BRPI0807631A2 - Membro de ligação isolado, domínios vh e vl isolados, composição, uso de um membro de ligação isolado, métodos para tratar um distúrbio, e para produzir um membro de ligação ou um domínio e uma composição de molécula de anticorpos, molécula de ácido nucleico isolada, e, célula hospedeira in vitro. - Google Patents

Description

“MEMBRO DE LIGAÇÃO ISOLADO, DOMÍNIOS VH E VL ISOLADOS, COMPOSIÇÃO, USO DE UM MEMBRO DE LIGAÇÃO ISOLADO, MÉTODOS PARA TRATAR UM DISTÚRBIO, E PARA PRODUZIR UM MEMBRO DE LIGAÇÃO OU UM DOMÍNIO E UMA COMPOSIÇÃO DE MOLÉCULA DE ANTICORPOS, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, E, CÉLULA HOSPEDEIRA IN VITRO”

Esta invenção diz respeito aos membros de ligação, especialmente às moléculas de anticorpos, para CXCL13. Os membros de ligação são úteis para o tratamento de distúrbios associados com CXCLl3, incluindo os distúrbios artríticos tais como artrite reumatóide.

CXCL13 é um quimioatrativo de células B potente, que direciona as células B simples aos folículos dos órgãos linfóides secundários e é de maneira constitutiva expressado pelas células dendríticas foliculares (FDCs) e células estromais nas áreas ricas em células B dos órgãos linfóides secundários. O CXCL13 também é conhecido como quimiocina 1 que atrai as células B (BCA-1). O CXCL13 sinaliza através do seu receptor CXCR5. O CXCR5 é um receptor ligado à proteína G que transpõe sete transmembranas e é um membro da subfamília do receptor de quimiocina CXC da classe 1 da família GPCR. O CXCR5 é expressado em altos níveis nas células B simples e ativadas, incluindo células B do sangue periférico ou tonsilares. Também é expressado em um subconjunto de células CD4+ T do sangue periférico ativadas e a maioria das células CD4+ no tecido linfóide secundário. O CXCL13 é o único ligando conhecido para CXCR5.

O CXCL13 desempenha um papel no desenvolvimento de órgãos linfóides periféricos; por exemplo, a Ansel et al [1] apresentou que os camundongos deficientes em CXCL13 têm várias deficiências no desenvolvimento do nódulo linfático periférico. O CXCL13 induz a expressão da linfotoxina α1β32 na membrana das células B simples recrutadas nos folículos, que promove a maturação das FDCs e também aumenta a produção de CXCL13 [I]. Os camundongos deficientes em CXCL13, imunizados com um antígenos dependentes de células T, formam centros germinais nos nódulos da linfa e baço mas estes são pequenos e têm uma arquitetura irregular sugerindo que o CXCL13 é necessário para o recrutamento e posicionamento correto das células B dentro dos folículos [1].

O CXCL13 também tem um papel na imunidade ingênita; os camundongos deficientes em CXCL13 necessitam de células Bl tanto na cavidade e são deficientes na produção de anticorpos naturais para os antígenos bacterianos da cavidade corporal (Ansel, KM. et al. Immunity, 16: 67-76,2002).

Existe uma evidência quanto ao envolvimento do CXCL13 em uma variedade de distúrbios, como aqui debatido em seguida.

Os membros de ligação de CXCL13 foram descritos na técnica anterior. Por exemplo, MAB801 é um anticorpo monoclonal de CXCL13 de murino anti-humano comercialmente disponível (R & D Systems: MAB801). O MAB470 é um CXCL13 monoclonal de rato anti-camundongo.

Utilizando-se as técnicas e ensaios de seleção apropriadamente indicados, desenvolvemos membros de ligação para CXCL13 que inibem a ligação de CXCL13 ao seu receptor CXCR5 alvo.

Um membro de ligação da invenção inibe a ligação do

CXCL13 ao receptor alvo, CXCR5. A inibição da ligação pode ser uma inibição direta.

Os membros de ligação para CXCL13, também indicados como membros de ligação a CXCLl3, são aqui descritos. Os membros de 25 ligação ligam e podem neutralizar CXCL13 humano e CXCL13 primata não humano, por exemplo, CXCL13 de cinomolgo. O CXCL13 não humano se refere a um ortólogo de CXCL13 que ocorre naturalmente em uma espécie outra que não o ser humano.

Os membros de ligação da invenção são normalmente específicos para CXCL13 em outros membros da família CXC das quimiocinas, incluindo por exemplo, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CXCLlO e/ou CXCL12 e deste modo ligam CXCL13 seletivamente. Isto pode ser determinado ou demonstrado por exemplo em um ensaio de 5 competição. Por exemplo, um ensaio adequado é aqui descrito no Exemplo 2,5.

Os membros de ligação são úteis para inibir a ligação de CXCL13 a CXCR5 in vivo ou in vitro, e podem ser usados para tratar os distúrbios associados com CXCLl3, tais como artrite reumatóide, como descritos em detalhe mais abaixo.

Como descrito em mais detalhes abaixo, os membros de ligação de acordo com a invenção mostraram neutralizar o CXCL13 com alta potência. A neutralização significa a inibição de uma atividade biológica do CXCLl3. Os membros de ligação da invenção podem neutralizar uma ou 15 mais atividades de CXCLl3. A atividade biológica inibida é tipicamente de CXCL13 ligando a um parceiro de ligação. Por exemplo, a atividade biológica inibida pode ser a ligação de CXCL13 a CXCR5.

De acordo com a invenção, a ligação de um CXCL13 humano ou não-humano a CXCR5 pode ser inibida, por exemplo um membro de 20 ligação pode inibir a ligação de um primata não-humano, tal como cinomolgo, CXCL13 a CXCR5. O CXCR5 pode ser humano ou não-humano, tal como de um primata não-humano, por exemplo cinomolgo, ou CXCR5 de camundongos. Em um aspecto, o CXCR5 é da mesma espécie que o CXCL13. Tipicamente CXCR5 é um CXCR5 humano.

A neutralização da ligação de CXCL13 a CXCR5 pode por

exemplo ser medida como uma função de atividade de sinalização que sinaliza CXCR5, visto que o CXCL13 que liga ao CXCR5 estimula tal atividade.

Visto que CXCR5 é um receptor ligado à G proteína, a atividade pode ser uma atividade associada com o receptor ligado às G proteínas.

Por exemplo, a ligação de CXCL13 a CXCR5 pode resultar na sub-regulação da atividade de adenilil ciclase e na diminuição nos níveis de 5 cAMP celular, através da liberação da sub-unidade de G proteína Gal, que inibe a adenilil ciclase. Portanto, um ensaio adequado pode compreender detectar uma inibição da diminuição nos níveis de cAMP celular que ocorre na ausência do membro de ligação isto é, um ensaio de cAMP aqui indicado mede a inibição (através de um membro de ligação da invenção) do CXCL13 10 mediado diminui em níveis de cAMP celular. Tipicamente, as células usadas no ensaio de cAMP são co-estimuladas com um ativador de adenil ciclase, tal como NKH477. As células adequadas para o uso em um tal ensaio são aqui descritos.

Os ensaios de cAMP (celular) adequados incluem aqueles que 15 combinam as técnicas de transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) e fluorescência de tempo determinado (TRF) em um formato de ensaio homogêneo (um ensaio TRF/FRET de cAMP como aqui indicado). Os exemplos de um ensaio TRF/FRET de cAMP inclui o ensaio de cAMP HTRF® (Fluorescência Homogênea de tempo determinado) (CisBio 20 International) (ver, por exemplo Gabriel D et al, (2003) Assay and Drug Development Technologies 1(2): 291-303) e o ensaio de cAMP LANCE® (Perkin Elmer) (ver, por exemplo Hemmila et al (1999) J Biomol Screen 4(6): 303-308).

FRET se refere a uma transferência de energia não radiativa da 25 energia de excitação entre um fluoroforo doador e fluoroforo receptor adequado (um par doador-receptor de FRET). Tipicamente os componentes do ensaio incluem: cAMP rotulados (traçador cAMP); e anticorpos rotulados de cAMP específicos. Cada um dos traçador cAMP e o anticorpo são rotulados com um membro de um par doador-receptor . Quando o anticorpo liga ao traçador cAMP, o FRET ocorre e o sinal emitido pelo receptor é determinado por TRF. O cAMP livre em uma amostra compete com o traçador cAMP para ligar ao anticorpo e reduz o sinal FRET. O ensaio deste modo compreende determinar o sinal emitido pelo receptor.

Preferivelmente o ensaio compreende determinar o sinal

específico tanto do doador quanto do receptor como um controle interno para fornecer uma medição da razão, que compensa a presença dos compostos coloridos no ensaio.

No presente ensaio, o par doador receptor é tipicamente tal que 10 o doador é excitado por uma luz a cerca de 337 a 340 nm. Tipicamente, seguindo o FRET entre o doador e o receptor, o receptor emite um sinal de cerca a 665 nm (que pode ser determinado com o tempo). Por exemplo, tanto o XL665 (receptor no ensaio de cAMP HTRF®) quanto o corante Alexa Fluor®-647 (receptor no ensaio de cAMP LANCE®) emitem um sinal 15 fluorescente a 665 nm. Um doador pode por exemplo emitir um sinal a cerca de 615 a 620 nm.

Um receptor pode ser por exemplo, uma matiz fluorescente que absorve vermelho, em particular uma matiz hidrofílica que absorve vermelho (Buschmann et al, Bioconjugate Chem. 2003, 14: 195-204). Uma matiz fluorescente que absorve vermelho pode ser por exemplo, Alexa Fluor®-647 (Perkin Elmer) tal como é usado no ensaio de cAMP LANCE®.

Os exemplos de pares de doador-receptor incluem ciptato de európio (doador)/XL665 (receptor), por exemplo como usado no ensaio de cAMP HTRF®, e quelato de európio (doador)/matiz Alexa Fluor®-647 (receptor), por exemplo como usado no ensaio de cAMP LANCE®.

O traçador cAMP ou o anticorpo podem ser rotulados com o doador ou o receptor. Deste modo um ensaio pode compreender o uso de (traçador cAMP rotulado com doador) e (anticorpos específicos de cAMP rotulados como receptor), ou de (traçador cAMP rotulados como receptor) e (anticorpos específicos de cAMP rotulados como doador). Por exemplo, um ensaio pode compreender o uso de XL665-cAMP e um anticorpo de ciptato de európio-anti-cAMP monoclonal, por exemplo como no ensaio HTRF . Um ensaio pode compreender o uso de cAMP rotulado com quelato de európio e matiz anticorpo cAMP rotulado com Alexa Fluor®-647, por exemplo como no ensaio de LANCE®.

Os sinais fluorescentes em um ensaio de TRF/FRET são determinados por TRF.

Um ensaio de cAMP TRF/FRET pode ser usado para ensaiar a inibição das diminuições mediadas por CXCL13 em níveis de cAMP celular na co-estimulação das células CH0qi5 CXCR5 com o ativador de adenilil ciclase, NKH477.

Em um ensaio de HTRF®, em geral, as macromoléculas que podem ligar a cada outra são rotuladas, uma com criptato de európio (Eu3+) (doador) e a outra com um segundo rótulo fluorescente, XL665 (ou XLent) (uma aloficocianina reticulada estável). Quando as moléculas ligam umas com as outras, e na excitação (a 337 nm), o FRET ocorre e o XL665 reemite uma fluorescência duradoura específica a 665 nm. NO: ensaio, os sinais específicos tanto do doador (a 620 nm) e do receptor (a 665 nm) são medidos como um controle interno, fornecendo uma medição da razão que compensa a presença dos compostos coloridos no ensaio.

Um ensaio de cAMP HTRF® tipicamente compreende: misturar XL665-cAMP (traçador cAMP), anticorpo de ciptato de európio- anti-cAMP monoclonal e uma amostra contendo cAMP; aplicando luz a 337 nm (deste modo excitando o doador de ciptato de európio); determinar o sinal fluorescente a 620 nm (doador) e 665 nm (receptor) por TRF; e determinar a razão do sinal 665 nm/620 nm como uma medida do FRET que ocorreu. Qualquer cAMP livre de uma amostra compete com XL665-cAMP (traçador cAMP) para ligar ao ciptato de anticorpo de európio-anti-cAMP monoclonal. O FRET máximo ocorre quando uma amostra não contem qualquer cAMP e o sinal FRET diminui com o aumento da amostra cAMP.

A tecnologia de HTRF® deste modo leva vantagem das possibilidades oferecidas pela fluorescência para trabalhar tanto nas 5 características espectrais do sinal emitido (correção da razão patenteada) e sob um modo de detecção de tempo determinado (eliminar, por exemplo a auto fluorescência). A tecnologia é homogênea, significando que as amostras e reagentes de detecção são misturados juntos em uma placa, que pode ser lida em um leitor de placas adequado, o então chamado protocolo “misturar e ler”. 10 O ensaio de cAMP LANCE® combina TRF e FRET e também

o uso de uma matiz Alexa® Fluor substituída por vermelho (Perkin Elmer), que permite um ensaio FRET sem a interferência do composto associado com as matizes azuis.

Um ensaio de cAMP LANCE® tipicamente compreende: 15 misturar um quelato de európio de európio/estreptavidina-biotina/cAMP traçador, anticorpos de cAMP específicos rotulados com Alexa Fluor®-647 e uma amostra contendo cAMP; aplicar luz a 340 nm (excitando deste modo o doador de európio); e determinar o sinal fluorescente a 665 nm (receptor) por TRF ao passo que uma medida de FRET ocorreu. A energia residual do 20 quelato produz uma luz a 615 nm. Qualquer cAMP livre de uma amostra compete com o cAMP rotulado com európio (traçador cAMP) para ligar ao anticorpo monoclonal anti-cAMP rotulado com Alexa®. O FRET máximo ocorre quando uma amostra does não contem qualquer cAMP e o sinal de FRET diminui com o aumento da amostra cAMP.

Os padrões adequados podem ser usados para calibrar os

ensaios.

Os protocolos dos ensaios e exemplos do desempenho destes ensaios são aqui descritos em detalhes na seção Materiais e Métodos.

Outra atividade de sinalização que sinaliza CXCR5, que pode ser ensaiada, de modo a determinar a neutralização de CXCL13 que liga ao CXCR5 é CXCL13 induzido pela liberação de cálcio. Tipicamente, um membro de ligação é ensaiado para um efeito inibitório na liberação de cálcio induzido por CXCL13 nas células que expressam CXCR5 e a Gqi5 proteína 5 G. O estímulo destas células com CXCL13 dá origem a aumentos no Ca2+ citoplásmico em uma maneira dependente da concentração induzindo-se a liberação de estoques e influxos intracelulares e do meio extracelular. Isto pode ser medido usando-se matizes sensíveis ao cálcio em um Leitor de Placa de Visualização por Fluorescência (FLIPR). Por exemplo, um tal ensaio usa 10 CXCL13 humano e uma linha celular CHO transfectada com Gqi5 e CXCR5 humano.

Os ensaios de cAMP e ensaios de liberação de Ca2+ podem ser realizados in vitro com uma linha celular mamífera, por exemplo células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) tais como células CHO Kl, que 15 expressam CXCR5 e a proteína G Gqi5 que contêm a sub-unidade Gai. As linhas celulares adequadas podem ser produzidas pela linha celular pré-B de murinos as células com ácidos nucleicos que codificam CXCR5 e Gqi5.

O CXCL13 é um quimioatrativo de células B potente. Os sinais de CXCL13 através do receptor de CXCR5, que é expressado em altos 20 níveis nas células B simples e ativadas, e em um sub-conjunto de células T ativadas. Portanto outra atividade, que pode ser ensaiada, de modo a determinar a neutralização de CXCL13 que liga ao CXCR5 é a quimiotaxia induzida por CXCL13 nas células B que expressam CXCR5.

As células B no ensaio podem ser as células B não primárias. Um tal ensaio usa uma linha celular pré-B de murinos que foi transfectada com CXCR5 recombinante humano (B300.19 hCXCR5 células).

Alternativamente, as células B primárias podem ser usadas. Um tal ensaio usa uma população de linfócitos misturada do baço de murino.

Deste modo, os ensaio adequados, tais como o cAMP, liberação de cálcio e ensaios de quimiotaxia da célula B podem ser usados para calcular a potência de um membro de ligação para inibir a ligação de CXCL13 a CXCR5, como descrito abaixo. Estes ensaios podem ser usados para calcular a potência de um membro de ligação para neutralizar CXCL13 5 que liga ao CXCR5. A potência neutralizante é calculada como uma função da atividade de sinalização que sinaliza o CXCR5. O ensaio pode medir a potência de neutralização induzida por CXCLl3: diminuição nos níveis de cAMP celular; aumento nos níveis de cálcio celular; ou quimiotaxia das células B.

A inibição na atividade biológica pode ser parcial ou total. Os

membros de ligação podem apresentar a atividade biológica CXCL13 em 100 %, ou pelo menos 95 %, pelo menos 90 %, pelo menos 85 %, pelo menos 80 %, pelo menos 75 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 %, ou pelo menos 50 % da atividade na ausência do membro de ligação.

A potência de neutralização de um membro de ligação pode

ser determinada. A potência é normalmente expressada como um valor IC50, em nM a menos que de outro modo estabelecido. NO:s ensaios funcionais, o IC50 é a concentração de um membro de ligação que reduz uma resposta biológica em 50 % do seu máximo. Nos estudos de ligando-ligação, a IC50 é a 20 concentração que reduz a ligação do receptor em 50 % do nível de ligação mínimo específico. O IC50 pode ser calculada pela plotagem do % da resposta biológica máxima como uma função do Iog da concentração do membro de ligação, e usando um programa de software, tal como Prism (GraphPad) para ajustar uma função sigmóide aos dados para gerar os valores IC5o· A potência 25 pode ser determinada ou medida usando um ou mais ensaios conhecidos à pessoa habilitada e/ou como aqui descrito ou indicado.

A neutralização da atividade CXCL13 por um membro de ligação em um ensaio aqui descrito, por exemplo um cAMP, liberação de cálcio ou Ensaio de quimiotaxia da célula B, indica que o membro de ligação liga CXCL13 e inibe a ligação de CXCL13 a CXCR5. Outros métodos que podem ser usados para determinar a ligação de um membro de ligação a CXCL13 inclui ELISA, Western blotting, imunoprecipitação, cromatografia de afinidade e ensaios bioquímicos.

A potência neutralizadora de um membro de ligação como

calculado em um ensaio usando CXCL13 de uma primeira espécie (por exemplo ser humano) pode ser comparada com a potência neutralizadora do membro de ligação no mesmo ensaio usando CXCL13 a partir de uma Segunda espécie (por exemplo um primata não-humano tal como), de modo a 10 avaliar a extensão da reatividade cruzada do membro de ligação para CXCL13 de duas espécie. Alternativamente, a reatividade cruzada pode ser avaliada em um ensaio de ligação por competição, como aqui descrito em maiores detalhes.

Um membro de ligação da invenção pode ter uma potência para neutralizar a ligação de CXCL13 humano para CXCR5 que está é dentro de 10 vezes da sua potência para neutralizar a ligação de CXCL13 cinomolgo a CXCR5. A potência pode ser por exemplo como medido em um ensaio de cAMP (por exemplo um ensaio TRF-FRET tal como um ensaio de cAMP LANCE®) ou em um ensaio de quimiotaxia da célula B, com CXCL13 de ser humano e cinomolgo respectivamente. A potência no ensaio de cAMP por exemplo um ensaio de cAMP LANCE® de CXCL13 humano pode, por exemplo, ser não mais do que 10-, 5-, 4-, 3- ou 2- vezes diferente do que em um ensaio de cAMP com CXCL13 de cinomolgos. A potência no ensaio de cAMP é como determinado por uma concentração final do CXCL13 humano ou cinomolgo de 2 nM. Os exemplos dos dados obtidos em um Ensaio de c AMP LANCE® de CXCL13 humano e CXCL13 cinomolgo são apresentados nas tabelas 2 e 5.

