BRPI0807617A2 - Aplicações terapêuticas de ativação de antígeno humano presente em células através de dectin-1. - Google Patents

Aplicações terapêuticas de ativação de antígeno humano presente em células através de dectin-1. Download PDF

Info

Publication number
BRPI0807617A2
BRPI0807617A2 BRPI0807617-0A BRPI0807617A BRPI0807617A2 BR PI0807617 A2 BRPI0807617 A2 BR PI0807617A2 BR PI0807617 A BRPI0807617 A BR PI0807617A BR PI0807617 A2 BRPI0807617 A2 BR PI0807617A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
dectin
cells
cell
fragment
antigen
Prior art date
Application number
BRPI0807617-0A
Other languages
English (en)
Inventor
F. Banchereau Jacques
Oh Sangkon
Zurawski Gerard
Zurawski Sandra
Ni Ling
Original Assignee
Baylor Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baylor Research Institute filed Critical Baylor Research Institute
Publication of BRPI0807617A2 publication Critical patent/BRPI0807617A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/20—Cellular immunotherapy characterised by the effect or the function of the cells
    • A61K40/24—Antigen-presenting cells [APC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/13—B-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/17—Monocytes; Macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/19—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4271—Melanoma antigens
    • A61K40/4272—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/46—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/108—Orthomyxoviridae (F), e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Description

APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS DA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS APRESENTADORAS DE ANTÍGENO HUMANAS POR MEIO DE DECTINA-1
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
A presente invenção está relacionada em geral ao campo da apresentação de antígeno e da ativação de células imunológicas e, mais particularmente, às composições e aos métodos para a ativação de çélulas imunológicas por meio de Dectina-I.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Sem limitar o escopo da invenção, seus fundamentos são
descritos em conexão com células dendríticas. As células dendríticas têm uma participação crucial no controle da interface de imunidade inata e adquirida ao fornecerem sinais solúveis e intercelulares, seguidos por 15 reconhecimento de patógenos. Essas funções de DCs são em grande parte dependentes da expressão de receptores de superfície especializados, "receptores de reconhecimento de padrão" (PRRs), representados, principalmente, por receptores toll-IiJce (TLRs) e lectinas do Tipo C ou 20 receptores lectina-Iike (LLRs) (1-3).
No paradigma atual, um papel importante dos TLRs é alertar as DCs para produzir interleucina 12 (IL-12) e outras citocinas inflamatórias para a iniciação de respostas imunológicas. LLRs do tipo C operam como 25 constituintes do mecanismo de captura e captação de antígeno poderoso de macrófagos e DCs (1) . Comparados com os TLRs, no entanto, os LLRs podem ter uma gama mais ampla de funções biológicas que incluem migrações de células (4), interações intercelulares (5). Essas múltiplas funções dos 30 LLRs podem ser decorrentes do fato de que os LLRs, diferentemente dos TLRs, podem reconhecer tanto self quanto nonself. No entanto, a complexidade dos LLRs, incluindo a redundância de vários dos LLRs expressos em células imunológicas, tem sido um dos principais obstáculos para a 5 compreensão das funções detalhadas de LLRs individuais. Além disso, ligantes naturais para a maioria desses receptores permanecem não identificados. Não obstante, evidências de estudos recentes sugerem que os LLRs, em colaboração com TLRs, podem contribuir para a ativação de 10 células imunológicas durante infecções microbianas (6-14). Comparada com outros LLRs, Dectina-I comprovadamente possui um motivo de ITAM que libera sinais para ativar células que expressam Dectina-I. No entanto, a maioria dos estudos foi realizada no modelo em camundongo, e a função biológica de 15 Dectina-I expressa em células apresentadoras de antígeno humanas, incluindo DCs, monócitos e células B, ainda não foi bem caracterizada. Isso é particularmente importante na medida em que não há uma concordância absoluta entre camundongos e seres humanos para muitos dos LLRs.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção inclui composições e métodos para a produção e utilização de vacinas que direcionam especificamente (liberam) antígenos às células apresentadoras de antígeno a fim de despertar respostas imunológicas potentes e amplas dirigidas contra o antígeno.
O objetivo é primariamente despertar respostas imunológicas protetoras ou terapêuticas contra o agente (patógeno ou câncer) do qual o antígeno foi derivado. Além disso, a invenção inclui agentes que são, diretamente ou em associação a outros agentes, terapêuticos por meio de sua ligação específica de um receptor denominado Dectina-I que é expresso em células apresentadoras de antígeno.
Os presentes inventores mostram que a expressão de Dectina-I em células humanas é restrita às células apresentadoras de antígeno, incluindo DCs, monócitos e células B. Sabe-se que a Dectina-I expressa em células de camundongo (macrófagos) é infra-regulada pelo ligante de TLR4 e IL-IO, e aqui demonstramos que apenas o ligante de TLR4 pode infra-regular a expressão de Dectina-I em DCs humanas e que IL-IO produz uma expressão ligeiramente aumentada de Dectina-I. Curiosamente, a Dectina-I expressa em DCs humanas apresenta sinergia com TLR4 bem mais eficazmente do que com TLR2, e a sinergia entre Dectina-I e TLR4 resulta na produção dramaticamente aumentada de citocinas e quimiocinas, particularmente IL-12, o que não fpi observado previamente em modelos em camundongo. As células B humanas da amídala podem ser divididas em dois grupos: CD19+Dectina-1+ e CD19+Dectina-1'. Esses achados também podem ser usados em reagentes terapêuticos e preventivos com base em agentes anti-Dectina-1.
Portanto, verificou-se aqui que a sinalização por meio de Dectina-I humana é única e funcional, tanto isoladamente quanto em colaboração com outros sinais celulares, em termos de . ativação de células (incluindo DCs) . A ativação 25 celular mediada por Dectina-I é induzida por mAbs antiDectina-1 específicos e, portanto, esses mAbs anti-Dectina
1 humana serão úteis para o desenvolvimento de reagentes contra doenças.
A presente invenção inclui composições e métodos para o aumento da eficácia de apresentação de antígeno por uma célula apresentadora de antígeno que expressa Dectina-I por contato da célula apresentadora de antígeno com um anticorpp anti-Dectina-l-específico, ou fragmento deste, capaz de ativar a célula apresentadora de antígeno, em que 5 a célula apresentadora de antígeno é ativada. Exemplos de células apresentadoras de antígeno incluem células dendríticas, células mononucleares do sangue periférico, monócitos, células B, células dendríticas mielóides e combinações destes. A célula apresentadora de antígeno pode 10 ser cultivada in vitro com GM-CSF e IL-4, interferon alfa, antígeno e combinações destes. Com a ativação das células apresentadoras de antígeno que tiveram contato com GM-CSF e IL-4 e um anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste, é obtido um aumento na expressão de superfície de 15 CD86, CD80 e HLA-DR na célula apresentadora de antígeno. Quando se faz a ativação das células apresentadoras de antígeno com Interferon alfa e com o anticorpo Dectina-lespecíf ico ou fragmento deste, as células aumentam a expressão de superfície de CD86, CD83, CD80 e HLA-DR.
Ainda outro método da presente invenção inclui o
contato da célula dendrítica que foi colocada em contato com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa para ativar a célula dendrítica, em que as células dendríticas ativadas aumentam a expressão de superfície de CD8 6, CD8 0 e HLA-DR. Para 25 células dendríticas que não foram colocadas em contato com o anticorpo anti-Dectina-1 ou fragmentos deste e GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa para ativar a célula dendrítica, as células dendríticas ativadas aumentam a secreção de IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, IP-IO e MIP-Ia e combinações destes. 30 Ainda outro método de ativação de células dendríticas inclui o contato com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa e o anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste, o que aumenta a ativação em conjunto com a sinalização por meio de CD40. Verificou-se que a célula dendrítica que entrou em 5 contato com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa e o anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste possui atividade co-estimuladora aumentada por células dendríticas de çélulas B e células T.
Ainda outro método inclui o contato de uma célula 10 apresentadora de antígeno com o anticorpo anti-Dectina-1 e a co-ativação da célula apresentadora de antígeno por meio do receptor TLR4, em que as células aumentam a produção de citocina e quimiocina. A co-ativação da célula apresentadora de antígeno por ativação por meio do receptor 15 TLR4 faz com que as células aumentem secreção de IL-10, ILIb, TNFa, IL-12p4 0 e combinações destes.
O método ainda compreende a etapa de co-ativação da célula apresentadora de antígeno por ativação por meio do receptor TLR4 usando pelo menos um de um ligante de TLR4, um anticorpo anti-TLR4 ou fragmentos deste, um anticorpo híbrido anti-TLR4-anti-Dectina-l ou fragmento deste, um conjugado de ligante anti-TLR4-anti-Dectina-l. O anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste pode ser um ou mais dos clones selecionados de 15E2.5, 11B6.4, 15F4.7, 14D6.3 e 9H7.6 e combinações destes. As células dendríticas podem ser ativadas por meio do receptor Dectina-I com o anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste para a ativação de monócitos, células dendríticas, células mononucleares do sangue periférico, células B e combinações destes. O anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste pode ser ligado a uma metade de um par de coesina/doguerina. Quando o anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste está ligado a uma metade de um par de coesina/doquerina, a outra metade do par pode estar ligada a um ou mais antígenos, citocinas selecionadas de interleucinas, fatores de transformação do crescimento (TGFs), fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs), fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs), fatores de crescimento epidérmicos (EGFs), peptídeos ativados por tecido conjuntivo (CTAPs), fatores osteogênicos, e análogos, fragmentos e derivados biologicamente ativos desses fatores de crescimento, fatores de diferenciação de células B/T, fatores de crescimento de células B/T, citocinas mitogênicas, citocinas e quimiocinas quimiotácticas, fatores de estimulação de colônias, fatores de angiogênese, IFN-oí, IFN-β, IFN-γ, ILl, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, ILlO, ILll, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 etc., leptina, miostatina, proteína de estimulação de macrófagos, fator de crescimento derivado de plaquetas, TNF-α, TNF-β, NGF, CD4 0L, CD137L/4-IBBL, Iinfotoxina-β humana, G-CSF, MCSF, GM-CSF, PDGF, IL-la, ILl-β, IP-10, PF4, GRO, 9E3, eritropoietina, endostatina, angiostatina, VEGF, família do supergene do fator de transformação do crescimento (TGF) incluem os fatores de transformação do crescimento beta (por exemplo, TGF-βΙ, TGF^2, ΤϋΕ-β3) ; proteínas morfogenéticas ósseas (por exemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); fatores de crescimento de ligação de heparina (fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento insulina-Iike (IGF)); Inibinas (por exemplo, Inibina A, Inibina B) ; fatores de diferenciação do crescimento (por exemplo, GDF-1); e Activinas (por exemplo, Activina A, Activina B, Activina AB).
A presente invenção inclui um hibridoma e anticorpos
isolados deste que expressam um anticorpo Dectina-lespecíf ico ou fragmento deste, em que o anticorpo Dectinal-específ ico ou fragmento deste ativa uma célula apresentadora de antígeno para expressar novos marcadores 10 de superfície, secretar uma ou mais citocinas, ou ambos. 0 hibridoma pode ser selecionado de clone PABl, PAB4, PAB5, PAB8, PABlO e combinações destes.
Um método para o aumento de respostas imunológicas de células B que inclui o acionamento de um receptor Dectina-I em uma célula dendrítica com um anticorpo específico para Dectina-I ou fragmento deste na presença de antígeno e um ativador de TLR9, em que uma célula B que é colocada em contato com a célula dendrítica ativada por Dectina-1/TLR9 aumenta a produção de anticorpo, secreta citocinas, aumenta a expressão de marcador de superfície da ativação de células B e combinações destes. As células B ativadas com o uso dessas células dendríticas secretam IL-8, MIP-Ια, IL-6, TNFa e combinações destes. Exemplos de células B incluem células plasmáticas, que também podem expressar Dectina-I e/ou aumentar a produção de IgM.
A presente invenção também inclui um método para o aumento de respostas imunológicas de células B que compreende o acionamento de um receptor Dectina-I em uma célula B com um anticorpo específico para Dectina-I ou fragmento deste, em que a célula B aumenta a produção de anticorpo. As células B ativadas usando a presente invenção aumentam a produção de IL-8, MIP-la, IL-6, TNFa secretados e combinações destes, e/ou aumentam a produção de IgG, IgM, IgA e combinações destas.
A presente invenção também inclui um método para o
aumento da ativação de células T por acionamento de um receptor Dectina-I em uma célula dendrítica com um anticorpo específico para Dectina-I ou fragmento deste e receptor TLR4 e o contato de uma célula T com a célula 10 dendrítica ativada por Dectina-1/TLR4, em que a ativação de células T é aumentada. As células dendríticas usadas para a ativação podem ser colocadas em contato com GM-CSF e IL-4, interferon alfa, antígeno e combinações destes. O anticorpo específico para Dectina-I ou fragmento deste aumenta a 15 secreção de IL-10, IL-15 e combinações destas pelas células T. As células T ativadas pelas células dendríticas podem aumentar a expressão de superfície de 4-IBBL e/ou proliferar.
A presente invenção também inclui uma imunoglobulina 20 anti-Dectina-1 ou porção desta que é secretada por células de mamíferos e um antígeno ligado à imunoglobulina, em que a imunoglobulina direciona o antígeno às células apresentadoras de antígeno. O domínio antígeno-específico inclui um anticorpo de comprimento total, um domínio da 25 região variável de anticorpo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2 e fragmento Fv, e fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fe.
Ainda outra modalidade da presente invenção inclui uma vacina que inclui uma célula dendrítica ativada com um anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste. A presente invenção também inclui células B, células T ou outras células imunológicas que são ativadas diretamente pelo anticorpo Dectina-1-específico ou fragmentos deste 5 e/ou por células apresentadoras de antígeno, por exemplo, células dendríticas, que foram ativadas com o anticorpo Dectina-l-específico ou fragmentos deste isoladamente ou em combinação com as outras células imunológicas. Por exemplo, uma terapia combinada pode incluir células apresentadoras 10 de antígeno carregáveis com antígeno (por exemplo, uma célula dendrítica) que foram ativadas com o anticorpo Dectina-l-específico ou fragmentos deste, uma célula B e/ou uma célula T que, em conjunto, formam a vacina.
A presente invenção também inclui o uso de agentes que ligam o receptor Dectina-I em células imunológicas, isoladamente ou com agentes de co-ativação, a combinação ativando células apresentadoras de antígeno para aplicações terapêuticas; o uso de um agente de ligação de Dectina-I ligado a um ou mais antígenos, com ou sem agentes de ativação, em células imunológicas para fazer uma vacina; o uso de agentes anti-Dectina-1 como agentes de co-ativação de células imunológicas para o aumento de respostas imunológicas dirigidas por meio de um receptor da superfície celular diferente da Dectina-I expressa em células imunológicas; o uso de seqüências da região V do anticorpo anti-Dectina-1 capazes de se ligar e ativar células imunológicas por meio do receptor Dectina-I e/ou o uso de agentes de ligação de Dectina-I ligados a um ou mais agentes tóxicos para fins terapêuticos no contexto de doenças que sabidamente ou com suspeita de resultarem da ativação inadequada de células imunológicas por meio de Dectina-I ou no contexto de células patogênicas ou tecidos que expressam Dectina-1.
Ainda outra modalidade da presente invenção inclui um carreador modular de rAb que inclui um domínio de ligação do anticorpo específico para Dectina-I ligado a um ou mais domínios de veículo de antígeno que compreendem metade de um par de ligação de coesina-doquerina. O domínio de ligação antígeno-específico pode ser pelo menos uma porção de um anticorpo e/ou pelo menos uma porção de um anticorpo em uma proteína de fusão com a metade do par de ligação de coesina-doquerina. O rAb também pode ser uma metade complementar do par de ligação de coesina-doquerina ligada a um antígeno que forma um complexo com o carreador modular de rAb e/ou uma metade complementar do par de ligação de coesina-doquerina que é uma proteína de fusão com um antígeno. O domínio antígeno-específico pode ser um anticorpo de comprimento total, um domínio da região variável de anticorpo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2 e fragmento Fv, e fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fe.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Para uma compreensão mais completa das características e vantagens da presente invenção, será feita referência agora à descrição detalhada da invenção, juntamente com as figuras que a acompanham, e nas quais:
As Figuras IA e IB mostram os níveis de expressão de Dectina-I em PBMCs de doadores normais;
A Figura 2 mostra os resultados de IL-4DCS cultivadas in vitro que foram cultivadas na presença de CD4 0L (50 ng/ml) , ligante de TLR2 (100 ng/ml) , ligante de TLR3 (100 nM) , ligante de TLR4 (20 ng/ml) , IL-10 (20 ng/ml) , IL-15 (100 ng/ml) , IFNa (500 U/ml) e IL-4 (50 ng/ml) por 24 horas;
A Figura 3 demonstra que mAbs anti-Dectina-1 ativam
DCs ;
As Figuras 4A e 4B mostram que a sinalização por meio de Dectina-I pode resultar na ativação tanto de IL-4DCs quanto de IFNDCs. mAbs anti-Dectina-1 ativam DCs. IFNDCs 10 (Figura 4A) e IL-4DCS (Figura 4B) foram estimuladas com anti-Dectina-1 por 24 horas, e depois as células foram coradas com anti-CD86, 80, 40, 83, CCR7 e HLA-DR;
A Figura 5 mostra que Dectina-I e TLRs apresentam sinergia para ativar DCs. IL-4DCS (2 x 10e5/200 μΐ/poço) 15 foram cultivadas em placas de 96 poços revestidas com antiDectina-1 na presença ou ausência de ligante de TLR4 solúvel (1,5 ng/ml) ou ligante de TLR2 (30 ng/ml) por 18 horas. mAbs de controle também foram testados. Após 18 horas, os sobrenadantes da cultura foram analisados para 20 medir citocinas e quimiocinas por Luminex;
As Figuras SA e 6B mostram os resultados para IFNDCs (5.000 DCs/poço/200 μΐ) carregadas com 10 μΜ de peptídeo Mart-I e ativadas com mAbs anti-Dectina-1, ligante de TLR4 ou mAbs anti-Dectina-1 e ligante de TLR4 por 18 horas 25 (Figura 6A). Células T CD8 autólogas purificadas (2 x 10e5 células/poço/200 μΐ) foram co-cultivadas na presença de 20 U/ml de IL-2 e 10 ng/ml de IL-7 por 10 dias. As células foram coradas com anti-CD8 e Mart-l-HLA-A2-tetrâmero. A Figura 6B mostra os resultados para IFNDCs (5.000 30 DCs/poço/200 μΐ) que foram carregadas com 10 μΜ de peptídeo Mart-I e ativadas com mAbs anti-Dectina-1, ligante de TLR2, ou mAbs anti-Dectina-1 e ligante de TLR2 por 18 horas. Células T CD 8 autólogas purificadas (2 x IO5 células/poço/200 μΐ) foram co-cultivadas na presença de 20
U/ml de IL-2 e 10 ng/ml de IL-7 por 10 dias. As células foram coradas com anti-CD8 e Mart-l-HLA-A2-tetrâmero;
A Figura 7 mostra os resultados para IFNDCs (5.000 DCs/poço/200 μΐ) carregadas com 10 μΜ de peptídeo Mart-I e ativadas com mAbs anti-Dectina-1, ligante de TLR4, ou mAbs 10 anti-Dectina-1 e ligante de TLR4, Zymosan por 18 horas. Anticorpo neutralizante anti-IL-10 (5 μg/ml) foi adicionado nas DCs estimuladas com anti-Dectina-1 e ligante de TLR4 e Zymosan. Anticorpo de controle para anti-IL-10 também foi testado, mas não foram observadas diferenças significantes 15 (dados não mostrados) . Células T CD8 autólogas purificadas (2 x 10e5 células/poço/200 μ) foram co-cultivadas na presença de 20 U/ml de IL-2 e 10 ng/ml de IL-7 por 10 dias. As células foram coradas com anti-CD8 e Mart-I-HLA-A2- tetrâmero;
A Figura 8 mostra que DCs ativadas com mAbs anti
Dectina-1 expressam níveis aumentados de IL-15 e 4-IBBL. IFNDCs (2 x IO5 /200 μΐ/poço) foram cultivadas nas placas de 96 poços revestidas com anti-Dectina-1 ou Ig de controle por 18 horas. Após 18 horas, as células foram coradas com anti-IL-15 e anti-4-lBBL;
As Figuras 9A e 9B mostram que Dectina-I expressa em DCs contribui para respostas imunológicas humorais aumentadas. IL-4 DCs de seis dias, 5 x 103/poço, foram incubadas em placas de 96 poços revestidas com antiDectina-I ou mAbs de controle por 16-18 horas, e depois 2 x 10e4 células B CD19+ autólogas coradas com CFSE foram cocultivadas na presença de 2 0 U/ml de IL-2 e 50 ng/ml de CD4 0L (Figura 9A) ou 50 nM de CpG (Figura 9B) . No 6° dia, as células foram coradas com anticorpo anti-CD3 8 marcado de 5 forma fluorescente. Os sobrenadantes da cultura no 13° dia foram analisados quanto às imunoglobulinas totais por ELISA em sanduíche;
As Figuras IOA e IOB mostram que Dectina-I expressa em células B contribui para a ativação de células B e para a 10 produção de imunoglobulina. Figura 10A. Células B CD19 + purifiçadas (20.000 células/poço/200 μΐ) foram cultivadas em placas revestidas com os mAbs, anti-Dectina-1 ou Ig de controle, na presença de 50 nM de CpG e 20 U/ml de IL-2 por
6 dias. As células foram coradas com anti-CD38 e a proliferação celular foi medida por diluição de CFSE. Figura 10B. No 13° dia da cultura, os sobrenadantes da cultura foram analisados pela medida de imunoglobulinas totais produzidas por ELISA;
As Figuras IlA a IlC mostram que Dectina-I expressa em DCs contribui para respostas imunológicas celulares aumentadas. Figura 11A. 5 x IO3 de IFNDCs foram cultivadas em placas revestidas com anti-Dectina-1 ou mAbs de controle na presença de 100 nM de proteína Flu Ml recombinante por 16-18 horas, e depois células T CD8 autólogas purificadas foram co-cultivadas na presença de 20 U/ml de IL-2 e 10 ng/ml de IL-7 por 7 dias. As células foram coradas com anti-CD8 e tetrâmero para o epitopo de peptídeo Flu Ml para HLA-A2. Figura IlB e Figura IlC. IFNDCs foram carregadas com 10 μΜ de peptídeo Mart-I (Figura 11B) ou 100 nM de proteína recombinante Coh-Mart-I, e depois estimuladas com anticorpo anti-Dectina-1 ou anticorpos de controle, como descrito na Figura 11A. Após 10 dias de cultura, as células foram coradas com anti-CD8 e tetrâmero (HLA-A2-peptídeo mart-1). Cada linha representa dados gerados de um doador 5 individual. Todas as células usadas neste estudo foram de doadores normais positivos para HLA-A201;
A Figura 12 mostra que mAbs anti-Dectina-1 em forma solúvel ativam DCs para aumentar a sensibilização de células T CD8 específicas para Mart-1. 5 x IO3 de IFNDCs 10 foram cultivadas na presença de 0,5 pg/ml de mAb antiDectina-1, mAb anti-CD4 0 ou mAb de controle por 16 horas. Antes de células T autólogas purificadas (2 x 105/poço) serem adicionados na cultura, 20 μΜ de peptídeo Mart-1 foram adicionados. Após 10 dias, as células foram coradas 15 com anti-CD8 e tetrâmero (HLA-A2-peptídeo mart-1). Todas as células usadas neste estudo foram de doadores normais positivos para HLA-A2 01;
Figura 13 mostra que foram adquiridas amídalas de doadores normais e foi preparada uma suspensão de células 20 com o uso de Colagenase do tipo III sem DNAse. As células foram lavadas vigorosamente com PBS contendo FCS 5%, e depois coradas com anti-CD3 ou anti-CD19 com mAbs antiDectina-1. Foram usados mAbs de controle com isótipo compatível;
As Figuras 14A e 14B mostram que cortes de tecido de
pele (Figura 14A) e linfonodos (Figura 14B) humanos de doadores normais foram preparados e corados com DAPI (Azul) e anti-Dectina-1 (Vermelho) preparados neste estudo;
A Figura 15 mostra que PBMC de primatas não humanos (Cynomolgus) foram coradas com mAb anti-Dectina-1 e anticorpos para marcadores da superfície celular;
A Figura 16 mostra análise por SDS-PAGE reduzida de proteínas de fusão rAb.antígeno típicas, que abrigam muitos dos antígenos mostrados ou mencionados acima.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Embora a produção e a utilização de várias modalidades da presente invenção sejam discutidas com detalhe abaixo, deve ser observado que a presente invenção fornece muitos conceitos aplicáveis da invenção que podem ser 10 exemplificados em diversos contextos específicos. As modalidades específicas aqui discutidas são meramente ilustrativas de formas e usos específicos da invenção, e não delimitam o escopo da invenção.
Para facilitar a compreensão desta invenção, diversos 15 termos serão definidos abaixo. Os termos aqui definidos possuem os significados normalmente utilizados por aqueles habilitados nas áreas relevantes para a presente invenção. Termos como, por exemplo, "um", "uma", "o" e "a" não se referem apenas à forma no singular, mas incluem a classe 20 geral da qual um exemplo específico pode ser usado para ilustração. A terminologia é aqui usada para descrever modalidades específicas da invenção, mas sua utilização não delimita a invenção, exceto como estabelecido nas reivindicações.
A presente invenção também inclui um mAb humanizado
recombinante (direcionado ao receptor Dectina-I específico da célula dendrítica humana) fundido por meio da cadeia pesada do Ab aos antígenos sabidamente ou suspeitos de codificarem antígenos protetores. Esses incluem, como exemplos para vacinação contra vários agentes, hemaglutiiLinas de Influenza H5N1; gag de HIV de toxinas atenuadas de Ricina, toxina do antraz e enterotoxina de Staphylococcus B; "strings" de peptídeos antigênicos de antígenos de melanona etc. A presente invenção encontrará 5 utilidade na vacinação preventiva ou terapêutica de pessoas em risco cm infectadas. A invenção possui ampla aplicação para vacinação contra muitas doenças e cânceres, para uso tanto em serem humanos quanto em animais.
