BRPI0806779A2 - composições e métodos para o diagnóstico, tratamento e prevenção de condições da próstata - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES E MéTODOS PARA 0 DIAGNóSTICO, TRATAMENTO E PREVENçãO DE CONDIçõES DA PRóSTATA. São reveladas composições e métodos para diagnóstico, prevenção e tratamento de câncer de próstata e neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN).

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA O DIAGNÓSTICO, TRATAMENTO E PREVENÇÃO DE CONDIÇÕES DA PRÓSTATA

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

As quimioterapias atuais anticâncer que são baseadas em agentes de alquilação, antimetabólitos e produtos naturais são heterogêneas em seus mecanismos de ação. Conseqüentemente, a maior parte deles também age contra células normais que resultam em efeitos colaterais severos e toxicidade ao paciente.

O acúmulo de mutações e a perda de funções de controle celular causam mudanças fenotípicas progressivas da histologia normal para pré-cancer precoce como neoplasia intra-epitelial (IEN) a IEN crescentemente severa a câncer superficial e finalmente à doença invasiva. Embora esse processo possa ser relativamente agressivo em alguns casos, ele ocorre geralmente de forma relativamente lenta por anos e mesmo décadas. A dependência de oncogene é a dependência fisiológica das células cancerosas sobre a ativação continuada ou superexpressão de oncogenes únicos para manutenção do fenótipo maligno. Essa dependência ocorre no ambiente das outras mudanças que marcam a progressão neoplásica.

A quimioproteção de câncer é definida como a prevenção de câncer ou tratamento no estado de pré-câncer ou mesmo antes. O longo período de progressão até o câncer invasivo é uma grande oportunidade científica, mas também um obstáculo econômico para mostrar o benefício clínico da drogas quimiopreventivas candidatas. Portanto, um importante componente da pesquisa de desenvolvimento de agente quimiopreventivo nos anos recentes tem sido a identificação de marcos precoces (pré-câncer) ou biomarcadores que predigam de modo preciso um benefício clínico do agente ou efeito redutor da incidência do câncer. Em vários cânceres, a IEN é um marco precoce como em próstata.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com o objetivo desta invenção, como aqui incorporado e amplamente descrito, esta invenção relaciona- se às composições e aos métodos para diagnóstico, prevenção e tratamento de câncer da próstata e de neoplasia intra- epitelial da próstata (PIN).

As vantagens adicionais do método e das composições reveladas serão apresentadas em parte na descrição que se segue, e em parte serão compreendidas a partir da descrição, ou podem ser entendidas pela prática do método e das composições reveladas. As vantagens do método e das composições reveladas serão compreendidas e conquistadas por meio dos elementos e combinações particularmente apontados nas reivindicações em anexo. Deve-se compreender que tanto a descrição geral anterior quanto a descrição detalhada a seguir são apenas exemplares e explanatórias, e não são restritivas da invenção como reivindicada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos em anexo, que são incorporados e constituem uma parte desta especificação, ilustram várias modalidades do método e das composições reveladas, e, junto com a descrição, servem para explicar os princípios do método e das composições revelados.

A Figura 1 mostra a análise quantitativa de RT-PCR (QRT-PCR) da expressão de beta-defensina-1 (DEFBl). Para verificar a indução da expressão de DEFBl, foi realizada QRT-PCR. A Figura IA mostra os níveis de expressão relativa de DEFBl comparados em amostras clínicas de 6 pacientes que se submeteram às prostatectomias radicais. A Figura IB mostra os níveis de expressão relativa de DEFBl comparados em amostras clínicas prostáticas benignas e malignas, células hPrEC e em linhagens de células de câncer da próstata, antes e depois da indução de DEFBl. A Figura IC mostra os níveis de expressão relativa de DEFBl analisados em tecido benigno, tecido maligno e em neoplasia intra- epitelial da próstata (PIN) em um corte de tecido único. A Figura ID mostra a expressão de DEFBl em tecido benigno, tecido maligno e PIN em um paciente, comparada no nível de expressão médio de DEFBl encontrado no tecido benigno.

A Figura 2 mostra a análise microscópica de mudanças induzidas por DEFBl na integridade da membrana e morfologia celular. A morfologia celular de DU14 5, PC3 e LNCaP foi analisada por microscopia de contraste de fase depois de 48 horas de indução de DEFBl. 0 pregueado da membrana é indicado por setas pretas e os corpos apoptóticos são indicados por setas brancas.

A Figura 3 mostra a análise de citotoxicidade de DEFBl em células de câncer da próstata. As linhagens de células da próstata DU145, PC3 e LNCaP foram tratadas com PonA para induzir a expressão de DEFBl por 1-3 dias, e depois um ensaio de MTT foi realizado para determinar a viabilidade celular. Os resultados representam a média ± D.P., η = 9.

A Figura 4 mostra a indução de morte celular em células DUl45 e PC3 por DEFBl. A expressão de DEFBl foi induzida em linhagens de células de câncer da próstata DU145 (A) e PC3 (B), e depois elas foram submetidas à coloração com anexina V/FITC/iodeto de propídio e à análise de citometria de fluxo. As células positivas para iodeto de propídio e anexina V foram consideradas apoptóticas. Os tempos de indução são mostrados sob cada painel. Os números próximos às caixas para cada ponto de tempo representam as percentagens de células iodeto de propídio (PI)" anexina V+ (quadrante inferior direito) e células PI+ anexina V+ (quadrante superior direito). Os dados são de um experimento único que é representativo dos três experimentos separados.

A Figura 5 mostra análise de pancaspase após indução de DEFBl. Células DU145 e PC3 foram coradas com fluormetil cetona rotulada com FAM-VAD-FMK para detectar atividade de caspase. As células eram visíveis sob DIC para cada condição. A análise microscópica confocal não revelou qualquer coloração de caspase nas células de controle DU14 5 (B), PC3 (F) e LNCaP (J). As células tratadas com PonA por 24 horas para induzir DEFBl revelaram atividade de caspase em DU14 5 (D) e PC3 (H). Nenhuma atividade de caspase foi detectada em LNCaP (L).

A Figura 6 mostra o silenciamento da expressão da proteína do paired box homeotic gene 2 (PAX2) após tratamento de siRNA de PAX2. A Figura 6A mostra análise de Western blot de células PC3 e DU145 transf ectadas com dúplex de siRNA de PAX2 no dia zero (linha 1), 2° dia (linha 2) e 4o dia (linha 3). A Figura 6B mostra análise de Western blot de células PC3 e DU14 5 transfectadas com dúplex de siRNA de PAX2 no dia zero (linha 1), 2° dia (linha 2), 4o dia (linha 3) e 6o dia (linha 4). A proteína ΡΑΧ2 estava indetectável logo após quatro dias de tratamento (linha 3) em células DU14 5 e após seis dias de tratamento em PC3. Os blots foram retirados e re-sondados para β-actina como um controle interno.

A Figura 7 mostra a análise do crescimento de células de câncer da próstata após tratamento com siRNA de PAX2. A análise microscópica por contraste de fase de DU145, PC3 e LNCaP em 6 dias na presença de meio de crescimento normal. O tratamento com siRNA de controle negativo não teve efeito sobre as células. No entanto, houve a redução significativa no número de células em todas as três linhas após o tratamento com siRNA de PAX2.

A Figura 8 mostra a análise de morte celular após silenciamento de siRNA de PAX2. As linhagens de células de câncer da próstata PC3, DU145 e LNCaP foram tratadas com 0,5 pg de um pool de quatro siRNAs de PAX2 ou quatro siRNAs de controle inespecificos por 2, 4 ou 6 dias, quando então foi feito o ensaio de MTT para determinar a viabilidade celular. Os resultados representam a média ± D.P., η = 9.

A Figura 9 mostra a análise da atividade de caspase. Células DU145, PC3 e LNCaP foram coradas com fluormetil cetona marcada com carboxifluoresceína para a atividade de caspase detectada após o tratamento com siRNA de PTlX2. A análise microscópica confocal de células não tratadas e tratadas mostra que as células eram visíveis com DIC. A análise sob fluorescência não revelou coloração de caspase em DU145 (B) de controle, células PC3 (F) e células LNCaP (J) . No entanto, as células tratadas com siRNA de PAX2 induziram atividade de caspase em DU145 (D) , PC3 (H) e LNCaP (L). A Figura 10 mostra análise de fatores apoptôticos após tratamento com siRNA de PAX2. As mudanças na expressão de fatores pró-apoptóticos foram comparadas em células não tratadas de controle e em células tratadas por seis dias com siRNA de PAX2. A Figura 1OA mostra níveis de expressão de proteína X associada a Bcl-2 (BAX) aumentados em DU145, PC3 e LNCaP. A Figura 1OB mostra a expressão aumentada do agonista de morte do domínio de interação de BH3 (BID) em DU145 e LNCaP, mas alterações em PC3. A Figura 1OC mostra níveis de expressão aumentados de promotor de morte associada a Bcl-2 (BAD) em todas as três linhagens de células.

A Figura 11 mostra o modelo de ligação de PAX 2 à seqüência de DNA de reconhecimento. O repressor da transcrição de PAX2 se liga a um sítio de reconhecimento CCTTG (ID. DE SEQ. N°: 1) imediatamente adjacente à TATA box DEFB1, evitando a transcrição e expressão da proteína DEFB1. A inibição da expressão de proteína PAX2 permite a expressão normal de DEFB1.

A Figura 12 ilustra a construção repórter de DEFB1. O promotor de DEFB1, que consiste nas primeiras 160 bases acima do sítio de iniciação de mRNA, foi amplificado por PCR por células DU145 e ligado no plasmídeo repórter de luciferase pGL3.

A Figura 13 mostra que a inibição de PAX2 resulta na expressão de DEFB1. DU145, PC3, LNCaP e HPrEC foram tratadas por 48 horas com siRNA de PAX2. A análise por QRT- PCR antes do tratamento mostrou ausência de expressão de DEFB1 em DU145, PC3 e LNCaP. No entanto, a expressão de DEFB1 foi restaurada após o tratamento em todas as linhagens. Não houve mudança na expressão de DEFBl após tratamento com siRNA de HPrEC PAX2-null.

A Figura 14 mostra que a inibição de PAX2 resulta em atividade aumentada do promotor de DEFBl. Construções de promotor de PC3/pGL3 e promotor de DU14 5/pGL3 foram geradas e transfectadas em células PC3 e DU14 5, respectivamente. A atividade do promotor foi comparada antes e depois da inibição de PAX2 por tratamento com siRNA. A atividade do promotor de DEFBl aumentou 2,65 vezes em DU145 e 3,78 vezes em PC3 após o tratamento.

A Figura 15 mostra análise ChIP da ligação de PAX2 ao promotor de DEFBl. A análise ChIP foi realizada em células DU145 e PC3. Após imunoprecipitação com um anticorpo anti- PAX2, foi realizada PCR para detectar a região do promotor de DEFBl que contém o sítio de reconhecimento de PAX2 GTTCC (ID. DE SEQ. N°: 2) . Isso demonstra que o repressor da transcrição de PAX 2 é ligado ao promotor de DEFBl em linhagens de células de câncer da próstata.

A Figura 16 mostra a estrutura prevista da PrdPD e PrdHD com DNA. As coordenadas das estruturas do PrdPD ligado ao DNA (Xu e cols. , 1995) e do PrdHD ligado ao DNA (Wilson e cols. , 1995) foram usadas para construir um modelo dos dois domínios ligados a um sítio de PHO. Os sítios de ligação individuais estão próximos uns aos outros com uma orientação específica, como indicado. O domínio RED é orientado com base na estrutura cristal de PrdPD.

A Figura 17 mostra uma comparação de seqüências de consenso de diferentes domínios pareados (paired domains) . No topo da Figura, é desenhada uma representação esquemática de contatos proteína ± DNA descritos na análise cristalográfica do complexo Prd-domínio pareado ± DNA. As caixas vazias indicam hélices a, caixas sombreadas indicam lâminas β, e uma linha espessa indica uma curva β. Aminoácidos em contato são mostrados por código de uma letra. São mostrados apenas os contatos aminoácido ± base diretos. Os círculos vazios indicam contatos de encaixe (groove contacts) importantes, enquanto as setas vermelhas indicam contatos de encaixe menores. Esse esquema está alinhado com todas as seqüências de consenso conhecidas para proteínas do domínio pareado (são mostradas somente as fitas superiores). As linhas verticais entre seqüências de consenso indicam pares de bases conservadas. A numeração das posições é mostrada na parte de baixo da Figura.

A Figura 18 mostra o direcionamento de PAX2 como uma estratégia quimiopreventiva. A expressão aberrante de PAX2 é um evento inicial na iniciação e progressão do câncer. A inibição de PAX2 durante displasia ou outro estágio pré- canceroso pode ser usada para a prevenção do câncer.

A Figura 19 mostra o efeito da angiotensina II (AngII) sobre a expressão de PAX2 em células DU145. A fim de determinar o efeito de AngII sobre a expressão de PAX2, os níveis de proteína DEFBl foram monitorados após o tratamento. Aqui, os níveis de expressão de PAX2 aumentaram logo após 4 horas, e persistiram até 48 horas.

A Figura 20A mostra o efeito de Losartan (Los) sobre a expressão de PAX 2 em células DU145. Células DU145 foram tratadas com o bloqueador de receptor de angiotensina II do tipo 1 (ATRl) Losartan. QRT-PCR revelou que os níveis de mensagem de PAX2 foram diminuídos pelo menos à metade após o tratamento. A Figura 2OB mostra o efeito de um bloqueador do receptor de angiotensina II do tipo 2 (ATR2) sobre a expressão de PAX 2 em células DU145. Para determinar o efeito do receptor ATR2 sobre a expressão de PAX2, células DU145 foram tratadas com o bloqueador do receptor ATR2 PD123319. Aqui, a expressão de PAX2 foi aumentada em 7 a 8 vezes.

A Figura 21 mostra que Los bloqueia o efeito de AngII sobre a expressão de PAX2 em células DU145. O tratamento de células DUl45 com 5 μΜ de AngII por 72 horas resultou em um aumento de 2 vezes na expressão de PAX2. Além disso, o tratamento com 10 μΜ por 72 horas resultou em um aumento de mais de 3 vezes na expressão. O tratamento de células com 5 μΜ de Losartan suprimiu a proliferação em 50%. Além disso, o tratamento com Losartan por 30 minutos antes do tratamento com AngII bloqueou o efeito de AngII sobre a proliferação.

A Figura 22 mostra que AngII aumenta a proliferação de células DU14 5. O tratamento de células DU145 com 5 μΜ de AngII por 72 horas resultou em um aumento de 2 vezes na proliferação. Além disso, o tratamento com 10 μΜ por 72 horas resultou em um aumento de mais de 3 vezes na proliferação.

A Figura 23 mostra o efeito de Los e inibidores da MAP quinase sobre a expressão de PAX 2 em células DU14 5. A Figura 23A mostra que o tratamento de células DU145 com Losartan suprime a expressão de fosfor-ERK 1/2 e de PAX2; a Figura 23B mostra que inibidores da MEK quinase e AICAR suprimem a expressão de proteína PAX2; a Figura 23C mostra que inibidores da MEK quinase e Losartan suprimem expressão da proteína fosfo-STAT3. A Figura 24 mostra o efeito de Los e inibidores da MEK quinase sobre a ativação de PAX2 em células DU145. A Figura 24A mostra que o tratamento de células DU14 5 com inibidores da sinalização de ATlR resultou em uma diminuição dos níveis de fósforo-proteína PAX2, que é a forma ativa de PAX2. Além disso, o tratamento com o indutor da AMP quinase AICAR resultou na supressão da expressão de PAX2. A Figura 24B mostra que a inibição de sinalização de ATlR com Los diminuiu os níveis de fosfo-JNK. No entanto, AngII aumentou os níveis da proteína fosfor-JNK.

A Figura 25 mostra que AngII aumenta a expressão de PAX2 e diminui a expressão de DEFBl em células hPrEC. Para determinar o efeito de AngII sobre os níveis de PAX2 em células hPrEC, as células foram tratadas por 72 e 96 horas, e a expressão de PAX2 e de DEFBl foi examinada por QRT-PCR. Aqui, o tratamento com AngII resultou em aumentos dramáticos de PAX2 a níveis similares aos de células PC3 de câncer da próstata. Inversamente, a expressão de DEFBl foi reduzida significativamente após tratamento com AngII.

A Figura 26 mostra uma representação esquemática da sinalização de AngII e PAX 2 no câncer da próstata. A expressão de PAX 2 em células de câncer da próstata é regulada pela sinalização da via de ATlR. Especificamente, a cascata de sinalização da MEK quinase leva à expressão aumentada de PAX2. Além disso, ATlR e AngII supra-regulam a ativação de PAX2 por meio de JNK.

A Figura 2 7 mostra uma representação esquemática do bloqueio da expressão de PAX 2 como uma terapia para o câncer da próstata. A Figura 27A mostra que a expressão de PAX2 é regulada pela via de sinalização de ATlR. A inibição da expressão de PAX 2 resulta na re-expressão de DEFBl e morte das células cancerosas. A Figura 27B mostra que compostos que bloqueiam o ATlR, quinases downstream ou que suprimem diretamente PAX2 oferecem uma nova abordagem para o tratamento de câncer da próstata.

A Figura 28 mostra uma comparação da expressão de DEFBl e de PAX2 com Escala de Gleason. Os níveis relativos de expressão de DEFBl foram comparados em amostras clínicas benignas de 6 pacientes que foram submetidos a prostatectomias radicais. Aqui, a escala de Gleason estava inversamente correlacionada com os níveis de expressão de DEFBl em tecido prostático benigno adjacente. Pacientes com níveis relativos de expressão de DEFBl maiores do que 0,005 tiveram escores de Gleason de 6. No entanto, aqueles com níveis de expressão de menos de 0,005 tiveram escores de Gleason de 7.

A Figura 2 9 mostra a proporção de PAX2-DEFBl como um fator preditivo para o desenvolvimento de câncer da próstata. QRT-PCR foi realizada em cortes de tecido prostático por microdissecção por captura a laser (LCM) para determinar níveis relativos de expressão de DEFBl e de PAX2. Os níveis de expressão de DEFBl diminuíram do normal a PIN até câncer. No entanto, a expressão de PAX2 aumentou do normal a PIN até câncer. Além disso, o paciente # 1.457 com câncer com escore de Gleason 6 teve mais DEFBl em tecido normal e PIN comparado com o paciente # 1.569 com câncer com escore de Gleason 7. Inversamente, o paciente # 1.569 teve níveis mais elevados de PAX2 em regiões cancerosas comparado com o paciente # 1.457.

A Figura 30 mostra que o Fator Preditivo de Donald (DPF) se baseia na proporção da expressão relativa de PAX2- DEFBl. Um aumento do DPF de tecido prostático aumenta probabilidade do desenvolvimento de câncer da próstata. 0 tecido com uma proporção de PAX2-DEFBl entre 0 e 3 9 com base no DPF era normal (benigno) . 0 tecido com uma proporção de PAX2-DEFBl entre 4 0 e 99 representava PIN (pré-canceroso) com base na escala do DPF. Finalmente, o tecido com uma proporção de PAX2-DEFBl entre 10 0 e 500 era maligno (câncer de grau baixo a elevado).

A Figura 31 mostra a análise da expressão de hBD-1 em tecido prostático humana. Os níveis relativos da expressão de hBD-1 foram comparados em amostras clínicas normais de pacientes que foram submetidos a prostatectomias radicais. A linha pontilhada serve como um ponto de referência para a comparação de valores obtidos entre amostras macroscópicas e derivadas por LCM7 e os escores de Gleason correspondentes estão indicados acima de cada barra. A Figura 3IA mostra os níveis de expressão de hBD-1 comparados em tecidos obtidos por dissecção macroscópica. A Figura 3IB mostra os níveis de expressão de hBD-1 comparados em tecido obtidos por microdissecção por captura a laser.

A Figura 32 mostra a análise de expressão de hBD-1 em linhagens de células da próstata. A Figura 32A mostra os níveis de expressão de hBD-1 comparados em relação às células hPrEC em linhagens de células de câncer da próstata, antes e depois da indução de hBD-1. Um asterisco representa níveis estatisticamente mais elevados de expressão comparados com hPrEC. Asteriscos duplos representam níveis de expressão estatisticamente significativos comparados com a linhagem celular antes da indução de hBD-1 (teste t de Student, ρ < 0,05) . A Figura 32B mostra a expressão ectópica de hBD-1 verificada na linhagem de células de câncer da próstata DU145 por imunoistoquímica. As células hPrEC foram coradas para hBD-1 como um controle positivo (a·. DIC e b: fluorescência) . Células DU145 foram transfectadas com hBD-1 e induzidas por 18 horas (c: DIC e d: fluorescência). Tamanho da barra = 2 0 μΜ.

A Figura 33 mostra a análise da citotoxicidade de hBD- 1 em células de câncer da próstata. As linhagens de células da próstata DU145, PC3, PC3/AR+ e LNCaP foram tratadas com Pon A para induzir a expressão de hBD-1 por 1-3 dias, quando então foi realizado o ensaio de MTT para determinar a viabilidade celular. Cada barra representa a média ± S.E.M. de três experimentos independentes realizados em triplicata.

A Figura 34 mostra a análise por QRT-PCR da expressão de hBD-1 e de cMYC em cortes de tecido prostático por LCM humana de tecido normal, PIN e tumor. A expressão para cada gene é apresentada como proporções de expressão comparadas com β-actina. A Figura 35A mostra uma comparação de níveis de expressão de hBD-1 em cortes normais, de PIN e tumorais. A Figura 35B mostra uma comparação do nível de expressão de cMYC em cortes normais, de PIN e tumorais.

A Figura 3 5 mostra a análise por QRT-PCR da expressão de hBDl após knockdown de PAX2 com siRNA. Os níveis de expressão de hBD-1 são apresentados como proporções de expressão comparadas com β-actina. Um asterisco representa níveis estatisticamente mais elevados de expressão comparados com a linhagem celular antes do tratamento com siRNA de PAX2 (teste t de Student, ρ < 0,05) .

A Figura 3 6 mostra o silenciamento da expressão de proteína PAX2 após tratamento com siRNA de PAX2. A Figura 37A mostra a expressão de PAX2 examinada por análise Western blot em células primárias da próstata HPrEC (raia 1) e em células de câncer da próstata DU14 5 (raia 2) , PC3 (raia 3) e LNCaP (raia 4) . Os blots foram removidos e re- sondados para β-actina como um controle interno para assegurar uma carga igual. A Figura 37B mostra a análise Western blot de células DU14 5, PC3 e LNCaP, e todas confirmaram knockdown de expressão de PAX2 após transfecção com dúplex de siRNA de PAX2. Novamente, os blots foram removidos e re-sondados para β-actina como um controle interno.

A Figura 37 mostra a análise do crescimento de células de câncer da próstata após tratamento com siRNA de PAX2. A análise microscópica por contraste de fase de células HPrEC (A) , LNCaP (C) , DU145 (E) e PC3 (G) em 6 dias na presença de siRNA inespecífico de controle negativo. Houve uma redução significativa no número de células em DU145 (D) , PC3 (F) e LNCaP (H) após o tratamento com siRNA de PAX2. No entanto, parece não ter havido nenhum efeito em HPrEC (B) . Barra = 20 pm.

A Figura 3 8 mostra a análise de morte celular após silenciamento de siRNA de PAX2. As linhagens de células de câncer da próstata PC3, DU14 5 e LNCaP foram tratadas com siRNA de PAX2 ou siRNAs inespecíficos de controle negativo por 2, 4 ou 6 dias, quando então foi realizado o ensaio de MTT. Knockdown de PAX2 resultou em uma diminuição da viabilidade celular relativa em todas as três linhagens. Os resultados representam média ± D.P., η = 9.

A Figura 39 mostra a análise da atividade de caspase. Células DU145, PC3 e LNCaP foram coradas com fluormetil cetona marcada com carboxifluoresceína para a atividade de caspase detectada após o tratamento com siRNA de PAX2. A análise sob fluorescência revelou ausência de coloração de caspase em DU145 de controle (A) , células PC3 (C) e células LNCaP (E) . No entanto, células tratadas com siRNA de PAX2 induziram atividade de caspase em DU145 (B) , PC3 (D) e LNCaP (F) . Barra = 20 μm.

A Figura 40 mostra a análise de fatores apoptóticos após tratamento com siRNA de PAX2. As alterações na expressão de fatores pró-apoptóticos foram comparadas em células não tratadas de controle e em células tratadas por 6 dias com siRNA de PAX2. A Figura 41A mostra expressão de BAD aumentada em DU14 5, PC3 e LNCaP após knockdown de PAX2. A Figura 41B mostra níveis de expressão de BID aumentados em células LNCaP e DU145, mas não em células PC3 . A Figura 41C mostra expressão de AKT diminuída em células LNCaP e DU145. No entanto, não houve alteração na expressão de AKT em células PC3 após knockdown de PAX2. Os resultados representam a média ± D. P., η = 9. Os asteriscos representam diferenças estatísticas (p < 0,05).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O método e as composições revelados podem ser compreendidos mais facilmente por referência à seguinte descrição detalhada de modalidades particulares e nos Exemplos aqui incluídos e nas Figuras e suas descrições anteriores e seguintes. São revelados materiais, composições e componentes que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados na preparação de, ou são produtos do método e das composições revelados. Esses e outros materiais são aqui revelados, e entende-se que, quando combinações, subconjuntos, interações, grupos etc. desses materiais são revelados, embora possa não ser explicitamente feita referência específica de cada uma das várias combinações individuais e coletivas e da permutação desses compostos, cada uma delas é aqui especificamente contemplada e descrita. Por exemplo, caso um peptídeo seja revelado e discutido e diversas modificações que possam ser feitas a diversas moléculas que incluem o peptídeo sejam discutidas, cada uma e todas as combinações e permutações de peptídeo e as modificações que são possíveis são especificamente contempladas, a menos que especificamente indicado de forma diferente. Dessa forma, se uma classe de moléculas A, B e C for revelada, bem como uma classe de moléculas D, EeFe um exemplo de uma molécula combinada, A-D, forem revelados, então, mesmo se cada uma não for citada individualmente, cada uma será individual e coletivamente contemplada. Dessa forma, neste exemplo, cada uma das combinações Α-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E e C-F é especificamente contemplada e deve ser considerada revelada pela revelação de A, B e C; D, EeF; e da combinação de exemplo A-D. Do mesmo modo, qualquer subconjunto ou combinação destes também é especificamente contemplado e revelado. Dessa forma, por exemplo, o subgrupo de Α-E, B-F e C-E é especificamente contemplado e deve ser considerado revelado pela revelação de A, B e C; D, EeF; e da combinação de exemplo A-D. Esse conceito deve ser aplicado a todos os aspectos deste pedido, incluindo, sem limitação, as etapas nos métodos de produção e utilização das composições reveladas. Dessa forma, caso haja diversas etapas adicionais que possam ser realizadas, entende-se que cada uma dessas etapas adicionais pode ser realizada com qualquer modalidade específica ou combinação de modalidades dos métodos revelados, e que cada uma dessas combinações é especificamente contemplada e deve ser considerada revelada.

Aqueles habilitados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar com a utilização, no máximo, de experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas do método e das composições aqui descritos. Esses equivalentes visam ser englobados pelas reivindicações em anexo.

Entende-se que o método e as composições revelados não se limitam à metodologia, aos protocolos e aos reagentes descritos, na medida em que esses podem variar. Entende-se também que a terminologia aqui usada tem a única finalidade de descrever modalidades específicas, e não visa limitar o escopo da presente invenção, que só será limitada pelas reivindicações em anexo.

A. Diagnóstico, tratamento e prevenção de câncer da próstata

São aqui reveladas composições e métodos de diagnóstico, tratamento e prevenção de câncer da próstata e de neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN).

1. Câncer de próstata

O carcinoma da próstata tornou-se uma doença importante em muitos países, e é a malignidade mais comumente diagnosticada em homens no mundo ocidental, sua ocorrência aumentando significativamente com a idade. Esse aumento e as mortes recentes de muitas pessoas públicas de câncer da próstata serviram para realçar a necessidade de se fazer algo sobre esse câncer. Foi sugerido que a disponibilidade mais ampla de rastreamento pode limitar a mortalidade por câncer da próstata.

O rastreamento do câncer da próstata atualmente consiste em um exame retal e a medida dos níveis do antígeno específico da próstata (PSA). Esses métodos não possuem especificidade, na medida em que o exame retal digital possui variabilidade considerável entre os examinadores e os níveis de PSA podem estar elevados na hiperplasia prostática benigna (BPH), em inflamação prostática e em outras condições. A incapacidade comparativa do PSA como teste diagnóstico foi demonstrada em 3 66 homens que desenvolveram câncer da próstata ao serem incluídos no "Physicians Health Study", um estudo prospectivo de mais de 22.000 homens. Os níveis de PSA foram medidos no soro, que foi armazenado no início do estudo, e foram encontrados níveis elevados em apenas 4 7% dos homens que desenvolveram câncer da próstata dentro dos quatro anos subseqüentes (Gann e cols. , 1995).

Os cânceres da próstata podem ser classificados com a utilização do sistema de Gleason, como conhecido por aqueles habilitados na técnica (Gleason, e cols. 1966). Esse sistema utiliza a arquitetura do tecido em vez de características citológicas. É usado um grau de 1 a 5 (bem a pouco diferenciado) , e o escore combinado das áreas mais freqüentes e mais severas da lesão é combinado. Os escores de Gleason fornecem informações prognósticas que podem ser valiosas em adição à avaliação do estágio do tumor (estadiamento) . Os escores de Gleason de 2 a 4 e 8 a 10 possuem bom valor preditivo, mas cerca de três quartos dos tumores possuem valores intermediários.

Dois sistemas principais são usados para o estadiamento do câncer da próstata: TNM e o sistema de Jewett (Benson & Olsson, e cols. 1989). O estadiamento leva em conta qualquer disseminação metastática do tumor e é difícil, pois é difícil avaliar o envolvimento de linfonodos locais ou invasão local. 0 tamanho do tumor também é difícil de medir, já que o tecido tumoral não pode ser distinguido macroscopicamente de tecido prostático normal, e porque a glândula prostática não possui uma cápsula e é circundada por uma camada de tecido gorduroso fibroso.

Quatro categorias descrevem o estágio dos tumores da próstata (T), variando de Tl a T4. Para TI, o câncer é microscópico, unilateral e não palpável. 0 médico não consegue sentir o tumor ou vê-lo com exames de imagem como, por exemplo, ultra-som transretal. 0 tratamento para a BPH pode ter descoberto a doença, ou ela foi confirmada por meio do uso de uma biópsia com agulha feita por causa de um PSA elevado. Para T2, o médico pode sentir o câncer com um exame digital do reto (DRE) . Parece que a doença está confinada à glândula prostática, em um ou em ambos os lados da glândula. Para T3, o câncer já avançou até o tecido imediatamente fora da glândula. Para T4, o câncer já se espalhou para outras partes do corpo. Portanto, os atuais métodos de triagem são insatisfatórios; não há um método confiável para o diagnóstico do câncer, ou para prever ou evitar sua possível disseminação metastática, que é a principal causa de morte para a maioria dos pacientes.

2. PAX2

Os genes PAX são uma família de nove genes de controle do desenvolvimento que codificam fatores de transcrição nucleares. Eles possuem um papel importante na embriogênese e são expressos em um padrão temporal e espacial muito ordenado. Todos contêm uma região "paired box" de 3 84 pares de bases que codifica um domínio de ligação de DNA que é altamente conservado ao longo da evolução (Stuart, E.T., e cols. 1994). A influência dos genes Pax sobre processos do desenvolvimento foi demonstrada pelas numerosas síndromes naturais do camundongo e humanas que podem ser atribuídas diretamente até mesmo a uma insuficiência heterozigota em um gene Pax. Uma seqüência de PAX2 é mostrada em Dressler, e cols. 1990. Exemplos de cânceres nos quais a expressão de PAX2 foi detectada estão listados na Tabela 1.

Tabela 1: Cânceres que expressam PAX2

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3. DEFBl

Beta-defensinas são peptídeos catiônicos com atividade antimicrobiana de amplo espectro que são produtos de epitélios e leucócitos (Ganz e Weiss, 1997) . Esses produtos gênicos únicos, de dois éxons, são expressos em superfícies epiteliais e secretados em locais que incluem a pele (Harder e cols., 1997) , a córnea (McNamara e cols., 1999) , a língua (Mathews e cols., 1999, Jia e cols., 2000), a gengiva (Mathews e cols., 1999; Krisanaprakornkit e cols., 1998) , as glândulas salivares (Mathews e cols., 1999) , o esôfago (Jia e cols., 2000), o intestino (0'Neil e cols., 1999), o rim (Valore e cols., 1998; Zucht e cols., 1998), o trato urogenital (Valore e cols., 1998) e o epitélio respiratório (Bals e cols., 1998; Goldman e cols., 1997; McCray e Bentley. 1997) . Até hoje, cinco genes de beta- defensina de origem epitelial foram identificados e caracterizados em seres humanos: DEFBl (Bensch e cols., 1995), DEFB2 (Harder e cols., 1997), DEFB3 (Harder e cols., 2001; Jia e cols., 2001), DEFB4 e HE2/EP2.

A estrutura primária de cada produto gênico de beta- def ensina é caracterizada por pequeno tamanho, um motivo de seis cisteínas, carga catiônica elevada, e diversidade intensa além dessas características. O traço mais característico de proteínas defensinas é seu motivo de seis cisteínas que forma uma rede de três ligações dissulfeto. As três ligações dissulfeto nas proteínas beta-defensina estão entre Cl-C5, C2-C4 e C3-C6. O espaçamento mais comum entre resíduos de cisteína adjacentes é 6, 4, 9, 6, 0. O espaçamento entre as cisteínas nas proteínas beta-defensina pode variar por um ou dois aminoácidos, exceto para C5 e C6, os localizados mais próximos ao terminal carbóxi. Em todos os genes de beta-defensina de vertebrados conhecidos, esses dois resíduos de cisteína estão adjacentes entre eles.

Uma segunda característica das proteínas beta- def ensina é seu pequeno tamanho. Cada gene de beta- defensina codifica uma pré-proproteína que varia em termos de tamanho de 59 a 80 aminoácidos, com um tamanho médio de 65 aminoácidos. Esse produto gênico é então clivado por um mecanismo desconhecido para criar o peptídeo maduro que varia em tamanho de 36 a 47 aminoácidos, com um tamanho médio de 45 aminoácidos. As exceções a essas faixas são os produtos gênicos de EP2/HE2 que contêm o motivo de beta- defensina e são expressos no epidídimo.

Uma terceira característica das proteínas beta- def ensina é a alta concentração de resíduos catiônicos. O número de resíduos carregados positivamente (arginina, lisina, histidina) no peptídeo maduro varia de 6 a 14, com uma média de 9.

A característica final dos produtos gênicos de beta- def ensina é sua estrutura primária diversa, mas conservação aparente da estrutura terciária. Além das seis cisteínas, nenhum aminoácido único em certa posição é conservado em todos os membros conhecidos dessa família de proteínas. No entanto, há posições que são conservadas que parecem ser importantes para as estruturas secundárias e terciárias e para a função.

Apesar da grande diversidade da seqüência de aminoácidos primária das proteínas beta-defensina, os dados limitados sugerem que a estrutura terciária dessa família de proteína é conservada. 0 núcleo estrutural é uma lâmina beta antiparalela, de fita tripla, como exemplificado pelas proteínas codificadas por BNBD-12 e DEFB2. As três fitas beta são conectadas por uma beta-turn e uma alça alfa- hairpin, e a segunda fita beta também contém um beta-bulge.

Quando essas estruturas são dobradas na sua estrutura terciária adequada, a seqüência aparentemente aleatória de resíduos catiônicos e hidrofóbicos é concentrada em duas faces de uma proteína globular. Uma face é hidrofílica e contém muitas das cadeias laterais carregadas positivamente, e a outra é hidrofóbica. Em solução, a proteína HBD-2 codificada pelo gene DEFB2 exibiu um segmento alfa-helicoidal próximo ao terminal N não atribuído previamente às estruturas em solução de alfa- defensinas ou à beta-defensina BNBD-12. Os aminoácidos cujas cadeias laterais são dirigidos contra a superfície da proteína são menos conservados entre proteínas beta- def ensina, enquanto os resíduos de aminoácidos nas três fitas beta da lâmina beta central são mais altamente conservados.

Os peptídeos de beta-defensina são produzidos como pré-pró-peptídeos e então clivados para liberar um fragmento de peptídeo do terminal C ativo; no entanto, as vias para o processamento intracelular, armazenamento e liberação dos peptídeos de beta-defensina humana nos epitélios das vias aéreas são desconhecidas.

4. Diagnóstico

Uraa vantagem fundamental do presente ensinamento é que os métodos aqui revelados geram um processo mais rápido e simplificado para identificar um tecido ou fluido corpóreo de um indivíduo que possui ou que está em risco para o câncer da próstata.

Dessa forma, os métodos aqui revelados podem compreender a detecção, incluindo a medida, de PAX2 e/ou DEFBl em um tecido do indivíduo, por exemplo, uma amostra de biópsia da próstata. A biópsia da próstata é um procedimento no qual são removidas pequenas amostras da glândula prostática de um homem para serem testadas quanto à presença de câncer. Ela é tipicamente realizada quando os níveis de um teste sangüíneo de PSA se elevam a um nível que está associado à possível presença de câncer da próstata.

Os métodos aqui revelados podem compreender a detecção, incluindo a medida, de PAX2 e/ou DEFBl em uma célula do indivíduo, por exemplo, uma célula da próstata do indivíduo.

Além disso, os métodos aqui revelados podem compreender a detecção, incluindo a medida, de PAX2 e/ou DEFBl em um fluido corpóreo do indivíduo, por exemplo, sangue, urina, plasma, soro, lágrimas, linfa, bile, líquido cefalorraquidiano, líquido intersticial, humor aquoso ou vítreo, colostro, escarro, líquido amniótico, saliva, secreções anais e vaginais, perspiração, sêmen, transudato, exsudato e líquido sinovial. O plasma sangüíneo é o componente líquido do sangue, no qual as células sangüíneas estão suspensas. 0 plasma é o maior componente único do sangue, constituindo cerca de 55% do volume total do sangue. 0 soro refere-se ao plasma sangüíneo do qual fatores de coagulação (por exemplo, fibrina) foram removidos. 0 plasma sangüíneo contém muitas proteínas vitais, incluindo fibrinogênio, globulinas e albumina sérica humana. Algumas vezes, o plasma sangüíneo pode conter impurezas virais que devem ser extraídas por meio de processamento viral.

A identificação de marcadores de proteínas sangüíneas que fornecem um diagnóstico mais preciso ou mais precoce de câncer pode ter um impacto positivo sobre o tratamento e a conduta do câncer. Como aqui revelado, a expressão aberrante de PAX2 ocorre precocemente na progressão do câncer e pode ser um evento de iniciação na tumorigênese. Portanto, amostras de pacientes coletadas para rastrear a presença de proteína PAX2 ou antígenos podem ser usadas para a detecção precoce de câncer.

Além disso, a incorporação de pesquisa de PAX2 pode dar aos médicos indicador para tecido iniciado ou pré- canceroso. Os candidatos para esse teste incluem pacientes em alto risco (com base na idade, raça) para câncer. Como diagnóstico, um teste de PAX2 positivo pode então ser acompanhado por pesquisas adicionais com biomarcador para determinar o local do câncer. Além disso, esses pacientes podem ser candidatos para inibidores de PAX2 para a quimioprevenção de seus cânceres. Alternativamente, esse teste pode ser usado em pacientes como uma medida da eficácia de sua terapia do câncer ou para monitorar a recorrência do câncer.

Como outro exemplo, pacientes que se apresentam com indicadores potenciais de câncer como, por exemplo, a detecção de nódulos na próstata durante um exame retal digital pelo médico, ou aqueles que apresentam uma elevação súbita do PSA, freqüentemente estão no estado de "espera vigilante". É freqüentemente difícil verificar se esses pacientes possuem ou irão desenvolver câncer. A detecção de PAX 2 em amostras, por exemplo, plasma/soro, desses pacientes pode ser usada para auxiliar na decisão de se obter uma biópsia em homens com suspeita de câncer da próstata, o que pode levar à redução do número de biópsias prostáticas desnecessárias e a uma intervenção mais precoce para sua doença.

Também é aqui fornecido um método de diagnóstico de câncer da próstata em um indivíduo, que compreende a detecção, em células da próstata do indivíduo, de níveis de PAX2 e beta-defensina-1 (DEFBl), em que a proporção de PAX2 para DEFBl é de pelo menos cerca de 100:1.

Também é aqui fornecido um método de diagnóstico de neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN) em um indivíduo, que compreende a detecção, em células da próstata do indivíduo, de níveis de PAX2 e beta-defensina-1 (DEFBl), em que a proporção de PAX2 para DEFBl é de pelo menos cerca de 40:1 e menos do que cerca de 100:1.

Também é aqui fornecido um método de identificação de um indivíduo como tendo uma próstata normal, que compreende a detecção, em células da próstata do indivíduo, de níveis de PAX 2 e beta-def ensina-1 (DEFBl), em que a proporção de PAX2 para DEFBl é menos do que cerca de 40:1. Também é aqui fornecido um método de distinguir entre condições normais, pré-cancerosas e cancerosas da próstata em um indivíduo, que compreende a detecção, em células da próstata do indivíduo, de níveis de PAX2 e beta-defensina-1 (DEFBl). Em alguns aspectos, quando a proporção de PAX2 para DEFBl é menos do que cerca de 40:1, uma condição normal da próstata é detectada. Em alguns aspectos, quando a proporção de PAX2 para DEFBl é de pelo menos cerca de 40:1 e menos do que cerca de 100:1, é detectada uma condição pré-cancerosa. Em alguns aspectos, quando a proporção de PAX2 para DEFBl é de pelo menos cerca de 100:1, é detectada uma próstata cancerosa.

5. Diagnóstico e tratamento

Também é aqui fornecido um método de diagnóstico e tratamento de câncer da próstata em um indivíduo, que compreende a detecção, em células da próstata do indivíduo, de níveis de PAX2 e beta-def ensina-1 (DEFBl) , em que a proporção de PAX2 para DEFBl é de pelo menos cerca de 100:1, compreendendo ainda o tratamento de referido indivíduo.

Também é aqui fornecido um método de diagnóstico e tratamento de neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN) em um indivíduo, que compreende a detecção, em células da próstata do indivíduo, de níveis de PAX2 e beta-defensina-1 (DEFBl) , em que a proporção de PAX2 para DEFBl é de pelo menos cerca de 40:1 e menos do que cerca de 100:1, compreendendo ainda o tratamento de referido indivíduo.

Como usado nos métodos revelados, o tratamento para o câncer da próstata pode envolver espera vigilante, cirurgia, radioterapia, ultra-som concentrado de alta intensidade (HIFU), quimioterapia, criocirurgia, terapia hormonal, ou alguma combinação destes. A melhor opção depende do estágio da doença, do escore de Gleason, e do nível de PSA. Outros fatores importantes são a idade do homem, sua saúde geral, e seus sentimentos sobre os tratamentos potenciais e seus possíveis efeitos colaterais.

Caso o câncer tenha se disseminado além da próstata, as opções de tratamento se alteram significativamente, e a maioria dos médicos que tratam o câncer da próstata usa diversos nomogramas para prever a probabilidade de disseminação. Tratamento por espera vigilante, HIFU, radioterapia, criocirurgia e cirurgia são geralmente oferecidos aos homens cujo câncer permanece dentro da próstata. A terapia hormonal e a quimioterapia são freqüentemente reservadas para doenças que se disseminaram para além da próstata. No entanto, há exceções: a radioterapia pode ser usada para alguns tumores avançados, e a terapia hormonal é usada para alguns tumores em estágio inicial. A crioterapia, a terapia hormonal e a quimioterapia também podem ser oferecidas se o tratamento inicial não obtém sucesso e o câncer progride.

A espera vigilante, também denominada "vigilância ativa", refere-se à observação e monitoramento regular, sem tratamento invasivo. A espera vigilante é freqüentemente usada quando é encontrado um câncer da próstata em estágio inicial, de crescimento lento, em um homem mais velho. A espera vigilante também pode ser sugerida quando os riscos de cirurgia, radioterapia ou terapia hormonal ultrapassam os possíveis benefícios. Outros tratamentos podem ser iniciados caso os sintomas se desenvolvam, ou caso haja sinais de que o crescimento do câncer está se acelerando (por exemplo, elevação rápida do PSA, aumento do escore de Gleason em biópsias repetidas etc.). A maioria dos homens que escolhem a espera vigilante para tumores em estágio inicial eventualmente possui sinais de progressão do tumor, e pode precisar iniciar o tratamento em até três anos.

A remoção cirúrgica da próstata, ou prostatectomia, é um tratamento comum para câncer da próstata em estágio inicial, ou para câncer que não respondeu à radioterapia. O tipo mais comum é a prostatectomia radical retropúbica, quando o cirurgião remove a próstata através de uma incisão abdominal. Outro tipo é a prostatectomia radical perineal, quando o cirurgião remove a próstata através de uma incisão no perineo, a pele entre o escroto e o ânus. A prostatectomia radical também pode ser realizada por via laparoscópica, através de uma série de pequenas incisões (1 cm) no abdome, com ou sem o auxílio de um robô cirúrgico.

A prostatectomia radical é altamente eficaz para tumores que não se disseminaram além da próstata; as taxas de cura dependem de fatores de risco, tais como o nível de PSA e o grau de Gleason. No entanto, ela pode causar lesão nervosa que altera significativamente a qualidade de vida dos que sobrevivem ao câncer da próstata. Medicações como, por exemplo, sildenafil (Viagra), tadalafil (Cialis) ou vardenafil (Levitra) podem ser usadas para restaurar algum grau de potência. Para a maioria dos homens com doença limitada ao órgão, uma técnica mais limitada que "poupa os nervos" pode ajudar a evitar a incontinência urinária e a impotência.

A prostatectomia radical tradicionalmente tem sido usada quando o câncer é pequeno. No caso de margens positivas ou doença localmente avançada encontrada na patologia, a radioterapia adjuvante pode oferecer um aumento da sobrevida. A cirurgia também pode ser oferecida quando um câncer não responde à radioterapia. No entanto, como a radioterapia causa alterações teciduais, a prostatectomia após radiação possui um risco maior de complicações.

A ressecção transuretral da próstata, comumente denominada "TURP", é um procedimento cirúrgico realizado quando o tubo da bexiga ao pênis (uretra) está bloqueado por aumento da próstata. A TURP é geralmente para doença benigna, e não significa um tratamento definitivo para o câncer da próstata. Durante uma TURP, um pequeno tubo (cistoscópio) é colocado no pênis, e o bloqueio da próstata é ressecado.

Na doença metastática, quando o câncer já se disseminou além da próstata, pode ser feita a remoção dos testículos (denominada orquidectomia) para diminuir os níveis de testosterona e controlar o crescimento do câncer.

A braquiterapia para o câncer da próstata é administrada com o uso de "sementes", pequenos bastões radioativos implantados diretamente no tumor. A terapia por radiação, também conhecida como radioterapia, utiliza raios gama para matar as células de câncer da próstata. Dois tipos diferentes de radioterapia são usados no tratamento do câncer da próstata: radioterapia por feixe externo e braquiterapia.

A radioterapia por feixe externo utilize um acelerador linear para produzir raios gama de alta energia que são dirigidos em um feixe em direção à próstata. Uma técnica denominada radioterapia de intensidade modulada (IMRT) pode ser usada para ajustar o feixe de radiação para se adaptar ao formato do tumor, permitindo que sejam aplicadas doses maiores à próstata e às vesículas seminais, com menos lesão da bexiga e do reto. A radioterapia por feixe externo é geralmente aplicada ao longo de várias semanas, com visitas diárias a um centro de radioterapia.

A radioterapia por feixe externo para o câncer da próstata é liberada por um acelerador linear, por exemplo, esse. A braquiterapia envolve a colocação de cerca de 100 pequenas "sementes" que contêm material radioativo (por exemplo, iodo-125 ou paládio-103) com uma agulha através da pele do períneo diretamente no tumor. Essas sementes emitem raios X de baixa energia que são capazes apenas de percorrer uma pequena distância. As sementes da braquiterapia ficarão na próstata permanentemente, mas homens com sementes implantadas não estão em risco de expor outras pessoas à radiação.

A radioterapia é comumente usada no tratamento do câncer da próstata. Ela pode ser usada no lugar da cirurgia para cânceres iniciais, e também pode ser usada em estágios avançados de câncer da próstata para o tratamento de metástases ósseas dolorosas. Os tratamentos com radiação também podem ser combinados com terapia hormonal para doença de risco intermediário, quando a radioterapia isoladamente possui uma menor probabilidade de cura do câncer. A radiação por feixe externo pode ser combinada com braquiterapia para situações de risco intermediário a elevado. Também se considera uma combinação de "modalidade tripla" de radioterapia por feixe externo, braquiterapia e terapia hormonal.

A radioterapia é freqüentemente oferecida aos homens cujos problemas médicos tornam a cirurgia mais arriscada. A radioterapia parece curar pequenos tumores que estão limitados à próstata, da mesma forma que a cirurgia. No entanto, desde 2006 algumas questões permanecem não resolvidas como, por exemplo, se a radiação deve ser aplicada ao resto da pelve, quanto deve ser a dose absorvida, e se a terapia hormonal deve ser dada ao mesmo tempo.

A criocirurgia é outro método de tratamento de câncer da próstata. Ela é menos invasiva do que a prostatectomia radical, e a anestesia geral é usada menos comumente. Sob orientação por ultra-som, bastes de metal são inseridos através da pele do períneo dentro da próstata. Nitrogênio líquido é usado para resfriar os bastões, congelando o tecido circundante a -196°C (~320°F) . À medida que a água no interior das células da próstata congela, as células morrem. A uretra é protegida do congelamento por um cateter preenchido com líquido aquecido. A criocirurgia geralmente causa menos problemas com o controle urinário do que outros tratamentos, mas a impotência ocorre em até noventa por cento das vezes.

A terapia hormonal utiliza medicações ou cirurgia para bloquear a captação pelas células de câncer da próstata de diidrotestosterona (DHT), um hormônio produzido na próstata e necessário para o crescimento e a disseminação da maioria das células de câncer da próstata. O bloqueio do DHT freqüentemente faz com que o câncer da próstata pare de crescer e até mesmo encolha. No entanto, a terapia hormonal raramente cura o câncer da próstata, pois cânceres que inicialmente respondem à terapia hormonal tipicamente se tornam resistentes após um a dois anos. A terapia hormonal é, portanto, normalmente usada quando o câncer já se disseminou da próstata. Ela pode ser dada aos homens submetidos à radioterapia ou cirurgia para ajudar a evitar o retorno do câncer.

A terapia hormonal para o câncer da próstata visa as vias utilizadas pelo corpo para produzir DHT. Uma alça de retroalimentação, que envolve os testículos, o hipotálamo, e as glândulas hipófise, adrenal e prostática, controla os níveis sangüíneos de DHT. Primeiro, níveis sangüíneos baixos de DHT estimulam o hipotálamo a produzir hormônio de liberação de gonadotrofina (GnRH). 0 GnRH então estimula a glândula hipófise a produzir hormônio luteinizante (LH), e o LH estimula os testículos a produzirem testosterona. Finalmente, a testosterona dos testículos e a desidroepiandrosterona das glândulas adrenais estimulam a próstata a produzir mais DHT. A terapia hormonal pode diminuir os níveis de DHT por interrupção dessa via em qualquer ponto.

A orquidectomia é a cirurgia para a remoção dos testículos. Como os testículos produzem a maior parte da testosterona do corpo, após a orquidectomia os níveis de testosterona caem. Agora a próstata não apenas não possui o estímulo da testosterona para produzir DHT, mas também não tem testosterona suficiente para transformar em DHT.

Antiandrogênios são medicações como, por exemplo, flutamida, bicalutamida, nilutamida e acetato de ciproterona, que bloqueiam diretamente as ações da testosterona e do DHT dentro das células de câncer da próstata.

Medicações que bloqueiam a produção de androgênios adrenais como, por exemplo, DHEA, incluem cetoconazol e aminoglutetimida. Como as glândulas adrenais só produzem cerca de 5% dos androgênios do corpo, essas medicações são geralmente usadas somente em combinação com outros métodos que possam bloquear os 95% de androgênios produzidos pelos testículos. Esses métodos combinados são denominados bloqueio total de androgênio (TAB) . O TAB também pode ser obtido com a utilização de antiandrogênios.

A ação do GnRH pode ser interrompida por uma de duas formas. Os antagonistas do GnRH suprimem a produção de GnRH diretamente, enquanto os agonistas de GnRH suprimem o GnRH por meio do processo de infra-regulação após um efeito de estimulação inicial. Abarelix é um exemplo de um antagonista do GnRH, enquanto os agonistas do GnRH incluem leuprolida, goserelina, triptorelina e buserelina.

Inicialmente, essas medicações aumentam a produção de LH. No entanto, como o suprimento constante da medicação não combina com o ritmo de produção natural do corpo, a produção tanto de LH quanto de GnRH diminui após poucas semanas.

6. Tratamento/prevenção

Também é aqui fornecido um método de prevenção de câncer da próstata em um indivíduo, que compreende a administração a um indivíduo diagnosticado com neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN) de uma composição que compreende um inibidor da expressão ou da atividade de PAX2. As "atividades" de uma proteína incluem, por exemplo, transcrição, tradução, translocação intracelular, secreção, fosforilação por quinases, clivagem por proteases, ligação homofílica ou heterofílica com outras proteínas, ubiqüitinação. Em alguns aspectos, "atividade de PAX2" refere-se especificamente ã ligação de PAX2 ao promotor de DEFB-I. Também é aqui fornecido um método de prevenção de câncer da próstata em um indivíduo, que compreende o diagnóstico de um indivíduo com neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN) e a administração ao indivíduo de uma composição que compreende um inibidor da expressão ou da atividade de PAX2. O indivíduo pode ser diagnosticado com PIN por detecção, em células da próstata do indivíduo, de níveis de PAX2 e beta-defensina-1 (DEFBl), em que a proporção de PAX2 para DEFBl é de pelo menos cerca de 40:1 e menos do que cerca de 100:1.

