BRPI0806599A2 - Marcador e plataforma de diagnóstico para elaboração de fármaco em infarto do miocárdio e falência cardíaca - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MARCADOR E PLATAFORMA DE DIAGNÓSTICO PARA ELABORAÇÃO DE FÁRMA- CO EM INFARTO DO MIOCÁRDIO E INSUFICIÊNCIA CARDÍACA".

O presente pedido reivindica prioridade do pedido provisório US 5 N0. 60/884.979 que é aqui incorporado a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao uso de um marcador e uma plataforma de diagnóstico para elaboração de fármaco em infarto do miocár- dio e insuficiência cardíaca.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Insuficiência cardíaca congestiva ((CHF) - Congestive heart fai- Iure) não é uma doença específica, mas uma compilação de sinais e sinto- mas, todos causados por uma incapacidade do coração em aumentar apro- priadamente o débito cardíaco como necessário. Os pacientes tipicamente 15 se apresentam com respiração curta, edema e fadiga. CHF se tornou uma doença de proporção epidêmica, afetando 3% da população adulta. A morta- lidade da CHF é pior do que muitas formas de câncer com uma sobrevivên- cia de cinco anos de menos do que 30%. Infarto do miocárdio ((MI) - Myo- cardial infarction) é uma das principais causas de CHF. Remodelagem ven- 20 tricular esquerda contribui muito para CHF.

É agora bem reconhecido que mudanças na matriz extracelular miocardial ((ECM) - Extracelular matrix) contribuem para o processo de re- modelagem progressivo. Um equilíbrio de síntese e degradação de ECM, também chamado turnover de ECM1 determina a manutenção de arquitetura 25 do tecido. A taxa normal de síntese de ECM no coração é muito baixa. Du- rante situações patológicas, tal como Ml, síntese e deposição de colágeno são aceleradas não apenas no miocárdio infartado, mas também no não- infartado. Crescente evidência sugere que mudanças em rede de colágeno fibrilar e desorganização da matriz de colágeno contribuem para remodela- 30 gem de LV . Desorganização de matriz tem sido atribuída à expressão alta de metaloproteinase de matriz ((MMPs) - Matrix metalloproteinases), que quebra proteínas da matriz e diminui a expressão de inibidores teciduais de metaloproteinase (TIMPs) - Tissue inhibitors of metaííoproteinase), uma fa- mília de inibidores de protease. Leucócitos e macrófagos polimorfonucleares são uma fonte rica de MMPs. Recrutamento e ativação de monóci- tos/macrófagos no miocárdio infartado foram mostrados contribuir de manei- ra importante para os processos que acontecem após Ml.

Deste modo, análogas a neurormônios e citocinas pró- inflamatórias tal como fator-alfa de necrose de tumor (TNF-alfa), metalopro- teinases (MMP) parecem representar outra classe distinta de moléculas bio- logicamente ativas que podem contribuir para progressão de insuficiência 10 cardíaca. Há um crescente corpo de evidência que sugere que modulação de níveis de citocinas inflamatórias e MMP pode representar um novo para- digma terapêutico para tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca.

Dentre a família de MMP contendo até agora 25 membros, MMP-9 parece ser uma proteína-chave envolvida em remodelagem ventricu- 15 lar. Foi recentemente mostrado que atividade de MMP é prejudicial durante a fase inicial seguindo Ml, mas benéfica durante a última fase pós-MI, sugerin- do a existência de uma janela terapêutica que tem que ser cuidadosamente levada em consideração quando aplicando estratégias terapêuticas para prevenir ou tratar remodelagem. Vários estudos sugeriram a necessidade de 20 usar inibidores de MMP-9 específicos, uma vez que outros membros da fa- mília MMP-9 podem ter papéis benéficos em remodelagem ventricular. O mesmo cenário problemático, isto é, inibição de MMP-9, mas não outras MMPs, é encontrado quando alguém pretende tratar outras patologias onde degradação de matriz está envolvida. Várias companhias farmacêuticas tes- 25 taram a possibilidade de criar tais inibidores específicos de MMP-9, mas tes- tes clínicos iniciais deram resultados confusos. Deste modo, isto evidencia a necessidade de desvelar novas estratégias para desenvolver inibidores de MMP-9 específicos.

Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs) nos genes de MMP-9 e TNF-alfa podem agir como fatores de susceptibilidade para o de- senvolvimento de Ml agudo. Em um estudo preliminar, a requerente deter- minou a oresenca de SNPs nos genes de MMP-9 e TNF-alfa de leucócitos em circulação. Tecnologia MassARRAY® foi realizada em um coorte de 98 pacientes com Ml agudo e 92 pacientes com dor do peito atípica e artérias coronárias normais. Dentre os 147 SNPs estudados, nove deles mostraram uma frequência muito diferente entre ambos os grupos.

Por outro lado, a requerente conduziu uma investigação clínica

onde a requerente foi capaz de mostrar pela primeira vez que níveis de MMP-9 no plasma estão relacionados com a evolução de insuficiência cardí- aca. Na verdade, níveis de MMP-9 são previsivos do início de CHF tardia após Ml. No estudo da requerente, pacientes com níveis de MMP-9 iniciais 10 baixos tiveram bom resultado final: nenhuma CHF1 fração de ejeção e volu- me diastólico final normais. No entanto, pacientes com níveis de MMP-9 al- tos tinham um risco significante de CHF de início tardio (índices de probabili- dade de 6,5, p < 0,006) e remodelagem ventricular esquerda (fração de eje- ção menor, volume diastólico final alto). Desde a publicação original de feve- 15 reiro de 2006 (Wagner, D.R., Delagardelle, C., Ernens, I., Rouy, D., Vaillant, M., Beissel, J., "Matrix metalloproteinase-9 is a marker of heart failure after acute myocardial infarction". J. Card. Fail., 2006 fev.; 12(1): 66-72), as ob- servações da requerente foram copiadas por vários outros grupos. Além dis- so, foi recentemente mostrado que níveis de MMP-9 diminuem em pacientes 20 que sofrem remodelagem reversa e melhora de insuficiência cardíaca se- cundária à terapia de ressincronização cardíaca. Então, é bem reconhecido que níveis de MMP-9 no plasma podem ser previsivos de remodelagem ven- tricular e CHF seguindo Ml reperfundido.

No entanto, apesar de ser capaz de ensaiar níveis de MMP-9 em um paciente, há ainda uma necessidade na técnica de previsão de se um paciente é suscetível à insuficiência cardíaca pós-MI, de modo que tra- tamento apropriado pode ser preparado ou educação do paciente iniciada. OBJETIVOS DA PRESENTE INVENÇÃO

Os objetivos da presente invenção são dois:

1. Prover uma ferramenta de diagnóstico

É um objetivo da presente invenção prover um método para di- agnóstico precoce da ocorrência de insuficiência cardíaca congestiva a fim de melhorar a sobrevivência e diminuir o desenvolvimento de insuficiência cardíaca pior.

É um objetivo da presente invenção usar esta ferramenta de diagnóstico para identificar pacientes suscetíveis sob risco de desenvolver

remodelagem ventricular e insuficiência cardíaca.

É outro objetivo da presente invenção usar esta ferramenta de diagnóstico para ajustar tratamentos para melhor prevenir o desenvolvimen- to de remodelagem ventricular e insuficiência cardíaca após infarto do mio- cárdio.

2. Prover uma plataforma para elaboração de fármaco

É outro objetivo da presente invenção prover uma plataforma para elaboração de fármaco para prover ou identificar molécula que pode especificamente inibir atividade de MMP-9.

É outro objetivo da presente invenção diminuir os níveis de MMP-9 ativa em um paciente com infarto do miocárdio ou insuficiência car- díaca.

É um objetivo adicional da presente invenção usar este fármaco para tratar pacientes após infarto do miocárdio a fim de prevenir remodela- gem mal-adaptativa do miocárdio incluindo fibrose, apoptose e necrose.

É outro objetivo da presente invenção usar este fármaco para

tratar pacientes após infarto do miocárdio a fim de prevenir o desenvolvimen- to de insuficiência cardíaca. Além disso, é também um objetivo da presente invenção administrar quantidades terapeuticamente eficazes deste fármaco para tratar um paciente com infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca agu- da ou insuficiência cardíaca crônica.

Surpreendentemente, foi constatado que um Polimorfismo de Nucleotídeo Único (SNP), presente na seqüência de codificação do gene de MMP-9, é encontrado em frequências diferentes em pacientes com prognós- ticos bons ou pobres para insuficiência cardíaca seguindo infarto do miocár- 30 dio. O que é particularmente surpreendente é que a requerente mostrou que SNP leva a uma mudança de aminoácido única no domínio hemopexina da proteína MMP-9 transcrita e ativa, resultando em uma mudança eletrostática no sítio na MMP-9 que se liga a TIMP-1. Isto é significante uma vez que TIMP-1 é o inibidor principal de atividade de MMP-9.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Então, em um primeiro aspecto, a presente invenção provê um 5 método para determinação da susceptibilidade de um indivíduo a uma con- dição cardíaca, pós-infarto do miocárdio, compreendendo detecção da pre- sença de mudança de um aminoácido na seqüência do domínio hemopexina de MMP-9 (Metaloproteinase de Matriz 9), a presença de uma mudança de aminoácido no dito domínio sendo indicativa de susceptibilidade à dita con- 10 dição cardíaca, pós-infarto do miocárdio.

É particularmente preferido que a seqüência que é detectada compreenda ou codifique um resíduo de aminoácido ou Arginina (Ar) ou Glu- tamina (GIn) em uma posição correspondendo à posição 148 da SEQ ID NO:

6 ou 8, ou resíduo em uma posição correspondendo à posição 668 da SEQ ID NO: 2 ou 4. A presença de um resíduo Arg aqui é indicativa de um indiví- duo sob risco de sofrer de ou desenvolver uma condição cardíaca pós Ml. A presença de um resíduo Gln aqui é indicativa de um efeito protetor, isto é, um indivíduo com um risco menor.

De preferência, a identidade de um SNP (A/G) é detectada em 20 uma posição correspondendo à posição 443 da SEQ ID NO 5 ou 7 ou em uma posição correspondendo à posição 7265 da SEQ ID NO: 1 ou 3. A pre- sença de um nucleotídeo Guanidina (G) aqui é indicativa de um indivíduo sob risco de sofrer de ou desenvolver uma condição cardíaca pós-MI. A pre- sença de um resíduo do nucleotídeo Adenina (A) é indicativa de um efeito 25 protetor, isto é, um indivíduo com um risco menor.

A seqüência do domínio hemopexina de MMP-9 (Metaloprotei- nase de Matriz 9), também conhecido como domínio PEX9, é mostrada nas SEQ ID NOs.: 5-8), das quais as SEQ ID NOs.: 6 e 8 são seqüências de a- minoácido e SEQ ID NOs.: 5 e 7 são seqüências de polinucleotídeo. A se- 30 quência do domínio pode ser detectada avaliando a seqüência da proteína per se ou a seqüência de nucleotídeo codificando o domínio da proteína. Devido à degeneração do código genético, a seguência de nucleotídeo (de preferência DNA ou RNA) pode ser qualquer uma que codifique a SEQ ID NO.: 6 ou 8. De preferência, no entanto, a seqüência de nucleotídeo é aque- la de acordo com a SEQ ID N°. 5 ou 7.

De preferência, a seqüência detectada é SEQ ID N°. 7, que é a seqüência de DNA do domínio hemopexina de MMP-9 do grupo sob risco (suscetível) (mostrando uma posição 443 do nucleotídeo G).

De preferência, a seqüência detectada é SEQ ID NO.: 8, que é a seqüência de aminoácido do domínio hemopexina de MMP-9 do grupo sob risco (suscetível) mostrando Arg da posição 148 de aminoácido).

É também preferido que a seqüência detectada seja SEQ ID

NO.: 5, que é a seqüência de DNA do domínio hemopexina de MMP-9 do grupo de proteção (mostrando um nucleotídeo Adenina na posição 443). De preferência, a seqüência detectada é SEQ ID NO.: 6, que é a seqüência de aminoácido do domínio hemopexina de MMP-9 do grupo de proteção (mos- trando um resíduo de aminoácido Gln na posição 148 de aminoácido).

De preferência, detecção da presença da mudança de um ami- noácido na seqüência do domínio hemopexina é através da comparação da seqüência de nucleotídeo de MMP-9 do indivíduo com SEQ ID NO.: 1 ou SEQ ID NO.: 3.

É particularmente preferido que esta detecção possa ser através

da avaliação da presença de pelo menos um nucleotídeo em uma posição correspondendo à posição 7265 da SEQ ID NO.: 1 ou SEQ ID NO.: 3. Con- forme acima mencionado, a presença de um nucleotídeo Guanidina nesta posição, ou uma correspondendo a ela, é indicativa da susceptibilidade de 25 um indivíduo a uma condição cardíaca, pós-infarto do miocárdio. De prefe- rência, então, o indivíduo tem a seqüência de MMP-9 mostrada na SEQ ID No.:3, compreendendo uma Guanidina na dita posição.

Alternativamente, esta detecção pode ser através da observa- ção da presença de Adenina em uma posição correspondendo à posição 7265 da SEQ ID NO.: 1, um nucleotídeo Adenina nesta posição, ou uma cor- respondendo a ela, sendo protetor contra uma condição cardíaca, pós-infarto do miocárdio. Em outras palavras, um nucleotídeo adenina na dita posição é indicativo de um indivíduo que é improvável de ser suscetível à dita condição cardíaca, pós-infarto do miocárdio. De preferência, o indivíduo tem a se- qüência de MMP-9 mostrada na SEQ ID NO.: 1, compreendendo uma Ade- nina na dita posição.

Alternativamente, ou em adição, a detecção pode ser através de

detecção da presença da mudança de aminoácido no dito domínio no RNA transcrito a partir do gene. Este é de preferência mRNA.