Como a.qui usado, o termo "carreador modular de rAb" é usado para descrever um sistema de anticorpo recombinante que foi criado geneticamente para permitir a adição modular controlada de diversos antígenos, proteínas de ativação ou outros anticorpos a um único anticorpo monoclonal recombinante (mAb), nesse caso, um anticorpo monoclonal anti-Dectina-I. O rAb pode ser um anticorpo monoclonal feito com o uso de técnicas padronizadas de hibridoma, apresentação de anticorpo recombinante, anticorpos monoclonais humanizados, e semelhantes. O carreador modular de rAb pode ser usado, por exemplo, para direcionar (por meio de um anticorpo recombinante primário contra um receptor de internaiização, por exemplo, um receptor de célula dendrítica humana) múltiplos antígenos e/ou antígenos e ima citocina de ativação às células dendríticas (DC). O carreador modular de rAb também pode ser usado para unir dois mAbs recombinantes diferentes de ponta a ponta de uma forma controlada e definida.
A porção de ligação de antígeno do "carreador modular de rAb" pode ser um ou mais domínios variáveis, um ou mais domínios variáveis e o primeiro domínio constante, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2, e um fragmento Fv, e um fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fc ao qual as porções de ligação modulares cognatas são adicionadas à seqüência de aminoácidos e/ou ligadas. O anticorpo para uso no carreador 5 modular de rAb pode ser de qualquer isótipo ou classe, subclasse ou de qualquer fonte (animal e/ou recombinante).
Em um exemplo não limitante, o carreador modular de rAb é criado geneticamente para ter um ou mais domínios modulares de proteína coesina-doquerina para a produção de 10 complexos de proteína específicos e definidos no contexto de mAbs recombinantes criados geneticamente. O mAb é uma porção de uma proteína de fusão que inclui um ou mais carbóxis dos domínios modulares de proteína coesinadoquerina dos domínios de ligação de antígeno do mAb. Os 15 domínios de proteína coesina-doquerina podem até mesmo ser anexados pós-tradução, por exemplo, com a utilização de vinculadores cruzados químicos e/ou pontes dissulfeto.
O termo "antígeno", como aqui usado, refere-se a uma molécula que pode iniciar uma resposta imunológica humoral e/ou celular em um receptor do antígeno. O termo "antígeno" pode ser usado em dois contextos diferentes com a presente invenção: como um alvo para o anticorpo ou outro domínio de reconhecimento de antígeno do rAb, ou como a molécula que é conduzida a e/ou para dentro de uma célula ou alvo pelo rAb como parte de um complemento da molécula de doquerina/coesina para o carreador modular de rAb. O antígeno é normalmente um agente que causa uma doença para a qual uma vacinação seria um tratamento vantajoso. Quando o antígeno é apresentado em MHC, o peptídeo freqüentemente possui um comprimento de cerca de 8 a cerca de 25 aminoácidos. Antígenos incluem qualquer tipo de molécula biológica, incluindo, por exemplo, metabólitos intermediários simples, açúcares, lipídeos e hormônios, além de macromoléculas como, por exemplo, carboidratos 5 complexos, fosfolipídeos, ácidos nucléicos e proteínas. Categorias comuns de antígenos incluem, sem limitação, antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos de protozoários e de outros parasitas, antígenos tumorais, antígenos envolvidos em doença 10 autoimune, alergia e rejeição de enxertos, e outros antígenos diversos.
O carreador modular de rAb é capaz de conduzir qualquer número de agentes ativos, por exemplo, antibióticos, agentes antiinfecciosos, agentes antivirais, 15 agentes antitumorais, antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatórios, agentes terapêuticos para osteoporose, enzimas, citocinas, anticoagulantes, polissacarídeos, colágeno, células, e combinações de dois ou mais dos agentes ativos citados anteriormente. Exemplos de 20 antibióticos para liberação com o uso da presente invenção incluem, sem limitação, tetraciclina, aminoglicosídeos, penicilinas, cefalosporinas, fármacos de sulfonamida, succinato sódico de cloranfenicol, eritromicina, vancomicina, lincomicina, clindamicina, nistatina, 25 anfotericina B, amantidina, idoxuridina, ácido p-amino salicílico, isoniazida, rifampina, antinomicina D, mitramicina, daunomicina, adriamicina, bleomicina, vinblastina, vincristina, procarbazina, imidazol
carboxamida, e semelhantes.
Exemplos de agentes antitumorais para liberação com o uso da presente invenção incluem, sem limitação, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, metotrexato, e semelhantes. Exemplos de antipiréticos e analgésicos incluem aspirina, Motrint, Ibuprofeno®, naprosin, acetaminofeno, e semelhantes.
Exemplos de agentes antiinflamatórios para liberação com o uso da presente invenção incluem, sem limitação, NSAIDS, aspirina, esteróides, dexametasona, hidrocortisona, prednisolona, diclofenaco sódio, e semelhantes.
Exemplos de agentes terapêuticos para o tratamento de
osteoporose e outros fatores que atuam sobre os ossos e o esqueleto para liberação com o uso da presente invenção incluem, sem limitação, cálcio, alendronato, peptídeo ósseo GLa, hormônio da paratireóide e seus fragmentos ativos, 15 peptídeo de formação e proliferação ósseas relacionado à histona H4, e mutações, derivados e análogos destes.
Exemplos de enzimas e co-fatores de enzima para liberação com o uso da presente invenção incluem, sem limitação, pancrease, L-asparaginase, hialuronidase, quimiotripsina, tripsina, tPA, estreptoquinase, uroquinase, pancreatina, colagenase, tripsinogênio,
quimiotripsinogênio, plasminogênio, estreptoquinase, adenil ciclase, superóxido dismutase (SOD), e semelhantes.
Exemplos de citocinas para liberação com o uso da 25 presente invenção incluem, sem limitação, interleucinas, fatores de transformação de crescimento (TGFs), fatores de crescimento de fibroblasto (FGFs), fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs), fatores de crescimento epidérmico (EGFs), peptídeos ativados por tecido conjuntivo 30 (CTAPs), fatores osteogênicos, e análogos, fragmentos e derivados biologicamente ativos desses fatores de crescimento. Citocinas podem ser fatores de diferenciação de células B/T, fatores de crescimento de células B/T, citocinas mitogênicas, citocinas quimiotáticas, fatores de 5 estimulação de colônias, fatores de angiogênese, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, ILl, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, ILlO, ILll, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 etc., leptina, miostatina, proteína de estimulação de macrófagos, fator de crescimento derivado de plaquetas, TNF-α, TNF-β, 10 NGF, CD4 0L, CDl37L/4-IBBL, Iinfotoxina-β humana, G-CSF, MCSF, GM-CSF, PDGF, IL-la, ILl-β, IP-10, PF4, GRO, 9E3, eritropoietina, endostatina, angiostatina, VEGF ou quaisquer fragmentos ou combinações destes. Outras citocinas incluem membros da família do supergene de fator 15 de transformação de crescimento (TGF), que incluem os fatores de transformação de crescimento beta (por exemplo, TGF-βΙ, ΤΰΓ-β2, ΤΘΕ-β3); proteínas morfogenéticas ósseas (por exemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); fatores de crescimento de ligação de 20 heparina (por exemplo, fator de crescimento de fibroblastos (FGF) , fator de crescimento epidérmico (EGF) , fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento insulina-Iike (IGF)); Inibinas (por exemplo, Inibina A, Inibina B) ; fatores de diferenciação do 25 crescimento (por exemplo, GDF-1); e Activinas (por exemplo, Activina A, Activina B, Activina AB).
Exemplos de fatores de crescimento para liberação com o uso da presente invenção incluem, sem limitação, fatores de crescimento que podem ser isolados de fontes nativas ou naturais como, por exemplo, de células de mamíferos, ou que podem ser preparados sinteticamente como, por exemplo, por técnicas de DNA recombinante ou por vários processos químicos. Além disso, análogos, fragmentos ou derivados desses fatores podem ser usados, desde que exibam pelo 5 menos um pouco da atividade biológica da molécula nativa. Por exemplo, análogos podem ser preparados por expressão de genes alterados por mutagênese sítio-específica ou por outras técnicas de engenharia genética.
Exemplos de anticoagulantes para liberação com o uso 10 da presente invenção incluem, sem limitação, warfarin, heparina, hirudina, e semelhantes. Exemplos de fatores que atuam sobre o sistema imunológico para liberação com o uso da presente invenção incluem, sem limitação, fatores que controlam a inflamação e neoplasias malignas, e fatores que 15 atacam microorganismos infecciosos como, por exemplo, peptídeos quimiotáticos e bradicininas.
Exemplos de antígenos virais incluem, sem limitação, por exemplo, antígenos retrovirais, tais como antígenos retrovirais do vírus da imunodeficiência humana (HIV), tais como produtos gênicos dos genes gag, pol e env, a proteína Nef, transcriptase reversa, e outros componentes do HIV; antígenos virais da hepatite, tais como as proteínas S, Me L do vírus da hepatite Β, o antígeno pré-S do vírus da hepatite B, e outros antígenos de hepatite, por exemplo, componentes virais da hepatite A, B e C como, por exemplo, RNA viral da hepatite C; antígenos do vírus influenza como, por exemplo, hemaglutinina e neuraminidase, e outros componentes do vírus influenza; antígenos do vírus do sarampo como, por exemplo, a proteína de fusão do vírus do sarampo e outros componentes do vírus do sarampo; antígenos virais da rubéola como, por exemplo, as proteínas El e E2 e outros componentes do vírus da rubéola; antígenos do rotavírus como, por exemplo, VP7sc e outros componentes do rotavírus; antígenos do citomegalovírus como, por exemplo, 5 a glicoproteína B do envelope e outros componentes antigênicos do citomegalovírus; antígenos do vírus sincicial respiratório como, por exemplo, a proteína de fusão do RSV, a proteína M2 e outros componentes antigênicos do vírus sincicial respiratório; antígenos do 10 vírus do herpes simples como, por exemplo, proteínas iniciais imediatas, glicoproteína D e outros componentes antigênicos do vírus do herpes simples; antígenos do vírus varicela zoster como, por exemplo, gpl, gpll e outros componentes antigênicos do vírus varicela zoster; antígenos 15 do vírus da encefalite japonesa como, por exemplo, as proteínas E, M-E7 M-E-NS1, NSl, NS1-NS2A, E 80%, e outros componentes antigênicos do vírus da encefalite japonesa; antígenos do vírus da raiva como, por exemplo, glicoproteína da raiva, nucleoproteína da raiva e outros 20 componentes antigênicos do vírus da raiva. Veja "Fundamental Virology", Segunda Edição, eds. Fields, Β. N. e Knipe, D. M. (Raven Press, Nova York, 1991) para exemplos adicionais de antígenos virais.
Os alvos antigênicos que podem ser liberados com o uso 25 das vacinas de rAb-DC/DC-antígeno da presente invenção incluem genes que codificam antígenos como, por exemplo, antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos ou antígenos parasíticos. Vírus incluem picornavírus, coronavírus, togavírus, flavivírus, rabdovírus,
paramixovírus, ortomixovírus, buniavírus, arenavírus, reovírus, retrovírus, papilomavírus, parvovírus,
herpesvírus, poxvírus, hepadnavírus e vírus espongiforme. Outros alvos virais incluem o vírus influenza, vírus do herpes simples 1 e 2, vírus do sarampo, dengue, varíola, pólio ou HIV. Patógenos incluem tripanossomos, solitárias, ascárides, helmintos, malária. Marcadores tumorais, tais como antígeno fetal ou antígeno específico da próstata, podem ser direcionados dessa forma. Outros exemplos incluem: proteínas do env de HIV e antígeno de superfície da hepatite B. A administração de um vetor de acordo com a presente invenção para fins de vacinação necessitaria que os antígenos associados ao vetor fossem suficientemente não imunogênicos para permitir a expressão de longo prazo do transgene, para o qual uma forte resposta imunológica seria desejada. Em alguns casos, a vacinação de um indivíduo pode ser necessária apenas raramente, por exemplo, a cada ano ou a cada dois anos, e fornece proteção imunológica de longo prazo contra o agente infeccioso. Exemplos específicos de organismos, alérgenos e seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos para uso em vetores e, em última análise, como antígenos com a presente invenção, podem ser encontrados na Patente U.S. N0 6.541.011, cujas porções relevantes são aqui incorporadas por referência, em particular, as tabelas que combinam organismos e seqüências específicas que podem ser usados com a presente invenção.
Os antígenos bacterianos para uso com a vacina de rAb aqui revelada incluem, sem limitação, por exemplo, antígenos bacterianos como, por exemplo, toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactina, FIM2, FIM3, adenilato ciclase e outros componentes de antígenos bacterianos de pertussis; antígenos bacterianos diftéricos como, por exemplo, toxina ou toxóide diftérico e outros componentes antigênicos bacterianos diftéricos; antígenos bacterianos tetânicos como, por exemplo, toxina ou toxóide 5 tetânico e outros componentes antigênicos bacterianos tetânicos; antígenos bacterianos estreptocócicos como, por exemplo, proteínas M e outros componentes antigênicos bacterianos estreptocócicos; antígenos bacterianos de bacilos gram-negativos como, por exemplo,
lipopolissacarídeos e outros componentes antigênicos bacterianos gram-negativos, antígenos bacterianos de Mycobacterium tuberculosis como, por exemplo, ácido micólico, proteína do choque térmico 65 (HSP65), a proteína secretada principal de 30 kDa, antígeno 85A e outros 15 componentes antigênicos micobacterianos; componentes antigênicos bacterianos de Helicobacter pylori; antígenos bacterianos pneumocócicos como, por exemplo, pneumolisina, polissacarídeos capsulares pneumocócicos e outros componentes antigênicos bacterianos pneumocócicos; 20 antígenos bacterianos de Haemophilus influenza como, por exemplo, polissacarídeos capsulares e outros componentes antigênicos bacterianos de Haemophilus influenza; antígenos bacterianos de antraz como, por exemplo, antígeno protetor de antraz e outros componentes antígenos bacterianos de 25 antraz; antígenos bacterianos de riquétsias como, por exemplo, rompA e outros componentes antigênicos bacterianos de riquétsias. Também são incluídos com os antígenos bacterianos aqui descritos quaisquer outros antígenos bacterianos, micobacterianos, micoplasmáticos, de 30 riquétsias ou de clamídias. Patógenos parciais ou inteiros também podem ser: Haemophilus influenza; Plasmodium falciparum; Neisseria meningitidis; Streptococcus
pneumoniae; Neisseria gonorrhoeae; Salmonella sorotipo typhi; Shigella; Vibrio cholerae; febre da Dengue;
Encefalites; Encefalite Japonesa; doença de Lyme; Yersinia pestis; vírus do Nilo Ocidental; febre amarela; tularemia; hepatite (viral; bacteriana); RSV (vírus sincicial respiratório); HPIV I e HPIV 3; adenovírus; catapora; alergias e cânceres.
Os antígenos fúngicos para uso com composições e
métodos da invenção incluem, sem limitação, por exemplo, componentes antigênicos fúngicos de cândida; antígenos fúngicos de histoplasma como, por exemplo, proteína do choque térmico 60 (HSP60) e outros componentes antigênicos 15 fúngicos de histoplasma; antígenos fúngicos criptocócicos como, por exemplo, polissacarídeos capsulares e outros componentes antigênicos fúngicos criptocócicos; antígenos fúngicos de coccídeos como, por exemplo, antígenos da esférula e outros componentes antigênicos fúngicos de 20 coccídeos; e antígenos fúngicos de tinha como, por exemplo, tricofitina e outros componentes antigênicos fúngicos coccídeos.
Exemplos de antígenos de protozoários e de outros parasitas incluem, sem limitação, por exemplo, antígenos de 25 Plasmodium falciparum como, por exemplo, antígeno de superfícies de merozoíto, antígenos de superfície de esporozoíto, antígenos de circunsporozoíto, antígenos de superfície de gametócito/gameta, antígeno do estágio sangüíneo pf 155/RESA e outros componentes antigênicos de 30 plasmódios; antígenos de toxoplasma como, por exemplo, SAG1, p3 0 e outros componentes antigênicos de toxoplasmas; antígenos de esquistossomos como, por exemplo, glutationaS-transferase, paramiosina e outros componentes de antígeno de esquistossomos; antígenos de Leishmania major e de 5 outras leishmânias como, por exemplo, gp63, lipofosfoglicano e sua proteína associada e outros componentes antigênicos de leishmânias; e antígenos de Trypanosoma cruzi como, por exemplo, o antígeno de 75-77 kDa, o antígeno de 56 kDa e outros componentes antigênicos 10 de tripanossomos.
O antígeno que pode ser direcionado com o uso do rAb da presente invenção geralmente será selecionado com base em diversos fatores, incluindo: probabilidade de internalização, nível de especificidade da célula 15 imunológica, tipo de célula imunológica visada, nível de amadurecimento e/ou ativação da célula imunológica, e semelhantes. Exemplos de marcadores da superfície celular para células dendríticas incluem, sem limitação, MHC Classe I, MHC Classe II, B7-2, CD18, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, 20 CD54, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR e/ou ASPGR, e semelhantes; embora, em alguns casos, também possuam a ausência de CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD56 e/ou CD57. Exemplos de marcadores da superfície celular para células apresentadoras de antígeno incluem, 25 sem limitação, MHC Classe I, MHC Classe II, CD40, CD45, B7- 1, B7-2, receptor de IFN-γ e receptor de IL-2, ICAM-I e/ou receptor Fcy. Exemplos de marcadores da superfície celular para células T incluem, sem limitação, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CDllb, CD16, CD4 5 e HLA-DR.
Antígenos-alvo em superfícies celulares para liberação incluem aqueles característicos de antígenos tumorais que tipicamente serão derivados da superfície celular, citoplasma, núcleo, organelas, e semelhantes, de células do tecido tumoral. Exemplos de alvos tumorais para a porção de anticorpo da presente invenção incluem, sem limitação, cânceres hematológicos, tais como leucemias e Iinfomas, tumores neurológicos, tais como astrocitomas ou glioblastomas, melanoma, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer da cabeça e pescoço, tumores gastrintestinais, tais como câncer gástrico ou do cólon, câncer hepático, câncer pancreático, tumores geniturinários, tais como câncer do cérvice, do útero, câncer ovariano, câncer vaginal, câncer testicular, câncer da próstata ou câncer do pênis, tumores ósseos, tumores vasculares ou cânceres dos lábios, da nasofaringe, da faringe e da cavidade oral, do esôfago, do reto, da vesícula biliar, da árvore biliar, da laringe, pulmão e brônquios, da bexiga, do rim, do cérebro e de outras partes do sistema nervoso, da tireóide, doença de Hodgkin, Iinfoma não Hodgkin, mieloma múltiplo e leucemia.
Exemplos de antígenos que podem ser liberados, isoladamente ou em combinação, às células imunológicas para apresentação de antígeno com o uso da presente invenção incluem proteínas tumorais, por exemplo, oncogenes mutados; proteínas virais associadas a tumores; e mucinas e glicolipídeos tumorais. Os antígenos podem ser proteínas virais associadas a tumores, que seriam daquelas classes de vírus observadas acima. Certos antígenos podem ser característicos de tumores (um subconjunto sendo formado por proteínas não expressas normalmente por uma célula precursora do tumor), ou podem ser uma proteína que é normalmente expressa em uma célula precursora do tumor, mas que possui uma mutação característica de um tumor. Outros antígenos incluem variantes mutantes da proteína normal que possuem uma atividade alterada ou uma distribuição 5 subcelular, por exemplo, mutações de genes que dão origem aos antígenos tumorais.
Exemplos não limitantes específicos de antígenos tumorais incluem: CEA, antígeno específico da próstata (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 e 12, MUC (Mucina) (por exemplo, MUC-1, MUC-2 etc.), gangliosídeos GM2 e GD2, ras, myc, tirosinase, MART (antígeno de melanoma) , Pmel 17 (gplOO) , seqüência V do íntron GnT-V (seqüência V do íntron de N-acetilglucoaminiltransferase V) , Ca psm da Próstata, PRAME (antígeno de melanoma) , βcatenina, MUM-I-B (produto gênico mutado ubíquo do melanoma), GAGE (antígeno de melanoma) I, BAGE (antígeno de melanoma) 2-10, C-ERB2 (Her2/neu), EBNA (antígeno nuclear do vírus de Epstein-Barr) 1-6, gp75, vírus do papiloma humano (HPV) E6 e E7, p53, proteína de resistência do pulmão (LRP), Bcl-2 e Ki-67. Além disso, a molécula imunogênica pode ser um auto-antígeno envolvido na iniciação e/ou propagação de uma doença autoimune, cuja patologia é, em grande parte, causada pela atividade de anticorpos específicos para uma molécula expressa pelo órgão-alvo, tecido ou células relevantes, por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico (LES) ou miastenia grave (MG) . Nessas doenças, pode ser desejável direcionar uma resposta imunológica mediada por anticorpo contínua (ou seja, uma do tipo Th2) ao auto-antígeno relevante em direção a uma resposta imunológica celular (ou seja, uma do tipo Thl) . Alternativamente, pode ser desejável evitar o surgimento ou diminuir o nível de uma resposta Th2 ao auto-antígeno em um indivíduo que não possui, mas com suspeita de ser suscetível à doença autoimune relevante por indução profilática de uma resposta Thl ao auto-antígeno apropriado. Auto-antígenos de interesse incluem, sem limitação: (a) com relação ao LES, a proteína de Smith, ribonucleoproteína RNP e as proteínas SS-A e SS-B; e (b) com relação à MG, o receptor de acetilcolina. Exemplos de outros antígenos diversos envolvidos em um ou mais tipos de resposta autoimune incluem, por exemplo, hormônios endógenos, tais como hormônio luteinizante, hormônio de estimulação folicular, testosterona, hormônio do crescimento, prolactina, e outros hormônios.
Antígenos envolvidos em doenças autoimunes, alergia e rejeição de enxertos podem ser usados nas composições e nos métodos da invenção. Por exemplo, um antígeno envolvido em uma ou mais das seguintes doenças ou distúrbios autoimunes pode ser usado na presente invenção: diabetes, diabetes melito, artrite (incluindo artrite reumatõide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática), esclerose múltipla, miastenia grave, lúpus eritematoso sistêmico, tireoidite autoimune, dermatite (incluindo dermatite atópica e dermatite eczematosa), psoríase, síndrome de Sjògren, incluindo ceratoconjuntivite seca secundária à síndrome de Sjògren, alopecia areata, respostas alérgicas causadas por reações à picada de artrópodes, doença de Crohn, úlcera aftosa, irite, conjuntivite, ceratoconjuntivite, colite ulcerativa, asma, asma alérgica, lúpus eritematoso cutâneo, esclerodermia, vaginite, proctite, erupções farmacológicas, reações de reversão de lepra, eritema nodoso da lepra, uveíte autoimune, encefalomielite alérgica, encefalopatia hemorrágica necrotizante aguda, perda auditiva 5 neurossensorial idiopática bilateral progressiva, anemia aplásica, anemia pura de células vermelhas, trombocitopenia idiopática, policondrite, granulomatose de Wegener, hepatite crônica ativa, síndrome de Stevens-Johnson, espru idiopático, líquen plano, doença de Crohn, oftalmopatia de 10 Graves, sarcoidose, cirrose biliar primária, uveíte posterior e fibrose pulmonar intersticial. Exemplos de antígenos envolvidos em doenças autoimunes incluem ácido glutâmico descarboxilase 65 (GAD 65) , DNA nativo, proteína básica da mielina, proteína proteolipídica da mielina, 15 componentes do receptor de acetilcolina, tireoglobulina e o receptor do hormônio estimulante da tireóide (TSH). Exemplos de antígenos envolvidos em alergia incluem antígenos do pólen como, por exemplo, antígenos do pólen do cedro japonês, antígenos do pólen da ambrosia, antígenos do 20 pólen do azevém, antígenos derivados de animais, tais como antígenos de ácaros e antígenos felinos, antígenos de histocompatibilidade e penicilina, e outros fármacos terapêuticos. Exemplos de antígenos envolvidos em rejeição de enxertos incluem componentes antigênicos do enxerto a 25 serem transplantados no receptor do enxerto como, por exemplo, componentes de enxerto cardíaco, pulmonar, hepático, pancreático, renal e neural. O antígeno pode ser um ligante peptídico alterado útil no tratamento de uma doença autoimune.
Como aqui usado, o termo "epitopo(s)" refere-se a um antígeno peptídico ou protéico que inclui uma estrutura primária, secundária ou terciária similar a um epitopo localizado dentro de qualquer um entre diversos polipeptídeos do patógeno codificados pelo DNA ou RNA do 5 patógeno. 0 nível de similaridade geralmente será em um grau tal que anticorpos monoclonais ou policlonais dirigidos contra esses polipeptídeos se ligarão, reagirão ou de algum outro modo reconhecerão o antígeno peptídico ou protéico. Podem ser empregados vários métodos de 10 imunoensaio em conjunto com esses anticorpos, tais como, por exemplo, Western blotting, ELISA, RIA, e semelhantes, todos os quais são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. A identificação de epitopos do patógeno e/ou de seus equivalentes funcionais adequados para uso em vacinas 15 é parte da presente invenção. Uma vez isolados e identificados, os equivalentes funcionais podem ser facilmente obtidos. Por exemplo, pode-se empregar os métodos de Hopp, como ensinado na Patente U.S. N0 4.554.101, aqui incorporada por referência, que ensina a 20 identificação e preparação de epitopos a partir de seqüências de aminoácidos com base na hidrofilicidade. Os métodos descritos em vários outros trabalhos, e programas de computador neles baseados, também podem ser usados para identificar seqüências epitópicas centrais (veja, por 25 exemplo, Jameson e Wolf, 1988; Wolf e cols., 1988; Patente U.S. N0 4.554.101). A seqüência de aminoácidos dessas "seqüências epitópicas centrais" pode então ser facilmente incorporada em peptídeos, por meio da aplicação de síntese peptídica ou por tecnologia recombinante.