Um membro de ligação da invenção pode ligar CXCL13 humano mais fortemente do que o CXCL13 cinomolgo. A força da ligação de um membro de ligação ao CXCL13 humano pode ser por exemplo não mais do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2- vezes maior do que para o CXCL13 cinomolgo como medido em um ensaio de competição de ligação . Por exemplo, a força da ligação pode ser não mais do que 4 vezes maior para o 5 CXCL13 humano do que para o CXCL13 cinomolgo. Os exemplos de dados obtidos em um ensaio de competição de CXCL13 humano e cinomolgo são apresentados na tabela 8.

Um membro de ligação da invenção pode ter uma potência neutralizadora ou IC5o de não mais do que 12 nM em um ensaio de cAMP de CXCL13 humano, como aqui descrito, com um concentração final de 2 nM de CXCL13. O IC5O pode ser por exemplo de não mais do que 11, 10, 9, 8, 7, 6,

5, 4, 3, 2 ou 1 nM, tal como não mais do que 5 nM. O membro de ligação pode estar em qualquer forma aqui descrita, por exemplo, um IgG ou scFv ou qualquer outra foram adequada.

Um membro de ligação da invenção pode ter uma potência

neutralizadora ou IC5o de não mais do que 12 nM em um ensaio de cAMP com CXCL13 cinomolgo, como aqui descrito, com uma concentração de 2 nM final de CXCLl3. O IC50 pode ser por exemplo de não mais do que 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 nM, tal como não mais do que 3 nM. O membro 20 de ligação pode estar em qualquer forma aqui descrita, por exemplo, um IgG ou scFv ou qualquer outra forma adequada.

Por exemplo, um membro de ligação da invenção pode Ter uma potência neutralizadora ou IC50 de não mais do que 12 nM em um ensaio de cAMP HTRF® de CXCL13 humano com uma concentração final de 2 nM de CXCL13. O IC50 por exemplo, pode ser de não mais do que 11, 10, 9, 8, 7,

6, 5, 4, 3, 2 ou 1 nM, tal como não mais do que 5 nM. Os exemplos de dados obtidos em um ensaio de cAMP HTRF® de CXCL13 humano são apresentados na tabela 1.

Por exemplo, um membro de ligação da invenção pode Ter uma potência neutralizadora ou IC50 de não mais do que 12 nM em um ensaio de cAMP HTRF® com CXCL13 cinomolgo com uma concentração final de 2 nM de CXCL13.

O IC50 por exemplo, pode ser de não mais do que 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 nM, tal como não mais do que 3 nM. Os exemplos de dados obtidos em um ensaio de cAMP HTRF® com CXCL13 cinomolgo são apresentados na tabela 1.

Em um exemplo, por exemplo onde um membro de ligação ensaiado está na forma de IgG, o membro de ligação pode ter uma potência neutralizadora ou IC50 de não mais do que 5 nM em um ensaio de cAMP de CXCL13 humano como aqui descrito com uma concentração final de 2 nM de CXCL13. O IC50 por exemplo, pode ser de não mais do que 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5,

2, 1,9, 1,7, 1,5, 1,3, 1,1, 1,0, 0,9, 0,7 ou 0,5 nM, tal como não mais do que 1,4 ou não mais do que 1,6 nM.

Em um exemplo, por exemplo onde um membro de ligação

ensaiado está na forma IgG, o membro de ligação pode ter uma potência neutralizadora ou IC50 de não mais do que 5 nM em um ensaio de cAMP com CXCL13 cinomolgo como aqui descrito com uma concentração final de 2 nM de CXCL13. O IC50 por exemplo, pode ser de não mais do que 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5, 0,4 ou 0,2 nM, tal como não mais do que 0,3 nM.

Por exemplo, um membro de ligação da invenção, por exemplo um IgG, pode ter uma potência neutralizadora ou IC50 de não mais do que 5 nM em um ensaio de cAMP LANCE® de CXCL13 humano com uma concentração final de 2 nM de CXCL13. O IC50 por exemplo, pode ser de não mais do que 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,9, 1,7, 1,5, 1,3, 1,1, 1,0, 0,9, 0,7 ou

0,5 nM, tal como não mais do que 1,4 ou não mais do que 1,6 nM. Os exemplos de dados obtidos em um ensaio de cAMP LANCE® de CXCL13 humano são apresentados nas tabelas 2 e 5.

Por exemplo, um membro de ligação da invenção, por exemplo um IgG5 pode ter uma potência neutralizadora ou IC5o de não mais do que 5 nM em um ensaio de cAMP LANCE® com CXCL13 cinomolgo com uma concentração final de 2 nM final de CXCLl3. O IC50 por exemplo, pode ser de não mais do que 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5, 0,4 ou 0,2 nM, 5 tal como não mais do que 0,3 nM. Os exemplos de dados obtidos em um ensaio de cAMP LANCE® com CXCL13 cinomolgo são apresentados nas tabelas 2 e 5.

Um membro de ligação da invenção pode ter uma potência neutralizadora ou IC5o de não mais do que 40 nM em um ensaio de liberação de cálcio de CXCL13 humano com uma concentração final de 100 nM de CXCL13. O IC5O por exemplo, pode ser de não mais do que 38, 36, 34, 32,

20, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, ou 2 nM. Os exemplos de dados obtidos em um ensaio de liberação de cálcio de CXCL13 humano são apresentados nas tabelas 4 e 7.

Um membro de ligação da invenção pode ter uma potência

neutralizadora ou IC5o de não mais do que 12 nM em um ensaio de quimiotaxia da célula B de CXCL13 humano com uma concentração final de CXCL13 humano que fornece uma resposta aproximadamente ED80 , e uma linha de células B não primárias que foram transfectadas com CXCR5 recombinante humano. O IC50 por exemplo, pode ser de não mais do que 11,

10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 1,5 nM. Tipicamente o ensaio usa uma linha de células B, por exemplo um linha celular pré-B de murinos a qual foi transfectada com CXCR5 recombinante humano, tal como células B300,19 que expressam CXCR5 recombinante humano. Os exemplos de dados obtidos 25 em um ensaio de quimiotaxia da célula B de CXCL13 humano com CXCL13 humano são apresentados nas tabelas 3 e 6.

Um membro de ligação da invenção pode ter uma potência neutralizadora ou IC5o de não mais do que 10 nM em um ensaio de quimiotaxia da célula B de CXCL13 cinomolgo com uma concentração final de CXCL13 cinomolgo que fomece um resposta aproximadamente ED80 e uma linha de células B não primárias as quais foram transfectadas com CXCR5 recombinante humano. O IC50 Por exemplo, pode ser de não mais do que 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 nM. Tipicamente o ensaio usa uma linha de 5 células B, por exemplo uma linha celular pré-B de murinos as quais foram transfectadas com CXCR5 recombinante humano, tais como as células B300,19 que expressam o CXCR5 recombinante. Os exemplos de dados obtidos em um ensaio de quimiotaxia da célula B de CXCL13 cinomolgo são apresentados na tabela 6.

Um membro de ligação da invenção pode ter uma potência

neutralizadora ou IC50 de não mais do que 40nM em um ensaio de quimiotaxia celular de CXCL13 humano primário com uma concentração final de CXCL13 humano que fomece um resposta aproximadamente ED80, e uma população de linfócitos misturados. O IC50 por exemplo, pode ser de não mais do que 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4 ou

2 nM. Tipicamente o ensaio usa uma população primária de linfócitos recentemente isolada de um baço de um camundongo. Um exemplo de dados obtidos em um ensaio de quimiotaxia da célula B de CXCL13 humano com CXCL13 humano e linfócitos de murinos primários é apresentado na tabela 12.

A afinidade e cinéticas de ligação (expressadas como a constante da dissociação do equilíbrio KD) dos membros de ligação CXCL13 para CXCL13 podem ser determinadas, por exemplo usando ressonância de plasmon de superfície por exemplo BIAcore. Os membros de ligação da 25 invenção normalmente têm uma afinidade para CXCL13 humano de menos do que 400 pM, por exemplo, menos do que 380, 360, 340, 320, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, ou 50 pM. A afinidade para CXCL13 cinomolgo é normalmente similar àquela para CXCL13 humano. Os exemplos de dados obtidos para CXCL13 humano e CXCL13 cinomolgo usando BIAcore são apresentados nas tabelas IOe 11.

Um membro de ligação da invenção pode ter uma afinidade para CXCL-13 humano e CXCL-13 menor do que 150 pM.

A afinidade e cinéticas da ligação podem ser medidas usando a

ressonância de plasmon de superfície fluindo-se CXCL-13 humano ou cino sobre uma superfície que compreende o membro de ligação.

Em geral, e a menos que de outro modo especificado, as potências neutralizadoras descritas para os ensaios acima podem se aplicar a 10 um membro de ligação ensaiado em qualquer forma aqui descrita. Por exemplo, as potências podem se aplicar ás moléculas de anticorpos incluindo quaisquer dos fragmentos de anticorpos aqui descritos, por exemplo membros de ligação IgG.

As formas glicosiladas e não glicosiladas de CXCL13 humano foram obtidas quando o CXCL13 foi expressado de modo recombinante nas linhas celulares mamíferas (células MEL). A maioria do CXCL13 humano produzido estava não glicosilado, embora uma fração menor contendo a forma glicosilada pode ser obtida quando a expressão foi graduada. O CXCL13 cinomolgo expressado nas células MEL foi glicosilado. A potência do anticorpo 1 para o CXCL13 humano glicosilado e não glicosilado foi dentro de 10 vezes diferente e pode ser considerado equipotente, como medido no ensaio de quimiotaxia da célula B aqui descrito. Os exemplos dos dados de potência para o CXCL13 humano não glicosilado, CXCL13 humano glicosilado e CXCL13 cinomolgo glicosilado são apresentados na tabela 6 no Exemplo 2,3. O que liga ao CXCL13 humano glicosilado pode representar uma vantagem dos membros de ligação da invenção, visto que o CXCL13 endógeno pode ser glicosilado e portanto o CXCL13 humano glicosilado pode representar o antígeno terapêutico alvo para a terapia de seres humanos.

Nos ensaios aqui descritos, o CXCL13 recombinante, por exemplo CXCL13 humano, pode ser usado na forma não glicosilado ou glicosilado.

Nossos dados indicam que os membros de ligação da invenção podem ligar um epítopo em uma região de CXCL13 não afetada pela 5 glicosilação (ver o Exemplo 2,3 e a Tabela 6). Deste modo, as potências do membro de ligação nos ensaios aqui descritos para CXCL13 humano podem se aplicar tanto para o CXCL13 humano não glicosilado quanto para o CXCL13 humano glicosilado.

Um membro de ligação da invenção pode ter não mais do que 10 10-, 5-, 4-, 3-, 2,5-, ou 2 vezes maior potência para o CXCL13 humano não glicosilado se comparado com o CXCL13 humano glicosilado em um ensaio aqui descrito, por exemplo o ensaio de quimiotaxia da célula B. A potência para o CXCL13 humano glicosilado pode ser naturalmente maior do que a potência para o CXCL13 humano não glicosilado.

A potência dos membros de ligação da invenção para CXCL13

humano glicosilado pode ser similar ou a mesma como para o CXCL13 humano não glicosilado, por exemplo pode ser de não mais do que 10-, 5-, 4-, 3-, 2,5- ou 2- vezes diferente como medido por um ensaio de competição de ligação, um ensaio de cAMP, ensaio de liberação de cálcio ou ensaio de quimiotaxia da célula B como aqui descritos.

Um membro de ligação da invenção pode compreender uma molécula de anticorpos, por exemplo uma molécula de anticorpos humanos. O membro de ligação normalmente compreende um domínio de anticorpos VH e/ou VL. Os domínios VH e VL dos membros de ligação também são fornecidos como parte da invenção. Dentro de cada um dos domínios VH e

SJ

VL estão as regiões que determinam a complementaridade, (“CDRs ), e regiões de estrutura, (“FRs ). Um domínio VH compreende um conjunto de HCDRs, e um domínio VL compreende um conjunto de LCDRs. Uma molécula de anticorpos pode compreender um domínio de anticorpos VH que compreende um VH CDRl, CDR2 e CDR3 e uma estrutura. Alternativamente, esta também pode compreender um domínio de anticorpos VL que compreende um VL CDR1, CDR2 e CDR3 e uma estrutura. Os exemplos de domínio de anticorpos VH e VL e CDRs de acordo com a 5 presente invenção são como listados nas listagens de seqüências em anexo que formam parte da presente divulgação. Todas as seqüências VH e VL, seqüências CDR, conjuntos de CDRs e conjuntos de HCDRs e conjuntos de LCDRs aqui divulgados representam aspectos e formas de realização da invenção. Como aqui descrito, um “conjunto de CDRs” compreende CDRl, 10 CDR2 e CDR3. Deste modo, um conjunto de HCDRs se refere a HCDRl, HCDR2 e HCDR3, e um conjunto de LCDRs se refere a LCDRl, LCDR2 e LCDR3. A menos que de outro modo estabelecido, um “conjunto de CDRs” inclui HCDRs e LCDRs. Tipicamente, os membros de ligação da invenção são anticorpos monoclonais.

Um membro de ligação da invenção pode compreender um

local de ligação de antígenos dentro de uma não molécula de anticorpos, normalmente fornecido por uma ou mais CDRs por exemplo um conjunto de CDRs em uma estrutura de proteína que não de anti-corpo, como divulgado mais abaixo.

Como descrito em maiores detalhes nos exemplos, nós

isolamos uma molécula de anticorpos, anticorpo numerado I. O anticorpo 1, como aqui descrito, se refere aos anticorpos com o conjunto de CDRs do anticorpo I. As seqüências para um anticorpo 1 são apresentadas na Listagem de Seqüências em anexo, com as seguintes seqüências na seguinte ordem: 25 seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio VH (SEQ ID NO: 1); seqüência de aminoácidos do domínio VH (SEQ ID NO: 2); seqüência de aminoácidos de VH CDRl (SEQ ID NO: 3); seqüência de aminoácidos VH CDR2 (SEQ ID NO: 4); seqüência de aminoácidos VH CDR3 (SEQ ID NO: 5); seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio VL (SEQ ID NO: 6); seqüência de aminoácidos do domínio VL (SEQ ID NO: 7); seqüência de aminoácidos VL CDRl (SEQ ID NO: 8); seqüência de aminoácidos VL CDR2 (SEQ ID NO: 9); seqüência de aminoácidos VL CDR3 (SEQ ID NO: 10).

Um membro de ligação da invenção pode compreender uma

ou mais CDRs como aqui descrito, por exemplo um CDR3, e também, opcionalmente um CDRl e CDR2 para formar um conjunto de CDRs. O CDR ou conjunto de CDRs podem ser um CDR ou conjunto de CDRs do anticorpo 1, ou podem ser uma variante destes como aqui descrito.

A invenção fomece os membros de ligação que compreendem

um HCDRl, HCDR2 e/ou HCDR3 do anticorpo 1 e/ou um LCDRl, LCDR2 e/ou LCDR3 do anticorpo 1 por exemplo um conjunto de CDRs do anticorpo

I. O membro de ligação pode compreender um conjunto de VH CDRs do anticorpo 1. Opcionalmente este também pode compreender um conjunto de 15 VL CDRs do anticorpo I, e os VL CDRs podem ser do mesmo anticorpo ou de um anticorpo diferente como as VH CDRs. Um domínio VH que compreende um conjunto de HCDRs do anticorpo 1, e/ou um domínio VL que compreende um conjunto de LCDRs do anticorpo 1, também são fornecidos pela invenção.

Tipicamente, um domínio VH é unido com um domínio VL

para fornecer um local de ligação de antígenos ao anticorpo, embora como divulgado mais abaixo um domínio VH ou VL sozinho pode ser usado para ligar ao antígeno de ligação. O domínio VH do anticorpo 1 pode ser unido com o domínio VL do anticorpo 1, de modo que um local de ligação de 25 antígenos ao anticorpo é formado o qual compreende tanto os domínios VH quanto VL do anticorpo I. Em outras formas de realização, o VH do anticorpo 1 é unido com um domínio VL outro que não o VL do anticorpo 1. A heterogeneidade de cadeia leve é bem estabelecida na técnica. Deste modo, o VH do anticorpo 1 pode ser unido com o VL do anticorpo 1 ou de outro anticorpo. Um membro de ligação pode compreender um conjunto de H e/ou L CDRs do anticorpo 1 com uma ou mais mutações do aminoácido dentro do conjunto de H e/ou L CDRs divulgado. A mutação pode ser uma substituição inserção ou exclusão de aminoácidos. Deste modo por exemplo, pode haver até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 mutações, por exemplo, substituições, dentro do conjunto de H e/ou L CDRs. Por exemplo, pode haver até 5, 4, 3 ou 2 mutações, por exemplo substituições no HCDR3 e/ou pode haver até 5, 4, 3 ou 2 mutações, por exemplo, substituições no LCDR3.

Um membro de ligação pode compreender uma molécula de anticorpos tendo uma ou mais CDRs, por exemplo um conjunto de CDRs, dentro da estrutura de um anticorpo. Por ,exemplo, um ou mais CDRs ou um conjunto de CDRs de um anticorpo pode ser enxertados em uma estrutura (por exemplo estrutura humana) para fornecer uma molécula de anticorpos. As regiões de estrutura podem ser das seqüências de segmento de gene da linhagem germinativa de seres humanos. Deste modo, a estrutura pode ser de linhagem germinativa, por meio da qual um ou mais resíduos dentro da estrutura são mudados para unir os resíduos na posição equivalente na estrutura da linhagem germinativa do ser humano similar. Um membro de ligação da invenção pode ser uma molécula de anticorpos humanos isolada tendo um domínio VH que compreende um conjunto de HCDRs em uma estrutura humana da linhagem germinativa, por exemplo estrutura humana da linhagem germinativa, por exemplo VH3-23 humano. Normalmente o membro de ligação também tem um domínio VL que compreende um conjunto de LCDRs, por exemplo em uma estrutura humana da linhagem germinativa, por exemplo VKl Ll2 humano. Um domínio VH ou VL da linhagem germinativa ou pode ou não pode ser da linhagem germinativa em um ou mais resíduos de Vemier.

Uma molécula de anticorpos que não da linhagem germinativa tem as mesmas CDRs, mas diferentes estruturas, se comparado com uma molécula de anticorpos da linhagem germinativa. As seqüências de anticorpo para o anticorpo 1 aqui apresentado nas listagens de seqüências em anexo são da linhagem germinativa. Como aqui descrito nos exemplos, a linhagem 5 germinativa dos domínios VH e VL do anticorpo 1 como isolados envolvem fazer as seguintes mutações no domínio VH: QlE, V5L, Rl6G, V23A, G24A, H39Q, G83R e R105Q; e as seguintes mutações no domínio VL: I15V, A58V e D70E. Portanto em um aspecto, um domínio VH de acordo com a invenção (incluindo um membro de ligação que compreende um tal domínio VH) pode 10 compreender a seqüência de aminoácidos na SEQ ID NO: 2 mas com 1 ou mais, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8, das mutações de VH acima revestidas. Em uma forma de realização, o domínio VH não é substituído nas posições 30, 97 e 98 da SEQ ID NO: 2. De modo similar, um domínio VL de acordo com a invenção pode compreender a seqüência de aminoácidos na 15 SEQ ID NO: 7 mas com 1, 2, ou todos 3 das mutações VL revertidas. Em uma forma de realização, o domínio VL não é substituído na posição 2 da SEQ ID NO: 7.