Em alguns aspectos, PAX2 é supra-regulada no estágio de atrofia, antes da PIN. Dessa forma, também é fornecido um método de prevenção de câncer da próstata em um indivíduo, que compreende a detecção, em células da próstata do indivíduo, de níveis de PAX2 e beta-defensina-1 (DEFBl), em que a proporção de PAX2 para DEFBl é de pelo menos cerca de 40:1 e menos do que cerca de 100:1, e a administração ao indivíduo de uma composição que compreende um inibidor da expressão ou da atividade de PAX2.

Também é aqui fornecido um método de tratamento de neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN) em um indivíduo, que compreende o diagnóstico de um indivíduo com PIN e a administração ao indivíduo de uma composição que compreende um inibidor da expressão ou da atividade de ΡΑΧ2. O indivíduo pode ser diagnosticado com PIN por detecção, em células da próstata do indivíduo, de níveis de PAX2 e beta-defensina-1 (DEFBl), em que a proporção de PAX2 para DEFBl é de pelo menos cerca de 40:1 e menos do que cerca de 100:1.

Também é fornecido um método de tratamento ou prevenção de neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN) em um indivíduo, que compreende a detecção, em células da próstata do indivíduo, de níveis de PAX2 e beta-defensina-1 (DEFBl), em que a proporção de PAX2 para DEFBl é de pelo menos cerca de 40:1 e menos do que cerca de 100:1, e a administração ao indivíduo de uma composição que compreende um inibidor da expressão ou da atividade de PAX2.

Também é aqui fornecido um método de tratamento de câncer da próstata em um indivíduo, que compreende o diagnóstico de um indivíduo com câncer da próstata e a administração ao indivíduo de uma composição que compreende um inibidor da expressão ou da atividade de PAX2. O indivíduo pode ser diagnosticado com câncer da próstata por detecção, em células da próstata do indivíduo, de níveis de PAX2 e beta-defensina-1 (DEFBl), em que a proporção de PAX2 para DEFBl é de pelo menos cerca de 100:1.

O inibidor dos métodos revelados pode ser um antagonista seletivo de angiotensina II. O inibidor dos métodos revelados pode ser um antagonista seletivo da enzima de conversão de angiotensina (ACE). Por exemplo, o inibidor pode ser enalapril. O inibidor pode ser um antagonista seletivo do receptor de angiotensina II do tipo 1 (ATlR). Por exemplo, o inibidor pode ser valsartan, olmesartan ou telmisartan. O inibidor pode ser um antagonista seletivo de MEK. 0 inibidor pode ser um antagonista seletivo de ERK1,2. 0 inibidor pode ser um antagonista seletivo de STAT3. 0 inibidor pode ser um antagonista seletivo de PAX2. O inibidor pode bloquear a ligação de PAX2 ao promotor de beta-defensina-1 (DEFBl). Em alguns aspectos, o inibidor da expressão ou da atividade de PAX2 revelado não é um antagonista do receptor ATlR.

0 termo "antagonista seletivo" significa alguma coisa que se liga diretamente e inibe a atividade do alvo. As "atividades" de uma proteína incluem, por exemplo, transcrição, tradução, translocação intracelular, secreção, fosforilação por quinases, clivagem por proteases, ligação homofílica ou heterofílica com outras proteínas, ubiqüitinação. Dessa forma, por exemplo, um antagonista seletivo de uma quinase pode se ligar à quinase e inibir a fosforilação do alvo da quinase. Dessa forma, por exemplo, um antagonista seletivo de uma quinase pode se ligar à quinase e evitar a ligação da quinase ao seu substrato.

Também é aqui fornecido um método de tratamento ou prevenção de câncer da próstata em um indivíduo, que compreende a administração ao referido indivíduo de uma composição que compreende um antagonista seletivo de MEK e/ou ERK1,2. Ele também pode ser um método de inibição da expressão de PAX2. O indivíduo nesse método pode primeiro ser diagnosticado com uma condição pré-cancerosa (por exemplo, PIN) ou com câncer.

O antagonista seletivo de MEK e/ou ERKl, 2 pode ser U0126. U0126 é um composto orgânico sintetizado quimicamente que foi inicialmente reconhecido como um antagonista celular AP-1, e verificou-se que é um inibidor muito seletivo e altamente potente da cascata da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) por inibição de seus ativadores upstream imediatos, proteína quinase ativada por mitógeno quinase 1 e 2 (também conhecidas como MEKl e MEK2, IC50: 70 e 60 nM, respectivamente). U0126 inibe MEK1,2 tanto ativa quanto inativa, diferentemente de PD098059, que só inibe a ativação de MEK inativa. O bloqueio da ativação de MEK evitaria a fosforilação downstream de diversos fatores, incluindo p62TCF (Elk-I), um indutor upstream de c-Fos e c-Jun, componentes do complexo de AP-I. A inibição da via de MEK/ERK por U0126 também evita todos os efeitos dos H-Ras e K-Ras oncogênicos, inibe parte dos efeitos desencadeados por fatores de crescimento, e bloqueia a produção de citocinas inflamatórias e metaloproteinases da matriz.

O antagonista seletivo de MEK e/ou ERK1,2 pode ser PD98059. Foi demonstrado que PD98059 (inibidor de MEKl) atua in vivo como um inibidor altamente seletivo da ativação de MEKl e da cascata de MAP quinase. PD98059 se liga às formas inativas de MEKl e evita a ativação por ativadores upstream como, por exemplo, c-Raf. PD98059 inibe a ativação de MEKl e MEK2 com valores de IC50 de 4 μΜ e 5 0 μΜ, respectivamente.

Também é aqui fornecido um método de tratamento ou prevenção de câncer da próstata em um indivíduo, que compreende a administração ao referido indivíduo de uma composição que compreende um antagonista seletivo de STAT3. Este também é um método de inibição da expressão de PAX2. O indivíduo nesse método pode inicialmente ser diagnosticado com uma condição pré-cancerosa (por exemplo, PIN) ou com câncer.

Como aqui mostrado, PAX2 inibe a expressão de DEFBl, e DEFB1 demonstrou ter atividade de morte de células tumorais. Dessa forma, é fornecido um método de tratamento de câncer em um indivíduo por inibição da expressão de PAX2. Um exemplo de um câncer tratado pelo presente método é câncer da próstata. Os presentes métodos são particularmente eficazes para o tratamento de câncer da próstata em estágio tardio.

Nos métodos de tratamento de câncer revelados, o método de inibição da expressão de PAX 2 pode ser por administração de um ácido nucléico que codifica um siRNA para PAX2. Dharmacon é uma fonte comercial para esses siRNAs.

Por exemplo, o siRNA para uso nos métodos pode compreender:

AUAGACUCGACUUGACUUCUU (ID. DE SEQ. N°: 3),

AUCUUCAUCACGUUUCCUCUU (ID. DE SEQ. N°: 4),

GUAUUCAGCAAUCUUGUCCUU (ID. DE SEQ. N°: 5),

GAUUUGAUGUGCUCUGAUGUU (ID. DE SEQ. N°: 6), ou combinações destes, incluindo fragmentos de pelo menos 10 ácidos nucléicos e variantes conservadoras destes.

Exemplos adicionais de seqüências-alvo para moléculas que inibem PAX2 incluem:

#1 ACCCGACTATGTTCGCCTGG (ID. DE SEQ. N°: 7),

#2 AAGCTCTGGATCGAGTCTTTG (ID. DE SEQ. N°: 8),

e #4 ATGTGTCAGGCACACAGACG (ID. DE SEQ. N°: 9). Foi demonstrado que o #4 inibe PAX2 (Davies e cols., Hum. Mol. Gen. Jan. 15, 13 (2); 235).

Outro trabalho (Muratovska e cols., "Paired-Box genes are frequently expressed in câncer and often required for câncer cell survival", Oncogene (2003) 22, 7.989-7.997) revela os seguintes siRNAs: GUCGAGUCUAUCUGCAUCCUU (ID. DE SEQ. N°: 10) e GGAUGCAGAUAGACUCGACUU (ID. DE SEQ. N°: 11).

Para infra-regular a expressão de Pax2, Fonsato e cols. transfectaram células endoteliais derivadas de tumor com um vetor de PAX2 anti-senso. Veja Fonsato V. e cols. Am. J. Pathol. 2006; 168(2): 706-1, que é aqui incorporado por referência quanto à sua descrição dessa molécula.

Similarmente, Hueber e cols. ensinam que cDNA de PAX2 anti- senso e pequeno RNA interveniente de PAX2 (100 nM) reduzem a proteína PAX2 endógena. Veja Hueber e cols. Kidney Int. 2006, que é aqui incorporado quanto aos seus ensinamentos de siRNA de PAX2 anti-senso e siRNA de PAX2.

São fornecidos inibidores de expressão de PAX2 ou da ligação de PAX 2 ao promotor de DEFB1 adicionais para aumentar a expressão de DEFB1 nos métodos atualmente revelados. Por exemplo, pequenas moléculas e anticorpos podem ser projetados com base nos presentes estudos para interferir ou inibir a ligação de PAX2 ao promotor de DEFB1.

Como aqui mostrado, PAX2 inibe a expressão de DEFB1, e foi demonstrado que DEFB1 possui atividade de morte de células tumorais. Dessa forma, também é fornecido um método de tratamento de câncer em um indivíduo por administração de DEFB1. Um exemplo de um câncer tratado pelo presente método é o câncer da próstata.

Similarmente, é fornecido um método de tratamento de câncer em um indivíduo por aumento da expressão de DEFB1 no indivíduo. Os presentes métodos de administração ou de aumento da expressão de DEFBl são particularmente eficazes para o tratamento de câncer da próstata em estágio tardio.

Em uma modalidade dos métodos da invenção para o tratamento de câncer por administração de DEFBl ou por aumento da expressão de DEFBl (por exemplo, por inibição da expressão ou ligação de PAX2), o indivíduo é um indivíduo diagnosticado com câncer da próstata. Em uma modalidade adicional dos métodos da invenção para o tratamento de câncer por administração de DEFBl ou por aumento da expressão de DEFBl (por exemplo, por inibição da expressão ou ligação de PAX2), o indivíduo é um indivíduo diagnosticado com câncer da próstata avançado (estágio tardio).

No método em que a expressão de DEFBl é aumentada, ela pode ser aumentada por bloqueio da ligação de PAX 2 ao promotor de DEFBl. 0 bloqueio da ligação de PAX2 ao promotor de DEFBl pode ser feito por administração de um oligonucleotídeo que contém o sítio de ligação de DNA de PAX2 de DEFBl. Esse oligonucleotídeo pode ser complementar à seqüência de PAX2 que se liga ao promotor de DEFBl. Alternativamente, o oligonucleotídeo pode interagir com a PAX2 de uma forma que iniba a ligação ao DEFBl. Essa interação pode ser baseada na estrutura tridimensional, e não na seqüência de nucleotídeos primária.

As proteínas PAX são uma família de fatores de transcrição conservados durante a evolução e capazes de se ligar a seqüências de DNA específicas por meio de um domínio denominado "domínio pareado" (paired domain) e "homeodomínio". 0 domínio pareado (PD) é uma seqüência de consenso compartilhada por certas proteínas PAX (por exemplo, PAX2 e PAX6). O PD dirige a ligação de DNA de aminoácidos localizados na α3-hélice que forma a complexo DNA-proteina. Para PAX2, os aminoácidos no HD reconhecem e interagem especificamente com uma seqüência de DNA central CCTTG (ID. DE SEQ. N°: 1). Espera-se que oligonucleotídeos com até e que excedem 64 bases de comprimento que incluem essa seqüência ou seu complemento sejam inibidores.

A especificidade de ligação de DNA do domínio pareado de PAX-8 foi investigada. Experimentos de seleção de sítio indicam que PAX-8 se liga a uma seqüência de consenso similar àquelas ligadas por PAX-2 e PAX-5. Quando seqüências de consenso de vários domínios pareados são observadas à luz de estudos estruturais recentes que descrevem a interação domínio pareado-DNA (Xu, e cols. 1995), parece que pares de bases em contato no sulco menor são conservados, enquanto a maioria dos pares de bases em contato com o sulco maior não o são. Portanto, uma rede de contatos de encaixe menores específicos é uma característica comum de interações domínio pareado-DNA. A importância funcional de uma rede desse tipo pode ser testada com sucesso por análise do efeito de mutações baseadas no consenso sobre o sítio de ligação de PAX2 do promotor de DEFBl.

O sítio de ligação de DNA de PAX 2 de DEFBl pode compreender o ID. DE SEQ. N°: 1 (CCTTG).

O oligonucleotídeo que compreende o sítio de ligação de DNA de PAX2 de DEFBl é selecionado do grupo que consiste em:

V-CCTTG-W (ID. DE SEQ. N°: 12), em que V é de 1 a 35 nucleotídeos contíguos flanqueados de DEFB1, e W é de 1 a 35 nucleotídeos. Os nucleotldeos podem ser nucleotídeos contíguos que normalmente flanqueiam o sítio de ligação de DNA de PAX2 de DEFBl. Alternativamente, eles podem não estar relacionados ao DEFBl, e selecionados rotineiramente para evitar interferência com a seqüência de reconhecimento.

Por exemplo, os oligonucleotídeos inibidores podem ser selecionados do grupo que consiste em:

CTCCCTTCAGTTCCGTCGAC (ID. DE SEQ. N°: 13)

CTCCCTTCACCTTGGTCGAC (ID. DE SEQ. N°: 14)

ACTGTGGCACCTCCCTTCAGTTCCGTCGACGAGGTTGTGC (ID. DE SEQ. N°: 15)

ACTGTGGCACCTCCCTTCACCTTGGTCGACGAGGTTGTGC (ID. DE SEQ. N°: 16)

As composições reveladas podem ser usadas para tratar qualquer doença em que ocorra proliferação celular não controlada como, por exemplo, cânceres. Uma lista não limitante de diferentes tipos de cânceres é a seguinte:. Iinfomas (de Hodgkin e não Hodgkin), leucemias, carcinomas, carcinomas de tecidos sólidos, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, sarcomas, gliomas, gliomas de alto grau, blastomas, neuroblastomas, plasmocitomas, histiocitomas, melanomas, adenomas, tumores hipóxicos, mielomas, Iinfomas ou sarcomas relacionados à AIDS, cânceres metastáticos ou cânceres em geral.

Uma lista representativa, mas não limitante, de cânceres nos quais as composições reveladas podem ser usadas no tratamento é a seguinte: linfoma, linfoma de célula B, linfoma de célula T, micose fungóide, doença de Hodgkin, leucemia mielóide, câncer da bexiga, câncer do cérebro, câncer do sistema nervoso, câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, câncer renal, cânceres do pulmão como, por exemplo, câncer do pulmão de pequenas células e câncer do pulmão de células não pequenas, neuroblastoma/glioblastoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer da próstata, câncer da pele, câncer hepático, melanoma, carcinomas de células escamosas da boca, garganta, laringe e pulmão, câncer do cólon, câncer cervical, carcinoma cervical, câncer de mama e câncer epitelial, câncer renal, câncer geniturinário, câncer pulmonar, carcinoma esofágico, carcinoma da cabeça e pescoço, câncer do intestino grosso, cânceres hematopoiéticos; câncer testicular; cânceres do cólon e do reto, câncer prostático ou câncer pancreático. Os compostos aqui revelados também podem ser usados para o tratamento de condições pré-câncer como, por exemplo, displasias cervicais e anais, outras displasias, displasias severas, hiperplasias, hiperplasias atípicas e neoplasias. Além disso, diversas doenças resultantes de inflamação crônica, por exemplo, prostatite e hipertrofia prostática benigna (BPH), além de vários cânceres da próstata, podem ser influenciadas pelos presentes métodos e compostos.

O lócus do gene de DEFBl (8p23.3) é um ponto importante para eliminações, e foi ligado a pacientes com prognóstico ruim. Dessa forma, DEFBl (e talvez PAX2) pode ser usado como um biomarcador, por exemplo, em uma pesquisa para a detecção precoce de câncer da próstata. Além disso, os dados aqui apresentados indicam que sua perda pode ocorrer tão precocemente quanto na PIN (ou até mesmo antes), e pode ser um fator contribuinte importante para o surgimento de câncer da próstata.

B. Composições

1. Imunoensaios

Há vários métodos para a detecção de analitos, tais como proteínas, por exemplo, PAX2 e/ou DEFBl, conhecidos ou recém-descobertos na técnica, que podem ser usados nos métodos revelados. Por exemplo, PAX2 e/ou DEFBl pode ser detectada com o uso de métodos padronizados de imunodetecção. As etapas de vários métodos de imunodetecção úteis foram descritas na literatura cientifica como, por exemplo, Maggio e cols., "Enzyme-Immunoassay", (1987) e Nakamura, e cols., "Enzyme Immunoassays: Heterogeneous and Homogeneous Systems, Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1: Immunochemistry", 27.1-27.20 (1986), cada um deles aqui incorporado por referência em sua totalidade e especificamente quanto aos seus ensinamentos em relação aos métodos de imunodetecção. Imunoensaios, em seu sentido mais simples e direto, são ensaios de ligação que envolvem a ligação entre anticorpos e antígeno. São conhecidos muitos tipos e formatos de imunoensaios, e todos são adequados para a detecção dos biomarcadores revelados. Exemplos de imunoensaios são os ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs), radioimunoensaios (RIA), ensaios de precipitação radioimune (RIPA), ensaios de captura de immunobeads, Western blotting, do t blotting, ensaios de gel-shift, citometria de fluxo, arranjos de proteína, arranjos de glóbulos em multiplexos, captura magnética, exames de imagem in vivo, transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET), e recuperação/localização de fluorescência após fotodegradação (FRAP/ FLAP). Em geral, os imunoensaios envolvem o contato de uma amostra suspeita de conter uma molécula de interesse (por exemplo, os biomarcadores revelados) com um anticorpo para a molécula de interesse, ou o contato de um anticorpo para uma molécula de interesse (por exemplo, anticorpos para os biomarcadores revelados) com uma molécula que pode ser ligada pelo anticorpo, o que o caso exigir, sob condições eficazes para permitir a formação de imunocomplexos. O contato de uma amostra com o anticorpo para a molécula de interesse ou com a molécula que pode ser ligada por um anticorpo para a molécula de interesse sob condições eficazes e por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes (complexos imunes primários) é geralmente uma questão de simplesmente colocar em contato a molécula ou o anticorpo e a amostra, e incubação da mistura por um período de tempo suficientemente longo para que os anticorpos formem complexos imunes com, ou seja, se liguem a, quaisquer moléculas (por exemplo, antígenos) presentes às quais os anticorpos podem se ligar. Em muitas formas de imunoensaio, a composição amostra-anticorpo como, por exemplo, um corte de tecido, placa de ELISA, dot blot ou Western blot, pode então ser lavada para remover quaisquer espécies de anticorpo ligadas de forma inespecífica, permitindo que apenas aqueles anticorpos ligados especificamente dentro dos complexos imunes primários sejam detectados.

Imunoensaios podem incluir métodos para a detecção ou quantificação da quantidade de uma molécula de interesse (por exemplo, os biomarcadores revelados ou seus anticorpos) em uma amostra, cujos métodos geralmente envolvem a detecção ou quantificação de quaisquer complexos imunes formados durante o processo de ligação. Em geral, a detecção da formação de imunocomplexos é bem conhecida na técnica, e pode ser obtida por meio da aplicação de várias abordagens. Esses métodos são geralmente baseados na detecção de um rótulo ou marcador como, por exemplo, quaisquer t ags radioativos, fluorescentes, biológicos ou enzimáticos, ou qualquer outro rótulo conhecido. Veja, por exemplo, Patentes U.S. 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 e 4.366.241, cada uma delas aqui incorporada por referência em sua totalidade e especificamente quanto aos ensinamentos em relação aos métodos de imunodetecção e marcadores.

Como aqui usado, um marcador pode incluir um corante fluorescente, um membro de um par de ligação, por exemplo, biotina/estreptavidina, um metal (por exemplo, ouro), ou um tag de epitopo que pode interagir especificamente com uma molécula que pode ser detectada, por exemplo, por produção de um substrato colorido ou fluorescência. Substâncias adequadas para marcar de forma detectável proteínas incluem corantes fluorescentes (também aqui denominados fluorcromos e fluoróforos) e enzimas que reagem com substratos colorimétricos (por exemplo, peroxidase de raiz forte). O uso de corantes fluorescentes é geralmente preferido na prática da invenção, já que podem ser detectados em quantidades muito baixas. Além disso, quando múltiplos antígenos são reagidos com um único arranjo, cada antIgeno pode ser marcado com um composto fluorescente distinto para detecção simultânea. Os spots marcados no arranjo são detectados com o uso de um fluorímetro, com a presença de um sinal indicando um antígeno ligado a um anticorpo específico.

Fluoróforos são compostos ou moléculas que apresentam luminescência. Tipicamente, fluoróforos absorvem energia eletromagnética em um comprimento de onda e emitem energia eletromagnética em um segundo comprimento de onda. Fluoróforos representativos incluem, sem limitação, 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-metilumbeliferona; 5-carbóxi-2,7- diclorofluoresceína; 5-carboxifluoresceína (5 -FAM); 5- carboxinaftof luoresceína; 5-carboxitetrametilrodamina (5- TAMRA); 5-hidróxi triptamina (5 -HAT) ; 5-ROX (carbóxi-X- rodamina); 6-carboxirodamina 6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-amino-4- metilcumarina; 7-aminoactinomicina D (7-AAD); 7-hidróxi-4-I metilcumarina; 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina (ACMA) ABQ; ácido fucsínico; Acridina Laranja; Acridina Vermelha Acridina Amarela; Acriflavina; Acriflavina Feulgen SITSA Aequorina (Fotoproteína); AFPs - Proteína AutoFluorescente - (Quantum Biotechnologies) veja sgGFP, sgBFP; Alexa Flúor

350™; Alexa Flúor; Alexa Flúor 430™ ; Alexa Flúor 488™; Alexa Flúor 532™; Alexa Flúor; Alexa Flúor 546™ ; Alexa Flúor 568™; Alexa Flúor 594™; Alexa Flúor; Alexa Flúor 633™ ; Alexa Flúor 647™; Alexa Flúor 660™; Alexa Flúor; Alexa Flúor 680™ ; Alizarina Complexon; Alizarina Vermelha; Aloficocianina (APC); AMC, AMCA-S; Aminometilcumarina (AMCA); AMCA-X; Aminoactinomicina D; Aminocumarina; Anilina Azul; estearato de antrocil; APC- Cy7; APTRA-BTC; APTS; Astrazon Brilhante Vermelho 4G; Astrazon Laranja R; Astrazon Vermelho 6B; Astrazon Amarelo 7 GLL; Atabrina; ATTO-TAG™ CBQCA; ATTO-TAG™ FQ; Auramina Aurofosfina G; Aurofosfina; BAO 9 (Bisaminofeniloxadiazol) BCECF (pH elevado); BCECF (pH baixo); Sulfato de Berberina Beta Lactamase; BFP blue shifted GFP (Y66H) ; Proteína Azul Fluorescente; BFP/GFP FRET; Bimane; Bisbenzemida; Bisbenzimida (Hoechst) ; bis-BTC; Blancofor FFG; Blaneofor SV; BOBOtm-I; BOBO™-3; Bodipy 4 92/515; Bodipy 4 93/5 03; Bodipy 500/510; Bodipy 505/515; Bodipy 530/550; Bodipy 542/563; Bodipy 558/568; Bodipy 564/570; Bodipy 576/589; Bodipy 581/591; Bodipy 630/650-X; Bodipy 650/665-X; Bodipy 665/676; Bodipy Fl; Bodipy FL ATP; Bodipy Fl-Ceramida; Bodipy R6G SE; Bodipy TMR; Bodipy TMR-X conjugado; Bodipy TMR-X, SE; Bodipy TR; Bodipy TR ATP; Bodipy TR-X SE; BO- PRO™ -1; BO-PRO™-3; Sulfoflavina Brilhante FF; BTC; BTC- 5N; Calceína; Calceína Azul; Cálcio Crimson -; Cálcio Verde; Cálcio-1 Verde Corante de Ca2+; Cálcio-2 Verde Ca2+; Cálcio-5N Verde Ca2+; Cálcio-C18 Verde Ca2+; Cálcio

Laranja; Calcoflúor Branco; Carbóxi-X-rodamina (5-ROX); Azul Cascata™; Amarelo Cascata; Catecolamina; CCF2 (GeneBlazer); CFDA; CFP (Proteína Ciano Fluorescente); CFP/YFP FRET; Clorofila; Cromomicina A; Cromomicina A; CL- NERF; CMFDA; Celenterazina; Celenterazina cp; Celenterazina f; Celenterazina fcp; Celenterazina h; Celenterazina hcp; Celenterazina ip; Celenterazina n; Celenterazina O; Cumarina Faloidina; C-ficocianinas; CPM I Metilcumarina; CTC; CTC Formazan; Cy2™; Cy3.1 8; Cy3.5™; Cy3™; Cy5.1 8; Cy5.5™; Cy5™; Cy7™; Ciano GFP; Fluorsensor de AMP cíclico (FiCRhR); Dabcil; Dansil; Dansil Amina; Dansil Cadaverina; Cloreto de Dansila; Dansil DHPE; fluoreto de Dansila; DAPI; Dapoxil; Dapoxil 2; Dapoxil 3'DCFDA; DCFH (Diacetato ed Diclorodiidrofluoresceína); DDAO; DHR (Diidro-rodamina 123); Di-4-ANEPPS; Di-8-ANEPPS (non-ratio); DiA (4-Di 16- ASP) ; Diacetato de Diclorodiidrofluoresceína (DCFH) ; DiD- Traçador Lipofílico; DiD (DilC18(5)); DIDS; Diidro-rodamina 123 (DHR); Dil (DilC18(3)); I Dinitrofenol; DiO (DiOC18(3)); DiR; DiR (DilC18(7)); DM-NERF (pH elevado); DNP; Dopamina; DsRed; DTAF; DY-63O-NHS; DY-635-NHS; EBFP; ECFP; EGFP; ELF 97; Eosina; Eritrosina; Eritrosina ITC; Brometo de Etidio; homodímero de Etidio-I (EthD-I); Euchrysin; EukoLight; cloreto de Európio (111); EYFP; Fast Blue; FDA; Feulgen (Pararosanilina); FIF (Fluorescência Induzida por Formaldeido); FITC; Flazo Laranja; Fluo-3; Fluo-4; Fluoresceina (FITC); Diacetato de Fluoresceina; Flúor-Esmeralda; Flúor-Ouro (Hidroxistilbamidina); Flúor- Rubi; FluorX; FM 1-43™; FM 4-46; Vermelho Fura™ (pH elevado); Vermelho Fura™/Fluo-3; Fura-2; Fura-2/BCECF; Genaeril Brilhante Vermelho B; Genaeril Brilhante Amarelo 10GF; Rosa Genaeril 3G; Genacril Amarelo 5GF; GeneBlazer; (CCF2); GFP (S65T); GFP red shifted (rsGFP); exeitação não UV de GFP do tipo selvagem (wtGFP) ; GFP do tipo selvagem, exeitação UV (wtGFP); GFPuv; Ácido Gloxálico; azul Granular; Hematoporfirina; Hoechst 33258; Hoeehst 33342; Hoeehst 34580; HPTS; Hidroxieumarina; Hidroxistilbamidina (FluoroGold); Hidroxitriptamina; Indo-1, cálcio alto; Indo- 1 cálcio baixo; Indodicarbocianinas (DiD); Indotricarbocianinas (DiR); Intrawhite Cf; JC-1; JO JO-1; JO-PRO-I; LaserPro; Laurodan; LDS 751 (DNA); LDS 751 (RNA); 25 Leucofor PAF; Leucofor SF; Leucofor WS; Lissamina Rodamina; Lissamina Rodamina B; Calceína/homodímero de Etidio; LOLO- 1; LO-PRO-1; Amarelo Lúcifer; Lyso Tracker Azuk; Lyso Tracker Azul-Branco; Lyso Tracker Verde; Lyso Tracker Vermelho; Lyso Tracker Amarelo; LysoSensor Azul; LysoSensor Verde; LysoSensor Amarelo/Azul; Mag Verde; Magdala Vermelho (Floxina Β) ; Mag-Fura Vermelho; Mag-Fura-2; Mag-Fura-5; Mag-Indo-1; Magnésio Verde; Magnésio Laranja; Malaquita Verde; Azul Marina; Flavina Brilhante Maxilon I 10 GFF; Flavina Brilhante Maxilon 8 GFF; Merocianina; Metoxicumarina; Mitotracker Verde FM; Mitotraeker Laranja; Mitotraeker Vermelho; Mitramicina; Monobromobimano; Monobromobimano (mBBr-GSH); Monoelorobimano; MPS (Metil Verde Pironina Estilbeno); NBD; NBD Amina; Vermelho Nilo; Nitrobenzoxedidol; Noradrenalina; Vermelho Nuclear Rápido; Amarelo i Nuclear; lavina Nylosan Brilhante E8G; Verde Oregon™; Verde Oregon™ 4 88; Verde Oregon™ 500; Verde Oregon™ 514; Azul Pacifico; Pararosanilina (Feulgen); PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-Vermelho Texas (Vermelho 613); Floxina B (Vermelho Magdala); Phorwite AR; Phorwite BKL; Phorwite Rev; Phorwite RPA; Fosfina 3R; PhotoResist; Ficoeritrina B [PE] ; Ficoeritrina R [PE] ; PKH26 (Sigma); PKH67; PMIA; Pontocrome Azul Preto; POPO-1; POPO-3; PO-PRO-I; PO-I PRO-3; Primulina; Amarelo Procion; Propídio lodid (Pl) ; PyMPO; Pireno; Pironina; Pironina B; Flavina Pirozal Brilhante 7GF; QSY 7; Mostarda Quinacrina; Resorufina; RH 414; Rhod-2; Rodamina; Rodamina 110; Rodamina 123; Rodamina 5 GLD; Rodamina 6G; Rodamina B; Rodamina B 200; Rodamina B extra; Rodamina BB; Rodamina BG; Verde Rodamina; Rodamina Faloidina; Rodamina: Faloidina; Vermelho Rodamina; Rodamina WT; Rose Bengala; R- ficocianinas; R-ficoeritrina (PE); rsGFP; S65A; S65C; S65L; S65T; Sapphire GFP; SBFI; Serotonina; Vermelho Brilhante Sevron 2B; Vermelho Brilhante Sevron 4G; Vermelho Brilhante Sevron I B; Laranja Sevron; Amarelo Sevron L; sgBFP™ (BFP super glow) ; sgGFP™ (GFP super glow) ; SITS (Primulina; Ácido Estilbeno Isotiossulfônico); calceína SNAFL; SNAFL-1; SNAFL-2; SNARF calceína; SNARFl; Sódio Verde; Spectrum Aqua; Spectrum Verde; Spectrum Laranja; Spectrum Vermelho; SPQ (6-metóxi- N- (3 sulfopropil) quinolínio) ; Estilbeno; Sulfo-rodamina B e C; Sulfo-rodamina Extra; SYTO 11; SYTO 12; SYTO 13; SYTO 14; SYTO 15; SYTO 16; SYTO 17; SYTO 18; SYTO 20; SYTO 21; SYTO 22; SYTO 23; SYTO 24; SYTO 25; SYTO 40; SYTO 41; SYTO 42; SYTO 43; SYTO 44; SYTO 45; SYTO 59; SYTO 60; SYTO 61; SYTO 62; SYTO 63; SYTO 64; SYTO 80; SYTO 81; SYTO 82; SYTO 83; SYTO 84; SYTO 85; SYTOX Azul; SYTOX Verde; SYTOX Laranja; Tetraciclina; Tetrametil-rodamina (TRITC); Vermelho Texas™; conjugado de Vermelho Texas-X™; Tiadicarbocianinaa (DÍSC3); Vermelho Tiazina R; Laranja Tiazol; Tioflavina 5; Tioflavina S; Tioflavina TON; Thiolyte; Laranja Tiozol; Tinopol CBS (Calcoflúor Branco) ; TIER; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; TriColor (PE-Cy5); TRITC Tetrametil Rodamina Isso Tio Cianato; Azul True; Vermelho Tru; Ultralite; Uranina B; Uvitex S FC; Wt GFP; WW 781; X-Rodamina; XRITC; Laranja Xileno; Y66F; Y66H; Y66W; Amarelo GFP; YFP; Y0-PR0-1; YO- PRO 3; YOYO-1;YOYO-3; Sybr Verde; Tiazol laranja (corantes interquelantes); nanopartícuias semicondutoras como, por exemplo, dots quantum; ou fluoróforo caged (que pode ser ativado com luz ou outra fonte de energia eletromagnética), ou uma combinação destes.

A marcação pode ser direta ou indireta. Na marcação direta, o anticorpo de detecção (o anticorpo para a molécula de interesse) ou a molécula de detecção (a molécula que pode ser ligada por um anticorpo para a molécula de interesse) inclui um marcador. A detecção do marcador indica a presença do anticorpo de detecção ou da molécula de detecção, o que, por sua vez, indica a presença da molécula de interesse ou de um anticorpo para a molécula de interesse, respectivamente. Na marcação indireta, uma molécula ou porção adicional é colocada em contato com, ou gerada no local do, imunocomplexo. Por exemplo, uma molécula ou porção geradora de sinal como, por exemplo, uma enzima, pode ser anexada ou associada ao anticorpo de detecção ou à molécula de detecção. A molécula geradora de sinal pode então gerar um sinal detectável no local do imunocomplexo. Por exemplo, uma enzima, quando fornecida com um substrato adequado, pode produzir um produto visível ou detectável no local do imunocomplexo. ELISAs utilizam esse tipo de marcação indireta.

Como outro exemplo de marcação indireta, uma molécula adicional (que pode ser chamada de agente de ligação) que pode se ligar à molécula de interesse ou ao anticorpo (anticorpo primário) para a molécula de interesse como, por exemplo, um segundo anticorpo para o anticorpo primário, pode ser colocada em contato com o imunocomplexo. A molécula adicional pode ter um marcador ou uma molécula ou porção geradora de sinal. A molécula adicional pode ser um anticorpo, que pode, dessa forma, ser denominado um anticorpo secundário. A ligação de um anticorpo secundário ao anticorpo primário pode formar um chamado sanduíche com o primeiro anticorpo (ou primário) e a molécula de interesse. Os complexos imunes podem ser colocados em contato com o anticorpo secundário marcado sob condições eficazes e por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes secundários. Os complexos imunes secundários podem então ser geralmente lavados para remover quaisquer anticorpos secundários marcados ligados de forma inespecífica, e o marcador restante nos complexos imunes secundários pode então ser detectado. A molécula adicional também pode ser ou incluir um de um par de moléculas ou porções que podem se ligar entre elas como, por exemplo, o par de biotina/avidina. Dessa forma, o anticorpo de detecção ou a molécula de detecção deve incluir o outro membro do par.

Outros modos de marcação indireta incluem a detecção de complexos imunes primários por uma abordagem em duas etapas. Por exemplo, uma molécula (que pode ser denominada um primeiro agente de ligação) como, por exemplo, um anticorpo, que possui afinidade de ligação pela molécula de interesse, ou anticorpo correspondente, pode ser usada para formar complexos imunes secundários, como descrito acima. Após lavagem, os complexos imunes secundários podem ser colocados em contato com outra molécula (que pode ser denominada um segundo agente de ligação) que possui afinidade de ligação pelo primeiro agente de ligação, novamente sob condições eficazes e por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes (formando, dessa forma, complexos imunes terciários). O segundo agente de ligação pode ser ligado a um marcador detectável ou a uma molécula ou porção geradora de sinal, permitindo a detecção dos complexos imunes terciários assim formados. Esse sistema pode permitir a amplificação do sinal.

Imunoensaios que envolvem a detecção de substâncias como, por exemplo, uma proteína ou um anticorpo para uma proteína específica, incluem ensaios sem marcador, métodos de separação de proteína (ou seja, eletroforese), ensaios de captura em suporte sólido, ou detecção in vivo. Ensaios sem marcador são geralmente meios diagnósticos de determinação da presença ou ausência de uma proteína específica, ou de um anticorpo para uma proteína específica, em uma amostra. Métodos de separação de proteína são adicionalmente úteis para avaliar as propriedades físicas da proteína como, por exemplo, o tamanho ou carga líquida. Os ensaios de captura são geralmente mais úteis para avaliar quantitativamente a concentração de uma proteína específica, ou de um anticorpo para uma proteína específica, em uma amostra. Finalmente, a detecção in vivo é útil para avaliar os padrões de expressão espacial da substância, ou seja, onde a substância pode ser encontrada em um indivíduo, tecido ou célula.

Desde que as concentrações sejam suficientes, os complexos moleculares ([Ab-Ag]n) gerados pela interação anticorpo-antígeno serão visíveis a olho nu, mas quantidades menores também podem ser detectadas e medidas em função de sua habilidade para dispersar um feixe de luz. A formação de complexos indica que ambos os reagentes estão presentes e, em ensaios de imunoprecipitação, uma concentração constante de um anticorpo reagente é usada para medir ( [Ab-Ag]n) antígeno-específico, e antígenos reagentes são usados para detectar ([Ab-Ag]n) anticorpo- específico. Caso as espécies reagentes sejam previamente revestidas sobre células (como em um ensaio de hemaglutinação) ou em partículas muito pequenas (como em um ensaio de aglutinação de látex), a "aglutinação" das partículas revestidas será visível em concentrações bem menores. Diversos ensaios baseados nesses princípios elementares são usados comumente, incluindo o ensaio de imunodifusão Ouchterlony, imunoeletroforese rocket e ensaios imunoturbidimétricos e nefelométricos. As principais limitações desses ensaios são a sensibilidade restrita (limites de detecção menores) em comparação com ensaios que empregam marcadores e, em alguns casos, o fato de que concentrações muito elevadas de analito podem, na verdade, exibir a formação do complexo, necessitando salvaguardas que tornam o procedimentos mais complexo. Alguns desses ensaios do Grupo 1 remontam à descoberta de anticorpos, e nenhum deles possui um "marcador" verdadeiro (por exemplo, Ag-enz). Outros tipos de imunoensaios que não utilizam marcador dependem de imunossensores, e diversos instrumentos que podem detectar diretamente interações anticorpo-antígeno são agora disponíveis comercialmente. A maioria deles depende da geração de uma onda fugaz na superfície de um sensor com ligante imobilizado, o que permite o monitoramento contínuo da ligação ao ligante. Imunossensores permitem uma investigação fácil de interações cinéticas e, com o advento de instrumentos especializados de baixo custo, podem, no futuro, encontrar uma ampla aplicação em imunoanálise.

O uso de imunoensaios para detectar uma proteína específica pode envolver a separação das proteínas por eletroforese. A eletroforese é a migração de moléculas carregadas em solução em resposta a um campo elétrico. Sua taxa de migração depende da potência do campo; da carga líquida, do tamanho e do formato das moléculas, e também da força iônica, da viscosidade e da temperatura do meio no qual as moléculas se movem. Como ferramenta analítica, a eletroforese é simples, rápida e altamente sensível. Ela é usada analiticamente para estudar as propriedades de uma espécie carregada única, e como uma técnica de separação.

Geralmente, a amostra é processada em uma matriz de suporte como, por exemplo, papel, acetato de celulose, gel de amido, agarose ou gel de poliacrilamida. A matriz inibe a mistura convectiva causada por aquecimento e fornece um registro do processamento eletroforético: ao final do processamento, a matriz pode ser corada e usada para varredura, auto-radiografia ou armazenamento. Além disso, as matrizes de suporte mais comumente usadas - agarose e poliacrilamida - fornecem um meio de separação de moléculas por tamanho, na medida em que são géis porosos. Um gel poroso pode atuar como uma peneira por retardar ou, em alguns casos, obstruir completamente o movimento de grandes macromoléculas, ao mesmo tempo em que permite que moléculas menores migrem livremente. Como géis de agarose diluídos são geralmente mais rígidos e fáceis de se manipular do que poliacrilamida da mesma concentração, a agarose é usada para separar macromoléculas maiores como, por exemplo, ácidos nucléicos, proteínas grandes e complexos de proteínas. A poliacrilamida, que é de fácil manipulação e de produção em concentrações mais elevadas, é usada para separar a maioria das proteínas e oligonucleotídeos pequenos que necessitam de um tamanho de poro do gel pequeno para retardo.

As proteínas são compostos anfotéricos; sua carga líquida, portanto, é determinada pelo pH do meio no qual estão suspensas. Em uma solução com um pH acima de seu ponto isoelétrico, uma proteína tem uma carga líquida negativa e migra em direção ao anodo em um campo elétrico.

Abaixo de seu ponto isoelétrico, a proteína é carregada positivamente e migra em direção ao catodo. A carga líquida carregada por uma proteína é, além disso, independente de seu tamanho - ou seja, a carga carregada por massa unitária (ou comprimento, considerando que proteínas e ácidos nucléicos são macromoléculas lineares) de molécula difere de proteína para proteína. Portanto, em certo pH e sob condições não desnaturantes, a separação eletroforética de proteínas é determinada tanto pelo tamanho quanto pela carga das moléculas.

O dodecil sulfato de sódio (SDS) é um detergente aniônico que desnatura proteínas por "envolvimento" da estrutura central do polipeptídeo - e SDS se liga às proteínas especificamente em uma proporção de massa de 1.4:1. Ao fazê-lo, SDS confere uma carga negativa ao polipeptídeo em proporção ao seu comprimento. Além disso, normalmente é necessário reduzir pontes dissulfeto nas proteínas (desnaturar) antes que elas adotem a configuração helicoidal aleatória (random-coil) necessária para a separação por tamanho; isso é feito com 2-mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT). Portanto, na desnaturação de separações de SDS-PAGE, a migração é determinada não pela carga elétrica intrínseca do polipeptídeo, mas por peso molecular.

A determinação do peso molecular é feita por SDS-PAGE de proteínas de peso molecular conhecido juntamente com a proteína a ser caracterizada. Existe um relacionamento linear entre o logaritmo do peso molecular de um polipeptídeo desnaturado por SDS, ou ácido nucléico nativo, e seu Rf. O Rf é calculado como a proporção da distância migrada pela molécula em relação àquela migrada pela frente de corante marcador. Uma forma simples de determinar o peso molecular relativo por eletroforese (Mr) é tabular uma curva-padrão de distância migrada vs. IoglOMW para amostras conhecidas, e ler o IogMr da amostra após medir a distância migrada no mesmo gel.

Na eletroforese bidimensional, as proteínas são fracionadas inicialmente com base em uma propriedade física e, em uma segunda etapa, com base em outra. Por exemplo, a concentração isoelétrica pode ser usada para a primeira dimensão, convenientemente efetuada em um gel em tubo, e a eletroforese de SDS em um gel em fatia pode ser usada para a segunda dimensão. Um exemplo de um procedimento é aquele de 0'Farrell, P.H., "High Resolution Two-dimensional Electrophoresis of Proteins", J. Biol. Chem. 250: 4.007- 4.021 (1975), aqui incorporado por referência em sua totalidade quanto aos seus ensinamentos em relação aos métodos de eletroforese bidimensional. Outros exemplos incluem, sem limitação, aqueles encontrados em Anderson, L e Anderson, NG, "High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins", Proc. Natl. Acad. Sei. 74: 5.421-5.425 (1977), Ornstein, L., "Disc electrophoresis", L. Ann. N.Y. Acad. Sei. 121: 321-349 (1964), cada um deles aqui incorporado por referência em sua totalidade quanto aos ensinamentos em relação aos métodos de eletroforese. Laemmli, U.K., "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature 227: 680 (1970), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade quanto aos seus ensinamentos em relação aos métodos de eletroforese, revela um sistema descontínuo para a resolução de proteínas desnaturadas com SDS. O íon principal no sistema tampão de Laemmli é cloreto, e o íon de rastro é glicina. Conseqüentemente, o gel de resolução e o gel de empilhamento são constituídos em tampões de Tris- HCl (de concentração e pH diferentes), enquanto o tampão do tanque é Tris-glicina. Todos os tampões contêm SDS 0,1%.

Um exemplo de um imunoensaio que utiliza eletroforese que é contemplado nos presentes métodos é análise Western blot. Western blotting ou imunoblotting permite a determinação da massa molecular de uma proteína e a medida de quantidades relativas da proteína presentes em diferentes amostras. Os métodos de detecção incluem detecção de quimioluminescência e cromatogênica. Métodos padronizados para análise Western blot podem ser encontrados, por exemplo, em D.M. Bollag e cols., "Proten Methods" (2 a edição 1996) e E. Harlow e D. Lane, "Antibodies, a Laboratory Manual" (1988), Patente U.S. 4.4 52.901, cada um deles aqui incorporado por referência em sua totalidade quanto aos seus ensinamentos em relação aos métodos de Western blot. Geralmente, as proteínas são separadas por eletroforese em gel, normalmente SDS-PAGE. As proteínas são transferidas para uma lâmina de papel de blotting especial, por exemplo, nitrocelulose, embora outros tipos de papel, ou membranas, possam ser usados. As proteínas retêm o mesmo padrão de separação que tinham no gel. O blot é incubado com uma proteína genérica (por exemplo, proteínas do leite) para se ligar em qualquer lugar pegajoso restante na nitrocelulose. Um anticorpo é então adicionado à solução que é capaz de se ligar â sua proteína específica.

A adesão de anticorpos específicos para antígenos imobilizados específicos pode ser facilmente visualizada por técnicas indiretas de imunoensaio enzimático, normalmente com o uso de um substrato cromogênico (por exemplo, fosfatase alcalina ou peroxidase de raiz forte) ou substratos quimioluminescentes. Outras possibilidades para a sondagem incluem o uso de marcadores fluorescentes ou de radioisótopo (por exemplo, fluoresceína, 125I) . As sondas para a detecção de ligação de anticorpo podem ser conjugadas a anti-imunoglobulinas, Proteína A estafilocócica conjugada (liga-se à IgG), ou sondas para anticorpos primários biotinilados (por exemplo, conjugados à avidina/estreptavidina).

O poder da técnica baseia-se na detecção simultânea de uma proteína específica por meio de sua antigenicidade e sua massa molecular. As proteínas são inicialmente separadas por massa na SDS-PAGE, e então especificamente detectadas na etapa de imunoensaio. Dessa forma, padrões de proteína (Iadders) podem ser processados simultaneamente a fim de aproximar a massa molecular da proteína de interesse em uma amostra heterogênea.

O ensaio de gel-shift ou o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) pode ser usado para detectar as interações entre proteínas de ligação de DNA e suas seqüências de reconhecimento de DNA cognatas, de uma forma tanto qualitativa quanto quantitativa. Técnicas exemplares são descritas em Ornstein L., "Disc electrophoresis - I: Background and theory", Ann. NY Acad. Sei. 121: 321-349 (1964), e Matsudiara, P.T. e D. R. Burgess, "SDS microslab linear gradient polyacrylamide gel electrophoresis", Anal. Biochem. 87: 386-396 (1987), cada um deles aqui incorporado por referência em sua totalidade quanto aos seus ensinamentos em relação aos ensaios de gel- shift.

Em um ensaio de gel-shift geral, proteínas purificadas ou extratos celulares brutos podem ser incubados com uma sonda de DNA ou RNA marcada (por exemplo, marcada radioativãmente com 32P), seguido por separação dos complexos da sonda livre por meio de um gel de poliacrilamida não desnaturante. Os complexos migram mais lentamente através do gel do que a sonda não ligada. Dependendo da atividade da proteína de ligação, uma sonda marcada pode ser de fita dupla ou de fita simples. Para a detecção de proteínas de ligação de DNA como, por exemplo, fatores de transcrição, podem ser usadas proteínas purificadas ou parcialmente purificadas ou extratos celulares nucleares. Para detecção de proteínas de ligação de RNA, podem ser usadas proteínas purificadas ou parcialmente purificadas ou extratos celulares nucleares ou citoplasmáticos. A especificidade da proteína de ligação de DNA ou RNA para o suposto sítio de ligação é estabelecida por experimentos de competição com o uso de fragmentos de DNA ou RNA ou oligonucleotídeos que contêm um sítio de ligação para a proteína de interesse, ou outra seqüência não relacionada. As diferenças na natureza e intensidade do complexo formado na presença de um competidor específico e inespecífico permitem a identificação de interações específicas. Veja "Promega, Gel Shift Assay FAQ", disponível em <http://www.promega.com/faq/géishfaq.html> (visitado pela última vez em 25 de março de 2005), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade quanto aos seus ensinamentos em relação aos métodos de gel-shift.

Os métodos de gel-shift podem incluir o uso, por exemplo, de formas coloidais de coloração azul COOMASSIE (Imperial Chemicals Industries, Ltd) para detectar proteínas em géis como, por exemplo, géis de eletroforese de poliacrilamida. Esses métodos são descritos, por exemplo, em Neuhoff e cols., Electrophoresis 6: 427-448 (1985), e Neuhoff e cols., Electrophòresis 9: 255-262 (1988), cada um deles aqui incorporado por referência em sua totalidade quanto aos seus ensinamentos em relação aos métodos de gel-shift. Além dos métodos convencionais de ensaio de proteína citados acima, uma composição combinada de limpeza e coloração de proteína é descrita na Patente U.S. 5.424.000, aqui incorporada por referência em sua totalidade quanto aos seus ensinamentos em relação aos métodos de gel-shift. As soluções podem incluir ácidos fosfórico, sulfúrico e nítrico e corante de Violeta ácida.

O Ensaio de Precipitação Radioimune (RIPA) é um ensaio sensível que utiliza antígenos marcados radioativamente para detectar anticorpos específicos no soro. Permite-se que os antígenos reajam com o soro, e então são precipitados com o uso de um reagente especial como, por exemplo, glóbulos de proteína A sefarose. O imunoprecipitado radiomarcado ligado é então comumente analisado por eletroforese em gel. 0 ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) é freqüentemente usado como um teste confirmatório para diagnosticar a presença de anticorpos para HIV. RIPA é também é denominado na técnica ensaio de Farr, ensaio de precipitina, ensaio radioimune de precipitina; análise por radioimunoprecipitação; análise por radioimunoprecipitação, e análise por radioimunoprecipitação.

Embora os imunoensaios acima que utilizam eletroforese para separar e detectar as proteínas de interesse específicas permitam a avaliação do tamanho da proteína, eles não são muito sensíveis para avaliar a concentração da proteína. No entanto, também são contemplados imunoensaios nos quais a proteína ou o anticorpo específico para a proteína é ligado a um suporte sólido (por exemplo, um tubo, um poço, um glóbulo ou uma célula) para capturar o anticorpo ou a proteína de interesse, respectivamente, de uma amostra, combinado com um método de detecção da proteína ou do anticorpo específico para a proteína no suporte. Exemplos desses imunoensaios incluem radioimunoensaio (RIA), ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), citometria de fluxo, arranjo de proteína, ensaio de glóbulos em multiplexos, e captura magnética.

0 radioimunoensaio (RIA) é um ensaio quantitativo clássico para a detecção de reações antígeno-anticorpo com o uso de uma substância marcada radioativamente (radioligante), diretamente ou indiretamente, para medir a ligação da substância não marcada a um anticorpo específico ou a outro sistema receptor. 0 radioimunoensaio é usado, por exemplo, para testar níveis hormonais no sangue, sem a necessidade de usar um bioensaio. Substâncias não imunogênicas (por exemplo, haptenos) também podem ser medidas caso estejam acopladas a proteínas de transporte maiores (por exemplo, gamaglobulina bovina ou albumina sérica humana) capazes de induzir a formação de anticorpo. RIA envolve a mistura de um antígeno radioativo (em função da facilidade com a qual átomos de iodo podem ser introduzidos em resíduos de tirosina em uma proteína, os isótopos radioativos 125I ou 131I são freqüentemente usados) com um anticorpo para aquele antígeno. O anticorpo é geralmente ligado a um suporte sólido, por exemplo, um tubo ou glóbulos. Um antígeno não marcado ou "frio" é então adicionado em quantidades conhecidas, e é medida a quantidade de antígeno marcado deslocado. Inicialmente, o antígeno radioativo está ligado aos anticorpos. Quando é adicionado o antígeno frio, os dois competem pelos sítios de ligação de anticorpo - e, em concentrações maiores de antígeno frio, mais se liga ao anticorpo, deslocando a variante radioativa. Os antígenos ligados são separados daqueles não ligados em solução, e a radioatividade de cada um usada para tabular uma curva de ligação. A técnica é extremamente sensível e específica.

0 ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), ou mais genericamente denominado EIA (imunoensaio de enzima), é um imunoensaio que pode detectar um anticorpo específico para uma proteína. Em um ensaio desse tipo, um marcador detectável ligado a um reagente de ligação de anticorpo ou de ligação de antígeno é uma enzima. Quando exposta ao seu substrato, essa enzima reage de tal forma que produz uma porção química que pode ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou visuais. As enzimas que podem ser usadas para marcar de forma detectável reagentes úteis para detecção incluem, sem limitação, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, glicose oxidase, β-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, asparaginase, álcool desidrogenase de levedura, alfa- glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glicoamilase e acetilcolinesterase. Para descrições de procedimentos de ELISA, veja Voller, A. e cols., J. Clin. Pathol. 31: 507- 520 (1978); Butler, J.E., Meth. Enzymol. 73: 482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), "Enzyme Immunoassay", CRC Press, Boca Raton, 1980; Butler, J.E., Em: "Structure of Antigens", Vol. 1 (Van Regenmortel, M., CRC Press, Boca Raton, 1992, páginas 209-259; Butler, J.E., Em: van Oss, C.J. e cols., (eds), "Immunochemistry", Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1994, páginas 759-803; Butler, J.E. (ed.), "Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay", CRC Press, Boca Raton, 1991); Crowther, "ELISA: Theory and Practice", Em: "Methods in Molecule Biology", Vol. 42, Humana Press; Nova Jersey, 1995; Patente U.S. 4.376.110, cada um deles aqui incorporado por referência em sua totalidade e especificamente quanto aos seus ensinamentos em relação aos métodos de ELISA.