A preparação de composições de vacina que incluem os ácidos nucléicos que codificam antígenos da invenção como o ingrediente ativo pode ser feita como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas à solução ou suspensão em um líquido antes da infecção também 5 podem ser preparadas. A preparação pode ser emulsificada, encapsulada em lipossomos. Os ingredientes imunogênicos ativos são freqüentemente misturados com veículos que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo.
O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere
se a um veículo que não causa uma reação alérgica ou outro efeito indesejável nos indivíduos aos quais é administrado.. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, por exemplo, um ou mais de água, solução salina, solução 15 salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol, ou semelhantes, e combinações destes. Além disso, se desejado, a vacina pode conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares, tais como agentes umidificantes e emulsificantes, agentes de tamponamento do pH e/ou 20 adjuvantes que aumentam a eficácia da vacina. Exemplos de adjuvantes que podem ser eficazes incluem, sem limitação: hidróxido de alumínio, N-acetil-muramil-L-treonil-Disoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-Disoglutamina, MTP-PE e RIBI, que contém três componentes 25 extraídos de bactérias, monofosforil lipídeo A, trehalose dimicolato e esqueleto da parede celular (MPL + TDM + CWS) em uma emulsão 2% de esqualeno/Tween 80. Outros exemplos de adjuvantes incluem DDA (brometo de
dimetildioctadecilamônio), adjuvantes completo e incompleto de Freund e QuilA. Além disso, substâncias de modulação imune como, por exemplo, linfocinas (por exemplo, IFN-γ, IL-2 e IL-12) ou indutores sintéticos de IFN-γ, tais como poli I:C, podem ser usados em combinação com os adjuvantes aqui descritos.
Os produtos farmacêuticos podem incluir um
polinucleotídeo naked com uma única cópia ou com múltiplas cópias das seqüências de nucleotídeos específicas que se ligam a sítios de ligação de DNA específicos das apolipoproteínas presentes em lipoproteínas plasmáticas 10 como descrito na presente invenção. O polinucleotídeo pode codificar um peptídeo biologicamente ativo, RNA anti-senso, ou ribozima, e será fornecido em uma forma administrável fisiologicamente aceitável. Outro produto farmacêutico que pode surgir da presente invenção pode incluir uma fração de 15 lipoproteína plasmática altamente purificada, isolada de acordo com a metodologia aqui descrita do sangue dos pacientes ou de outra fonte, e um polinucleotídeo que contém uma única cópia ou múltiplas cópias das seqüências de nucleotídeos específicas que se ligam aos sítios de 20 ligação de DNA específicos das apolipoproteínas presentes em lipoproteínas plasmáticas, pré-ligado à fração de lipoproteína purificada em uma forma administrável fisiologicamente aceitável.
Ainda outro produto farmacêutico pode incluir uma 25 fração de lipoproteína plasmática altamente purificada que contém fragmentos de apolipoproteína recombinante que contêm uma única cópia ou múltiplas cópias de motivos de ligação de DNA específicos, pré-ligados a um polinucleotídeo que contém uma única cópia ou múltiplas 30 cópias das seqüências de nucleotídeos específicas, em uma forma administrável fisiologicamente aceitável. Ainda outro produto farmacêutico pode incluir uma fração de lipoproteína plasmática altamente purificada que contém fragmentos de apolipoproteína recombinante que contêm uma 5 única cópia ou múltiplas cópias de motivos de ligação de DNA específicos, pré-ligados a um polinucleotídeo que contém uma única cópia ou múltiplas cópias das seqüências de nucleotídeos específicas, em uma forma administrável fisiologicamente aceitável.
A dosagem a ser administrada depende, em grande parte,
do peso corporal e da condição física do indivíduo que está sendo tratado, bem como da via de administração e da freqüência de tratamento. Uma composição farmacêutica que inclui o polinucleotídeo naked pré-ligado a uma fração de 15 lipoproteína altamente purificada pode ser administrada em quantidades que variam de I pg a 1 mg de polinucleotídeo e
1 pg a 100 mg de proteína.
A administração de um rAb e de complexos de rAb a um paciente irá seguir protocolos gerais para a administração 20 de quimioterápicos, levando-se em conta a toxicidade, se houver, do vetor. Antecipa-se que os ciclos de tratamento seriam repetidos, se necessário. Contempla-se também que várias terapias padronizadas, bem como intervenções cirúrgicas, podem ser aplicadas em combinação com a terapia 25 gênica descrita.
Quando a aplicação clínica de uma terapia gênica é contemplada, será necessário preparar o complexo como uma composição farmacêutica adequada à aplicação desejada. Geralmente, isso engloba o preparo de uma composição farmacêutica que é basicamente livre de pirógenos, assim como de outras impurezas que poderiam ser danosas a seres humanos ou animais. Geralmente, também será desejável empregar sais e tampões apropriados para tornar o complexo estável e permitir a captação do complexo pelas célulasalvo.
As composições aquosas da presente invenção podem incluir uma quantidade eficaz do composto, dissolvida ou dispersa em um veículo ou meio aquoso farmaceuticamente aceitável. Essas composições também podem ser denominadas 10 inóculos. O uso desses meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto se quaisquer meios ou agentes convencionais forem incompatíveis com o ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas será contemplado. Ingredientes 15 ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. As composições da presente invenção podem incluir preparações farmacêuticas clássicas. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e misturas destes, e em óleos. Sob 20 condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de microorganismos.
Estados de doença. Dependendo da doença em particular a ser tratada, a administração de composições terapêuticas 25 de acordo com a presente invenção será feita através de qualquer via comum, desde que o tecido-alvo esteja disponível através daquela via a fim de maximizar a liberação de antígeno a um local para uma resposta imunológica máxima (ou, em alguns casos, mínima). A 30 administração geralmente será por injeção ortotópica, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa. Outras áreas para liberação incluem: via oral, nasal, bucal, retal, vaginal ou tópica. A administração tópica seria particularmente vantajosa para o tratamento de 5 cânceres da pele. Tais composições normalmente seriam administradas como composições farmaceuticamente aceitáveis que incluem veículos, tampões ou outros excipientes fisiologicamente aceitáveis.
As composições de vacina ou de tratamento da invenção podem ser administradas parenteralmente, por injeção, por exemplo, por via subcutânea ou intramuscular. Formulações adicionais que são adequadas a outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais ou formulações adequadas à distribuição como aerossóis. No caso das formulações orais, a manipulação de subconjuntos de células T que emprega adjuvantes, envolvimento de antígeno ou a adição de citocinas individuais a várias formulações resulta em vacinas orais aprimoradas com respostas imunológicas otimizadas. Para supositórios, aglutinantes e veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis ou triglicerídeos; esses supositórios podem ser formados por misturas que contêm o ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10%, preferivelmente l%-2%. Formulações orais incluem excipientes normalmente empregados como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, estearato de magnésio de amido, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, e semelhantes. Essas composições assumem a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações ou pós de liberação sustentada, e contêm 10%-95% de ingrediente ativo, preferivelmente 25- 70%.
Os ácidos nucléicos que codificam o antígeno da invenção podem ser formulados nas composições de vacina ou tratamento como formas neutras ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com grupos amino livres do peptídeo) e que são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético, oxálico, tartárico, maléico, e semelhantes. Sais formados com os grupos carboxil livres também podem ser derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxido de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, e semelhantes.
As composições de vacina ou tratamento são administradas de uma forma compatível com a formulação da dosagem, e em tal quantidade que será profilática e/ou terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imunológico do indivíduo para sintetizar anticorpos, e do grau de proteção ou tratamento desejado. Faixas de dosagem adequadas são da ordem de várias centenas de microgramas de ingrediente ativo por vacinação com uma faixa de cerca de 0,1 mg a 1.000 mg, por exemplo, na faixa de cerca de 1 mg a 3 00 mg e, preferivelmente, na faixa de cerca de 10 mg a 50 mg. Os regimes adequados para administração inicial e injeções de reforço também são variáveis, mas são tipificados por uma administração inicial, seguida por inoculações ou outras administrações subseqüentes. As quantidades precisas de ingrediente ativo que precisam ser administradas dependem da avaliação do profissional, e podem ser específicas para 5 cada pessoa. Ficará claro para aqueles habilitados na técnica que a quantidade terapeuticamente eficaz de molécula de ácido nucléico ou de polipeptídeos de fusão desta invenção dependerá, inter alia, da posologia de administração, da dose unitária de antígeno administrada, 10 de se a molécula de ácido nucléico ou o polipeptídeo de fusão é administrado em combinação com outros agentes terapêuticos, do estado imunológico e da saúde do receptor, e da atividade terapêutica da molécula de ácido nucléico ou do polipeptídeo de fusão em particular.
As composições podem ser dadas em uma posologia de
dose única ou de doses múltiplas. Uma posologia de doses múltiplas é aquela na qual um esquema primário de vacinação pode incluir, por exemplo, 1-10 doses separadas, seguidas por outras doses dadas em intervalos de tempo subseqüentes necessários para manter e/ou reforçar a resposta imunológica, por exemplo, em 1-4 meses para uma segunda dose e, se necessário, uma dose(s) subseqüente(s) após vários meses. Reforços periódicos em intervalos de 1-5 anos, normalmente 3 anos, são desejáveis para manter os níveis desejáveis de imunidade protetora. A evolução da imunização pode ser acompanhada por ensaios de proliferação in vitro de linfócitos do sangue periférico (PBLs) cocultivados com ESAT6 ou ST-CF, e pela medida dos níveis de IFN-γ liberados pelos linfócitos sensibilizados. Os ensaios podem ser realizados com a utilização de marcadores convencionais, tais como radionucleotídeos, enzimas, marcadores fluorescentes, e semelhantes. Essas técnicas são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e podem ser encontradas nas Patentes U.S. Nos 3.791.932, 4.174.384 e 5 3.949.064, cujas porções relevantes são aqui incorporadas por referência.
O carreador modular de rAb e/ou complexo conjugado veículo de rAb-(coesina/doquerina e/ou doquerina-coesina)antígeno (vacina de rAb-DC/DC-antígeno) pode ser fornecido 10 em uma ou mais "doses unitárias", dependendo de se os vetores de ácido nucléico são usados, das proteínas purificadas finais ou da forma de vacina final usada. A dose unitária é definida como contendo uma quantidade predeterminada da composição terapêutica calculada para 15 produzir as respostas desejadas em associação com sua administração, ou seja, a via e o regime de tratamento apropriados. A quantidade a ser administrada, e a via e formulação em particular, estão dentro dos conhecimentos daqueles habilitados nas técnicas clínicas. O indivíduo a 20 ser tratado também pode ser avaliado, em particular o estado do sistema imunológico do indivíduo e a proteção desejada. Uma dose unitária não precisa ser administrada como uma injeção única, mas pode incluir a infusão contínua ao longo de um período de tempo definido. A dose unitária 25 da presente invenção pode convenientemente ser descrita em termos de DNA/kg (ou proteína/kg) de peso corporal, com faixas entre cerca de 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,5, 1,
10, 50, 100, 1.000 ou mais mg/DNA ou proteína/kg de peso corporal sendo administradas. Da mesma forma, a quantidade de vacina de rAb-DC/DC-antígeno liberada pode variar de cerca de 0,2 a cerca de 8,0 mg/kg de peso corporal. Dessa forma, em modalidades particulares, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,8 mg, 1,0 mg, 1,5 mg, 2,0 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 4,0 mg, 5,0 mg, 5,5 mg, 6,0 mg, 6,5 mg, 7,0 mg e 7,5 mg da vacina podem ser liberados a um indivíduo in vivo. A dosagem de vacina de rAb-DC/DC-antígeno a ser administrada depende, em grande parte, do peso e da condição física do indivíduo que está sendo tratado, bem como da via de administração e da freqüência de tratamento. Uma composição farmacêutica que inclui um polinucleotídeo naked pré-ligado a um vetor de liberação lipossômica ou viral pode ser administrada em quantidades que variam de I pg a 1 mg de polinucleotídeo até 1 pg a 100 mg de proteína. Dessa forma, composições particulares podem incluir entre cerca de 1 pg, 5 pg, 10 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 100 pg, 150 pg, 200 pg, 250 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg ou 1.000 pg de polinucleotídeo ou proteína que estejam ligados independentemente a 1 pg, 5 pg, 10 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 100 pg, 150 pg, 200 pg, 250 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg,
1 mg, 1, 5 mg, 5 mg, 10 mg, 2 0 mg, 3 0 mg, 4 0 mg, 5 0 mg, 6 0 mg, 7 0 mg, 8 0 mg, 90 mg ou 100 mg de vetor.
A presente invenção foi testada em um sistema celular in vitro que mede a estimulação imune de células T humanas 25 Flu-específicas por células dendríticas às quais o antígeno de Flu foi dirigido. Os resultados aqui apresentados demonstram a expansão específica dessas células antígenoespecíf icas em doses do antígeno que são, por elas próprias, ineficazes nesse sistema.
A presente invenção também pode ser usada para produzir um carreador modular de rAb, ou seja, por exemplo, um mAb recombinante humanizado (dirigido a um receptor de célula dendrítica humana específico) em complexo com antígenos protetores de Ricina, toxina de Antraz e 5 enterotoxina de estafilococo B. 0 mercado potencial para esse produto é a vacinação de todo o pessoal militar e a vacina armazenada mantida em reserva para ser administrada em grandes centros populacionais em resposta a qualquer ameaça biológica relacionada a esses agentes. A invenção 10 possui uma aplicação ampla para o design de vacinas em geral, para uso tanto em seres humanos quanto em animais. As indústrias de interesse incluem as indústrias farmacêuticas e de biotecnologia.
A presente invenção inclui composições e métodos, incluindo vacinas, que direcionam especificamente (liberam) antígenos às células apresentadoras de antígeno (APCs) com a finalidade de despertar respostas imunológicas potentes e amplas dirigidas contra o antígeno. Essas composições despertam respostas imunológicas protetoras ou terapêuticas contra o agente (patógeno ou câncer) do qual o antígeno foi derivado. Além disso, a invenção cria agentes que são diretamente (ou associados a outros agentes) terapêuticos por meio de sua ligação específica a um receptor denominado DC-ASGPR que é expresso em células apresentadoras de antígeno.
Dectina-I (CLEC7A; G.D. Brown, Nat. Rev. Immuno1. 6 (2006), páginas 33-43.) foi relatada originalmente como uma molécula específica da célula dendrítica (DC) com uma capacidade co-estimuladora de células T (N. Kanazawa e cols., J. Biol. Chem. 278 (2003), páginas 32.645-32.652), mas mais tarde sua expressão foi encontrada mais fortemente em monócitos, macrófagos e neutrófilos, e fracamente em um subconjunto de células Te, em seres humanos, células B e eosinófilos. Mais importante, foi determinado que Dectina-I reconhece β-glucano fúngico como o principal receptor não opsônico e é crucial para os efeitos biológicos de βglucano (G.D. Brown, Nat. Rev. Immunol. 6 (2006), páginas 33-43.). A expressão de Dectina-I em macrófagos é supraregulada por IL-4 e IL-13, e infra-regulada por LPS, bem como por IL-IO e dexametasona. Dectina-I contém exclusivamente ITAM em sua região citoplasmática e, na verdade, funciona como um receptor de ativação na ausência de qualquer molécula adaptadora. A estrutura de seu ITAM também é única. Comparada com a seqüência de consenso que contém duas repetições de YxxL/I (tirosina-qualquerqualquer-leucina ou isoleucina) (S.J. van Vliet e cols., Int Immunol 17 (2005), páginas 661-669, três resíduos de aminoácido são inseridos entre a primeira tirosina e a leucina ou isoleucina seguinte (YxxxL/I) na Dectina-I de camundongo ou humana, respectivamente. Na verdade, a fosforilação apenas da segunda tirosina foi supostamente suficiente para o recrutamento de Syk e vários efeitos ativadores de Dectina-I como, por exemplo, indução de fagocitose, produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS) e produção de citocina mediada por ativação de fator nuclear (NF)-kB. No entanto, Syk só era necessário para alguns desses efeitos em certo tipos de células (macrófago ou DCs) . Além disso, alguns desses efeitos necessitavam da cooperação com sinalização de TLR mediada por MyD88. Notavelmente, o sinal de Dectina-I em DCs também induziu a produção de IL-IO de uma forma Syk-dependente. Curiosamente, β-glucano é exposto na superfície de células de levedura apenas sob algumas condições específicas, e a perda do sinal de Dectina-I pode explicar por que alguns 5 fungos escapem da vigilância imunológica do hospedeiro (S.E. Heinsbroek e cols., Trends Inmunol. 26 (2005), páginas 352-354) . Além disso, há relatos de que o sinal mediado por Dectina-I promove a indução de artrite autoimune no camundongo SKG geneticamente predisposto (ΖΑΡΙΟ 70-mutado) (H. Yoshitomi e cols., J. Exp. Med. 201 (2005), páginas 94 9-96 0). Considerando que antígenos de Candida têm sido usados amplamente para a indução de vários modelos de doença autoimune (E.C. Keystone e cols., Arthritis Rheum 20 (1977), páginas 1396-1401), Dectina-I pode participar da 15 quebra a auto-tolerância. Sua possível associação com células T reguladoras, similar àquela da Dectina-2 (E. P. McGreal, M. Rosas, G.D. Brown, S. Zamze, S.Y. Wong e S. Gordon e cols., Glycobiology 16 (2006), páginas 422-430), no entanto, permanece a ser elucidada.
As DCs podem apresentar de forma cruzada antígenos
protéicos (Rock K.L., Immunol. Rev., outubro de 2005; 207: 166-83) . In vivo, DCs recolhem antígenos por meio de diversos receptores e apresentam peptídeos antigênicos tanto na classe I quanto na classe II. Nesse contexto, 25 Lectinas de DC, como receptores de reconhecimento de padrão, contribuem para a captação eficiente de antígenos, assim como para a apresentação cruzada de antígenos.
A presente invenção inclui o desenvolvimento, caracterização e uso de anticorpos monoclonais (mAbs) antiDectina-I humana e a caracterização de suas funções biológicas que levam à descoberta de aplicações terapêuticas prováveis de mAbs anti-Dectina-1 e seus substitutos. A revelação da invenção apresenta meios para o desenvolvimento de agentes únicos capazes de ativar células 5 que abrigam Dectina-1, bem como o efeito das alterações resultantes em células que recebem esses sinais em relação à ação sobre outras células no sistema imunológico. Esses efeitos [tanto isoladamente, quanto em relação a outros sinais (ou seja, co-estimulação)] são altamente preditivos 10 dos resultados terapêuticos para certos estados de doença ou para o aumento dos resultados protetores no contexto de vacinação.
Materiais e métodos
Anticorpos e tetrâmeros - Anticorpos (Abs) para a 15 coloração de superfície de DCs e células B, incluindo Abs de controle de isótipo, foram adquiridos de BD Biosciences (CA). Abs para ELISA foram adquiridos de Bethyl (TX). AntiBLyS e anti-APRIL foram adquiridos de PeproTech (NJ) . Tetrâmeros, HLA-A*0201-GILGFVFTL (Flu Ml) e HLA-A*0201- 20 ELAGIGILTV (Mart-1) foram adquiridos de Beckman Coulter (CA) .
Células e culturas - Monócitos (1 x 106/ml) de doadores normais foram cultivados em meio Cellgenics (França) contendo GM-CSF (100 ng/ml) e IL-4 (50 ng/ml) 25 (R&D, CA) . Para o 3o dia e 6° dia, DCs, nas mesmas quantidades de citocinas, foram suplementadas no meio no Io dia e no 3° dia, respectivamente. As células B foram purificadas com um kit de isolamento negativo (BD). Células T CD4 e CD8 foram purificadas com glóbulos magnéticos 30 revestidos com anti-CD4 ou CD8 (Milteniy, CA) . As PBMCs foram isoladas de camadas de células brancas usando gradientes Percoll™ (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK) por centrifugação por gradiente de densidade. Para ativação de DC, 1 x IO5 DCs foram cultivadas na placa de 96 poços revestida com mAb por 16-18 horas. mAbs (1-2 pg/poço) em tampão de carbonato, pH 9,4, foram incubados por pelo menos 3 horas a 3 7°C. Os sobrenadantes da cultura foram coletados e as citocinas / quimiocinas foram medidas por Luminex (Biorad, CA) . Para análise gênica, as DCs foram cultivadas nas placas revestidas com mAbs por 8 horas. Em alguns estudos, 50 ng/ml de CD4 0L solúvel (R&D, CA) ou 50 nM de CpG (InVivogen, CA) foram adicionados nas culturas. Nas co-culturas de DCs e de células B, 5 x IO3 DCs ressuspensas em RPMI 1640 com FCS 10% e antibióticos (Biosource, CA) foram inicialmente cultivadas nas placas revestidas com mAbs por pelo menos 6 horas, e depois 1 x IO5 de células B autólogas purificadas marcadas com CFSE (Molecular Probes, OR) foram adicionadas. Em alguns estudos, as DCs foram pulsadas com 5 moi (multiplicidade de infecção) de vírus influenza inativado pelo calor (A/PR/8 HlNl) por 2 horas, e depois misturadas com células B. Para as co-culturas de DCs e células T, 5 x IO3 DCs foram cultivadas com 1 x IO5 células T CD8 autólogas purificadas ou células T alogênicas mistas. As células T alogênicas foram pulsadas com 1 pCi/poço de 3[H]-timidina pelas 18 horas finais de incubação, e depois as cpm foram medidas por um contador beta (Wallac, MN) . 5 x IO5 PBMCs /poço foram cultivadas nas placas revestidas com mAbs. A freqüência de células T CD8 específicas para Mart-I e Flu Ml foi medida por coloração das células com anti-CD8 e tetrâmeros no 10° dia e no 7 o dia das culturas, respectivamente. Dez μΜ de peptídeo Mart-I (ELAGIGILTV) e nM de proteína recombinante contendo peptídeos Mart-I (veja abaixo) foram adicionados às culturas de DCs e células T CD8. Vinte nM de proteína Flu Ml recombinante purificada (veja abaixo) foram adicionados às culturas de PBMCs.
Anticorpos monoclonais - Foram gerados mAbs de camundongo por tecnologia convencional. Resumidamente, camundongos BALB/c com seis semanas de idade foram imunizados i.p. com 20 μg de proteína de fusão de ectodomínio de receptor.hlgGFc com adjuvante Ribi, e depois com reforços com 2 0 μς de antígeno dez e quinze dias mais tarde. Após três meses, os camundongos receberam reforços novamente três dias antes da retirada dos baços. Alternativamente, os camundongos foram injetados no coxim da pata com 1-10 μς de antígeno em adjuvante Ribi a cada três a quatro dias ao longo de um período de trinta a quarenta dias. Três a quatro dias após um reforço final, os linfonodos de drenagem foram coletados. Células B do baço ou células de linfonodos foram fundidas com células SP2/0- Ag 14. Os sobrenadantes do hibridoma foram avaliados para analisar Abs para a proteína de fusão do ectodomínio de receptor comparada com o parceiro de fusão isoladamente, ou com o ectodomínio de receptor fundido à fosfatase alcalina (15). Os poços positivos foram então avaliados em FACS usando células 293F transfectadas transitoriamente com plasmídeos de expressão que codificam cDNAs do receptor de comprimento total. Os hibridomas selecionados foram clonados e expandidos por célula única em frascos CELLine (Integra, CA) . Os sobrenadantes do hibridoma foram misturados com um volume igual de glicina 1,5 M, NaCl 3 M, Ix PBS, pH 7,8 e precipitados com resina MabSelect. A resina foi lavada com tampão de ligação e eluída com glicina 0,1 M, pH 2,7. Após neutralização com Tris 2 M, os mAbs foram dialisados versus PBS.