Com mais preferência, no entanto, a detecção pode ser através da detecção da presença da mudança de aminoácido no dito domínio na 10 proteína ativa ou funcional. De preferência o indivíduo ou paciente tem a pro- teína MMP-9 de acordo com a SEQ ID NO.: 2 compreendendo Glutamina (GIn) na posição 668 da SEQ ID NO.: 2, ou uma correspondendo a ela, sen- do protetora contra insuficiência cardíaca, pós-infarto do miocárdio. Alterna- tivamente, o indivíduo ou paciente tem a proteína MMP-9 de acordo com a 15 SEQ ID NO.: 4 compreendendo Arginina (Arg) na posição 668 da SEQ ID NO.: 2, ou uma correspondendo a ela, sendo indicativa de susceptibilidade à insuficiência cardíaca, pós-infarto do miocárdio.

O indivíduo ou paciente pode ser homozigoto para os alelos de risco ou protetores ou pode ser heterozigoto.

De preferência, a condição cardíaca é infarto do miocárdio, sín-

drome coronária aguda, cardiomiopatia isquêmica, cardiomiopatia não- isquêmica ou insuficiência cardíaca congestiva. Com mais preferência, a condição cardíaca é insuficiência cardíaca congestiva.

A amostragem da seqüência de proteína é de preferência op- cionalmente em adição à análise do nucleotídeo, isto é, ambos o genótipo e a seqüência de proteína da proteína ativa ou funcional são avaliados (análi- ses genômica e proteômica).

A mudança na seqüência de aminoácido é de preferência o re- sultado do SNP referido aqui como SNP7265.

O presente SNP envolve uma mudança do nucleotídeo Guanidi-

na mais comum para o nucleotídeo Adenina menos comum em uma posição correspondendo à 7265 da SEQ ID NO.: 1 ou 3, conforme acima descrito. Esta mudança resulta em uma mudança de aminoácido de um resíduo de aminoácido Arginina para um resíduo de aminoácido Glutamina em uma po- sição correspondendo à 668 das SEQ ID NOs.: 2 e 4, conforme também a- cima descrito.

De preferência, a invenção compreende avaliação ou determi-

nação da presença do alelo de risco, sendo a presença de G na posição re- levante. Alternativamente, ou em adição, a invenção compreende de prefe- rência avaliação ou determinação da presença do alelo protetor, sendo a presença de A na dita posição.

Onde for feito referência às SEQ ID NOs.: 1 e/ou 3, isto será

compreendido incluir referência às seqüências do domínio hemopexina (SEQ ID NOs.: 5 e/ou 7) e a numeração correspondendo dos nucleotídeos nelas, a menos que de outro modo aparente. Igualmente, onde for feito refe- rência às SEQ ID NOs.: 2 e/ou 4, isto será compreendido incluir referência 15 às seqüências do domínio hemopexina (SEQ ID NOs.: 6 e/ou 8) e a numera- ção correspondendo dos aminoácidos nelas, a menos que de outro modo aparente.

O domínio hemopexina de MMP-9 é de preferência aquele defi- nido pelas SEQ ID NOs.: 5-8, conforme acima discutido, com ou sem a mu- dança de aminoácido causada pelo presente SNP. O domínio hemopexina é de preferência aquele associado com ligação de TIMP, com mais preferência ligação de TIMP-1.

A mudança de aminoácido resultante do presente SNP está es- trategicamente posicionada do domínio tipo hemopexina de MMP-9 (vide 25 Figuras 1-3) e é então altamente provável estar envolvida em ligação não apenas a fibras de colágeno, mas também ao inibidor principal de MMP-9, Inibidor Tecidual de Metaloproteinase-1 (TIMP-1). Então, este SNP e a mu- dança de aminoácido resultante desempenham muito provavelmente um papel-chave em remodelagem ventricular e desenvolvimento de, ou progres- 30 são para, uma condição cardíaca, especialmente insuficiência cardíaca. Isto é confirmado pelos presentes Exemplos que mostram uma correlação esta- tisticamente significante entre a presença do alelo protetor e uma atividade de MMP-9 de fase inicial baixa, EF alfa (pós-MI), junto com EF e EDV nor- mais, com muito poucas chances de desenvolver insuficiência cardíaca, par- ticularmente Insuficiência cardíaca Congestiva (CHF) ou remodelagem do Ventrículo Esquerdo (LV) - Left Ventricle).

A janela para a atividade de fase inicial de MMP-9 é de prefe-

rência 1-2 dias pós-MI e de preferência menos do que 24 horas pós-MI. En- tão, para avaliar os níveis de atividade de MMP-9, é preferido que MMP-9 seja medida em amostras de plasma coletadas até 24 horas após Ml.

A seqüência de proteína avaliada é de preferência após quais- quer modificações pós-traducionais.

De preferência o paciente já sofreu um infarto do miocárdio. No entanto, é também contemplado que o paciente possa não ter ainda sofrido de um infarto do miocárdio, caso onde a presença de SNP ou a mudança de aminoácido resultante seria indicativa da probabilidade de desenvolver uma 15 condição cardíaca após Infarto do Miocárdio, então o indivíduo deveria ter um Infarto do Miocárdio. Isto é particularmente útil para avaliação de um pa- ciente que estaria sob risco de um Ml, por exemplo, devido a uma história de família, tendo coração fraco ou outro fator de risco, e/ou antes de uma ope- ração que possa causar um Infarto do Miocárdio.

Então, a presente invenção provê um método de avaliação de

pacientes infartados compreendendo determinação da presença ou ausência da mudança de aminoácido acima. Similarmente, a presente invenção tam- bém provê um método de avaliação para a população geral, infartada ou outra.

É também provido um método de estabelecimento de um diag-

nóstico e/ou prognóstico em pacientes com infarto do miocárdio, através da correlação de uma mudança de aminoácido em metaloproteinase de matriz-

9 (MMP-9) com níveis menores de atividade de MMP-9, o que indica um me- lhor resultado clínico após infarto do miocárdio.

Então, é preferido que a atividade mensurável de MMP-9 seja

reduzida, com mais preferência através de uma redução na expressão da proteína MM-9. Isto pode ser através de sub-requlagem da expressão do gene ou isto pode ser através de competição ou inibição (tal como efeitos esteáricos do inibidor se ligando no sítio ativo ou outro local). A evidência até agora é que há uma redução na expressão de MMP-9, então uma atividade mensurável reduzida, resultante do SNP.

5 A atividade é mensurável através de vários métodos conhecidos

na técnica para proteases que podem, por exemplo, ensaiar a clivagem de um marcador fluorescente. Zimografia e/ou ELISA são particularmente prefe- ridos.

Conforme aqui mostrado, a atividade de MMP-9 é reduzida quando o domínio hemopexina é alterado, com mais preferência através da alteração da seqüência de domínio, particularmente a mudança resultante do presente SNP. Isto é particularmente o caso na janela de fase inicial pós- MI, conforme acima definido.

Continuando a partir dos estudos anteriores da requerente, a requerente investigou o polimorfismo genético de MMP-9 e suas conseqüên- cias sobre insuficiência cardíaca. Para este propósito, a requerente iniciou experimentos de sequenciamento com objetivo de definir a presença ou au- sência de SNPs na seqüência inteira do gene de MMP-9. Dois grupos de 22 pacientes com fenótipos extremos foram selecionados: um grupo tendo um bom resultado clínico após Ml e ausência de remodelagem ventricular es- querda e sinais de insuficiência cardíaca (caracterizado por uma fração de ejeção do ventrículo esquerdo maior do que 55%) e um grupo tendo um re- sultado clínico ruim após Ml e presença de remodelagem ventricular esquer- da e sinais de insuficiência cardíaca (caracterizado por uma fração de ejeção do ventrículo esquerdo menor do que 40%). Vários SNPs foram identificados nesses pacientes. Dentre esses, um SNP, localizado na posição 7265 da seqüência de codificação do gene de MMP-9, parece particularmente inte- ressante. Na verdade, a frequência de SNP7265 foi diferente entre os dois grupos de pacientes. Isto sugeriu que SNP7265 pode estar associado com a ocorrência de insuficiência cardíaca após Ml e pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico. Em seguida a requerente procurou determinar se a associação entre SNP7265 e insuficiência cardíaca observada em uma amostra peque- na de pacientes com Ml (44 pacientes) poderia ser verificada em uma coorte grande. A requerente usou registro de Luxembourg Acute Myocardial Infarc- 5 tion (LUCKY)1 que é mantido em seu laboratório, para realizar experimentos de genotipificação para detectar a presença de SNP7265 em 229 pacientes. Primeiro, esses experimentos permitiram que a requerente mostrasse que SNP7265 está associado com níveis no plasma de MMP-9 de uma maneira estatisticamente significante. Segundo, a requerente foi capaz de mostrar 10 que SNP7265 está na verdade significantemente associado com fração de ejeção e o desenvolvimento de insuficiência cardíaca pós-MI.

Esses experimentos revelaram a utilidade potencial de SNP7265 como uma ferramenta de diagnóstico para prever a ocorrência de insuficiência cardíaca seguindo Ml. Também, foi postulado pela requerente 15 que SNP7265 pode ser o ponto de partida para desenvolver estratégias te- rapêuticas com objetivo de diminuir a atividade de MMP-9 prejudicial no co- ração de pacientes com Ml.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é provido um método de estabelecimento de um diagnóstico e um prognóstico 20 em pacientes com infarto do miocárdio através da correlação de uma mu- dança de aminoácido no domínio hemopexina de metaloproteinase de ma- triz-9 (MMP-9) com níveis de MMP-9 menores, o que indica um melhor resul- tado clínico após infarto do miocárdio.

A mudança de aminoácido pode ser um polimorfismo de nucleo- tídeo único (SNP) em MMP-9, de preferência localizado na posição 7265 da seqüência de nucleotídeo de MMP-9. O SNP pode ser uma mudança de Guanidina para Adenina. O SNP induz uma mudança de aminoácido Argini- na para Glutamina.

De preferência, a condição cardíaca é infarto do miocárdio, sín- drome coronária aguda, cardiomiopatia isquêmica, cardiomiopatia não- isquêmica ou insuficiência cardíaca congestiva. Com mais preferência, a condição cardíaca é insuficiência cardíaca congestiva. De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um método de tratamento para inibir remodelagem ventricular e tratar e pre- venir insuficiência cardíaca através de correlação de uma mudança de ami- noácido no domínio hemopexina de metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9) 5 com níveis de MMP-9 menores, o que indica um melhor resultado clínico após infarto do miocárdio.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é provido um método de previsão da ocorrência de remodelagem ventricular em pacientes seguindo infarto do miocárdio, através da correlação de uma 10 mudança de aminoácido no domínio hemopexina de metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9) com níveis de MMP-9 menores, o que indica um melhor resultado clínico após infarto do miocárdio.

De acordo com um aspecto ainda adicional da presente inven- ção, é provido um método de aperfeiçoamento da estratégia terapêutica de 15 um paciente seguindo infarto do miocárdio, com base na correlação de uma mudança de aminoácido no domínio hemopexina de metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9), que por sua vez está relacionada com níveis de MMP-9 menores que indicam um melhor resultado clínico.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provida 20 uma plataforma para elaboração de fármaco para tratar remodelagem ventri- cular com base em correlação de uma mudança de aminoácido no domínio hemopexina de metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9) correlacionada com níveis de MMP-9 menores, o que indica um melhor resultado clínico após infarto do miocárdio.

De acordo com um aspecto ainda adicional da presente inven-

ção, é provida uma plataforma para desenvolvimento de fármaco para espe- cificamente inibir atividade de Metaloproteinase de Matriz-9 (MMP-9), onde uma mudança de aminoácido na metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9) está correlacionada com níveis de MMP-9 menores e indica um melhor resultado após infarto do miocárdio.

De preferência, isto é em relação ao uso das mudanças confor- macionais e eletrostáticas na estrutura secundária ou terciária da proteína MMP-9, causadas pela mudança de aminoácido do SNP, para prover novos agonistas ou antagonistas/inibidores para MMP-9, especialmente aqueles capazes de imitar ou se ligar ao sítio de ligação de TIMP "alterado".

Alternativamente, a invenção pode ser usada para desenvolver estratégias para bloquear atividade de MMP-9 ou reforçar sua interação com TMP-1.

Então, a presente invenção provê métodos de identificação de agonistas ou antagonistas/inibidores de MMP-9, ou moléculas capazes de bloquear a atividade de MMP-9 ou reforçar sua interação com TMP-1 ou re- duzir a atividade detectável ou expressão de MMP-9.

A invenção também provê um método de identificação de ago- nistas ou antagonistas/inibidores de MMP-9, ou moléculas capazes de blo- quear atividade de MMP-9, ou reforçar sua interação com TIMP-1 ou reduzir a atividade detectável ou expressão de MMP-9, compreendendo elaboração 15 de uma molécula ou Iigante que vai interagir com o domínio hemopexina mudado de metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9).

De acordo com outro aspecto da invenção, é provido um método para melhorar a ligação de MMP-9 a seu inibidor natural InibidorTeciduaI de MMP-1 (TIMP-1), através da correlação de uma mudança de aminoácido no 20 domínio hemopexina de metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9) com níveis de MMP-9 menores e indica um melhor resultado clínico após infarto do mi- ocárdio.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é provido um método de prevenção da degradação de tecido do miocárdio as- 25 sociada com doença cardíaca de estágio final compreendendo administrar quantidades terapeuticamente eficazes de fármaco, onde uma mudança de aminoácido no domínio hemopexina de metaloproteinase de matriz-9 (MMP- 9) está correlacionada com níveis de MMP-9 menores e indica um melhor resultado clínico após infarto do miocárdio.

Em ainda um aspecto adicional da presente invenção, é provido

um método de tratamento de um paciente apresentando sintomas de insufi- ciência cardíaca congestiva compreendendo administração de um agente que diminui a atividade de MMP-9 no tecido do miocárdio, onde uma mu- dança de aminoácido no domínio hemopexina de metaloproteinase de ma- triz-9 (MMP-9) está correlacionada com níveis de MMP-9 menores e indica um melhor resultado clínico após infarto do miocárdio.