Variações das técnicas de ELISA são conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Em uma variação, anticorpos que podem se ligar às proteínas podem ser imobilizados sobre uma superfície selecionada que exibe afinidade de proteína, por exemplo, um poço em uma placa de microtitulação de poliestireno. A seguir, uma composição de teste suspeita de conter um antigeno marcador pode ser adicionada aos poços. Após ligação e lavagem para remover imunocomplexos ligados de forma inespecifica, o antigeno ligado pode ser detectado. A detecção pode ser obtida pela adição de um segundo anticorpo especifico para a proteína- alvo, que é ligada a um marcador detectável. Esse tipo de ELISA é um "ELISA em sanduíche" simples. A detecção também pode ser obtida pela adição de um segundo anticorpo, seguida pela adição de um terceiro anticorpo que possui afinidade de ligação para o segundo anticorpo, com o terceiro anticorpo estando ligado a um marcador detectável.

Outra variação é uma ELISA por competição. Em ELISAs por competição, amostras de teste competem pela ligação com quantidades conhecidas de antígenos ou anticorpos marcados. A quantidade de espécies reativas na amostra pode ser determinada por mistura da amostra com as espécies marcadas conhecidas, antes ou durante a incubação com poços revestidos. A presença de espécies reativas na amostra age para reduzir a quantidade de espécies marcadas disponíveis para ligação ao poço e, dessa forma, reduz o sinal final.

Independentemente do formato empregado, ELISAs possuem certas características em comum, por exemplo, revestimento, incubação ou ligação, lavagem para remover espécies ligadas de forma inespecífica e detecção dos complexos imunes ligados. Antígenos ou anticorpos podem estar ligados a um suporte sólido, por exemplo, na forma de placa, glóbulos, vareta, membrana ou matriz de coluna, e a amostra a ser analisada aplicada ao antigeno ou anticorpo imobilizado. No revestimento de uma placa com antigeno ou anticorpo, geralmente se incubam os poços da placa com uma solução do antígeno ou anticorpo, de um dia para o outro ou por um período de horas especificado. Os poços da placa podem então ser lavados para remover o material adsorvido incompletamente. Quaisquer superfícies disponíveis restantes dos poços podem então ser "revestidas" com uma proteína inespecífica que é antigenicamente neutra em relação aos anti-soros de teste. Esses incluem albumina sérica bovina (BSA), caseína e soluções de leite em pó. 0 revestimento permite o bloqueio de locais de adsorção inespecífica na superfície de imobilização e, dessa forma, reduz o nível de fundo causado por ligação inespecífica de anti-soros sobre a superfície.

Em ELISAs, também pode ser usado um meio de detecção secundário ou terciário, em vez de um procedimento direto. Dessa forma, após ligação de uma proteína ou anticorpo ao poço, revestimento com um material não reativo para reduzir o nível de fundo e lavagem para remover material não ligado, a superfície de imobilização é colocada em contato com a amostra clínica ou biológica de controle a ser testada sob condições eficazes para permitir a formação de complexo imune (antígeno/anticorpo). A detecção do complexo imune então necessita de um agente de ligação secundário marcado ou de um agente de ligação secundário em conjunto com um terceiro agente de ligação marcado.

O termo "sob condições eficazes para permitir a formação de complexo imune (antígeno/anticorpo)" significa que as condições incluem a diluição dos antígenos e anticorpos com soluções como, por exemplo, BSA, gamaglobulina bovina (BGG) e solução salina tamponada com fosfato (PBS)/Tween, de modo a reduzir a ligação inespecífica e promover uma proporção razoável de sinal em relação ao ruído.

Condições adequadas também significam que a incubação ocorre em uma temperatura e por um período de tempo suficientes para permitir a ligação efetiva. As etapas de incubação podem ser tipicamente de cerca de 1 minuto a doze horas, em temperaturas de cerca de 20°C a 30°C, ou podem ser incubadas de um dia para o outro a cerca de OcC a cerca de 10°C.

Após todas as etapas de incubação em um ELISA, a superfície contatada pode. ser lavada a fim de remover material não complexado. Um procedimento de lavagem pode incluir a lavagem com uma solução como, por exemplo, PBS/Tween ou tampão de borato. Após a formação de complexos imunes específicos entre a amostra de teste e o material originalmente ligado, e subseqüente lavagem, pode ser determinada a ocorrência de quantidades até mesmo diminutas de complexos imunes.

Para fornecer um meio de detecção, o segundo ou terceiro anticorpo pode ter um marcador associado para permitir a detecção, como descrito acima. Esse pode ser uma enzima que pode gerar desenvolvimento de cor mediante incubação com um substrato cromogênico adequado. Dessa forma, por exemplo, pode-se colocar em contato e incubar o primeiro ou segundo complexo imune com um anticorpo marcado por um período de tempo e sob condições que favoreçam o desenvolvimento da formação de mais complexos imunes (por exemplo, incubação por 2 horas em temperatura ambiente em uma solução que contém PBS, por exemplo, PBS-Tween). Após incubação com o anticorpo marcado, e subseqüentemente à lavagem para remover material não ligado, a quantidade de marcador pode ser quantificada, por exemplo, por incubação com um substrato cromogênico, como uréia e roxo bromocresol ou ácido 2,2'-azido-di-(3-etil- benzotiazolina-6-sulfônico [ABTS] e H2O2, no caso de peroxidase como marcador enzimático. A quantificação pode então ser obtida por medida do grau de geração de cor, por exemplo, com a utilização de um espectrofotômetro de espectros visíveis.

Arranjos de proteína são sistemas de ensaio de ligação de ligante de fase sólida que utilizam proteínas imobilizadas em superfícies que incluem vidro, membranas, poços de microtitulação, placas de espectrômetro de massa e glóbulos ou outras partículas. Os ensaios são altamente paralelos (multiplexados) e freqüentemente miniaturizados (microarranjos, chips de proteína). Suas vantagens incluem o fato de serem rápidos e automatizáveis, capazes de alta. sensibilidade, econômicos em reagentes, e geram uma abundância de dados para um único experimento. 0 apoio da bioinformática é importante; a manipulação dos dados demanda software sofisticado e análise de comparação de dados. No entanto, o software pode ser adaptado daquele usado para arranjos de DNA, bem como boa parte do hardware e dos sistemas de detecção.

Um dos formatos principais e o arranjo de captura, em que reagentes de ligação de ligante, que são normalmente anticorpos, mas também podem ser scaffolds de proteína alternativos, peptídeos ou aptâmeros de ácido nucléico, são usados para detectar moléculas-alvo em misturas como, por exemplo, plasma ou extratos de tecido. Em aplicações diagnosticas, os arranjos de captura podem ser usados para realizar múltiplos imunoensaios em paralelo, tanto para teste de vários analitos em soros individuais, por exemplo, quanto para teste de muitas amostras de soro simultaneamente. Em aplicações proteômicas, os arranjos de captura são usados para quantificar e comparar os níveis de proteínas em diferentes amostras na saúde e na doença, ou seja, para a criação de um perfil de expressão de proteína. Proteínas diferentes dos aglutinantes de ligantes específicos são usadas no formato de arranjo para pesquisa de interação funcional in vitro como, por exemplo, proteína-proteína, proteína-DNA, proteína-fármaco, receptor-ligante, enzima-substrato etc. Os próprios reagentes de captura são selecionados e avaliados contra muitas proteínas, o que também pode ser feito em um formato de arranjo multiplexo contra várias proteínas-alvo.

Para a construção de arranjos, fontes de proteínas incluem sistemas de expressão baseados em células para proteínas recombinantes, purificação de fontes naturais, produção in vitro por sistemas de tradução isento de células, e métodos sintéticos para peptídeos. Muitos desses métodos podem ser automatizados para uma produção com alto rendimento. Para arranjos de captura e análise de função de proteína, é importante que as proteínas devam ser dobradas corretamente e sejam funcionais; isso nem sempre é o caso, por exemplo, quando as proteínas recombinantes são extraídas de bactérias sob condições desnaturantes. No entanto, arranjos de proteínas desnaturadas são úteis na pesquisa de anticorpos quanto à reatividade cruzada, na identificação de autoanticorpos e na seleção de proteínas de ligação de ligante.

Arranjos de proteína foram projetados como uma miniaturização de métodos de imunoensaio familiares como, por exemplo, ELISA e do t blotting, utilizando freqüentemente leitura fluorescente, e facilitados por sistemas robóticos e de detecção de alto rendimento para permitir que sejam realizados vários ensaios em paralelo.

Os suportes físicos comumente usados incluem lâminas de vidro, silício, micropoços, membranas de nitrocelulose ou PVDF, e microglóbulos magnéticos e outros microglóbulos. Embora microgotas de proteína liberadas nas superfícies planas sejam o formato mais familiar, arquiteturas alternativas incluem dispositivos de centrifúgação CD baseados nos desenvolvimentos em microfluidos (Gyros, Monmouth Junction, NJ) e designs de chips especializados, por exemplo, microcanais projetados em uma placa (por exemplo, o Living Chip™, Biotrove, Woburn, MA) e minúsculas hastes 3D em uma superfície de silício (Zyomyx, Hayward CA). As partículas em suspensão também podem ser usadas como a base de arranjos, desde que sejam codificadas para identificação; sistemas incluem codificação de cores para microglóbulos (Luminex, Austin, TX; Bio-Rad Laboratories) e nanocristais semicondutores (por exemplo, QDots™, Quantum Dot, Hayward, CA) , e codificação de barras para glóbulos (UltraPlex™, SmartBead Technologies Ltd, Babraham, Cambridge, UK) e microbastões multimetálicos (por exemplo, partículas Nanobarcodes™, Nanoplex Technologies, Mountain View, CA). Glóbulos também podem ser montados em arranjos planos em chips semicondutores (LEAPS technology, BioArray Solutions, Warren, NJ).

A imobilização de proteínas envolve tanto o reagente de acoplamento quanto a natureza da superfície à qual está sendo acoplado. Uma boa superfície de suporte de arranjo de proteína é quimicamente estável antes e depois dos procedimentos de acoplamento, permite boa morfologia do spot, exibe ligação inespècífica mínima, não contribui para o nível de fundo em sistemas de detecção, e é compatível com diferentes sistemas de detecção. 0 método de imobilização usado é reprodutível, aplicável a proteínas de diferentes propriedades (tamanho, hidrofílicas, hidrofóbicas), passível de alto rendimento e automatização, e compatível com retenção de atividade de proteína totalmente funcional. A orientação da proteína ligada à superfície é reconhecida como um fator importante na sua apresentação ao ligante ou substrato em um estado ativo; para arranjos de captura, os resultados de ligação mais eficientes são obtidos com reagentes de captura orientados, que geralmente exigem a marcação sítio-específica da proteína.

Métodos de imobilização de proteína tanto covalentes quanto não covalentes são usados e possuem vários prós e contras. A adsorção passiva às superfícies é metodologicamente simples, mas permite pouco controle quantitativo ou orientacional; ela pode ou não alterar as propriedades funcionais da proteína, e a reprodutibilidade e a eficiência são variáveis. Métodos de acoplamento covalente fornecem uma ligação estável, podem ser aplicados a uma gama de proteínas, e possuem boa reprodutibilidade; no entanto, a orientação pode ser variável, a derivatização química pode alterar a função da proteína e exige uma superfície interativa estável. Métodos de captura biológica que utilizam um tag na proteína fornecem uma ligação estável e se ligam à proteína especificamente e em orientação reprodutível, mas o reagente biológico deve primeiro ser imobilizado adequadamente, e o arranjo pode exigir uma manipulação especial e ter uma estabilidade variável.

Várias químicas e tags de imobilização foram descritas para a fabricação de arranjos de proteína. Substratos para a adesão covalente incluem lâminas de vidro revestidas com reagentes de silano contendo amino ou aldeído. No sistema Versalinx™ (Prolinx, Bothell, WA) , o acoplamento covalente reversível é obtido por interação entre a proteína derivatizada com ácido fenildiborônico e ácido salicilhidroxâmico imobilizado na superfície do suporte. Ele também possui baixa ligação de fundo e baixa fluorescência intrínseca, e permite que as proteínas imobilizadas retenham a função. A ligação não covalente de proteína não modificada ocorre dentro de estruturas porosas como, por exemplo, HidroGel™ (PerkinElmer, Wellesley, MA) , com base em um gel de poliacrilamida tridimensional; esse substrato supostamente gera um nível de fundo particularmente baixo em microarranjos de vidro, com uma alta capacidade e retenção da função da proteína. Métodos amplamente usados de acoplamento biológico são por meio de interações biotina/estreptavidina ou hexahistidina/Ni, tendo a proteína sido modificada adequadamente. A biotina pode ser conjugada a uma estrutura central de polilisina imobilizada em uma superfície como, por exemplo, dióxido de titânio (Zyomyx) ou pentóxido de tântalo (Zeptosens, Witterswil, Suíça).

Métodos de fabricação de arranjos incluem impressão robótica por contato, jato de tinta, spotting piezelétrico e fotolitografia. Vários dispositivos comerciais de formação de arranjos são disponíveis [por exemplo, Packard Biosciences], bem como equipamento manual [V & P Scientific]. Colônias bacterianas podem ser entrelaçadas roboticamente sobre membranas de PVDF para indução da expressão de proteína in si tu.

No limite do tamanho e da densidade do spot estão os nanoarranjos, com spots na escala espacial do nanômetro, permitindo que sejam realizadas milhares de reações em um único chip com menos de 1 mm2. BioForce Laboratories desenvolveram nanoarranjos com 1.521 spots de proteína em 85 mícrons2, equivalentes a 25 milhões de spots por cm2, no limite da detecção óptica; seus métodos de leitura são fluorescência e microscopia de força atômica (AFM).

Métodos de marcação e detecção de fluorescência são amplamente usados. A mesma instrumentação usada para a leitura de microarranjos de DNA é aplicável aos arranjos de proteína. Para exibição diferencial, arranjos de captura (por exemplo, anticorpo) podem ser sondados com proteínas marcadas de forma fluorescente para dois estados celulares diferentes, em que os lisados celulares são conjugados diretamente com diferentes fluoróforos (por exemplo, Cy-3, Cy-5) e misturados, de tal forma que a cor atua como uma leitura das alterações na abundância de alvo. A sensibilidade da leitura fluorescente pode ser amplificada 10-100 vezes por amplificação do sinal de tiramida (TSA) (PerkinElmer Lifesciences). A tecnologia de guia de onda plano (Zeptosens) permite a detecção ultra-sensível da fluorescência, com a vantagem adicional de não haver procedimentos de lavagem intervenientes. A alta sensibilidade também pode ser obtida com glóbulos e partículas em suspensão, usando ficoeritrina como marcador (Luminex) ou as propriedades de nanocristais semicondutores (Quantum Dot). Foram desenvolvidas diversas leituras alternativas inéditas, especialmente na arena comercial da biotecnologia. Essas incluem adaptações de ressonância de plasmônio de superfície (HTS Biosystems, Intrinsic Bioprobes, Tempe, AZ), amplificação de DNA por círculo rolante (rolling circle) (Molecular Staging, New Haven CT), espectrometria de massa (Intrinsic Bioprobes; Ciphergen, Fremont, CA), dispersão luminosa de ressonância (Genicon Sciences, San Diego, CA), e microscopia de força atômica [BioForce Laboratories].

Os arranjos de captura formam a base de chips e arranjos diagnósticos para criação de perfil de expressão. Eles empregam reagentes de captura de alta afinidade, por exemplo, anticorpos convencionais, domínios únicos, sccafolds projetados, peptídeos ou aptâmeros de ácido nucléico, que se ligam e detectam ligantes-alvo específicos de uma forma com alto rendimento.

Arranjos de anticorpo possuem as propriedades necessárias de especificidade e nível de fundo aceitável, e alguns são disponíveis comercialmente (BD Biosciences, San Jose, CA; Clontech, Mountain View, CA; BioRad; Sigma, St. Louis, MO). Anticorpos para arranjos de captura são feitos por imunização convencional (soros policlonais e hibridomas) , ou como fragmentos recombinantes, normalmente expressos em E. coli, após seleção em bibliotecas de apresentação em fago ou ribossomo (Cambridge Antibody Technology, Cambridge, UK; BioInvent, Lund, Suécia; Affitech, Walnut Creek, CA; Biosite, San Diego, CA) . Além dos anticorpos convencionais, fragmentos Fab e scFv, domínios V únicos de camçlídeos ou equivalentes humanos criados geneticamente (Domantis, Waltham, MA) também podem ser úteis em arranjos.

O termo "scaffold" refere-se a domínios de ligação de ligante de proteínas, que são projetados em múltiplas variantes capazes de ligação a moléculas-alvo diversas com propriedades de especificidade e afinidade semelhantes a um anticorpo. As variantes podem ser produzidas em um formato de biblioteca genética e selecionadas contra alvos individuais por apresentação em fago, bacteriana ou em ribossomo. Esses scaffolds ou estruturas centrais de ligação de ligante incluem nAffibodies" baseados na proteína A de S. aureus (Affibody, Bromma, Suécia), nTrinectins" baseados em fibronectinas (Phylos, Lexington, MA) , e nAnticalins" baseados na estrutura de lipocalina (Pieris Proteolab, Freising-Weihenstephan, Alemanha). Esses podem ser usados em arranjos de captura de uma forma similar aos anticorpos, e podem ter vantagens de robustez e facilidade de produção.

Moléculas de captura não proteínas, notavelmente os aptâmeros de ácido nucléico de fita simples que se ligam aos ligantes de proteína com alta especificidade e afinidade, também são usadas em arranjos (SomaLogic, Boulder, CO). Aptâmeros são selecionados de bibliotecas de oligonucleotldeos pelo procedimento Selex™, e sua interação com proteína pode ser aumentada por adesão covalente, por meio da incorporação de desoxiuridina bromada e entrecruzamento ativado por UV (fotoaptâmeros). 0 foto- entrecruzamento ao ligante reduz a reatividade cruzada de aptâmeros causada por necessidades estéricas específicas. Aptâmeros possuem as vantagens de facilidade de produção por síntese automatizada de oligonucleotldeos e a estabilidade e robustez de DNA; em arranjos de fotoaptâmero, a proteína fluorescente universal cora e pode ser usada para detectar ligação.

A ligação de analitos de proteína aos arranjos de anticorpo pode ser detectada diretamente ou por meio de um anticorpo secundário em um ensaio em sanduíche. A marcação direta é usada para comparação de diferentes amostras com diferentes cores. Embora estejam disponíveis pares de anticorpos dirigidos ao mesmo ligante de proteína, imunoensaios em sanduíche fornecem alta especificidade e sensibilidade e são, portanto, o método de escolha para proteínas com baixa abundância como, por exemplo, citocinas; eles também geram a possibilidade de detecção de modificações da proteína. Métodos de detecção sem marcador, incluindo espectrometria de massa, ressonância de plasmônio de superfície e microscopia de força atômica, evitam a alteração de ligante. O que é necessário para qualquer método é sensibilidade e especificidade ótimas, com baixo nível de fundo para gerar um sinal alto em relação ao ruído. Como as concentrações de analito cobrem uma gama ampla, a sensibilidade deve ser ajustada adequadamente; a diluição serial da amostra ou o uso de anticorpos de diferentes afinidades são soluções para esse problema. As proteínas de interesse são freqüentemente aquelas em baixa concentração nos líquidos e extratos corporais, exigindo detecção na faixa de picogramas ou menos como, por exemplo, citocinas, ou os produtos de baixa expressão em células.

Uma alternativa a um arranjo de moléculas de captura é a utilização da tecnologia de "impressão molecular", na qual peptídeos (por exemplo, das regiões do terminal C de proteínas) são usados como modelos para gerar cavidades estruturalmente complementares, seqüência-específicas, em uma matriz polimerizável; as cavidades podem então especificamente capturar proteínas (desnaturadas) que possuem a seqüência de aminoácidos primária apropriada (ProteinPrint™, Aspira Biosystems, Burlingame, CA).

Outra metodologia que pode ser usada de forma diagnostica e na criação de um perfil de expressão é o arranjo ProteinChip® (Ciphergen, Fremont, CA), no qual superfícies cromatográficas de fase sólida se ligam às proteínas com características similares de carga ou hidrofobicidade a partir de misturas como, por exemplo, plasma ou extratos tumorais, e espectrometria de massa SELDI-TOF é usada para detectar as proteínas retidas.

Foram construídos em larga escala chips funcionais por imobilização de grandes números de proteínas purificadas, e usados para avaliar uma ampla gama de funções bioquímicas, por exemplo, interações de proteínas com outras proteínas, interações com o fármaco-alvo, enzima-substratos etc. Geralmente, eles necessitam de uma biblioteca de expressão, clonada em E. coli, levedura ou similar, da qual as proteínas expressas são então purificadas, por exemplo, por meio de um tag His, e imobilizadas. A transcrição/tradução da proteína sem células é uma alternativa viável para a síntese de proteínas que não são bem expressas em sistemas bacterianos ou em outros sistemas in vivo.

Para a detecção de interações proteína-proteína, arranjos de proteína podem ser alternativas in vitro para o sistema de levedura de dois híbridos baseado em células, e podem ser úteis quando o último for deficiente, por exemplo, interações que envolvem proteínas secretadas ou proteínas com pontes dissulfeto. A análise de alto rendimento de atividades bioquímicas em arranjos foi descrita para proteína quinases de levedura e para várias funções (interações proteína-proteína e proteína-lipídeo) do proteoma de levedura, em que uma grande proporção de todos os quadros de leitura aberta de levedura foi expressa e imobilizada em um microarranjo. "Chips de proteoma" em grande escala prometem ser muito úteis na identificação de interações funcionais, avaliação de fármacos etc. (Proteometrix, Branford, CT).

Como uma exibição bidimensional de elementos individuais, um arranjo de proteína pode ser usado para pesquisar bibliotecas de apresentação em fago ou ribossomo, a fim de selecionar parceiros de ligação específicos, incluindo anticorpos, scaffolds sintéticos, peptídeos e aptâmeros. Dessa forma, pode ser realizada a pesquisa de "biblioteca contra biblioteca". A pesquisa de candidatos a fármaco em bibliotecas químicas combinatórias contra alvos de um arranjo de proteína identificados por projetos de genoma é outra aplicação da abordagem.

Um ensaio de glóbulos multiplexados como, por exemplo, o "BD™ Cytometric Bead Array", é uma série de partículas espectralmente distintas que pode ser usada para capturar e quantificar analitos solúveis. O analito é então medido por detecção de uma emissão baseada na fluorescência e análise citométrica de fluxo. O ensaio de glóbulos em multiplexo gera dados que são comparáveis aos ensaios baseados em ELISA, mas de uma forma "multiplexada" ou simultânea. A concentração de desconhecidos é calculada para o arranjo de glóbulos citométrico como com qualquer ensaio em formato sanduíche, ou seja, por meio do uso de padrões conhecidos e por tabulação dos desconhecidos contra uma curva-padrão. Além disso, o ensaio de glóbulos multiplexados permite a quantificação de analitos solúveis em amostras nunca considerados previamente em função de limitações do volume da amostra. Além dos dados quantitativos, podem ser geradas imagens visuais poderosas que revelam perfis ou assinaturas únicas que fornecem ao usuário informações adicionais rapidamente.

2. Anticorpos

São aqui revelados anticorpos que se ligam especificamente a PAX2 ou DEFBl que podem ser usados para detectar PAX 2 ou DEFBl em uma amostra nos métodos diagnósticos aqui revelados, ou que podem ser usados para inibir a interação entre PAX2 e DEFBl nos métodos aqui revelados de tratamento ou prevenção de câncer da próstata ou PIN.

O termo "anticorpos" é aqui usado em um sentido amplo, e inclui tanto anticorpos policlonais quanto anticorpos monoclonais. Além de moléculas de imunoglobulina intactas, também estão incluídos no termo "anticorpos" fragmentos ou polímeros daquelas moléculas de imunoglobulina, e versões humanas ou humanizadas de moléculas de imunoglobulina ou fragmentos destas, desde que sejam escolhidas por sua habilidade para interagir, por exemplo, com PAX2 ou DEFB1, de tal forma que PAX2 tenha sua interação com DEFB1 inibida. Também são revelados anticorpos que se ligam às regiões reveladas de PAX2 ou DEFB1 envolvidas na interação entre PAX2 e DEFB1. Os anticorpos podem ser testados quanto à sua atividade desejada com o uso dos ensaios in vitro aqui descritos, ou por métodos análogos, após os quais suas atividades terapêuticas e/ou profiláticas in vivo são testadas de acordo com métodos conhecidos de testes clínicos.

O termo "anticorpo monoclonal", como aqui usado, refere-se a um anticorpo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, ou seja, os anticorpos individuais dentro da população são idênticos, exceto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em um pequeno subconjunto das moléculas do anticorpo. Os anticorpos monoclonais aqui apresentados incluem especificamente anticorpos "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade antagonista desejada (veja, Patente U.S. N0 4.816.567 e Morrison e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.Ά., 81: 6.851-6.855 (1984)) .

Os anticorpos monoclonais revelados podem ser feitos com a utilização de qualquer procedimento que produza anticorpos monoclonais. Por exemplo, os anticorpos monoclonais revelados podem ser preparados com a utilização de métodos de hibridoma, tais como aqueles descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256: 495 (1975) . Em um método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado é tipicamente imunizado com um agente imunizante para despertar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao agente imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro, por exemplo, com o uso dos complexos de Env de HIV-CD4-co-receptor aqui descritos.

Os anticorpos monoclonais também podem ser feitos por métodos de DNA recombinante, tais como aqueles descritos na Patente U.S. N0 4.816.567 (Cabilly e cols.). 0 DNA que codifica os anticorpos monoclonais revelados pode ser facilmente isolado e seqüenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, pela utilização de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos murídeos) . Bibliotecas de anticorpos ou fragmentos ativos de anticorpo também podem ser geradas e pesquisadas com o uso de técnicas de apresentação em fago, por exemplo, como descrito na Patente U.S. N0 5.804.440 para Burton e cols. e na Patente U.S. N0 6.096.441 para Barbas e cols. Métodos in vitro também são adequados ã preparação de anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir fragmentos destes, particularmente, fragmentos Fab, pode ser obtida com o uso de metodologias rotineiras conhecidas na técnica. Por exemplo, a digestão pode ser realizada com a utilização de papaína. Exemplos de digestão com papaína são descritos em WO 94/29348, publicada em 22 de dezembro de 1994, e na Patente U.S. N0 4.342.566. A digestão de papaína de anticorpos tipicamente produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, denominados fragmentos Fab, cada um com um único sítio de ligação de antígeno, e um fragmento Fc residual. 0 tratamento com pepsina gera um fragmento que possui dois sítios de combinação de antígeno, e ainda é capaz de entrecruzamento de antígeno.

Os fragmentos, se anexados a outras seqüências ou não, também podem incluir inserções, eliminações, substituições, ou outras modificações selecionadas de regiões particulares ou resíduos de aminoãcidos específicos, desde que a atividade do anticorpo ou fragmento de anticorpo não seja significativamente alterada ou prejudicada, comparada com a do anticorpo ou fragmento de anticorpo não modificado. Essas modificações podem fornecer alguma propriedade adicional como, por exemplo, para remover/adicionar aminoácidos capazes de ligação dissulfeto, para aumentar sua bio-longevidade, para alterar suas características secretoras etc. Em qualquer caso, o anticorpo ou fragmento de anticorpo deve possuir uma propriedade bioativa, por exemplo, ligação específica ao seu antígeno cognato. Regiões funcionais ou ativas do anticorpo ou fragmento de anticorpo podem ser identificadas por mutagênese de uma região específica da proteína, seguida por expressão e testes do polipeptídeo expresso. Esses métodos são facilmente evidentes para aqueles habilitados na técnica, e podem incluir mutagênese sítio-específica do ácido nucléico que codifica o anticorpo ou fragmento de anticorpo. (Zoller, M.J. Curr. Opin. Biotechnol. 3: 348-354, 1992).

Como aqui usado, o termo "anticorpo" ou "anticorpos" também pode se referir a um anticorpo humano e/ou a um anticorpo humanizado. Muitos anticorpos não humanos (por exemplo, aqueles derivados de camundongos, ratos ou coelhos) são naturalmente antigênicos em seres humanos e, dessa forma, podem dar origem a respostas imunológicas indesejáveis quando administrados a seres humanos. Portanto, o uso de anticorpos humanos ou humanizados nos métodos serve para reduzir a chance de que um anticorpo administrado a um ser humano provoque uma resposta imunológica indesejável.

Os anticorpos humanos revelados podem ser preparados com a utilização de qualquer técnica. Exemplos de técnicas para a produção de anticorpo humano monoclonal incluem aquelas descritas por Cole e cols. ("Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, página 77, 1985) e por Boerner e cols. (J. Immunol., 147(1): 86 95, 1991). Anticorpos humanos (e fragmentos destes) também podem ser produzidos com o uso de bibliotecas de apresentação em fago (Hoogenboom e cols., J. Mol. Biol., 227: 381, 1991; Marks e cols., J. Mol. Biol., 222: 581, 1991).

Os anticorpos humanos revelados também podem ser obtidos de animais transgênicos. Por exemplo, camundongos mutantes, transgênicos, que são capazes de produzir um repertório inteiro de anticorpos humanos em resposta à imunização, foram descritos (veja, por exemplo, Jakobovits e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 90: 2.551-255 (1993); Jakobovits e cols., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann e cols., Year in Immunol., 7: 33 (1993)). Especificamente, a eliminação homozigota do gene da região de junção da cadeia pesada de anticorpo (J(H)) nesses camundongos mutantes quiméricos e de linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção endógena de anticorpo, e a transferência bem sucedida do arranjo de gene do anticorpo da linhagem germinativa humana nesses camundongos mutantes de linhagem germinativa resulta na produção de anticorpos humanos mediante ataque de antígeno.

Anticorpos que possuem a atividade desejada são selecionados com o uso de complexos Env-CD4-co-receptor, como aqui descrito.

Técnicas de humanização de anticorpo geralmente envolvem o uso de tecnologia de DNA recombinante para manipular a seqüência de DNA que codifica uma ou mais cadeias polipeptídicas de uma molécula de anticorpo. Conseqüentemente, uma forma humanizada de um anticorpo não humano (ou um fragmento deste) é um anticorpo ou uma cadeia de anticorpo quimérica (ou um fragmento deste, por exemplo, um Fv, Fab, Fab', ou outra porção de ligação de antígeno de um anticorpo) que contém uma porção de um sítio de ligação de antígeno de um anticorpo não humano (doador) integrada na estrutura central de um anticorpo humano (receptor).

Para gerar um anticorpo humanizado, resíduos de uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma molécula de anticorpo receptor (humano) são substituídos por resíduos de uma ou mais CDRs de uma molécula de anticorpo doador (não humano) que sabidamente possui características de ligação de antígeno desejadas (por exemplo, certo nível de especificidade e afinidade pelo antígeno-alvo). Em alguns casos, resíduos estruturais Fv (FR) do anticorpo humano são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Anticorpos humanizados também podem conter resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas seqüências de CDR ou estruturais importadas. Geralmente, um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos de uma fonte que é não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos da CDR e, possivelmente, alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. Anticorpos humanizados geralmente contêm pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo (Fc), tipicamente aquela de um anticorpo humano (Jones e cols., Nature, 321: 522 525 (1986), Reichmann e cols., Nature, 332: 323 327 (1988) e Presta, Curr. Opin. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)).

Métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos humanizados podem ser gerados de acordo com os métodos de Winter e colaboradores (Jones e cols., Nature, 321: 522-525 (1986), Riechmann e cols., Nature, 332: 323-327 (1988), Verhoeyen e cols., Science, 239: 1.534-1.536 (1988)), por substituição de CDRs ou seqüências de CDR de roedores para as seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Métodos que podem ser usados para produzir anticorpos humanizados também são descritos na Patente U.S. N0 4.816.567 (CabiIly e cols.), Patente U.S. N0 5.565.332 (Hoogenboom e cols.), Patente U.S. N0 5.721.367 (Kay e cols.), Patente U.S. N0 5.837.243 (Deo e cols.), Patente U.S. N0 5.939.598 (Kucherlapati e cols.), Patente U.S. N0 6.130.364 (Jakobovits e cols.), e Patente U.S. N0 6.180.377 (Morgan e cols.).

A administração dos anticorpos pode ser feita como aqui revelado. Também existem abordagens de ácido nucléico para a liberação de anticorpos. Os anticorpos e fragmentos de anticorpo anti-PAX2 ou anti-DEFBl amplamente neutralizantes também podem ser administrados aos pacientes ou indivíduos como uma preparação de ácido nucléico (por exemplo, DNA ou RNA) que codifica o anticorpo ou fragmento de anticorpo, de forma que as próprias células do paciente ou do indivíduo captam o ácido nucléico e produzem e secretam o anticorpo ou fragmento de anticorpo codificado. A liberação do ácido nucléico pode ser feita por qualquer meio, como aqui revelado, por exemplo.

3. Similaridades de seqüências

Entende-se que, como aqui discutido, os termos "homologia" e "identidade" significam a mesma coisa que similaridade. Dessa forma, por exemplo, se o uso da palavra "homologia" é feito entre duas seqüências não naturais, entende-se que isso não indica necessariamente um relacionamento evolucionário entre essas duas seqüências, mas sim uma busca pela similaridade ou relação entre suas seqüências de ácidos nucléicos. Muitos dos métodos para determinação da homologia entre duas moléculas evolucionariamente relacionadas são rotineiramente aplicados a quaisquer dois ou mais ácidos nucléicos ou proteínas com a finalidade de medir a similaridade de seqüências, independentemente de se estão elas evolucionariamente relacionadas ou não.

Em geral, entende-se que uma forma de definir quaisquer variantes e derivados conhecidos ou aqueles que possam surgir dos genes e proteínas aqui revelados é por meio da definição das variantes e dos derivados em termos de homologia para seqüências conhecidas específicas. Essa identidade de seqüências específicas aqui reveladas é também discutida nesta especificação em outra seção. Em geral, variantes de genes e proteínas aqui revelados tipicamente possuem pelo menos cerca de 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de homologia para a seqüência estabelecida ou para a seqüência nativa. Aqueles habilitados na técnica saberão facilmente como determinar a homologia de duas proteínas ou ácidos nucléicos como, por exemplo, genes. Por exemplo, a homologia pode ser calculada após alinhamento das duas seqüências de tal forma que a homologia esteja em seu nível mais elevado.

Outra forma de calcular a homologia pode ser realizada por algoritmos publicados. O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser efetuado pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento para homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela pesquisa pelo método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.Ά. 85: 2.444 (1988), por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA na Suíte de Programas Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção.

Os mesmos tipos de homologia podem ser obtidos para ácidos nucléicos, por exemplo, pelos algoritmos revelados em Zuker, M. Science 244: 48-52, 1989, Jaeger e cols. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86: 7.706-7.710, 1989, Jaeger e cols. Methods Enzymol. 183: 281-306, 1989, que são aqui incorporados por referência pelo menos para o material relacionado ao alinhamento de ácidos nucléicos. Entende-se que qualquer um dos métodos tipicamente pode ser usado e que, em certos casos, os resultados desses vários métodos podem diferir, mas aqueles habilitados na técnica sabem que, se a identidade é encontrada com pelo menos um desses métodos, as seqüências seriam consideradas como tendo a identidade estabelecida, e seriam aqui reveladas.

Por exemplo, como aqui usado, uma seqüência citada como tendo um percentual de homologia específico para outra seqüência refere-se às seqüências que possuem a homologia citada da forma calculada por qualquer um ou mais dos métodos de cálculo descritos acima. Por exemplo, uma primeira seqüência possui 80 por cento de homologia, como aqui definido, para uma segunda seqüência se a primeira seqüência é calculada como tendo 80 por cento de homologia para a segunda seqüência com o uso do método de cálculo de Zuker, mesmo se a primeira seqüência não possuir 80 por cento de homologia para a segunda seqüência, como calculado por qualquer um dos outros métodos de cálculo. Como outro exemplo, uma primeira seqüência possui 80 por cento de homologia, como aqui definido, para uma segunda seqüência se a primeira seqüência é calculada como tendo 80 por cento de homologia para a segunda seqüência usando tanto o método de cálculo de Zuker quanto o método de cálculo de Pearson e Lipman, mesmo se a primeira seqüência não possuir 80 por cento de homologia para a segunda seqüência, como calculado pelo método de cálculo de Smith e Waterman, pelo método de cálculo de Needleman e Wunsch, pelo método de cálculo de Jaeger, ou qualquer um dos outros métodos de cálculo. Ainda como outro exemplo, uma primeira seqüência possui 80 por cento de homologia, como aqui definido, para uma segunda seqüência se a primeira seqüência é calculada como tendo 80 por cento de homologia para a segunda seqüência usando cada um dos métodos de cálculo (embora, na prática, os diferentes métodos de cálculo freqüentemente resultarão em percentagens de homologia calculadas diferentes).

4. Hibridização/hibridização seletiva

O termo "hibridização" tipicamente significa uma interação dirigida por seqüência entre pelo menos duas moléculas de ácido nucléico, por exemplo, um iniciador ou uma sonda e um gene. Interação dirigida por seqüência significa uma interação que ocorre entre dois nucleotídeos ou análogos de nucleotideo ou derivados de nucleotídeo de uma forma nucleotídeo-especifica. Por exemplo, a interação de G com C ou a interação de A com T são interações dirigidas por seqüência. Tipicamente, interações dirigidas por seqüência ocorrem na face de Watson-Crick ou na face de Hoogsteen do nucleotídeo. A hibridização de dois ácidos nucléicos é afetada por diversas condições e parâmetros conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, as concentrações de sal, o pH e a temperatura da reação afetam se duas moléculas de ácido nucléico irão hibridizar.

Os parâmetros para a hibridização seletiva entre duas moléculas de ácido nucléico são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, em algumas modalidades, as condições de hibridização seletiva podem ser definidas como condições de hibridização estringentes. Por exemplo, a estringência da hibridização é controlada tanto pela temperatura quanto pela concentração de sal das etapas de hibridização e lavagem ou de uma delas. Por exemplo, as condições de hibridização para se obter hibridização seletiva podem envolver hibridização em solução com força iônica elevada (6X SSC ou 6X SSPE) em uma temperatura que é cerca de 12-25°C abaixo da Tm (a temperatura de fusão na qual metade das moléculas se dissocia de seus parceiros de hibridização), seguida por lavagem em uma combinação de temperatura e concentração de sal escolhida de tal forma que a temperatura de lavagem seja cerca de 5°C a 20°C abaixo da Tm. As condições de temperatura e sal são facilmente determinadas empiricamente em experimentos preliminares nos quais as amostras de DNA de referência imobilizado em filtros são hibridizadas para um ácido nucléico marcado de interesse, e então lavadas sob condições de diferentes estringências. As temperaturas de hibridização são tipicamente maiores para hibridizações DNA-RNA e RNA-RNA. As condições podem ser usadas como descrito acima para se obter estringência, ou como é conhecido na técnica (Sambrook e cols., "Molecular Cloning:

A Laboratory Manual", 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989; Kunkel e cols. Methods Enzymol. 1987: 154:367, 1987, que é aqui incorporado por referência pelo menos quanto ao material relacionado à hibridização de ácidos nucléicos). Uma condição de hibridização estringente preferível para uma hibridização DNA:DNA pode ser a cerca de 680C (em solução aquosa) em 6X SSC ou 6X SSPE, seguida por lavagem a 68°C. A estringência de hibridização e lavagem, se desejado, pode ser reduzida à medida que o grau de complementaridade desejado é diminuído e, além disso, dependendo da riqueza de G-C ou A-T de qualquer área em que a variabilidade é pesquisada. Do mesmo modo, a estringência da hibridização e lavagem, se desejado, pode ser aumentada à medida que a homologia desejada é aumentada e, além disso, dependendo da riqueza de G-C ou A-T de qualquer área em que se deseja homologia elevada, tudo como conhecido na técnica.

Outra forma de definir hibridização seletiva é olhando-se a quantidade (percentagem) de um dos ácidos nucléicos ligados ao outro ácido nucléico. Por exemplo, em algumas modalidades, condições de hibridização seletiva seriam quando pelo menos cerca de, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por cento do ácido nucléico limitante estão ligados ao ácido nucléico não limitante. Tipicamente, o iniciador não limitante está, por exemplo, 10 ou 100 ou 1.000 vezes em excesso. Esse tipo de ensaio pode ser realizado sob condições em que tanto o iniciador limitante quanto o iniciador não limitante estão, por exemplo, 10 vezes ou 100 vezes ou 1.000 vezes abaixo de seu kd, ou em que apenas uma das moléculas de ácido nucléico está 10 vezes ou 100 vezes ou 1.000 vezes ou em que uma ou ambas as moléculas de ácido nucléico estão acima de seu kd.

Outra forma de definir hibridização seletiva é buscando-se a percentagem de iniciador que é manipulada enzimaticamente sob condições em que hibridização é necessária para promover a manipulação enzimática desejada. Por exemplo, em algumas modalidades, condições de hibridização seletiva seriam quando pelo menos cerca de 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por cento do iniciador são enzimaticamente manipulados sob condições que promovem a manipulação enzimática, por exemplo, se a manipulação enzimática é extensão de DNA, então condições de hibridização seletiva seriam quando pelo menos cerca de 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por cento das moléculas de iniciador são estendidos. Condições preferidas também incluem aquelas sugeridas pelo fabricante ou indicadas na técnica como sendo adequadas para a enzima que efetua a manipulação.

Exatamente como com homologia, entende-se que há vários métodos aqui revelados para a determinação do nível de hibridização entre duas moléculas de ácido nucléico. Entende-se que esses métodos e condições possam fornecer percentagens diferentes de hibridização entre duas moléculas de ácido nucléico, mas, a menos que indicado de forma diferente, a obediência aos parâmetros de qualquer um dos métodos seria suficiente. Por exemplo, se 80% de hibridização fosse necessário, e desde que a hibridização ocorra dentro dos parâmetros necessários em qualquer um desses métodos, ela é considerada aqui revelada.

Entende-se que aqueles habilitados na técnica entendem que, se uma composição ou método obedece a qualquer um desses critérios para a determinação de hibridização, coletiva ou isoladamente, ela é uma composição ou um método que é aqui revelado.

5. Ácidos nucléicos

Há diversas moléculas aqui reveladas que se baseiam em ácido nucléico. Os ácidos nucléicos revelados são constituídos, por exemplo, por nucleotideos, análogos de nucleotldeo ou substitutos de nucleotídeo. Exemplos não limitantes dessas e de outras moléculas são aqui discutidos. Entende-se que, por exemplo, quando um vetor é expresso em uma célula, o mRNA expresso tipicamente será constituído por A, C, G e U. Do mesmo modo, entende-se que se, por exemplo, uma molécula anti-senso é introduzida em uma célula ou ambiente celular por meio, por exemplo, de liberação exógena, é vantajoso que a molécula anti-senso seja constituída por análogos de nucleotídeo que reduzem a degradação da molécula anti-senso no ambiente celular, i. Nucleotideos e moléculas relacionadas Um nucleotídeo é uma molécula que contém uma porção de base, uma porção de açúcar e uma porção de fosfato. Nucleotideos podem ser ligados em conjunto por meio de suas porções de fosfato e porções de açúcar, criando uma ligação internucleosídeos. A porção de base de um nucleotídeo pode ser adenina-9-il (A) , citosina-l-il (C) , guanina-9-il (G) , uracil-l-il (U) e timina-l-il (T). A porção de açúcar de um nucleotídeo é uma ribose ou uma desoxirribose. A porção de fosfato de um nucleotídeo é fosfato pentavalente. Um exemplo não limitante de um nucleotídeo seria 31-AMP (31- adenosina monofosfato) ou 51-GMP (51-guanosina monofosfato). Há muitas variedades desses tipos de moléculas disponíveis na técnica e aqui disponíveis.

Um análogo de nucleotídeo é um nucleotídeo que contém algum tipo de modificação nas porções de base, açúcar ou fosfato. As modificações aos nucleotídeos são bem conhecidas na técnica e incluiriam, por exemplo, 5- metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina e 2-aminoadenina, além de modificações nas porções de açúcar ou fosfato. Há muitas variedades desses tipos de moléculas disponíveis na técnica e aqui disponíveis.

Substitutos de nucleotídeo são moléculas que possuem propriedades funcionais similares aos nucleotídeos, mas que não contêm uma porção de fosfato, por exemplo, ácido nucléico-peptídeo (PNA). Substitutos de nucleotídeo são moléculas que reconhecerão ácidos nucléicos de uma forma tipo Watson-Crick ou Hoogsteen, mas que estão ligados em conjunto por meio de uma porção diferente de uma porção de fosfato. Substitutos de nucleotídeo são capazes de se ajustar a uma estrutura do tipo dupla hélice quando interagem com o ácido nucléico-alvo apropriado. Há muitas variedades desses tipos de moléculas disponíveis na técnica e aqui disponíveis.

Também é possível ligar outros tipos de moléculas (conjugados) aos nucleotídeos ou aos análogos de nucleotídeo para aumentar, por exemplo, a captação celular. Conjugados podem ser ligados quimicamente ao nucleotídeo ou aos análogos de nucleotídeo. Esses conjugados incluem, sem limitação, porções de lipídeo como, por exemplo, uma porção de colesterol (Letsinger e cols., Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A., 1989, 86, 6.553-6.556). Há muitas variedades desses tipos de moléculas disponíveis na técnica e aqui disponíveis.

Uma interação de Watson-Crick é pelo menos uma interação com a face de Watson-Crick de um nucleotídeo, análogo de nucleotídeo ou substituto de nucleotídeo. A face de Watson-Crick de um nucleotídeo, análogo de nucleotídeo, ou substituto de nucleotídeo inclui as posições C2, Nl e C6 de um nucleotídeo baseado em purina, análogo de nucleotídeo, ou substituto de nucleotídeo, e as posições C2, N3, C4 de um nucleotídeo baseado em pirimidina, análogo de nucleotídeo ou substituto de nucleotídeo.

Uma interação de Hoogsteen é a interação que ocorre na face de Hoogsteen de um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo, que é exposta no sulco principal do DNA dúplex. A face de Hoogsteen inclui a posição N7 e grupos reativos (NH2 ou O) na posição C6 de nucleotídeos de purina.

ii. Seqüências

Há diversas seqüências relacionadas às moléculas de proteína envolvidas nas vias de sinalização aqui reveladas, por exemplo, PAX2, ou qualquer um dos ácidos nucléicos aqui revelados para a produção de PAX2, todos esses codificados por ácidos nucléicos ou sendo ácidos nucléicos. As seqüências para os análogos humanos desses genes, bem como outros análogos, e alelos desses genes, e variantes splice e outros tipos de variantes, estão disponíveis em várias bases de dados de proteínas e genes, incluindo Genbank. Aquelas seqüências disponíveis no momento do depósito desse pedido no Genbank são aqui incorporadas por referência em sua totalidade, bem como as subseqüências individuais nele contidas. O Genbank pode ser acessado em http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi. Aqueles habilitados na técnica sabem como resolver discrepâncias e diferenças de seqüências e como ajustar as composições e os métodos relacionados a uma seqüência em particular a outras seqüências relacionadas. Iniciadores e/ou sondas podem ser projetados para qualquer seqüência definida, considerando as informações aqui reveladas e conhecidas na técnica.

iii. Ácidos nucléicos funcionais

O inibidor de PAX 2 do método fornecido pode ser um ácido nucléico funcional. Ácidos nucléicos funcionais são moléculas de ácido nucléico que possuem uma função específica, por exemplo, ligação a uma molécula-alvo ou catalisação de uma reação específica. As moléculas de ácido nucléico funcionais podem ser divididas nas seguintes categorias, que não têm a intenção de ser limitantes. Por exemplo, os ácidos nucléicos funcionais incluem moléculas anti-senso, aptâmeros, ribozimas, moléculas formadoras de tríplex, RNAi e seqüências-guia externas. As moléculas de ácido nucléico funcional podem atuar como efetores, inibidores, moduladores e estimuladores de uma atividade específica possuída por uma molécula-alvo, ou as moléculas de ácido nucléico funcional podem possuir uma atividade de novo independente de quaisquer outras moléculas.

As moléculas de ácido nucléico funcional podem interagir com qualquer macromolécula, por exemplo, DNA, RNA, polipeptídeos ou cadeias de carboidrato. Dessa forma, os ácidos nucléicos funcionais podem interagir com o mRNA de PAX2 ou com o DNA genômico de PAX2, ou elas podem interagir com o polipeptídeo PAX2. Freqüentemente, os ácidos nucléicos funcionais são projetados para interagir com outros ácidos nucléicos com base na homologia de seqüências entre a molécula-alvo e a molécula de ácido nucléico funcional. Em outras situações, o reconhecimento especifico entre a molécula de ácido nucléico funcional e a molécula-alvo não se baseia na homologia de seqüências entre a molécula de ácido nucléico funcional e a molécula- alvo, mas sim na formação de estrutura terciária que permite que ocorra o reconhecimento especifico.

Moléculas anti-senso são projetadas para interagir com uma molécula de ácido nucléico-alvo por meio de pareamento de bases canônico ou não canônico. A interação da molécula anti-senso e da molécula-alvo é projetada para promover a destruição da molécula-alvo, por exemplo, por meio da degradação mediada por RNAseH do híbrido de RNA-DNA. Alternativamente, a molécula anti-senso é projetada para interromper uma função de processamento que normalmente ocorreria na molécula-alvo, por exemplo, transcrição ou replicação. Moléculas anti-senso podem ser projetadas com base na seqüência da molécula-alvo. Existem vários métodos para otimização da eficiência anti-senso por busca das regiões mais acessíveis da molécula-alvo. Métodos exemplares seriam experimentos de seleção in vitro e estudos de modificação de DNA com o uso de DMS e DEPC. Prefere-se que as moléculas anti-senso se liguem à molécula-alvo com uma constante de dissociação (Kd) menor ou igual a 10-6, 10-8, 10-10 ou 10-12. Uma amostra representativa de métodos e técnicas que auxiliam no design e uso de moléculas anti-senso pode ser encontrada nas Patentes U.S. N°s 5.135.917, 5.294.533, 5.627.158, 5.641.754, 5.691.317, 5.780.607, 5.786.138, 5.849.903, 5.856.103, 5.919.772, 5.955.590, 5.990.088, 5.994.320, 5.998.602, 6.005.095, 6.007.995, 6.013.522, 6.017.898, 6.018.042, 6.025.198, 6.033.910, 6.040.296, 6.046.004, 6.046.319 e 6.057.437.

Aptâmeros são moléculas que interagem com uma molécula-alvo, preferivelmente de uma forma específica. Tipicamente, os aptâmeros são pequenos ácidos nucléicos que variam de 15-50 bases de comprimento que se dobram em estruturas secundárias e terciárias definidas, por exemplo, stem-loops ou quartetos G. Aptâmeros podem se ligar a pequenas moléculas, por exemplo, ATP (Patente U.S. N0 5.631.146) e teofilina (Patente U.S. N0 5.580.737), bem como a grandes moléculas, por exemplo, transcriptase reversa (Patente U.S. N0 5.786.4 62) e trombina (Patente U.S. N0 5.543.293). Os aptâmeros podem se ligar muito intimamente com Kds da molécula-alvo de menos que 10-12 M. Prefere-se que os aptâmeros se liguem à molécula-alvo com um Kd de menos do que 10-6, 10-8, 10-10 ou 10-12. Os aptâmeros podem se ligar à molécula-alvo com um grau de especificidade muito elevado. Por exemplo, foram isolados aptâmeros que possuem uma diferença maior do que 10.000 vezes em termos de afinidades de ligação entre a molécula- alvo e outra molécula que difere em apenas uma única posição na molécula (Patente U.S. N0 5.543.293). Prefere-se que o aptâmero tenha uma Kd com a molécula-alvo pelo menos 10, 100, 1.000, 10.000 ou 100.000 vezes menor do que a Kd com uma molécula de ligação de fundo. Prefere-se, quando se faz a comparação para um polipeptídeo, por exemplo, que a molécula de fundo seja um polipeptídeo diferente. Exemplos representativos de como se produzir e utilizar aptâmeros para se ligar a diversas moléculas-alvo diferentes podem ser encontrados nas Patentes U.S. Nos 5.476.766, 5.503.978, 5.631.146, 5.731.424, 5.780.228, 5.792.613, 5.795.721, 5.846.713, 5.858.660, 5.861.254, 5.864.026, 5.869.641, 5.958.691, 6.001.988, 6.011.020, 6.013.443, 6.020.130, 6.028.186, 6.030.776 e 6.051.698.

Ribozimas são moléculas de ácido nucléico que são capazes de catalisar uma reação química, de forma intramolecular ou intermolecular. Dessa forma, as ribozimas são ácidos nucléicos catalíticos. Prefere-se que as ribozimas catalisem reações intermoleculares. Há diversos tipos diferentes de ribozimas que catalisam reações do tipo nuclease ou ácido nucléico polimerase que são baseadas em ribozimas encontradas em sistemas naturais, tais como ribozimas hammerhead, (Patentes U.S. Nos 5.334.711, 5.436.330, 5.616.466, 5.633.133, 5.646.020, 5.652.094, 5.712.384, 5.770.715, 5.856.463, 5.861.288, 5.891.683, 5.891.684, 5.985.621, 5.989.908, 5.998.193, 5.998.203; Pedidos de Patente Internacional Nos WO 9858058 por Ludwig e Sproat, WO 9858057 por Ludwig e Sproat e WO 9718312 por Ludwig e Sproat), ribozimas hairpin (por exemplo, Patentes U.S. Nos 5.631.115, 5.646.031, 5.683.902, 5.712.384, 5.856.188, 5.866.701, 5.869.339 e 6.022.962) e ribozimas de Tetrahymena (por exemplo, Patentes U.S. Nos 5.595.873 e 5.652.107). Há também diversas ribozimas que não são encontradas em sistemas naturais, mas que foram criadas geneticamente para catalisar reações específicas de novo (por exemplo, Patentes U.S. N"os 5.580.967, 5.688.670, 5.807.718 e 5.910.408). Ribozimas preferidas clivam substratos de RNA ou DNA e, mais preferivelmente, clivam substratos de RNA. As ribozimas tipicamente clivam substratos de ácido nucléico por meio de reconhecimento e ligação do substrato-alvo com subseqüente clivagem. Esse reconhecimento é freqüentemente baseado principalmente em interações canônicas ou não canônicas de par de bases. Essa propriedade torna as ribozimas candidatos particularmente bons para a clivagem alvo-específica de ácidos nucléicos, pois o reconhecimento do substrato-alvo é baseado na seqüência dos substratos-alvo. Exemplos representativos de como se produzir e utilizar ribozimas para catalisar diversas reações diferentes podem ser encontrados nas Patentes U.S. Nos 5.646.042, 5.693.535, 5.731.295, 5.811.300, 5.837.855, 5.869.253, 5.877.021, 5.877.022, 5.972.699, 5.972.704, 5.989.906 e 6.017.756.

