BRPI0806697A2 - Células não símias para o crescimento de vírus de síndrome respiratória e reprodutiva suína (prrs) - Google Patents

Description

CÉLULAS NÃO SÍMIAS PARA O CRESCIMENTO DE VÍRUS DE SÍNDROME RESPIRATÓRIA E REPRODUTIVA SUÍNA (PRRS)

REFERÊNCIAS CRUZADAS AOS PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido reivindica o benefício do Pedido Número de 5 Série US 60884782 depositado em 12 de janeiro de 2007 e US 60956597 depositado em 17 de agosto de 2007, cada um é incorporado aqui por referência à extensão não incompatível com o mesmo.

DECLARAÇÃO EM PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO FEDERALMENTE PATROCINADO

Não aplicável FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína (PRRS) é uma doença viral de suíno que causa grande perda econômica anual comparada a qualquer doença infecciosa atual ou precedente que tem sempre afligido a indústria da carne suína. PRRS, também conhecida como "Doença de Suínos Misteriosa", a Síndrome Respiratória e de Infertilidade Suína (SIRS), e "Doença da Orelha Azul," foi primeiramente detectada na América do Norte em 1987 e na Europa em 1990. Desde então, PRRS tem se tornado uma ameaça principal às indústrias de suínos na maioria das áreas de produção de porco no mundo inteiro, exceto Austrália. PRRS tem seu efeito mais pronunciado em leitões novos e recém-nascidos. Até 20-30% dos leitões nas ninhadas das porcas infectadas são natimortos, e até 8 0% dos leitões em rebanhos infectados morrem antes de desmamar. As conseqüências econômicas da doença, consequentemente, são devastadoras (veja Patente US 5476778 por Chladek e col.). Em um estudo financiado em parte pela National Pork Board, notou-se que as perdas atribuídas a PRRS excederam $560 milhões somente nos Estados Unidos (Neumann EJ e col., 2005) .

A pesquisa de PRRS e desenvolvimento de abordagens diagnosticas e terapêuticas, incluindo novas vacinas e 5 tecnologia de produção de vacina, é confinada pela disponibilidade restrita de opções para cultivar o vírus de PRRS in vitro. Previamente, as células símias foram o único tipo de linhagem celular disponível conhecido para sustentar o crescimento de PRRS para a produção de vacina. 10 A linhagem celular símia MA-104 e os derivados relacionados (por exemplo, MARC-145) podem representar o que até agora pode ter sido a única opção prática para suportar a replicação de vírus de PRRS in vitro.

A presente invenção melhora o estado da técnica fornecendo opções alternativas para trabalhar com o vírus de PRRS, tal como a modalidade de células não símias que podem suportar um crescimento de PRRS.

Outras abordagens foram tomadas, com resultados menos desejáveis, para desenvolver opções para o crescimento de

2 0 PRRSV. Em uma abordagem, macrófagos alveolares suínos podem ser usados para o crescimento de PRRSV; entretanto, o alto grau de variabilidade inerente em células isoladas dos diferentes porcos é considerado uma desvantagem (veja Vincent e col., 2005; Bautista e col., 1993). Em outra 25 abordagem, Weingartl e col. estabeleceu as linhagens celulares monomielóides suínas seguindo a transfecção de macrófagos alveolares suínos primários obtidos de porcos de 12 semanas de idade. Essas células foram testadas, mas falharam em suportar a replicação de PRRSV (Weingartl e 30 col., 2002, Journal of Virological Methods 104:203-216). Em contraste a presente invenção surpreendentemente divulga, inter alia, a descoberta que determinadas células de porcos fetais são certamente capazes de suportar o crescimento de PRRSV.

5 Aplicações de tecnologia de grande interesse para a

utilização da presente invenção incluem aspectos da pesquisa aplicados, tais como produção de vacina veterinária, além da capacidade de estudar o crescimento do vírus de PRRS ao nível de pesquisa básico. As vacinas para PRRSV que são vacinas vivas modificadas ou vacinas inativadas /mortas podem ser produzidas pelas células e linhagens celular da invenção. Uma ferramenta para crescer este vírus particular e métodos relacionados também são significativos no contexto de gerar material útil para aplicações de diagnóstico. No contexto de uma analogia histórica pretendida para enfatizar a ciência da descoberta, a capacidade para trabalhar com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) foi geralmente interrompido devido às dificuldades e uma falta de opções para cultivar o vírus in vitro. Os avanços cruciais na capacidade para estudar e gerar diagnósticos e vacinas potenciais para HIV relacionados ao evento decisivo de ser capaz de cultivar com sucesso o vírus in vitro; veja Gallo RC, 2002, Historical essay. The early years of HIV/AIDS; Science 298 (5599): 1728-30.

A principal limitação ao controle da doença PRRS é acreditada permanecer com a disponibilidade e eficácia de tecnologias de vacina. A contribuição de células e métodos inovadores para o crescimento de vírus de PRRS representa 3 0 assim um avanço significativo na capacidade de trabalhar com vírus de PRRS, para desenvolver tecnologias de vacina alternativas e/ou melhoradas, e endereçar o problema da doença de PRRS.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção amplamente relaciona-se às células não-

símias capazes de reproduzir o vírus e métodos de PRRS para reproduzir o vírus de PRRS usando tais células.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma célula não- símia isolada capaz de reproduzir o vírus de PRRS, em que a

célula não-símia é obtida de um animal individual e cultivada por pelo menos 5 passagens.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma célula de pulmão fetal suína isolada capaz de infecção por e/ou reproduzir o vírus de PRRS. Em uma modalidade, a célula é

uma célula macrõfaga alveolar. Em uma modalidade, a célula é propagada em cultura por pelo menos 5 passagens. Em uma modalidade, a célula é propagada em cultura por pelo menos 10 passagens. Em uma modalidade, a célula é propagada em cultura por pelo menos 20 e/ou 50 passagens.

2 0 Em uma modalidade, a invenção fornece uma célula

primária isolada ou população de células obtidas de um pulmão de um feto suíno. Em uma modalidade, o feto é de aproximadamente 3 0 a aproximadamente 90 dias de idade gestacional. Em uma modalidade, a célula é um macrófago

2 5 alveolar ou a população de células compreende pelo menos

uma célula macrófaga alveolar. Em uma modalidade, a célula é um macrófago, de linhagem macrófaga, ou progenitor da mesma.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma célula ou

3 0 uma linhagem celular designada aqui como ZMAC. Em uma modalidade, a invenção fornece uma célula ou uma linhagem celular designada aqui como FBAL-A. Em uma modalidade, a invenção fornece uma célula representada por um depósito com a American Type Culture Collection designado como 5 depósito de patente ATCC N0. PTA-8764 ou derivada do mesmo.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma variante celular imortalizada ou derivado de uma célula descrita aqui tendo a capacidade de suportar o crescimento de PRRSV.

Em uma modalidade, a invenção fornece um método de gerar descendência de um vírus de PRRS compreendendo:

a) fornecer uma célula não-símia isolada ou purificada capaz de replicar vírus de PRRS, em que a referida célula não-símia é cultivada por pelo menos 5 passagens;

b) expor a referida célula não-símia ao referido vírus de PRRS; e

c) permitir o vírus de PRRS replicar na célula;

desse modo gerando a descendência de um vírus de PRRS.

Em uma modalidade, a célula não-símia é obtida de um animal individual. Em uma modalidade, o método ainda compreende a colheita de PRRSV crescido.

Em uma modalidade, a invenção fornece um método de produzir uma vacina de PRRS, compreendendo o fornecimento de uma cepa de vírus vivo modificado (MLV) de PRRSV, e crescer a referida cepa de MLV em uma célula não-símia 25 isolada ou purificada capaz de replicar a referida cepa MLV de PRRSV. Em uma modalidade, a célula não-símia é uma célula macrófaga ou de linhagem macrófaga ou um progenitor da mesma. Em uma modalidade, a célula não-símia é uma célula suína ou um derivado da mesma. Em uma modalidade, a 30 célula não-símia é uma célula macrófaga alveolar suína. Em uma modalidade, a célula não-símia é uma célula primária macrófaga alveolar suína, população de células, variante ou um derivado da mesma. Em uma modalidade do método, a célula é representada por uma célula designada como ZMAC-I, FBAL-A, 5 ou um depósito com a American Type Culture Collection designada como Depósito de Patente ATCC N0. PTA-87 64 ou derivado da mesma.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição compreendendo célula ou linhagem celular designada como 10 ZMAC-I ou representada por um depósito com a American Type Culture Collection designada como Depósito de Patente ATCC N°. PTA-8 7 64 ou derivada da mesma. Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição compreendendo uma célula ou linhagem celular designada como FBAL-A.

Em uma modalidade, a invenção fornece um método de

isolar uma célula de um pulmão fetal suíno compreendendo fornecer um indivíduo fetal suíno; obter uma amostra de lavagem broncoalveolar contendo célula do referido indivíduo; e separar um componente celular da referida

2 0 amostra; desse modo isolando a referida célula. Em uma modalidade, a referida amostra contendo célula é uma amostra de lavagem broncoalveolar. Em uma modalidade, a referida amostra é uma amostra de tecido extirpado que é opcionalmente processada por maceração e/ou homogeneização.

2 5 Em uma modalidade, a invenção fornece um método de

crescimento de um vírus, compreendendo: (a) isolar uma célula de um pulmão fetal suíno; (b) cultivar a referida célula; e (c) colocar em contato a referida célula com o referido vírus para permitir a replicação viral; desse modo crescendo o vírus. Em uma modalidade, o referido vírus é um vírus de PRRS. Em uma modalidade, o referido vírus é um vírus de PRRS atenuado ou um isolado de campo de vírus de PRRS. Em uma modalidade, o isolado de campo é virulento ou naturalmente de baixa virulência ou não-virulento. Em uma modalidade, o referido cultivo compreende passar a referida célula por pelo menos 5 passagens e/ou crescer a referida célula por pelo menos 10 dias de cultura contínua.

Em uma modalidade, a invenção fornece um método de crescimento e isolamento de PRRSV, que compreende a inoculação do vírus em uma cultura de células não-símias na presença de soro em um meio de crescimento apropriado e incubar as células inoculadas até o material de vírus de descendência de PRRSV ser gerado. Em uma modalidade particular, o PRRSV é ATCC-VR2332. Em uma modalidade particular, as células não-símias foram previamente crescidas em cultura por pelo menos 5 passagens. Em outra modalidade particular, as células não-símias foram previamente cultivadas por pelo menos 10, 20, e/ou 50 passagens.

