BRPI0806742A2 - métodos e composições para modular a via de mirna - Google Patents

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Lionel Navarro
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Lionel Navarro
Olivier Voinnet
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Abstract

MéTODOS E COMPOSIçõES PARA MODULAR A VIA DE miRNA. A presente invenção refere-se a um espectro específico de miRNAs de planta e animal que confere resistência aumentada a patógenos virulentos. Plantas deficientes de acúmulo de miRNA são hipersuscetíveis a patógenos bacterianos não-virulentos e bactérias virulentas suprimem as vias de miRNA por meio de proteínas tipo III secretadas (TTS) injetadas. Métodos e composições para modular a via de miRNA em plantas e animais são descritos, através dos quais os efeitos adversos sobre o desenvolvimento da planta e animal são evitados ou minimizados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA MODULAR A VIA DE miRNA".
PEDIDOS RELACIONADOS
Esse pedido reivindica o benefício da patente U.S. N0 60/881.443 e 60/881.434, ambos depositados em 18 de Janeiro de 2007, que estão incorporados aqui por referência em suas totalidades.
CAMPO DA INVENÇÃO
Composições e métodos para conferir um amplo espectro de re- sistência a patógeno, contra patógenos de animais e plantas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Nos anos recentes, houve uma avaliação continuamente cres- cente da complexidade e dos efeitos pleiotrópicos do silenciamento de gene e dos componentes do maquinário de silenciamento de gene. A partir de e- feitos observados inicialmente através da supressão de transgene da ex- pressão de gene endógeno em plantas de petúnia, surgiu uma percepção mais clara de efeitos em plantas e animais que abrangem a defesa antiviral e controle de transposons através de metilação de DNA dirigida por RNA. RNA pequeno. Dicers e Arqonautas: o núcleo bioquímico de silenciamento de RNA
O "silenciamento de RNA" refere-se, coletivamente, a diversos processos baseados em RNA em que todos resultam em inibição específica para seqüência de expressão de gene, tanto em níveis transcricional, de es- tabilidade de mRNA ou traducional. Esses processos partilham três caracte- rísticas bioquímicas: (i) formação de (ds)RNA de fita dupla, (ii) processamen- to de dsRNA em dsRNAs pequenos com 20 a 26 nt com extremidades em zigue-zague ("staggered ends"), e (iii) ação inibitória de uma fita selecionada de dsRNA dentro de complexos efetores que atuam sobre RNA/DNA parci- almente ou totalmente complementares. Apesar de vários mecanismos po- derem gerar dsRNA, o processamento de sRNA e as etapas efetoras têm um núcleo bioquímico comum. sRNAs são produzidos por enzimas do tipo RNAseIII chamadas Dicers1 com domínios distintos de ligação a dsRNA, RNA helicase, RNAseIII e PAZ (Piwi/Argonauta/Zwille). Uma das duas fitas de sRNA se liga a complexos efetores chamados RISCs (complexo de silen- ciamento induzido por RNA) que invariavelmente contêm um membro da família da proteína Argonauta (Ago). Agos têm um domínio PAZ que se liga a sRNA e também contêm um domínio PIWI que fornece atividade endonu- cleolítica ("slicer") para aqueles RISCs programados para clivar RNAs2,3- alvo. De fato, Ago2 humana carregada com sRNA sozinha constitui um complexo de clivagem RISC competente in vitro, mas várias proteínas adi- cionais podem ser componentes funcionais de RISCs in viVo4.
Aqui, foram revisadas evidências recentes de que várias vias fundamentadas sobre o núcleo Dicer-Ago executam um conjunto diverso de funções biológicas dirigidas por sRNA em plantas superiores. Essas incluem a regulação de expressão de gene endógeno, repressão de transposon, de- fesa viral e formação de heterocromatina. O foco está, primariamente, sobre as plantas por que elas exibem um espectro quase completo efeitos de si- lenciamento de RNA conhecidos, mas as similaridades e as diferenças com outros organismos também são discutidas.
Vias de silenciamento de RNA desencadeadas exogenamente que resultam em clivagem de transcrito de transgenes que produzem dsRNA e IR-PTGS: úteis mas misteriosas
O silenciamento pós-transcricional de gene (PTGS) foi desco- berto em Petunia transgênica como perda de ambas as expressões5 de transgene (tanto na configuração senso quanto antissenso) e de gene endó- geno homólogo. Os Ioci de transgene freqüentemente produzem dsRNA porque eles formavam arranjos com modelos de integração complexa6,7. A- lém disso, a eficácia de PTGS era muito aumentada pela expressão senso e antissenso simultâneas8 ou pela produção direta de um dsRNA longo a partir de transgenes de repetição invertida (IR)9. O último processo, IR-PTGS1 forma atualmente a base de RNAi experimental em plantas e envolve pelo menos duas classes de sRNA distintas denominadas (si)RNAs curtos de interferência. siRNAs de 21 nt são considerados guiar a clivagem de mRNA, enquanto que siRNAs de 24 nt podem mediar, exclusivamente, modificações de cromatina10,11. Ambas as classes de siRNA se acumulam como popula- ções ao longo da seqüência completa de transcritos de IR. Embora ampla- mente usada como uma ferramenta de pesquisa, IR-PTGS permanece como um dos processos de silenciamento de RNA em planta menos compreendido (figura 1 A). A figura 1A mostra como um construto de transgene de repetição invertida (IR), empregado tipicamente para RNAi em plantas, produz trans- critos de fita dupla (ds) com braços perfeitamente complementares. Duas enzimas distintas similares à Dicer (DCL) processam os transcritos ds. DCL3 muito provavelmente produz siRNAs da classe de tamanho de 24 nt, que podem dirigir a modificação de DNA/histona e Ioci homólogos (veja Figura 3) e parece dispensar a clivagem de RNA. DCL4 é provavelmente a enzima preferida para a produção de siRNAs de 21 nt de extensão a partir do dsR- NA. Uma fita de siRNA se incorpora em RISC carregado com AG01 para guiar a clivagem endonucleolítica de RNA homólogo, levando a sua degra- dação. Ambas as espécies de siRNA são protegidas da degradação pela adição de conjuntos metila nas terminações 3' de cada fita de RNA, pela me- tiltransferase HEN1.
Portanto, até recentemente, nenhum mutante defeituoso nessa via tinha sido recuperado, apesar dos esforços consideráveis em vários labo- ratórios. Uma provável explicação é que os altos níveis de dsRNA produzi- dos em IR-PTGS promovem as atividades de Dicers e RISCs diferentes, que poderiam atuar normalmente em vias distintas, para mediar o silenciamento de maneira redundante. Análises recentes de "knockouts" combinatórios de Dicer em Arabidopsis suportam essa idéia12,13. Entretanto, a enzima similar a Dicer4 (DCL4) parece uma enzima preferida para IR-PTGS por que ela foi especificamente necessária para acumulação de siRNA de 21 nt e silencia- mento de um transgene IR14 específico para o floema, moderadamente ex- presso. DCL2 também pode estar envolvida em RNAi, por que ela processa alguns substratos endógenos de DCL4 em siRNAs de 22 nt de extensão na ausência de DCL412,13, embora permaneça obscuro se essas moléculas po- dem substituir funcionalmente os siRNA de 21 nt, produtos de DCL4. S-PTGS e silenciamento transitório: introdução de RDR
Existem vários exemplos nos quais inserções de transgene de cópia única que produzem transcritos senso desencadeiam PTGS. Essa via, senso (S)-PTGS1 tem sido operada usando restreamentos genéticos futuros de Arabidopsis que forneceram observações sobre como o dsRNA é produ- zido (figura 1B). Esses restreamentos convergiram para a identificação da RNA polimerase RDR6 dependente de RNA1 uma das seis RDRs15-16 putati- vas de Arabidopsis. RDR6 é acreditada reconhecer e usar como modelos certos transcritos de transgene com características aberrantes que incluem a ausência de 5"'capping". Por exemplo, a mutação de Arabidopsis XRN4, uma 5'-3' exonuclease que degrada mRNAs não protegidos, intensificou a acumulação de mRNAs de transgene não protegido. Isso favoreceu a sua conversão para dsRNA por RDR6 e a subsequente degradação de todos os transcritos de transgene através da via S-PTGS17. RDR6 muito provavel- mente sintetiza fitas complementares a partir de seus modelos de RNA1 re- sultando na produção de dsRNA, por que uma mutação missense no motivo GDD, essencial para a atividade catalítica de todas as RDRs caracterizadas, é suficiente para aliviar S-PTGS16.
Embora Dicer que produz siRNAs a partir de produtos de RDR6 continue a ser formalmente identificada, a acumulação de siRNA por S- PTGS em Arabidopsis requer a proteína "coiled-coil" de função desconheci- da SGS316, a RNAseD exonuclaease WEX18, uma metil transferase HEN119 específica para sRNA e a RNA helicase SDE320 putativa (figura 1B). Na Fi- gura 1B, a via é mostrada como sendo produzida por RNAs com caracterís- ticas aberrantes, embora eles possam ser disparos alternativos. As aberra- ções de RNA podem incluir a ausência de uma cauda poli-A ou a ausência de 5' "capping". A última levaria normalmente à degradação de RNA através da atividade da 5-3' exonuclease XRN4. A ausência de XRN4 poderia pro- mover o acúmulo de mRNA não protegido, desencadeando dessa maneira sua conversão para dsRNA pela ação combinada de RDR6, SGS3, SDE3 e, possivelmente, WEX. O dsRNA resultante é então processado por uma DCL, muito provavelmente DCL4 (veja o texto), produzindo siRNAs que são exclu- sivamente da classe de tamanho 21 nt e metilados por HEN1. Essas molé- culas podem se engajar em dois conjuntos de reações. Primeiro, elas podem ser usadas como iniciadores por RDR6 para reforçar a produção de dsRNA a partir de modelos de fita única através de um fenômeno conhecido como "transitoriedade" (veja Figura 2). Elas também podem se incorporar a RISC carregado por AGO1 para guiar a clivagem específica para seqüência de RNA homólogo. Os produtos de clivagem resultantes podem ser percebidos como RNAs aberrantes e, assim, poderiam promover ainda a produção de dsRNA, resultando em uma reação amplificada.
Diferente de RDR6, SDE3 não é estringentemente necessária para silenciamento de transgene e assim poderá determinar de maneira a- cessória as estruturas secundárias encontradas em modelos de RDR20. Consequentemente, um homólogo de SDE3 é parte do complexo RDR de Schizosaccharomyces pombe21. SDE3 também poderá atuar em outras eta- pas do silenciamento de RNA por que a proteína homóloga Armitage é ne- cessária para a reunião de RISC em Drosophilal um organismo privado de genes RDR22. WEX está relacionado ao domínio de exonuclease de mut-7, necessário para o silenciamento do transposon e de RNAi em C.elegans, mas seu papel em S-PTGS permanece ambíguo23. A metilação catalisada por HEN1 das terminações hidróxi livres protege sRNAs de Arabidopsis, in- cluindo siRNAs de S-PTGS, da oligo-uridilação, uma modificação que pro- move sua instabilidade (veja a seção sobre miRNA do contexto abaixo)24.
Em um rastreamento de mutante de S-PTGS, uma extensa série alélica de agol foi recuperada, argumentando que entre os 10 parálogos AGO de Arabidopsis, AGO1 está especificamente envolvido nessa via25,26. Até alelos fracos de ago 1 perderam completamente os siRNAs de S-PTGS1 sugerindo inicialmente um papel para AGO1 na produção de siRNA mais do que uma ação26. Entretanto, desde que AGO1 é reconhecida agora como uma atividade slicer no miRNA de planta - e RISCs carregados com siRNA, a perda de siRNAs em ago 1 também pode resultar de sua incorporação po- bre em RISC, intensificando sua modificação. Entretanto, um papel para AGO1 na produção de siRNA - possivelmente ligado à síntese de dsRNA dependente de RDR6 - não pode ser excluído por que alguns mutantes agol deficientes de acúmulo de siRNA de S-PTGS não mostram defeitos em IR- PTGS27.
RDR6, e talvez outros componentes de S-PTGS, também está envolvido no fenômeno de silenciamento relacionado, transitoriedade28,29. Transitoriedade é a "transição" de siRNAs primários de regiões de direcio- namento (que correspondem a um intervalo de seqüência de um RNA dire- cionado) para siRNAs secundários fora do intervalo inicial (figura 2). A Figura 2 mostra como no silenciamento de RNA transitório, uma fonte de dsRNA de siRNAs primários promove a produção de siRNAs secundários em ambas 5' e 3' do intervalo inicialmente direcionado de um transcrito. A produção 5' siRNAs secundários (caso 1) pode ser explicada pela síntese da fita com- plementar dependente de RDR6/SGS3/SDE3 que é iniciada por um dos siRNAs primários. A produção de 3' siRNAs secundários (caso 2) não pode ser explicada por uma reação primada, e é possível que fragmentos de RNA que resultam da clivagem de transcrito dirigida por siRNA primário sejam reconhecidos como aberrantes, iniciando dessa maneira a síntese de dsRNA como em S-PTGS. As reações em 5' e 3' não devem ser consideradas mu- tuamente exclusivas, já que siRNAs produzidos em (2) podem iniciar a sín- tese posterior de dsRNA de acordo com o esquema descrito em (1). DCL4 é mostrada como envolvida putativamente na biogênese de 5' e 3' siRNA se- cundário. Diferente de siRNAs primários (que podem ter 21 nt e 24 nt de ex- tensão), um siRNA secundário é exclusivamente da classe de 21 nt de ex- tensão. Permanece não esclarecido se siRNAs primários com 24 nt podem desencadear o silenciamento de RNA transitório.
Em plantas, essa transição pode ocorrer tanto a 5' quanto a 3' do intervalo primário, possivelmente refletindo as atividades dependentes de iniciador e independentes de iniciador de RDR6. A transitoriedade serve co- mo um mecanismo de amplificação de siRNA que também é responsável pelo extenso movimento de silenciamento através de plantas transgênicas30. siRNAs secundários são exclusivamente da classe de 21 nt de extensão30. Assim, dado que siRNAs de S-PTGS parecem se acumular como espécies de 21 nt32, que DCL4 produz os siRNAs de 21 nt a partir de transcritos de IR14 e que as atividades de DCL4 e RDR6 estão acopladas para a biogêne- se de siRNA de 21 nt que atua em trans (veja abaixo), é tentador especular que DCL4 também é a Dicer preferida para a produção de siRNA em ambos os S-PTGS e transitoriedade (figura 1B, 2).
Qual seria a função biológica de uma via amplificada e não au- tônoma da célula sobre siRNAs de 21 nt ? Pelo menos uma resposta é a defesa antiviral. siRNAs de 21 nt derivados de vírus se acumulam em células infectadas31 e plantas comprometidas pela função de RDR6 são hiper- suscetíveis a vários vírus16,32. Uma resposta amplificada de RDR iniciada por siRNAs virais (transitoriedade) e/ou produzidas por RNAs aberrantes deriva- dos de vírus (via S-PTGS) poderão assegurar que o maquinário de silencia- mento progride na mesma velocidade que as altas taxas de replicação do patógeno. Essa natureza sistêmica da resposta poderia imunizar as células que estão prestes a serem infectadas, resultando, em alguns casos, em ex- clusão viral. Consistente com essa idéia, os meristemas de Nicotiniana ben- thamiana com atividade comprometida de RDR6 podem ser invadidos por vários vírus, embora aqueles tecidos sejam normalmente imunes à infec- ção33
Vias de silenciamento de RNA endógeno envolvidas na regulação pós- transcricional MicroRNAs
Em plantas, miRNAs são produzidos como espécies de sRNA de fita única de 20 a 24 nt, removidos de transcritos não-codificadores endó- genes com extensa estrutura de repetição invertida. miRNAs atuam em trans sobre transcritos-alvo celulares para induzir sua degradação através de cli- vagem ou para atenuar a produção de proteína (figura 1C)34. A Figura 1C mostra como transcritos de (pri)miRNA primário com estruturas de repetição invertida são produtos de RNA polimerase Il (Pol II). A posição do miRNA maduro está enquadrada. A ação nuclear combinada de DCL1, HYL1 e HEN1 produz um miRNA maduro, metilado. Após a exportação nuclear, pos- sivelmente medida pela exportina 5 homóloga de HASTY de Arabidopsis, o miRNA maduro associa-se a RISC carregado de AG01 para promover dois conjuntos possíveis de reações que não são mutuamente exclusivas. Uma primeira reação poderia levar à clivagem endonucleolítica de RNA homólo- go, como dirigidas por siRNAs de 21 nt. Isso poderá resultar em um frag- mento de clivagem poliuridilado 5' - uma modificação que talvez promova sua rápida transformação - e um fragmento 3' mais estável que poderá ser degradado pela exonuclease XRN4. O esquema também acomoda a possi- bilidade de que miRNAs maduros poderão ter efeitos específicos para se- qüência no núcleo (veja o texto). Essas atividades nucleares incluem a cliva- gem de RNA (após a incorporação em um RISC nuclear putativo) assim co- mo a metilação de DNA.
Atualmente, aproximadamente 100 genes MIRNA de Arabidop- sis que se distribuem em 25 famílias distintas foram identificados35, mas possivelmente existam muito mais. miRNAs têm papéis biológicos importan- tes no desenvolvimento da planta e do animal, como evidenciados pelos a- centuados defeitos de desenvolvimento da superexpressão de vários miRNA e de mutantes com perda de função34. Por exemplo, os elementos-chave regulatórios da resposta da planta ao hormônio auxina, que especifica a for- ma do órgão e o eixo do corpo da planta, são controlados pelos miRNAs36'37. miRNAs também regulam a acumulação de fatores de transcrição (TFs) en- volvidos na identidade/número do órgão floral38,39, forma da folha40, assime- tria abaxial/adaxial da folha41'42 e formação de raiz lateral43. Além disso, D- CL1 e AG01, envolvidos na via de miRNA, são eles próprios regulados por miRNAs44,45. Entretanto, miRNAs de planta com alvos confirmados envolvi- dos no metabolismo primário e secundário foram identificados36,46, indicando que seus papéis não estão confinados a ajustes do desenvolvimento. miR- NAs devem, de fato, ter amplas implicações na fisiologia da planta e na a- daptação ambiental.
Transcrição e bioaênese de miRNA
A maioria dos genes de miRNA de planta e animal residem en- tre genes que codificam proteína ou dentro de íntrons47. Muitos são, prova- velmente, unidades de transcrição independentes e seus padrões de ex- pressão geralmente mostram excelente especificidade do tipo tecidual ou até celular, em concordância com um papel na padronização e na manutenção de estados celulares diferenciados48,49. Entretanto, os fatores de transcrição ou mecanismos pós-transcricionais que especificam a expressão de gene de miRNA de planta permanecem desconhecidos. Muitos dos transcritos de miRNA primário humano (pri-miRNAs) são sintetizados pela RNA polimerase II (Pol II), devido ao fato de que pri-miRNAs têm 5' caps típicos em Pol II e caudas de poli-A, sua síntese é inibida por fármacos que inibem Pol II e Pol II é encontrada em seus promotores in vivo50. Do mesmo modo, embora menos abrangente, as evidências também apontam para Pol II como a poli- merase principal na produção de pri-miRNAs de planta35.