Moléculas de ácido nucléico funcional formadoras de tríplex são moléculas que podem interagir com ácido nucléico de fita dupla ou de fita simples. Quando as moléculas do tríplex interagem com uma região-alvo, é formada uma estrutura denominada tríplex, em que há três fitas de DNA que formam um complexo dependente do pareamento de bases de Watson-Crick e de Hoogsteen. As moléculas do tríplex são preferidas, pois podem se ligar a regiões-alvo com alta afinidade e especificidade. Prefere- se que as moléculas formadoras de tríplex se liguem à molécula-alvo com uma Kd de menos de 10-6, 10-8, 10-10 ou 10-12. Exemplos representativos de como se produzir e utilizar moléculas formadoras de tríplex para se ligar a diversas moléculas-alvo diferentes podem ser encontrados nas Patentes U.S. Nos 5.176.996, 5.645.985, 5.650.316, 5.683.874, 5.693.773, 5.834.185, 5.869.246, 5.874.566 e 5.962.426.

Seqüências-guia externas (EGSs) são moléculas que se ligam a uma molécula-alvo de ácido nucléico formando um complexo, e esse complexo é reconhecido por RNase P, que cliva a molécula-alvo. EGSs podem ser projetadas para visar especificamente uma molécula de RNA de escolha. RNAse P auxilia no processamento de RNA de transferência (tRNA) dentro de uma célula. RNAse P bacteriana pode ser recrutada para clivar praticamente qualquer seqüência de RNA pela utilização de uma EGS que faça com que o complexo RNA:EGS- alvo mimetize o substrato de tRNA natural (WO 92/03566 por Yale e Forster e Altman, Science 238: 407-409 (1990)).

Similarmente, clivagem de RNA dirigida por EGS eucariótica/RNAse P pode ser utilizada para clivar alvos desejados dentro de células eucarióticas (Yuan e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 8.006-8.010 (1992); WO 93/22434 por Yale; WO 95/24489 por Yale; Yuan e Altman, EMBO J. 14: 159-168 (1995) e Carrara e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92: 2.627-2.631 (1995)). Exemplos representativos de como se produzir e utilizar moléculas de EGS para facilitar a clivagem de várias moléculas-alvo diferentes podem ser encontrados nas Patentes U.S. Nos 5.168.053, 5.624.824, 5.683.873, 5.728.521, 5.869.248 e 5.877.162. A expressão gênica também pode ser silenciada eficazmente de uma forma altamente específica por meio de interferência de RNA (RNAi) . Esse silenciamento foi originalmente observado com a adição de RNA de fita dupla (dsRNA) (Fire, A., e cols. (1998) Naturel 391: 806-11; Napoli, C., e cols. (1990) Plant. Cell 2: 279-89; Hannon, G. J. (2002) Nature, 418: 244-51). Após o dsRNA penetrar em uma célula, ele é clivado por uma enzima RNase III-like, Dicer, em pequenos RNAs intervenientes de fita dupla (siRNA) com 21-23 nucleotídeos de comprimento que contêm 2 protuberâncias de nucleotídeo nas extremidades 3' (Elbashir, S.M., e cols. (2001) Genes Dev., 15: 188-200; Bernstein, E., e cols. (2001) Nature, 409: 363-6; Hammond, S.M., e cols. (2000) Nature, 404: 293-6). Em uma etapa dependente de ATP, os siRNAs se tornam integrados em um complexo de proteína multi-subunidades, comumente conhecido como complexo de silenciamento induzido por RNAi (RISC), que guia os siRNAs até a seqüência de RNA-alvo (Nykanen, A., e cols. (2001) Cell, 107: 309-21). Em algum ponto, o dúplex de siRNA é liberado, e parece que a fita anti-senso permanece ligada ao RISC e dirige a degradação da seqüência de mRNA complementar por uma combinação de endo e exonucleases (Martinez, J., e cols. (2002) Cell, 1.10: 563- 74). No entanto, o efeito de iRNA ou siRNA ou seu uso não é 25 limitado por qualquer tipo de mecanismo.

O RNA interveniente curto (siRNA) é um RNA de fita dupla que pode induzir silenciamento gênico pós-transcrição seqüência-específico, diminuindo ou até mesmo inibindo, dessa forma, a expressão gênica. Em um exemplo, um siRNA desencadeia a degradação específica de moléculas de RNA homólogas, por exemplo, mRNAs, dentro da região de identidade de seqüência entre o siRNA e o RNA-alvo. Por exemplo, WO 02/44321 revela siRNAs capazes de degradação seqüência-específica de mRNAs-alvo quando têm as bases pareadas com as extremidades 3' protrusas, aqui incorporado por referência quanto ao método de produção desses siRNAs. o silenciamento gênico seqüência-específico pode ser obtido em células de mamíferos usando RNAs de fita dupla curtos, sintéticos, que mimetizam os siRNAs produzidos pela enzima dicer (Elbashir, S.M., e cols. (2001) Nature, 411: 494 498) (Ui-Tei, K., e cols. (2000) FEBS Lett. 479: 79-82). O siRNA pode ser sintetizado quimicamente ou in vitro, ou pode ser o resultado de RNAs de fita dupla curtos hairpin-Iike (shRNAs) que são processados em siRNAs dentro da célula. siRNAs sintéticos são geralmente projetados com o uso de algoritmos e um sintetizador de DNA/RNA convencional. Os fornecedores incluem Ambion (Austin, Texas), ChemGenes (Ashland, Massachusetts) , Dharmacon (Lafayette, Colorado), Glen Research (Sterling, Virgínia), MWB Biotech (Esbersberg, Alemanha) , Proligo (Boulder, Colorado) e Qiagen (Vento, Holanda). 0 siRNA também pode ser sintetizado in vitro com a utilização de kits como, por exemplo, o Kit de Construção de siRNA SILENCER® da Ambion. São aqui revelados quaisquer siRNAs projetados como descrito acima com base nas seqüências para PAX2.

A produção de siRNA a partir de um vetor é mais comumente feita por meio da transcrição de um RNAs hairpin curto (shRNAs) . Estão disponíveis kits para a produção de vetores que compreendem shRNA como, por exemplo, Kits de Construção GENESUPPRESSOR™ da Imgenex e o plasmídeo de RNAi indutível BLOCK-IT™ de Invitrogen e vetores de lentivírus. São aqui revelados quaisquer shRNAs projetados como descrito acima com base nas seqüências para os mediadores inflamatórios aqui revelados.

6. Sistema de liberação celular

Há diversas composições e métodos que podem ser usados para liberar ácidos nucléicos às células, tanto in vitro quanto in vivo. Esses métodos e composições podem ser divididos de forma ampla em duas classes: sistemas de liberação com base viral, e sistemas de liberação com base não viral. Por exemplo, os ácidos nucléicos podem ser liberados por meio de diversos sistemas de liberação direta como, por exemplo, eletroporação, lipofecção, precipitação com fosfato de cálcio, plasmídeos, vetores virais, ácidos nucléicos virais, ácidos nucléicos de fago, fagos, cosmídeos, ou por meio de transferência de material genético em células ou veículos como, por exemplo, lipossomos catiônicos. Meios adequados para transfecção, incluindo vetores virais, transfectantes químicos ou métodos físico-mecânicos, tais como eletroporação e difusão direta de DNA, são descritos, por exemplo, por Wolff, J.A., e cols., Science, 247, 1.465-1.468, (1990); e Wolff, J.A. Nature, 352, 815-818, (1991). Esses métodos são bem conhecidos na técnica e facilmente adaptáveis para uso com as composições e métodos aqui descritos. Em certos casos, os métodos serão modificados para funcionar especificamente com grandes moléculas de DNA. Além disso, esses métodos podem ser usados para visar certas doenças e populações de células pela utilização das características de direcionamento do veículo. i. Sistemas de liberação baseados em ácido nucléico

Vetores de transferência podem ser qualquer construção de nucleotídeo usada para liberar genes em células (por exemplo, um plasmídeo), ou como parte de uma estratégia geral para liberar genes, por exemplo, como parte de retrovlrus ou adenovirus recombinante (Ram e cols. Câncer Res. 53: 83-88, (1993)).

Como aqui usado, plasmídeo ou vetores virais são agentes que transportam os ácidos nucléicos revelados, por exemplo, siRNA de PAX2, para dentro da célula, sem degradação, e incluem um promotor que gera a expressão do gene nas células nas quais é liberado. Em algumas modalidades, os vetores são derivados de um vírus ou um retrovírus. Vetores virais são, por exemplo, Adenovirus, vírus adeno-associado, Herpes vírus, vírus da vacínia, vírus da pólio, vírus da AIDS, vírus trófico neuronal, Sindbis e outros vírus de RNA, incluindo esses vírus com a estrutura central do HIV. Também são preferidas quaisquer famílias virais que compartilham as propriedades desses vírus que os tornam adequados para uso como vetores. Retrovírus incluem vírus da leucemia murídea de Maloney, MMLV e Retrovírus que expressam as propriedades desejáveis de MMLV como um vetor. Vetores retrovirais são capazes de carregar uma carga genética maior, ou seja, um transgene ou gene marcador, do que outros vetores virais e, por essa razão, são um vetor comumente usado. No entanto, eles não são úteis em células não proliferantes. Vetores adenovirais são relativamente estáveis e fáceis de se trabalhar, possuem titulações elevadas, e podem ser liberados em formulação em aerossol, e podem transfectar células que não estão em divisão. Vetores virais Pox são grandes e possuem vários sítios para a inserção de genes, são termoestáveis e podem ser armazenados em temperatura ambiente. Uma modalidade preferida é um vetor viral que foi criado geneticamente de modo a suprimir a resposta imunológica do organismo hospedeiro, despertada pelos antígenos virais. Vetores desse tipo preferidos carregarão regiões codificadoras para interleucina 8 ou 10.

Os vetores virais podem ter maiores habilidades de transação (habilidade para introduzir genes) do que métodos químicos ou físicos para introduzir genes em células. Tipicamente, os vetores virais contêm genes precoces não estruturais, genes tardios estruturais, um transcrito de RNA polimerase III, repetições terminais invertidas necessárias à replicação e encapsidação, e promotores para o controle da transcrição e replicação do genoma viral. Quando criados geneticamente como vetores, os vírus tipicamente possuem um ou mais dos genes precoces removidos, e um gene ou cassete de gene/promotor é inserido no genoma viral no lugar do DNA viral removido. As construções desse tipo podem carregar até cerca de 8 kb de material genético estranho. As funções necessárias dos genes precoces removidos são tipicamente fornecidas por linhagens de células que foram criadas geneticamente para expressar os produtos gênicos dos genes precoces em trans.

a. Vetores retrovirais

Um retrovírus é um vírus animal que pertence à família de vírus dos Retroviridae, incluindo quaisquer tipos, subfamílias, gênero ou tropismos. Vetores retrovirais, em geral, são descritos por Verma, I.M., "Retroviral vector for gene transfer". Em: "Microbiology - 1985", "American Society for Microbiology", páginas 229-232, Washington, (198 5), que é aqui incorporado por referência. Exemplos de métodos para a utilização de vetores retrovirais para terapia gênica são descritos nas Patentes U.S. Nos 4.868.116 e 4.980.286; Pedidos PCT WO 90/02806 e WO 89/07136; e Mulligan, (Science 260: 926-932 (1993)); cujos ensinamentos são aqui incorporados por referência.

Um retrovírus é basicamente um pacote que tem nele empacotado uma carga de ácido nucléico. A carga de ácido nucléico carrega com ela um sinal de empacotamento, que assegura que as moléculas-filha replicadas serão eficientemente empacotadas dentro do revestimento do pacote. Além do sinal de empacotamento, há diversas moléculas que são necessárias em eis, para a replicação, e empacotamento do vírus replicado. Tipicamente, um genoma retroviral contém os genes gag, pol e env que estão envolvidos na produção do revestimento de proteína. São os genes gag, pol e env que são tipicamente substituídos pelo DNA estranho que deve ser transferido para a célula-alvo. Vetores retrovirais tipicamente contêm um sinal de empacotamento para incorporação no revestimento do pacote, uma seqüência que sinaliza o início da unidade de transcrição de gag, elementos necessários para a transcrição reversa, incluindo um sítio de ligação de iniciador para ligar o iniciador de tRNA da transcrição reversa, seqüências de repetição terminal que guiam a troca das fitas de RNA durante a síntese de DNA, uma LTR 5' a 3' de seqüência rica em purina que serve como o sítio de iniciação para a síntese da segunda fita da síntese de DNA, e seqüências específicas próximas às extremidades das LTRs que permitem a inserção do estado de DNA do retrovírus para inserção no genoma do hospedeiro. A remoção dos genes gag, pol e env permite que sejam inseridos cerca de 8 kb de seqüência estranha no genoma viral, se tornem transcritos de forma reversa e, mediante replicação, sejam empacotados em uma nova partícula retroviral. Essa quantidade de ácido nucléico é suficiente para a liberação de um a muitos genes, dependendo do tamanho de cada transcrito. É preferível incluir marcadores selecionáveis positivos ou negativos juntamente com outros genes no inserto.

Como o maquinário de replicação e as proteínas de empacotamento na maioria dos vetores retrovirais foram removidos (gag, pol e env), os vetores são tipicamente gerados por sua colocação em uma linhagem de células de empacotamento. Uma linhagem de células de empacotamento é uma linhagem celular que foi transfectada ou transformada com um retrovírus que contém o maquinário de replicação e de empacotamento, mas não possui nenhum sinal de empacotamento. Quando o vetor que carrega o DNA de escolha é transfectada nessas linhagens de células, o vetor que contém o gene de interesse é replicado e empacotado em novas partículas retrovirais pelo maquinário fornecido em eis pela célula auxiliar. Os genomas para o maquinário não são empacotados, pois não possuem os sinais necessários.

b. Vetores adenovirais

A construção dos adenovírus com defeitos na replicação foi descrita (Berkner e cols., J. Virology 61: 1.213-1.220 (1987); Massie e cols., Mol. Cell. Biol. 6: 2.872-2.883 (1986); Haj-Ahmad e cols., J. Virology 57: 267-274 (1986); Davidson e cols., J. Virology 61: 1.226-1.239 (1987); Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15: 868-872 (1993)). O benefício da utilização desses vírus como vetores é que eles são limitados na extensão à qual eles podem se disseminar para outros tipos de células, na medida em que podem se replicar dentro de uma célula infectada inicial, mas são incapazes de formar novas partículas virais infecciosas. Foi demonstrado que adenovirus recombinantes obtêm transferência gênica com eficiência elevada após liberação direta, in vivo, ao epitélio das vias aéreas, hepatócitos, endotélio vascular, parênquima do SNC, e diversos outros locais de tecido (Morsy, J. Clin. Invest. 92: 1.580-1.586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92: 381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92: 1.085-1.092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4: 154-159 (1993); La Salle, Science 259: 988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267: 25.129-25.134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4: 461- 476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6: 75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73: 1.201-1.207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994); Zabner, Cell 75: 207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5: 1.287-1.291 (1993); e Ragot, J. Gen. Virology 74: 501-507 (1993)). Adenovirus recombinantes obtêm transdução gênica por ligação aos receptores da superfície celular específicos, quando então o vírus é internalizado por endocitose mediada por receptor, da mesma forma que adenovirus do tipo selvagem ou com defeito da replicação (Chardonnet e Dales, Virology 40: 462-477 (1970); Brown e Burlingham, J. Virology 12: 386-396 (1973); Svensson e Persson, J. Virology 55: 442-449 (1985); Seth, e cols., J. Virol. 51: 650-655 (1984); Seth, e cols., Mol. Cell. Biol. 4: 1.528- 1.533 (1984); Varga e cols., J. Virology 65: 6.061-6.070 (1991); Wickham e cols., Cell 73: 309-319 (1993)).

Um vetor viral pode ser aquele baseado em um adenovírus que teve o gene E1 removido, e esses vírions são gerados em uma linhagem celular como, por exemplo, a linhagem de células 293 humanas. Em outra modalidade preferida, tanto o gene E1 quanto o gene E3 são removidos do genoma do adenovírus.

c. Vetores virais adeno-associados

Outro tipo de vetor viral é baseado em um vírus adeno- associado (AAV). Esse parvovírus defeituoso é um vetor preferido, porque ele pode infectar muitos tipos de células, e é não patogênico para seres humanos. Os vetores do tipo AAV podem transportar cerca de 4 a 5 kb, e o AAV do tipo selvagem sabidamente se insere no cromossomo 19. Vetores que contêm essa propriedade de integração específica são preferidos. Uma modalidade especialmente preferida desse tipo de vetor é o vetor P4.1 C produzido por Avigen, San Francisco, CA, que pode conter o gene de timidina quinase do vírus do herpes simples, HSV-tk e/ou um gene marcador, por exemplo, o gene que codifica a proteína fluorescente verde, GFP.

Em outro tipo de vírus AAV, o AAV contém um par de repetições terminais invertidas (ITRs) que flanqueiam pelo menos um cassete que contém um promotor que dirige a expressão célula-específica ligado operacionalmente a um gene heterólogo. Heterólogo nesse contexto refere-se a qualquer seqüência de nucleotídeos ou gene que não seja nativo ao AAV ou parvovírus B19.

Tipicamente, as regiões codificadoras de AAV e B19 foram eliminadas, resultando em um vetor seguro, atóxico.

As ITRs de AAV, ou modificações destas, conferem infectividade e integração sítio-específica, mas não citotoxicidade, e o promotor dirige a expressão célula- específica. A Patente U.S. N0 6.261.834 é aqui incorporada por referência quanto ao material relacionado ao vetor de AAV.

Dessa forma, os vetores revelados fornecem moléculas de DNA que são capazes de integração em um cromossomo de mamífero, sem toxicidade substancial.

Os genes inseridos em vetores virais e retrovirais normalmente contêm promotores e/ou intensificadores para ajudar no controle da expressão do produto gênico desejado. Um promotor é geralmente uma seqüência ou seqüências de DNA que funciona quando em uma localização relativamente fixa: em relação ao sítio de iniciação da transcrição. Um promotor contém elementos centrais necessários para a interação básica de RNA polimerase e fatores de transcrição, e pode conter elementos upstream e elementos de resposta.

d. Vetores virais com grande carga

Experimentos de genética molecular com grandes herpesvírus humanos forneceram um meio pelo qual grandes fragmentos de DNA heterólogo podem ser clonados, propagados e estabelecidos em células que permitem a infecção com herpesvírus (Sun e cols., Nature genetics 8: 33-41, 1994; Cotter e Robertson, Curr. Opin. Mol. Ther. 5: 633-644, 1999). Esses grandes vírus de DNA (vírus herpes do simples (HSV) e vírus de Epstein-Barr (EBV) possuem o potencial para liberar fragmentos de DNA heterólogo humano > 150 kb para células específicas. EBV recombinante pode manter grandes pedaços de DNA nas células B infectadas como DNA epissômico. Clones individuais carregados por insertos genômicos humanos de até 33 0 kb parecem ser geneticamente estáveis. A manutenção desses epissomos exige uma proteína nuclear de EBV específica, EBNAl, expressa constitutivamente durante a infecção com EBV. Adicionalmente, esses vetores podem ser usados para transfecção, em que grandes quantidades de proteína podem ser geradas transitoriamente in vitro. Sistemas de amplicon de herpesvírus também estão sendo usados para empacotar pedaços de DNA > 220 kb e para infectar células que podem manter de forma estável DNA como epissomos.

Outros sistemas úteis incluem, por exemplo, vetores de vírus da vacínia replicantes e não replicantes com restrição de hospedeiro.

ii. Sistemas não baseados em ácido nucléico

As composições reveladas podem ser liberadas às células-alvo de diversas formas. Por exemplo, as composições podem ser liberadas por meio de eletroporação, ou por meio de lipofecção, ou por meio de precipitação com fosfato de cálcio. O mecanismo de liberação escolhido dependerá, em parte, do tipo de célula visada e de se a liberação está ocorrendo, por exemplo, in vivo ou in vitro.

Dessa forma, as composições podem compreender lipídeos, tais como lipossomos, por exemplo, lipossomos catiônicos (por exemplo, DOTMA, DOPE, DC colesterol) ou lipossomos aniônicos. Lipossomos podem ainda compreender proteínas para facilitar o direcionamento a uma célula em particular, se desejado. A administração de uma composição que compreende um composto e um lipossomo catiônico pode ser feita no sangue aferente a um órgão-alvo ou inalada no trato respiratório até as células-alvo do trato respiratório. Em relação aos lipossomos, veja, por exemplo, Brigham e cols. Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1: 95-100 (1989); Felgner e cols. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 7.413 7417 (1987); Patente U.S. N0 4.897.355. Além disso, o composto pode ser administrado como um componente de uma microcápsula que pode ser direcionada a tipos de células específicos, por exemplo, macrófagos, ou quando a difusão do composto ou a liberação do composto pela microcápsula for projetada para uma taxa ou dosagem específica.

Nos métodos descritos acima que incluem a administração e a captação de DNA exógeno nas células de um indivíduo (ou seja, transdução ou transfecção gênica), a liberação das composições às células pode ocorrer por meio de diversos mecanismos. Como um exemplo, a liberação por ser por meio de um lipossomo, usando preparações de lipossomos disponíveis comercialmente como, por exemplo, LIPOFECTINA, LIPOFECTAMINA (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemanha) e TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI), além de outros lipossomos desenvolvidos de acordo com procedimentos padronizados na técnica. Além disso, o ácido nucléico ou vetor revelado pode ser liberado in vivo por eletroporação, a tecnologia que é disponível por Genetronics, Inc. (San Diego, CA) , bem como por meio de uma máquina de S0N0P0RAÇÃ0 (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ).

Os materiais podem estar em solução, suspensão (por exemplo, incorporados em micropartícuias, lipossomos ou células) . Esses podem ser direcionados para um tipo de célula em particular por meio de anticorpos, receptores ou ligantes de receptor. As referências seguintes são exemplos do uso dessa tecnologia para direcionar proteínas-alvo específicas para tecido tumoral (Senter, e cols., Bioconjugate Chem., 2: 447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Câncer, 60: 275-281, (1989); Bagshawe, e cols., Br. J. Câncer, 58: 700-703, (1988); Senter, e cols., Bioconjugate Chem., 4: 3-9, (1993); Battelli, e cols., Câncer Immunol. Immunother., 35: 421-425, (1992); Pietersz e McKenzie, Immunolog. Reviews, 129: 57-80, (1992); e Roffler, e cols., Biochem. Pharmacol., 42: 2.062-2.065, (1991)). Essas técnicas podem ser usadas para vários outros tipos de células específicos. Veículos como, por exemplo, "stealth" e outros lipossomos conjugados a anticorpo (incluindo direcionamento de fármaco mediado por lipídeo para carcinoma do cólon), direcionamento mediado por receptor de DNA por meio de ligantes célula-específicos, direcionamento a tumor dirigido por linfócito, e direcionamento retroviral terapêutico altamente específico de células de glioma murídeo in vivo. As referências seguintes são exemplos do uso dessa tecnologia para direcionar proteínas-alvo específicas para tecido tumoral (Hughes e cols., Câncer Research, 49: 6.214-6.220, (1989); e Litzinger e Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1.104: 179-187, (1992)). Em geral, receptores estão envolvidos nas vias de endocitose, seja ela constitutiva ou induzida por ligante. Esses receptores se agrupam em depressões revestidas por clatrina, penetram na célula por meio de vesiculas revestidas com clatrina, passam através de um endossomo acidifiçado no qual os receptores são separados, e então são reciclados para a superfície celular, ficam armazenados intracelularmente, ou são degradados em lisossomos. As vias de internalização servem para várias funções, por exemplo, captação de nutriente, remoção de proteínas ativadas, depuração de macromoléculas, entrada oportunística de vírus e toxinas, dissociação e degradação de ligante e regulação do nível de receptor. Muitos receptores seguem mais de uma via intracelular, dependendo do tipo de célula, da concentração de receptor, do tipo de ligante, da valência do ligante, e da concentração do ligante. Mecanismos moleculares e celulares de endocitose mediada por receptor foram revisados (Brown e Greene, DNA and Cell Biology 10: 6, 399-409 (1991)).

Os ácidos nucléicos que são liberados às células que estão para ser integradas no genoma da célula hospedeira tipicamente contêm seqüências de integração. Essas seqüências são freqüentemente seqüências relacionadas a vírus, particularmente quando são usados sistemas com base viral. Esses sistemas virais de integração também podem ser incorporados em ácidos nucléicos que estão para ser liberados com o uso de um sistema de liberação não baseado em ácido nucléico, por exemplo, um lipossomo, de tal forma que o ácido nucléico contido no sistema de liberação possa se tornar integrado no genoma do hospedeiro.

Outras técnicas gerais para integração no genoma do hospedeiro incluem, por exemplo, sistemas projetados para promover a recombinação homóloga com o genoma do hospedeiro. Esses sistemas tipicamente se baseiam em uma seqüência que flanqueia o ácido nucléico a ser expresso que possua homologia suficiente com uma seqüência-alvo dentro do genoma da célula hospedeira onde ocorre a recombinação entre o ácido nucléico do vetor e o ácido nucléico-alvo, fazendo com que o ácido nucléico liberado seja integrado no genoma do hospedeiro. Esses sistemas e os métodos necessários para promover a recombinação homóloga são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

iii. In vivo/ex vivo

Como descrito acima, as composições podem ser administradas em um veículo farmaceuticamente aceitável, e podem ser liberadas às células do indivíduo in vivo e/ou ex vivo por diversos mecanismos bem conhecidos na técnica (por exemplo, captação de DNA desnudo (naked), fusão de lipossomo, injeção intramuscular de DNA por meio de uma pistola de gene, endocitose e semelhantes).

Caso sejam empregados métodos ex vivo, as células ou os tecidos poderão ser removidos e mantidos fora do corpo de acordo com protocolos padronizados bem conhecidos na técnica. As composições podem ser introduzidas nas células por meio de qualquer mecanismo de transferência gênica como, por exemplo, liberação gênica mediada por fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção ou proteolipossomos. As células transduzidas podem então ser infundidas (por exemplo, em um veículo farmaceuticamente aceitável) ou transplantadas de forma homotópica de volta para o indivíduo por métodos padronizados para o tipo de célula ou tecido. Métodos padronizados são conhecidos para transplante ou infusão de várias células em um indivíduo.

7. Kits

Os materiais descritos acima, bem como outros materiais, podem ser embalados em conjunto em qualquer combinação adequada como um kit útil para realizar, ou para ajudar no desempenho, do método revelado. Ele é útil se os componentes do kit em certo kit são projetados e adaptados para uso em conjunto no método revelado. Por exemplo, são revelados kits para a detecção, tratamento ou prevenção de câncer da próstata ou PIN, o kit compreendendo peptídeos ou anticorpos que se ligam especificamente a PAX2 e DEFBl.

8. Sistemas de expressão

Os ácidos nucléicos que são liberados às células tipicamente contêm sistemas de controle da expressão. Por exemplo, os genes inseridos em sistemas virais e retrovirais normalmente contêm promotores e/ou intensificadores para ajudar no controle da expressão do produto gênico desejado. Um promotor é geralmente uma seqüência ou seqüências de DNA que funcionam quando em uma localização relativamente fixa em relação ao sítio de iniciação da transcrição. Um promotor contém elementos centrais necessários à interação básica de RNA polimerase e fatores de transcrição, e pode conter elementos upstream e elementos de resposta.

i. Promotores virais e intensificadores Promotores que controlam a transcrição preferidos de vetores em células hospedeiras de mamíferos podem ser obtidos de várias fontes, por exemplo, os genomas de vírus como, por exemplo: polioma, vírus símio 40 (SV40), adenovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e, principalmente, citomegalovírus, ou de promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, promotor de beta actina. Os promotores iniciais e tardios do vírus SV4 0 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV4 0 que também contém a origem de replicação viral de SV4 0 (Fiers e cols., Nature, 273: 113 (1978)). 0 promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindIII E (Verdeway, P.J. e cols., Gene 18: 355-360 (1982)). Evidentemente, promotores da célula hospedeira ou de espécies relacionadas também são úteis nesta especificação.

Intensificador geralmente se refere a uma seqüência de DNA que funciona sem distância fixa do sítio de iniciação da transcrição e pode ser 5' (Laimins, L. e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. 78: 993 (1981)) ou 3' (Lusky, M.L., e cols., Mol. Cell. Βίο. 3: 1108 (1983)) em relação â unidade de transcrição. Além disso, intensificadores podem estar dentro de um íntron (Banerji, J.L. e cols., Cell 33: 729 (1983)), bem como dentro da própria seqüência codificadora (Osborne, T.F., e cols., Mol. Cell. Bio. 4: 1293 (1984)). Eles normalmente possuem entre 10 e 300 bp de comprimento, e funcionam em eis. Intensificadores funcionam para aumentar a transcrição por promotores próximos.

Intensificadores freqüentemente também contêm elementos de resposta que medeiam a regulação da transcrição. Promotores também podem conter elementos de resposta que mediam a regulação da transcrição. Intensificadores freqüentemente determinam a regulação da expressão de um gene. Embora muitas seqüências intensificadoras sejam agora conhecidas de genes mamíferos (globina, elastase, albumina, fetoproteína e insulina) , tipicamente será utilizado um intensificador de um vírus de célula eucariótica para expressão geral. Exemplos preferidos são o intensificador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (100-270 bp) , o intensificador de promotor inicial de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e intensificadores de adenovírus.

O promotor e/ou intensificador pode ser especificamente ativado por luz ou por eventos químicos específicos que desencadeiam sua função. Os sistemas podem ser regulados por reagentes como, por exemplo, tetraciclina e dexametasona. Também há formas de intensificar a expressão gênica do vetor viral por exposição à irradiação, por exemplo, irradiação gama, ou fármacos quimioterápicos alquilantes.

Em certas modalidades, a região promotora e/ou intensificadora pode atuar como um promotor e/ou intensificador constitutivo para maximizar a expressão da região da unidade de transcrição a ser transcrita. Em certas construções, a região promotora e/ou intensificadora é ativa em todos os tipos de células eucarióticas, mesmo se só for expressa em um tipo de célula em particular em um momento específico. Um promotor preferido desse tipo é o promotor de CMV (650 bases). Outros promotores preferidos são promotores de SV40, citomegalovírus (promotor de comprimento total) e LTR de vetor retroviral.

Foi demonstrado que todos os elementos reguladores específicos podem ser clonados e usados para construir vetores de expressão que são expressos seletivamente em tipos de células específicos como, por exemplo, células de melanoma. 0 promotor de proteína acética fibrilar glial (GFAP) tem sido usado para expressar seletivamente genes em células de origem glial.

Os vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (células de levedura, fungos, inseto, planta, animais, humanas ou nucleadas) também podem conter seqüências necessárias à terminação da transcrição que podem afetar a expressão de mRNA. Essas regiões são transcritas como segmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica a proteína de fator tecidual. As regiões não traduzidas 3' também incluem sítios de terminação da transcrição. Prefere-se que a unidade de transcrição também contenha uma região de poliadenilação. Um benefício dessa região é que ela aumenta a probabilidade de que a unidade transcrita seja processada e transportada como mRNA. A identificação e o uso de sinais de poliadenilação nas construções de expressão são bem estabelecidos. Prefere-se que sejam usados sinais de poliadenilação homólogos nas construções de transgene. Em certas unidades de transcrição, a região de poliadenilação é derivada do sinal de poliadenilação inicial de SV4 0 e consiste em cerca de 400 bases. Prefere-se também que as unidades transcritas contenham outras seqüências padronizadas isoladamente ou em combinação com as seqüências acima para aumentar a expressão ou a estabilidade da construção,

ii. Marcadores

Os vetores virais podem incluir uma seqüência de ácido nucléico que codifica um produto marcador. Esse produto marcador é usado para determinar se o gene foi liberado ã célula e, uma vez liberado, se está sendo expresso. Genes marcadores preferidos são o gene lacZ de E. Coli, que codifica β-galactosidase e proteína fluorescente verde.

Em algumas modalidades, o marcador pode ser um marcador selecionável. Exemplos de marcadores selecionáveis adequados para células de mamíferos são diidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase, neomicina, análogo de neomicina G418, hidromicina e puromicina. Quando esses marcadores selecionáveis são transferidos com sucesso em uma célula hospedeira mamífera, a célula hospedeira mamífera transformada pode sobreviver, se colocada sob pressão seletiva. Há duas categorias distintas amplamente usadas de regimes seletivos. A primeira categoria é baseada no metabolismo de uma célula e o uso de uma linhagem celular mutante que não possui a habilidade para crescer independente de um meio suplementado. Dois exemplos são·, células CHO DHFR e células LTK de camundongo. Essas células, não possuem a habilidade de crescer sem a adição de nutrientes como, por exemplo, timidina ou hipoxantina. Como essas células não possuem certos genes necessários para uma via de síntese de nucleotídeo completa, elas não sobrevivem, a menos que os nucleotídeos ausentes sejam fornecidos em um meio suplementado. Uma alternativa à suplementação do meio é a introdução de um gene DHFR ou TK intacto nas células que não possuem os respectivos genes, alterando, dessa forma, suas necessidades de crescimento. As células individuais que não foram transformadas com o gene DHFR ou TK não serão capazes de sobreviver em meio não suplementado. A segunda categoria é a seleção dominante, que se refere a um esquema de seleção usado em qualquer tipo de célula e não exige o uso de uma linhagem celular mutante. Esses esquemas tipicamente utilizam um fármaco para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Aquelas células que possuem um novo gene expressariam uma proteína que confere resistência fàrmacológica e sobreviveriam ã seleção. Exemplos dessa seleção dominante utilizam os fármacos neomicina (Southern P. e Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)), ácido micofenólico, (Mulligan, R.C. e Berg, P. Science 209: 1.422 (1980)) ou higromicina (Sugden, B. e cols., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)). Os três exemplos empregam genes bacterianos sob controle eucariótico para conferir resistência ao fármaco apropriado, G418 ou neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) , ou higromicina, respectivamente. Outros incluem o análogo de neomicina G418 e puramicina.

9. Veículos farmacêuticos

As composições reveladas podem ser usadas terapeuticamente em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável" significa um material que não é biologicamente ou de algum outro modo indesejável, ou seja, o material pode ser administrado a um indivíduo, juntamente com o ácido nucléico ou vetor, sem causar nenhum efeito biológico indesejável ou interagir de uma forma deletéria com qualquer um dos outros componentes na composição farmacêutica na qual está contido. 0 veículo seria naturalmente selecionado para minimizar qualquer degradação do ingrediente ativo e para minimizar quaisquer efeitos colaterais adversos no indivíduo, como é do conhecimento daqueles habilitados na técnica.

Veículos adequados e suas formulações são descritos em "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (19a Edição) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Tipicamente, uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável é usada na formulação para torná-la isotônica. Exemplos do veículo farmaceuticamente aceitável incluem, sem limitação, solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. 0 pH da solução é pref erivelmente de cerca de 5 a cerca de 8 e, mais preferivelmente, de cerca de 7 a cerca de 7,5. Veículos adicionais incluem preparações de liberação sustentada como, por exemplo, matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo, películas, lipossomos ou micropartículas. Ficará evidente para aqueles habilitados na técnica que certos veículos podem ser mais preferíveis, dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração da composição que está senso administrada.

Veículos farmacêuticos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Os mais típicos seriam veículos padronizados para administração de fármacos a seres humanos, incluindo soluções como, por exemplo, água estéril, solução salina e soluções tamponadas em pH fisiológico. As composições podem ser administradas por via intramuscular ou subcutânea. Outros compostos serão administrados de acordo com procedimentos padronizados usados por aqueles habilitados na técnica. Composições farmacêuticas podem incluir veículos, espessantes, diluentes, tampões, conservantes, agentes tensoativos e semelhantes, além da molécula de escolha. As composições farmacêuticas também podem incluir um ou mais ingredientes ativos, tais como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatórios, anestésicos e semelhantes.

Preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões estéreis aquosas ou não aquosas. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais como, por exemplo, azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis como, por exemplo, oleato de etila. Veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meios tamponados.

Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactato ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem repositores de líquido e de nutrientes, repositores de eletrólitos (por exemplo, aqueles baseados em dextrose de Ringer), e semelhantes. Conservantes e outros aditivos também podem estar presentes como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes, e semelhantes.

Formulações para administração tópica podem incluir pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Veículos farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e semelhantes podem ser necessários ou desejáveis.

Composições para administração oral incluem pós ou grânulos, suspensões ou soluções em água ou em meios não aquosos, cápsulas, sachês ou comprimidos. Espessantes, flavorizante, diluentes, emulsificantes, auxiliares de dispersão ou ligantes podem ser desejáveis.

Algumas das composições podem potencialmente ser administradas como um sal de adição de ácido ou de base farmaceuticamente aceitável, formado por reação com ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociânico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico, e ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido lático, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maléico e ácido fumárico, ou por reação com uma base inorgânica como, por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, e bases orgânicas como, por exemplo, mono-, di-, trialquil e aril aminas, e etanolaminas substituídas.

Os materiais podem estar em solução, suspensão (por exemplo, incorporados em micropartícuias, lipossomos ou células). Esses podem ser direcionados a um tipo de célula em particular por meio de anticorpos, receptores ou ligantes de receptor. As referências seguintes são exemplos do uso dessa tecnologia para direcionar proteínas-alvo específicas para tecido tumoral (Senter, e cols., Bioconjugate Chem., 2: 447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Câncer, 60: 275-281, (1989); Bagshawe, e cols., Br. J. Câncer, 58: 700-703, (1988); Senter, e cols., Bioconjugate Chem., 4: 3-9, (1993); Battelli, e cols., Câncer Immunol. Immunother., 35: 421-425, (1992); Pietersz e McKenzie, Immunolog. Reviews, 129: 57-80, (1992); e Roffler, e cols., Biochem. Pharmacol., 42: 2.062-2.065, (1991)). Veículos como, por exemplo, "stealth" e outros lipossomos conjugados a anticorpo (incluindo direcionamento de fármaco mediado por lipídeo para carcinoma do cólon), direcionamento mediado por receptor de DNA por meio de ligantes célula- específicos, direcionamento a tumor dirigido por linfócito, e direcionamento retroviral terapêutico altamente específico de células de glioma murídeo in vivo. As referências seguintes são exemplos do uso dessa tecnologia para direcionar proteínas-alvo específicas para tecido tumoral (Hughes e cols., Câncer Research, 49: 6.214-6.220, (1989) ; e Litzinger e Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104: 179-187, (1992)). Em geral, receptores estão envolvidos nas vias de endocitose, sejam elas constitutivas ou induzidas por ligante. Esses receptores se agrupam em depressões revestidas com clatrina, penetram na célula por meio de vesícuias revestidas com clatrina, passam através de um endossomo acidificado no qual os receptores são separados, então são reciclados para a superfície celular, ficam armazenados intracelularmente ou são degradados em lisossomos. As vias de internalização servem para várias funções, por exemplo, captação de nutriente, remoção de proteínas ativadas, depuração de macromoléculas, entrada oportunística de vírus e toxinas, dissociação e degradação de ligante, e regulação do nível de receptor. Muitos receptores seguem mais de uma via intracelular, dependendo do tipo de célula, da concentração de receptor, do tipo de ligante, da valência do ligante, e da concentração do ligante. Mecanismos moleculares e celulares de endocitose mediada por receptor foram revisados (Brown e Greene, DNA and Cell Biology 10: 6, 399-409 (1991)).

10. Química combinatória

As composições reveladas podem ser usadas como alvos para qualquer técnica combinatória para identificar moléculas ou moléculas macromoleculares que interagem com as composições reveladas de uma forma desejada. Também são reveladas as composições que são identificadas por meio de técnicas combinatórias ou técnicas de triagem nas quais as composições reveladas como a seqüência de PAX2 ou porções desta (por exemplo, domínio de ligação de DNA de PAX2) são usadas como o alvo em um protocolo combinatório ou de triagem.

Entende-se que, quando se utilizam as composições reveladas em técnicas combinatórias ou em métodos de triagem, serão identificadas moléculas, por exemplo, moléculas macromoleculares, que possuem propriedades específicas desejadas como, por exemplo, inibição ou estimulação, ou a função da molécula-alvo. Moléculas identificadas e isoladas quando se utilizam as composições reveladas, por exemplo, DEFBl ou PAX2, também são reveladas. Dessa forma, os produtos produzidos com o uso das abordagens combinatórias ou de triagem que envolvem as composições reveladas também são considerados aqui revelados.

Entende-se que os métodos revelados para a identificação de moléculas que inibem as interações entre, por exemplo, promotor de DEFBl e PAX2, podem ser realizados com a utilização de meios de alto rendimento. Por exemplo, supostos inibidores podem ser identificados com o uso de transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET) para identificar rapidamente interações. A teoria subjacente das técnicas é que, quando duas moléculas estão próximas no espaço, ou seja, interagem em um nível além do nível de fundo, é produzido um sinal ou um sinal pode ser extinto. A seguir, podem ser feitos vários experimentos, incluindo, por exemplo, a adição de um suposto inibidor. Caso o inibidor compita com a interação entre as duas moléculas de sinalização, os sinais serão removidos de ambas no espaço, e isso irá causar uma diminuição ou um aumento no sinal, dependendo do tipo de sinal usado. Essa diminuição ou esse aumento do sinal pode ser correlacionado com a presença ou ausência do suposto inibidor. Qualquer meio de sinalização pode ser usado. Por exemplo, são revelados métodos de identificação de um inibidor da interação entre quaisquer duas das moléculas reveladas, que compreendem o contato de uma primeira molécula e uma segunda molécula em conjunto, na presença de um suposto inibidor, em que a primeira molécula ou a segunda molécula compreende um doador de fluorescência, em que a primeira ou a segunda molécula, tipicamente a molécula que não compreende o doador, compreende um receptor de fluorescência; e a medida da transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET), na presença do suposto inibidor e na ausência do suposto inibidor, em que uma diminuição da FRET na presença do suposto inibidor, comparada com a medida de FRET em sua ausência, indica que o suposto inibidor inibe a ligação entre as duas moléculas. Esse tipo de método também pode ser realizado com um sistema celular.

A química combinatória inclui, sem limitação, todos os métodos para o isolamento de pequenas moléculas ou macromoléculas que são capazes de se ligar tanto a uma pequena molécula quanto a outra macromolécula, tipicamente em um processo repetitivo. Proteínas, oligonucleotídeos e açúcares são exemplos de macromoléculas. Por exemplo, moléculas de oligonucleotídeo com certa função, catalítica ou de ligação de ligante, podem ser isoladas de uma mistura complexa de oligonucleotídeos aleatórios, no que foi denominado "genética in vitro" (Szostak, TIBS 19: 89, 1992). Sintetiza-se um grande pool de moléculas que abrigam seqüências aleatórias e definidas, e submete-se aquela mistura complexa, por exemplo, aproximadamente 1.015 seqüências individuais em 100 μg de um RNA de 100 nucleotídeos, a seleção e a algum processo de enriquecimento. Por meio de ciclos repetidos de cromatografia por afinidade e amplificação por PCR das moléculas ligadas ao ligante na coluna, Ellington e Szostak (1990) estimaram que 1 em 1.010 moléculas de RNA se dobra de uma forma tal que se liga a corantes de pequena molécula. Também foram isoladas moléculas de DNA com esse comportamento de ligação de ligante (Ellington e Szostak, 1992; Bock e cols., 1992). Existem técnicas com objetivos similares para pequenas moléculas orgânicas, proteínas, anticorpos e outras macromoléculas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. A triagem de conjuntos de moléculas quanto a uma atividade desejada, seja ela baseada em pequenas bibliotecas orgânicas, oligonucleotídeos ou anticorpos, é amplamente citada como química combinatória.

As técnicas combinatórias são particularmente adequadas à definição de interações de ligação entre moléculas e para o isolamento de moléculas que possuem uma atividade de ligação específica, freqüentemente denominadas aptâmeros quando as macromoléculas são ácidos nucléicos.

Há diversos métodos para o isolamento de proteínas que possuem uma atividade de novo ou uma atividade modificada. Por exemplo, foram usadas bibliotecas de apresentação em fago para isolar numerosos peptídeos que interagem com um alvo específico (veja, por exemplo, Patentes U.S. NoS 6.031.071, 5.824.520, 5.596.079 e 5.565.332, que são aqui incorporadas por referência pelo menos quanto ao seu material relacionado à apresentação em fago e aos métodos relacionados à química combinatória).

Um método preferido para o isolamento de proteínas que possuem certa função é descrito por Roberts e Szostak (Roberts R.W. e Szostak J.W. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 94(23): 12.997-302 (1997). Esse método de química combinatória acopla o poder funcional das proteínas com o poder genético dos ácidos nucléicos. É gerada uma molécula de RNA na qual uma molécula de puromicina é anexada de forma covalente à extremidade 3' da molécula de RNA. Uma tradução in vitro dessa molécula de RNA modificada faz com que a proteína correta, codificada pelo RNA, seja traduzida. Além disso, por causa da adesão da puromicina, um receptor de peptdil que não pode ser estendido, a cadeia peptídica em crescimento é anexada à puromicina que está anexada ao RNA. Dessa forma, a molécula de proteína é anexada ao material genético que a codifica. Podem agora ser feitos procedimentos normais de seleção in vitro para isolar peptídeos funcionais. Após o procedimento de seleção para a função do peptídeo estar completo, são realizados procedimentos tradicionais de manipulação de ácido nucléico para amplificar o ácido nucléico que codifica os peptídeos funcionais selecionados. Após amplificação do material genético, o novo RNA é transcrito com puromicina na extremidade 3', o novo peptídeo é traduzido, e outra rodada funcional de seleção é realizada. Dessa forma, a seleção de proteína pode ser realizada de forma repetitiva, exatamente como as técnicas de seleção de ácido nucléico. 0 peptídeo que é traduzido é controlado pela seqüência do RNA anexado à puromicina. Essa seqüência pode ser qualquer uma de uma seqüência aleatória criada geneticamente para tradução ótima (ou seja, sem códons de parada etc.), ou ela pode ser uma seqüência degenerada de uma molécula de RNA conhecida, para pesquisa de função aumentada ou alterada de um peptídeo conhecido. As condições para a amplificação de ácido nucléico e tradução in vitro são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica, e são realizadas preferivelmente como em Roberts e Szostak (Roberts R.W. e Szostak J.W. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 94(23): 12.997- 302 (1997) ) .

Outro método preferido para métodos combinatórios projetados para o isolamento de peptídeos é descrito em Cohen e cols. (Cohen B.A., e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95(24): 14.272-7 (1998)). Esse método utiliza e modifica a tecnologia de dois híbridos. Sistemas de levedura de dois híbridos são úteis para a detecção e análise de interações proteína:proteína. 0 sistema de dois híbridos, descrito inicialmente na levedura Saccharomyces eerevisiae, é uma técnica de genética molecular poderosa para a identificação de novas moléculas reguladoras, específicas para a proteína de interesse (Fields e Song, Nature 340: 245-6 (1989)). Cohen e cols. modificaram essa tecnologia de modo que pudessem ser identificadas novas interações entre seqüências de peptídeos sintéticas ou criadas geneticamente que se ligam a uma molécula de escolha. 0 benefício desse tipo de tecnologia é que a seleção é feita em um ambiente intracelular. 0 método utiliza uma biblioteca de moléculas de peptídeo anexadas a um domínio de ativação ácido.

Com o uso de uma metodologia bem conhecida por aqueles habilitados na técnica, em combinação com várias bibliotecas combinatórias, pode-se isolar e caracterizar aquelas pequenas moléculas ou macromoléculas, que se ligam ou interagem com o alvo desejado. A afinidade de ligação relativa desses compostos pode ser comparada, e compostos ótimos identificados, com o uso de estudos de ligação competitiva, que são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Metodologias para a produção de bibliotecas combinatórias e para a triagem de bibliotecas combinatórias para isolar moléculas que se ligam a um alvo desejado são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Técnicas e métodos representativos podem ser encontrados, sem limitação, nas Patentes U.S. Nos 5.084.824, 5.288.514, 5.449.754, 5.506.337, 5.539.083, 5.545.568, 5.556.762, 5.565.324, 5.565.332, 5.573.905, 5.618.825, 5.619.680, 5.627.210, 5.646.285, 5.663.046, 5.670.326, 5.677.195, 5.683.899, 5.688.696, 5.688.997, 5.698.685, 5.712.146, 5.721.099, 5.723.598, 5.741.713, 5.792.431, 5.807.683, 5.807.754, 5.821.130, 5.831.014, 5.834,195, 5.834.318, 5.834.588, 5.840.500, 5.847.150, 5.856.107, 5.856.496, 5.859.190, 5.864.010, 5.874.443, 5.877.214, 5.880.972, 5.886.126, 5.886.127, 5.891.737, 5.916.899, 5.919,955, 5.925.527, 5.939.268, 5.942.387, 5.945.070, 5.948.696, 5.958.702, 5.958.792, 5.962.337, 5.965.719, 5.972.719, 5.976.894, 5.980.704, 5.985.356, 5.999.086, 6.001.579, 6.004.617, 6.008.321, 6.017.768, 6.025.371, 6.030.917, 6.040.193, 6.045.671, 6.045.755, 6.060.596 e 6.061.636.

Bibliotecas combinatórias podem ser feitas a partir de um arranjo de moléculas amplo, com o uso de diversas técnicas sintéticas diferentes. Por exemplo, bibliotecas contendo 2,4-pirimidinadionas fundidas (Patente U.S. N0 6.025.371), diidrobenzopiranos (Patentes U.S. Nos 6.017.768 e 5.821.130), alcoóis de amida (Patente U.S. N0 5.976.894), hidróxi-aminoácido amidas (Patente U.S. N0 5.972.719), carboidratos (Patente U.S. N0 5.965.719), 1,4- benzodiazepin-2,5-dionas (Patente U.S. N0 5.962.337), cíclicos (Patente U.S. N0 5.958.792), biaril aminoácido amidas (Patente U.S. N0 5.948.696), tiofenos (Patente U.S. N0 5.942.387), tetrahidroquinolinas triclclicas (Patente U.S. N0 5.925.527), benzofuranos (Patente U.S. N0 5.919.955), isoquinolinas (Patente U.S. N0 5.916.899), hidantoína e tio-hidantoína (Patente U.S. N0 5.859.190), indóis (Patente U.S. N0 5.856.496), imidazol-pirido-indol e imidazol-pirido-benzotiofenos (Patente U.S. N0 5.856.107), 2-metileno-2, 3-diidrotiazóis substituídos (Patente U.S. N0 5.847.150), quinolinas (Patente U.S. N0 5.840.500), PNA (Patente U.S. N0 5.831.014), que contêm tags (Patente U.S. N0 5.721.099), policetidas (Patente U.S. N0 5.712.146), subunidades de morfolino (Patente U.S. N°s 5.698.685 e 5.506.337), sulfamidas (Patente U.S. N0 5.618.825) e benzodiazepinas (Patente U.S. N0 5.288.514).

A triagem de moléculas similares às moléculas de siRNA reveladas quanto à inibição de PAX2, supressão da expressão de DEFBl, é um método de isolamento de compostos desejados.

As moléculas isoladas podem ser inibidores competitivos ou inibidores não competitivos.

Em outra modalidade, os inibidores são inibidores não competitivos. Um tipo de inibidor não competitivo causará rearranjos alostéricos.

Como aqui usados, métodos e bibliotecas combinatórios incluíam métodos e bibliotecas de triagem tradicionais, bem como métodos e bibliotecas usados em processos repetitivos.

11. Projeto de fármacos com auxilio de computador

As composições reveladas podem ser usadas como alvos para qualquer técnica de modelagem molecular para identificar a estrutura das composições reveladas ou para identificar moléculas potenciais ou verdadeiras, tais como pequenas moléculas, que interagem de uma forma desejada com as composições reveladas. Os ácidos nucléicos, peptídeos e moléculas relacionadas aqui reveladas podem ser usados como alvos em qualquer programa ou abordagem de modelagem molecular.

Entende-se que, quando se utilizam as composições reveladas em técnicas de modelagem, serão identificadas moléculas como, por exemplo, as moléculas macromoleculares, que possuem propriedades específicas desejadas, tais como inibição ou estimulação da função da molécula-alvo. Moléculas identificadas e isoladas com a utilização das composições reveladas, por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 1, também são reveladas. Dessa forma, os produtos produzidos com a utilização das abordagens de modelagem molecular que envolvem as composições reveladas, por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 1, também são considerados aqui revelados.

Dessa forma, uma forma de se isolar moléculas que se ligam a uma molécula de escolha é por meio do design proporcional. Isso é obtido por meio de informações estruturais e modelagem por computador. A tecnologia de modelagem por computador permite a visualização da estrutura atômica tridimensional de uma molécula selecionada e o design proporcional de novos compostos que irão interagir com a molécula. A construção tridimensional tipicamente depende de dados de análises cristalográficas por raios-X ou de imagens de RNM da molécula selecionada. A dinâmica molecular exige dados do campo de força. Os sistemas gráficos computacionais permitem a previsão de como um novo composto irá se ligar à molécula-alvo e permite a manipulação experimental das estruturas do composto e da molécula-alvo para aperfeiçoar a especificidade de ligação. A previsão de como será a interação molécula-composto quando forem feitas pequenas mudanças em um ou em ambos exige um software de mecânica molecular e computadores com grande capacidade de processamento, normalmente acoplados a interfaces amigáveis através de menus, entre o programa de design molecular e o usuário.