Em um aspecto, um membro de ligação da invenção pode compreender (i) um domínio VH que compreende a seqüência de 20 aminoácidos SEQ ID NO: 2 ou a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 com uma ou mais alterações de aminoácido (por exemplo substituições) em uma ou mais das regiões de estrutura (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 substituições); e (ii) um domínio VL que compreende a seqüência de aminoácidos na SEQ ID NO: 7 ou a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 7 25 mas com uma ou mais alterações de aminoácido (por exemplo substituições) em uma ou mais das regiões de estrutura (por exemplo 1, 2 ou 3 substituições). Em uma forma de realização deste aspecto, o domínio VH do membro de ligação (por exemplo IgG) não é substituído em uma ou todas das posições 30, 97 e 98 da SEQ ID NO: 2 e o domínio VL não é substituído na posição 2 da SEQ ID NO: 7. O domínio VH pode compreender a seqüência de aminoácidos na SEQ ID NO: 2 ou pode compreender a seqüência de aminoácidos na SEQ ID NO: 2 com um ou mais (por exemplo 1, 2 ou todos) das seguintes substituições de aminoácido: G30S; T97A; R98K. O domínio 5 VL pode compreender a seqüência de aminoácidos na SEQ ID NO: 7 ou pode compreender a seqüência de aminoácidos na SEQ ID NO: 2 com a seguinte substituição de aminoácido: T2Ile.

Os dados aqui fornecidos para o anticorpo 1 são apresentados para os formatos da linhagem germinativa e/ou não da linhagem germinativa, e isto é indicado onde apropriado. Para o anticorpo que foi testado na forma da linhagem germinativa, dados muito similares foram obtidos se comparado com a forma não da linhagem germinativa.

O códon 3’ cgt, e o resíduo de arginina correspondente, apresentados no nucleotídeo e seqüência de aminoácidos para o domínio capa 15 VL do anticorpo 1 foi incluído nas seqüências scFv e IgG expressadas deste anticorpo. O resíduo de arginina no terminal C da seqüência corresponde ao resíduo Kabat 108. A origem deste resíduo e seu cgt de codificação tripleto é explicada abaixo.

Para expressar a cadeia leve do IgG, uma seqüência de 20 nucleotídeos que codifica o anticorpo da cadeia leve foi fornecida, que compreende um primeiro éxon que codifica o domínio VL, um segundo éxon que codifica o domínio CL, e um íntron que separa o primeiro éxon e o segundo éxon. Sob circunstâncias normais, o íntron é dividido através de um mecanismo de processamento de mRNA celular, juntando a terminação 3’ do 25 primeiro éxon à terminação 5’ do segundo éxon. Deste modo, quando o DNA tendo a dita seqüência de nucleotídeos foi expressada como RNA, o primeiro e segundo éxons foram unidos. A translação do RNA unido produz um polipeptídeo que compreende o domínio VL e domínio CL. Após unir, o Arg no resíduo Kabat 108 é codificado pela última base (c) do seqüência 4 da estrutura do domínio VL e as primeiras duas bases (gt) do domínio CL.

O resíduo de arginina no resíduo Kabat 108 pode ser considerado ser o resíduo do domínio VL do terminal C da molécula de anticorpos.

Um membro de ligação da invenção pode ser aquele que

compete para ligar ao CXCL13 com qualquer membro de ligação que

(i) liga CXCL13 e

(ii) compreende um membro de ligação, domínio VL e/ou VH, CDR por exemplo HCDR3, e/ou um conjunto de CDRs aqui divulgados.

Em um aspecto, a invenção fomece um membro de ligação

que compete para a ligação com uma molécula de anticorpos de scFv tendo a SEQ ID NO: 11. a seqüência na SEQ ID NO: 11 corresponde ao domínio VH da SEQ ID NO: 2 ligado ao domínio VL da SEQ ID NO: 7 através de uma seqüência de ligação (Glyl20 a Ser 134). O membro de ligação pode 15 compreender um CDR ou conjunto de CDRs do anticorpo 1, ou uma variante destes como aqui descrito em outra parte. O membro de ligação pode ser uma molécula de anticorpos por exemplo um IgG (por exemplo IgGl) ou scFv, como aqui descrito em outra parte.

Um membro de ligação pode apresentar competição completa 20 ou parcial em um ensaio de competição. Por exemplo, um membro de ligação pode apresentar pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 ou 100 % de competição para ligar ao CXCL13 em um ensaio de competição, por exemplo, com uma molécula de anticorpo scFv tendo a seqüência da SEQ ID NO: 11.

A competição entre membros de ligação pode ser facilmente

ensaiada in vitro, por exemplo usando ELISA e/ou etiquetando-se uma molécula repórter específica a um membro de ligação que pode ser detectado na presença de um ou mais outros membros de ligação não etiquetados, para permitir a identificação dos membros de ligação que ligam ao mesmo epítopo ou um epítopo de sobreposição. Tais métodos são prontamente conhecidos àquele de habilidade comum na técnica, e são aqui descritos em maiores detalhes. Por exemplo, um ensaio de competição de epítopo usando a tecnologia TRF-FRET aqui descrita em relação aos ensaios de cAMP, pode 5 ser usado (um ensaio de competição de epítopo TRF-FRET), por exemplo o ensaio de competição de epítopo HTRF®.

A tecnologia HTRF® é como aqui descrita em relação aos ensaios de cAMP. UM ensaio de competição de epítopo HTRF® tipicamente compreende: misturar CXCL13 rotulado como XL665, anticorpo de 10 referência rotulado com ciptato de európio (por exemplo uma molécula de anticorpos de scFv tendo a SEQ ID NO: 11) e um membro de ligação de teste; aplicando luz a 337 nm (deste modo excitando o doador de ciptato de európio); determina o sinal fluorescente a 620 nm (doador) e 665 nm (receptor) através do TRF; e determina a razão do sinal a 665 nm/620 nm 15 como uma medida do FRET que ocorreu. Um membro de ligação de teste, por exemplo uma molécula de anticorpos IgG ou ScFv, que compete com o anticorpo de referência para ligar ao CXCL13 reduz o FRET que ocorre. Um método detalhado para este ensaio é fornecido nos exemplos.

Deste modo, um outro aspecto da presente invenção fomece 20 um membro de ligação que compreende um local de anticorpos humanos que liga aos antígenos que compete com uma molécula de anticorpos, por exemplo especialmente uma molécula de anticorpos que compreende um domínio VL e/ou VH, CDR por exemplo HCDR3, ou conjunto de CDRs do anticorpo 1 para ligar ao CXCLl3.

Em outros aspectos, a presente invenção fomece um membro

de ligação que compreende um local de anticorpos humanos que liga aos antígenos que compete com um local de ligação de antígenos ao anticorpo para ligar ao CXCL13, em que o local de ligação de antígenos ao anticorpo é composto de um domínio VH e um domínio VL, e em que o domínios VH e VL compreendem um conjunto de CDRs do anticorpo 1 aqui divulgado.

Um membro de ligação da invenção pode ligar um epítopo de CXCL-13 humano em que o dito epítopo inclui pelo menos um resíduo da seqüência Ile-Leu-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Cys-Pro-Arg-Lys-Glu (SEQ ID NO: 5 20) nas posições 31 a 42 do IL-17A humano maduro. Este pode por exemplo ligar um, dois, três, quatro, cinco ou mais do que cinco resíduos da SEQ ID NO: 20. Um membro de ligação da invenção pode ligar outras regiões de CXCL-13 humano além da SEQID NO: 20.

Qualquer método adequado pode ser usado para determinar a seqüência dos resíduos ligados por um membro de ligação, por exemplo troca de hidrogênio-deutério, mutagênese de loco-direcionada, espectrometria de massa, cristalografia de RMN e raio-X.

A troca de hidrogeno amido peptídeo é uma metologia muito bem descrita usada para estudar as proteínas (Englander, S.W. et al. Methods 15 Enzymol. 232:26-42, 1994). Mais recentemente esta também foi desenvolvida para usar proteínas rotuladas com deutério que podem trocar por prótons e ligar estas à espectrometria de massa para medir as taxas de troca através de uma proteína inteira (Pantazatos, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 101(3):751- 756, 2004). Esta taxa de troca de hidrogênio/deutério (troca H/D) pode ser 20 significantemente modificada pela acessibilidade ao solvente tal que quando uma parte da proteína está envolvida na ligação a outra molécula a taxa da troca será significantemente lenta. Este método foi usado para mapear as regiões de um proteína envolvida na interação com os anticorpos, e foi usado para investigar as regiões de CXCL-13 envolvidas na ligação dos anticorpos 25 da invenção, como aqui detalhado no Exemplo 7. A espectrometria de massa foi usada junto com a troca H/D, para identificar as regiões de CXCL-13 humano em contato com um membro de ligação. Pode ser demonstrado por exemplo que a troca H/D para os resíduos dentro da SEQ ID NO: 20 é significantemente diminuída quando o CXCL-13 humano é ligado a um membro de ligação da invenção.

Em outros aspectos, a invenção fomece um ácido nucleico isolado que compreende uma seqüência que codifica um membro de ligação, domínio VL e/ou domínio VH de acordo com a presente invenção, e os 5 métodos de preparar um membro de ligação, um domínio VH e/ou um domínio VL da invenção, que compreende expressar o dito ácido nucleico sob condições para trazer a parte da produção do dito membro de ligação, domínio VL e/ou domínio VH, e recuperá-lo.

Outro aspecto da presente invenção fomece o ácido nucleico, em geral isolado, que codifica uma seqüência VH CDR ou VL CDR aqui divulgada.

Outro aspecto fomece uma célula hospedeira contendo ou transformada com o ácido nucleico da invenção.

Outros aspectos da presente invenção leva em consideração as composições contendo os membros de ligação da invenção, e seu uso nos métodos de inibir e/ou neutralizar CXCLl3, incluindo os métodos de tratamento do corpo humano ou animal através da terapia.

Os membros de ligação de acordo com a invenção podem ser usados em um método de tratamento ou diagnose, tal como um método de 20 tratamento (que pode incluir o tratamento profilático) de uma doença ou distúrbio no corpo humano ou animal (por exemplo em um paciente humano), que compreende administrar ao dito paciente uma quantidade eficaz de um membro de ligação da invenção. As condições tratáveis de acordo com a presente invenção inclui qualquer uma em que a CXCL13 desempenha um 25 papel, como aqui debatido em detalhes em outro lugar.

Estes e outros aspectos da invenção são descritos em maiores detalhes abaixo.

É importante salientar que “e/ou” onde aqui usado é deve ser entendido como divulgação específica de cada uma das duas características ou componentes especificados com ou sem o outro. Por exemplo “A e/ou B” deve ser entendido como a divulgação específica de cada um dos (i) A, (ii) B e (iii) AeB, como se cada um fosse aqui individualmente apresentado.

CXCLl 3

CXCL13 é ligando 13 de quimiocina (motivo C-X-C). Uma

seqüência de CXCL13 humano de extensão completa é depositada sob o número de acessão NP_006410 SEQ ID NO: 12. A seqüência de aminoácidos de extensão completa inclui um peptídeo N-terminal do resíduo 22 que é clivado in vivo para gerar a forma madura. O CXCL13 maduro tem a 10 seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 13.0 CXCL13 maduro é o antígeno in vivo alvo para aplicações terapêuticas e de diagnóstico, e aqui, as referências ao CXCL13 humano são CXCL13 maduro a menos que de outro modo especificado.

Para certos ensaios e experiências aqui descritos, CXCL13 15 humano foi expressado na linha celular MEL. O CXCL13 humano expressado a partir das células MEL foi truncado na terminação C, e sua seqüência de aminoácidos é a SEQID NO: 14. Deste modo, a SEQ ID NO: 14 é o CXCL13 humano expressado em MEL como usado nos ensaios aqui descritos. O CXCL13 maduro não truncado (SEQ ID NO: 13) também seria adequado 20 para o uso nos ensaios e o truncamento não é acreditada afetar os resultados obtidos.

O CXCL13 humano biotinilado foi usado em alguns dos ensaios aqui descritos. Este CXCL13 foi sinteticamente produzido e tem a seqüência de CXCL13 maduro SEQ ID NO: 13, carregando a biotina na maioria do resíduo de lisina do terminal C.

Em algumas formas de realização, o CXCL13 pode ser CXCL13 cinomolgo. Quando expressado a partir das células MEL para o trabalho experimental, o CXCL13 cinomolgo foi truncado de modo C terminal por 5 aminoácido e tem a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 16. Uma seqüência proposta de CXCL13 cinomolgo maduro não truncada é a SEQ ID NO: 15. Como apresentado, a seqüência cino completa não truncada é proposta incluir KRKIP na terminação C como para CXCL13 humano e reso. Este é adotado porque o primata reso usado para clonagem foi 5 planejado para recozer à região que é removida do CXCL13 humano maduro quando este está truncado.

O CXCL13 maduro não truncado (SEQ ID NO: 15) também seria adequado para o uso nos ensaios e o truncamento não é acreditado afetar os resultados obtidos.

Como aqui descrito em outra parte, o CXCL13 pode ser

recombinante, e/ou pode ser glicosilado ou não glicosilado. O CXCL13 glicosilado e/ou não glicosilado pode ser expressado em sistemas recombinantes, por exemplo em células mamíferas tais como linhas celulares humanas, linhas celulares de murinos por exemplo células MEL, ou em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

CXCR5

CXCR5 é o receptor para CXCL13 como aqui descrito em outra parte. O CXCR5 humano existe em duas isoformas. Uma seqüência de aminoácidos da isoforma 1 de CXCR5 é depositada sob o Número de Acessão 20 NP 001707 e é aqui apresentada como SEQ ID NO: 17. Uma seqüência de aminoácidos da isoforma 2 de CXCR5 é depositada sob o Número de Acessão NP 116743 e é aqui apresentada como SEQ ID NO: 18. A isoforma 2 é truncada por 45 aminoácidos na terminação N. A isoforma 2 portanto necessita do códon de início da translação e domínio extracelular da variante 25 Ie portanto não é para unir ao ligando e ser a isoforma 1 funcional de CXCR5 humano, tendo a SEQ ID NO: 17, foi aqui usada nas experiências. Portanto, as referências aqui contidas de CXCR5 são para a isoforma 1 humana a menos que de outro modo indicado.

O CXCR5 aqui indicada pode ser humano ou não-humano como indicado pelo contexto. Por exemplo, nos ensaios de neutralização usando CXCL13 humano ou CXCL13 não humano, o CXCR5 de uma espécie apropriada pode ser selecionada. Uma espécie apropriada pode ser CXCR5 humano ou não-humano onde o parceiro de ligação é CXCL13 humano ou 5 não humano da mesma espécie. Alternativamente, o CXCL13 humano ou não humano pode ser usado nos n ensaios com CXCR5 humano ou não-humano de uma espécie diferente onde o CXCL13 humano ou não humano é conhecido por reagir cruzado.

Membro de ligação

Este descreve um membro de um par de moléculas que ligam

uma a outra. Os membros de um par de ligação pode ser naturalmente derivado ou produzido completa ou parcialmente de modo sintético. Um membro do par de moléculas tem uma área na sua superfície, ou uma cavidade, que liga a e é portanto complementar a uma organização espacial e 15 polar particular do outro membro do par de moléculas. Os exemplos dos tipos dos pares de ligação são antígeno-anticorpo, biotina-avidina, hormônio- receptor de hormônio, receptor-ligando, e enzima-substrato. A presente invenção é relacionada com as reações do tipo antígeno-anticorpo.

Um membro de ligação normalmente compreende uma molécula tendo um local de ligação de antígenos. Por exemplo, um membro de ligação pode ser uma molécula de anticorpos ou uma proteína que não de anticorpos que compreende um local de ligação de antígenos.

Um local de ligação de antígenos pode ser fornecido por intermédio de um arranjo da CDRs na estrutura de proteína que não de anti- 25 corpos, tal como fibronectina ou citocromo B etc. [2, 3, 4], ou mutando-se ou tomando-se aleatórios os resíduos de aminoácido de uma alça dentro de uma estrutura protéica para conceder especificidade de ligação para um alvo desejado. As estruturas para projetar novos locais de ligação nas proteínas foram examinadas em detalhes por Nygren et al. [4]. As estruturas protéicas para os imitadores de anticorpo são divulgadas na WO/0034784, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade, em que os inventores descrevem as proteínas (imitadores de anticorpo) que inclui um domínio de fibronectina tipo III tendo pelo menos uma alça aleatória. Uma estrutura adequada em que 5 o enxerto de um ou mais CDRs, por exemplo um conjunto de HCDRs, pode ser fornecido por qualquer membro de domínio da superfamília do gene de imunoglobulinas. A estrutura pode ser uma proteína humana ou não-humana. A vantagem de uma estrutura protéica que não de anticorpos é que esta pode fornecer um local de ligação de antígenos em uma molécula da estrutura que é 10 menor e/ou mais fácil de fabricar do que pelo menos algumas moléculas de anticorpos. O tamanho pequeno de um membro de ligação pode conferir propriedades fisiológicas úteis, tais como uma capacidade de entrar nas células, penetrar profundamente nos tecidos ou alcançar os alvos dentro de outras estruturas, ou ligar dentro das cavidades das proteína do antígeno alvo. 15 O uso dos locais de ligação de antígenos na estrutura de proteína que não de anti-corpos é examinada em Wess, 2004 [5]. As proteínas são típicas tendo uma estrutura estável e um ou mais alças variáveis, em que a seqüência de aminoácidos da alça ou alças é especifica ou aleatoriamente transformada para criar um local de ligação de antígenos que liga ao antígeno alvo. Tais 20 proteínas incluem os domínios de ligação IgG de proteína A para S. aureus, transferina, tetranectina, fibronectina (por exemplo IOe domínio de fibronectina tipo III), lipocalinas bem como gama-cristalina e outras estruturas de Affilin® (proteínas Scil). Os exemplos de outros métodos incluem “Microcorpos” sintéticos com base em ciclotídeos - proteínas 25 pequenas tendo ligações de dissulfeto intra-molecular, Microproteínas (Versabodies®, Amunix) e proteínas de repetição de anquirinas (DARPins, Molecular Partners).

Além da seqüências de anticorpos e/ou um local de ligação de antígenos, um membro de ligação de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, por exemplo formar um peptídeo ou polipeptídeo, tal como um domínio dobrado, ou comunicar à molécula outra característica funcional além da capacidade de ligar ao antígeno. Os membros de ligação da invenção podem carregar um rótulo detectável, ou pode ser 5 conjugado para uma toxina ou uma porção ou enzima alvo (por exemplo por intermédio de uma ligação ou ligante peptidila). Por exemplo, um membro de ligação pode compreender um local catalítico (por exemplo em um domínio enzimático) bem como um local de ligação de antígenos, em que o local de ligação de antígenos liga ao antígeno e deste modo alveja o local catalítico 10 para o antígeno. O local catalítico pode inibir a função biológica do antígeno, por exemplo através da clivagem.

Contudo, como notado, os CDRs podem ser carregados por estruturas que não de anticorpos, a estrutura para carregar um CDR ou um conjunto de CDRs da invenção será em geral um anticorpo pesado ou a 15 seqüência de cadeia leve ou uma porção substancial desta em que o CDR ou conjunto de CDRs está localizado em um local correspondente ao CDR ou conjunto de CDRs domínios variáveis do anticorpo VH e VL de ocorrência natural codificados reorganizando-se os genes de imunoglobulina. As estruturas e locais dos domínios variáveis de imunoglobina podem ser 20 determinados em referência à Kabat, et al., 1987 [6] e atualizações destes. Vários recursos acadêmicos e comerciais on-line estão disponíveis para consulta neste banco de dados. Por exemplo, ver a ref. [7] e o recurso on-line associado, atualmente no endereço na rede

http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html.

