BRPI0807196B1 - Compostos 6-amino-8-hidróxipurin-9-ilbenzil substituídos, e, usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PREVENIR OU INIBIR UMA INFECÇÃO BACTERIANA, VACINA, COMPOSTO, E, MÉTODO PARA PREVENIR, TRATAR OU INIBIR A ASMA. A invenção fornece agonistas de TLR e conjugados destes úteis em vacinas e para prevenir, inibir ou tratar uma variedade de distúrbios incluindo infecção por patógeno e asma.

Description

Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados

O presente pedido reivindica benefício da data de depósito do pedido U.S. Serial N- 60/888.699, depositado em 7 de fevereiro de 2007, a divulgação do qual é aqui incorporada por referência.

Declaração dos direitos do Governo

A invenção aqui descrita foi feita com suporte governamental sob o Número de Subvenção AI056453 concedido pelo National Institutes of Health. O Governo dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção.

Fundamentos

Uma enorme quantidade tem sido aprendida a cerca da base molecular de reconhecimento inato de patógenos microbianos na última década. E no geral aceito que muitas células somáticas expressam uma faixa de receptores de reconhecimento de padrão que detectam patógenos potenciais independentemente do sistema imune adaptativo (ver Janeway et al., Annu. Rev. Immunol., 20: 197 (2002)). Acredita-se que estes receptores interajam com componentes microbianos chamados de padrão molecular associados a patógeno (PAMPs). Os exemplos de PAMPs incluem peptidoglicanos, ácidos lipotecóicos de paredes celulares gram positivas, o açúcar manose (que é comum em carboidratos microbianos mas raros em seres humanos), o DNA bacteriano, RNA de filamento duplo de vírus, e glicanos de paredes celulares fúngicas. PAMPs no geral atingem certos critérios que incluem, (a) sua expressão pelos micróbios mas não seus hospedeiros mamíferos, (b) conservação de estrutura através da ampla faixa de patógenos, e (c) a capacidade para estimular a imunidade inata. Receptores equivalentes a Toll (TLRs) foram descobertos desempenhar um papel central na detecção de PAMPs e na resposta inicial às infecções microbianas (ver Underhill et al., Curr. Opin. Immunol., 14: 103 (2002)). Dez TLRs de mamífero e vários de seus agonistas foram identificados. Por exemplo, TLR7 e TLR9 reconhecem e respondem ao imiquimod e oligonucleotídeos CpG imunoestimulatórios (ISS-ODN), respectivamente. O imunomodulador R-848 sintético (resiquimod) ativa tanto TLR7 quanto TLR8. Embora o estímulo de TLR inicie uma cascata de sinalização comum (envolvendo a proteína adaptadora MyD88, o fator de transcrição NF-kB, e as citocinas pró- inflamatórias e efetoras), certos tipos de célula tendem a produzir certas TLRs. Por exemplo, TLR7 e TLR9 são encontrados predominantemente nas faces internas de endossomas em células dendríticas (DCs) e linfócitos B (em seres humanos; os macrófagos de camundongo expressam TLR7 e TLR9). TLR8, por outro lado, é encontrado em monócitos do sangue humano (ver Hornung etal., J. Immunol., 168: 4531 (2002)).

Interferons (INFs) também estão envolvidos na indução eficiente de uma resposta imune, especialmente depois da infecção virai (Brassard et al., J. Leukoc. Biol., 71: 568 (2002)). Entretanto, muitos vírus produzem uma variedade de proteínas que bloqueiam a produção de interferon ou a ação em vários níveis. Acredita-se que o antagonismo de interferon seja parte de uma estratégia geral para evitar a imunidade inata, assim como adaptativa (ver Levy et al., Citokine Growth Factor Rev., 12: 143 (2001)). Embora os agonistas de TLR possam ser suficientemente ativos para alguns métodos de tratamento, em alguns casos os antagonistas de interferon microbiano podem mitigar os efeitos adjuvantes de agonista de TLR sintéticos.

Uma resposta mais específica às infecções microbianas é fundamentada na imunização ativa ou passiva. Se a imunização universal não é considerada eficaz em custo (ou farmacoeconomicamente viável), a identificação de uma população em risco que beneficiar-se-ia da imunoprofilaxia pode ser eficaz em custo, embora a identificação desta população possa não ser direta. Não obstante, existe alguma populações em risco claramente definida para certas infecções bacterianas, tais como infecções estafilocócicas, incluindo pacientes de diálise, pacientes com desvios ventriculoperitoneais, pacientes em risco de endocardite infecciosa, e residentes de casas de repouso, todos os quais sofrem de condições crônicas que os coloca em um risco aumentado prolongado de infecções estafilocócicas. Muitos destes pacientes também estão em risco aumentado para adquirir Staphylococcus aureus resistente à meticilina associado com cuidado de saúde (HAMRSA). Bloquear a colonização de Staphylococcus, entretanto, pode ser mais executável do que proteger contra a infecção.

A imunoprofilaxia passiva usando anticorpos policlonais (Capparelli et al., Antimicrob. Agents Chemo., 49: 4121 (2005)) ou anticorpos monoclonais (mAbs) (www.biosynexus.com/product candidates.html) pode fornecer proteção imediata (embora de curta duração) para pacientes que não podem esperar que um efeito de vacina ocorra ou cujos sistemas imunes estejam muito comprometidos para montar uma resposta a uma vacina. Uma indicação potencial para a imunoprofilaxia passiva é um surto hospitalar de infecções relacionadas com MRSA. Em tais casos, os indivíduos expostos podem se beneficiar da profilaxia imediata, ao passo que os indivíduos que residem na mesma enfermaria ou instalação de cuidado crônico podem se beneficiar da imunização ativa. Além disso, os pacientes da unidade de cuidado intensivo são beneficiários potenciais da imunoprofilaxia passiva, visto que cada um deles provavelmente adquiririam um ou mais fatores de risco para as infecções estafilocócicas.

Sumário da Invenção

A presente invenção diz respeito a conjugados de um agonista TLR sintético ligado por intermédio de uma ligação covalente estável a uma macromolécula e composições tendo esses conjugados, assim como métodos de usar os conjugados. Os conjugados podem incluir macromoléculas diretamente ligadas a um agonista de TLR sintético, por exemplo, agonistas de TLR7 ou TLR9 ou ligados por intermédio de um ligador ao agonista de TLR, por exemplo, ligados por intermédio de um grupo amino, um grupo carbóxi ou um grupo succinamida. Por exemplo, os conjugados da invenção incluem um agonista de TLR sintético (farmacóforo) diretamente ligado a uma macromolécula tal como, por exemplo, um peptídeo, polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno deste, lipídeo, um polímero tal como polietileno glicol, uma conta, tal como um conta de poliestireno ou dendrímero. Os conjugados da invenção são de amplo espectro, de longa duração, e agentes imunoestimuladores sintéticos não tóxicos, que são úteis para ativar o sistema imune de um mamífero, por exemplo, um ser humano. Em particular, os conjugados da invenção otimizam a resposta imune enquanto limitam efeitos colaterais sistêmicos indesejáveis associados com agonistas de TLR não conjugados.

O agonista de TLR sintético pode ajudar direto o conjugado para TLRs dentro de endossomas das células alvo e realçar a liberação a macromolécula. Em uma forma de realização, o agonista de TLR sintético é específico para TLRs endossômicos. Em uma forma de realização, o agonista de TLR pode ser um agonista de TLR7, TLR8, TLR3 ou TLR9. Além disso, o agonista de TLR sintético pode realçar a resposta para a macromolécula (por exemplo, resposta imune). Do mesmo modo, a macromolécula pode ser útil para ativar o sistema imune e/ou pode direcionar o conjugado às células particulares. Assim, a macromolécula, por exemplo, uma como um grupo amino primário que é ligado a um agonista de TLR sintético, pode realçar a atividade do agonista de TLR sintético ou tem uma atividade desejável separada. Por exemplo, a macromolécula pode realçar a atividade do agonista de TLR pela ajuda para direcionar o agonista para o TLR dentro de endossomas das células alvo, pelo realce da transdução de sinal induzido pelo agonista de TLR ou pela reticulação do receptor ou qualquer combinação desta. Em uma forma de realização, a macromolécula é um lipídeo que é 5 espontaneamente incorporado em lipossomas. Em uma forma de realização, a macromolécula é uma nanopartícula que tem grupos amina na sua superfície. Uma vez ligado a um agonista de TLR, o conjugado de agonista de TLR- nanopartícula pode ser de um tamanho, por exemplo, cerca de 100 nm, que pode residir (estar presente) em endossomas.

As infecções por Staphylococcus aureus (SA) adquiridas em hospital são uma causa principal de morbidez e mortalidade. Entretanto, vacinas não são usadas em cenários agudos porque elas levam muito tempo para atuar e elas não são eficazes em pacientes imunocomprometidos. A invenção diz respeito a um método para vacinação rápida de pacientes em risco para infecções bacterianas gram-positivas, por exemplo, infecções SA, que utiliza agonista do receptor 7 equivalente a Toll (TLR7) e um ou mais antígenos (imunógenos) de uma bactéria gram-positiva. O uso das vacinas da invenção induz a imunidade em cerca de 6 dias, que fornece aplicações não acessíveis ao protocolo de vacinação padrão (por exemplo, cenários de cuidado agudo).

Como aqui divulgado, uma composição compreende uma bactéria gram-positiva, Bacillus anthraces (BA), e um agonista sintético de TLR7 foi preparado. A composição induziu a secreção de IL12 e IL6 (indicativo da ativação macrófagos derivados da medula óssea (BMDM)) in vitro e protegeu os camundongos em contraste com a inoculação de BA intra- pulmonar subsequente, de outro modo letal in vivo. Em particular, a administração de uma composição contendo um conjugado agonista de TLR7 e um imunógeno (UC-IVT99-albumina/esporos de BA irradiados) induziu a imunidade protetora para BA dentro de 6 dias. Ao contrário, a injeção dos animais com esporos de BA sozinhos ou com BA mais um adjuvante convencional, isto é, a toxina da cólera (CT), não protegeu os animais de um inoculador letal. A rapidez de uma resposta imune protetora em um animal ingênuo foi inesperada.

A invenção fornece assim composições imunogênicas. Em uma forma de realização, uma composição imunogênica da invenção inclui um agonista de TLR sintético tal como um agonista de TLR7, por exemplo, UC-IV199, ligado a uma célula bacteriana gram-positiva, por exemplo, ligada aos grupos amino livres em Staphylococcus aureus mortos; um agonista de TLR sintético tal como um agonista de TLR7 ligado a um extrato bacteriano de antígenos bacterianos gram-positivos isolados; um agonista de TLR sintético tal como um agonista de TLR7 ligado à proteína bacteriana gram- positiva isolada, por exemplo, proteína recombinante; ou um agonista de TLR sintético tal como um agonista de TLR7 ligado aos carboidratos bacterianos gram-positivos isolados. Por exemplo, um agonista sintético de TLR7 pode estar ligado aos carboidratos bacterianos usando métodos para ligar polissacarídeos de Staphylococcus aureus aos carreadores de proteína (tais como aqueles usados para o toxóide do tétano). A preparação bacteriana morta pode ser preparada usando irradiação gama, tratamento térmico ou químico. Em uma outra forma de realização, uma composição imunogênica da invenção inclui um agonista de TLR sintético tal como um agonista de TLR7 ligado a um adjuvante e uma preparação compreendendo células bacterianas gram-positivas mortas; um agonista de TLR sintético tal como um agonista de TLR7 ligado a um adjuvante e uma preparação compreendendo um extrato bacteriano gram-positivo; ou um agonista de TLR sintético tal como um agonista de TLR7 ligado a um adjuvante e uma preparação compreendendo um antígeno bacteriano gram-positivo isolado, por exemplo, proteína recombinante. Por exemplo, a composição imunogênica pode incluir UCIV199 ligado a albumina e uma preparação com bactérias gram-positivas mortas, por exemplo, Staphylococcus aureus mortos. Em uma forma de realização, uma composição imunogênica da invenção inclui um agonista sintético de TLR7 ligado a um adjuvante e uma preparação que compreende um antígeno bacteriano gram-positivo recombinante, tal como uma proteína bacteriana gram-positiva isolada ou um peptídeo deste ou carboidrato bacteriano gram-positivo isolado. Em uma forma de realização, uma dose única da composição imunogênica pode mostrar atividade muito potente, por exemplo, fornecer imunidade protetora, em um período curto de tempo, por exemplo, menos do que cerca de 10 dias.

Em uma forma de realização, uma vacina esterilizada é administrada a um paciente de 0 a 7 dias antes da hospitalização. Em uma forma de realização, a vacina é administrada intramuscularmente. Em uma forma de realização, a vacina é administrada em uma dosagem entre 10 μg e 10 mg. O uso de conjugados de agonistas de TLR sintéticos tais como agonistas da TLR7 da invenção é vantajoso visto que a química acessível versátil permite a conjugação a qualquer antígeno, e os conjugados modificáveis têm estequiometria definida. Os conjugados são baratos para preparar e são potentes, e assim fornecem proteção rápida, permitindo o uso em cenários agudos tais como trauma, queimadura, pré-cirurgia ou bio- terrorismo. Consequentemente, é fornecido um composto da fórmula (I): em que X1 é -O-, -S- ou -NRC-; em que Y é S ou NH; em que Rc é hidrogénio, alquila CM o ou alquila CM o substituído por cicloalquila C3-6 ou Rc e R1 quando juntos com o átomo de nitrogénio pode formar um anel heterocíclico ou um anel heterocíclico substituído, em que os substituintes são hidróxi, alquila Ci-6, hidróxi-alquileno Ci-6, alcóxi Ci-6, alcóxi Ci-6 alquileno Ci-6 ou ciano; em que R1 é alquila (Ci-Cio), alquila (Ci-Cio) substituído, atila Có-io ou arila CÓ-IO substituído, heterocíclico C5-9, heterocíclico C5-9 substituído; em que cada R2 é independentemente hidrogênio, -OH, alquila (Ci-Cf,), alquila (CI-CÔ) substituído, alcóxi (Ci-Ce), alcóxi (CI-CÔ) substituído, -C(O)- alquila (Ci-Cβ) (alcanoíla), -C(O)- alquila (Ci-Cf,) substituído, -C(O)- arila (Ce-Cio) (aroíla), -C(O)-arila (Ce-Cio) substituído, -C(O)OH (carboxila), -C(O)O alquila (CI-CÓ) (alcóxi-carbonila), -C(O)O alquila (Ci-Ce substituído), -NRaRb, -C(O)NRaRb (carbamoíla), -C(O)NRaRb substituído, halo, nitro ou ciano; em que cada Ra e Rb é independentemente hidrogênio, alquila (Ci-Cβ), cicloalquila (Cβ-Cs), alcóxi (Ci-Cβ), halo-alquila (Ci-Cβ), cicloalquila (C3-C8) alquila (Ci-Cβ), alcanoíla (Ci-Cô), hidróxi-alquila (CI-CÔ), arila, aril- alquila (CI-CÓ), Het, Het alquila (Ci-Cβ) ou alcóxi Ci-6 carbonila; em que X2 é uma ligação ou um grupo de ligação; em que R3 é uma macromolécula; em que n é 1,2, 3 ou 4; em que m é 1, 2, 3 ou mais, por exemplo, 5, 10, 15 ou mais; em que q é 1, 2, 3 ou até cerca de 1.000, cerca de 10.000 ou mais, por exemplo, cerca de 105, cerca de 106 ou maior; ou um sal deste farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização, qélemédela 20 ou qualquer número inteiro entre eles. Em uma outra forma de realização, m é 1 e q é > 2. Em uma forma de realização, m é 1 e R3 pode ser um vírus, por exemplo, um lentivírus outro que não vírus da imunodeficiência símia (SIV), um retrovirus, um vírus da influenza, um rinovírus, um vírus de papiloma, um vírus do herpes e outros, uma bactéria gram-positiva ou esporo bacteriano ou uma nanopartícula ou uma conta, por exemplo, uma conta de sílica, e q é 102, 103, 104, 105, 106 ou mais. Assim, o conjugado pode incluir multímeros do agonista de TLR, a macromolécula ou ambos. Os multímeros podem ser lineares ou ramificados.

Em uma forma de realização, R3 pode ser uma macromolécula que compreende uma bactéria gram-positiva, peptídeo de uma bactéria gram- positiva, proteína de uma bactéria gram-positiva, carboidrato de uma bactéria gram-positiva ou um adjuvante tal como uma proteína ou peptídeo heterólogos, isto é, de uma outra fonte que não as bactérias gram-positivas tais como uma proteína ou peptídeo de célula hospedeira, por exemplo, albumina ou ovalbumina ou um lipídeo heterólogo, ácido nucleico heterólogo, conta, tal como uma conta de poliestireno, uma nanopartícula ou dendrímero.

Assim, em várias formas de realização, m pode ser 1 ou 2; e q pode ser 1 ou 2. Em algumas formas de realização, m é 1 e a superfície do grupo R3 é ligada a centenas, milhares ou mais, grupos q. Por exemplo, os sítios relativos de uma partícula de sílica pode ser usada para ligar a partícula de sílica às porções de uma fórmula aqui descrita. Para esta configuração, o R3 pode ser qualquer outra macromolécula aqui divulgada, tal como uma nanopartícula, conta, dendrímero, lipídeo, esporo ou célula bacteriana. Em outras formas de realização, a fórmula e o grupo R3 podem formar uma cadeia alternada de três a cerca de dez grupos de repetição (por exemplo, fórmula- R3-fórmula-R3-fórmula-R3-, etc).

A macromolécula nos conjugados da invenção formam uma ligação estável com o agonista de TLR, isto é, o conjugado não atua como um pró medicamento. A macromolécula pode incluir moléculas orgânicas, compostas de carbono, oxigênio, hidrogênio, nitrogênio, enxofre, fósforo ou qualquer combinação desta, contanto que a macromolécula não seja prejudicial aos tecidos corporais (por exemplo, não seja tóxica, e/ou não cause inflamação). A macromolécula pode permitir alvejar ou realçar a resposta imune, por exemplo, a macromolécula pode ser um antígeno tal como um peptídeo específico de melanoma.

Em várias formas de realização, quando mais do que um R3 está presente em uma molécula de qualquer fórmula aqui descrita, cada R3 pode ser o mesmo ou o grupos R3 podem ser diferentes um do outro. Consequentemente, quando mais do que um grupo R3 está presente, cada R3 é independentemente um grupo como definido para cada fórmula.

Além disso, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um composto da fórmula (I) ou um sal deste farmaceuticamente aceitável, em combinação com um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável. A invenção inclui o uso de conjugados de um agonista TLR sintético e uma macromolécula, assim como conjugados agonistas de TLR e uma outra molécula. O conjugado pode ser útil para prevenir, inibir ou tratar distúrbios incluindo mas não limitados a, asma alérgica, doenças infecciosas tais como infecções virais respiratórias, por exemplo, aquelas associadas com o vírus da influenza ou infecção pelo vírus sincicial respiratório (RSV), lupo e outras doenças autoimunes, e como uma vacina, por exemplo, para câncer ou doenças infecciosas. Em uma forma de realização, uma dose única do conjugado pode mostrar atividade muito potente na estimulação da resposta imune. Além disso, por causa da toxicidade baixa dos conjugados, em algumas circunstâncias doses mais altas podem ser administradas, por exemplo, sistemicamente, enquanto que sob outras circunstâncias doses mais baixas podem ser administradas, por exemplo, devido à localização do conjugado. Em uma forma de realização, quando administrado em doses altas, os conjugados agonistas de TLR sintéticos podem evocar uma resposta antagonística, e assim podem ser úteis para inibir ou tratar asma ou doenças auto imunes. Uma primeira dose pode evocar uma hiperresposta que, por sua vez, suprime a resposta imune, evitando deste modo a inflamação. Assim, o uso de doses mais altas e readministração pode resultar em inibição de uma resposta imune.

Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um método para prevenir ou inibir uma infecção bacteriana gram-positiva em um mamífero. O método inclui administrar a um mamífero uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um antígeno bacteriano de uma bactéria gram-positiva e uma quantidade de um composto tendo a fórmula (IA): em que X1 é -O-, -S- ou -NRC-; em que Rc é hidrogênio, alquila Cno ou alquila CMO substituído ou Rc e R1 quando juntos com o átomo de nitrogênio podem formar um anel heterocíclico ou um anel heterocíclico substituído, em que os substituintes nos grupos alquila, arila ou heterocíclico são hidróxi, alquila Ci-6, hidróxi-alquileno Ci-6, alcóxi Ci-6, cicloalquila C3-6, alcóxi C1-6 alquileno Ci-6, amino, ciano, halogênio ou arila; R1 é hidrogênio, alquila (C1-C10), alquila (C1-C10) substituído, arila CÔ-IO ou arila Ce-io substituído, heterocíclico C5.9, heterocíclico C5.9 substituído; em que os substituintes nos grupos alquila, arila ou heterocíclico são hidróxi, alquila Ci-6, hidróxi-alquileno Ci-6, alcóxi Ci-6, cicloalquila C3-6, alcóxi Ci-6 alquileno CI-Ó, amino, ciano, halogênio ou arila; cada R2 é independentemente hidrogênio, -OH, alquila (Ci- Cβ), alquila (Ci-Cβ) substituído, alcóxi (Ci-β), alcóxi (Ci-β) substituído, -C(O)- alquila (Cl-Ce) (alcanoíla), -C(O)- alquila (CI-CÓ) substituído, -C(O)- arila (CÕ-CIO) (aroíla), -C(O)- arila (Cg-Cio) substituído, -C(O)OH (carboxila), - C(O)O alquila (CI-CÓ) (alcóxi-carbonila), -C(O)O alquila (Ci-Ce) substituído, -NRaRb, -C(O)NRaRb (carbamoíla), -C(O)NRaRb substituído, halo, nitro ou ciano; em que os substituintes nos grupos alquila, arila ou heterocíclico são hidróxi, alquila Ci-6, hidróxi-alquileno Ci-6, alcóxi Ci-6, cicloalquila C3.6, alcóxi Ci-6 alquileno Cu, amino, ciano, halogênio ou arila; cada Ra e Rb é independentemente hidrogênio, alquila (CI-CÓ), cicloalquila (Cs-Cs), alcóxi (Ci-Cβ), haloalquila (Ci-Cβ), cicloalquila (Cs-Cs) alquila (Ci-Cβ), alcanoíla (CI-CÓ), hidróxi-alquila (Ci-Cβ), arila, aril-alquila (Ci-Ce), Het, Het alquila (CI-CÓ) ou alcóxi-carbonila (Ci-Ce); X2 é uma ligação ou um grupo de ligação; n é 1,2, 3 ou 4; e R3 é uma macromolécula que compreende um peptídeo heterólogo, proteína heteróloga, lipídeo heterólogo, conta, tal como uma conta de poliestireno, molécula de ácido nucleico heterólogo ou dendrímero; ou um sal deste farmaceuticamente aceitável, incluindo hidratos deste.

Em certas formas de realização, a determinação do grupo R1 pode ser usada intercambiavelmente com a determinação do grupo R1 para qualquer outra fórmula aqui descrita. Os exemplos não limitantes das macromoléculas ou ligadores para estas incluem não apenas um átomo de oxigênio, um átomo de enxofre, um átomo de nitrogênio ou um átomo de carbono (e apropriadamente átomos de carbono anexos quando necessário para preencher valências) mas também macromoléculas ou ligadores com cadeias laterais que aumentam a solubilidade, tal como, por exemplo, grupos contendo anéis de morfolino, piperidino, pirrolidino ou piperazino e outros; aminoácidos, polímeros de aminoácidos (proteínas ou peptídeos), por exemplo, dipeptídeos ou tripeptídeos, e outros; carboidratos (polissacarídeos), nucleotídeos tais como, por exemplo, PNA, RNA e DNA, e outros; polímeros de materiais orgânicos, tais como, por exemplo, polietileno glicol, polilactídeo e outros; lipídeos monoméricos e poliméricos; nanopartículas orgânicas insolúveis; substâncias corporais não tóxicas tais como, por exemplo, células, lipídeos, antígenos tais como, por exemplo micróbios, tais como, por exemplo, vírus, bactérias, fungos, e outros. Os antígenos podem incluir organismos inteiros inativados ou sub-componentes destes e outros.

Também é fornecido um método para prevenir ou inibir uma infecção bacteriana gram-positiva em um mamífero. O método inclui administrar a um mamífero uma quantidade eficaz de um composto tendo a fórmula (IB): em que X1 é -O-, -S- ou -NRC-; em que Rc é hidrogênio, alquila Ci-io ou alquila Ci-io substituído ou Rc e R1 quando juntos com o átomo de nitrogênio podem formar um anel heterocíclico ou um anel heterocíclico substituído, em que os substituintes nos grupos alquila, arila ou heterocíclico são hidróxi, alquila Ci-6, hidróxi-alquileno Ci-6, alcóxi Ci-e, cicloalquila C3-6, alcóxi C1-6 alquileno Ci-6, amino, ciano, halogênio ou arila; R1 é hidrogênio, alquila (C1-C10), alquila (C1-C10) substituído, arila Ce-io ou arila Cβ-io substituído, heterocíclico C5.9, heterocíclico C5.9 substituído; em que os substituintes nos grupos alquila, arila ou heterocíclico são hidróxi, alquila C1.6, hidróxi-alquileno Ci-6, alcóxi C1.6, cicloalquila C3-6, alcóxi Ci-6 alquileno C1-6, amino, ciano, halogênio ou arila; cada R2 é independentemente hidrogênio, -OH, alquila (Ci- CÔ), alquila (Ci-Cβ) substituído, alcóxi (CI-CÔ), alcóxi (Ci-Ce) substituído, - C(O)- alquila (CI-CÔ) (alcanoíla), -C(O)- alquila (CI-CÓ) substituído, -C(O)- arila (CÓ-CIO) (aroíla), -C(O)- arila (Cf,-Cio) substituído, -C(O)OH (carboxila), -C(O)O alquila (Ci-Cg) (alcóxi-carbonila), -C(O)O alquila (CI-CÔ) substituído, -NRaRb, -C(O)NRaRb (carbamoíla), -C(O)NRaRb substituído, halo, nitro ou ciano; em que os substituintes nos grupos alquila, arila ou heterocíclico são hidróxi, alquila Ci-6, hidróxi-alquileno hidróxiCi-6, alcóxi Ci. 6, cicloalquila C3-6, alcóxi Ci-6 alquileno Ci-6, amino, ciano, halogênio ou arila; cada Ra e Rb é independentemente hidrogênio, alquila (Ci-Cβ), cicloalquila (Cs-Cs), alcóxi (CI-CÓ), haloalquila (Ci-Ce), cicloalquila (Cs-Cs) alquila (Ci-Ce), alcanoíla (CI-CÓ), hidróxi-alquila (Ci-Cβ), arila, aril-alquila (Ci-Cf,), Het, Het alquila (CI-CÔ) OU alcóxi (CI-CÔ) carbonila; X2 é uma ligação ou um grupo de ligação; n é 1,2, 3 ou 4; e R3 é a bactéria gram-positiva, uma proteína ou peptídeo antigênicos isolados das bactérias gram-positivas ou um polissacarídeo isolado das bactérias gram- positivas; ou um sal deste farmaceuticamente aceitável, incluindo hidratos deste. Em uma forma de realização, as bactérias gram-positivas são um Staphylococcus.

Em uma forma de realização, R3 é uma proteína ou peptídeo antigênicos isolados de Staphylococcus e este composto é administrado com uma preparação de Staphylococcus mortos.

A invenção diz respeito a um composto da invenção para o uso na terapia médica (por exemplo, para a profilaxia de doenças bacterianas tal como em uma vacina). Os compostos da invenção também podem ser usados para biodefesa, e contra B. anthrax.

São ainda fornecidos as composições e um composto da invenção para o uso na terapia médica, por exemplo, para tratar asma ou infecções virais ou prevenir infecção viral, assim como o uso dos conjugados para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição ou sintoma associados com TLR ou uma em que uma resposta imune aumentada ou uma resposta imune suprimida é indicada.

Além disso, a invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um composto da invenção ou um sal deste farmaceuticamente aceitável, em combinação com um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável, opcionalmente em combinação com uma preparação de uma bactéria gram-positiva selecionada, por exemplo, uma preparação morta ou um extrato, proteína isolada de uma bactéria gram- positiva selecionada ou carboidrato isolado (polissacarídeo) de uma bactéria gram-positiva selecionada.

A invenção inclui o uso de conjugados de agonistas da TLR7 e uma macromolécula, por exemplo, uma como um grupo amino primário, que realça a atividade do agonista, por exemplo, albumina ou tem um atividade desejável separada, por exemplo, é um antígeno de uma bactéria gram- positiva. Os conjugados podem incluir macromoléculas diretamente ligadas a um agonista de TLR7 ou ligado por intermédio de um ligador para o agonista de TLR7. Os conjugados podem otimizar a resposta imune enquanto limitam efeitos colaterais sistêmicos indesejáveis de agonistas da TLR7.

Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um método para prevenir ou tratar uma infecção bacteriana gram-positiva em um mamífero, tal como um ser humano. O método inclui administrar a um animal em necessidade de tal terapia, uma quantidade eficaz de um composto da invenção ou um sal deste farmaceuticamente aceitável, conjugado a um adjuvante ou a pelo menos um antígeno da bactéria gram-positiva.

Também é fornecido um método para identificar conjugados úteis para prevenir, inibir ou tratar uma condição ou sintomas particulares, por exemplo, pela identificação do perfil de citocina induzido pelo conjugado in vitro ou in vivo ou pela identificação do endossoma, por exemplo, início, meio ou final, tendo o TLR para o agonista de TLR. Visto que células diferentes têm endossomas diferentes, a identificação do endossoma precursor em células pode permitir para alvejamento de conjugados a tipos de célula específicos ou acesso melhorado dos conjugados aos endossomas.

Descrição Resumida das Figuras

A Figura 1 mostra um conjugado de agonista TLR/alfa- 16 galactosil-ceramida.

A Figura 2 ilustra um conjugado de UC-1V150 de G1 PAMAM com um núcleo de etileno diamina.

A Figura 3A ilustra um ligador (SANH) para conjugar uma macromolécula e um agonista de TLR sintético.

A Figura 3B ilustra a síntese de UC-1V150.

A Figura 3C ilustra conjugação de UC-1V150 a MSA. 200 μL de MSA (25 mg/ml) são misturados com 100 μL de tampão de conjugação (fosfato 1 M,pH = 7,2) e 690 μL de PBS. 844 μg de SANH em 10 μL de DMF (40-vezes de excesso molar para massa) são adicionados à solução de proteína (concentração final de NP em mistura de reação é de 5 mg/ml). Depois de misturar suavemente, a reação é deixada prosseguir na temperatura ambiente por 2 horas. Para remover o excesso de SANH a mistura de reação é carregada em um dispositivo de filtração giratório microcon (YM-3, Millipore) e concentrada a cerca de 70 μL. 460 μg de UC-1V150 dissolvidos em 10 μL de DMF foram adicionados a MSA modificado com SANH e a mistura de reação foi incubada durante a noite na temperatura ambiente. Para remover o excesso de UC-1V150 a mistura de reação foi primeiro concentrada até 50 μL usando um dispositivo de filtração giratório microcon (Millipore: YM-3) e carregada em uma coluna de G25 micro-spin (GE Healthcare).

A Figura 4 é uma ilustração gráfica do perfil de absorção (a cerca de 350 nm) de um composto da fórmula I (um conjugado de OVA/SANH/ de UC-1V150).

A Figura 5 ilustra o perfil de absorção de uma reação de conjugação de um agonista sintético de TLR7, UC-1V150, à albumina sérica de camundongo (MSA). A razão de UC-1V150 para MSA é aproximadamente de 5: 1.

A Figura 6 ilustra um conjugado de agonista TLR/fosfolipídeo

A Figura 7 mostra o efeito de administração de UC-1V199/ lipídeo em diferentes doses e tempo.

As Figuras 8A-B mostram que de UC-lV199/lipídeo inibe a sinalização de TLR7 e TLR2.

A Figura 9 ilustra dose-resposta bifásica para um agonista de TLR7 ultrapotente (um agonista de pico/nanomolar e antagonista micromolecular).

As Figuras 10A e B ilustram que os conjugados UC-1 V150/MSA ativam tanto macrófagos derivados da medula óssea de murino (painel A) quanto células mononucleares de sangue periférico humanas painel B). Células foram incubada com várias concentrações dos conjugados de 0,5 nM a 10 μM com BMDM ou de 0,1 a 10 μM com PBMC. Os sobrenadantes de cultura foram colhidos depois de 24 horas e os níveis de citocina foram analisados pela Luminex.

As Figuras 11 A, B, e C ilustram a eficácia in vivo de um conjugado de agonista de TLR7. C57BL/6 mice foram injetados (i.v. por intermédio da veia da cauda) com várias quantidades de UC-1 VI50 (SM- 360320 modificado com aldeído) ou UC-1V150/MSA por camundongo. As amostras de soro foram coletadas e os níveis de citocina foram analisados por Luminex. O efeito do agonista sintético de TLR7 não conjugado, SM-360320, durou por apenas 2 horas ao passo que UC-1V150/MSA prolongou o efeito por pelo menos 6 horas.

A Figura 12 mostra a atividade local prolongada in vivo de um conjugado de UC-1V150/MSA sem um efeito sistêmico. Os camundongos C57BL/6 foram anestesiados e administrados (i.t.) com 3 nmoles de UC- 1V150/MSA. Nos pontos de tempo indicados, os camundongos foram sacrificados, e BALF e os soros coletados. Os dados foram combinados a partir de dois experimentos separados com pelo menos seis camundongos por grupo. Os resultados mostram os valores médios ± SEM.

A Figura 13 mostra a indução de citocina em BMDM pelo agonista de TLR7 conjugado a esporo de antraz irradiado.

A Figura 14 fornece gráficos de sobrevivência depois da imunização de camundongos com UC-1V150/MSA e inoculação com esporos. A) camundongos A/J fêmeas igualados em idade foram administrados i.n. apenas com solução salina ou solução salina contendo MSA (uma quantidade equivalente a UC-1V150/MSA), UC-1V150 ou UC- 1V150/MSA a 0,75 nmol/camundongo 1 dia antes da infecção pelo B. anthraces, e a sobrevivência foi avaliada em até 13 dias. B) Camundongos Balb/c foram administrados i.n. em solução salina ou UC-1V150/MSA em 5 nmoles/camundongo 1 dia antes da infecção pelo vírus da influenza, e a sobrevivência seguiu por 21 dias. Em cada modelo, as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e testes de classificação de log foram realizados para determinar a significância. Pelo menos 8 camundongos foram testados em cada grupo.

A Figura 15 fornece um gráfico de sobrevivência percentual depois de uma dose única de vacina com agonistas da TLR7 e conjugados.

A Figura 16 ilustra que a proteção contra a exposição ao esporo de antraz depende das células CD4+.

A Figura 17 mostra um perfil de citocina local em camundongos. Camundongos C57BL/6 foram administrados i.t. com um UC- 1V150/MSA conjugado ou UC-1V136 não conjugado a 3 nmoles ou 500 nmoles por camundongo, respectivamente. BALF e os soros foram coletados nos pontos de tempo indicados e os níveis de citocina determinados pelo imunoensaio de multiplex. Os valores médios de pelo menos 3 a 5 camundongos por grupo são mostrados ± SEM.

A Figura 18 ilustra o espectro de absorbância para a conjugação direta de partículas SIV ao UC-1V150.

A Figura 19 ilustra a indução da citocina em BMDC por um conjugado de um agonista sintético de TLR7 e partículas virais.

As Figuras 20A-B ilustram os efeitos de um conjugado de UC- 1V150/SIV inativado (painel A) ou UC-1V150/OVA/ODN painel B) na produção de IL-12. As BMDC mielóides foram incubadas por 24 horas sob várias condições com 0,1 μg/ml como indicado. Os níveis de IL-12 no sobrenadante de célula foram medidos pelo ELISA.

A Figura 21 é uma ilustração gráfica da estimulação de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC) com OVA/UC-1V150 ou OVA/ODN (ODN = oligodesoxinucleotídeo).

A Figura 22 é uma ilustração do espectro de UV de um conjugado duplo, (OVA/UC-1V150/ODN 1043).

A Figura 23 é uma ilustração da indução de IL-12 em BMDC usando conjugado OVA/ODN/UC-1V150. OVA/1043 e OVA/1018 são conjugados a ODN.

A Figura 24 ilustra a conjugação de um agonista TLR sintético a um componente de lipídeo de um lipossoma. A auto-montagem do TLR conjugado ligado por intermédio do espaçador-ligador a um lipídeo C-15, resultou na formação de 100 nM de nanopartículas. O agonista de TLR e um NHS-éster do lipídeo foram reagidos em quantidades equimolares em DMF e 1 equivalente de trietilamina por 6 horas. A mistura de reação foi purificada pela HPLC de preparação sob condições isocráticas em acetonitrila/água 50:50.

A Figura 25 mostra um esquemático de um conjugado de agonista/lipossoma de TLR. Os lipossomas são formados com colesterol:DOPE:DSPC:mPEG2000-DSPE:TLRDSPE:BODIPY-DOPE 30:30:30:5:5:1,5; DSPE = distearoilfosfatidiletanolamina; DOPE = dioleoilfosfatidiletanolamina; BODIPY = 6-(((4-4-difluoro-5-(2-tienil)-4- boro-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-il)estirilóxi)acetil)aminoexanamido-DOPE. Colesterol:DOPE:DSPC:DSPETLRagonista:DSPE-mPEG (na razão molar 1:1:1:0,16:0,16) em clorofórmio foram coletados em tubos de cultura de vidro de 30 ml, secados sob uma corrente de gás de nitrogênio e dessecados a vácuo por um mínimo de 6 h para remover qualquer solvente orgânico residual. A película de lipídeo seco foi hidratada em água deionizada estéril em um volume total de 1 ml por um mínimo de 12 horas. Lipossomas foram turbilhonados por 2 a 3 minutos para remover qualquer película de lipídeo aderente e sonificados em um sonificador de banho (ULTRAsonik 28X) por 2 a 3 minutos na temperatura ambiente para produzir vesículas multilamelares (MLV). MLVs foram depois sonificados com uma sonda de Ti (usando um sonificador Branson 450 a 100 % de ciclo trabalho e energia de saída de 25 W) em um banho de gelo por 1 a 2 minutos para produzir vesículas unilamelares pequenas (SUVs) como indicado pela formação de uma solução translúcida clara. A solução foi filtrada por pressão em sequência através de membranas de policarbonato de nucleoporo de 200 e depois 100 nm para obter nanopartí cuias lipossômicas de 100 nm com um fator de polidispersividade de menos do que 0,1.