5 Os sintomas podem ser indicativos de insuficiência cardíaca

crônica ou aguda e o agente que diminui a produção de MMP-9 no tecido do miocárdio pode ser compreendido de um fármaco terapeuticamente eficaz.

Para evitar dúvida, a mudança de aminoácido, em qualquer as- pecto da presente invenção, pode ser um polimorfismo de nucleotídeo único 10 (SNP) em MMP-9, de preferência localizado na posição 7265 da seqüência de codificação de MMP-9. O SNP pode ser uma mudança de Guanidina em Adenina. O SNP induz uma mudança de aminoácido Arginina para Glutami- na conforme definido mais acima. De preferência, a condição cardíaca é in- farto do miocárdio, síndrome coronária aguda, cardiomiopatia isquêmica, 15 cardiomiopatia não-isquêmica ou insuficiência cardíaca congestiva. Com mais preferência, a condição cardíaca é insuficiência cardíaca congestiva. O fármaco ou agente pode ser administrado oralmente, intravenosamente, in- tradermalmente, transdermalmente ou expresso em um vetor adequado.

É também provido um método de determinação de susceptibili- dade a uma condição cardíaca em um indivíduo compreendendo detecção de alelo sob risco de um SNP, onde o SNP está localizado dentro de uma seqüência codificando o domínio hemopexina da proteína MMP-9 ativa.

A invenção também provê um método para ensaio quanto à presença de um primeiro polinucleotídeo tendo um SNP associado com sus- 25 ceptibilidade a uma condição cardíaca em uma amostra compreendendo: contato da dita amostra com um segundo polinucleotídeo, onde o dito se- gundo polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeo selecio- nada do grupo consistindo em SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 7, 9 e/ou 10 e os com- plementos das ditas seqüências, onde o dito segundo polinucleotídeo hibri- 30 diza para o dito primeiro polinucleotídeo sob condições estringentes. A con- dição estringente é de preferência estringência alta, de preferência 6 x SSC. É também provido um vetor compreendendo um polinucleotídeo isolado contendo um SNP associado com susceptibilidade a uma condição cardíaca, onde o dito polinucleotídeo isolado está operavelmente ligado a uma seqüência reguladora, de preferência um promotor adequado. É tam- 5 bém provida uma célula hospedeira compreendendo dito vetor.

Em todos os aspectos o SNP associado com susceptibilidade a uma condição cardíaca resulta na presente mudança de aminoácido no do- mínio hemopexina da proteína MMP-9 ativa transcrita, e com mais preferên- cia SNP7265 conforme aqui descrito, a saber mudança de nucleotídeo G em 10 A resultando em uma mudança de aminoácido Arg em Gln no dito domínio. A invenção também provê um método para produção de um polipeptídio co- dificado por um polinucleotídeo isolado tendo um SNP associado com sus- ceptibilidade a uma condição cardíaca; compreendendo cultura da célula hospedeira recombinante acima sob condições adequadas para expressão 15 do dito polipeptídio.

É também provido um método de ensaio quanto à presença de um polipeptídio codificado por um polinucleotídeo isolado tendo um SNP as- sociado com susceptibilidade a uma condição cardíaca em uma amostra, o dito método compreendendo contato da amostra com um anticorpo que se liga especificamente ao dito polipeptídio codificado.

A invenção provê ainda um animal transgênico compreendendo um polinucleotídeo tendo um SNP associado com susceptibilidade a uma condição cardíaca.

É também provido um método de identificação de um agente que altera a expressão de um polinucleotídeo contendo um SNP associado com susceptibilidade a uma condição cardíaca compreendendo:

(a) contato de um polinucleotídeo com um agente a ser testado sob condi- ções para expressão, onde o polinucleotídeo compreende (1) um SNP asso- ciado com susceptibilidade a uma condição cardíaca e (2) uma região pro-

motora operavelmente ligada a um gene repórter;

(b) avaliação do nível de expressão do gene repórter na presença do agente; (c) avaliação do nível de expressão do gene repórter na ausência do agente; e

(d) comparação do nível de expressão na etapa (b) com o nível de expres- são na etapa (c) quanto a diferenças que indiquem que expressão foi altera-

da pelo agente.

A invenção também provê um método para ensaio de uma a- mostra quanto à presença de um primeiro polinucleotídeo, o qual é pelo me- nos parcialmente complementar a uma parte de um segundo polinucleotídeo onde o segundo polinucleotídeo compreende uma seqüência selecionada do grupo consistindo nas seqüências identificadas por SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 7,

9 e/ou 10, e os seus complementos, compreendendo:

a) contato da dita amostra com dito segundo polinucleotídeo sob condições apropriadas para hibridização, e

b) avaliação de se hibridização aconteceu entre o dito primeiro e o dito se- gundo polinucleotídeo;

onde se hibridização tiver acontecido, o dito primeiro polinucleotídeo está presente na dita amostra. Marcadores adequados de hibridização são co- nhecidos na técnica.

É também provido um reagente para ensaio de uma amostra 20 quanto à presença de um primeiro polinucleotídeo compreendendo um SNP associado com susceptibilidade a uma condição cardíaca, o dito reagente compreendendo um segundo polinucleotídeo compreendendo uma seqüên- cia de nucleotídeo contígua que é pelo menos parcialmente complementar a uma parte do primeiro polinucleotídeo.

A invenção provê ainda um estojo de reagente para ensaio de

uma amostra quanto à presença de um primeiro polinucleotídeo compreen- dendo um SNP associado com susceptibilidade a uma condição cardíaca compreendendo em recipientes separados:

a) um ou mais segundo polinucleotídeos marcados compreendendo uma seqüência selecionada do grupo consistindo nas seqüências identificadas

pelas SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 7, 9 e/ou 10, e os complementos das mesmas; e

b) reagentes oara detecção do dito marcador. É também provido um método de diagnóstico de uma suscepti- bilidade a uma condição cardíaca em um indivíduo compreendendo detec- ção de um haplotipo associado com a dita condição, o haplotipo compreen- dendo o presente SNP e pelo menos outro haplotipo. De preferência o dito 5 pelo menos haplotipo adicional está também associado com estados de do- ença pós-MI, particularmente condições cardíacas.

De preferência detecção da presença do haplotipo compreende amplificação enzimática de ácido nucléico do indivíduo. De preferência, de- tecção da presença do haplotipo compreende ainda análise eletroforética. 10 Detecção da presença do haplotipo pode compreender ainda análise de po- Iimorfismo do comprimento de fragmento de restrição. Detecção da presença do haplotipo pode compreender ainda análise de seqüência.

É também provido um método de diagnóstico de susceptibilida- de a uma condição cardíaca em um indivíduo compreendendo:

a) obtenção de uma amostra de polinucleotídeo a partir do dito indivíduo; e

b) análise da amostra de polinucleotídeo quanto à presença ou ausência de um haplotipo, onde a presença do haplotipo corresponde a uma susceptibili- dade à dita condição cardíaca.

É também provido um método de identificação de um gene as- 20 sociado com susceptibilidade a uma condição cardíaca compreendendo: (a) identificação de um gene contendo um SNP que está localizado dentro de uma seqüência selecionada do grupo consistindo nas seqüências identifica- das pelas SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 7, 9 e/ou 10, e os complementos das mes- mas; e (b) comparação da expressão do dito gene em um indivíduo tendo 25 um alelo de risco com a expressão do dito gene em um indivíduo não tendo um alelo de risco quanto a diferenças indicando que o gene está associado com susceptibilidade à dita condição cardíaca.

A invenção provê ainda um método de identificação de um a- gente adequado para tratar uma condição cardíaca compreendendo: (a) con- tato de um polinucleotídeo com um agente a ser testado, onde o polinucleo- tídeo contém um SNP localizado dentro de uma seqüência selecionada do grupo consistindo nas seqüências identificadas pelas SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 7, 9 e/ou 10 e os componentes das mesmas; e (b) determinação de se o dito agente se liga a, altera ou afeta o polinucleotídeo de uma maneira que seria útil para tratamento da dita condição.

É ainda provido um método de identificação de um agente ade- quado para tratamento de uma condição cardíaca compreendendo:

a) contato de um polipeptídio com um agente a ser testado, onde o polipep- tídio é SEQ ID NO: 2 ou 4 ou é codificado por um polinucleotídeo contendo um SNP localizado dentro de uma seqüência selecionada do grupo consis- tindo nas seqüências identificadas pelas SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 7, 9 e/ou 10, 10 e os complementos das mesmas; e (b) determinação de se o dito agente se liga a, altera ou afeta o polipeptídeo de uma maneira que seria útil para tra- tamento da dita condição cardíaca.

É também provido um fármaco ou agente identificado através dos ditos métodos, uma composição farmacêutica contendo o dito agente em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é uma ilustração da estrutura 3D do domínio hemo- pexina de MMP-9 destacando a posição da arginina.

A Figura 2 mostra uma estrutura 3D do domínio hemopexina de MMP-2 humana contendo uma glutamina na mesma posição (isto é, uma correspondente).

A Figura 3A ilustra uma previsão da estrutura 3D da estrutura de MMP-9 sem mutação.

A Figura 3B ilustra uma previsão de estrutura 3D da estrutura de MMP-9 com mutação.

A Figura 4A mostra uma associação estatisticamente significan- te entre SNP7275 e o nível de MMP-9 no plasma em pacientes seguindo Ml agudo.

A Figura 4B mostra uma associação estatisticamente significan- te entre SNP7275 e a fração de ejeção de pacientes quatro meses após Ml.

A Figura 5 provê a seqüência de DNA genômico integral e se- qüência de aminoácido de MMP-9 humana. Está destacado o SNP na Iocali- zação 7265 da seqüência de nucleotídeo (exon 12) que induz - quando con- vertido a partir de uma guanidina (símbolo "G") em uma adenina (símbolo "A") - uma mudança no aminoácido arginina (símbolo "R") em glutamina (símbolo "Q"), que é também destacado por negrito e caracteres sublinhados na seqüência de aminoácido (aminoácido 668).

DESCRIÇÃO DETALHADA

Metaloproteinases de matriz (MMPs) são compostos muito im- portantes que são a força impulsora por trás da degradação da matriz extra- celular miocardial. Estudos recentes mostraram claramente que no coração, 10 MMPs contribuem para remodelagem ventricular e insuficiência cardíaca. No nível clínico, estudos do grupo da requerente confirmados recentemente por outros mostraram que níveis de MMPs elevados no sangue estão associa- dos com o desenvolvimento de insuficiência cardíaca após Ml. Então, medi- ção de MMPs, e em particular MMP-9, em pacientes com Ml ou CHF provê 15 uma medida de prognóstico similar àquela de TNF-alfa, angiotensina Il ou norepinefrina. Neutrófilos e macrófagos desempenham um papel importante nas respostas inflamatórias que levam a dano do miocárdio e fibrose, pelo menos parcialmente através da produção de grandes quantidades de MMP- 9.

A requerente investigou os mecanismos responsáveis pela regu-

Iagem de atividade de MMP-9 durante remodelagem, e a requerente testou a hipótese de que polimorfísmos genéticos do gene de MMP-9 poderiam modi- ficar a atividade de MMP-9.

Para este propósito, a requerente primeiro selecionou 44 paci- 25 entes com infarto do miocárdio, 22 deles com um resultado favorável (EF > 55%) e 22 com um resultado desfavorável (EF < 40%). DNA genômico foi extraído de células mononucleares de sangue periférico isoladas do sangue venoso desses pacientes. O gene de MMP-9 integral (9 kBytes) foi sequen- ciado. Em paralelo, concentrações de MMP-9 no plasma foram determina- 30 das com zimografia de gelatina.

A requerente identificou 5 SNPs que variam significantemente entre duas populações de pacientes. Dentre esses, um SNP na posição 7265 da seqüência de codificação do gene de MMP-9 (chamado SNP7265) está fortemente associado com modificações da estrutura e atividade de MMP-9. Este SNP induz uma mudança na composição do aminoácido do domínio hemopexina de MMP-9, o mesmo domínio onde TIMP-1 interage 5 com MMP-9. TIMP-1 é a quebra natural mais importante de MMP-9. A sim- ples existência deste SNP já era conhecida. No entanto, sua importante clí- nica e terapêutica era totalmente desconhecida.

A requerente então constatou a significância de SNP7265 em uma coorte maior de pacientes com Ml agudo (229 pacientes). A requerente 10 foi também capaz de revelar uma associação estatisticamente significante entre SNF7265, níveis de MMP-9 no plasma e fração de ejeção. A presença da mutação melhora o resultado clínico dos pacientes com Ml uma vez que ela está associada com níveis de MMP-9 no plasma menores e fração de ejeção maior. A mutação é então protetora e reduz as chances de desenvol- 15 ver insuficiência cardíaca após Ml.

Deste modo, a requerente propõe um novo método para usar este SNP de duas maneiras complementares: primeiro, como um método de diagnóstico e prognóstico para identificar pacientes com risco de desenvol- ver insuficiência cardíaca após infarto do miocárdio e, segundo, como uma 20 plataforma para elaboração de fármaco com objetivo de especificamente inibir atividade de MMP-9.

A publicação original da requerente sobre MMP-9 foi publicada em fevereiro de 2006 (Wagner e outros, supra) e mostrou que Metaloprotei- nase de Matriz-9 (MMP-9) é um marcador para insuficiência cardíaca após 25 infarto agudo do miocárdio. No entanto, este trabalho não menciona mudan- ças em SNPs ou nucleotídeo ou aminoácido que pudessem ser protetoras contra, ou indicativas de, susceptibilidade a uma condição cardíaca, pós-MI.