Após a transcrição, pri-miRNAs de mamífero são processados através de uma via biossintética bem-definida. A RNAseIII Drosha e seu co- fator essencial DGCR8/Pasha - ambos constituintes do complexo Micropro- cessador nuclear - catalisam cortes iniciais na base do "stem-loop" de pri- miRNAs para produzir pré-miRNAs. Os pré-miRNAs são processados por Dicer em miRNAs maduros após a exportação nuclear dependente de Ex- portina-551. As plantas não têm um equivalente direto de Microprocessador. Em Arabidopsis, a biossíntese de miRNA depende especificamente de D- CL1 52,53 que e necessária para o processamento gradual nuclear de pri- miRNAs. Se a própria DCL1 catalisa todas as reações envolvidas é incerto54. HASTY homólogo de exportina-5 de planta está envolvido na biogênese de miRNA55, mas seu papel exato não está claro em mamíferos onde o produto pré-miRNA do Microprocessador é uma carga verificada experimentalmen- te56. Mutantes hasty exibem acumulação diminuída de alguns, embora nem de todos, miRNAs em ambas as frações nuclear e citoplasmática55. Essas observações apoiam a existência de sistema de exportação de miRNA inde- pendentes de HASTY e questionam se miRNAs ou complexos contendo miRNAs são de fato cargas diretas de HASTY.
Em plantas e animais, o processamento de Dicer ocorre em as- sociação com proteínas que se ligam a dsRNA específico. Primeiramente observado com o complexo Dcr2-R2D2 necessário para o carregamento de RISC na via de RNAi de Drosophila57, isso também foi encontrado agora pa- ra o complexo Dcr1-Loqs envolvido na via de miRNA de DrosophHa58 e Di- cer-TRBP assim como Dicer-PACT em células humanas59,60. DCL1-HYL1 constituem um complexo similar que atua no processamento de pri-miRNA na via de miRNA de Arabidopsis (figura 1C)61"64 Em todos os casos, Dicer produz um duplex entre o miRNA maduro (miR) e sua fita complementar (miR*)65. A fita miR é geralmente menos estavelmente pareada em sua ex- tremidade 5' e é, consequentemente, carregada como a fita-guia em RISC, enquanto que a fita miR* é degradada66 (figura 1C). Na via de RNAi de Dro- sophila, R2D2 atua como um sensor de assimetria termodinâmica de siRNA duplexes e Loqs, TRBP, PACT e HYLI podem possivelmente desempenhar papéis similares.
HEN-1 é um metil transferase que se liga a S-adenosil metionina (SAM) que metila as terminações 2' hidróxi de miR/miR* duplexes, uma rea- ção aparentemente específica para o reino vegetal67,68. A metilação protege miRNAs de atividades que uridilam e degradam sRNAs de planta na extre- midade 3'24, mas não é necessária para a clivagem guiada de miRNA de- pendente de RISC em extratos de Arabidopsis (Qi, 2005#5064). Todas as classes de sRNAs de plantas conhecidas são metiladas por HEN124, mas essa modificação parece impactar diferencialmente sobre a estabilidade de sRNA, talvez refletindo interações variáveis entre HEN1 e complexos distin- tos de proteína ou populações distintas de sRNA. Por exemplo, o supressor de silenciamento viral Hc-Pro previne a metilação de siRNAs derivados de vírus, mas não de miRNAs69, e vários alelos mutantes de hen 1 existem, nos quais a acumulação de miRNA, mas não de siRNAs de S-PTGS, é prejudi- cada19.
Atividades de miRNA de planta
A maioria dos miRNAs identificados de planta têm complemen- taridade quase perfeita com seus alvos e promovem sua clivagem. Isso é seguido pela oligo-uridilação e rápida degradação do fragmento de clivagem 5'70 e a degradação lenta do fragmento de clivagem 3' mediada, pelo menos em alguns casos, por XRN471 (figura 1C). miRNAs de animal exibem geral- mente complementaridade imperfeita e reprimem a produção de proteína a partir de mRNAs-alvo intactos. Entretanto, é possível que a ação de ambos os miRNAs de planta e animal resulte de uma combinação de ambos os pro- cessos, cujas respectivas contribuições provavelmente variam dependendo da extensão da complementaridade miRNA:alvo. Embora o(s) RISC(s) que atua(m) na via de miRNA de planta permaneça(m) mal definido(s), AG01 se associa com miRNAs e os alvos de miRNA são clivados in vitro pela AG01 purificada por imuno-afinidade. Assim, em plantas, o mesmo Argonauta pa- rece funcionar como uma Slicer para ambos os miRNA e RISCs carregados com siRNA, contrastando com as situações em Drosophila e C. elegans. Componentes de RISC de planta diferentes de AG01 aguardam identifica- ção e pode ser até que vários RISC alternativos existam, dado o número de genes similares a AGO em Arabidopsis.
miRNAs maduros de planta são detectados em ambas as fra- ções celulares nuclear e citossólica55. Igualmente, RISC programado com miRNA de let-7 pode ser imunopurificado a partir de frações celulares nucle- ares humanas72, indicando que miRNAs de planta e de animal podem ter funções nucleares (figura 1C). Essas podem incluir a clivagem de RNA1 co- mo sugerida pela atividade direcionada ao íntron de miR173 de planta73, mas também pode compreender modificações de DNA homólogo74. Assim, em Arabidopsis, o reconhecimento de miR165 do transcrito combinado PHB aparentemente direciona a c/s-metilação sobre o DNA molde de PHB. Essa metilação é enigmática, entretanto, já que ela ocorre a vários kb a jusante do sítio de ligação de miRNA74. É concebível que a clivagem induzida por miR- NA do transcrito PHB nascente desencadeie a formação de dsRNA iniciada na terminação 3' do transcrito através de uma atividade de RDR indepen- dente de iniciador com processabilidade moderada. A produção de siRNA resultante poderá então estar confinada à terminação 3' e poderá mediar a metilação de DNA de acordo com esquemas discutidos em uma seção pos- terior dessa revisão. Intrigantemente, alguns, embora poucos, siRNAs cor- respondendo a partes a jusante de vários alvos de miRNA foram detectados em Arabidopsis, embora nenhum fosse diretamente complementar à se- qüência de PHB metilado75. A metilação direta de DNA guiada por miRNA em eis e/ou em trans também foi sugerida a partir da observação de que al- guns miRNAs de 21 nt de Arabidopsis acumulam-se como uma segunda espécie de 24 nt em estágios específicos do desenvolvimento65. siRNAs transatuantes: mistura de ações de miRNA e siRNA
siRNAs transatuantes (ta) são uma classe recentemente desco- berta de sRNAs endógenos de planta. Eles derivam de transcritos não- codificadores, de fita única, os pri-tasiRNAs, que são convertidos em dsRNA por RDR6-SGS3, dando origem a siRNAs produzidos como espécies distin- tas em uma fase de 21 nt específica76,77 (figura 1D). A Figura 1D mostra co- mo transcritos primários (pri) transatuantes de siRNA são RNAs não- codificadores desprovidos de extensas estruturas de "fold-back". Um miRNA incorporado em RISC carregado com AG01 guia a clivagem endonucleolíti- ca do pri-tasiRNA. Esse corte gera dois fragmentos de clivagem, um dos quais age como um modelo para RDR6, levando à produção de dsRNA. DCL4 inicia o processamento exclusivamente a partir de terminações de ds- RNA que correspondem ao sítio de corte do miRNA inicial, para produzir ta- siRNAS planejados em etapas que são metilados por HEN1. produzir tasiR- NAS guiam, subseqüentemente, a clivagem de mRNAs homólogos, logo in- corporados em RISC carregado com AG01. As reações coloridas descritas no enquadramento ilustram a importância do corte promovido do miRNA ini- ciai na determinação do estágio apropriado para tasiRNAs (1). O planeja- mento incorreto (2) poderá resultar na produção de RNAs pequenos "offtarget".
O envolvimento de RDR6-SGS3 é sugestivo da biogênese de siRNA em S-PTGS, mas as necessidades genéticas dessas vias não são idênticas, por que a acumulação de tasiRNA é normal no mutante hipomórfi- co ago 1-27 e nos mutantes imperfeitos em SDE3 e WEX76. Muito similares a miRNAs de planta, tasiRNAs maduros guiam a clivagem e a degradação de transcritos celulares homólogos. Até agora, Ioci que gera tasiRNA (TAS1- 3) foram identificados apenas em Arabidopsis73, mas eles provavelmente existem em outras espécies de planta e possivelmente em outros organis- mos que contêm RDRs tais como C. elegans ou N. crassa.
A produção de tasiRNA envolve uma mistura interessante de ação de miRNA e o maquinário da biogênese de siRNA. Pri-tasiRNAs con- têm um sítio de ligação para miRNA que guia a clivagem em um ponto defi- nido. O corte guiado do miRNA inicial tem duas conseqüências importantes. Primeiro, ele desencadeia a transitoriedade mediada por RDR6 sobre os produtos de clivagem de pri-tasiRNA, permitindo a produção de dsRNA tanto a 5' quanto a 3' do sítio de clivagem73. Segundo, ele fornece uma terminação bem-definida para dsRNA importante para a exatidão de uma reação de "sli- cing" em estágios, realizada por DCL4, que produz tasiRNAs maduros (figura 1D).
Qual o papel biológico de tasiRNAs? rdr6, sgs3 e dcl4, todos e- xibem acelerada transição da fase juvenil para adulta12,13 77·78, indicando que tasiRNAs podem regular essa característica. Os alvos de tasiRNA incluem dois fatores de resposta à auxina (ARF)TFs e uma família de proteínas de repetição de pentatricopeptídeo, embora não haja evidência para o envolvi- mento de apenas um alvo funcionalmente caracterizado (ARF3/ETTIN) na transição da fase juvenil para adulta79, nem foram observados defeitos hete- rocrônicos na inserção de mutantes que rompem os Ioci de TAS1 ou TAS276,78 Mutantes em AG07/ZIPPY exibem um defeito de transição de fa- se similar80 sugerindo que AG07 poderia ser parte de um RISC programado para tasiRNA específico, embora tasiRNAs coimunoprecipitam com AG01 para formar um RISC competente para clivagem {Qi, 2005 #5064}.
Transcrito de siRNAs antissenso natural
Um exemplo foi descrito recentemente no qual um par de genes vizinhos sobre fitas opostas de DNA (genes eis-antissenso) dá inicio a uma espécie de siRNA único a partir da região de superposição de seus transcri- tos81. Essa espécie de siRNA de 24 nt - denominado de transcrito de siRNA antissenso natural (nat-siRNA) - guia a clivagem de um dos dois transcritos parentes e é produzido em uma via única que envolve DCL2, RDR6, SGS3 e a subunidade NRPDIa similar a RNA polimerase dependente de DNA atípi- co (veja a discussão de vias de silenciamento de RNA direcionadas à croma- tina abaixo). A clivagem guiada por nat-siRNA desencadeia a produção de uma série de siRNAs de 21 nt planejados, secundários, uma reação similar à biogênese de tasiRNA exceto que a Dicer envolvida é DCL1. O papel de nat- siRNAs secundários não está esclarecido atualmente, mas a clivagem guia- da por nat-siRNA primário contribui para a adaptação ao estresse e, dado o grande número de pares de genes eis antissenso em plantas e outros ge- nomas82,83, esse exemplo isolado pode refletir um amplo mecanismo de re- gulação de gene.
Vias de silenciamento de RNA direcionadas para cromatina
Além de atuar sobre RNA1 siRNAs podem orientar a formação de heterocromatina transcricionalmente silenciosa em fungos, animais e plantas. A heterocromatina de planta é caracterizada por dois conjuntos de modificações: metilação de citosinas e de resíduos de histona Iisina específi- cos (histona 3 Lys9 (H3K9) e histona 3 Lys27 (H3K27) em Arabidopsis)84. Em alguns organismos, essas modificações atuam como plataformas de u- nião para proteínas que promovem condensação de cromatina. Citosina me- tiltransferases de Arabidopsis incluem o DRM 1/2 rigorosamente homólogo necessário para a metilação de todo DNA de novo, MET1 necessária para a manutenção replicativa de metilação em sítios CG e CMT3 necessária para a manutenção em sítios CNG e CNN assimétricos (revisados em 85,86). His- tona metiltransferases envolvidas na metilação de H3K9 e H3K27 pertencem ao conjunto de homólogos de Su(Var)3-9 e incluem KYP/SUVH4 e SUVH2 em Arabidopsiss7
Em vários organismos, siRNAs que correspondem a vários Ioci silenciosos endógenos incluindo retrotransposons, 5S rDNA e repetições centroméricas, foram encontrados85. Eles são referidos como siRNAs cis- atuantes (casiRNAs) por que eles promovem modificações de DNA/histona nos Ioci que os geram. Em plantas, casiRNAs são metilados por HEN1 e são predominantemente de 24 nt de extensão. Seu acúmulo é especificamente dependente de DCL3 e, em muitas circunstâncias, de RDR2. A acumulação de casiRNA também requer uma isoforma (que contém as subunidades N- RPDIa e NRPD2) de uma RNA polimerase dependente de DNA putativo e específico de planta, denominada PoIIV88"90. PoIIV pode atuar como um RNA polimerase específica para silenciamento que produz transcritos para serem convertidos em siRNAs pelas ações de RDR2 e DCL3. Entretanto, muitos aspectos das atividades de silenciamento relacionadas à PoIIV permanecem obscuras. Portanto, é incerto se PoIIV possui de fato atividade de RNA poli- merase. Além disso, uma isoforma distinta de PoIIV com as subunidades NRPDIb e NRPD2 é necessária para a metilação promovida por siRNAs derivados de IR com homologia de promotor de transgene, sugerindo que a ação de complexos de PoIIV pode não ser confinada à biogênese de siR- NA91. Finalmente, a necessidade de NRPDIa para a acumulação de nat- siRNA na presença de ambos mRNAs antissenso (produzidos por PollI) su- gere que PoIIV pode ter funções relacionadas ao silenciamento independen- tes da atividade de RNA polimerase dependente de DNA81. Outros fatores envolvidos na metilação promovida por siRNA derivado de IR incluem o fator de remodelagem de cromatina DRD192 e a histona desacetilase putativa HDA693, cuja atividade pode ser necessária para fornecer histona Iisinas Ii- vres para metilação por enzimas KYP/SUVH (figura 3). Atualmente, é incerto se DRD1 e HDA6 também estão implicados no silenciamento de Ioci endó- genos. siRNAs de 24 nt podem atuar em um complexo RISC, talvez relacio- nados ao complexo de silenciamento transcricional induzido por RNA, RITS, caracterizado na fissão de levedura94. Esse complexo pode conter AG04 por que mutantes de ago 4 têm fenótipos que se superpõem com aqueles de rdr2, dcl3, nrpdla e rtrpd211. Nos Ioci afetados pelas mutações acima, a me- tilação de CNG e particularmente de CNN está acentuadamente reduzida, apesar da perda de metilação de CG ser menos pronunciada, consistente com a observação de que a metilação do promotor de CG dependente de MET1 pode ser mantida na ausência de um RNA viral codificado desenca- deador de TGS95.
O próprio DNA ou transcritos nascentes são ambos possíveis alvos de casiRNAs (figura 3A e 3B, respectivamente). Na Figura 3A, o trans- crito polll/pollll nascente é clivado através da ação de AG04 programada por siRNA, resultando em um RNA truncado que é convertido em dsRNA pela ação de RDR2. O dsRNA é então processado por DCL3 em siRNAs de 24 nt que direcionam depois a clivagem de transcritos nascentes e podem guiar, possivelmente, atividades seqüenciais de histona desacetilases (por exemplo, HDA6), histona metil transferases (por exemplo, ΚΥΡ, SUVH2) e/ou DNA metiltransferases(CMT3/DRM). Não está claro se a modificação de histona precede a metilação de DNA ou não. O processo pode envolver também fatores de remodelagem de cromatina promovidos por siRNA tais como DRD1. As posições de PoIIVa e PoIIVb naquelas reações estão atual- mente mal definidos de forma inadequada.
Na Figura 3B, os mesmos efetores estão envolvidos, mas, nes- se cenário, RDR2 usa transcritos nascentes como modelos e AG04 carre- gada com siRNA é recrutada para guiar as modificações de cromatina mais do que a clivagem de RNA.
Na via de RNAi heterocromática de S. pombe que resulta em metilação de H3K9 (mas não em citosina), a transcrição-alvo por Polll é ne- cessária para a ação de siRNA e Ago 1 se associa com transcritos nascen- tes96. A metilação de histona dirigida por siRNA do promotor EF1 A humano também foi dependente da transcrição ativa de Polll97. Entretanto, o parea- mento de base direto de siRNA-DNA não pode ser excluído. Por exemplo, em experimentos que envolvem siRNAs direcionados por promotor derivado de vírus.o intervalo de DNA metilado sobre os promotores direcionados com- bina com a fonte de siRNA primário e não se estende adicionalmente sobre quaisquer das regiões transcritas95. Se siRNAs interagem de fato diretamen- te com DNA, como a dupla hélice se torna disponível para o pareamento com siRNA? PoIIV poderia facilitar esse acesso, por exemplo, pelo desloca- mento ao longo do DNA com helicases associadas. Os mecanismos molecu- lares precisos subjacentes ao recrutamento específico para seqüência de citosina e histona metiltransferases para silenciar Ioci também permanecem difíceis de entender, já que as associações entre sRNA e tais enzimas foram relatadas em apenas um único caso, em células humanas97. De fato, uma alça autosustentável, na qual a produção de siRNA e a metilação de DNA/histona são mutuamente dependentes, parece existir em Ioci silencio- sos endógenos, surgindo a possibilidade de que a produção de siRNAs dire- cionados a cromatina in vivo podem mesmo ser uma conseqüência mais do que uma causa da metilação de DNA/histona (figura 3).
A via de RDR2/DCL3/NRPD1/AG04 tem papéis claros no con- trole de transposon e na manutenção da integridade do genoma em plantas, por que a perda de casiRNA causada pelas mutações nos fatores acima rea- tiva a atividade de transposon. Essa via também pode manter a heterocro- matina em repetições centroméricas, que parece ser mandatório para a se- gregação exata de cromossomo em S. pombe98. O maquinário que gera siR- NA de 24 nt também pode atuar para silenciar genes que codificam proteína. Por exemplo, a expressão do regulador-chave negativo de florescência FLC é mantido em nível baixo no ecotipo de Arabidopsis na florescência precoce devido à presença de um transposon intrônico que causa modificações re- pressivas na cromatina através da ação de uma via dependente de N- RPD1a/AG0499. Entretanto, vários mecanismos adicionais, não necessaria- mente mediados por siRNAs, são responsáveis pela regulação epigenética de expressão de genes em plantas. Por exemplo, em Arabidopsis, a muta- ção do fator de remodelagem da cromatina ODM1 tem conseqüências muito mais amplas sobre o silenciamento da cromatina do que qualquer mutante simples conhecido no silenciamento do maquinário de RNA100,101. Além dis- so, a regulação de gene por proteínas similares a policomb em Arabidopsis não está ligada ao silenciamento de RNA102. Tabela 1 Sinopose proteinas com papeis em vias de RNA pequeno em Arabidopsis
<table>table see original document page 19</column></row><table> Tabela 1
<table>table see original document page 20</column></row><table> Resistência à doença em plantas e animais
Há uma extensa evidência de que a via de RNAi em planta de- sempenha papéis essenciais na defesa antiviral104. RNA de fita dupla deri- vado de genomas virais é fragmentado em siRNAs pelas atividades redun- dantes de ambas DCL4 (a principal Dicer antiviral) e DCL2 (uma substituta de DCL4)105. Esses siRNAs então incorporados em RISC (o Complexo de Silenciamento Induzido por RNA) para mediar a "slicing" de transcritos virais e dessa maneira reduzir a carga viral global em células de planta105. AG01 é provavelmente uma proteína efetora de RISC carregado com siRNA, embora outros parálogos de AGO também possam estar envolvidos106. Um sinal de célula para célula e de longa distância para o silenciamento de RNA também explica a difusão sistêmica da resposta imune inata antiviral através das plantas104. Como uma estratégia de contra-ataque, os vírus codificam proteí- nas supressoras que são direcionadas contra processadores e efetores prin- cipais de silenciamento antiviral. Por exemplo, a proteína P19 de tombusví- rus seqüestram siRNAs e previnem seu uso por RISC107, a proteína 2b do vírus Cucumber mosaic interage fisicamente com AG01 e inibe a atividade de clivagem106, e a proteína P38 do Turnip crinckle virus (vírus do encres- pamento do nabo) inibe acentuadamente a atividade de DCL4105. DCL3 (que produz siRNAs heterocromáticos) e DCL1 (que produz miRNAs) não pare- cem ter um impacto significativo sobre a acumulação de vírus na planta.