A Figura 26 mostra a síntese de lipídeo conjugado WW-109. 0,45 mg (1 μmol) de IV-199 foi adicionado a 100 μl de uma solução a 10 mM de DOPE em clorofórmio. Para esta solução foi adicionado 0,1 mg de trietilamina a partir de um estoque de clorofórmio. A mistura foi reagido na temperatura ambiente por 24 horas e o clorofórmio foi submetido ao rotavapor. O resíduo sólido branco foi lavado três vezes em 60 %/metanol/hexano e centrifugado para se obter um sólido branco. O m/z pelo espec. de massa foi de 1086 e o composto teve uma absorção max de uv a 268 nm. Porções de ácido graxo de vários comprimentos de cadeia podem ser usadas para preparar os compostos análogos, incluindo ácidos carboxílicos C14-C22 com um, dois, três ou quatro sítios de insaturação, epoxidação, hidroxilação ou uma combinação destes, em quaisquer locais praticáveis da cadeia carbônica do ácido carboxílico. Em uma forma de realização específica, as porções de ácido graxo são ácidos carboxílicos C17 com um sítio de insaturação em C8-C9. Em uma outra forma de realização específica, as porções de ácido graxo são ácidos carboxílicos Cis com um sítio de insaturação em C9-C10. As porções de ácido carboxílico de cada porção de ácido graxo podem ser as mesmas ou elas podem ser diferentes (ver, por exemplo, a Figura 6).

A Figura 27 ilustra um esquemático de uma partícula de sílica com agonistas de TLR covalentemente ligados a ela.

A Figura 28 fornece compostos exemplares para preparar conjugados da invenção ou para o uso nos métodos da invenção. Outros conjugados incluem agonistas de TLR ligados à albumina sérica humana, por exemplo, HSA/UC-1V150 ou DOPE/UC-1V199. UC-1 X-51 aumenta os níveis de TNF-alfa três vezes (110 ng/ml)

Descrição Detalhada da Invenção Definições

Como aqui usado, o termo “anticorpo” refere-se a uma proteína tendo um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados pelos genes da imunoglobulina ou fragmentos de genes da imunoglobulina. Os genes da imunoglobulina reconhecidos incluem os genes da região constante a capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, assim como a miríade de genes da região variável de imunoglobulina. Cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

A unidade estrutural da imunoglobina básica (anticorpo) é conhecida compreender um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia “leve” (cerca de 25 kD) e uma “pesada” (cerca de 50 a 70 kD). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. Os termos variável de cadeia leve (VL) e variável de cadeia pesada (VH) referem-se a estas cadeias leves e pesadas respectivamente.

Os anticorpos podem existir como imunoglobulinas intactas ou como modificações em uma variedade de formas incluindo, por exemplo, FabFc2, Fab, Fv, Fd, (Fab’X um fragmento Fv contendo apenas regiões variáveis de cadeia leve e pesada, um fragmento Fab ou (Fab)52 contendo as regiões variáveis e partes das regiões constantes, um anticorpo de cadeia única, por exemplo, scFv, os anticorpos enxertados na CDR e outros. A cadeia pesada e leve de um Fv pode ser derivada do mesmo anticorpo ou anticorpos diferentes produzindo deste modo uma região quimérica Fv. O anticorpo pode ser de animal (especialmente camundongo ou rato) ou de origem humana ou pode ser quimérico ou humanizado. Como aqui usado o termo “anticorpo” inclui estas várias formas.

Uma composição é compreendida de “substancialmente todo” de um composto um particular ou uma forma particular de um composto (por exemplo, um isômero) quando uma composição compreende pelo menos cerca de 90 %, e preferivelmente pelo menos cerca de 95 %, 99 %, e 99,9 %, da composição particular em uma base em peso. Uma composição compreende uma “mistura” de compostos ou formas do mesmo composto, quando cada composto (por exemplo, isômero) representa pelo menos cerca de 10 % da composição em uma base em peso. Um análogo de purina da invenção ou um conjugado deste, pode ser preparado como um sal ácido ou como um sal básico, assim como nas formas de ácido livre ou base livre. Em solução, certos dos compostos da invenção podem existir como zuiteríons, em que contra ions são fornecidos pelas próprias moléculas de solvente ou de outros ions dissolvidos ou colocados em suspensão no solvente.

Como aqui usado, o termo “isolado” refere-se a preparação, isolação e/ou purificação in vitro de uma molécula do ácido nucleico, um peptídeo ou proteína ou outra molécula de modo que a mesma não esteja associada com as substâncias in vivo ou esteja presente em uma forma que seja diferente que é encontrada na natureza. Assim, o termo “isolado” quando usado em relação a um ácido nucleico, como em “oligonucleotídeo isolado” ou “polinucleotídeo isolado” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos um contaminante com o qual a mesma está ordinariamente associada na sua fonte. Um ácido nucleico isolado está presente em uma forma ou cenário que é diferente daquele nos quais a mesma é encontrada na natureza. Ao contrário, ácidos nucleicos não isolados (por exemplo, DNA e RNA) são encontrados no estado em que eles existem na natureza. Por exemplo, uma dada sequência de DNA (por exemplo, um gene) é encontrado no cromossoma da célula hospedeira em proximidade aos genes vizinhos; sequências de RNA (por exemplo, uma sequência específica de mRNA que codifica uma proteína específica), são encontrados na célula como uma mistura com numerosos outros mRNAs que codificam uma multidão de proteínas. Por este motivo, com respeito a uma “molécula de ácido nucleico isolada”, que inclui um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma combinação destes, a molécula do ácido nucleico isolada” (1) não seja associada com todo ou uma porção de um polinucleotídeo em que a molécula do ácido nucleico isolada” é encontrada na natureza, (2) esteja operavelmente ligada a um polinucleotídeo que a mesma não está ligada na natureza ou (3) não ocorra na natureza como parte de uma sequência maior. A molécula do ácido nucleico isolada pode estar presente na forma de filamento único ou filamento duplo. Quando uma molécula de ácido nucleico deva ser utilizada para expressar uma proteína, o ácido nucleico contém em um mínimo, o filamento de sentido ou codificador (isto é, o ácido nucleico pode ser de filamento único), mas pode conter tanto o filamento de sentido quanto o de anti-sentido (isto é, o ácido nucleico pode ser de filamento duplo).

O termo “aminoácido” como aqui usado, compreende os resíduos dos aminoácidos naturais (por exemplo, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, Hyl, Hyp, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, e Vai) na forma D ou L, assim como os aminoácidos não naturais (por exemplo, fosfosserina, fosfotreonina, fosfotirosina, hidróxi-prolina, gama- carboxiglutamato; ácido hipúrico, ácido octaidroindol-2-carboxílico, estatina, ácido l,2,3,4,-tetraidroiso-quinolino-3-carboxílico, penicilamina, omitina, citrulina, -metil-alanina, para-benzoilfenilalanina, fenilglicina, propargilglicina, sarcosina, e terc-butilglicina). O termo também compreende os aminoácidos naturais e não naturais que carregam um grupo de proteção de amino convencional (por exemplo, acetil ou benziloxicarbonila), assim como os aminoácidos naturais e não naturais protegidos no terminal carbóxi (por exemplo, como um alquila (Ci-Cβ), éster fenílico ou benzílico ou amida; ou como uma amida metilbenzílica). outros grupos de proteção de amino e carbóxi adequados são conhecidos por aqueles habilitados na técnica (ver por exemplo, T. W. Greene, Protecting Grupos In Organic Synthesis; Wiley: Nova Iorque, 1981, e referências citadas nesta). Por exemplo, um aminoácido pode ser ligado ao resto de um composto da fórmula I através do terminal carbóxi, do terminal amino ou através de qualquer outro ponto conveniente de ligação, tal como, por exemplo, através do enxofre de cisteína.

O termo “receptor equivalente a toll” (TLR) refere-se a um membro de um família de receptores que se ligam ao precursor molecular associado a patógeno (PAMPs) e facilita uma resposta imune em um mamífero. Dez TLRs de mamíferos são conhecidos, por exemplo, TLR1-10.

O termo “agonista do receptor equivalente a toll” (agonista de TLR) refere-se a um molécula que se liga a um TLR. Os agonistas sintéticos de TLR são compostos químicos que são planejados para ligar a um TLR e ativar o receptor. Os agonistas sintéticos de TLR exemplares aqui fornecidos incluem “agonista de TLR-7”, “agonista de TLR”, “agonista de TLR-3” e “agonista de TLR-9.” Os agonistas de TLR incluem imiquimod, resiquimod, broprimina e loxoribina.

O termo “ácido nucleico” como aqui usado, refere-se a DNA, RNA, de filamento único, de filamento duplo ou motivos de hibridização mais altamente agregados, e quaisquer modificações químicas destas. As modificações incluem, mas não são limitadas a, aquelas que fornecem grupos químicos que incorporam carga adicional, polarizabilidade, ligação de hidrogênio, interação eletrostática e fluxionalidade para as bases de ligando de ácido nucleico ou para o ligando de ácido nucleico como um todo. Tais modificações incluem, mas não são limitadas a, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), modificações de grupo fosfodiéster (por exemplo, fosforotioatos, metilfosfonatos), modificações de açúcar na posição 2’, modificações de pirimidina na posição 5, modificações de purina na posição 7, modificações de purina na posição 8, modificações de purina posição 9, modificações nas aminas exocílicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo ou 5- iodouracila; modificações da cadeia principal, metilações, combinações de emparelhamento de base não usuais tais como a isobase, isocitidina e isoguanidina e outros. Os ácidos nucleicos também podem incluir bases não naturais, tais como, por exemplo, nitroindol. As modificações também podem incluir modificações em 3’ e 5’ tais como encapuzamento com um BHQ, um fluoróforo ou uma outra porção. Como aqui usado, “sais farmaceuticamente aceitáveis” refere-se aos derivados dos compostos divulgados em que o composto precursor é modificado para fabricação de sais ácidos ou bases destes. Os exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitadas a, sais de ácido mineral ou orgânico de resíduos básicos tais como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos tais como ácidos carboxílicos; e outros. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amónio quaternários do composto precursor formado, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Por exemplo, tais sais não tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos tais como clorídrico, bromídrico, sulfúrico, sulfamico, fosfórico, nítrico e outros; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos tais como acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamóico, maléico, hidróxi- maléico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicílico, sulfanílico, 2- acetoxibenzóico, fumárico, tolueno-sulfônico, metanossulfônico, etano dissulfônico, oxálico, isetiônico, e outros.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos úteis na presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto precursor, que contém uma porção ácida ou básica, pelos métodos químicos convencionais. No geral, tais sais podem ser preparados pela reação das formas de ácido ou base livres destes compostos com uma quantidade estequiométrica do ácido ou base apropriados em água ou em um solvente orgânico ou em uma mistura dos dois; no geral, meios não aquosos como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol ou acetonitrila são preferidos. Listas de sais adequados são encontrados em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17a. ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985), a divulgação da qual por meio deste incorporada por referência.

A frase “farmaceuticamente aceitável” é utilizada aqui para se referir àqueles compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que estão, dentro do escopo do julgamento médico criterioso, adequado para o uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação proporcionados com uma razão de benefício/risco razoável.

As seguintes definições são usadas, a menos que de outro modo descrito: halo ou halogênio são flúor, cloro, bromo ou iodo. Alquila, alcóxi, alquenila, alquimia etc. denota grupos tanto retos quanto ramificados; mas referência a um radical individual tal como “propila” abrange apenas o radical de cadeia reta, um isômero de cadeia ramificada tal como “isopropila” sendo especificamente aludido. Arila denota um radical fenila ou um radical carbocíclico bicíclico fundido em orto tendo cerca de nove a dez átomos no anel em que pelo menos um anel é aromático. Het pode ser heteroarila, que abrange um radical ligado por intermédio de um anel carbono de um anel aromático monocíclico contendo cinco ou seis átomos no anel consistindo de carbono e um a quatro heteroátomos cada um selecionado do grupo que consiste de oxigênio não peróxido, enxofre, e N(X) em que X é ausente ou é H, O, alquila (C1-C4), fenila ou benzila, assim como um radical de um heterociclo bicíclico fundido em orto de cerca de oito a dez átomos no anel derivado disto, particularmente um benz-derivado ou um derivado pela fusão de um dirradical de propileno, trimetileno ou tetrametileno para este.

Será avaliado por aqueles habilitados na técnica que os compostos da invenção tendo um centro quiral podem existir em e ser isolados em formas racêmicas opticamente ativas. Alguns compostos podem exibir polimorfismo. Deve ser entendido que a presente invenção abrange qualquer forma racêmica, opticamente ativa, polimórfica ou estereoisomérica ou misturas destas, de um composto da invenção, que possuam as propriedades úteis aqui descritas, sendo bem conhecido na técnica como preparar formas opticamente ativas (por exemplo, pela resolução da forma racêmica pelas técnicas de recristalização, pela síntese de materiais de partida opticamente ativos, pela síntese quiral ou separação cromatográfica usando uma fase estacionária quiral) e como determinar a atividade agonista usando os testes padrão aqui descritos ou usando outros testes similares que são conhecidos na técnica. Também é entendido por aqueles habilitados na técnica que os compostos aqui descritos incluem seus vários tautômeros, que podem existir em vários estados de equilíbrio um com o outro. “Quantidade terapeuticamente eficaz” é intencionado a incluir uma quantidade de um composto útil na presente invenção ou uma quantidade da combinação de compostos reivindicada, por exemplo, para tratar ou prevenir a doença ou distúrbio ou para tratar os sintomas da doença ou distúrbio, em um hospedeiro. Como aqui usado, “tratando” ou “tratar” inclui (i) prevenir uma condição patológica de ocorrer (por exemplo profilaxia); (ii) inibir a condição patológica ou impedindo seu desenvolvimento; (iii) aliviar a condição patológica; e/ou diminuir sintomas associados com a condição patológica.

Como aqui usado, o termo “paciente” refere-se aos organismos a serem tratados pelos métodos da presente invenção. Tais organismos incluem, mas não são limitados a, mamíferos tais como seres humanos. No contexto da invenção, o termo “paciente” no geral refere-se a um indivíduo que receberá ou que tem recebido tratamento (por exemplo, administração de um composto da invenção). “Composto estável” e “estrutura estável” são significados que indicam um composto que é suficientemente robusto para sobreviver a isolação a um grau útil de pureza de uma mistura de reação, e formulação em um agente terapêutico eficaz. Apenas compostos estáveis são contemplados pela presente invenção.

Os Agonistas de TLR e Conjugados da invenção e Seus Usos

Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um método terapêutico para prevenir ou tratar uma condição patológica ou sintoma em um mamífero, tal como um ser humano, em que a atividade de um agonista de TLR é implicado e sua ação é desejada. O método inclui administrar a um animal em necessidade de tal terapia, uma quantidade eficaz de um composto da invenção ou um sal deste farmaceuticamente aceitável. Os exemplos não limitantes das condições ou sintomas patológicos que são adequados para o tratamento incluem cânceres, doenças inflamatórias do trato gastrointestinal, cérebro, pele, juntas, e outros tecidos, doenças bacterianas e virais, doenças auto imunes, e tratar a doença de Crohn. Os compostos da invenção também podem ser usados para preparar vacinas contra bactérias, vírus, câncer, células ou peptídeos específicos de câncer ou para realçar anticorpos monoclonais anticâncer, como um estimulante do CNS ou para biodefesa. A invenção assim fornece um composto da invenção para o uso na terapia médica (por exemplo, para o uso como um agente anticâncer, para tratar doenças bacterianas, para tratar doenças virais, tais como hepatite C e hepatite B, para tratar a doença de Crohn, e no geral como agentes terapêuticos para tratar doença imunológica). Além disso, os compostos da invenção podem prevenir carcinogênese, por exemplo, pelos vírus da hepatite C e hepatite B, e podem ser usados para a fabricação de um medicamento útil para o tratamento de câncer, infecção virai ou bacteriana, a doença de Crohn, e distúrbios imunológicos em um mamífero, tal como um ser humano.

Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para tratar uma infecção virai em um mamífero pela administração de um agonista de TLR conjugado da invenção. A infecção virai pode ser causada por um vírus de RNA, um produto do vírus de RNA que atua como um agonista de TLR, e/ou um vírus de DNA. Um vírus de DNA exemplar é o vírus da hepatite B. Em uma forma de realização, a infecção virai é causada por um coronavirus que causa a Síndrome Respiratória Aguda Severa (SARS), um vírus da Hepatite B ou um Vírus da Hepatite C.

Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para tratar câncer pela administração de uma quantidade eficaz de um conjugado do agonista de TLR da invenção, o câncer pode ser um câncer sensível ao interferon, tal como, por exemplo, uma leucemia, um linfoma, um mieloma, um melanoma ou um câncer renal. Os cânceres específicos que podem ser tratados incluem melanoma, câncer da bexiga superficial, queratose actínica, neoplasia intraepitelial, e carcinoma dérmico de célula basal, escamoso e outros. Além disso, o método da invenção inclui tratamento para uma condição pré cancerosa tal como, por exemplo, queratose actínica ou neoplasia intraepitelial, polipose familiar (pólipos), displasia cervical, cânceres cervicais, câncer da bexiga superficial e quaisquer outros cânceres associados com infecção (por exemplo, linfoma, sarcoma de Karposi sarcoma ou leucemia); e outros.

Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para tratar uma doença autoimune pela administração de um quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado do agonista de TLR da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável de um tal composto. As doenças autoimunes exemplares são Esclerose Múltipla, lupo, artrite reumatóide e outros.

Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método de tratar a doença de Crohn pela administração de um conjugado do agonista de TLR da invenção.

Os conjugados agonistas de TLR podem incluir um polímero agonista de TLR homofuncional, por exemplo, formado de um agonista de TLR7 ou um agonista de TLR3. O agonista de TLR7 pode ser uma porção 7- tia-8-oxoguanosinila (TOG), uma porção 7-deazaguanosinila (7DG), uma porção de resiquimod ou um porção de imiquimod. Em uma outra forma de realização, o conjugado agonista de TLR pode incluir um polímero agonista de TLR heterofuncional. O polímero agonista de TLR heterofimcional pode incluir um agonista de TLR7 e um agonista de TLR3 ou um agonista de TLR9 ou todos os três agonistas. O polímero agonista de TLR heterofuncional pode incluir um agonista de TLR8 e um agonista de TLR9.

A invenção inclui covalentemente conjugar um agonista de TLR sintético com macromoléculas selecionadas para obter, por exemplo, uma forma molecular, tamanho e valência desejados de modo a otimizar as propriedades imunológicas do conjugado resultante, e/ou para alvejar ou liberar o conjugado aos tecidos e células desejadas. Como aqui descrito, os conjugados são designados serem úteis em uma variedade de aplicações médicas incluindo mas não limitados a, asma alérgica, infecções virais respiratórias (influenza e RSV), lupo e outras doenças autoimunes, e como combinações de antígeno-adjuvante para vacinas contra câncer e doenças infecciosas. Os conjugados fornecem uma resposta imune ótima enquanto limitam efeitos colaterais sistêmicos indesejáveis amarrando-se o ativador imune (o agonista de TLR sintético) a uma macromolécula por uma ligação covalente forte. A macromolécula pode servir como uma entidade alvejadora e/ou um parte integral da resposta imune, tal como o antígeno em um conjugado adjuvante-antígeno. Uma vantagem principal quando administrar um conjugado estável em um ambiente localizado é que apenas quantidades muito pequenas do agonista de TLR são liberadas com o tempo no ambiente sistêmico.

