BRPI0807563A2 - Ativação de células apresentando antígeno humano através de receptor-1 (lox-1) de ldl oxidado semelhante a lectina de célula dendrítica - Google Patents

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Jacques F Banchereau
Sangkon Oh
Gerard Zurawski
Sandra Zurawski
Dapeng Li
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Baylor Res Inst
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Description

ATIVAÇÃO DE CÉLULAS DE APRESENTAÇÃO DE ANTÍGENO HUMANAS ATRAVÉS DO RECEPTOR-I DE LDL OXIDADO (LOX-I) SEMELHANTE A LECTINA DE CÉLULA DENDRÍTICA
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se geralmente ao campo
de ativação de célula imune, e mais particularmente, às composições e métodos para ativar células imunes através do receptor LOX-I.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO Sem limitar o escopo da invenção, seu fundamento é
descrito em relação à ativação célula dendrítica.
As células dendríticas têm um papel essencial em controlar a relação de imunidade inata e adquirida fornecendo sinais solúveis e intercelulares, seguido pelo 15 reconhecimento de patógenos. Estas funções das DCs são amplamente dependentes da expressão de receptores de superfície especializados, "receptores de reconhecimento de padrões" (PRRs), representados, especialmente, por receptores toll-like (TLRs) e receptores semelhante a 20 lectina ou lectinas tipo C (LLRs) (2-4) .
No paradigma atual, um maior papel de TLRs é alertar as DCs para produzir interleucina 12 (IL-12) e outros citocinas inflamatórias para iniciar respostas imunes. As LLRs tipo C operam como constituintes da captura de 25 antígeno e mecanismo de captação poderosos de macrófagos e DCS (2). Comparado aos TLRs, entretanto, os LLRs podem ter faixas de funções biológicas mais amplas que incluem a migração celular (5) e interações intercelulares (6). Estas funções múltiplas de LLRs podem ser devido ao fato que os
3 0 LLRs, ao contrário de TLRs, podem reconhecer os próprios e não próprios. Entretanto, a complexidade de LLRs, incluindo a redundância de um número de LLRs expressos em células imunes, tem sido um dos obstáculos principais para compreender as funções detalhadas de LLRs individuais. Além 5 disso, os ligantes naturais para a maioria destes receptores permanecem não identificados. Todavia, a evidência de estudos recentes sugere que os LLRs, em colaboração com os TLRs, podem contribuir para a ativação de células imunes durante as infecções microbianas (7-15) .
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção inclui novas composições e métodos de direcionamento e usar os anticorpos monoclonais de LOX-I anti-humanos (mAbs) e caracterizar suas funções biológicas. Os mAbs anti-LOX-I e os fragmentos dos mesmos são mostrados por serem úteis para a localização, caracterização e ativação de células imunes. Os presentes inventores reconheceram que, enquanto LOX-I é capaz de direcionar a internalização do antígeno substituto na DC humana, a presente invenção identifica e usa novas atividades biológicas de LOX-I para efetuar particularmente mudanças desejáveis no sistema imune, algumas no contexto de captação de antígeno (por exemplo, vacinação), outras através da ação única de efetores LOX-I (sozinhos ou em combinação com outras moléculas regulatórias imunes) capazes de provocar a sinalização através deste receptor na DC, células B, e monócitos. A divulgação da invenção revela meios de desenvolver os agentes únicos capazes de ativar as células carregando LOX-1, assim como o efeito das mudanças resultantes em células recebendo estes sinais apesar da ação em outras células no sistema imune. Estes efeitos [sozinhos, ou em combinação com outros sinais (isto é, coestimulação)] são altamente preditivos de resultados terapêuticos para determinados estados de doença ou para aumentar resultados protetores no contexto de vacinação.
O LOX-I foi originalmente identificado como um
receptor de lipoproteína de baixa densidade oxidada (OxLDL) em células endoteliais e foi investigado extensivamente em associação com aterosclerose. A ativação, disfunção e lesão endoteliais mediadas por OxLDL têm um papel chave na 10 progressão de aterosclerose em sua fase mais precoce. LOX-I media supostamente os sinais de OxLDL, induzindo a produção de espécies de oxigênio reativas, uma expressão subregulada de endotelina-1, MCP-I e moléculas de adesão mediadas pela ativação de NF-kB, e apoptose. Embora LOX-I 15 seja classificado como um tipo de receptor scavenger D, endocitose de OxLDL por macrófagos, conduzindo a formação de célula de espuma, tem sido mostrado por ser principalmente mediado por outros receptores scavenger. LOX-I supostamente pode internalizar células 20 apoptóticas/envelhecidas. LOX-I pode também reconhecer componentes bacterianos. A expressão de LOX-I tem sido observada em DCs mielóides imaturas, bem como DCs derivadas de monócito, monócitos, macrófagos e células B.
As DCs podem cruzar antígenos presentes em proteína 25 (Rock KL Immunol Rev. 2005 outubro; 207: 166-83) . In vivo, as DCs captam antígenos por meio de vários receptores e peptídeos antigênicos presentes em ambas classes I e II. Em particular, LOX-I é um receptor de "reconhecimento de padrões" que eficientemente capta antígenos e apresenta 30 cruzadamente peptídeos antigênicos (Delneste Y Immunity 2002 17:353). No modelo de camundongo, certamente, o antígeno conjugado com anti-LOX-I foi suficiente para induzir respostas imunes ao tumor desafiado. Entretanto, a ativação por um componente bacteriano não pode ser 5 observada com LOX-I (1) sozinho e a co-localização de TLR2 foi mostrada por ser responsável pela sinalização de ativação. Em L0X-1, nem um resíduo de tirosina citoplasmática nem um aminoácido catiônico transmembrana é conhecidos por ter a função de sinalização.
A presente invenção inclui composições e métodos para
aumentar a eficácia de apresentação de antígeno por uma célula de apresentação de antígeno expressando LOX-I isolando um anticorpo específico de LOX-I ou um fragmento do mesmo capaz de ativar a célula de apresentação de 15 antígeno e contatar a célula de apresentação de antígeno com um anticorpo específico anti-L0X-l ou um fragmento do mesmo, em que a célula de apresentação de antígeno é ativada. A célula de apresentação de antígeno pode ser uma célula dendrítica isolada, uma célula mononuclear sanguínea 20 periférica, um monócito, uma célula dendrítica mielóide e combinações das mesmas. A célula de apresentação de antígeno pode ser uma célula dendrítica isolada, uma célula mononuclear sanguínea periférica, um monócito, uma célula B, uma célula dendrítica mielóide e combinações das mesmas que 25 foram cultivadas in vitro com GM-CSF e IL-4, interferon alfa, antígeno e combinações dos mesmos. O método pode também incluir a etapa de ativar as células de apresentação de antígeno contatadas com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa, em que o contato com o anticorpo específico de L0X-1 ou
3 0 fragmento do mesmo aumenta a expressão de superfície de CD86 e HLA-DR na célula de apresentação de antígeno. Por exemplo, as células de apresentação de antígeno podem ser uma célula dendrítica que tenha sido contatada com o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo, GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa para ativar a célula dendrítica, em que as células dendríticas ativadas aumentam a expressão de superfície de CD86, CD80, e HLA-DR. Em outro exemplo, a célula de apresentação de antígeno pode ser uma célula dendrítica que tenha sido contatada com o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo, GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa para ativar a célula dendrítica, em que as células dendríticas ativadas aumentam a secreção de IL12p40, MCP-I, IL-8, TNFa, IL-6, ΜΙΡ-la, e IL-Ib e combinações dos mesmos, e/ou pode aumentar sua ativação conjuntamente com a sinalização através de CD40. Também descobriu-se que as células de apresentação de antígeno incluem uma célula dendrítica que tenha sido contatada com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa e o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo aumentaram a atividade coestimulatória de células dendríticas. Os exemplos específicos de genes que têm uma mudança no perfil de expressão sob exposição ao anticorpo específico de LOX-I ou ao fragmento do mesmo da presente invenção incluem um ou mais genes como mostrado na Figura 4. Exemplos não limitantes do anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo podem ser selecionados do clone 9D7-10-4, 8B4-10-2, 11C8-B7, 13B11-A8 e combinações dos mesmos. As células dendríticas que são ativadas através do LOX-I com o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo são capazes de ativar células B, células T e combinações das mesmas.
A presente invenção também inclui um anticorpo recombinante (rAb) em que o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo está ligado a uma metade de um par de Coesina/Doquerina. O anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo que é parte do rAb pode ser ligado a uma metade de um par de Coesina/Doquerina e a outra metade do par pode ser ligado a uma ou mais citocinas selecionadas de interleucinas, fatores de crescimento transformadores (TGFs), fatores de crescimento de fibroblasto (FGFs), fatores de crescimento derivados de plaqueta (PDGFs), fatores de crescimento epidérmico (EGFs), peptídeos ativados de tecido conectivo (CTAPs), fatores osteogênicos, e análogos biologicamente ativos, fragmentos, e derivados de tais fatores de crescimento, fatores de diferenciação de célula B/T, fatores de crescimento de célula B/T, citocinas mitogênicas, citocinas quimiotáticas e quimiocinas, fatores de estimulação de colônia, fatores de angiogênese, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, ILl, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, ILlO, ILll, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, etc., leptina, miostatina, proteína de estimulação de macrófago, fator de crescimento derivado de plaqueta, TNF-α, TNF-β, NGF, CD4 0L, CD137L/4-1BBL, Iinfotoxina-β humana, G-CSF, MCSF, GM-CSF, PDGF, IL-la, ILl-β, IP-10, PF4, GRO, 9E3, eritropoietina, endostatina, angiostatina, VEGF, a família de supergene de fator de crescimento transformador (TGF) inclui os fatores de crescimento beta transformantes (por exemplo, TGF-βΙ, TGF^2, TGF-p3); proteínas morfogenéticas de osso (por exemplo, BMP-I, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); fatores de crescimento Iigantes de heparina (fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)); Inibinas (por exemplo, Inibina A, Inibina B); fatores diferenciadores de crescimento (por exemplo, GDF-1); e Activinas (por exemplo, Activina A, Activina B, Activina AB).
A presente invenção também inclui um hibridoma que expressou um anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo, em que o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo ativa uma célula de apresentação de antígeno para expressar novos marcadores de superfície, secretar uma ou mais citocinas ou ambos. Exemplos não limitantes do hibridoma incluem clones 9D7-10-4, 8B4-10-2, 11C8-B7, 13B11-A8 e combinações dos mesmos.
A presente invenção também inclui um método para melhorar as respostas imunes de célula B disparando um receptor LOX-I em uma célula dendrítica com um anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo na presença de antígeno, em que uma célula B que é contatada com a célula dendrítica ativada de LOX-I aumenta a produção de anticorpo, secreta citocinas, aumenta a expressão de marcador de superfície de ativação de célula B e combinações das mesmas. As células B ativadas usando a presente invenção podem secretar IL-8, ΜΙΡ-la, IL-6, TNFa e as combinações dos mesmos, podem ser células plasmáticas, ativar células B para expressar LOX-1, e/ou ativar a célula B para aumentar a produção de IgG, IgM, IgA e combinações das mesmas.
Em outro método, a presente invenção inclui melhorar as respostas imunes de célula B acionando um receptor L0X-1 em uma Célula B com um anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo, em que a célula B aumenta a produção de anticorpo, IL-8 secretado, MIP-Ia, IL-6, TNFa e combinações dos mesmos, e/ou aumento a produção de IgG, IgM, IgA e combinações das mesmas.
A presente invenção também inclui um método para melhorar a ativação de célula T acionando um receptor LOX-I em uma célula dendrítica com um anticorpo específico de LOX-I ou fragmento e contactando uma célula T para a célula dendrítica ativada de LOX-1, em que a ativação de célula T é melhorada. As células dendríticas podem ser contatadas com GM-CSF e IL-4, Interferon alfa, antígeno e combinações dos mesmos e causar a ativação de células T CD8+. Em uma modalidade, as células T proliferam sob exposição às células dendríticas ativadas com anticorpos anti-LOX-1 ou fragmentos dos mesmos.
A presente invenção também inclui uma imunoglobulina anti-LOX-1 ou porção da mesma que é secretada de células mamíferas e um antígeno ligado à imunoglobulina, em que a imunoglobulina tem como alvo o antígeno para as células de apresentação de antígeno. A imunoglobulina pode incluir um ou mais domínios específicos de antígeno selecionado de um anticorpo de comprimento inteiro, um domínio de região variável de anticorpo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2, e fragmento Fv, e fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fe. O anticorpo ou fragmentos do mesmo pode ser usado para produzir uma vacina que inclui uma célula dendrítica ativada com um anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo.
A presente invenção também inclui o uso de agentes que acoplam o receptor LOX-I em células imunes, sozinhos ou com agentes de co-ativação, a combinação ativando células de apresentação de antígeno para aplicações terapêuticas; uso de um agente de ligação de LOX-I ligado a um ou mais 5 antígenos, com ou sem agentes de ativação, em células imunes para fazer uma vacina; uso de agentes anti-LOX-1 como agentes de co-ativação de células imunes para aumentar as respostas imunes direcionadas através de um receptor de superfície celular diferente de LOX-I expresso em células 10 imunes; uso de seqüências de região V de anticorpo antiLOX-1 capazes de ligar a e ativar células imunes através do receptor L0X-1 e/ou uso de agentes de ligação de DC-LOX-I ligados a um ou mais agentes tóxicos para finalidades terapêuticas no contexto de doenças conhecidas ou 15 suspeitadas em resultar de ativação imprópria de células imunes através de LOX-I no contexto de células ou tecidos patogênicos que expressam L0X-1.
A presente invenção também inclui um carreador de rAb modular que inclui um domínio de ligação de anticorpo específico de L0X-1 ligado a um ou mais domínios de carreador de antígeno que compreendem uma metade de um par de ligação de coesina-doquerina. 0 domínio de ligação antígeno específico do rAb incluirá pelo menos uma porção de um anticorpo, por exemplo, o domínio de ligação antígeno específico pode incluir pelo menos uma porção de um anticorpo em uma proteína de fusão com um meio do par de ligação de coesina-doquerina. 0 rAb pode incluir uma metade complementar do par de ligação coesina-doquerina ligado a um antígeno que forma um complexo com o carreador de rAb modular ou a uma metade complementar do par de ligação coesina-doquerina que é uma proteína de fusão com um antígeno. 0 domínio específico de antígeno pode ser um anticorpo de comprimento inteiro, um domínio de região variável de anticorpo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2, e fragmento Fvl e fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fe.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Para uma compreensão mais completa das características e vantagens da presente invenção, referência é agora feita à descrição detalhada da invenção junto com as figuras acompanhantes nas quais:
As Figuras IA, IB e IC. Ambas DCs cultivada in vivo e in vitro expressam LOX-I. Figura IA; as PBMCs de doadores normais foram coradas com anti-CDllc, CD14, CD19, e CD3 com mAb anti-LOX-1. As células coradas com anticorpos individuais foram controladas para medir os níveis de expressão de LOX-1. Figura IB; os monócitos de doadores normais foram cultivados na presença de GM-CSF com IL-4 (IL-4DCs) ou IFNa (IFNDCs), e as células foram coradas com mAb anti-LOX-1. C. As DCs mielóides (Lin-HLADR+CDllc+CD123-) foram purificadas do sangue por um separador de FACS, e coradas com mAb anti-LOX-1.
A Figura IC mostra a ordem crescente de ligação 15C4> 10F9> 1G6>> anti-LOX-1 comercial em capturar o ectodomínio de LOX-I em solução. 15C4-10-1 e 15C4.1 são duas preparações independentes de anticorpo de dois sub-clones do hibridoma 15C4 inicial.
As Figuras 2A e 2B mostram que os mAbs Anti-LOX-1 ativam as DCs. As IFNDCs foram cultivadas nas placas revestidas com clones diferentes de mAbs por 18 H. Figura 2Α; as células foram coradas com anti-CD86. Figura 2B; os sobrenadantes de cultura foram analisados para medir as citocinas e quimiocinas por Luminex.