ELISA - ELISA em sanduíche foi realizada para medir IgM, IgG e IgA totais, bem como imunoglobulinas (Igs) fluespecíficas. Soro humano padronizado (Bethyl) contendo quantidades conhecidas de Igs e soro humano AB foram usados como padrão para Igs totais e Igs flu-específicas, respectivamente. As titulações de Ab Flu-específico nas amostras, em unidades, foram definidas como o fator de diluição de soro AB que mostra uma densidade óptica idêntica. As quantidades de BAFF e BLyS foram medidas por kits de ELISA (Bender MedSystem, CA).
Purificação e análise gênica de RNA - O RNA total foi extraído com colunas RNeasy (Qiagen) e analisado com o Bioanalisador 2100 (Agilent). Foram preparados alvos de cRNA marcado com biotina usando o kit de marcação "Illumina totalprep" (Ambion) e hibridizados para "Sentrix Human6 BeadChips" (transcritos de 46 K). Esses microarranjos consistem em sondas de oligonucleotídeos de 50mer anexadas a glóbulos de 3 pm que são alojados em micropoços entalhados na superfície de um wafer de silício. Após coloração com Estreptavidina-Cy3, é feita uma imagem da superfície do arranjo usando um escâner de resolução submícron fabricado por Illumina (Beadstation 50OX). Um software de análise de expressão gênica, GeneSpring, Versão 7.1 (Agilent), foi usado para realizar a análise dos dados. Expressão e purificação de proteínas Flu Ml e MART-I recombinantes - PCR foi usada para amplificar o ORF (open readig frame - quadro de leitura aberta) do gene Ml de Influenza A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (HlNl),
incorporando um sítio de Nhe I distai ao códon iniciador e um sítio de Not I distai ao códon de parada. 0 fragmento digerido foi clonado em pET-28b(+) (Novagen), colocando o ORF de Ml in frame com um tag de His6, codificando, dessa forma, His.proteína Flu Ml. Um derivado pET28b (+) que 10 codifica um domínio de coesina do terminal N de 169 resíduos de C. thermocellum (não publicado) inserido entre os sítios de Nco I e Nhe I expressou Coh.His. Para expressão de Coesina-Flex-hMART-1-PeptideA-His, a seqüência GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCG 15 GAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCG GCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACAC TGGCGGCCG (ID. DE SEQ. N°: 1) (que codifica DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHW RP (ID. DE SEQ. N°: 2) - os resíduos sombreados são o 20 peptídeo imunodominante HLA-A2-restrito e os resíduos sublinhados que circundam o peptídeo são de MART-1) - foi inserida entre os sítios de Nhe I e Xho I do vetor acima. As proteínas foram expressas em E. coli cepa BL21 (DE3) (Novagen) ou T7 Express (NEB) , desenvolvidas em LB a 37°C 25 com seleção para resistência à canamicina (40 yg/ml) e agitação a 200 rodadas/min até crescimento em fase mid log, quando 120 mg/l de IPTG foram adicionados. Após três horas, as células foram coletadas por centrifugação e armazenadas a -80°C. As células de E. coli de cada litro de fermentação 30 foram ressuspensas em 3 0 ml de Tris 50 mM gelado, EDTA 1 mM pH 8,0 (tampão B) com 0,1 ml de coquetel de inibidor de protease II (Calbiochem, CA) . As células foram sonificadas no gelo 2x5 min no ajuste 18 (Fisher Sonic Dismembrator 60) com um período de repouso de 5 min, e depois centrifugadas a 17.000 r.p.m. (Sorvall SA-600) por 20 min a 4°C. Para purificação de His.Flu Ml, a fração de 50 ml do sobrenadante do lisado de células foi passada através de glóbulos de Q Sefarose de 5 ml e 6,25 ml de Tris 160 mM, imidazol de 40 mM, NaCl 4 M pH 7,9 foram adicionados ao fluxo de Q Sefarose. Essa foi carregada a 4 ml/min em uma coluna HP quelante 5 ml HiTrap carregada com Ni++. A proteína ligada à coluna foi lavada com NaPO4 20 mM, NaCl 3 00 mM pH 7,6 (tampão D), seguida por outra lavagem com H3COONa 100 mM pH 4,0. A proteína ligada foi eluída com H3COONa 100 mM pH 4,0. As frações de pico foram reunidas em pool e carregadas a 4 ml/min em uma coluna HiTrap S de 5 ml equilibrada com H3COONa 100 mM pH 5,5, e lavadas com o tampão de equilíbrio, seguida por eluição com um gradiente de 0 - I M de NaCl em NaPO4 50 mM pH 5,5. As frações de pico que eluem em cerca de 500 mM de NaCl foram reunidas em um pool. Para purificação de Coh.Flu Ml.His, células de 2 litros de cultura foram lisadas da forma acima. Após centrifugação, 2,5 ml de Triton X114 foram adicionados ao sobrenadante com incubação no gelo por 5 minutos. Após incubação adicional a 250C por 5 min, o sobrenadante foi separado do Triton X114 após centrifugação a 25°C. A extração foi repetida e o sobrenadante foi passado através de glóbulos de Q Sefarose de 5 ml e 6,25 ml de Tris 160 mM, imidazol 40 mM, NaCl 4 M pH 7,9 foram adicionados ao fluxo de Q Sefarose. A proteína foi então purificada por cromatografia quelante de Ni++, como descrito acima, e eluída com 0-500 mM de imidazol em tampão D.
mAbs anti-Dectina-1 - A invenção engloba seqüências de aminoácidos específicas mostradas abaixo que correspondem aos anticorpos monoclonais anti-LOX-1 que são componentes desejáveis (no contexto, por exemplo, de anticorpos recombinantes humanizados) de produtos terapêuticos ou protetores. A seguir, serão apresentadas seqüências desse tipo no contexto de anticorpos recombinantes com região V quimérica de camundongo (sublinhada) - região C humana (negrito). Essas regiões V de camundongo podem ser facilmente "humanizadas", ou seja, as regiões que combinam LOX-I enxertadas em seqüências estruturais da região V humana, por aqueles habilitados na técnica. Além disso, as seqüências também podem ser expressas no contexto de proteínas de fusão que preservam a funcionalidade do anticorpo, mas adicionam, por exemplo, antígeno, citocina, ou toxina para as aplicações terapêuticas desejadas. rAB-pIRES2[manti-Dectina_l_llB6.4_H-V-hIgG4H-C]
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCSVSGFSLSNYDISWIRQPPGKGLEWLGVMWTGGGANY N SAFMSRLSINKDNSKSQVFLKMNNLQTDDTAIYYCVRDAVRYWNFDVWGAGTTVTVSS AKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN 25 STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP S SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (ID. DE SEQ. N°: 3).
rAB-pIRES2[manti-Dectina_l_llB6.4_K-V-hIgGK-C] QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSHLASGVPA
RFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDTATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(ID. DE SEQ. N°: 4).
rAB-pIRES2[manti-Dectina_l_15E2.5_H-V-hIgG4H-C] QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSSGYTN 5 YNQKFKDKATLTADKSSSTASMQLSSLTSEDSAVYYCARERAVLVPYAMDYWGQGTSVT VSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP 10 SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (ID. DE SEQ. N°: 5).
rAB-pIRES2[manti-Dectina_l_15E2.5_K-V-hIgGK-C] QIVLTQSPAVMSASPGEKVTITCTASSSLSYMHWFQQKPGTSPKLWLYSTSILASGVPT RFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (ID. DE SEQ. N°: 6).
rAB-pIRES2[mAnti-Dectina_l_2D8.2D4H-V-hIgG4H-C] EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNWVKQSNGKSLEWIGNIDPYYGDTN YNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCARPYGSEAYFAYWGQGTLVTVS AAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (ID. DE SEQ. N°: 7). rAB-pIRES2[mAnti-Dectina_l_2D8.2D4K-V-hIgGK-C] DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYAAQSISGIP SRFSGSGSGSDFTLSINGVEPEDVGVYYCQNGHSFPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (ID. DE SEQ. N°: 8). As seqüências da região V e seqüências relacionadas podem ser modificadas por aqueles habilitados na técnica para, por exemplo, aumentar a afinidade por Dectina-I e/ou integrar em seqüências estruturais da região V humana para 5 serem projetadas geneticamente em vetores de expressão para dirigir a expressão de formas de proteína que podem se ligar à Dectina-I em células apresentadoras de antígeno. Além disso, os outros mAbs revelados na invenção (ou derivados usando métodos e avaliações similares para a 10 biologia única aqui revelada) podem ser transformados através de meios similares (inicialmente por meio de clonagem e seqüenciamento por PCR de regiões V de hibridoma de camundongo) em construções de expressão que codificam anticorpos recombinantes (rAbs) similares. Essas regiões V 15 anti-Dectina-1 podem, além disso, ser humanizadas (ou seja, seqüências de combinação camundongo-específicas enxertadas em seqüências estruturais da região V humana) por aqueles habilitados na técnica, de modo a minimizar a reatividade imunológica potencial do rAb terapêutico.
Proteínas de fusão recombinantes de anticorpo anti
Dectina-1 recombinante - antígeno (rAb.antígeno) são vacinas prototípicas eficazes in vitro criadas por engenharia genética - Podem ser construídos vetores de expressão com seqüências codificadoras de proteína 25 diversas, por exemplo, fundidas in-frame à seqüência codificadora da cadeia H. Por exemplo, antígenos como, por exemplo, HA5 de Influenza, Ml de Influenza, gag do HIV ou peptídeos imunodominante de antígenos de câncer, ou citocinas, podem ser expressos subseqüentemente como 30 proteínas de fusão de rAb.antígeno ou rAb.citocina, as quais, no contexto desta invenção, podem ter utilidade derivada da utilização da seqüência da região V antiDectina-1 para levar o antígeno ou citocina (ou toxina) diretamente até a superfície da célula apresentadora de 5 antígeno que abriga Dectina-I. Isso permite a internalização, por exemplo, de antígeno - algumas vezes associada à ativação do receptor e assegurando a iniciação da ação terapêutica ou protetora (por exemplo, por meio da iniciação de uma resposta imunológica potente, ou por meio 10 de morte da célula-alvo. Uma vacina prototípica exemplar baseada nesse conceito poderia usar um vetor da cadeia H como, por exemplo, rAB-pIRES2[manti-Dectina_l_llB6.4_H-LVhIgG4H-C-Flex-FluHAl-l-6xHis] , que dirige a síntese de uma proteína de fusão da região V da cadeia H do mAb de 15 camundongo (sublinhada)-região C de IgG4 humana (em negrito)-Flu HAl-I (em itálico). Co-expressa com o plasmídeo de expressão da cadeia leve análogo (que codifica a seqüência mostrada acima), isso produz um anticorpo recombinante (rAb) multifuncional que se liga à Dectina-I e 20 libera o antígeno Flu HAl-I à superfície celular para ativação de DC, internalização de antígeno, processamento de antígeno, apresentação de antígeno e educação e expansão de anti-Flu HAl-I B e células T específicas. Construções da cadeia H similares com fusões a FluHA5-l, HIV Viralgag p24, 25 e PSA (antígeno específico da próstata) também são mostradas abaixo.
rAB-pIRES2[manti-Dectina_l_llB6.4_H-LV-hIgG4H-C-FlexFluHAl-l-6xHis]
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCSVSGFSLSNYDISWIRQPPGKGLEWLGVMWTGGGANY
NSAFMSRLSINKDNSKSQVFLKMNNLQTDDTAIYYCVRDAVRYWNFDVWGAGTTVTVSS AKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE 5 EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTDTJCJGYHAMV STDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPL LPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTN GVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQ IO NLYQNENAYVSWTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNL IAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGECLKYV RSAKLRMVRmimm (ID. DE SEQ. N°: 9).
rAB-pIRES2[manti-Dectina_l_llB6.4_H-LV-hIgG4H-C-FlexFluHA5-l-6xHis]
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCSVSGFSLSNYDISWIRQPPGKGLEWLGVMWTGGGANY NSAFMSRLSINKDNSKSQVFLKMNNLQTDDTAIYYCVRDAVRYWNFDVWGAGTTVTVSS AKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN 20 STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTDQJCJGYHAiW STEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEF INVPEWSYIVEKANPVNDL CYPGDFND YEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSS WS SHEASL 25 GVSSACPYQGKSSFFRNWWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQT KLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNF IAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYV
Jcswrlvi4Ahhhhhh (id. de seq. n° : 10) .
rAB-pIRES2[mAnti-Dectina_l_2D8.2D4H-LV-hIgG4HViralgag] EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNWVKQSNGKSLEWIGNIDPYYGDTN YNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCARPYGSEAYFAYWGQGTLVTVS AAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG 5 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDMAKKETVWRLEEFGRPJVQNJQG QMVHQAISPRTLNAWVKWEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQ IO MLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPV GEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWM TETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL (ID. DE SEQ. N0: 11).
rAB-pIRES2[mAnti-Dectina_l_2D8.2D4H-V-hIgG4H-C-hPSA]
EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNWVKQSNGKSLEWIGNIDPYYGDTN YNQKFKGKATLTVDKS S STAYMHLKS LTS EDSAVYY CARPYGS EAYFAYWGQGTLVTVS AAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF 20 NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTPTTTLLAPLJ LSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSL FHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVM 25 DLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLC AGR WTGGKS TCSGDSGGPL VCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSL YTKWHYRKWIKD TI VANP (ID. DE SEQ. N°: 12).
Similarmente, rAB-pIRES2[manti-Dectina_l_llB6.4_H-LVhIgG4H-C-Doquerina] mostrado abaixo codifica uma cadeia H anti-Dectina-1 fundido à doquerina (seqüência mostrada abaixo). A doquerina permite uma forte interação específica não covalente com proteínas de fusão de coesina-antígeno (coh.antígeno) que fornecem um meio alternativo de liberação de antígeno às DCs e outras células apresentadoras de antígeno.
rAB-pIRES2[manti-Dectina_l_llB6.4_H-LV-hIgG4H-CDoquerina]
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCSVSGFSLSNYDISWIRQPPGKGLEWLGVMWTGGGANY NSAFMSRLSINKDNSKSQVFLKMNNLQTDDTAIYYCVRDAVRYWNFDVWGAGTTVTVSS
AKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE
Emtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdks
RWQEGNVFS C SVMHEALHNHYTQKSL S LS LGKASWSPQWEVL YGDVNDDGKVNSTDLTL LKRYVLKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI (ID. DE SEQ. N0: 13).
Métodos relacionados à clonagem e expressão de anticorpos recombinantes (rAbs) e rAb.antígenos
Clonagem e expressão de cDNA mAbs quiméricos de
camundongo/humanos - RNA total foi preparado por células de hibridoma (RNeasy kit, Qiagen) e usado para síntese de cDNA e PCR (kit SMART RACE, BD Biosciences) usando os iniciadores 5' fornecidos e os iniciadores 3' gene
específicos: mlgGK,
5' ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc 3' (ID. DE SEQ. N°: 14);
mlgGÀ,
5' ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgaccttc 3' (ID. DE SEQ. N0: 15); mlgGl,
5' gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc 3' (ID. DE SEQ. N°: 16);
mIgG2a,
5' ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt 3' (ID. DE SEQ. N°: 17) ; e
mIgG2b,
5 'ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt 3' (ID. DE SEQ. N0: 18).
Os produtos de PCR foram clonados (kit pCR2.1 TA, Invitrogen) e caracterizados por seqüenciamento de DNA. Usando as seqüências derivadas para os cDNAs da região V da cadeia H e L de camundongo, foram usados iniciadores específicos para amplificar por PCR o peptídeo sinalizador e regiões V, incorporando, ao mesmo tempo, sítios de restrição de flanqueamento para clonagem em vetores de expressão que codificam regiões de IgGK ou IgG4H humanas downstream. 0 vetor para a expressão de mVK-hlgK quimérico foi construído por amplificação dos resíduos 401-731 (gi 1631019371) flanqueados por sítios de Xho I e Not I e inserção destes no intervalo Xho I - Not I de pIRES2-DsRed2 (BD Biosciences). PCR foi usada para amplificar a região Vk do mAb pelo códon iniciador, anexando um sítio de Nhe I ou Spe I, e depois CACC, à região codificadora (por exemplo, resíduo 126 de gi|76779294|), anexando um sítio de Xho I. O fragmento de PCR foi então clonado no intervalo Nhe I - Not I do vetor acima. 0 vetor para mVK-hlgK quimérico usando o líder mSLAM foi construído por inserção da seqüência 5' ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctc tccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggcccactcgag 3' (ID. DE SEQ. N°: 19) no intervalo Nhe I - Xho I do vetor acima. PCR foi usada para amplificar o intervalo entre o códon do terminal N códon maduro previsto (definido usando o SignalP 5 3.0 Server) (16) e a extremidade da região mVx (como definida acima), anexando, ao mesmo tempo, 5' tcgtacgga 3'.
0 fragmento digerido com Bsi WI e Xho I foi inserido nos sítios correspondentes do vetor acima. A seqüência de controle de hlgK corresponde aos resíduos 26-85 de 10 giI 49257887 I e aos resíduos 67-709 de gi|21669402| . 0 vetor de controle de hIgG4H corresponde aos resíduos 12-1.473 de gi1196840721 com as substituições S229P e L236E, que estabilizam uma ligação dissulfeto e interrompem a ligação de FcR residual (27), inseridos entre os sítios de Bgl II e 15 Not I do vetor pIRES2-DsRed2, adicionando, ao mesmo tempo, a seqüência 5' gctagctgattaattaa 3' (ID. DE SEQ. N°: 20) em vez do códon de parada. PCR foi usada para amplificar a região VH do mAb pelo códon iniciador, anexando CACC e, a seguir, um sítio de Bgl II à região que codifica o resíduo 20 473 de gi I 19684072 I . 0 fragmento de PCR foi então clonado no intervalo Bgl II - Apa I do vetor acima. 0 vetor para a seqüência quimérica de mVH-hIgG4 usando o líder mSLAM foi construído por inserção da seqüência 5'
ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctc 25 tccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggccc 3' (ID. DE SEQ. N°: 22) no intervalo Nhe I - Apa I do vetor acima. PCR foi usada para amplificar o intervalo entre o códon do terminal N códon maduro previsto e a extremidade da região mVH, anexando, ao mesmo tempo, 5' tcgtacgga 3'. 0 fragmento 30 digerido com Bsi WI e Apa I foi inserido nos sítios correspondentes do vetor acima. 0 Anexo 2 detalha as seqüências de nucleotídeos das várias regiões mVK e mVH usadas neste estudo.
Várias seqüências codificadoras de antígeno 5 flanqueadas por um sítio de Nhe I proximal e um sítio de Not I distai após o códon de parada foram inseridas no intervalo Nhe I - Pac I - Not I dos vetores da cadeia H. Flu HAl-I foi codificado pelos resíduos 82-1.025 de hemaglutinina gi[21693168| do vírus Influenza A (A/Puerto 10 Rico/8/34(HlNl)) (com uma alteração C982T) com a seqüência proximal 5' gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa 3' (ID. DE SEQ. N°: 23) (um sítio de Nhe I seguido pela seqüência que codifica resíduos vinculadores de coesinacoesina cipA) e a seqüência distai 5'
caccatcaccatcaccattgagcggccgc 3' (ID. DE SEQ. N°: 24) (que codifica His6, um códon de parada e um sítio de Not I). Flu HA5-1 foi codificado pelos resíduos 49-990 de hemaglutinina de gi1502960521 do vírus Influenza A (A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)) ligados pelas mesmas seqüências que 20 Flu HAl-I. Doc foi codificado pelos resíduos 1.923-2.150 de gi 1406711 celD com o sítio de Nhe I proximal e o sítio de Not I distai. PSA foi codificado pelos resíduos 101-832 de gi1347848121 do antígeno específico da próstata com a seqüência proximal 5'
gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaacaccgacaacaac acttctagcgc 3' (ID. DE SEQ. N°: 25) (sítio de Nhe I e espaçador cipA) e um sítio de Not I distai. Flu Ml-PEP foi codificado por 5'
gctagccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctgac cgtgcccagcgaacgcaagggtatacttggattcgttttcacacttacttaagcggccg c 3' (ID. DE SEQ. N°: 26). Essas e todas as outras seqüências peptídicas que codificam foram criadas por meio de misturas de fragmentos de DNA sintéticos complementares com extremidades compatíveis para clonagem em vetores da cadeia H Nhe I e Not I-restritos, ou vetor de Coh.His Nhe I
- Xho I-restritos. Sempre foram usados códons humanos preferidos, exceto quando sítios de restrição precisavam ser incorporados ou em seqüências espaçadores CipA.
Os níveis de produção de construções de expressão de 10 rAb foram testados em transfecções transitórias de 5 ml usando aproximadamente 2,5 pg de cada uma das construções de cadeia L e cadeia Heo protocolo descrito acima. Os sobrenadantes foram analisados por ELISA anti-hlgG (AffiniPure anti-IgG humana (H+L) de cabra, Jackson 15 ImmunoResearch). Em testes desse protocolo, a produção de rAb secretado foi independente da concentração dos vetores de cadeia H e cadeia L ao longo de uma faixa de aproximadamente 2 vezes de cada concentração de DNA (ou seja, o sistema era saturado de DNA).
Novos anticorpos monoclonais (mAbs) anti-Dectina-1
foram desenvolvidos e usados para descobrir uma biologia previamente desconhecida associada a esse receptor da superfície celular que é encontrado em células apresentadoras de antígeno. Essa nova biologia é altamente 25 preditiva da aplicação de agentes anti-Dectina-1 que ativam esse receptor para diversas aplicações terapêuticas e protetoras. Os dados apresentados abaixo apoiam fortemente as previsões iniciais e demonstram a via para a redução das descobertas aqui reveladas à aplicação clínica.
Desenvolvimento de anticorpos monoclonais com alta afinidade contra Dectina-I humana - Foram produzidas proteínas de fusão de ectodomínio de receptor.hlgG (IgGlFc humano) e AP (fosfatase alcalina placentária humana) para imunização de camundongos e avaliação de mAbs, respectivamente. Uma construção de expressão para ectodomínio de DCIR.IgG foi descrita previamente (15) e usava o peptídeo sinalizador de camundongo SLAM (mSLAM) para direcionar a secreção (16). Um vetor de expressão para ectodomínio de DCIR.AP também foi gerado usando PCR para amplificar resíduos 133-1.581 de AP (gb|BC009647|), adicionando, ao mesmo tempo, um sítio de Xho I proximal inframe e um códon de parada TGA e um sítio de Not I. Esse fragmento Xho I - Not I substituiu a seqüência codificadora de IgG no ectodomínio de vetor de DCIR.IgG acima. As construções do ectodomínio de Dectina-I na mesma série de vetor Ig e AP continham insertos que codificam bp 397-603, giI 889995911 . As proteínas de fusão de Dectina-I foram produzidas usando o Sistema de Expressão FreeStyle™ 2 93 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante (1 mg de DNA de plasmídeo total com 1,3 ml de reagente 293 Fectin /1 de transfecção) . Para a produção de rAb, quantidades iguais de vetor que codifica as cadeias HeL foram cotransfectadas. As células transfectadas são cultivadas por
3 dias, o sobrenadante da cultura foi coletado e meio fresco adicionado com incubação continuada por dois dias. Os sobrenadantes reunidos em pool foram clarificados por filtração. O ectodomínio de receptor.hlgG foi purificado por cromatografia por afinidade de proteína A HiTrap com eluição por glicina O,I M pH 2,7, e depois dialisado versus PBS. rAbs (anticorpos recombinantes aqui descritos) foram purificados de modo similar, pela utilização de colunas HiTrap MabSelect™. mAbs de camundongos foram gerados por tecnologia convencional de fusão de células. Resumidamente, camundongos BALB/c de 6 semanas de idade foram imunizados 5 por via intraperitoneal com 2 0 pg de proteína de fusão de ectodomínio de receptor.hlgGFc com adjuvante Ribi, e depois reforços com 20 μς de antígeno 10 dias e 15 dias mais tarde. Após 3 meses, os camundongos receberam reforços novamente três dias antes da retirada dos baços. 10 Alternativamente, os camundongos foram injetados no coxim da pata com 1-10 μ9 de antígeno em adjuvante Ribi a cada 3-
4 dias ao longo de um período de 30-40 dias. Três a quatro dias após um reforço final, os linfonodos de drenagem foram coletados. Células B do baço ou células de linfonodos foram fundidas com células SP2/0-Ag 14 (17) usando técnicas convencionais. ELISA foi usada para avaliar os sobrenadantes de hibridoma contra a proteína de fusão do ectodomínio de receptor comparada com o parceiro de fusão isoladamente, ou versus o ectodomínio de receptor fundido à AP (15) . Os poços positivos foram então avaliados em FACS usando células 293F transfectadas transitoriamente com plasmídeos de expressão que codificam cDNAs do receptor de comprimento total. Os hibridomas selecionados foram clonados por célula única, adaptados ao meio sem soro e expandidos em frascos CELLine (Intergra). Os sobrenadantes do hibridoma foram misturados com um volume igual de glicina 1,5 M, NaCl 3 M, Ix PBS, pH 7,8 e precipitados com resina MabSelect. A resina foi lavada com tampão de ligação e eluída com glicina 0,1 M, pH 2,7. Após neutralização com Tris 2 M, os mAbs foram dialisados versus PBS. Caracterização de anticorpos monoclonais anti-Dectina
1 purificados por ELISA direto. As afinidades relativas de vários mAbs anti-Dectina-1 por ELISA (ou seja, proteína Dectina-l.Ig é imobilizada na superfície da placa de 5 microtitulação e os anticorpos são testados em uma série de titulação de doses quanto à sua habilidade para se ligar à Dectina-l.Ig (como detectado por um reagente conjugado de anti-IgG de camundongo-HRP). Os painéis são (esquerda) reatividade de mAb para proteína Dectina-l.Ig; e (direita) 10 reatividade de mAb para proteína hlgGFc. Os painéis mostram que os mAbs anti-Dectina-1 reagem especificamente com a Dectina-I. Foram observadas variações na ligação para os vários anticorpos.