Em uma forma de realização, a macromolécula é selecionada de produtos, tais como proteínas, lipídeos ou dendrímeros ou polímeros tendo grupos amino nas suas superfícies, tais como poliestireno “contas de amino,” cada um tendo grupos amino primários disponíveis para conjugação a um ligador tal como SANH ou para conjugação direta ao agonista sintético de TLR7. Por exemplo, seguindo as conjugação do ligador e macromolécula, do agonista de TLR7, tal como UC-1 VI50, é reagido com o éster de NHS do conjugado SANH-macromolécula para fornecer um conjugado agonista de TLR7-S ANH-macromolécula. Vacinas no geral não são usadas em cenários agudos porque (1) elas levam muito tempo para atuar e (2) elas não são eficazes em pacientes imuno comprometidos. Por exemplo, infecções por Staphylococcus aureus (SA) são uma causa principal de morbidez e mortalidade em pacientes hospitalizados. Os grupos particularmente em risco são aqueles com imuno supressão devido a queimaduras, trauma, colocação de cateter, diálise ou idade avançada em clínica de repouso. Além disso, muitas cepas de SA adquiridas em hospital são resistentes aos antibióticos convencionais.

A presente invenção supera estas duas barreiras para tratamento. O uso de composições, incluindo agonistas sintéticos de TLR7 e conjugados com agonistas sintéticos de TLR7, em combinação com antígenos bacterianos gram-positivos são aqui fornecidos. Os ligandos de TLR7 no geral têm farmacocinéticas deficientes, e absorção e excreção sistêmicas rápidas. Devido a dispersão sistêmica, eles resultam na síndrome da citocina. Os adjuvantes eficazes devem criar um “gradiente imune” de citocinas e quimiocinas. Em uma forma de realização, a conjugação de agonistas de TLR7 sintéticos potentes às macromoléculas realça propriedades de liberação, melhora as farmacocinéticas, e evita a toxicidade sistêmica pela exposição localizada.

Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um método para prevenir ou inibir uma infecção bacteriana gram-positiva em um mamífero, que compreende administrar a um mamífero uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um antígeno bacteriano de uma bactéria gram-positiva e uma quantidade de um agonista sintético de TLR7. Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um método para prevenir ou inibir uma infecção bacteriana gram-positiva em um mamífero, que compreende administrar a um mamífero uma quantidade eficaz de um conjugado agonista sintético de TLR7 a um antígeno bacteriano gram- positivo. Por exemplo, um conjugado de 1V150-MSA retém sua atividade agonista de TLR7, tem potência realçada e toxicidade reduzida, causa ativação local de imunidade inata, e induz a proteção imune dependente de célula T dentro de 6 dias depois de uma vacinação única com um antígeno bacteriano.

Em uma forma de realização, um agonista sintético de TLR7 é administrado com ou conjugado a, um ou mais antígenos de S. aureus. A Tabela 1 fornece antígenos exemplares para S. aureus para o uso com agonistas sintéticos de TLR7, particularmente em cenários de cuidado agudo. As vacinas da invenção podem inesperadamente fornecer uma rápida e eficaz resposta imune.

Em uma forma de realização, a invenção diz respeito aos seguintes conjugados X‘ = -O-,-S- ouNRc-, em que Rc hidrogênio, alquila CMO OU alquila Cmo substituído por cicloalquila C3-6 ou Rc e R1 quando juntos com o átomo de nitrogênio podem formar um anel heterocíclico ou um anel heterocíclico substituído, em que os substituintes são hidróxi, alquila Ci-6, hidróxi-alquileno Ci-6, alcóxi Ci. 6,alcóxi Ci-6 alquileno Ci-6 ou ciano; em que R1 é alquila (C1-C10), alquila (C1-C10) substituído, arila Có-io ou arila CÓ-IO substituído, heterocíclico C5-9, heterocíclico C5-9 substituído; em que os substituintes nos grupos alquila, arila ou heterocíclico são hidróxi, alquila Ci-6, hidróxi-alquileno Ci-6, alcóxi Ci-6, alcóxi Ci-6 alquileno Ci-6, amino, ciano, halogênio ou arila; cada R2 é independentemente hidrogênio, -OH, alquila (Ci- CÓ), alquila (Ci-Cβ) substituído, alcóxi (Ci-Cβ), alcóxi (CI-CÓ) substituído, - C(O)- alquila (CI-CÔ) (alcanoíla), -C(O) alquila (Ci-C6) substituído, -C(O)- arila (CÔ-CIO) (aroíla), -C(O)- arila (Cβ-Cio) substituído, -C(O)OH (carboxila), -C(O)O alquila (Ci-Cβ) (alcóxi-carbonila), -C(O)O alquila (Ci-Cβ) substituído, -NRaRb, -C(O)NRaRb (carbamoíla), -O-C(O)NRaRb, alquenila Ci-Ce -NRaRb, -alquileno Ci-Cf, -C(O)NRaRb, halo, nitro ou ciano; em que cada Ra e Rb é independentemente hidrogênio, alquila (Ci-g), cicloalquila (Cs-Cs), alcóxi (Ci-e), halo-alquila (CI-Ô), cicloalquila (C3-C8) alquila (Ci-β), alcanoíla (Ci-β), hidróxi-alquila (CI-Ó), arila, aril-alquila (Ci-e), arila, aril-alquila (CI-Ó), Het, Het alquila (CI-Ó) ou alcóxi (Ci-e) carbonila; em que X2 é uma ligação ou um grupo de ligação; em que R3 é uma macromolécula; em que n é 1, 2, 3 ou 4; em que m é 1 ou 2; em que q é 1 a 1.000, 104, 105, 106 ou mais; ou um sal deste farmaceuticamente aceitável. Os grupos de macromolécula podem incluir moléculas orgânicas, compostas de carbono, oxigênio, hidrogênio, nitrogênio, enxofre, fósforo ou combinações destes, que não são nocivos aos tecidos corporais (por exemplo, eles não são tóxicos, e/ou não causam a inflamação) e podem incluir, mas não são limitados a, dendrímeros, proteínas, peptídeos, lipídeos e suas formulações (por exemplo, nanopartículas lipossômicas), com ou sem ligadores (grupos X2), e polímeros amino-modificados, tais como contas de poliestireno, assim como a-galactosilceramidas (ver Figura 1).

Os compostos da invenção podem ser preparados usando compostos tendo a fórmula (IA-1): onde X2 é um grupo que pode reagir com um grupo específico de compostos, por exemplo, aqueles descritos na Patente U.S. N°. 6.329.381 (Kurimoto et al.) ou formam uma ligação com um grupo de ligação ou reagem para formar uma ligação a uma macromolécula, e as variáveis remanescentes são como definidas acima para a fórmula (IA). Os exemplos não limitantes das macromoléculas incluem aqueles com cadeias laterais que aumentam a solubilidade, tais como, por exemplo, grupos contendo anéis de morfolino, piperidino, pirrolidino ou piperazino e outros; aminoácidos, polímeros de aminoácidos (proteínas ou peptídeos), por exemplo, dipeptídeos ou tripeptídeos, e outros; carboidratos (polissacarídeos), nucleotídeos tais como, por exemplo, PNA, RNA e DNA, e outros; polímeros de materiais orgânicos, tais como, por exemplo, polietileno glicol, poli-lactídeo e outros; lipídeos monoméricos e poliméricos; nanopartículas orgânicas insolúveis; substâncias corporais não tóxicas tais como, por exemplo, células, lipídeos, vitaminas, co-fatores, antígenos tais como, por exemplo micróbios, tais como, por exemplo, vírus, bactérias, fungos, e outros. Os antígenos podem incluir organismos inteiros inativados ou sub-componentes destes, por exemplo, células e outros.

Em uma forma de realização, um composto da invenção tem fórmula (IC): em que X é N ou CRX em que Rx é hidrogênio, halogênio, alquila substituído, alquila não substituído, heteroalquila substituído ou heteroalquila não substituído; YéSouN; os traços (-—) indicam ligações opcionais; em que: quando a ligação entre Y e carbono marcado por um asterisco é uma ligação dupla, Q2 não está presente; quando a ligação entre Q1 e o carbono marcado por um asterisco é uma ligação dupla, Q1 é O, S, NY1 ou NNY2Y3; e quando a ligação entre Q1 e o carbono marcado por um asterisco é uma ligação única, Q1 é hidrogênio, ciano, nitro, O-Y2, S-Y2, N Y1 Y2 ou NY2NY3Y4; em que Y1 é hidrogênio, alquila substituído, alquila não substituído, cicloalquila substituído, cicloalquila não substituído, heteroalquila substituído, heteroalquila não substituído, arila substituído, arila não substituído, heteroarila substituído, heteroarila não substituído, - C(=O)- alquila substituído, -C(=O)- alquila não substituído, -C(_O)O- alquila substituído, - C(=O)O- alquila não substituído, ciano, nitro, hidroxila ou O-Y2; Y2, Y3, e Y4, são cada um independentemente hidrogênio, alquila substituído, alquila não substituído, heteroalquila substituído, heteroalquila não substituído, arila substituído, arila não substituído, heteroarila substituído, heteroarila não substituído; Z é O, S ou NY5 em que Y5 é hidrogênio, alquila substituído, alquila não substituído, heteroalquila substituído, heteroalquila não substituído, arila substituído, arila não substituído, heteroarila substituído, heteroarila não substituído; Q2 e Q3 são cada um independentemente hidrogênio, alquila substituído, alquila não substituído, heteroalquila substituído, heteroalquila não substituído, arila substituído, arila não substituído, heteroarila substituído, heteroarila não substituído; X1 é -O-, -S- ou -NRC-; Rc é hidrogênio, alquila Ci-io ou alquila substituído Ci-io ou Rc e R1 quando juntos com o átomo de nitrogênio podem formar um anel heterocíclico ou um anel heterocíclico substituído; R1 é hidrogênio, alquila (Ci-Cio), alquila (Ci-Cio) substituído, arila CÓ-IO OU arila CÔ-IO substituído, anel heterocíclico C5.9 ou anel heterocíclico C5.9 substituído; cada R2 é independentemente hidrogênio, -OH, alquila (CI-CÕ), alquila (CI-CÔ) substituído, alcóxi (Ci-Ce), alcóxi (CI-CÓ) substituído, -C(O)- alquila (CI-CÔ) (alcanoíla), substituído -C(O)- alquila (Ci-Cβ), -C(O)- arila (CÔ-CIO) (aroíla), -C(O)- arila (Cβ-Cio) substituído, -C(O)OH (carboxila), -C(O)O alquila (Ci-Cβ) (alcóxi-carbonila), -C(O)O alquila (Ci-Cβ) substituído, -NRaRb, -C(O)NRaRb (carbamoíla), -O-C(O)NRaRb, -alquileno (C1-C6)- NRaRb, -alquileno CI-CÓ -C(O)NRaRb, halo, nitro ou ciano; cada Ra e Rb é independentemente hidrogênio, alquila (CI-CÓ), cicloalquila (Cs-Cs), heteroalquila (CI-CÓ), alcóxi (Ci-Cβ), haloalquila (Ci-Cβ), cicloalquila (Cs-Cg) alquila (CI-CÓ), alcanoíla (Ci-Cβ), hidróxi-alquila (Ci-Ce), arila, aril-alquila (CI-CÓ), Het, Het alquila (CI-CÓ) ou alcóxi (CI-CÓ) carbonila; em que os substituintes em que quaisquer grupos alquila, cicloalquila, heteroalquila, amino, alcóxi, alcanoíla, arila, heteroarila ou heterocíclico são um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) hidróxi, alquila Ci-6, hidróxi-alquileno Ci-6, alcóxi Ci-6, cicloalquila C3.6, alcóxi Ci-6 alquileno Ci-6, amino, ciano, halogênio, heterociclo (tal como piperidinila ou morfolinila) ou arila; X2 é uma ligação ou um grupo de ligação; k é 0,1, 2, 3 ou 4; n é 0, 1, 2, 3 ou 4; e R3 é uma macromolécula que compreende uma célula, vírus, vitamina, co-fator, peptídeo, proteína, molécula de ácido nucleico, lipídeo, conta ou partícula, tal como uma conta de poliestireno ou nanopartículas ou um dendrímero; ou um sal destes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo hidratos destes.

Em certas formas de realização, os grupos X2-R3 podem formar um ligador a uma segunda porção da fórmula (IC) de modo a formar um dímero. Por exemplo, o ligador pode ser qualquer ligador como aqui descrito, tal como um arila ou heteroarila bivalentes, arila bis-amida, heteroarila bis-amida, arila bis-hidrazida, heteroarila bis- hidrazida ou coisa parecida. Altemativamente, Q1 pode formar um ligador a uma segunda porção da fórmula (IC) de modo a formar um dímero através de uma ligação de dissulfeto. Ver por exemplo, Figura 28.

No caso onde compostos são suficientemente básicos ou ácidos para formar ácido ou sal básicos, o uso dos compostos como sais podem ser apropriados. Os exemplos de sais aceitáveis são sais de adição de ácido orgânicos formados com ácidos que formam um ânion fisiologicamente aceitável, por exemplo, tolilato, metanossulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, a-cetoglutarato, e a-glicerofosfato. Sais inorgânicos adequados também podem ser formados, incluindo sais de cloridreto, sulfato, nitrato, bicarbonato, e carbonato.

Sais aceitáveis podem ser obtidos usando procedimentos padrão bem conhecidos na técnica, por exemplo pela reação de um composto suficientemente básico tal como uma amina com um ácido adequado produzindo um ânion fisiologicamente aceitável. Metal alcalino (por exemplo, sódio, potássio ou lítio) ou sais de metal alcalino terroso (por exemplo cálcio) dos ácidos carboxílicos também podem ser fabricados.

Alquila inclui grupos alquila CMO retos ou ramificados, por exemplo, metila, etila, propila, butila, pentila, isopropila, isobutila, 1- metilpropila, 3-metilbutila, hexila, e outros.

Alquila inferior inclui grupos alquila Ci-6 retos ou ramificados, por exemplo, metila, etila, propila, 1-metiletila, butila, 1-metilpropila, 2- metilpropila, 1,1-dimetiletila, pentila, 1-metilbutila, 2-metilbutila, 3- metilbutila, 1,1-dimetilpropila, 1,2-dimetilpropila, 2,2-dimetilpropila, e outros.

O termo “alquileno” refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto reta ou ramificada bivalente (por exemplo, etileno: -CH2-CH2-). Cicloalquila C3.7 inclui grupos tais como, ciclopropila, ciclopentila, cicloexila, cicloeptila, e outros, e grupo cicloalquila C3.7 substituído por alquila, preferivelmente grupo alquila C1.6 reto ou ramificado tal como metila, etila, propila, butila ou pentila, e grupo cicloalquila C5.7 tal como, ciclopentila ou cicloexila, e outros.

Alcóxi inferior inclui grupos alcóxi Ci-6, tais como metóxi, etóxi ou propóxi, e outros. Alcanoíla inferior inclui grupos Ci-6 alcanoíla, tais como formila, acetila, propanoíla, butanoíla, pentanoíla ou hexanoíla, e outros. Aroíla C7.11, inclui grupos tais como benzoíla ou naftoíla; Alcóxi-carbonila inferior inclui grupos alcóxi-carbonila C2.7, tal como metoxicarbonila, etoxicarbonila ou propoxicarbonila, e outros. Grupo alquilamino inferior significa grupo amino substituído por grupo alquila Ci-6, tal como, metilamino, etilamino, propilamino, butilamino, e outros.

Grupo di(alquila inferior) amino significa grupo amino substituído pelo mesmo grupo alquila C1.6 ou diferente (por exemplo, dimetilamino, dietilamino, etilmetilamino).

Grupo alquilcarbamoíla inferior significa grupo carbamoíla substituído por grupo alquila Ci-6 (por exemplo, metilcarbamoíla, etilcarbamoíla, propilcarbamoíla, butilcarbamoíla).

Grupo di(alquila inferior) carbamoíla significa grupo carbamoíla substituído pelo mesmo grupo alquila C1-6 ou diferente (por exemplo, dimetilcarbamoíla, dietilcarbamoíla, etilmetilcarbamoíla). Átomo halogênio significa átomo halogênio tal como átomo de flúor, átomo de cloro, átomo de bromo ou átomo de iodo. Arila refere-se a um grupo arila CÔ-IO monocíclico ou cíclico fundido, tal como fenila, indenila ou naftila, e outros.

Heterocíclico ou heterociclo refere-se a grupos hetero-cíclicos monocíclicos saturados ou grupo heterocíclico não saturado monocíclico ou fundido contendo pelo menos um heteroátomo, por exemplo, de 0 a 3 átomo de nitrogênio (-NRd- onde Rd é H, alquila ou Y2 como aqui definido), de 0 a 1 átomo de oxigênio (-O-), e de 0 a 1 átomo de enxofre (-S-). Os exemplos não limitantes do grupo heterocíclico monocíclico saturado inclui grupo heterocíclico de 5 ou 6 membros saturado, tal como tetraidrofuranila, pirrolidinila, morfolinila, piperidila, piperazinila ou pirazolidinila. Os exemplos não limitantes do grupo heterocíclico monocíclico saturado inclui grupo heterocíclico de 5 ou 6 membros não saturado, tal como furila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tiazolila, tienila, piridila ou pirimidinila. Os exemplos não limitantes dos grupos heterocíclicos não saturados fundidos incluem grupo heterocíclico não saturado bicíclico, tal como indolila, isoindolila, quinolila, benzotizolila, cromanila, benzofuranila, e outros. Um grupo Het pode ser um grupo heterocíclico saturado ou um grupo heterocíclico não saturado, tal como um grupo heteroarila.

Rc e R1 quando juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados podem formar um anel heterocíclico. Os exemplos não limitantes do anel heterocíclico incluem anéis heterocíclicos de 5 ou 6 membros saturados, tais como 1-pirrolidinila, 4-morfolinila, 1-piperidila, 1- piperazinila ou 1-pirazolidinila, anéis heterocíclicos de 5 ou 6 membros não saturado tal como 1-imidazolila, e outros.

Os grupos alquila, arila, heterocíclico do R1 podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes, em que os substituintes são os mesmos ou diferentes, e incluem alquila inferior; cicloalquila, hidroxila; hidróxi-alquileno Ci-e, tal como hidróxi-metila, 2- hidróxi-etila ou 3-hidróxi-propila; alcóxi inferior; alcóxi Ci-6 alquila Ci-6, tal como 2-metoxietila, 2-etoxietila ou 3-metoxipropila; amino; alquilamino; dialquil amino; ciano; nitro; acila; carboxila; alcóxi-carbonila inferior; halogênio; mercapto; alquiltio Ci-6, tal como, metiltio, etiltio, propiltio ou butiltio; alquiltio Ci-6 substituído, tal como metóxi-etiltio, metiltioetiltio, hidróxi-etiltio ou cloroetiltio; arila; arila CÓ-IO monocíclico ou cíclico fundido substituído, tal como 4-hidróxi-fenila, 4-metoxifenila, 4-fluorofenila, 4- clorofenila ou 3,4-diclorofenila; heterociclo de 5 a 6 membros não saturado, tal como furila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tiazolila, tienila, piridila ou pirimidinila; e heterocíclico bicíclico não saturado, tal como indolila, isoindolila, quinolila, benzotiazolila, cromanila, benzofuranila ou ftalimino. Em certas formas de realização, um ou mais dos grupos acima podem ser expressamente excluídos como um substituinte de vários outros grupos das fórmulas.