Exemplos de sistemas de modelagem molecular são os programas CHARMm e QUANTA, da Polygen Corporation, Waltham, MA. CHARMm efetua as funções de minimização de energia e dinâmica molecular. QUANTA efetua a construção, a modelagem gráfica e a análise da estrutura molecular. QUANTA permite a construção interativa, modificação, visualização e análise do comportamento das moléculas umas com as outras.

Vários artigos revisam a modelagem por computador de fármacos de forma interativa com proteínas específicas, por exemplo, Rotivinen, e cols., 1988 Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166; Ripka, New Scientist 54-57 (16 de junho de 1988) ; McKinaly e Rossmann, 198 9 Annu. Rev. Pharmaeol. Toxieol. 29, 111-122; Perry e Davies, "QSAR:

Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design", páginas 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis e Dean, 1989 Proe. R. Soe. Lond. 236, 125-140 e 141-162; e, com relação a uma enzima-modelo para componentes de ácido nucléico, Askew, e cols., 1989 J. Am. Chem. Soe. 111,

1.082-1.090. Outros programas de computador que avaliam e representam graficamente substâncias químicas estão disponíveis por outras empresas como, por exemplo, BioDesign, Inc., Pasadena, CA., Allelix, Inc, Mississauga, Ontário, Canadá, e Hypercube, Inc., Cambridge, Ontário.

Embora esses sejam projetados primariamente para fármacos específicos para proteínas específicas, eles podem ser adaptados para o design de moléculas que interagem especificamente com regiões específicas de DNA ou RNA, após essa região ser identificada.

Embora tenha sido descrito acima com referência ao design e à geração de compostos que pudessem alterar a ligação, também poderia ser feita a avaliação de bibliotecas de compostos conhecidos, incluindo produtos naturais ou substâncias químicas sintéticas e materiais biologicamente ativos, incluindo proteínas, quanto aos compostos que alteram a atividade de ligação de substrato ou enzimática.

12. Meios que podem ser lidos por computador

Entende-se que os ácidos nucléicos e as proteínas reveladas podem ser representados como uma seqüência que consiste nos nucleotídeos de aminoácidos. Há diversas formas de exibir essas seqüências, por exemplo, o nucleotídeo guanosina pode ser representado por G ou g. Do mesmo modo, o aminoácido valina pode ser representado por Val ou V. Aqueles habilitados na técnica sabem como exibir e expressar qualquer seqüência de ácido nucléico ou proteína em qualquer uma das diversas formas que existem, cada uma das quais é considerada aqui revelada. É especificamente aqui contemplada a exibição dessas seqüências em meios que podem ser lidos por computador como, por exemplo, disquetes, fitas, chips, discos rígidos, compact disks e video disks disponíveis comercialmente, ou outros meios que podem ser lidos por computador. Também são reveladas as representações do código binário das 20 seqüências reveladas. Aqueles habilitados na técnica sabem quais os meios que podem ser lidos por computador. Dessa forma, são revelados meios que podem ser lidos por computador nos quais as seqüências de ácidos nucléicos ou de proteína são registradas, armazenadas ou salvas.

São revelados meios que podem ser lidos por»computador que compreendem as seqüências e informações relativas às seqüências aqui apresentadas. Também são revelados meios que podem ser lidos por computador que compreendem as seqüências e informações relativas às seqüências apresentadas. C. Métodos

1. Administração

Uma composição aqui revelada pode ser administrada de diversas formas, dependendo de se é desejado o tratamento local ou sistêmico, e na área a ser tratada. Por exemplo, as composições podem ser administradas oralmente, parenteralmente (por exemplo, injeção intravenosa, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular), por inalação, por via extracorpórea, tópica (incluindo transdérmica, oftálmica, vaginal, retal, intranasal), ou semelhantes.

Como aqui usado, o termo "administração tópica intranasal" significa a liberação das composições no nariz e nas passagens nasais através de uma ou de ambas as narinas, e pode compreender a liberação por um mecanismo de spray ou um mecanismo de gotícula, ou por meio de aerossolização do ácido nucléico ou vetor. A administração das composições por inalante pode ser através do nariz ou da boca por meio de liberação por um mecanismo de spray ou goticula. A liberação também pode ser feita diretamente a qualquer área do sistema respiratório (por exemplo, pulmões) por meio de entubação.

A administração parenteral da composição, se usada, é geralmente caracterizada por injeção. Injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas à solução de suspensão em um líquido antes da injeção, ou como emulsões. Uma abordagem revisada mais recentemente para administração parenteral envolve uso de um sistema de liberação lenta ou de liberação sustentada, de tal forma que seja mantida uma dosagem constante. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N0 3.610.795, que é aqui incorporada por referência.

A quantidade exata das composições necessária irá variar de indivíduo para indivíduo, dependendo da espécie, da idade, do peso e da condição geral do indivíduo, da gravidade do distúrbio alérgico que está sendo tratado, do ácido nucléico ou vetor usado em particular, de seu modo de administração, e semelhantes. Dessa forma, não é possível especificar uma quantidade exata para cada composição. No entanto, uma quantidade apropriada pode ser determinada por aqueles habilitados na técnica utilizando somente experimentação de rotina considerando os ensinamentos aqui apresentados. Dessa forma, dosagens e posologias eficazes para administração das composições podem ser determinadas empiricamente, e a realização dessas determinações faz parte dos conhecimentos daqueles habilitados na técnica. As faixas de dosagem para a administração das composições são aquelas suficientemente grandes para produzir o efeito desejado em que os sintomas do distúrbio são afetados. A dosagem não deve ser tão grande a ponto de causar efeitos colaterais adversos, por exemplo, reações cruzadas indesejadas, reações anafiláticas, e semelhantes. Geralmente, a dosagem irá variar com a idade, condição, sexo e extensão da doença no paciente, com a via de administração, ou se outros fármacos estão incluídos no regime, e pode ser determinada por aqueles habilitados na técnica. A dosagem pode ser ajustada pelo médico do indivíduo no caso de contra-indicações. A dosagem pode variar, e pode ser administrada em uma ou mais administrações de doses diárias, por um ou vários dias. Diretrizes podem ser encontradas na literatura quanto às dosagens adequadas para certas classes de produtos farmacêuticos.

Por exemplo, uma dosagem diária típica da composição revelada usada isoladamente pode variar de cerca de 1 μg/kg até 100 mg/kg de peso corporal ou mais por dia, dependendo dos fatores mencionados acima.

Após a administração de uma composição revelada para o tratamento, inibição ou prevenção de câncer da próstata ou PIN, a eficácia da substância terapêutica pode ser avaliada de várias formas bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, aqueles habilitados na técnica saberão que uma composição aqui revelada é eficaz no tratamento ou inibição de câncer da próstata em um indivíduo por observação de que a composição reduz o antígeno PSA ou evita um aumento adicional do tamanho do tumor da próstata. O antígeno PSA pode ser medido por métodos que são conhecidos na técnica, por exemplo, com o uso de ensaios de anticorpo para detectar a presença da proteína PSA em uma amostra (por exemplo, sem limitação, sangue) de um indivíduo ou paciente, ou por medida dos níveis circulantes de PSA no paciente.

As composições que inibem as interações aqui reveladas podem ser administradas profilaticamente aos pacientes ou aos indivíduos em risco para o câncer da próstata ou que foram recém-diagnosticados com PIN ou câncer da próstata.

Outras moléculas que interagem com PSA ou DEFBl para inibir as interações que não possuem uma função farmacêutica específica, mas que podem ser usadas para rastrear as alterações dentro de cromossomos celulares ou para a liberação de ferramentas diagnosticas, por exemplo, podem ser liberadas de formas similares àquelas descritas para os produtos farmacêuticos.

2. Produção

As composições aqui reveladas e as composições necessárias para realizar os métodos revelados podem ser feitas com a utilização de qualquer método conhecido por aqueles habilitados na técnica para aquele reagente ou composto em particular, a menos que especificamente observado de forma diferente.

i. Síntese de ácido nucléico

Por exemplo, os ácidos nucléicos, por exemplo, os oligonucleotídeos a serem usados como iniciadores, podem ser feitos com o uso de métodos padronizados de síntese química, ou podem ser produzidos com a utilização de métodos enzimáticos ou qualquer outro método conhecido. Esses métodos podem variar de digestão enzimática padronizada, seguida por isolamento de fragmento de nucleotídeo (veja, por exemplo, Sambrook e cols., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Capítulos 5, 6), até métodos puramente sintéticos, por exemplo, pelo método de cianoetil fosforamidita, usando um sintetizador de DNA Milligen ou Beckman System IPlus (por exemplo, sintetizador automatizado Modelo 8700 de Milligen-Biosearch, Burlington, MA ou ABI Modelo 380B). Métodos sintéticos úteis para a produção de oligonucleotídeos também são descritos por Ikuta e cols., Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356 (1984), (métodos de fosfotriéster e fosfito-triéster), e Narang e cols., Methods Enzymol., 65: 610-620 (1980), (método de fosfotriéster). Moléculas de ácido nucléico de proteína podem ser feitas com o uso de métodos conhecidos, tais como aqueles descritos por Nielsen e cols., Bioconjug. Chem.

5:3-7 (1994).

ii. Síntese peptídica

Um método de produção das proteínas reveladas, por exemplo, o ID. DE SEQ. N°: 49, é ligar dois ou mais peptídeos ou polipeptídeos em conjunto por técnicas de química de proteína. Por exemplo, peptídeos ou polipeptídeos podem ser sintetizados quimicamente com o uso de equipamentos laboratoriais disponíveis atualmente, usando a química de Fmoc (9-flurenilmetiloxicarbonil) ou Boc (terc-butiloxicarbonoil) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) . Aqueles habilitados na técnica podem facilmente observar que um peptídeo ou polipeptídeo que corresponde às proteínas reveladas, por exemplo, pode ser sintetizado por reações químicas padronizadas. Por exemplo, um peptídeo ou polipeptídeo pode ser sintetizado e não clivado de sua resina de síntese, enquanto o outro fragmento de um peptídeo ou proteína pode ser sintetizado e subseqüentemente clivado da resina, expondo, dessa forma, um grupo terminal que está funcionalmente bloqueado no outro fragmento. Por reações de condensação de peptídeo, esses dois fragmentos podem ser unidos de forma covalente por meio de uma ligação peptídica em seus terminais carboxil e amino, respectivamente, para formar um anticorpo, ou fragmento deste (Grant GA (1992) "Synthetic Peptides: A User Guide" . W.H. Freeman e Co., N. Y. (1992); Bodansky M e Trost B., Ed. (1993) "Principies of Peptide Synthesis". Springer Verlag Inc., NY (que é aqui incorporado por referência pelo menos quanto ao material relacionado ã síntese peptídica). Alternativamente, o peptídeo ou polipeptídeo é sintetizado independentemente in vivo, como aqui descrito. Uma vez isolados, esses peptídeos ou polipeptídeos independentes podem ser ligados para formar um peptídeo ou fragmento deste por meio de reações de condensação de peptídeo similares.

Por exemplo, a ligação enzimática de segmentos peptídicos clonados ou sintéticos permite que fragmentos peptídicos relativamente curtos sejam unidos para produzir fragmentos peptídicos maiores, polipeptídeos ou domínios de proteína inteiros (Abrahmsen L e cols., Biochemistry, 30: 4.151 (1991)). Alternativamente, a ligação química nativa de peptídeos sintéticos pode ser utilizada para construir sinteticamente peptídeos ou polipeptídeos maiores a partir de fragmentos peptídicos mais curtos. Esse método consiste em uma reação química em duas etapas (Dawson e cols. uSynthesis of Proteins by Native Chemical Ligation". Science, 266: 776-779 (1994)). A primeira etapa é a reação quimiosseletiva de um tioéster de um peptídeo sintético não protegido com outro segmento peptídico não protegido contendo um resíduo Cys no amino terminal para gerar um intermediário ligado ao tioéster como o produto covalente inicial. Sem uma mudança das condições de reação, esse intermediário passa por uma reação intramolecular rápida, espontânea, para formar uma ligação peptídica nativa no sítio de ligação (Baggiolini M. e cols. (1992) FEBS Lett. 307: 97-101; Clark Lewis I. e cols., J. Biol. Chem., 269: 16.075 (1994); Clark Lewis I. e cols., Biochemistry, 30: 3.128 (1991); Rajarathnam Κ. e cols. , Biochemistry 33: 6.623-30 (1994) ) .

Alternativamente, segmentos peptídicos não protegidos são ligados quimicamente, em que a ligação formada entre os segmentos peptídicos em conseqüência da ligação química é uma ligação não natural (não peptídica) (Schnolzer, M. e cols. Science, 256: 221 (1992)). Essa técnica tem sido usada para a síntese de análogos de domínios de proteína, bem como de grandes quantidades de proteínas relativamente puras com atividade biológica completa (de Lisle Milton R. C. e cols., "Techniques in Protein Chemistry IV". Academic Press, Nova York, páginas 257-267 (1992)).

D. Definições

A menos que definido de forma diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui usados possuem os mesmos significados que comumente entendido por aqueles habilitados na técnica à qual o método e as composições revelados pertencem. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste do presente método e composições, os métodos, dispositivos e materiais particularmente úteis são como descritos. As publicações aqui citadas e o material para o qual são citadas são aqui especificamente incorporados por referência. Nada aqui deve ser considerado como uma admissão de que a presente invenção não está intitulada a antedatar esta revelação em virtude de invenção prévia. Não é feita nenhuma admissão de que qualquer referência constitua técnica estabelecida. A discussão de referências estabelece o que seus autores afirmam, e os requerentes se reservam o direito de questionar a precisão e a pertinência dos documentos citados.

Deve-se observar que, como aqui usado e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um", "uma", "a" e "o" incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente de forma diferente. Dessa forma, por exemplo, referência a "um peptídeo" inclui vários peptídeos, a referência "o peptídeo" é uma referência a um ou mais peptídeos e equivalentes destes conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e assim por diante.

"Opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento, a circunstância ou o material subseqüentemente descrito pode ou não ocorrer ou estar presente, e que a descrição inclui casos em que o evento, a circunstância ou o material ocorre ou está presente, e casos em que ele não ocorre ou não está presente.

As faixas podem ser aqui expressas como "cerca de" um valor em particular e/ou até "cerca de" outro valor em particular. Quando uma faixa desse tipo é expressa, outra modalidade inclui de um valor em particular e/ou até o outro valor em particular. Similarmente, quando valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente "cerca de", será subentendido que o valor em particular forma outra modalidade. Será ainda subentendido que os pontos finais de cada uma das faixas são significantes tanto em relação ao outro ponto final, e independentemente do outro ponto final. Subentende-se também que há diversos valores aqui revelados, e que cada valor também é aqui revelado como "cerca de" aquele valor em particular, além do próprio valor. Por exemplo, se o valor "10" é revelado, então "cerca de 10" é também revelado. Subentende-se também que, quando um valor é revelado como "menor ou igual" ao valor, "maior ou igual ao valor" e possíveis faixas entre valores também são revelados, como adequadamente entendido por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, se o valor "10" é revelado, "menor ou igual a 10", bem como "maior ou igual a 10", também é revelado. Subentende-se também que, ao longo de todo o pedido, são fornecidos dados em diversos formatos diferentes, e que esses dados representam pontos finais e pontos de partida, e faixas para qualquer combinação dos pontos de dados. Por exemplo, se um ponto de dados em particular "10" e um ponto de dados em particular "15" são revelados, entende-se que "maior", "maior ou igual a", "menor do que", "menor ou igual a" e "igual a" 10 e 15 também são considerados revelados, bem como entre 10 e 15. Subentende-se também que cada unidade entre duas unidades em particular também é revelada. Por exemplo, se 10 e 15 são revelados, então 11, 12, 13 e 14 também são revelados.

Ao longo da descrição e das reivindicações desta especificação, a palavra "compreender" e variações da palavra, tais como "que compreende" e "compreende", significam "incluindo sem limitação", e não têm a intenção de excluir, por exemplo, outros aditivos, componentes, números inteiros ou etapas.

Ao longo de todo este, pedido são citadas várias publicações. As revelações dessas publicações em suas totalidades são aqui incorporadas por referência neste pedido a fim de descrever mais plenamente a tecnologia atual à qual esta invenção pertence. As referências reveladas também são aqui individual e especificamente incorporadas por referência quanto ao material nelas contido que é discutido na frase na qual a referência se baseia.

E. Exemplos

1. Exemplo 1: Beta defensina-1 humana ê citotõxica para câncer da próstata em estágio tardio e participa da imunidade tumoral do câncer da próstata

Resumo

DEFB1 foi clonado em um sistema de expressão indutível para examinar qual efeito teria sobre células epiteliais da próstata normal, bem como linhagens de células de câncer da próstata receptor de androgênio-positivas (AR+) e receptor de androgênio-negativas (AR-). A indução da expressão de DEFB1 resultou em uma diminuição do crescimento celular em células DU14 5 e PC3 AR", mas não teve nenhum efeito sobre o crescimento das células de câncer da próstata LNCaP AR+. DEFB1 também causou a indução rápida de apoptose mediada por caspase. Os dados aqui apresentados são os primeiros a fornecer evidências de seu papel na imunidade tumoral inata e indicam que sua perda contribui para a progressão do tumor no câncer da próstata.

Materiais e métodos

Linhagens celulares: as linhagens de células DU145 foram cultivadas em meio DMEM, PC3 cresceram em meio F12, e LNCaP cresceram em meio RPMI (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). O meio de crescimento para todas as três linhagens foi suplementado com soro bovino fetal 10% (v/v) (Life Technologies). As células hPrEC foram cultivadas em meio basal para o epitélio da próstata (Cambrex Bio Science, Inc., Walkersville, MD) . Todas as linhagens celulares foram mantidas a 37°C e CO2 5%.

Amostras de tecido e microdissecção por captura a laser: tecidos prostáticos obtidos de pacientes que autorizaram que foram submetidos à prostatectomia radical foram adquiridos do banco de tumor do "Hollings Câncer Center" de acordo com um protocolo aprovado pelo "Institutional Review Board". Esse incluía diretrizes quanto ao processamento, corte, caracterização histológica, purificação de RNA, e amplificação por PCR de amostras. Após exame patológico de cortes de tecido congelados, foi realizada a microdissecção por captura a laser (LCM) para assegurar que as amostras de tecido testadas consistiam em populações puras de células de próstata benignas. Para cada k15 corte de tecido analisado, a LCM foi realizada em três regiões diferentes contendo tecido benigno, e as células coletadas foram então reunidas em um pool.

Clonagem do gene de DEFBl: cDNA de DEFBl foi gerado- por RNA por transcrição reversa-PCR. Os iniciadores de PCR foram projetados para conter sítios de restrição de ClaI e KpnI. Os produtos de PCR de DEFBl foram digeridos por restrição com ClaI e KpnI e ligados em um vetor de clonagem TA. 0 vetor TA/DEFB1 foi então transfectado em E. coli por choque térmico e clones individuais foram selecionados e expandidos. Foram isolados plasmídeos por "Cell Culture DNA Midiprep" (Qiagen, Valencia, CA), e a integridade de seqüência verificada por seqüenciamento automatizado. 0 fragmento do gene de DEFBl foi então ligado no pTRE2 digerido com ClaI e KpnI, que serviu como um vetor intermediário para fins de orientação. A seguir, a construção pTRE2/DEFBl foi digerida com ApaI e KpnI para remover o inserto de DEFBl, que foi ligado no vetor pIND do Sistema de Expressão Indutível Ecdysone (Invitrogen, Carlsbad, CA), também digerido duplamente com ApaI e KpnI.

A construção foi transfectada novamente em E. coli, e clones individuais foram selecionados e expandidos. Plasmídeos foram isolados e a integridade de seqüência de pIND/DEFBl foi novamente verificada por seqüenciamento automatizado.

Transfecção: células (1 χ IO6) foram semeadas sobre placas de Petri de 100 mm e foram desenvolvidas de um dia para o outro. A seguir, as células foram co-transfectadas com o uso de Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) com 1 pg de plasmídeo pVgRXR, que expressa o receptor heterodimérico de ecdisona, e 1 pg da construção de DEFBl/vetor pIND ou vetor de controle vazio pIND em meio Opti-MEM (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY).

Isolamento de RNA e RT-PCR quantitativa: a fim de verificar a expressão da proteína DEFBl nas células transf ectadas com construção de DEFBlf o RNA foi coletado após um período de indução de 24 horas com Ponasterona A (Pon A) . Resumidamente, RNA total foi isolado com o uso do Sistema de Isolamento de RNA Total SV (Promega, Madison, WI) de aproximadamente 1 χ IO6 células coletadas por tripsinização. Aqui, as células foram lisadas e o RNA total foi isolado por centrifugação por meio de colunas de centrifugação. Para as células coletadas por LCM, o RNA total foi isolado usando o Kit de Isolamento de RNA PicoPure (Arcturus Biosciences, Mt. View, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. 0 RNA total (0,5 pg por reação) de ambas as fontes foi transcrito de forma reversa em cDNA com a utilização de iniciadores aleatórios (Promega). A enzima Transcriptase Reversa II AMV (500 unidades por reação; Promega) foi usada para síntese da primeira fita e DNA Polimerase Tfl para a síntese da segunda fita (500 unidades por reação; Promega) de acordo com o protocolo do fabricante. Em cada caso, 50 pg de cDNA foram usados após a reação de PCR. QRT-PCR em duas etapas foi realizada no cDNA gerado usando a Transcriptase Reversa MultiScribe do Sistema de Transcrição Reversa TaqMan e o "SYBR Green PCR Master Mix" (Applied Biosystems).

O par de iniciadores para DEFBl (Tabela 2) foi gerado pela seqüência de DEFBl publicada (N° de Acesso no GenBank U5093 0). Quarenta ciclos de PCR foram realizados sob condições padronizadas usando uma temperatura de anelamento de 56°C. Além disso, β-actina (Tabela 2) foi amplificada como um gene de manutenção para normalizar o teor inicial de cDNA total. A expressão de DEFBl foi calculada como a proporção de expressão relativa entre DEFBl e β-actina e foi comparada em linhagens de células induzidas e não induzidas para expressão de DEFBl, bem como tecido prostático benigno por LCM. Como controle negativo, também foram realizadas reações de QRT-PCR sem modelo de cDNA. Todas as reações foram executadas três vezes em triplicata.

Ensaio de viabilidade celular de MTT: para examinar os efeitos de DEFBl sobre o crescimento celular, ensaios metabólicos de brometo 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difenil tetrazólio (MTT) foram realizados. Células PC3, DUl 4 5 e LNCaP co-transfectadas com plasmídeo pVgRXR e construção de pIND/DEFBl ou vetor pIND vazio foram semeadas sobre uma placa de 96 de poços a 1-5 χ IO3 células por poço. Vinte e quatro horas após a semeadura, foi adicionado meio de crescimento fresco contendo 10 μΜ de Ponasterona A diariamente para induzir a expressão de DEFBl por 24, 48 e 72 horas, e depois o ensaio de MTT foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (Promega). As reações foram realizadas três vezes em triplicata.

Citometria de fluxo: células PC3 e DU145 co- transfectadas com o sistema de expressão de DEFBl cresceram em placas de 60 mm e foram induzidas por 12, 24 e 48 horas com 10 μΜ de Ponasterona A. Após cada período de incubação, o meio foi coletado das placas (para reter quaisquer células destacadas) e combinado com o PBS usado para lavar as placas. As células anexadas restantes foram coletadas por tripsinização e combinadas com as células destacadas e PBS. As células foram então peletizadas a 40C (500 χ g) por 5 minutos, lavadas duas vezes em PBS, e ressuspensas em 100 μl de tampão de ligação Ix Anexina (0,1 M de Hepes/NaOH em pH 7,4, 1,4 M de NaCl, 25 mM de CaCl2) contendo 5 μl de Anexina V-FITC e 5 μl de PI. As células foram incubadas em temperatura ambiente por 15 minutos no escuro, então diluídas com 400 μl de tampão de ligação Ix Anexina e analisadas por FACscan (Becton Dickinson, San Jose, CA) . Todas as reações foram realizadas três vezes.

Análise microscópica: a morfologia celular foi analisada por microscopia por contraste de fase. Células DU14 5, PC3 e LNCaP sem vetor, plasmídeo vazio ou plasmídeo de DEFBl foram semeadas sobre placas de cultura de 6 poços (BD Falcon, EUA) . No dia seguinte, as células contendo plasmídeo foram induzidas por um período de 4 8 horas com meio contendo 10 μΜ de Ponasterona A, enquanto as células de controle receberam meio fresco. As células foram então visualizadas sob um microscópio invertido Zeiss IM 35 (Carl Zeiss, Alemanha) . As imagens de contraste de fase de um campo de células foram obtidas usando a câmera SPOT Insight Mosaic 4.2 (Diagnostic Instruments, EUA). As células foram examinadas por microscopia por contraste de fase sob ampliação de 32X, e as imagens digitais foram armazenadas como arquivos TIFF não compactados e exportadas no software Photoshop CS (Adobe Systems, San Jose, CA) para processamento de imagem e apresentação impressa.

Detecção de caspase

A detecção da atividade de caspase nas linhagens de células de câncer da próstata foi realizada usando o kit de detecção de caspase de Carboxifluoresceina APO LOGIXTM (Cell Technology, Mountain View, CA) . As caspases ativas foram detectadas por meio da utilização de um inibidor FAM- VAD-FMK que se liga irreversivelmente às caspases ativas. Resumidamente, células DU145 e PC3 (1,5-3 X IO5) contendo o sistema de expressão de DEFBl foram plaqueadas em placas de micropoço com fundo de vidro de 35 mm (Matek, Ashland, MA) e tratadas por 24 horas somente com meio ou com meio contendo PonA, como descrito previamente. A seguir, 10 μΐ de uma diluição de trabalho de 3OX de peptídeo fluormetil cetona marcado com carboxifluoresceina (FAM-VAD-FMK) foram adicionados a 3 00 μΐ de meio e adicionados a cada placa de 35 mm. As células foram então incubadas por 1 hora a 37°C sob CO2 5%. A seguir, o meio foi aspirado e as células foram lavadas duas vezes com 2 ml de uma diluição de trabalho IX de tampão de lavagem. As células foram visualizadas sob contraste por interferência diferencial (DIC) ou sob excitação por laser a 488 nm. O sinal fluorescente foi analisado usando um microscópio confocal (Zeiss LSM 5 Pascal) e uma lente de óleo 63X DIC com um Módulo de Varredura de Laser Vario 2 RGB.

Análise estatística

As diferenças estatísticas foram avaliadas usando o teste t de Student para valores não pareados. Os valores P foram determinados por um cálculo two-sided, e um valor P de menos que 0,05 era considerado estatisticamente significante.

Resultados

Expressão de DEFBl em tecido e linhagens de células da próstata: os níveis de expressão de DEFBl foram medidos por QRT-PCR em tecido prostático benigno e maligno, células epiteliais da próstata hPrEC, e células DU145, PC3 e LNCaP de câncer da próstata. A expressão de DEFBl foi detectada em todas as amostras clínicas benignas. A quantidade média de expressão relativa de DEFBl foi 0,0073. Além disso, a expressão relativa de DEFBl em células hPrEC foi de 0,0089. Não houve diferença estatística na expressão de DEFBl detectada nas amostras de tecido prostático benigno e hPrEC (Figura IA). A análise dos níveis relativos de expressão de DEFBl nas linhagens de células de câncer da próstata revelou níveis significativamente menores em DU145, PC3 e LNCaP. Como um ponto de referência adicional, a expressão relativa de DEFBl foi medida no corte maligno adjacente de tecido prostático do paciente #1215. Não houve diferenças significativas no nível de expressão de DEFBl observado nas três linhagens de câncer da próstata, comparado com tecido prostático maligno do paciente #1215 (Figura 1B). Além disso, os níveis de expressão em todas as quatro amostras foram próximos aos dos controles negativos sem modelo, o que confirmou pouca a nenhuma expressão endógena de DEFBl (dados não mostrados). QRT-PCR também foi realizada nas linhagens de células de câncer da próstata transfectadas com o sistema de expressão de DEFBl. Após um período de indução de 24 horas, os níveis relativos de expressão foram de 0,01360 em DU145, 0,01503 em PC3, e 0,138 em LNCaP. Os produtos de amplificação foram verificados por eletroforese em gel.

QRT-PCR foi realizada em regiões de tecidos LCM contendo benigno, PIN e câncer. A expressão relativa de DEFBl foi de 0,0146 na região benigna, comparada com 0,0009 3-5 na região maligna (Figura 1C.). Isso representa uma diminuição de 94%, o que demonstra novamente uma infra- regulação significativa da expressão. Além disso, a análise de PIN revelou que o nível de expressão de DEFBl foi de 0,044, o que eqüivale a uma diminuição de 70%. A comparação da expressão no paciente #1457 com o nível médio de expressão encontrado em regiões benignas de seis outros pacientes (Figura IA) revelou uma proporção de 1,997, que representa quase o dobro de expressão (Figura ID.). No entanto, a proporção de expressão foi de 0,0595 em PIN e de 0,125 em tecido maligno, comparado com os níveis médios de expressão em tecido benigno.

DEFB1 causa permeabilidade e desordenamento da membrana celular: a indução de DEFB1 nas linhagens de células de câncer da próstata resultou em uma redução significativa no número de células em DU145 e PC3, mas não teve nenhum efeito sobre a proliferação celular em LNCaP (Figura 2). Como controle negativo, a proliferação celular foi monitorada em todas as três linhagens que contêm plasmídeo vazio. Não houve alterações observáveis na morfologia celular em células DU145, PC3 ou LNCaP após a adição de PonA. Além disso, a indução de DEFBl resultou em alterações morfológicas tanto em DU145 quanto em PC3. Aqui, as células pareciam mais arredondadas e exibiam desordenamento da membrana indicativa de morte celular. Corpos apoptóticos também estavam presentes em ambas as linhagens.

Expressão de DEFBl resulta em viabilidade celular diminuída: o ensaio de MTT mostrou uma redução na viabilidade celular por DEFBl em células PC3 e DU145, mas nenhum efeito significativo sobre células LNCaP (Figura 3). Após 24 horas, a viabilidade celular relativa era de 72% em DUl45 e 56% em PC3. A análise 48 horas após indução revelou 49% de viabilidade celular em DU145 e 37% de viabilidade celular em PC3. Após 72 horas de expressão de DEFBl, havia 44% e 29% de viabilidade celular relativa em células DU145 e PC3, respectivamente.

DEFBl causa apoptose rápida mediada por caspase em células câncer da próstata em estágio tardio: a fim de determinar se os efeitos de DEFBl sobre PC3 e DU145 eram citostáticos ou citotóxicos, a análise FACS foi realizada. Sob condições normais de crescimento, mais do que 90% das culturas de PC3 e DU145 eram viáveis e não apoptóticas (quadrante inferior esquerdo) e não coravam com anexina V ou PI (Figura 4) . Após indução da expressão de DEFBl em células PC3, o número de células apoptóticas (quadrantes inferior e superior direitos) totalizou 10% em 12 horas, 20% em 24 horas e 44% em 48 horas. Para células DU145, o número de células apoptóticas totalizou 12% após 12 horas, 34% em 24 horas e 59% após 4 8 horas de indução. Não houve aumento na apoptose observada em células contendo plasmídeo vazio após indução com PonA (dados não mostrados).

A atividade de caspase foi determinada por análise microscópica por laser confocal (Figura 5). Células DU145 e PC3 foram induzidas para expressão de DEFBl, e a atividade foi monitorada com base na ligação de FAM-VAD-FMK verde fluorescente às caspases em células que passam ativamente por apoptose. A análise de células sob DIC mostrou a presença de células DU145 (A) , PC3 (E) e LNCaP (I) viáveis de controle a 0 horas. Excitação pelo laser confocal a 488 nm não produziu coloração verde detectável, o que indica ausência de atividade de caspase em DU145 (B) , PC3 (F) ou LNCaP (J) . Após indução por 24 horas, células DU145 (C) , PC3 (G) e LNCaP (K) eram novamente visíveis sob DIC. A análise confocal sob fluorescência revelou coloração verde em células DU145 (D) e PC3 (H) , indicando atividade de caspase. No entanto, não havia coloração verde em LNCaP (L)i indicando ausência de indução de apoptose por DEFBl.

Conclusão

Para avaliar seu papel funcional, o gene de DEFBl foi clonado no sistema de expressão indutível de ecdisona e seu efeito sobre células de câncer da próstata examinado. Os presentes dados demonstram atividade citotóxica de DEFBl contra células de câncer da próstata em estágio tardio receptor de androgênio-negativas e hormônio-refratárias. Em conclusão, este estudo apresenta o papel funcional de DEFBl no câncer da próstata. Além disso, esses achados mostram que DEFBl é parte de um sistema imunológico inato envolvido na imunidade tumoral. Os dados aqui apresentados demonstram que DEFBl expresso em níveis fisiológicos é citotóxico para células de câncer da próstata AR" hormônio-refratárias, mas não para células de câncer da próstata AR+ hormônio- sensíveis, nem para células epitêliais da próstata normal. Considerando que DEFBl é expresso constitutivamente em células normais da próstata sem citotoxicidade, pode ser que células de câncer da próstata em estágio tardio AR" possuam características fenotípicas distintas que as tornam sensíveis à citotoxicidade de DEFBl. Dessa forma, DEFBl é um agente terapêutico viável para o tratamento de câncer da próstata em estágio tardio.

2. Exemplo 2: Knockdown mediado por siRNA da expressão de PAX2 resulta na morte de células de câncer da próstata, independente do estado de p53

Resumo

Este exemplo examina os efeitos da inibição da expressão de PAX2 por interferência de RNA em células de câncer da próstata que diferem no estado do gene p53. Esses resultados demonstram que a inibição de PAX2 resulta em morte celular independentemente do estado de p53, indicando que há genes supressores de tumor ou vias de morte celular adicionais inibidos por PAX2 no câncer da próstata.

Materiais e métodos

Linhagens celulares: as linhagens de células PC3, DU14 5 e LNCaP foram obtidas da "American Type Culture Collection" (Rockville, MD, EUA) . As célula PC3 cresceram em meio F-12, DU14 5 em DMEM, e LNCaP em RPMI, todos suplementados com soro bovino fetal 10% (v/v). As células foram mantidas a 37°C em CO2 5%.

Silenciamento siRNA de PAX 2: a fim de se obter silenciamento gênico eficiente, um pool de quatro ribonucleotídeos intervenientes curtos complementares (siRNAs) direcionados ao mRNA de PAX2 humano (N° de Acesso NM_003989.1) foi sintetizado (Dharmacon Research, Lafayette, CO, EUA) . Um segundo pool de quatro siRNAs foi usado como controle interno para testar a especificidade de siRNAs de PAX2. Duas das seqüências sintetizadas visam o mRNA de luciferase GL2 (N° de Acesso X65324) , e duas eram seqüência-não-específicas (Tabela 3). Para o anelamento de siRNAs, 35 M de fitas simples foram incubados em tampão de anelamento (100 mM de acetato de potássio, 30 mM de HEPES- :L5 KOH era pH 7,4, 2 mM de acetato de magnésio) por 1 minuto a 90°C, seguido por incubação por 1 hora a 37°C.

Análise Western: resumidamente, as células foram coletadas por tripsinização e lavadas duas vezes com PBS. Tampão de lise foi preparado de acordo com as instruções do fabricante (Sigma), e foi então adicionado às células. Após um período de incubação de 15 minutos a 4 °C em uma agitadora orbital, os lisados celulares foram então coletados e centrifugados por 10 minutos a 12.000 xg para peletizar os restos celulares. Os sobrenadantes contendo proteína foram então coletados e quantificados. A seguir, 25 pg de extrato de proteína foram carregados em uma SDS- PAGE com gradiente de 8-16% (Novex) . Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF, e então bloqueadas com leite em pó desnatado 5% em TTBS (Tween 20 0,05% e 100 mM de Tris-Cl) por 1 hora. Os blots foram então sondados com anticorpo primário de coelho anti- PAX2 (Zymed, San Francisco, CA) em uma diluição de 1:2.000. Após lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpo anti-coelho conjugado à peroxidase de raiz forte (HRP) (diluição 1:5.000; Sigma), e a detecção de sinal foi visualizada com o uso de reagentes de quimioluminescência (Pierce) em um Alpha Innotech Fluorchem 8900. Como controle, os blots foram removidos e re-sondados com anticorpo primário de camundongo anti-β-actina (1:5.000; Sigma-Aldrich) e anticorpo secundário anti-camundongo conjugado à HRP (1:5.000; Sigma-Aldrich), e a detecção de sinal foi novamente visualizada.

Microscopia por contraste de fase: o efeito do knockdown de PAX2 sobre o crescimento celular foi analisado por microscopia por contraste de fase. Aqui, 1-2 χ IO4 células foram semeadas sobre placas de cultura de 6 poços (BD Falcon, EUA) . No dia seguinte, as células foram tratadas somente com meio, siRNA inespecífico de controle negativo ou siRNA de PAX2, e permitiu-se a incubação por seis dias. As células foram então visualizadas sob um microscópio invertido Zeiss IM 35 (Carl Zeiss, Alemanha) em um aumento de 32x. As imagens de contraste de fase de um campo de células foram obtidas usando a câmera SPOT Insight Mosaic 4.2 (Diagnostic Instruments, EUA).

Ensaio de citotoxicidade com MTT: células DU145, PC3 e LNCaP (1 χ IO5) foram transfectadas com 0,5 pg do pool de siRNA de PAX2 ou pool de siRNA de controle usando o reagente de transfecção Codebreaker de acordo com o protocolo do fabricante (Promega). A seguir, as suspensões de células foram diluídas e semeadas sobre uma placa de 96 poços a 1-5 x 10^3 células por poço, e permitiu-se o crescimento por 2, 4 ou 6 dias. Após cultura, a viabilidade celular foi determinada por medida da conversão de brometo de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difenil tetrazólio, MTT (Promega), em um produto de formazano colorido. A absorbância foi lida a 540 nm em um espectrofotômetro de varredura multipoços.

Pan-detecção de caspa.se: a detecção da atividade de caspase nas linhagens de células de câncer da próstata foi realizada usando o kit de detecção de caspase de Carboxifluoresceína APO L0GIXTM (Cell Technology, Mountain View, CA). As caspases ativas foram detectadas por meio da utilização de um inibidor FAM-VAD-FMK que se liga irreversivelmente às caspases ativas. Resumidamente, células (1-2 X IO4) foram plaqueadas sobre placas de micropoço com fundo de vidro de 35 mm (Matek, Ashland, MA) e tratadas somente com meio ou siRNA de PAX2, como descrito previamente. A seguir, 10 μl de uma diluição de trabalho de 30X de peptideo fluormetil cetona marcado com carboxifluoresceína (FAM-VAD-FMK) foram adicionados a 300 μl de meio e adicionados a cada placa de 35 mm. As células foram então incubadas por 1 hora a 37°C sob CO2 5%. A seguir, o meio foi aspirado e as células foram lavadas duas vezes com 2 ml de uma diluição de trabalho IX de tampão de lavagem. As células foram visualizadas sob contraste por interferência diferencial (DIC) ou sob excitação por laser a 488 nm. O sinal fluorescente foi analisado usando um microscópio confocal (Zeiss LSM 5 Pascal) e uma lente de óleo 63X DIC com um Módulo de Varredura de Laser Vario 2 RGB. RT-PCR quantitativa em tempo real: RT-PCR quantitativa em tempo real foi realizada a fim de verificar a expressão gênica após tratamento com siRNA de linhagens de células PAX2 em PC3, DU145 e LNCaP. O RNA total foi isolado com o uso do Sistema de Isolamento de RNA Total SV (Promega). Resumidamente, aproximadamente 1 x IO6 células foram coletadas por tripsinização e enxaguadas em PBS. As células foram então lisadas e o RNA total foi isolado por centrifugação por meio de colunas de centrifugação. O RNA total (0,5 pg por reação) foi transcrito de forma reversa em cDNA com a utilização do iniciador Oligo (dT) 15 (Promega) e a enzima Transcriptase Reversa II AMV (500 unidades por reação; Promega) para a síntese da primeira fita, e DNA Polimerase Tfl para a síntese da segunda fita (500 unidades por reação; Promega) , de acordo com o protocolo do fabricante, com amostras de controle idênticas tratadas sem a enzima RT. Tipicamente, 50 pg de cada cDNA foram usados após a reação de PCR. QRT-PCR em duas etapas foi realizada no cDNA gerado usando a Transcriptase Reversa MultiScribe do Sistema de Transcrição Reversa TaqMan e o "SYBR Green PCR Master Mix" (PE Biosystems). Os pares de iniciadores para ΒΑΧ, BID e BAD foram gerados a partir das seqüências publicadas (Tabela 3). As reações foram realizadas em uma Placa de Reação de 96 poços MicroAmp Optical (PE Biosystems). Quarenta ciclos de PCR foram realizados sob condições padronizadas usando uma temperatura de anelamento de 60°C. A quantificação foi determinada pelo número do ciclo em que a amplificação exponencial se iniciou (valor-limite), e foi obtida a média dos valores obtidos das repetições em triplicata. Houve um relacionamento inverso entre o nível de mensagem e o valor- limite. Além disso, GAPDH foi usado como um gene de manutenção para normalizar o teor inicial de cDNA total. A expressão gênica foi calculada como a proporção de expressão relativa entre os genes pró-apoptóticos e GAPDH.

Todas as reações foram feitas em triplicata.

Resultados

Inibição de siRNA de proteína PAX2: a fim de confirmar que o siRNA visou eficazmente o mRNA de PAX2, foi realizada a análise Western para monitorar os níveis de expressão de proteína PAX2 ao longo de um período de tratamento de seis dias. As células passaram por uma única rodada de transfecção com o pool de siRNA de PAX2. Os resultados confirmaram direcionamento específico de mRNA de PAX2 ao mostrar knockdown de proteína PAX2 por volta do 4° dia em DU145 (Figura 6a) e por volta do 6o dia em PC3 (Figura 6b).

Knock-down de PAX2 inibe o crescimento de células de câncer da próstata: as células foram analisadas após um período de tratamento de seis dias somente com meio, siRNA inespecífico de controle negativo ou siRNA de PAX2 (Figura 7). As células DU145 (a), PC3 (d) e LNCaP (g) alcançaram pelo menos 90% de confluência nas placas de cultura que contêm apenas meio. O tratamento de DU145 (b), PC3 (e) e LNCaP (h) com siRNA inespecífico de controle negativo não teve nenhum efeito sobre crescimento celular, e as células alcançaram novamente a confluência após seis dias. No entanto, o tratamento com siRNA de PAX2 resultou em uma diminuição significativa no número de células. As células DU14 5 eram aproximadamente 15% confluentes (c), e as células PC3 eram apenas 10% confluentes (f). As células LNCaP foram 5% confluentes após o tratamento com siRNA.

Ensaios de citotoxicidade: a viabilidade celular foi medida após tempos de exposição de dois, quatro e seis dias, e é expressa como uma proporção da absorbância a 570- 63 0 nm de células tratadas dividida por aquela das células não tratadas de controle (Figura 8) . A viabilidade celular relativa após 2 dias de tratamento foi de 77% em LNCaP, 82% em DU145 e 78% em PC3. Após quatro dias, a viabilidade celular relativa era de 46% em LNCaP, 53% em DU145 e 63% em PC3. Após seis dias de tratamento, a viabilidade celular relativa diminuiu para 31% em LNCaP, 37% em PC3, e era de 53% em DU145. Como controles negativos, a viabilidade celular foi medida após um período de tratamento de seis dias com siRNA inespecífico de controle negativo ou reagente de transfecção isoladamente. Para ambas as condições, não houve alteração estatisticamente significante na viabilidade celular, comparada com meio de crescimento normal.

Pan-Detecção de caspase: a atividade de caspase foi detectada por análise microscópica por laser confocal. Células DU145, PC3 e LNCaP foram tratadas com siRNA de PAX2 e a atividade foi monitorada com base na ligação de peptídeo marcado com FAM às caspases em células que passam ativamente por apoptose que irão apresentar fluorescência verde. A análise de células somente com meio sob DIC mostra a presença de células DU145 (A) , PC3 (E) e LNCaP (I) viáveis em 0 hora (Figura 9) . A excitação pelo laser confocal a 488 nm não produziu coloração verde detectável, o que indica ausência de atividade de caspase em células DUl45 (B), PC3 (F) ou LNCaP (J) não tratadas. Após quatro dias de tratamento com siRNA de PAX2, células DU145 (C), PC3 (G) e LNCaP (K) eram novamente visíveis sob DIC. Sob fluorescência, as células DU145 (D) , PC3 (H) e LNCaP (L) tratadas apresentavam coloração verde, indicando atividade de caspase.

Efeito da inibição de PAX2 sobre fatores pró- apoptóticos

Células DUl4 5, PC3 e LNCaP foram tratadas com siRNA contra PAX2 por seis dias, e a expressão de genes pró- apoptóticos dependente e independente da regulação da transcrição de p53 foi medida para monitorar as vias de morte celular. Para ΒΑΧ, houve um aumento de 1,81 vez em LNCaP, um aumento de 2,73 vezes em DU145 e um aumento de 1,87 vez em PC3 (Figura 10a). Os níveis de expressão de BID aumentaram em 1,3 8 vez em LNCaP e 1,7 7 vez em DUl45 (Figura 10b) . No entanto, os níveis de expressão de BID diminuíram em 1,44 vez em PC3 após o tratamento (Figura 10c) . A análise de BAD revelou um aumento de 2,0 vezes na expressão; em LNCaP, um aumento de 1,3 8 vez em DU14 5 e um aumento de 1,58 vez em PC3.

Conclusão

Apesar de avanços significativos na terapia do câncer, ainda há pouco progresso no tratamento de doença avançada. O tratamento farmacológico bem sucedido de câncer da próstata exige o uso de substâncias terapêuticas com efeitos específicos sobre células-alvo, mantendo, ao mesmo tempo, efeitos clínicos mínimos sobre o hospedeiro. 0 objetivo da terapia do câncer é desencadear morte celular tumor-seletiva. Portanto, a compreensão dos mecanismos dessa morte é crucial na determinação da eficácia de um tratamento específico.

A dependência da sobrevida da célula de câncer da próstata sobre a expressão de PAX2 é aqui demonstrada. A fim de distinguir entre a morte observada na linhagem de células LNCaP que expressam p53, na linhagem DU145 p53- mutada e na linhagem PC3 p53-null, foram examinados os eventos downstream que se seguem à ativação de p53, em conseqüência do knockdown de PAX2. A atividade de caspase foi detectada em todas as três linhagens, o que é indicativo da iniciação de morte celular programada. Com isso, foram examinadas as alterações da expressão de genes pró-apoptóticos. Aqui, a expressão de BAX estava supra- regulada em todas as três linhagens de células, independente do estado de p53. A expressão do fator pró- apoptótico BAD estava aumentada em todas as três linhagens após inibição de PAX2. Após o tratamento com siRNA de PAX2, a expressão de BID estava aumentada em LNCaP e DU145, mas na verdade diminuiu em PC3. Isso indica que a morte celular observada no câncer da próstata é influenciada pela expressão de p53, mas não é dependente dela. A iniciação da apoptose em células de câncer da próstata por meio de diferentes vias de morte celular, independentemente do estado de p53, indica que PAX2 inibe outros supressores de tumor.

Exemplo 3: Inibição do oncogene PAX2 resulta em morte mediada por DEFBl de células câncer da próstata

Resumo

A identificação de moléculas tumor-específicas que servem como alvos para o desenvolvimento de novos fármacos para o câncer é considerada como sendo um objetivo importante na pesquisa sobre o câncer. O Exemplo I demonstrou que há uma freqüência elevada de perda da expressão de DEFB1 no câncer da próstata, e que a indução da expressão de DEFB1 resulta em rápida apoptose no receptor de câncer da próstata em estágio tardio androgênio-negativo. Esses dados demonstram que DEFB1 tem participação na supressão do tumor dã próstata. Além disso, considerando que ele é um componente de ocorrência naturalmente do sistema imunológico do epitélio da próstata normal, espera-se que DEFB1 seja um agente terapêutico viável com pouco ou nenhum efeito colateral. O Exemplo II demonstrou que a inibição da expressão de PAX2 resulta na morte de células de câncer da próstata independente de p53. Esses dados indicam que há um fator pró-apoptótico ou supressor de tumor adicional que é inibido por PAX2. Além disso, os dados mostram que o fator oncogênico PAX2, que é superexpresso no câncer da próstata, é um repressor da transcrição de DEFB1. A finalidade deste estudo é determinar se a perda da expressão de DEFB1 é causada pela expressão aberrante do oncogene PAX2, e se a inibição de

PAX2 resulta em morte celular mediada por DEFB1.

Os dados mostram que a perda da expressão de DEFB1 ocorre no nível da transcrição. Além disso, a análise computacional do promotor de DEFB1 revelou a presença de um sítio de ligação de DNA GTTCC (ID. DE SEQ. N°: 2) para o repressor da transcrição de PAX2 próximo ao TATA box de DEFB1 (Figura 1). Os resultados aqui apresentados mostram que PAX2 e DEFB1 exibem vários atributos de alvos para câncer adequados, incluindo um papel na supressão de morte celular. Portanto, DEFB1 tem uma participação na imunidade tumoral, e sua expressão é modulada por meio de infra- regulação terapêutica do oncogene PAX2.

Materiais e métodos

Isolamento de RNA e RT-PCR quantitativa: a fim de verificar alterações nos níveis de expressão de DEFBl, RNA foi coletado após 4 dias de tratamento com siRNA de PAX 2. Resumidamente, RNA total foi isolado com o uso do Sistema de Isolamento de RNA Total SV (Promega, Madison, WI) de aproximadamente 1 χ 106 células coletadas por tripsinização. Aqui, as células foram lisadas e o RNA total foi isolado por centrifugação por meio de colunas de centrifugação. O RNA total (0,5 pg por reação) de ambas as fontes foi transcrito de forma reversa em cDNA com a utilização de iniciadores aleatórios (Promega). A enzima Transcriptase Reversa II AMV (500 unidades por reação; Promega) foi usada para síntese da primeira fita, e DNA Polimerase Tfl foi utilizada para a síntese da segunda fita (50 0 unidades por reação; Promega), de acordo com o protocolo do fabricante. Em cada caso, 50 pg de cDNA foram usados após a reação de PCR. QRT-PCR em duas etapas foi realizada no cDNA gerado usando a Transcriptase Reversa MultiScribe do Sistema de Transcrição Reversa TaqMan e o "SYBR Green PCR Master Mix" (Applied Biosystems).

O par de iniciadores para DEFBl foi gerado pela seqüência de DEFBl publicada (N° de Acesso U50930). Quarenta ciclos de PCR foram realizados sob condições padronizadas usando uma temperatura de anelamento de 56 °C. Além disso, GAPDH foi amplificada como um gene de manutenção para normalizar o teor inicial de cDNA total. A expressão de DEFBl foi calculada como a proporção de expressão relativa entre DEFBl e GAPDH, e foi comparada em linhagens de células antes e depois de knockdown siRNA da expressão de PAX2. Todas as reações foram executadas três vezes em triplicata.

Geração da construção repórter de DEFBl: o plasmídeo repórter de luciferase pGL3 foi usado para monitorar a atividade repórter de DEFBl. Aqui, uma região de 16 0 bases upstream do sítio de iniciação da transcrição de DEFBl e incluía a TATA box de DEFBl. A região também incluía a seqüência GTTCC (ID. DE SEQ. N°: 2), que é necessária para ligação de PAX2. Os iniciadores de PCR foram projetados para conter sítios de restrição de KpnI e NheI. Os produtos de PCR do promotor de DEFBl foram digeridos por restrição de KpnI e NheI e ligados em um plasmídeo pGL3 digerido por restrição de forma similar (Figura 2) . As construções foram transfectadas em E. coli, e clones individuais foram selecionados e expandidos. Os plasmídeos foram isolados e a integridade de seqüência da construção DEFBl/pGL3 foi verificada por seqüenciamento automatizado.

Ensaio de repórter de luciferase: aqui, 1 pg da construção repórter de DEFBl ou do plasmídeo pGL3 de controle foi transfectado em 1 x 10^6 células DU145. A seguir, 0,5 x 10^3 células foram semeadas sobre cada poço de uma placa de 96 de poços, e permitiu-se o crescimento de um dia para o outro. A seguir, foi adicionado meio fresco contendo siRNA de PAX2 ou somente meio, e as células foram incubadas por 48 horas. A luciferase foi detectada pelo kit BrightGlo de acordo com o protocolo do fabricante (Promega) , e as placas foram lidas em um luminômetro automatizado de 96 poços Veritas. A atividade do promotor era expressa como luminescência relativa.

Análise de permeabilidade da membrana: foi realizada a coloração dupla com Acridina laranja (AO)/brometo de etidio (EtBr) para identificar alterações na integridade da membrana celular, bem como células apoptóticas por coloração da cromatina condensada. AO cora células viáveis, assim como células apoptóticas iniciais, enquanto EtBr cora células apoptóticas em estágio tardio que perderam a permeabilidade da membrana. Resumidamente, as células foram semeadas em lâminas de cultura de 2 câmaras (BD Falcon, EUA) . As células transfectadas com plasmídeo vazio pIND/pvgRXR ou pIND DEFBl/pvgRXR foram induzidas por 24 ou 48 horas com meio contendo 10 μΜ de Ponasterona A. Células de controle receberam meio fresco em 24 e 48 horas. A fim de determinar o efeito de inibição de PAX2 sobre a integridade da membrana, lâminas de cultura separadas contendo DU14 5, PC3 e LNCaP foram tratadas com siRNA de PAX2 e incubadas por 4 dias. Após isso, as células foram lavadas uma vez com PBS e coradas com 2 ml de uma solução (1:1) de uma mistura de AO (Sigma, EUA) e EtBr (Promega, EUA) (5 pg/ml) por 5 minutos. Após a coloração, as células foram lavadas novamente com PBS. A fluorescência foi visualizada por um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM 5 Pascal Vario 2 (Carl Zeiss Jena, Alemanha) . A roda de cor de excitação contém filtros de bloqueio BS505-530 (verde) e LP560 (vermelho) que permitem a separação de luz verde emitida por AO no canal verde e luz vermelha por EtBr no canal vermelho. Os ajustes de saída de potência do laser e de controle de ganho dentro de cada experimento individual foram idênticos entre células induzidas por controle e por DEFBl. A excitação foi fornecida por um laser a gás misto Kr/Ar em comprimentos de onda de 543 nm para AO e 4 88 nm para EtBr. As lâminas foram analisadas sob ampliação de 4OX e as imagens digitais foram armazenadas como arquivos TIFF não compactados e exportadas no software Photoshop CS (Adobe Systems, San Jose, CA) para processamento de imagem e apresentação impressa.