Além da defesa antiviral, existe atualmente pouca informação disponível sobre o papel das vias de RNA pequeno na defesa contra outros tipos de patógenos incluindo bactérias e fungos, que são responsáveis pelas principais perdas econômicas mundiais. Em plantas, a resistência a bacté- rias e fungos tem sido mais exaustivamente estudada no contexto de intera- ções específicas para o gênero, nas quais uma proteína de resistência (R) específica protege a planta contra um gênero particular de patógeno108. Esse reconhecimento altamente específico leva à ativação de respostas de defesa e morte celular local referida como "resposta hipersensível" (HR). Um exem- plo bem-caracterizado de indução de HR através de interação específica para o gênero é fornecido pelo gene RPS2 de Arabidopsis que confere resis- tência à cepa DC3000 de Pseudomonas syringae pv. tomato (Psf DC3000) produzindo a proteína desencadeadora AvrRpt2 correspondente. A presença de ambos os componentes RPS2 e AvRpt2 levam à resistência, enquanto que a ausência de um ou outro componente leva à doença108.
Ao lado da interação específica para o gênero está um meca- nismo de defesa basal que desempenha um papel principal na "resistência não-hospedeira", que é responsável pelo fato da maioria das plantas e ani- mais ser resistente à maioria dos patógenos. A defesa basal conta com am- bas as respostas constitutiva e induzível. A resposta da defesa basal induzí- vel é desencadeada após a percepção de estimuladores gerais conhecidos como "padrões moleculares associados a patógeno" (PAMPs). Um de tais PAMP é um motivo conservado com 22 aminoácidos (flg-22) da flagelina bacteriana109, que é reconhecido em diversas espécies de planta, incluindo A. thaliana. A percepção de flg-22 desencadeia uma resposta imune inata em plantas que eleva a resistência a cepa virulenta Pst DC3000110. Como uma estratégia de contra-ataque, patógenos bacterianos evoluíram para su- primir as respostas de defesa basal pela injeção de proteínas TTS1 referidas como "efetoras"111. Esses efetores bacterianos são, portanto, fatores de viru- lência: sua ausência causa uma diminuição de sintomas da doença e uma inabilidade geral do patógeno em proliferar sobre as folhas. miRNAs e a resposta de defesa basal
Foi mostrado, recentemente, que miR393, um miRNA canônico e conservado de planta, é rapidamente induzido por flg-22, levando à re- pressão de toda a cascata de sinalização que normalmente orquestra a res- posta ao fitormônio auxina112. Esse relato é de Navarro, L., et ai, Science (2006) 312:436-439, incorporado aqui por referência. A repressão resultante da sinalização de auxina restringe o crescimento bacteriano, implicando a auxina na suscetibilidade a doença e a supressão da sinalização de auxina mediada por miRNA na resistência à doença. Teorizou-se que miR303 não era um exemplo isolado e que um grande conjunto de miRNAs pode atuar como reguladores positivos da resposta de defesa da planta a patógenos.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Um espectro específico de miRNAs de planta e animal confere resistência aumentada a patógenos virulentos. Foi mostrado que plantas deficientes na acumulação de miRNA são hiper-suscetíveis a patógenos bacterianos não-virulentos. Como um corolário, foi mostrado que bactérias virulentas desenvolveram estratégias para suprimir a via de miRNA em plan- tas, por exemplo, pelo uso de algumas proteínas secretadas do tipo Ill (TTS) injetadas.
Em um aspecto, a invenção é promovida para um método de modular a via de miRNA em plantas e animais que compreende a introdução em uma planta ou animal de um construto de ácido nucleico, que compreen- de um promotor constitutivo ou responsivo a patógeno operativamente ligado a uma seqüência de pri-miRNA responsiva-padrão molecular associada ao patógeno (PAMP) ou a uma seqüência que codifica um componente envolvi- do na biogênese ou atividade de miRNA, incluindo ainda elementos cis- regulatórios dentro ou a 5' do dito promotor. Em uma modalidade particular, a via de miRNA modulada é diferente daquela de miR393. Em outra modali- dade ainda, a dita via regulada inclui miR393.
Em uma modalidade, tal modulação da via de miRNA em plan- tas e animais é realizada de tal maneira que os efeitos adversos sobre o de- senvolvimento da planta e do animal são evitados ou minimizados.
Em outra modalidade, são fornecidas composições e métodos para conferir resistência aumentada a patógenos, em plantas e animais, pela modulação seletiva da via de miRNA. Em uma modalidade, a via de miRNA modulada é diferente daquela de miR393; em outra modalidade ainda, a via inclui aquela de miR393.
A invenção fornece métodos para identificar compostos úteis na modulação seletiva da via de miRNA em plantas e animais pelo uso de su- pressores derivados de bactéria de silenciadores de RNA como sondas mo- leculares. Tais fatores que silenciam RNA provavelmente interagem direta- mente com alguns dos supressores de silenciamento bacteriano como des- crito acima.
A invenção também é dirigida para a identificação de compostos ou o estabelecimento de abordagens genéticas para agir contra a supressão bacteriana de silenciamento de RNA em ambas as células de planta e ani- mal. As abordagens globais conferem resistência a patógenos de planta e animal.
As abordagens bioquímicas e genéticas conhecidas por aqueles versados na técnica são usadas para identificar alvos Bss adicionais. Essas abordagens incluem, mas não são restritas, a rastreamento de duplo híbrido de levedura de bibliotecas de cDNA de planta ou imunoprecipitações bio- químicas usando versões marcadas de Bss. Os componentes identificados interagem (tanto fisicamente quanto geneticamente), possivelmente, com, por exemplo, DCL1, AG01, HEN1, SERRATE e podem ser usados ainda para manipular especificamente atividades de miRNA, usando os métodos descritos acima. Significativamente, essas proteínas Bss também são usa- das para inibir a função de miRNA em células de animais como observado com alguns supressores virais de silenciamento de RNA derivados de vírus patogênicos de planta que também são funcionais em células de animais.
Outro aspecto da invenção tira vantagem da habilidade de Bss de suprimir o silenciamento de transgenes, intensificando dessa maneira a produção de proteínas recombinantes usando hospedeiros nos quais as pro- teínas Bss são eficazes. Em uma modalidade, tais hospedeiros são plantas. A célula ou planta recombinante hospedeira é modificada para conter um sistema de expressão para a proteína desejada, tal como um terapêutico fundido com uma proteína Bss. Técnicas bioquímicas e de biologia molecu- lar padronizadas são empregadas para construir sistemas de expressão a- dequados e para modificar células hospedeiras para a produção da proteína desejada. Alternativamente, construtos separados para a proteína Bss e pa- ra a proteína desejada podem ser usados e cotransformados na mesma cé- lula ou organismo. Em virtude da presença da proteína Bss, os mecanismos celulares que poderiam silenciar sua expressão são inibidos. Assim, o nível de produção é intensificado e, se a proteína desejada é produzida com uma seqüência marcadora, a purificação é simplificada.
Outra aplicação emprega a disponibilidade de proteínas Bss pa- ra identificar compostos que reprimam a infecção bacteriana pelo rastrea- mento de candidatos a compostos para melhorar os efeitos de tais proteínas. Os compostos identificados também podem ser úteis em outras aplicações quando os mecanismos de silenciamento estão desejavelmente aumenta- dos. Nesse método, os compostos que contra-atacam experimentalmente a supressão desencadeada por Bss de silenciamento de RNA e restauram um fenótipo da nervura clorótica normal são selecionados. Compostos endóge- nos que têm esse efeito também podem ser identificados pela mutageniza- ção de plantas nas quais o silenciamento foi suprimido usando as proteínas Bss e pela identificação de alterações genéticas em plantas nas quais o si- lenciamento de RNA foi restaurado.
Além disso, pelo aumento constitutivamente ou condicionalmen- te da atividade dos componentes da via de miRNA identificados como aqui descrito acima, a resistência aumentada a um amplo espectro de patógenos é obtida em uma variedade de espécies de cultivo. Esse método também permite a resistência aumentada, induzível, que é desejável por que ela não é, ou é menos, prejudicial para o desenvolvimento e fisiologia da planta em condições não infecciosas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figuras 1A-1D mostram as vias de silenciamento de RNA pós- transcricionais em plantas. A Figura 1A mostra a via IR-PTGS; Figura 1B mostra a via S-PTGS; Figura 1C mostra a via de micro(mi)RNA; e a Figura 1D mostra a via transatuante (ta)siRNA; e a Figura 1D mostra a via transatu- ante (ta)siRNA.
Figura 2 mostra o silenciamento transitório de RNA.
Figuras 3A e 3B mostra o silenciamento de RNA atingido por cromatina, mostrando dois de vários cenários mutuamente exclusivos que possivelmente são responsáveis por modificações de cromatina direciona- das a siRNA em Ioci endógenos. Ambos os cenários são baseados em es- quemas circulares e amplificados nos quais a produção de siRNA e a modifi- cação de cromatina reforçam um ao outro.
Figura 4 mostra a super-representação de elementos W-box no promotor AtmiR393b.
Figura 5 mostra formações típicas "stem loop" associadas com pri-miRNA.
Figuras 6A e 6B demonstram a suscetibilidade de mutantes de- ficientes em miRNA a patógenos fúngicos e bacterianos. A Figura 6A mostra a suscetibilidade a patógenos fúngicos e a Figura 6B a patógenos bacteria- nos.
Figuras 7A-7E mostram resultados experimentais que confir- mam que a via de miRNA confere resistência basal assim como não hospe- deira a bactérias.
Figura 8A-8D demonstram que a infecção por TuMV suprime a resistência basal assim como não-hospedeira a bactérias.
Figuras 9A-9C demostram que a cepa virulenta Pst DC3000 po- de suprimir indução de alguns miRNA responsivos a PAMP.
Figuras 10A-10D fornecem resultados experimentais que de- monstram que PstDC3000 codifica a proteína secretada do Tipo Ill que su- prime a biossíntese e/ou atividade de miRNA.
FiguraS 11A-11F fornecem resultados experimentais que de- monstram que HopTI-1 suprime uma função de silenciamento mediada por RISCmiRNA.
Figuras 12A-12D apresentam resultados experimentais que de- monstram que a superexpressão de HopYI suprime a função de RISCmiRNA.
Figuras 13A-13E apresentam resultados experimentais que mostram que HopUI suprime a inibição traducional desencadeada de miR- NA e siRNA.
MODOS DE REALIZAR A INVENÇÃO
Pela exploração dos elementos de resistência a patógeno e seu relacionamento com as vias de silenciamento, determinou-se vários fatores e métodos para aumentar a resistência de plantas e animais à infecção por patógeno, para identificar componentes críticos para a resistência e para rastrear compostos e agentes que são úteis na intensificação da resistência. Por exemplo, componentes conhecidos da via de miRNA (por exemplo, D- CL1, AG01, ΗΕΝ1, SERRATE) e os componentes identificados como des- crito aqui acima (por exemplo, AtGRP7, GRP8) são modificados tal que eles se tornam resistentes à ação de proteínas Bss. A manipulação de alelos re- sistentes desses componentes é obtida de acordo com métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, mas não limitado, a mutagênese direcionada ao sítio de aminoácidos-chave e transgênese assim como Tar- geted Induced Local Lesions in Genomes (TILLING) de espécies de cultivo não-transgênicas. O método descrito fornece resistência natural e/ou mani- pulada à ação de Bss e confere dessa maneira defesa basal aumentada a espécies de cultivo contra patógenos virulentos.
As seqüências identificadas no Exemplo 1 abaixo e listadas na Tabela 2 que expressam pri-miRNA são operativamente ligadas a promoto- res adequados e usadas para modificar plantas para conferir resistência à infecção virulenta. Uma dessas seqüências, miR393 foi anteriormente mos- trada como sendo induzida transcricionalmente por flg-22. Sua superexpres- são constitutiva confere resistência aumentada a PsíDC3000 virulento (Na- varro, L., et ai, Science (2006)312:436-439). Seqüências adicionais de pri- miRNA assim identificadas são usadas para elevar a resistência da planta contra um amplo espectro de patógenos. Essas seqüências individuais ou em conjuntos, designadas pato-miRNAs ("patho-miRNAs"), são expressas transgenicamente em plantas usando métodos conhecidos por aqueles ver- sados na técnica, tais como para a superexpressão de um dos dois Ioci de miR393 (Navarro, L., et ai, supra)). A expressão dessas seqüências (+40 nt a montante e a jusante) tanto é constitutiva quanto, preferivelmente, é dirigi- da por promotores que são amplamente conhecidos por serem responsivos a patógenos bacterianos, fúngicos e virais. Exemplos de tais promotores in- cluem, mas não estão restritos a WRKY6 e PR1. O método fornece resistên- cia aumentada, induzível, o que é desejável por que ela não é, ou é menos, prejudicial ao desenvolvimento e fisiologia da planta em condições não- infectantes.
Além disso, vários desses pato-miRNAs são conservados atra- vés de espécies de planta (monocotiledôneas e dicotiledôneas), indicando que pato-miRs derivados de Arabidopsis poderão ser diretamente eficazes em uma grande variedade de culturas.
São preparados construtos em que, em uma modalidade, um promotor responsivo constitutivo ou de patógeno (incluindo, mas não Iimita- do, por exemplo, ao promotor WRKY6, o promotor PR1 e similares) está o- perativamente ligado a uma seqüência de ácido nucleico que é transcrita em uma ou mais seqüências individuais de pato-miR para conferir resistência a patógenos não relacionados em várias espécies de planta, incluindo cultivos.
Análises computadorizadas revelam uma super-representação de elementos regulatórios específicos localizados a 1,5 ou 2 quilobases (kb) a montante das estruturas "stem-loop" de pato-miR. Alguns desses elemen- tos regulatórios foram descritos previamente: como um exemplo, o promotor At-miR393a responsivo a flg-22 contém 10 elementos W-box, enquanto que o promotor At-miR393b, que não é responsivo ao tratamento com flg-22, contém apenas 3 elementos W-box. Veja Figura 4. A Figura 4 mostra a su- per-representação do elemento W-box dentro da seqüência promotora At- miR393a. 1,5 quilobase a montante da estrutura "stem-loop" de At-miR393a foram extraídos e analisados quanto a representação de elementos W-box.
Em vermelho na figura e sublinhado na seqüência fornecida abaixo está o núcleo da seqüência do elemento W-box. Também foi identificado uma su- per-representação do elemento caracterizado AuRE responsivo à auxina assim como o elemento RY dentro de subconjuntos de promotores pato-miR.
Além disso, foi encontrada uma super-representação de novos elementos referidos como elemento de MiRNA Induzido por Flg-22 (FIM). Esses últimos representam uma fonte original de elementos de DNA responsivos a patóge- no a serem usados e manipulados em abordagens convencionais para in- tensificar a resistência a patógeno. Tais abordagens incluem a geração de segmentos quiméricos de DNA contendo múltiplas cópias desses conheci- dos ou novos elementos c/s-regulatórios. O método aqui descrito é assim usado para hiperinduzir especificamente a expressão de genes que codifi- cam proteína ou genes que não-codificam proteína (por exemplo, genes de miRNA) em infecções por patógenos, em plantas, incluindo cultivos. Assim, um promotor artificial responsivo a patógeno carregando múltiplas cópias de elemento FIM ou, alternativamente, um promotor nativo pato-miR, operativamente ligado a uma seqüência codificadora de genes de defesa da planta ou a seqüências não-codificadoras (por exemplo, sequên- cias de miRNA) que desempenhem um papel na resistência à doença, po- dem ser usados no controle da expressão para resistência a doença. Essa abordagem permite a expressão condicionada e eficaz de genes que codifi- cam proteína ou de genes que não-codificam proteína durante infecções por patógenos.
Como a via de miRNA é a principal via de silenciamento de RNA em vertebrados superiores, e como as células de mamíferos são comumente infectadas por patógenos bacterianos TTS, mecanismos similares de defe- sa/contradefesa são operacionais em mamíferos. Achados recentes também realçam o papel-chave de miRNAs na resposta imune inata de animal. Pelo uso de genes sensores de miRNA similares àqueles exemplificados aqui para Arabidopsis, mas incorporando componentes de bactérias patogênicas para seres humanos ou outros animais (por exemplo, Yersinia pestis, Pseu- domonas aeruginosa, Shigeila fiexnerí), são testados métodos e composi- ções que interferem com a atividade/biogênese de miRNA em células culti- vadas humanas ou de animal. Proteínas efetoras TTS individuais que se responsabilizam por essa interferência e são os fatores-chave da virulência que neutraliza as respostas imunes inatas do mamífero à patógenos que ameaçam a vida são assim identificadas. Essa tecnologia fornece um méto- do através do qual a transfecção de plasmídeos que codificam proteínas TTS individuais (junto com suas chaperonas correspondentes), em células humanas que expressam um sensor de miRNA que compreende as seqüên- cias de controle de expressão de geradores de miRNA em animal operati- vamente ligados a um construto de seqüência repórter permite a identifica- ção de agentes terapêuticos. Moléculas que interferem com a atividade da proteína TTS sem danificar as funções de miRNA celular são selecionadas como candidatas a um estudo posterior e de desenvolvimento de fármaco. Células humanas cultivadas coexpressando o sensor de miRNA e proteínas TTS bacterianas são submetidas à liberação com alto ritmo de transferência de uma grande coleção de moléculas ativas. Aquelas moléculas que supri- mem a expressão do sensor de miRNA são isoladas e testadas posterior- mente quanto ao seu efeito terapêutico potencial como descrito acima.
Proteínas Bss de patógenos de mamíferos identificadas através dos métodos descritos aqui acima também são proteínas úteis para isolar componentes de animal envolvidos na biogênese e/ou atividade de miRNA usando abordagens bioquímicas e genéticas conhecidas por aqueles versa- dos na técnica. Essas abordagens incluem, mas não estão restritas ao ras- treamento de duplo híbrido de levedura de bibliotecas de cDNA de mamífe- ro, imunoprecipitações bioquímicas e rastreamentos genéticos futuros para a perda da função de Bss em células mutagenizadas com sulfonato de etil- metila (EMS). Os componentes identificados possivelmente interage (tanto fisicamente quanto geneticamente) com, por exemplo, Dicer de mamífero, Drosha de mamífero, TBP de mamífero, e podem ser usados ainda para manipular especificamente atividades de miRNA em mamíferos.