As Figuras 3A e 3B mostram que os mAbs anti-LOX-1 5 ativam as DCs. Figura 3A; as IL-4DCS foram estimuladas com anti-LOX-1 por 24 h, e então as células foram coradas com anti-CD86 e HLA-DR. Figura 3B; as DCs mielóides foram purificadas do sangue por Seleção de FACS, e as células foram coradas com anti-CD86, CD8 0, e HLA-DR.
A Figura 4 mostra o perfil de expressão de gene para
IL-4DCS que foram estimuladas com anti-LOX-1 ou mAb controle por 10 h. O RNA total extraído com colunas de RNeasy (Qiagen), e analisado com o 2100 Bioanalyser (Agilent) . os alvos de cRNA marcados por Biotina foram preparados usando o kit de marcação preparação total Illumina (Ambion) e hibridizados por Sentrix Human6 BeadChips (46K transcrito). Estes microarranjos consistem de sondas de oligonucleotídeo de 50mer unidas aos grânulos de 3um que são alojados em micropoços gravados na superfície de uma placa de silicone. Após a coloração com Estreptavidina-Cy3, a superfície de arranjo foi varrida usando um varredor de resolução submícron fabricado por Illumina (Beadstation 500X). Um programa de software de análise de expressão de gene, GeneSpring, versão 7.1 (Agilent), foi usado para realizar a análise de dados.
As Figuras 5A e 5B mostram que as DCs ativadas com anti-LOX-1 produzem quantidades aumentadas de citocinas e quimiocinas. Em IL-4DCs cultivadas in vitro e mCDs purificadas (lxl05/200 yL) , como descritas nas Figuras IA e
3 0 IB, respectivamente, foram cultivados nas placas revestidas com mAb anti-LOX-1 (2 pg/poço) por 18 h. Os sobrenadantes de cultura foram analisados para medir a citocina e quimiocinas por Luminex.
As Figuras 6A e 6B mostram que o anticorpo anti-LOX-1 5 e ligante CD40 entram sinergia para ativar as DCs. As IL4DCs (2xl05/200 pL/poço) foram cultivadas em placas de 96 poços revestidas com anti-LOX-1 na presença ou ausência de CD4 0L solúvel (20 ng/ml) por 18 h. Os mAbs de controle foram também testados. Após 18 h, as células foram coradas 10 com anti-CD83 e os sobrenadantes de cultura foram analisados para medir citocinas e quimiocinas por Luminex.
As Figuras 7A a 7F mostram que LOX-I expresso nas DCs contribui para melhoras as respostas imunes humorais. As DCs GM/IL-4 de seis dias, 5xl03/poço, foram incubadas em placas de 96 poços revestidas com anti-LOX-1 ou mAbs de controle por 16-18 h, e então IxlO5 de células B CD19+ autólogas coradas com CFSE foram co-cultivadas na presença de 2 0 unidades/ml de IL-2 e 50 nM de CpG. A Figura 7 A mostra a coloração seis dias de células coradas com anticorpos fluorescentemente marcados. As células CD3+ e 7- AAD+ foram controladas. As células de CD38+ e CFSE' foram purificadas por um separador FACS e a coloração de Giemsa foi realizada. A Figura 7B mostra os sobrenadantes de cultura no dia treze analisados para IgM total por sanduíche ELISA. A Figura 7C mostra as DCs que foram pulsadas com 5 moi de vírus influenza inativado por calor (PR8), e cultivado com células B. O sobrenadante de cultura foi analisado para imunoglobulinas específicas de influenza (Igs) no dia treze. A Figura 7D mostra os resultados de 5xl05 PBMCs marcadas por CFSE dos revestimentos de camada que foram cultivados em placas revestidas de mAb com (painéis inferiores) ou sem (painéis superiores) 50 nM de CpG. As células foram coradas com anti-CD38 no dia sete. As células CD3+ e 7-AAD+ foram controladas. A Figura 7E mostra 5 que os sobrenadantes de cultura da cultura de PBMCs foram analisados para medir a Igs total por ELISA no dia treze. A Figura 7F são os resultados das DCs GM/IL-4 de seis dias cultivadas em placas revestidas por mAb por 48 h, e níveis de expressão de APRIL foram determinados por coloração 10 intracelular das células. As linhas pontilhadas são células coradas com o anticorpo de controle. As linhas finas e grossas representam as células incubadas nas placas revestidas com anti-LOX-I ou mAbs de controle, respectivamente. Os dados são representativos de dois 15 experimentos separados usando células de três doadores normais diferentes cada vez.
As Figuras 8A a 8C mostram que LOX-I expresso em células B contribui para a ativação de célula B e produção de imunoglobulina. A Figura 8A mostra que as PBMCs de revestimentos de camada foram coradas com anti-CD19, antiCD3, e anti-LOX-I ou mAbs de controle. As células CD19+ foram controladas e os níveis de expressão das moléculas em células B CD19+ foram medidos pelo citometria de fluxo. A Figura 8B mostra as células B CD19+ que foram cultivadas em placas revestidas com mAbs por 16-18 h, e então os sobrenadantes de cultura foram analisados para citocinas e quimiocinas por Luminex. A Figura 8C que mostra IxlO5 de células B CD19+ foram cultivadas em placas revestidas com os mAbs por treze dias. Os níveis totais de Ig foram 3 0 medidos por ELISA. Os dados são representativos de dois experimentos repetidos usando células de três doadores normais diferentes.
As Figuras 9A a 9D mostram que LOX-I expresso nas DCs, contribui para respostas imunes celulares melhoradas. A Figura 9A mostra que 5xl03 de DCs GM/IL-4 de seis dias foram cultivadas em placas revestidas com anti-LOX-I ou mAbs de controle por 16-18 h, e então as células T alogênicas purificadas foram co-cultivadas. As células foram pulsadas com 3[H]-timidina, 1 uCi/poço, por 18 h antes de colher. A captação de 3[H]-timidina foi medida pelo b-contador. As Figuras 9B e 9C mostram que DCs GM/IL-4 de seis dias (5xl03/poço) foram incubadas em placas revestidas com os mAbs na presença 20 uM de peptídeo Mart-I (A) ou 27 pg/ml de proteína de fusão recombinante de Mart-I (B) por 16 H. 2xl06 de células T CD8 autólogas purificadas foram co-cultivadas por dez dias. No dia dois, 20 unidades/ml de IL-2 e 10 unidades/ml de IL-7 foram adicionadas à cultura. As células foram coradas com antiCD8 e tetrâmero Mart-I. A Figura 9C mostra 5xl05 PBMCs de revestimentos de camada que foram cultivados com 0,1 uM de peptídeo Flu Ml em placas revestidas com os mAbs por uma semana. As células foram coradas com anti-CD8 e tetrâmero Flu Ml. D. As IL-4DCS foram carregadas com 10 ou 1 nM de anti-LOX-I-Flu Ml ou proteína de fusão de Ig-Flu Ml de controle por 2 h. 2xl0s células T CD8 autólogas purificadas foram co-cultivadas por 7 dias. As células foram coradas com anti-CD8 e o tetrâmero específico de Flu Ml.
A Figura 10 mostra que PBMC de primatas não humanos (Cynomolgus) foi corada com mAb anti-LOX-I e anticorpos 3 0 para marcadores de superfície celular. A Figura 11 mostra a análise de SDS.PAGE reduzida de proteínas de fusão de antígeno de rAb típicas, incluindo anti-LOX-l.15C4.PSA, que é capaz de direcionar o antígeno específico de próstata (cinza destacado) para a superfície 5 celulars de apresentação de antígeno com a finalidade de vacinação contra o câncer de próstata.
A Figura 12 mostra que complexos de anti-LOX
1.Doc:Coh.Flu Ml liberam Flu Ml à superfície celulars CHO transfectadas com cDNA de LOX-I. 1 pg/ml (gráfico vermelho 10 preenchido) de rAb anti-LOX-1.Doc ou rAb hIgG4.Doc de controle (gráfico verde) foi incubado com Coh.Flu Ml biotinilado (2 μς/ιηΐ) por 1 h em temperatura ambiente, as células CHO transfectadas foram adicionadas e a incubação continuou por 20 min em gelo. As células foram então 15 lavadas e coradas com estreptavidina PE-marcada. As células foram então analisadas para fluorescência PE (eixo X é a intensidade). O gráfico para o complexo anti-LOX-1.Doc versus células CHO não transfectadas é mostrado em amarelo.
A Figura 13 mostra a coloração de mAb anti-LOX-1 de 20 uma seção da amígdala humana. As células coradas de vermelho são populações específicas de células carregando LOX-I na área envolvente dos centros germinais. Isto e outra coloração de tecido com mAbs anti-LOX-I revelaram que as células de tecido muito específicas no corpo humano 25 expressam LOX-I. Tais métodos podem ser usados para mostrar que os mAbs se desenvolveram para, por exemplo, direcionar antígenos que são específicos e células carregando LOX-I que estão presentes no corpo, alvos prontos para agentes anti-LOX-I terapêuticos.
3 0 As Figuras 14A e 14B mostram o retorno mucoso de células B por DCs ativadas com mAb anti-LOX-1.
A Figura 15 mostra que mAb anti-LOX-1 contribuem para a produção melhorada de IgAl e IgA2.
A Figura 18 mostra que uma vacina anti-LOX-1 pode provocar respostas imunes específicas de subconjunto de DC.
A Figura 19 mostra a reatividade cruzada de anticorpos anti-LOX-1 para LOX-I de macaco.
A Figura 20 mostra um alinhamento de Clustal W das quatro variantes de seqüências de (5U1-5U4) macacos com LOX-I humano.
As Figuras 21A à 21D mostram que os antígenos liberados através do resultado de LOX-I em respostas de célula T CD4 específicas de antígeno.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Enquanto a fabricação e uso de várias modalidades da
presente invenção são discutidos em detalhe abaixo, deve-se apreciar que a presente invenção fornece muitos conceitos inventivos aplicáveis que podem ser incorporados em uma ampla variedade de contextos específicos. As modalidades 20 específicas discutidas aqui são meramente ilustrativas de maneiras específicas para fazer e usar a invenção e não limitam o escopo da invenção.
Para facilitar a compreensão desta invenção, vários termos são definidos abaixo. Os termos definidos aqui têm 25 significados como geralmente compreendidos por uma pessoa de habilidade ordinária nas técnicas relevantes à presente invenção. Os termos tais como "um", "uma" e "a/o" não são pretendidos referir a somente uma entidade singular, mas incluem a classe geral da qual um exemplo específico pode 30 ser usado para ilustração. A terminologia aqui é usada para descrever modalidades específicas da invenção, mas seu uso não limita a invenção, exceto como destacado nas reivindicações.
Como usado aqui, o termo "carreador de rAb modular" é 5 usado para descrever um sistema de anticorpo recombinante que tenha sido projetado para fornecer a adição modular controlada de antígenos diversos, proteínas de ativação, ou outros anticorpos a um único anticorpo monoclonal recombinante (mAb), neste caso, um anticorpo monoclonal 10 anti-LOX-1. O rAb pode ser um anticorpo monoclonal feito usando técnicas de hibridoma padrão, exibição de anticorpo recombinante, anticorpos monoclonais humanizados e similares. O carreador de rAb modular pode ser usado para, por exemplo, direcionar (através de um anticorpo 15 recombinante primário contra um receptor de internalização, por exemplo, um receptor de célula dendrítica humana) antígenos múltiplos e/ou antígenos e uma citocina de ativação para células dendríticas (DC) . O carreador de rAb modular pode também ser usado para unir dois mAbs
2 0 recombinantes diferentes extremidade a extremidade em uma
maneira controlada e definida.
A porção de ligação de antígeno do "carreador de rAb modular" pode ser um ou mais domínios variáveis, um ou mais domínios variáveis e o primeiro domínio constante, um 25 fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2í e fragmento Fv7 e fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fc as quais as porções de ligação modulares cognatas são adicionadas e/ou ligadas à seqüência de aminoácido. O anticorpo para uso no carreador de rAb
3 0 modular pode ser de qualquer isotipo ou classe, subclasse ou de qualquer fonte (animal e/ou recombinante).
Em um exemplo não limitante, o carreador de rAb modular é projetado para ter um ou mais domínios de proteína coesina-doquerina modulares para fazer complexos 5 de proteína específicos e definidos no contexto de mAbs recombinante projetados. O mAb é uma porção de uma proteína de fusão que inclui um ou mais carbóxi domínios de proteína coesina-doquerina modular dos domínios de ligação de antígeno do mAb. Os domínios de proteína coesina-doquerina 10 podem ser unidos pós-translacionalmente, por exemplo, usando ligantes de cruzamento químicos e/ou ligação de bissulfeto.
O termo "antígeno" como usado aqui refere-se a uma molécula que pode iniciar uma resposta imune celular e/ou 15 humoral em um receptor do antígeno. 0 antígeno pode ser usado em dois contextos diferentes com a presente invenção: como um alvo para o anticorpo ou outro domínio de reconhecimento de antígeno do rAb ou como a molécula que é carregada e/ou em uma célula ou alvo pelo rAb como parte de
2 0 um complemento de molécula doquerina/coesina ao carreador
de rAb modular. O antígeno é geralmente um agente que causa uma doença para a qual uma vacinação seria um tratamento vantajoso. Quando o antígeno é apresentado em MHC, o peptídeo é frequentemente de aproximadamente 8 a 25 aproximadamente 25 aminoácidos. Os antígenos incluem qualquer tipo de molécula biológica, incluindo, por exemplo, metabólitos intermediários simples, açúcares, lipídios e hormônios, bem como macromoléculas, tais como carboidratos complexos, fosfolipídios, ácidos nucléicos e proteínas. As
3 0 categorias comuns de antígenos incluem, mas não são limitadas a, antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, protozoários e outros antígenos parasíticos, antígenos de tumor, antígenos envolvidos na doença auto-imune, alergia e rejeção de enxerto, e outros antígenos variados.
0 carreador de rAb modular é capaz de carregar qualquer número de agentes ativos, por exemplo, antibióticos, agentes antiinfecciosos, agentes antivirais, agentes antitumorais, antipiréticos, analgésicos, agentes 10 antiinflamatórios, agentes terapêuticos para osteoporose, enzimas, citocinas, anticoagulantes, polissacarídeos, colágeno, células, e combinações de dois ou mais dos agentes ativos antecedentes. Os exemplos de antibióticos para liberação usando a presente invenção incluem, sem 15 limitação, tetraciclina, aminoglicosídeos, penicilina, cefalosporinas, fármacos de sulfonamida, succinato de sódio de clorafenicol, eritromicina, vancomicina, lincomicina, clindamicina, nistatina, anfotericina B, amantidina, idoxuridina, ácido p-aminosalicílico, isoniazida, rifampina, 20 antinomicina D, mitramicina, daunomicina, adriamicina, bleomicina, vinblastina, vincristina, procarbazina, carboxamida imidazol, e similares.
Os exemplos de agentes antitumor para liberação usando a presente invenção incluem, sem limitação, doxorubicina, Daunorubicina, taxol, metotrexato, e similares. Os exemplos de antipiréticos e analgésicos incluem aspirina, Motrin®, Ibuprofeno®, naprosima, acetaminofeno, e similares.
Os exemplos de agentes antiinflamatórios para liberação usando a presente invenção incluem, sem limitação, NSAIDS, aspirina, esteróides, dexametasona, hidrocortisona, prednisolona, diclofenaco de sódio, e similares.
Os exemplos de agentes terapêuticos para tratar osteoporose e outros fatores atuando no osso e esqueleto incluem para liberação usando a presente invenção, sem 5 limitação, cálcio, alendronato, peptídeo de GLa de osso, hormônio da paratireóide e seus fragmentos ativos, formação de osso relacionado à histona H4 e peptídeo de proliferação e mutações, derivados e análogos dos mesmos.
Os exemplos des enzimas e cofatores de enzima para liberação usando a presente invenção incluem, sem limitação, pancrease, L-asparaginase, hialuronidase, quimotripsina, tripsina, tPA, estreptoquinase, uroquinase, pancreatina, colagenase, tripsinogênio, quimiotripsinogênio,
plasminogênio, estreptoquinase, adenil ciclase, dismutase superóxido (SOD), e similares.