Por região CDR ou CDR, é intencionado indicar as regiões

hipervariáveis de cadeias pesadas ou leves de imunoglobulina como definido por Kabat et al. 1991 [8], e edições anteriores. Um anticorpo tipicamente contem 3 CDRs de cadeia pesada e 3 CDRs de cadeia leve. O termo CDR ou CDRs é aqui usado de modo a indicar, de acordo com o caso, uma ou várias destas regiões, ou mesmo todas destas regiões que contêm a maioria dos resíduos de aminoácidos responsáveis para a ligação por afinidade do anticorpo para o antígeno ou o epítopo que este reconhece.

Entre as seis seqüências de CDR curtas, a terceira CDR de 5 cadeia pesada (HCDR3) tem uma maior variabilidade no tamanho (maior diversidade essencialmente devido aos mecanismos de organização dos genes que dão origem a esta). Esta pode ser tão curta quanto os 2 aminoácidos embora o tamanho mais longo conhecido seja 26. A extensão da CDR também pode variar de acordo com a extensão que pode ser fornecida pela 10 estrutura subjacente particular. Funcionalmente, o HCDR3 desempenha um papel na parte da determinação da especificidade do anticorpo [9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16].

Molécula de Anticorpos

Esta descreve uma imunoglobulina seja natural ou produzida 15 parcial ou completamente de modo sintético. O termo também envolve qualquer polipeptídeo ou proteína que compreende um local de ligação de antígenos ao anticorpo. Aqui, deve ser entendido que a invenção não diz respeito aos anticorpos em sua forma natural, isto quer dizer que estes não estão no seu ambiente natural mas que são capazes de ser isolados ou obtidos 20 através da purificação a partir de fontes naturais, ou mesmo obtidos pela recombinação genética, ou pela síntese química, e que podem então conter aminoácidos não naturais ao passo que serão descritos posteriormente. Os fragmentos de anticorpos que compreendem um local de ligação de antígenos ao anticorpo incluem, mas não são limitados a, moléculas tais como Fab, 25 Fab’, Fab’-SH, scFv, Fv, dAb e Fd. Várias outras moléculas de anticorpos incluindo um ou mais locais de ligação de antígenos aos anticorpos foram projetadas, incluindo por exemplo Fab2, Fab3, dicorpos, tricorpos, tetracorpos e minicorpos. As moléculas de anticorpos e os métodos para sua construção e uso são descritos em [17]. É possível ter anticorpos monoclonais e outros e usar técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que ligam ao antígeno alvo. Tais técnicas podem envolver introduzir o DNA que codifica a região variável de imunoglobina, 5 ou as CDRs, de um anticorpo para as regiões constantes, ou regiões constante mais as regiões de estrutura, de uma imunoglobulina diferente. Ver, por exemplo, a EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400, e um corpo grande da literatura subsequente. Um hibridoma ou outra célula que produz um anticorpo pode ser submetido a mutação genética ou outras mudanças, que 10 podem ou não podem alterar a especificidade de ligação dos anticorpos produzidos.

Como os anticorpos podem ser modificados de várias maneiras, o termo “molécula de anticorpos” deve ser interpretado como cobrindo qualquer membro de ligação ou substância tendo um local de 15 ligação de antígenos ao anticorpo com a especificidade necessária e/ou que liga ao antígeno. Deste modo, este termo abrange os fragmentos e derivados de anticorpos, incluindo qualquer polipeptídeo que compreende um local de ligação de antígenos ao anticorpo, seja natural ou total ou parcialmente sintético. As moléculas quiméricas que compreendem um local de ligação de 20 antígenos ao anticorpo, ou equivalente, fundido a outro polipeptídeo (por exemplo derivado de outra espécie ou que pertence a outra classe ou subclasse anticorpos) são portanto incluídas. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritos na EP-A-0120694 e EP-A-0125023, e um grande corpo da literatura subsequente.

Outras técnicas disponíveis na técnica de projetar anticorpos

tomou possível isolar anticorpos humanos e humanizados. Por exemplo, hibridomas humanos podem ser feitos como descrito por Kontermann & Dubel [18]. O desenvolvimento de fagos, outra técnica estabelecida para gerar membros de ligação foi descrito em detalhes em muitas publicações, tais como Kontermann & Dubel [18] e W092/01047 (divulgada mais abaixo), e nas Patentes US US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404.

Os camundongos transgênicos em que o genes de anticorpo de

camundongos são inativados e funcionalmente substituídos com genes de anticorpos humanos enquanto deixam intactos outros componentes do sistema imunológico do camundongo, podem ser usados para isolar anticorpos humanos [19]. Os anticorpos humanizados podem ser produzidos usando 10 técnicas conhecidas na técnica tais como aquelas conhecidas por exemplo na W091/09967, US 5.585.089, EP592106, US 565.332 e W093/17105. Além disso, a W02004/006955 descreve os métodos para a humanização de anticorpos, fundamentados na seleção das seqüências de estrutura da região variável dos genes de anticorpos humanos comparando-se os tipos de 15 estrutura de CDR canônicos para as seqüências de CDR da região variável de um anticorpo não-humano para os tipos de estrutura CDR canônicas para as CDRs correspondentes a partir de uma compilação de seqüências de anticorpos humanos, por exemplo segmentos de gene de anticorpos da linhagem germinativa. As regiões variáveis de anticorpos humanos tendo 20 tipos de estrutura CDR canônicas similares às CDRs não-humanas formam um subconjunto de seqüências de anticorpos de membros humanos a partir dos quais seleciona-se as seqüências de estrutura humana. Os membros de sub-conjuntos também podem ser classificados por semelhança de aminoácidos entre as seqüências de CDR humanas e não humanas . NO: 25 método da W02004/006955, seqüências humanas de classificação de topo são selecionadas para fornecer as seqüências da estrutura para formar um anticorpo quimérico que substitui funcionalmente as seqüências CDR humanas com as contrapartes de CDR não-humanas usando o estruturas humanas do membro do subconjunto selecionado, deste modo fornecendo um anticorpo humanizado de alta afinidade e baixa imunogenicidade sem necessitar de comparar as seqüências de estrutura entre os anticorpos não- humanos e humanos. Os anticorpos quiméricos feitos de acordo com o método também são divulgados.

As moléculas sintéticas de anticorpos podem ser criadas

através da expressão dos genes gerados por intermédio dos oligonucleotídeos sintetizados e montados dentro de vetores de expressão adequados, por exemplo como descrito por Knappik et al. [20] ou Krebs et al. [21].

Foi apresentado que os fragmentos de um anticorpo inteiro por 10 desempenhar a função dos antígenos de ligação. Os exemplos de fragmentos de ligação são (1) o fragmento Fab que consiste dos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) o fragmento Fd que consiste dos domínios VH e CHI; (iii) o fragmento Fv que consiste dos domínios VL e VH de um anticorpo único; (iv) o fragmento dAb [22, 23, 24], que consiste de um domínio VH ou VL; (v) 15 regiões de CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab’)2, um fragmento bivalente que compreendem fragmentos de moléculas Fv Fab (vii) de cadeia única (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL são ligados por um ligante de peptídeo que permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação de antígeno [25, 26]; (viii) dímeros Fv de cadeia única 20 biespecíficos (PCT/US92/09965) e (ix) “dicorpos , fragmentos multivalentes ou multiespecíficos formados pela fusão do gene (W094/13804; [27]). As moléculas Fv, scFv ou diacorpo podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes de dissulfeto ligando aos domínios VH e VL [28]. Os minicorpos que compreendem um scFv unido a um domínio CH3 também podem ser 25 fabricados [29]. Outros exemplos de fragmentos de ligação são Fab’, que diferem dos fragmentos de Fab pela adição de poucos resíduos na terminação carboxila do domínio CHl de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas do região de dobradiça do anticorpo, e Fab5-SH, que é um fragmento de Fab5 em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre.

Os fragmentos de anticorpos da invenção podem ser obtidos partindo da molécula de anticorpos 1, através dos métodos tais como digestão pelas enzimas por exemplo pepsina ou papaína e/ou através da clivagem das 5 pontes de dissulfeto através da redução química. De outro modo, os fragmentos de anticorpos compreendidos na presente invenção podem ser obtidos através das técnicas de recombinação genética igualmente bem conhecidas àquele habilitado na técnica ou ainda pela síntese de peptídeos por intermédio de, por exemplo, sintetizadores de peptídeo automático, tais como 10 aqueles fornecidos pela companhia Applied Biosystems, etc., ou através da síntese e expressão do ácido nucleico.

Os fragmentos funcionais de anticorpos de acordo com a presente invenção incluem qualquer fragmento funcional cuja meia-vida é aumentada por uma modificação química, especialmente pela PEGilação, ou pela incorporação em um lipossomo.

Um dAb (anticorpo de domínio) é um fragmento monomérico pequeno que liga ao antígeno de um anticorpo, a saber à região variável de uma cadeia de anticorpos pesada ou leve [24]. Os dAbs do VH ocorrem naturalmente em camelídeos (por exemplo camelo, lhama) e podem ser 20 produzidos imunizando-se um camelídeo com um antígeno alvo, isolando-se as células B específicas de antígenos e clonando-se diretamente os genes do dAb a partir das células B individuais. Os dAbs também são produzíveis em uma cultura celular. Seu tamanho pequeno, boa solubilidade e estabilidade na temperatura os tomam particularmente úteis do ponto de vista fisiológico e 25 adequados para a maturação de seleção e afinidade. Os dAbs do VH dos camelídeos estão sendo desenvolvidos para o uso terapêutico sob o nome “nanobodies®”. Um membro de ligação da presente invenção pode ser um dAb que compreende um domínio VH ou VL substancialmente como aqui apresentado, ou um domínio VH ou VL que compreende um conjunto de CDRs substancialmente como aqui apresentado.

Os anticorpos biespecíficos ou bifuncionais formam uma segunda geração de anticorpos monoclonais em que duas regiões variáveis diferentes são combinadas na mesma molécula [30]. Seu uso foi demonstrado 5 tanto no campo diagnóstico quanto no campo da terapia a partir de sua capacidade de recrutar novas funções atuadoras ou alvejar várias moléculas na superfície das células tumorais. Onde os anticorpos biespecíficos devem ser usados, estes pode ser anticorpos biespecíficos convencionais, que podem ser produzidos de várias maneiras [31], por exemplo quimicamente preparados ou 10 a partir de hibridomas híbridos, ou podem ser qualquer um dos fragmentos de anticorpos biespecíficos mencionados acima. Estes anticorpos podem ser obtidos através de métodos químicos [32,33] ou métodos somáticos [34, 35] mas também e preferencialmente através de técnicas da engenharia genética que permitem que a heterodimerização seja forçada e deste modo facilite o 15 processo de purificação do anticorpo pesquisado [36]. Os exemplos de anticorpos biespecíficos incluem aqueles da tecnologia BiTE® em que os domínios de ligação de dois anticorpos com especificadas diferentes podem ser usados e diretamente ligado por intermédio de peptídeos flexíveis curtos. Isto combina dois anticorpos em um cadeia de polipeptídeos curta única. 20 Dicorpos e scFv podem ser interpretados sem uma região Fe, usando somente os domínios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos da reação anti- idiotípica.

Os anticorpos biespecíficos podem ser formados como IgG inteiros, como Fab’2 biespecífico, como FabTEG, como dicorpos ou ainda como scFv biespecífico. Além disso, dois anticorpos biespecíficos podem ser ligados usando métodos de rotina conhecidos na técnica para formar anticorpos tetravalentes.

Os diacorpos biespecíficos, como opostos aos anticorpos biespecíficos integrais, também podem ser particularmente úteis porque estes podem ser prontamente formados e expressados em dicorpos de E.coli. (e muitos outros polipeptídeos, tais como fragmentos de anticorpos) de especificidades de ligação apropriadas podem ser prontamente selecionados usando uma apresentação de fago (W094/13804) das bibliotecas. Se uma 5 ramo do diacorpo deve ser mantida constante, por exemplo, com uma especificidade direcionada contra CXCL13, então uma biblioteca pode ser feita onde um outra ramo é variado e um anticorpo de especificidade apropriado é selecionado. Os anticorpos biespecíficos integrais podem ser feitos através de métodos de engenharia alternativos como descrito na 10 Ridgeway et al., 1996 [3 7].

Vários métodos são disponíveis na técnica para obter os anticorpos contra CXCL13. Os anticorpos podem ser anticorpos monoclonais, especialmente de seres humanos, murinos, quiméricas ou de origem humanizada, os quais podem ser obtidos de acordo com os métodos padrão bem conhecidos àquele habilitado na técnica.

Em geral, para a preparação dos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos funcionais, especialmente de origem murino, é possível se referir às técnicas que são descritas em particular no manual “Anticorpos” [38] ou à técnica de preparação a partir dos hibridomas descritos por Kohler e Milstein [39].

Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos, por exemplo, a partir de uma célula animal imunizada contra CXCL13, ou um de seus fragmentos contendo o epítopo que reconhece os ditos anticorpos monoclonais. Os fragmentos adequados e peptídeos ou polipeptídeos que os 25 compreendem são aqui descritos, e podem ser usados para imunizar os animais para gera anticorpos contra CXCL13. O dito CXCL13, ou um de seus fragmentos, podem ser especialmente produzidos de acordo com os métodos de trabalho usuais, através da recombinação genética começando com uma seqüência de ácidos nucleicos contida na seqüência cDNA que codifica quanto a CXCL13 ou fragmento deste, através da síntese de peptídeos partindo de uma seqüência de aminoácidos compreendida na seqüência de peptídeos do CXCL13 e/ou fragmento deste.

Os anticorpos monoclonais podem, por exemplo, ser 5 purificados em uma coluna de afinidade em que CXCL13 ou um de seus fragmentos contendo o epítopo reconhecido pelos ditos anticorpos monoclonais, foi previamente imobilizado. Mais particularmente, os anticorpos monoclonais podem ser purificados através de cromatografia na proteína A e/ou G, seguido ou não seguido por cromatografia de troca de íons 10 visando a eliminação dos contaminastes de proteína residual bem como o DNA e o LPS, em si, seguido ou não seguido pela cromatografia de exclusão em gel de Sepharose de modo a eliminar os agregados potenciais devido à presença de dímeros ou de outros multímeros. Em uma forma de realização, todas estas técnicas podem ser usadas de modo simultâneo ou sucessivo.

Local que liga ao antígeno

Este descreve a parte de uma molécula que liga a e é complementar a todo o ou parte do antígeno alvo. Em uma molécula de anticorpos este é referido como o local de ligação de antígenos ao anticorpo, e compreende a parte do anticorpo que liga ao e é complementar a todo ou parte 20 do antígeno alvo. Onde um antígeno é grande, um anticorpo pode somente ligar a uma parte particular do antígeno, cuja parte é chamada de um epítopo. Um local de ligação de antígenos ao anticorpo pode ser fornecido por um ou mais domínios de anticorpos variáveis. Um local de ligação de antígenos ao anticorpo pode compreender um região de anticorpos de cadeia leve variável 25 (VL) e um região de anticorpos de cadeia pesada variável (VH).

Isolado

Este se refere ao estado em que os membros de ligação da invenção, ou ácido nucleico que codifica tais membros de ligação, estará em geral de acordo com a presente invenção. Deste modo, os membros de ligação, domínios VL e/ou VH, e codificando as moléculas e vetores de ácido nucleico de acordo com a presente invenção podem ser fornecidos isolados e/ou purificados, por exemplo a partir do seu ambiente natural, na forma substancialmente pura ou homogênea, ou, no caso do ácido nucleico, isento 5 ou substancialmente isento de ácido nucleico ou genes de origem outra que não a seqüência que codifica um polipeptídeo com a função requerida. Os membros isolados e ácido nucleico isolado serão isentos ou substancialmente isentos de material com o qual estes são naturalmente associados, tais como outros polipeptídeos ou ácido nucleicos com os quais estes são encontrados 10 no seu ambiente natural, ou no ambiente em que estes são preparados (por exemplo cultura celular) quando tal preparação é através da tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Os membros e o ácido nucleico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda para propósitos práticos ser isolados - por exemplo os membros normalmente serão 15 misturados com gelatina ou outros carregadores se usados para revestir as placas microtitulantes para o uso em imunoensaios, ou serão misturados com carregadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis quando usados no diagnóstico ou terapia. Os membros de ligação podem ser sistemas glicosilados naturalmente ou por meio de células eucarióticas heterólogas (por 20 exemplo células CHO ou NSO (ECACC 85110503), ou podem ser (se produzidos pela expressão em uma célula procariótica, por exemplo) não glicosilados.

As preparações heterogêneas que compreendem moléculas de anticorpos anti-CXCL13 também formam parte da invenção. Por exemplo, 25 tais preparações podem ser misturas de anticorpos com cadeias pesadas de tamanho natural e cadeias pesadas deficientes no terminal C lisina, com vários graus de glicosilação e/ou com aminoácidos derivados, tais como ciclização de um ácido glutâmico N-terminal para formar um resíduo do ácido piroglutâmico. Como aqui usado, o termo “substancialmente como apresentado” se refere à(s) característica(s) das CDRs relevantes do domínio VH ou VL dos membros de ligação aqui descritos que serão idênticas ou altamente similares às regiões especificadas das quais a seqüência é aqui 5 apresentada. Como aqui descrito, o termo “altamente similar” com respeito às região(ões) especificada(s) de um ou mais domínios variáveis, é considerado que de 1 a cerca de 5, por exemplo de 1 a 4, incluindo de 1 a 3, ou 1 ou 2, ou

3 ou 4, substituições de aminoácidos podem ser feitas no CDR e/ou domínios VH ou VL.

IO DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como notado acima, um membro de ligação de acordo com a presente invenção liga CXCL13 e pode neutralizar uma atividade biológica de CXCL13. Um membro de ligação da presente invenção pode ser submetido à otimização da potência, para também melhorar sua potência neutralizadora. 15 Em geral, a otimização da potência envolve a mutação da seqüência de um membro de ligação selecionado (normalmente a seqüência de domínio variável de um anticorpo) para gerar uma biblioteca de membros de ligação, que são então ensaiados quanto a potência e os membros de ligação mais potentes são selecionados. Deste modo os membros de ligação “de potência 20 otimizada” selecionados tendem a ter uma potência maior do que a do membro de ligação a partir do qual a biblioteca foi gerada.

Não obstante, os membros de ligação de alta potência podem ser obtidos sem otimização. Como aqui demonstrado, os membros de ligação de alta potência podem ser diretamente obtidos a partir de uma triagem inicial, por exemplo, um ensaio de neutralização bioquímico.

Um membro de ligação “de potência otimizada” se refere a um membro de ligação com uma potência otimizada de neutralização de uma atividade particular ou função a jusante do CXCL13. Os ensaios e potências são descritos em maiores detalhes aqui em outro lugar. Os membros de ligação de potência otimizada e não otimizada são aspectos da invenção, bem como os métodos para a otimização de potência a partir de um membro de ligação selecionado. A presente invenção deste modo permite que a pessoa habilitada gere os membros de ligação tendo alta potência.

Em outro aspecto, a presente invenção fomece um método de obter um ou mais membros de ligação capazes de ligar ao antígeno, o método incluindo trazer em contato uma biblioteca de membros de ligação de acordo com a invenção ao dito antígeno, e selecionar um ou mais membros de ligação da biblioteca capazes de ligar ao antígeno.

A biblioteca pode ser apresentada em partículas ou complexos moleculares, por exemplo pacotes genéticos reproduzíveis, tais como sistemas de apresentação de partículas de levedura, bacterianas ou bacteriófagas (por exemplo T7), viral, celulares ou covalentes, ribossômicas ou outras in vitro, 15 cada complexo de partícula ou molecular contendo ácido nucleico que codifica o domínio de anticorpo VH variável apresentada neste, e opcionalmente também um domínio VL apresentado se presente. A apresentação do fago é descrita na W092/01047 e por exemplo nas Patentes US US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, 20 US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 e US6521404, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

Seguindo a seleção de membros de ligação capazes de ligar ao antígeno e apresentadas no bacteriófago ou outra biblioteca de partículas ou 25 complexos moleculares, o ácido nucleico pode ser retirado de um bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular que apresenta um dito membro de ligação selecionado. Tal ácido nucleico pode ser usado na produção subsequente de um membro de ligação ou um domínio de anticorpo VH ou VL variável pela expressão do ácido nucleico com a seqüência de ácido nucleico retirado de um bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular que apresenta um dito membro de ligação selecionado.