Em uma modalidade, a invenção fornece um método de crescer PRRSV compreendendo (a) inocular PRRSV em células não-símias que foram previamente cultivadas por pelo menos 5, 10, 20, e/ou 50 passagens; e (b) incubar as células não- símias inoculadas. Em uma modalidade, as células não-símias são macrófagos alveolares suínos. Em uma modalidade, as células não-símias são obtidas de uma amostra de pulmão fetal suíno. Em uma modalidade, o PRRSV é derivado de um homogeneizado de tecido suíno infectado com o vírus. Em uma modalidade, o método compreende incubar a cultura até um período de tempo fixo e/ou até que um efeito citopático seja observado. Em uma modalidade, o período de tempo fixo é de aproximadamente 16 a aproximadamente 72 horas.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição imunogênica compreendendo PRRSV inativado, em que o vírus inativado é formado por um processo que inclui crescer PRRSV em células não-símias antes de inativar o vírus, em que as células não-símias foram previamente cultivadas por pelo menos 5, 10, 20, e/ou 50 passagens. Em uma modalidade, o crescimento do vírus compreende: (a) inocular vírus de síndrome respiratória e infertilidade suínas nas células; e (b) incubar as células inoculadas em aproximadamente 34 a aproximadamente 37°C. Em uma modalidade, o crescimento do vírus envolve um meio de crescimento incluindo soro. Em uma modalidade, o vírus inativado é a cepa ATCC VR-2332 de PRRSV morto. Em uma modalidade, a composição imunogênica ainda compreende um adjuvante e/ou um carreador farmaceuticamente aceitável.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição compreendendo um vírus crescido em uma célula da invenção. Em uma modalidade, o vírus é um vírus de PRRS (que pode incluir um vírus derivado de um vírus de PRRS).

Em uma modalidade de métodos da invenção, uma célula da invenção é colocada em contato com uma composição de fator de crescimento. Em uma modalidade, a composição de 25 fator de crescimento compreende o fator estimulante de colônia de macrófago (MCSF). Em uma modalidade, a composição de fator de crescimento compreende o fator de estimulação de colônia granulócito-macrófago (GMCSF).

Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição 3 0 compreendendo PRRSV em ou de uma cultura de células não- símias; em que as células não-símias foram previamente cultivadas por pelo menos 5, 10, 20, e/ou 50 passagens, são derivadas de um macrófago alveolar suíno originando de uma amostra de pulmão suíno fetal, ou ambos. Em uma modalidade, o PRRSV é um vírus de RNA envelopado fastidioso, não- hemaglutinante e é capaz de efetuar PRRS em suínos. Em uma modalidade, a composição tem um título de vírus de aproximadamente IO3 a aproximadamente IO7 TCID50/ml. Em uma modalidade, o título de vírus é até aproximadamente IO9 TCIDso/ml. Em uma modalidade, o PRRSV é uma cepa de MLV. Em uma modalidade, o PRRSV é derivado de um inóculo compreendendo um homogeneizado de tecido de um suíno afetado com PRRS. Em uma modalidade, o inóculo é derivado de um homogeneizado de tecido neutralizado, e o homogeneizado de tecido neutralizado é obtido neutralizando o homogeneizado de tecido com soros de anticorpo para doenças suínas selecionadas do grupo consistindo de hemófilo, brucelose, leptospira, parvovírus, pseudoraiva, encefalomiocardite, enterovírus, influenza suína, e misturas dos mesmos. Em uma modalidade, o inóculo é derivado de um homogeneizado filtrado do homogeneizado de tecido, o homogeneizado filtrado contendo partículas tendo um tamanho não maior que aproximadamente 0,4 5 mícron.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma célula não- símia em que a célula é uma célula suína. Em uma modalidade particular, a célula é derivada de um pulmão suíno. Em uma modalidade preferida, a célula é derivada de um pulmão fetal suíno. Em uma modalidade particular, o pulmão fetal suíno é de um feto suíno de uma idade gestacional de aproximadamente 2 0 a aproximadamente 8 0 dias. Em uma modalidade particularmente preferida, o feto suíno tem uma idade gestacional de aproximadamente 5 0 a aproximadamente 7 0 dias. Em uma modalidade, a célula é obtida de uma amostra de lavagem de pulmão de um feto suíno. Em uma modalidade particular, a célula é uma célula macrófaga alveolar suína.

Em uma modalidade, as células não aderentes e/ou relativamente menos aderentes são preferivelmente selecionadas. Em uma modalidade, uma população de células misturada é obtida de um pulmão fetal suíno. Em uma modalidade, há pelo menos dois tipos de célula na população de células misturada incluindo uma célula precursora de linhagem de macrófago/monócito que é auto-regenerada e relativamente menos diferenciada ou não diferenciada; e uma célula diferenciada de linhagem de macrófago/monócito que é relativamente mais diferenciada. Em uma modalidade, há pelo menos um terceiro tipo de célula na população de célula misturada que é um tipo de célula alimentadora/auxiliar. Em uma modalidade, o terceiro tipo de célula é de uma amostra endógena ou é adicionado exogenamente.

Em uma modalidade, uma célula e/ou população de células da invenção pode ser descrita como tendo uma população de precursores de células endoteliais que podem ser feitos para produzir células endoteliais sob condições de cultura apropriadas. Por exemplo, as condições de cultura podem incluir o tipo de utensílio plástico e/ou tratamentos de superfície.

Em uma modalidade, pode haver uma fração de células que expressam CD90 e CD117. Em uma modalidade particular, a fração é aproximadamente 30% ou pelo menos 30%. Em uma modalidade, uma célula não-símia da invenção é usada para produzir uma vacina contra o Vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suíno (PRRSV).

Em uma modalidade, uma célula ou linhagem celular da invenção é capaz de suportar o crescimento de um vírus de PRRS que é um vírus do tipo selvagem ou uma cepa de laboratório. Em uma modalidade preferida a invenção suporta o crescimento de um vírus vivo modificado de PRRS. Em uma modalidade particular, o vírus é uma cepa correspondendo a ou derivado de uma linha de produtos de Boehringer Ingelheim, tais como vacinas dos suínos de PRRS Ingelvac® PRRS e ReproCyc®. Em uma modalidade particular, o vírus é uma cepa correspondendo a ou derivado de uma linha de produto de Schering-Ploug de vacina de PRRS Principal-Pac®. Em uma modalidade particular, o vírus é um isolado usado na United States Veterinary Biological Product License (29/03/96) para Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína, Forma Reprodutiva, Vírus Morto, Código 19S5.20. Em uma modalidade, o vírus de PRRS é um vírus atenuado. Em uma modalidade, o vírus de PRRS é um isolado de campo. Em uma modalidade, o isolado de campo é uma cepa virulenta ou uma cepa de virulência naturalmente baixa ou não-virulenta. Em uma modalidade, as composições ou métodos da invenção são aplicáveis para o crescimento de material de vírus de PRRS que é usado para fabricação de vacina viva, atenuada, ou inativada.

Em uma modalidade de uma célula ou linhagem celular da invenção, um derivado imortalizado é estabelecido do material de partida de uma célula ou linhagem celular não- imortalizada ou já imortalizada. Em uma modalidade, uma linhagem celular imortalizada ou linhagem celular é estabelecida usando uma ou mais transformações ou outras técnicas de imortalização como é compreendido na técnica.

Em uma modalidade de uma célula ou linhagem celular da 5 invenção, um ou mais subclones são estabelecidos. Por exemplo, um subclone é isolado e reproduzido de acordo com técnicas convencionais tal como pela diluição limitante em cultura.

Em uma modalidade da invenção, uma célula primária ou 10 linhagem celular é cultivada por pelo menos 5 passagens. Em outras modalidades, uma célula primária ou linhagem celular é cultivada por pelo menos 10 passagens, pelo menos 20 passagens, e/ou pelo menos 50 passagens. Em uma modalidade da invenção, uma célula primária ou linhagem celular é 15 cultivada por pelo menos uma semana. Em uma modalidade da invenção, uma célula primária ou uma linhagem celular é cultivada por pelo menos duas semanas. Em outras modalidades, uma célula primária ou linhagem celular é cultivada por pelo menos quatro semanas, pelo menos oito

2 0 semanas, e/ou pelo menos dezesseis semanas.

Em uma modalidade, uma composição tal como uma célula ou linhagem celular é isolada ou purificada.

Em uma modalidade, a invenção fornece um processo crescendo um vírus da síndrome respiratória e reprodutiva 25 suíno (PRRSV) crescendo o vírus em uma cultura de tecido para uma quantidade suficiente para proteger animais contra PRRS para diagnosticar PRRS ou para identificar a estrutura molecular de PRRSV por subunidade ou produtos recombinantes, compreendendo inocular PRRSV em uma cultura de tecido de 30 uma célula ou linhagem celular não-símia e colher o vírus crescido. Em uma modalidade, a célula ou linhagem celular é suína. Em uma modalidade, a célula ou linhagem celular é um macrófago alveolar suíno. Em uma modalidade, a invenção fornece uma cultura de tecido contendo o PRRSV produzido de 5 acordo com o processo. Em uma modalidade, a invenção fornece um processo para preparar uma vacina eficaz para proteger porcos contra a PRRS compreendendo fornecer PRRSV como descrito aqui, liberar o PRRSV das células de cultura de tecido e ajustar a massa antigênica por diluição, 10 concentração ou extração para produzir uma quantidade imunologicamente eficaz da massa antigênica para um produto recombinante ou subunidade relativamente intacto.

Em uma modalidade, uma célula não-símia ou linhagem celular da invenção é usada para produzir PRRSV vivo ou PRRSV inativado/morto.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma célula ou linhagem celular não-símia purificada de linhagem de macrófago derivada de um organismo suíno fetal. Em uma modalidade, a invenção fornece um método de gerar uma 20 célula ou linhagem celular não-símia purificada de linhagem de macrófago derivada de um organismo suíno fetal. Em uma modalidade, a célula ou linhagem celular é cultivada in vitro por pelo menos três, cinco, ou 10 passagens.

Sem desejar ser limitado por qualquer teoria 25 particular, pode haver discussão aqui de crenças ou compreensões de princípios subjacentes ou mecanismos em relação à invenção. Reconhece-se que não obstante a exatidão final de qualquer explanação ou hipótese, uma modalidade da invenção pode todavia ser operativa e útil.

3 0 BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ilustra o crescimento de duas cepas atenuadas de PRRSV (PrimePac e Syva) em uma cultura de célula não-símia UIMAC FBAL-A.

A Figura 2 ilustra o fenótipo de células UIMAC-FBAL-A 5 incluindo a expressão de marcadores de superfície de célula macrófagas característicos.

A Figura 3 ilustra características morfológicas de células FBAL-A usando técnicas de microscopia: A) coloração Giemsa para mostrar a aparência morfológica (citospin); B) 10 microscopia confocal de FBAL-A tingido para CD14; C) coloração de microscopia de fluorescência confocal para CD172; e D) coloração de FBAL-A infectada com PRRSV tingindo para antígeno de nucleocapsídeo que indica uma localização característica de N antígeno ao núcleo e 15 associação com nucléolo. A Fig. 3B e Fig. 3C ilustram a morfologia real das células frescas tingidas para CD14 ou CDl72 com filopódios e lamelipódios característicos.

A Figura 4 ilustra dados em cinéticas de crescimento das células ZMAC (Fig. 4A) e crescimento de PPRSV usando as células (Fig. 4B).