Os exemplos de citocinas para liberação usando a presente invenção incluem, sem limitação, interleucinas, fatores de crescimento transformadores (TGFs), fatores de crescimento de fibroblasto (FGFs), fatores de crescimento
2 0 derivados de plaqueta (PDGFs), fatores de crescimento epidérmico (EGFs), peptídeos ativados de tecido conectivo (CTAPs), fatores osteogênicos, e análogos biologicamente ativos, fragmentos, e derivados de tais fatores de crescimento. As citocinas podem ser fatores de 25 diferenciação de célula B/T, fatores de crescimento de célula B/T, citocinas mitogênicas, citocinas quimiotáticas, fatores de estimulação de colônia, fatores de angiogênese,
IFN-Oi, IFN-β, IFN-Y, ILl, IL2 , IL3 , IL4 , IL5 , IL6 , IL7 , IL8 , IL9, ILlO, ILll, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, etc., leptina, miostatina, proteína de estimulação de macrófago, fator de crescimento derivado de plaqueta, TNF-oí, TNF-β, NGF, CD4 0L, CD137L/4-1BBL, Iinfotoxina-β humana, GCSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF, IL-Ια, β de ILl-, IP-IO, PF4, GRO, 9E3, eritropoietina, endostatina, angiostatina, VEGF ou 5 quaisquer fragmentos ou combinações dos mesmos. Outras citocinas incluem membros da família de supergene de fator de crescimento transformador (TGF) que incluem fatores de crescimento beta transformantes (por exemplo TGF-βΐ, TGF-β2, TGF-β3); proteínas morfogenéticas de osso (por exemplo, 10 BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); fatores de crescimento ligante de heparina (por exemplo, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento 15 semelhante à insulina (IGF)); Inibinas (por exemplo, Inibina A, Inibina B) ; fatores de diferenciação de crescimento (por exemplo, GDF-1); e Activinas (por exemplo, Activina A, Activina B, Activina AB).
Os exemplos de fatores de crescimento para liberação usando a presente invenção incluem, sem limitação, os fatores de crescimento que podem ser isolados de fontes nativas ou naturais, tais como células de mamífero, ou podem ser preparados sinteticamente, tais como por técnicas de DNA recombinante ou por vários processos químicos. Além disso, os análogos, fragmentos, ou derivados destes fatores podem ser usados, contanto que exibam pelo menos alguma das atividades biológicas da molécula nativa. Por exemplo, os análogos podem ser preparados pela expressão de genes alterados pela mutagênese específica de sítio ou outras técnicas de engenharia genética. Os exemplos de anticoagulantes para liberação usando a presente invenção incluem, sem limitação, varfarina, heparina, Hirudina, e similares. Os exemplos de fatores atuando no sistema imune incluem para liberação usando a 5 presente invenção, sem limitação, os fatores que controlam a inflamação e neoplasmas malignos e fatores que atacam microrganismos infecciosos, tais como peptídeos quimiotácticos e bradicininas.
Os exemplos de antígenos virais incluem, mas não são 10 limitados a, por exemplo, antígenos retrovirais, tais como antígenos retrovirais dos antígenos de vírus da imunodeficiência humana (HIV), tais como produtos dos genes gag, pol, e env, a proteína Nef, transcriptase reversa, e outros componentes de HIV; antígenos virais de hepatite, 15 tais como proteínas S, M, e L de vírus de hepatite Β, o antígeno pre-S de vírus de hepatite B, e outra hepatite, por exemplo, hepatite A, B, e C, componentes virais, tais como RNA viral de hepatite C; antígenos virais de influenza, tais como hemaglutinina e neuraminidase e outros 20 componentes virais de influenza; antígenos virais de sarampo, tais como a proteína de fusão de vírus de sarampo e outros componentes de vírus de sarampo; antígenos virais de rubéola, tais como as proteínas El e E2 e outros componentes de vírus de rubéola; antígenos de rotavírus,
2 5 tais como VP7sc e outros componentes de rotavírus;
antígenos citomegalovírus, tais como glicoproteína B de envelope e outros componentes de antígeno de citomegalovírus; antígenos de vírus sincicial respiratório, tais como proteína de fusão RSV, proteína M2 e outros
3 0 componentes de antígeno de vírus sincicial respiratório; antígenos de vírus simplex de herpes, tais como proteínas precoces imediatas, glicoproteína D, e outros componentes de antígeno de vírus simplex de herpes; antígenos virais de varicela zoster, tais como gpl, gpll, e outros componentes 5 de antígeno virais de varicela zoster; antígenos de vírus de encefalite japonesa, tais como proteínas E, M-E, M-E-NS1, NSl, NS1-NS2A, 80% E, e outros componentes de antígeno virais de encefalite Japonesa; antígenos virais de raiva, tais como glicoproteína de raiva, nucleoproteína de raiva e
outros componentes de antígeno viral de raiva. Veja Fundamental Virology, Segunda Edição, eds. Fields, B.N. e Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991) para exemplos adicionais de antígenos virais.
Os alvos antigênicos que podem ser liberados usando as
vacinas de antígeno rAb-DC/DC da presente invenção incluem os genes que codificam antígenos, tais como antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos ou antígenos parasíticos. Os vírus incluem picornavírus, coronavírus, togavírus, flavivírus, rabdovírus,
2 0 paramixovírus, ortomixovírus, buniavírus, arenavírus,
reovírus, retrovírus, papilomavírus, parvovírus,
herpesvírus, poxvírus, hepadnavírus, e vírus espongiforme. Outros alvos virais incluem influenza, vírus simplex de herpes 1 e 2, sarampo, dengue, varíola, poliomielite ou HIV.
Os patógenos incluem tripanossomas, tênias, lombrigas, helmintos, malária. Os marcadores de tumor, tais como antígeno fetal ou antígeno específico de próstata, podem ser encontrados desse modo. Outros exemplos incluem: env proteínas de HIV e antígeno de superfície de hepatite B. A
3 0 administração de um vetor de acordo com a presente invenção para finalidades de vacinação exigiria que os antígenos associados ao vetor fossem suficientemente não imunogênicos para permitir a expressão a longo prazo do transgene, para o qual uma resposta imune forte seria desejada. Em alguns 5 casos, a vacinação de um indivíduo pode somente ser exigida infrequentemente, como anualmente ou bienalmente, e fornece proteção imunológica a longo prazo contra o agente infeccioso. Os exemplos específicos de organismos, alérgenos e seqüências nucléicas e amino para uso em 10 vetores e finalmente como antígenos com a presente invenção podem ser encontrados na patente US N°. 6.541.011, porções relevantes incorporadas aqui por referência, em particular, as tabelas que combinam organismos e seqüências específicas que podem ser usadas com a presente invenção.
Os antígenos bacterianos para uso com a vacina de rAb
divulgada aqui incluem, mas não são limitados a, por exemplo, antígenos bacterianos, tais como toxina de coqueluche, hemaglutinina filamentosa, pertactina, FIM2, FIM3, adenilato ciclase e outros componentes de antígeno bacteriano de coqueluche; antígenos bacterianos de difteria, tais como toxina ou toxõide de difteria e outros componentes de antígeno bacteriano de difteria; antígenos bacterianos de tétano, tais como toxina ou toxóide de tétano e outros componentes de antígeno bacteriano de tétano; antígenos bacterianos de estreptococus, tais como proteínas M e outros componentes de antígeno bacteriano de estreptococus; antígenos bacterianos de bacilos gram negativos, tais como lipopolissacarídeos e outros componentes de antígeno bacteriano gram negativo, antígenos bacterianos de tuberculose de Mycobacterium, tais como ácido micólico, proteína de choque de calor 65 (HSP65), a proteína secretada principal de 3 0 kDa, antígeno 85A e outros componentes de antígeno de micobactéria; componentes de antígeno bacteriano de Helicobacter pylori; antígenos 5 bacterianos pneumocóccicos, tais como pneumolisina, polissacarídeos capsulares pneumocóccicos e outros componentes de antígeno bacteriano pneumocóccico; antígenos bacterianos de Haemophilus influenza, tais como polissacarídeos capsulares e outros componentes de antígeno
bacteriano de Haemophilus influenza; antígenos bacterianos de antraz, tais como antígeno protetor de antraz e outros componentes de antígeno bacteriano de antraz; antígenos bacterianos de rickettsiae, tais como rompA e outro componente de antígeno bacteriano de rickettsiae. Também
são incluídos dentro dos antígenos bacterianos descritos aqui quaisuqer outros antígenos bacterianos,
micobacterianos, micoplasmais, de rickettsia, ou de clamidia. Os patógenos parciais ou inteiros podem também ser: Haemophilus influenza; Plasmodium falciparum;
2 0 Neisseria meningitidis; Streptococcus pneumoniae; Neisseria
gonorrhoeae; salmonelas serotipo typhi; Shigella; vibrião da cólera; Febre de dengue; Encefalites; Encefalite japonesa; doença de Iyme; Yersinia pestis; vírus do Nilo ocidental; febre amarela; tularemia; hepatite (viral;
bacteriana); RSV (vírus sincicial respiratório); HPIV 1 e HPIV 3; vírus adenóide; varíola; alergias e cânceres.
Os antígenos fúngicos para uso com composições e métodos da invenção incluem, mas não são limitados a, por exemplo, componentes de antígeno fúngico de candida;
3 0 antígenos fúngicos de histoplasma, tais como proteína de choque de calor 60 (HSP60) e outros componentes de antígeno fúngico de histoplasma; antígenos fúngicos de cryptococcus, tais como polissacarídeos capsulares e outros componentes de antígeno fúngico cryptococcus; antígenos fúngicos de 5 coccidiodes, tais como antígenos de spherule e outros componentes fúngicos de antígeno de coccidiodes; e antígenos fúngicos de tinea, tais como tricófitos e outros componentes de antígeno fúngico de coccidiodes.
Os exemplos de antígenos de protozoários e outros parasíticos incluem, mas não são limitados a, por exemplo, antígenos de Plasmodium falciparum, tais como antígenos de superfície de merozóito, antígenos de superfície de esporozóito, antígenos de circumesporozóito, antígenos de superfície de gameta/gametócito, antígeno de estágio de sangue pf 155/RESA e outros componentes de antígeno de plasmódio; antígenos de toxoplasma, tais como SAG-1, p3 0 e outros componentes de antígeno de toxoplasma; antígenos de esquistossoma, tais como glutationa-S-transferase, paramiosina, e outros componentes de antígeno de esquistossoma; antígenos de leishmania principal e outras leishmanias, tais como gp63, lipofosfoglicano e sua proteína associada e outros componentes de antígeno de leishmania; e antígenos de trypanosoma cruzi, tais como antígeno de 75-77 kDa, antígeno de 56 kDa e outros componentes de antígeno de trypanosoma.
O antígeno que pode ser encontrado usando o rAb da presente invenção será geralmente selecionado baseado em um número de fatores, incluindo: probabilidade de internalização, nível de especificidade de célula imune, tipo de célula imune encontrada, nível de maturidade e/ou ativação de célula imune e similares. Os exemplos de marcadores de superfície celular para células dendríticas incluem, mas não são limitados a, MHC classe I, MHC classe
II, B7-2, CDl8, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, CD54, CD58,
CD8 3, CD8 6, CMRF-44, CMRF-56, DCIR e/ou DECTIN-I e similares; em alguns casos também tendo a ausência de CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD56, e/ou CD57. Os exemplos de marcadores de superfície celular para células de apresentação de antígeno incluem, mas não são 10 limitados a, MHC classe I, MHC classe II, CD40, CD45, B7-1, B7-2, receptor de IFN-γ e receptor de IL-2, receptor de ICAM-I e/ou Fcy. Os exemplos de marcadores de superfície celular para células T incluem, mas não são limitados a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CDllb, CD16, CD45 e HLA-DR.
Os antígenos alvo em superfícies celulares para
liberação incluem aqueles característicos de antígenos de tumor que tipicamente serão derivados da superfície celular, citoplasma, núcleo, organelas e similares de células de tecido de tumor. Os exemplos de alvos de tumor para a porção de anticorpo da presente invenção incluem, sem limitação, cânceres hematológicos, tais como leucemias e Iinfomas, tumores neurológicos, tais como astrocitomas ou glioblastomas, melanoma, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer decabeça e garganta, tumores gastrintestinais, tais como gástrico ou câncer de cólon, câncer de fígado, câncer pancreático, tumores genitourinário, tal como cérvix, útero, câncer ovariano, câncer vaginal, câncer testicular, câncer de próstata ou câncer peniâno, tumores de osso, tumores vasculares, ou cânceres do lábio, nasofaringe, faringe e cavidade oral, esôfago, reto, vesícula biliar, árvore biliar, laringe, pulmão e brônquio, bexiga, rim, cérebro e outras partes do sistema nervoso, tireóide, doença de Hodgkin, Iinfoma não Hodgkin, mieloma múltiplo e leucemia.
Os exemplos de antígenos que podem ser liberados 5 sozinhos ou em combinação para células imunes para a apresentação de antígeno usando a presente invenção incluem proteínas de tumor, por exemplo, oncogenes mutados; proteínas virais associadas com tumores; e mucinas e glicolipídios de tumor. Os antígenos podem ser proteínas 10 virais associadas com tumores seriam aqueles das classes de vírus notadas acima. Determinados antígenos podem ser característicos de tumores (um subconjunto sendo proteínas não geralmente expressas por uma célula precursora de tumor), ou podem ser uma proteína que é normalmente 15 expressa em uma célula de precursor de tumor, mas tendo uma mutação característica de um tumor. Outros antígenos incluem variantes mutantes da proteína normal tendo uma atividade alterada ou uma distribuição subcelular, por exemplo, mutações de genes gerando antígenos de tumor.
Os exemplos não limitantes específicos de antígenos de
tumor incluem: CEA, antígeno específico de próstata (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 e 12, MUC (Mucina) (por exemplo, MUC-1, MUC-2, etc.), GM2 e GD2 gangliosídeos, ras, myc, tirosinase, MART (antígeno de melanoma), Pmel 17 25 (gplOO), seqüência V de íntron GnT-V (seqüência V de íntron V de N-acetilglucoaminiltransferase V) , Próstata Ca psm, PRAME (antígeno de melanoma), β-catenina, MUM-I-B (produto de gene mutado ubiquitoso de melanoma), GAGE (antígeno de melanoma) I, BAGE (antígeno de melanoma) 2-10, C-ERB2 30 (Her2/neu), EBNA (antígeno nuclear de vírus de Epstein-Barr) 1-6, gp75, vlrus de papiloma humano (HPV) E6 e E7, p53, proteína de resistência de pulmão (LRP), Bcl-2, e Ki-67. Além disso, a molécula imunogenênica pode ser um autoantígeno envolvido na iniciação e/ou propagação de uma doença auto-imune, a patologia da qual é largamente devida à atividade de anticorpos específicos para uma molécula expressa pelo órgão alvo, tecido, ou células relevantes, por exemplo, SLE ou MG. Em tais doenças, pode ser desejável direcionar uma resposta imune mediada por anticorpo em curso (isto é, um tipo Th2) ao autoantígeno relevante para uma resposta imune celular (isto é, um Thl-tipo). Alternativamente, pode ser desejável prevenir o início de ou diminuir o nível de uma resposta de Th2 ao autoantígeno em um indivíduo não tendo, mas quem é suspeito de ser suscetível a, a doença auto-imune relevante por profilaticamente induzir uma resposta Thl ao autoantígeno apropriado. Autoantígenos de interesse incluem, sem limitação: (a) com relação à SLE, proteína de Smith, ribonucleoproteína RNP, e proteínas SS-A e SS-B; e (b) com relação à MG, o receptor de acetilcolina. Os exemplos de outros antígenos variados envolvidos em um ou mais tipos de resposta auto-imune incluem, por exemplo, hormônios endógenos, tais como hormônio luteinizante, hormônio de estimulação folicular, testosterona, hormônio de crescimento, prolactina, e outros hormônios.