Tanto DCs in vivo quanto DCs cultivadas in vitro 15 expressam Dectina-I: as Figuras IA e IB mostram os níveis de expressão de Dectina-I em PBMCs de doadores normais. Como mostrado na Fig. IA abaixo, células apresentadoras de antígeno, incluindo DCs CDllc+, monócitos CD14+ e CD19+células B expressam Dectina-I. As células T CD3+ não .20 expressam Dectina-I detectável na superfície. Os níveis de expressão de Dectina-Il em DCs cultivadas in vitro, IFNDCs e IL-4DCS são mostrados na Fig. Ib. Tanto IL-4 quanto IFNDCs foram coradas com todos os três anti-Dectina-1 feitos neste estudo.
DCs cultivadas tanto in vivo quanto in vitro que
expressam Dectina-I. Figura IA. PBMCs de doadores normais foram coradas com anti-CDllc, CD14, CD19, e CD3 com mAb anti-Dectina-1. As células coradas com anticorpos individuais foram reunidas para medir os níveis de expressão de Dectina-I. Figura IB. Monócitos de doadores normais foram cultivadas na presença de GM-CSF com IL-4 (IL-4DCs) ou IFNa (IFNDCs), e as células foram coradas com mAb anti-Dectina-1. As células também foram coradas com anticorpos de controle e anticorpo de cabra anti-camundongo marcado com FITC.
Os níveis de expressão de Dectina-I em DCs são modulados com ligantes de TLR e citocinas: os níveis de expressão de moléculas de superfície das DCs podem ser modulados com vários estimuladores. Para ver se a expressão 10 de Dectina-I é controlada pela ativação de DCs, IL-4DCS foram estimuladas com ligantes de TLR e citocinas. Os dados na Fig. 2 mostram que o ligante de TLR4 (LPS de E. coli) reduziu os níveis de expressão de Dectina-1, mas IL-IO aumentou ligeiramente a expressão de Dectina-1 em IL-4DCS. 15 Em um estudo repetido, IL-15 infra-regulou ligeiramente Dectina-1. Outros estimuladores, incluindo IFNa e ligante de TLR3, não alteraram os níveis de expressão de Dectina-1 em IL-4DCs.
Figura 2. IL-4DCS cultivadas in vitro foram cultivadas 20 na presença de CD40L (50 ng/ml) , ligante de TLR2 (100 ng/ml) , ligante de TLR3 (100 nM) , ligante de TLR4 (20 ng/ml) , IL-10 (20 ng/ml) , IL-15 (100 ng/ml) , IFNa (500 U/ml) e IL-4 (50 ng/ml) por 24 horas. As células foram coradas com mAbs anti-Dectina-1 ou mAbs de controle. As 25 linhas pontilhadas indicam as células coradas com anticorpo de controle de isótipo. Histogramas cinza e abertos representam células cultivadas nos meios sem nenhum estimulador e com estimuladores, respectivamente.
A sinalização por meio de Dectina-1 estimula DCs a produzirem citocinas e quimiocinas: as células dendríticas são as células imunológicas primárias que determinam os resultados de respostas imunológicas, indução ou tolerância, dependendo de sua ativação (18) . 0 papel da Dectina-1 na ativação de DCs humanas ainda não foi estudado 5 detalhadamente. Geramos 8 clones diferentes de hibridoma que produzem mAbs anti-hDectina-1 de camundongo, e testamos se os mAbs individuais ativam DCs por medida das citocinas e quimiocinas secretadas por DCs. Os dados na Fig. 3 mostram que especialmente PAB47 e PAB4 9 podiam ativar DCs 10 para a produção de quantidades significativas de IL-6, IL8, IL-IO, IL- 12p4 0, IP-IO e ΜΙΡ-la. PAB187 é um mAb antiCD40 que sabidamente ativa DCs. PAB85 é um anticorpo de controle.
A Figura 3 mostra que mAbs anti-Dectina-1 ativam DCs. Ix 10e5/200 μΐ de IFNDCs foram cultivadas nas placas revestidas com diferentes clones de mAbs por 18 horas. A. Os sobrenadantes da cultura foram analisados para medir citocinas e quimiocinas por Luminex.
A Figura 4 mostra que a sinalização por meio de 20 Dectina-1 pode resultar na ativação tanto de IL-4DCS quanto de IFNDCs. Para IFNDCs, mAbs anti-Dectina-1 estimulam DCs a expressar niveis significativamente aumentados de CD86, CD83, CD80 e HLA-DR (Fig. 4A) . O mAb anti-Dectina-1 também ativou IL-4DCS a expressar niveis aumentados de CD86, CD8 0 25 e HLA-DR (Fig. 4B).
A sinalização por meio de Dectina-1 aumenta a sinalização por meio de TLRs: sinais através de Dectina-1 podem apresentar sinergia com sinais através de TLRs para ativação aumentada de DCs (Fig. 5). Sabia-se que a Dectina1 apresenta sinergia com TLR2. Neste estudo, no entanto, demonstramos que a sinergia entre Dectina-1 e TLR4 é mais forte do que a sinergia entre Dectina-1 e TLR2 para a ativação de DCs. Essa sinergia, entre Dectina-1 e TLR4, resultou na produção dramaticamente aumentada de IL-IO, IL5 lb, TNF-α e IL-12p40 por DCs. Também coramos as células com anti-moléculas co-estimuladoras, incluindo CD86, CD80, CD83 e CD4 0; essa sinergia não resultou em expressão aumentada das moléculas co-estimuladoras testadas.
A sinergia entre Dectina-1 e TLR4 resultou nas respostas de células T CD8 antígeno-específicas aumentadas: para testar se a sinergia entre a sinalização mediada por Dectina-1 e por TLR resulta em respostas imunológicas aumentadas, foi testada a capacidade de DCs para sensibilizar células T CD8 específicas para Mart-I (Fig. 6). Como mostrado na Fig. 6A, a sinergia entre Dectina-1 e TLR4L resultou em um número aumentado em mais de 5 vezes de respostas de células T CD8 específicas para Mart-I. Também podíamos observar que a sinergia entre Dectina-1 e TLR2 resultou na sensibilização aumentada de células T CD8 específicas para Mart-I. Os dados na Fig. 6 serão úteis para o desenvolvimento futuro de vacinas.
IL-IO produzida por DCs estimuladas por meio de Dectina-1 contribui para a sensibilização aumentada de células T CD8 específicas para Mart-I: como mostrado na 25 Fig. 3 e na Fig. 5, a sinalização por meio de Dectina-1 resultou em quantidades significativas de IL-IO, uma citocina inibidora para respostas de células T CD8, por DCs. As quantidades de IL-10 foram significativamente aumentadas quando Dectina-1 apresentou sinergia com 30 ligantes de TLR. Independentemente da IL-10 produzida por DCs, no entanto, as DCs estimuladas com anti-Dectina-1 isoladamente ou com anti-Dectina-1 e ligantes de TLR resultaram na sensibilização aumentada de células T CD8 específicas para Mart-I (Fig. 6). Portanto, é provável que 5 IL-10 durante a sensibilização possa contribuir para a sensibilização antígeno-específica de células T CD8. Para testar essa hipótese, adicionamos anticorpo anti-IL-10 na cultura, e os dados na Fig. 7 indicam que IL-10 de DCs estimuladas com anti-Dectina-1 e ligantes de TLR aumentam a 10 sensibilização de células T CD8 específicas para Mart-I. Resultados similares foram observados quando as DCs foram estimuladas com Zymosan. Quando as mesmas DCs foram estimuladas com Zymosan, as DCs produziram uma quantidade significativa de IL-10 (mais de 1.000 pg/ml por 1 x 10e5 15 DCs) (dados não mostrados) . Como as DCs estimuladas com mAbs anti-Dectina-1 produzem quantidades significativas de IL-10, essa sensibilização aumentada de células T CD8 antígeno-específicas mediada por IL-10 será útil para o desenvolvimento futuro de vacinas.
DCs ativadas com anti-Dectina-1 expressam níveis
aumentados de IL-15 e 4-IBBL: para analisar ainda mais o papel de anti-Dectina-1 na ativação de DCs, IFN DCs foram estimuladas com anti-Dectina-1, e depois as células foram coradas com anti-IL-15 e 4-IBBL. Os dados na Fig. 8 mostram 25 que a sinalização por meio de Dectina-1 induz a expressão aumentada tanto de IL-15 quanto de 4-IBBL, o que pode contribuir para respostas imunológicas humorais e celulares aumentadas. IL-15 sabidamente tem uma participação importante nas respostas de células T CD8 e na proliferação 30 de células B e produção de anticorpo. 4-I-BBL é uma molécula co-estimuladora que contribui para as respostas de células T CD8 mediadas por DCs - sinais de 4-IBBL humana por meio de CD13 7/4-1BB e por ela própria. Sua cauda citoplasmática participa na sinalização reversa que induz 5 apoptose em células T e na secreção de citocina (IL-6; TNFα) por monócitos. A ligação de 4-IBBL à CD137/4-1BB produz diversos efeitos e tem uma participação fundamental na resposta de células T de memória. Ela mantém os números de células T ao final de uma resposta primária, e induz 10 células T CD4+ e CD8+ a proliferar e secretar citocinas como, por exemplo, IL-2 e IFN-γ em células CD4+, e IFN-γ em células CD8+.
DCs estimuladas por meio de Dectina-1 induzem respostas imunológicas humorais potentes: DCs têm uma participação importante nas respostas imunológicas humorais ao fornecerem sinais para respostas de células B tanto Tdependentes quanto T-independentes (19-22) e por transferência de antígenos às células B (23, 24). Além das DCs, a sinalização por meio de TLR9 como um terceiro sinal é necessária para respostas de células B eficientes (25, 26) . A Dectina-1 pode afetar as respostas imunológicas humorais mediadas por DCs na presença de ligante de TLR9, CpG. IL-4 DCs de seis dias foram estimuladas com mAb antiDectina-1, e depois as células B purificadas foram cocultivadas na presença de CD4 0L ou CpG. Como mostrado na Fig. 9a e 9b, DCs ativadas com mAb anti-Dectina-1 resultam na proliferação aumentada de células B (observada por meio de diluição de CFSE) e diferenciação de células plasmáticas (aumento de CD3 8 + ) , comparadas com DCs estimuladas com mAb de controle. As quantidades de imunoglobulinas totais (Igs) produzidas foram medidas por ELISA (Fig. 9a e b) . Consistente com a proliferação de células B e diferenciação de células plasmáticas, células B cultivadas com DCs 5 estimuladas com mAb anti-Dectina-1 resultam na produção aumentada significativamente de imunoglobulinas totais na presença de CD4 0L ou CpG.
A presente invenção pode ser usada para a aplicação terapêutica de agentes que ativam especificamente por meio 10 de Dectina-1, por exemplo, como adjuvante na vacinação, ou como estimulantes do sistema imunológico para indivíduos imunologicamente comprometidos. Além disso, a descoberta prevê que o bloqueio da ativação natural ou anormalmente regulada por meio de Dectina-1 pode ter aplicações (por 15 exemplo, para evocar tolerância em casos de transplante, ou atenuar doenças autoimunes).
mAbs anti-Dectina-1 ativam células B: células B CD19+ expressam Dectina-1 (Fig. 1) e isso prevê um possível papel para a Dectina-1 expressa em células B. Os dados na Fig. 20 IOA mostram que o acionamento de Dectina-1 em células B resulta na proliferação aumentada de células B e na diferenciação de células plasmáticas na presença de CpG. Consistentemente, a Fig. IOB mostra que células B ativadas com mAb anti-Dectina-1 secretam quantidades aumentadas de 25 IgM total, mas não de IgG e IgA.
A descoberta acima de efeitos diretos em células B por meio da ligação de Dectina-1 reforça o escopo da aplicação terapêutica ressaltada acima para agentes que atuam por meio de - ou contra - Dectina-1.
Papel da Dectina-1 em respostas de células T: DCs estimuladas por meio de Dectina-1 expressam níveis aumentados de moléculas co-estimuladoras e produzem quantidades aumentadas de citocinas e quimiocinas (Fig. 3 e 4), sugerindo que a Dectina-1 contribui para respostas 5 imunológicas celulares aumentadas, bem como para respostas imunológicas humorais. Isso foi testado por medida de respostas de células T CD8 antígeno-específicas (Fig. 11). Os dados na Fig. 11 mostram que DCs ativadas por meio de Dectina-1 resultam em respostas de memória de células T CD8 10 específicas para proteína Flu Ml aumentadas (Fig. 11a) . Mais importante, a sinalização por meio de Dectina-1 permite que as DCs sensibilizem e sensibilizem de forma cruzada peptídeos Mart-I às células T CD8 (Fig. Ilb e c) . Isso indica que a Dectina-1 tem uma participação importante 15 no aumento da função das DCs, resultando em sensibilização e sensibilização cruzada aumentadas de antígenos às células T CD8. Portanto, proteínas de fusão de mAb anti-Dectina-1 e antígeno induzirão respostas de células T CD8 antígenoespecí ficas robustas, sugerindo que reagentes compostos por 20 mAbs anti-Dectina-1 serão úteis para o desenvolvimento de vacina contra cânceres e infecções.
A forma solúvel de mAbs anti-Dectina-1 ativa DCs, resultando na sensibilização aumentada de células T CD8 específicas para Mart-I de doadores normais. Demonstramos 25 que mAbs anti-Dectina-1 solúveis podem ativar DCs e, portanto, testamos se as DCs estimuladas com anti-Dectina-1 solúvel poderiam aumentar respostas de células T CD8 antígeno-específ icas. Os dados na Fig. 12 mostram que DCs ativadas com anti-Dectina-1 solúvel resultou na 30 sensibilização aumentada de células T CD8 específicas para Mart-I de doadores normais. A forma solúvel de anti-CD40 feita neste estudo também resultou na sensibilização aumentada de células T CD8.
Células B da amídala humana foram divididas em dois 5 grupos com base na expressão de Dectina-1: células de amídalas humanas foram coradas com anti-Dectina-1 e outros anticorpos. Como mostrado na Fig. 13, células T CD3+ não expressam Dectina-1 (painel esquerdo). No entanto, havia dois grupos de células B CD19+; um não expressa Dectina-1 e 10 o outro grupo de células B CD19+ expressa Dectina-1 similarmente às células B CD19+ de PBMCs de doadores normais. Isso provavelmente pode ter implicações para o desenvolvimento de novos reagentes terapêuticos baseados em anti-Dectina-1 para cânceres e vacinas.
Células na pele e linfonodos humanos expressam
Dectina-1: células que expressam Dectina-1 são detectáveis na pele e em linfonodos humanos por IHC. Os cortes de tecido foram corados com o corante nuclear DAPI (Azul) e Anti-Dectina-1 (Vermelho). A Fig. 14 mostra que tanto a 20 pele quanto os linfonodos humanos contêm células que expressam níveis significativos de Dectina-1. Essa é uma observação importante, na medida em que revela que células in vivo expressam Dectina-1 - na localização exata (pele) que seria um local preferido para administração, por 25 exemplo, de anti-Dectina-l-antígeno visado.
DCs in vivo em primata não humano expressam Dectina-1
- DCs sangüíneas em primatas não humanos (Cynomolgus); as PBMCs de macacos foram coradas com mAbs anti-Dectina-1 e com anticorpos para outros marcadores celulares, CD3, CD14, CDllc, CD27, CD56 e CD16. Os dados na Fig. 15 mostram que tanto células CD14 quanto células CDllc+ foram coradas com mAbs anti-Dectina-1 humana. Diferentemente das células CD14+ e CDllc+, as células CD3+, CD16+, CD27+ e CD56+ não expressaram Dectina-1 (dados não mostrados). Esses dados 5 demonstram a reatividade cruzada de certos mAbs antiDectina-1 humana-1 contra células apresentadoras de antígeno de macacos. Isso facilita enormemente a redução das invenções aqui descritas à prática, na medida em que o macaco pode ser usado como um modelo válido para estudos de 10 eficácia e segurança de terapias humanas previstas.
As descobertas mostradas acima aumentam e ampliam o escopo da aplicação terapêutica para agentes que atuam por meio de Dectina-1. A ativação de DCs por Dectina-1 influencia as células T vizinhas, dirigindo-as a aumentar a 15 proliferação. Além disso, quando antígeno está presente durante essa interação, DCs ativadas por Dectina-1 resultam no aumento da expansão de células T antígeno-específicas. Isso mostra que a ativação por Dectina-1, por exemplo, no caso de uma vacina, pode dirigir a expansão seletiva de 20 células T virgens antígeno-específicas - isso, junto com os efeitos diretos e indiretos acima da ativação por Dectina-1 em células B, prevê claramente a expansão de células B antígeno-específicas e, portanto, a produção de anticorpo antígeno-específico.
Contempla-se que qualquer modalidade discutida nesta
especificação possa ser implementada com relação a qualquer método, kit, reagente ou composição da invenção, e viceversa. Além disso, as composições da invenção podem ser usadas para se realizar os métodos da invenção.
Será subentendido que as modalidades particulares aqui descritas são apresentadas como forma de ilustração, e não como limitações da invenção. As características principais desta invenção podem ser empregadas em várias modalidades, sem se afastar do escopo da invenção. Aqueles habilitados 5 na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando não mais do que experimentação de rotina, numerosos equivalentes para os procedimentos específicos aqui descritos. Esses equivalentes são considerados como estando incluídos no escopo desta invenção e cobertos pelas 10 reivindicações.
Todas as publicações e os pedidos de patentes mencionados na especificação são indicativos do nível de conhecimento daqueles habilitados na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as publicações e os pedidos de 15 patentes são aqui incorporados por referência no mesmo grau como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.
O uso da palavra "um" ou "uma", quando usada em conjunto com o termo "que compreende" nas reivindicações e/ou na especificação, pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais do que um" . 0 uso do termo "ou" nas reivindicações significa "e/ou", a menos que explicitamente indicado para se referir apenas às alternativas ou no caso de as alternativas serem mutuamente exclusivas, embora a revelação permita a definição de que se refere apenas às alternativas e "e/ou" . Ao longo de todo este pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui a variação de erro inerente para o dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor, ou a variação que existe entre os indivíduos do estudo.
Como usadas nesta especificação e nas reivindicações, as palavras "que compreende" (e qualquer forma de "que 5 compreende", por exemplo, "compreendem" e "compreende"), "que possui" (e qualquer forma de "que possui", por exemplo, "possuem" e "possui"), "incluindo" (e qualquer forma de incluindo, por exemplo, "inclui" e "incluem") ou "que contém" (e qualquer forma de "que contém", por 10 exemplo, "contém" e "contêm") são inclusivas ou abertas e não excluem elementos ou etapas de métodos adicionais não citados.
O termo "ou combinações destes", como aqui usado, refere-se a todas as permutações e combinações dos itens listados que precedem o termo. Por exemplo, "A, B, C ou combinações destes" visa incluir pelo menos um de: A, B, C, AB, AC, BC ou ABC e, se a ordem for importante em um contexto em particular, também BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC ou CAB. Continuando com esse exemplo, são expressamente incluídas combinações que contêm repetições de um ou mais itens ou termos, por exemplo, BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, e assim por diante. Aqueles habilitados na técnica compreenderão que tipicamente não há limite para o número de itens ou termos em qualquer combinação, a menos que explicitamente indicado pelo contexto.
Todas as composições e/ou métodos aqui revelados e reivindicados podem ser feitos e executados sem experimentação desnecessária à luz da presente revelação. Embora as composições e os métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, ficará evidente para aqueles habilitados na técnica que podem ser aplicadas variações às composições e/ou aos métodos e nas etapas ou na seqüência de etapas do método aqui descrito, se afastar do conceito, do espírito e do escopo da 5 invenção. Todos esses substitutos e modificações similares evidentes para aqueles habilitados na técnica são considerados como estando incluídos no espírito, escopo e conceito da invenção, como definida pelas reivindicações em anexo.
REFERÊNCIAS
1. Figdor, C. G., Y. van Kooyk e G. J. Adema. 2002. "C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells". Nat. Rev. Immunol. 2: 77-84.
2. Pyz, E., A. S. Marshall, S. Gordon e G. D. Brown. 2006. "C-type lectin-like receptors on myeloid cells". Ann.
Med. 38: 242-251.
3. Brown, G. D. 2006. "Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor". Nat. Rev. Immunol. 6: 33-43.
4. Geijtenbeek, T. B., D. J. Krooshoop, D. A. Bleijs, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, V. Grabovsky, R.
Alon, C. G. Figdor e Y. van Kooyk. 2000. "DC-SIGN-ICAM-2 interaction mediates dendritic cell trafficking". Na t. Immunol. 1: 353-357.
5. Geijtenbeek, T. B., R. Torensma, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, G. J. Adema, Y. van Kooyk e C. G.
Figdor. 2000. "Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses". Cell 100: 575-585.
6. dOstiani, C. F., G. Del Sero, A. Bacci, C. Montagnoli, A. Spreca, A. Mencacci, P. Ricciardi-Castagnoli e L. Romani. 2000. "Dendritic cells discriminate between yeasts and hyphae of the fungus Candida albicans. Implications for initiation of T helper cell immunity in vitro and in vivo". J. Exp. Med. 191: 1.661-1.674.
7. Fradin, C., D. Poulain e T. Jouault. 2000. "beta
1,2-linked oligomannosides from Candida albicans bind to a 32-kilodalton macrophage membrane protein homologous to the mammalian lectin galectin-3". Infect. Immun. 68: 4.3 91- 4.398.
8. Cambi, A., K. Gij zen, J. M. de Vries, R. Torensma,
B. Joosten, G. J. Adema, M. G. Netea, B. J. Kullberg, L. Romani e C. G. Figdor. 2003. "The C-type lectin DC-SIGN (CD20 9) is an antigen-uptake receptor for Candida albicans on dendritic cells". Eur. J. Immunol. 33: 532-538.
9. Netea, M. G., J. W. Meer, I. Verschueren e B. J.
Kullberg. 2002. "CD40/CD40 ligand interactions in the host defense against disseminated Candida albicans infection: the role of macrophage-derived nitric oxide". Eur. J. Immunol. 32: 1.455-1.463.
10. Lee, S. J., S. Evers, D. Roeder, A. F. Parlow, J.
Risteli, L. Risteli, Y. C. Lee, T. Feizi, H. Langen e M. C. Nussenzweig. 2002. "Mannose receptor-mediated regulation of serum glycoprotein homeostasis". Science 295: 1.898-1.901.
11. Maeda, N., J. Nigou, J. L. Herrmann, M. Jackson,
A. Amara, P. H. Lagrange, G. Puzo, B. Gicquel e 0. Neyrolles. 2003. "The cell surface receptor DC-SIGN discriminates between Mycobacterium species through selective recognition of the mannose caps on lipoarabinomannan". J. Biol. Chem. 278: 5.513-5.516.
12. Tailleux, L., 0. Schwartz, J. L. Herrmann, E. Pivert, M. Jackson, A. Amara, L. Legres, D. Dreher, L. P. Nicod, J. C. Gluckman, P. H. Lagrange, B. Gicquel e O. Neyrolles. 2003. "DC-SIGN is the major Myeobaeterium tuberculosis receptor on human dendritic cells". J. Exp. Med. 197: 121-127.
13. Geijtenbeek, T. B., S. J. Van Vliet, E. A. Koppel, M. Sanchez-Hernandez, C. M. Vandenbroucke-Grauls, B. Appelmelk e Y. Van Kooyk. 2003. "Mycobacteria target DCSIGN to suppress dendritic cell function". J. Exp. Med.
197: 7-17.
14. Cooper, A. M., A. Kipnis, J. Turner, J. Magram, J. Ferrante e I. M. Orme. 2002. "Mice lacking bioactive IL-12 can generate protective, antigen-specific cellular responses to mycobacterial infection only if the IL-12 p4 0
subunit is present". J. Immunol. 168: 1.322-1.327.
15. Bates, E. E., N. Fournier, E. Garcia, J. Valladeau, I. Durand, J. J. Pin, S. M. Zurawski, S. Patel, J. S. Abrams, S. Lebecque, P. Garrone e S. Saeland. 1999. "APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor
containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif". J. Immunol. 163: 1.973-1.983.
16. Bendtsen, J. D., H. Nielsen, G. von Heijne e S. Brunak. 2004. "Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0". J. Mol. Biol. 340: 783-795.
17. Shulman, M., C. D. Wilde, G. Kohler, M. J.
Shulman, N. S. Rees, D. Atefi, J. T. Horney, S. B. Eaton, W. Whaley, J. T. Galambos, H. Hengartner, L. R. Shapiro e L. Zemek. 1978. "A better cell Iine for making hybridomas secreting specific antibodies". Nature 276: 269-270.
18. Banchereau, J., F. Briere, C. Caux, J. Davoust, S. Lebecque, Υ. J. Liuf Β. Pulendran e Κ. Palucka. 2000. "Immunobiology of dendritic cells". Annu. Rev. Iwmunol. 18: 767-811.
19. Wykes, Μ. e G. MacPherson. 2000. "Dendritic cellB-cell interaction: dendritic cells provide B cells with
CD4 0-independent proliferation signals and CD40-dependent survival signals". Immunology 100: 1-3.
20. Balazs, M., F. Martin, T. Zhou e J. Kearney. 2002. "Blood dendritic cells interact with splenic marginal zone
B cells to initiate T-independent immune responses". Immunity 17: 341-352.
21. Kikuchi, T., S. Worgall, R. Singh, Μ. A. Moore e R. G. Crystal. 2000. "Dendritic cells genetically modified to express CD4 0 ligand and pulsed with antigen can initiate
antigen-specific humoral immunity independent of CD4+ T cells". Nat. Med. 6: 1.154-1.159.
22. Dubois, B., J. M. Bridon, J. Fayette, C. Barthelemy, J. Banchereau, C. Caux e F. Briere. 1999. "Dendritic cells directly modulate B cell growth and
differentiation". J. Leukoc. Biol. 66: 224-230.
23. Qi, H., J. G. Egen, A. Y. Huang e R. N. Germain. 2006. "Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells". Science 312: 1.672-1.676.
24. Bergtold, A., D. D. Desai, A. Gavhane e R. Clynes. 2005. "Cell surface recycling of internalized antigen
permits dendritic cell priming of B cells". Immunity 23: 503-514.
25. Ruprecht, C. R. e A. Lanzavecchia. 2006. "TollIike receptor stimulation as a third signal required for
activation of human naive B cells". Eur. J. Immunol. 36: 810-816.
26. Bernasconi, Ν. L., E. Traggiai e Α. Lanzaveeehia. 2002. "Maintenanee of serologieal memory by polyclonal activation of human memory B cells". Science 298: 2.199-
2.202.
27. Reddy, M. P., C. A. Kinney, Μ. A. Chaikin, A. Payne, J. Fishman-Lobell, P. Tsui, P. R. Dal Monte, M. L. Doyle, M. R. Brigham-Burke, D. Anderson, M. Reff, R. Newman, N. Hanna, R. W. Sweet e A. Truneh. 2000.
"Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4". J. Immunol. 164: 1.925-1.933.