A Figura 5 ilustra células ZMAC em 2 0 horas após sendo infectadas com cepa de vírus de PRRS NADC2 0 em MOI de 1 (Fig. 5A) e 0,1 (Fig. 5B) . As células foram fixadas e tingidoas com FITC marcado de SDOW17 mAb que é específico para proteína de núcleocapsídeo (N).

A Figura 6 ilustra resultados de mudança de peso em porcos após a exposição ao vírus de PRRS do tipo selvagem.

A Figura 7 ilustra a extensão e frequência de viremia em porcos após a exposição ao vírus de PRRS tipo selvagem.

3 0 A Figura 8 ilustra resultados de medição da carga de vírus em amostras da lavagem broncoalveolar de porcos após a exposição ao vírus de PRRS tipo selvagem.

A Figura 9 ilustra o crescimento de células ZMAC-I na presença de fatores de crescimento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As seguintes abreviações são aplicáveis: PRRS, Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína e; PRRSV, vírus de PRRS; TCID50, nível de 50% de dose infecciosa de cultura de tecido; ATCC, American Type Culture Collection; MOI, multiplicidade de infecção.

Geralmente os termos e frases usados aqui têm seu significado técnico reconhecido, que pode ser encontrado por referência aos textos padrões, referências de jornal e contextos conhecidos aos hábeis na técnica. As seguintes 15 definições são fornecidas para esclarecer seu uso específico no contexto da invenção.

Quando usado aqui, o termo "célula" pode referir-se a uma entidade biológica como seria compreendido na técnica e que é pretendido englobar as entidades específicas que

2 0 podem ser descritas como uma célula primária ou uma

linhagem celular. Quando diversos destes termos são usados aqui, será apreciado por um de capacidade ordinária que tal uso é meramente para finalidades de enfatizar distinções bem compreendidas. Por exemplo, a frase "uma célula ou 25 linhagem celular" pode enfatizar o contraste entre um isolado primário original versus uma versão imortalizada que poderia ser um derivado direto do isolado primário original.

Quando usado aqui, o termo "isolado" refere-se a um

3 0 estado manipulado que é diferente do que é o estado natural e/ou é modificado relativo a um material de partida, neste caso o termo é significado ser consistente com o conceito de ser purificado. Por exemplo, uma célula primária isolada é extirpada de um tecido natural ou de outra fonte em um organismo hospedeiro e mantida longe da fonte original. Como outro exemplo, um componente celular pode ser colocado em cultura ou ainda separado de uma amostra baseada em fluido de lavagem de pulmão, assim conseguindo uma célula relativamente isolada.

Quando usado aqui, o termo "purificado" refere-se a uma condição em que houve um enriquecimento, separação, e/ou remoção relativos de uma substância relativa a um material de partida. O termo pode englobar condições de uma purificação pelo menos parcial e não necessariamente implica um estado absoluto de pureza. Por exemplo, o termo pode se aplicar a uma célula que é capaz de reproduzir um vírus de PRRS e presente em uma cultura misturada e independentemente pode ser aplicável ao que pode habitualmente ser considerado uma cultura pura. O termo pode se aplicar a uma cultura de célula primária que é opcionalmente uma cultura misturada. O termo pode se aplicar a uma linhagem celular.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma linhagem celular de macrófago alveolar suíno que é capaz de suportar o crescimento de PRRSV. Uma composição de exemplo da invenção é uma linhagem celular não-símia. As composições particulares da invenção incluem uma célula ou população de célula obtida das amostras de pulmão fetal suíno. Uma composição específica adicional inclui um macrófago alveolar suíno fetal. Em uma modalidade, a invenção fornece métodos de crescer PRRSV em uma célula não-símia ou linhagem celular.

A invenção pode mais ser compreendida pelos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLO I. 0 isolado de célula não-símia UIMAC FBAL-A é capaz de suportar o crescimento de PRRSV.

A linhagem celular de macrófago alveolar suíno UIMAC FBAL-A foi derivada do pulmão de um feto suíno de 4 5 dias por lavagem broncoalveolar com meio de cultura. A cultura inicial foi expandida in vitro dos iniciais poucos milhares de células a diversos milhões durante um período de 6 meses Naquele tempo, os experimentos foram conduzidos para medir o crescimento de vírus de PRRS. Estes experimentos mostraram que as células de FBAL-A foram capazes de suportar a replicação do vírus. Este isolado não foi deliberadamente transformado ainda demonstrou uma capacidade de crescer e propagar em cultura e um fenótipo para a capacidade de suportar a infectividade e crescimento de vírus de PRRS.

As condições de cultura de célula foram como segue. Meio de cultura: RPMI 164 0 suplementado com L-glutamina e mM de HEPES. O meio é suplementado com aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio, gentamicina, e soro bovino fetal 10%. As células foram incubadas em 37°C com CO2 5% em 100% de umidade. As placas de 6 poços de grau de cultura de tecido foram usadas para a superfície de cultura. Um volume de cultura de 4-6 ml de meio de cultura/poço foi usado. Para passagens, as células foram selecionadas por serem não aderentes ou fracamente aderentes. Cada 3-4 dias uma porção das células foi removida da cultura com a ajuda de uma pipeta Pasteur e um bulbo de borracha delicadamente suspendendo as células no fluido de cultura e transferindo 1/3 do volume de poço a um poço novo. 0 poço novo e o poço fonte foram alimentados com meio fresco.

5 A Figura 1 ilustra o crescimento de cepas atenuadas de

PRRSV PrimePac e Syva em UIMAC FBAL-A. Os resultados demonstram que as células suínas podem ser usadas para produzir o vírus de vacina de PRRS em quantidades suficientes para a produção de vacina.

As células suínas isoladas podem ser identificadas

e/ou isoladas pela expressão de determinadas moléculas de superfície. O padrão de molécula de superfície de expressão pode ser usado para isolar outras células suínas independentes ou para selecionar linhagens celulares como 15 indicadores potenciais para a capacidade de suportar o crescimento de PRRSV. Por exemplo, as células são opcionalmente selecionadas para a expressão de CD163. Em um exemplo particular, as células ou linhagens celulares são submetidas à coloração e/ou técnicas de separação em vista 20 de moléculas de superfície celular.

A Figura 2 ilustra o fenótipo de células UIMAC-FBAL-A incluindo a expressão de marcadores de superfície de célula macrófaga característica. As células FBAL-A expressam CD14, CD163, e CD172. A molécula de proteína CD163 é indicativa 25 de linhagem monócito/macrófago e correlaciona com permissividade de infecção por vírus de febre suína africana. As células também expressam moléculas MHC de classe II em baixo nível. A linha vermelha para o lado esquerdo representa os resultados de coloração da amostra

3 0 de controle negativa. Nota-se que a expressão de determinado marcador, incluindo tais descritos aqui, pode ser usada para caracterização das células, mas independentemente pode também ser usada para enriquecimento, separação (por exemplo, classificando), e outras 5 finalidades. Em uma modalidade, uma célula, tal como uma célula macrófaga da invenção pode não necessariamente expressar um ou mais determinados marcadores dados, ou seu padrão de expressão pode mudar com o tempo, mas pode todavia ser capaz de replicar PRRSV.

A Figura 3 ilustra características morfológicas de

células FBAL-A usando técnicas de microscopia: A) coloração de Giemsa para mostrar a aparência morfológica (citospin); B) microscopia confocal de FBAL-A tingida para CD14; C) coloração de microscopia de fluorescência confocal para 15 CDl72; e D) coloração de FBAL-A infectada com PRRSV tingindo para antígeno de núcleocapsídeo que indica uma localização característica de N antígeno ao núcleo e associação com nucléolo. As Fig. 3B e Fig. 3C ilustram a morfologia real de células frescas tingidas para CD14 ou 20 CD172 com filopódios e lamelipódios característicos.

Em experimentos de examinação microscópica, as células foram centrifugadas em uma lâmina e tingidas com coloração de Giemsa. As células não fixadas foram incubadas com anticorpo monoclonal específico para SWC3 ou CD14 seguido 25 por exposição à Ig de cabra anticamundongo marcado por FITC. Para a detecção de núcleocapsídeo de PRRSV, as células foram infectadas com vírus de PRRS (cepa VR-2332). Após 18 h, as células foram centrifugadas em uma lâmina, fixadas com acetona, e incubadas com N proteína de vírus anti-PRRS 30 marcado por FITC mAb SDOWl7. As células não infectadas não reagiram com mAb SD0W17. Em estudos cinéticos de crescimento, o isolado de PRRSV VR2332 foi usado em células UIMAC-FBAL-A. Os rendimentos de vírus obtidos da linhagem celular de macrófago foram titulados em células MARC-145.

Sem desejar ser limitado pela explanação teórica, para

determinadas composições acredita-se que as células descritas aqui derivadas dos pulmões fetais suínos podem conter progenitores de auto-regeneração. Estes progenitores de auto-regeneração podem produzir macrófagos de

descendência, que podem ainda se diferenciar, e além disso podem ter a capacidade para produzir células progenitoras adicionais permitindo a continuação de propagação.

EXEMPLO 2. 0 isolado de célula não-símia ZMAC é capaz de suportar o crescimento de PRRSV.

Além do desenvolvimento de células FBAL-A, um esforço

independente resultou no desenvolvimento de um segundo isolado de célula designado como ZMAC. As células ZMAC foram caracterizadas e observadas por ter a capacidade de suportar a infectividade e crescimento de PRRSV.

Nesta tentativa independente, seis fetos de 58 dias de

idade foram assepticamente colhidos do útero de porca 9688 obtida do rebanho de suínos da University of Illinois Veterinary Medicine Research Farm. Esta porca era um porco híbrido com a seguinte composição de raça: 17/32 Landrace, 25 13/32 Yorkshire e 2/32 Duroc. Os fetos foram transportados ao laboratório de cultura de célula e seus pulmões dissecados dentro de uma cabine de segurança biológica sob condições estéreis.

As células nas vias aéreas dos pulmões de cada um dos

3 0 6 fetos foram isoladas separadamente por lavagem broncoalveolar. Aproximadamente 100.0 00 células foram obtidas do pulmão de cada feto. As células de cada feto foram cultivadas separadamente em poços diferentes de uma placa de cultura de tecido de 6 poços. Após uma cultura de

5 4 dias inicial, as células foram purificadas através de um gradiente de densidade Ficoll-Hypaque. Em uma modalidade, as células podem ser purificadas por Ficoll-Hypaque no dia de isolamento ou em um tempo depois, por exemplo, 1, 2, ou

3 semanas mais tarde, reconhece-se que isto pode facilitar 10 a remoção de determinados componentes, tais como células vermelhas, e potencialmente outro material, presente em uma preparação original. Dentro de 2 0 dias após o estabelecimento das culturas iniciais, as células estavam exibindo crescimento robusto e foram divididas em placas de 15 e poços adicionais. Estas células foram nomeadas ZMAC/FBAL-

II e ainda designadas como sublinhagens 1-6 para identificar as células isoladas dos 6 fetos diferentes. Subsequentemente as células foram divididas aproximadamente a cada 4-5 dias. 0 crescimento robusto de células foi evidente pela presença de aglomerados celulares que começaram a dobrar nos termos de células por aglomerado a cada 2,5 a 3 dias. Em 6 0 dias após a iniciação da cultura, as células ZMAC/FBAL-II. 1, e ZMAC/FBAL-11.2 exibiram o melhor crescimento que as outras quatro linhagens. Sob passagens adicionais, as linhagens de ZMAC/FBAL-II.1, e ZMAC/FBAL-II.2 estavam crescendo suficientemente bem para serem transferidas aos frascos de cultura de tecido de 75 cm2. As condições de cultura foram geralmente como descritas acima. Neste experimento, as frascos de Sarstedt para culturas em suspensão foram usados. Sob passagens múltiplas, as células exibiram crescimento vigoroso; as diversas milhões de células foram capazes de serem colhidas a cada 10-12 dias. As curvas de crescimento indicaram que as células são capazes de replicar o vírus de PRRS assim como as células FBAL-I (FBAL-A) . Em um ensaio, o rendimento de vírus foi aproximadamente 0,2 TCID50/célula. Dois tipos de isolados de vírus de PRRS vivo modificado foram testados para o crescimento nestas células (cepa PrimePac de Schering- Plough e o isolado de vacina espanhola de Syva na Europa).