Embora a simples existência deste SNP (referido aqui como SNP7265) fosse conhecida, nenhuma função nunca foi associada a ele. Isto é porque o SNP foi identificado (e provido com a ref. SNP ID rs2274756), junto com muitos outros SNPs, por vários grupos de pesquisa que sequenci- aram os genomas de centenas de pessoas de populações diferentes. Esses indivíduos não tinham sido associados com um estado de doença, então não houve nenhuma comparação da frequência de SNP entre dois ou mais gru- pos de pacientes (isto é, normal vs. doente; ou doente vs. não doente). Em outras palavras, o SNP foi identificado como parte de um projeto de sequen- 5 ciamento de genoma e nunca foi ligado com a incidência de uma condição cardíaca pós-MI.

São também providos um método para melhorar ligação de MMP-9 a seu inibidor natural Inibidor Tecidual de MMP-1 (TIMP-1), um mé- todo de prevenção de degradação de tecido do miocárdio associado com 10 doença cardíaca de estágio final compreendendo administrar quantidades terapeuticamente eficazes de fármaco e um método de tratamento de um paciente apresentando sintomas de insuficiência cardíaca congestiva com- preendendo administrar um agente que diminui a atividade de MMP-9 no tecido do miocárdio.

Onde referência ao SNP for feita, será compreendido que esta

compreende a mudança de nucleotídeo e a mudança de aminoácido resul- tante, a menos que de outro modo aparente.

Um polimorfismo de nucleotídeo único, ou SNP, é geralmente aceito ser uma variação na seqüência de DNA ocorrendo quando um nucleo- 20 tídeo único - A, T, C ou G - no genoma difere entre membros de uma espé- cie (ou entre cromossomos em pares em um indivíduo). Por exemplo, dois fragmentos de DNA sequenciados de indivíduos diferentes, AAGCCTA a AAGCTTA, contêm uma diferença em um nucleotídeo único. Neste exemplo são ditos ser dois a/e/os: CeT.

Na presente invenção, há também dois alelos: o alelo protetor

(compreendendo Adenina e codificando Gin) e o alelo de risco/suscetível (compreendendo Guanidina e codificando Arg).

Será também compreendido que o códon integral codificando Gln (CAA ou CAG) pode ser detectado. Alternativamente, ou ainda, o códon integral codificando Arg (CGA ou CGG) pode ser detectado. Opcionalmente, nucleotídeos de flanqueamento de adição podem ser também detectados, de preferência pelo menos 2, com mais preferência pelo menos 5, com mais preferência pelo menos 10, com mais preferência pelo menos 15, com mais preferência pelo menos 20 e com mais preferência pelo menos 25. O núme- ro em qualquer lado do nucleotídeo ou códon de SNP pode ser igual ou dife- rente.

SNPs são frequentemente verificados ser a etiologia de muitas

doenças humanas e são de interesse particular em farmacogenética. Então, análise farmacogenética e escolha individual de tratamento e medicação para cada indivíduo são também compreendidos dentro da presente inven- ção.

O presente SNP pode também prover uma impressão digital

genética para uso em teste de identidade.

A etapa de detecção pode envolver isolamento da seqüência de proteína ou polinucleotídeo e determinação da identidade do nucleotídeo ou nucleotídeos ou resíduo ou resíduos de aminoácido relevantes.

Métodos adequados para detecção do SNP serão conhecidos

da pessoa versada, mas podem incluir qualquer um daqueles descritos abai- xo. A invenção não é limitada a nenhum de tais métodos.

Métodos adequados podem incluir métodos à base de hibridiza- ção, incluindo Hibridização específica de Alelo Dinâmica ((DASH) - Dynamic Allele-Specific Hybridization), que leva vantagem das diferenças na tempera- tura de fusão em DNA que resultam da instabilidade dos pares de base sem combinação. O processo pode ser amplamente automatizado e compreende alguns princípios simples. Na primeira etapa, um segmento genômico é am- plificado e ligado a uma conta através de uma reação PCR com um iniciador biotinilado. Na segunda etapa, o produto amplificado é ligado a uma coluna de estreptavidina e lavado com NaOH para remover o filamento não- biotinilado. Um oligonucleotídeo específico de alelo é então adicionado na presença de uma molécula que fluoresce quando ligada a um DNA de fila- mento duplo. A intensidade é então medida conforme a temperatura é au- mentada até que a Tm possa ser determinada. Um SNP vai resultar em uma Tm menor do que esperada. Detecção de SNP através de sinalizadores moleculares faz uso de uma sonda de oligonucleotídeo de filamento simples especificamente en- genheirada. O oligonucleotídeo é elaborado de modo que há regiões com- plementares em cada extremidade e uma seqüência de sonda localizada 5 entre elas. Este projeto permite que a sonda tome uma estrutura "hairpin", ou alça, em seu estado isolado, natural. Ligado a uma extremidade da sonda está um fluoróforo e à outra extremidade um extintor de fluorescência. Por causa da estrutura de alça da sonda, o fluoróforo está em proximidade ínti- ma com o extintor, então prevenindo a molécula de emitir qualquer fluores- 10 cência. A molécula é então também engenheirada de modo que apenas a seqüência da sonda é complementar ao DNA genômico que será usado no ensaio.

Se a seqüência da sonda do sinalizador molecular encontrar seu DNA genômico alvo durante o ensaio, ele vai anelar e hibridizar. Por causa 15 do comprimento da seqüência da sonda, o segmento "hairpin" da sonda vai desnaturar a favor de formação de um híbrido alvo de sonda mais estável, longo. Esta mudança conformacional permite que o fluoróforo e o extintor sejam liberados de sua proximidade íntima devido à associação "hairpin", permitindo que a molécula fluoresça. Se por outro lado a seqüência da son- 20 da encontrar uma sequência-alvo com o mínimo de um nucleotídeo não- complementar, o sinalizador molecular vai de preferência ficar em seu esta- do "hairpin" natural e nenhuma fluorescência será observada, uma vez que o fluoróforo permanece extinto.

O projeto único desses sinalizadores moleculares permite um 25 ensaio de diagnóstico simples para identificar SNPs em uma dada localiza- ção. Se um sinalizador molecular for elaborado para combinar com um alelo do tipo selvagem e outro para combinar com um mutante do alelo, os dois podem ser usados para identificar o genótipo de um indivíduo. Se apenas o comprimento de onda do primeiro fluoróforo da sonda for detectado durante 30 o ensaio então o indivíduo é homozigoto para o tipo selvagem. Se apenas o comprimento de onda da segunda sonda for detectado então o indivíduo é homozigoto para o alelo mutante. Finalmente, se ambos os comprimentos de onda forem detectados, então ambos sinalizadores moleculares devem hi- bridizar para seus complementos e então o indivíduo deve conter ambos os alelos e ser heterozigoto.

Microdisposição de SNP pode ser também usada. Em disposi- 5 ções de SNP de oligonucleotídeo de alta densidade, centenas de milhares de sondas estão dispostas em um pequeno chip, permitindo que um grande número de SNPs seja interrogado simultaneamente, então permitindo que outros fatores de risco sejam também detectados, em adição à presente in- venção.

Métodos à base de enzima, incluindo DNA ligase, DNA polime-

rase e nucleases, podem ser também empregados, uma vez que esses são considerados ser métodos de genotipificação de SNP de alta fidelidade.

Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição ((RFLP) - Restriction fragment Iength polymorphism) é considerado ser um dos méto- 15 dos mais simples e primeiros de detecção de SNPs. SNP-RFLP faz uso das muitas endonucleases de restrição diferentes e sua afinidade alta para sítios de restrição únicos e específicos. Ao realizar uma digestão em uma amostra genômica e determinar os comprimentos de fragmento através de um ensaio de gel é possível verificar se ou não as enzimas cortam os sítios de restrição 20 esperados. Uma falha em cortar a amostra genômica resulta em um frag- mento identificável maior do que esperado implicando que há uma mutação no ponto do sítio de restrição que o está protegendo de atividade de nuclea- se.

Métodos baseados em PCR são também contemplados. Por 25 exemplo, o Tetrainiciador ARMS-PCR emprega dois pares de iniciadores para amplificar dois alelos em uma reação PCR. Os iniciadores são elabora- dos de modo que os dois pares de iniciador se sobrepõem em uma localiza- ção de SNP, mas cada um combina perfeitamente com o outro para apenas um dos SNPs possíveis. Como resultado, se um dado alelo estiver presente 30 na reação PCR, o par de iniciador específico para este alelo vai produzir produto, mas não para o alelo alternativo com um SNP diferente. Os dois pares de iniciador são também elaborados de modo que seus produtos de PCR são de um comprimento significantemente diferente permitindo faixas facilmente distinguíveis através de eletroforese em gel.

No exame dos resultados, se uma amostra genômica for homo- zigota, então os produtos de PCR que resultam serão do iniciador que com- 5 bina com a localização do SNP do iniciador de filamento oposto, externo, bem como dos dois iniciadores externos, opostos. Se a amostra genômica for heterozigota, então produtos vão resultar do iniciador de cada alelo para seus respectivos contrapartes de iniciador externo bem como dos dois inici- adores externos, opostos.

Endonuclease flap (FEN) é uma endonuclease que catalisa cli-

vagem específica de estrutura. Esta clivagem é altamente sensível a faltas de combinação e pode ser usada para interrogar SNPs com um alto grau de especificidade.

No ensaio "Invader" básico, uma FEN chamada cleavase é com- binada com duas sondas de oligonucleotídeo específicas, que, junto com o DNA alvo, podem formar uma estrutura tripartida reconhecida por cleavase. A primeira sonda, chamada o oligonucleotídeo Invader, é complementar à extremidade 3’ do DNA alvo. A última base do oligonucleotídeo Invader é uma base de não-combinação que se sobrepõe ao nucleotídeo de SNP no DNA alvo. A segunda sonda é uma sonda específica de alelo que é com- plementar à extremidade 5’ do DNA alvo, mas também se estende além do lado 3’ do nucleotídeo de SNP. A sonda específica de alelo vai conter uma base complementar ao nucleotídeo de SNP. SE o DNA alvo contiver o alelo desejado, o Invader e sondas específicas de alelo se ligarão ao DNA alvo formando a estrutura tripartida. Esta estrutura é reconhecida por cleavase, que vai clivar e liberar a extremidade 3’ da sonda específica de alelo. Se o nucleotídeo de SNP no DNA alvo não for complementar à sonda específica de alelo, a estrutura tripartida correta não é formada e nenhuma clivagem acontece. O ensaio Invader é geralmente acoplado com sistema de transfe- rência de ressonância de fluorescência (FRET) para detectar o evento de clivagem. Nesta configuração, uma molécula de extinção é ligada à extremi- dade 3’ e um fluoróforo é Iiqado à extremidade 5’ da sonda específica de alelo. Se clivagem acontecer, o fluoróforo será separado da molécula de ex- tinção gerando um sinal detectável.

Apenas clivagem mínima acontece com sondas com falta de combinação tornando o ensaio Invader altamente específico. No entanto, em 5 seu formato original, apenas um alelo de SNP poderia ser interrogado por amostra de reação e é requerida uma grande quantidade de DNA alvo para gerar um sinal detectável em uma estrutura de tempo razoável. Ao realizar reações de clivagem FEN secundárias, o Serial Invasive Signal Amplification Reaction (SISAR) permite que ambos alelos de SNP sejam interrogados em 10 uma única reação. Ensaio SISAR Invader deve também requerer menos DNA alvo, melhorando a sensibilidade do ensaio Invader original. O ensaio foi também adaptado de várias maneiras para uso em um formato de alto rendimento. Em uma plataforma, as sondas específicas de alelo são ancora- das a microesferas. Quando uma clivagem por FEN gera um sinal fluores- 15 cente detectável, o sinal é medido usando citometria de fluxo. A sensibilida- de da citometria de fluxo elimina a necessidade de amplificação por PCR do DNA alvo. Essas plataformas de alto rendimento não progrediram além do estágio de prova-de-princípio e até agora o sistema Invader não foi usado em quaisquer projetos de genotipificação de SNP de grande escala.

Outros métodos adequados incluem análise de extensão de Ini-

ciador - ensaios de nuclease 5’ (tal como o ensaio Taqman® para genotipifi- cação de SNP), um ensaio de oligonucleotídeo ligase, ensaios de polimor- fismo de conformação de filamento único, Eletroforese em Gel de Gradiente de Temperatura ((TGGE) Temperature Gradient Gel Electrophoresis), cro- 25 matografia líquido de alto desempenho de desnaturação ((DHPLC) - Denatu- rating high performance Iiquid chromatography), Fusão de Alta-Resolução do amplicon inteiro, SNPIex (uma plataforma de genotipificação proprietária vendida pela Applied Biosystems) ou até mesmo através de sequenciamento (especialmente através de pirossequenciamento).

O termo "SNP" refere-se a um polimorfismo de nucleotídeo úni-

co em uma posição particular no genoma humano que varia dentre uma po- pulação de indivíduos. Conforme aqui usado, um SNP pode ser identificado por seu nome ou através da localização dentro de uma seqüência particular.

Conforme aqui usado, a seqüência de nucleotídeo descrita pe- las SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 7, 9 e 10 da presente invenção compreende o complemento das ditas seqüências de nucleotídeo. Ainda, conforme aqui usado, o termo "SNP" compreende qualquer alelo dentre um conjunto de alelos.

O termo "alelo" refere-se a um nucleotídeo específico dentre uma seleção de nucleotídeos definindo um SNP. O termo "alelo menor" refe- 10 re-se a um alelo de um SNP que ocorre menos frequentemente dentro de uma população de indivíduos do que o alelo maior, por exemplo, o alelo pro- tetor da presente invenção (compreendendo A). O termo "alelo maior" refere- se a um alelo de um SNP que acontece mais frequentemente dentro de uma população de indivíduos do que o alelo menor, por exemplo, o alelo de risco 15 da presente invenção (compreendendo G).