Os antígenos envolvidos em doenças autoimunes, alergia, e rejeição de enxerto podem ser usados nas composições e métodos da invenção. Por exemplo, um antígeno envolvido em quaisquer uma ou mais das seguintes doenças ou distúrbios
3 0 autoimunes pode ser usado na presente invenção: diabetes, diabetes mellitus, artrite (incluindo artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteodistrofia, artrite psoriática), esclerose múltipla, miastenia gravis, eritematose de lúpus sistêmico, tireoidite auto-imune,
dermatite (incluindo dermatite atópica e dermatite eczematosa), psoríase, síndrome de Sjogren, incluindo cerato-conjuntivite seca secundária à síndrome de Sjogren, alopecia areata, respostas alérgicas devido às reações de mordida de artrópode, doença de Crohn, úlcera aftosa, irite, 10 conjuntivite, cerato-conjuntivite, colite pLcerosa, asma, asma alérgica, eritematoses de lúpus cutaneous, escleroderma, vaginite, proctite, erupções de fármaco, reações de reversão leprasa, eritema nodoso leproso, uveíte auto-imune, encefalomielite alérgica, encefalopatia 15 hemorrágica necrozante aguda, perda de audição neurossensorial progressiva bilateral idiopática, anemia aplásica, anemia de célula vermelha pura, thrombocitopenia idiopática, policondrite, granulomatose de Wegener, hepatite ativa crônica, síndrome de Stevens-Johnson, 20 sangramento idiopático, liquen plano, doença de Crohn, oftalmopatia de Graves, sarcoidose, cirrose biliar primária, uveíte posterior, e fibrose de pulmão intersticial. Os exemplos de antígenos envolvidos na doença auto-imune incluem ácido glutâmico decarboxilase 65 (GAD 65), DNA 25 nativo, proteína básica de mielina, proteína de proteolipídio de mielina, componentes de receptor de acetilcolina, tiroglobulina, e o receptor de hormônio estimulante de tireóide (TSH). Os exemplos de antígenos envolvidos na alergia incluem antígenos de pólen, tais como
3 0 antígenos de pólen de cedro japonês, antígenos de pólen de ambrosia, antígenos de pólen de grama de centeio, antígenos derivados de animal, tais como antígenos de ácaro de poeira e antígenos de felinos, antígenos de histocompatibilidade, e penicilina e outras fármacos terapêuticos. Os exemplos de 5 antígenos envolvidos na rejeição de enxerto incluem componentes antigênicos do enxerto a ser enxertado no receptor de enxerto, tal como coração, pulmão, fígado, pâncreas, rim, e componentes de enxerto neural. O antígeno pode ser um ligante de peptídeo alterado útil em tratar uma 10 doença auto-imune.
Como usado aqui, o termo "epítopo(s)" refere-se a um antígeno de peptídeo ou proteína que inclui uma estrutura primária, secundária ou terciária similar a um epítopo localizado dentro de vários polipeptídeos de patógeno 15 codificados pelo DNA ou RNA de patógeno. O nível de similaridade será geralmente a tal grau que os anticorpos monoclonais ou policlonais direcionados contra a tais polipeptídeos também ligarão, reagir com, ou reconhecer de outra maneira, o peptídeo ou antígeno de proteína. Vários
2 0 métodos de imunoensaio podem ser empregados conjuntamente
com tais anticorpos, como, por exemplo, Western blotting, ELISA, RIA, e similares, que são conhecidos aos de habilidade na técnica. A identificação de epítopos de patógeno, e/ou seus equivalentes funcionais, apropriados 25 para uso em vacinas é parte da presente invenção. Uma vez isolado e identificado, um pode prontamente obter equivalentes funcionais. Por exemplo, pode-se empregar os métodos de Hopp, como ensinado em Pat US. N°. 4.554.101, incorporada aqui por referência, que ensina a identificação
3 0 e preparação de epítopos das seqüências de aminoácido na base de hidrofobicidade. Os métodos descritos em diversos outros papéis, e programas de software baseados no mesmo, podem também ser usado para identificar seqüências de núcleo epitópico (veja, por exemplo, Jameson e Wolf, 1988;
Wolf e col. , 1988; Pat. US N°. 4.554.101). A seqüência de aminoácido destas "seqüências de núcleo epitópico" pode então ser prontamente incorporada em peptídeos, através da aplicação de síntese de peptídeo ou tecnologia recombinante, A preparação de composições de vacina incluindo os ácidos nucléicos que codificam antígenos da invenção como o ingrediente ativo, pode ser preparada como injetável, como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas apropriadas para solução, ou suspensão, em líquido antes da infecção podem também ser preparadas. A preparação pode ser emulsificada, encapsulada em lipossomas. Os ingredientes imunogênicos ativos são frequentemente misturados com veículos que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo.
O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere
2 0 se a um veículo que não causa uma reação alérgica ou outro
efeito inconveniente em indivíduos aos quais é administrado Os veículos farmaceuticamente aceitáveis apropriados incluem, por exemplo, um ou mais de água, solução salina, solução salina tamponada de fosfato, dextrose, glicerol, 25 etanol, ou similares e combinações dos mesmos. Além disso, se desejado, a vacina pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes umidificantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, e/ou adjuvantes que melhoram a eficácia da vacina. Os exemplos de
3 0 adjuvantes que podem ser eficazes incluem, mas não são limitados q: hidróxido de alumínio, N-acetil-muramil-Ltreonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-Lalanil-D-isoglutamina, MTP-PE e RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, lipídio monofosforil A, 5 dimicolato de trehalose e esqueleto de parede celular (MPL+TDM+CWS) em uma emulsão de 2% escaleno/Tween 80. Outros exemplos de adjuvantes incluem DDA (brometo de dimetildioctadecilamônio), adjuvantes completos e incompletos de Freund e QuilA. Além disso, as substâncias 10 de modulação imunes, tais como linfocinas (por exemplo, IFN-γ, IL-2 e IL-12) ou indutor de IFN-γ sintéticos, tais como poli I: C podem ser usados em combinação com os adjuvantes descritos aqui.
Os produtos farmacêuticos que podem incluir um 15 polinucleotídeo exposto (naked polynucleotide) com cópias únicas ou múltiplas das seqüências de nucleotídeo específicas que ligam aos sítios de ligação de DNA específicos das apolipoproteínas presentes nas lipoproteínas plasmáticas como descritas na presente 20 invenção. O polinucleotídeo pode codificar um peptídeo biologicamente ativo, RNA antisenso, ou ribozima e será fornecido em uma forma administrável fisiologicamente aceitável. Outro produto farmacêutico que pode saltar da presente invenção pode incluir uma fração de lipoproteína 25 plasmática altamente purificada, isolada de acordo com a metodologia, descrita aqui do sangue dos pacientes ou outra fonte, e um polinucleotídeo contendo cópias únicas ou múltiplas das seqüências de nucleotídeo específicas que ligam aos sítios de ligação de DNA específicos das
3 0 apolipoproteínas presentes nas lipoproteínas plasmáticas, pré-ligadas à fração de lipoproteína purificada em uma forma fisiologicamente aceitável, administrável.
Contudo outro produto farmacêutico pode incluir uma fração de lipoproteína plasmática altamente purificada que contém os fragmentos de apolipoproteína recombinantes contendo cópias únicas ou múltiplas das porções de ligação de DNA específicas, pré-ligadas a um polinucleotídeo contendo cópias únicas ou múltiplas das seqüências de nucleotídeo específicas, em uma forma administrável fisiologicamente aceitável. Contudo outro produto farmacêutico pode incluir uma fração de lipoproteína plasmática altamente purificada contendo fragmentos de apolipoproteína recombinante contendo cópias únicas ou múltiplas das porções de ligação de DNA específicas, préligadas a um polinucleotídeo contendo cópias únicas ou múltiplas das seqüências de nucleotídeo específicas, em uma forma administrável fisiologicamente aceitável.
A dosagem a ser administrada depende na maior parte do peso corporal e da condição física do indivíduo sendo 20 tratado, bem como a rota de administração e frequência de tratamento. Uma composição farmacêutica que inclui o polinucleotídeo exposto pré-ligado a uma fração de lipoproteína altamente purificada pode ser administrada em quantidades variando de I pg a 1 mg de polinucleotídeo e 1 25 pg a 100 mg de proteína.
A administração de rAb e complexos de rAb a um paciente seguirá protocolos gerais para a administração de quimioterápicos, levando em consideração a toxicidade, se qualquer, do vetor. Antecipa-se que os ciclos de tratamento
3 0 seriam repetidos como necessário. Também contempla-se que várias terapias padrões, bem como a intervenção cirúrgica, podem ser aplicadas em combinação com a terapia de gene descrita.
Onde a aplicação clínica de uma terapia de gene é 5 contemplada, será necessário preparar o complexo como uma composição farmacêutica apropriada que a aplicação pretendida. Geralmente isto envolverá preparar uma composição farmacêutica que está essencialmente livre de pirogênios, bem como quaisquer outras impurezas que 10 poderiam ser prejudiciais aos humanos ou animais. Também desejará geralmente empregar sais e tampões apropriados para render o complexo estável e permitir a captação complexa por células alvo.
As composições aquosas da presente invenção podem 15 incluir uma quantidade eficaz do composto, dissolvida ou dispersada em um veículo farmaceuticamente aceitável ou em um meio aquoso. Tais composições podem também ser referidas como inóculo. O uso de tais meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é conhecido na técnica.
2 0 Exceto em tal extensão, como qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas é contemplado. Os ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. As composições da presente 25 invenção podem incluir preparações farmacêuticas clássicas. As dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e em misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições ordinárias de armazenamento e uso, estas preparações contêm um conservante para prevenir o 30 crescimento dos microrganismos. Estados de doença. Dependendo da doença particular a ser tratada, a administração de composições terapêuticas de acordo com a presente invenção será através de qualquer rota comum contanto que o tecido alvo esteja disponível 5 através dessa rota a fim de maximizar a liberação de antígeno a um local para resposta imune máxima (ou em alguns casos mínima). A administração será geralmente por injeção ortotópica, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa. Outras áreas para liberação 10 incluem: oral, nasal, bucal, retal, vaginal ou tópica. A administração tópica seria particularmente vantajosa para o tratamento de cânceres de pele. Tais composições seriam normalmente administradas como composições
farmaceuticamente aceitáveis que incluem veículos, tampões ou outros excipientes fisiologicamente aceitáveis.
As composições de vacina ou tratamento da invenção podem ser administradas parenteralmente, por injeção, por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente. As formulações adicionais que são apropriadas para outros
2 0 modos de administração incluem supositórios, e em alguns casos, formulações orais ou formulações apropriadas para a distribuição como aerossóis. No caso das formulações orais, a manipulação de subconjuntos de célula T empregando adjuvantes, empacotamento de antígeno, ou a adição de 25 citocinas individuais para várias formulações que resultam em vacinas orais melhoradas com respostas imunes otimizadas. Para supositórios, os aglutinates e veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis ou triglicerídeos; tais supositórios podem ser formados de 30 misturas contendo o ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10%, preferivelmente l%-2%. As formulações orais incluem excipientes normalmente empregados como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, estearato de magnésio de amido, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio,
5 e similares. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação prolongadas ou pós e contêm 10%-95% de ingrediente ativo, preferivelmente 25-70%.
Os ácidos nucléicos codificadores de antígeno da invenção podem ser formulados na vacina ou nas composições de tratamento como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com grupos amino livres do peptídeo) e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos, tais como acético, oxálico, tartárico, maléico, e similares. Os sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio, ou hidróxidos férricos, e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, e similares.
As composições de vacina ou tratamento são administradas em uma maneira compatível com a formulação de 25 dosagem, e em tal quantidade como será profilaticamente e/ou terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imune do indivíduo para sintetizar anticorpos, e o grau de proteção ou 3 0 tratamento desejado. As faixas de dosagem apropriadas são da ordem de várias centenas de microgramas de ingrediente ativo por vacinação com uma faixa de aproximadamente 0,1 mg a 10 0 0 mg, tal como na faixa de aproximadamente 1 mg a 300 mg, e preferivelmente na faixa de aproximadamente 10 mg a 5 50 mg. Os regimentos apropriados para administração inicial e injeções de reforço são também variáveis, mas são classificados por uma administração inicial seguida por inoculações subsequentes ou outras administrações. As quantidades precisas de ingrediente ativo exigidas para 10 serem administradas dependem do julgamento do médico e podem ser peculiares a cada indivíduo. Será aparente aos de habilidade na técnica que a quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de ácido nucléico ou polipeptídeos de fusão desta invenção dependerá, entre outras coisas, da 15 programação de administração, da unidade de dosagem de antígeno administrada, se a molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo de fusão é administrada em combinação com outros agentes terapêuticos, do status imune e saúde do receptor, e da atividade terapêutica da molécula de ácido
2 0 nucléico particular ou polipeptídeo de fusão.
As composições podem ser dadas em uma programação de dose única ou em uma programação de dose múltipla. Uma programação de dose múltipla é uma em que um curso primário de vacinação pode incluir, por exemplo, 1-10 doses 25 separadas, seguidas por outras doses dadas em intervalos de tempo subsequentes exigidos para manter e/ou reforçar a resposta imune, por exemplo, em 1-4 meses para uma segunda dose, e se necessário, uma dose subsequente após diversos meses. Os reforçadores periódicos em intervalos de 1-5 anos,
3 0 geralmente 3 anos, são desejáveis para manter os níveis desejados de imunidade protetora. 0 curso da imunização pode ser seguido por ensaios de proliferação in vitro de linfócitos sanguíneos periféricos (PBLs) co-cultivados com ESAT6 ou ST-CF, e medindo os níveis de IFN-γ liberados dos 5 linfócitos amplificados. Os ensaios podem ser realizados usando marcações convencionais, tais como radionucleotídeos, enzimas, marcadores fluorescentes e similares. Estas técnicas são conhecidas ao hábil na técnica e podem ser encontradas nas Pats. US N°. 3.791.932, 4.174.384 e 10 3.94 9.064, porções relevantes incorporadas por referência.
0 carreador de rAb modular e/ou o carreador de rAb conjugado-(coesina/doquerina e/ou doquerina-coesina)complexo de antígeno (vacina de rAb-DC/DC-antígeno) pode ser fornecido em uma ou mais "unidades de dose" dependendo 15 se os vetores de ácido nucléico são usados, as proteínas purificadas finais, ou a forma vacinai final é usada. A unidade de dosagem é definida como contendo uma quantidade predeterminada da composição terapêutica calculada para produzir as respostas desejadas em associação com sua
2 0 administração isto é, rota apropriada e regime de
tratamento. A quantidade a ser administrada, e a rota e formulação particulares, estão dentro da habilidade daqueles em técnicas clínicas. 0 indivíduo a ser tratado pode também ser avaliado, em particular, o estado do 25 sistema imune do indivíduo e a proteção desejada. Uma unidade de dosagem não precisa ser administrada como uma única injeção mas pode incluir a infusão contínua durante um período de tempo predeterminado. A unidade de dosagem da presente invenção pode pode convenientemente ser descrita
3 0 em termos de DNA/kg (ou proteína/Kg) de peso corporal, com faixas entre aproximadamente 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25,
0,5, 1, 10, 50, 100, 1.000 ou mais mg/DNA ou proteína/kg de peso corporal são administrados. Do mesmo modo a quantidade de vacina de rAb-DC/DC-antlgeno liberada pode variar de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 8,0 mg/kg de peso corporal. Assim, em modalidades particulares, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,8 mg, 1,0 mg, 1,5 mg, 2,0 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 4,0 mg, 5,0 mg, 5,5 mg, 6,0 mg, 6,5 mg, 7,0 mg e 7,5 mg da vacina podem ser liberados a um indivíduo in vivo. A dosagem de vacina de rAb-DC/DC-antígeno a ser administrada depende na maior parte do peso e da condição física do indivíduo sendo tratado, bem como a rota de administração e a frequência de tratamento. Uma composição farmacêutica que inclui um polinucleotídeo exposto pré-ligado a um vetor lipossomal ou de liberação viral pode ser administrada em quantidades variando de I pg a 1 mg de polinucleotídeo para 1 pg a 100 mg de proteína. Assim, as composições particulares podem incluir entre aproximadamente 1 pg, 5 pg, 10 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 100 pg, 150 pg, 200 pg, 250 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg ou 1.000 pg de polinucleotídeo ou proteína que são independente ligados a 1 pg, 5 pg, 10 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 100 pg, 150 pg, 200 pg, 250 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 mg, 1,5 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg ou 100 mg de vetor.