Cinco lotes de células foram congelados e armazenados em nitrogênio líquido. Cada lote tem um mínimo de 10 tubos de ensaio com dois milhões de células cada um. Um tubo de ensaio representativo de cada lote foi descoberto por ter viabilidade >80% após ser descongelado e exibir crescimento vigoroso dentre 4 dias após a iniciação de cultura. A população de ZMAC foi descoberta por ser 7 0% suscetível à infecção com vírus de PRRS como determinada por coloração de imunofluorescência para proteínas virais dentro de 18 horas após a infecção em um MOI de 0,01. Em outra avaliação, determinamos que a linhagem celular de ZMAC é 100% suscetível à infecção por vírus de PRRS, como determinado por coloração de imunofluorescência para proteínas virais

12 horas após a infecção em um MOI de 10.

Também realizamos curvas de crescimento de múltipla etapa infectando as células ZMAC com vírus de PRRS (PrimePac) em um MOI de 0,02. Baseado no tempo real a análise de PCR de expressão de genoma de vírus nas células infectadas e titulando a quantidade de descendência de vírus produzida, determinamos que a primeira rodada de replicação de vírus de PRRS é terminada em 9 horas após a infecção, e que o rendimento de pico de descendência de vírus é conseguido pela segunda rodada de replicação em 18 horas após a infecção (Fig. 4B).

NA figura 4, a Fig. 4A mostra resultados de cinéticas

de crescimento das células ZMAC. As culturas estabelecidas de células ZMAC foram crescidas em frascos de cultura de 7 5 cm2 contendo 15 ml de células em 2-3,2 x IO5 células/ml; as células foram alimentadas com um volume igual de meio de 10 cultura fresco para conseguir uma densidade celular de 1- 1,6 x IO5 células/ml. As células foram contadas em 0, 3, e

6 dias após o meio fresco ser fornecido. Cada frasco é capaz de produzir 2-3 x IO6 células a cada quatro dias.

A figura 4B ilustra uma curva de crescimento de etapa múltipla de vírus de PRRS em células de ZMAC. Nestes experimentos, os resultados indicam os rendimentos e cinéticas virais de crescimento de PRRSV em células ZMAC. Uma suspensão de células ZMAC em lxl06/ml foi contaminada em um MOI de 0,02 com o isolado de vírus de PRRS atenuado PrimePac. Após a incubação em uma hora em 37°C o inóculo foi removido por centrifugação, e as células foram suspensas em lxl06/ml. Um volume de 0,1 ml foi removido nos tempos indicados após a infecção e o número de unidades TCID50 determinado em células MARC-145. A cepa de vírus de PRRS atenuado PrimePac, potencialmente apropriada como um material de vacina, cresce bem na linhagem celular ZMAC.

A Figura 5 ilustra células ZMAC em 2 0 horas após serem infectadas com cepa de vírus de PRRS NADC2 0 em um MOI de 1 (Fig. 5A) e 0,1 (Fig. 5B). Um controle negativo com células infectadas falsas foi também observado (não mostrado). As células foram fixadas e tingidas com SD0W17 mAb marcado por FITC que é específico para a proteína de núcleocapsídeo (N). A microscopia de contraste de fase foi também realizada para observar as células. Geralmente estas células não 5 mostram CPE até aproximadamente 28-36 horas após a infecção. Uma quantidade substancial de material de vírus, entretanto, é liberada das células muito mais cedo, por exemplo em aproximadamente 18-20 horas após a infecção.

As amostras de células são usadas para adaptar as

condições de crescimento de célula e as condições de crescimento viral para finalidades de maximizar e/ou otimizar títulos de vírus. As matérias-primas virais de PRRS são consequentemente gerados e podem ser usados para o desenvolvimento de vacina e finalidades de vacinação.

EXEMPLO 3. Linhagens celulares não-símias

imortalizadas capazes de suportar o crescimento de PRRSV.

A célula ou linhagem celular da invenção é estabelecida como uma ou mais de uma variante imortalizada espontânea, derivado deliberadamente transformada, outra

2 0 variante ou derivado, e uma versão de outra maneira imortalizada de uma célula primária ou linhagem celular como descrita aqui.

Por exemplo, as técnicas são utilizadas como seria compreendido na técnica, tal como envolvendo tecnologia de

2 5 transformação viral; fusão com um parceiro imortalizado;

exposição às condições químicas/físicas incluindo; por exemplo, irradiação; e tecnologia em relação à manipulação de função de telomerase. Em uma abordagem preferida, o sistema tert é usado para estabelecer uma célula ou

3 0 linhagem celular que pode evitar, atrasar, ou de outra maneira alterar a senescência. Veja, por exemplo, Carrillo e col., Veterinary Immunology and Immunopathology 89 (2002) 91-98; Kwak S e col., 2006 Animal Biotechnology, 17:10 51- 58; http://www.atcc.org/common/products/CellImmortProducts.

cfm.

Em esforços de isolamento preliminares ou desenvolvimento a jusante de uma célula imortalizada, os aspectos, tais como purificação e/ou subclonagem são facilitados pela classificação de célula ativada por

fluorescência ou outra separação de citometria de fluxo ou técnica de análise. Outras técnicas, tais como separação celular magnética são adaptáveis para uso com células e métodos aqui.

EXEMPLO 4. Determinação de imunogenicidade e eficácia

de uma vacina viva modificada de PRRS.

Neste exemplo, a imunogenicidade e eficácia de uma vacina de vírus vivo modificado de PRRS produzido usando uma linhagem celular macrófaga suína são determinadas. Uma linhagem celular de macrófago alveolar suíno é testada. Em

2 0 um exemplo particular, as linhagens celulares primárias de

macrófago suíno UIMAC-FBAL-A e/ou ZMAC são usadas. Alternativamente, um pode gerar materiais de partida e/ou derivados independentes, tais como transformantes de acordo com a divulgação aqui.

Um candidato de PRRS MLV é selecionado e produzido em

relação a uma célula ou linhagem celular como descrita aqui para gerar material de PRRS MLV para avaliação de ensaio clínico. Um estudo de vacinação e provocação é conduzido com 32 porcos que tem quatro semanas de idade,

3 0 aleatoriamente alocados em quatro grupos de n=8 por grupo. Os porcos são obtidos do rebanho suíno livre de vírus PRRS da University of Illinois Veterinary Research Farm e acondicionados em uma instalação de isolamento por uma semana antes de começar o estudo.

5 Os animais nos grupos 1 e 2 são imunizados uma vez na

área do traseiro com a dose de 5 x IO4 unidades TCID50 em um volume de 2 ml da matéria-prima de MLV crescido nas células UIMAC-FBAL-A ou em células MARC-145. Os animais no grupo 3 são injetados com uma mistura de 50:50 de 2 ml do 10 sobrenadante de cultura gasta de UIMAC-FBAL-A e células MARC-145 símias. Os animais no grupo 4 não são tratados e servem como controles. Como uma medida de imunidade específica de vírus, as amostras de sangue periférico são coletadas de cada animal em 0, 2, 4, 6 e 8 semanas pós- 15 imunização. Destas amostras, o soro e PBMC são obtidos e a intensidade das respostas imunes humorais e mediadas por células medidas. 0 título de anticorpos neutralizantes de vírus de soro e a frequência de células secretando interferon (IFN)-gama específico de vírus de PRRS (SC) 2 0 separadamente contra os dois isolados de vírus de PRRS progenitores FL-12 e NEB-I, um vírus quimérico (Kwon B, 2006), e cepa de provocação virulenta VR2385 (Opriessnig T, 2002) .

Para medir o nível de imunidade protetora induzida

2 5 pelo material de vacina, animais nos grupos 1-3 são

provocados em 6 semanas pós-imunização por instilação de 2 ml da cepa de vírus de PRRS virulento VR2385 (IO5 doses TCID50 por 2 ml, administrados em alíquotas de 1 ml por narina). Os animais no grupo 4 permanecem não vacinados e

3 0 não são provocados a fim de determinar os parâmetros clínicos normais assim como a aparência de pulmão normal. Os animais de vírus não nocivo de PRRS no grupo 3 servirão como controles de provocação para determinar a severidade da provocação. 0 grau de imunidade protetora provocado pela vacina é estabelecido baseado nos fatores incluindo a medida de temperatura corporal e mudança de peso e a observância de sinais clínicos, tais como depressão e sinais respiratórios. Estes parâmetros são monitorados diariamente por quatorze dias. 0 nível de viremia, resposta IFN-gama, e peso corporal são determinados em 0, 4, 7, 10 e

14 dias pós-provocação. Quatorze dias após a provocação, os animais são aplicados eutanásia, e a carga viral no tecido de pulmão e fluido de lavagem broncoalveolar é determinada. As mudanças patológicas no pulmão são avaliadas em níveis macro e microscópicos.

Em outro experimento, a imunogenicidade e eficácia de material biológico gerado de ZMAC são avaliadas. O material de ZMAC é comparado ao mesmo vírus de vacina, mas crescido nas células MARC-145. Com esta finalidade temos realizado 3 passagens em série da cepa de vírus PrimePac em células ZMAC. A terceira passagem deste vírus nas células ZMAC é utilizada para conduzir o estudo de vacinação comparativo deste biológico ao vírus de PrimePac crescido em células MARC-14 5. As matérias-primas de vacina de PrimePac crescidas nas células ZMAC ou MARC-145 são preparadas a um título de IO6 TCID50/ml. Os grupos de porcos são imunizados em dose de 5 x IO4 TCID50 em um volume de 2 ml da matéria- prima de MLV crescido nas células UIMAC-FBAL-A ou nas células MARC-145.

EXEMPLO 5. Uso de uma linhagem celular de macrófago alveolar suíno para produzir uma vacina de vírus vivo modificada de PRRS.