Claims (46)

1. Método para o aumento da eficácia de apresentação de antígeno por uma célula apresentadora de antígeno que expressa Dectina-1 caracterizado por compreender o contato da célula apresentadora de antígeno com um anticorpo antiDectina-l-específico, ou fragmento deste, capaz de ativar a célula apresentadora de antígeno, em que a célula apresentadora de antígeno é ativada.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula apresentadora de antígeno compreende uma célula dendrítica isolada, uma célula mononuclear do sangue periférico, um monócito, uma célula B, uma célula dendrítica mielóide e combinações destas.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula apresentadora de antígeno compreende uma célula dendrítica isolada, uma célula mononuclear do sangue periférico, um monócito, uma célula B, uma célula dendrítica mielóide e combinações destas que foram cultivadas in vitro com GM-CSF e IL-4, interferon alfa, antígeno e combinações destes.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado ainda por compreender a etapa de ativação das células apresentadoras de antígeno que entraram em contato com GM-CSF e IL-4, em que o contato com o anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste aumenta a expressão de superfície de CD86, CD80 e HLA-DR na célula apresentadora de antígeno.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado ainda por compreender a etapa de ativação das células apresentadoras de antígeno que entraram em contato com Interferon alfa, em que o contato com o anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste aumenta a expressão de superfície de CD86, CD83, CD80 e HLA-DR na célula apresentadora de antígeno.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígeno compreendem uma célula dendrítica que foi colocada em contato com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa para ativar a célula dendrítica, em que as células dendríticas ativadas aumentam a expressão de superfície de CD86, CD80 e HLA-DR.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígeno compreendem uma célula dendrítica que foi colocada em contato com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa para ativar a célula dendrítica, em que as células dendríticas ativadas aumentam a secreção de IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, IP-IO e MIP-Ia e combinações destes.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígeno compreendem uma célula dendrítica que foi colocada em contato com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa e o anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste aumentam a ativação em conjunto com sinalização por meio de CD4 0.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígeno compreendem uma célula dendrítica que foi colocada em contato com GM-CSF e IL-4 ou Interferon alfa e o anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste possui atividade co-estimuladora aumentada de células dendríticas.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado ainda por compreender a etapa de co-ativação da célula apresentadora de antígeno pela ativação por meio do receptor TLR4, em que as células aumentam a produção de citocina e quimiocina.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado ainda por compreender a etapa de co-ativação da célula apresentadora de antígeno pela ativação por meio do receptor TLR4, em que as células aumentam secreção de IL-10, IL-lb, TNFD, IL-12p40 e combinações destes.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado ainda por compreender a etapa de co-ativação da célula apresentadora de antígeno pela ativação por meio do receptor TLR4 usando pelo menos um ligante de TLR4, um anticorpo anti-TLR4 ou fragmentos deste, um híbrido de anticorpo anti-TLR4 e anti-Dectina-1 ou fragmento deste, um conjugado de ligante de anti-TLR4-anti-Dectina-1.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo Dectina-Iespecífico ou fragmento deste é selecionado de clone15E2.5, 11B6.4, 15F4.7, 14D6.3 e 9H7.6 e combinações destes.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células dendríticas ativadas por meio do receptor Dectina-1 com o anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste ativam monócitos, células dendríticas, células mononucleares do sangue periférico, células B e combinações destes.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo Dectina-1- específico ou fragmento deste está ligado a uma metade de um par de coesina/doquerina.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo Dectina-Iespecífico ou fragmento deste está ligado a uma metade de um par de coesina/doquerina e a outra metade do par está ligada a um ou mais antígenos, citocinas selecionadas de interleucinas, fatores de transformação do crescimento (TGFs), fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs), fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs), fatores de crescimento epidérmicos (EGFs), peptídeos ativados por tecido conjuntivo (CTAPs), fatores osteogênicos, e análogos, fragmentos e derivados biologicamente ativos desses fatores de crescimento, fatores de diferenciação de células B/T, fatores de crescimento de células B/T, citocinas mitogênicas, citocinas e quimiocinas quimiotácticas, fatores de estimulação de colônias, fatores de angiogênese, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, ILl, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, ILlO, ILll, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 etc., leptina, miostatina, proteína de estimulação de macrófagos, fator de crescimento derivado de plaquetas, TNF-oí, TNF-β, NGF, CD4 0L, CD137L/4-1BBL, Iinfotoxina-β humana, G-CSF, MCSF, GM-CSF, PDGF, IL-Ioí, ILl-β, IP-10, PF4, GRO, 9E3, eritropoietina, endostatina, angiostatina, VEGF, família do supergene do fator de transformação do crescimento (TGF) incluem os fatores de transformação do crescimento beta (por exemplo, TGF-βΙ, TGF^2, TGF^3) ; proteínas morfogenéticas ósseas (por exemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); fatores de crescimento de ligação de heparina (fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento insulina-Iike (IGF)); Inibinas (por exemplo, Inibina A, Inibina B) ; fatores de diferenciação do crescimento (por exemplo, GDF-1); e Activinas (por exemplo, Activina A, Activina B, Activina AB).
17. Hibridoma que expressou um anticorpo Dectina-lespecíf ico ou fragmento deste, caracterizado pelo fato de que o anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste ativa uma célula apresentadora de antígeno para expressar novos marcadores de superfície, secretar uma ou mais citocinas, ou ambos.
18. Hibridoma, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o hibridoma é selecionado de clone PABl, PAB4, PAB5, PAB8, PABlO e combinações destes.
19. Método para o aumento de respostas imunológicas de células B, caracterizado por compreender o acionamento de um receptor Dectina-1 em uma célula dendrítica com um anticorpo específico para Dectina-1 ou fragmento deste na presença de antígeno e um ativador de TLR9, em que uma célula B que é colocada em contato com a célula dendrítica ativada por Dectina-1/TLR9 aumenta a produção de anticorpo, secreta citocinas, aumenta a expressão de marcador de superfície da ativação de células B e combinações destes.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que as células B secretam IL-8, ΜΙΡ-la, IL-6, TNF-a e combinações destes.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que as células B compreendem células plasmáticas.
22. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que as células B ativadas expressam Dectina-1.
23. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que as células B aumentam a produção de IgM.
24. Método para o aumento de respostas imunológicas de células B, caracterizado por compreender o acionamento de um receptor Dectina-1 em uma célula B com um anticorpo específico para Dectina-1 ou fragmento deste, em que a célula B aumenta a produção de anticorpo.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a célula B aumenta a produção de IL-8, MIP-Ια, IL-6, TNF-α secretados e combinações destes.
26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a célula B aumenta a produção de IgG, IgM, IgA e combinações destas.
27. Método para o aumento da ativação de células T, caracterizado por compreender acionamento de um receptor Dectina-1 em uma célula dendrítica com um anticorpo específico para Dectina-1 ou fragmento deste e receptor TLR4 e o contato de uma célula T com a célula dendrítica ativada por Dectina-1/TLR4, em que a ativação de células T é aumentada.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as células dendríticas são ainda colocadas em contato com GM-CSF e IL-4, interferon alfa, antígeno e combinações destes.
29. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o anticorpo específico para Dectina-1 ou fragmento deste aumenta a secreção de IL-10, IL-15 e combinações destas.
30. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o anticorpo específico para Dectina-1 ou fragmento deste aumenta a expressão de superfície de 4-IBBL.
31. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as células T se proliferam mediante a exposição às células dendríticas ativadas com anti-Dectina-1 anticorpos ou fragmentos destes.
32. Imunoglobulina anti-Dectina-1 ou porção desta que é secretada por células de mamíferos e um antígeno ligado à imunoglobulina, caracterizada pelo fato de que a imunoglobulina direciona o antígeno às células apresentadoras de antígeno.
33. Imunoglobulina, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o domínio antígenoespecífico compreende um anticorpo de comprimento total, um domínio da região variável de anticorpo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2 e fragmento Fv, e fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fe.
34. Vacina caracterizada por compreender uma célula dendrítica ativada com um anticorpo Dectina-l-específico ou fragmento deste.
35. Vacina, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a vacina compreende pelo menos um dos IDS. DE SEQ. Nos 1-13.
36. Carreador modular de rAb caracterizado por compreender um domínio de ligação do anticorpo específico para Dectina-1 ligado a um ou mais domínios de veículo de antígeno que compreendem metade de um par de ligação de coesina-doquerina.
37. rAb, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação antígeno-específico compreende pelo menos uma porção de um anticorpo.
38. rAb, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação antígeno-específico compreende pelo menos uma porção de um anticorpo em uma proteína de fusão com a metade do par de ligação de coesina-doquerina.
39. rAb, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por ainda compreender uma metade complementar do par de ligação de coesina-doquerina ligada a um antígeno que forma um complexo com o carreador modular de rAb.
40. rAb, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por ainda compreender uma metade complementar do par de ligação de coesina-doquerina que é uma proteína de fusão com um antígeno.
41. rAb, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o domínio antígenoespecífico compreende um anticorpo de comprimento total, um domínio da região variável de anticorpo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2 e fragmento Fv, e fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fc.
42. Uso de agentes que se ligam ao receptor Dectina-1 em células imunológicas, isoladamente ou com agentes de coativação, a combinação ativando células apresentadoras de antígeno caracterizado por ser para aplicações terapêuticas.
43. Uso de agente de ligação de Dectina-1 ligado a um ou mais antígenos, com ou sem agentes de ativação, em células imunológicas caracterizado por ser para fazer uma vacina.
44. Uso de agentes anti-Dectina-1 caracterizados por serem usados como agentes de co-ativação de células imunológicas para o aumento de respostas imunológicas dirigidas por meio de um receptor da superfície celular diferente da Dectina-1 expressa em células imunológicas.
45. Uso de seqüências da região V do anticorpo antiDectina-1, caracterizadas por serem capazes de se ligar e ativar células imunológicas por meio do receptor Dectina-1.
46. Agentes de ligação de DC-Dectina-I ligados a um ou mais agentes tóxicos, caracterizados por serem usados para fins terapêuticos no contexto de doenças que sabidamente ou com suspeita de resultarem da ativação inadequada de células imunológicas por meio de Dectina-1 ou no contexto de células patogênicas ou tecidos que expressam Dectina-1.
BRPI0807617-0A 2007-02-23 2008-02-22 Aplicações terapêuticas de ativação de antígeno humano presente em células através de dectin-1. BRPI0807617A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89142507P 2007-02-23 2007-02-23
US60/891,425 2007-02-23
PCT/US2008/054798 WO2008118587A2 (en) 2007-02-23 2008-02-22 Therapeutic applications of activation of human antigen-presenting cells through dectin-1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0807617A2 true BRPI0807617A2 (pt) 2014-07-22