Em algumas formas de realização, o anel de cinco membros da fórmula é um anel de tiazol, por exemplo, onde Y da fórmula IA acima é S e Q2 é ausente. Os grupos alquila, arila, heterocíclico do R2 podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes, em que os substituintes são os mesmos ou diferentes, e incluem hidroxila; alcóxi Ci-6, tais como metóxi, etóxi ou propóxi; carboxila; alcóxi C2-7 carbonila, tal como metoxicarbonila, etoxicarbonila ou propoxicarbonila) e halogênio.

Os grupos alquila, arila, heterocíclico do Rc podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes, em que os substituintes são os mesmos ou diferentes, e incluem cicloalquila C3.6; hidroxila; alcóxi Ci-β; amino; ciano; arila; arila substituído, tal como 4- hidróxi-fenila, 4-metoxifenila, 4-clorofenila ou 3,4-diclorofenila; nitro e halogênio.

O anel heterocíclico formado junto com Rc e R1 e o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes, em que os substituintes são os mesmos ou diferentes, e incluem alquila Cμe; hidróxi-alquileno Cμβ; alcóxi C1.6 alquileno C1-6; hidroxila; alcóxi Ci-β; e ciano.

Em algumas formas de realização, quando Q1 é O-Y2, Y2 não é hidrogênio. Um valor específico para X é N. Um outro valor específico para X é CH. Naturalmente, apenas uma das duas ligações indicadas pelas linhas tracejadas podem estar presentes em uma molécula de um composto da fórmula indicada. Em uma forma de realização, a ligação entre Y e o carbono marcado por um asterisco é uma ligação dupla. Em uma outra forma de realização, a ligação entre Q1 e o carbono marcado por um asterisco é uma ligação dupla. Um valor específico para Q1 é O. Um outro valor específico para Q1 é S. Um outro valor específico para Q1 é NY1, por exemplo, =NH. Um outro valor específico para Q1 é NNY2Y3.

Em uma forma de realização, a ligação entre Q1 e o carbono marcado por um asterisco é uma ligação única. Um valor específico para Q1 é hidrogênio. Um outro valor específico para Q1 é NH2. Um outro valor específico para Q1 é O-Y2. Um valor específico for Y1 é hidrogênio. Um outro valor específico for Y1 é alquila, por exemplo, alquila (Ci-Cβ), tal como metila. Um outro valor específico para Y1 é arila, tal como fenila. Um valor específico para cada um de Y2, Y3, e Y4 é hidrogênio. Um outro valor específico para cada um de Y2, Y3, e Y4 (independentemente) é alquila, por exemplo, alquila (Ci-Cβ), tal como metila. Um outro valor específico para cada um de Y2, Y3, e Y4 (independentemente) é arila, tal como fenila. Um valor específico para Z é O. Um outro valor específico para Z é S. Um outro valor específico para Z é NY5 em que Y5 é hidrogênio, metila ou fenila. Um valor específico para Q2 é hidrogênio. Um outro valor específico para Q2 é metila ou fenila. Um valor específico para Q3 é hidrogênio. Um outro valor específico para Q3 é metila ou fenila. Um valor específico para X1 é um átomo de enxofre, um átomo de oxigênio ou -NRC-. Um outro X1 específico é um átomo de enxofre. Um outro X1 específico é um átomo de oxigênio. Um outro X1 específico é -NRC-. Um outro X1 específico é -NH-. Um valor específico para Y é N. Um outro valor específico para Y é S. Um valor específico para Rc é hidrogênio, alquila Cu ou alquila Cl-4 substituído. Um valor específico para R1 e Rc quando juntos é quando eles formam um anel heterocíclico ou um anel heterocíclico substituído. Um outro valor específico para R1 e Rc quando juntos é anel de morfolino, piperidino, pirrolidino ou piperazino substituído ou não substituído Um valor específico para R1 é hidrogênio, alquila CM OU alquila Cu substituído. Um outro aspecto de R1 é 2-hidróxietila, 3-hidróxipropila, 4- hidróxibutila, 2-aminoetila, 3-aminopropila, 4-aminobutila, metóxi-metila, 2- metoxietila, 3-metoxipropila, etoximetila, 2-etoxietila, metiltio-metila, 2- metiltioetila, 3-metiltiopropila, 2-fluoroetila, 3-fluoropropila, 2,2,2- trifluoroetila, cianometila, 2-cianoetila, 3-cianopropila, metóxi- carbonilmetila, 2-metoxicarboniletila, 3-metoxicarbonilpropila, benzila, fenetila, 4-piridilmetila, cicloexilmetila, 2-tienilmetila, 4-metoxifenil-metila, 4-hidróxi-fenilmetila, 4-fluorofenilmetila ou 4-clorofenilmetila. Um outro aspecto de R1 é hidrogênio, CH3-, CH3-CH2-, CH3CH2CH2-, hidróxi-alquileno CM OU alcóxi CM alquileno CM- Um outro valor específico para R1 é hidrogênio, CH3-, CH3- CH2-, CH3-OCH2CH2- ou CH3-CH2-O-CH2CH2-. Um valor específico para R2 é hidrogênio, halogênio ou alquila CM. Um outro valor específico para R2 é hidrogênio, cloro, bromo, CH3- OU CH3-CH2-. Os substituintes específicos para substituição nos grupos alquila, arila ou heterocíclico são hidróxi, alquila CM, hidróxi-alquileno CM, alcóxi CM, alcóxi CM alquileno CM, cicloalquila C3.6, amino, ciano, halogênio ou arila. Um valor específico para X2 é uma ligação ou uma cadeia tendo até cerca de 24 átomos; em que os átomos são selecionados do grupo que consiste de carbono, nitrogênio, enxofre, oxigênio não peróxido, e fósforo. Um outro valor específico para X2 é uma ligação ou uma cadeia tendo de cerca de 4 a cerca de 12 átomos. Um outro valor específico para X2 é uma ligação ou uma cadeia tendo de cerca de 6 a cerca de 9 átomos. Um outro valor específico para X2 é Um outro valor específico para X2 é o Em certas formas de realização, o ligador ou o grupo X2 não é um ligador divulgado na Publicação do Pedido da PCT No. WO 2007/024707. Adicionalmente, em algumas formas de realização, R3 não é um 5 auxiliar divulgado na Publicação do Pedido da PCT No. WO 2007/024707. Uma macromolécula específica é um aminoácido, um carboidrato, um peptídeo, uma proteína, um antígeno, um ácido nucleico, um lipídeo, um dendrímero, uma substância corporal ou uma célula tal como um micróbio. 10 Um peptídeo específico, tem de 2 a cerca de 20 resíduos de aminoácido. Um outro peptídeo específico, tem de 10 a cerca de 20 resíduos de aminoácido. Uma macromolécula específica inclui um carboidrato. 15 Um ácido nucleico específico é DNA, RNA ou PNA. Uma macromolécula específica é uma célula, lipídeo, vitamina, lipídeo ou co-fator. Um antígeno específico é um micróbio. Um micróbio específico é um vírus, bactérias ou fungos. Um outro micróbio específico é um vírus ou uma bactéria.

As bactérias específicas são Bacillus anthraces, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Salmonella ou Staphylococcus. As Salmonelas específicas são S. typhimurium ou S. enteritidis. Estafilococos específicos incluem S. aureus. Vírus específicos são vírus de RNA, incluindo RSV e o vírus da influenza, um produto do vírus de RNA ou um vírus de DNA, incluindo vírus do herpes. Um vírus específico de DNA é o vírus da hepatite B.

Em outras formas de realização, a macromolécula não é um aminoácido, um carboidrato, um peptídeo, um antígeno tal como um micróbio, por exemplo, um vírus (por exemplo, vírus de RNA, por exemplo, SIV, hepatite C vírus ou um coronavirus, um produto do vírus de RNA ou um vírus de DNA, tal como vírus da Hepatite B, fungos ou bactérias tais como Bacillus anthracis (antrax), Listeria monocytogenes, Francisella tularensis ou Salmonella (por exemplo, typhimurium ou enteritidis), um ácido nucleico tal como DNA, RNA, PNA ou uma substância corporal tal como uma célula ou lipídeo. Um valor específico para k é O. Um outro valor específico para k é 1. Um outro valor específico para k é 2. Em algumas formas de realização, k não é 1.

Os compostos da invenção têm a fórmula geral em que IA é como aqui divulgado; L é ausente ou é um grupo de ligação; e cada grupo A1 independentemente representa uma macromolécula.

A invenção inclui composições de um composto da invenção opcionalmente em combinação com outros agentes ativos, por exemplo, ribavirina, mizoribina, e micofenolato de mofetila. Os outros exemplos não limitantes são conhecidos e são divulgado no Pedido de Patente Publicado U.S. No. 20050004144.

Processos para preparar compostos da invenção para preparar intermediários úteis para preparar compostos da invenção são fornecidos como outras formas de realização da invenção. Intermediários útil para preparar os compostos da invenção também são fornecidos como outras formas de realização da invenção.

Por exemplo, os compostos (conjugados) da invenção pode ser preparado usando métodos sintéticos padrão conhecidos na técnica, uma síntese geral de éster e aldeído é ilustrada abaixo. UC-1 VI50 foi sintetizado em sete etapas de 2,6-dicloropurina. O grupo aldeído livre na porção benzila de UC-1V150 permitiu que ligássemos o agonista a muitas entidades químicas auxiliares diferentes, incluindo proteínas, oligonucleotídeos, moléculas aromáticas, lipídeos, vírus, e células, através de um ligador molécula que contém um hidrazina ou grupo amino.

Química de UC-1 VI50. A síntese de UC-1V150 e a preparação dos compostos indicados de 2 a 8 foi como segue. O Composto 2: 5 4-(2,6-dicloropurin-9-ilmetil)benzonitrila. 2,6-dicloro-9H-purina (1,16 mmol) foi dissolvido em DMF (50 ml) com carbonato de potássio (50 mmol) adicionado e a mistura foi agitada na temperatura ambiente por 16 horas depois de adicionar de a-Bromo-p-tolunitrila (22 mmol). depois da filtração para remover os sais inorgânicos insolúveis, o filtrado foi vertido em água 10 (1500 ml) e extraído com acetato de etila (2 x 400 ml), secado em sulfato de magnésio e evaporado para produzir um resíduo que foi submetido a cromatografia cintilante em gel de sílica usando acetato de etila/acetona/hexanos 1: 2: 10. Rendimento 3,33 g (69 %). UV, RMN e MS foram compatíveis com designações de estrutura. Composto 3: 4-(6-amino-2- cloropurin-9-ilmetilbenzonitrila. O Composto 2 (1,9 g) foi colocado em um vaso de reação de aço e amónia metálica ( 80 ml, 7 N) foi adicionada. O vaso selado foi aquecido a 60° C por 12 horas, esfriado em gelo e o produto sólido separado por filtração. Rendimento 1,09 g. UV, RMN e MS compatíveis com estrutura designada. O Composto 4: 4-[6-amino-2-(2-metoxietóxi)purin-9- ilmetil]benzonitrila. O sal de sódio de 2-metoxietanol foi primeiro gerado dissolvendo-se metal de sódio (81 mg) em 2-metoxietanol (30 ml) com aquecimento e depois o composto 3 (1,0 g) dissolvido em metoxietanol foi adicionado (300 ml, com aquecimento). A mistura de reação foi aquecida por 8 horas a 115° C de temperatura de banho, concentrada a vácuo até próximo a secura e particionado entre acetato de etila e água. A cromatografia cintilante em gel de sílica da camada orgânica usando 5 % de metanol em diclorometano dá 763 mg do produto. RMN foi compatível com designações de estrutura. O Composto 5: 4-[6-amino-8-bromo-2-(2-metoxietóxi)purin-9- ilmetil]benzonitrila. O Composto 4 (700 mg) foi dissolvido em diclorometano (400 ml) e bromo (7 ml) foi adicionado às gotas. A mistura foi agitada durante a noite na temperatura ambiente e extraída primeiro com solução aquosa de tiossulfato de sódio (2 litros de 0,1 M), depois com bicarbonato de sódio aquoso (500 ml, saturado). O resíduo da camada orgânica foi submetido a cromatografia em gel de sílica usando 3 % de metanol em diclorometano para produzir 460 mg do produto de bromo. RMN, W e MS compatíveis com designações de estrutura. O Composto 6: 4-[6-amino-8-metóxi-2-(2- metoxietóxi)purin-9-ilmetil]benzonitrila. Metóxido de sódio foi gerado pela reação do metal de sódio (81 mg) em metanol seco (30 ml) e combinado com uma solução do composto 5 (700 mg) dissolvido em dimetoxietano seco e a temperatura elevada a 100° C. Depois da reação durante a noite, a mistura foi concentrada a vácuo e o resíduo foi submetido a cromatografia em sílica usando 5 % de metanol em diclorometano. Rendimento 120 mg. RMN foi compatível com designações de estrutura. O Composto 7: 4-[6-amino-8- metóxi-2-(2-metoxietóxi)purin-9-ilmetil]benzaldeído. O Composto 6 (100 mg) foi dissolvido em THF seco (3 ml) e esfriado a 0o C sob argônio. O agente de redução, N,N’-(dimetiletilenodiamino)alumino hidreto de lítio, usado para converter a nitrila para função aldeído. Uma solução 0,5 M em THF seco foi preparada e 0,72 ml de tal foi adicionada ao frasco de reação. A mistura foi agitada de 0 a 5o C por 1 hora, extinta pela adição de HC1 3 M e extraída com acetato de etila seguida por diclorometano e depois concentrada a vácuo para produzir 85 mg. RMN foi compatível com designações de estrutura. O Composto 8: 4-[6-amino-8-hidróxi-2-(2-metoxietóxi)purin-9- ilmetil]benzaldeído (UC-1V150). O Composto 7 (800 mg) foi combinado com iodeto de sódio (504 mg) e acetonitrila (40 ml) e clorotrimetilsilana (0,5 ml) foi lentamente adicionada. A mistura foi aquecida a 70° C por 3,5 horas, esfriada e lavada. O produto sólido foi lavado com água, depois éter, para produzir 406 mg. RMN, UV e MS compatíveis com designações de estrutura. Os exemplos adicionais para preparar os compostos são aqui incluídos. Como descrito nos exemplos aqui, um agonista de TLR7 solúvel capaz de ligação covalente para aminas primárias sob condições fisiológicas foi preparado. A atividade in vitro de vários compostos e complexos antígeno-adjuvante foi depois testada utilizando células dendríticas (DC) derivadas da medula óssea de murino ou derivadas de célula mononuclear de sangue periférico para caracterizar a maturação de DC e a secreção de citocina (por exemplo, IL-12, IL-6, TGF-beta e IFN-gama). Camundongos C57/B1 singênicos imunocompetentes foram profilaticamente vacinados com complexos antígeno-agonista de TLR7 intradérmicos e inoculados com células de tumor de melanoma B16 que expressam o transgene cOVA.

A concentração eficaz (EC50) para cada composto no geral seguiram uma distribuição na forma de sino com doses mais altas sendo inibitórias. A estimulação máxima ocorreu entre 10 e 1000 nM. As moléculas adjuvantes covalentemente ligadas ao agonista de TLR retiveram a atividade mas no geral com valores EC50 inferiores. A ligação de UC-1V199 à ovalbumina de galinha quase dobrou a sobrevivência média de 22 para 35 dias a seguir da inoculação de tumor subcutânea comparada com a ovalbumina de galinha sozinha.

Assim, a ligação covalente de um agonista de TLR7 a um antígeno de tumor estimulou a produção de citocina DC protegeu os camundongos da inoculação do tumor. O uso de um agonista de TLR7 adequado que retém as suas propriedades estimuladoras imunes sob condições fisiológicas a seguir da ligação a uma macromolécula, tal como um antígeno, pode ser útil no desenvolvimento de uma vacina in situ na terapia de tumor sólido.

Várias purinas, piridinas e imidazoquinolinas, com pesos moleculares de 200 a 400 kD, mostraram ativar TLR7 e os compostos que foram ligandos de TLR7 específicos foram de 100 a 1000 vezes mais potentes do que imiquimod em uma base molar (Lee et al., infra). Porque estes agonistas de TLR são estruturalmente muito similares aos componentes normais de nucleotídeos, eles são muito improváveis de induzir uma reação imune haptênica depois da administração repetida.

Um farmacóforo de TLR7 com base em adenina pode necessitar ser covalentemente amarrado a um “grupo auxiliar” (macromolécula) para promover a captação dentro de endossomas de células dendríticas, onde TLR7 é expressado e para reter o agonista de TLR. Consequentemente, 0 agonista de TLR7 UC-1V150 foi preparado e ligado por intermédio de sua função aldeído e um ligador para os grupos amino livres em várias proteínas, incluindo albumina de camundongo (MSA) (Figura 3). Os conjugados foram 100 vezes mais potentes in vitro e in vivo do que o análogo de adenina não ligado. Além disso, a administração intrapulmonar do conjugado de albumina (UC-1V150/MSA) aos camundongos induziu a produção de citocina local no fluido de lavagem alveolar brônquica (BALF) sem a liberação de citocina sistêmica. Em contraste marcante, a liberação dos medicamentos não amarrados às vias aéreas rapidamente deflagraram a liberação da citocina na corrente sanguínea.

Em uma forma de realização, um agonista de TLR7 maximiza a produção de citocinas que estimulam Thl (interferons e IL-12) comparados com o TNFα e IL-1. A TLR7 está localizada nas superfícies internas das vesículas endossômicas que são constantemente sintetizadas e passam pela maturação em DC. Por exemplo, para prevenir a asma, um agonista estável e potente de TLR que trafica para os endossomas iniciais de células dendríticas e induz primariamente interferons Tipo I é preferido. Um agonista de TLR foi covalentemente ligado a um grupo auxiliar de fosfolipídeo com a expectativa de que o conjugado, UC-1V199/L (Figura 6), seria rápida e estavelmente inserido nas membranas lipídicas das células, incluindo as vesículas endossômicas. Acentuadamente, tão pouco quanto 30 picomolares de UC- 1V199/L induziram a síntese de citocina na medula óssea derivada de células mononucleares de camundongo. As Figuras 7 e 8 mostram os dados para a síntese de IL-12.

Os ligandos de TLR7 que são purinas ou imidazoquilolinas têm uma propriedade peculiar, isto é, uma curva de dose-resposta bifásica. Em altas concentrações, o medicamento falha em induzir a síntese de citocina. O efeito bifásico é observado em células dendríticas altamente purificadas e parece ser autônomo em célula. Entretanto, a potência acentuável de UC- 1V199/L permitiu a re-exame do fenômeno, usando concentrações de medicamento farmacologicamente aceitáveis (Figura 9). A produção de citocina máxima foi observada com 10 nM de UC-1V199/L enquanto que concentrações mais altas induziram progressivamente menos liberação de IL- 12 (e TNF).