Introdução. Na metade de 1994, a primeira vacina MLV de PRRS (Ingelvac PRRS MLV) foi liberada. Desde então, o uso de vírus atenuados como vacinas tornou-se habitual na América do Norte e Europa. É bem aceito que estes agentes são eficazes em conferir níveis apropriados de imunidade protetora homóloga enquanto suportando graus variáveis de proteção contra a provocação por cepas heterólogas (Mengeling e col., 1996; Mengeling e col., 1999). Assim há a motivação e interesse direcionados para um progresso adicional em tecnologias de alternativa e estratégias melhoradas, vacinas, e ferramentas e métodos na conexão com os mesmos.

Neste estudo, uma linhagem celular de macrófago alveolar suíno, designada ZMAC-I, é usada para a produção de uma vacina de vírus vivo modificado de PRRS (MLV) . Também, a eficácia de vírus de vacina crescido neste hospedeiro suíno é comparada a propagada na única outra linhagem celular conhecida na iniciação deste estudo para suportar o crescimento de vírus de PRRS, especificamente a linhagem celular símia MA-104 e/ou seu derivado a linhagem MARC-14 5.

Inicialmente, as células ZMAC-I foram descobertas por serem prontamente suscetíveis à vacina de MLV PrimePac de PRRS (Schering-Plough Animal Health). Além disso, após a terceira passagem do vírus em células ZMAC-1, um rendimento comparável ao conseguido quando usando as células MARC-145 foi obtido. Para avaliar o potencial de vacina de vírus crescido de célula ZMAC-1, um padrão estudo de provocação de imunização foi conduzido. Neste caso, seis porcos de 8 semanas de idade foram injetados com uma dose equivalente da vacina PrimePac crescida em células ZMAC-1 ou MARC-145 enquanto dois grupos adicionais de três animais não foram imunizados. Quatro semanas mais tarde, todos os vacinados e um dos grupos de vírus não nocivo de PRRS foram provocados com o isolado de vírus "violento aborto de PRRS atípico" NADC-20. Um resultado do estudo foi que a vacina de MLV PrimePac crescida em qualquer linhagem celular foi igualmente eficaz em impedir perda de peso corporal de porcos de vírus não nocivo de PRRS que tenham sido expostos ao vírus heterólogos 7 dias antes. Entretanto, o vírus de vacina crescido em células ZMAC-1 foi significativamente mais eficaz do que o crescido em MARC-145 em reduzir a extensão de viremia e também em eliminar o vírus virulento dos pulmões em 7 e 10 dias pós-provocação, respectivamente.

A observação que o tipo de linhagem celular usado para crescer a vacina PRRS MLV pode melhorar o nível de imunidade protetora provocada pelo mesmo vírus de vacina contra um vírus de PRRS virulento geneticamente divergente tem implicações importantes para o prospecto de desenvolver uma vacina altamente eficaz contra este patógeno. Especificamente, os resultados deste estudo sugerem que a eficácia de uma vacina de vírus de PRRS MLV não é, como se geralmente acredita, simplesmente determinada por sua similaridade genética ao vírus de provocação, mas é também influenciada por como é produzida. Os resultados deste estudo são significativos em demonstrar que as células suínas são úteis em gerar uma vacina de MLV eficaz contra o vírus de PRRS. Sumário. Uma linhagem celular de macrófago alveolar suíno, designada ZMAC-1, foi gerada e sua utilidade para fabricar uma vacina de vírus vivo modificado de PRRS eficaz (MLV) foi examinada. Esta linhagem celular foi descoberta por ser 100% suscetível a infecção por vírus de PRRS, como evidenciado pela coloração de imunofluorescência bem sucedida para proteínas virais em 20 horas após infecção. Além disso, baseado em análises de curva de crescimento de múltiplas etapas, a primeira rodada de replicação de vírus de PRRS foi determinada para ser completada em 9 horas após infecção e o rendimento de descendência de vírus durante a segunda rodada de replicação em 19 horas após infecção.

Para comparar a eficácia de matérias-primas da vacina de MLV PrimePac PRRS (Schering-Plough Animal Health) preparada em ZMAC-1 ou linhagem celular símia MARC-14 5, um estudo de provocação de imunização padrão foi conduzido. Seis porcos de 8 semanas de idade foram inicialmente vacinados intramuscularmente com uma dose equivalente (IO4 TCID50) da vacina PrimePac crescida em células ZMAC-1 ou MARC-14 5, enquanto dois grupos adicionais de três animais não foram imunizados. Todos estes animais, assim como um dos dois grupos de controles não vacinados, foram provocados 4 semanas mais tarde com IO4 TCID50 do isolado de vírus de "violento aborto atípico de PRRS" NADC-20. Enquanto os animais não vacinados experimentaram uma perda de peso corporal média (BW) de 2,27+1,81 kg por 7 dias após a provocação de vírus virulento, os controles de vírus não nocivo de PRRS tinham ganhado em média 8,93+2,7 kg durante este intervalo de tempo. Em contraste, em 7 dias pós- provocação, os animais vacinados com o vírus de MLV crescido em células ZMAC-1 ou MARC-145 exibiram ganhos BW médios de 3,72+2,36 e 4,22+1,63, respectivamente. Assim, estatisticamente a vacina PrimePac MLV crescida em qualquer linhagem celular foi igualmente eficaz em reduzir o efeito negativo da exposição de porcos a um vírus de PRRS altamente virulento em seu crescimento. Notavelmente, as análises da carga de vírus no soro e as amostras de lavagem de pulmão dos animais provocados e imunizados de vírus de PRRS revelaram que o vírus de vacina crescido em células ZMAC-1 foi significativamente (P=0,015) mais eficaz em reduzir a extensão de viremia em 7 dias pós-provocação e também em eliminar o vírus virulento de seus pulmões em 10 dias pós-provocação. A observação que o tipo de linhagem celular usado para crescer a vacina de MLV PRRS pode melhorar o nível de imunidade protetora provocado por este produto contra um vírus de PRRS virulento geneticamente divergente tem implicações significantes para desenvolver uma vacina altamente eficaz contra este patógeno. Especificamente, os resultados deste estudo sugerem que a eficácia de uma vacina de vírus de PRRS MLV não é somente, como é geralmente acreditado, determinada por sua similaridade genética ao vírus provocado, mas é também influenciada por como é produzida.

Os objetivos deste estudo, pelo menos em parte, incluída a determinação (1) das características de crescimento de cepas de vírus de PRRS atenuado na linhagem celular de macrófago suíno ZMAC-1; e (2) a imunogenicidade e eficácia de uma vacina de vírus vivo modificado de PRRS produzida na linhagem celular de macrófago suíno ZMAC-1.

Materiais e métodos Células. As células de macrófago alveolar sulno foram selecionadas, por exemplo, como descrito adicionalmente aqui, da lavagem de pulmão de um feto de 58 dias de idade obtido de uma porca SPF (livre de patógeno específico). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640, suplementado com soro bovino fetal 10%, piruvato de sódio e aminoácidos não essenciais, e mantido em 37°C em uma atmosfera de 5% CO2. Uma linhagem celular, designada ZMAC-1, foi estabelecida em maio de 2006 e tem sido continuamente crescida. Matérias-primas representativas de subdivisões temporais diferentes desta linhagem celular foram crio preservadas.

Vírus. A vacina de MLV PrimePac PRRS (Schering-Plough Animal Health) foi seqüencialmente passada três vezes em células ZMAC-1. Embora o título fosse somente IO4 TCID50/ml após as primeiras duas passagens, o vírus pareceu ter adaptado durante a terceira passagem enquanto o título aumentou para IO6,25 TCID50/ml. Consequentemente, esta descendência foi usada para vacinação. As matérias-primas da vacina PrimePac foram também preparadas em células MARC- 145 como previamente descrito (Osorio e col., 2006) e alcançaram um título de IO6 TCID50/ml. 0 isolado de vírus de "violento aborto de PRRS atípico" NADC-20 (Harms e col., 2001) foi crescido em células ZMAC-1 e exibiu um título máximo de IO7'5 TCID50/ml.

Estudo de vacinação e provocação: Dezoito porcos SPF de 8 semanas de idade (livres de todos os principais patógenos de suíno incluindo o vírus de PRRS, micoplasma e circovírus) foram aleatoriamente alocados em 6 compartimentos de isolamento (3 porcos por compartimento) em um cômodo na Instalação de Bioconfinamento na University of Illinois. Os animais de quatro compartimentos foram injetados uma vez na área traseira com uma solução de 2 ml contendo IO4 TCID50 de vírus PrimePac crescido em células 5 ZMAC-1 ou MARC-14 5, para um total de 2 compartimentos por formulação de vacina (6 porcos no total) . Os seis porcos restantes nos dois outros compartimentos não foram imunizados e serviram como controles não vacinados. Quatro semanas após a vacinação, todos os animais imunizados, bem 10 como três dos porcos de controle alojados em um compartimento foram provocados com IO4 TCID50 de cepa de vírus de PRRS NADC-20. Enquanto os animais não vacinados e provocados serviram para estabelecer a severidade de infecção pelo vírus de PRRS NADC-20, os porcos de vírus não 15 nocivo de PRRS no compartimento restante foram usados para fornecer parâmetros clínicos normais de crescimento e saúde 0 grau de imunidade protetora provocado pela vacina foi determinado baseado em uma comparação de mudanças de peso corporal (BW) e na aparência de depressão e sinais 20 respiratórios. Estes parâmetros foram monitorados diariamente por dez dias após a provocação. 0 nível de viremia foi determinado em 0, 4, 7 e 10 dias após a provocação medindo unidades infecciosas em células MARC-145 Dez dias após a provocação, os animais foram aplicados 25 eutanásia e a carga viral no fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) foi determinada usando PCR de tempo real e métodos virológicos como descrito previamente (Zuckermann e col., 2 007).

Análise estatística. A análise de Variância foi usada para determinar diferenças significativas entre grupos de porcos com relação ao ganho de peso. As médias de grupo foram comparadas pelo procedimento de menor diferença significativa de Fisher utilizando o software Stat View (SAS). Para minimizar o efeito de diferenças de peso de BW 5 entre animais no momento da provocação, os dados foram calculados como a diferença entre o BW dos animais no momento da provocação e 7 dias mais tarde.

Resultados

Objetivo 1. determina as características de 10 crescimento de cepas de vírus de PRRS atenuado na linhagem celular de macrófago suíno ZMAC-1. O objetivo deste alvo foi verificar a robustez da linhagem celular ZMAC-1 e sua susceptibilidade à infecção pelo vírus de PRRS. Além disso, procuramos determinar condições ótimas para o crescimento 15 de vírus de PRRS atenuado nas células ZMAC-1 e demonstrar que as matérias-primas de vacina de MLV preparadas nesta linhagem celular poderiam ser usadas para finalidades comerciais.