Anál ise ChIP de PAX2: a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) permite a identificação de sítios de ligação para proteínas de ligação de DNA com base na ocupação in vivo de um promotor por um fator de transcrição e enriquecimento de cromatina ligada ao fator de transcrição por imunoprecipitação. Foi usada uma modificação do protocolo descrito pelo laboratório Farnham; também online em http://mcardle.oncology.wisc.edu/farnham/. As linhagens de células DUl45 e PC3 superexpressam a proteína PAX2, mas não expressam DEFBl. As células foram incubadas com PBS contendo formaldeído 1,0% por 10 minutos para entrecruzar as proteínas ao DNA. As amostras foram então sonifiçadas para gerar DNA com um comprimento médio de 60 0 bp. A cromatina sonificada pré-clareada com Dynabeads de Proteína A foi incubada com anticorpo PAX2-específico ou controle "sem anticorpo" [anticorpos de controle com isótipos combinados]. Os imunoprecipitados lavados foram então coletados. Após reversão dos entrecruzamentos, o DNA foi analisado por PCR usando iniciadores promotor-específicos para determinar se DEFBl está representado nas amostras PAX2-imunoprecipitadas. Foram projetados iniciadores para amplificar a região de 160 bp imediatamente upstream do sítio de iniciação de mRNA de DEFBl que continha a TATA box de DEFBl e o sítio de reconhecimento de PAX2funcional GTTCC (ID. DE SEQ. N°: 2). Para esses estudos, controles positivos incluíram PCR de uma alíquota da cromatina de entrada (antes da imunoprecipitação, mas com entrecruzamentos revertidos). Todas as etapas foram realizadas na presença de inibidores de protease.

Resultados

Inibição de siRNA de PAX2 aumenta a expressão de DEFBl: a análise por QRT-PCR da expressão de DEFBl antes do tratamento com siRNA revelou níveis relativos de expressão de 0,00097 em DU145, 0,00001 em PC3 e 0,00004 em LNCaP (Figura 13) . Após knockdown siRNA de PAX2, a expressão relativa foi de 0,03294 (aumento de 338 vezes) em DU145, 0,00020 (aumento de 22,2 vezes) em PC3 e 0,00019 (aumento de 4,92 vezes) em LNCaP. Como controle negativo, a linhagem de células epiteliais da próstata humana (hPrEC), que é null para PAX2, revelou níveis de expressão de 0,00687 antes do tratamento e 0,00661 após o tratamento com siRNA, confirmando ausência de alteração estatística na expressão de DEFBl.

DEFBl causa permeabilidade da membrana celular: a integridade da membrana foi monitorada por análise confocal (Figura 14). Aqui, células intactas são coradas em verde em função da AO, que é permeável à membrana. Além disso, as células com membranas plasmáticas comprometidas recebem a coloração vermelha por EtBr, que é impermeável à membrana. Aqui, células DU145 (A) e PC3 (D) não induzidas coraram positivamente com AO e emitiram cor verde, mas não coraram com EtBr. No entanto, a indução de DEFBl tanto em DU145 (B) quanto em PC3 (E) resultou no acúmulo de EtBr no citoplasma em 24 horas, indicado pela coloração vermelha. Em torno de 48 horas, DU145 (C) e PC3 (F) possuíam núcleos condensados e apareciam amarelas, o que era causado pela presença de coloração tanto verde quanto vermelha resultante do acúmulo de AO e EtBr, respectivamente.

Inibição de PAX2 resulta em permeabilidade da membrana: as células foram tratadas com siRNA de PAX2 por 4 dias, e a integridade da membrana foi monitorada novamente por análise confocal. Aqui, tanto DU145 quanto PC3 possuíam núcleos condensados e apareciam amarelas. No entanto, o citoplasma e os núcleos das células LNCaP permaneceram verdes após tratamento com siRNA. Além disso, a coloração vermelha na periferia da célula indica a manutenção da integridade da membrana celular. Esses achados indicam que a inibição de PAX2 resulta em morte celular mediada especificamente por DEFBl em DU145 e PC3, mas não em células LNCaP. A morte observada em LNCaP é causada pela transativação do p53 do tipo selvagem existente em LNCaP após inibição de PAX2.

Inibição de siRNA de PAX2 aumenta a atividade do promotor de DEFBl: a análise da atividade do promotor de DEFBl em células DU145 contendo a construção DEFBl/pGL3 revelou um aumento de 2,65 vezes em unidades relativas de luz após 4 8 horas de tratamento, comparadas com células não tratadas. Nas células PC3, houve um aumento de 3,78 vezes em unidades relativas de luz, comparadas com células não tratadas.

PAX2 se liga ao promotor de DEFBl: a análise ChIP foi realizada em células DU145 e PC3 para determinar se o repressor da transcrição de PAX2 está ligado ao promotor de DEFBl (Figura 15) . A Raia 1 contém um marcador com peso molecular de 100 bp. A Raia 2 é um controle positivo que representa uma região do promotor de DEFBl de 16 0 bp amplificada por DU14 5 antes do entrecruzamento e da imunoprecipitação. A Raia 3 é um controle negativo que representa PCR realizada sem DNA. As Raias 4 e 5 são controles negativos que representam PCR de imunoprecipitações realizadas com IgG pelo entrecruzamento de DU145 e PC3, respectivamente. A amplificação por PCR de 25 pg de DNA (linha 6 e 8) e 50 pg de DNA (linha 7 e 9) imunoprecitipitados com anticorpo anti-PAX2 após entrecruzamento mostra um fragmento de promotor de 160 bp em DU145 e PC3, respectivamente.

Conclusão

Os novos dados agora apresentados são os primeiros a revelar o papel de DEFBl na imunidade tumoral do câncer da próstata. Os dados também mostram que o fator oncogênico PAX2 suprime a expressão de DEFBl. Uma das características importantes da citotoxicidade da defensina é a ruptura da integridade da membrana. Os presentes resultados mostram que a expressão ectópica de DEFBl em células de câncer da próstata resulta em uma perda do potencial de membrana em conseqüência de membranas celulares comprometidas. O mesmo fenômeno é observado após inibição da expressão da proteína PAX2. A análise ChIP também foi realizada, e confirmou que PAX 2 está ligado ao promotor de DEFBl, o que resulta na repressão da expressão de DEFBl. Portanto, a supressão da expressão ou da função de PAX2 resulta no restabelecimento da expressão de DEFBl e subseqüentemente morte celular mediada por DEFBl. Além disso, os presentes dados estabelecem a utilidade de DEFBl como uma terapia dirigida para o tratamento do câncer da próstata através da imunidade inata.

3. Exemplo 4: Expressão de DEFB1 resulta em redução das dimensões do tumor

A habilidade antitumoral de DEFB1 é avaliada por injeção de células tumorais que superexpressam DEFBl em camundongos atímicos (nude). DEFB1 é clonado no vetor pBI- EGFP, que possui um promotor bidirecional responsável de tetraciclina. Foram geradas linhas de células Tet-Off por transfecção de pTet-Off em células DU145, PC3 e LNCaP e seleção com G418. O plasmideo pBI-EGFP-DEFBl é co- transfectado com pTK-Hyg nas linhagens de células Tet-off e selecionado com higromicina. São usadas apenas suspensões de células únicas com uma viabilidade >90%. Cada animal recebe aproximadamente 500.000 células administradas por via subcutânea no flanço direito de femeas de camundongos atímicos. Há dois grupos, um grupo de controle injetado com clones apenas de vetor e um grupo injetado com os clones que superexpressam DEFBl. Há 35 camundongos em cada grupo, como determinado por um estatístico. Os animais são pesados duas vezes por semana, o crescimento tumoral monitorado por compassos e os volumes tumorais determinados com o uso da seguinte fórmula: volume = 0,5 χ (largura)2 χ comprimento.

Todos os animais são sacrificados por overdose de CO2 quando o tamanho do tumor atinge 2 mm3 ou 6 meses após a implantação; os tumores são removidos, pesados e armazenados em formalina tamponada neutra para exame patológico. As diferenças no crescimento tumoral entre os grupos são caracterizadas descritivamente por meio de resumo dos dados estatísticos e representações gráficas. A significância estatística é avaliada cora o teste t ou equivalente não paramétrico.

4. Exemplo 5: Expressão de siRNA de PAX2 resulta em supra- regulação da expressão de DEFBl e redução das dimensões do tumor in vivo

OligonucIeotídeos de modelo hairpin de siRNA de PAX2 utilizados nos estudos in vitro são utilizados para examinar o efeito da supra-regulação da expressão de DEFBl in vivo. As fitas senso e anti-senso (veja a Tabela 3) são aneladas e clonadas em vetor de expressão de siRNA "pSilencer 2.1 U6 hygro" (Ambion) sob o controle do promotor humano de U6 RNA pol III. 0 plasmídeo clonado é seqüenciado, verificado e transfectado em linhagens de células PC3, DU145 e LNCaP. shRNA embaralhado é clonado e usado como controle negativo nesses estudo. As colônias resistentes à higromicina são selecionadas, as células são introduzidas nos camundongos por via subcutânea e o crescimento tumoral é monitorado como descrito acima. 5. Exemplo 6: A ligação de inibidores de pequena molécula de PAX2 resulta em supra-regulação da expressão de DEFBl e redução do volume do tumor in vivo

A seqüência de DNA de reconhecimento para a ligação de PAX2 reside no promotor de DEFBl entre os nucleotídeos -75 e -71 [ + 1 refere-se ao sítio de iniciação da transcrição] . Oligonucleotídeos curtos complementares ao domínio de ligação de DNA de PAX2 são fornecidos. Exemplos desses oligonucleotídeos incluem os oligonucleotídeos de 20-mer e 40-mer que contêm a seqüência de reconhecimento GTTCC (ID. DE SEQ. N°: 2) fornecida abaixo. Esses comprimentos foram selecionados aleatoriamente, e espera-se que outros comprimentos sejam eficazes bloqueadores de ligação. Como controle negativo, foram projetados oligonucleotídeos com uma seqüência embaralhada (CTCTG) (ID. DE SEQ. N°: 17) para verificar a especificidade. Os oligonucleotídeos são transfectados nas células de câncer da próstata e nas células HPrEC com reagente de lipofectamina ou reagente de transfecção Codebreaker (Promega, Inc) . A fim de confirmar interações DNA-proteína, oligonucleotídeos de fita dupla serão marcados com [32P] dCTP e são realizados ensaios eletroforéticos de alteração de mobilidade. Além disso, a expressão de DEFBl é monitorada por QRT-PCR e análise Western após o tratamento com oligonucleotídeos. Finalmente, a morte celular é detectada pelo ensaio de MTT e citometria de fluxo, como descrito previamente.

Seqüência de reconhecimento #1: CTCCCTTCAGTTCCGTCGAC (ID. DE SEQ. N0: 13)

Seqüência de reconhecimento #2: CTCCCTTCACCTTGGTCGAC (ID. DE SEQ. N°: 14) Seqüência embaralhada #1:

CTCCCTTCACTCTGGTCGAC (ID. DE SEQ. N°: 18) Seqüência de reconhecimento #3:

ACTGTGGCACCTCCCTTCAGTTCCGTCGACGAGGTTGTGC (ID. DE SEQ. N°: 15)

Seqüência de reconhecimento #4:

ACTGTGGCACCTCCCTTCACCTTGGTCGACGAGGTTGTGC (ID. DE SEQ. N°: 16)

Seqüência embaralhada #2:

ACTGTGGCACCTCCCTTCACTCTGGTCGACGAGGTTGTGC (ID. DE SEQ. N°: 19) Exemplos adicionais de oligonucleotídeos da invenção incluem:

Seqüência de reconhecimento #1:

5'-AGAAGTTCACCCTTGACTGT-3' (ID. DE SEQ . N°: 20) Seqüência de reconhecimento #2:

5'-AGAAGTTCACGTTCCACTGT-3' (ID. DE SEQ . N°: 21) Seqüência embaralhada #1:

5'-AGAAGTTCACGCTCTACTGT-3 ' (ID. DE SEQ. N°: 22)

Seqüência de reconhecimento #3: 5 ' - TTAGCGATTAGAAGTTCACCCTTGACTGTGGCACCTCCC - 3 ' (ID . DE

SEQ. N°: 23)

Seqüência de reconhecimento #4:

5 ' - GTTAGCGATTAGAAGTTCACGTTCCACTGTGGCACCTCCC - 3 ' (ID . DE SEQ. N°: 24) Seqüência embaralhada #2:

5 ' - GTTAGCGATTAGAAGTTCACGCTCTACTGTGGCACCTCCC - 3 ' (ID . DE SEQ. N°: 25)

Esse conjunto de inibidores de oligonucleotídeos alternativos representa a seqüência de reconhecimento (juntamente com a seqüência central CCTTG (ID. DE SEQ. N°: 1) ) para o domínio de ligação de PAX2 e homeobox. Esses incluem seqüências verdadeiras do promotor de DEFBl.

O gene PAX2 é necessário para o crescimento e sobrevida de várias células de câncer, incluindo da próstata. Além disso, a inibição da expressão de PAX2 resulta em morte celular mediada pelo componente da imunidade inata DEFBl. A supressão da expressão e da atividade de DEFBl é obtida por ligação da proteína PAX2 a um sítio de reconhecimento GTTCC (ID. DE SEQ. N°: 2) no promotor de DEFBl. Portanto, essa via fornece um alvo terapêutico viável para o tratamento de câncer da próstata. Nesse método, as seqüências se ligam ao sítio de ligação de DNA de PAX2 e bloqueiam a ligação de PAX2 ao promotor de DEFBl, permitindo, dessa forma, a expressão de DEFBl e atividade. As seqüências de oligonucleotídeos e o experimento descrito acima são exemplos e demonstram um modelo para o projeto de fármacos inibidores de PAX2 adicionais.

Considerando que a seqüência GTTCC (ID. DE SEQ. N°: 2) existe em interleucina-3, interleucina-4, no receptor de insulina e outros, PAX2 também regula sua expressão e atividade. Portanto, os inibidores de PAX2 aqui revelados possuem utilidade em várias outras doenças, incluindo aquelas relacionadas diretamente ã inflamação, incluindo prostatite e hipertrofia prostática benigna (BPH).

6. Exemplo 7: A perda da expressão de DEFBl resulta em tumorigênese aumentada

Geração de camundongos com perda de função: o sistema Cre/IoxP tem sido útil na elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à carcinogênese da próstata. Aqui, um knockou t (KO) condicional de DEFBl Cre é usado para ruptura indutível dentro da próstata. 0 KO condicional de DEFBl Cre envolve a geração de um vetor de direcionamento contendo sítios de IoxP que flanqueiam éxons codificadores de DEFBl, células ES visadas por esse vetor e a geração de camundongos de linhagem germinativa quimérica a partir dessas células ES visadas. Os heterozigotos são cruzados com transgênicos Cre próstata-especifíco e o intercruzamento heterozigoto é usado para gerar camundongos KO para DEFBl próstata-específico. Verificou-se que quatro compostos químicos genotóxicos induzem carcinomas da próstata em roedores: N-metil-N-nitrosouréia (MNU), N- nitrosobis 2-oxopropil, amina (BOP), 3,2X-dimetil-4-amino- bifenil (MAB) e 2-amino-l-metil-6-fenilimidazol 4,5- bxpiridina (PhIP). Camundongos DEFBl-transgênicos são tratados com esses compostos carcinogênicos por meio de administração de injeção intragástrica ou i.v. para estudos de indução de adenoma e adenocarcinoma de próstata. Amostras da próstata são estudadas quanto às diferenças no crescimento tumoral e alterações da expressão gênica por meio de análises histológicas, imunoistológicas, de mRNA e de proteína.

Geração de camundongos GOF: para camundongos GOF indutíveis por PAX2, GOF PAX2 (bi-transgênicos) e parentes do tipo selvagem (mono-transgênicos) recebem a administração de doxiciclina (Dox) a partir de 5 semanas de idade para induzir expressão de PAX2 próstata-específica. Resumidamente, camundongos mono-transgênicos PROBASIN-rtTA (indutor da expressão de rtTA tet-dependente célula da próstata-específica) são cruzados com nossas linhagens transgênicas responsivas a PAX2. Para indução, camundongos bi-transgênicos recebem Dox através da água de beber (500 mg/l recém-preparados duas vezes por semana). Os experimentos iniciais verificam os níveis de fundo baixos, boa capacidade de indução e expressão de PAX2 tipo de célula-específica e o repórter de EGFP com o uso da linhagem fundadora transgênica em camundongos bi- transgênicos. Em relação aos tamanhos do grupo experimental, 5-7 indivíduos com idade e sexo compatíveis em cada grupo (do tipo selvagem e GOF) permitem a significância estatística. Para todos os animais neste estudo, os tecidos prostáticos são coletados inicialmente em intervalos semanais para análise e comparação, para determinar parâmetros de tempo carcinogênicos.

Genotipagem por PCR, RT-PCR e qPCR: camundongos transgênicos PROBASIN-rtTA são genotipados com o uso dos seguintes iniciadores e condições de PCR:

PROBASIN5 (direto):

5'-ACTGCCCATTGCCCAAACAC-3' (ID. DE SEQ. N°: 26);

RTTA3 (reverso):

5'-AAAATCTTGCCAGCTTTCCCC-3' (ID. DE SEQ. N°: 27);

Desnaturação a 95°C por 5 minutos, seguido por 30 ciclos de 95°C por 30 segundos, 57°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos, seguido por uma extensão por 5 minutos a 72°C, gerando um produto de 600 bp.

Camundongos transgênicos indutíveis por PAX2 são genotipados usando os seguintes iniciadores e condições de PCR:

PAX2For:

5'-GTCGGTTACGGAGCGGACCGGAG-3' (ID. DE SEQ. N°: 28);

Rev5'IRES:

5'- TAACATATAGACAAACGCACACCG-3' (ID. DE SEQ. N°: 29);

Desnaturação a 95°C por 5 minutos, seguido por 34 ciclos de 95°C por 30 segundos, 63°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos, seguido por uma extensão por 5 minutos a 72°C, gerando um produto de 460 bp.

Hemizigotos immortomouse são genotipados usando os seguintes iniciadores e condições de PCR:

Immoll:

5'-GCGCTTGTGTC GCCATTGTATTC-3' (ID. DE SEQ. N°: 30); Immo12:

5' - GTCACACCACAGAAGTAAGGTTCC - 3' (ID. DE SEQ . Ν°: 31);

94°C por 30 segundos, 58°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto e 30 segundos, 30 ciclos para gerar uma banda de aproximadamente 1 kb. Para genotipagem de camundongos knockout para PAX2, são usados os seguintes iniciadores e condições de PCR:

PAX2 For:

5'-GTCGGTTACGGAGCGGACCGGAG-3' (ID. DE SEQ. N°: 32); PAX 2 Rev:

5' - CACAGAGCATTGGCGATCTCGATGC - 3' (ID. DE SEQ . N°: 33);

94 °C por 1 minuto, 65°C por 1 minuto, 72°C por 30 segundos, 36 ciclos para gerar uma banda de 280 bp.

Estudos animais do peptideo DEFBl: machos de camundongos atímicos (nude) com seis semanas de idade adquiridos de Charles River Laboratories são injetados por via subcutânea sobre a escápula com 10^6 células PC3 viáveis. Uma semana após a injeção, os animais são alocados aleatoriamente a um de três grupos: grupo I: controle; grupo II: injeções intraperitoneais de DEFBl, 100 μg/dia, 5 dias por semana, por 2-14 semanas; grupo III: injeções intraperitoneais de DEFBl, 100 mg/dia, 5 dias por semana, por 8-14 semanas. Os animais são mantidos em um abrigo estéril, quatro animais por gaiola, e observados diariamente. Em intervalos de 10 dias, os tumores são medidos com a utilização de compassos, e os volumes dos tumores são calculados com o uso da fórmula: V= (Lx W2)/2.

Tabela 2. Seqüências de iniciadores de QRT-PCR.

<formula>formula see original document page 184</formula> <table>table see original document page 185</column></row><table>

Tabela 3. Seqüências de siRNA de PAX2. Um pool de quatro siRNA foi utilizado para inibir a expressão de proteína PAX 2 .

<table>table see original document page 185</column></row><table>

Tabela 4. Iniciadores de RT-PCR quantitativa. Seqüências de nucleotídeo de iniciadores usados para amplificar PAX 2 e GAPDH.

<table>table see original document page 185</column></row><table> <table>table see original document page 186</column></row><table>

7. Exemplo 8: Direcionamento da expressão de PAX 2 para a quimioprevenção de neoplasia intra-epitelial e câncer

Resumo

O acúmulo de mutações e a perda de funções de controle celular causam alterações fenotípicas progressivas da histologia normal até o pré-cancer inicial como, por exemplo, neoplasia intra-epitelial (IEN) a IEN crescentemente severa até o câncer superficial e finalmente doença invasiva. Embora esse processo possa ser relativamente agressivo em alguns casos, ele geralmente ocorre de forma relativamente lenta ao longo de anos e até mesmo décadas. Como descrito por Weinstein e outros, a dependência de oncogene é a dependência fisiológica de células de câncer na ativação continuada ou superexpressão de oncogenes únicos para a manutenção do fenótipo maligno.

Essa dependência ocorre no ambiente de outras alterações que marcam a progressão neoplásica. A dependência e resistência de células de câncer no oncogene PAX2 para crescimento e sobrevida célula é um desses exemplos. Inversamente, a ausência de genes supressores de tumor como, por exemplo, DEFBl, que é reprimido transcricionalmente por PAX2, confere uma dependência pró- câncer similar.

A quimioprevenção do câncer é definida como a prevenção do câncer ou o tratamento em um estágio pré- câncer ou até mesmo antes. O longo período de progressão até o câncer invasivo é a principal oportunidade científica, mas também um obstáculo econômico para mostrar o benefício clínico de candidatos a fármacos quimiopreventivos. Portanto, um importante componente da pesquisa para o desenvolvimento de um agente quimiopreventivo nos últimos anos tem sido identificar pontos finais ou biomarcadores precoces (não câncer) que prevejam com precisão o benefício clínico do agente ou um efeito de redução da incidência de câncer. Em muitos cânceres, IEN é um ponto final precoce como, por exemplo, no câncer da próstata. Considerando que a via de PAX2/DEFBl está desregulada durante IEN e talvez até mesmo anteriormente, o estágio histopatológico a torna um biomarcador preditivo poderoso e um excelente alvo para a quimioprevenção de câncer. São mostrados diversos compostos que suprimem PAX2 e aumentam a expressão de DEFBl que podem ter utilidade como agentes de quimioprevenção para o câncer da próstata.

Fundamentos

Os genes PAX são capazes de atuar como proto-oncogenes por meio das alterações estruturais de fatores de transcrição e genes que regulam o crescimento celular e apoptose, resultando em um forte sinal de sobrevida no câncer da próstata. Além disso, foi demonstrado que vários cânceres possuem expressão aberrante de PAX2 (Figura 18) . Angiotensina II (AngII) é um regulador importante da pressão sangüínea e da homeostasia cardiovascular e é reconhecida como um potente mitógeno. AngII medeia seus efeitos biológicos por meio da ligação a dois subtipos de receptores, receptor de Angiotensina do Tipo I (ATlR) e receptor de Angiotensina do Tipo II (AT2R), que pertencem à superfamília dos receptores acoplados à proteína G, mas possuem distribuição tecidual e vias de sinalização intracelular diferentes. Além de seus efeitos sobre a pressão sangüínea, demonstrou-se que AngII participa de várias situações patológicas que envolvem remodelagem tecidual, por exemplo, cicatrização de feridas, hipertrofia e desenvolvimento cardíacos. Na verdade, estudos recentes revelaram a expressão local de vários componentes do 15 Sistema Renina-Angiotensina (RAS) em várias células e tecidos de câncer, incluindo a próstata. A supra-regulação de ATlR fornece uma vantagem considerável às células de câncer que aprenderam a escapar da apoptose e de elementos reguladores do crescimento.

Este estudo demonstra que a supra-regulação do oncogene PAX2 no câncer da próstata é causada pela sinalização desregulada do RAS. A expressão de PAX2 é regulada pela via de sinalização ERK que é mediada pelo receptor de Angiotensina do Tipo I. Além disso, o bloqueio da ATlR com Losartan (Los) suprime a expressão de PAX2. Além disso, AICAR, que é um ativador de AMPK, também se mostrou promissor como um inibidor de PAX2 potencial. Coletivamente, esses estudos implicam fortemente essas classes de fármacos como supressores potenciais da expressão de PAX2 e podem, ao final, servir como novos agentes de quiraioprevenção (Tabela 5).

Tabela 5. Cânceres que expressam PAX2 como candidatos para estratégias de quimioprevenção

<table>table see original document page 189</column></row><table>

Até hoje, foi demonstrado que diversos cânceres expressam PAX2 de forma aberrante. A quimioprevenção por meio da expressão de PAX2 como alvo pode ter um impacto significativo nas mortes relacionadas ao câncer.

Materiais e métodos

Cultura de células: as linhagens de células DU145 foram cultivadas em meio DMEM, e PC3 cresceram em meio F12 (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) . O meio de crescimento para todas as três linhagens foi suplementado com soro bovino fetal 10% (v/v) (Life Technologies) . As células hPrEC foram cultivadas em meio basal para o epitélio da próstata (Cambrex Bio Science, Inc., Walkersville, MD). Todas as linhagens celulares foram mantidas a 370C e CO2 5%.

Reagentes e tratamentos: as células foram tratadas com 5 ou 10 μΜ de AngII, 5 μΜ do antagonista de ATRl Los, 5 μΜ do antagonista de ATR2 PD123319, 25 μΜ do inibidor de MEK U0126, 20 μΜ do inibidor de MEK/ERK PD98 059, ou 250 μΜ do indutor da AMP quinase AICAR.

Análise Western: resumidamente, as células foram coletadas por tripsinização e lavadas duas vezes com PBS. Tampão de Iise foi preparado de acordo com as instruções do fabricante (Sigma) e então adicionado às células. Após um período de incubação de 15 minutos a 4 0C em uma agitadora orbital, os lisados celulares foram coletados e centrifugados por 10 minutos a 12.000 xg para peletizar os restos celulares. Os sobrenadantes contendo proteína foram então coletados e quantificados. A seguir, 25 μg de extrato de proteína foram carregados em uma SDS-PAGE com gradiente de 8-16% (Novex) . Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF, e então bloqueadas com leite em pó desnatado 5% em TTBS (Tween 20 0,05% e 100 mM de Tris-Cl) por 1 hora. Os blots foram então sondados com anticorpo primário (anti-PAX2, -fosfo-PAX2, -JNK, -fosfo- JNK, -ERKl/2 ou -fosfo-ERKl/2) (Zymed, San Francisco, CA) em diluições de 1:1.000-2.000. Após lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpo anti-coelho conjugado à peroxidase de raiz forte (HRP) (diluição 1:5.000; Sigma), e a detecção de sinal foi visualizada com o uso de reagentes de quimioluminescência (Pierce) em um Alpha Innotech Fluorchem 8900. Como controle, os blots foram retirados e re-sondados com anticorpo primário de camundongo anti-β- actina (1:5.000; Sigma-Aldrich) e anticorpo secundário anti-camundongo conjugado à HRP (1:5.000; Sigma-Aldrich), e a detecção de sinal foi novamente visualizada.

Análise QRT-PCR: RT-PCR quantitativa em tempo real foi realizada para verificar as alterações na expressão gênica após knockdown de PAX2 em linhagens de células de câncer da próstata PC3 e DU145 e nas células epiteliais da próstata normal hPrEC. Aproximadamente 1 χ IO6 células foram coletadas por tripsinização e as células foram enxaguadas em PBS. As células foram então lisadas e o RNA total foi isolado por centrifugação por meio de colunas de centrifugação com o uso do Sistema de Isolamento de RNA Total SV (Promega). cDNA foi gerado (0,5 pg por reação) por transcrição reversa por iniciador Oligo (dT) 15 (Promega) e a enzima Transcriptase Reversa II AMV (500 unidades por reação; Promega) para a síntese da primeira fita e DNA Polimerase Tfl para a síntese da segunda fita (500 unidades por reação; Promega) de acordo com o protocolo do fabricante. Tipicamente, 50 pg de cada cDNA foram usados após a reação de PCR. QRT-PCR em duas etapas foi realizada no cDNA gerado usando a Transcriptase Reversa MultiScribe do Sistema de Transcrição Reversa TaqMan e o "SYBR Green PCR Master Mix" (PE Biosystems). As reações foram realizadas em uma Placa de Reação de 96 poços MicroAmp Optical (PE Biosystems). Quarenta ciclos de PCR foram realizados sob condições padronizadas usando uma temperatura de anelamento de 60°C. A quantificação foi determinada pelo número do ciclo em que a amplificação exponencial se iniciou (valor-limite) , e foi obtida a média dos valores obtidos das repetições em triplicata. Houve um relacionamento inverso entre o nível de mensagem e o valor- limite. Além disso, GAPDH foi usado como um gene de manutenção para normalizar o teor inicial de cDNA total. A expressão relativa foi calculada como a proporção entre cada um dos genes e GAPDH. Todas as reações foram feitas em triplicata.

Incorporação de timidina: a proliferação de células foi determinada por incorporação de [3H] timidina ribotídeo ([3H] TdR) em DNA. 0,5 χ IO6 células/poço de suspensão células DU14 5 foram plaqueadas em seu meio apropriado. As células foram incubadas por 72 horas com ou sem a presença de AngII nas concentrações indicadas. As células foram expostas a 37 kBq/ml de [metil-3H] timidina no mesmo meio por 6 horas. As células aderentes foram fixadas por ácido tricloroacético 5% e lisadas em tampão de Iise SDS/NaOH de um dia para o outro. A radioatividade foi medida por um. contador de cintilação líquida Beckman LS3801 (Canadá). A cultura de células em suspensão foi coletada por uma colheitadeira de células (Packard Instruments Co., Meriden, CT) e a radioatividade foi medida por um contador de cintilação líquida 1450 microbeta (PerkinElmer Life Sciences).

Análise estatística: as diferenças estatísticas foram avaliadas usando o teste t de Student para valores não pareados. Os valores P foram determinados por um cálculo two-sided, e um valor P de menos que 0,05 era considerado estatisticamente significante.

Resultados Para investigar o efeito de AngII sobre a expressão de PAX2 em células DU145 de câncer da próstata, a expressão de PAX2 foi examinada após o tratamento com AngII ao longo de um período de 30 minutos até 48 horas. Como mostrado na Figura 19, a expressão de PAX2 aumentou progressivamente ao longo do tempo após tratamento com AngII. O bloqueio da sinalização do RAS por tratamento de DU14 5 com Los reduziu significativamente a expressão de PAX2 (Figura 20A). Aqui, a expressão de PAX2 era de 3 7% após 4 8 horas e de 50% após 72 horas de tratamento com Los, comparadas com células DU14 5 não tratadas de controle (Figura 21). Sabe-se que o receptor AT2R se opõe à ação do AT1R. Portanto, o efeito de bloqueio do receptor AT2R sobre a expressão de PAX2 foi examinado. O tratamento de DU14 5 com o bloqueador de AT2R PD123319 resultou em um aumento de 7 vezes na expressão de PAX2 após 4 8 horas e em um aumento de 8 vezes após 96 horas de tratamento (Figura 20B). Coletivamente, esses achados demonstram que a expressão de PAX2 é regulada pelo receptor ATR1.

Sabe-se que AngII afeta diretamente a proliferação de células de câncer da próstata por meio da ativação de MAPK mediada por AT1R e da fosforilação de STAT3. O tratamento de DU145 com AngII resultou em um aumento de duas a três vezes na taxa de proliferação (Figura 21). No entanto, o tratamento com Los diminuiu as taxas de proliferação em 50%. Além disso, o bloqueio do receptor AT1R por pré- tratamento com Los por 3 0 minutos suprimiu o efeito de AngII sobre a proliferação.

Para examinar ainda mais o papel da sinalização de AT1R na regulação da expressão e ativação de PAX2, foi examinado o efeito do bloqueio de vários componentes da via de sinalização de MAP quinase sobre a expressão de PAX2. Aqui, o tratamento de células DU14 5 com o inibidor de MEK U012 6 resultou em uma redução significativa da expressão de PAX2 (Figura 22) . Além disso, o tratamento com inibidor de MEK/ERK PD98 059 também resultou na diminuição de PAX2. 0 tratamento de células DU14 5 com Los não teve nenhum efeito sobre os níveis de proteína ERK, mas reduziu a quantidade de fosfo-ERK (Figura 23A) . No entanto, o tratamento de DU145 com Los resultou em uma redução significativa da expressão de PAX2. Resultados similares foram observados com U0126 e PD98059. Sabe-se também que a expressão de PAX2 é regulada por STAT3, que é um alvo downstream de ERK. 0 tratamento de DU14 5 com Los, UO126 e PD98 05 9 reduziu os níveis de proteína fosfo-STAT3 (Figura 23C) . Esses resultados demonstram que PAX2 é regulada por meio de ATlR em células de câncer da próstata.

Além disso, foi examinado o efeito da sinalização de ATlR sobre a ativação de PAX 2 por JNK. 0 tratamento de DU145 com Los, U0126 e PD98059 resultou em uma diminuição significativa ou supressão dos níveis de proteína fosfo- PAX2 (Figura 24A) . No entanto, Los e U0126 não diminuíram os níveis proteína fosfo-JNK (Figura 24B) . Portanto, a diminuição de fosfo-PAX2 parece ser causada pelos níveis de PAX2 diminuídos, mas não de fosforilação diminuída. 5-aminoimidazol-4-carboxamida-1-β-4-r ibof uranos í deo (AICAR) é amplamente usada como um ativador de AMP-quinase, que regula a homeostasia de energia e a resposta ao estresse metabólico. Relatos recentes indicaram ação antiproliferativa e pró-apoptótica de AMPK ativado com o uso de agentes farmacológicos ou superexpressão de AMPK. Foi demonstrado que a ativação de AMPK induz apoptose em células de câncer gástrico humano, células de câncer do pulmão, câncer da próstata, células pancreáticas e células de carcinoma hepático, e aumenta a apoptose induzida por estresse oxidativo em células de neuroblastoma de camundongo, por vários mecanismos que incluem a inibição da via de ácido graxo sintase e a indução de quinases de estresse e caspase 3. Além disso, o tratamento de células PC3 de câncer da próstata aumentou a expressão de proteínas p21, p27 e p53 e a inibição da via PI3K-Akt. Todas essas vias são reguladas direta ou indiretamente por PAX2. O tratamento de células de câncer da próstata com AICAR resultou na supressão da expressão da pressão de PAX 2 Figura 23B) , bem como de sua forma ativada fosfor-PAX2 (Figura 24A) . Além disso, fosfo-STAT3, que regula a expressão de PAX2, também foi suprimido (Figura 23C).

Finalmente, criou-se a hipótese de que a sinalização aberrante do RAS, que leva à supra-regulação e superexpressão de PAX2, suprime a expressão do gene supressor de tumor DEFBl. Para investigar essa hipótese, células de cultura primária de células epiteliais da próstata normal hPrEC foram tratadas com AngII e foram examinados os níveis de expressão tanto de PAX2 quanto de DEFBl. Foi descoberto um relacionamento inverso entre a expressão de DEFBl e de PAX2 em células normais da próstata versus células de câncer da próstata. Células hPrEC não tratadas exibiram 10% de expressão relativa de PAX 2, comparada com a expressão em células PC3 de câncer da próstata. Inversamente, PAX2 não tratadas exibiram apenas 2% de expressão relativa de DEFB1, comparada com a expressão em hPrEC. Após 72 horas de tratamento com 10 μΜ de AngII, houve uma diminuição de 3 5% na expressão de DEFB1, comparada com células hPrEC não tratadas, e em 96 horas havia uma diminuição de 50% na expressão de DEFB1, comparada com células hPrEC não tratadas. No entanto, houve um aumento de 66% na expressão de PAX2 em 72 horas, e por volta de 96 horas havia uma diminuição de 79% na expressão de PAX2, comparada com células hPrEC não tratadas. Além disso, o aumento na expressão de PAX2 em células hPrEC após 72 horas era de 77% dos níveis de PAX 2 observados em células PC3 de câncer da próstata. Após 96 horas de tratamento com AngII, a expressão de PAX2 era 8 9% da expressão de PAX2 em PC3. Esses resultados demonstram que a sinalização desregulada do RAS suprime a expressão de DEFB1 por meio da supra-regulação de expressão de PAX2 em células da próstata.

Discussão

O sistema Renina-Angiotensina AngII é um regulador importante da pressão sangüínea e da homeostasia cardiovascular, e é reconhecido como um mitógeno potente. AngII medeia seus efeitos biológicos por meio da ligação a dois subtipos de receptores, AT1R e AT2R, que pertencem à superfamília de receptores acoplados à proteína G, mas possuem distribuição tecidual e vias de sinalização intracelular diferentes. A supra-regulação de AT1 fornece uma vantagem considerável às células de câncer que aprenderam a escapar da apoptose e de elementos reguladores do crescimento. Além disso, a expressão aumentada de AT1R foi detectada em tecido de câncer de próstata, comparados com os níveis de expressão na próstata humana normal.

Está agora bem estabelecido que ATlR induz a proliferação celular em vários modelos celulares, incluindo células de câncer humano, por ativação de várias cascatas intracelulares de proteína quinases normalmente associadas à estimulação do fator de crescimento. Mais notavelmente, ATlR transativa o EGFR em células de câncer da próstata, levando à ativação de quinase (ERK) por regulação extracelular, fosforilação do transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 (STAT3) . A transativação de EGFR mediada por ATlR é particularmente relevante para o câncer, pois a amplificação de EGFR está freqüentemente associada à progressão do tumor. Na verdade, estão agora sendo desenvolvidas estratégias anticâncer eficientes com a utilização de anticorpos monoclonais para o EGFR como, por exemplo, Herceptin® (Genentec, Inc.).

O interesse recente se concentrou no possível papel de fármacos anti-hipertensivos na terapia anticâncer. Por exemplo, o uso de ACEs em modelos animais experimentais indica um efeito protetor desses fármacos contra o desenvolvimento tumoral. Além disso, verificou-se que Los e Candesartan, que são ambos antagonistas de AT1R, reduzem o crescimento tumoral e a vascularização em modelos de xenoenxerto de células de câncer da próstata humana. Além disso, a supra-regulação de ACE foi detectada na hipertrofia prostática benigna. PAX2 estava supra-regulada em regiões benignas de pacientes com PIN e câncer da próstata. Portanto, é plausível que PAX2 seja um evento de início na patobiologia do câncer da próstata, e pode ser um alvo de quimioprevenção viável para a prevenção do desenvolvimento de câncer da próstata.

A inibição de apoptose é um fator fisiopatológico crucial que contribui para o desenvolvimento de câncer da próstata. Apesar dos avanços significativos nas substâncias terapêuticas para o câncer, pouco progresso foi feito no tratamento de doença avançada. Considerando que a carcinogênese é a doença de progressão de anos, com várias etapas e vias, a quimioprevenção por meio da utilização de fármacos ou outros agentes para inibir, retardar ou reverter esse processo foi reconhecida como uma área muito promissora nas pesquisas contra o câncer. O tratamento farmacológico bem sucedido para a quimioprevenção de câncer da próstata exige o uso de substâncias terapêuticas com efeitos específicos sobre células-alvo, mantendo, ao mesmo tempo, efeitos clínicos mínimos sobre o hospedeiro, com o objetivo global de suprimir o desenvolvimento do câncer. Portanto, a compreensão dos mecanismos no estágio inicial da carcinogênese é crucial na determinação da eficácia de um tratamento específico. A significância da expressão aberrante de PAX2 e sua interrupção da apoptose, com subseqüente contribuição para a formação tumoral, sugerem que ela possa ser um alvo adequado para o tratamento do câncer da próstata. PAX2 era regulada pelo ATlR no câncer da próstata (Figura 26). Assim, a sinalização desregulada do RAS resultou na expressão aumentada do oncogene PAX2, e uma diminuição da expressão de supressor de tumor DEFBl. Portanto, o uso de antagonistas de ATlR diminui a expressão de PAX2 e resulta em aumento da morte de células de câncer da próstata por meio da re-expressão de DEFBl (Figura 27).

Esses resultados oferecem um novo achado de que o direcionamento da expressão de PAX2 por meio da via de sinalização de Renina-Angiotensina, a via de AMP quinase ou outros métodos que envolvem a inativação da proteína PAX2 (ou seja, vacinação com anticorpo anti-PAX2) pode ser um alvo viável para a prevenção do câncer (Tabela 7).

Tabela 7. Compostos utilizados para inibir a expressão de

PAX2 para quimioprevenção <table>table see original document page 199</column></row><table>

8. Exemplo 9: O nível de expressão de PAX2-DEFBl como uma ferramenta de graduação para tecido prostático e previsor do desenvolvimento do câncer da próstata

Materiais e métodos

Análise QRT-PCR: foram coletados cortes de próstata de pacientes que foram submetidos a prostatectomias radicais. Após exame patológico, foi realizada microdissecção por captura a laser para isolar áreas de tecido normal, de neoplasia intra-epitelial proliferativa (PIN) e canceroso. QRT-PCR foi realizada, como descrita previamente, para avaliar a expressão. A expressão de DEFBl e de PAX2 foi determinada em cada região e GAPDH foi usado como controle interno.

Coleta de sangue e isolamento de RNA: para QRT-PCR, sangue (2,5 ml) de cada indivíduo foi coletado em um tubo "PAXgene™ Blood RNA" (QIAGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. O sangue total foi misturado cuidadosamente com reagente de estabilização PAXgene e armazenado em temperatura ambiente por 6 horas, antes da extração de RNA. O RNA total foi então extraído usando o kit "PAXgene™ Blood RNA" de acordo com as instruções do fabricante (QIAGEN). A fim de remover DNA genômico contaminante, as amostras de RNA total absorvidas à coluna de centrifugação "PAXgene™ Blood RNA System" foram incubadas com DNase I (QIAGEN) a 25°C por 20 minutos para remover DNA genômico. O RNA total foi eluído, quantificado, e a QRT-PCR é realizada como mencionada previamente para comparar as proporções da expressão de PAX2 e de DEFBl.

Resultados

A análise por QRT-PCR de tecido normal LCM demonstrou que pacientes com níveis relativos de expressão de DEFB1 acima de 0,005 possuem um escore de Gleason menor, comparados com aqueles com níveis de expressão menores do que 0,005 (Figura 28A) . Dessa forma, há um relacionamento inverso entre a expressão de DEFBl e o escore de Gleason. Inversamente, houve uma correlação positiva entre a expressão de PAX2 e a o escore de Gleason em tecido maligno da próstata e PIN (Figura 28B).

Os níveis de expressão de PAX2 e de DEFBl em tecidos normais, de PIN e cancerosos de pacientes separados foram calculados e comparados (Figura 29). No geral, os níveis de expressão de PAX2 em relação ao controle interno de GAPDH variaram entre 0 e 0,2 em tecido normal (benigno), 0,2 e 0,3 em PIN, e entre 0,3 e 0,5 em tecido canceroso (maligno) (Figura 30) . Para DEFBl, houve um relacionamento inverso comparado com PAX2. Aqui, os níveis de expressão de DEFBl em relação ao controle interno de GAPDH variaram entre 0,06 e 0,005 em tecido normal (benigno), 0,005 e 0,003 em PIN, e entre 0,003 e 0,001 em tecido canceroso (maligno). Portanto, é revelada uma escala preditiva (DPF) que utiliza a proporção da expressão de PAX2-DEFBl como um indicador de tecido benigno, pré-canceroso (PIN) e maligno da próstata. Tecidos com proporções de PAX2-DEFBl entre 0 e 39 com base no DPF representarão tecido normal (patologicamente benigno). Tecidos com uma proporção de PAX2-DEFBl entre 4 0 e 99 representarão PIN (pré-canceroso) com base na escala do DPF. Finalmente, tecidos com uma proporção de PAX2-DEFBl entre 100 e 500 serão malignos (câncer de grau baixo a elevado).

Conclusão

Há atualmente uma necessidade crucial por biomarcadores preditivos para o desenvolvimento de câncer da próstata. Sabe-se que o surgimento do câncer da próstata ocorre muito tempo antes de a doença ser detectável pelos métodos de triagem atuais, tais como o teste de PSA ou o exame retal digital. Acredita-se que um teste confiável que pudesse monitorar a progressão e o surgimento inicial do câncer da próstata reduziria grandemente a taxa de mortalidade por meio de uma conduta mais eficaz frente à doença. É aqui revelado um índice preditivo para permitir que os médicos saibam antecipadamente o estado patológico da próstata. O DPF mede a diminuição na proporção da expressão de PAX2-DEFBl associada à progressão da doença prostática. Essa medida poderosa pode não apenas prever a probabilidade de um paciente desenvolver câncer da próstata, mas também pode identificar o surgimento precoce de câncer pré-maligno. Em última análise, essa ferramenta permite que os médicos separem quais pacientes possuem doença mais agressiva daqueles que não possuem.

A identificação de marcadores câncer-especificos tem sido utilizada para ajudar a identificar células tumorais circulantes (CTCs). Há também evidências emergentes que demonstram que a detecção de células tumorais disseminadas no sangue periférico pode fornecer dados clinicamente importantes para o estadiamento do tumor, prognóstico e identificação de marcadores substitutos para a avaliação precoce da eficácia da terapia adjuvante. Além disso, por comparação do perfil de expressão gênica de todas as células circulantes, pode-se examinar a expressão dos genes

DEFBl e PAX2 que participam da "imunovigilância" e da "sobrevida ao câncer", respectivamente, como um indicador para a detecção precoce do câncer da próstata. 9. Exemplo 10: Análise funcional do peptídeo de defesa do hospedeiro Beta Defensina-1: nova abordagem em seu papel potencial no câncer Materiais e métodos

Cultura de células: as linhagens de células de câncer da próstata foram obtidas da "American Type Culture Collection" (Manassas, VA) . As células DU145 foram cultivadas em meio DMEM, PC3 e PC3/AR+ cresceram em meio F12, e LNCaP cresceram em meio RPMI (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). 0 meio de crescimento para todas as três linhagens foi suplementado com soro bovino fetal 10% (v/v) (Life Technologies) . A cultura primária de hPrEC foi obtida de Cambrex Bio Science, Inc. (Walkersville, MD), e as células cresceram em meio basal de epitélio da próstata. Todas as células foram mantidas a 37°C e CO2 5%.

Amostras de tecido e microdissecção por captura a laser: tecidos prostáticos foram obtidos de pacientes que forneceram uma autorização por escrito, antes de serem submetidos a uma prostatectomia radical. As amostras foram adquiridas do banco de tumor do "Hollings Câncer Center" de acordo com um protocolo aprovado pelo "Institutional Review Board". Esse incluía diretrizes quanto ao processamento, corte, caracterização histológica, purificação de RNA e amplificação por PCR de amostras. Os espécimes da próstata recebidos dos cirurgiões e patologistas foram imediatamente congelados em composto OCT. Cada bloco de OCT foi cortado para produzir cortes seriais que foram corados e examinados. Áreas contendo células benignas, neoplasia intra-epitelial prostática (PIN) e câncer foram identificadas e usadas para guiar nossa seleção de regiões a partir de lâminas não coradas usando o Sistema Arcturus PixCell II (Sunnyvale, CA) . Tampas contendo material capturado foram expostas a 20 ml de lisado do kit de isolamento de RNA wArcturus Pico Pure" e processadas imediatamente. A quantidade e a qualidade do RNA foram avaliadas usando conjuntos de iniciadores que produzem amplicons 5'. Os conjuntos incluem aqueles para a proteína ribossômica L32 (o amplicon 3' e o amplicon 5' estão afastados por 298 bases), para a glicose fosfato isomerase (afastamento de 391 bases) e para a glicose fosfato isomerase (afastamento de 842 bases). Foram rotineiramente obtidas proporções de 0,95 a 0,80 para esses conjuntos de iniciadores usando amostras de diversos tecidos preparados. Amostras adicionais de tumor e normais foram dissecadas macroscopicamente por patologistas, congeladas em nitrogênio líquido e avaliadas quanto à expressão de hBD-1 e cMYC.

Clonagem do gene hBD-1: cDNA de hBD-1 foi gerado por RNA por transcrição reversa-PCR usando os iniciadores gerados a partir da seqüência de hBD-1 publicada (N° de Acesso U50930) (Ganz, 2004) . Os iniciadores de PCR foram projetados para conter sítios de restrição de ClaI e KpnI. Os produtos de PCR de hBD-1 foram digeridos por restrição com ClaI e KpnI e ligados em um vetor de clonagem TA. 0 vetor TA/hBDl foi então transfectado na cepa XL-I Blue de E. coli por choque térmico, e clones individuais foram selecionados e expandidos. Foram isolados plasmídeos por "Cell culture DNA Midiprep" (Qiagen, Valencia, CA) , e a integridade de seqüência verificada por seqüenciamento automatizado. 0 fragmento do gene hBD-1 foi então ligado no pTRE2 digerido com ClaI e KpnI, que serviu como um vetor intermediário para fins de orientação. A construção pTRE2/hBD-1 foi digerida com ApaI e KpnI para remover o inserto de hBD-1. O inserto foi ligado no vetor pIND do Sistema de Expressão Indutível Ecdysone (Invitrogen, Carlsbad, CA), também digerido duplamente com ApaI e KpnI. A construção foi transfectada em E. coli, e clones individuais foram selecionados e expandidos. Plasmídeos foram isolados e a integridade de seqüência de pIND/hBD-1 foi novamente verificada por seqüenciamento automatizado.

Transfecção: as células (1 χ IO6) foram semeadas sobre placas de Petri de 100 mm e foram desenvolvidas de um dia para o outro. A seguir, as células foram co-transfectadas com o uso de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) com 1 mg de plasmídeo pvgRXR, que expressa o receptor heterodimérico de ecdisona, e 1 mg da construção de vetor pIND/hBD-1 ou vetor de ρΙΝΟ/β-galactosidase (β-gal) de controle em meio Opti- MEM (Life Technologies, Inc.). A eficiência da transfecção foi determinada por indução da expressão de β-gal com Ponasterona A (PonA) e coloração das células com um kit de. detecção de β-galactosidase (Invitrogen). A avaliação da eficiência da transfecção foi feita por contagem de colônias com coloração positiva (azul), que demonstrou que 60-85% das células expressavam β-galactosidase para as linhagens de células.

Imunocitoquimica: a fim de verificar a expressão de proteína hBD-1, células DU14 5 e hPrEC foram semeadas sobre lâminas de cultura de 2 câmaras (BD Falcon, EUA) a 1,5-2 χ IO4 células por câmara. Células DU145 transfectadas somente com pvgRXR (controle) ou com o plasmídeo de hBD-1 foram induzidas por 18 horas com meio contendo 10 mM de Pon A, enquanto as células não transfectadas receberam meio de crescimento fresco. Após indução, as células foram lavadas em 1 χ PBS, e fixadas por 1 hora em temperatura ambiente com paraformaldeído 4%. As células foram então lavadas seis vezes com Ix PBS e bloqueadas em Ix PBS suplementado com BSA 2%, soro de cabra normal 0,8% (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) e Triton-X 100 0,4% por 1 hora em temperatura ambiente. A seguir, as células foram incubadas de um dia para o outro em anticorpo policlonal primário de coelho anti-BD-1 humano (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ) diluído a 1:1.000 em solução de bloqueio. A seguir, as células foram lavadas seis vezes com solução de bloqueio e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente em anticorpo secundário Alexa Flúor 488 de cabra anti-IgG de coelho (H + L) em uma diluição de 1:1.000 em solução de bloqueio. Após a lavagem das células com solução de bloqueio seis vezes, as lamínulas foram montadas com Gel Mount (Biomeda, Foster City, CA). Finalmente, as células foram visualizadas sob contraste por interferência diferencial (DIC) e sob excitação por laser a 488 nm. O sinal fluorescente foi analisado por microscopia confocal (Zeiss LSM 5 Pascal) usando uma lente em óleo DIC 63x com um Módulo de Varredura de Laser Vario 2 RGB. As imagens digitais foram exportadas no Software Photoshop CS (Adobe Systems) para processamento de imagem e apresentação impressa.

Isolamento de RNA e RT-PCR quantitativa: QRT-PCR foi realizada como descrita previamente (Gibson e cols., 2007). Resumidamente, RNA total (0,5 mg por reação) de cortes de tecido foi transcrito de forma reversa em cDNA com a utilização de iniciadores aleatórios (Promega). QRT-PCR em duas etapas foi realizada no cDNA gerado usando a Transcriptase Reversa MultiScribe do Sistema de Transcrição Reversa TaqMan e o "SYBR Green PCR Master Mix" (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os pares de iniciadores para hBD-1 e c-MYC foram gerados a partir das seqüências publicadas (Tabela 7). Quarenta ciclos de PCR foram realizados sob condições padronizadas usando uma temperatura de anelamento de 56,4°C para hBD-1 e c-MYC e 550C para PAX2. Além disso, β-actina (Tabela 7) foi amplificada como um gene de manutenção para normalizar o teor inicial de cDNA total. A expressão gênica em amostras de tecido prostático benigno foi calculada como a proporção de expressão comparada com β-actina. Os níveis de expressão de hBD-1 em tecido maligno da próstata, cultura primária de próstata hPREC e linhagens de células de câncer da próstata, antes e depois indução, foram calculados em relação ao nível médio de expressão de hBD-1 em células hPrEC. Como controle negativo, também foram realizadas reações de QRT-PCR sem modelo de cDNA. Todas as reações foram executadas no mínimo três vezes.