Um domínio de anticorpo VH variável com a seqüência de aminoácidos de um domínio de anticorpo VH variável de um dito membro de ligação selecionado pode ser fornecido na forma isolada, como pode um membro de ligação que compreende um tal domínio VH.

A capacidade de ligar a CXCL13 também pode ser testada, também a capacidade de competir com um membro de ligação por exemplo um anticorpo 1, (por exemplo no formato scFv e/ou formato IgG, por exemplo IgGl) para ligar ao CXCL13 pode ser determinada. A capacidade de neutralizar CXCL13 pode ser testada, como também debatido em outro lugar.

Um membro de ligação de acordo com a presente invenção pode ligar CXCL13 com a afinidade do anticorpo 1, por exemplo scFv ou IgGl, ou com uma afinidade que é melhor.

Um membro de ligação de acordo com a presente invenção

pode neutralizar uma atividade biológica de CXCL13 com a potência do anticorpo 1, por exemplo scFv, ou IgGl, ou com uma potência que é melhor.

A potência de afinidade e neutralização de ligação de diferentes membros de ligação pode ser comparada sob condições apropriadas.

As variantes dos domínios VH e VL e CDRs da presente invenção, incluindo aquelas pelas quais as seqüências de aminoácido são aqui apresentadas, e que podem ser utilizadas nos membros de ligação para CXCL13 podem ser obtidas por intermédio dos métodos de alteração ou 25 mutação de seqüência e triagem para os membros de antígeno-ligação com características desejadas. Os exemplos de características desejadas incluem mas não são limitados a:

• Afinidade de ligação aumentada para o antígeno com relação aos anticorpos conhecidos que são específicos para o antígeno • Neutralização aumentada de uma atividade de antígeno com relação aos anticorpos conhecidos que são específicos para o antígeno se a atividade é conhecida

• Capacidade competitiva especificada com um anticorpo ou ligando conhecidos ao antígeno em uma razão molar específica

• Capacidade de imunoprecipitar o complexo

• Capacidade de ligar a um epítopo especificado

° Epítopo linear, por exemplo uma seqüência de peptídeos identificada usando escaneamento de ligação de peptídeos como aqui descrito, por exemplo usando os peptídeos triados na configuração linear e/ou restringida

° Epítopo estrutural, formado por resíduos não contínuos

• Capacidade de modular uma nova atividade biológica de CXCL13, ou molécula a jusante.

Tais métodos também são aqui fornecidos.

As variantes das moléculas de anticorpos aqui divulgadas podem ser produzidas e usadas na presente invenção. Seguindo o exemplo da química computacional na aplicação de técnicas de análises de dados multivariadas às relações de atividade de estrutura/propriedade [40] as 20 relações de atividade-propriedade quantitativas de anticorpos podem ser derivadas usando técnicas matemáticas bem conhecidas, tais como padrões de regressão estatística, reconhecimento e classificação [41, 42, 43, 44, 45, 46]. As propriedades dos anticorpos podem ser de modelos empíricos ou teóricos (por exemplo, análise de resíduos de contato semelhantes ou propriedade de 25 físico-química calculada) da seqüência de anticorpos, as estruturas funcionais e tridimensionais e estas propriedades podem ser consideradas individualmente e em combinação.

Um local de ligação de antígenos ao anticorpo composto de um domínio VH e um domínio VL é tipicamente formado por seis alças de polipeptídeos: três do domínio variável de cadeia leve (VL) e três do domínio variável de cadeia pesada (VH). A análise dos anticorpos de estrutura atômica conhecida tem relações explicadas entre a seqüência e a estrutura tridimensional dos locais de combinação de anticorpos [47,48]. Estas relações 5 significam que, exceto para a terceira região (circuito fechado) nos domínios VH, as alças do local de ligação têm uma de um pequeno número de configurações de cadeia principal: as estruturas canônicas. A estrutura canônica formada em uma alça particular foi apresentada ser determinada pelo seu tamanho e pela presença de certos resíduos em locais chave tanto no 10 circuito fechado quanto nas regiões de estrutura [47, 48].

Este estudo da relação da sequência-estrutura pode ser usado para o prognóstico daqueles resíduos em um anticorpo de seqüência conhecida, mas de uma estrutura tridimensional desconhecida, as quais são importantes na manutenção da estrutura tridimensional dos suas alças de CDR 15 e para assim manter a especificidade de ligação. Estes prognósticos podem ser sobressalentes em comparação com os prognósticos para a saída das experiências da otimização principais. Em um método estrutural, um modelo pode ser criado a partir da molécula de anticorpos [49] usando qualquer acondicionamento livremente disponível ou comercial, tal como WAM [50]. 20 Um acondicionamento de visualização de proteína e suporte lógico de análise, tal como Insight II (Accelrys, Inc.) ou Deep View [51] podem então ser usados para avaliar as possíveis substituições em cada posição no CDR. Esta informação pode então ser usada para fazer as substituições que provavelmente têm um efeito mínimo ou benéfico na atividade.

As técnicas necessárias para fazer as substituições dentro das

seqüências de aminoácido dos CDRs, domínios de anticorpos VH ou VL e membros de ligação em geral são disponíveis na técnica. As seqüências variantes podem ser feitas, com substituições que podem ou não podem ser prognosticadas ter um efeito mínimo ou benéfico na atividade, e testadas quanto a capacidade de ligar e/ou neutralizar o CXCL13 e/ou quanto qualquer outra propriedade desejada.

A seqüência de domínio variável de variantes de aminoácidos de qualquer um dos domínios VH e VL cujas seqüências são especificamente aqui divulgadas pode ser utilizada de acordo com a presente invenção, como divulgado.

Um outro aspecto da invenção é uma molécula de anticorpos que compreende um domínio VH que tem pelo menos 60, 70, 80, 85, 90, 95,

98 ou 99 % de igualdade na seqüência de aminoácidos com um domínio VH do anticorpo 1 apresentado nas listagens de seqüências em anexo, e/ou que

compreende um domínio VL que tem pelo menos 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 ou

99 % de igualdade na seqüência de aminoácidos com um domínio VL do anticorpo 1 apresentado nas listagens de seqüências em anexo. Os algoritmos que podem ser usados para calcular a igualdade em % de duas seqüências de

aminoácido incluem por exemplo BLAST [52], FASTA [53], ou algoritmo de Smith-Waterman [54], por exemplo utilizando parâmetros padrão.

As variantes particulares dos domínios VH, domínios VL e/ou CDRs ou conjuntos de CDRs podem inclui uma ou mais alterações das seqüências de aminoácido (adição, exclusão, substituição e/ou inserção de um 20 resíduo de aminoácido). As variantes podem incluir menos do que cerca de 20 alterações, tais como menos do que cerca de 15, menos do que cerca de 10 ou menos do que cerca de 5 alterações, por exemplo 5, 4, 3, 2 ou 1.

As alterações podem ser feitas em uma ou mais regiões de estrutura e/ou um ou mais CDRs. As alterações normalmente não resultam na 25 perda da função, de modo que um membro de ligação que compreende uma seqüência de aminoácidos deste modo alterada pode reter uma capacidade de ligar e/ou neutralizar o CXCLl3. Esta pode reter a mesma ligação quantitativa e/ou capacidade neutralizadora como um membro de ligação em que a alteração não é feita, por exemplo como medido em um ensaio aqui descrito. O membro de ligação que compreende uma seqüência de aminoácidos deste modo alterada pode ter uma capacidade melhorada de ligar e/ou neutralizar o CXCLl 3.

A alteração pode compreender substituir um ou mais resíduos de aminoácido com um aminoácido de ocorrência não natural ou não padrão, modificar um ou mais resíduos de aminoácido em um forma de ocorrência não natural ou não padrão, ou inserir um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural ou não padrão na seqüência. Os exemplos de números e locais de alteração nas seqüências da invenção são aqui descritos em outra parte. Os aminoácidos de ocorrência natural incluem os 20 L-aminoácidos “padrão” identificados como G, A, V, L, I, Μ, P, F5 W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E pelos seus códigos de letra única padrão. Aminoácidos que não padrão incluem qualquer outro resíduo que pode ser incorporado em uma estrutura de polipeptídeos ou que resulta da modificação de um resíduo de aminoácido existente. Os aminoácidos que não padrão podem ser ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Vários aminoácidos de ocorrência natural que não são padrão são conhecidos na técnica, tais como 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metilistidina, N-acetilserina, etc. [55]. Aqueles resíduos de aminoácidos que são derivados na sua posição N-alfa somente estarão localizados na terminação N de uma seqüência de aminoácidos. Normalmente, na presente invenção um aminoácido é um L-aminoácido, mas este pode ser um D- aminoácido. A alteração pode portanto compreender modificar um L- aminoácido em, ou substituí-lo com, um D-aminoácido. As formas metiladas, acetiladas e/ou fosforiladas de aminoácidos também são conhecida, e os aminoácidos na presente invenção podem ser submetidos a tal modificação.

As seqüências de aminoácidos nos domínios de anticorpos e membros de ligação da invenção podem compreender aminoácidos não naturais ou que não são padrão descritos acima. Os aminoácidos que não são padrão (por exemplo D-aminoácidos) podem ser incorporados em uma seqüência de aminoácidos durante a síntese, ou através da modificação ou substituição dos aminoácidos padrão “originais” após a síntese da seqüência de aminoácidos.

O uso de aminoácidos de ocorrência não padrão e/ou não 5 natural aumenta a diversidade estrutural e funcional, e pode deste modo aumentar o potencial para qbter as propriedades de ligação e neutralização de CXCL13 desejadas em um membro de ligação da invenção. Adicionalmente, os D-aminoácidos e análogos foram apresentados ter diferentes perfis farmacocinéticos se comparado com os L-aminoácidos padrão, devido à 10 degradação in vivo dos polipeptídeos tendo L-aminoácidos após a administração a um animal por exemplo um ser humano, significando que os D-aminoácidos são vantajosos para algumas aplicações in vivo.

As regiões VH ou VL novas que carregam as seqüências da derivadas de CDR da invenção podem ser geradas usando a mutagênese 15 aleatória de um ou mais genes de VH e/ou VL selecionados para gerar as mutações dentro do domínio variável inteiro. Uma tal técnica é descrita por Gram et al. [56], que usou PCR propenso ao erro. Em algumas formas de realização uma ou duas substituições de aminoácido são feitas dentro de um domínio variável inteiro ou conjunto de CDRs.

Outro método que pode ser usado é direcionar a mutagênese

para as regiões CDR dos genes VH ou VL. Tais técnicas são divulgadas por Barbas et al. [57] e Schier et al. [58].

Todas as técnicas acima mencionadas são conhecidas como tais na técnica e o técnico habilitado será capaz de usar tais técnicas para fornecer os membros de ligação da invenção usando uma metodologia de rotina da técnica.

Um outro aspecto da invenção fornece um método para obter um local de ligação de antígenos ao anticorpo para CXCL13, o método que compreende fornecer por intermédio da adição, exclusão, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos na seqüência de aminoácidos de um domínio VH aqui apresentado, um domínio VH que é uma seqüência de aminoácidos variante do domínio VH, opcionalmente combinando o domínio VH deste modo fornecido com um ou mais domínios VL, e testando o 5 domínio VH ou combinação ou combinações VtLVL para identificar um membro de ligação ou um local de ligação de antígenos ao anticorpo para CXCL13 e opcionalmente com um ou mais propriedades desejadas, por exemplo a capacidade de neutralizar a atividade de CXCL13. O dito domínio VL pode ter uma seqüência de aminoácidos que é substancialmente como 10 aqui apresentada. Um método análogo pode ser utilizado em que uma ou mais variantes da seqüência de um domínio VL aqui divulgadas são combinadas com um ou mais domínios VH.

Como indicado acima, uma seqüência de aminoácidos CDR substancialmente como aqui apresentada pode ser carregada como um CDR 15 em um domínio variável de anticorpos humanos ou uma porção substancial deste. As seqüências HCDR3 substancialmente como aqui apresentadas representam as formas de realização da presente invenção e cada um desses pode ser carregado como um HCDR3 em um domínio variável de cadeia pesada humano ou uma porção substancial deste.

Os domínios variáveis utilizados na invenção podem ser

obtidos ou derivados de qualquer linhagem germinativa ou domínio variável humano reorganizado, ou pode ser um domínio variável sintético com base no consenso ou seqüências atuais de domínios variáveis humanos conhecidos. Um domínio variável pode ser derivado de um anticorpo não-humano. Uma 25 seqüência CDR da invenção (por exemplo CDR3) pode ser introduzida em um repertório de domínios variáveis deficiente em CDR (por exemplo CDR3), usando tecnologia de DNA recombinante. Por exemplo, Marks et al.

[59] descreve os métodos de produzir repertórios dos domínios de anticorpos variáveis em que os iniciadores em acordo direcionados à ou adjacente à terminação 5’ da área de domínio variável são usados junto com os iniciadores de acordo com a terceira região da estrutura dos genes VH humanos para fornecer um repertório de domínios VH variáveis deficientes em um CDR3. Marks et al. Também descreve com oeste repertório pode ser 5 combinado com um CDR3 de um anticorpo particular. Usando técnicas análogas, as seqüências derivadas de CDR3 da presente invenção podem ser embaralhadas com repertórios de domínios VH ou VL deficientes de um CDR3, e o domínio embaralhado completo de VH ou VL combinado com domínios VL ou VH cognatos para fornecer os membros de ligação da 10 invenção. O repertório pode então ser visualizado em um sistema hospedeiro adequado, tal como o sistema de apresentação de fago da W092/01047, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade, ou qualquer um de um corpo grande subsequente da literatura, incluindo Kay, Winter & McCafferty

[60], de modo que os membros de ligação adequados podem ser selecionados. Um repertório de qualquer um dos IO4 membros individuais ou mais, por

6 7 &

exemplo pelo menos 10 , pelo menos 10 , pelo menos 10 , pelo menos 10 , pelo menos IO9 ou pelo menos IO10 membros ou mais. Outros sistemas de hospedeiro adequados incluem, mas não são limitados a apresentação de levedura, apresentação bacteriana, apresentação de T7, apresentação viral, apresentação celular, apresentação de ribossomos e apresentação covalente.

Um método de preparar um membro de ligação para o antígeno de CXCL13 é fornecido, cujo método compreende:

(a) fornecer um repertório de partida de ácido nucleicos que codifica um domínio VH que inclui um CDR3 a ser substituído ou necessita

de um região que codifica CDR3;

(b) combinar o dito repertório com um ácido nucleico doador que codifica uma seqüência de aminoácidos substancialmente como aqui apresentado para CDR3 de VH tal que o dito ácido nucleico doador é inserido na região de CDR3 no repertório, assim como para fornecer um repertório de produtos de ácidos nucleico que codifica um domínio VH;

(c) expressar os ácidos nucleicos do dito repertório de

produtos;

(d) selecionar um membro de ligação para CXCL13; e

(e) recuperar o dito membro de ligação ou ácido nucleico que

o codifica.

Novamente, um método análogo pode ser utilizado em que um CDR3 do VL da invenção é combinado com um repertório de ácidos nucleicos que codifica um domínio VL que inclui um CDR3 a ser substituído ou necessita de um região que codifica CDR3.

De modo similar, um ou mais, ou todos os três CDRs podem ser enxertados em um repertório de domínios VH ou VL que são depois triados para um membro de ligação ou membros de ligação para CXCLl3.

Por exemplo, um ou mais dos anticorpos I HCDRl, HCDR2 e HCDR3 ou o conjunto de anticorpo I de HCDRs podem ser utilizados, e/ou um ou mais dos anticorpos I LCDRl, LCDR2 e LCDR3 ou o conjunto de anticorpos I de LCDRs podem ser utilizados.

De modo similar, outros domínios VH e VL, conjuntos de CDRs e conjuntos de HCDRs e/ou conjuntos de LCDRs aqui divulgados podem ser utilizados.

Uma porção substancial de um domínio variável de imunoglobinas pode compreender pelo menos as três regiões CDR, junto com suas regiões de estrutura interpostas. A porção também pode incluir pelo menos cerca de 50 % de uma ou ambas da primeira e quarta regiões de 25 estrutura, 50 % sendo C-terminal e 50 % da primeira região da estrutura e o N-terminal de 50 % da quarta região da estrutura. Os resíduos adicionais na terminação N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles não normalmente associados com as regiões de domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, a construção de membros de ligação da presente invenção feitas por técnicas de DNA recombinantes pode resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminais codificados pelos ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação. Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligantes 5 para unir os domínios variáveis da invenção a outras seqüências de proteína incluindo as regiões constantes do anticorpo, outros domínios variáveis (por exemplo na produção de diacorpos) ou rótulos detectáveis/funcionais como debatido acima em maiores detalhes aqui em outro lugar.

Embora em alguns aspectos da invenção, os membros de 10 ligação compreendem um par de domínios VH e VL, os domínios de ligação únicos com base nas seqüências de domínio VH ou VL formam outros aspectos da invenção. É conhecido que os domínios de domínios de imunoglobulina simples, especialmente os domínios VH, são capazes da ligar aos antígenos alvo em uma maneira específica. Por exemplo, ver a discussão 15 das dAbs acima.

No caso dos domínios de ligação únicos, estes domínios podem ser usados para fazer a triagem por domínios complementares capazes de formar um membro de ligação de dois domínios capaz de ligar ao CXCL13. Isto pode ser obtido pela métodos de triagem de apresentação de 20 fago usando o então chamando método combinatório duplo hierárquico como divulgado na W092/01047, aqui incorporada por referência na sua totalidade, em que uma colônia individual contendo um clone da cadeia H ou L é usada para infectar uma biblioteca completa de clones que codifica a outra cadeia (L ou H) e o membro de ligação de duas cadeias resultante é selecionado de 25 acordo com as técnicas de apresentação de fago, tais como aquelas descritas na referência. Esta técnica é também divulgada em Marks et al, ibid.

Os membros de ligação da presente invenção também podem compreender as regiões de anticorpos constantes ou partes destas, por exemplo regiões de anticorpos constantes humanos ou partes destas. Por exemplo, um domínio VL pode ser ligado na sua terminação C-terminal aos domínios de anticorpos constantes de cadeia leve incluindo as cadeias humanas Cx ou Ck. De modo similar, um membro de ligação com base em um domínio VH pode ser ligado na sua terminação C-terminal a toda ou parte 5 (por exemplo um domínio CHI) de uma cadeia de imunoglobulina pesada derivada de qualquer isótipo de anticorpo, por exemplo IgG, IgA, IgE e IgM e qualquer uma das sub-classes de isótopos, particularmente IgGl e IgG4. O IgGl é vantajoso, devido a sua função realizadora e fácil fabricação. Qualquer variante de região constante sintética ou outra que tem estas propriedades e 10 estabiliza as regiões variáveis também pode ser útil na presente invenção.

Os membros de ligação da invenção podem ser rotulados com um rótulo detectável ou funcional. Deste modo, um membro de ligação ou molécula de anticorpos pode estar presente na forma de um imunoconjugado de modo a obter um sinal detectável e/ou quantificável. Um imunoconjugado 15 pode compreender uma molécula de anticorpos da invenção conjugada com um rótulo detectável ou funcional. Um rótulo pode ser qualquer molécula que produz pode ser induzida a produzir um sinal, incluindo mas não limitando a agentes de fluorescência, radiorrótulos, enzimas, agentes de quimiluminescência ou fotossensibilizadores. Deste modo, a ligação pode ser 20 detectada e/ou medida detectando-se a fluorescência ou luminescência, radioatividade, atividade enzimática ou absorvência de luz.