A presente invenção foi testada em um sistema celular in vitro que mede a estimulação imune de células T Fluespecíficas humanas por células dendríticas às quais o 3 0 antígeno Flu tem sido procurado. Os resultados mostrados aqui demonstram a expansão específica de tais células específicas de antígeno em doses do antígeno que são ineficazes neste sistema.
A presente invenção pode também ser usada para fazer um carreador de rAb modular isto é, por exemplo, um mAb humanizado recombinante (direcionado a um receptor de célula dendrítica humana específico) complexado com antígenos protetores de Ricin, toxina Anthrax, e enterotoxina B de Staphylococcus. O mercado potencial para esta entidade é a vacinação de todo pessoal militar e a vacina armazenada mantida em reserva para administrar aos grandes centros de população em resposta a qualquer bioameaça relativa a estes agentes. A invenção tem a aplicação ampla ao projeto de vacinas em geral, para uso humano e animal. As indústrias de interesse incluem as indústrias farmacêuticas e de biotecnologia.
A presente invenção inclui as composições e métodos, incluindo as vacinas, que especificamente procuram (liberam) antígenos às células de apresentação de antígeno (APCs) com 20 a finalidade de provocar as respostas imunes potentes e amplas direcionadas contra o antígeno. Estas composições evocam respostas imunes protetoras ou terapêuticas contra o agente (patógeno ou câncer) do qual o antígeno foi derivado. Além disso a invenção cria os agentes que são diretamente, 25 ou em combinação com outros agentes, terapêuticos através de seu acoplamento específico do receptor LOX-I expresso em células de apresentação de antígeno.
Materiais e métodos.
Anticorpos e tetrâmeros - Os anticorpos (Abs) para coloração de superfície de DCs e células B, incluindo Abs de controle de isotipo, foram comprados de BD Biosciences (CA). Os Abs para ELISA foram comprados de Bethyl (TX). Os Anti-BLyS e anti-APRIL foram de PeproTech (NJ) . Os tetrâmeros, HLA-A* 02 01-GILGFVFTL (Flu Ml) e HLA-A*0201- 5 ELAGIGILTV (Mart-I), foram comprados de Beckman Coulter (CA) .
Células e culturas - Os monócitos (lxl06/ml) dos doadores normais foram cultivados em meios de Cellgenics (França) contendo GM-CSF (100 ng/ml) e IL-4 (50 ng/ml) (R&D, CA) . Para as DCs de dia três e de dia seis, as mesmas quantidades de citocinas foram suplementadas no meio no dia um e no dia três, respectivamente. As células B foram purificadas com um kit de isolamento negativo (BD) . As células T CD4 e CD8 foram purificadas com grânulos magnéticos revestidos com anti-CD4 ou CD8 (Milteniy, CA) . As PBMCs foram isoladas dos revestimentos de camada usando gradientes de Percoll™ (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, Reino Unido) por centrifugação de gradiente de densidade. Para a ativação de DC, IxlO5 de DCs foram cultivadas na placa mAb-revestida de 96 poços por 16-
18. Os mAbs (1-2 yg/poço) em tampão de carbonato, pH 9,4, foram incubados no mínimo 3 h em 37°C. Os sobrenadantes de cultura foram colhidos e as citocinas/quimiocinas foram medidas por Luminex (Biorad, CA) . Para a análise de gene,
2 5 as DCs foram cultivadas em placas revestidas com mAbs por 8
h. Em alguns experimentos, 5 0 ng/ml solúvel de CD4 0L (R&D, CA) ou 50 nM de CpG (InVivogen, CA) foram adicionados nas culturas. Nas co-culturas de DCs e célula B, DCS 5xl03 resuspensas em RPMI 1640 com 10% de FCS e antibióticos
3 0 (Biosource, CA) foram primeiramente cultivadas em placas revestidas com mAbs por pelo menos 6 h, e então IxlO5 células B autólogas purificadas marcadas com CFSE (Sondas Moleculares, OR) foram adicionadas. Em alguns experimentos, as DCs foram pulsadas com 5 moi (multiplicidade de infeção)
de vírus de influenza inativado por calor (A/PR/8 HlNl) por
2 h, e então misturadas com as células B. Para as coculturas de DCs e célula T, 5xl03 de DCs foram cultivadas com IxlO5 células T CD8 autólogas purificadas ou células T alogênicas misturadas. As células T alogênicas foram pulsadas com 1 uCi/poço 3[H]-timidina por 18h finais de incubação, e então a cpm foi medida por um gama-counter (Wallac, MN) . 5xl05 PBMCs/poço foram cultivadas nas placas revestidas com mAbs. A frequência de Mart-I e células T CD8 específicas de Flu Ml foi medida corando as células com anti-CD8 e tetrâmeros no dia dez e dia sete das culturas, respectivamente. 10 uM de peptídeo Mart-I (ELAGIGILTV) e 20 nM de proteína recombinante contendo os peptídeos Mart-I (veja abaixo) foram adicionados às culturas de DC e célula T CD8. 20 nM de proteína Flu Ml recombinante purificada (veja abaixo) foram adicionos às culturas de PBMC.
Anticorpos monoclonais - Os mAbs de camundongo foram gerados pela tecnologia convencional. Resumidamente, os camundongos BALB/c de seis semanas de idade foram imunizados i.p. com 20 yg de proteína de fusão hlgGFc de
2 5 ectodomínio de receptor com adjuvante Ribi, então reforçado
com 20 yg de antígeno dez dias e quinze dias mais tarde. Após três meses, os camundongos foram reforçados novamente três dias antes de pegar os baços. Alternadamente, os camundongos foram injetados na pata com 1-10 pg de antígeno
3 0 em adjuvante Ribi cada três a quatro dias durante um período de trinta a quarenta dias. Três a quatro dias após um reforço final, drenando os linfonodos foram colhidos. As células B das células do baço ou linfonodo foram fundidas com células de SP2/0-Ag 14. Os sobrenadantes de hibridoma 5 foram selecionados para analisar os Abs para a proteína de fusão de ectodomínio de receptor comparada ao parceiro de fusão sozinho, ou o ectodomínio de receptor fundido à fosfatase alcalina (16) . Os poços positivos foram então selecionados em FACS usando as células 2 93 F 10 transitoriamente transfectadas com plasmídeos de expressão codificando cDNAs de receptor completos. Os hibridomas selecionados eram de célula única clonada e expandida em frascos de CELLine (Integra, CA). Os sobrenadantes de hibridoma foram misturados com um volume igual de 1,5 M de 15 glicina, 3M de NaCl, IxPBS, pH 7,8 e despejados com resina MabSelect. A resina foi lavada com tampão aglutinante e eluída com 0,1 M de glicina, pH 2,7. Seguindo a neutralização com 2 M de Tris, os mAbs foram dializados contra PBS.
2 0 ELISA - O sanduíche ELISA foi realizado para medir IgM,
IgG, e IgA totais bem como imunoglobulina flu-específicas (Igs) . O soro humano padrão (Bethyl) contendo quantidades conhecidas de Igs e o soro de AB humano foram usados como padrão para Igs total e Igs flu-específicas, 25 respectivamente. Os títulos de Ab específicos de flu, unidades, em amostras foram definidos como fator de diluição de soro AB que mostra uma densidade ótica idêntica. As quantidades de BAFF e BLyS foram medidas por kits ELISA (Bender MedSystem, CA).
3 0 Purificação de RNA e análise de gene - O RNA total foi extraído com colunas RNeasy (Qiagen), e analisado com o 2100 Bioanalyser (Agilent) . Os alvos de cRNA marcados por biotina foram preparados usando o kit de marcação de preparação total Illumina (Ambion) e hibridizados para 5 Sentrix Human6 BeadChips (46K transcritos). Estes microarranjos consistem de sondas de oligonucleotídeo de 5 Omer unidas a 3um de grânulos que estão alojados em micropoços gravados na superfície de uma placa de silicone. Após a coloração com Estreptavidina-Cy3, a superfície de 10 arranjo é varrida usando um varredor de resolução submícron fabricado por Illumina (Beadstation 50OX). Um programa de software de análise de expressão de gene, GeneSpring, versão 7.1 (Agilent) , foi usado para realizar a análise de dados.
Expressão e purificação de proteínas Flu Ml e MART-I
recombinantes - A PCR foi usada para amplificar o ORF de um gene Ml de Influenza A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (HlNl) ao incorporar um sítio Nhe 0\I que longe do códon iniciador e um sítio Not I longe do códon de parada. 0 fragmento 20 digerido foi clonado em pET28b(+) (Novagen), colocando o Ml ORF em quadro com uma marca de His6, assim codificando a proteína His.Flu Ml. Um derivado de pET28b(+)codificando um domínio de coesina de resíduo 169 N-terminal de C. thermocellum (não-publicado) inserido entre os sítios Nco I
2 5 e Nhe I expressaram Coh.His. Para a expressão de CoesinaFlex-hMART-I-PeptideoA-His, a seqüência
GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCG GAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCG GCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACAC TGGCGGCCG (Id. de Seq. N°: 1) (codificando DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHW RP (Id. de Seq. N°: 2) - os resíduos sombreados são o peptídeo HLA-A2-restrito imuno-dominante e os resíduos sublinhados envolvendo o peptídeo são MART-1) foram 5 inseridos entre os sítios de Nhe I e Xho I do vetor acima. As proteínas foram expressas na cepa BL21 de E. coli (DE3) (Novagen) ou T7 expressas (NEB) , crescidas em LB em 370C com seleção para resistência à canamicina (40 yg/ml) e agitação em 200 rpm para crescimento de fase Iog mid quando 10 120 mg/L de IPTG foram adicionados. Após três horas, as células foram colhidas por centrifugação e armazenadas em 80 °C. As células de E. coli de cada I L de fermentação foram resuspensas em 30 ml de 50 mM de Tris gelado, 1 mM de EDTA de pH 8,0 (tampão B) com 0,1 ml de inibidor de 15 protease Cocktail II (Calbiochem, CA) . As células foram sonicadas em gelo 2x 5 min no ajuste 18 (Fisher Sonic Dismembrator 60) com um período de descanso de 5 min e então giradas em 17.000 rpm (Sorvall SA-600) por 20 min em 4°C. Para a purificação de His.Flu Ml a fração de 20 sobrenadante de lisado de célula de 50 ml foi passada através de 5 ml de grânulos de Q Sepharose e 6,25 ml 160 mM de Tris, 4 0 mM de imidazol, 4 M de NaCl pH 7,9 foram adicionados ao fluxo de Q Sepharose. Isto foi carregado em
4 ml/min em uma coluna HP quelante HiTrap de 5 ml carregada 25 com Ni++. A proteína ligada à coluna foi lavada com 20 mM de NaPO4, 300 mM de NaCl pH 7,6 (tampão D) seguida por uma outra lavagem com 100 mM de H3COONa pH 4,0. A proteína ligada foi eluída com 100 mM de H3COONa pH 4,0. As frações de pico foram esolhidas e carregadas em 4 ml/min em uma 3 0 coluna HiTrap S de 5 ml equilibrada com 10 0 mM de H3COONa pH 5,5, e lavada com o tampão de equilíbrio seguido pela eluição com um gradiente de 0-1 M de NaCl em 50 mM de NaPO4 pH 5,5. As frações de pico eluindo em aproximadamente 500 mM de NaCl foram escolhidas. Para a purificação de Coh.Flu 5 Ml.His, as células de 2 1 de cultura foram lisadas como acima. Após centrifugação, 2,5 ml de Triton X114 foram adicionados ao sobrenadante com incubação em gelo por 5 min. Após uma incubação adicional em 25 0C por 5 min, o sobrenadante foi separado do Triton X114 seguindo a 10 centrifugação em 25°C. A extração foi repetida e o sobrenadante foi passado através de 5 ml de grânulos de Q Sepharose e 6,2 5 ml de 16 0 mM de Tris, 4 0 mM de imidazol, 4 M de NaCl pH 7,9 foram adicionados ao fluxo de Q Sepharose A proteína foi então purificada por cromatografia quelante 15 de Ni++ como descrita acima e eluída com 0-500 mM de imidazol em tampão D.
mAbs Anti-LOX-I - A invenção abrange as seqüências de aminoãcido particulares mostradas abaixo correspondendo aos anticorpos monoclonais anti-LOX-I que são componentes desejáveis (no contexto de, por exemplo, anticorpos recombinantes humanizados) de produtos terapêuticos ou protetores. Os seguintes são tais seqüências no contexto de anticorpos recombinante de região C humana de região V de camundongo quimérico (sublinhada). Estas regiões V de camundongo podem ser prontamente humanizadas, isto é, as regiões combinantes de L0X-1 enxertadas em seqüências de estrutura de região V humanas, por qualquer um bem prático nesta técnica. Além disso, as seqüências podem também ser expressas no contexto de proteínas de fusão que preservam a funcionalidade de anticorpo, mas adicionam, por exemplo, antígeno, citocina, ou toxina para aplicações terapêuticas desejadas.
[mAnti-LOX-l_llC8H-LV-hIgG4H-C]
EVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIYPG NSDTTYNQKFKGKAKLTAVTSTSTAYMELSSLTNEDSAVYYCTPTYYFDYWGQGTSLTV SSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (Id. de Seq. N°: 3) [mAnti-LOX-1_11C8K-LV-hlgGK-C]
DWMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFLQRPGQSPKRLIY LVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPWTFGGGTKLEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (Id. de Seq N°: 4)
[mAnti-LOX_l_10F9H-LV-hIgG4H-C]
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFGSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPG
2 0 SGNTNYNENFKGKATFTADTSSNTAYMQLTSLTSEDSAVYYCARAGIYWGQGTLVTVSA AKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE
2 5 EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (Id. de Seq. N°: 5)
[mAnti-LOX_l_10F9K-LV-hIgGK-C]
DIVLTQSPAFLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYV
ASKQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMIFCQQSKEVPRTFGGGTKLEIKRT
3 0 VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (Id. de Seq. N0 : 6)
[mAnti-LOX-l_15C4H-LV-hIgG4H-C]
EIQLQQTGPELVKPGASVKISCKASGYPFTDYIMVWVKQSHGKSLEWIGNISPY 5 YGTTNYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARSPNWDGAWFAHWGQG ALVTVSAAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY 10 TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (Id. de Seq. N°: 7)
[mAnti-LOX-l_15C4K-LV-hIgGK-C]
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWFQQKPGQPPKLLIYA ASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (Id. de Seq. N0 : 8)
A presente invenção inclui as seqüências de região V e seqüências relacionadas modificadas por aqueles bem versados na técnica por exemplo, melhora de afinidade para LOX-I e/ou integradas em seqüências de estrutura de região
V humanas a serem projetadas em vetores de expressão de direcionamento da expressão de formas de proteína que podem 25 se ligar a L0X-1 nas células de apresentação de antígeno. Além disso, os outros mAbs divulgados na invenção (ou derivados usando métodos e seleções similares para a biologia única divulgada aqui), podem ser através de meios similares (inicialmente através de clonagem e
3 0 sequenciamento por PCR de regiões V de hibridoma de camundongo) conseguidos em construções de expressão codificando anticorpos recombinantes similares (rAbs). Tais regiões V de anti-LOX-I podem além disso, por aqueles bem versados na técnica, ser "humanizadas 11 (isto é, seqüências 5 de combinação específicas de camundongo enxertadas em seqüências de estrutura de região V humanas) para minimizar a reatividade imune potencial do rAb terapêutico.