As concentrações altas e prolongadas de agonistas da TLR7 são conhecidas induzir reffatariedade à re-estimulação da TLR que pode durar 24 horas ou mais. Um tal sistema complexo de regulagem é aparentemente parte de um mecanismo seguro de falhas que previne as células e tecidos de auto-destruição durante as respostas inflamatórias. Assim, foi de interesse determinar se as concentrações de UC-1V199/L que falharam em induzir a síntese de citocina significante não obstante induziria “tolerância a TLR.” De fato, quando as células mononucleares derivadas da medula óssea foram expostas a uma concentração não ativadora de UC-1V199/L (1 μM) e depois re-estimuladas 24 horas mais tarde com o mesmo composto, com UC-1V150 ou com pam3Cys (P3C, um ativador de TLR2), elas demonstraram uma resposta de citocina acentuadamente diminuída. Ao contrário, a células tratadas com UC-1V199/L retiveram responsividade aos ligandos de TLR3 e TLR4, que vão através do caminho de TRIF (resultados não mostrados). Preliminarmente os experimentos indicaram que a não responsividade também foi induzida in vivo. Assim, a administração diária de UC-1V1991L e medicamentos relacionados, pode suprimir a inflamação induzida pelos estímulos dependentes de MyD88, sem os efeitos colaterais sistêmicos associados com a ativação de TLR.

Em uma forma de realização, os conjugados da invenção podem ser úteis para prevenir, inibir ou tratar a asma. A asma é caracterizada pelos episódios de constrição das vias aéreas reversível intermitentes, hiperplasia do músculo liso brônquico e inflamação crônica. A doença atópica predispõe a asma mas até metade dos pacientes afetados não são atópicos. Outros fatores de risco ambiental para asma incluem fumaça de tabaco e poluentes do ar. Além disso, surtos de doença em pacientes asmáticos afetados podem ser deflagrados não apenas pelos alérgenos mas também pelos irritantes de vias aéreas, mudanças de temperatura e infecções.

O desenvolvimento inicial de um resposta alérgica é parcialmente regulado por um equilíbrio entre linfócitos de Thl e Th2 e suas citocinas respectivas e especialmente os interferons e IL-4. A vacinação de animais com um alérgeno em conjunção com um agonista de TLR7 ou TLR9 preferivelmente expande células de memória Thl específicas de alérgeno. Consequentemente, a imunização subsequente com antígeno em conjunção com um adjuvante influenciado por Th2 não evoca facilmente um resposta IgE. Os camundongos que foram vacinados com antígeno e agonistas de TLR7 ou TLR9 foram resistentes a asma experimental.

Um método diferente é necessário para o tratamento da asma com agonistas de TLR versus a prevenção da asma. Nos pacientes afetados, os tecidos das vias aéreas pulmonares já são infiltrados com um uma população diversa de células inflamatórias, incluindo muitos subconjuntos de linfócitos, macrófagos, células dendríticas, mastóides e eosinófilos e neutrófilos. Nesta situação, os agonistas de TLR podem potencialmente exacerbar doença, pelo aumento da liberação de mediadores inflamatórios tais como TNF-alfa e IL-1. De fato, a capacidade de vários agentes microbianos que ativam TLRs pode explicar por que eles deflagram ataques asmáticos .

Um agonista de TLR para a prevenção da asma preferivelmente é limitado aos pulmões mas também maximiza a produção de citocinas que estimula Thl (interferons e IL-12), comparada a TNF-alfa e IL- 1. Tanto TLR7 quanto TLR9 estão localizados nas superfícies internas das vesículas endossômicas que estão constantemente sintetizadas e sofrem mutação em células dendríticas. Oligonucleotídeos que ativam TLR9 que são oligonucleotídeos fosfodiéster agregados permanecem por mais tempo nas vesículas endossômicas iniciais e por esta razão induz mais tipos de interferons I do que os oligonucleotídeos de fosforotioato não agregados, que vão para as vesículas maduras. Os resultados implicam que a organização espacial do agonista de TLR controla o seu tráfico e o seu padrão de síntese de citocina induzida. Para prevenir a asma, um agonista de TLR estável, potente e molecularmente caracterizado que trafica aos endossomas iniciais de células dendríticas e induz primariamente interferons Tipo I é preferido. Para estudar o efeito dos conjugados da invenção sobre a asma alérgica, a inflamação das vias aéreas é induzida pela sensibilização de camundongos por intermédio da injeção subcutânea de 20 μg de ovalbumina absorvida com 500 μg de alúmen por camundongo em solução salina no dia 0 e dia 7. Nos dias 16 e 21, os camundongos são inoculados i.n. com 5 μg de ovalbumina por camundongo. Os conjugados são administrados i.n., p.o. ou i.v. em pontos de tempo diferentes antes da primeira inoculação de ovalbumina no dia 16. Vinte e quatro horas depois da última inoculação (dia 22), a responsividade das vias aéreas é medida, os camundongos são sacrificados e as células BALF, amostras de pulmão e baço coletadas. Os camundongos ingênuos e os camundongos sensibilizados com ovalbumina/alúmen servem como controles. O número total de células em BALF é contado e tingido com Wright-Giemsa para determinar os números de eosinófilos, linfócitos, neutrófilos e mastóides. Os níveis de citocina no BALF são determinados pelos ensaios Luminex. A responsividade das vias aéreas à metacolina é avaliada 24 horas depois da última inoculação usando uma câmara única, pletismógrafo de corpo inteiro. O Penh, um valor adimensional que se correlaciona bem com a resistência pulmonar medida pelas duas câmaras de pletismografia convencional em camundongos ventilados, é usado para monitorar a responsividade das vias aéreas.

Os compostos desta invenção são administrados em uma quantidade terapeuticamente eficaz a um paciente em necessidade de tratamento. A administração das composições da invenção pode ser por intermédio de qualquer via adequada de administração, de modo particular parenteralmente, por exemplo, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraestemal, intracraniana, intramuscular ou subcutaneamente. Tal administração pode ser como uma injeção de bolo única, injeções múltiplas ou como uma infusão de duração curta ou longa. Dispositivos implantáveis (por exemplo, bombas de infusão implantáveis) também podem ser utilizados para liberação parenteral periódica com o tempo de dosagens equivalentes ou variáveis da formulação particular. Para tal administração parenteral, os compostos são preferivelmente formulados como uma solução estéril em água ou um outro solvente adequado ou mistura dos solventes. A solução pode conter outras substâncias tais como sais, açúcares (particularmente glicose ou manitol), para fabricar a solução isotônica com sangue, agentes de tamponização tais como ácidos acético, cítrico e/ou fosfórico e seus sais de sódio e conservantes.

Os compostos da invenção podem ser formulados como composições farmacêuticas e administrados a um hospedeiro mamífero, tal como um paciente humano em uma variedade de formas adaptadas para a via de administração escolhida, isto é, oral ou parenteralmente, pelas vias intravenosa, intramuscular, tópica ou subcutânea.

Assim, os compostos presentes podem ser sistemicamente administrados, por exemplo, oralmente em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável tal como um diluente inerte ou um carreador comestível assimilável. Estes podem ser incluídos em cápsulas de gelatina de casca dura ou mole, podem se comprimidos em tabletes ou podem ser incorporados diretamente com o alimento da dieta do paciente. Para administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser combinado com um ou mais excipientes e usado na forma de tabletes ingeríveis, tabletes bucais, comprimidos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas e outros. Tais composições e preparações devem conter pelo menos 0,1 % do composto ativo. A porcentagem das composições e preparações, naturalmente, podem ser variadas e convenientemente podem ser entre cerca de 2 a cerca de 60 % do peso de um dada forma de dosagem única. A quantidade do composto ativo em tais composições terapeuticamente úteis é tal que um nível de dosagem eficaz será obtido.

Os tabletes, pastilhas, pílulas, cápsulas e outros também podem conter os seguintes: aglutinantes tais como goma tragacanto, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes tais como fosfato dicálcio; um agente desintegrante tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e outros; um lubrificante tal como estearato de magnésio; e um agente adoçante tal como sacarose, frutose, lactose ou aspartame ou um agente flavorizante tal como flavorizante de hortelã, óleo de gaultéria ou cereja pode ser adicionado. Quando a forma de dosagem única é um cápsula, a mesma pode conter, além disso materiais tipo acima, um carreador líquido, tal como um óleo vegetal ou um polietileno glicol. Vários outros materiais podem ser apresentados como revestimentos ou para de outro modo modificar a forma física da forma de dosagem única sólida. Por exemplo, tabletes, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com gelatina, cera, goma laca ou açúcar e outros. Um xarope ou elixir podem conter o composto ativo, sacarose ou frutose como um agente adoçante, metil e propilparabenos como conservantes, um corante e flavorizante tal como sabor de cereja ou laranja. Naturalmente, qualquer material usado na preparação de qualquer forma de dosagem deve ser farmaceuticamente aceitável e substancialmente não tóxico nas quantidades utilizadas. Além disso, o composto ativo pode ser incorporado em preparações e dispositivos de liberação prolongada.

O composto ativo também pode ser administrado intravenosa ou intraperitonealmente pela infusão ou injeção. As soluções do composto ativo ou seus sais podem ser preparadas em água, opcionalmente misturadas com um tensoativo não tóxico. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, triacetina e misturas destes e em óleos. Sob condições comuns de armazenagem e uso, estas preparações contém um conservante para prevenir o crescimento dos microorganismos.

As formas de dosagem farmacêuticas adequadas para injeção ou infusão podem incluir soluções ou dispersões aquosas estéreis ou pós estéreis que compreendem o ingrediente ativo que são adaptados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis ou infusíveis estéreis, opcionalmente encapsulado em lipossomas. Em todo caso, a forma de dosagem final deve ser estéril, fluida e estável sob as condições de fabricação e armazenagem. O carreador ou veículo líquidos podem ser um solvente ou meio de dispersão líquido que compreende, por exemplo, água, etanol, um poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicóis líquidos e outros), óleos vegetais, ésteres glicerílicos não tóxicos e misturas adequadas destes. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela formação de lipossomas, pela manutenção do tamanho de partícula requerida no case da dispersão ou pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação dos microorganismos pode ser realizada pelos vários agentes antifúngicos e antibacterianos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerossal e outros. Em muitos casos, será preferível agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, tampões ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pelo uso na composições de agentes de absorção demorada, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções estéreis injetáveis são preparadas pela incorporação do composto ativo na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes acima enumerados, como requerido, seguido pela esterilização por filtração. No caso dos pós estéreis para a preparação das soluções estéreis injetáveis, os métodos preferidos de preparação são técnicas secagem a vácuo e a secagem por congelamento, que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer um ingrediente adicional desejado presente nas soluções previamente filtradas estéreis.

Para administração tópica, os compostos presentes podem ser aplicados na forma pura, isto é, quando eles são líquidos. Entretanto, será no geral desejável administrá-los à pele como composições ou formulações em combinação com um carreador dermatologicamente aceitável, que pode ser um sólido ou um líquido.

Os carreadores sólidos incluem sólidos finamente divididos tais como talco, argila, celulose microcristalina, sílica, alumina e outros. Os carreadores líquidos úteis incluem água, álcoois ou glicóis ou misturas de água-álcool/glicol em que os compostos presentes podem ser dissolvidos ou dispersos em níveis eficazes, opcionalmente com a ajuda dos tensoativos não tóxicos. Adjuvantes tais como fragrâncias e agentes antimicrobianos adicionais podem ser adicionados para utilizar as propriedades para um dado uso. As composições líquidas resultantes podem ser aplicadas a partir de almofadas absorventes, usadas para impregnar as bandagens e outros curativos ou pulverizados na área afetada usando pulverizadores tipo bomba ou aerossol.

Espessadores tais como polímeros sintéticos, ácidos graxos, sais de ácido graxo e ésteres, álcoois graxos, celuloses modificadas ou materiais minerais modificados também podem ser utilizados com carreadores líquidos para formar pastas espalháveis, géis, unguentos, sabões e outros, para aplicação diretamente à pele do usuário.

Além disso em uma forma de realização, a invenção diz respeito a várias formulações de dosagem dos conjugados para liberação por inalação. Por exemplo, formulações podem ser designadas para o uso em aerossol em dispositivos tais como inaladores de dose medida, inaladores de pó seco e nebulizadores.

Os exemplos de composições dermatológicas úteis que pode ser usados para liberar os compostos da invenção à pele são conhecidos na técnica; por exemplo, ver Jacquet et al. (Patente U.S. No. 4.608.392), Geria (Patente U.S. No. 4.992.478), Smith et al. (Patente U.S. No. 4.559.157) e Wortzman (Patente U.S. No. 4.820.508).

As dosagens dos compostos úteis da invenção podem ser determinadas pela comparação de sua atividade in vitro e atividade in vivo in em modelos de animal. Métodos para a extrapolação de dosagens eficazes em camundongos e outros animais, para os seres humanos são conhecidos na técnica; por exemplo, ver Patente U.S. No. 4.938.949. A capacidade de um composto da invenção para atuar como um agonista de TLR pode ser determinado usando modelos farmacológicos que são conhecidos na técnica, incluindo os procedimentos divulgados por Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 6646 (2003).

No geral, a concentração do(s) composto(s) da invenção em uma composição líquida, tal como uma loção, será de cerca de 0,1 a 25 % em peso, preferivelmente de cerca de 0,5 a 10 % em peso. A concentração em uma composição semi-sólida ou sólida tal como um gel ou um pó será de cerca de 0,1 a 5 % em peso, preferivelmente cerca de 0,5 a 2,5 % em peso.

O ingrediente ativo pode ser administrado para se obter concentrações plasmáticas de pico do composto ativo de cerca de 0,5 a cerca de 75 μM, preferivelmente, de cerca de 1 a 50 μM, o mais preferivelmente, de cerca de 2 a cerca de 30 μM. Isto pode ser alcançado, por exemplo, pela injeção intravenosa de uma solução de 0,05 a 5 % do ingrediente ativo, opcionalmente em solução salina ou oralmente administrado como um bolo contendo de cerca de 1 a 100 mg do ingrediente ativo. Os níveis sanguíneos desejáveis podem ser mantidos pela infusão contínua para fornecer de cerca de 0,01 a 5,0 mg/kg/h ou pelas infusões intermitentes de contendo cerca de 0,4 a 15 mg/kg do(s) ingrediente(s) ativo(s).

A quantidade do composto ou um sal ativo ou derivado deste, requerida para o uso no tratamento variará não apenas com o sal particular selecionado mas também com a via de administração, a natureza da condição sendo tratada e a idade e a condição do paciente e por fim estará no critério do médico ou clínico atendente. No geral, entretanto, uma dose adequada estará na faixa de cerca de 0,5 a cerca de 100 mg/kg, por exemplo, de cerca de 10 a cerca de 75 mg/kg do peso corporal por dia, tal como de 3 a cerca de 50 mg por quilograma do peso corporal do recipiente por dia, preferivelmente na faixa de 6 a 90 mg/kg/dia, o mais preferivelmente na faixa de 15 a 60 mg/kg/dia.

O composto é convenientemente administrado na forma de dosagem única; por exemplo, contendo de 5 a 1000 mg, convenientemente de 10 a 750 mg, o mais convenientemente, de 50 a 500 mg do ingrediente ativo por forma de dosagem unitária.

A dose desejada convenientemente pode ser apresentada em uma dose única ou como doses divididas administradas em intervalos apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais sub-doses por dia. A sub-dose por si só pode ser ainda dividida, por exemplo, em várias administrações separadas livremente espessadas; tais como inalações múltiplas a partir de um insuflador ou pela aplicação de uma pluralidade de gotas nos olhos. A dose e talvez a frequência de dose, também variará de acordo com a idade, do peso corporal, condição e a resposta do paciente individual. No geral, a faixa de dose diária total para um composto ou compostos da fórmula (I), para as condições aqui descritas, podem ser de cerca de 50 mg a cerca de 5000 mg, em doses únicas ou divididas. Preferivelmente, uma faixa de dose diária deve ser de cerca de 100 mg a cerca de 4000 mg, o mais preferivelmente de cerca de 1000 a 3000 mg, em doses únicas ou divididas, por exemplo, 750 mg a cada 6 horas do composto oralmente administrado. Isto pode alcançar níveis de plasma de cerca de 500 a 750 μM, que podem ser eficazes para matar células cancerosas. No controle do paciente, a terapia deve ser iniciada em uma dose mais baixa e aumentada dependendo da resposta global do paciente.

Como acima descrito, as composições que contém um composto da invenção, são úteis no tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio, por exemplo, em seres humanos ou outros mamíferos (por exemplo, animais bovino, canino, equino, felino, ovino e porcino) e talvez também outros animais. Dependendo do composto particular, a composição, por exemplo, será útil para tratar câncer, uma infecção, realçar a imunidade adaptativa (por exemplo, produção de anticorpo, ativação da célula T etc.), como vacinas e /ou estimulação do sistema nervoso central. A invenção será ainda descrita pelos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplo I

Processos para preparar compostos da fórmula (I) são fornecidos como outras formas de realização da invenção e são ilustrados pelos seguintes procedimentos em que os significados dos radicais genéricos são como dados acima a menos que de outro modo qualificados.

Química Geral. Reagentes e solventes foram adquiridos da Aldrich, Milwaukee, WI. Pontos de fusão não corrigidos foram determinados em um aparelho de ponto de fusão capilar Laboratory Device Mel-Temp II. Os espectros de ressonância magnética nuclear de próton foram registrados espectrofotômetro de RMN Varian Unity 500 a 499,8 MHz ou em um espectrofotômetro de RMN Varian Mercury a 400,06 MHz. As mudanças químicas foram relatadas em ppm na escala de referência indicada.

Os espectros de massa de laço iônico positivo e negativo foram realizados pelo Department of Chemistry UCSD, San Diego, CA. A análise elementar foram realizadas pela NuMega Resonance Labs, San Diego, CA. A cromatografia de coluna foi conduzida em gel de sílica E Merck (malhas 230 a 400) com o sistema de solvente indicado. A cromatografia de camada fina analítica (TLC) foi conduzida em placas de gel de sílica 60 F-254 (EM Reagents).

Preparação de 4-(2,6-dicloropurin-9-ihnetiI)benzonitrila. 2,6- dicloro-9H-purina (16 mmol) é dissolvido em DMF (50 ml) e carbonato de potássio (50 mmol) é adicionado. a-Bromo-p-tolunitrila (22 mmol) é depois adicionada e a mistura é agitada na temperatura ambiente por 16 horas. Depois da filtração para remover os sais inorgânicos insolúveis, o filtrado é vertido em água (1500 ml) e extraído com acetato de etila (2 x 400 ml), secado em sulfato de magnésio e evaporado para produzir um resíduo que é submetido a cromatografia cintilante em gel de sílica usando acetato de etila/acetona/hexanos 1:2:10. Rendimento 3,33 g (69 %). UV, RMN e MS compatíveis com designações de estrutura.

Preparação de 4-(6-amino-2-cloropurin-9-ilmetilbenzo-nitrila. O produto acima (1,9 g) é colocado em um vaso de reação de aço e amónia metálica (80 ml, 7 N) é adicionada. O vaso selado é aquecido a 60° C por 12 horas, esfriado em gelo e o produto sólido separado por filtração. Rendimento 1,09 g. UV, RMN e MS compatíveis com estrutura designada.