O termo "alelo de risco" refere-se a um alelo que é associado com susceptibilidade a uma condição cardíaca pós-MI. O termo "haplotipo" refere-se a uma combinação de alelos particulares de dois ou mais SNPs.

O termo "polinucleotídeo" refere-se a formas poliméricas de nu- cleotídeos de qualquer comprimento. Os polinucleotídeos podem conter de- soxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e/ou seus análogos. Polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional incluindo estruturas moleculares helicais de filamento único, filamento duplo e triplas, e podem realizar qual- quer função, conhecida ou desconhecida. O que segue são modalidades não-limitantes de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene, exons, íntrons, mRNA, tRNA, rRNA, moléculas de ácido nucléico de interferência curtas (siRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucle- otídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer seqüên- cia, RNA isolado de qualquer seqüência, sondas de ácido nucléico e inicia- dores. Um polinucleotídeo pode também compreender moléculas de ácido nucléico modificadas, tal como moléculas de ácido nucléico metiladas e aná- logos de molécula de ácido nucléico. Um polinucleotídeo "substancialmente isolado" ou "isolado" é um que é substancialmente livre das seqüências com as quais ele é associ- ado na natureza. Por substancialmente livre quer dizer pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% livre dos materiais 5 com os quais ele é associado na natureza. Um "polinucleotídeo isolado" também inclui polinucleotídeos recombinantes, que, em virtude de origem de manipulação: (1) não estão associados com todo ou uma porção de um poli- nucleotídeo com o qual ele está associado na natureza, (2) estão ligados a um polinucleotídeo outro que não aquele ao qual ele está ligado na natureza 10 ou (3) não acontecem na natureza.

O termo "hibridiza sob condições estringentes" pretende descre- ver condições para hibridização e lavagem sob as quais seqüências de nu- cleotídeo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% idênticas uma à outra tipicamente permanecem hibridizadas uma para a ou- 15 tra. Tais condições estringentes são conhecidas daqueles versados na téc- nica podem ser encontradas em Current Procols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6. Um exemplo não-limitante de con- dições de hibridização estringente são hibridização em cloreto de só- dio/citrato de sódio 6x (SSC) em cerca de 45 graus C, seguido por uma ou 20 mais lavagens em 0,2 x SSC, SDS 0,1 % a 50-65 graus C.

Onde referência a uma seqüência, aminoácido ou nucleotídeo particular for feita, então será compreendido que isto inclui de preferência pelo menos 70% de homologia de seqüência com a dita seqüência de refe- rência e com mais preferência pelo menos 75%, com mais preferência pelo 25 menos 80%, com mais preferência pelo menos 85%, com mais preferência pelo menos 90%, com mais preferência pelo menos 95%, com mais prefe- rência pelo menos 99%, com mais preferência pelo menos 99,5% e, com mais preferência ainda, pelo menos 99,9%, de homologia, a menos que de outro modo aparente. Métodos adequados para estabelecimento disto inclu- 30 em o programa BLAST.

O termo "vetor" refere-se a uma molécula de DNA que pode car- regar DNA inserido e ser perpetuada em uma célula hospedeira. Vetores são também conhecidos como vetores de clonagem, veículos de clonagem ou veículos. O termo "vetor" inclui vetores que funcionam principalmente para inserção de uma molécula de ácido nucléico em uma célula, vetores de re- plicação que funcionam principalmente para a replicação de ácidos nucléicos 5 e vetores de expressão que funcionam para transcrição e/ou tradução do DNA ou RNA. São também incluídos vetores que proveem mais de uma das funções acima.

Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou uma cul- tura de célula que pode ser ou foi um recipiente para vetor(es) ou para in- 10 corporação de moléculas de ácido nucléico e/ou proteínas. Células hospe- deiras incluem progênie de uma célula hospedeira única, e a progênie pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA total) ao progenitor original devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas 15 com os polinucleotídeos da presente invenção. Uma "célula hospedeira iso- lada" é uma que foi fisicamente dissociada do organismo do qual ela foi deri- vada.

Os termos "indivíduo", "hospedeiro" e "sujeito" são usados inter- comutavelmente aqui para se referir a um vertebrado, de preferência um mamífero, com mais preferência um ser humano.

Os termos "transformação", "transfecção" e "transformação ge- nética" são usados intercomutavelmente aqui para se referir à inserção ou introdução de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, sem importar o método usado para inserção, por exemplo, lipofecção, transdu- 25 ção, infecção, eletroporação, precipitação de CaPU4, DEAE-dextrano, bom- bardeamento de partícula, etc. O polinucleotídeo exógeno pode ser mantido como um vetor não-integrado, por exemplo, um plasmídeo, ou, alternativa- mente, pode ser integrado ao genoma da célula hospedeira. A transforma- ção genética pode ser transiente ou estável.

A presente invenção emprega, a menos que de outro modo indi-

cado, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas re- combinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica.

Conforme aqui usado, a forma singular de qualquer termo pode alternativamente compreendera forma plural e vice versa. Todas as publica- ções e referências mencionadas aqui são incorporadas a título de referência em sua totalidade para qualquer propósito.

A presente invenção será agora descrita em relação ao Exemplo não-limitante que segue.

Exemplo PACIENTES E MÉTODOS

Para aumentar as chances da requerente em detectar SNPs relevantes no contexto de remodelagem ventricular, a requerente selecionou dois grupos de pacientes tendo fenótipos "extremos" após infarto do miocár- dio, a saber pacientes que se desenvolveram muito favoravelmente após 15 infarto (EF > 55%, média 60%) e pacientes que se desenvolveram desfavo- ravelmente (EF < 40%, média 29%). Cada grupo continha 22 pacientes.

DNA genômico foi extraído de células mononucleares de san- gue periférico seguindo separação Ficoll. Extração foi realizada com o estojo FIexiGene DNA (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade e a qualidade do DNA foram avaliadas através de eletroforese em gel de agarose.

O gene de MMP-9 integral foi sequenciado em todos os pacien- tes, incluindo promotor, seqüência de codificação e regiões não-traduzidas (total 9 kb), sem conhecer o fenótipo do paciente.

Níveis de MMP-9 no plasma foram determinados através de zi-

mografia de gelatina.

Com referência agora à Figura 1, o domínio hemopexina de MMP-9 com a posição de arginina destacada (circulada por uma linha ponti- lhada). Sua carga positiva líquida deve estar envolvida em interação de MMP-9 / TIMP-1. Uma modificação putativa pode ser esperada se arginina for substituída por glutamina, um aminoácido polar negativo. Conforme mostrado na Figura 2, domínios hemopexina de MMP-2 humana contêm uma glutamina na mesma posição. Uma estrutura 3D mostra que este aminoácido (circulado por uma linha pontilhada) é pro- vável estar envolvido em interações com inibidores.

Uma previsão da estrutura de MMP-9 com o software MAGOS é

mostrada nas Figuras 3A e 3B. Estão destacados (por pontos coloridos cla- ros) aminoácidos positivamente carregados.

A requerente mostra claramente uma mudança na polaridade da proteína quando o SNP muda o aminoácido glutamina (Figura 3B) para argi- nina (Figura 3A).

Experimentos de genotipificação adicionais para detectar a pre- sença de SNP7265 foram realizados em uma coorte maior do registro do Luxembourg Acute Myocardial Infaretion (LUCKY). Este registro foi aceito pelo comitê ético local e pelo comitê de proteção de dados. 229 pacientes 15 foram genotipificados usando a tecnologia Taqman® e a sonda que segue: GACACGCACGACGT CTT CCAGT ACC[A/G]AGGT GAGG GCTGAGGAGGATCCCTT. (SEQ ID NOS.: 9 (compreendendo A na posição

26 e SEQ ID NO.: 10 compreendendo G na posição 26)).

Todos os pacientes tiveram os níveis de MMP-9 no plasma do- cumentados (medidos através do Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) e 125 pacientes tiveram fração de ejeção documentada (medida a- través de ecocardiografia) 4 meses seguindo Ml.

RESULTADOS

1. Níveis de MMP-9 no plasma foram 660 pixels2 no grupo de EF baixa e 437 pixels2 no grupo de EF alta. Isto estava de acordo com o trabalho ante- rior da requerente mostrando que MMP-9 é um elemento de previsão de EF após infarto do miocárdio.

2. Cinco SNPs foram identificados com frequências diferentes entre ambos os grupos. Dentre esses, um SNP, localizado na posição 7265 da seqüência

de codificação mostra um SNP conhecido (rs2274756) com uma mudança de nucleotídeo Guanidina para Adenina produzindo uma mudança de ami- noácido Arginina para Glutamina. Esta mudança estava presente em 2 paci- entes no grupo de EF baixa e 6 pacientes no grupo de EF alta. Níveis de MMP-9 médios em pacientes heterozigotos A/G eram 215 pixels2, compara- do com 675 pixels2 em pacientes homozigotos G/G (p = 0,004). Esta mudan- ça de aminoácido está então relacionada com níveis de MMP-9 menores e 5 um melhor resultado clínico após Ml (pacientes com EF de 60% vs. 2 paci- entes com EF de 35%).

3. Experimentos de genotipificação em pacientes com Ml agudo revelaram uma associação estatisticamente significante entre a presença de SNP7265 e níveis de MMP-9 no plasma por um lado e entre SNP7265 e a fração de

ejeção por outro lado. Valores médios para MMP-9 no plasma eram 562,41 ng/mL nos pacientes não-mutados (n=176) vs. 404,55 ng/mL nos pacientes mutados (n=53) (P = 0,03). Vide Figura 4A. Isto indica que a presença de SNP7265 está associada com níveis de MMP-9 menores no plasma.

Valores médios para fração de ejeção foram 48,65% nos paci- entes não-mutados (n=93) vs. 52,23% nos pacientes mutados (n=32) (P = 0,04). Vide Figura 4B. Isto indica que a presença de SNP7265 está associa- da com fração de ejeção maior e então melhor resultado clínico após Ml.

Devido à sua posição estratégica no domínio tipo hemopexina de MMP-9 (vide desenhos abaixo) envolvido em ligação não apenas a fibras 20 de colágeno, mas também ao inibidor principal de MMP-9, Inibidor Tecidual de Metaloproteinase-1 (TIMP-1), este SNP é muito provável de desempe- nhar um papel-chave em desenvolvimento de remodelagem ventricular e insuficiência cardíaca.

Breve Descrição das Seqüências SEQ ID NO.: 1: Seqüência de DNA de MMP-9 de grupo de proteção - Ade- nina (A) na posição 7265.

SEQ ID NO.: 2: Seqüência de aminoácido de MMP-9 de grupo de proteção - Gln (Q) na posição 668.

SEQ ID NO.: 3. Seqüência de DNA de MMP-9 de grupo de risco (suscetível) - Guanidina (G) na posição 7265.

SEQ ID NO.: 4. Seqüência de aminoácido de MMP-9 de grupo de risco (sus- cetível) - Arq (R) na posição 668. SEQ ID NO.: 5: Seqüência de DNA do domínio hemopexina de MMP-9 de grupo de proteção - Adenina (A) na posição 443.

SEQ ID NO.: 6: Seqüência de aminoácido do domínio hemopexina de MMP- 9 de grupo de proteção - Gln (Q) na posição 148.

SEQ ID NO.: 7. Seqüência de DNA do domínio hemopexina de MMP-9 de um grupo de risco (suscetível) - Guanidina (G) na posição 443).

SEQ ID NO.: 8: Seqüência de aminoácido do domínio hemopexina de MMP- 9 de um grupo de risco (suscetível) - Arginina (R) na posição 148).

SEQ ID NO.: 9: sonda compreendendo A na posição 26.

SEQ ID NO.: 10: sonda compreendendo G na posição 26. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Centre de Recherche Public de Ia Santé

<120> MARCADOR E PLATAFORMA DE DIAGNÓSTICO PARA ELABORAÇÃO DE FÁRMACO EM

<130> WPP987 69

<150> US 60/884.979

<151> 2007-01-15

<160> 10

<210> 1 <211> 10353 <212> DNA <213> Homo sapiens

<4 00> 1

taatcctagc actttgggag gccaggtggg cagatcactt gagtcagaag ttcgaaacca 60

gcctggtcaa cgtagtgaaa ccccatctct actaaaaata caaaaaattt agccaggcgt 120

ggtggcgcac gcctataata ccagctactc gggaggctga ggcaggagaa ttgcttgaac 180

ccgggaggca gatgttgcag tgagccgaga tcacgccact gcactccagc ctgggtgaca 240

gagtgatact acacccccca aaaataaaat aaaataaata aatacaactt tttgagttgt 300

tagcaggttt ttcccaaata gggctttgaa gaaggtgaat atagaccctg cccgatgccg 360

gctggctagg aagaaaggag tgagggaggc tgctggtgtg ggaggcttgg gagggaggct 420

tggcataagt gtgataattg gggctggaga tttggctgca tggagcaggg ctggagaact 480

gaaagggctc ctatagatta ttttccccca tatcctgccc caatttgcag ttgaagaatc 540

ctaagctgac aaaggggaag gcatttactc caggttacac tgcagcttag agcccaataa 600

cctggtttgg tgattccaag ttagaatcat ggtcttttgg cagggtctcg ctctgttgcc 660

caggctggag tgcagtgaca taatcatggc tcactgtatc cttgaccttc tttctgggct 720

caagcaatcc tcccacctcg gcctcccaaa gtgctaagat tacaggaatg agccaccata 780 cctggccctg aatcttgggt cttggcctta gtaattaaaa ccaatcacca ccatccgttg 840

cggacttaca acctacagtg ttctaaacat tttatatgtt tgatctcatt taatcctcac 900

atcaatttag ggacaaagag ccccccaccc cccgtttttt tttttacagc tgaggaaaca 960 cttcaaagtg gtaagacatt tgcccgaggt cctgaaggaa gagagtaaag ccatgtctgc 1020