Anticorpo recombinante anti-LOX-1 recombinante projetado - As proteínas de fusão de antígeno ((antígeno de 10 rAb) são vacinas protótipos eficazes in vitro - Os vetores de expressão podem ser construídos com seqüência de codificação de proteína diversa, por exemplo, fundido emframe à seqüência de codificação de cadeia H. Por exemplo, os antígenos tais como Influenza HA5, Influenza Ml, HIV gag, 15 ou peptídeos imuno-dominantes de antígenos de câncer, ou citocinas, podem ser expressos subsequentemente como proteínas de fusão rAb.antígeno ou rAb.citocina, que no contexto desta invenção, podem ter a utilidade derivada do uso da seqüência de região V anti-LOX-l para trazer o 20 antígeno ou citocina (ou toxina) diretamente à superfície da célula de apresentação de antígeno carregando LOX-I. Isto permite a internalização de, por exemplo, antígeno às vezes associado com a ativação do receptor e seguindo a iniciação de ação terapêutica ou protetora (por exemplo, 25 através da iniciação de uma resposta imune potente, ou através da morte da célula alvo). Uma vacina protótipo de exemplo baseada neste conceito poderia usar um vetor de cadeia H, tal como rAB-pIRES2 [mAnti-LOX-l_15C4H-LV-hIgG4HC-Flex-FluHA5-l-6xHis] que dirige a síntese de uma região V
3 0 de mAb V de camundongo de cadeia H (sublinhada) - região C IgG4 humana - proteína de fusão de Flu HA5-1 (negrito). Coexpressa com o plasmídeo de expressão de cadeia leve análogo (seqüência de codificação mostrada acima), isto produz um anticorpo recombinante multifunctional (rAb) que 5 liga LOX-I e libera o antígeno de Flu HA5-1 à superfície celular para a ativação de DC, internalização de antígeno, processamento de antígeno, apresentação de antígeno, e instrução e expansão de anti-Flu HA5-1 B específicas e células T.
EIQLQQTGPELVKPGASVKISCKASGYPFTDYIMVWVKQSHGKSLEWIGNISPY
YGTTNYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARSPNWDGAWFAHWGQG ALVTVSAAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTDQIC IGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLG NPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSW
2 0 SSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNWWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHP
NDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAIN FESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTI GECPKYVKSNRLVLAHHHHHH (Id. de Seq. N°: 9)
Similarmente, rAB-pIRES2 [mAnti-LOX-l_15C4H-LV-hIgG4H
C-Doquerina] codifica uma cadeia anti-LOX-1 H fundida à doquerina (seqüência mostrada abaixo). A doquerina permite a interação não covalente específica forte com proteínas de fusão coesina-antígeno (coh.antígeno) - fornecendo um meio alternativo de liberação de antígeno à DC e outras células
3 0 de apresentação de antígeno. EIQLQQTGPELVKPGASVKISCKASGYPFTDYIMVWVKQSHGKSLEWIGNISPY YGTTNYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARSPNWDGAWFAHWGQG ALVTVSAAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA 5 PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASNSPQNEVLYGDVNDDGKV NSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI 10 (Id. de Seq. N0: 10)
EIQLQQTGPELVKPGASVKISCKASGYPFTDYIMVWVKQSHGKSLEWIGNISPY
Y GTTNYNLKFKGKATLTVDKS S S TAYMQLNSLTS EPSAVYY CARS PNWDGAWFAHWGQG ALVTVSAAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA 15 PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTPTTT LLAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVIL
2 0 LGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELT DAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKV TKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKWHYRK WIKDTIVANP (Id. de Seq. N°: 11)
Métodos relacionando à clonagem e expressão de anticorpos recombinantes (rAbs) e antígeno de rAbs.
Clonagem de cDNA e expressão de camundongo quimérico/mAbs humanos - O RNA total foi preparado de células de hibridoma (kit RNeasy, Qiagen) e usado para a síntese de cDNA e PCR (kit SMART RACE, BD Biosciences) usando primers 5' e primers 3' específico de gene fornecidos:
mlgGK, 5'ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3' (Id. de Seq. N0: 12);
mlgGÀ, 5'ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgacc ttc3' (Id. de Seq. N°: 13);
mlgGl, 5'gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3' (Id. de Seq. N0: 14);
mIgG2a, 5'ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3' (Id. de Seq. N0: 15); e
mIgG2b, 5'ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt3' (Id.
de Seq. N0: 16).
Os produtos de PCR foram clonados (kit pCR2.I Ta, Invitrogen) e caracterizados sequenciamento de DNA. Usando as seqüências derivadas para os cDNAs de região V de cadeia 15 H e L de camundongo, primers específicos foram usados para PCR amplificar o sinal de peptídeo e regiões V ao incorporar os sítios de restrição de flanco para clonagem em vetores de expressão codificando regiões IgGx ou IgG4H humanas a jusante. O vetor para a expressão de mVK-hlgK 20 quimérico foi construído amplificando resíduos 401-731 (gi 163101937 I ) f lanqueado por sítios Xho I e Not I e inserindo isto no intervalo Xho I - Not I de pIRES2-DsRed2 (BD Biosciences) . 0 PCR foi usado para amplificar a região Vk de mAb do códon iniciador, anexando um sítio Nhe I ou 25 Spe I depois CACC, à codificação de região (por exemplo, resíduo 126 de gi|76779294|), anexando um sítio Xho I. 0 fragmento de PCR foi então clonado no intervalo Nhe I - Not
I do vetor acima. 0 vetor para mVK-hlgK quimérico usando o líder mSLAM foi construído inserindo a seqüência
3 0 5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttc tctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggcccactcgag3' (Id. de Seq. N°: 17) no intervalo Nhe I - Xho I do vetor acima.
O PCR foi usado para amplificar o intervalo entre o códon N-terminal maduro previsto (definido usando o SignalP 3.0 Server) (Bendtsen, Nielsen e col. 2004) e o fim da região mVK (como definido acima) ao adicionar 5'tcgtacgga3'. 0 fragmento digerido com BSI WI e Xho I foi inserido nos sítios correspondentes do vetor acima. A seqüência hlgic de controle corresponde ao gi|49257887| resíduos 26-85 e gi1216694021 resíduos 67-709. O vetor hIgG4H de controle corresponde aos resíduos 12-1473 de gi119684072 | com as substituições S229P e L236E, que estabilizam uma ligação de bissulfeto e ligação de FcR residual anulada (Reddy, Kinney e col. 2000) , inseridas entre os sítios BGL II e Not I de vetor pIRES2-DsRed2 ao adicionar a seqüência 5' gctagctgattaattaa3' em vez do códon de parada. 0 PCR foi usado para amplificar a região VH de mAb do códon iniciador, anexando CACC então um sítio BGL II, ao resíduo de codificação de região 473 de gi|19684072|. 0 fragmento de PCR foi então clonado no intervalo BGL II - Apa I do vetor acima. 0 vetor para a seqüência mVH-hIgG4 quimérico usando
0 líder mSLAM foi construído inserindo a seqüência 5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttc tctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggccc3' (Id. de Seq.
N°: 18) no intervalo Nhe I - Apa I do vetor acima. 0 PCR foi usado para amplificar o intervalo entre o códon Nterminal maduro previsto e a extremidade da região mVH ao anexar 5'tcgtacgga3'. O fragmento digerido com BSI WI e Apa
1 foi inserido nos sítios correspondentes do vetor acima. 0
3 0 apêndice 2 detalha as seqüências de nucleotídeo das várias regiões de mVK e mVH usadas neste estudo.
As várias seqüências de codificação de antígeno flanqueadas por um sítio Nhe I proximal e um sítio Not I distai seguindo o códon de parada foi inserido no intervalo 5 Nhe I - Pac I - Not I dos vetores cadeia H. Flu HAl-I foi codificado pelo vírus Influenza A (A/Puerto Rico /8/34 (HlNl)) hemaglutinina gi 1216931681 resíduos 82-1025 (com uma mudança de C982T) com a seqüência
5'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa3' proximal 10 (um sítio Nhe I seguido por resíduos ligante de coesinacoesina cipA de codificação de seqüência) e seqüência distai de 5'caccatcaccatcaccattgagcggccgc3' (codificação His6, um códon de parada, e sítio Npot I). A Flu HA5-1 foi codificada pelo vírus de influenza A gi|50296052| 15 (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)) resíduos 49-990 de hemaglutinina ligado pelas mesmas seqüências que Flu HAl-I. A Doc foi codificada pelo gi|40671| 1923-2150 resíduos celD com sítios Nhe I proximal e Not I distai. A PSA foi codificada por gi|34784812| resíduos de antígeno de 20 próstata específicos 101-832 com seqüência proximal 5'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaacaccgacaaca acacttctagcgc3' (Id. de Seq. N°: 19) (sítio Nhe I e espaçador cipA) e um sítio Not I distai. A Flu Ml-PEP foi codificada por
5'gctagccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctg accgtgcccagcgaacgcaagggtatacttggattcgttttcacacttacttaagcggc cgc3' (Id. de Seq. N°: 20). Esta e todas as outras seqüências de codificação de peptídeo foram criadas através das misturas de fragmentos de DNA sintéticos complementares
3 0 com extremidades compatíveis para clonar em vetores de cadeia H restrita Nhe I e Not I, ou vetor Coh.His restrito Nhe I - Xho I. Os códons humanos preferidos foram usados sempre, exceto onde os sítios de restrição necessários para serem incorporados ou em seqüências de espaçador CipA.
Os níveis de produção de construções de expressão de rAb foram testados em transfecções transitórias de 5 ml usando ~2,5 pg de cada construção de cadeia L e cadeia H e
o protocolo descrito acima. Os sobrenadantes foram analisados por anti-hlgG ELISA (IgG anti-humano de AffiniPure Goat (H+L), Jackson ImunoResearch). Em testes deste protocolo, a produção de rAb secretado foi independente da concentração de vetores da cadeia H e cadeia L sobre uma faixa de ~2-vezes de cada concentração de DNA (isto é, o sistema estava saturado de DNA).
Os presentes inventores demonstram aqui que LOX-1, um dos LLRs, é funcional, sozinho ou em colaboração com outros sinais celulares, em termos de ativação de célula (incluindo a DC). A ativação de célula mediada por LOX-I é induzida pelos mAbs anti-LOX-l particulares, e portanto tais mAbs LOX-I anti-humanos serão úteis para desenvolver reagentes contra doenças.
A presente invenção inclui os reagentes LOX-I antihumanos novos e seu uso para descobrir a biologia nova que é a base da invenção e suas aplicações. Em resumo, anticorpos monoclonais anti-LOX-l (mAbs) novos foram desenvolvidos e usados para descobrir a biologia previamente desconhecida associada com este receptor de superfície celular que é encontrado em células de apresentação de antígeno. Esta biologia nova é altamente preditiva da aplicação de agentes anti-LOX-l que ativam este receptor para aplicações terapêuticas e protetoras diversas. Os dados apresentados abaixo fortemente suportam as predições iniciais e demonstram o caminho para reduzir as descobertas aqui à aplicação clínica.
Desenvolvimento de anticorpos monoclonais de afinidade
elevada contra LOX-I humano: 0 receptor ectodomínio.hlgG (IgGlFc humano) e as proteínas de fusão AP (fosfatase alcalina de placenta humana) foram produzidos para imunização de camundongos e seleção de mAbs, 10 respectivamente. Uma construção de expressão para DCIR ectodomínio.IgG foi descrita previamente (16) e usou o peptídeo de sinal SLAM de camundongo (mSLAM) de direcionamento da secreção (17). Um vetor de expressão para DCIR ectodomínio.AP foi também gerado usando PCR para 15 amplificar resíduos AP 133-1581 (gb|BC009647|) ao adicionar um sítio Xho I em-frame proximal e um códon de parada TGA distai e sítio Not I. Este fragmento Xho I - Not I substituí a seqüência de codificação de IgG no vetor de DCIR ectodomínio.IgG acima. As construções de ectodomínio 20 LOX-I na mesma série de vetor de Ig e AP continham a codificação de inserções (bp 224-874, gi|18490152 | ) . As proteínas de fusão LOX-I foram produzidas usando o sistema de expressão de FreeStyle™ 293 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante (1 mg de DNA de plasmídeo total com 25 1,3 ml de reagente 293 Fectina/L de transfecção) . Para a produção de rAb, as quantidades iguais de vetor codificando a cadeia HeL foram co-transfectadas. As células transfectadas são cultivadas por 3 dias, o sobrenadante de cultura foi colhido e meio fresco adicionado com incubação
3 0 continuada por dois dias. Os sobrenadantes escolhidos foram clarificados pela filtração. 0 receptor ectodomínio.hlgG foi purificado por cromatografia de afinidade de proteína A HiTrap com eluição por 0,1 M de glicina pH 2,7 e então foi dializado contra PBS. Os rAbs (anticorpos recombinantes 5 descritos mais tarde) similarmente purificados, usando colunas de HiTrap MabSelect™. Os mAbs de camundongo foram gerados por tecnologia de fusão de célula convencional. Brevemente, camundongos BALB/c de 6 semanas de idade foram imunizados intraperitonealmente com 20 pg de proteína de 10 fusão de ectodomínio.hlgGFc de receptor com adjuvante Ribi, então reforçado com 2 0 pg de antígeno 10 dias e 15 dias mais tarde. Após 3 meses, os camundongos foram reforçados novamente três dias antes de pegar os baços. Alternadamente, os camundongos foram injetados na pata com 1-10 pg de 15 antígeno em adjuvante de Ribi cada 3-4 dias durante um período de 30-40 dias. 3-4 dias após um reforço final, drenando os linfonodos foram colhido. As células B das células do baço ou linfonodo foram fundidas com as células SP2/0-Ag 14 (18) usando técnicas convencionais. ELISA foi 20 usado para selecionar sobrenadantes de hibridoma contra a proteína de fusão de ectodomínio de receptor comparada ao parceiro de fusão sozinho, ou contra o ectodomínio de receptor fundido ao AP (16). Os poços positivos foram então selecionados em FACS usando as células 293F transfectadas 25 transitoriamente com plasmídeos de expressão codificando cDNAs de receptor completos. Os hibridomas selecionados eram única célula clonada, adaptados aos meios livres de soro, e expandidos em frascos CELLine (Intergra). Os sobrenadantes de hibridoma foram misturados com um volume
3 0 igual de 1,5 M de glicina, 3M de NaCl, IxPBS, pH 7,8 e despejados com resina MabSelect. A resina foi lavada com tampão aglutinante e eluída com 0,1 M de glicina, pH 2,7. Seguindo neutralização com 2M Tris, os mAbs foram dializados contra PBS.
Caracterização de anticorpos monoclonais anti-LOX-l
purificados por ELISA direto: As Figuras abaixo mostram um exemplo de teste das afinidades relativas de diversos mAbs anti-LOX-l por ELISA (isto é, a proteína de LOX-l.Ig é imobilizada na superfície de placa de microtítulo) e os 10 anticorpos são testados em uma série de titulação de dose para sua habilidade de se ligar a LOX-l.Ig (como detectado por um reagente conjugado IgG.HRP anticamundongo). Os painéis são (esquerda) reatividade de mAb à proteína LOXl.Ig; (direita) reatividade de mAb à proteína de hlgGFc, e 15 (inferior) reatividade de mAb à proteína de fusão de LOXl.fosfatase alcalina. No último caso, os mAbs são ligados à placa (através de um reagente de IgG anticamundongo) e ligam uma quantidade constante de LOX-I.AP em solução. Os mAbs Anti-LOX-l reagem especificamente ao ectodomínio L0X-1 20 com afinidade superior a um mAb anti-LOX-l comercialmente obtido.
Tanto DCs cultivadas in vivo e DCs in vitro expressam LOX-I: A Figura 1 mostra os níveis de expressão de LOX-I em PBMCs de doadores normais. Como mostrado na Fig. Ia abaixo, 25 as células de apresentação de antígeno, incluindo a DCS CDllc+, monócitos CD14+, e células B CD19+ expressam L0X-1. As células T CD3+ não expressam L0X-1 detectável na superfície. Os níveis de expressão de L0X-1 em DCs cultivadas in vitro e mielóides de sangue purificadas (mCDs)
3 0 são mostrados na Fig. Ib. IL-4 e IFNDCs expressam níveis significativos de LOX-I. Embora as mDCs expressem altos níveis de LOX-1, as pDCs não expressam L0X-1 (não mostrado), sugerindo que manipular a DC através de LOX-1 deva provocar respostas únicas já que estes subconjuntos de DC têm funções diferentes in vivo.