Preparação de 4-r6-amino-2-(2-metoxietóxi)purin-9-ihnetil1 benzonitrila. Sal de sódio de 2-metoxietanol é gerado dissolvendo-se metal de sódio (81 mg) em 2-metoxietanol (30 ml) com aquecimento. A esta solução é adicionado o produto do exemplo 2 (1,0 g) dissolvido em metoxietanol (300 ml, com aquecimento). A mistura de reação é aquecida por 8 horas a 115° C de temperatura de banho, concentrada a vácuo até próximo a secura e particionada entre acetato de etila e água. A cromatografia cintilante em gel de sílica da camada orgânica usando 5 % de metanol em diclorometano dá 763 mg do produto. RMN é compatível com as designações de estrutura.

Preparação de 4-r6-amino-8-bromo-2-(2-metoxietóxi)purin-9- ilmetillbenzonitrila. O produto imediatamente acima (700 mg) é dissolvido em diclorometano (400 ml) e bromo (7 ml) é adicionado às gotas. A mistura é agitada durante a noite na temperatura ambiente e extraída com solução aquoso de tiossulfato de sódio (2 litros de 0,1 M) e depois com bicarbonato de sódio aquoso (500 ml, saturado). O resíduo da camada orgânica é submetido a cromatografia em gel de sílica usando 3 % de metanol em diclorometano) para produzir 460 mg do produto de bromo. RMN, UV e MS são compatível com designações de estrutura.

Preparação de 4-r6-amino-8-metóxi-2-(2-metoxietóxi)purin-9- ilmetillbenzonitrila. Metóxido de sódio é gerado pela reação do metal de sódio (81 mg) em metanol seco (30 ml). O produto imediatamente acima (700 mg) é dissolvido em dimetoxietano seco e a temperatura elevada a 100° C. Depois da reação durante a noite, a mistura é concentrada a vácuo e o resíduo é submetido a cromatografia em sílica usando 5 % de metanol em diclorometano. Rendimento 120 mg. RMN é compatível com as designações de estrutura.

Preparação de N,N’-(dimetiletílenodíamino)alumino hidreto de lítio. Este agente de redução usado para converter a nitrila para função aldeído é preparado essencialmente como descrito na Bull. Korean Chem. Soc., 23: 1697 (2002). Uma solução 0,5 M em THF seco é preparado.

Preparação de 4-r6-amino-8-metóxi-2-(2-metoxietóxi)purin-9- ilmetillbenzaldeído. 4-[6-amino-8-metóxi-2-(2-metoxietóxi)purin-9- ilmetil]benzonitrila (100 mg) é dissolvida em THF seco (3 ml) e esfriada a 0° C sob argônio. O reagente de hidreto de alumínio gerado acima (0,72 ml) é adicionado ao frasco de reação e a mistura é agitada de 0 a 5o C por 1 hora e depois extinta pela adição de HC1 3 M. A mistura é depois extraída com acetato de etila e depois diclorometano e concentrado a vácuo para produzir 85 mg. RMN é compatível com as designações de estrutura.

Preparação de 4-r6-amino-8-hidróxi-2-(2-metoxietóxi)-purin- 9-ilmetillbenzaldeído (UC-1VI50). O produto imediatamente acima (800 mg) é combinado com iodeto de sódio (504 mg) e acetonitrila (40 ml) e depois clorotrimetilsilano (0,5 ml) é lentamente adicionado. A mistura é aquecida a 70° C por 3,5 horas, esfriada e lavada. O produto sólido é lavado com água, depois éter para produzir 406 mg. RMN, UV, MS são compatíveis com as designações de estrutura. Este material adequado para as reações de conjugação entre ligadores e macromoléculas.

Preparação de 4-r6-amíno-8-metóxí-2-(2-metoxietóxi)purin-9- ilmetillbenzoato de metila. O procedimento é como descrito pelo Jayachitra et al., Synth. Comm., 33: 3461 (2003)). 4-[6-amino-8-metóxi-2-(2- metoxietóxi)purin-9-ilmetil]benzonitrila (1 mmol) é dissolvido em metanol seco (5 ml) e eterato de BF3 recém destilado (4 mmol) é adicionado à solução. A mistura resultante é refluxada sob argônio por 20 horas. O solvente é removido a vácuo e resíduo é absorvido em diclorometano (10 ml) e extraído com bicarbonato de sódio aquoso diluído (2 x 10 ml) e a camada orgânica é secada em sulfato de magnésio. Depois da evaporação o produto é purificado pela cromatografia de coluna em gel de sílica usando 5 % de metanol em diclorometano para produzir 0,8 mmol.

Preparação de ácido 4-r6-amino-8-hidróxi-2-(2-metóxi- etóxi)purin-9-ilmetíl]benzóíco. 4-[6-amino-8-metóxi-2-(2-metoxietóxi)-purin- 9-ilmetil]benzoato (100 mg) é combinado com iodeto de sódio (63 mg) e acetonitrila (10 ml) e depois clorotrimetilsilano (120 ml) é lentamente adicionado. A mistura é aquecida a 70° C por 6 horas, esfriada e lavada. O produto sólido é lavado com água, depois éter para produzir 51 mg.

Preparação de 2,5-dioxopirrolidin-l-ila 4-r6-amino-8-hidróxi- 2-(2-metoxietóxi)purín-9-ilmetillbenzoato. 4- [6-amino-8-metóxi-2-(2- metoxietóxi)purin-9-ilmetil]benzoato (2 mmol) é dissolvido em diclorometano ou dioxano (10 ml) e EDC (2 mmol) é adicionado. A esta solução é adicionada N-hidróxi-succinimida (2 mmol) e a mistura resultante é agitada na temperatura ambiente por 1 hora. A mistura é absorvida até a secura a vácuo e o produto bruto é purificado pela cromatografia de gel de sílica para produzir 2 mmol do produto que é adequado para as reações de conjugação envolvendo aminas primárias.

Exemplo II

UC-1 VI50 foi covalentemente ligado a MSA modificado primeiro com um ligador de succinimidila 6-hidrazino-nicotinamida acetona hidrazina (SANH) para produzir molécula estável com um espectro UV caracteristicamente alterado. O conjugado de UC-1V150/MSA foi identificado por um pico de absorção de UV a 342 nm devido à formação de hidrazina, ao passo que SANH sozinho absorveu a 322 nm. A quantificação de moléculas UC-1 VI50 conjugadas por MSA foi extrapolada a partir de uma curva padrão de UC-1V150-SANH (Figura 1). Compativelmente os conjugados de UC-1V150/MSA foram obtidos em uma razão de cerca de 5: 1. Os estudos biológicos aqui relatados foram feitos usando 5: 1 UC- 1V150/MSA.

Modificação de MSA com SANH. 200 μL de MSA (25 mg/ml) foi misturada com 100 μL de tampão de conjugação (NaPi 1 M, pH = 7,2) e 690 μl de PBS. 844 μg de SANH em 10 μl de DFM (40 vezes de excesso molar para MSA) foi adicionado à solução de proteína (concentração final de MSA na mistura de reação é 5 mg/ml). Depois de misturar suavemente a reação foi continuada na temperatura ambiente por 2 horas. Para remover o excesso de SANH a mistura de reação foi carregada na coluna de NAP-10 equilibrada com PBS e MSA modificada foi eluída com 1,5 ml de PBS.

Ligação de IV150 à MSA modificada com SANH. 460 μg de IV150 dissolvido em 10 μl de DMF foi adicionado à MSA modificada com SANH e a mistura de reação foi incubada durante a noite na temperatura ambiente. Para remover o excesso de IV150 a mistura de reação foi primeiramente concentrada a 1 ml usando coluna de micro-spin (Millipore: BIOMAX 5K) e carregada na coluna de NAP-10 como mencionado acima.

Os agonistas da TLR7 também foram conjugados para oligodesoxinucleotídeos (ODNs) (Figuras 20 e 21), um vírus (Figuras 18 e 19) e a um componente de lipídio que pode ser depois incorporado em um lipossoma (Figuras 24 e 25).

Síntese de agonista de TLR7 espacialmente regulamentado. Cada conjugado é preparado pelas técnicas padrão bem conhecidas na química da bioconjugação. A caracterização de cada um pelos métodos quantitativos UV, LC/MS e PAGE determina a “valência” ou razão do agonista de TLR para o seu grupo auxiliar (macromolécula). A partir desta informação, o tamanho e a forma dos conjugados são facilmente estimados pelas técnicas de modelação. A diversidade no tamanho, forma e valência dos conjugados é introduzida através da seleção da macromolécula, representada no esquema da estrutura como R3. Por exemplo, quando R3 é um dendrímero, tal como da variedade da poli(amidoamina) comum, o número de grupos fímcionais de superfície para ligação do agonista de TLR é precisamente definido com base no número de pontos de ramificação ou gerações deste dendrímero particular. Uma primeira geração (Gl) tem 8 grupos amino na superfície, um G2 tem 16 e assim por diante, resultando assim em um nível alto de controle sobre valência e o tamanho dos conjugados (ver Figura 2). Adicionalmente, algumas nanopartículas de dendrímero podem conter tanto um ligando alvejado quanto agonista de TLR7. O agonista de conjugados de TLR7-lipídeo também podem ter uma variedade de “valências” dependendo da seleção de lipídeos. Por exemplo, o conjugado de UV-1V199/L potente (Figura 6) foi preparado pela ligação de um derivado carbóxi do agonista de TLR7 (UC-1V199) ao grupo etanolamino da dioleanilfosfatidiletanolamina comercialmente disponível (DOPE).

Os conjugados de lipídeo são formulados em várias nanopartículas lipossômicas pela combinação com colesterol, DOPE e outros lipídeos para produzir partículas tendo um diâmetro hidrodinâmico de cerca de 100 nm (Figuras 24 e 25). Os hexágonos na figura representam UC- 1V199/L e agonista de TLR7 relacionado com caudas de fosfolipídeo.

Os agonistas da TLR7 e dímeros, assim como conjugados de TLR foram mostrados ter liberação de citocina e/ou atividade de citocina in vivo como determinado pelos ensaios tais como aqueles aqui divulgados. Por exemplo, imiquimod, bropirimina, UC-1V138, UC-1V136, UC-1V150, UC- 1X105, UC-1V199, UC-1W236, UC-1X51, UC-1W247, UC-1X113, UC- 1V199/L, UC-1V150BSA, conjugados de UC-1V150 com ou sem um ligador e MS A, OVA, virions e/ou ODN, conjugados de UC-1V199 e DOPE, sílica, lipídeo ou esporos irradiados e conjugados de UC-1V1043 e UC-1V1018 com OVA todos mostraram atividade.

Exemplo III Materiais e Métodos

Composto de avaliação in vitro. A capacidade de conjugados de TLR7 para estimular e/ou para inibir produção de citocina é avaliada em células mononucleares derivadas de medula óssea de murino (BMDM) que são altamente enriquecidas em células dendríticas, assim como em células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC). As BMDM são plaqueadas em placas de 96 reservatórios e tratadas em triplicata com veículo ou várias doses partindo de 10 μM diluídas em incrementos de 3 vezes abaixo das concentrações picomolares. Depois de 24 horas os sobrenadantes são colhidos e ensaiados quanto até 30 citocinas diferentes, quimiocinas e outros mediadores, usando um Sistema de ensaio de conta Luminex e reagentes comercialmente disponíveis. Os resultados de ELISA de citocina/quimiocina são suplementados com medidas de expressão de mRNA quantitativas e com a análise de fosfoproteína bidimensionais, para se obter discernimento dentro do escopo e mecanismo de indução da tolerância. No momento da coleta do sobrenadante, os meios são substituídos nos reservatórios com MTT, como uma avaliação colorimétrica da sobrevivência da célula. As PBMC humanas são isoladas a partir de bolsas de sangue comerciais e tratadas similarmente. Para avaliar o tráfico dos nanolipossomas conjugados com agonista de TLR e dendrímeros, as respectivas nanopartículas são carregadas ou modificadas com um fluorocromo. A localização subcelular é determinada microscopicamente, em alguns casos em células que foram tratadas com inibidores da maturação endossômica.

Para comparar as atividades antiinflamatórias dos conjugados de TLR7 com grupos auxiliares diferentes, as BMDM são tratadas primeiro com os compostos mais potentes, nas concentrações anteriormente determinadas que tiveram efeitos mínimos sobre a estimulação de citocina pró-inflamatória (TNFα, IL-1). Depois de 24 horas, o meio é substituído e as células são inoculadas com ligandos de ativação de membros da família TLR diferentes (Pam3Cys para TLR2, poli(LC) para TLR3, LPS para TLR4, flagelina para TLR5, Malp-2 para TRL6, UC-1V150 para TLR7, R848 para TLR7/8, oligonucleotídeos de CpG para TLR9 e outros) nas concentrações que eficazmente induzem a produção de citocina em células tratadas com simulado. As células são avaliadas pelo imunoensaio multiplex, PCR quantitativa e manchamento de fosfoproteína. Para melhor entender as cinéticas de indução e manutenção da tolerância, as células iniciadas com conjugado de TLR7 também são inoculadas em intervalos de tempo diferentes e analisadas quanto ao padrão de produção de citocina.

Avaliação de composto in vivo. A produção de fluído de lavagem broncoalveolar (BALF) versus citocinas sistêmicas depois da administração às vias aéreas de camundongos é avaliada. Camundongos C57BL/6 igualados em idade fêmeas anestesiados são administrados nasal (i.n.), oral (p.o.) ou intravenosamente (i.v.), com várias quantidades dos conjugados de TLR7 como anteriormente descrito ou com os lipossomas ou dendrímeros em veículos apropriados. Depois da recuperação e em pontos de tempo diferentes, os soros e BALF são coletados e analisados quanto as citocinas e quimiocinas pelo ensaio Luminex. Os pesos, temperaturas e precursor de captação de fluido dos animais tratados são registrados, como um substituto clínico para uma “síndrome da citocina sistêmica.”

Os experimentos subsequentes avaliam a capacidade dos agentes diferentes para produzir refratariedade local e sistêmica (tolerância ao TLR) para ativar TLR depois da administração de dose alta i.n., p.o. ou i.v., como determinado pelas citocinas séricas e de BALF. Altas doses dos vários conjugados de TLR7, que não induzem citocinas significantes in vivo, nem sinais clínicos de uma síndrome de citocina, são selecionados. Os camundongos são tratados com as altas doses dadas pelas vias diferentes de administração e depois inoculados com ativadores de TLRs diferentes em vários pontos de tempo. O soro e BALF são coletados e analisados e os sintomas clínicos são registrados. As atividades antiinflamatórias dos conjugados são confirmadas com um modelo de choque letal previamente usado para estudar LPS e CpG. Neste modelo, os camundongos Balb/c que foram previamente injetados i.p. com D-galactosamina sucumbem depois da inoculação sistêmica com ativadores de TLR diferentes, devido o estímulo com citocina e dano hepático. Os medicamentos antiinflamatórios ativos falham em induzir sintomas clínicos em animais sensibilizados e também prevenirão o choque causado por outros ligandos de TLR. Com um ponto final definido, este modelo é especialmente útil para determinar as cinéticas e duração da tolerância ao TLR.

Exemplo IV Materiais e Métodos

Camundongos. Camundongos C57BL/6 fêmeas (5 a 6 semanas de idade) foram obtidos da Harlan West Coast (Germantown, CA) e camundongos A/J fêmeas (6 a 8 semanas de idade) foram adquiridas da Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Os camundongos A/J foram usados para a infecção com a cepa Steme de B. anthracis (Kenney et al., J. Infect. Dis., 190: 774 (2004)). Os camundongos foram cruzados e mantidos sob condições padrão na University of California na San Diego Animal Facility, que é reconhecida pela American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. Todos os protocolos de animal receberam aprovação anterior pelo Institutional Review Board. Para o estudo da influenza H1N1, camundongos BALB/c fêmeas (16 a 18 g) foram obtidos da Charles River Laboratories (Wilmington, MA) e mantidos no Laboratory Animal Research Center of Utah State University reconhecido pela American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care.

Estimulação In Vitro de BMDM. BMDM foram isoladas de várias cepas de camundongos e foram semeadas em placas de 96 reservatórios a uma densidade de 5 x 104 células por reservatório. Os compostos foram adicionados a culturas de 10 dia de idade a uma concentração final variando de 0,01 a 10 μM ou como de outro modo indicado. Depois de 24 horas de incubação, os sobrenadantes de cultura foram coletados e ensaiados quanto as induções de citocina pelo ensaio de ELISA intercalado (BD Pharmingen, San Diego, CA) ou Luminex multiplex (Austin, TX) usando o kit feito de encomenda Beadlyte Mouse MultiCitokine (Upstato, Charlottesville, VA e eBiosciences, San Diego, CA), de acordo com as instruções do fabricante.

Administração dos Compostos aos Camundongos.

Camundongos C57BL/6 igualados em idade fêmeas foram injetados com 100 μl de solução salina contendo UC-1V150 ou UC-1V150/MSA cada um contendo o equivalente de 0,38 a 38 nmoles do farmacóforo por intermédio da veia da cauda. Para a administração intrapulmonar, os camundongos foram anestesiados com solução de Avertem i.p. e raspados em tomo da área do pescoço. As traquéias foram expostas com uma incisão pequena e injetados com 50 μl de solução salina contendo várias quantidades de UC-1V150/MSA ou o medicamento não conjugado. Depois da recuperação e em pontos de tempo diferentes, o soro e BALF foram coletados e analisados quanto à IL-6, IL-12p40, IFN-y, RANTES e MCP-1 pelo ensaio Luminex. Em outros experimentos, os camundongos foram anestesiados com uma solução de 74 cetamina/xileno intramuscular e administrado na mesma quantidade de UC- 1V150/MSA em doses i.t. de 50 μl ou doses i.n. de 20 μl. Porque níveis similares de citocina foram observados no BALF 24 horas depois da administração por cada um dos métodos, a via i.n. mais conveniente foi usada em estudos de modelo infeccioso.

Infecção de Camundongos A/J com Esporos de B. anthracis. Os esporos foram preparados a partir da cepa Steme de B. anthracis (pXOl+pXO2) como anteriormente descrito (Sabet et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol., 47: 369 (2006); Guidi-Rontani et al., Mol. Microbiol., 42: 931 (2001)). Os esporos purificados foram armazenados em PBS de 1 x 108 a 4 x 108 cfu/ml a 4o C. Antes da infecção, os esporos foram aquecidos a 65° C por 30 minutos para iniciar a germinação. Os camundongos A/J foram anestesiados intramuscularmente com solução de cetamina/xileno e administrados i.n. com 0,75 nmol de UC-1V150 ou UC-1V150/MSA por camundongo 1 dia antes da infecção com antraz. Os camundongos de controle receberam apenas solução salina ou solução salina contendo MSA em quantidades equivalentes como em UC-1V150/MSA. A infecção foi realizada i.n. com 2xl05a8xl05 esporos de B. anthracis em um volume de 20 μl. a sobrevivência foi observada por 13 dias, porque a maioria dos camundongos tratados com solução salina morreram dentro de 3 a 6 dias. Os resultados foram obtidos de oito camundongos por grupo.