Usando os métodos de rastreamento de alta eficiência descritos aqui acima, são identificadas as moléculas ativas que promovem ou intensi- ficam a atividade de componentes conhecidos da via de miRNA de mamífero (por exemplo, Dicer de mamífero, Drosha de mamífero, TBP de mamífero) e dos componentes da via de miRNA de mamífero identificados acima. O tra- tamento de células humanas ou de outro animal com tais moléculas intensi- fica a defesa basal para uma ampla faixa de patógenos.
Pela intensificação, constitutivamente ou condicionalmente, da atividade dos componentes da via de miRNA de mamífero identificados aci- ma, é obtida uma resistência aumentada a um amplo espectro de patógenos em uma variedade de células hospedeiras de mamífero. A expressão condi- cionada é conferida, por exemplo, pelo promotor NFkB. O método descrito possibilita assim resistência aumentada, induzível, o que é desejável por que ela não é, ou é menos, prejudicial ao desenvolvimento e fisiologia da planta em condições não-infectantes. Os métodos dessa invenção são aplicáveis a todas as infecções que envolvem a injeção/liberação de fatores de origem parasitária. Exemplos incluem fungos biotróficos tais como E. cichoracea- rum, um oídio que se superacumula sobre ambos os mutantes hen1-1 e d- cl1-9 e portanto provavelmente secretam proteínas efetoras para suprimir as vias de silenciamento de RNA.
As proteínas Bss também podem ser usadas para inibir a função de miRNA a fim de alterar processos fisiológicos e de desenvolvimento nor- malmente orquestrados por essas pequenas moléculas de RNA. Isso é obti- do pela fusão de seqüências codificadoras de Bss com promotores específi- cos para tecido de planta conhecidos por aqueles versados na técnica (diri- gindo a expressão em, por exemplo, raízes, folhas, caule e inflorescências), que também podem incluir elementos promotores de pato-miR aqui identifi- cados. O método aqui discutido possibilita, assim, a expressão específica para tecido de proteínas Bss para controle espacial e temporal da função de miRNA.
As proteínas Bss são usadas, assim, para suprimir o silencia- mento de transgene e permitir alta expressão de quaisquer proteínas de inte- resse (por exemplo, moléculas terapêuticas). Em uma aplicação, construtos únicos ou múltiplos que carregam o(s) gene(s) de interesse e um construto que carrega um cDNA de Bss (por exemplo, HopU 1) fundidos a um promotor forte são coliberados na planta (usando um ensaio transitório mediado por Agrobacterium). Esse ensaio transitório pode ser realizado em folhas de N. benthamiana, na qual o ensaio transitório é mais eficiente, ou preferencial- mente em culturas de célula de planta (tais como células Col-O de Arabi- dopsis). A(s) proteína(s) de interesse é (são) purificada(s) posteriormente usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica e suas ativi- dades biológicas testadas. O uso de culturas de célula de planta permitirá a produção de grandes quantidades de proteína recombinante. Além disso, esse sistema facilitará as etapas de purificação de proteína já que os materi- ais de partida conterão quantidades reduzidas de componentes derivados de planta que são indesejados na purificação de proteína (por exemplo, polifenois).
Versões mutadas de HopNI (com substituições C172S, H238A ou D299A, abolidas em suas atividades de cisteina protease) serão particu- larmente úteis para essa abordagem já que essas versões mutantes não serão, ou serão pouco, reconhecidas por proteínas resistentes (o que de- sencadeia a morte programada da célula hospedeira que poderia impactar negativamente sobre os rendimentos de proteína recombinante).
Outra aplicação está em um método para identificar compostos que agem contra a supressão do silenciamento de RNA bacteriano. Proteí- nas Bss e um construto sensor de miRNA (por exemplo, sensor 171) ou o transgene SUC-SUL (ou quaisquer outros construtos repórter de silencia- mento) são coexpressos estavelmente em plantas e pulverizados com uma biblioteca de compostos para identificar as moléculas que agem contra a supressão do silenciamento de RNA desencadeado por Bss. Como um e- xemplo, as plantas SUC-SUL que expressam HopTI-1 apresentam um fenó- tipo atenuado para a nervura clorótica devido à supressão da atividade de RISC contendo AG01. Essas plantas são pulverizadas com uma bateria de moléculas para identificar compostos que agem contra a supressão do silen- ciamento de RNA desencadeado por Bss e restaurar igualmente um fenótipo normal de nervura clorótica. Tais moléculas são usadas para conferir um amplo espectro de resistência a patógenos em várias espécies de planta incluindo cultivos.
Alternativamente, as plantas são mutagenizadas (usando méto- dos conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como a mutagênese por EMS) para identificar mutantes nos quais o silenciamento de RNA é res- taurado. Por exemplo, plantas SUC-SUL que expressam HopT1-1 são muta- genizadas e os mutantes que restauram o fenótipo da nervura clorótica nor- mal isolados. Os genes correspondentes são identificados posteriormente usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica (por exemplo, clonagem baseada em mapa). Ortólogos de tais genes, em várias espécies de planta incluindo cultivos, são identificados e métodos usados para "knock-out" ou "kcnok-down" esses genes em particular são aplicados.
Como bactérias patogênicas de animal também usam o sistema de secreção tipo três para liberar as proteínas-chave de virulência, bactérias patogênicas de animal (incluindo bactérias patogênicas humanas) também têm evoluído para suprimir o silenciamento de RNA. Tais genes de virulência bacteriana são fundidos com um promotor forte (por exemplo, CMV) e libe- rados em células de animais usando métodos conhecidos. Níveis de miR- NAs endógenos assim como de alvos de miRNAs são monitorados para i- dentificar proteínas que suprimem o silenciamento de RNA (como realizado em sistemas experimentais de planta descritos acima). Essas proteínas Bss1 derivadas de bactérias patogênicas de animal, são posteriormente coex- pressas em células de animais com um construto sensor de miRNA. Molécu- las que restauram uma expressão normal do sensor de miRNA são posteri- ormente identificadas e usadas para conferir resistência aumentada a pató- genos bacterianos. Tais moléculas representam, potencialmente, substitutos de antibióticos. Alternativamente, as células de animais acima são mutage- nizadas usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica e os genes correspondentes identificados. Métodos que possibilitam o "knock- down" ou "knock-out" de tais genes são usados para elevar a resistência a patógenos bacterianos. Tais métodos incluem, mas não estão restritos a, uso de siRNAs artificiais dirigidos contra repressores endógenos da supres- são desencadeada por Bss do silenciamento de RNA.
Os aspectos não Iimitantes da invenção são os seguintes.
1. Um método para modular a via de miRNA em plantas e ani- mais que compreende a introdução em uma planta ou animal de um constru- to de ácido nucleico que compreende um promotor responsivo constitutivo ou de patógeno operativamente ligado a uma seqüência que codifica miRNA ou uma seqüência que codifica uma proteína efetora de miRNA, opcional- mente incluindo ainda elementos cis-regulatórios dentro ou a 5' do dito pro- motor.
Esse método pode ser planejado tal que os efeitos adversos so- bre o desenvolvimento da planta ou do animal sejam evitados ou minimiza- dos e pode fornecer resistência a patógeno aumentada após a expressão na dita planta ou animal, por exemplo, pelo emprego de seqüências de controle induzíveis ou condicionais. Nesse método, a proteína efetora é uma proteína descrita na Tabela 1, por exemplo, DCL1, AGOI, SERRATE e/ou HEN1.
2. Um método para identificar compostos úteis na modulação seletiva da via de miRNA em plantas e animais pela monitoração da expres- são em uma célula de planta ou animal de um transgene sensor que informa a atividade de miRNAs endógenos em resposta a perturbação causada pela exposição da dita célula de planta ou animal a um candidato a composto.
3. A invenção também fornece um supressor de silenciamento bacteriano, por exemplo, HopNI, HopHI, HopPto1 HopTI, HopYI ou HopUI ou seus derivados funcionais.
Esses podem ser usados em um método para modular seleti- vamente a expressão de miRNA em uma célula pelo contato da dita célula com o supressor de silenciamento bacteriano.
4. Um método para identificar miRNAs associados com a res- posta de uma planta ou animal a um estimulador patogênico. Uma planta ou um animal ou uma célula de planta ou de animal é exposta a um estimulador patogênico e comparada com uma planta ou um animal ou uma célula de planta ou de animal substancialmente idêntica não exposta ao estimulador patogênico. A flutuação transcricional de miRNAs computacionalmente pre- ditos ou experimentalmente validados como transcritos primários é monito- rada e comparada. A invenção também é dirigida a um miRNA isolado esti- mulado por patógeno assim identificado.
A invenção também é dirigida a um método para conferir resis- tência intensificada a patógeno sobre uma planta ou animal ou célula de planta ou de animal pela expressão efetiva de um miRNA estimulado por patógeno identificado acima. A expressão pode ser sob o controle operativo de um promotor que é ativado pela exposição ao patógeno, por exemplo, promotor WRKY6 ou promotor PR1.
Um ou mais elementos regulatórios cis-atuantes também podem ser fornecidos a montante ou incorporados dentro do dito promotor e da se- qüência que codifica miRNA. 0 elemento regulatório cis-atuante pode ser um W-box, um elemento AuxRE, um elemento RY, um elemento FIM, múlti- pios desses elementos ou suas combinações.
5. Um método para determinar o papel de um miRNA pela su- pressão de miRNA em um célula que exibe de outra maneira a expressão do dito miRNA pelo contato da dita célula com um supressor bacteriano de si- lenciamento (Bss).
6. Um método para modular a resistência em um animal à infec- ção por um patógeno, que compreende tanto intensificar a expressão de componentes da via de miRNA suprimidos pelas proteínas secretadas pelo dito patógeno quanto aumentar a resistência de componentes da via de mir- NA à supressão por proteínas secretadas pelo dito patógeno.
7. Um método de conferir resistência em uma planta à patóge- nos que compreende selecionar plantas com componentes da via de miRNA resistentes à ação de supressores de silenciamento, tais como supressor bacteriano de silenciamento, e plantas selecionadas por esse método.
8. Um método para manipular, especificamente, a acumulação de miRNA a fim de alterar os processos fisiológicos e de desenvolvimento normalmente orquestrados por aquelas moléculas, pela fusão de uma se- qüência que codifica Bss com um promotor específico para tecido de planta que direciona a expressão em raízes, folhas, caule, inflorescências, opcio- nalmente incluindo elementos promotores de pato-miR para obter um contro- le espacial e temporal da atividade de miRNA.
9. Um método para explorar a supressão desencadeada por Bss da atividade de silenciamento de RNA sem reconhecimento pelas plantas. Isso inclui gerar mutantes que podem ainda suprimir as vias de miRNA e siRNA mas que não podem mais ser percebidos pelos genes R derivados de planta. HopNI mutada nas tríades catalíticas pode ser usada por que esses mutantes suprimem a biogênese de miRNA no mesmo nível como faz HopNI de tipo selvagem, mas não é percebida pelas proteínas R.
10. Um método para identificar componentes da via de siRNA e/ou miRNA pelo uso de proteínas Bss como sondas moleculares em ambas as células de planta e de animal e restaurar componentes que interagem fisicamente com tais proteínas.
11. Um método para suprimir a função de miRNA em células de animal pelo uso de proteínas Bss derivadas de bactérias patogênicas de planta tais como Pst DC3000. As proteínas são fundidas a promotores cons- titutivos humanos e transfectadas em células de animal a fim de suprimir a função de miRNA. Isso pode ser usado em combinação com a expressão recombinante das proteínas desejadas.
12. Um método para superexpressar proteínas recombinantes (por exemplo, proteínas humanas com atividade terapêutica) em células de planta. Isso poderá ser realizado pela expressão de proteínas Bss que ini- bem o silenciamento de transgene. Essa abordagem é realizada preferenci- almente em culturas de célula usando um ensaio transitório de Agrobacteri- um. As proteínas recombinantes purificadas são testadas posteriormente quanto as suas atividades biológicas e usadas como medicamentos.
13. Um método para identificar moléculas que promovem a transcrição de fatores endógenos envolvidos na atividade de biogênese de miRNA. Um método emprega construtos nos quais as seqüências de contro- le da expressão de miRNA são acopladas com seqüências repórter. Outro método emprega construtos repórter que são silenciados pelo miRNA. No primeiro caso, as moléculas ou alterações genéticas que aumentam a ex- pressão de repórteres são intensificadoras da expressão de miRNA. No se- gundo caso, o oposto é verdade.
14. Um método para identificar compostos que agem contra a supressão desencadeada por Bss do silenciamento de RNA tanto em células de planta quanto de animal. Essa abordagem compreende o uso de células de planta ou de animal que coexpressam um construto repórter de silencia- mento de RNA com uma proteína Bss. As moléculas que restauram a ex- pressão normal do gene repórter de silenciamento de RNA são identificadas e usadas para elevar a resistência a bactérias em plantas e animais. Tais moléculas podem ser usadas como antibióticos em células de animais. Al- ternativamente, repressores endógenos da supressão desencadeada por Bss de silenciamento de RNA são identificados pelo uso de mutagênese das ditas linhagens de célula de planta ou animal que coexpressam um construto repórter de silenciamento de RNA e uma proteína Bss.
15. As abordagens aqui descritas são usadas para identificar proteínas secretadas a partir de parasitas que podem suprimir as vias de silenciamento de RNA.
Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar mas não limi- tam a invenção.
EXEMPLOS
Os Exemplos mostram que 1) um espectro específico de miR- NAs de planta confere resistência aumentada a patógenos virulentos; e que 2) plantas deficientes em acumulação de miRNA são hiper-suscetíveis a pa- tógenos bacterianos virulentos e não-virulentos e que, como corolário, uma bactéria virulenta pode ter desenvolvido estratégias para suprimir a via de miRNA, por exemplo, pelo uso de algumas das proteínas secretadas tipo Ill (TTS) injetadas.
Todos os resultados abaixo são gerados em modelos da espé- cie Arabidopsis thaliana, como ilustrativos de plantas em geral incluindo cul- tivos. Embora as especificações dos exemplos que se seguem sejam forne- cidas para capacitar plenamente aqueles versados na técnica a entender e praticar essa invenção, fornecer o melhor modo de praticar essa invenção e fornecer uma descrição exaustiva da invenção, a invenção não deve ser in- terpretada como sendo limitada às especificações como delineadas nesses exemplos.
Exemplo 1
Um espectro específico de miRNAs de planta é regulado positivamente pelo peptídeo flg-22
Um conjunto de transcritos de miRNA primário foi identificado usando frações de RNA total isoladas de plantas nãive ou tratadas com flg- 22. flg-22 é um peptídeo que estimula uma resposta a padrões moleculares associados a patógeno (PAMP). Complementos reversos com seqüências de 60 nt de extensão localizadas a montante de "stem loops" preditos e vali- dados de pré-miRNA foram apresentados sobre um arranjo e usados como sondas para traçar o perfil de transcritos de miRNA primário após o trata- mento com flg-22.
Como observado nos Antecedentes acima, miRNA é gerado ini- cialmente a partir de transcritos de RNA primário (pri-miRNA) que são sub- seqüentemente clivados em transcritos de pré-miRNAs a partir dos quais os transcritos de miRNA são formados. Como os transcritos de pri-miRNA são caracterizados por uma estrutura "stem loop", como mostrado na Figura 5, a identificação de "stem loops" nas estruturas de RNA preditas permitiu a iden- tificação de localizações putativas para localizações de pri-miRNA no geno- ma.
O método descrito acima foi aplicado para plantas de tipo selva- gem assim como vários mutantes de silenciamento, incluindo dcl4-1 e dcl1- 9.
Foram identificados 68 pri-miRNAs, que são significativamente regulados positivamente após o tratamento com flg-22 em pelo menos um antecedente genético (tanto os antecedentes de Col-0, dcl1-9 quanto de d- cl4-1). Alguns desses transcritos de pri-miRNA primário não foram ainda descritos em outros relatos indicando que vários miRNAs são expressos es- pecificamente após tratamentos de estresse biótico mas não em condições padronizadas de crescimento. A maioria desses precursores dá início a ex- tensas estruturas de "fold-back".