Sinalização através de L0X-1 ativa DCs e estimula as DCs produzirem citocinas e quimiocinas: As células dendríticas são as células imunes primárias que determinam os resultados de respostas imunes, indução ou tolerância, dependendo de sua ativação (19) . 0 papel de L0X-1 na ativação de DC não é conhecido. Nós geramos 8 clones diferentes que produzem mAbs anti-hLOX-1 de camundongo, e testamos se os mAbs individuais ativam as DCs medindo fenótipos de DC e citocinas e quimiocinas secretada de DCs. Os dados na Fig. 2A mostram que PABl, 4, 5, 8, e 10 poderiam ativar as DCs, mas outros mAbs anti-LOX-l, ou mAbs de controle, não ativaram as DCs (dados não mostrados). Além disso, cada mAb estimula as DCs para produzirem níveis diferentes de citocinas e quimiocinas embora todos os mAbs apresentados na Fig. 2 possam induzir a maturação de DC.
A Figura 3 mostra que Sinalização através de L0X-1 pode resultar na ativação de DCs. IL-4DCs foram estimuladas com mAb específico para LOX-I, e os dados na Fig. 3a mostram que sinais através de L0X-1 poderiam ativar IL-4DCS, 25 resultando na expressão aumentada de CD86 e HLA-DR. L0X-1 poderia também ativar IFNDCs (não mostrado). Para testar se L0X-1 pode ativar as DCs in vivo, as mDCs purificadas foram estimuladas com anti-LOX-l por 24 h, e as células foram então coradas com anti-CD86, CD80, e HLA-DR (estes são
3 0 marcadores de ativação de DC) . Como mostrado na Fig. 3b, LOX-I pode também ativar mDCs derivadas in vivo para expressar níveis aumentados de CD86, CD8 0, e HLA-DR. Os últimos dados são particularmente importantes já que representam os efeitos biológicos diretos de determinados mAbs anti-LOX-l nas células ex vivo (isoladas diretamente do sangue).
Sinalização através de LOX-I induz a ativação única de DCs: Para caracterizar mais detalhadamente a ativação de DC através de LOX-I, a análise de expressão de gene de microarranjo foi realizada. A Fig. 4 mostra que os mAbs anti-LOX-l estimulam as DCs para sobre ou sub-regular os tipos diferentes de genes, mostrando que sinais através de LOX-I resultam em um padrão único de ativação de DC Os dados, quando comparados à sinalização através de DC-ASGPR e CLEC-6 (não mostrados), revelam que cada lectina de DC de superfície celular libera sinais únicos para ativar as DCs. Consequentemente, nós esperamos que as DCs ativadas através dos sinais diferentes resultarão em respostas imunes diferentes.
Sinalização através de LOX-I ativa as DCs para secretarr citocinas e quimiocinas: As DCs estimuladas com mAb LOX-I-específico expressam níveis aumentados de genes múltiplos, incluindo moléculas co-estimulatórias, bem como quimiocina e genes relacionados à citocina (Fig. 5a e b) . Ambas IL-4DCs e CDM cultivadas in vitro produziram quantidades significativamente aumentadas de IL-12p40, MCP1, e IL-8 secretados quando foram estimuladas com mAb antiLOX-l. Os níveis aumentados de outras citocinas e quimiocinas incluindo TNFa, IL-6, ΜΙΡ-la, e IL-lb, foram também observados nos sobrenadantes de cultura de DCs estimuladas com anti-LOX-l. A contribuição possível de LLRs na ativação de célula imune mediada por TLR2 e TLR4 foi descrita previamente (14, 20).
Sinalização através de LOX-I aumenta a sinalização 5 através de DCs CD4 0: Os sinais através de LOX-I podem entrar em sinergia com sinais através de CD4 0 para a ativação melhorada de DCs (Fig. 5) . 0 acoplamento de L0X-1 durante a interação CD40-CD40L resulta na expressão de superfície celular dramaticamente aumentada do marcador de 10 ativação CD83 (Fig. 6a) e secreção aumentada de IL-12p7 0 e de Il-12p4 0 (Fig. 6b) . Isto mostra que LOX-1 pode servir como uma molécula co-estimulatória durante a ativação de DC in vivo e tem implicações amplas para a utilidade terapêutica de agentes que ativam através de L0X-1 (mAbs, 15 tais como aqueles descritos aqui, ou ligantes de L0X-1 naturais ou substitutos). Analisados juntos, os dados apresentados na Fig. 1 a Fig. 6 mostram que a sinalização através de L0X-1 pode ativar as DCs e que L0X-1 é uma molécula co-estimulatória nova para a ativação de DCs.
As DCs estimuladas através de L0X-1 induzem respostas
imunes humorais potentes: - As DCs têm um papel importante em respostas imunes humorais fornecendo sinais para as respostas de célula B T-dependentes e T-independentes (21- 24) e transferindo antígenos às células B (25, 26). Além de 25 das DCS, a sinalização através de TLR9 como um terceiro sinal é necessária para as respostas de célula B eficientes (27, 28) . L0X-1 pode afetar as respostas imunes humorais mediadas por DCS na presença do ligante de TLR9, CpG. As DCs IL-4 de 6 dias foram estimuladas com mAb anti-LOX-l, e 30 então as células B purificadas foram co-cultivadas. Como mostrado na Fig. 6a, as DCs ativadas mAb anti-LOX-l resultaram na proliferação de célula de B notavelmente melhorada (vista através da diluição de CFSE) e a diferenciação de célula plasmática (aumento em CD38+CD20"),
comparado às DCs estimuladas com mAb controle. As células B CD38+CD20" têm uma morfologia típica de células plasmáticas, mas não expressam CD13 8. A maioria das células proliferativas não expressou CCR2, CCR4, CCR6, ou CCR7.
As quantidades de imunoglobulina totais (Igs) 10 produzidas foram medidas por ELISA (Fig. 7b) . Consistente com os dados na Fig. 7a, as células B cultivadas com DCs estimuladas por anti-LOX-l resultou na produção significativamente aumentada de IgM total. Além do aumento total de Ig, as DCs ativadas pelo acionamento de LOX-I são 15 mais potentes do que as DCs estimulada com mAb controle para a produção de IgM, IgG, e IgA específicas de influenza vírus (Fig. 7c) pelas células B, mostrando que a ativação de DC mediada por LOX-I contribui às respostas imunes humorais específicas e totais de antígeno.
A proteína estimulatória de linfócito B derivada de DC
(BLyS, BAFF) e um ligante de indução de proliferação (APRIL) são moléculas importantes pelas quais as DCs podem diretamente regular a proliferação e função de célula B humana (29-32). Os dados na Fig. 6d mostram que as DCs 25 estimuladas através de LOX-I expressam níveis aumentados de APRIL intracelular bem como APRIL secretado, mas não BLyS (não mostrado). Os níveis de expressão de receptores BLyS e APRIL em células B nas culturas misturadas foram medidos, mas não havia nenhuma mudança significativa (não mostrada).
3 0 Isto foi confirmado pelos dados na Fig. 7e. Durante as coculturas de DC e célula B, as combinações de receptor BAFF (BAFFR), TACI e BCMA foram bloqueadas com as proteínas de fusão de receptor-Fc solúveis. As produções de IgM e IgA eram significativamente diminuídas quando TACI ou BCMA foi 5 bloqueado. Isto não foi observado quando BAFFR-Fc foi adicionado nas culturas, mostrando que APRIL produzido de DCs estimuladas através de anti-LOX-l têm um papel importante nas produções aumentadas de imunoglobulinas.
As descobertas acima têm grandes implicações para a 10 aplicação terapêutica de agentes que especificamente ativam através de LOX-1, por exemplo, como adjuvante na vacinação, ou como estimulantes de sistema imune para indivíduos comprometidos imunes. Também, a descoberta prevê que bloqueando a ativação natural ou anormalmente regulada 15 através de LOX-I pode ter aplicações (por exemplo, para evocar a tolerância em um ajuste de transplantação, ou melhorar doenças autoimunes).
Os mAbs anti-LOX-l ativam células B: As células B CD19 + expressam LOX-I (Fig. 1 e Fig. 8a) e isto prevê um 2 0 papel para LOX-I expresso em células B. Os dados na Fig. 8b mostram que disparando LOX-I em células B resulta na produção aumentada de IL-8 e MIP-Ia secretados, sugerindo que LOX-I pode contribuir diretamente para a ativação de célula B. Além de IL-8 e MIP-la, leves aumentos em IL-6 e 25 TNFa foram também observados quando as células B foram estimuladas com mAb anti-LOX-l, comparado ao mAb controle. A Fig. 8c mostra que as células B ativadas com mAb antiLOX-l secretam quantidades aumentadas de IgG, IgM, e IgA totais.
A descoberta acima de efeitos diretos em células B através do acoplamento de LOX-I reforça o escopo da aplicação terapêutica esboçado acima para os agentes atuando através de ou contra LOX-I.
Papel de LOX-I em respostas de célula T: As DCs estimuladas através de LOX-I expressam níveis melhorados de moléculas co-estimulatórias e produzem quantidades aumentadas de citocinas e quimiocinas (Fig. 1 e 3), sugerindo que LOX-I contribui para respostas imunes celulares, bem como respostas imunes humorais. Isto foi testado por uma reação de linfócito misturada (MLR). A proliferação de células T alogênicas purificadas foi significativamente melhorada pelas DCs estimuladas com mAb específico para LOX-I (Fig. 9a). As DCs ativadas através de LOX-I também prepararam células T CD8 específicas de Mart-I mais eficientemente do que a DC estimulada com mAb controle (painéis superiores na Fig. 9b). Mais importantemente, a sinalização através de LOX-I permite as DCs preparar cruzadamente os peptídeos Mart-I para células T CD8 (painéis inferiores na Fig. 9c). Os painéis da direita nas Figs. 9b e 9c mostram os dados gerados com células de 5 e 4 doadores normais diferentes, respectivamente. Isto indica que LOX-I tem um papel importante em melhorar a função de DC, resultando na preparação melhorada e preparação cruzada de antígenos para células T CD8. 0 mAb anti-LOX-l e a proteína de fusão de antígeno também induzem as respostas de célula T CD8 específicas de antígeno mais robustas do que a proteína de fusão de mAb controle. As IL-4DCs foram carregadas com 10 ou 1 nM dos conjugados de mAb com a proteína Flu Ml, e células T CD8+ autólogas foram cocultivadas por 7 dias. As células foram coradas com antiCD8 e tetrâmero de Flu Ml. Os dados na Fig. 9d mostram que a proteína de fusão anti-LOX-l induziu respostas de célula T CD8 específicas de Flu Ml significativamente melhoradas.
Descobriu-se que a ativação de LOX-I de DCS influencia 5 as células T vizinhas direcionando-as ao aumento de proliferação. Além disso, quando o antígeno está presente durante esta interação, as DCs ativadas de LOX-I resultam na melhora de expansão de células T antígeno-específicas. Isto mostra que a ativação de LOX-1, por exemplo, em um 10 ajuste de vacina, pode direcionar a expansão seletiva de células T naive antígeno-específicas - isso junto com os efeitos diretos e indiretos acima de ativação de LOX-I em células B, claramente prevê a expansão de células B antígeno-específicas, e consequentemente a produção de 15 anticorpo antígeno-específico. Uma demonstração adicional da utilidade de anti-LOX-l é quando o antígeno está diretamente focalizado para DC através de um conjugado de mAb anti-LOX-l, as DCs dirigem a expansão de células CD8 + de memória antígeno-específicas.
DCs in vivo em primatas não humanos expressam LOX-I
Para testar se as DCs sanguíneas em primatas não humanos (Cynomolgus) são reconhecidas pelos mAbs LOX-I anti-humanos, PBMCs de macaco foram coradas com mAbs anti-LOX-l e anticorpos para outros marcadores celulares, CD3, CD14, 25 CDllc, CD27, CD56, e CDl6. Os dados na Fig. 10 mostram que ambas as células CD14 e CDllc+ foram coradas com mAbs LOX-I anti-humano. Ao contrário das células CD14+ e CDllc+, as células CD3+, CD16+, CD27+, e CD56+ não expressaram LOX-1. Estes dados demonstram a reatividade cruzada de 30 determinados mAbs LOX-I anti-humanos contra as células de apresentação de antígeno de macaco. Isto facilita extremamente reduzir as invenções descritas aqui à prática, pois o macaco pode ser usado como um modelo válido para estudos de eficácia e segurança de terapias humanas previstas.
A Figura 11 mostra a análise de SDS.PAGE reduzida de proteínas de fusão de rAb.antígeno típicas - incluindo anti-LOX-1_15C4.PSA, que é capaz de direcionar o antígeno específico de próstata (cinza destacado) para a superfície de células de apresentação de antígeno com a finalidade de vacinação contra o câncer de próstata.
As Figuras 12 e 13 demonstram diretamente a habilidade de um rAb anti-LOX-l liberar o antígeno ligado à superfície de células carregando LOX-1.
As Figuras 14A e 14B mostram o retorno mucoso de células B por DCs ativadas com mAb anti-LOX-l. A Figura 14B mostra os níveis de expressão de receptores homólogos de mucosa em células B que foram medidos. As células B naive co-cultivadas com as DCs ativadas com anti-LOX-l proliferam melhor do que as células B cultivadas com as DCs estimuladas com imunoglobulina de controle (Ig) (dois painéis superiores na Fig. 14A) . Com a proliferação e diferenciação de célula plasmática melhoradas, as células B naive co-cultivadas com DCs estimuladas com mAb anti-LOX-l expressam CCRlO. Estas células B podem migrar em resposta a CCL2 8. Embora CCRlO seja conhecido como um receptor de retorno de intestino distai, os estudos recentes mostram que a mucosa respiratória também expressa quantidades significativas de CCL28. Consequentemente, CCRlO é agora demonstrado por ser um receptor de retorno mucoso. A Figura 14B mostra que as células B interagindo com a DC ativada através de LOX-I são programadas para retornar à mucosa. Junto com os dados que mostram que DC ativa a proliferação de célula B, a diferenciação em células tipo 5 plasmáticas, e a secreção melhorada de imunoglobulina (incluindo Ig antígeno-específico quando a ativação de LOX
1 está associada com o antígeno de procura através de LOX-1) esta expressão aumentada de célula B CCRlO demonstra o potencial elevado de ativação de L0X-1 e procura de antígeno para aumentar a imunidade mucosal antígenoespecíf ica .
A Figura 15 mostra que mAb anti-LOX-l contribui para a produção melhorada de IgAl e IgA2. Em seguida, se as DCs ativadas com mAb anti-LOX-l podem induzir células B naive 15 para produzir IgAl e IgA2 foi determinado. As células B naive (IgD+CD27-) foram purificadas por seleção FACS. A Fig. 15 mostra que as células B naive cultivadas com as DCs ativadas com anti-LOX-l resultam em produções de IgAl e IgA2 significativamente melhoradas. Os níveis de IgM e IgG 20 foram também melhorados pelas DCs estimuladas com anti-LOX
1. Vistas juntas, a ativação de DCs através de DC-Lectinas, especial LOX-1, pode resultar em respostas imunes humorais melhoradas. Em particular, as células B induzidas com o receptor de retorno mucoso expresso de DCS, CCRlO, e podem 25 produzir IgAl e lgA2. Consequentemente, as vacinas feitas de anti-LOX-l induzirão respostas imunes mucosais potentes.
A Figura 16 mostra que as DCs carregadas com a proteína de fusão recombinante de anti-LOX-l e hemaglutinina viral de influenza (HA1, HlNl, PR8) induzem células B naive para secretar IgM flu-específica. Comparado a anti-LOX-l, as proteínas de fusão HAl de anti-ASGPR e anti-CLEC-6 resultaram em respostas fracas. As células B naive co-cultivadas com as DCs carregadas com anti-LOX-1- HA5 também produziram IgM HAl-específico. Vistas juntas, as 5 vacinas feitas de mAbs anti-Lectina e antígenos podem induzir as respostas de IgAl e IgA2 mucosais potentes que previnem infeções virais.