Ensaio de viabilidade celular com MTT: para examinar os efeitos de hBD-1 sobre o crescimento celular, foi realizado o ensaio metabólico com 3-[4,5-dimetiltiazol-2- il]-2,5-difenil tetrazólio brometo (MTT). Células DU145, LNCaP, PC3 e PC3/AR+ co-transfectadas com plasmídeo pvgRXR e construção pIND/hBD-1 ou plasmídeo pvgRXR de controle foram semeadas sobre uma placa de 96 de poços a 1-5 χ IO3 células por poço. Vinte e quatro horas após a semeadura, foi adicionado meio de crescimento fresco contendo 10 mM de Pon A diariamente para induzir a expressão de hBD-1 por 24, 48 e 72 horas, e depois o ensaio de MTT foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (Promega) . As reações foram realizadas três vezes em triplicata.

Análise de integridade da membrana: foi realizada a coloração dupla com Acridina laranja (AO)/brometo de etídio (EtBr) para identificar alterações na integridade da membrana celular, bem como células apoptóticas por coloração da cromatina condensada. AO cora células viáveis e células apoptóticas iniciais, enquanto EtBr cora células apoptóticas em estágio tardio que possuem membranas comprometidas. Resumidamente, células PC3, DU145 e LNCaP foram semeadas em lâminas de cultura de 2 câmaras (BD Falcon). As células transfectadas com plasmídeo vazio ou hBD-1 plasmídeo foram induzidas por 24 ou 48 horas com meio contendo 10 mM de Pon A, enquanto as células de controle receberam meio de crescimento fresco em cada ponto de tempo. Após indução, as células foram lavadas uma vez com PBS e coradas com 2 ml de uma solução (1:1) de uma mistura de AO (Sigma, St. Louis, MO) e EtBr (Promega) (5 mg/ml) por 5 minutos, e foram novamente lavadas com PBS.

A fluorescência foi visualizada por um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM 5 Pascal Vario 2 (Carl Zeiss). A roda de cor de excitação contém filtros de bloqueio BS505-530 (verde) e LP560 (vermelho) que permitem a separação de luz verde emitida por AO no canal verde e luz vermelha por EtBr no canal vermelho. Os ajustes de saída de potência do laser e de controle de ganho dentro de cada experimento individual foram idênticos entre células induzidas por controle e por hBD-1. A excitação foi fornecida por um laser a gás misto Kr/Ar em comprimentos de onda de 54 3 nm para AO e 488 nm para EtBr. As lâminas foram analisadas sob ampliação de 4OX e as imagens digitais foram armazenadas como arquivos TIFF não compactados e exportadas no software Photoshop CS (Adobe Systems, San Jose, CA) para processamento de imagem e apresentação impressa. Tabela 7. Seqüências de iniciadores de QRT-PCR

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Citometria de fluxo: células PC3 e DU145 transfectadas com o sistema de expressão de hBD-1 cresceram em placas de 60 mm e foram induzidas por 12, 24 e 48 horas com 10 mM de Pon A. Após cada período de incubação, o meio foi coletado das placas (para reter quaisquer células destacadas) e combinado com o PBS usado para lavar as placas. As células anexadas restantes foram coletadas por tripsinização e combinadas com as células destacadas e PBS. As células foram então peletizadas a 4°C (500 χ g) por 5 minutos, lavadas duas vezes em PBS, e ressuspensas em 100 ml de tampão de ligação 1x Anexina (0,1 M de Hepes/NaOH em pH 7,4, 1,4 M de NaCl, 25 mM de CaCl2) contendo 5 ml de Anexina V-FITC e 5 ml de PI. As células foram incubadas em temperatura ambiente por 15 minutos no escuro, então diluídas com 400 ml de tampão de ligação 1x Anexina e analisadas por FACscan (Becton Dickinson, San Jose, CA) . Todas as reações foram realizadas três vezes. Detecção de caspase: a detecção da atividade de caspase nas linhagens de células de câncer da próstata foi realizada usando um kit de detecção de caspase APO LOGIX™ Carboxifluoresceína (Cell Technology, Mountain View, CA) . As caspases ativas foram detectadas por meio da utilização do peptideo fluormetil cetona marcado com carboxifluoresceína (FAMVAD-FMK) que se liga irreversivelmente às caspases ativas. Resumidamente, células DU145 e LNCaP (1,5-3 χ IO5) contendo o sistema de expressão de hBD-1 foram plaqueadas em placas com fundo de vidro de 35 mm (Matek, Ashland, MA) e tratadas por 24 horas somente com meio ou com meio contendo Pon A, como descrito previamente. A seguir, 10 ml de uma diluição de trabalho de 30 χ de FAM-VAD-FMK foram adicionados a 300 ml de meio e adicionados a cada placa de 3 5 mm. As células foram então incubadas por 1 hora a 37°C sob CO2 5%. 0 meio foi aspirado e as células foram lavadas duas vezes com 2 ml de uma diluição de trabalho de 1 χ de tampão de lavagem. As células foram visualizadas sob contraste por interferência diferencial (DIC) ou sob excitação por laser a 488 nm. O sinal fluorescente foi analisado por microscopia confocal, como descrito acima.

Silenciamento de siRNA de PAX2: knockdown e verificação SiRNA foram realizados como descritos previamente (Gibson e cols., 2007). Resumidamente, um pool de quatro siRNAs complementares direcionados ao mRNA de PAX 2 humano (N° de Acesso NM 003989.1) foi sintetizado (Dharmacon Research, Lafayette, CO, EUA). Além disso, um segundo pool de quatro siRNAs inespecificos foi usado como controle negativo para testar a especificidade de siRNAs de PAX2. As moléculas de SiRNA foram revestidas com reagente de transfecção CodeBreaker (Promega, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante, antes do tratamento.

Análise estatística: a análise estatística foi realizada com o uso do teste t de Student para valores não pareados. Os valores P foram determinados por um cálculo two-sided, e um valor P de menos que 0,05 foi considerado estatisticamente significante. As diferenças estatísticas são indicadas por asteriscos.

Resultados

Expressão de hBD-1 em tecido prostático: 82% dos cortes de tecido congelados de câncer da próstata analisados exibiram pouca ou nenhuma expressão de hBD-1 (Donald e cols., 2003). Para comparar os níveis de expressão de hBD-1, foi realizada análise QRT-PCR no tecido prostático normal obtido por dissecção macroscópica ou LCM de tecido prostático normal adjacente às regiões malignas que foram escolhidas aleatoriamente. Aqui, hBD-1 foi detectada em todas as amostras clínicas normais dissecadas macroscopicamente com uma faixa de expressão que representa aproximadamente uma diferença de 6,6 vezes nos níveis de expressão (Fig. 31A). Amostras de tecido normal capturado por LCM expressaram hBD-1 em níveis em uma faixa que representa uma diferença de 32 vezes na expressão (Fig. 31B). Perfis que combinam os números da amostra com os pacientes correspondentes revelaram que, na maioria dos casos, o nível de expressão de hBD-1 era maior em amostras de pacientes com um escore de Gleason de 6 do que em amostras de pacientes com um escore de Gleason de 7. Além disso, uma comparação dos níveis de expressão de hBD-1 em tecido obtidos por dissecção macroscópica e LCM do mesmo paciente, #1343, demonstrou uma diferença de 854 vezes na expressão entre as duas técnicas de isolamento. Portanto, esses resultados indicam que LCM fornece uma técnica mais sensível para avaliar a expressão de hBD-1 em tecido prostático.

Expressão de hBD-1 em linhagens de células da próstata: para verificar a supra-regulação de hBD-1 nas linhagens de células de câncer da próstata após transfecção com o sistema de expressão de hBD-1, foi realizada QRT-PCR. Além disso, controles negativos sem modelo também foram realizados, e os produtos de amplificação foram verificados por eletroforese em gel. Aqui, a expressão de hBD-1 era significativamente menor nas linhagens de células de câncer da próstata, comparadas com células hPrEC. Após um período de indução de 24 horas, os níveis relativos de expressão de hBD-1 aumentaram significativamente em DU14 5 PC3 e LNCaP, quando comparados com as linhagens de células antes da indução de hBD-1 (Fig. 32A).

A seguir, expressão de proteína de hBD-1 foi verificada em células DU145 transfectadas com o sistema de expressão de hBD-1 após indução com Pon A por imunoistoquímica. Como controle positivo, células epiteliais da próstata hPrEC que expressam hBD-1 também foram examinadas. As células foram coradas com anticorpo primário contra hBD-1, e a expressão de proteína foi monitorada baseada na fluorescência verde do anticorpo secundário (Fig. 32B) . A análise de células sob DIC verificou a presença de células hPrEC e células DU145 induzidas para expressão de hBD-1 a 18 horas. A excitação pelo laser confocal a 488 nra revelou fluorescência verde, indicando a presença de proteína hBD-1 em hPrEC como controle positivo. No entanto, não havia fluorescência verde detectável em células de controle DU14 5 e células DU14 5 induzidas por plasmídeo vazio, demonstrando ausência de expressão de hBD-1. A análise confocal de células DU145 induzidas para expressão de hBD-1 revelou fluorescência verde, indicando a presença de proteína hBD-1 após indução com Pon A.

Expressão de hBD-1 resulta em viabilidade celular diminuída: o ensaio de MTT foi realizado para avaliar o efeito da expressão de hBD-1 sobre a viabilidade celular relativa em linhagens de células de câncer da próstata DU14 5, PC3, PC3/AR+ e LNCaP. A análise MTT com vetor vazio não apresentou alteração estatística significante da viabilidade celular. Vinte e quatro horas após indução de hBD-1, a viabilidade celular relativa era de 72% em células DU145 e 56% em células PC3 e, após 48 horas, a viabilidade celular foi reduzida para 49% em células DU145 e 37% em células PC3 (Fig. 33A) . Após 72 horas de indução de hBD-1, a viabilidade celular relativa diminuiu anda mais para 44% em células DU145 e 29% em células PC3. Inversamente, não houve nenhum efeito significativo sobre a viabilidade de células LNCaP. A fim de avaliar se a resistência à citotoxicidade de hBD-1 observada em LNCaP era causada pela presença do receptor de androgênio (AR) , a citotoxicidade de hBD-1 em células PC3 foi examinada com expressão ectópica de AR (PC3/AR+) . Aqui, não houve diferença entre células PC3/AR+ e PC3. Portanto, os dados indicam que hBD-1 é citotóxico especificamente para células de câncer da próstata em estágio tardio.

A fim de determinar se os efeitos de hBD-1 sobre células PC3 e DU145 eram citostáticos ou citotóxicos, foi realizada análise FACS para medir a morte celular. Sob condições normais de crescimento, mais do que 90% das culturas de PC3 e DU145 eram viáveis e não apoptóticas (quadrante inferior esquerdo) e não coravam com anexina V ou PI (Fig. 4) . Após indução da expressão de hBD-1 em células PC3, o número de células que passam por apoptose inicial e apoptose tardia/necrose (quadrantes inferior e superior direitos, respectivamente) totalizou 10% em 12 horas, 20% em 24 horas, e 44% em 4 8 horas. Para células DU14 5, o número de células que passam por apoptose inicial e apoptose tardia/necrose totalizou 12% após 12 horas, 34% em 24 horas e 59% após 48 horas de indução. Não foi observado nenhum aumento da apoptose em células contendo plasmídeo vazio após indução com Pon A. Estudos de captação de Anexina V e iodeto de propídio demonstraram que hBD-1 possui atividade citotóxica contra células de câncer da próstata DU145 e PC3, e os resultados indicam apoptose como um mecanismo de morte celular.

hBD-1 causa alterações na integridade da membrana e na ativação de caspase: foi investigado se a morte celular observada em células de câncer da próstata após indução de hBD-1 é apoptose mediada por caspase. Para melhor compreender os mecanismos celulares envolvidos na expressão de hBD-1, foi realizada análise microscópica por laser confocal (Fig. 5) em células DU14 5 e LNCaP induzidas para expressão de hBD-1. A pan-ativação de caspase foi monitorada com base na ligação e clivagem de fluorescexna verde FAM-VAD-FMK às caspases em células que passam ativamente por apoptose. A análise de células sob DIC mostrou a presença de células viáveis de controle DU145 (Fig. 5A) e LNCaP (Fig. 5E) em 0 hora. A excitação pelo laser confocal a 4 88 nm não produziu coloração verde detectável, o que indica ausência de atividade de caspase em células de controle DU145 (Fig. 5B) ou LNCaP (Fig. 5F). Após indução por 24 horas, as células DU14 5 (Fig. 5C) e LNCaP (Fig. 5G) eram novamente visíveis sob DIC. A análise confocal sob fluorescência revelou coloração verde em células DU145 (Fig. 5D), indicando atividade de pan-caspase após a indução da expressão de hBD-1. No entanto, não havia coloração verde em células LNCaP (Fig. 5H) induzidas para expressão de hBD-1. Portanto, a morte celular observada após indução de hBD-1 é apoptose mediada por caspase.

O mecanismo de atividade antimicrobiana proposto de peptídeos de defensina é a ruptura da membrana microbiana em função da formação de poros (Papo e Shai, 2005) . A fim de determinar se a expressão de hBD-1 alterava a integridade da membrana, a captação de EtBr foi examinada por análise confocal. Células intactas coravam verde por causa da AO que é permeável à membrana, enquanto somente células com membranas plasmáticas comprometidas coravam em vermelho em função da incorporação do EtBr impermeável à membrana. Células DU14 5 e PC3 de controle coraram positivamente com AO e emitiram cor verde, mas não coraram com EtBr. No entanto, a indução de hBD-1 tanto em DU14 5 quanto em PC3 resultou no acúmulo de EtBr no citoplasma em 24 horas, indicado pela coloração vermelha. Por volta de 4 8 horas, DU145 e PC3 possuíam núcleos condensados e apareciam amarelas em função da co-localização de coloração verde e vermelha por AO e EtBr, respectivamente. Inversamente, não houve alterações observáveis da integridade da membrana em células LNCaP após 4 8 horas de indução, como indicado por fluorescência verde positiva com AO, mas ausência de fluorescência vermelha de EtBr. Esse achado indica que as alterações à integridade e à permeabilização da membrana em resposta à expressão de hBD-1 diferem entre células de câncer da próstata em estágio inicial e tardio.

Comparação dos níveis de expressão de hBD-1 e cMYC: a análise por QRT-PCR foi realizada em cortes de tecido prostático por LCM de três pacientes (Fig. 34). No paciente #1457, a expressão de hBD-1 exibiu uma diminuição de 2,7 vezes de normal para PIN, uma diminuição de 3,5 vezes de PIN para tumor, e uma diminuição de 9,3 vezes de normal para tumor (Fig. 34A) . Do mesmo modo, a expressão de cMYC seguiu um padrão de expressão similar no paciente #1457, em que a expressão diminuiu em 1,7 vez de normal para PIN, 1,7 vez de PIN para tumor, e 2,8 vezes de normal para tumor (Fig. 34B) . Além disso, não houve diminuição estatisticamente significante da expressão de cMYC nos outros dois pacientes. 0 Paciente #1569 teve uma diminuição de 2,3 vezes de normal para PIN, enquanto no paciente #1586 houve uma diminuição de 1,8 vez de normal para PIN, uma diminuição de 4,3 vezes de PIN para tumor, e uma diminuição de 7,9 vezes de normal para tumor.

Indução da expressão de hBD-1 após inibição de PAX2: para examinar ainda mais o papel de PAX2 na regulação da expressão de hBD-1, foi utilizado siRNA para knockdown da expressão de PAX2, e foi realizada QRT-PCR para monitorar a expressão de hBD-1. O tratamento de células hPrEC com siRNA de PAX2 não exibiu nenhum efeito sobre a expressão de hBD-1 (Fig. 35) . No entanto, o knockdown de PAX2 resultou em um aumento de 42 vezes em LNCaP, um aumento de 37 vezes em PC3, e um aumento de 1.026 vezes em DU145 na expressão de hBD-1, comparadas com células não tratadas. Como controle negativo, as células foram tratadas com siRNA inespecífico que não possui nenhum efeito significativo sobre a expressão de hBD-1. 10. Exemplo 11: Inibição da expressão de PAX2 resulta em vias de morte celular alternativas em células de câncer da próstata que diferem em seu estado de p53

Materiais e métodos

Linhagens celulares: as linhagens de células de câncer PC3, DU145 e LNCaP, que diferem no estado mutacional de p53, foram obtidas da "American Type Culture Collection" (Rockville, MD, EUA) . As células PC3 cresceram em meio F- 12, DUl45 em DMEM e LNCaP em RPMI, todos suplementados com soro bovino fetal 10% (v/v) . A linhagem de células epiteliais da próstata HPrEC foi obtida de Cambrex Bio Science, Inc., (Walkersville, MD), e foi cultivada em meio basal de epitélio da próstata. As células foram mantidas a 37°C em CO2 5%.

Silenciamento de siRNA de PAX2: para se obter um silenciamento gênico eficiente, um pool de quatro ribonucleotídeos intervenientes curtos complementares (siRNAs) direcionados ao mRNA de PAX2 humano (N° de Acesso NM_003 98 9.1) foi sintetizado (Dharmacon Research, Lafayette, CO, EUA) . Para assegurar a especificidade, foram projetados siRNAs para as regiões-alvo exclusivas da seqüência de PAX2 para evitar o knockdown subseqüente de outros membros da família PAX. Além disso, um segundo pool de quatro siRNAs foi usado como controle interno para testar a especificidade de siRNAs de PAX2. Duas das seqüências que foram sintetizados visavam o mRNA de luciferase GL2 (N° de Acesso X65324) , e as outras duas visavam um mRNA de PAX2 embaralhado (Tabela 9).

Análise Western: resumidamente, as células foram coletadas por tripsinização e lavadas duas vezes com PBS. Tampão de Iise foi preparado de acordo com as instruções do fabricante (Sigma) e então adicionado às células. Após um período de incubação de 15 minutos a 40C em uma agitadora orbital, os lisados celulares foram coletados e centrifugados por 10 minutos a 12.000 g para peletizar os restos celulares. Os sobrenadantes contendo proteína foram então coletados e quantificados. A seguir, 25 mg de extrato de proteína foram carregados sobre uma SDS-PAGE com gradiente de 8-16% (Novex). Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF, e então bloqueadas com leite em pó desnatado 5% em TTBS (Tween 20 0,05% e 100 mM de Tris-Cl) por 1 hora. Os blots foram então sondados com anticorpo primário de coelho anti-PAX2 (Zymed, San Francisco, CA) em uma diluição de 1:1.000. Após lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpo anti- coelho conjugado à peroxidase de raiz forte (HRP) (diluição 1:5.000,- Sigma), e a detecção de sinal foi visualizada com o uso de reagentes de quimioluminescência (Pierce) em um Alpha Innotech Fluorchem 8900. Como controle, os blots foram removidos e re-sondados com anticorpo primário de camundongo anti-β-actina (1:5.000; Sigma-Aldrich) e anticorpo secundário anti-camundongo conjugado à HRP (1:5.000; Sigma-Aldrich) , e a detecção de sinal foi novamente visualizada.

Tabela 8. Mutação do gene p53 em linhagens de células de câncer da próstata

<table>table see original document page 219</column></row><table>

Tabela 9. Seqüências de siRNA de PAX2

<table>table see original document page 219</column></row><table> Microscopia por contraste de fase: o efeito do knockdown de PAX2 sobre o número de células foi analisado por microscopia por contraste de fase. Aqui, 1-2 x 10"4 células foram semeadas de um dia para o outro sobre placas de cultura de seis poços (BD Falcon, EUA). A seguir, as células foram tratadas somente com meio, siRNA inespecífico de controle negativo ou siRNA dê PAX2, e permitiu-se a incubação por 6 dias. As células foram então visualizadas sob um microscópio invertido Zeiss IM 35 (Carl Zeiss, Alemanha). As imagens de contraste de fase de um campo de células foram obtidas usando a câmera SPOT Insight Mosaic 4.2 (Diagnostic Instruments, EUA).

Ensaio de citotoxicidade com MTT: suspensões de células DU145, PC3 e LNCaP foram diluídas e semeadas sobre uma placa de 96 de poços a 1-5 x 10"3 células por poço. A seguir, as células foram transfectadas de acordo com o protocolo do fabricante (Promega), com 5 pg/célula do pool de siRNA de PAX2, do pool de siRNA de controle ou do reagente de transfecção Codebreaker isoladamente. Permitiu- se que todas as células crescessem por 2, 4 ou 6 dias após tratamento. A viabilidade celular foi então determinada por medida da conversão de brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2- il]-2,5 difenil tetrazólio, MTT (Promega) em um produto de formazano colorido. A absorbância foi lida a 540 nm em um espectrofotômetro de varredura multipoços.

Detecção de pan-caspase: a detecção da atividade de caspase nas linhagens de células de câncer da próstata foi realizada usando o kit de detecção de caspase APO L0GIX™ Carboxifluoresceína (Cell Technology, Mountain View, CA). As caspases ativas foram detectadas com um inibidor de FAMVAD-FMK que se liga irreversivelmente ãs caspases ativas. Resumidamente, 1-2 x IO4 células foram plaqueadas sobre placas de micropoço com fundo de vidro de 35 mm (Matek, Ashland, MA) e tratadas somente com meio ou siRNA de PAX2, como descrito previamente. A seguir, 3 00 ml de peptideo fluormetil cetona marcado com carboxifluoresceína (FAM-VAD-FMK) foram adicionados a cada placa de 3 5 mm e incubados por 1 hora a 37 0C sob CO2 5%. Finalmente, as células foram lavadas duas vezes com 2 ml de tampão de lavagem e visualizadas sob contraste por interferência diferencial (DIC) ou sob excitação por laser a 488 nm. 0 sinal fluorescente foi analisado usando um microscópio confocal Zeiss LSM 5 Pascal com um Módulo de Varredura de Laser Vario 2 RGB.

RT-PCR quantitativa em tempo real: para verificar as alterações na expressão gênica após knockdown de linhagens de células PAX2 em PC3, DU14 5 e LNCaP, foi realizada RT-PCR quantitativa em tempo real. Aproximadamente 1 x IO6 células foram coletadas por tripsinização e as células foram enxaguadas em PBS. As células foram então lisadas e o RNA total foi isolado por centrifugação por meio de colunas de centrifugação com o uso do Sistema de Isolamento de RNA Total SV (Pro-mega) . cDNA foi gerado (0,5 mg por reação) por transcrição reversa por iniciador Oligo (dT) 15 (Promega) , e a enzima Transcriptase Reversa II AMV (500 U por reação; Promega) para a síntese da primeira fita e DNA Polimerase Tfl para a síntese da segunda fita (500 U por reação; Promega), de acordo com o protocolo do fabricante. Tipicamente, 50 pg de cada cDNA foram usados após PCR. QRT- PCR em duas etapas foi realizada no cDNA gerado usando a Transcriptase Reversa MultiScribe do Sistema de Transcrição Reversa TaqMan e o "SYBR Green PCR Master Mix" (PE Biosystems) . Os pares de iniciadores para ΒΑΧ, BID, BCL-2, AKT e BAD foram gerados a partir das seqüências publicadas (Tabela 10) . As reações foram realizadas em uma Placa de Reação de 96 poços MicroAmp Optical (PE Biosystems) . Quarenta ciclos de PCR foram realizados sob condições padronizadas usando uma temperatura de anelamento de 60°C. A quantificação foi determinada pelo número do ciclo em que a amplificação exponencial se iniciou (valor-limite), e foi obtida a média dos valores obtidos das repetições em triplicata. Houve um relacionamento inverso entre o nível de mensagem e o valor-limite. Além disso, GAPDH foi usado como um gene de manutenção para normalizar o teor inicial de cDNA total. A expressão relativa foi calculada como a proporção entre cada um dos genes e GAPDH. Todas as reações foram feitas em triplicata.

Tabela 10. Iniciadores de RT-PCR quantitativa

<table>table see original document page 222</column></row><table> (ID. DE SEQ. N0: 56)

<table>table see original document page 223</column></row><table>

Ensaio de permeabilidade da membrana: foi realizada a coloração dupla com Acridina laranja (AO)/brometo de etídio (EtBr) para identificar alterações na integridade da membrana celular, bem como células apoptóticas por coloração da cromatina condensada. AO cora células viáveis, bem como células apoptóticas iniciais, enquanto EtBr cora células apoptóticas em estágio tardio que possuem a integridade da membrana comprometida. Resumidamente, células PC3 e LNCaP foram semeadas em lâminas de cultura de duas câmaras (BD Falcon), e as células foram transfectadas com siRNA de PAX2, siRNA inespecífico ou apenas meio. Após tratamento, as células foram lavadas uma vez com PBS e coradas com 2 ml de uma solução (1:1) de uma mistura de AO (Sigma, St. Louis, MO) e EtBr (Promega) (5 mg/ml) por 5 minutos. Após a coloração, as células foram lavadas novamente com PBS. A fluorescência foi visualizada por um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM 5 Pascal Vario 2 (Carl Zeiss) . A roda de cor de excitação contém filtros de bloqueio BS505-530 (verde) e LP560 (vermelho) que permitem a separação de luz verde emitida por AO no canal verde e luz vermelha por EtBr no canal vermelho. Os ajustes de saída de potência do laser e de controle de ganho dentro de cada experimento individual foram idênticos entre células induzidas por controle e por DEFBl. A excitação foi fornecida por um laser a gás misto Kr/Ar em comprimentos de onda de 54 3 nm para AO e 488 nm para EtBr. As lâminas foram analisadas sob ampliação de 40X e as imagens digitais foram armazenadas como arquivos TIFF não compactados e exportadas no software Photoshop CS (Adobe Systems, San Jose, CA) para processamento de imagem e apresentação impressa.

Análise estatística: as diferenças estatísticas foram avaliadas usando o teste t de Student para valores não pareados. Os valores P foram determinados por um cálculo two-sided, e um valor P de menos que 0,05 era considerado estatisticamente significante.

Resultados

Análise da expressão de proteína PAX2 em células da próstata: a expressão de proteína PAX2 foi examinada por análise Western em cultura primária de células da próstata HPrEC e em linhagens de células de câncer da próstata LNCaP, DU145 e PC3. Aqui, a proteína PAX2 foi detectada em todas as linhagens de células de câncer da próstata (Fig. 36A). No entanto, nenhuma proteína PAX2 era detectável em HPrEC. Os blots foram removidos e re-sondados para β-actina como controle interno para assegurar uma carga igual. A expressão de proteína PAX2 também foi monitorada após direcionamento seletivo e inibição por siRNA PAX2- específico em linhagens de células de câncer da próstata DU145, PC3 e LNCaP. As células passaram por uma única rodada de transfecção com o pool de siRNA de PAX2 ao longo de um período de tratamento de seis dias. A proteína PAX2 foi expressa em células de controle tratadas somente com meio. O direcionamento específico de mRNA de PAX 2 foi confirmado por observação de knockdown da proteína PAX2 em todas as três linhagens de células (Fig. 36B).

Efeito do knockdown de PAX2 sobre o crescimento de células de câncer da próstata: o efeito de siRNA de PAX2 sobre o número de células e a viabilidade celular foi analisado usando microscopia óptica e análise de MTT. Para examinar o efeito de siRNA de PAX2 sobre o número de células, linhagens de células PC3, DU145 e LNCaP foram transfectadas somente com meio, siRNA inespecífico ou siRNA de PAX2 ao longo de um período de 6 dias. Cada uma das linhagens celulares alcançou uma confluência de 80-90% em placas de cultura de 6Ό"~ mmcontendo apenas meio. O tratamento de células HPrEC, DU14 5, PC3 e LNCaP com siRNA inespecífico pareceu ter pouco ou nenhum sobre o crescimento celular, comparado com células tratadas somente com meio (Figs. 38A, 38C e 38E, respectivamente) . O tratamento da linhagem de células HPrEC PAX2-null com siRNA de PAX2 pareceu não ter nenhum efeito significativo sobre o. crescimento celular (Fig. 37B) . No entanto, o tratamento das linhagens de células de câncer da próstata DU145, PC3 e LNCaP com siRNA de PAX2 resultou em uma diminuição significativa no número de células (Figs. 38D, 38F e 38H, respectivamente).

Efeito do knockdown de PAX2 sobre a viabilidade de células de câncer da próstata: a viabilidade celular foi medida após tempos de exposição de 2, 4 e 6 dias. O percentual de viabilidade foi calculado como a proporção da absorbância a 570-630 nm de células tratadas com siRNA de PAX2 dividida pelas células não tratadas de controle. Como controles negativos, a viabilidade celular foi medida após cada período de tratamento com siRNA inespecífico de controle negativo ou transfecção apenas com reagente. A viabilidade celular relativa foi calculada dividindo-se o percentual de viabilidade após tratamento com siRNA de PAX2 pelo percentual de viabilidade após o tratamento com siRNA inespecífico (Fig. 38). Após 2 dias de tratamento, a viabilidade relativa era de 116% em DU145, 81% em PC3 e 98% em LNCaP. Após 4 dias de tratamento, a viabilidade celular relativa diminuiu para 69% em DU145, 79% em PC3 e 80% em LNCaP. Finalmente, em 6 dias, a viabilidade relativa foi de 63% em DU145, 43% em PC3 e 44% em LNCaP. Além disso, a viabilidade celular também foi medida após o tratamento apenas com reagente de transfecção. Aqui, todas as linhagens celulares não exibiram diminuição significativa da viabilidade celular.

Detecção da atividade de pan-caspase: a atividade de caspase foi detectada por análise microscópica por laser confocal. Células LNCaP, DU14 5 e PC3 foram tratadas com siRNA de PAX2, e a atividade foi monitorada com base na ligação de peptídeo marcado com FAM às caspases em células que passam ativamente por apoptose que irão apresentar fluorescência verde. A análise de células somente com meio mostra a presença de células LNCaP, DU14 5 e PC3 viáveis, respectivamente. A excitação pelo laser confocal a 488 nm não produziu coloração verde detectável, o que indica ausência de atividade de caspase nas células não tratadas (Figs. 3 9A, 3 9C e 3 9E, respectivamente). Após 4 dias de tratamento com siRNA de PAX2, as células LNCaP, DU14 5 e PC3 sob fluorescência apresentaram coloração verde, indicando atividade de caspase (Figs. 39B, 39D e 39F, respectivamente).

Efeito da inibição de PAX2 sobre fatores apoptóticos: células LNCaP, DU14 5 e PC3 foram tratadas com siRNA contra PAX 2 por 4 dias, e a expressão de fatores pró- e anti- apoptóticos foi medida por QRT-PCR. Após knockdown de PAX2, a análise de BAD revelou ura aumento de 2 vezes em LNCaP, 1,58 vez em DU145 e 1,375 vez em PC3 (Fig. 40A). Os níveis de expressão de BID aumentaram em 1,38 vez em LNCaP e 1,78 vez em DU145, mas não houve diferença estatisticamente significativa em BID observada em PC3 após supressão da expressão de PAX2 (Fig. 40B). A análise do fator anti- apoptótico AKT revelou uma diminuição de 1,25 vez na expressão em LNCaP e uma diminuição de 1,28 vez em DU145 após o tratamento, mas não foram observadas alterações em PC3 (Fig. 40C).

Análise de integridade da membrana e necrose: a integridade da membrana foi monitorada por análise confocal em células LNCaP, DU145 e PC3. Aqui, as células intactas coraram em verde por causa da AO, que é permeável à membrana, enquanto as células com membranas plasmáticas comprometidas coraram em vermelho em função da incorporação do EtBr impermeável à membrana no citoplasma, e em amarelo em função da co-localização de AO e EtBr nos núcleos. Células LNCaP, DU145 e PC3 não tratadas coraram

positivamente com AO e emitiram cor verde, mas não coraram

com EtBr. Após knockdown de PAX2, não havia alterações observáveis na integridade da membrana em células LNCaP, como indicado por fluorescência verde positiva com AO e ausência de fluorescência vermelha de EtBr. Esses achados indicam ainda que células LNCaP podem passar por apoptose, mas não apresentam morte celular necrótica após knockdown de PAX2. Inversamente, o knockdown de PAX2 em células DU145 e PC3 resultou no acúmulo de EtBr no citoplasma, como indicado pela coloração vermelha. Além disso, tanto DU145

quanto PC3 possuíam núcleos condensados que aparecem em amarelo em função da co-localização da coloração verde e vermelha de AO e EtBr, respectivamente. Esses resultados indicam que as células DU14 5 e PC3 passam por uma via alternativa de morte celular que envolve a morte celular necrótica, comparadas com as células LNCaP.

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G. SEQÜÊNCIAS LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> UNIVERSIDAPE DE MEDICINA DA CAROLINA DO STJL CARLTON p. DONALD <120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA O DIAGNÓSTICO, TRATAMENTO E PREVENÇÃO DE CQNDIÇÕES DA PRÓSTATA

<13Q> 19113.0129P2

<150> 60/885,142 <151> 16-01-2007

<160> 68

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> ι

<211> 5 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 1

ccttg 5

<210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 2

auagacucga cuugacuucu u

<210> 3 <211> 21 <212> RNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 3

gaggaaacgu gaugaagauu u

<210> 4 <211> 21 <212> RNA

<213> Seqüência Artificial

Artificial: nota =

21

Artificial: nota =

21

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética <400> 4

aucuucauca cguuuccucu u

<210> 5 < 211> 21 <212> RNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Construção Sintética

<400> 5

ggacaagauu gcugaauacu u

<210> 6 <211> 21 <212> RNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial

Construção Sintética <400> 6

guauucagca aucuuguccu u

<210> 7 <211> 21 <212> RNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 7

caucagagca çaucaaaucu u

<210> 8 <211> 21 <212> RNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 8

gauuugaugu gcucugaugu u

<210> 9 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

Artificial: nota =

21

Artificial: nota =

21

Artificial: nota =

<400> 9 ctcccttcag ttccgtcgac

<210 > 10 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Construção Sintética

<400> 10

ctcccttcac cttggtcgac

<210> 11 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0 >

<223> Descrição da Seqüência Artificial Construção Sintética

<400> 11

ctcccttcac tctggtcgac

<210> 12 <211> 40 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 12

actgtggcac ctcccttcag ttccgtcgac gaggttgtgc 40

<210> 13 <211> 40 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 13

actgtggcac ctcccttcac cttggtcgac gaggttgtgc 40

<210> 14 <211> 40 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 14 actgtggcac ctcccttcac tctggtcgac gaggttgtgc 40

<210> 15 <211> 21 <212 > RNA

<213> Seqüência Artificial <220 >

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 15

gaagucaagu cgagucuauuu 21

<210> 16 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 16

ccacccatgg caaattccat ggca 24

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 17

ctcaggccta tgcaaaaaga gga

<210> 18 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 18

aacctacgca cctacgtgag gag

<210 > 19 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

Artificial: nota =

23

Artificial: nota =

23

Artificial: nota =

<400> 19 gacacctgag ctgaccttgg 20

<210> 20 <211> 24 <212 > DNA

<213> Sequênçia Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 20

tctagacggc aggtcaggtc aacc

Artificial: nota =

24

<210> 21 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 21

gccctccctc caaaggagac

Artificial: nota =

20

<210> 22 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 22

cgttcagtcc atcccatttc tg

<210> 23 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 23

gaggaagtcc agtgtccagc

<210> 24 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

22

Artificial: nota =

20

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 24 agaagttcac ccttgactgt

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Construção Sintética

<400> 25

agaagttcac gttccactgt

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Construção Sintética

<400> 26

agaagttcac gctctactgt

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 27

ttagcgatta gaagttcacc cttgactgtg gcacctccc 3 9

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 28

gttagcgatt agaagttcac gttccactgt ggcacctccc 40

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 29 gttagcgatt agaagttcac gctctactgt ggcacctccc 40

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 30

cctggcaccc agcacaat

<210> 31

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

18

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 31

gttgcctgcc agtcgccatg agaacttcct ac 32

<210> 32 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220 >

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<4Q0> 32

gccgatccac acggagtact 2 0

<210> 33 <211> 32 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 33

tggccttccc tctgtaacag gtgccttgaa tt 32

<210> 34 <211> 135 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 34 Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Arg His

1 5 10 15

Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro Leu

20 25 30

Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly Val

35 40 45

Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys Val

50 55 60

Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro Gly 65 70 75 80

Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val Asp

85 90 95

Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp Glu

100 105 110

Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr Val

115 120 125

Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn 130 135

<210> 35 <211> 7331 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<220> <221> misc_característica

<222> (O) ... (O)

<223> n = a, c, g, ou t

<400> 35

ttcccccttt ccangagggc ctaatccgtt gcgcgcgcgc acgcggacac acacacacac 60

acacacacac acacacacac acacacggcc cccatagcca ccgcaactct cagcagcagn 120

ncctagctcc tctgacccga ggccccaaga cggcgggcac aggaacccct gggacgtcct 180

ggctccaggc tggacgtagg cggaggtggc aggagtggac aaacccaggc gggtcccacg 240

acgccccttt cctcgggtct ctccttgttt cagccagccg ctctcgcccc tggtcccctc 300

ttccctgcgt tagggtcctt tgtctccagc cacctcgcag cctgtccccg cctcggcggc 360

cctgcccttt gggcctccca gatctctctg gcgggtcccc ctgccttacc agctcccggc 420

tgtggcgcgc tcttcgcctg ctcctcacat ncacacagct gctgggagag gaggaaggaa 480

aggcggncgc gccgcggatg gatccgagac ggtagatttg gtgccggctc gcaaactctg 540

ggaaacttaa ngccggttct tccgcccctc tncaactatg nccagcgcgg cccggtcgcg 600

cgcgctcacc ccgcggggac cctttccttt tcctgtattt cggctgcggc tgtttcgctt 660

cctctggtct cccagccttt ggagtggctt ccctggccct gcactccgtt ccctttcggc 720 cgcccccggc tgtcgcctgc ccccaccctc cgcaggtccc acggtcgcgg cggcgatgac 780

tgtggaggta acgccgggga cgtcctgggt cagcctgcac cgtctccctc gaccacagcc 840

cgatgaggcc gcgggctccg ggccggctgc taagagagtt aatcattact tcgccagcga 900

cactcagcct ccccttccga ctctctcgcc cggcctaggg gaggagggga ggggacagct 960

ggccaggtgg ggacttcggc ttcgcacaaa ccagcctctt caggcctccc agagacaggt 1020

ggtggcttct cagttccctc ggcaactctc taaggtcctc tttcttcccc tcctgtctct 1080

ccctccttcg agcctcctcc cagccaggcc tctccccacc gtctcctgtc cgctctggct 1140

ttgactgatt aactgcaggt cctgggagaa ccaactttct ttgtttggaa ccggaccgga 12 0 0

cgggatttcc ttccctaggt ctccgccaat gggccagctc ctcccgacgg ttttggcgga 1260

ctggctgaag aggaccgcgc ctgaggccac aattaacccg gctgttggtg gtggtggttg 1320

agtgaggaat ttaaccgatc ctctagcagc tgcgctggtg cagttgggag 13 80

gggggtgcag gaagtgggaa tggaggagtg gcaggaggta tagacagagg gaagaacgat 144 0

aaacctggac aggtgtggca tagccaatag aaggggaaac aaaataaaac aggaaggcgg 1500

cgcggggagg aatccccagt aacctttata ggattgaagt tgggtggaaa acgccacctc 1560

ctgccctacc ttagcactca gatccctcct ttacctcttt gtgaaagggt aagagttcag 162 0 aaagctggcc atttactcca taatctacta gagaaatgtc tgggtttgca aaatgcctat 1680

tgattagctc catggagtag acaagacagg cgtaattatc cccattttac aggtgagaaa 1740

actgagtctc aaagaagcaa agggactgtg tatgtagtgg ctgtcacttt ttcctgtagg 1800

ctgtggggtg agtggcccct ttagctgtgc agaggtccat gggtatctag ggaggcggta 1860

caggctgtgt ccaggtctga gccagaagta ccagggcctc acggggctcc tagccctttt 1920

agcttgttct ctgttggaca ggaccttcac tcttactctc tagacctgct ggctgggttt 1980

ctcccagctt cgctattttt tcagttccct agtagagtgg cccatgggcg gtagccacct 2040

ggctggcccg tgccactaag aggcagcttt ggtggccaag tggcttgcat tgttgttgct 2100

cctcaaaggg cctgtgaagg gctgggcagg tcgcaaagac ctcttgtgag gggaaagcta 2160

gattaaaggg ggtaaggatc ctggaggata aaggccaagc acgtgcgcct ggactccaca 2220

ggaccaacag accgagcggg cggggccngc tgggagtcag gccccccggg cttcacgcag 2280

ggagcccaaa tattgggaac aaaagcagga aaagaagagt gagagcagga gggagggagg 2340

gagcgaggaa gcagaaatta gggggtctta gatgaaaaaa aaaagaaagt agctttaggg 2400

ggaatgtgct gtggagtgtg aaattgcagc ccatggtgct ccatattgta ccagaagctc 2460

ttccaaaaaa aaaaaaaaaa accatcctcc aacgtgacca gagggccagg cagggggaag 2520 ggcggggaga gaatggggag gaggaggggg aaaggccggg caggagccgg tcaggccttt 2580

ctgcggaagg ggctggggtg taagtttcgg ctccctggga tctgacagcc gagggtatgc 2640

gccctggggt gcgccgggac ccagagggcg agtgagcctc ggttggtcgg ctctggagtt 2700

cggttgtcag aagaactttt atttttcttt ttggtggtga cttctaaaag tgggaataat 2760

ccagaaatga agctcagctg cggagctgca gctctgttct ccctctctcc cctgcctttc 2820

tgcttctctt cccttcggac tacttttctc cccttggttc taaatagctt tttcccctct 2880

gaactttaat gcatttaatt tggtccgcgc tgtggggagc atttcctggg gagatgcatt 2 94 0

taatttcgga atttctaatc ccctccctca gaccccggtc ctagctcccc tagccgctcc 3000

ccgggaagtg gaaggaggaa ggcaggtccc ggccacgggg gaggggcgcg gctgggatgc 3 060

tcccgcggcc ccctccgtct caccaaggct cagccgcctt cccaagctac tggaggccgg 312 0

gcgcctgggc cccgggtcag ggccctgcan gaagaagaga ggcaaccccc gctttctgcc 3180

ttttcttcgc ctgggcaaga aaacgctggg ccagggaact ggaaaccgga aaacaggaga 3240

aagggtttnt ggaaggcanc gggagcgggt ggcagncggg gcancgggca ntggactagg 3300

tctacaccgg cacttcactt ttgcacaaca tgcccagaaa cgcatttgag agccctggag 3 3 60

tcgcgcttgg cttggcttgg ggcgccggtg cgtgggtaca ctcgaggtcg gggtgcctat 3420 ccgccacccc gacacctaca cccagtgcag agcaggcgcg gcccagccag acaaccaggc 3480

cggcagtagc tcggcctgga gggcggaggc aaggttgggg gccgccaggc gcctgggcaa 3540

gcctggcagg gaagggagcc gagaaggcaa aggagccgag atccacaagg aagattnntt 3600

gggcagatca gatgcacaga ggcggctaat gaagcaaatc ccgagatggg tttcagagca 3660

actccccaaa agtttatttt gcctttaaat ttccgcaggg aggcgggctc cttgtttgaa 3720

gtgtaaatgc ccctaggttg gggggtggaa gggccgcttt gaaaacacca gagagaaaag 3780

gttcatttag aggcggacgg gaaaagcaac caaccctgac aggtcggagc ccgggtagtg 3840

tttggggttg ggtngttttc tttctttctc tttcttttcc cctttcctct tctttcttcc 3900

cttttgtgnn ttttnnttgt tttttttntn ttntttttnt ttaantggct ttcttgcttc 3960

cccccacccc tctactagac tctatagaag aaagagaaca gaaaaggggg agtcagagga 4020

gcggccagtg actggatgaa ggccagccct tcatcctgga gccccaggag aaggcagagc 4080

tttggagaaa aggggttcct aatctccagg gagcattact ctttgactct ctagacccag 4140

gaatgggctg gacgctaatg gggaagcggc caggaacccg gcctggcgga agagtgagtg 4200

tccagctagt gcagtgctgg gaagacgatc ccaggagcag gggggactct caggggctac 4260

ctgggaatgg gactatcaga agggtcttta ctcctcanaa ggtgcatgtg aaggacaggt 4320 gtgtgaggac aacttccagc acacttggcg cattaagtcc ccttctctac aaaatggaaa 4380

atccttctcg cccaacatgt gaaaatgctt gttgtgggca cccacatttc atggtacttg 4440

taacatagga catgtctagc tggttctaga aaaatctgtg tctgtgtgga aggggggggg 450ο

tttactcaca gctttcttcc ttcaatagtt cacacacccc gagacaaatt cctggatgac 4560

caacttggag agacctgggg caaaggttac tttagttctg agctcctcta aataaggacc 4620

ctttctcaac gttcctttca ccccagttct gggttaatta cttccagtta gtgcgtgttc 4680

gtggggttgt gaggccaaag caaacccggg agcgccatct gcaggcctca agaggaagag 4740

actgacctta gaggctaggc cctgcgtctt caacctctag cccaagggaa ccaacctgcc 4800

tagccaccca agggaagtgg gataggggct gggaggggca ggcggtgagg agtgttttcc 4860

tcccagactt taccccgcag gtggattaag cttattgggc tctggaggat acaggaggga 4920

gggcaaatgc caggatccca gcggacccag gccccacagg agtgagaggc tcagaacctc 4980

gtcccgctga gcctggcctg agctcctcct gaggaataag ggcatcccaa aaacccgggt 5040

acaagacgcc cagtagtagt agttaggctg agtcaggcag gtgcatctct ccccatggta 5100

tctgccgccc aggctccggc cagagggagg ggagcgcgag tccgcggcgc ttccgcgggg 5160

cgcccggaac tgcagacggg ggctggagga atctcggatt cgggctgcaa gagcgctgcg 5220 caagcttcgc cgagccgccc tttcgcagac ccagggaagc ggggggaggg agcgaaggag 5280

ggagagagag ttaaaacatc agcttgaaag tgcccaagat gattttatta agaccgaggg 5340

gaaaattatt ttcatgaaag attctccccg gaatatttct tgtacttaac ccagttagga 5400

agacaaaggg cttctttctg cctggtgcgg tgcgagcgga ccccagcgag caagggagct 5460

agtgccaaag agaactgcgg aggctccggc aggagtgggg acgtccccgt ggttgcgcct 5520

cctgcgctcg ccccggatcc accgagctag cagcgggcgg cgctcagccg cgtccgcagc 5580

ctcctcttct ccccagccgg ggagagccag cctcgtctcc cacatcctct gccgccagcg 5640

acctgcagct ccgcactgtt tccctcccct gtaccccctt cccagtcacc cgagggttca 5700

gaaaccaagt cccccggctc tcccgccatc cgctgggtcc caccgaggca ggtgggtact 5760

cgccggaggt cttcagctcg attctgaacc aagcgttctg gactgcccag acccggtggg 5820

caaggggact ggggaggccc tgcgcacagt cgcgtggaac gggaggggac aagacaaact 5880

gctggacact tttccgtgga atgagaagtg gggggtgcgt gggtgggaag gtacctccgg 5940

agggaaaggc caaagggaag gaccagaaag agaggaagga agagccggga aggaacggaa 6000

gggaactcag agccgagggt ggtggggttg gggctaggga tgcgcactgg gcccggggcc 6060

gcgcggccca ggcgggcact ggccagtgga tggcagggct gggcgagtta gaactgagag 6120 cccggcttca cagcgcagcg cgctccgagg ccctctgtcg ttacctgaat attcattaga 6180

ctgaccgctc tttatcctta tctaacgttt atcttatcgg cgagtttcgt ttctcagtgt 6240

agttttaatc ccgggctccc attccccctc ccccggtccg ctcccctccc tccctcttcc 6300

ttcgccggct gctccctccc tccctccctc ccatttctcc ctcccctgcc ctccccttgc 6360

cggcaccgga gtgacaggct cggggccctc ctcgccgaag ctcggggctc cagcgctggc 6420

gaatcacaga gtggtggaat ctattgcctt tgtctgacaa gtcatccatc tcccggcgcg 6480

gggaggggga ggaggtctgg agggggcttt gcagctttta gagagacaca caccgggagc 6540

cgaggctcca gtctccggcc gagtcttcta gcagccgcaa cccacctggg gccagcccag 6600

agctgccagc gccgctcggc tccctccctc cctcccggcc cttcggccgc ggcggcgtgc 6660

gcctgccttt tccgggggcg ggggcctggc ccgcgcgctc ccctcccgca ggcgccacct 6720

cggacatccc cgggattgct acttctctgc caacttcgcc aactcgccag cacttggaga 6780

ggcccggctc ccctcccggc gccctctgac cgcccccgcc ccgcgcgctc tccgaccacc 6840

gcctctcgga tgaacaggtt ccaggggagc tgagcgagtc gcctcccccg cccagcttca 6900

gccctggctg cagctgcagc gcgagccatg cgcccccagt gcaccccggc ccggcccacc 6960

gccccggggc cattctgctg accgcccagc cccgagcccc gacagtggca agttgcggct 7020 actgcggttg caagctccgg ccaacccgga ggagccccag cggggagcgc agtgttgcgc 7080

cccccgcccc cgcgcgcgcc gcagcagccg ggcgttcact catcctccct cccccaccgt 7140

ccctcccttt tctcctcaag tcctgaagtt gagtttgaga ggcgacacgg cggcggcggc 7200

cgcgctgctc ccgctcctct gcctccccat ggatatgcac tgcaaagcag accccttctc 7260

cgcgatgcac cgtgagtacc cgçgcccggc tcctgtcccg gctcgggctc tccgtcccaa 7320 ccctgtccag t 7331

<210> 36 <211> 416 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 36

Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly

15 10 15

His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro

20 25 30

Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly 35 40 45 Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys 50 55 60

Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro 65 70 75 80

Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val 85 90 95

Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp 100 105 110

Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr 115 120 125

Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln 130 135 140

Gln Pro Phe His Pro Thr Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Val Thr Ala 145 150 155 160

Pro Gly His Thr Ile Val Pro Ser Thr Ala Ser Pro Pro Val Ser Ser 165 170 175

Ala Ser Asn Asp Pro Val Gly Ser Tyr Ser Ile Asn Gly Ile Leu Gly 180 185 190

Ile Pro Arg Ser Asn Gly Glu Lys Arg Lys Arg Asp Glu Val Glu Val 195 200 205

Tyr Thr Asp Pro Ala His Ile Arg Gly Gly Gly Gly Leu His Leu Val 210 215 220

Trp Thr Leu Arg Asp Val Ser Glu Gly Ser Val Pro Asn Gly Asp Ser 225 230 235 240

Gln Ser Gly Val Asp Ser Leu Arg Lys His Leu Arg Ala Asp Thr Phe 245 250 255

Thr Gln Gln Gln Leu Glu Ala Leu Asp Arg Val Phe Glu Arg Pro Ser 260 265 270

Tyr Pro Asp Val Phe Gln Ala Ser Glu His Ile Lys Ser Glu Gln Gly 275 280 285 Asn Glu Tyr Ser Leu Pro Ala Leu Thr Pro Gly Leu Asp Glu Val Lys

290 295 300

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Thr Asn Pro Glu Leu Gly Ser Asn Val Ser 305 310 315 320

Gly Thr Gln Thr Tyr Pro Val Val Thr Gly Arg Asp Met Ala Ser Thr

325 330 335

Thr Leu Pro Gly Tyr Pro Pro His Val Pro Pro Thr Gly Gln Gly Ser

340 345 350

Tyr Pro Thr Ser Thr Leu Ala Gly Met Val Pro Gly Ser Glu Phe Ser

355 360 365

Gly Asn Pro Tyr Ser His Pro Gln Tyr Thr Ala Tyr Asn Glu Ala Trp

370 375 380

Arg Phe Ser Asn Pro Ala Leu Leu Ser Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ser Ala 385 390 395 400