Os rótulos adequados incluem, por via de ilustração e não de

limitação,

- enzimas, tais como alcalino fosfatase, glucose-6-fosfato deidrogenase (“G6PDH”), alfa-D-galactosidase, glucose oxidase, glucose

amilase, carbono anidrase, acetilcolinesterase, lisozima, malato deidrogenase e peroxidase por exemplo peroxidase de rábano silvestre;

- tinturas;

- rótulos fluorescentes ou fluorescedores, tais como fluoresceína e seus derivados, fluorocromo, compostos de rodamina e derivados, GFP (GFP para “Proteína Verde Fluorescente), dansil, umbeliferona, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído, e fluorescamina; fluoroforos tais como cripartos de lantanida e quelatos por exemplo Európio etc (Perkin Elmer e Cis Biointemational),

- rótulos quimioluminescentes ou agentes de quimilumi- nescência, tais como isoluminol, luminol e os dioxetanos;

- rótulos bio-luminescentes, tais como luciferase e luciferina;

- sensibilizadores;

- coenzimas;

- substratos enzimáticos;

- radiorrótulos incluindo mas não limitando a bromo77, carbono 14, cobalto57, flúor8, gálio67, gálio 68, hidrogênio3 (trítio), índiolll, índio 113m, iodol23m, iodol25, iodol26, iodol31, iodol33, mercúriol07,

mercúrio203, fósforo32, rênio99m, rêniolOl, rêniol05, rutênio95, rutênio97, rutêniol03 , rutêniol05, escândio47, selênio75, enxofre35, tecnécio99, tecnécio99m, telúriol21m, telúriol22m, telúriol25m, túlio 165, túlio 167, túlio 168, ítriol99 e outros radiorrótulos aqui mencionados;

- partículas, tais como partículas de látex ou carbono; sal metálico; cristalita; lipossomos; células, etc., que também podem ser rotuladas

com uma tintura, catalisador ou outro grupo detectável;

- moléculas tais como biotina, digoxigenina ou 5- bromodeoxiuridina;

- porções de toxina, tais como por exemplo uma porção de toxina selecionada de um grupo de Pseudomonas exotoxina (PE ou um

fragmento citotóxico ou mutante deste), toxina da difteria ou um fragmento citotóxico ou mutante desta, uma toxina botuliforme A, B, C, D, E ou F, ricina ou um fragmento citotóxico desta por exemplo ricina A, abrina ou um fragmento citotóxico desta, saporina ou um fragmento citotóxico desta, toxina antiviral de caruru-de-cacho ou um fragmento citotóxico desta e briodina 1 ou um fragmento citotóxico desta.

As enzimas e coenzimas adequadas são divulgadas em Litman, et al., US4275149, e Boguslaski, et al., US4318980, cada uma das quais são 5 aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Os fluorescedores e agentes de quimiluminescência adequados são divulgados na Litman, et al., US4275149, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Os rótulos também incluem porções químicas, tais como biotina que pode ser detectada por intermédio do que liga a uma porção cognata detectável 10 específica, por exemplo avidina ou estreptavidina rotulada. Os rótulos detectáveis podem ser ligados aos anticorpos da invenção usando a química convencional conhecida na técnica.

Os imunoconjugados ou seus fragmentos funcionais podem ser preparados através de métodos conhecidos à pessoa habilitada na técnica. 15 Estes podem ser ligados às enzimas ou aos rótulos fluorescentes diretamente ou por intermédio de um grupo espaçador ou de um grupo de ligação, tal como um polialdeído, como glutaraldeído, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido dietileno-triaminopentacético (DPTA), ou na presença dos agentes de ligação, tais como aqueles mencionado acima para os conjugados 20 terapêuticos. Os conjugados contendo os rótulos do tipo fluoresceína podem ser preparados através da reação com um isotiocianato.

Os métodos conhecidos à pessoa habilitada na técnica que existem para ligar os radioisótopos terapêuticos aos anticorpos diretamente ou por intermédio de um agente quelante, tal como EDTA. O DTPA mencionado 25 acima pode ser usado para os radioelementos que podem ser usados em diagnósticos. Também é possível realizar a rotulação com sódio 125 através do método de cloramina T [61] ou ainda com tecnécio99m através da técnica de Crockford et al., (US4424200, aqui incorporada por referência na sua totalidade) ou ligado por intermédio de DTPA como descrito por Hnatowich (US4479930, aqui incorporada por referência na sua totalidade).

Existem vários métodos através dos quais o rótulo pode produzir um sinal detectável por meios externos, por exemplo, através do exame visual, radiação eletromagnética, calor, e reagentes químicos. O rótulo também pode ser ligado a outro membro de ligação que liga ao anticorpo da invenção, ou a um suporte.

O rótulo pode produzir diretamente um sinal, e portanto, os componentes adicionais não são necessários para produzir um sinal. As várias moléculas orgânicas, por exemplo fluorescedores, são capazes de absorver a 10 luz ultravioleta e visível, onde a absorção de luz transfere energia para estas moléculas e eleva-as a um estado excitado de energia. Esta energia absorvida é depois dissipada através da emissão de luz em um segundo comprimento de onda. Esta segunda emissão do comprimento de onda também pode transferir energia a um molécula rotulada com um receptor, e a energia resultante 15 dissipada da molécula receptor através da emissão de luz por exemplo transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET). Outros rótulos que produzem diretamente um sinal incluem os isótopos e tinturas radiativos.

Alternativamente, o rótulo pode precisar de outros 20 componentes para produzir um sinal, e o sistema que produz o sinal então incluiria todos os componentes necessários para produzir um sinal mensurável, que pode incluir substratos, coenzimas, realçadores, enzimas adicionais, substâncias que reagem com produtos enzímicos, catalisadores, ativadores, co-fatores, inibidores, descontaminantes, íons metálicos, e uma 25 substância de ligação específica necessária para a ligação de substâncias que geral sinal. Uma divulgação detalhada dos sistemas que produzem um sinal adequado podem ser encontrados em Ullman, et al. US5185243, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

A presente invenção fornece um método que compreende causar ou permitir a ligação de um membro de ligação como aqui fornecido para CXCLl3. Como notado, tal ligação pode ocorrer in vivo, por exemplo a seguir da administração de um membro de ligação, ou ácido nucleico que codifica um membro de ligação, ou pode ocorrer in vitro, por exemplo em 5 ELISA, Western blotting, imunocitoquímica, imunoprecipitação, cromatografia de afinidade, e ensaios bioquímicos ou de base celular, tais como um cAMP, liberação de cálcio ou ensaio de quimiotaxia da célula B.

A presente invenção também fornece a medição de níveis de antígeno diretamente, utilizando-se um membro de ligação de acordo com a invenção por exemplo em um sistema biossensor. Por exemplo, a presente invenção compreende um método de detecção e/ou medição que liga ao CXCL13, que compreende, (i) expor o dito membro de ligação ao CXCL13 e

(ii) detectar a ligação do dito membro de ligação ao CXCLl3, em que a ligação é detectada usando qualquer método ou rótulo detectável aqui 15 descrito. Isto, e qualquer outro método de detecção de ligação aqui descritos, pode ser diretamente interpretado pela pessoa que realiza o método, por exemplo, observando-se visualmente um rótulo detectável. Alternativamente, este método, ou qualquer método de detecção de ligação aqui descrito, pode produzir um relatório na forma de um autorradiografia, uma fotografia, uma 20 impressão em computador, um relatório de fluxo citométrico, um gráfico, um mapa, um tubo ou recipiente de teste ou contendo o resultado, ou qualquer outra representação visual ou física de um resultado do método.

A quantidade de ligação do membro de ligação para CXCL13 pode ser determinada. A quantificação pode ser relacionada com a quantidade 25 de antígeno na amostra de teste, que pode ser de interesse diagnóstico. A triagem para a ligação de CXCL13 e/ou a quantificação desta pode ser útil, por exemplo, na triagem dos pacientes quanto doenças ou distúrbios aqui indicados e/ou qualquer outra doença ou distúrbio que envolve expressão e/ou atividade de CXCL13 anômala. Várias doenças são associadas com níveis aumentados de CXCL13. Os níveis de CXCL13 são um indicador de diagnóstico e/ou prognóstico útil para vários distúrbios, por exemplo, doenças inflamatórias e/ou autoimunes, como aqui descrito em outra parte. Por exemplo, os níveis 5 elevados de CXCL13 em por exemplo soro ou amostras fluidas sinoviais, podem ser usados como um prognosticador de artrite reumatóide.

Um método de diagnóstico da invenção pode compreender (i) obter uma amostra de tecido ou fluida de um paciente, (ii) expor a dita amostra de tecido ou fluida a um ou mais membros de ligação da presente 10 invenção; e (iii) detectar a ligação de CXCL13 como comparado com uma amostra de controle, em que um aumento na quantidade de CXCL13 ligando como comparado com o controle pode indicar um nível anômalo da expressão ou atividade de CXCLl3. A amostra de tecido ou fluidas a ser testadas incluem sangue, soro, urina, material de biópsia, tumores, ou qualquer tecido 15 suspeito de conter níveis anômalos de CXCL13. Os pacientes de resultado positivo no teste de níveis ou atividade anômalos de CXCL13 também podem se beneficiar dos métodos de tratamento posteriormente aqui divulgados.

Aqueles habilitados na técnica são capazes de escolher um modo adequado de determinar a ligação do membro de ligação a um antígeno de acordo com sua preferência e conhecimento geral, no esclarecimento dos métodos aqui divulgados.

As reatividades dos membros de ligação em uma amostra podem ser determinadas por qualquer método apropriado. O radioimunoensaio (RIA) é uma possibilidade. O antígeno rotulado radioativo 25 é misturado com um antígeno não rotulado (amostra de teste) e deixada ligar ao membro de ligação. O antígeno de ligação é fisicamente separado de um antígeno não ligado e a quantidade da ligação do antígeno radioativo ligado ao membro de ligação determinado. Quanto mais antígeno existir na amostra de teste menos antígeno radioativo ligará ao membro de ligação. Um ensaio de ligação competitiva também pode ser usado com um antígeno não radioativo, usando antígeno ou um análogo ligado a uma molécula repórter. A molécula repórter pode ser uma tintura de fluorocromo, fósforo ou laser com absorção ou características de emissão espectralmente isoladas. Os 5 fluorocromos adequados incluem fluoresceína, rodamina, ficoeritrina e Vermelho Texas, e quelatos ou criptatos de lantanida. As tinturas cromogênicas adequadas incluem diaminobenzidina.

Outros relatórios incluem partículas macromoleculares coloidais ou material particulado, tais como pérolas de látex que são coloridas, magnéticas ou paramagnéticas, e agentes ativos do ponto de visto biológico ou químico que pode causar direta ou indiretamente sinais detectáveis a ser visualmente observados, eletronicamente detectados ou de outro modo registrado. Estas moléculas podem ser enzimas, que catalisam as reações que desenvolvem, ou mudam as cores ou causam mudanças nas propriedades elétricas, por exemplo. Podem ser molecularmente excitáveis, tal que as transições eletrônicas entre os estados de energia resultam em absorções ou emissões espectrais características. Podem incluir as entidades químicas usadas em conjunção com os biossensores. A biotina/avidina ou biotina/estreptavidina e os sistemas de detecção de alcalino fosfatase podem ser utilizado.

Os sinais gerados pelos sinais gerados por conjugados de membro-repórter de ligação individuais podem ser usados podem ser usados para derivar dados quantificáveis absolutos ou relativos da ligação do membro de ligação relevante nas amostras (normal e teste).

Um kit que compreende um membro de ligação de acordo com

qualquer aspecto ou forma de realização da presente invenção também é fornecido como um aspecto da presente invenção. NO: kit, o membro de ligação pode ser rotulado para permitir sua reatividade em uma amostra a ser determinada, por exemplo como descrito mais abaixo. Além disso, o membro de ligação pode ou não pode ser ligado a um suporte sólido. Os componentes de um kit em geral são estéreis e estão em frascos lacrados ou outros recipientes. Os kits podem ser utilizados em uma análise de diagnóstico ou outros métodos para que os membros de ligação sejam úteis. Um kit pode 5 conter instruções para o uso dos componentes em um método, por exemplo um método de acordo com a presente invenção. Os materiais ancilares para auxiliar no ou para permitir a realização de um tal método podem ser incluídos dentro de um kit da invenção, os materiais ancilares incluem um segundo, membro de ligação diferente que liga ao primeiro membro de 10 ligação e é conjugado a um rótulo detectável (por exemplo, um rótulo fluorescente, isótopo radioativo ou enzima). Os kits com base em anticorpos também podem compreender esferas para conduzir uma imunoprecipitação. Cada componente dos kits está geralmente no seu próprio recipiente adequado. Deste modo, estes kits em geral compreendem recipientes distintos 15 adequados para cada membro de ligação. Além disso, os kits podem conter instruções para realizar o ensaio e os métodos para interpretar e analisar os dados resultantes da realização do ensaio.

A presente invenção também fornece o uso de um membro de ligação como acima para medir os níveis de antígeno em um ensaio de 20 competição, isto que dizer um método de medir o nível de antígeno em uma amostra utilizando-se um membro de ligação como fornecido pela presente invenção em um ensaio de competição. Isto pode ser onde a separação física da ligação do antígeno não ligado não é necessária. Ligar uma molécula repórter ao membro de ligação de modo que um mudança física ou ótica 25 ocorre na ligação é uma possibilidade. A molécula repórter pode gerar direta ou indiretamente sinais detectáveis, que pode ser quantificado. A ligação das moléculas repórter pode ser direta, indireta ou covalentemente, por exemplo por intermédio de uma ligação de peptídeos ou não covalentemente. A ligação por intermédio de uma ligação de peptídeos pode ser como um resultado da expressão recombinante de uma fusão do gene que codifica anticorpo e molécula repórter.

Em vários aspectos e formas de realização, a presente invenção se estende a um membro de ligação que compete para ligar ao 5 CXCL13, por exemplo CXCL13 humano, com qualquer membro de ligação aqui definido, por exemplo anticorpo 1, por exemplo no formato IgGl. A competição entre membros de ligação pode ser facilmente ensaiada in vitro, por exemplo etiquetando-se uma molécula repórter específica a um membro de ligação que pode ser detectada na presença de outro(s) membro(s) de 10 ligação(s) não identificado(s), para permitir a identificação dos membros de ligação que ligam ao mesmo epítopo ou a um epítopo sobreposto. A competição pode ser determinada por exemplo usando ELISA em que CXCL13 é imobilizado em uma placa e um primeiro membro de ligação identificado ou rotulado junto com um ou mais outros membros de ligação 15 não identificados ou não rotulados é adicionado à placa. A presença de um membro de ligação não identificado que compete com o membro de ligação identificado é observada por uma diminuição no sinal emitido pelo membro de ligação identificado. Em um exemplo, um ensaio de competição de epítopo HTRF® pode ser usado.

Por exemplo, a presente invenção inclui um método de

identificar um composto que liga ao CXCLl3, que compreende (i) imobilizar o CXCL13 a um suporte, (ii) comunicar os dito CXCL13 simultaneamente imobilizado ou em uma maneira às etapas com pelo menos um membro de ligação identificado ou rotulado de acordo com a invenção e um ou mais 25 compostos de ligação de teste não identificados ou não rotulados, e (iii) identificar um novo composto de ligação de CXCL13 observando-se uma diminuição na quantidade de identificação de ligada a partir do membro de ligação identificado. Tais métodos podem ser realizados de uma maneira de alto rendimento usando um formato de multi-reservatório ou série. Tais ensaios também podem ser realizados em uma solução. Ver, por exemplo, a U.S. 5.814.468, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Como descrito acima, a detecção da ligação pode ser diretamente interpretada pelo técnico realizando o método, por exemplo, observando-se visualmente 5 um rótulo detectável, ou uma diminuição na presença deste. Alternativamente, os métodos de ligação da invenção podem produzir um relatório na forma de um autorradiografia, uma fotografia, uma impressão em computador, um relatório de fluxo citométrico, um gráfico, um mapa, um tubo, recipiente ou reservatório de teste contendo o resultado, ou qualquer outra representação 10 visual ou física de um resultado do método.

Os ensaios de competição também podem ser usados no mapeamento do epítopo. Em um exemplo, o epítopo pode ser usado para identificar a ligação do epítopo para um membro de ligação de CXCL13 que opcionalmente pode ter características de neutralização e/ou modulação 15 otimizadas. Um tal epítopo pode ser linear ou estrutural. Um epítopo estrutural pode compreender pelo menos dos fragmentos diferentes de CXCLl3, em que os ditos fragmentos são posicionados em proximidade a cada outro quando CXCL13 é dobrado na sua estrutura temária ou quaternária para formar um epítopo estrutural que é reconhecido por um inibidor de 20 CXCL13, tal como um membro de ligação de CXCLl3. NO: teste quanto a competição, um fragmento de peptídeo do antígeno pode ser utilizado, especialmente um peptídeo que inclui ou consiste essencialmente de um epítopo de interesse. Um peptídeo tendo a seqüência de epítopo mais um ou mais aminoácidos em cada terminação podem ser usados. Os membros de 25 ligação de acordo com a presente invenção podem ser tal que sua ligação ao antígeno é inibida por um peptídeo com ou incluindo a seqüência dada.

A presente invenção também fornece um ácido nucleico isolado que codifica um membro de ligação da presente invenção. O ácido nucleico pode incluir DNA e/ou RNA. Em um aspecto, a presente invenção fomece um ácido nucleico que codifica para um CDR ou conjunto de CDRs ou domínio VH ou domínio VL ou local de ligação de antígenos ao anticorpo ou molécula de anticorpos, por exemplo scFv ou IgGl, da invenção como definido acima.

A presente invenção também fomece construções na forma de

plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo como acima.

A presente invenção também fomece uma célula hospedeira recombinante que compreende um ou mais construções como acima. Um ácido nucleico que codifica qualquer CDR ou conjunto de CDRs ou domínio VH ou domínio VL ou local de ligação de antígenos ou anticorpo ou molécula de anticorpos, por exemplo scFv ou IgGl, como fornecido, por si forma um aspecto da presente invenção, como faz um método de produção do produto codificado, cujo método compreende a expressão a partir do qual codifica o ácido nucleico consequentemente. A expressão pode ser convenientemente obtida cultivando-se sob condições apropriadas as células contendo hospedeiras recombinantes do ácido nucleico. Em seguida, a produção através da expressão de um domínio VH ou VL, ou membro de ligação pode ser isolado e/ou purificado usando qualquer técnica adequada, então usada como apropriada.

O ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode compreender DNA ou RNA e pode ser completa ou parcialmente sintético. A referência a uma seqüência de nucleotídeos como aqui apresentado abrange uma molécula de DNA com a seqüência especificada, e abrange uma 25 molécula de RNA com a seqüência especificada em que T é substituído por U, a menos que o contexto diga de outra forma.

Um outro aspecto fomece ainda um método de produção de um domínio de anticorpo VH variável, o método incluindo causar a expressão a partir da qual codifica o ácido nucleico. Tal método pode compreender cultivos de células hospedeiras sob condições para a produção do dito domínio de anticorpo VH variável.

Os métodos análogos para a produção dos domínios variáveis VL e membros de ligação que compreendem um domínio VL e/ou VH são fornecidos como outros aspectos da presente invenção.

Um método de produção pode compreender uma etapa de isolamento e/ou purificação do produto. Um método de produção pode compreender formular o produto em uma composição incluindo pelo menos um componente adicional, tal como um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Os sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo em uma variedade de diferentes células hospedeiras são bem conhecidos. As células hospedeiras adequadas incluem bactéria, células mamíferas, células de plantas, fungos filamentosos, levedura e sistemas de baculovírus e plantas e 15 animais transgênicos. A expressão dos anticorpos e fragmentos de anticorpos nas células procarióticas é bem estabelecida na técnica. Para uma revisão, ver por exemplo Plückthun [62]. Um hospedeiro bacteriano comum é E. coli.