A Figura 17 mostra que as DCs procuradas de anti-LOX1-HA5 também têm a capacidade para expandir células T CD4+ HA5-específicas, adicionalmente demonstrando a utilidade da presente invenção como uma vacina potente.
A Figura 18 mostra que uma vacina anti-LOX-l provoca respostas imunes específicas de subconjunto de DC. Se os subconjuntos diferentes de DC procurados com a vacina antiLOX-1-HA5 provocam uma faixa diferente de respostas imunes como demonstrada pela expansão de células T HA5-específicas como definido por sua estimulação com peptídeos HA5 foi determinada. Assim, as vacinas a base de anti-LOX-l, procurando o mesmo antígeno para subtipos de DC diferentes 2 0 resultam em uma resposta imune ampla direcionada contra ao antígeno. Estes dados também destacam a propriedade desejada de vacina de procura de anti-LOX-l em provocar respostas de célula T específicas de antígeno que são altamente previstas para serem células efetoras como caracterizado por sua produção de IFNy.
A Figura 19 mostra a reatividade cruzada de anticorpos anti-LOX-l para LOX-I de macaco. Os clones de cDNA correspondendo aos 4 cDNAs LOX-I variantes foram isolados de macaco e configurados em um vetor de expressão mamífero. A Figura 19 mostra uma análise de FACS de três anticorpos LOX-I anti-humanos particularmente desejáveis em células
2 93F transfectadas com estes vetores de expressão contra as células 293F transfectadas com um vetor de expressão LOX-I humano. Os resultados mostram que todos os dois mAbs 5 testados (15C4 e 11C8) reagiram com todas as três variantes de L0X-1 de macaco testadas, enquanto 10F9 reagiu com uma das variantes. Tal reatividade cruzada é desejável já que permite o teste de toxicidade baseada mecanismo e eficácia em modelos NHP antes de ensaios clínicos humanos.
A Figura 20 mostra um alinhamento Clustal W das quatro
variantes de seqüências de macacos (5U1-5U4) com LOX-I humano.
As Figuras 21A a 21D mostram que antígenos liberados através de LOX-I resultam em respostas de célula T CD4 15 específicas de antígeno. A afinidade de ligação de antiL0X-1-HA1 e IG-HAl controle foi testada (Fig. 21A) . Ambos anti-LOX-I-HAl e Ig-HAl controle podem se ligar às IFNDCs derivadas de monócito, mas anti-LOX-I-HAl se liga ligeiramente melhor do que Ig-HAl controle às DCs. A 20 proliferação de célula T CD4 induzida por DCs carregadas com anti-LOX-I-HAl ou Ig-HAl controle foi medida. A Fig. 21B mostra que as IFNDCs carregadas com anti-LOX-l-HAl induziram a maior proliferação de célula T CD4 (69%) do que Ig-HAl controle (7%) .
Para determinar se as células T CD4 proliferativas são
específicas de antígeno (HAl) ou não, as células T CD4 expandidas com a DC carregada com anti-LOX-I-HAl foram reestimuladas com IFNDCs carregadas com seleções de peptídeo de HAl. A Fig. 21C mostra que a seleção de peptídeo 37-48 resultou em uma frequência relativamente mais elevada de células T CD4 produtoras de IFNy. A responsividade de células T CD4 aos peptídeos individuais na seleção de peptídeo 37-48 foi também determinada. A Fig. 2ID mostra que as células T CD4 produzem IFNy intracelular 5 em resposta a três peptídeos, peptídeo 43, peptídeo 44, e peptídeo 45. Vistos juntos, estes dados demonstram que as DCs de procura humanas com anti-LOX-l-HAl podem induzir respostas de célula T CD4 específicas de antígeno.
É contemplado que qualquer modalidade discutida neste relatório descritivo pode ser implementada com relação a qualquer método, kit, reagente, ou composição da invenção, e vice e versa. Além disso, as composições da invenção podem ser usadas para conseguir métodos da invenção.
Será compreendido que as modalidades particulares 15 descritas aqui são mostradas por modo de ilustração e não como limitações da invenção. As características principais desta invenção podem ser empregadas em várias modalidades sem sair do escopo da invenção. Aqueles hábeis na técnica reconhecerão, ou são capazes de verificar usando não mais
2 0 do que experimentação rotineira, numerosos equivalentes aos
procedimentos específicos descritos aqui. Tais equivalentes são considerados como estando dentro do escopo desta invenção e são cobertos pelas reivindicações.
Todas as publicações e pedidos de patente mencionados 25 no relatório descritivo são indicativos do nível de habilidade daqueles hábeis na técnica aos quais esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são incorporados aqui por referência à mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente
3 0 individual fossem especificamente e individualmente indicados para serem incorporados por referência. 0 uso da palavra "um" ou "uma" quando usada conjuntamente com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou no relatório descritivo pode significar "um," mas é também consistente com o significado de "um ou mais," "pelo menos um," e "um ou mais do que um." O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e/ou" a menos que explicitamente indicado para referir às alternativas somente ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação suporte uma definição que se refere somente às alternativas e "e/ou." Através deste pedido, o termo "aproximadamente" é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor, ou a variação que existe entre os indivíduos de estudo.
Como usado neste relatório descritivo e reivindicações, as palavras "compreendendo" (e qualquer forma de compreendendo, como "compreende" e "compreendem"), "tendo" (e qualquer forma de ter, tais como "tem" e "têm"), "incluindo" (e qualquer forma de incluir, tais como "inclui" e "incluem") ou "contendo" (e qualquer forma de contendo, como "contem" e "contêm") são inclusivos ou em aberto e não excluem elementos não citados, adicionais ou etapas de método.
O termo "ou combinações dos mesmos" como usado aqui refere-se a todas permutações e combinações dos itens listados precedendo o termo. Por exemplo, "A, B, C, ou combinações dos mesmos" é pretendido incluir pelo menos um de: A, B, C, AB, AC, BC, ou ABC, e se a ordem é importante em um contexto particular, também BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, ou CAB. Continuando com este exemplo, expressamente incluídos estão as combinações contendo repetições de um ou mais itens ou termos, tais como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC,
CBBAAA, CABABB, e assim por diante. O hábil compreenderá que tipicamente não há nenhum limite no número de itens ou termos em qualquer combinação, a menos que de outra maneira aparente do contexto.
Todas as composições e/ou métodos divulgados e
reivindicados aqui podem ser feitos e realizados sem experimentação imprópria na luz da divulgação presente. Enquanto as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, será aparente aos de habilidade na técnica que as variantes
podem ser aplicadas às composições e/ou métodos e nas etapas ou na seqüência de etapas do método descrito aqui sem sair do conceito, conceito inventivo e escopo da invenção. Todos tais substitutos e modificações similares aparentes aos hábeis na técnica são julgados estar dentro
2 0 do conceito inventivo, escopo e conceito da invenção como
definidos pelas reivindicações adicionadas.
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Claims (44)

1. Método para aumentar a eficácia de apresentação de antígeno por uma célula de apresentação de antígeno expressando LOX-I caracterizado pelo fato de que compreende contatar a célula de apresentação de antígeno com um anticorpo específico de anti-LOX-l ou um fragmento do mesmo, em que a célula de apresentação de antígeno é ativada.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula de apresentação de antígeno compreende uma célula dendrítica isolada, uma célula mononuclear sanguínea periférica, um monócito, uma célula dendrítica mielóide e combinações dos mesmos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula de apresentação de antígeno compreende uma célula dendrítica isolada, uma célula mononuclear sanguínea periférica, um monócito, uma célula B, uma célula dendrítica mielóide e combinações das mesmas que foram cultivadas in vitro com GM-CSF e IL-4, Interferon alfa, antígeno e combinações dos mesmos.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de ativar as células de apresentação de antígeno contatadas com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa, em que o contato com o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo aumenta a expressão de superfície de CD86 e HLA-DR na célula de apresentação de antígeno.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células de apresentação de antígeno compreendem uma célula dendrítica que foi contatada com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa para ativar a célula dendrítica, em que as células dendríticas ativadas aumentam a expressão de superfície de CD86, CD80, e HLA-DR.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células de apresentação de antígeno compreendem uma célula dendrítica que foi contatada com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa para ativar a célula dendrítica, em que as células dendríticas ativadas aumentam a secreção de IL-12p4 0, MCP-1, IL-8, TNFa, IL-6, ΜΙΡ-la, e IL-Ib e combinações dos mesmos.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células de apresentação de antígeno compreendem uma célula dendrítica que foi contatada com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa e o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo aumenta a ativação conjuntamente com a sinalização através de CD40.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células de apresentação de antígeno compreendem uma célula dendrítica que foi contatada com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa e o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo aumentou a atividade co-estimulatória de células dendríticas.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células dendríticas contatadas com o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo têm uma mudança no perfil de expressão em um ou mais genes selecionados daqueles na Figura 4.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo específico de L0X-1 ou fragmento do mesmo é selecionado a partir do clone 9D7-10-4, 8Β4-10-2, 11C8-B7, 13Β11-Α8 e combinações dos mesmos.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células dendríticas ativadas através do receptor LOX-I com o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo ativam as células B, células T e combinações das mesmas.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo é ligado a uma metade de um par de Coesina/Doquerina.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo é ligado a uma metade de um par de Coesina/Doquerina e a outra metade do par é ligada a uma ou mais da citocinas selecionados de interleucinas, fatores de crescimento transformadores (TGFs), fatores de crescimento de fibroblasto (FGFs), fatores de crescimento derivados de plaqueta (PDGFs), fatores de crescimento epidérmico (EGFs) , peptídeos ativados de tecido conectivo (CTAPs), fatores osteogênicos, e análogos, fragmentos, e derivados biologicamente ativos de tais fatores de crescimento, fatores de diferenciação de célula B/T, fatores de crescimento de célula B/T, citocinas mitogênicas, citocinas quimiotáticas e quimiocinas, fatores de estimulação de colônia, fatores de angiogênese, IFN-α, IFNβ, IFN-Y, ILl, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, ILll, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, etc., leptina, miostatina, proteína de estimulação de macrófago, fator de crescimento derivado de plaqueta, TNF-a, TNF-β, NGF, CD40L, CD13 7L/4-IBBL, Iinfotoxina-β humana, G-CSF, MCSF, GM-CSF, PDGF, IL-Ια, ILl-β, ΙΡ-10, PF4, GRO, 9Ε3, eritropoietina, endostatina, angiostatina, VEGF, família de supergene de fator de crescimento transformador (TGF) que incluem os beta fatores de crescimento transformadores (por exemplo TGF-βΙ, TGF-β2, TGF-β3); proteínas morf ogenênicas de osso (por exemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); fatores de crescimento ligantes de heparina (fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)); Inibinas (por exemplo, Inibina A, Inibina B); fatores de diferenciação de crescimento (por exemplo, GDF-1); e Activinas (por exemplo, Activina A, Activina B, Activina AB).
14. Hibridoma que expressa um anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo específico de L0X-1 ou fragmento do mesmo ativa uma célula de apresentação de antígeno para expressar novos marcadores de superfície, secretar uma ou mais citocinas ou ambos.
15. Hibridoma, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o hibridoma é selecionado a partir dos clones 9D7-10-4, 8B4-10-2, 11C8-B7, 13B11-A8 e combinações dos mesmos.
16. Método para aumentar as respostas imunes de célula B caracterizado pelo fato de que compreende ativar um receptor L0X-1 em uma célula dendrítica com um anticorpo específico de LOX-1 ou fragmento do mesmo na presença de antígeno, em que uma célula B que é contatada com a célula dendrítica ativada de LOX-I aumenta a produção de anticorpo, secreta citocinas, aumenta a expressão de marcador de superfície de ativação de célula B e combinações das mesmas.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as células B secretam IL-8, MIP-Ia, IL-6, TNFa e combinações dos mesmos.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as células B compreendem células plasmáticas.
19. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as células B ativadas pelo anticorpo anti-LOX-l retornam à mucosa.
20. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as células B ativadas expressam LOX-I.
21. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a célula B aumenta a produção de IgG, IgM, IgA e combinações das mesmas.
22. Método para aumentar as respostas imunes de célula B caracterizado pelo fato de que compreende ativar um receptor LOX-I em uma Célula B com um anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo, em que a célula B aumenta a produção de anticorpo.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a célula B aumenta a produção de IL-8, MIP-Ia, IL-6, TNFa secretados e combinações dos mesmos.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a célula B aumenta a produção de IgG, IgM, IgA e combinações das mesmas.
25. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a célula B aumenta a produção de IgAl e IgA2.
26. Método para melhorar a ativação de célula T caracterizado pelo fato de que compreende ativar um receptor LOX-I em uma célula dendrítica com um anticorpo específico de LOX-I ou fragmento e contatar uma célula T com a célula dendrítica ativada de LOX-1, em que a ativação de célula T é melhorada.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as células dendríticas são ainda contatadas com GM-CSF e IL-4, Interferon alfa, antígeno e combinações dos mesmos.
28. Método,' de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que aumenta a ativação de células T CD8+.
29. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as células T proliferam sob exposição a células dendríticas ativadas com os anticorpos anti-L0X-l ou fragmentos dos mesmos.
30. Imunoglobulina anti-LOX-1 ou porção da mesma que é secretada por células de mamífero e um antígeno ligado à imunoglobulina, caracterizada pelo fato de que a imunoglobulina tem como alvo o antígeno para as células de apresentação de antígeno e as células de apresentação de antígeno estimulam a proliferação de células CD4+.
31. Imunoglobulina, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o domínio específico de antígeno compreende um anticorpo de comprimento inteiro, um domínio de região variável de anticorpo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2, e fragmento Fv, e fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fe.
32. Imunoglobulina, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a imunoglobulina ou porção da mesma compreende pelo menos um dos Id. de Seq. N°: Ia 11.
33. Vacina caracterizada pelo fato de que compreende uma célula dendrítica ativada com um anticorpo específico de LOX-I ou fragmento do mesmo.
34. Carreador de rAb modular caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação de anticorpo específico de L0X-1 ligado a um ou mais domínios de carreador de antígeno que compreendem uma metade de um par de ligação de coesina-doquerina.
35. Carreador, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação antígeno-específico compreende pelo menos uma porção de um anticorpo.
36. Carreador, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação antígeno-específico compreende pelo menos uma porção de um anticorpo em uma proteína de fusão com uma metade dos pares de ligação de coesina-doquerina.
37. Carreador, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma metade complementar do par de ligação de coesina-doquerina ligada a um antígeno que forma um complexo com o carreador de rAb modular.
38. Carreador, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma metade complementar do par de ligação de coesina-doquerina que é uma proteína de fusão com um antígeno.
39. Carreador, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o domínio específico de antígeno compreende um anticorpo de comprimento inteiro, um domínio de região variável de anticorpo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2/ e fragmento Fv, e fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fc.
40. Uso de agentes que acoplam o receptor L0X-1 a células imunes, sozinho ou com agentes de co-ativação, a combinação ativando células de apresentação de antígeno, caracterizado pelo fato de ser para aplicações terapêuticas
41. Uso de um agente de ligação de L0X-1 ligado a um ou mais antígenos, com ou sem agentes de ativação, em células imunes caracterizado pelo fato de ser para fazer uma vacina.
42. Uso de agentes anti-LOX-1 como agentes de coativação de células imunes caracterizado pelo fato de ser para aumentar as respostas imunes direcionadas através de um receptor de superfície celular diferente de LOX-I expresso em células imunes.
43. Uso de seqüências de região V de anticorpo antiLOX-I capazes de se ligararem a e ativar células imunes através do receptor LOX-I caracterizado pelo fato de ser para ativar células imunes.
44. Uso de agentes de ligação de DC-LOX-I ligados a um ou mais agentes tóxicos caracterizado pelo fato de ser para finalidades terapêuticas no contexto de doenças conhecidas ou suspeitas por resultarem de ativação imprópria de células imunes através de LOX-I ou no contexto de células patogênicos ou tecidos que expressam LOX-1.
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