Ala Pro Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Asp Arg His

405 410 415

<210> 37 <211> 4276 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 37

aggctccagt ctccggccga gtcttctcgç agccgcaacc cacctggggc cagcccagag 60 ctgccagcgc cgctcggctc cctccctccc tcccggccct tcggccgcgg cggcgtgcgc 120

ctgccttttc cgggggcggg ggcctggccc gcgcgctccc ctcccgcagg cgccacctcg 180

gacatccccg ggattgctac ttctctgcca acttcgccaa ctcgccagca cttggagagg 240

cccggctccc ctcccggcgc cctctgaccg cccccgcccc gcgcgctctc cgaccaccgc 300

ctctcggatg accaggttcc aggggagctg agcgagtcgc ctcccccgcc cagcttcagc 360

cctggctgca gctgcagcgc gagccatgcg cccccagtgc accccggccc ggcccaccgc 420

cccggggcca ttctgctgac cgcccagccc cgagccccga cagtggcaag ttgcggctac 480

tgcagttgca agctccggcc aacccggagg agccccagcg gggagcgcag tgttgcgccc 540

cccgcccccg cgcgccccgc agcagccggg cgttcactca tcctccctcc cccaccgtcc 600

ctcccttttc tcctcaagtc ctgaagttga gtttgagagg cgacacggcg gcggcggccg 660

cgctgctccc gctcctctgc ctccccatgg atatgcactg caaagcagac cccttctccg 720

cgatgcaccc agggcacggg ggtgtgaacc agctcggggg ggtgtttgtg aacggccggc 780

ccctacccga cgtggtgagg cagcgcatcg tggagctggc ccaccagggt gtgcggccct 840

gtgacatctc ccggcagctg cgggtcagcc acggctgtgt cagcaaaatc ctgggcaggt 900

actacgagac cggcagcatc aagccgggtg tgatcggtgg ctccaagccc aaagtggcga 960 cgcccaaagt ggtggacaag attgctgaat acaaacgaca gaacccgact atgttcgcct 1020

gggagattcg agaccggctc ctggccgagg gcatctgtga caatgacaca gtgcccagcg 1080

tctcttccat caacagaatc atccggacca aagttcagca gcctttccac ccaacgccgg 1140

atggggctgg gacaggagtg accgcccctg gccacaccat tgttcccagc acggcctccc 1200

ctcctgtttc cagcgcctcc aatgacccag tgggatccta ctccatcaat gggatcctgg 1260

ggattcctcg ctccaatggt gagaagagga aacgtgatga agttgaggta tacactgatc 1320

ctgcccacat tagaggaggt ggaggtttgc atctggtctg gactttaaga gatgtgtctg 1380

agggctcagt ccccaatgga gattcccaga gtggtgtgga cagtttgcgg aagcacttgc 1440

gagctgacac cttcacccag cagcagctgg aagctttgga tcgggtcttt gagcgtcctt 1500

cctaccctga cgtcttccag gcatcagagc acatcaaatc agaacagggg aacgagtact 1560

ccctcccagc cctgacccct gggcttgatg aagtcaagtc gagtctatct gcatccacca 1620

accctgagct gggcagcaac gtgtcaggca cacagacata cccagttgtg actggtcgtg 1680

acatggcgag caccactctg cctggttacc cccctcacgt gccccccact ggccagggaa 1740

gctaccccac ctccaccctg gcaggaatgg tgcctgggag cgagttctcc ggcaacccgt 1800

acagccaccc ccagtacacg gcctacaacg aggcttggag attcagcaac cccgccttac 1860 taagttcccc ttattattat agtgccgccc cccggtccgc ccctgccgct gctgccgctg 1920

cctatgaccg ccactagtta ccgcggggac cacatcaagc ttcaggccga cagcttcggc 1980

ctccacatcg tccccgtctg accccacccc ggagggaggg aggaccgacg cgacgcgatg 2040

cctcccggcc accgccccag cctcacccca tcccacgacc cccgcaaccc ttcacatcac 2100

ccccctcgaa ggtcggacag gacgggtgga gccgtgggcg ggaccctcag gcccgggccc 2160

gccgccccca gccccgcctg ccgcccctcc ccgcctgcct ggactgcgcg gcgccgtgag 2220

ggggattcgg cccagctcgt cccggcctcc accaagccag ccccgaagcc cgccagccac 2280

cctgccggac tcgggcgcga cctgctggcg cgcgccggat gtttctgtga cacacaatca 2340

gcgcggaccg cagcgcggcc cagccccggg cacccgcctc ggacgctcgg gcgccaggag 2400

gcttcgctgg aggggctggg cçaaggagat taagaagaaa acgactttct gcaggaggaa 2460

gagcccgctg ccgaatccct gggaaaaatt çttttccccc agtgccagcc ggactgccct 2520

cgccttccgg gtgtgccctg tcccagaaga tggaatgggg gtgtgggggt ccggctctag 2580

gaacgggctt tgggggcgtc aggtctttcc aaggttggga cccaaggatc ggggggccca 264 0

gcagcccgca ccgatcgagc cggactctcg gctcttcact gctcctcctg gcctgcctag 2700

ttccccaggg cccggcacct cctgctgcga gacccggctc tcagccctgc cttgccccta 2760 cctcagcgtc tcttccacct gctggcctcc cagtttcccc tcctgccagt ccttcgcctg 2820

tcccttgacg ccctgcatcc tcctccctga ctcgcagccc catcggacgc tctcccggga 2880

ccgccgcagg accagtttcc atagactgcg gactggggtc ttcctccagc agttacttga 2940

tgccccctcc cccgacacag actctcaatc tgccggtggt aagaaccggt tctgagctgg 3000

cgtctgagct gctgcggggt ggaagtgggg ggctgcccac tccactcctc ccatcccctc 3060

ccagcctcct cctccggcag gaactgaaca gaaccacaaa aagtctacat ttatttaata 3120

tgatggtctt tgcaaaaagg aacaaaacaa cacaaaagcc caccaggctg ctgctttgtg 3180

gaaagacggt gtgtgtcgtg tgaaggcgaa acccggtgta cataacccct ccccctccgc 3240

cccgccccgc ccggccccgt agagtccctg tcgcccgccg gccctgcctg tagatacgcc 33 00

ccgctgtctg tgctgtgaga gtcgccgctc gctggggggg aaggggggga cacagctaca 3360

cgcccattaa agcacagcac gtcctggggg aggggggcat tttttatgtt acaaaaaaaa 3420

attacgaaag aaaagaaatc tctatgcaaa atgacgaaca tggtcctgtg gactcctctg 3480

gcctgttttg ttggctcttt ctctgtaatt ccgtgttttc gctttttcct ccctgcccct 3540

ctctccctct gcccctctct cctctccgct tctctccccc tctgtctctg tctctctccg 3600

tctctgtcgc tcttgtctgt ctgtctctgc tctttcctcg gcctctctcc ccagacctgg 3660 cccggccgcc ctgtctccgc aggctagatc cgaggtggca gctccagccc ccgggctcgc 3720

cccctcgcgg gcgtgccccg cgcgccccgg gcggccgaag gccgggccgc cccgtcccgc 3780

cccgtagttg ctctttcggt agtggcgatg cgccctgcat gtctcctcac ccgtggatcg 3840

tgacgactcg aaataacaga aacaaagtca ataaagtgaa aataaataaa aatccttgaa 3900

caaatccgaa aaggcttgga gtcctcgccc agatctctct cccctgcgag ccctttttat 3960

ttgagaagga aaaagagaaa agagaatcgt ttaagggaac ccggcgccca gccaggctcc 4020

agtggcccga acggggcggc gagggcggcg agggcgccga ggtccggccc atcccagtcc 4080

tgtggggctg gccgggcaga gaccccggac ccaggcccag gcctaacctg ctaaatgtcc 4140

ccggacggtt ctggtctcct cggccacttt cagtgcgtcg gttcgttttg attctttttc 4200

ttttgtgcac ataagaaata aataataata ataaataaag aataaaattt tgtatgtcaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaa 4276

<210> 38 <211> 393 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 38

Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly 1 5 10 15

His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro 20 25 30

Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly 35 40 45

Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys 50 55 60

Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro 65 70 75 80

Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val 85 90 95

Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp 100 105 110

Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr 115 120 125

Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln 130 135 140

Gln Pro Phe His Pro Thr Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Val Thr Ala 145 150 155 160

Pro Gly His Thr Ile Val Pro Ser Thr Ala Ser Pro Pro Val Ser Ser 165 170 175

Ala Ser Asn Asp Pro Val Gly Ser Tyr Ser Ile Asn Gly Ile Leu Gly 180 185 190

Ile Pro Arg Ser Asn Gly Glu Lys Arg Lys Arg Asp Glu Asp Val Ser 195 200 205

Glu Gly Ser Val Pro Asn Gly Asp Ser Gln Ser Gly Val Asp Ser Leu 210

Arg Lys His Leu 225

Leu Asp Arg Val

Ser Glu His Ile 260

Leu Thr Pro Gly 275

Asn Pro Glu Leu 290

Val Thr Gly Arg 305

His Val Pro Pro

Gly Met Val Pro 340

Gln Tyr Thr Ala 355

Leu Ser Ser Pro 370

Ala Ala Ala Ala 385

215

Arg Ala Asp Thr 230

Phe Glu Arg Pro 245

Lys Ser Glu Gln

Leu Asp Glu Val 280

Gly Ser Asn Val 295

Asp Met Ala Ser 310

Thr Gly Gln Gly 325

Gly Ser Glu Phe

Tyr Asn Glu Ala 360

Tyr Tyr Tyr Ser 375

Ala Tyr Asp Arg 390

220

Phe Thr Gln Gln 235

Ser Tyr Pro Asp 250

Gly Asn Glu Tyr 265

Lys Ser Ser Leu

Ser Gly Thr Gln 300

Thr Thr Leu Pro 315

Ser Tyr Pro Thr 330

Ser Gly Asn Pro 345

Trp Arg Phe Ser

Ala Ala Pro Arg 380

His

Gln Leu Glu Ala 240

Val Phe Gln Ala 255

Ser Leu Pro Ala 270

Ser Ala Ser Thr 285

Thr Tyr Pro Val

Gly Tyr Pro Pro 320

Ser Thr Leu Ala 335

Tyr Ser His Pro 350

Asn Pro Ala Leu 365

Ser Ala Pro Ala

<210> 39 <211> 4207 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 39

aggctccagt ctccggccga gtcttctcgc agccgcaacc cacctggggc cagcccagag 6 0

ctgccagcgc cgctcggctc cctccctccc tcccggccct tcggccgcgg cggcgtgcgc 120

ctgccttttc cgggggcggg ggcctggccc gcgcgctccc ctcccgcagg cgccacctcg 180

gacatccccg ggattgctac ttctctgcca acttcgccaa ctcgccagca cttggagagg 240

cccggctccc ctcccggcgc cctctgaccg cccccgcccc gcgcgctctc cgaccaccgc 300

ctctcggatg accaggttcc aggggagctg agcgagtcgc ctcccccgcc cagcttcagc 360

cctggctgca gctgcagcgc gagccatgcg cccccagtgc accccggccc ggcccaccgc 420

cccggggcca ttctgctgac cgcccagccc cgagccccga cagtggcaag ttgcggctac 480

tgcagttgca agctccggcc aacccggagg agccccagcg gggagcgcag tgttgcgccc 540

cccgcccccg cgcgccccgc agcagccggg cgttcactca tcctccctcc cccaccgtcc 600

ctcccttttc tcctcaagtc ctgaagttga gtttgagagg cgacacggcg gcggcggccg 660

cgctgctccc gctcctctgc ctccccatgg atatgcactg caaagcagac cccttctccg 720 cgatgcaccc agggcacggg ggtgtgaacc agctcggggg ggtgtttgtg aacggccggc 780

ccctacccga cgtggtgagg cagcgcatcg tggagctggc ccaccagggt gtgcggccct 840

gtgacatctc ccggcagctg cgggtcagcc acggctgtgt cagcaaaatc ctgggcaggt 900

actacgagac cggcagcatc aagccgggtg tgatcggtgg ctccaagccc aaagtggcga 960

cgcccaaagt ggtggacaag attgctgaat acaaacgaca gaacccgact atgttcgcct 1020

gggagattcg agaccggctc ctggccgagg gcatctgtga caatgacaca gtgcccagcg 1080

tctcttccat caacagaatc atccggacca aagttcagca gcctttccac ccaacgccgg 1140

atggggctgg gacaggagtg accgcccctg gccacaccat tgttcccagc acggcctccc 1200

ctcctgtttc cagcgcctcc aatgacccag tgggatccta ctccatcaat gggatcctgg 1260

ggattcctcg ctccaatggt gagaagagga aacgtgatga agatgtgtct gagggctcag 1320

tccccaatgg agattcccag agtggtgtgg acagtttgcg gaagcacttg cgagctgaca 1380

ccttcaccca gcagcagctg gaagctttgg atcgggtctt tgagcgtcct tcctaccctg 1440

acgtcttcca ggcatcagag cacatcaaat cagaacaggg gaacgagtac tccctcccag 1500

ccctgacccc tgggcttgat gaagtcaagt cgagtctatc tgcatccacc aaccctgagc 1560

tgggcagcaa cgtgtcaggc acacagacat acccagttgt gactggtcgt gacatggcga 1620 gcaccactct gcctggttac ccccctcacg tgccccccac tggccaggga agctacccca 1680

cctccaccct ggcaggaatg gtgcctggçfa gcgagttctc cggcaacccg tacagccacc 1740

cccagtacac ggcctacaac gaggcttgga gattcagcaa ccccgcctta ctaagttccc 1800

cttattatta tagtgccgcc ccccggtccg cccctgccgc tgctgccgct gcctatgacc 1860

gccactagtt accgcgggga ccacatcaag cttcaggccg acagcttcgg cctccacatc 1920

gtccccgtct gaccccaccc cggagggagg gaggaccgac gcgacgcgat gcctcccggc 1980

caccgcccca gcctcacccc atcccacgac ccccgcaacc cttcacatca cccccctcga 2040

aggtcggaca ggacgggtgg agccgtgggc gggacçctca ggcccgggcc cgccgccccc 2100

agccccgcct gccgcccctc cccgcctgcc tggactgcgc ggcgccgtga gggggattcg 2160

gcccagctcg tcccggcctc caccaagcca gccccgaagc ccgccagcca ccctgccgga 2220

ctcgggcgcg acctgctggc gcgcgccgga tgtttctgtg acacacaatc agcgcggacc 2280

gcagcgcggc ccagccccgg gcacccgcct cggacgctcg ggcgccagga ggcttcgctg 2340

gaggggctgg gccaaggaga ttaagaagaa aacgactttc tgcaggagga agagcccgct 2400

gccgaatccc tgggaaaaat tcttttcccc cagtgccagc cggactgccc tcgccttccg 2460

ggtgtgccct gtcccagaag atggaatggg ggtgtggggg tccggctcta ggaacgggct 2520 ttgggggcgt caggtctttc caaggttggg acccaaggat cggggggccc agcagcccgc 2580

accgatcgag ccggactctc ggctcttcac tgctcctcct ggcctgccta gttccccagg 2640

gcccggcacc tcctgctgcg agacccggct ctcagccctg ccttgcccct acctcagcgt 2700

ctcttccacc tgctggcctc ccagtttccc ctcctgccag tccttcgcct gtcccttgac 2760

gccctgcatc ctcctccctg actcgcagcc ccatcggacg ctctcccggg accgccgcag 2820

gaccagtttc catagactgc ggactggggt cttcctccag cagttacttg atgccccctc 2880

ccccgacaca gactctcaat ctgccggtgg taagaaccgg ttctgagctg gcgtctgagc 2940

tgctgcgggg tggaagtggg gggctgccca ctccactcct cccatcccct cccagcctcc 3000

tcctccggca ggaactgaac agaaccacaa aaagtctaca tttatttaat atgatggtct 3060

ttgcaaaaag gaacaaaaca acacaaaagc ccaccaggct gctgctttgt ggaaagacgg 3120

tgtgtgtcgt gtgaaggcga aacccggtgt acataacccc tccccctccg ccccgccccg 3180

cccggccccg tagagtccct gtcgcccgcc ggccctgcct gtagatacgc cccgctgtct 3240

gtgctgtgag agtcgccgct cgctgggggg gaaggggggg acacagctac acgcccatta 3300

aagcacagca cgtcctgggg gaggggggca ttttttatgt tacaaaaaaa aattacgaaa 3360

gaaaagaaat ctctatgcaa aatgacgaac atggtcctgt ggactcctct ggcctgtttt 3420 gttggctctt tctctgtaat tccgtgtttt cgctttttcc tccctgcccc tctctccctc 3480

tgcccctctc tcctctccgc ttctctcccc ctctgtctct gtctctctcc gtctctgtcg 3540

ctcttgtctg tctgtctctg ctctttcctc ggcctctctc cccagacctg gcccggccgc 3600

cctgtctccg caggctagat ccgaggtggc agctccagcc cccgggctcg ccccctcgcg 3660

ggcgtgcccc gcgcgccccg ggcggccgaa ggccgggccg ccccgtcccg ccccgtagtt 3720

gctctttcgg tagtggcgat gcgccctgca tgtctcctca cccgtggatc gtgacgactc 3780

gaaataacag aaacaaagtc aataaagtga aaataaataa aaatccttga acaaatccga 3840

aaaggcttgg agtcctcgcc cagatctctc tcccctgcga gcccttttta tttgagaagg 3900

aaaaagagaa aagagaatcg tttaagggaa cccggcgccc agccaggctc cagtggcccg 3960

aacggggcgg cgagggcggc gagggcgccg aggtccggcc catcccagtc ctgtggggct 4020

ggccgggcag agaccccgga cccaggccca ggcctaacct gctaaatgtc cccggacggt 4080

tctggtctcc tcggccactt tcagtgcgtc ggttcgtttt gattcttttt cttttgtgca 4140

cataagaaat aaataataat aataaataaa gaataaaatt ttgtatgtca

aaaaaaaaaa 4200

aaaaaaa

4207

<210> 40 <211> 396 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 40

Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly 15 10 15

His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro 20 25 30

Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly 35 40 45

Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys 50 55 60

Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro 65 70 75 80

Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val 85 90 95

Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp 100 105 110

Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr 115 120 125

Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln 130 135 140

Gln Pro Phe His Pro Thr Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Val Thr Ala 145 150 155 160

Pro Gly His Thr Ile Val Pro Ser Thr Ala Ser Pro Pro Val Ser Ser Ala Ser Asn Asp 180

Ile Pro Arg Ser 195

Glu Gly Ser Val 210

Arg Lys His Leu 225

Leu Asp Arg Val

Ser Glu His Ile 260

Leu Thr Pro Gly 275

Asn Pro Glu Leu 290

Val Thr Gly Arg 305

His Val Pro Pro

Gly Met Val Pro 340

Lys Pro Gly Arg 355

Gly Ala Ser Ser 370

Thr Thr Arg Leu 385

165

Pro Val Gly Ser

Asn Gly Glu Lys 200

Pro Asn Gly Asp 215

Arg Ala Asp Thr 230

Phe Glu Arg Pro 245

Lys Ser Glu Gln

Leu Asp Glu Val 280

Gly Ser Asn Val 295

Asp Met Ala Ser 310

Thr Gly Gln Gly 325

Glu Ala Ala Val

Lys Leu Ala Glu 360

Pro Ala Thr Arg 375

Gly Asp Ser Ala 390

170

Tyr Ser Ile Asn 185

Arg Lys Arg Asp

Ser Gln Ser Gly 220

Phe Thr Gln Gln 235

Ser Tyr Pro Asp 250

Gly Asn Glu Tyr 265

Lys Ser Ser Leu

Ser Gly Thr Gln 300

Thr Thr Leu Pro 315

Ser Tyr Pro Thr 330

Gly Pro Ser Ser 345

Val Pro Pro Cys

Thr Ala Thr Pro 380

Thr Pro Pro Tyr 395

175

Gly Ile Leu Gly 190

Glu Asp Val Ser 205

Val Asp Ser Leu

Gln Leu Glu Ala 240

Val Phe Gln Ala 255

Ser Leu Pro Ala 270

Ser Ala Ser Thr 285

Thr Tyr Pro Val

Gly Tyr Pro Pro 320

Ser Thr Leu Ala 335

Ser Leu Met Ser 350

Val Gln Pro Thr 365

Ser Thr Arg Pro <210> 41 <211> 4290 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 41

aggctccagt ctccggccga gtcttctcgc agccgcaacc cacctggggc cagcccagag 60

ctgccagcgc cgctcggctc cctccctccc tcccggccct tcggccgcgg cggcgtgcgc 120

ctgccttttc cgggggcggg ggcctggccc gcgcgctccc ctcccgcagg cgccacctcg 180

gacatccccg ggattgctac ttctctgcca acttcgccaa ctcgccagca cttggagagg 240

cccggctccc ctcccggcgc cctctgaccg cccccgcccc gcgcgctctc cgaccaccgc 300

ctctcggatg accaggttcc aggggagctg agcgagtcgc ctcccccgcc cagcttcagc 360

cctggctgca gctgcagcgc gagccatgcg cccccagtgc accccggccc ggcccaccgc 420

cccggggcca ttctgctgac cgcccagccc cgagccccga cagtggcaag ttgcggctac 480

tgcagttgca agctccggcc aacccggagg agccccagcg gggagcgcag tgttgcgccc 540 cccgcccccg cgcgccccgc agcagccggg cgttcactca tcctccctcc cccaccgtcc 600

ctcccttttc tcctcaagtc ctgaagttga gtttgagagg cgacacggcg gcggcggccg 660

cgctgctccc gctcctctgc ctccccatgg atatgcactg caaagcagac cccttctccg 720

cgatgcaccc agggcacggg ggtgtgaacc agctcggggg ggtgtttgtg aacggccggc 780

ccctacccga cgtggtgagg cagcgcatcg tggagctggc ccaccagggt gtgcggccct 840

gtgacatctc ccggcagctg cgggtcagcc acggctgtgt cagcaaaatc ctgggcaggt 900

actacgagac cggcagcatc aagccgggtg tgatcggtgg ctccaagccc aaagtggcga 960

cgcccaaagt ggtggacaag attgctgaat acaaacgaca gaacccgact atgttcgcct 1020

gggagattcg agaccggctc ctggccgagg gcatctgtga caatgacaca gtgcccagcg 1080

tctcttccat caacagaatc atccggacca aagttcagca gcctttccac ccaacgccgg 1140

atggggctgg gacaggagtg accgcccctg gccacaccat tgttcccagc acggcctccc 1200

ctcctgtttc cagcgcctcc aatgacccag tgggatccta ctccatcaat gggatcctgg 1260

ggattcctcg ctccaatggt gagaagagga aacgtgatga agatgtgtct gagggctcag 1320

tccccaatgg agattcccag agtggtgtgg acagtttgcg gaagcacttg cgagctgaca 1380

ccttcaccca gcagcagctg gaagctttgg atcgggtctt tgagcgtcct tcctaccctg 1440 acgtcttcca ggcatcagag cacatcaaat cagaacaggg gaacgagtac tccctcccag 1500

ccctgacccc tgggcttgat gaagtcaagt cgagtctatc tgcatccacc aaccctgagc 1560

tgggcagcaa cgtgtcaggc acacagacat acccagttgt gactggtcgt gacatggcga 1620

gcaccactct gcctggttac ccccctcacg tgccccccac tggccaggga agctacccca 1680

cctccaccct ggcaggaatg gtgcctgagg ctgcagttgg tccctcatcc tccctcatga 1740

gcaagccggg gaggaagctt gcagaagtgc ccccttgtgt gcaacccact ggagcgagtt 1800

ctccggcaac ccgtacagcc acccccagta cacggcctac aacgaggctt ggagattcag 1860

caaccccgcc ttactaagtt ccccttatta ttatagtgcc gccccccggt ccgcccctgc 1920

cgctgctgcc gctgcctatg accgccacta gttaccgcgg ggaccacatc aagcttcagg 1980

ccgacagctt cggcctccac atcgtccccg tctgacccca ccccggaggg agggaggacc 2040

gacgcgacgc gatgcctccc ggccaccgcc ccagcctcac cccatcccac gacccccgca 2100

acccttcaca tcacccccct cgaaggtcgg acaggacggg tggagccgtg ggcgggaccc 2160

tcaggcccgg gcccgccgcc cccagccccg cctgccgccc ctccccgcct gcctggactg 2220

cgcggcgccg tgagggggat tcggcccagc tcgtcccggc ctccaccaag ccagccccga 2280

agcccgccag ccaccctgcc ggactcgggc gcgacctgct ggcgcgcgcc ggatgtttct 2340 gtgacacaca atcagcgcgg accgcagcgc ggcccagccc cgggcacccg cctcggacgc 2400

tcgggcgcca ggaggcttcg ctggaggggc tgggccaagg agattaagaa gaaaacgact 2460

ttctgcagga ggaagagccc gctgccgaat ccctgggaaa aattcttttc ccccagtgcc 2520

agccggactg ccctcgcctt ccgggtgtgc cctgtcccag aagatggaat gggggtgtgg 258ο

gggtccggct ctaggaacgg gctttggggg cgtcaggtct ttccaaggtt gggacccaag 2640

gatcgggggg cccagcagcc cgcaccgatc gagccggact ctcggctctt cactgctcct 2700

cctggcctgc ctagttcccc agggcccggc acctcctgct gcgagacccg gctctcagcc 2760

ctgccttgcc cctacctcag cgtctcttcc acctgctggc ctcccagttt cccctcctgc 2820

cagtccttcg cctgtccctt gacgccctgc atcctcctcc ctgactcgca gccccatcgg 2880

acgctctccc gggaccgccg caggaccagt ttccatagac tgcggactgg ggtcttcctc 2940

cagcagttac ttgatgcccc ctcccccgac acagactctc aatctgccgg tggtaagaac 3 000

cggttctgag ctggcgtctg agctgctgcg gggtggaagt ggggggctgc ccactccact 3060

cctcccatcc cctcccagcc tcctçctccg gcaggaactg aacagaacca caaaaagtct 312 0

acatttattt aatatgatgg tctttgcaaa aaggaacaaa acaacacaaa agcccaccag 3180

gctgctgctt tgtggaaaga cggtgtgtgt cgtgtgaagg cgaaacccgg tgtacataac 3240 ccctccccct ccgccccgcc ccgcccggcc ccgtagagtc cctgtcgccc gccggccctg 3300

cctgtagata cgccccgctg tctgtgctgt gagagtcgcc gctcgctggg ggggaagggg 33 60

gggacacagc tacacgccca ttaaagcaca gcacgtcctg ggggaggggg gcatttttta 3420

tgttacaaaa aaaaattacg aaagaaaaga aatctctatg caaaatgacg aacatggtcc 3480

tgtggactcc tctggcctgt tttgttggct ctttctctgt aattccgtgt tttcgctttt 3540

tcctccctgc ccctctctcc ctctgcccct ctctcctctc cgcttctctc cccctctgtc 3600

tctgtctctc tccgtctctg tcgctcttgt ctgtctgtct ctgctctttc ctcggcctct 3660

ctccccagac ctggcccggc cgccctgtct ccgcaggcta gatccgaggt ggcagctcca 3720

gcccccgggc tcgccccctc gcgggcgtgc cccgcgcgcc ccgggcggcc gaaggccggg 3 780

ccgccccgtc ccgccccgta gttgctcttt cggtagtggc gatgcgccct gcatgtctcc 3840

tcacccgtgg atcgtgacga ctcgaaataa cagaaacaaa gtcaataaag tgaaaataaa 3900

taaaaatcct tgaacaaatc cgaaaaggct tggagtcctc gcccagatct ctctcccctg 3960

cgagcccttt ttatttgaga aggaaaaaga gaaaagagaa tcgtttaagg gaacccggcg 4020

cccagccagg ctccagtggc ccgaacgggg cggcgagggc ggcgagggcg ccgaggtccg 4080

gcccatccca gtcctgtggg gctggccggg cagagacccc ggacccaggc ccaggcctaa 414 0 cctgctaaat gtccccggac ggttctggtc tcctcggcca ctttcagtgc gtcggttcgt 4200

tttgattctt tttcttttgt gcacataaga aataaataat aataataaat aaagaataaa 4260

attttgtatg tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4290

<210> 42 <211> 408 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 42

Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly

15 10 15

His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro

20 25 30

Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly

35 40 45

Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys

50 55 60

Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro 65 70 75 80

Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val

85 90 95

Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp 100 105 110

Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr

115 120 125

Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln

130 135 140

Gln Pro Phe His Pro Thr Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Val Thr Ala 145 150 155 160

Pro Gly His Thr Ile Val Pro Ser Thr Ala Ser Pro Pro Val Ser Ser

165 170 175

Ala Ser Asn Asp Pro Val Gly Ser Tyr Ser Ile Asn Gly Ile Leu Gly

180 185 190

Ile Pro Arg Ser Asn Gly Glu Lys Arg Lys Arg Asp Glu Asp Val Ser

195 200 205

Glu Gly Ser Val Pro Asn Gly Asp Ser Gln Ser Gly Val Asp Ser Leu

210 215 220

Arg Lys His Leu Arg Ala Asp Thr Phe Thr Gln Gln Gln Leu Glu Ala 225 230 235 240

Leu Asp Arg Val Phe Glu Arg Pro Ser Tyr Pro Asp Val Phe Gln Ala

245 250 255

Ser Glu His Ile Lys Ser Glu Gln Gly Asn Glu Tyr Ser Leu Pro Ala

260 265 270

Leu Thr Pro Gly Leu Asp Glu Val Lys Ser Ser Leu Ser Ala Ser Thr

275 280 285

Asn Pro Glu Leu Gly Ser Asn Val Ser Gly Thr Gln Thr Tyr Pro Val

290 295 300

Val Thr Gly Arg Asp Met Ala Ser Thr Thr Leu Pro Gly Tyr Pro Pro 305 310 315 320

His Val Pro Pro Thr Gly Gln Gly Ser Tyr Pro Thr Ser Thr Leu Ala

325 330 335

Gly Met Val Pro Gly Ser Glu Phe Ser Gly Asn Pro Tyr Ser His Pro 340

Gln Tyr Thr Ala 355

Leu Met Pro Pro 370

Thr Ala Thr Ser 385

Phe Gly Leu His

Tyr Asn Glu Ala 360

Pro Gly Pro Pro 375

Tyr Arg Gly Asp 390

Ile Val Pro Val 405

345

Trp Arg Phe Ser

Leu Pro Leu Leu 380

His Ile Lys Leu 395

350

Asn Pro Ala Leu 365

Pro Leu Pro Met

Gln Ala Asp Ser 400

<210> 43 <211> 4188 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 43

aggctccagt ctccggccga gtcttctcgc agccgcaacc cacctggggc cagcccagag 60

ctgccagcgc cgctcggctc cctccctccc tcccggccct tcggccgcgg cggcgtgcgc 12 0

ctgccttttc cgggggcggg ggcctggccc gcgcgctccc ctcccgcagg cgccacctcg 180

gacatccccg ggattgctac ttctctgcca acttcgccaa ctcgccagca cttggagagg 24 0 cccggctccc ctcccggcgc cctctgaccg ccçccgcccc gcgcgctctc cgaccaccgc 300

ctctcggatg accaggttcc aggggagctg agcgagtcgc ctcccccgcc cagcttcagc 360

cctggctgca gctgcagcgc gagccatgcg cccccagtgc accccggccc ggcccaccgc 420

cccggggcca ttctgctgac cgcccagccc cgagccccga cagtggcaag ttgcggctac 480

tgcagttgca agctccggcc aacccggagg agccccagcg gggagcgcag tgttgcgccc 540

cccgcccccg cgcgccccgc agcagccggg cgttcactca tcctccctcc cccaccgtcc 600

ctcccttttc tcctcaagtc ctgaagttga gtttgagagg cgacacggcg gcggcggccg 660

cgctgctccc gctcctctgc ctccccatgg atatgcactg caaagcagac cccttctccg 720

cgatgcaccc agggcacggg ggtgtgaacc agctcggggg ggtgtttgtg aacggccggc 780

ccctacccga cgtggtgagg cagcgcatcg tggagctggc ccaccagggt gtgcggccct 840

gtgacatctc ccggcagctg cgggtcagcc acggctgtgt cagcaaaatc ctgggcaggt 900

actacgagac cggcagcatc aagccgggtg tgatcggtgg ctccaagccc aaagtggcga 960

cgcccaaagt ggtggacaag attgctgaat acaaacgaca gaacccgact atgttcgcct 1020

gggagattcg agaccggctc ctggccgagg gcatctgtga caatgacaca gtgcccagcg 1080

tctcttccat caacagaatc atccggacca aagttcagca gcctttccac ccaacgccgg 1140 atggggctgg gacaggagtg accgcccctg gccacaccat tgttcccagc

acggcctccc 1200

ctcctgtttc cagcgcctcc aatgacccag tgggatccta ctccatcaat

gggatcctgg 1260

ggattcctcg ctccaatggt gagaagagga aacgtgatga agatgtgtct

gagggctcag 1320

tccccaatqq aggattcccag agtggtgtgg acagtttgcg gaagcacttg

cgagctgaca 1380

ccttcaccca geageagetg gaagctttgg atcgggtctt tgagcgtcct tcctaccctg 1440

acgtcttcca ggcatcagag cacatcaaat cagaacaggg gaacgagtac tccctcccag 1500

ccctgacccc tgggcttgat gaagtcaagt cgagtctatc tgcatccacc aaccctgagc 1560

tgggcagcaa cgtgtcaggc acacagacat acccagttgt gactggtcgt gacatggcga 1620

gcaccactct gcctggttac ccccctcacg tgccccccac tggccaggga agctacccca 1680

cctccaccct ggcaggaatg gtgcctggga gcgagttctc cggcaacccg tacagccacc 1740

cccagtacac ggcctacaac gaggcttgga gatteageaa ccccgcctta ctaatgccgc 1800

cccccggtcc gcccctgccg ctgctgccgc tgcctatgac cgccactagt taccgcgggg 1860

accacatcaa gcttcaggcc gacagcttcg gcctccacat cgtccccgtc tgaccccacc 1920

ccggagggag ggaggaccga cgcgacgcga tgcctcccgg ccaccgcccc agcctcaccc 1980

catcccacga cccccgcaac ccttcacatc acccccctcg aaggtcggac aggacgggtg 2040 gagccgtggg cgggaccctc aggcccgggc ccgccgcccc cagccccgcc tgccgcccct 2100

ccccgcctgc ctggactgcg cggcgccgtg agggggattc ggcccagctc gtcccggcct 2160

çcaccaagcc agccccgaag cccgccagcc accctgccgg actcgggcgc gacctgctgg 2220

cgcgcgccgg atgtttctgt gacacacaat cagcgcggac cgcagcgcgg cccagccccg 2280

ggcacccgcc tcggacgctc gggcgccagg aggcttcgct ggaggggctg ggccaaggag 234 0

attaagaaga aaacgacttt ctgcaggagg aagagcccgc tgccgaatcc ctgggaaaaa 2400

ttcttttccc ccagtgccag ccggactgcc ctcgccttcc gggtgtgccc tgtcccagaa 2460

gatggaatgg gggtgtgggg gtccggctct aggaacgggc tttgggggcg tcaggtcttt 2520

ccaaggttgg gacccaagga tcggggggcc cagcagcccg caccgatcga gccggactct 2580

cggctcttca ctgctcctcc tggcctgcct agttccccag ggcccggcac ctcctgctgc 2640

gagacccggc tctcagccct gccttgcccc tacctcagcg tctcttccac ctgctggcct 2700

cccagtttcc cctcctgcca gtccttcgcc tgtcccttga cgccctgcat cctcctccct 2760

gactcgcagc cccatcggac gctctcccgg gaccgccgca ggaccagttt ccatagactg 2820

cggactgggg tcttcctcca gcagttactt gatgccccct cccccgacac agactctcaa 2880

tctgccggtg gtaagaaccg gttctgagct ggcgtctgag ctgctgcggg gtggaagtgg 2 94 0 ggggctgccc actccactcc tcccatcccc tcccagcctc ctcctccggc aggaactgaa 3 000

cagaaccaca aaaagtctac atttatttaa tatgatggtc tttgcaaaaa ggaacaaaac 3 060

aacacaaaag cccaccaggc tgctgctttg tggaaagacg gtgtgtgtcg tgtgaaggcg 312 0

aaacccggtg tacataaccc ctccccctcc gccccgcccc gcccggcccc gtagagtccc 3180

tgtcgcccgc cggccctgcc tgtagatacg ccccgctgtc tgtgctgtga gagtcgccgc 3240

tcgctggggg ggaagggggg gacacagcta cacgcccatt aaagcacagc acgtcctggg 3300

ggaggggggc attttttatg ttacaaaaaa aaattacgaa agaaaagaaa tctctatgca 3360

aaatgacgaa catggtcctg tggactcctc tggcctgttt tgttggctct ttctctgtaa 3420

ttccgtgttt tcgctttttc ctccctgccc ctctctccct ctgcccctct ctcctctccg 3480

cttctctccc cctctgtetc tgtctctctc cgtctctgtc gctcttgtct gtctgtctct 3540

gctctttcct cggcctctct ccccagacct ggcccggccg ccctgtctcc gcaggctaga 3 600

tccgaggtgg cagctccagc ccccgggctc gccccctcgc gggcgtgccc cgcgcgcccc 3660

gggcggccga aggccgggcc gccccgtccc gccccgtagt tgctctttcg gtagtggcga 3 72 0

tgcgccctgc atgtctcctc acccgtggat cgtgacgact cgaaataaca gaaacaaagt 3780

caataaagtg aaaataaata aaaatccttg aacaaatccg aaaaggcttg gagtcctcgc 3840 ccagatctct ctcccctgcg agcccttttt atttgagaag gaaaaagaga aaagagaatc 3 900

gtttaaggga acccggcgcc cagccaggct ccagtggccc gaacggggcg gcgagggcgg 3 960

cgagggcgcc gaggtccggc ccatcccagt cctgtggggc tggccgggca gagaccccgg 4020

acccaggccc aggcctaacc tgctaaatgt ccccggacgg ttctggtctc ctcggccact 4080

ttcagtgcgt cggttcgttt tgattctttt tcttttgtgc acataagaaa taaataataa 4140

taataaataa agaataaaat tttgtatgtc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 4188

<210> 44 <211> 431 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 44

Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly 1 5 10 15

His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro 20 25 30

Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly 35 40 45

Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys 50 55 60

Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro 65 70 75 80

Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val

85 90 95

Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp

100 105 110

Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr

115 120 125

Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln

130 135 140

Gln Pro Phe His Pro Thr Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Val Thr Ala 145 150 155 160

Pro Gly His Thr Ile Val Pro Ser Thr Ala Ser Pro Pro Val Ser Ser

165 170 175

Ala Ser Asn Asp Pro Val Gly Ser Tyr Ser Ile Asn Gly Ile Leu Gly

180 185 190

Ile Pro Arg Ser Asn Gly Glu Lys Arg Lys Arg Asp Glu Val Glu Val

195 200 205

Tyr Thr Asp Pro Ala His Ile Arg Gly Gly Gly Gly Leu His Leu Val

210 215 220

Trp Thr Leu Arg Asp Val Ser Glu Gly Ser Val Pro Asn Gly Asp Ser 225 230 235 240

Gln Ser Gly Val Asp Ser Leu Arg Lys His Leu Arg Ala Asp Thr Phe

245 250 255

Thr Gln Gln Gln Leu Glu Ala Leu Asp Arg Val Phe Glu Arg Pro Ser

260 265 270

Tyr Pro Asp Val Phe Gln Ala Ser Glu His Ile Lys Ser Glu Gln Gly

275 280 285

Asn Glu Tyr Ser Leu Pro Ala Leu Thr Pro Gly Leu Asp Glu Val Lys 290 295 300

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Thr Asn Pro Glu Leu Gly Ser Asn Val Ser 305 310 315 320

Gly Thr Gln Thr Tyr Pro Val Val Thr Gly Arg Asp Met Ala Ser Thr

325 330 335

Thr Leu Pro Gly Tyr Pro Pro His Val Pro Pro Thr Gly Gln Gly Ser

340 345 350

Tyr Pro Thr Ser Thr Leu Ala Gly Met Val Pro Gly Ser Glu Phe Ser

355 360 365

Gly Asn Pro Tyr Ser His Pro Gln Tyr Thr Ala Tyr Asn Glu Ala Trp

370 375 380

Arg Phe Ser Asn Pro Ala Leu Leu Met Pro Pro Pro Gly Pro Pro Leu 385 390 395 400

Pro Leu Leu Pro Leu Pro Met Thr Ala Thr Ser Tyr Arg Gly Asp His

405 410 415

Ile Lys Leu Gln Ala Asp Ser Phe Gly Leu His Ile Val Pro Val 420 425 430

<210> 45 <211> 4257 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 45 aggctccagt ctccggccga gtcttctcgc agccgcaacc cacctggggc cagcccagag 60

ctgccagcgc cgctcggctc cctçcctccc tcccggccct tcggccgcgg cggcgtgcgc 120

ctgccttttc cgggggcggg ggcctggccc gcgcgctccc ctcccgcagg cgccacctcg 180

gacatccccg ggattgctac ttctctgcca acttcgccaa ctcgccagca cttggagagg 240

cccggctccc ctcccggcgc cctctgaccg çccccgcccc gcgcgctctc cgaccaccgc 300

ctctcggatg accaggttcc aggggagctg agcgagtcgc ctcccccgcc cagcttcagc 360

cctggctgca gctgcagcgc gagccatgcg cccccagtgc accccggccc ggcccaccgc 420

cccggggcca ttctgctgac cgcccagccc cgagccccga cagtggcaag ttgcggctac 480

tgcagttgca agctccggcc aacccggagg agccccagcg gggagcgcag tgttgcgccc 540

cccgcccccg cgcgccccgc agcagccggg cgttcactca tcctccctcc cccaccgtcc 600

ctcccttttc tcctcaagtc ctgaagttga gtttgagagg cgacacggcg gcggcggccg 660

cgctgctccc gctcctctgc ctccccatgg atatgcactg caaagcagac cccttctccg 720

cgatgcaccc agggcacggg ggtgtgaacc agctcggggg ggtgtttgtg aacggccggc 780

ccctacccga cgtggtgagg cagcgcatcg tggagctggc ccaccagggt gtgcggccct 840

gtgacatctc ccggcagctg cgggtcagcc acggctgtgt cagcaaaatc ctgggcaggt 900 actacgagac cggcagcatc aaagtggcga 960 cgcccaaagt ggtggacaag atgttcgcct 1020 gggagattcg agaccggctc gtgcccagcg 1080 tctcttccat caacagaatc ccaacgccgg 1140 atggggctgg gacaggagtg acggcctccc 1200 ctcctgtttc cagcgcctcc gggatcctgg 1260 ggattcctcg ctccaatggt tacactgatc 1320 ctgcccacat tagaggaggt gatgtgtctg 1380

agggctcagt ccccaatgga aagcacttgc 1440 gagctgacac cttcacccag gagcgtcctt 1500 cctaccctga cgtcttccag aacgagtact 1560 ccctcccagc cctgacccct gcatccacca 1620 accctgagct gggcagcaac actggtcgtg 1680 acatggcgag caccactctg ggccagggaa 1740 gctaccccac ctccaccctg ggcaacccgt 1800

57/69

aagccgggtg tgatcggtgg ctccaagccc

attgctgaat acaaacgaca gaacccgact

ctggccgagg gcatctgtga caatgacaca

atccggacca aagttcagca gcctttccac

accgcccctg gccacaccat tgttcccagc

aatgacccag tgggatccta ctccatcaat

gagaagagga aacgtgatga agttgaggta

ggaggtttgc atctggtctg gactttaaga

gattcccaga gtggtgtgga cagtttgcgg

cagcagctgg aagctttgga tcgggtcttt

gcatcagagc acatcaaatc agaacagggg

gggcttgatg aagtcaagtc gagtctatct

gtgtcaggca cacagacata cccagttgtg

cctggttacc cccctcacgt gccccccact

gcaggaatgg tgcctgggag cgagttctcc acagccaccc ccagtacacg gcctacaacg aggcttggag attcagcaac cccgccttac 1860

taatgccgcc ccccggtccg cccctgccgc tgctgccgct gcctatgacc gccactagtt 1920

accgcgggga ccacatcaag cttcaggccg acagcttcgg cctccacatc gtccccgtct 1980

gaccccaccc cggagggagg gaggaccgac gcgacgcgat gcctcccggc caccgcccca 2040

gcctcacccc atcccacgac ccccgcaacc cttcacatca cccccctcga aggtcggaca 2100

ggacgggtgg agccgtgggc gggaccctca ggcccgggcc cgccgccccc agccccgcct 2160

gccgcccctc cccgcctgcc tggactgcgc ggcgccgtga gggggattcg gcccagctcg 2220

tcccggcctc caccaagcca gccccgaagc ccgccagcca ccctgccgga ctcgggcgcg 2280

acctgctggc gcgcgccgga tgtttctgtg acacacaatc agcgcggacc gcagcgcggc 2340

ccagccccgg gcacccgcct cggacgctcg ggcgccagga ggcttcgctg gaggggctgg 2400

gccaaggaga ttaagaagaa aacgactttc tgcaggagga agagcccgct gccgaatccc 2460

tgggaaaaat tcttttcccc cagtgccagc cggactgccc tcgccttccg ggtgtgccct 2520

gtcccagaag atggaatggg ggtgtggggg tccggctcta ggaacgggct ttgggggcgt 2580

caggtctttc caaggttggg acccaaggat cggggggccc agcagcccgc accgatcgag 2640

ccggactctc ggctcttcac tgctcctcct ggcctgccta gttccccagg gcccggcacc 2700 tcctgctgcg agacccggct ctcagccctg ccttgcccct acctcagcgt ctcttccacc 2760

tgctggcctc ccagtttccc ctcctgccag tccttcgcct gtcccttgac gccctgcatc 2820

ctcctccctg actcgcagcc ccatcggacg ctctcccggg accgccgcag gaccagtttc 2880

catagactgc ggactggggt cttcctccag cagttacttg atgccccctc ccccgacaca 2 94 0

gactctcaat ctgccggtgg taagaaccgg ttctgagctg gcgtctgagc tgctgcgggg 3 0 00

tggaagtggg gggctgccca ctccactcct cccatcccct cccagcctcc tcctccggca 3060

ggaactgaac agaaccacaa aaagtctaca tttatttaat atgatggtct ttgcaaaaag 3120

gaacaaaaca acacaaaagc ccaccaggct gctgctttgt ggaaagacgg tgtgtgtcgt 3180

gtgaaggcga aacccggtgt acataacccc tccccctccg ccccgccccg cccggccccg 3240

tagagtccct gtcgcccgcc ggccctgcct gtagatacgc cccgctgtct gtgctgtgag 3300

agtcgccgct cgctgggggg gaaggggggg acacagctac acgcccatta aagcacagca 3360

cgtcctgggg gaggggggca ttttttatgt tacaaaaaaa aattacgaaa gaaaagaaat 3420

ctctatgcaa aatgacgaac atggtcctgt ggactcctct ggcctgtttt gttggctctt 3480

tctctgtaat tccgtgtttt cgctttttcc tccctgcccc tctctccctc tgcccctctc 3540

tcctctccgc ttctctcccc ctctgtctct gtctctctcc gtctctgtcg ctcttgtctg 3600 tctgtctctg ctctttcctc ggcctctctc cccagacctg gcccggccgc cctgtctccg 3660

caggctagat ccgaggtggc agctccagcc cccgggctcg ccccctcgcg ggcgtgcccc 3720

gcgcgccccg ggcggccgaa ggccgggccg ccccgtcccg ccccgtagtt gctctttcgg 3780

tagtggcgat gcgccctgca tgtctcctca cccgtggatc gtgacgactc gaaataacag 3 84 0

aaacaaagtc aataaagtga aaataaataa aaatccttga acaaatccga aaaggcttgg 3 90 0

agtcctcgcc cagatctctc tcccctgcga gcccttttta tttgagaagg aaaaagagaa 3 960

aagagaatcg tttaagggaa cccggcgccc agccaggctc cagtggcccg aacggggcgg 4 020

cgagggcggc gagggcgccg aggtccggcc catcccagtc ctgtggggct ggccgggcag 4 080

agaccccgga cccaggccca ggcctaacct gctaaatgtc cccggacggt tctggtctcc 4140

tcggccactt tcagtgcgtc ggttcgtttt gattcttttt cttttgtgca cataagaaat 4200

aaataataat aataaataaa gaataaaatt ttgtatgtca aaaaaaaaaa aaaaaaa 4257

<210> 46 <211> 104 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética <400> 46

ttcacccttg actgtggcac ctcccttcag ttccgtcgac gaggttgtgc aatccaccag

tcttataaat acagtgacgc tccagcctct ggaagcctct gtca

<210> 47

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 47 tcaagcgtga ctaattg

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 48

actgcccatt gcccaaacac <210> 49 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 49

aaaatcttgc cagctttccc c 21

<210> 50 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 50

gtcggttacg gagcggaccg gag 23

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 51

taacatatag acaaacgcac accg 24

<210> 52 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400 > 52

gcgcttgtgt cgccattgta ttc 23

<210> 53 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 53

gtcacaccac agaagtaagg ttcc

24 <210> 54

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 54

gtcggttacg gagcggaccg gag 23

<210> 55

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 55

cacagagcat tggcgatctc gatgc 25

<210> 56 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 56

acccgactat gttcgcctgg 20

<210> 57 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota Construção Sintética

<400> 57

aagctctgga tcgagtcttt g 21

<210> 58 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 58

atgtgtcagg cacacagacg

20 <210> 59

<211> 21

<212> RNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 59

gucgagucua ucugcaucct t 21

<210> 60

<211> 21

<212> RNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 60

ggaugcagau agacucgact t 21

<210> 61

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 61

tcagcagtgg agggcaatg

<210> 62 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 62

cctctgtaac aggtgccttg aat

<210> 63 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

Artificial: nota =

19

Artificial: nota =

23

Artificial: nota =

<400> 63

acagcaaacc tcctcacagc c

21 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 64 tggagacgtg gcacctcttg

<210> 65 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: nota = Construção Sintética

<400> 65 tatgataccc gggagatcgt gatc

<210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 66

gtgcagatgc cggttcaggt actc

<210> 67 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

<400> 67

tcagccctgg actacctgca

<210> 68 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Construção Sintética

Artificial: nota =

24

Artificial: nota =

20

Artificial: nota =

<400> 68

gaggtcccgg tacaccacgt

NÚMERO DE PROTOCOLO DO PROCURADOR. 19113.0129P2

20

Claims (32)

1. Método para monitoramento de condições da próstata em um indivíduo caracterizado por compreender: a determinação de uma proporção de expressão de gene Paired Box 2-para-gene beta defensina-1 (PAX2-para-DEFBl) em células obtidas a partir da próstata do indivíduo, em que a proporção de expressão de PAX2-para-DEFBl está correlacionada com condições da próstata.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma proporção de expressão de PAX 2 -para-DEFBl de 100:1 ou maior é indicativa da presença de câncer de próstata no indivíduo, uma proporção de expressão de a PAX 2-para-DEFB 1 de 40:1 ou maior, mas menor que 100:1, é indicativa da presença de neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN) no indivíduo, e uma proporção de expressão de PAX2-para-DEFBl de menos que 40:1 é indicativa de próstata normal no indivíduo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação compreende: determinação do nível de expressão de gene PAX2 em relação ao nível de expressão de um gene de controle; determinação do nível de expressão de gene DEFBl em relação ao nível de expressão do mesmo gene de controle; e determinação da proporção de expressão de um PAX 2- para-DEFB 1 com base nos níveis de expressão de PAX 2 e DEFBl.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os níveis de expressão de PAX2, DEFBl e dos genes de controle são determinados por RT-PCR quantitativa em tempo real.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o gene de controle é o gene de gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase (GAPDH).

6. Método para o diagnóstico de câncer de próstata em um indivíduo caracterizado por compreender: a determinação de uma proporção de expressão de PAX2- para-DEFB 1 em células obtidas a partir da próstata do indivíduo, em que a proporção de expressão de PAX 2 -para-DEFB 1 de cerca de 100:1 ou maior é indicativa da presença de câncer de próstata no indivíduo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação compreende: a determinação do nível de expressão de gene PAX2 em relação ao nível de expressão de um gene de controle; a determinação do nível de expressão de gene DEFBl era relação ao nível de expressão do mesmo gene de controle; e a determinação da proporção de expressão de PAX 2- para-DEFB 1 com base nos níveis de expressão de PAX2 e DEFBl.

8. Método para o diagnóstico de neoplasia intra- epitelial da próstata (PIN) em um indivíduo caracterizado por compreender: a determinação de uma proporção de expressão de PAX 2- para-DEFB 1 em células obtidas a partir da próstata do indivíduo, em que a proporção de expressão de PAX 2-para-DEFB 1 na faixa de cerca de 40:1 a cerca de 100:1 é indicativa da presença de PIN no indivíduo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação compreende: a determinação do nível de expressão de gene PAX2 em relação ao nível de expressão de um gene de controle; a determinação do nível de expressão de gene DEFBl em relação ao nível de expressão do mesmo gene de controle; e a determinação da proporção de expressão de a PAX 2- para-DEFB 1 com base nos níveis de expressão de PAX2 e DEFB1.

10. Método para a prevenção ou tratamento de câncer de próstata em um indivíduo, caracterizado por compreender: a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um inibidor da expressão de gene PAX 2 ou atividade de PAX2.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado com neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN).

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o inibidor é um antagonista seletivo de angiotensina II ou enzima de conversão de angiotensina (ACE).

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o inibidor é um antagonista seletivo de receptor tipo 1 de angiotensina II (ATlR).

14. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o inibidor é um antagonista seletivo de quinase regulada por sinal extracelular/ proteína ativada por mitógeno (MEK).

15. Método, de acordo cora a. reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o inibidor é um antagonista seletivo de quinases reguladas por sinal extracelular (ERK)I e/ou ERK2.

16. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o inibidor é um antagonista seletivo de transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 (STAT 3).

17. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o inibidor é um antagonista seletivo de PAX2.

18. Método, de acordo cora a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o antagonista seletivo de PAX2 bloqueia a ligação de PAX 2 ao promotor de beta defensina-1 (DEFBl).

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o antagonista seletivo de PAX2 compreende um siRNA.

20. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o antagonista seletivo de PAX2 compreende um RNA antisenso.

21. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o antagonista seletivo de PAX2 compreende um polinucleotideo que codifica um siRNA ou um RNA antisenso.

22. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o antagonista seletivo de PAX2 compreende um anticorpo anti-PAX2.

23. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o inibidor é um antagonista seletivo de PAX2.

24. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado com câncer de próstata.

25. Método para a prevenção ou tratamento de câncer de próstata em um indivíduo caracterizado por compreender: a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um agente que aumenta o nível de expressão de gene DEFBl ou de atividade de DEFB 1.

26. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente compreende DEFBI.

27. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o agente compreende um polinucleotídeo que codifica e é capaz de expressar DEFB 1.

28. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente compreende um inibidor de PAX2 que se liga ao promotor de DEFB 1. .

29. Método para a prevenção ou tratamento de neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN) em um indivíduo, caracterizado por compreender: a administração ao indivíduo de uma composição que compreende um inibidor da expressão ou atividade de PAX 2.

30. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o inibidor é selecionado do grupo que consiste em antagonistas seletivos de angiotensina II ou enzima de conversão de angiotensina (ACE), antagonistas seletivos de receptor tipo 1 de angiotensina II (ATlR), antagonistas seletivos de MEK, antagonistas seletivos de ERKl e de ERKl 2, antagonistas seletivos de STAT 3, antagonistas seletivos de PAX, e inibidores que bloqueiam a ligação de DEFBl ao promotor de PAX 2 .

31. Método para a prevenção ou tratamento de neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN) em um indivíduo caracterizado por compreender: a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um agente que aumenta o nível de expressão do gene DEFB 1 ou atividade de DEFB 1.

32. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o agente é selecionado do grupo que consiste em DEFB 1, polinucleotídeos que codificam e são capazes de expressar DEFB 1, e inibidores da ligação de PAX2 ao promotor de DEFBl.