Caracterização da linhagem celular de macrófago alveolar suíno ZMAC-1. A linhagem de macrófago ZMAC-1 exibiu um padrão de crescimento muito robusto com um tempo de duplicação de aproximadamente 72 horas (Fig. BI; isto corresponde à Fig. 4A). Fomos capazes de adaptar as células a serem crescidas em frascos de 7 5 cm2 e manter este tipo de cultura de célula em produção contínua pelos últimos 15 meses. Até agora, geramos mais de 1 bilhão de células de uma população de partida inicial de poucos mil. A fim de assegurar a perpetuidade desta linhagem celular valiosa mais de 100 matérias-primas de células congeladas foram preparadas. Cada lote tem pelo menos 10 tubos de ensaio, e cada tubo de ensaio 20 contém pelo menos 2-3 milhões de células. Sob descongelamento um tubo de ensaio representativo de cada lote, determinamos que estes tubos de ensaio têm >90% de células viáveis que exibem 5 crescimento vigoroso dentro de 4 dias após a re-iniciação de seu cultivo. Esta linhagem celular foi confirmada por ser de origem suína pela reatividade de 100% das células na população com o anticorpo monoclonal K252.1E4, que é específico para CD45 de suíno (Schnitzlein e Zuckermann, 10 1998; Zuckermann e col., 2001). Além disso, as células ZMAC-1 expressam os seguintes marcadores de superfície de célula: CD14, CD163, CD172, MHC classe II, cuja presença é característica de macrófagos (Fig. 2) .

Figura Bl (corresponde à Fig. 4A) . A cinética de

crescimento da linhagem celular ZMAC-1. As culturas estabelecidas de células ZMAC-1 em frascos de 75cm2 contendo 2-3,2 x IO5 células/ml de meio foram combinadas com um volume igual de meio fresco para conseguir uma densidade celular de 1-1,6 x IO5 células/ml. As células

2 0 foram contadas em 0, 3 e 6 dias depois que o meio fresco

foi liberado no frasco de cultura.

Crescimento de vírus de PRRS em células ZMAC-1. A linhagem celular ZMAC-1 é 100% suscetível ã infecção pelo vírus de PRRS, como evidenciado pela coloração de 25 imunofluorescência bem sucedida para proteínas virais em 20 horas após a infecção (Fig. B2; corresponde à Fig. 5A) . Além disso, determinamos que a primeira rodada de replicação de vírus de PRRS é completada em 9 horas após a infecção (dados não mostrados) e que o rendimento máximo de

3 0 descendência de vírus é conseguido pela segunda rodada de replicação em 19 horas após a infecção (Fig. B3 ; corresponde à Fig. 4B) .

Figura B2 (corresponde à Fig. 5A) . A expressão de proteína de núcleocapsídeo de vírus de PRRS em células 5 ZMAC-I. Em 2 0 horas após a infecção com cepa de vírus de PRRS NADC-2 0 em MOI de 1, as células foram fixadas e tingidas com núcleocapsídeo de vírus anti-PRRS mAb SD0W17 marcado por FITC.

Figura B3 (corresponde à Fig. 4B) . As curvas de 10 crescimento de múltiplas etapas de vírus de PRRS em células ZMAC-I. Uma suspensão de células ZMAC-I em lxlOs/ml foi infectada em um MOI de 0,02 com o isolado de vírus de PRRS atenuado PrimePac. Após uma hora de incubação em 370C o inóculo foi removido por centrifugação e as células 15 suspensas no meio em uma concentração de lxl06/ml. Alíquotas de um décimo de ml foram removidas nos tempos indicados após a infecção e usadas para determinar a presença de vírus infeccioso (TCID50 em células MARC-145).

Objetivo 2. Determinar a imunogenicidade e eficácia de 20 uma vacina de vírus vivo modificado de PRRS produzida na linhagem celular de macrófago suíno ZMAC-I. 0 objetivo deste alvo foi comparar os níveis de imunidade protetora provocados pela mesma vacina de PRRS MLV, neste caso o vírus de PRRS PrimePac, produzido na linhagem celular ZMAC- 25 1 ou na linhagem celular MARC-145.

Para testar a eficácia da vacina de vírus de PRRS PrimePac, foi preparada em células ZMAC-I ou MARC-14 5, grupos de porcos foram imunizados com o vírus de vacina derivado de uma das duas linhagens celulares ou tratados 3 0 falsamente. No momento de provocação, 4 semanas após a imunização, o peso corporal médio (BW) de todos os 18 porcos no estudo foi 53,1+3,9 kg. Já que nenhuma diferença significativa entre o BW médio de animais vacinados e não- vacinados foi observada, a vacinação com o MLV propagado em 5 células ZMAC-I ou MARC-145 não teve nenhum impacto óbvio no crescimento animal. Em contraste, 7 dias após a provocação com o isolado de NADC-2 0 virulento, os porcos não vacinados tiveram uma perda de BW média de 2,27±1,81 kg enquanto os animais não provocados ganharam em média 8,93+2,72 kg (Fig. 10 6) . Um ganho de BW médio de 3,72±2,36 e 4,22±1,63 kg, de que não foram estatisticamente diferentes de si, foram também notados para os grupos que tinham previamente recebido a vacina de vírus de MLV preparada em células ZMAC-I ou MARC-145, respectivamente. Assim, apesar do tipo 15 de célula usada para propagar o vírus, a vacina PrimePac MLV foi igualmente eficaz em diminuir o efeito negativo da exposição ao vírus de PRRS virulento em crescimento, como evidenciado pela perda de BW significativa de porcos de vírus não nocivo de PRRS que tinham sido expostos a um

2 0 vírus virulento heterólogo 7 dias antes. Notavelmente, as análises da carga de vírus nas amostras de soro e lavagem de pulmão dos animais vírus-imunizados e provocados de PRRS revelaram que o vírus de vacina crescido em células ZMAC-I foi significativamente (P=0,015) mais eficaz em reduzir a 25 extensão de viremia em 7 dias pós-provocação (Figura 7) e também em eliminar o vírus virulento de seus pulmões em 10 dias pós-provocação (Figura 8).

Figura 6. A mudança de peso em porcos após a exposição ao vírus de PRRS tipo selvagem. Os pesos corporais de animais de vírus não nocivo de PRRS (n=3) e imunizados (n=6 para cada tipo de vacina gerada de célula) foram medidos imediatamente antes e em 7 dias após a provocação com o isolado de vírus de PRRS tipo selvagem NADC-20. As medidas foram também feitas nestes pontos de tempo para o não 5 provocado, os animais de vírus não nocivo de PRRS (n=3). As mudanças no peso durante o intervalo de 7 dias foram calculadas a média para membros de cada grupo e estes valores ± o erro padrão são mostrados. Um asterisco (*) indica que a média de grupo é estatisticamente diferente

(P<0,01) do provocado, os animais controle de vírus não nocivo de PRRS. Dois asteriscos (**) são usados para indicar que a média de grupo é estatisticamente diferente (P<0,01) do não provocado, os animais de controle de vírus não nocivo de PRRS.

Figura 7. Extensão e frequência de viremia em porcos

após a exposição ao vírus de PRRS do tipo selvagem. As amostras de soro foram coletadas de vírus não nocivo de PRRS e os animais imunizados imediatamente antes e nos dias indicados após a provocação com o isolado de vírus de PRRS

tipo selvagem NADC-20. As amostragens foram tomadas também nestes pontos de tempo para o não provocado, os animais de vírus não nocivo de PRRS. 0 nível de carga de vírus no soro foi determinado realizando titulação em células MARC-14 5 e então calculado a média. Os dados representam o nível médio

2 5 de viremia para cada grupo. A razão próxima aos símbolos

indica o número de porcos virêmicos (numerador) e o número total de porcos por grupo (denominador).

Figura 8. A carga de vírus na lavagem broncoalveolar de porcos após a exposição ao vírus de PRRS tipo selvagem.

3 0 A lavagem broncoalveolar foi coletada dos pulmões de porcos vírus não nocivo de PRRS e previamente imunizados em 10 dias após a provocação com o isolado de vírus de PRRS tipo selvagem NADC-20. As amostras foram também obtidas neste tempo do não provocado, os animais de vírus não nocivo de 5 PRRS. O nível de carga viral no BAL de cada animal foi determinado realizando titulação em células MARC-145.

Discussão

A observação que a linhagem celular usada para crescer a mesma cepa de vacina PRRS MLV pode melhorar o nível de 10 imunidade protetora provocado por este produto contra um vírus de PRRS virulento geneticamente divergente tem importantes implicações para desenvolver uma vacina altamente eficaz contra este patógeno. Especificamente, os resultados deste estudo sugerem que a eficácia de uma 15 vacina de vírus de PRRS MLV não é, como se geralmente acredita, simplesmente determinada por sua similaridade genética ao vírus, mas é influenciada também por como é produzida. Uma interpretação razoável para as observações descritas acima é que as propriedades biológicas do vírus 20 de vacina foram modificadas em uma maneira positiva simplesmente sendo crescido em células ZMAC-I. Consequentemente, uma resposta imune protetora mais eficaz se desenvolver nos animais vacinados. Assim, os resultados deste estudo demonstram que uma vacina de MLV mais eficaz

2 5 contra o vírus de PRRS pode ser criada.

Referências para o Exemplo 5

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EXEMPLO 6. Materiais de célula e crescimento de

células.

Materiais de célula. As células designadas como ZMAC-I foram preparadas e depositadas com uma Autoridade Depositária Internacional reconhecida, a American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia, Estados Unidos da América) sob o Tratado de Budapeste. 0 número de acesso é N0 de Depósito de Patente ATCC PTA-8764 para as células caracterizadas como sendo de origem de tecido de pulmão de Sus scrofa (porco/suíno). De acordo com o documento de Certificado de Depósito ATCC datado de 7 de dezembro de 2007 (Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos Para Finalidades de Procedimento de Patente; Forma Internacional; Recibo no Caso de um Depósito Original Emitido Conforme a Regra 7.3 e Declaração de Viabilidade Emitida Conforme a Regra 10.2), a Data de Recibo de Cultura é 14 de novembro de 2 0 07 para a Designação de Depósito de Patente ATCC® PTA-8764.

Crescimento de células. Em modalidades da invenção, as 5 células, tais como as células ZMAC-I são cultivadas in vitro. Geralmente, os princípios de cultura de célula mamífera são aplicados. Por exemplo, as células podem ser cultivadas na presença de antibióticos; a gentamicina é usada mas não necessariamente exigida.

As células são preparadas como segue (meio de cultura:

RPMI-1640 suplementado com o soro bovino fetal 10%, piruvato de sódio (I mM; Mediatech Cellgro, Cat. N°. 25- 0 0 0-Cl), aminoácidos não essenciais (IX; Mediatech Cellgro Cat. N°. 2 5 - 02 5 - Cl) , e gentamicina (50 mg/ml; Gibco, Cat.