Expressão nas células eucarióticas na cultura também é disponível àqueles habilitados na técnica como uma opção para a produção de 20 um membro de ligação [63, 64, 65]. As linhas celulares mamíferas disponíveis na técnica para a expressão de um polipeptídeo heterólogo inclui as células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), células de HeLa, células do rim de um hamster bebê, células de melanoma de camundongos NSO, células de mieloma de rato YB2/0, células embrionárias renais humanas, retina 25 embriônica humana e muitas outras.

Os vetores adequados podem ser escolhidos ou produzidos, contendo seqüências reguladoras apropriadas, incluindo seqüências promotoras, seqüências terminadoras, seqüências de poliadenilação, seqüências aumentadoras, genes marcadores e outras seqüências como apropriado. Os vetores podem ser plasmídeos por exemplo fagomídeo, ou viral por exemplo fago, como apropriado [66]. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação do ácido nucleico, por exemplo na preparação das construções de ácido nucleico, mutagênese, sequenciamento, a introdução 5 do DNA nas células e expressão de gene, e análise de proteínas, são descritas em detalhes em Ausubel et al. [67].

Um outro aspecto da presente invenção fomece uma célula hospedeira contendo ácido nucleico como aqui divulgado. Uma tal célula hospedeira pode ser in vitro e pode estar em cultivo. Uma tal célula 10 hospedeira pode ser in vivo. A presença in vivo da célula hospedeira pode permitir a expressão intracelular dos membros de ligação da presente invenção como “intracorpos” ou anticorpos intra-celulares. Os intracorpos podem ser usados para a terapia de gene.

Outro aspecto fomece ainda um método que compreende introduzir um ácido nucleico da invenção em uma célula hospedeira. A introdução pode utilizar qualquer técnica disponível. Para as células eucarióticas, as técnicas adequadas podem incluir a transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-Dextran, eletroporação, transfecção e transdução mediadas por lipossomo usando um retrovírus ou outro vírus, por exemplo vacina ou, para células de insetos, baculovírus. A introdução do ácido nucleico na célula hospedeira, em particular em uma célula eucariótica pode usar um sistema com base viral ou plasmídea. O sistema plasmídeo pode ser mantido epissomicamente ou pode ser incorporado na célula hospedeira ou em um cromossomo artificial. A incorporação pode ser ou através da integração aleatória ou alvejada de uma ou mais cópias em locais únicos ou múltiplos. Para as células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir transformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção usando um bacteriófago.

A introdução pode ser seguida causando-se ou deixando-se a expressão do ácido nucleico, por exemplo pelo cultivo das células hospedeiras sob condições para a expressão do gene. A purificação do produto expressado pode ser obtida através de métodos conhecidos àquele habilitado na técnica.

O ácido nucleico da invenção pode ser integrado no genoma (por exemplo cromossomo) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão das seqüências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com as técnicas padrão.

A presente invenção também fomece um método que compreende usar uma construção como determinado acima em um sistema de expressão de modo a expressar um membro de ligação ou polipeptídeo como acima.

Os membros de ligação da presente invenção podem ser usados nos métodos de diagnose ou tratamento em pacientes humanos ou animais, por exemplo seres humanos. Os membros de ligação para CXCL13 15 podem ser usados para tratar os distúrbios associados com CXCL13, por exemplo associado com a expressão e/ou atividade de CXCL13 anômalas. Há indícios quanto o envolvimento de CXCL13 em uma variedade de distúrbios, como aqui debatido em seguida. Os membros de ligação da invenção podem ser usados para inibir a ligação de CXCL13 a CXCR5 e por meio disso tratar 20 uma doença ou distúrbio mediado por CXCL13 que liga ao CXCR5. Os distúrbios associados com CXCL13 incluem os distúrbios que são causados e/ou exacerbados por CXCL13 que liga ao seu CXCR5 receptor. Os aspectos da invenção dizem respeito ao tratamento de tais distúrbios aliviando-se ou melhorando-se um ou mais sintomas e/ou causas do distúrbio.

Os membros de ligação para CXCL13 podem ser usados para

inibir ou reduzir a formação e/ou desenvolvimento anômalos dos folículos linfóides, por exemplo folículos linfóides ectópicos, tais como aqueles encontrados na sinóvia artrítica. Os membros de ligação podem inibir ou reduzir: o recrutamento mediados pela sinalização mediada por CXCL13- CXCR5 das células B e/ou células dendríticas e/ou células T auxiliares das B foliculares, aos folículos; e/ou reduz a produção de imunoglobulina pelas células foliculares B; e/ou inibe ou reduz a produção da célula B folicular de citocinas e/ou ativação das células T. Os membros de ligação também podem 5 ser usados para inibir ou reduzir a destruição dos ossos e/ou cartilagem anômalos.

Os membros de ligação deste modo podem ser usados para o tratamento de doenças ou distúrbios associados com ou folículos linfóides ectópicos anômalos. Os distúrbios associados com folículos linfóides 10 ectópicos incluem artrite reumatóide, síndrome de Sjogrens, esclerose múltipla, miastenia grave, eritematose de Iupo sistêmico (SLE), doenças autoimunes da tireóide (por exemplo doença de Grave, tireoidite de Hashimoto), infecção crônica por exemplo Neuroborreliose de Lyme e rejeição cardíaca aguda que caracteriza o efeito de Quilty.

Por exemplo, sinóvia artrítica inflamada é em geral

caracterizada por: folículos linfóides ectópicos contendo centros germinais; célula inflamatória infiltrada; produção da célula B de auto-anticorpos e citocinas; ativação da célula B das células T; e/ou destruição dos ossos ou cartilagem. Os membros de ligação podem romper a formação dos folículos 20 ectópicos como aqui descrito e deste modo inibir a produção de autoanticorpo da célula B e/ou inflamação sinovial. Deste modo, os membros de ligação podem ser usados no tratamento de distúrbios artríticos tais como artrite reumatóide (RA), e/ou osteoartrite.

Os membros de ligação da invenção podem ser usados para o 25 tratamento de doenças ou distúrbios ósseos e/ou nas juntas, especialmente doenças ou distúrbios associados com a destruição e/ou remodelação óssea e/ou da cartilagem, por exemplo rotação anômala do osso ou cartilagem. Por exemplo, os membros de ligação podem ser usados para tratar artrite reumatóide e/ou osteoartrite. Os membros de ligação da invenção podem ser usados para inibir a quimiotaxia dos linfócitos (por exemplo célula B e/ou T), e podem deste modo ser usados para tratar distúrbios associados com quimiotaxia de linfócitos tais como infecção viral (por exemplo infecção por HIV) e leucemia 5 (por exemplo leucemia linfocítica aguda da linhagem das células T e leucemia linfocítica crônica e aguda da linhagem da células B).

Os membros de ligação da invenção podem ser usados para inibir a proliferação de linfomas e deste modo podem ser usados para tratar os distúrbios associados com proliferação de linfomas, tais como leucemia (por exemplo leucemia linfocítica aguda da linhagem das células T e leucemia linfocítica crônica e aguda da linhagem da células B).

Os membros de ligação para CXCL13 podem ser usados para inibir a formação e/ou desenvolvimento anômalos dos folículos linfóides, por exemplo folículos linfóides ectópicos, inibir a destruição e/ou remodelagem 15 dos ossos e/ou cartilagem anômalos, e/ou inibir a quimiotaxia dos linfócitos e/ou a proliferação dos linfomas como aqui descrito. Portanto, a invenção fomece um método de inibir a formação e/ou desenvolvimento anômalos dos folículos linfóides, por exemplo folículos linfóides ectópicos, inibir a destruição e/ou remodelação dos ossos e/ou cartilagem anômalos, e/ou inibir a 20 quimiotaxia dos linfócitos e/ou proliferação de linfomas, que compreende administrar a um paciente em necessidade disto uma quantidade eficaz de um ou mais membros de ligação da presente invenção sozinhos ou em um regime terapêutico combinado com outro medicamento apropriado conhecido na técnica ou aqui descrito tal que a formação e/ou desenvolvimento anômalos 25 de folículos linfóides, por exemplo folículos linfóides ectópicos, a destruição e/ou remodelação dos ossos e/ou cartilagem anômalos, e/ou a quimiotaxia dos linfócitos e/ou proliferação de linfomas é ou são inibidos.

Os membros de ligação da invenção podem ser usados no diagnósticos de doenças ou distúrbios associados com CXCL13 por exemplo em que os níveis deCXCL13 são alterados por exemplo relevantemente elevados aos níveis normais. Os membros de ligação podem ser usados no diagnóstico de uma ou mais doenças ou distúrbios aqui descritos, incluindo por exemplo artrite reumatóide, síndrome de Sjogren, HIV, miastenia grave, 5 linfoma angioimunoblástico da célula T e encefalopatia espongiforme transmissível (TSE).

A evidência quanto ao envolvimento de CXCL13 em certos distúrbios é descrita abaixo e aqui em outro lugar. Além disso, os dados aqui apresentados também indicam que os membros de ligação da invenção podem 10 ser usados para tratar tais distúrbios, incluindo o tratamento preventivo e redução da gravidade dos distúrbios. Portanto, a invenção fomece um método para tratar ou reduzir a gravidade de pelo menos um sintoma de qualquer um dos distúrbios aqui mencionados, que compreende administrar a um paciente em necessidade disto uma quantidade eficaz de um ou mais membros de 15 ligação da presente invenção sozinho ou em um regime terapêutico combinado com outro medicamento apropriado conhecido na técnica ou aqui descrito tal que a gravidade de pelo menos um sintoma de qualquer um dos distúrbios acima é reduzida.

A evidência quanto ao papel do CXCL13 no desenvolvimento de órgãos linfóides periféricos e na imunidade ingênita é descrita em partes aqui em outro lugar.

Além disso, vária linhas de evidência indicam um papel para CXCL13 na patogênese da artrite reumatóide (RA) no ser humano. Por exemplo, a expressão do mRNA CXCL13 e proteína é elevada na sinóvia de 25 RA [68], existe uma correlação positiva entre os níveis de proteína CXCL13 na sinóvia de RA e gravidade da doença [69]. Nós também descobrimos que os níveis elevados de CXCL13 foram medidos no soro e fluido sinovial dos pacientes com RA, indicando que os membros de ligação da invenção podem ser usados nos métodos de diagnosticar a RA como aqui descrito. A sinóvia inflamada é caracterizada por um célula inflamatória infiltrada e a presença de agregados de linfócitos organizados que se assemelha ao tecido linfóide. Estas estruturas linfóides ectópicas contêm características de centros germinais incluindo a presença de FDCs, e altas 5 vênulas endoteliais (HEVs). Os centros germinais fornecem um microambiente que suporta o diferenciamento da célula B nas células plasmáticas e a geração de anticorpos de alta afinidade tais como o fator reumatóide [70]. A proteína CXCL13 na sinóvia de RA foi imunolocalizada para FDCs dentro dos centros germinais [69] e macrófagos no infiltrado 10 celular [71]. Nas lesões de RA, o CXCL13 é fortemente prognosticável quanto a formação de folículos linfóides ectópicos e o desenvolvimento das reações do centro germinal (Takemura, S. et al. J. Imunol. 167: 1072-1080, 2001).

O papel do CXCL13 na RA também é sustentado pelas 15 evidências in vivo dos modelos animais da doença. A dosagem profilática de um anticorpo que neutraliza CXCL13 reduz a gravidade da doença na artrite induzida por colágeno (CIA) no camundongo, com uma redução concomitante da infiltração da célula inflamatória na junta artrítica e uma redução no grau da erosão cartilaginosa e óssea [72]. NO: modelo da CIA, os 20 folículos tanto no baço quanto nas juntas dos camundongos tratados com um anticorpo anti-CXCL13 contêm menos centros germinais e os centros germinais são menores em tamanho se comparado com os camundongos de controle [72].

Outros estudos apresentaram que os camundongos deficientes 25 em CXCR5 desenvolvem menos sintomas graves em um modelo de artrite induzida por adjuvantes (AIA) com uma redução na inflamação sinovial e destruição das juntas (Hartmann, S. et al, European Congress on Imunology, resumo 2672, 2006). A formação de centros germinais organizados, os níveis de anticorpos anti-antígeno e as respostas proliferativas da célula T induzidas pelo antígeno também foram reduzidos neste estudo.

Um papel para o CXCL13 na rotação óssea e cartilagenosa também foi demonstrado pelas evidências in vitro dos condrócitos e osteoblastos cultivados. O CXCR5 é expressado nos condrócitos isolados da cartilagem articular dos pacientes com osteoartrite (OA). O tratamento destes condrócitos nas condições de cultura com CXCL13 induz a liberação da matriz de metaloproteinases (MMPs) e catepsina B bem como induz a proliferação [73]. O CXCL13 também induz a proliferação dos osteoblastos cultivados derivados de pacientes com OA e a expressão do mRNA da interleucina-1 (IL-I) [74]. A secreção basal de CXCL13 a partir dos osteoblastos cultivados também pode ser aumentada através do tratamento com IL-I [75]. Nas amostras ósseas retiradas dos pacientes com RA que passaram por cirurgia nas juntas, a proteína do CXCL13 é imunolocalizada nos agregados de células mononucleares na medula óssea contendo características de neogênese linfóide [76].

O receptor de CXCR5 é expressado em um subconjunto de células T da memória com função de auxílio à célula B , as quais são indicadas como células T que auxiliam as células B foliculares (Tfh)· O CXCL13 induz a quimiotaxia das células Tfh que expressam o CXCR5 20 isolado da amígdala humana [77], enquanto nos órgãos linfóides secundários, as células Tfh de CXCR5 positivo se localizam nos folículos e centros germinais das células B onde auxiliam a produção de imunoglobulina [78]. As células TFH recentemente isoladas dos centros germinais secretam baixos níveis de CXCL13 mas este é significantemente elevado após o estímulo 25 através de TCR e CD28 (Kim, CH. et al. Blood, 104: 1952-1960, 2004).

Um subconjunto de células dendríticas identificou que expressa CXCR5 e que localiza os folículos linfóides em resposta a CXCL13 [79]. Esta resposta é dependente das linfotoxinas ligadas à membrana derivadas da célula B que estimulam a expressão de CXCL13 através da células estromais foliculares e estabelecem o gradiente quimiotático necessário para recrutar as células CXCR5 positivas nos folículos.

Embora a inibição do movimento da célula B não tem precedentes na prática clínica, existe um precedente clínico quanto a B terapia 5 de diminuição celular em pacientes com RA [80]. A diminuição da célula B com um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico é eficaz e bem tolerada com pacientes que experimentam períodos sustentados da redução da doença variando de meses a anos seguindo um curso único de tratamento. A redução dos níveis de autoanticorpo é um mecanismo chave do sucesso da diminuição 10 da célula B ao passo que a recidiva clínica tenha relação com o retomo dos autoanticorpos do soro aos níveis de pré-tratamento [81]. Além da produção de autoanticorpo, as células B são pensadas contribuir para a progressão da RA através da produção de citocina e a ativação das T células através da apresentação do antígeno.

A inibição do movimento da célula B pela neutralização de

CXCL13 representa um novo método para o tratamento de RA. A neutralização de CXCL13 tem o potencial tanto de inibir a produção de autoanticorpos e quanto a inflamação sinovial através do rompimento dos folículos ectópicos e reações de centro germinal na sinóvia RA. A 20 neutralização de CXCL13 também pode fornecer um benefício adicional prevenindo-se a destruição dos ossos ou cartilagem através de mecanismos diretos e indiretos.

Os níveis elevados de CXCL13 foram descritos em HIV (Widney, DP. et al. J. Int. Cyt. Res: 25: 702-706, 2005). O uso de CXCL13 como marcador substituto para a encefalopatia espongiforme transmissível (TSE) também foi divulgado (EP1703282A1).

Um membro de ligação da invenção pode ser usado no tratamento de qualquer um dos seguintes:

1. trato respiratório: doenças obstrutivas das vias aéreas incluindo: asma, incluindo asma brônquica, alérgica, intrínseca, extrínseca, induzida por exercícios, induzida por medicamentos (incluindo aspirina e induzida por NS AID) e asma induzida por pós, tanto intermitente e persistente e de todas as gravidades, e outras causas de hiper-sensibilidade das vias 5 aéreas; doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD); bronquite, incluindo bronquite infecciosa e eosinofílica; enfizema; bronquiectase; fibrose cística; sarcoidose; doenças pulmão de fazendeiro e relacionados; pneumonite com hipersensibilidade; fibrose pulmonar, incluindo alveolite de fibrose criptogênica, pneumonias intersticial idiopática, terapia anti-neoplástica que 10 complica a fibrose e infecção crônica, incluindo tuberculose e aspergilose e outras infeções füngicas; complicações de transplante de pulmão; distúrbios vasculíticos e trombóticos da vasculatura pulmonar, e hipertensão pulmonar; atividade anti-tosse incluindo tratamento da tosse crônica associada com condições inflamatórias e de secreção das vias aéreas, e tosse iatrogênica; 15 rinite aguda e crônica incluindo rinite medicamentosa, e rinite vasomotora; rinite alérgica perene e sazonal incluindo rinite nervosa (febre do feno); polipose nasal ; infecção viral aguda incluindo o frio comum, e infecção devido ao vírus sincicial respiratório, influenza, coronavírus (incluindo SARS) e adenovírus;

2. ossos e juntas: artrites associadas com ou incluindo

osteoartrite/osteoartrose, tanto primária quanto secundária, por exemplo, displasia de quadril congênita; espondilite cervical e lombar, e dores de pescoço e região lombar; artrite reumatóide e doença de Still; espondiloartropatias soro-negativa incluindo espondilite de anquilose, artíte 25 psoriática, artrite reativa e espondartropatia não-diferenciada; artrite séptica e outras artopatias relacionadas com infecção e distúrbios ósseos tais como tuberculose, incluindo doença de Pott e síndrome de Poncet; sinovite induzida por cristal aguda e crônica incluindo gota de urato, doença da deposição de pirofosfato de cálcio, e inflamação do tendão, bursal e sinovial relacionada com a apatia cálcica; doença de Behcet; síndrome de Sjogren primária e secundária; esclerose sistêmica e escleroderma limitado; lupus eritematoso sistêmico, doenças mistas do tecido conjuntivo, e doenças do tecido tecido conectivo não-diferenciadas; miopatias inflamatórias incluindo 5 dermatomiosite e polimiosite; polimalgia reumática; artrite juvenil incluindo artrites idiopáticas inflamatórias de qualquer distribuição das juntas e síndromes associadas, e febre reumática e suas complicações sistêmicas; vasculites incluindo arterite da célula gigante, arterite de Takayasu, síndrome de Churg-Strauss5 poliarterite nodosa, poliarterite microscópica, e vasculites 10 associadas com infecção viral, reações de hipersensibilidade, crioglobulinas, e paraproteínas; dor da região lombar; febre familiar do mediterrâneo, síndrome de Muckle-Wells, e febre familiar hibernai, doença de Kikuchi; induzida por artalgias induzidas por medicamentos, tendinites, e miopatias;

3. dor e remodelação do tecido conectivo dos distúrbios musculoesqueletais devido a ferimento [por exemplo ferimento por esportes]

ou doença: artrite (por exemplo artrite reumatóide, osteoartrite, gota ou artropatia de cristal), outra doença de junta (tal como degeneração do disco intervertebral ou degeneração da junta temporomandibular), doença de remodelação óssea (tal como osteoporose, doença de Paget ou osteonecrose), 20 policondritite, escleroderma, distúrbios mistos do tecido conectivo, espondiloartropatias ou doença periodontal (tal como periodontite);