Family

ID=39774942

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0807617-0A BRPI0807617A2 (pt) 2007-02-23 2008-02-22 Aplicações terapêuticas de ativação de antígeno humano presente em células através de dectin-1.

Country Status (14)

Country Link
US (2) US20080233140A1 (pt)
EP (2) EP2129773B1 (pt)
JP (5) JP2010519316A (pt)
KR (1) KR20090114466A (pt)
CN (1) CN101679949B (pt)
AU (1) AU2008231242B2 (pt)
BR (1) BRPI0807617A2 (pt)
CA (1) CA2717659C (pt)
IL (2) IL200527A0 (pt)
MX (1) MX2009008926A (pt)
NZ (7) NZ579262A (pt)
TW (1) TWI423985B (pt)
WO (1) WO2008118587A2 (pt)
ZA (1) ZA200906619B (pt)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI422594B (zh) 2007-02-02 2014-01-11 Baylor Res Inst 經由樹狀細胞去唾液酸糖蛋白受體（ｄｃ-ａｓｇｐｒ）接合抗原呈現細胞之藥劑
BR112012004546A8 (pt) 2009-08-29 2017-12-05 Abbott Lab Terapêutica por proteínas ligantes dll4-ligantes
KR101853278B1 (ko) * 2010-03-02 2018-05-02 애브비 인코포레이티드 치료학적 ｄｌｌ４ 결합 단백질
KR20130108295A (ko) * 2010-08-13 2013-10-02 베일러 리서치 인스티튜트 항원-제시 세포에 항체에 대한 보조제를 직접 표적화함을 기초로 하는 신규 백신 보조제
US20120128710A1 (en) * 2010-11-02 2012-05-24 Baylor Research Institute Enhancement of Pathogen-Specific Memory Th17 Cell Responses
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
EP2646468B1 (en) 2010-12-01 2018-07-25 AlderBio Holdings LLC Anti-ngf compositions and use thereof
TW201247706A (en) * 2011-03-08 2012-12-01 Baylor Res Inst Novel vaccine adjuvants based on targeting adjuvants to antibodies directly to antigen-presenting cells
WO2013033104A1 (en) * 2011-08-29 2013-03-07 Baylor Research Institute CONTROLLING ALLERGY AND ASTHMA BY ACTIVATING HUMAN DCs VIA DECTIN-1 OR DECTIN-1 AND TOLL-LIKE RECEPTOR 2 (TLR2)
US20140037606A1 (en) * 2012-08-06 2014-02-06 Eyal Amiel Cell-based, anti-cancer vaccines
CN105555303A (zh) 2013-06-28 2016-05-04 贝勒研究院 用于多发性硬化症的树突细胞asgpr靶向免疫治疗剂
CN120939216A (zh) 2014-01-13 2025-11-14 贝勒研究院 抗hpv和hpv相关的疾病的新疫苗
WO2015175957A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Baylor Research Institute Methods and compositions for treating autoimmune and inflammatory conditions
AU2015270845B2 (en) * 2014-06-02 2019-09-12 Baylor Research Institute Methods and compositions for treating allergy and inflammatory diseases
EP3045470A1 (en) 2015-01-15 2016-07-20 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Öffentlichen Rechts Modulators of the function of the core domain of annexins, and uses thereof in autoimmune and/or cancer therapy
EP3308800B1 (en) * 2015-06-10 2021-08-25 The University of Tokyo Adjuvant for vaccines, vaccine, and immunity induction method
BR112018006251A2 (pt) * 2015-09-30 2018-10-16 Janssen Biotech Inc anticorpos antagonistas que se ligam especificamente a cd40 humano e métodos de uso
JP7019578B2 (ja) * 2015-12-30 2022-02-15 セルジーン コーポレイション Ｔリンパ球の産生方法及びそれにより産生されるｔリンパ球
WO2017201635A1 (zh) * 2016-05-23 2017-11-30 蔡胜和 透明质酸酶的细胞表达及其在实体瘤细胞治疗中的应用
PL3468621T3 (pl) 2016-06-10 2023-01-30 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Domena rdzeniowa aneksyn i jej zastosowania w dostarczaniu antygenu i szczepieniu
CN109843327B (zh) 2016-07-07 2022-05-13 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抗体佐剂缀合物
CN106148279A (zh) * 2016-07-28 2016-11-23 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种长时间培养b细胞的方法
CN109022431B (zh) * 2018-08-06 2022-02-11 苏州吉玛基因股份有限公司 激活免疫反应的cpg-b型寡核苷酸及其应用
WO2020190725A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting her2
AU2020253621A1 (en) * 2019-04-05 2021-11-11 Dren Bio Management, Inc. Methods of depleting disease causing agents via antibody targeted phagocytosis
US20220177912A1 (en) * 2019-04-12 2022-06-09 The Methodist Hospital Therapeutic particles that enable antigen presenting cells to attack cancer cells
CN111303302A (zh) * 2020-03-19 2020-06-19 芜湖天明生物技术有限公司 一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白及其制备方法和应用
CA3198102A1 (en) * 2020-10-07 2022-04-14 Dren Bio, Inc. Anti-dectin-1 antibodies and methods of use thereof
CN113624964A (zh) * 2021-06-29 2021-11-09 上海市第十人民医院 一种侵袭性真菌的检测方法及检测试剂盒

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) * 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
US3949064A (en) 1973-10-26 1976-04-06 Baxter Laboratories, Inc. Method of detecting antigens or antibodies
US4174384A (en) * 1975-06-30 1979-11-13 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US20040258688A1 (en) * 1995-01-31 2004-12-23 Daniel Hawiger Enhanced antigen delivery and modulation of the immune response therefrom
JP4484969B2 (ja) * 1996-11-26 2010-06-16 ヌベンタ バイオファーマスティカル コーポレイション ストレスタンパク質を含む組成物を使用する免疫応答
US6046158A (en) * 1996-12-20 2000-04-04 Board Of Regents The University Of Texas Systems Unique dendritic cell-associated C-type lectins, dectin-1 and dectin-2; compositions and uses thereof
US6541011B2 (en) 1998-02-11 2003-04-01 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
US5945308A (en) * 1998-04-03 1999-08-31 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human oxidized LDL receptor
US6544780B1 (en) * 2000-06-02 2003-04-08 Genphar, Inc. Adenovirus vector with multiple expression cassettes
GB0112649D0 (en) * 2001-05-24 2001-07-18 Isis Innovation Macrophage receptor
US20050106700A1 (en) * 2001-10-11 2005-05-19 Tsuyoshi Nomura Method of purifying recombinant fused protein and method of producing protein using the same
CN1867355A (zh) * 2003-08-11 2006-11-22 财团法人阪大微生物病研究会 包含诱导粘膜免疫的佐剂的新型疫苗
EP1813668A4 (en) * 2004-11-12 2008-07-16 Seikagaku Kogyo Co Ltd HYBRIDOM capable of producing a monoclonal anti-DECTIN-1 antibody
US20060135906A1 (en) * 2004-11-16 2006-06-22 Akihiko Matsumura Iontophoretic device and method for administering immune response-enhancing agents and compositions
WO2006063101A2 (en) * 2004-12-09 2006-06-15 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Vaccines for the rapid response to pandemic avian influenza
JP2008528673A (ja) * 2005-02-04 2008-07-31 ヴィラネイティヴ アーベー トリインフルエンザの治療のための方法およびインターフェロン組成物の使用
AR054020A1 (es) * 2005-03-23 2007-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Nuevo uso
US7666596B2 (en) * 2005-05-23 2010-02-23 University Of Alberta Tissue rejection
WO2007041218A2 (en) * 2005-09-30 2007-04-12 Oklahoma Medical Research Foundation Regulation of tool-like receptors on stem cells
GB0605735D0 (en) * 2006-03-22 2006-05-03 Immunobiology Ltd Composition and method for mediating an immune response
CN101657464A (zh) * 2007-02-02 2010-02-24 贝勒研究院 与靶向人源化单克隆抗体复合的多变量抗原
JP5904227B2 (ja) * 2014-03-24 2016-04-13 トヨタ自動車株式会社 エンジンの冷却装置

Also Published As

Publication number Publication date
EP2129773A4 (en) 2010-03-10
US20080233140A1 (en) 2008-09-25
CN101679949A (zh) 2010-03-24
JP6433873B2 (ja) 2018-12-05
CN101679949B (zh) 2015-08-19
AU2008231242A1 (en) 2008-10-02
JP2019052156A (ja) 2019-04-04
EP2522718B1 (en) 2014-03-26
IL216513A0 (en) 2011-12-29
EP2129773A2 (en) 2009-12-09
NZ600143A (en) 2013-01-25
WO2008118587A2 (en) 2008-10-02
TW200848430A (en) 2008-12-16
JP2010519316A (ja) 2010-06-03
TWI423985B (zh) 2014-01-21
NZ594892A (en) 2012-12-21
NZ710459A (en) 2016-06-24
WO2008118587A3 (en) 2009-03-12
US20140322214A1 (en) 2014-10-30
KR20090114466A (ko) 2009-11-03
CA2717659C (en) 2017-08-22
HK1135431A1 (en) 2010-06-04
AU2008231242B2 (en) 2013-01-31
ZA200906619B (en) 2010-06-30
IL200527A0 (en) 2010-04-29
JP2016040265A (ja) 2016-03-24
MX2009008926A (es) 2009-09-14
JP2015007044A (ja) 2015-01-15
NZ603245A (en) 2014-04-30
CA2717659A1 (en) 2008-10-02
EP2129773B1 (en) 2013-02-13
NZ603247A (en) 2012-12-21
NZ624059A (en) 2015-10-30
NZ579262A (en) 2012-04-27
EP2522718A1 (en) 2012-11-14
JP2017079770A (ja) 2017-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2522718B1 (en) Therapeutic applications of activation of human antigen-presenting cells through dectin-1
AU2008218184B2 (en) Activation of human antigen-presenting cells through CLEC-6
JP6422797B2 (ja) 樹状細胞のレクチン様酸化ｌｄｌ受容体−１（ｌｏｘ−１）を介したヒト抗原提示細胞の活性化
BRPI0807152A2 (pt) Agentes que acoplam células contendo antígeno através do receptor asialoglicoproteina de célula dendrítica (dc-asgpr)
AU2012261626B2 (en) Activation of human antigen-presenting cells through dendritic cell lectin-like oxidized ldl receptor-1 (lox-1)
HK1135431B (en) Therapeutic applications of activation of human antigen-presenting cells through dectin-1

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 8A ANUIDADE.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2364 DE 26-04-2016 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.