As seqüências dos 68 precursores de miRNA induzidos por flg- 22 são mostradas na Tabela 2. As seqüências destacadas em negrito são as seqüências de miRNA maduras preditas. Tabela 2
>mirspot730
TTAGATCAICAICCATGGCACIGACGCCGTICACGGCAACIGCCGIAGACGIIGIIGIIGCCGIGAACGGC
GTGAGTGCCGTAGAIIAIIGGCIXAT
>mirspotl07/997/S98
TCTCGCTAGAGCTCTTCTCTCCCGGCTGTCTCCTC-CTCCTGCCTAAGCGATGGCCTGGAGAGTGCTCTAGT GGTG
>mirspotl56
GAGTGAXAGCCATGGCATGGAAGAAAGTGAGAIIIGCCICAAICGATCGIGAAICAAAACCTTIATGATTA
TCACTGCAAGCTTTACCITCIICIIAGCCAIGAXIAICACIG
>miRspotl93
AXCAAGXGXGGGGTGTCGAGAGTCTTTAGATTTGGXGXGAAXAAXCTGACAAXXXGGAXXXGAACXCXGCX XXGACATCCXGACAXXAGAA
>miRspot894 (nii39Sc) =miRspot 4=895=402=896
XGGAXC XC GAC AGGGXXGA XAXGAGAAC AC AC GAGC AAXCAACGGCXAXAACGACGCXACGXCAXXGXTAC AGCXCXCGIXXCATGTGTTCTCAGGTCACCCCTGCXGAGCXCXXX >AtmiR3 98a
XTCAAAGGAGIGGCAXGXGAACACAIAXCCXAIGGXIXCXXCAAAIIICCAXXGAAACCAXXGAGXTXTGT
GTTCTCAGGTCACCCCTTIGAAICI
>miRspot701/703/704/706/709
GXCACXGGACCGCAAGAGCAXXGAXAGGACXCACXCCAXCXCCAATGTCTCATGAGGGTCCATGAC >mirspot711/712/713/325
CTGTCACTGGACCC-CAAGAACATTGATAGGGCACACTCCATCXCTAATGTCTCATGAGGGTCAATGACAC >mirspot326/715
CTGGACCGCAAGAGCATTGATAGGGGTCACICCAICTCCAATGTCTCATGATGCTCCATGA >AtmiR3 95f
AIGICCCCIIGAGTICCCIIAAACGCTICAIIGIICAIACIIIGIIAICAICIAICGAICGAICAATCAAI
CX GAIGAAC ACTGAAGTGTTTGGGGGGAGTCTAGG TGACAXC
>mirspotl08
TCGGGITCICGGGTCCGGTTCAATTCCGGITTTIGACCCGAACCIGIITCCGTCTTCTTCICAACGGITAT GCTTCTGAAGTGATATCACCACTCTCTCTCGTCTGAACCTGAATTTTCAACCCGACCCGACTCCAACTT >mirspot110/1002/460/miR160c
CGIXATGCCTGGCTCCCTGTATGCCACGAGXGGAIACCGAXXTXGGXXXXAAAATCGGCIGCCGGXGGCGI AC AAGGAGICAAGC AXC-AC CAG >AtmiR3 93a (miRspot90)
GCAAC TAGAGG AAGGATCCAAAGGGATCGCATTGATCC XAAIXAAGGIGAAIXCTCC CC AIAIIXXC XTTA TAAXXGGCAAAXAAAXCACAAAAAXTTGCXXGGXTTTGGAXCATGCTAXCTCTXXGGATXCAXCCTXCGGX AGCT
>miRspot255/mirspotll02
GA TGTGTC TA TATCTTTCTCTATCCCCCACTCCAATCAATTTCAAGTTATTATTAAATTATCTTGATTTGG TAAAGAGTTAGTTTTGTAAAGTACGXAAAATXXGAAAAACAATTAATTAAAAAATGAAGGTTGGGTGGGGA AGAGGCAGATATGAACACGTAGTGAGGATA >miRspot14 2/1016/1018 AAAGTTGTTCGTTTGCCTGTCGCTGGTTCAACGACCAAAAGTAGCGACCAGCGACCGCAATTTTTGATCC-C TGAAATTTTTAGCGATCAGTCGCTGGTTXCAGCGAXXAGXCGCXGCTTTTGGTCGCTGAATCCAGCGACAT GCAAACGAACAAC >mirspot.35/23 (miR405) AATTAAATAAGTTATGGGTTGACCCAACCTATTTAACATAATGAGTTGGGTCAACCCATAACTCATTTAAT XT >mirspot292 ATCTATAGCAGCAAAGCTTTTTTGTCATGAGAAGAAGAAGAAGAATAAGAGC-TCAAAGAAGATCTCTATTC ATGATGCTCCTTCTGAAGCTTTGAGAAAGCATTTTGTCGCATATGGGTTT >miRspot300 CCTATGXCTCCATACATACACATTCTCTTCAAAACTCATTTCTTCGTCCGGTCCCCTCTTTAAATAGCGCT TCXCXCCCTTCATXCATACATACAIIGAXCACAXCCATGAAGAAGGAGAGGAAGAGACAAGXACAGGAGGA GGAGGAGGAGAAGGAGGXGGAGGTTGTTGTGGTGGATGCGTTGA >miRspot4 95/4 96/497 (At-miR396b) ATCC XGGXCA XACXTTTCCACAGCTTTCTTGAACTTTCTXXXXCATTXCCAXXGXXXTTXXCXXAAACAAA AGTAAGAAGAAAAAAAACTTTAAGATTAAGCATTTTGGAAGCTCAAGAAAGCTGTGGGAAAACATGACAAT TCAGGGTT >miRspot73/miRl6 9a/384 CAACGGAGTAGAATXGCATGAAGTGGAGTAGAGTATAA TGCAGC CAAGGATGACTTGCCGGAACGTXGXTA AC CA TGCATA TGAAT AATGTGATGATTAATTATGTGATGAACA TATTTC TGGCAAGTTGTCCTTCGGC TAC ATTTTGCTCTCTTCTTCTCATGCAAACXXXCCXXG >miRapot375 CCAAAAGTTGTTTGTTTGCCTATCGCTGATTCAGCGACAAAAATXAGCGACAGTCGCCAGCGACTGCAATT TTTAGTCGCTGAAATTTTTAGCGATCAGTCGTTGGTTTCAGCGATTAGTTGCTGCTTTTGGTCGCTGGATC CAGCGACATGCAAAC GAACAA C TTTG >miRspot38 3/miR419 GAAATTATGAATGCTGAGGATGTTGXXATTACGAGCAATGAGATGTCTTXXXTTAAAAAAAAAAATTTGGT TGCTTGCTTGCAAGAGGACATCTTAGCATCAAATTXG >raiRspotl213 TTTTTTTCTTAGCTTTCCAATCTCTGCCTTTXCXCXGGXCXCXAXAXCGXCGXXXXTGCXACATTTGATTG GGAGTAGTAAAGATGAAGAGACAGATCGGATCGGAGGAAGAGAGGAAGAAGAGAGAAATGGT >miRspot658/27 5 CGCCTTCTTCCTTCCCTAGTCATTCACTCTTCTCIAACTTCGCTTTTTXXXTGGAGAGCAAAGGTGATGAT GAATGCAGAGGAAGATAG T >miRspot441 TXCGTT TGCTTGTCGCTGGCGACTGAAACCAGCGACAGCGACCAAAAGTTGTTCGTTTGCCTGTCGCTGGT TCAGCGACCAAAACTAGTGACAGTCGCCAGCGACCAGCGACCGCA >miRspot316 TAATTTATTTGAGGGGAC-AAATATTTGACACGGAAGCATAGCTCCATATCCTTCAATGGAGGTGTGGTCCT TCAACAAAAATACCCCCCTCTTGAAACTCTGTTTCACCACACCTCCATTGAAGGACCXGAAGCTATGCTTC CT TG TCATATTC C TTAC CAXCAAATAAATGCT >miRspofc64 TTTTAGAGGTGAATCTATTTTAGAGGCATTGTGCTCCAATGGTCACTTCTAAAATAGAGTXTCCTCAAAAA TAGAGGAAAAAATAGAGATGAATTGTAGAGATCTCTATTTATAGAGACAAAAAGTAAATATCTCTATXXXX XCXCXATTATAGAGGAAACTCTATTTTAGAGGTGATCATTGGAGCACAATCCCTCCAAAATAGAATCACCT CXA >miRspot919 XGCAGAATAAAAATGAATAGACrAGAAACAATGTAACAATGTATTTTGTGTC-GTATXttggt Cttgtteag ttctgttCCC >miRspot418/941 IGR Atlg40143-136 and IGR Atlg40129-131 AGGGXXXAGGGTTTAGGGTTTTGGTTTAAGGGTTTAGGGTTAAAAGTTtatggtttagggtttacggttTT GGGTTTGGGATTTAGGGTATAGGGGTTAGGGTAAAGAATXTAXGATTTTATC-TGTAGGAXXGAAXATAAAA CTAGAACCTCAACAAGATACCGAAGAGTGGACCGAACTGTCTCACGACGTTCTAAACCCAGCTCA >miRspot948 IGR Atlg40118-112 and IGR Atlg40135-137 ACXAGAXGCTTTGTTTATCATTGAGCATAAGCACTAGAACCGCAACCGTATTCCGGATGCCTAAAGTAGGA TTTAGGTTTTAAAGTTTGGGATTtatggtttagggtttaggttTAAGGGTTTAGGGTTAACAGTTTATGGT TTAGGGTTTAGG >miRspot1169 IGR Afc3g30S5S-0867 TttcagaecaatgaggataggatatgaTTATTGGAGTCTCTAACAGGATTTACAAGCCAAGGTGAAAATC-T AGGAATTACTCGTCCACCGAGTGGGTCTTGTACGCCTCGATCATCTGATCCATCATCTGGTCCATC >miRcpotl42 IGR Atlg47370-Atlg473S0
AAGTTGTTCGTTTGCCTGTCGCTGGTTCAACGACCAAAAGTAGCGACCAGCGACCGCAATTTTTGATCGCT GAAATTTTTAGCGATCAGTCGCTGGTTTCAGCGATTAGTCGCTgcttttggtcgetgaateeaGCGACATG CAAACGAACAAC T T
>niiRspot 10 19 IGR Atlg72880-890
AAAGTTGTTCGTTTGCCTGTCGCTGC-TTCAGCGACCAAAAGTAGCGACAGTCGCCAGCGATCAGCGACCGC AATT TTTGGT CGC TGAAATTT T TAGC GATC AGTCGC TGGTTTCAGC GA T TAGTCGCTgcttttggtcgctg gatecaGCGACAAGCAAACGAACAACTTA
>miRspot1020 IGR Atlgl0580-690 mir3potl019 paralog
AAAAGTTGTTTGTTTGCCTATCGCTGATTCAGCGACAAAAATTAGCGACAGTCGCCAGCGACTGCAATTTT TAGTCGCTGAAATTTTTAGCGATCAGTCGTTGGTTTCAGCGATIAGTTGCTgcttttggtegctggatcca GCGACATGCAAACGAACAAC TT TG
>miRspot 95 3 IGR Atlg40113-I15 941/418 and 948 paralog
CCGGATTCCGGAAGCTTAAAAGTATAATTTAGGTTTTAAAGTTTGGTATCTATTGTTTAGGGTTTAGGTTT
AAGGGTTTAGGGTTCAGAGTTtatggtttagggtttacggttCCGG
>miRspot607 IGR At5g23220-23230
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Entre os pri-miRNAs induzidos por flg-22, vários que correspon- dem a seqüências maduras de miRNA são conservados no milho e no arroz.
O método mencionado anteriormente também pode ser usado para identifi- car o espectro completo de miRNAs estimulados por estimuladores comuns que exibem padrões moleculares associados a patógeno (PAMPs) tais como flg-22.
Transcritos primários de miRNA suprimidos por proteínas su- pressoras tais como aquelas associadas com bactérias virulentas podem ser identificados pela estimulação de folhas Col-O de tipo selvagem com Pst DC3000 hrcC (uma bactéria Pst DC3000 que não pode injetar proteínas su- pressoras nas células hospedeiras) e Pst DC3000 virulentas (que podem) por 6 horas e pela seleção posterior de transcritos primários de miRNA (u- sando o método acima) que são regulados positivamente por Pst DC3000 hrcC mas não por Pst DC3000 virulenta como descrito abaixo. Como esses pri-miRNAs são transcricionalmente reprimidos por proteínas TTS de Pst DC3000, eles provavelmente atuam como componentes-chave da resposta de defesa antibacteriana. O método mencionado acima também pode ser usado para identificar o espectro completo de transcritos de miRNA que são regulados positivamente por patógenos biotróficos e necrotróficos não rela- cionados assim como estresses abióticos.
Exemplo 2
Plantas mutantes com acumulação de miRNA comprometida são mais sus- cetíveis a patóqenos virulentos
Foi demonstrado o envolvimento da via de miRNA na resistência à doença da planta, pela estimulação de mutantes hen1-1 e dcl1-9 de Arabi- dopsis com um oídio virulento Erysiphe cichoracearum ou com PsfDC3000 virulenta. Foi encontrado que hen1-1 é hiper-suscetível a ambos, fungo e bactéria, e que dcl1-9 exibe suscetibilidade aumentada a Erysiphe cichora- cearum e sintomas intensificados de doença após infecção com Pst DC3000 virulenta (figura 6A, B e C). Na Figura 6A, ambos hen1-1 e dcl1-9 são hiper- suscetíveis ao oídio. Plantas La-er com seis semanas de idade, hen1-1 e dcl1-9 foram infectadas com esporos de E. cichoracearum (isolado UEA) e o crescimento do fungo foi avaliado visualmente 10 dpi (painel superior). O crescimento fúngico e a esporulação também foram avaliados microscopi- camente após a coloração da folha com trypan blue em 2-3 dpi (painéis infe- riores).
Na Figura 6B, ambos hen1-1 e dcl1-9 exibem sintomas intensifi- cados de doença avançada após a infecção com Pst DC3000. La-er, hen1-1 e dcl1-9 foram estimuladas com 105 unidades formadoras de colônia (cfu/ml) de Pst DC3000 e os sintomas da doença bacteriana avaliados visualmente em 3 dpi.
Como mostrado na Figura 6C, Hen1-1 exibe títulos maiores de Pst DC3000. La-er, hen1-1 e dcH-9 foram tratadas como na Figura 6B e o crescimento bacteriano medido em 4 dpi.
A intensificação constitutivamente ou condicionalmente da ativi- dade/expressão de componentes envolvidos na atividade ou biogênese de miRNA, tais como DCL1, AG01, SERRATE, HEN1, usando os métodos a- cima aumentando a resistência a um amplo espectro de patógenos é obtida em uma variedade de plantas, incluindo espécies de cultivo. O método des- crito possibilita, assim, resistência aumentada, induzível, o que é desejável por que ela não é, ou é menos, prejudicial ao desenvolvimento e fisiologia da planta em condições não-infectantes.
Linhagens transgênicas de Arabidopsis carregando regiões 1,5 Kb a montante de genes envolvidos na biogênese e/ou atividade de miRNA (por exemplo, DCL1) são fundidas com um seqüência repórter. Essas linha- gens transgênicas são usadas para rastrear compostos químicos que de- sencadeiam a regulação positiva de mRNA ou proteína repórter.
Isso é obtido pela monitoração de níveis de miRNA (usando mé- todos conhecidos por aqueles versados na técnica tais como análise Nor- thern, análise por RT-PCR semi-quantitativa ou análise por RT-PCR quanti- tativa) após a exposição dessas linhagens transgênicas a uma biblioteca de agentes químicos. As moléculas que induzem os níveis de mRNA (ou prote- ína) repórter são usadas posteriormente para conferir resistência antibacteri- ana e antifúngica em uma variedade de espécies de plantas incluindo culti- vo.
Exemplo 3
Plantas deficientes em miRNA são suscetíveis a bactérias não-virulentas
A indução, por flg-22, de um subconjunto de pato-miRs (veja Exemplo 1) sugere que a via de miRNA desempenha um papel importante na resistência basal a patógenos. Mutantes dcl1-9 e hen1-1 de Arabidopsis foram estimulados com Pst DC3000 deficiente em proteína secretada tipo três (TTS). Pst DC3000hrcC, uma cepa que em Arabidopsis de tipo selva- gem é incapaz de produzir uma infecção efetiva, foi injetada nesses mutan- tes. Ambos os mutantes exibiram sintomas de doença desenvolvida, lem- brando o fenótipo induzido pela bactéria virulenta sobre Arabidopsis de tipo selvagem (figuras 7A e 7B).
Na Figura 7A, ambos hen1-1 e dcl1-9, mas não mutantes defici- entes em si-RNA, estão comprometidos na resistência basal. Col-0, dcl2-1, dcl3-1, dcl4-2, dcl3-1/dcl4-2, dcl2-1/dcl4-1. dcl2-1/dcl3-1/dcl4-2, rdr6-1, rdr2- 1, La-er, hen1-1 e dcl1-9 foram estimulados com hrcC PstDc3000 em uma concentração de 106 unidades formadoras de colônia (cfu/ml) e os títulos bacterianos foram medidos 6 dpi.
Na Figura 7B, ambos hen1-1 e dcH-9 exibiram sintomas de do- ença quando inoculados com a cepa hrcC Pst DC3000. As inoculações fo- ram feitas como na Figura 7A e os sintomas da doença bacteriana foram avaliados visualmente. Foi descoberto que a indução de WRKY30 (um gene marcador de defesa basal bem-caracterizado) estava comprometida em ambos os mu- tantes hen1-1 e dcl1-9 estimulados com Pst DC3000 HrcC (figura 7C), indi- cando uma perda de resposta de defesa basal naquelas plantas. Na Figura 7C, a indução do gene WRKY30 estava prejudicada em ambos hen1-1 e dcl1-9 tratados com a cepa hrcC Pst DC3000. As inoculações foram feitas como na Figura 7 A e os níveis de WRKY30 foram analisados por RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) em amostras 12 horas após a inoculação.
Igualmente, ambos hen1-1 e dcl1-9 apresentaram infecção com o patógeno bacteriano não-hospedeiro de Pseudomonas syríngae pv. pha- seolicola (NPS3121) (figura 7D), que é normalmente virulento para feijões, mas não para Arabidopsis. Na Figura 7D, ambos hen1-1 e dcl1-9 estão comprometidos na resistência não hospedeira. La-er, hen1-1 e dcl1-9 foram estimulados com Pseudomonas syríngae pv. phaseolicola (NPS3121) em uma concentração de 10^6 unidades formadoras de colônia (cfu/ml) e os títu- los bacterianos foram medidos 4 dpi.
A indução de WRKY30 também estava prejudicada após o es- tímulo com Pseudomonas syríngae pv. phaseolicola (NPS3121) (figura 7E). Na Figura 7E, a indução do gene WRKY30 estava prejudicada em ambos hen1-1 e dcH-9 tratados com Pseudomonas syríngae pv. phaseolicola (NPS3121). As inoculações foram realizadas como na Figura 7D e os níveis de WRKY30 foram analisados por RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) em a- mostras 12 horas após a inoculação. Significativamente, resultados similares foram obtidos com Pseudomonas fluorescence não patogênica (dados não mostrados).
Também foi descoberto que o vírus TuMV (que codifica o su- pressor viral de silenciamento PI-HcPro) suprime a resistência basal à bac- téria não-virulenta Pst DC3000 hrcC e Pseudomonas syríngae pv. phaseoli- cola (NPS3121), sugerindo que a supressão do maquinário de silenciamento de RNA deve desempenhar um papel fundamental na infecção polimicrobia- na.
A Figura 8A mostra que a infecção por TuMV resgata sintomas da doença bacteriana de Pst DC3000 hrcC mutante. Plantas Col-O foram tratadas com 106 cfu/ml de Pst DC3000 hrcC por 6 dias (painel esquerdo) ou SAP inoculado com TuMV por 7 dias e tratado posteriormente com 106 cfu/ml de Pto DC3000 hrcC por outros 6 dias (painel direito).
A Figura 8B mostra que a infecção por TuMV resgata o cresci- mento bacteriano de Pst DC3000 hrcC mutante. Plantas Col-O de tipo sel- vagem foram tratadas como na Figura 8A e os títulos bacterianos foram me- didos 6 dpi.
A Figura 8C mostra que a infecção por TuMV resgata os sinto- mas de doença bacteriana de Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (NPS3121) não-hospedeira. Plantas Col-O de tipo selvagem foram tratadas com 106 cfu/ml de Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (NPS3121) por 4 dias (painel esquerdo) ou SAP inoculado com TuMV por 7 dias e tratado posteriormente com 106 cfu/ml de Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (NPS3121) por outros 4 dias (painel direito).
A Figura 8D mostra que infecção por TuMV resgata o cresci- mento bacteriano de Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (NPS3121). Plantas Col-O de tipo selvagem foram tratadas como na Figura 8C e os títu- los bacterianos foram medidos 4 dpi.
Exemplo 4
Proteínas de Silenciamento Bacteriano Suprimem a Identificação de miRNA de Supressores de Silenciamento Bacterianos (Bss)
Também foi concluído a partir dos resultados do Exemplo 3 que patógenos, tais como vírus e bactérias virulentas, devem ter desenvolvido estratégias para suprimir os componentes do maquinário de silenciamento.