tgttttctag aggctgctac tgtccccttt actgccctga agattcagcc tgcggaagac 1080

^gggggttgc cccagtggaa ttccccagcc ttgcctagca gagcccattc cttccgcccc 1140

cagatgaagc agggagagga agctgagtca aagaaggctg tcagggaggg aaaaagagga 1200

cagagcctgg agtgtgggga ggggtttggg gaggatatct gacctgggag ggggtgttgc 1260

aaaaggccaa ggatgggcca gggggatcat tagtttcaga aagaagtctc agggagtctt 1320

ccatcacttt cccttggctg accactggag gctttcagac caagggatgg gggatccctc 1380

cagcttcatc cccctccctc cctttcatac agttcccaca agctctgcag tttgcaaaac 1440

cctacccctc ccctgagggc ctgcggtttc ctgcgggtct ggggtcttgc ctgacttggc 1500

agtggagact gcgggcagtg gagagaggag gaggtggtgt aagccctttc tcatgctggt 1560

gctgccacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac accctgaccc 1620

ctgagtcagc acttgcctgt caaggagggg tggggtcaca ggagcgcctc cttaaagccc 1680

ccacaacagc agctgcagtc agacacctct gccctcacca tgagcctctg gcagcccctg 1740

gtcctggtgc tcctggtgct gggctgctgc tttgctgccc ccagacagcg ccagtccacc 1800

cttgtgctct tccctggaga cctgagaacc aatctcaccg acaggcagct ggcagaggtg 1860

ggcaaacacc tagtctagag ttggggaggg ctgtccgtga gggtgttgag tgtcccagag 1920

aggatgcagg gcctcagagg agatgcttta ggggtgtgtt ggtggtgatg ggcgtatctg 1980

aagaacagag gtgtccaggg ttaggcagtg gggggtcttg tggaggcttt gagcagtgat 2040

ggccagaaat gggcaatggg gctttcctag gtgggaaatg ggaaatggtt tggggtgggg 2100

gaggcattgg agggttctgg ggtaagcata ggctgggagt gaacaggggc aaaccttatg 2160

cagctgtggg gtagaaatgg gctagaggca tccaggggtg agaaggagct gaggatgtct 2220

aaggagggga gatccctggg tggtcagaaa gcactggtgt ctggaaagca tttaatgctt 2280

tattaaatgt tagtccctgc tgggcatgac ggctcacact tgtaatccca gcactttggg 2340

aggctgaggt ggtaggatcg ctgaagctca ggagtttgag cccagcctag gcaacatagt 2400 aagatcctgt ctctacaaaa aaattaaaga aatagccagg cacagtgatg tgcacctgta 2460

gttccagcta tgcagaaggc tgagatggga ggatcgcttg agtccaggag gtccaggctg 2520

cagtgggctg ataccgtctc tccgaaaaag aaaaagaaaa aagactccct ccatgagtgt 2580

ctggagggag tcctttggcc ccagctgggc agagaaaggg gtcagagatc tggcatgtgt 2640

5 gtgtcccttc atccacagga atacctgtac cgctatggtt acactcgggt ggcagagatg 2700

cgtggagagt cgaaatctct ggggcctgcg ctgctgcttc tccagaagca actgtccctg 2760

cccgagaccg gtgagctgga tagcgccacg ctgaaggcca tgcgaacccc acggtgcggg 2820

gtcccagacc tgggcagatt ccaaaccttt gagggcgacc tcaagtggca ccaccacaac 2880

atcacctatt ggtgagccgg ggccgtgggg gcagcggggt ggggcgggga ggccaggtct 2940

ggctcttggg ccagcggtga acatgtcctg tcttggacgc gtccctgggt ttcactattt 3000

aatgtgtggc ccctggggag tgtccccacc tctgagcctc tgtttctcct tcagggaaat 3060

ggctcttgca atccaagtcc tcctgccagg gccattgtga gggtctaagt agacaaaaaa 3120

aaaaaaaaaa aaaacagtct ggaagcaatt tatagatgag agcgtggacg gcagagagca 3180

ttgtgtatgt tgaagtctct gcgatatggg gtgtccctgc tgccccgctc cagcctttca 3240

cttctgacct ccttcctctg gctcttacgc tacaggatcc aaaactactc ggaagacttg 3300

ccgcgggcgg tgattgacga cgcctttgcc cgcgccttcg cactgtggag cgcggtgacg 3360

ccgctcacct tcactcgcgt gtacagccgg gacgcagaca tcgtcatcca gtttggtgtc 3420

gcgggtgaga acgtgaggag ggaaaatcca agagacctgg gcggggtcag ggaagggagg 3480

accacggaga gcgtggaggc agcagtggcc ccggcttcct cttgcctgcc cgcgctgccc 3540

tggcttatac ggcccctcct gccagacagt gcacagggcc agggcgccag gctgggagag 3600

cttcgcgcag gcgggatttc agcccgcact tatttcggag cccttgcctt gggcagcgca 3660

caatctgcgc agcagtactc ggctaaccct cttcctctcg acctgtttct tcagagcacg 3720

gagacgggta tcccttcgac gggaaggacg ggctcctggc acacgccttt cctcctggcc 3780

ccggcattca gggagacgcc catttcgacg atgacgagtt gtggtccctg ggcaagggcg 3840

tcggtgagat tctgagtcct cctggcccct gattcccttc attctctccc actcatcacc 3900

cgccgcccta actccggtcc cccctcctcc tgcagtggtt ccaactcggt ttggaaacgc 3960

agatggcgcg gcctgccact tccccttcat cttcgagggc cgctcctact ctgcctgcac 4020 caccgacggt cgctccgacg gcttgccctg gtgcagtacc acggccaact acgacaccga 4080

cgaccggttt ggcttctgcc ccagcgagag tgagtgaggg ggctcgccga gggctggggg 4140

cgcccaccac ccttgatggt cctgggttct aattccagct ctgccactag tgctgtgtgg 4200

cctgcaattc accctcccgc actctgggcc caattttctc atctgagaaa tgatgagaga 4260

5 tgggatgaac tgcagaccat ccatgggtca aagaacagga cacacttggg ggttataatg 4320

tgctgtctcc gccttctccc cctttcccac atcctcctcg ccccaggact ctacacccag 4380

gacggcaatg ctgatgggaa accctgccag tttccattca tcttccaagg ccaatcctac 4440

tccgcctgca ccacggacgg tcgctccgac ggctaccgct ggtgcgccac caccgccaac 4500

tacgaccggg acaagctctt cggcttctgc ccgacccgag gtacctccac cctgtctacc 4560

aggttcagcc ccgccctctc atcatgtatt ggcccccaaa acgcggctct tccctcccat 4620

cagtttgtct ttccactctc attggtcctc aggacgaccg tgactccgcc cacctacacc 4680

acatttccac cactatccct gacttccaat ggccccgccc cagccactaa ggttcggcct 4740

tttctgccca gctggccgcc tcttccttgg tctggtgtcc caggcaccgc ccacgggtct 4800

agcctcttct caggagtgct ctacagcgcc ccctaggcca ccaagattgt ttagctccct 4860

gtcgggtcgg cccctgactc cttattggac tcatccatct ggctcatcca aggccttggg 4920

tctctccagc tgactcgacg gtgatggggg gcaactcggc gggggagctg tgcgtcttcc 4980

ccttcacttt cctgggtaag gagtactcga cctgtaccag cgagggccgc ggagatgggc 5040

gcctctggtg cgctaccacc tcgaactttg acagcgacaa gaagtggggc ttctgcccgg 5100

accaaggtag gcgtggtccc gcggctccgg ggctggggtt cccggcagtg gtggtggtgg 5160

ggtggccagg gctgggggct cggcccggcg ctcacgtctc aggctccctc tccctccagg 5220

atacagtttg ttcctcgtgg cggcgcatga gttcggccac gcgctgggct tagatcattc 5280

ctcagtgccg gaggcgctca tgtaccctat gtaccgcttc actgaggggc cccccttgca 5340

taaggacgac gtgaatggca tccggcacct ctatggtgag gcaggggcag ggatgggagg 5400

aggaggggaa agggcgtggc tgtgccacag taccaaagaa ttgggggttg gggatcgggg 54 60

gaggaacggg gcgtgcagga gaggtgggac ctcaacgtct gtctggaagc agagcctggg 5520

cccagtcgct gccatgtcag tgcttagagg tggtgataaa gagactctag agagagatag 5580

gtgtgacttc aaaagccagt ctactctggg catggtggct cacgcctcta atcccagggc 5640 tttgggagac ccaaggcggg aggattgctt aagcccagga gttccagacc agcctcggca 5700

acatagccag actcccatct ctacaaaaaa taaatgagca aggcgtgaag gcacatgtct 57 60

gtagtcctag ctactctgga ggctgaggtg ggaggatctc ttgagcccag gagttcgagg 5820

ctgtagtgag ctatgattgc accactgcat tccatcctgg gccatagagg atgtcgctta 5880

aaacgaaaaa gaagaagaag aaagtcctgt ggtttgggaa gggaggctga gtgaggaggg 5940

gcctgtgtgc cagaggaggc ttcactgaga agcttagggg agcagatgtt ctaggggtac 6000

agaggtatgc aggaatagga agagtctcac cccgtgtctc tttttaggtc ctcgccctga 6060

acctgagcca cggcctccaa ccaccaccac accgcagccc acggctcccc cgacggtctg 6120

ccccaccgga ccccccactg tccacccctc agagcgcccc acagctggcc ccacaggtcc 6180

cccctcagct ggccccacag gtccccccac tgctggccct tctacggcca ctactgtgcc 6240

tttgagtccg gtggacgatg cctgcaacgt gaacatcttc gacgccatcg cggagattgg 6300

gaaccagctg tatttgttca aggatgggtg aggaggcggg gttgtgtgga tgcgggaggg 6360

ggctttgcgg aggggctgcc cgtcccttcc cgcccactgg ccctgtgtcc aaggcttaga 6420

gcccgtcctt tccctcctcg ctttctcagg aagtactggc gattctctga gggcaggggg 6480

agccggccgc agggcccctt ccttatcgcc gacaagtggc ccgcgctgcc ccgcaagctg 6540

gactcggtct ttgaggagcg gctctccaag aagcttttct tcttctctgg ttagttacct 6600

actttccctc ccccgcccgg tcaatcccca tcagtcaagg aggctcaaga gaccatcgat 66'60

aacccacgaa acgtcttgtg cgttttagaa aaatacgccc cctggcggac gcagtttagc 6720

aaacgtaggg gcggctgagt ttctgccccc tcctctccac gccctcgcgt cgctctaccc 6780

agcgcctctg cccctgggtt gcagggactg cgggcacgcg ggctaggaaa ggcctcgccg 6840

gaatctccct cctcgcgttc taggagtacg tgctccctct gcgcccccaa accgacgtga 6900

ccctcctccc ctgcagggcg ccaggtgtgg gtgtacacag gcgcgtcggt gctgggcccg 6960

aggcgtctgg acaagctggg cctgggagcc gacgtggccc aggtgaccgg ggccctccgg 7 020

agtggcaggg ggaagatgct gctgttcagc gggcggcgcc tctggaggtg agcgccgccg 7080

cggccgccgg cagggggagc ccgggcgccg tcggtccgtc cgctagccgg ctcagcacct 7140

gtctcctccg cgcctgcccg caggttcgac gtgaaggcgc agatggtgga tccccggagc 7200

gccagcgagg tggaccggat gttccccggg gtgcctttgg acacgcacga cgtcttccag 7260 taccaaggtg agggctgagg aggatccctt cgtgagacac cacactaagc tcctcttagt 7320

gagtggtcaa attctgagcg aggaagaaaa agcccttgga aatggaaaca aatgccccag 7380

cacagacaag atcccagcag aggcagaggc cttctccagg tcatttagga agtcagggat 7440

gcaaccaaga ccaggaccca gatttcctgc ctccccggct ggaagctctt tctccttcag 7500

5 tacaggacgg caggtggttt gtatggaagc tcagttatta gacaacagtc atcaagtgcc 7560

gataatgtgc caggcactgt gctacaggga gagataagac aattcacagc tctgtgactt 7620

tgggcaagtc actgcttctc tactcttcga gcctcagttt ccccatctgt aatatgggga 7680

ctatagctgg aattacactt gacttccctt tcttaccagt cacatccaaa cagttgacaa 77 40

ggtgaacaag atttcctgcc accaaaatct ttttcgagtc tgtcattttt tttgccatct 7800

tctttataaa caccccagcc caaaccatac tggctgtcca ggacctttaa caaattccat 7860

gagattagag agggggtagg agtgaagggc aatggtcttg ggagtgaccc cagatgaatt 7920

ccaaggtcaa agaaattaag aggatctgac actccacccc cgtgttctca tctcttccca 7980

ctcctcctgt tatttactct gctccaccca cactggctgc tctttgaaca gatcaaggtc 8040

attcctagct tacagccttt gtgccagttg ttccctctgt ctggaaagct tcccctccag 8100

attgtcactg ggccatccca ctgtcttcct tcaggtttca gtgctaaggc cattgcttca 8160

atgaggcctt ctttgatgct tattatctat ttacttgttt ttattttctc catagctttc 8220

tatattttct ttttttttct tttttctttt tttttttttt tgagatggag tcttgctctg 8280

tcgcccaggc tggagtgcag tggcacgatc tcagctcact gcaacctccg cctcccgggt 8340

tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccaa gtagctggga ttacaggtgc ctgccaccac 8400