N°. 15750-060). As células são mantidas em concentrações celular de aproximadamente 1 a 5 x 10e5 por ml. Estas células geralmente crescem em suspensão. As colônias discretas de células frouxamente aderentes podem se desenvolver, mas a maioria das células estarão crescendo em

suspensão. As culturas normais produzirão grupos de célula flutuante. Para reduzir a aderência, o tipo preferido de frasco de cultura é Frasco de Cultura de Tecido Sarstedt para suspensão celular com o tampão ventilado PE (Cat. N°. 83.1813.502). Os frascos estabelecidas podem ser colhidas a

2 5 cada 4-5 dias com remoção de 2/3 do fluido e adição de meio

de cultura fresco. Os novos frascos são estabelecidos adicionando pelo menos 3-6 milhões de células em um volume de 20 ml em um frasco T25 (mínimo de 1.5 x 10e5 células/ml) O crescimento pode ser melhorado adicionando 2-10 ng/ml de

3 0 fator de estimulação de colônia de macrófago (camundongo; Produto de Sigma-Aldrich N°. M9170). 0 congelamento celular pode ser realizado misturando volumes iguais de suspensões geladas de células em 4-8 milhões de células por ml e meio de congelamento gelado (90% de soro, 10% de DMSO). Os crio 5 frascos refrigerados são enchidos com as células suspensas em meio de congelamento e mantidas em temperatura gelada durante o processo.

A Figura 9 ilustra o crescimento de células ZMAC-I na presença de fatores de crescimento. As células ZMAC-I em 10 1,2 x IO5 célula por ml, foram cultivadas por 8 dias sem fator de crescimento exógeno ou na presença da concentração indicada de fator de estimulação de colônia de macrófago (MCSF) ou fator de estimulação de colônia de granulócito- macrófago (GMCSF). A concentração celular foi determinada 15 com a ajuda de um hemocitômetro no quarto e oitavo dia de cultura. 0 eixo y indica células/ml (xlO5) .

Em uma modalidade, uma célula da invenção é representada por uma célula designada como ZMAC-I ou um depósito com a American Type Culture Collection designado como Depósito de Patente ATCC N0. PTA-8764 ou derivado da mesma.

EXEMPLO 7. Geração de materiais celulares e métodos de isolamento das amostras suínas fetais.

As composições e métodos adicionais foram 25 desenvolvidos. Em uma tentativa independente, os materiais foram derivados de uma porca em 6 0 dias de gestação do rebanho suínos na University of Illinois Veterinary Medicine Research Farm (identificada como porca número 5850) . Depois da eutanásia, o útero foi assepticamente

3 0 removido da cavidade abdominal e transportado ao laboratório de cultura de célula. As manipulações foram geralmente realizadas usando uma cabine de segurança biológica sob condições estéreis. Seis fetos foram assepticamente colhidos do útero e colocados em placas de 5 Petri plásticas. Os órgãos de pulmão, com a traquéia intacta e unida ao pulmão, foram dissecados longe do coração, esôfago e outras membranas. A parte externa do pulmão foi completamente enxaguada com solução salina balanceada estéril de Hank (HBSS) para remover qualquer 10 sangue visível e outro tecido restante contaminante. As células nas vias aéreas dos pulmões de cada um dos 6 fetos foram isoladas separadamente por lavagem broncoalveolar colocando o pulmão em uma placa de Petri limpa e estéril e enchendo as vias aéreas com 10 ml de HBSS estéril. Os 10 ml 15 de HBSS foram propelidos no pulmão com o ajuda de uma seringa de 10 cm3 e uma agulha de 18g 2,54 cm, que foi introduzida através do lúmen da traqueia. O fluido foi delicadamente propelido através da traqueia ao confiná-la através de compressão com fórceps para prevenir o recuo de

2 0 HBSS, resultando nos pulmões se tornando visivelmente

inflados com o fluido. Subsequentemente, o fluido contendo as células de lavagem de pulmão foi auto-expelido do pulmão simplesmente liberando a compressão traqueal. A suspensão celular coletada na placa de Petri foi transferida a um 25 tubo plástico cônico estéril de 15 ml, e submerso com 3-4 ml de Ficoll-Hypaque 1077 morno. Imediatamente após a suspensão celular purificada através de centrifugação isopícnica (400 g por 30 minutos em temperatura ambiente).

Em uma modalidade, as células podem ser purificadas

3 0 por centrifugação isopícnica usando Ficoll-Hypaque 1077 o dia de isolamento ou em um tempo mais tarde, por exemplo, 1,

2, ou 3 semanas mais tarde. Reconhece-se que este procedimento de purificação pode facilitar a remoção de determinados componentes, tais como células vermelhas, e 5 potencialmente outro material, presente na preparação original. A banda de células obtidas após a centrifugação na interface entre o Ficoll-Hypaque 1077 e meio foi colhida e lavada com HBSS duas vezes e as células recuperadas cada vez por centrifugação. Após a segunda centrifugação, a 10 pelota de célula recuperada de cada lavagem de pulmão fetal foi suspensa em meio de cultura: RPMI-164 0 suplementado com soro bovino fetal 10%, piruvato de sódio (I mM; Mediatech Cellgro, Cat. N°. 25-000-C1), aminoácidos não essenciais (IX; Mediatech Cellgro Cat. N°. 25-025-C1), e colocados 15 independentemente em um poço da placa de 6 poços (Sarstedt) para suspensão de cultura. Cada poço foi marcado de 1-6 para identificar as células independentemente purificadas de cada um dos seis fetos. Embora nesta tentativa muito poucas células e muito pequenas (<100) foram recuperadas

2 0 após o procedimento de centrifugação isopícnica, dentro de

14 dias após o estabelecimento das culturas iniciais, o crescimento significativo foi observado em cada poço. Já os progenitores de macrófago colhidos do pulmão fetal aparentemente muito pequeno e poderia ter uma densidade 25 maior do que 1.077 (assim atravessando o meio de densidade ao fundo do tubo durante a centrifugação isopícnica), no caso do feto #1, a pelota de célula vermelha obtida após a centrifugação isopícnica também foi colhida e colocada em cultura e marcada Pl. Neste caso, embora o tipo celular 30 predominante na iniciação da cultura consistida de células sanguíneas vermelhos, um pequeno número de células mononucleares muito pequenas foi observado. Em 16 e 24 dias após a iniciação da cultura o crescimento em células derivadas da lavagem de pulmão de feto #4 exibiu o 5 crescimento suficiente para merecer divisão em novos poços de uma placa de 6 poços. As células derivadas desta cultura foram nomeadas ZMAC1107-4. Similarmente, crescimento no poço marcado como Pl, que foi derivado da pelota de célula vermelha foi claramente evidente em 3 6 dias após a 10 iniciação da cultura e foi também dividido em 2 poços. As células derivadas desta cultura foram nomeadas ZMAC1107-P1. O crescimento de células foi evidente pela presença de aglomerados de célula compreendido de 2, 4, 8, 16 ou mais células por aglomerado.

Em 3 7 dias após a iniciação da cultura da ZMAC1107-4,

o meio de cultura para esta linhagem celular foi suplementado em uma de poços duplicados com 10 ng/ml de fator de estimulação de colônia de macrófago (camundongo; Produto de Sigma-Aldrich N0. M9170) . Sete dias mais tarde foi claro que o crescimento das células ZMAC1107-4 tinha sido significativamente ajudado nesta fase inicial de cultura pelo suplemento exógeno com o fator de crescimento, e portanto o meio de todas culturas foi suplementado com MCSF em 5-10 ng/ml. As culturas são alimentadas cada 4-6 dias removendo por aspiração metade de volume da cultura de célula e substituí-la com meio fresco suplementado com o fator de crescimento. O crescimento robusto de ambas linhagens ZMAC 1107-4 e ZMAC 1107-P1 foi evidente pela formação de colônias celular crescendo em suspensão e unida frouxamente à superfície de cultura. Em outra tentativa independente, as composições e métodos adicionais foram desenvolvidos. Uma porca identificada como número 9093, em 54 dias de gestação foi obtida do rebanho de suínos na University of Illinois 5 Veterinary Medicine Research Farm. Depois da eutanásia, o útero foi assepticamente removido da cavidade abdominal e transportado ao laboratório de cultura de célula. Todas as manipulações deste ponto em diante foram feitas dentro de uma cabine de segurança biológica sob condições estéreis.

Oito fetos foram assepticamente colhidos do útero e colocados em placas de Petri de plástico e seus pulmões, com a traqueia intacta e unida ao pulmão, dissecados longe do coração, esôfago e outras membranas. A parte externa do pulmão foi completamente enxaguada com HBSS para remover

qualquer sangue visível e outro tecido remanescente contaminante. As células nas vias aéreas dos pulmões de cada um dos oito fetos foram isoladas separadamente por lavagem broncoalveolar colocando o pulmão em uma placa de Petri limpa e estéril e enchendo as vias aéreas com 10 ml

de solução salina balanceada estéril de Hank (HBSS). Os 10 ml de HBSS foram propelidos no pulmão com a ajuda de uma seringa de 10 cm3 e uma agulha de 18g de 2,54 cm, que foi introduzida através do lúmen da traqueia. O fluido foi delicadamente propelido através da traqueia ao comprimi-la

2 5 com fórceps para prevenir o recuo de HBSS, resultando nos

pulmões tornando-se visivelmente inflados com o fluido. Subsequentemente o fluido contendo as células de lavagem de pulmão foi auto-expelido do pulmão simplesmente reduzindo a compressão da traqueia. Em alguns casos o pulmão foi

3 0 delicadamente comprimido com a extremidade sem corte de tesouras para ajudar a expelir o fluido de lavagem restante A suspensão celular coletada na placa de Petri foi transferida a um tubo plástico cônico estéril de 15 ml, e centrifugada por 10 minutos em 1.500 rpm em uma centrifuga 5 clínica de balcão. A pelota de célula recuperada de cada lavagem de pulmão fetal foi suspensa em meio de cultura: RPMI-164 0 suplementado com 10% soro bovino fetal, piruvato de sódio (I mM; Mediatech Cellgro, Cat. N°. 25-000-C1) , aminoácidos não essenciais (IX; Mediatech Cellgro Cat. N°.

25-025-Cl) e colocado independentemente em um poço de placa de 6 poços (Sarstedt) para cultura de suspensão. Cada poço foi marcado de 1-8 para identificar as células independentemente purificadas de cada um dos oito fetos. Aproximadamente 10.000 células foram inicialmente colocadas

em cultura de cada lavagem de pulmão fetal. 0 crescimento nestas culturas foi evidente em 5 dias. Grande aglomerados de células foram evidentes em culturas derivadas dos fetos #1, 3, 6, 7 e 8.