Para testar essa hipótese, foi investigado primeiro se Pst DC3000 virulenta poderia suprimir a transcrição de miRNAs responsivos a PAMP. Foi medido o impacto da liberação do efetor Pto DC3000 (proteína TTS) sobre a expressão de pri-miRNA. Pto DC3000 virulenta, ou sua contra- partida não-virulenta Pto DC3000 hrcC, foi inoculada em plantas Col-O de Arabidopsis e os vários níveis de vários pri-miRNAs induzidos por Pto DC3000 hrcC (referidos como responsivos a PAMP) foram então monitora- dos durante um período de tempo de 6 horas. Em plantas tratadas com Pto DC3000, a indução de pri-miR393a/b e pri-miR396b responsivos a PAMP foi significativamente suprimida 6 horas após a inoculação (hpi), como foi a in- dução dos marcadores de defesa basal WRKY30 e Flagellin Receptorkinase 1 (FRK1) usados como controles internos (figura 9A). A Figura 9A mostra que a indução de miRNAs responsivos a PAMP é suprimida por Pst DC3000 virulenta. Folhas Col-O de tipo selvagem foram inoculadas com Pst DC3000 hrcC em uma concentração de 2x107 cfu/ml e os níveis de transcritos de miRNA primários responsivos a PAMP foram monitorados por RT-PCR semi quantitativa durante um período de tempo de 6 horas. Pri-miR166a foi usado como um controle negativo nesse experimento. Em contraste, os níveis de pri-miR166 e pri-miR173 insensíveis a PAMP permaneceram inalterados.
foram usadas então as linhagens transgênicas previamente des- critas miR393a-p::eGFP e miR393b-p::eGFP, que reportam a atividade transcricional de miR393. Em 6 hpi, Pto DC3000 hrcC causou um aumento nos níveis de eGFP mRNA em ambas as linhagens transgênicas, indicando a presença de elementos responsivos a PAMP a montante de MIR393a e MIR393b (figura 9B). A Figura 9B mostra que Pst DC3000 suprime a indução de miR393a/b a nível transcricional. As linhagens transgênicas que expres- sam os transgenes mir393a-p::eGFP ou miR393b-p::eGFP foram tratados como na Figura 9A por 6 horas e os níveis de transcrito de eGFP foram mo- nitorados por RT-qPCR. A quinase similar a receptor FRK1 foi usada como controle positivo nesse experimento. Entretanto, essa indução foi comprome- tida por Pto DC3000, como foi a indução do controle de FRK1. Como as du- as bactérias diferem nas suas habilidades de liberar efetoras TTS em células hospedeiras, esses resultados sugerem que algumas proteínas bacterianas injetadas suprimem especificamente a ativação transcricional de pri- miR393a/b e talvez de outros miRNAs responsivos a PAMP.
Para identificar tais proteínas bacterianas, foram liberados efeto- res de Pst DC3000 individuais (dirigidos pelo promotor forte 35S) em folhas efr1 mutantes, um mutante no qual o ensaio transitório com Agrobacterium é facilitado e os níveis de pri-miRNA responsivo a PAMP foram monitorados. A liberação de AvrPtoB reduz significativamente os níveis de pri-miR393a/b e pri-miR396b sem efeito significativo sobre pri-miR166a insensível a PAMP (figura 9C). A Figura 9C mostra que AvrPtoB suprime a acumulação de pri- miRNAs responsivos a PAMP. Plantas mutantes Efrl foram Agroinfiltradas em uma OD de 0,4 com 35S::GUSintron, 35S:AvrPtoB e os níveis de pri- miRNA monitorados por análise RT-PCR semi-quantitativa. Assim, AvrPtoB inibe potencialmente a expressão de miRNA responsivo a PAMP à nível transcricional.
Foi testado posteriormente se a via global de miRNA poderia ser afetada por efetores de Pst DC3000. Para esse propósito, foram geradas plantas transgênicas Col-O que expressam um construto sensor que descre- ve a atividade de miR171. miR171, quando expresso, silencia um construto repórter de GFP. Tais plantas transgênicas expressam constitutivamente um gene repórter GFP no qual um sítio-alvo de miR171 é adicionado em 3'UTR do gene GFP (figura 10A). O sítio-alvo de miRNA foi modificado a fim de evi- tar a transitoriedade do transgene desencadeada por RDR6, como previa- mente descrito. Como miR171 é bem expresso em folhas, nenhum sinal de GFP pode ser detectado em condições de crescimento padronizadas. Folhas das linhagens sensoras de miR171 foram estimuladas com Pst DC3000 viru- lenta e Pst DC3000hrcC deficiente em TTS não-virulenta e os níveis de GFP foram monitorados durante o decorrer do experimento. Foi encontrado que Pst DC3000 virulenta, mas não Pst DC3000hrcC, restaura a expressão do gene de GFP 24 horas após a inoculação (figura 10A). A Figura 10A mostra como Pst DC3000 restaura a expressão de GFP nas linhagens sensoras de miR171. Representação esquemática do construto sensor de miR171 (painel superior). Folhas de linhagens sensoras de miR171 foram inoculadas com "mock" (MgCI2) (painel esquerdo), hrcC Pst DC3000 (painel central) e Pst DC3000 virulenta (painel direito). Fotografias foram feitas 30 horas após a inoculação (hpi). Nesse ensaio foi usada uma concentração de 105 unidades formadoras de colônia (cfu/ml). Esse resultado indica que algumas proteínas TTS atuam como supressoras da via de miRNA tanto pela inibição da biogê- nese de miRNA quanto pela inibição da atividade de miRNA. Exemplo 5
Identificação de Proteínas que Suprimem as Vias de miRNA
Para identificar tais fatores bacterianos, 23 genes individuais de efetor de TTS (dirigidos pelo promotor forte 35S) foram transfectados transi- toriamente em folhas mutantes de Arabidopsis efr1 (figura 10B). A Figura 10B mostra que a acumulação de ambos miR173 e tas255 é parcialmente prejudicada em folhas que expressam hopN1, H1 e Pto. Os 23 construtos foram liberados transitoriamente em folhas de Arabidopsis usando transfor- mação com Agrobacterium e uma análise Northern de baixo peso molecular foi realizada usando sondas de oligo complementares aos RNAs pequenos de miR173 e tas255). Os níveis de miR173 e Tas255 endógenos (que de- pende da atividade de miR173 para sua biogênese) foram monitorados. Foi encontrado que três daquelas proteínas (a cisteína protease HopN1, HopH1 e AvrPto) causaram uma diminuição significativa nos níveis do estado esta- cionário de miR173 e Tas255 (figura 10C). A Figura 10C mostra que a acu- mulação de miR173 e tas255 está drasticamente prejudicada em folhas que coexpressam hopN1 e hopH1. Uma liberação transitória de construtos que superexpressam hopN1 e hopH1 foi realizada como descrito na Figura 10B. A análise Northern foi feita como na Figura 10B. Além disso, esses efeitos foram aditivos depois da coliberação de HopN1 e HopH1, indicando que es- sas proteínas interferem, diretamente ou indiretamente, com fatores distintos do hospedeiro envolvidos no silenciamento de RNA. Ambas as versões de HopNI de tipo selvagem e mutante, a última sendo alterada na tríade catalí- tica predita de cisteína (C172S, H283A e D299A resgataram a expressão de GFP quando liberada em plantas efrl transgênicas que expressam o cons- truto sensor de miR171 descrito acima (dados não mostrados). Todas as versões mutantes de HopN1 eram estáveis in planta como ensaiado pela análise Western (dados não mostrados).
A Figura 10D mostra que a supressão desencadeada por HopN1 de silenciamento de RNA não necessita da atividade de cisteína pro- tease. Plantas mutantes efrl que expressam o construto sensor de miR171 foram agroinfiltradas (0D=Q,4) com 35S::GUSintron, 35S::hopN1-HA, 35S::HopN1 C172S, 35S::HopN1 H283A e os níveis de GFP foram analisa- dos visualmente sob UV. Isso indica que a atividade de cisteína protease não é necessária para a supressão do silenciamento de RNA. Todas juntas, as proteínas TTS identificadas suprimem a biogênese de miRNA. Elas são assim referidas aqui como "Supressores de silenciamento bacteriano" (Bss).
As seqüências de nucleotídeos (seqüências codificadoras) das proteínas Bss que suprimem a biogênese de miRNA são as seguintes: sequência codificadora de AvrPtoB
AT GGCGGG TATCAATAGAGCGGGACCATCGGGCGC XTATIT TGT TGGCCAC ACAGAC CCCGAGCCAGTATC GGGGCAAGCACACGGAXCCGGCAGCGGCGCCAGCTCCTCGAACAGXCCGCAGGTTCAGCCGCGACCCXCGA AXACXCCCCCGXCGAACGCGCCCGCACCGCCGCCAACCGGACGXGAGAGGCXXXCACGAXCCACGGCGCTG XCGCGCCAAACCAGGGAGXGGCXGGAGCAGGGXAXGCCXACAGCGGAGGAXGCCAGCGXGCGXCGX AGGCC ACAGGTGACTGCCGATGCCGCAACGCCGCGTGCAGAGGCAAGACGCACGCCGGAGGCAACTGCCGATGCCA GCGCACCGCGXAGAGGGGCGGXXGCACACGCCAACAGXAXCGXXCAGCAAXXGGXCAGXGAGGGCGCXGAX ATTTCGCATACTCGTAACATGCTCCGCAATGCAATGAATGGCGACGCAGTCGCTTTTTCTCGAGTAGAACA GAACAXAXXTCGCCAGCAXXXCCCGAACAXGCCCAXGCAXGGAAICAGCCGAGAXXCGGAACXCGCXAXCG AGCTCCGTGGGGCGCTTCGTCGAGCGGTTCACCAACAGGCGGCGTCAGCGCCAGTGAGGTCGCCCACGCCA ACACCGGCCAGCCCXGCGGCAXCAXCAXCGGGCAGCAGXCAGCGXXCXXXAXXXGGACGGXXXGCCCGXXX GAXGGC GC CAAACCAGGGACGGTCGXCGAACACXGCCGCCXCXCAC-ACGCCGGICGACAGGAGCCCGCCAC GCGTCAACCAAAGACCCAXACGCGXCGACAGGGCTGCGATGCGTAATCGTGGCAATGACGAGGCGGACGCC GCGCTGCGGGGGXTAGTACAACAGGGGGTCAATXXAGAGCACCXGCGCACGGCCCXXGAAAGACATGXAAT GCAGC GCCXCCCTAXCCCCC TCGATAX AGGCAGCGCGITGCAGAATGTGGGAAXTAACCCAAGTATCGAC T TGGGGGAAAGCCTTGTGCAACATCCCCTGCTGAATTTGAATGTAGCGTXGAAXCGCATGC TGGGGCTGCGT CCCAGC GCTGAAAGAGCGCCTCGTCCAGCCGTCCCCGTGGCTCCCGCGACCGCCTCCAGGCGACCGGATGG XACGCGTGCAACACGATTGCGGGTGAXGCCGGAGCGGGAGGATTACGAAAATAATGTGGCXTATGGAGXGC GCTTGCTTAACCTGAACCCGGGGGTGGGGGTAAGGCAGGCTGTXGCGGCCTTTGXAACCGACCGGGCTGAG CGGCCAGCAGTGGTGGCXAAXATCCGGGCAGCCCTGGACCCTATCGCGTCACAATTCAGTCAGCTGCGCAC AAXXXCGAAGGCCGAXGCXGAAXCXGAAGAGCXGGGXXXXAAGGAXGCGGCAGATCAXCACACGGATGACG XGACGCACTGTCXXXXTGGCGGAGAAXTGXCGCTGAGTAAXCCGGAXCAGCAGGTGATCGGTTTGGCGGGT AATCCGACGGACACGTCGCAGCCXTACAGCCAAGAGGGAAAXAAGC-ACCTGGCGTXCAXGGATAXGAAAAA ACIXGCCCAAXICCTCGCAGGCAAGCCXGAGCAXCCGAXGACCAGAGAAACGCXIAACGCCGAAAA XAXCG CCAAGXAXGCXXXXAGAAXAGXCCCCXGA
>Sequência codificadora de HopHI:
AXGAXCACTCCGTCXCGAXAXCCAGGCATCXAXATCGCCCCCCXCAGXAACGAACCGACAGCAGCTCACAC ATXXAAAGAACAAGCAGAGGAAGCACXXGACCAXAXCAGCGCCGCACCCXCXGGCGA XAAGC TATXGCGAA AAAXAXCCACXCXXGCCAGTCAAAAAGAXAGAAAAGXCACGCXAAAAGAGATXGAAATAAATAACCAGXGX TAXACCGAAGCTGXXCXGAGCAGGAGGCAACXGGAAAAGXACGAACCAGAAAACTTXAACGAGAACCGGCA CAXXGCAXCACAGCXAXCACGAAAGGC-GACCTXXACCAAAGGXGAAGGAAGCAACGCGAXIATXGGCXGGX CACCAGACAAAGCAAGCAXACGCXTAAAXCAGAATGGCTCACCGTXACACCXXGGAAXGGArAACGACGAC AAAAXCACGACCCTAGCTCAXGAGCXCGXXCAXGCXCGACAXC-XGXTAGGXGGCAGCXCCXTAGCGGAXGG CGGAGAXCGCXAXAAXCCACGIACGGGAXCIGGCAAAGAGGAACITAGGGCCGIXGGATXAGAIAAGXACC GCXATICACXXACAAAAAAACCGXCAGAGAACXCCATCCGAGCXGAACACGGCCTGCCTCTGCGCAXGAAG TACAGGGCACAX CAAXAG >Sequência codificadora de HopNI:
ATGT ATATCC AGCAATCTGGCGCCCAATCAGGGGTTGCCGCTAAGACGCAACACGAT AAGCCCTCG TCATT GTCC GGACTC GCCCCCGGTTCGTCGGATGCGTTCGCCCGTTTTCATCCCGAAAAGGCGGGCGCCTTTGTCC C ATTGGA GGGGCATGAAGaGGTCTTTT TC GATGCGCGC TC TTCCTTTTCGTCGGTCGATGCCGCTGATCTT CCCAGTCCCGAGCAGGTACAACCCCAGCTTCATTCGTTGCGTACCCTGCTACCGGATCTGATGGTCTCTAT CGCC TCATTACGTGACGGCGC CACGC AATACATCAAGAC CAGAA TCAAGGCTATGGCGGACAACAGCA TAG GCGCGACTGCGAACATCGAAGCCAAAAGAAAGATTGCCCAAGAGCACGGCTGTCAGCTTGTCCACCCGTTT C ACCAGAGC AAATTTCTATTTGAAAAAAC TATCGATGA TAGAGC GTTTGCTGCTGATTATGGCCGCGC GGG TGGCGACGGGCACGCTTGTCTGGGGCTATCAGTAAATTGGTGTCAGAGCCGTGCAAAAGGGCAGTCGGATG AGGCCTTCTTTCACAAACTGGAGGACTATCAGGGCGATGCATTC-CTACCCAGGGTAATGGGCTTCCAGCAT ATCGAGCAGCAGGCCTATTCAAACAAGTTGCAGAACGCAGCACCTATGCTTCTGGACACACTTCCCAAGTT GGGC ATGACACTTGGAAAAGGGCTGGGCAGAGCACAGCACGCGCACTA TGC GGTTGC TCTGG AAAACCTTG ATCGC GATC TCAAAGCAGTGTTGCAGCCCGGTAAAGAC CAGATGCTTCTGTTTTTGAGTGATAGCCATGCG ATGGCTCTGCATCAGGACAGTCAGGGATGTCTGCATTTTTTTGATCCTCTTTTTGGCGTGGTTCAGGCAGA CAGCTTCAGCAACATGAGCCATTTTCTTGCTGATGTGTTCAAGCGCGACGTAGGTACGCACTGGCGTGGCA CGGAGC AACGTCTGCAACTGAGCGAAATGGTGCCCAGAGCAGACTTTCACTTGCGATAA
>Sequência codificadora de AvrPto:
ATGGGAAA TA TATGTGTCGGC GGATC CAGGATGGCCCATCAGGTGAAC TCCCCAGAC CGAGTTAGTAACAA CTCGGGTGACGAAGATAACGTAACGTCCAGTCAACTGC TGAGCGTCAGACATCAACTTGCGGAGTCTGCTG GTGTACCAAGAGATCAGCATGAATTTGTTAGTAACCAAGCACCTCAAAGCCTGAGAAATCGCTACAACAAT CTTTACTCAC ATACGC AAAGAACACTGGATATGGCGGACATGCAGCATAGGTACATGACGGGAGCGTCAGG AATCAATCCGGGAATGCTGCCACATGAGAATGTGGACGATATGCGTAGCGCTATAACTGATTGGAGTGACA TGCGCGAAGCTCTGCAGTACGCAATGGGTATCCATGCCGACATCCCACCGTCTCCAGAGCGATTTGTTGCG ACTATGAACCCGAACGGATCAATTCGAATGTCAACACTTTCTCCTAGCCCGTACCGTAACTGGCAATGA
As seqüências de aminoácidos das proteínas Bss que suprimem a biogênese de miRNA são as seguintes: >Sequência de aminoácidos de HopPtoB:
MAGINRAGP SGAYFVGHTDPEPV3GQAHGSGSGA333NSPQVQP RP SNTP? SNAPAP PPTGRERL3 RSTAL SRQTREÍ^EQGMP TAEDAS VRHRPQVT AD AATPRA EARRTPEATADAS AP RRGAVAH ANSIVQQLVSEGAD ISHTRNMLRNAMNGDAVAF S RVEQNIFRQ HFPNMP MHGISRD SE LAIE LRGALRRAVHQQAASAPVRSP TP TPA3PAASSSGS3QRSLFGRFARLMAPNQGRSSNTAA3QTPVDR3PPRVNQRPIRVDRAAMRNRGNDEADA ALRGLVQQGVMLEHLRTALERHVMQRLPIPLDIGSALQIíVGINPSIDLGESLVQHPLLNLNVALMRMLGLR P SAERAF RF AVP VAPATA3RRP DGTRA TRLRWJPEREDYENNVAYGVRLLNLNPGVGVRQAVAAFVTD RAE RPAWANIRAALD? IA3QFSQLRTI3KADAE-3EELGFKDAADHHTDDVTHCLFGGELSLSNPDQQVIGLAG NPTDTSQPYSQEGNKDLAFMDMKKLAQFLAGKPEHPMTRETLNAENIAKYAFRIVP
>Sequência de aminoácidos de HopHI:
MYIQQSGAQSGVAAKTQHDKPSSLSGLAFGSSDAFARFHPEKAGAFVFLEGHEEVFFDARSSFSSVDAADL PSPEQVQPQLH3LRTLLPDLMVSIASLRDGATQYIKTRIKAMADNSIC-ATANIEAKRKIAQEHGCQLVHPF HQ3KF LFEKTIDDRAF AAD YGRAGGDGHACLGLSVNWCQSRAKGQ5DEAFFHKLEDYQGDALLPRVMGFQH IEQQAYSNKLQNAAPMLLDTLPKLGMTLGKGLGRAQHAHYAVALENLDRDLKAVLQPGKDQMLLFLSDSHA HALHQD SQGC LHFFDPLFGWQADSFSNMSHFLADVFKRDVGTHWRGTEQRLQLSSMVPRADFHLR
>Sequência de aminoácidos de Hopnl:
MYIQQSGAQSGVAAKTQHDKPSSLSGLAPGSSDAFARFHPEKAGAFVPLEGHEEVFFDARSSFSSVDAADL PSPEQVQPQLHSLRTLLPDLMVSIASLRDGATQYIKTRIKAMADNSIGATANIEAKRKIAQEHGCQLVHPF HQSKF LFEKTIDDRAFAADYGRAGGDGHACLGLSVNWCQSRAKGQSDEAFFHKLEDYQGDALLPRVMGFQH IEQQAYSNKLQNAAPMLLDTLPKLGMTLGKGLGRAQHAHYAVALENLDRDLKAVLQPGKDQMLLFLSDSHA MALHQD SQGC LHFFDP LFGWQAD SF SNMSHF LADVFKRDVGTH WRGTEQRLQLSEMVP RADFH LR
>Sequência de aminoácidos de AvrPto:
MGNICVGGSRMAHQVNSPDRVSNNSGDEDNVT33QLLSVRHQLAESAGVPRDQHEFV3NQAPQSLRNRYNN LYSHTQRTLDMADMQHRYMTGA3GINPGMLPHENVDDMRSAITDWSDMREALQYAMGIHADIPPSPERFVA TMNFNGSIRMSTLSFSPYRNWQ
Exemplo 6 Identificação de Proteínas que Suprimem RISC Contendo AGQ1
Foi investigado então se quaisquer efetores de Pst DC3000 po- deriam suprimir a função de RISC que contém AG01 como observado com alguns supressores derivados de vírus de silenciamento de RNA. O mesmo conjunto de 23 efetores de Pto DC3000 foi testado adicionalmente quanto a possível interferência com as atividades de miRNA. A expressão transitória de um ou mais HopTI-1 não afetou a acumulação de miR834, mas aumen- tou dramaticamente os níveis de seu alvo cognato, a proteína 4 que interage com COP (CIP4) (figura 11). Em contraste, nem os níveis de miR834 nem os de CIP4 foram alterados após a liberação transitória de efetores HopCI, -X1 (figura 11 A) não relacionados de Pto DC3000.