Infecção de camundongos Balb/c com o Vírus da Influenza. O vírus da Influenza A/New Caledonia/20/99 (H1N1) foi obtido do Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, GA). O vírus foi propagado duas vezes em células renais caninas de Madin Darby (MDCK), passado mais 7 vezes em camundongos para tomá-lo virulento seguido por uma outra passagem em cultura de célula para amplificá-lo. Os camundongos foram anestesiados i.p. com cetamina (100 mg/kg) e infectados i.n. com o vírus em aproximadamente de IO5,0 doses infecciosas de cultura de célula por 75 camundongo em um volume de inóculo de 50 μl. Uma dose intranasal única de 75 μl apenas em solução salina ou contendo UC-1V150/MSA a 5 nmoles por camundongo foi dada 24 horas antes da exposição ao vírus. Dez camundongos infectados por grupo tratado e 20 animais de controle de placebo foram deixados sobreviver por 21 dias.

Estatísticas. Os níveis de citocina foram comparados pelo teste μ de Mann Whitney com p < 0,05 para determinar a significância estatística. As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e os teste de classificação log foram realizados usando o software GraphPad Prism versão 4.0c (San Diego, CA) para comparar as diferenças na sobrevivência.

Resultados

Liberação de citocina in vitro e in vivo potente em resposta aos conjugados de UC-1V150/MSA. A incubação de macrófagos derivados da medula óssea (BMDM) com UC-1V150 sozinho estimulou a liberação de citocina (Figura 10). Quando conjugados a MSA, níveis de citocinas similares ou mais altos foram detectados com uma concentração equivalente 10 vezes mais baixa do agonista de TLR7. Experimentos com transformantes de TLR, realizados como anteriormente descrito, confirmaram que UC-1V150, similar ao composto que carece da modificação de aldeído (UC-1V136), foi um agonista específico de TLR7 (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 103: 1828 (2006)). Depois da injeção i.v. em camundongos, UC-1V150 induziu níveis séricos de citocina que deram pico em cerca de 2 horas depois da injeção e depois rapidamente declinou até próximo aos níveis de fundo (dados não mostrados). A comparação dos perfis de produção de citocina de UC- 1V150 versus o UC-1V150/MSA 2 horas depois da injeção i.v. em várias dosagens demonstrou que o conjugado de MSA realçou a potência em 10 a 100 vezes (Figura 11). Os soros dos grupos de solução salina ou controle de MSA revelou pouco ou nenhum nível detectável de citocina (dados não mostrados).

Os Conjugados de UC-1V150/MSA Fornecem Atividade Pulmonar Prolongada e Localizada. Para garantir a liberação adequada dos agonistas da TLR7 ao sistema respiratório, os medicamentos foram de modo inicialmente direto na traquéia. A indução de citocina substancial foi encontrada no fluido de lavagem alveolar brônquico (BALF) extraído de camundongos intratraquealmente tratados (i.t.) com UC-1V150/MSA, ao passo que as citocinas séricas foram muito baixas e próximas ao níveis de fundo nos mesmos animais (Figura 12). Em contraste acentuado, os níveis similares de citocina foram observados tanto em BALF quanto nos soros de camundongos injetados i.t. com agonistas de molécula pequena de TLR7, que algumas vezes induziram mudanças comportamentais, tais como cabelo em pé na extremidade e calafrios, sugestivas de uma síndrome da citocina (Tabela 2). Estudos subsequentes com UC-1V150 mostrou que a liberação intranasal (i.n.) também induziu a produção seletiva de citocina no BALF, provavelmente devido às aspiração do medicamento. Consequentemente, a administração i.n. foi usada para avaliar os conjugados de UC-1 VI50 em dois modelos de animal infecciosos de pneumonite.

Os camundongos pré tratados i.n. com UC-1V150/MSA um dia antes da infecção com esporos de B. anthracis tiveram uma sobrevivência média prolongada de 7,5 dias comparada com 5 dias nos camundongos de controle (P < 0,025) (Figura 14A). Ao contrário, nenhuma diferença significante foi observada em camundongos tratados com solução salina, a quantidade equivalente de MSA ou apenas com UC-1 VI50. Estes dados confirmaram que o conjugado de UC-1 VI50, mas não o medicamento livre, teve atividade imunoterapêutica intrapulmonar. Assim, a conjugação do agonista de TLR7 a MSA realçou a sua potência e reduziu a sua toxicidade depois da liberação local ao trato respiratório.

Em um outro estudo, camundongos BALB/c foram pré tratados i.n. com o conjugado UC-1V150/MSA 1 dia antes da infecção do vírus da influenza (cepa H1N1). A sobrevivência média dos camundongos tratados foi prolongada para 11,5 dias comparada com 7 dias nos controles não tratados (P < 0,0001) (Figura 14B). Juntos estes resultados sugerem que a conjugação do agonista de TLR7 a MSA realçou a sua potência e reduziu a sua toxicidade depois da liberação local ao trato respiratório. UC-1V150/MSA foi administrado i.n. antes da infecção pelo antraz seguido pelo tratamento com ciprofloxacina (25 mg/kg) no dia 4. O tratamento com placebo seguido pelo tratamento com ciprofloxacina resultou em cerca de 15 a 25 % de sobrevivência, enquanto que o tratamento com um conjugado e ciprofloxacina resultou em cerca de 90 % de sobrevivência. Assim, o conjugado é particularmente útil como um coadjuvante com uma vacina contra o antraz.

Debate

O composto UC-1V150 é um dos ligandos de TLR7 de molécula pequena sintéticos mais potentes e versáteis até agora descobertos porque (i) os mesmos são ativos nas concentrações nanomolares; (ii) os mesmos podem estar ligados a uma variedade das macromoléculas com realce de atividade em alguns casos; e (iii) as suas propriedades farmacocinéticas podem ser mudados pela modificação dos grupos auxiliares. O conjugado de TLR7-proteína UC-1V150/MSA foi caracterizado como tendo aproximadamente cinco moléculas pequenas covalentemente ligadas a cada molécula da proteína de MSA. O conjugado reteve a atividade de agonista de TLR7 e de fato foi tanto mais potente quanto teve uma duração mais longa de ação, comparado com o medicamento monomérico livre. Além disso, este conjugado pôde ser liberado eficazmente ao sistema respiratório pela administração i.n. ou i.t.. a liberação de medicamento pela i.n. mostrou ser eficaz em um modelo de camundongo de uma infecção bacteriana. Quando da consideração da biblioteca para o sistema respiratório, uma vantagem potencialmente importante de preparar os agonistas da TLR7 como 78 conjugados das macromoléculas é que os efeitos colaterais sistêmicos podem ser evitados pelo confinamento da atividade imunoestimulatória ao ambiente mucósico local.

Esperar-se-ia que o conjugado macromolecular fosse absorvido na circulação sistêmica mais lentamente do que o medicamento livre e, de fato, pudesse ser avidamente retirado pelos macrófagos residentes e células dendríticas que expressam TLR7. Consequentemente, o conjugado deve mitigar o tipo de efeitos colaterais severos que foram associados com a liberação sistêmica de agonistas de TLR7/8. O conjugado UC-1V150/MSA também pode fornecer atividade imunoterapêutica quando administrado aos sítios mucósicos, tais como os tratos genitourinário e gastrointestinal, para o controle de doenças infecciosas, alérgicas ou malignas. O carreador macromolecular do agonista de TLR7 também pode fornecer um método melhorado para a liberação seletiva do produto imunoterapêutico a um órgão ou tecido específicos. Por exemplo, os conjugados lipídicos de UC-1V150 podem ser incorporados em lipossomas de tamanho e composição diferentes, ao passo que o conjugado de proteína do agonista de TLR7 pode alvejar subconjuntos de célula dendrítica diferentes. As diferenças no tráfico intracelular do conjugado de UC-1V150 pode induzir precursor distinto da produção de citocina, análogo aos efeitos observados com oligonucleotídeos que ativam TLR9 (Rothenfusser et al., Hum. Immunol., 63: 111 (2002)).

Um problema potencial que foi observado com medicamentos conjugados às proteínas é o desenvolvimento de anticorpos contra a porção equivalente a hapteno de peso molecular baixo da molécula. Entretanto, UC- 1V150, diferente aos conjugados de vacina de TLR7/8 estudados mais no princípio, tem uma estrutura igual a adenina simples que é improvável de induzir reações. De fato, anticorpos anti-UC-lV150 não foram observados depois da administração dos conjugados de proteína exceto depois da administração repetida de um carreador da hemocianina do lapa buraco de fechadura em adjuvante de Freud completo (dados não publicados).

Novos agentes para a prevenção e tratamento de infecções pelo vírus da influenza estão sendo procurados, particularmente com a disseminação de cepas altamente patogênicas da Ásia. A morbidez e mortalidade das cepas habitualmente circulantes é alta a cada ano.

O tratamento da infecção pode ser realizada pelos medicamentos antivirais aprovados, que são moderadamente eficazes se iniciados no princípio. O realce do sistema imune também está sendo investigado como uma estratégia que aceleraria as respostas antivirais protetoras e especialmente em hospedeiros imuno comprometidos. É possível que a ativação imune sistêmica por intermédio da sinalização de TLR não crie um gradiente de citocina e quimiocina local requerido para mobilizar células imunes para o local de infecção. Em auxílio desta hipótese, o UC-1V150 não conjugado, que é rapidamente absorvido através da mucosa, falhou em proteger os camundongos da infecção pelo B. anthracis, ao passo que o conjugado de UC-1V150 foi eficaz.

O B. anthracis tem se tomado um agente de bio-terrorismo. Uma resposta rápida contra os patógenos microbianos é crítica para a biodefesa eficaz. No geral uma resposta imune de anticorpo ou celular pode proteger contra estes patógenos; entretanto, gerar estas respostas protetoras rapidamente requer exposição anterior aos antígenos específicos para cada organismo. Embora seja conhecido que o vírus da influenza requer o TLR7 (Barchet et al., Eur. J. Immunol., 35: 360 (2005)), o antraz bacteriano mais provavelmente pode requerer TLR2, TLR4 e TLR9. Além disso para ser um intermediário de sinalização comum para os TLRs, MyD88 também mostrou ser necessário para a resistência à infecção em um modelo de camundongo de antraz (Hughes et al., Infect. Immun., 73: 7535 (2005)). Porque o conjugado de UC-1V150 funciona eficazmente como um adjuvante contra infecções que usam caminhos diferentes, o mesmo pode ser aplicado como uma estratégia de biodefesa que não necessitaria ser específico para os antígenos de um micróbio particular e que seria útil em ataques de agentes mistos assim como únicos.

Exemplo V

Não existe nenhuma vacina SA conhecida que seja potente o bastante ou que possa atuar rapidamente o bastante para prevenir infecções SA em pacientes “em risco” antes da hospitalização. Uma única injeção de um agonista de TLR7 potente e bactérias gram-positivas mortas, por exemplo, SA ou uma subunidade deste, pode reforçar a imunidade protetora para as bactérias dentro de uma semana de administração. A injeção pode incluir, por exemplo, 1) um agonista de TLR7 tal como UC-IV199 conjugado diretamente aos grupos amino livres nas bactérias gram-positivas mortas, 2) um agonista de TLR7 tal como UC-IV199 conjugado à albumina em combinação com bactérias gram-positivas mortas, 3) um agonista de TLR7 tal como UCIV199 conjugado a uma proteína bacteriana gram-positiva recombinante ou 4) um agonista de TLR7 tal como UC-IV199 conjugado aos polissacarídeos bacterianos gram-positivos (por exemplo, por intermédio de um ligador conhecido na técnica, tal como aquele usado o StaphVax®).

Como aqui descrito acima, um agonista de TLR7 foi conjugado aos esporos letalmente irradiados da cepa de vacina Steme de Bacillus anthracis (BA). Como SA, BA é uma bactéria gram-positiva. Comparado ao esporos sozinhos, a bactéria conjugada foi um ativador potente de macrófagos derivados da medula óssea de camundongo (BMDM) como medido pela secreção de citocina (IL-12 e IL-6). Em um outro experimento, uma única injeção em camundongos de esporos letalmente irradiados da cepa Steme de BA, misturados com um conjugado de agonista de TLR7 a albumina de camundongo (MSA), protegeu os animais contra a inoculação de BA intrapulmonar letal administrado apenas seis dias mais tarde. Ao contrário, a injeção dos animais com esporos de BA sozinhos ou com BA mais um adjuvante convencionais, a toxina da cólera (CT), não protegeu os animais. Assim, uma vacina em albumina/esporo irradiado de agonista de TLR7 induziu a imunidade protetora ao Bacillus anthracis dentro de 6 dias. Esta rapidez de resposta em um animal ingênuo foi totalmente inesperada. A 5 mesma tecnologia de vacina provavelmente protegerá os seres humanos de infecção de AS adquirida em hospital.

Todas as publicações, patentes e documentos de patente citados no relatório descritivo são aqui incorporados por referência, como se individualmente incorporados por referência. No caso de qualquer 10 inconsistência, a presente divulgação, incluindo quaisquer definições nesse sentido prevalecerão. A invenção foi descrita com referência a várias formas de realização e técnicas específicas e preferidas. Entretanto, deve ser entendido que muitas variações e modificações podem ser feitas embora permaneçam dentro do espírito e escopo da invenção.

Claims (25)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um composto de fórmula A: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, incluindo um hidrato do mesmo, em que: X1 é -O; R1 é alquila Ci-Cio, opcionalmente substituído com alcóxi CM; cada R2 é independentemente -OH, alquila Ci-Ce, alquila Ci-Cβ substituído, alcóxi Ci.C6, alcóxi Ci-C6 substituído, - C(O)- alquila Ci-Ce (alcanoíla), -C(O)- alquila Ci-Cβ substituído, -C(O)- arila CÓ-CIO (aroíla), -C(O)- arila Cβ-Cio substituído, -C(O)OH (carboxila), -C(O)O alquila Ci-Cβ (alcoxicarbonila), -C(O)O alquila CI-CÓ substituído, -NRaRb, - C(O)NRaRb (carbamoíla), -C(O)NRaRb substituído, halo, nitro ou ciano; em que os substituintes nos grupos alquila, arila ou heterocíclico são hidróxi, alquila Ci-Cio, hidroxil-alquileno Ci.Cio, alcóxi Ci C6, cicloalquila C3-C6, alcóxi Ci-6 alquileno Ci.Ce, amino, ciano, halogênio ou arila; cada Ra e Rb é independentemente hidrogênio, alquila CI-CÔ, cicloalquila C3-C8, alcóxi Ci-C6, haloalquila Ci-Ce, cicloalquila C3-C8 alquila Ci-Cβ, alcanoíla Ci-Ce, hidróxi-alquila CI-CÔ, arila, aril-alquila CI-CÔ, heteroarila, heteroarila alquila Ci-C6 ou alcóxi CI-CÔ carbonila; X2 é uma ligação ou uma cadeia tendo até cerca de 24 átomos; em que os átomos são selecionados do grupo que consiste de carbono, nitrogênio, enxofre, oxigênio não peróxido, e fósforo; n = 0, 1, 2, 3 ou 4; e R3 é um fosfolipídeo compreendendo dois ácidos carboxílicos C14-C22, cada um tendo um, dois, três ou quatro sítios de insaturação, epoxidação, hidroxilação ou uma combinação dos mesmos, cada um em um local da cadeia de carbono do ácido carboxílico.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ácidos carboxílicos do fosfolipídeo são os mesmos ou diferentes.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada ácido carboxílico do fosfolipídeo é independentemente um ácido carboxílico C17 com um sítio de insaturação em C8-C9.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada ácido carboxílico do fosfolipídeo é independentemente um ácido carboxílico Cl8 com um sítio de insaturação em C9-C10.

5. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fosfolipídeo é dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE).

6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que um oxigênio do fosfolipídeo fosfato está ligado ao ligador.

7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que R1 é um alquila Ci-Cio substituído por alcóxi Ci-6.

8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que n é 0 e X2 é carbonila.

9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que R1 é -(CH2)2-OCH3, R3 é dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), n é 0 e X2 é carbonila.

10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende um lipossoma.

11. Uso de um composto de Fórmula A, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para tratar um mamífero que sofre de ou susceptível a câncer ou inflamação pela administração do medicamento ao mamífero, em que o composto de Fórmula A tem a estrutura: em que: X1 é -O; R1 é alquila Ci-Cio, opcionalmente substituído com alcóxi CI-Ô; cada R2 é independentemente -OH, alquila CI-CÓ, alquila CI-CÓ substituído, alcóxi Ci-6, alcóxi CI-CÔ substituído, -C(O)- alquila Ci-Cf, (alcanoíla), -C(O)- alquila CI-CÔ substituído, -C(O)- arila Ce-Cio (aroíla), -C(O)- arila CÓ-CIO substituído, -C(O)OH (carboxila), -C(O)O alquila Ci-Cβ (alcoxicarbonila), -C(O)O alquila Ci-Cβ substituído, -NRaRb, - C(O)NRaRb (carbamoíla), -C(O)NRaRb substituído, halo, nitro ou ciano; em que os substituintes nos grupos alquila, arila ou heterocíclico são hidróxi, alquila Ci.Cio, hidroxil-alquileno Ci.Cio, alcóxi CJ.CÔ, cicloalquila C3.C6, alcóxi Ci-Cβ alquileno C1-6, amino, ciano, halogênio ou arila; cada Ra e Rb é independentemente hidrogênio, alquila Ci-Cβ, cicloalquila C3-C8, alcóxi Ci-Ce, haloalquila Ci-Cg, cicloalquila C3-C8 alquila Ci-Cβ, alcanoíla CI-CÔ, hidróxi-alquila CI-CÔ, arila, aril-alquila CI-CÔ, heteroarila, heteroarila alquila Ci-C(, ou alcóxi Ci-Ce carbonila; X2 é uma ligação ou uma cadeia tendo até cerca de 24 átomos; em que os átomos são selecionados do grupo que consiste de carbono, nitrogênio, enxofre, oxigênio não peróxido, e fósforo; n = 0, 1, 2, 3 ou 4; e R3 é um fosfolipídeo compreendendo dois ácidos carboxílicos C14-C22, cada um tendo um, dois, três ou quatro sítios de insaturação, epoxidação, hidroxilação ou uma combinação dos mesmos, cada um em um 4 local da cadeia de carbono do ácido carboxílico.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os ácidos carboxílicos do fosfolipídeo são os mesmos ou diferentes.

13. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que cada ácido carboxílico do fosfolipídeo é independentemente um ácido carboxílico C17 com um sítio de insaturação em C8-C9.

14. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que cada ácido carboxílico do fosfolipídeo é independentemente um ácido carboxílico Cl8 com um sítio de insaturação em C9-C10.

15. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o fosfolipídeo é dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE).

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que um oxigênio do fosfolipídeo fosfato está ligado ao ligador.

17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 16, caracterizado pelo fato de que R1 é um alquila Ci-Cio substituído por alcóxi Ci-6.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 17, caracterizado pelo fato de que X2 é carbonila.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 18, caracterizado pelo fato de que R1 é -(CH2)2-OCH3, R3 é dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), n é 0 e X2 é carbonila.

20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 19, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

21. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 20, caracterizado pelo fato de que a condição é inflamação.

22. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 21. caracterizado pelo fato de que a condição é câncer.

23. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 22, caracterizado pelo fato de que o medicamento é uma vacina e o composto é um adjuvante.

24. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado 5 pelo fato de que tem a estrutura:

25. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o composto é