifica SSAO.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que as células que expressam SSAO são procarióticas.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que as células que expressam SSAO são eucarióticas.

6. Método de identificação da estabilidade metabólica de um a- gente de teste devido ao metabolismo catalisado de SSAO em uma amostra biológica, o método compreendendo: a)obtenção de uma amostra biológica compreendendo SSAO; b) adição de um agente de teste à amostra biológica; c) incubação do agente de teste com a amostra biológica por um período de tempo predeterminado; d) medição da quantidade do agente de teste no período de tempo predeterminado; e e) comparação da quantidade do agente de teste no período de tempo predeterminado à quantidade de agente de teste em um controle para determinar um valor no qual o valor identifica a estabilidade metabólica do agente de teste na presença de uma amostra biológica compreendendo SSAO.

7. Método de identificação da estabilidade metabólica de um a- gente de teste radioetiquetado devido ao metabolismo catalisado de SSAO em uma amostra biológica, o método compreendendo: a) obtenção de uma amostra biológica compreendendo SSAO; b) adição de um agente de teste radioetiquetado à amostra bio- lógica; c) incubação do agente de teste radioetiquetado com a amostra biológica por um período de tempo predeterminado; e d) medição da quantidade do agente de teste radioetiquetado no período de tempo predeterminado, no qual a percentagem de agente de tes- te radioetiquetado que não foi metabolizada identifica a estabilidade metabó- lica do agente de teste na presença de uma amostra biológica compreen- dendo SSAO.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7, em que a amostra biológica é selecionada a partir do grupo consistindo em sangue, plasma, soro, artéria, cordão umbilical, fígado, íleo, e pulmão.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que a amostra biológica é de um indivíduo humano.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que a amostra biológica é de um indivíduo não-humano.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou reivindicação -10, em que o indivíduo humano ou não-humano é manipulado antes da ob- tenção da amostra biológica.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a mani- pulação do indivíduo humano ou não-humano é selecionada a partir do gru- po consistindo em tratamento com um ou mais fármacos, indução de um ou mais aspectos de um estado de doença, manipulação cirúrgica e alteração genética.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 6, em que a quantidade de agente de teste é determinada por uma técnica se- lecionada a partir do grupo consistindo em espectrometria de massa, croma- tografia líquida de alta pressão, cromatografia líquida/espectrometria de massa, cromatografia líquida/espectrometria de massa/espectrometria de massa e cromatografia líquida/detecção radiomática.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 6, em que uma ou mais etapas são realizadas por um dispositivo robótico.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 6, em que a estabilidade metabólica do agente de teste é determinada por me- dição de um ou mais metabolitos do agente de teste em adição a ou no lugar da medição do agente de teste.

16. Método de determinar um perfil de estabilidade metabólica de um agente de teste, o método compreendendo: a) obtenção do valor de estabilidade metabólica do agente de teste incubado na presença da célula compreendendo SSAO expressa u- sando-se o método como definido na reivindicação 1; b) obtenção de uma amostra biológica compreendendo SSAO; c) adição de um agente de teste à amostra biológica; d) incubação do agente de teste com a amostra biológica por um período de tempo predeterminado; e) medição da quantidade do agente de teste no período de tempo predeterminado; e f) comparação da quantidade do agente de teste no período de tempo predeterminado à quantidade de agente de teste em um controle para determinar um valor que identifica a estabilidade metabólica do agente de teste na presença de uma amostra biológica compreendendo SSAO1 em que o valor da estabilidade metabólica do agente de teste na presença da célula compreendendo SSAO expressa é comparado ao valor de estabilidade me- tabólica do agente de teste na presença de uma amostra biológica compre- endendo SSAO que proporciona o perfil de estabilidade metabólica do agen- te de teste.

17. Método de determinar o perfil de estabilidade metabólica de um agente de teste radioetiquetado, o método compreendendo: a) obtenção do valor da estabilidade metabólica do agente de teste radioetiquetado incubado na presença do Iisato de célula compreen- dendo SSAO expressa usando-se o método como definido na reivindicação -2; b) obtenção de uma amostra biológica compreendendo SSAO; c) adição de um agente de teste radioetiquetado à amostra bio- lógica; d) incubação do agente de teste radioetiquetado com a amostra biológica por um período de tempo predeterminado; e) medição da quantidade do agente de teste radioetiquetado no período de tempo predeterminado; e f) identificação da estabilidade metabólica do agente de teste radioetiquetado pela percentagem de agente de teste radioetiquetado que não foi metabolizada no período de tempo predeterminado, em que o valor da estabilidade metabólica do agente de teste radioetiquetado na presença de Iisato de célula compreendendo SSAO expressa é comparado ao valor de estabilidade metabólica do agente de teste radioetiquetado na presença de uma amostra biológica compreendendo SSAO que proporciona o perfil de estabilidade metabólica do agente de teste .