A Figura 11A mostra que a superexpressão de hopT1-1 promo- ve a acumulação de mir384-alvo e não tem efeito significativo sobre os ní- veis estacionários de miR834. Folhas erfl mutantes foram agroinfiltradas com o construto 35S::hopT1-1 (OD=0,4) e os níveis de miR834 assim como de miR834-alvo (proteína 4 que interage com COP1 CIP4) foram monitora- dos 3 dias após a infiltração por análise Northern (painel superior) e análise Western (painel inferior), respectivamente.
Esses resultados sugerem que HopTI-1 age a jusante da bio- gênese de miRNA, potencialmente pela inibição de RISC direcionado a A- GOI, que é recrutada pela maioria dos miRNAs de planta.
Para testar essa hipótese, foi usada a linhagem repórter SUC- SUL (SS)120, na qual a expressão específica em floema de um transgene repetido invertido desencadeia um RNAi autônomo não-celular do transcrito de SULPHUR (SUL) endógeno, resultando em um fenótipo clorótico que se expande além da vasculatura (figura 11 Β). A Figura 11B mostra que um ale- lo fraco de agol suprime o silenciamento artificial sem efeito significativo sobre os níveis estacionários de siRNAs com 21-24 nt. A mutação de Agol- 12 suprime o silenciamento artificial ativado por uma forma de grampo artifi- ciai, atingindo o "sulphure" endógeno (SUL) e direcionado pelo promotor es- pecífico para floema (SUC2). Ago1-12 suprime o fenótipo de nervura cloróti- ca desencadeado pelo transgene SUC-SUL (painel superior). A mutação de Ago1-12 não interfere significativamente com a acumulação de siRNA de 21- 24 nt como ensaiado pela análise Northern (painel inferior). Das espécies de siRNA de SUL com 21 nt (dependente de DCL4) e 24 nt (dependente de DCL3), apenas o primeiro é necessário para RNAi em uma maneira estrita- mente dependente de AGO1.
O construto 35S::HopT1-1 foi transformado em SUC-SUL e du- as linhagens T2 independentes foram selecionadas, mostrando acumulação de mRNA de HopTI moderada (#4) e acentuada (#22) (figura 11C). A Figura 11C mostra que a superexpressão de HopT1-1 suprime o fenótipo SUC-SUL sem efeito significativo nem sobre a acumulação de siRNA de 21-24 nr nem sobre a de miRNA endógeno. Supressão do fenótipo de nervura clorótica ativada pelo transgene SUC-SUL (painel superior). Northern com baixo peso molecular sobre 21-24 SUL siRNA (painel central e direito). RT-PCR sobre mRNA de HopTI (painel central e esquerdo), LMW Northern de um subcon- junto de miRNAs endógenos (painel inferior). Ambas as linhagens exibiram pouca ou nenhuma clorose e acumularam níveis maiores de mRNA de SUL. Entretanto, a acumulação de siRNAs de SUL permaneceu inalterada, mime- tizando os efeitos da mutação de ago1-12 em plantas SUC-SUL. Também como em mutantes ago1-12, os níveis de vários miRNAs canônicos estavam normais em linhagens que expressam HopTI-1 apesar da grande acumula- ção de seus transcritos-alvo.
A Figura 11D mostra a representação esquemática que descre- ve o efeito esperado de uma perturbação de uma função RISCmiRNA. A Figu- ra 11E mostra que a superexpressão de hopT1-1 promove a acumulação do alvo de miR834 (CIP4) sem efeito sobre a acumulação de miR384. Resulta- dos da análise Western usando um anticorpo anti-CIP4. Figura 11F mostra que a superexpressão de hopT1-1 promove o acúmulo de alvos de miRNA. Um subconjunto de alvos de miRNA está mais elevado em duas linhagens transgênicas independentes que superexpressam hopT1-1 (painel esquer- do). O mesmo subconjunto de alvos de miRNA está mais elevado em mutan- tes ago1-11 e ago1-12 (painel direito). Coletivamente esses resultados indi- cam que HopT1-1 provavelmente interfere com a função de AGO1-RISC, resultando na supressão de miRNA, assim como das atividades de siRNA.
Foram obtidos resultados similares quando foi superexpressos o efetor hopY1 na linhagem repórter de silenciamento SUC-SUL (figura 12), exceto que um discreto aumento nos níveis de 21-24 nt SUL siRNA assim como de miRNAs endógenos foi observado nesse caso particular. Linhagens que superexpressam HopYI exibiram um aumento significativo na acumula- ção de vários alvos de miRNA (figura 12). A Figura 1C mostra que a super- expressão de hopY1 aumenta discretamente a acumulação de alguns miR- NAs endógenos. Entretanto, apesar de seu efeito sobre a atividade de miR- NA, HopYI não induziu uma alteração drástica do desenvolvimento (figura 12A). A Figura 12A mostra que a superexpressão de HopYI reduz o fenótipo de nervura clorótica ativado pelo transgene SUC-SUL. A Figura 12B mostra que a superexpressão de HopYI aumenta discretamente a acumulação de 21-24 nt SUL siRNAs. A Figura 12D mostra que a superexpressão de HopYI promove a acumulação de um subconjunto de alvos de miRNA assim como de mRNA de SUL.
As seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas Bss que interferem com a função de RISCmiRNA são as seguintes: >Sequência codificadora de HopT1-1:
AXGAXGAAAACAGICAGCAAICACTCGATACCCAGTACAAAICTCGICGIGGAXGCGGGAACGGAAACTTC GGCGCAGAAATCCCAGCCGGTTTGCAGCGAAATCCAGCGTAACAGCAAGATCGAAAAAGCAGTCATCGAAC ACATXGCCGACCACCCGGCAGC GAAAA TGACAA TAAGC GCGCTGGTTGACACGTIGACAGACGXXTTTGTC AGGGCTCATGGGGAGGTTAAGGGGTGGGCCC-AAATCGTCCAGGCAGTCTCTCGCCCTCATGACAGTAATCG ACACGGCAGTGGAGTGCTCAGCCCGCGCTTTGATGTAATGGGGAGTGIIGGXTGGAATGCGGCAGCTATCC GGGC CACCAG TCGCGTCGGGACGCTTCGAGAGAAAGGTACACTGTTCACXAACCXTATGCTCAGTAACAAC TTTAAACATITGCIXAAACGAGTGGTTAACGATCCAGCCTTGCAGCAAAAGCTCGACGGTGGGIXAGACCX CAACTATCTGAAGGCTTGTGAAGGCGAXCTTXATGTCAIGTCAGGGTGGGCIGCACGGGCXAGCGAAAGTC GTGAACAAAXXGGCAAAGCCCGGXAXGAAACGGCATCAAATCXTAGCCAGACGCIGATCAGXGCAC GIGAG XXGGCXTIXCAICGTCACAAXCCGGTXAAICATCCGXCTGCCCAAACGAAAGTGGGCIXCGA XAAGGGTTT GCCTGAGGAAICTGAXCXGCAGGTTCTGAGAGGCCAXGGCAGCAGIGTATGGAGIGTAAAACCGGGCAGCG ATTTCGCAAAGCGTGCIGAAGXTICTGGAAAGCCXAIIAICGCCGGCCCGICCGGIACCGCIICGCGCAXG GICGCXGTTGCGCGTXTTCIGGCACCGGC XTGTTTGAAAAGCCTGGGXAXXGAGAGTGAGCAGAACCTGAA AGAGC TIGTGCGGIATGCCTGCTATGCCTATTTCGGTCAGGACAGCCACCAITCGATGCTTGAAGTGAATC TTGGTGTCGCITCCCAIGGAAIGCCGGAACAAIGGGACGACACGCTTTATAACGAGCCTTXCAGTAATTCA ATTAAAGGTCGCGGGTTTGGTATAGACAATCTCGCGCATAGGCAAGTCGTCAGGCAGGCGGCTCAAAAGTC ATGA >Sequência codificadora de HopYI:
AT GAACAT TACGC CGC TCACGTC AGCCGCGGGCAAGGGCTC GTC CGCACAAGGC ACAGAC AAAATT TC CAT TCCCAACXCCACGCGCATGATCAATGCCGCTTCAATCAAGTGGTTGAATAAGGTGCGTAGCGCCATCAGTG ACCACATCCGCACCAGCATCGAGAAA.GGGAAACTGTTCGAGCTCGCCTCCTTGGGCAGCAACATGTTCGGT GTCCCGGCTCTTTCAGCGCGCCCCTCGACGCTCCAACCTGTGTTGGCGTTTGAGGCTGACCCCAATCACGA CCTGAACCTTGTCAGGGTCTATATGCAGGACAGCGCCGGCAAGCTCACTCCCTGGGACCCGACGCCCAACG CGGTCACGACGACGTCGAATCCATCAGAGCCTGATGCGCAGAGCGATACGGCTTCGTCATCATTACCTCGG CGGCCTCCCGCAGGCTCGGTGCTGAGTTTGCTGGGCATTGCGCTGGATCACGCGCAACGCCACAGTCCTCG CGCGGACAGGTCTGCCAAGGGACGACCTGGCCGAGAGGAGAGGAACGGGGCAAGGTTCAATGCCAAGCAAA CAAAGCCGACAGAGGCTGAAGCCTACGGTGATCATCAGACACCCAATCCTGATTTGCACAGGCAAAAAGAG ACAGCTCAACGCGTTGCTGAAAGCATCAACAGCATGCGAGAGCAGCAAAATGGAATGCAACGCGCCGAAGG GCTTCTCAGAGCCAAAGAAGCGTTGCAAGCTCGGGAAGCCGCGCGCAAGCAGCTTCTGC-ACGTGCTCGAGG CCATCCAGGCTGGCCGTGAAGACTCCACCGACAAGAAGATCAGCGCCACTGAAAAGAACGCCACGGGCATC AAC TACC AGTGA
As seqüências de aminoácidos das proteínas Bss que interferem com a função de RISCmiRNA são as seguintes:
>Sequência de aminoácidos de HopTI-1:
MMKTV3NH5IPSTNL VVDAGTST3AQK3QFVCSSIQRNSKIEKAVIEHIAD HPAAKMTI SAL VDTLTD VFV RAHGEVKGWAEIVQAV3RPHDSHHHG3GVL3PRFDVMGSVGWNAAAIRATSRVGTLREKGTLFTNLMLSNN FKHLLKRWNDPALQQKLDGGLDLNYLKACEGDLYVMSGKAARA3ESREQIGKARYETA3NLSQTLI3ARE LAFHRJHN?VNHP3AQTKVGFDKGL?EE3DLQVLRGHGSSVW3VKPGSD?AKRAEV3GKPIIAGPSGTASRM VAVARFLAPACLK3LGIESSQNLKELVRYACYAYFGQD3HH3MLEVNLGVA3HC-M?EQWDDTLYNEP?3NS IKGRGFGIDNLAHRQWRQAAQK3
>Sequência de aminoácidos de HopYI:
MNITPLTSAAGKGS3AQGTDKISIPNSTRMINAASIKWLNKVR3AISDHIRTSIEKGKLFELASLGSNMFG VPAL SARP ST LQP VLAFEADPNHD LNLVRVYMQD 3 AGKLTP WDP TP MAVT T T SNP 3E PD AQ SD TAS 33LP R RPPAGSVLSLLGIALDHAQRHSPRADRSAKGRPGREERNGARFNAKQTKPTEAEAYGDHQTPNPDLHRQKE TAQRVAE3INSMRSQQNGMQRAEGLLRAKEALQAREAARKQLLDVLEAIQAGREDSTDKKI3ATSKNATGI NYQ
Exemplo 7
Identificação de Proteínas que Suprimem a Inibição Traducional de miRNA
Foi investigado finalmente se proteínas efetoras bacterianas po- deriam suprimir a inibição traducional dirigida por miRNA, um fenômeno bem-caracterizado em animais mas também eficaz em plantas. Para esse propósito, foi liberado transitoriamente o mesmo conjunto de efetores de Pst DC3000 nas folhas mutantes efr1 e foram rastreados os efetores que pode- riam intensificar a acumulação de proteína de alvos de miRNA sem um im- pacto significativo nem sobre os níveis de alvo de mRNA nem sobre os ní- veis de miRNA maduro. Entre o subconjunto de efetores testados, a mono- ADP ribosiltransferase HopUI preencheu esses critérios já que ela induz níveis elevados de proteína alvo de miR398:Superóxido dismutase 1 (CDS1) e 2 (CDS2), sem efeito significativo sobre a acumulação dos níveis de mR- NA de CDS1/2 ou dos níveis de miR398 (dados não mostrados). Além disso, a liberação de HopUI no mutante efr1 que expressa o construto sensor de miR171 restaurou uma grande acumulação de proteína GFP mas não alte- rou os níveis de miRNA de GFP1 indicando que HopUI interfere de fato com a inibição traducional dirigida por miRNA (figura 13A/B e dados não mostra- dos). A Figura 13A mostra que a superexpressão de HopUI1 mas não da versão mutante HopUI DD1 restaura a expressão de GFP em plantas efr1 que expressam os construtos sensores de miR171. Plantas com Sensor (e- fr1) de miR171 foram Agroinfiltradas (OD=0,4) com os construtos 35S::GUSintron, 35S::HopU1 e 35S::HopU1DD e os níveis de GFP analisa- dos visualmente sob UV. A Figura 13B mostra a análise Western usando anticorpo anti-GFP. Significativamente, nenhum resgate de expressão de GFP nem do alvo CSD2 de miR398 endógeno foi observado quando foi libe- rada transitoriamente uma versão mutante de HopUI que abole a atividade da ADP-ribosiltransferase. Isso indica que a atividade de ADP- ribosiltransferase é necessária para a supressão de silenciamento de RNA ativada por HopUI.
Para adicionalmente investigar se HopUI interfere na inibição traducional dirigida por um siRNA putativo, o construto 35S::HopU1 foi trans- formado na linhagem de referencia SUC-SUL e selecionamos linhagens transgênicas T2 que expressam níveis elevados de proteínas hopU1. A ex- pressão de HopUI nessas linhagens transgênicas estáveis diminuiu discre- tamente os níveis de 21-24 SUL siRNA, mas não afetou os níveis de mRNA de SUL. Figura 13C mostra plantas SUC-SUL que expressam HopUI. Figura 13 D mostra a análise LMW Northern. Entretanto, uma redução significativa no fenótipo da nervura clorótica foi observada, o que é diagnóstico de níveis elevados de proteína SUL. A análise Western usando um anticorpo anti- CSD2 sugere que HopUI interfere adicionalmente com a inibição da tradu- ção dirigida por siRNA. Figura 13E mostra qRT-PCR de SUL mRNA.
A seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína Bss que in- terfere com a inibição traducional mediada por miRNA é a seguinte: >Sequência codificadora de HopUI:
ATGAAIATAAATCGACAACTGCCTGTAICAGGCTCGGAGCGAIXGTIGACTCCCGACGIGGGCGXAXCTCG CCAGGCTIGXTCCGAAAGGCAXXAXXCIACXGGACAGGAICGGCAXGAIXXXXACCGXXXXGCXGCCAGGC TACATGTGGAXGCGCAGXGTTXTGGTCXGXCAAXAGACGAXXXGATGGATAAGTTIXCXGACAAGCACXTC AGGGCXGAGCAICCTGAAXACAGGGAIGXCXAICCGGAGGAAIGXXCTGCCAXTXAXAXGCAXACCGCXCA AGACXAXTCXAGTCACCTCGXAAGGGGGGAAATAGGAACGCCGCXGXACCGAGAGGTCAATAATXAXCXTC GACTICAACATGAGAAXTCIGGGCGAGAAGCXGAAAXTGAIAAICACGACGAAAAGCIATCGCCTCACAXA AAAAXGCTXXCATCXGCGCTTAAXCGXXXAATGGATGXCGCCGCTXTTAGAGGAACGGXXXAXAGAGGCAT XC GC GGTGAX XXA GATACC AXXGCXC GGCXCXACC AXC XAX XCGAXACGGGCGGCCGGXACGXAGA GCCCG CXXT CATGAG TACAACXCGAAXAAAGGACAGTGCCCAGGTGTTTGAGCCAGGCACGCCAAACAACA TAGCT TTCCAGAXAAGCCXAAAAAGAGGCGCCGACA.XXXCGGGAXCXXCCCAAGCGCCCXCAGAGGAAGAAAXCAX GCTACCCATGAXGAGXGAGTXCGXCATTGAACATGCAXCCGCTCXXXCCGAAGGAAAGCATXTAXTXGXAT TAAGTCAGAXIXGA
A seqüência de aminoácidos da proteína Bss que interfere com a inibição traducional mediada por miRNA é a seguinte: >Sequência de aminoácidos de HopUI:
MNINRQLP VS GSERLLTPDVGV5RQACSSRHY3TGQDRHDF YRF AARLHVDAQCFGLSIDDLMD KF SDECHF RAEHFE YRDVYPEECSAIYMHXAQD YSSHLVRGEIGXP LYRE VNNY LRLQHENSGRE AEIDNHDEK LSFHI KMLSSALNRLMDVAAFRGTVYRGrRGDLDIIARLYHLFDXGGRYVEPAFMSTTRIKDSAQVFEPGXPMNIA FQISLKRGADISGSSQAPSEEEIMLFMMSEFVIEHASALSEGKHLFVLSQI
Proteínas Bss mutadas em resíduos-chave que não perturbam a supressão do silenciamento de RNA serão particularmente úteis já que elas não são reconhecidas pelas proteínas de resistência (R) da planta e, portan- to, não devem induzir a morte celular programada clássica mediada por R (que é geralmente prejudicial a planta). Exemplos incluem versões de HopNI que são mutadas nas tríades catalíticas preditas de cisteína protease e que ainda retém sua habilidade de suprimir o silenciamento de RNA (figura 1°C). Essas versões mutantes podem estar comprometidas no reconheci- mento do gene R e ainda suprimir o silenciamento de RNA em diferentes espécies de planta. O método descrito aqui permite, assim, a geração de versões mutadas de proteínas Bss a fim de desacoplar a supressão de si- lenciamento de RNA do reconhecimento do gene R.