Em 12 dias após a iniciação da cultura as células não-

2 0 aderentes e frouxamente aderentes de todas as 8 culturas

celulares de lavagem de pulmão fetal foram colhidas pipetando delicadamente e purificadas por centrifugação isopícnica usando Ficoll-Hypaque 1077. Isto foi realizado transferindo a suspensão celular a um tubo plástico cônico

de 15 ml estéril, que foi submerso com 3-4 ml de Ficoll- Hypaque 1077 morno e então centrifugado em 400 g por 30 minutos em temperatura ambiente. Uma banda claramente visível de células foi obtida após centrifugação na interface entre o Ficoll-Hypaque 1077. 0 meio foi colhido e

3 0 lavado com HBSS duas vezes, e as células foram recuperadas cada vez por centrifugação. Após a segunda centrifugação, a pelota de célula recuperada de cada cultura de lavagem de pulmão fetal individual foi suspensa em 3 ml de meio de cultura: RPMI-1640 suplementado com soro bovino fetal 10%, 5 piruvato de sódio (I mM; Mediatech Cellgro, Cat. N°. 25- 000-C1), aminoácidos não essenciais (IX; Mediatech Cellgro Cat. N°. 25-025-C1), e colocado independente em um poço de placas de 6 poços (Sarstedt) para cultura de suspensão e marcado de 1-8, que correspondeu diretamente à marcação 10 original das culturas. Cinco dias mais tarde todas as culturas celulares foram alimentadas de 2 cm3 de meio de cultura fresco. Nove dias mais tarde um crescimento significativo de células em suspensão, bem como células aderentes foi evidente em culturas derivadas das culturas 15 de célula de lavagem de pulmão fetal marcadas 3 e 6, que exibiram um número significativo de colônias de macrófago crescendo em suspensão bem como macrófagos redondos frouxamente aderentes. Um número de células sinciais esféricas grandes, cercadas por macrófagos pequenos

2 0 formando uma estrutura parecendo como uma coroa celular,

foram observados. Em 26 dias após o começo da cultura, as culturas celulares foram alimentadas de meio fresco suplementadas com 5 ng/ml de MCSF (camundongo; Produto de Sigma-Aldrich N°. M9170). Cinco dias mais tarde o 25 crescimento vigoroso de colônias de macrófago de célula crescendo em suspensão, bem como frouxamente aderente na superfície da placa de cultura foi observado em culturas derivadas dos fetos #3, #6 e #8. Estas linhagens foram nomeadas ZMAC1207-3, ZMAC1207-6, e ZMAC1207-8

3 0 respectivamente e foram expandidas poucos dias mais tarde transferindo aos frascos T75 em meio de cultura suplementado com 5-10 ng/ml de MCSF.

DECLARAÇÕES COM RELAÇÃO À MODALIDADE POR REFERÊNCIA E

VARIAÇÕES

Todas as referências mencionadas através deste pedido,

por exemplo, documentos de patente incluindo patentes ou equivalentes emitidas ou concedidas; publicações de pedido de patente; pedidos de patente não publicados; e documentos de literatura de não patente ou outra material de fonte; são incorporados aqui por referência em suas totalidades, como individualmente incorporado por referência. No caso de qualquer inconsistência entre as referências mencionadas e a divulgação do presente pedido, a divulgação aqui toma precedência. Algumas referências fornecidas aqui são incorporadas por referência para fornecer informação, por exemplo, detalhes referindo-se às fontes de materiais de partida, materiais de partida adicionais, reagentes adicionais, métodos adicionais de síntese, métodos adicionais de análise, materiais biológicos adicionais, células adicionais, e usos adicionais da invenção.

Todas as patentes e publicações mencionadas aqui são indicativas dos níveis de capacidade daqueles hábeis na técnica a que a invenção pertence. As referências mencionadas aqui podem indicar o estado da técnica como sua 25 data de publicação ou data de depósito, e é pretendido que esta informação pode ser empregada aqui, se necessário, para excluir as modalidades específicas que estão na técnica anterior. Por exemplo, quando a composição de matéria é reivindicada aqui, deve-se compreender que os

3 0 compostos conhecidos e disponíveis na técnica anterior à invenção do Requerente, incluindo compostos para os quais uma divulgação capacitante é fornecida nas referências mencionadas aqui, não é pretendida ser incluída na composição de reivindicações de matéria aqui.

Qualquer apêndice ou apêndices é incorporado por

referência como parte do relatório descritivo e/ou desenhos.

Onde os termos "compreende", "compreendem", "compreendido", ou "compreendendo" são usados aqui, devem ser interpretados como especificando a presença das características estabelecidas, inteiros, etapas, ou componentes referidos a, mas para não impossibilitar a presença ou adição de uma ou mais outras características, inteiro, etapa, componente, ou grupo dos mesmos. Assim como usado aqui, compreendendo é sinônimo de incluindo, contendo, tendo, ou caracterizado por, e é inclusivo ou finalidade aberta. Como usado aqui, "consistindo de" exclui qualquer elemento, etapa, ou ingrediente, etc. não especificado na descrição de reivindicação. Como usado aqui, "consistindo essencialmente de" não exclui materiais ou etapas que não afetam materialmente as características básicas e novas da reivindicação (por exemplo, relacionando ao ingrediente ativo) . Em cada exemplo aqui quaisquer dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente de" e "consistindo de" pode ser substituído com qualquer um dos outros dois termos, desse modo divulgando modalidades separadas e/ou escopos que não são necessariamente coextensivos. A invenção ilustrativamente descrita aqui apropriadamente pode ser praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos ou limitação ou limitações não especificamente divulgadas aqui. Sempre que uma faixa é divulgada aqui, por exemplo, uma faixa de temperatura, faixa de tempo, faixa de composição ou concentração, ou outra faixa de valor, etc., todas as faixas e subfaixas intermediárias, bem como todos 5 os valores individuais incluídos nas faixas dadas são pretendidos ser incluídos na divulgação. Esta invenção não deve ser limitada pelas modalidades divulgadas, incluindo qualquer mostrada nos desenhos ou exemplificada no relatório descritivo, que são dadas como exemplo ou 10 ilustração e não de limitação. Será compreendido que quaisquer subfaixas ou valores individuais em uma faixa ou subfaixa que são incluídos na descrição aqui podem ser excluídos das reivindicações aqui.

A invenção foi descrita em referência às várias 15 modalidades e técnicas específicas e/ou preferidas. Entretanto, deve-se compreender que muitas variações e modificações podem ser feitas ao permanecer dentro do conceito inventivo e escopo da invenção. Será aparente a um de capacidade ordinária na técnica que composições, métodos, 20 dispositivos, elementos de dispositivo, materiais, procedimentos e técnicas diferentes daquelas descritas especificamente aqui podem ser empregadas na prática da invenção como amplamente divulgado aqui sem recurso para experimentação imprópria; isto pode se estender, por 25 exemplo, aos materiais de partida, materiais biológicos, reagentes, métodos sintéticos, métodos de purificação, métodos analíticos, métodos de ensaio, e métodos biológicos diferentes daqueles exemplificados especificamente. Tudos equivalentes funcionais conhecidos da técnica antecedente

3 0 (por exemplo, composições, métodos, dispositivos, elementos de dispositivo, materiais, procedimentos e técnicas, etc.) descritos aqui são pretendidos ser englobados por esta invenção. Os termos e expressões que foram empregados são usados como termos de descrição e não de limitação, e não 5 há nenhuma intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções da mesma, mas reconhece-se que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Assim, deve-se compreender que 10 embora a presente invenção foi especificamente divulgada por modalidades, modalidades preferidas, e características opcionais, a modificação e variação dos conceitos aqui divulgados podem ser recorridas por aqueles hábeis na técnica, e que tais modificações e variações são 15 consideradas por estarem dentro do escopo desta invenção como definido pelas reivindicações apensas.

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Claims (31)

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2. Célula de pulmão fetal suína isolada caracterizada pelo fato de ser capaz da infecção por e/ou reprodução do vírus PRRS.

3. Célula, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que é uma célula macrófaga alveolar.

4. Célula, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que é propagada em cultura por pelo menos 5 passagens.

5. Célula, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que é propagada em cultura por pelo menos 10, 20, e/ou 50 passagens.

6. Célula primária isolada ou população de célula caracterizada pelo fato de ser obtida de um pulmão de um feto suíno.

7. Célula ou população de célula, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o feto tem de aproximadamente 3 0 a aproximadamente 9 0 dias de idade gestacional.

8. Célula ou população de célula, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a referida célula é um macrófago alveolar ou a referida população de célula compreende pelo menos uma célula macrófaga alveolar.

9. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que a referida célula é representada por uma célula designada como ZMAC-I ou um depósito com a American Type Culture Collection designado como Depósito de Patente ATCC N0 PTA-87 64 ou derivados dos mesmos.

10. Derivado ou variante da célula, caracterizado pelo fato de ser da célula de qualquer uma das reivindicações 1, 2 , 3 , 6, 7, 8 ou 9.

11. Método de gerar progênia de um vírus PRRS caracterizado pelo fato de que compreende: a) fornecer uma célula não símia isolada ou purificada capaz replicar um vírus PRRS, em que a referida célula não símia é cultivada por pelo menos 5 passagens; b) expor a referida célula não símia ao referido vírus PRRS; e c) permitir o vírus PRRS replicar na célula; desse modo gerando progênia de um vírus PRRS.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida célula não símia é obtida de um animal individual.

13 . Método de produzir uma vacina de PRRS caracterizado pelo fato de que compreende fornecer uma cepa de vírus vivo modificado (MLV) de PRRSV, e crescer a referida cepa de MLV em uma célula não símia purificada ou isolada capaz de replicar a referida cepa de PRRSV MLV.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a referida célula não símia é uma célula macrófaga alveolar suína.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a referida célula não símia é uma célula primária macrófaga alveolar suína, população da célula, variação ou derivado da mesma.

16. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a célula é selecionada do grupo consistindo de ZMAC e FBAL-A.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a célula é selecionada do grupo consistindo de ZMAC e FBAL- A.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que a célula não símia é representada por uma célula designada como ZMAC-I ou um depósito com a American Type Culture Collection designado como Depósito de Patente ATCC N0 PTA-87 64 ou derivada da mesma.

19. Célula ou linhagem celular, caracterizada pelo fato de ser designada como ZMAC-I ou representada por um depósito com a American Type Culture Collection designado como Depósito de Patente ATCC N0 PTA-87 64 ou derivado da mesma.

20. Célula ou linhagem celular, caracterizada pelo fato de ser designada como FBAL-A.

21. Método de isolar uma célula de um pulmão fetal suíno caracterizado pelo fato de que compreende fornecer um indivíduo fetal suíno; obter uma amostra de lavagem broncoalveolar contendo a célula do referido indivíduo; e separar um componente celular da referida amostra; desse modo isolando a referida célula.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a referida amostra contendo células é a amostra de lavagem broncoalveolar.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a referida amostra é uma amostra de tecido cortada que é opcionalmente processada por maceração e/ou homogeneização.

24 . Método de crescimento de um vírus caracterizado pelo fato de que compreende: (a) isolar uma célula de um pulmão fetal suíno; (b) cultivar a referida célula; e (c) colocar em contato a referida célula com o referido vírus para permitir a replicação viral; desse modo crescendo o vírus.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o referido vírus é um vírus PRRS .

26. Método, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o referido cultivo compreende a passagem da referida célula por pelo menos 5 passagens e/ou crescer a referida célula por pelo menos 10 dias da cultura contínua.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o referido isolamento é o isolamento da reivindicação 21.

28. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um vírus crescido na célula das reivindicações1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 ou crescido na célula imortalizada da reivindicação 10.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o vírus é vírus PRRS.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 24, 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que ainda compreende colocar em contato a referida célula com uma composição de fator de crescimento.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a referida composição de fator de crescimento compreende o fator de estimulação de colônia de macrófago (MCSF) ou fator de estimulação de colônia granulócito-macrófago (GMCSF).