gcttggctaa ttttttgtat tttttagtag agacggggtt tcaccatctt ggccaggctg 8460

gtcttgaact cctgacctcg tgatccaccc gcctcagcct cccaaagtgc tgggattaca 8520

ggcatgagcc accgcaccca gccgctttct atattttcaa aaccaatctc atttatttat 8580

gtgtttgctt aattgtctct tgcctcacta gagtgtaagc accaagataa ttgagatcat 8640

gcctgcattt tttctgctta tccccagtat cttgaacaaa gcacatagta gatgctcagt 8700

aaatgatgaa tgaacagatt tgttcaatga atgagcgttg aatgaattgt tctgagcatt 8760

aagatagttg gtctattcat ttgttaattc attcacaaaa tgtgtatggt gtacctactg 8820

tgtgctaggc tctgtggcag tgctttgggc actgaggtct gtgccctcca gcatctcaca 8880 gaacctcaca gcatctcaca ggttgggggg atggaggtça tatgtgaaaa ccttagaaag 8940

ttctagaaat ggcagaagag atggttgtca agatcttgtt cctatttctg tatatgtggg 9000

agaattagaa tcactcctct tatgcctgcc tgtctcctgc agagaaagcc tatttctgcc 9060

aggaccgctt ctactggcgc gtgagttccc ggagtgagtt gaaccaggtg gaccaagtgg 9120

gctacgtgac ctatgacatc ctgcagtgcc ctgaggacta gggctcccgt cctgctttgg 9180

cagtgccatg taaatcccca ctgggaccaa ccctggggaa ggagccagtt tgccggatac 9240

aaactggtat tctgttctgg aggaaaggga ggagtggagg tgggctgggc cctctcttct 9300

cacctttgtt ttttgttgga gtgtttctaa taaacttgga ttctctaacc tttagaagca 9360

gactttattt atatatgtat gcacgtatgt atgcatgtat gtatttaact gatagagtgc 9420

aaaaaaaaaa aaaaaaagga aaaacaaata actgatagag tgctttctac gtgccagaaa 9480

gtgttctagg ccgggcacgg tagctcactc ctagcacttt gggaggccga ggcaggcgga 9540

tcacgaggtc aggagattga gaccaccctg gctaacacga tgaaaccctg tctctactaa 9600

aaaaaaaata gaaaaaatta gccgggcgtg gtggcgggcg cctgtagtcc cagctacttg 9660

ggaggctgag gcaggagaat ggcttgaacc tgggaggtgg agcttgcagt gagccgagat 9720

cacgccactg cactccagcc tgggaggtgg agcttgcagt gagccgagat cacgccactg 9780

cactccagcc tgggtgactg agcaagactc cgtctcaaaa aaaaaaaaaa tagtgttcta 9840

ggcactttgt aaatgttaac atattcaatc attcctgtta ggaaagtatg atgtgattat 99Ò0

ttctatttta cagtcaagga aatgatcaac ctgtttattc attcatcaaa catttattga 9960

gcccctacat ggagccaggc cctgtactgg gcaatgggga tagagaaatg agttagactt 10020

tagaatgcat aagattcccc ttggaacttg cttaaaatgc aactccaggc tccacctcca 10080

gagagtctga cctatttaca agggtgattc tatggctggt ggcggtggga tcacacttgg 10140

ggagtgtgca gtgcatgatc ttttattcta caataatggt gtgtgtgtgt gcacatgtgt 10200

gtgtgtctgt gttgtggttg aggtccagga acgtttctca gtcaagatga catctgaacc 10260

ggaactgaat cagaaaggat gaacgagctt cttcctgtcc aagggacaat cttcttacag 10320

ggtaatttac caagaaccac taaacctaaa aat 10353 <210> 2 <211> 707 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ser Leu Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Cys 1 5 10 15

Cys Phe Ala Ala Pro Arg Gln Arg Gln Ser Thr Leu Val Leu Phe Pro 20 25 30

Gly Asp Leu Arg Thr Asn Leu Thr Asp Arg Gln Leu Ala Glu Glu Tyr 35 40 45

Leu Tyr Arg Tyr Gly Tyr Thr Arg Val Ala Glu Met Arg Gly Glu Ser 50 55 60

Lys Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Leu Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu 65 70 75 80

Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr 85 90 95

Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly 100 105 110

Asp Leu Lys Trp His His His Asn Ile Thr Tyr Trp Ile Gln Asn Tyr 115 120 125

Ser Glu Asp Leu Pro Arg Ala Val Ile Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala 130 135 140

Phe Ala Leu Trp Ser Ala Val Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr 145 150 155 160

Ser Arg Asp Ala Asp Ile Val Ile Gln Phe Gly Val Ala Glu His Gly 165 170 175

Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe 180 185 190 Pro Pro Gly Pro Gly Ile Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu 195 200 205

Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly Val Val Val Pro Thr Arg Phe Gly Asn 210 215 220

Ala Asp Gly Ala Ala Cys His Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser 225 230 235 240

Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Leu Pro Trp Cys 245 250 255

Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly Phe Cys Pro 260 265 270

Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Gln Asp Gly Asn Ala Asp Gly Lys Pro Cys 275 280 285

Gln Phe Pro Phe Ile Phe Gln Gly Gln Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr 290 295 300

Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr 305 310 315 320

Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly Phe Cys Pro Thr Arg Ala Asp Ser Thr 325 330 335

Val Met Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val Phe Pro Phe Thr 340 345 350

Phe Leu Gly Lys Glu Tyr Ser Thr Cys Thr Ser Glu Gly Arg Gly Asp 355 360 365

Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Asn Phe Asp Ser Asp Lys Lys 370 375 380

Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala 385 390 395 400

His Glu Phe Gly His Ala Leu Gly Leu Asp His Ser Ser Val Pro Glu 405

410

415

Ala Leu Met Tyr Pro Met Tyr Arg Phe Thr Glu Gly Pro Pro Leu His 420 425 430

Lys Asp Asp Val Asn Gly Ile Arg His Leu Tyr Gly Pro Arg Pro Glu 435 440 445

Pro Glu Pro Arg Pro Pro Thr Thr Thr Thr Pro Gln Pro Thr Ala Pro 450 455 460

Pro Thr Val Cys Pro Thr Gly Pro Pro Thr Val His Pro Ser Glu Arg 465 470 475 480

Pro Thr Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro

485 490 495

Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr Ala Thr Thr Val Pro Leu Ser Pro Val 500 505 510

Asp Asp Ala Cys Asn Val Asn Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly 515 520 525

Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu 530 535 540

Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp 545 550 555 560

Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Val Phe Glu Glu Arg Leu Ser

565 570 575

Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly 580 585 590

Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala 595 600 605

Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met 610 615 620 Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln 625 630 635 640

Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly 645 650 655

Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val Phe Gln Tyr Gln Glu Lys Ala Tyr 660 665 670

Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu 675 680 685

Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys 690 695 700

Pro Glu Asp 705

<210> 3 <211> 10353 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 3

taatcctagc actttgggag gccaggtggg cagatcactt gagtcagaag ttcgaaacca gcctggtcaa cgtagtgaaa ccccatctct actaaaaata caaaaaattt agccaggcgt 20 ggtggcgcac gcctataata ccagctactc gggaggctga ggcaggagaa ttgcttgaac ccgggaggca gatgttgcag tgagccgaga tcacgccact gcactccagc ctgggtgaca gagtgatact acacccccca aaaataaaat aaaataaata aatacaactt tttgagttgt tagcaggttt ttcccaaata gggctttgaa gaaggtgaat atagaccctg cccgatgccg gctggctagg aagaaaggag tgagggaggc tgctggtgtg ggaggcttgg gagggaggct 25 tggcataagt gtgataattg gggctggaga tttggctgca tggagcaggg ctggagaact gaaagggctc ctatagatta ttttccccca tatcctgccc caatttgcag ttgaagaatc ctaagctgac aaaggggaag gcatttactc caggttacac tgcagcttag agcccaataa

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600 cctggtttgg tgattccaag ttagaatcat ggtcttttgg cagggtctcg ctctgttgcc 660

caggctggag tgcagtgaca taatcatggc tcactgtatc cttgaccttc tttctgggct 720

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cctggccctg aatcttgggt cttggcctta gtaattaaaa ccaatcacca ccatccgttg 840

5 cggacttaca acctacagtg ttctaaacat tttatatgtt tgatctcatt taatcctcac 900

atcaatttag ggacaaagag ccccccaccc cccgtttttt tttttacagc tgaggaaaca 960

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agggggttgc cccagtggaa ttccccagcc ttgcctagca gagcccattc cttccgcccc 1140

cagatgaagc agggagagga agctgagtca aagaaggctg tcagggaggg aaaaagagga 1200

cagagcctgg agtgtgggga ggggtttggg gaggatatct gacctgggag ggggtgttgc 1260

aaaaggccaa ggatgggcca gggggatcat tagtttcaga aagaagtctc agggagtctt 1320

ccatcacttt cccttggctg accactggag gctttcagac caagggatgg gggatccctc 1380

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cctacccctc ccctgagggc ctgcggtttc ctgcgggtct ggggtcttgc ctgacttggc 1500

agtggagact gcgggcagtg gagagaggag gaggtggtgt aagccctttc tcatgctggt 1560

gctgccacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac accctgaccc 1620

ctgagtcagc acttgcctgt caaggagggg tggggtcaca ggagcgcctc cttaaagccc 1680

ccacaacagc agctgcagtc agacacctct gccctcacca tgagcctctg gcagcccctg 1740

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cttgtgctct tccctggaga cctgagaacc aatctcaccg acaggcagct ggcagaggtg 1860

ggcaaacacc tagtctagag ttggggaggg ctgtccgtga gggtgttgag tgtcccagag 1920

aggatgcagg gcctcagagg agatgcttta ggggtgtgtt ggtggtgatg ggcgtatctg 1980

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cagctgtggg gtagaaatgg gctaaaggca tccaggagtg agaaggagct gaggatgtct 2220 aaggagggga gatccctggg tggtcagaaa gcactggtgt ctggaaagca tttaatgctt 2280

tattaaatgt tagtccctgc tgggcatgac ggctcacact tgtaatccca gcactttggg 2340

aggctgaggt ggtaggatcg ctgaagctca ggagtttgag cccagcctag gcaacatagt 2400

aagatcctgt ctctacaaaa aaattaaaga aatagccagg cacagtgatg tgcacctgta 2460

gttccagcta tgcagaaggc tgagatggga ggatcgcttg agtccaggag gtccaggctg 2520

cagtgggctg ataccgtctc tccgaaaaag aaaaagaaaa aagactccct ccatgagtgt 2580

ctggagggag tcctttggcc ccagctgggc agagaaaggg gtcagagatc tggcatgtgt 2640

gtgtcccttc atccacagga atacctgtac cgctatggtt acactcgggt ggcagagatg 2700

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cccgagaccg gtgagctgga tagcgccacg ctgaaggcca tgcgaacccc acggtgcggg 2820

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ggctcttggg ccagcggtga acatgtcctg tcttggacgc gtccctgggt ttcactattt 3000

aatgtgtggc ccctggggag tgtccccacc tctgagcctc tgtttctcct tcagggaaat 3060

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aaaaaaaaaa aaaacagtct ggaagcaatt tatagatgag agcgtggacg gcagagagca 3180

ttgtgtatgt tgaagtctct gcgatatggg gtgtccctgc tgccccgctc cagcctttca 3240

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cctgcaattc accctcccgc actctgggcc caattttctc atctgagaaa tgatgagaga 4260

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aggaggggaa agggcgtggc tgtgccacag taccaaagaa ttgggggttg gggatcgggg 5460 gaggaacggg gcgtgcagga gaggtgggac cccagtcgct gccatgtcag tgcttagagg gtgtgacttc aaaagccagt ctactctggg tttgggagac ccaaggcggg aggattgctt 5 acatagccag actcccatct ctacaaaaaa gtagtcctag ctactctgga ggctgaggtg ctgtagtgag ctatgattgc accactgcat aaacgaaaaa gaagaagaag aaagtcctgt gcctgtgtgc cagaggaggc ttcactgaga 10 agaggtatgc aggaatagga agagtctcac acctgagcca cggcctccaa ccaccaccac ccccaccgga ccccccactg tccacccctc cccctcagct ggccccacag gtccccccac tttgagtccg gtggacgatg cctgcaacgt 15 gaaccagctg tatttgttca aggatgggtg ggctttgcgg aggggctgcc cgtcccttcc gcccgtcctt tccctcctcg ctttctcagg agccggccgc agggcccctt ccttatcgcc gactcggtct ttgaggagcg gctctccaag 20 actttccctc ccccgcccgg tcaatcccca aacccacgaa acgtcttgtg cgttttagaa aaacgtaggg gcggctgagt ttctgccccc agcgcctctg cccctgggtt gcagggactg gaatctccct cctcgcgttc taggagtacg 25 ccctcctccc ctgcagggcg ccaggtgtgg aggcgtctgg acaagctggg cctgggagcc agtggcaggg ggaagatgct gctgttcagc

ctcaacgtct gtctggaagc agagcctggg 5520 tggtgataaa gagactctag agagagatag 5580

catggtggct cacgcctcta atcccagggc 5640

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ctcctcctgt tatttactct gctccaccca cactggctgc tctttgaaca gatcaaggtc 8040

attcctagct tacagccttt gtgccagttg ttccctctgt ctggaaagct tcccctccag 8100

attgtcactg ggccatccca ctgtcttcct tcaggtttca gtgctaaggc cattgcttca 8160

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tatattttct ttttttttct tttttctttt tttttttttt tgagatggag tcttgctctg 8280

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gaacctcaca gcatctcaca ggttgggggg atggaggtga tatgtgaaaa ccttagaaag 8940

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cacctttgtt ttttgttgga gtgtttctaa taaacttgga ttctctaacc tttagaagca 9360

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aaaaaaaaaa aaaaaaagga aaaacaaata actgatagag tgctttctac gtgccagaaa 9480

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aaaaaaaata gaaaaaatta gccgggcgtg gtggcgggcg cctgtagtcc cagctacttg 9660

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cactccagcc tgggtgactg agcaagactc cgtctcaaaa aaaaaaaaaa tagtgttcta 9840