Bss identificadas de acordo com essa invenção também são proteínas úteis para identificar componentes de planta e de animal envolvi- dos na biogênese e/ou atividade de miRNA. Como um exemplo, a mono- ADP-ribosiltransferase HopUI discutida acima foi mostrada, recentemente, interagir diretamente com as proteínas que se ligam a RNA ricas em glicina, AtGRP7 e AtGRP8. A ADP-ribosilação de GRP7 por HopUI ocorre sobre dois resíduos conservados de arginina localizados no domínio de reconhe- cimento de RNA de GRP7 e provavelmente perturba sua habilidade de se ligar a RNA. Como a atividade de HopUI ADP-ribosiltransferase é necessá- ria para sua atividade de supressão de silenciamento de RNA1,foi antecipado que AtGRP7 e AtGRP8 são novos fatores envolvidos na inibição traducional dirigida por miRNA e siRNA. A Figura 13 mostra que a superexpressão de HopU1, mas não da versão mutante HopUIDD, restaura a expressão de GFP em plantas efr1 que expressam construtos sensores de miR171. Outras proteínas Bss também interagirão diretamente e perturbarão componentes do hospedeiro envolvidos no silenciamento de RNA e podem, portanto, ser usadas como sondas moleculares para identificar fatores que silenciam RNA ou seus reguladores, em ambos os sistemas de planta e de animal.
As seqüências codificadoras dos novos componentes putativos de silenciamento de RNA de Arabidopsis thaliana são as seguintes:
>Sequência codificadora de AtGRP7 (At2q21660)
ATGGCGTCCGGTGATGTTGAGTATCGGIGCXTCGTTGGAGGTCTAGCATGGGCCACTGATGACAGAGCTCT TGAGACTGCCTTCGCTCAATACGGCGACGXTAXXGAXTCCAAGATCATTAACGATCGTGAGACTGG AAGAX CAAGG GGATTCGGATTCGTCACCTTCAAGGATGAGAAAGCCATGAAGGATGCGATTGAGGGAATGAACGGA CAAGATCTCGATGGCCGTAGCATCACTGTTAACGAGGCTCAGTCACGAGGAAGCGGTGGCGGCGGAGGCCA CCGTGGAGGTGGTGGCGGTGGATACCGCAGCGGCGGTGGXGGAGGTTACTCCGGTGGAGGTGGTAGCTACG GAGGTGGCGGCGGXAGACGCGAGGGTGGAGGAGGAXACAGCGGCGGCGGCGGCGGTTACXCCTCAAGAGGT GGTGGTGGCGGAA GC TACGGTGGTGGAAGACGXGAGGGAGGAGGAGGATACGGXGGTGGTGAAGGA GGAGG TTACGGAGGAAGCGGTGGTGGTGGAGGATGGTAA
>Sequência codificadora de AtGRP8 (At4q39260)
ATGTCTGAAGTTGAGTACCGGTGCTTTGTCGGCGGCCTTGCCTGGGCCACCAATGATGAAGATCTTCAAAG GACGXTCTCACAGXTCGGCGACGTTATCGATTCTAAGAXCATXAACGACCGCGAGAGIGGAAGATCAAGGG GATTCGGATTCGTCACCTTCAAGGACGAGAAAGCCATGAGGGATGCGATXGAAGAGATGAACC-GTAAAGAG CTCGATGGACGTGTCATCACCGTGAACGAGGCTCAGTCGAGAGGTAGCGGC GGTGGC GGAGGAGGC CGTGG TGG AAGC GGTGGTGGTTACCGCAGCGGAGGCGGTGGTGGATACTCAGGAGGCGGTGGCGGCGGATACTCAG GAGGAGGCGGTGGTGGTTACGAGAGACGTAGCGGAGGTTACGGATCTGGTGGAGGCGGTGGTGGCCGAGGA TACGGTGGTGGTGGACGCCGTGAGGC-AGGTGGCTACGGAGGCGGTGATGGTGGAAGTTACGGAGGCGGTGG TGGCGGCTGGIAA
As seqüências de aminoácidos dos novos componentes putati- vos de silenciamento de RNA de Arabidopsis são as seguintes:
>Sequência de aminoácidos de AtGRP7
MASGDVEYRCFVGGLAWATDDRALETAFAQYGDVIDSKIINDRE TGRSRGFGFVTFKDEKAMKDAIEGMNG QDLDGRSITVNEAQSRGSGGGGGHRGGGGGGYR3GGGGGY3GGGGSYGGGGGRRE GG GGY SGGGGG YSSRG GGGGSYGGGRRSGGGGYGGGEGGGYGGSGGGGGW
>Sequência de aminoácidos de AtGRP8
MSEVEYRCFVGGLAWATNDED LQRTF 3QFGDVIDSKI INDRESGRSRGFGFVTFKDEKAiMRDAIEEMNGKE LDGRVITVNEAQSRGSGGGGGGRGGSGGGYRSGGGGGYSGGGGGGYSGGGGGGYERRSGGYGSGGGGGGRG YGGGGRREGGGYGGGDGGSYGGGGGGw
Pesquisa de homologia em animais revelou vários ortólogos possíveis de AtGRP8 em seres humanos, sugerindo que um ou vários des- ses ortólogos podem estar envolvidos na execução ou regulação de funções dirigidas por miRNA em animais. Portanto, Bss de planta e de animal tam- bém são ferramentas valiosas para descobrir novos componentes de silenci- amento de RNA em uma ampla faixa de organismos.
As várias proteínas humanas com homologia com AtGRP8 estão listadas abaixo:
>HsCIRBP gil4502847lreflNP 001271.1|proteína de ligação a RNA induzível pelo frio THomo sapiens]
Masdegklfvgglsfdtneqsleqvfskygqisevvwkdretqrsrgfgfvtfeniddakdammamngks
VDGRQIRVDQAGKSSDNRSRGYRGGSAGGRGFFRGGRGRGRGFSRGGGDRGYGGNRFESRSGGYGGSRDYY SSRSQSGGYSDRSSGGSYRDSYDSYATHNE
>HsCIRP CDS:
ATGGCATCAGATGAAGGCAAACTTTTTGTTGGAGGGCTGAGTTTTGACACCAATGAGCAGTCGCTGGAGCA GGTCTTCTCAAAGTACGGACAGATCTCTGAAGTGGTGGTTGTGAAAGACAGGGAGACCCAGAGATCTCGGG GATTTGGGTTTGTCACCTTTGAGAACATTGACGACGCTAAGGATGCCATGATGGCCATGAATGGGAAGTCT GTAGATGGACGGCAGATCCGAGTAGACCAGGCAGGCAAGTCGTCAGACAACCGATCCCGTGGGTACCGTGG TGGCTCTGCCGGGGGC CGGGGC TTCTTCCGTGGGGGCCGAGGACGGGGCCGTGGGTTCTCTAGAGGAGGAG GGGACCGAGGCTATGGGGGGAACCGGTTCGAGTCCAGGAGTGGGGGCTACGGAGGCTCCAGAGACTACTAT AGCAGCCGGAGTCAGAGTGGTGGCTACAGTGACCGGAGCTCGGGCGGGTCCTACAGAGACAGTTACGACAG TTarcrTararar»arr;ar;Taa
>HsRBP3 qil5803137lreflNP 006734.1 !proteína 3 do motivo de ligação a RNA fHomo sapiensl
M5SEEGKLFVGGLNFNTDEQALEDHFS3FGPISEVVVVKDRETQRSRGJGFITFTNPEHASVAMRAMNGES LDGRQIRVDHAGKSARGTRGGGFGAHGRGR3YSRGGGDQGYGSGRYYD5RPGGYGYGYGRSRDYNGRNQGG YDRY 3GGNYRDNY DN
>HsRBP3 CDS:
ATGTCCTCTGAAGAAGGAAAGCTCTTCGTGGGAGGGCTCAACTTTAACACCGACGAGCAGGCACTGGAAGA CCACTTCAGCAGTTTCGGACCTATCTCTGAGGTGGTCGTTGTCAAGGACCGGGAGACTCAGCGGTCCAGGG GTTTTGGTTTCATCACCTTCACCAACCCAGAGCATGCTTCAGTTGCCATGAGAGCCATGAACGGAGAGTCT CrGGATGGTCGTCAGATCCGTGTGGATCATGCAGGCAAGTCTGCTCGGGGAACCAGAGGAGGTGGCTTTGG GGCCCA TGGGCGTGGTCGCAGCTACTCTAGAGGTGGTGGGGACCAGGGCTATGGGAGTGGCAGGTATTATG ACAGTCGACCTGGAGGGTATGGATATGGATATGGACGTTCCAGAGACTATAATGGCAGAAACCAGGGTGGT TATGACCGCTACTCAGGAGGAAATTACAGAGACAATTATGACAACTGA
>HsRBPX gil89059830lreflXP 933552.1 IPREDITA:similar a proteína do mo- tivo de ligação a RNA. ligada a X fHomo sapiensl
MGEADRLGKFFIGGLNTE TNK KALEA VF GKYGQIVEVHLMKDCETNKSRGF AFITFERPADAKDAA RD MNG KSLDGKAIKVEQATKPSFE3GRRGPPPPPRSRGPPRVLRGGRGG3GGTREPPSRGGHMDDWWIFHEF
>HsRBPX CDS:
ATGGGTGAAGCAGATCGCCTAGGAAAGTTTTTCATTGGTGGGCTTAATACGGAAACAAATAAGAAAGCTCT TGAAGCAGTATTTGGCAAATATGGACAAATAGTGGAAGrACACTTGATGAAAGACTG TGAAACCAACAAAT CAAGAGGATTTGCTTTTATCACCTTTGAAAGACCAGCAGACGCTAAGGATGCAGCCAGAGACATGAATGGA AAGTCATTAGATGGAAAAGCCATCAAGGTGGAACAAGCCACCAAACCGTCATTTGAAAGTGGTAGACGTGG ACCGCCTCCACCTCCAAGAAGTAGAGGCCCTCCAA GAGTTCTTAGAGGTGG AAGAGG AGGAAGTGGAGGAA CCAGGGAACCTCCCTCACGGGGAGGACACATGGATGACTGGTGGATATTCCATGAATTTTAA

Claims (34)

1. Método para modular a via de miRNA em plantas e animais, cujo método compreende: - introduzir em uma planta ou animal um construto de ácido nu- cleico que compreende um promotor responsivo constitutivo ou de patógeno operativamente ligado a uma seqüência de miRNA primário (pri-miRNA) res- ponsivo a um padrão molecular associado a um patógeno (PAMP) ou uma seqüência que codifique uma proteína envolvida na biogênese ou atividade de miRNA.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito pri- miRNA ou a dita proteína envolvida na biogênese ou atividade de miRNA aumenta a resistência ao patógeno após a expressão na dita planta ou ani- mal.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito pri- miRNA é selecionado a partir daqueles da Tabela 2.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o dito pri- miRNA é diferente de miR393.
5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a dita proteína envolvida na biogênese ou atividade de miRNA é selecionada do conjunto que consiste em DCL1, AG01, SERRATE e HEN1.
6. Planta ou animal não-humano preparado pelo método como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 5.
7. Construto de ácido nucleico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 5.
8. Método para identificar compostos úteis na modulação seleti- va da via de miRNA em plantas e animais, cujo método compreende: - expor a planta ou animal ou células de uma planta ou animal que tenham sido modificados para conter um sistema de expressão que compreende seqüências de controle para expressão de um componente da via de miRNA operativamente ligado a uma seqüência repórter em que a dita planta, animal ou células contenham opcionalmente também um desenca- deador da expressão do componente da dita via de miRNA a um candidato a composto, e - detectar a presença ou ausência de expressão da seqüência repórter, através do que um composto que efetue a expressão da se- quência repórter é identificado como um composto útil na modulação seletiva da via de miRNA em plantas e animais.
9. Método para identificar um gene útil na modulação seletiva da via de miRNA em plantas e animais, cujo método compreende: - mutagenizar uma planta ou animal ou células de uma planta ou animal que tenham sido modificados para conter um sistema de expressão compreendendo seqüências de controle associadas com a expressão de um componente da via de miRNA operativamente ligado a uma seqüência repór- ter, em que a dita planta, animal ou células contenham também, opcional- mente, um desencadeador da dita expressão de componente da via de miRNA, e - detectar o nível de expressão da seqüência repórter, através do que um mutante que efetue a expressão aumentada da seqüência repórter é identificado como contendo uma mutação de gene útil na modulação seletiva da via de miRNA em plantas e animais, identifi- cando o gene mutante.
10. Método para identificar compostos úteis na modulação sele- tiva da via de miRNA em plantas e animais, cujo método compreende: - expor uma planta ou animal ou células de uma planta ou um animal que tenham sido modificados para conter um sistema de expressão constitutivo para uma seqüência repórter que pode ser silenciada por um miRNA, em que a dita planta, animal ou células contenham também, opcio- nalmente, um desencadeador da expressão do componente da dita via de miRNA para um candidato a composto e, - detectar o nível de expressão da seqüência repórter, através do que um composto que diminua o nível de expressão da seqüência repórter é identificado como um composto útil na modulação seletiva da via de miRNA em plantas e animais.
11. Método para identificar um gene útil na modulação seletiva da via de miRNA em plantas e animais, cujo método compreende: - mutagenizar uma planta ou animal ou células de uma planta ou animal que tenham sido modificados para conter uma expressão constitutiva para uma seqüência repórter que pode ser silenciada pelo miRNA, em que a dita planta, animal ou células contenham também, opcionalmente, um de- sencadeador da dita expressão do componente da via de miRNA a um can- didato a composto, e - detectar o nível de expressão da seqüência repórter, através do que um composto que diminua o nível de expressão da seqüência repórter é identificado como um composto útil na modulação seletiva da via de miRNA em plantas e animais.
12. Método para identificar precursores de miRNA (pri-miRNA) responsivos a PAMP, cujo método compreende: - isolar o RNA total do dito hospedeiro, e - selecionar o RNA do RNA total isolado de um hospedeiro modi- ficado para conter uma proteína que induza uma resposta de PAMP que é expressa em níveis elevados no dito hospedeiro quando comparado com um hospedeiro que não tenha sido exposto à dita proteína e que hibridiza com complementos de seqüências a montante das estruturas "stem loop" no ge- noma.
13. Pri-miRNA isolado responsivo a PAMP identificado de acor- do com o método como definido na reivindicação 12.
14. Pri-miRNA isolado responsivo a PAMP de acordo com a rei- vindicação 13, que está descrito na Tabela 2.
15. Pri-miRNA isolado responsivo a PAMP da reivindicação 14 que é diferente de miR393.
16. Método para conferir resistência aumentada a patógeno em uma planta ou animal ou célula de planta ou animal, que compreende modi- ficar a dita planta ou animal ou célula de planta ou animal para efetuar a ex- pressão do pri-miRNA responsivo a PAMP como definido em quaisquer das reivindicações 12 a 15.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o dito pri- miRNA é expresso sob o controle operativo de um promotor que é ativado pela exposição de uma planta ou animal ou célula de planta ou animal a um patógeno.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o dito promotor é selecionado entre o promotor WRKY6 e o promotor PR1 ou outro promotor responsivo a patógeno incluindo o promotor de miRNA responsivo a PAMP.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que um ou mais elementos reguladores cis-atuantes estão dispostos a montante, ou incorporados dentro, do dito promotor e da seqüência que expressa miRNA.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o dito e- lemento regulador cis-atuante é selecionado do conjunto que consiste em uma W Box, um elemento AuxRE, um elemento RY, um elemento FIM, múl- tiplos desses elementos e combinações dos mesmos.
21. Supressor de silenciamento bacteriano identificado pelo mé- todo aqui descrito.
22. Supressor de silenciamento bacteriano de acordo com a rei- vindicação 21, selecionado do conjunto que consiste em AvrPtoB, AvrPto, HopNI, HopHI, HopUI, HopT1-1 e HopYI.
23. Método para modular seletivamente a expressão de miRNA em uma célula, o qual compreende contatar a dita célula com o supressor de silenciamento bacteriano como definido na reivindicação 21 ou 22, ou um sistema de expressão para isso.
24. Método para produzir uma proteína desejada em células hospedeiras recombinantes, cujo método compreende cultivar as células que tenham sido modificadas para expressar um supressor de silenciamento bacteriano (Bss) e expressar um construto de ácido nucleico para expressão de uma seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína desejada.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que as células hospedeiras recombinantes são células de planta.
26. Método de acordo com a reivindicação 24 ou 25, em que Bss e a proteína desejada são expressas como uma proteína de fusão.
27. Sistema de expressão recombinante, o qual compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão compos- ta por um supressor de silenciamento bacteriano (Bss) e uma proteína dese- jada operativamente ligada a seqüências de controle que realizam sua ex- pressão nas células hospedeiras recombinantes.
28. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 27, em que as ditas seqüências de controle são operáveis em células de planta.
29. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 26 ou -27, em que a proteína desejada é uma proteína que é terapeuticamente efi- caz em animais.
30. Sistema de expressão, o qual compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica um supressor de silenciamento bacteriano ope- rativamente ligado a seqüências de controle heterólogas.
31. Método para conferir resistência a patógenos em uma planta, o qual compreende selecionar plantas com componentes envolvidos na bio- gênese ou atividade de miRNA que se tornam resistentes a ação de supres- sores de silenciamento.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o dito su- pressor é um supressor bacteriano de silenciamento.
33. Planta selecionada de acordo com o método como definido na reivindicação 31 ou 32.
34. Método para manipular especificamente o acúmulo de miR- NA a fim de alterar processos fisiológicos e de desenvolvimento normalmen- te orquestrados por aquelas moléculas, o qual compreende fundir uma se- qüência codificadora de supressor de silenciamento bacteriano Bss a um promotor de planta específico para tecido que direciona a expressão em raí- zes, folhas, caule, inflorescências, incluindo opcionalmente elementos pro- motores pato-miR para obter controle espacial e temporal da atividade de miRNA.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013016201A1 (en) * 2011-07-22 2013-01-31 University Of Delaware Use of phased small rnas for suppression of plant defense and other plant genes
WO2013055898A1 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for enhancing the efficacy of microrna mediated interference
EP2798065B1 (en) 2011-12-27 2019-06-05 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Simultaneous gene silencing and supressing gene silencing in the same cell
CN103194484B (zh) * 2012-01-09 2015-05-27 中国科学院微生物研究所 培育抗病水稻的方法及其专用载体和启动子
WO2015048083A1 (en) * 2013-09-24 2015-04-02 The Feinstein Institute For Medical Research Peptides inhibiting cold-inducible rna binding protein activity
US10550400B2 (en) * 2014-12-15 2020-02-04 Paris Sciences Et Lettres—Quartier Latin Methods to monitor post-translational gene silencing activity in plant tissues/cell types relevant for pathogen entry, propagation or replication
AU2022315530A1 (en) 2021-07-20 2024-01-18 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their preparation, and uses
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Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6852835B2 (en) * 2000-04-03 2005-02-08 Alan Collmer DNA molecules and polypeptides of Pseudomonas syringae Hrp pathogenicity island and their uses
WO2003068912A2 (en) * 2002-02-12 2003-08-21 Cornell Research Foundation, Inc. PSEUDOMONAS SYRINGAE HARPINS, HopPtoP AND HopPmaHPTO, AND THEIR USES
EP1375669A1 (en) * 2002-06-13 2004-01-02 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Method for enhancing the disease resistance in plants by altering trehalose-6-phosphate levels
US7888467B2 (en) * 2002-08-16 2011-02-15 Boyce Thompson Institute For Plant Research Bacterial effector proteins which inhibit programmed cell death
US20050144669A1 (en) * 2003-07-01 2005-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research MicroRNAs in plants
ITRM20030335A1 (it) * 2003-07-09 2005-01-10 Univ Roma Sistema di espressione di sirna.
WO2006044322A2 (en) * 2004-10-12 2006-04-27 The Rockefeller University Micrornas

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