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gcccctacat ggagccaggc cctgtactgg gcaatgggga tagagaaatg agttagactt 10020

tagaatgcat aagattcccc ttggaacttg cttaaaatgc aactccaggc tccacctcca 10080

gagagtctga cctatttaca agggtgattc tatggctggt ggcggtggga tcacacttgg 10140

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Met Ser Leu Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Cys 15 10 15

Cys Phe Ala Ala Pro Arg Gln Arg Gln Ser Thr Leu Val Leu Phe Pro

20 25 30

Gly Asp Leu Arg Thr Asn Leu Thr Asp Arg Gln Leu Ala Glu Glu Tyr 35 40 45

Leu Tyr Arg Tyr Gly Tyr Thr Arg Val Ala Glu Met Arg Gly Glu Ser 50 55 60

Lys Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Leu Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu 65 70 75 80

Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr 85 90 95

Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly 100 105 110

Asp Leu Lys Trp His His His Asn He Thr Tyr Trp He Gln Asn Tyr 115 120 125

Ser Glu Asp Leu Pro Arg Ala Val He Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala 130 135 140

Phe Ala Leu Trp Ser Ala Val Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr 145 150 155 160

Ser Arg Asp Ala Asp He Val He Gln Phe Gly Val Ala Glu His Gly

10353 165

170

175

Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe 180 185 190

Pro Pro Gly Pro Gly He Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu 195 200 205

Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly Val Val Val Pro Thr Arg Phe Gly Asn 210 215 220

Ala Asp Gly Ala Ala Cys His Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser 225 230 235 240

Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Leu Pro Trp Cys

245 250 255

Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly Phe Cys Pro 260 265 270

Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Gln Asp Gly Asn Ala Asp Gly Lys Pro Cys 275 280 285

Gln Phe Pro Phe Ile Phe Gln Gly Gln Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr 290 295 300

Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr 305 310 315 320

Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly Phe Cys Pro Thr Arg Ala Asp Ser Thr

325 330 335

Val Met Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val Phe Pro Phe Thr 340 345 350

Phe Leu Gly Lys Glu Tyr Ser Thr Cys Thr Ser Glu Gly Arg Gly Asp 355 360 365

Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Asn Phe Asp Ser Asp Lys Lys 370 375 380 Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala 385 390 395 400

His Glu Phe Gly His Ala Leu Gly Leu Asp His Ser Ser Val Pro Glu 405 410 415

Ala Leu Met Tyr Pro Met Tyr Arg Phe Thr Glu Gly Pro Pro Leu His 420 425 430

Lys Asp Asp Val Asn Gly Ile Arg His Leu Tyr Gly Pro Arg Pro Glu 435 440 445

Pro Glu Pro Arg Pro Pro Thr Thr Thr Thr Pro Gln Pro Thr Ala Pro 450 455 460

Pro Thr Val Cys Pro Thr Gly Pro Pro Thr Val His Pro Ser Glu Arg 465 470 475 480

Pro Thr Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro 485 490 495

Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr Ala Thr Thr Val Pro Leu Ser Pro Val 500 505 510

Asp Asp Ala Cys Asn Val Asn Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly 515 520 525

Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu 530 535 540

Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp 545 550 555 560

Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Val Phe Glu Glu Arg Leu Ser 565 570 575

Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly 580 585 590

Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala 595 600 605

Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met 610 615 620

Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln 625 630 635 640

Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly 645 650 655

Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val Phe Gln Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr 660 665 670

Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu 675 680 685

Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys 690 695 700

Pro Glu Asp

705

<210> 5

<211> 552

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 5

ttcgacgcca tcgcggagat tgggaaccag ctgtatttgt tcaaggatgg gaagtactgg

cgattctctg agggcagggg gagccggccg cagggcccct tccttatcgc cgacaagtgg

cccgcgctgc cccgcaagct ggactcggtc tttgaggagc ggctctccaa gaagcttttc

ttcttctctg ggcgccaggt gtgggtgtac acaggcgcgt cggtgctggg cccgaggcgt

ctggacaagc tgggcctggg agccgacgtg gcccaggtga ccggggccct ccggagtggc

agggggaaqa tgctgctgtt cagcgggcgg cgcctctgga ggttcgacgt gaaggcgcag

atggtggatc cccggagcgc cagcgaggtg gaccggatgt tccccggggt gcctttggac

60

120

180

240

300

360

420 acgcacgacg tcttccagta ccaagagaaa gcctatttct gccaggaccg cttctactgg cgcgtgagtt cccggagtga gttgaaccag gtggaccaag tgggctacgt gacctatgac atcctgcagt gc <210> 6 <211> 184

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 6

Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys Asp

1 5 10 15

Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly 20 25 30

Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp 35 40 45

Ser Val Phe Glu Glu Arg Leu Ser Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly 50 55 60

Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg 65 70 75 80

Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala 85 90 95

Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu 100 105 110

Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser 115 120 125

Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val 130 135 140

Phe Gln Tyr Gln Glu Lys Ala Tyr Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp

480

540

552 145 150 155 160

Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr 165 170 175

Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys

180

<210> 7

<211> 552

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

ttcgacgcca tcgcggagat tgggaaccag ctgtatttgt tcaaggatgg gaagtactgg cgattctctg agggcagggg gagccggccg cagggcccct tccttatcgc cgacaagtgg cccgcgctgc cccgcaagct ggactcggtc tttgaggagc ggctctccaa gaagcttttc ttcttctctg ggcgccaggt gtgggtgtac acaggcgcgt cggtgctggg cccgaggcgt 15 ctggacaagc tgggcctggg agccgacgtg gcccaggtga ccggggccct ccggagtggc agggggaaga tgctgctgtt cagcgggcgg cgcctctgga ggttcgacgt gaaggcgcag atggtggatc cccggagcgc cagcgaggtg gaccggatgt tccccggggt gcctttggac acgcacgacg tcttccagta ccgagagaaa gcctatttct gccaggaccg cttctactgg cgcgtgagtt cccggagtga gttgaaccag gtggaccaag tgggctacgt gacctatgac 20 atcctgcagt gc <210> 8 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens

<4 00> 8

Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys Asp 15 10 15

60

120

180

240

300

360

420

480

540

552 Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly 20 25 30

Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp 35 40 45

Ser Val Phe Glu Glu Arg Leu Ser Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly 50 55 60

Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg 65 70 75 80

Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala 85 90 95

Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu 100 105 110

Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser 115 120 125

Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val 130 135 140

Phe Gln Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp 145 150 155 160

Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr 165 170 175

Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys 180

<210> 9 <211> 51 <212> DNA

<213> artificial <22 0> <223> Seqüência da Sonda : A na posição 26 <400> 9

gacacgcacg acgtcttcca gtaccaaggt gagggctgag gaggatccct t <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> Seqüência da sonda : G na posição 26 <4 00> 10

gacacgcacg acgtcttcca gtaccgaggt gagggctgag gaggatccct

Claims (25)

1. Método para determinação da susceptibilidade de um indiví- duo a uma condição cardíaca, pós-infarto do miocárdio, compreendendo de- tecção da presença de uma mudança de aminoácido na seqüência do domí- nio hemopexina de MMP-9 (Metaloproteinase de Matriz 9), a presença de uma mudança de aminoácido no dito domínio sendo indicativa de susceptibi- lidade à dita condição cardíaca, pós-infarto do miocárdio.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüência que é detectada compreende ou codifica um resíduo de aminoácido ou Glu- tamina (GIn) ou Arginina (Arg) em uma posição correspondendo à posição 148 da SEQ ID NO.: 6 ou 8 ou um resíduo em uma posição correspondendo à posição 668 da SEQ ID NO.: 2 ou 4.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a presença de um resíduo Arginina na dita posição é indicativa de um indivíduo sob risco de sofrer de ou desenvolver uma condição cardíaca pós-IM.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a presença de um resíduo Glutamina na dita posição é indicativa de um efeito protetor.

5. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a identidade de um SNP (A/G) é detectada em uma posição correspon- dendo à posição 443 da SEQ ID NO.: 5 ou 7 ou em uma posição correspon- dendo à posição 7265 da SEQ ID NO.: 1 ou 3.

6. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a seqüência detectada é um polinucleotídeo selecionado do grupo con- sistindo nas SEQ ID NOs.: 1, 3, 5 e/ou 7.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, em que a seqüência detectada é uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs.: 2, 4, 6 e/ou 8.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a presença de um resíduo de aminoácido Glutamina na dita posição é indicativa de uma Fração de Ejeção alta (EF)1 atividade de MMP-9 de fase inicial baixa, pós- infarto Miocárdio e reduzida uma chance de desenvolvimento de insuficiên- cia cardíaca.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a MMP-9 de fase inicial baixa é medida até 24 horas após o indivíduo ter sofrido um Infar- to do Miocárdio.

10. Método de avaliação para pacientes infartados compreen- dendo determinação da presença ou ausência da mudança de aminoácido na seqüência do domínio hemopexina de MMP-9, como definido em qual- quer uma das reivindicações anteriores.

11. Método de avaliação para uma população não-infartada compreendendo determinação da presença ou ausência da mudança de a- minoácido, como definido em qualquer uma das reivindicações 1-9, na se- qüência do domínio hemopexina de MMP-9.

12. Método de estabelecimento de um diagnóstico e/ou prog- nóstico em pacientes com infarto do miocárdio, através da correlação de uma mudança de aminoácido na seqüência do domínio hemopexina de MMP-9, como definido em qualquer uma das reivindicações 1-9, com níveis menores de atividade de MMP-9, que indica um resultado clínico melhor a- pós infarto do miocárdio.

13. Método de tratamento de inibição de remodelagem ventricu- Iar e o tratamento e/ou profilaxia de insuficiência cardíaca através da corre- lação de uma mudança de aminoácido no domínio hemopexina de metalo- proteinase de matriz-9 (MMP-9), como definido em qualquer uma das reivin- dicações 1-9, com níveis de MMP-9 menores, o que indica um melhor resul- tado clínico após infarto do miocárdio.

14. Método de previsão da ocorrência de remodelagem ventricu- Iar em pacientes seguindo infarto do miocárdio, através da correlação de uma mudança de aminoácido no domínio hemopexina de metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9), como definido em qualquer uma das reivindicações 1- 9, com níveis de MMP-9 menores, o que indica um melhor resultado clínico após infarto do miocárdio.

15. Método de identificação de agonistas ou antagonis- tas/inibidores de MMP-9, ou moléculas capazes de bloquear atividade de MMP-9, ou reforço de sua interação com TIMP-1 ou redução da atividade ou expressão detectável de MMP-9, compreendendo elaboração de uma molé- cula ou Iigante que vai interagir com o domínio hemopexina mudado de me- taloproteinase de matriz-9 (MMP-9), como definido em qualquer uma das reivindicações 1-9.

16. Método para ensaio quanto à presença de um primeiro poli- nucleotídeo tendo um SNP associado com susceptibilidade a uma condição cardíaca em uma amostra compreendendo: contato da dita amostra com um segundo polinucleotídeo, em que o dito segundo polinucleotídeo compreen- de uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 7, 9 e/ou 10 e os complementos das ditas seqüências, em que o dito segundo polinucleotídeo hibridiza para o dito primeiro polinucleo- tídeo sob condições estringentes.

17. Método de ensaio quanto à presença de um polipeptídio co- dificado por um polinucleotídeo isolado tendo um SNP no domínio hemope- xina de MMP-9 associado com susceptibilidade a uma condição cardíaca em uma amostra, o dito método compreendendo contato da amostra com um anticorpo que se liga especificamente ao dito polipeptídio codificado.

18. Método de identificação de um agente que altera a expres- são de um polinucleotídeo contendo um SNP associado com susceptibilida- de a uma condição cardíaca compreendendo: (a) contato de um polinucleotídeo com um agente a ser testado sob condi- ções para expressão, em que o polinucleotídeo compreende (1) um SNP no domínio hemopexina de MMP-9 associado com susceptibilidade a uma con- dição cardíaca e (2) uma região promotora operavelmente ligada a um gene repórter; (b) avaliação do nível de expressão do gene repórter na presença do agente; (c) avaliação do nível de expressão do gene repórter na ausência do agente; e (d) comparação do nível de expressão na etapa (b) com o nível de expres- são na etapa (c) quanto a diferenças que indiquem que expressão foi altera- da pelo agente.

19. Método para diagnóstico da susceptibilidade a uma condição cardíaca em um indivíduo compreendendo: a) obtenção de uma amostra de polinucleotídeo a partir do dito indivíduo; e b) análise da amostra de polinucleotídeo quanto à presença ou ausência de um haplotipo, em que a presença do haplotipo corresponde a uma suscepti- bilidade à dita condição cardíaca; em que o haplotipo compreende um alelo resultante de um SNP no domínio hemopexina de MMP-9 associado com susceptibilidade a uma condição cardíaca.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a condição cardíaca é pelo menos uma selecionada do grupo consistindo em: infarto do miocárdio, síndrome coronária aguda, car- diomiopatia isquêmica, cardiomiopatia não-isquêmica e insuficiência cardía- ca congestiva.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a condi- ção cardíaca é insuficiência cardíaca congestiva.

22. Vetor compreendendo um polinucleotídeo isolado contendo um SNP no domínio hemopexina de MMP-9 associado com susceptibilidade a uma condição cardíaca, em que o dito polinucleotídeo isolado é operavelmen- te ligado a uma seqüência reguladora, de preferência um promotor adequado.

23. Célula hospedeira, compreendendo o vetor como definido na reivindicação 22.

24. Animal transgênico compreendendo um polinucleotídeo ten- do um SNP no domínio hemopexina de MMP-9 associado com susceptibili- dade a uma condição cardíaca.

25. Kit para ensaio de uma amostra quanto à presença de um primeiro polinucleotídeo compreendendo um SNP no domínio hemopexina de MMP-9 associado com susceptibilidade a uma condição cardíaca com- preendendo em recipientes separados: a) um ou mais segundos polinucleotídeos marcados compreendendo uma seqüência selecionada do grupo consistindo em seqüências identificadas por SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 7, 9 e/ou 10 e seus complementos; e b) reagentes para detecção do dito marcador.