4. pele: psoríase, dermatite atópica, dermatite de contato ou outra dermatose eczematosa, e reações de hipersensibilidade do tipo atrasada; fito- e fotodermatite; dermatite seborréica, dermatite herpetiforme, líquen

plano, líquen escleroso e atrófico, pioderma gangrenoso, sarcóide de pele, lupus eritematoso discóide, pênfigo, penfigóide, epidermólise bolhosa, urticária, angioedema, vasculite, eritemas tóxicos, eosinofilia cutânea, alopecia em áreas, calvície do padrão masculino, síndrome de Sweet, síndrome de Weber-Christian, ertema multiforme; celulite, tanto infecciosa quanto não-infecciosa; paniculite; linfomas cutâneos, câncer de pele que não de melanomas e outras lesões displásticas; induzidas por distúrbios induzidos por medicamentos incluindo erupções fixas de medicamentos;

5. olhos: blefarite; conjuntivite, incluindo conjuntivite perene e alérgica vemal; irite; uveíte anterior e posterior; coroidite; autoimune;

distúrbios degenerativos ou inflamatórias que afetam a retina; oftalmite incluindo oftalmite do sistema nervoso simpático; sarcoidose; infecções incluindo virais, füngicas, e bacterianas;

6. trato gastrointestinal: glossite, gingivite, periodontite;

oesofagite, incluindo refluxo; gastro-enterite eosinofílica, mastocitose, doença

de Crohn, colite incluindo colite ulcerativa, proctite, prurite; doença celíaca, síndrome do intestino irritável, e alergias relacionadas com alimentação que podem ter efeitos leves nos intestinos (por exemplo enxaqueca, rinite ou eczema);

7. abdominal: hepatite, incluindo autoimune, alcóolica e viral;

fibrose e cirrose hepática; colecistite; pancreatite, tanto aguda quanto crônica;

8. genitourinário: nefrite incluindo intersticial e glomerulonefrite; síndrome nefrótica; cistite incluindo cistite aguda e crônica (intersticial) e úlcera de Hunner; uretrite aguda e crônica, prostatite,

epididimite, ooforite e salpingite; vulvo-vaginite; doença de Peyronie; disfunção erétil (tanto masculina quanto feminina);

9. rejeição de aloenxerto: aguda e crônica a seguir de, por exemplo, transplante de rim, coração, fígado, pulmão, medula óssea, pele ou córnea ou a seguir de transfusão de sangue; ou enxerto crônico versus a

doença do paciente;

10. SNC: doença de Alzheimer e outros distúrbios de dementação incluindo CJD e nvCJD; amloidose; esclerose múltipla e outras síndromes de desmielinação; aterosclerose cerebral e vasculite; arterite temporal; miastenia grave; dor aguda e crônica (aguda, intermitente ou persistente, seja de origem central ou periférica) incluindo dor nas vísceras, dor de cabeça, enxaqueca, neuralgia trigeminal, dor facial atípica, dor nas juntas e ossos, dor que se origina a partir da invasão cancerosa e tumoral, síndromes de dores neuropáticas incluindo neuropatias diabéticas, pés- 5 herpéticas, e associadas com HIV; neurosarcoidose; complicações do sistema nervoso central e periférico processos de malignos, infecciosos ou autoimunes;

11. outros distúrbios alérgicos e auto-imunes incluindo tireoidite de Hashimoto, doença de Graves, doença de Addison, diabetes

melitus, púrpura trombocitopênica idiopática, fasciite eosinofílica, síndrome de hiper-IgE, síndrome antifosfolipídea;

12. outros distúrbios com um componente inflamatório ou imunológico; incluindo síndrome da imuno deficiência adquirida (AIDS), mal de Hansen, síndrome de Sezary, e síndromes paraneoplásticas;

13. cardiovascular: aterosclerose, que afeta a circulação

coronária e periférica; pericardite; miocardite, cardiomiopatias inflamatórias e auto-imunes incluindo sarcóide do miocárdio; danos de reperfusão isquêmica; endocardite, valvulite, e aortite incluindo a infectiva (por exemplo sifilítica); vasculite; distúrbios das veias próximas e periféricas incluindo flebite e

trombose, incluindo trombose de veia profunda e complicações das veias varicosas;

14. oncológico: tratamento de cânceres comuns incluindo tumores de próstata, mama, pulmão, ovariano, pancreático, intestino e cólon, estômago, pele e cerebrais e malignidades que afetam a medula óssea

(incluindo as leucemias) e sistemas linfoproliferativo, tal como linfoma de Hodgkin e que não de Hodgkin; incluindo a prevenção e tratamento de doença metaestáticas e recorrências de tumor, síndromes paraneoplásticas; e,

15. trato gastrointestinal: doença de celíaca, proctite, gastro- enterite eosinofílica, mastocitose, doença de Crohn, colite ulcerativa, colite microscópica, colite indeterminada, distúrbio do intestino irritável, síndrome do intestino irritável, diarréia não inflamatória, alergias relacionadas com alimentação que têm efeitos remotos a partir dos intestinos, por exemplo, enxaqueca, rinite e eczema.

Os membros de ligação da invenção podem ser usados em

animais ou em modelos animais da doença, incluindo camundongos, ratos, coelhos, porquinho-da-índia, macacos, peixes, cães, vacas, cabras, cavalos, etc. Os modelos animais que envolvem o sistema sinalizador de CXCL13/CXCR5 são conhecidos na técnica. Por exemplo, os modelos 10 animais de artrite reumatóide são conhecidos, por exemplo, modelos de parede celular CIA, AIA e estreptocócitos (SCW). Um modelo animal de MS é o modelo de camundongo de encefalomielite autoimune experimental (EAE). Os modelos de camundongos de SLE incluem o modelo de camundongo MRL/lpr e o modelo de camundongo NZB x NZW Fi (BWFj).

Deste modo, os membros de ligação da presente invenção são

úteis como agentes terapêuticos no tratamento de doenças ou distúrbios que envolvem CXCL13, por exemplo a expressão e/ou atividade CXCL13, especialmente expressão/atividade anômalas. Um método de tratamento pode compreender administrar uma quantidade eficaz de um membro de ligação da 20 invenção a um paciente em necessidade disto, em que a expressão e/ou atividade anômala de CXCL13 é diminuída. Um método de tratamento pode compreender (i) identificar um paciente que demonstra níveis ou atividade de CXCL13 anômalos, por exemplo usando os métodos de diagnóstico descritos acima, e (ii) administrar uma quantidade eficaz de um membro de ligação da 25 invenção ao paciente, em que a expressão e/ou atividade anômala de CXCL13 é diminuída. Uma quantidade eficaz de acordo com a invenção é uma quantidade que diminui a expressão e/ou atividade anômala de CXCL13 de modo a diminuir ou reduzir a gravidade de pelo menos um sintoma da doença ou distúrbio particulares sendo tratados, mas não necessariamente curar a doença ou distúrbio.

A invenção também fomece um método de antagonizar pelo menos um efeito de CXCL13 que compreende comunicar com ou administrar uma quantidade eficaz de um ou mais membros de ligação da presente 5 invenção tal que o dito pelo menos um efeito de CXCL13 é antagonizado. Os efeitos de CXCL13 que podem ser antagonizados pelos métodos da invenção incluem ligar ao CXCR5, e quaisquer efeitos a jusante que surgem como uma conseqüência destas reações de ligação. Deste modo, os membros de ligação da presente invenção são úteis como agentes terapêuticos no tratamento de 10 doenças ou distúrbios que envolvem sinalização de CXCL13-CXCR5, especialmente sinalização de CXCL13-CXCR5 anômala.

Portanto, outros aspectos da invenção fornecem métodos de tratamento que compreende a administração de um membro de ligação como fornecido, as composições farmacêuticas que compreendem um tal membro 15 de ligação, e uso de um tal membro de ligação na fabricação de um medicamento para a administração, por exemplo em um método de fazer um medicamento ou composição farmacêutica que compreende formular o membro de ligação com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Um excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um 20 composto ou uma combinação de compostos que entram em uma composição farmacêutica que não provoca reações secundárias e que permite, por exemplo, facilitação da administração do(s) composto(s), ativo(s) um aumento no seu período de vida e/ou na sua eficácia no corpo, um aumento da sua solubilidade na solução ou ainda uma melhora na sua conservação. Estes 25 veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos e serão adaptados por uma pessoa habilitada na técnica como uma função da natureza e do modo de administração do(s) composto(s) ativo(s) escolhidos.

Os membros de ligação da presente invenção serão usualmente administrados na forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente além do membro de ligação. Deste modo as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para o uso de acordo com a presente invenção, podem compreender, além do ingrediente ativo, um excipiente, carregador, tampão, estabilizador ou outros 5 materiais farmaceuticamente aceitáveis, bem conhecidos àqueles habilitados na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do carregador ou outro material dependerá da via de administração, que pode ser oral, inalada, intra- traqueal, tópica, intra-vesicular ou através da injeção, como divulgado abaixo. 10 As composições farmacêuticas para a administração oral, tal

como por exemplo as moléculas de anticorpos de domínio único (por exemplo “nanobodies®”) etc também são considerados na presente invenção. Tais formulações orais podem estar na forma de tablete, cápsula, pó, líquido ou semi-sólida. Um tablete pode compreender um carregador sólido, tal como 15 gelatina ou um adjuvante. As composições farmacêuticas líquidas em geral compreendem um carregador líquido, tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. A solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeos ou glicóis, tais como etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol podem ser incluídas.

Para a injeção intra-venosa, ou injeção no local da aflição, o

ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é isenta de pirogênio e tem um pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Aqueles de habilidade relevante na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotônicos, tais 25 como Injeção de Cloreto de Sódio, injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactada. Conservadores, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser utilizados como necessário incluindo tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico e metionina; conservadores (tais como cloreto de octaciecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3’-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular;

proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como poliviniPpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparaginas, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agente quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como 10 sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo complexos protéicos de Zn); e/ou tensoativos não-iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS^® ou polietileno glicol (PEG).

Os membros de ligação da presente invenção podem ser 15 formulados nas formas líquidas, semi-sólidas ou sólidas dependendo das propriedades físico-químicas da molécula e a via de liberação. As formulações podem incluir os excipientes, ou combinações de excipientes, por exemplo: açúcares, aminoácidos e tensoativos. As formulações líquidas podem incluir uma ampla faixa de concentrações de anticorpo e pH. As 20 formulações sólidas podem ser produzidas através da liofilização, secagem por pulverização, ou secagem por tecnologia de fluido supercrítica, por exemplo. As formulações de anti-CXCL13 dependerão da via de liberação intencionada: por exemplo, formulações para a liberação pulmonar podem consistir de partículas com propriedades físicas que asseguram a penetração 25 na inalação profunda ao pulmão; as formulações tópica (por exemplo para o tratamento de cicatrizes, por exemplo cicatrizes dérmicas) podem incluir agentes modificadores de viscosidade, que prolongam o tempo que o medicamento é residente no local de ação. Um membro de ligação pode ser preparado com um carregador que protegerá o membro de ligação contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulados. Os polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser usados, tais como acetato de vinil etileno, polianidretos, ácido poliglicólico,

colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático. Quaisquer métodos para a preparação de tais formulações são conhecidos por aqueles habilitados na técnica [82].

O tratamento anti-CXCL13 pode ser oralmente fornecido (tal como, por exemplo, moléculas de anticorpos de domínio único (por exemplo 10 “nanobodies® )) através da injeção (por exemplo, subcutânea, intra-articular, intravenosa, intra-peritoneal, intra-arterial ou intra-muscular), através da inalação, intra-traqueal, pela via intra-vesicular (instilação na bexiga urinária), ou topicamente (por exemplo intra-ocular, intra-nasal, retal, nos ferimentos, na pele). O tratamento pode ser administrado através da infusão de pulso, 15 particularmente com doses decrescentes do membro de ligação. A via de administração pode ser determinada através das características físico- químicas do tratamento, através de considerações especiais para a doença ou para a necessidade de otimizar a eficácia ou minimizar os efeitos colaterais. Uma via particular de administração é a intra-venosa. Outra via de administrar

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as composições farmacêuticas da presente invenção é subcutânea. E

considerado que o tratamento anti-CXCL13 não será restrito ao uso na prática clínica. Portanto, a injeção subcutânea usando um dispositivo isento de agulha também é vantajosa.

Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, de modo simultâneo ou seqüencial dependendo da condição a ser tratada.

Um membro de ligação para CXCL13 pode ser usado como parte de uma terapia de combinação em conjunção com um componente médico adicional. Os tratamentos de combinação podem ser usados para fornecer efeitos sinergísticos significantes, particularmente a combinação de um membro de ligação anti-CXCL13 com um ou mais outros medicamentos. Um membro de ligação para CXCL13 pode ser administrado de modo simultâneo ou seqüencialmente ou como uma preparação combinada com 5 outro agente ou agentes terapêuticos, para o tratamento de uma ou mais das condições aqui listadas.

Um membro de ligação de acordo com a presente invenção pode ser fornecido em combinação ou adição com um ou mais dos seguintes agentes:

- uma citocina ou agonista ou antagonista da função citocina

(por exemplo um agente que age nos caminhos que sinalizam a citocina, tal como um modulador do sistema SOCS), tal como um alfa-, beta-e/ou gama- interferon; fator de crescimento semelhante a insulina tipo I (IGF-1), seus receptores e proteínas de ligação associadas; interleucinas (IL), por exemplo 15 um ou mais de IL-I a -33, e/ou um antagonista ou inibidor de interleucina, tal como anaquinra; inibidores dos receptores de membros ou inibidores da família de interleucina de sub-unidades específicas de tais receptores, um inibidor alfa do fator de necrose tumoral (TNF-α), tal como anticorpos monoclonais anti-TNF (por exemplo infliximab, adalimumab e/ou CDP-870) 20 e/ou um antagonista do receptor de TNF, por exemplo uma molécula de imunoglobulina (tal como etanercept) e/ou um agente de baixo peso molecular, tal como pentoxifilina;

- um modulator de células B, por exemplo um anticorpo monoclonal alvejando os linfócitos B (tais como CD20 (rituximab, MRA-

aIL16R ou Belimumab) ou linfócitos T (por exemplo CTLA4-Ig (Abatacept), HuMax 11-15);

- um modulator da ativação, maturação ou sobrevivência das células B (tal como Atacicept);

- um modulator da função imune, por exemplo um antagonista de caminhos LEVES de linfotoxina (tal como LTBR-Fc)

- um modulator que inibe a atividade de osteoclastos, por exemplo um anticorpo para RANKL;

- um modulator de quimiocina ou função receptora de quimiocina, tal como um antagonista de CCRl, CCR2, CCR2A, CCR2B,

CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCRlO e CCRll (para a família C-C); CXCRl, CXCR2, CXCR3, CXCR4 e CXCR5 e CXCR6 (para a família C-X-C) e CX3CRl para a família C-X3-C;

- um inibidor de metaloproteases de matriz (MMPs), isto é, uma ou mais das estromelisinas, as colagenases e as gelatinases bem como

agrecanase, especialmente colagenase-1 (MMP-1), colagenase-2 (MMP-8), colagenase-3 (MMP-13), estromelisina-1 (MMP-3), estromelisina-2 (MMP- 10) e/ou estromelisina-3 (MMP-11) e/ou MMP-9 e/ou MMP-12, por exemplo um agente tal como doxiciclina;

- um inibidor da biossíntese de leucotrieno, inibidor de 5-

lipoxigenase (5-LO) ou antagonista da proteína que ativa 5-Iipoxigenase (FLAP), tal como zileuton; ABT-761; fenleuton; tepoxalina; Abbott-79175; Abbott-85761; N-(5-substituido)-tiofeno-2-alquilsulfonamidas; 2,6-di-terc- butilfenolidrazonas; metoxitetraidropiranos tais como Zeneca ZD-2138; o 20 composto SB-210661; um composto de 2-cianonaftaleno substituído com piridinila, tal como L-739.010; um composto de 2-cianoquinolina, tal como L-746,530; indol e/ou um composto de quinolina, tal como MK-591, MK-886 e/ou BAY x 1005;

- um antagonista do receptor de leucotrienos (LT) B4, LTC4, LTD4, e LTE4, selecionado do grupo que consiste de fenotiazin-3-ls, tal

como L-651,392; compostos de amidino, tais como CGS-25019c; benzoxalaminas, tais como ontazolast; benzeno-carboximidamidas, tais como BIIL 284/260; e compostos, tais como zafirlukast, ablukast, montelukast, pranlukast, verlukast (MK-679), RG-12525, Ro-245913, iralukast (CGP 45715A) e BAY x 7195;

- um inibidor de fosfodiesterase (PDE), tal como um metilxantanina, por exemplo teofilino e/ou aminofilino; e/ou um inibidor de isoenzima PDE seletivo, por exemplo um inibidor PDE4 e/ou inibidor da

isoforma PDE4D e/ou um inibidor de PDE5;

- um antagonista do receptor de histamina tipo 1, tal como cetirizina, loratadina, desloratadina, fexofenadina, acrivastina, terfenadina, astemizol, azelastina, levocabastina, clorfeniramina, prometazina, ciclizina, e/ou mizolastina (em geral aplicado de modo oral, tópico ou perenteral);

- um inibidor de bomba de prótons (tal como omeprazol) ou

antagonista do receptor de histamina gastroprotetora tipo 2 ;

- um antagonista do receptor de histamina tipo 4;

- um agente simpatomimético vasoconstritor do agonista de do adrenoceptor alfa-l/alfa-2, tal como propilexedrina, fenilefrino,

fenilpropanolamina, efedrina, pseudoefedrina, cloridreto de nafazolina, cloridreto de oximetazolina, cloridreto de tetraidrozolina, cloridreto de xilometazolina, cloridreto de tramazolina e cloridreto de etilnorepinofrina;

- um agente anticolinérgico, por exemplo um antagonista do receptor muscarínico (Ml, M2, e M3), tal como atropina, hioscina,

glicopirrrolato, brometo de ipratrópio, brometo de tiotrópio, brometo de oxitrópio, pirenzepina e telenzepina;

- um agonista do beta-adrenoceptor (incluindo subtipos do beta receptor 1-4), tal como isoprenalina, salbutamol, formoterol, salmeterol, terbutalina, orciprenalina, mesilato de bitolterol e/ou pirbuterol, por exemplo

um enantiômero quiral deste;

- um cromona, por exemplo cromoglicato de sódio e/ou nedocromil de sódio;

- um glucocorticóide, tal como flunisolida, triamcinolona acetonida, beclometazona dipropionato, budesonida, fluticasona propionato, ciclesonida, e/ou furoato de mometasona;

- um agente que modula os receptores de hormônios nucleares, tal como um PPAR;

- uma imunoglobulina (Ig) ou preparação Ig ou um antagonista ou anticorpo que modula a função Ig, tal como anti-IgE (por exemplo

omalizumab);

- outro agente anti-inflamatório sistêmico ou topicamente aplicado, por exemplo talidomida ou um derivado deste, um retinóide, ditranol e/ou calcipotriol;

- combinações de aminosalicilatos e sulfapiridina, tal como

sulfasalazina, mesalazina, balsalazida, e olsalazina; e agentes imunomodulatórios, tais como as tiopurinas; e corticosteróides, tais como budesonida;

- um agente antibacteriano, por exemplo um derivado de penicilina, um tetraciclina, um macrólido, um beta-lactama, um

fluoroquinolona, metronidazol e/ou um aminoglicosídeo inalado; e/ou um agente antiviral, por exemplo aciclovir, fanciclovir, valaciclovir, ganciclovir, cidofovir; amantadina, rimantadina; ribavirina; zanamavir e/ou oseltamavir; um inibidor de protease, tal como indinavir, nelfmavir, ritonavir e/ou 20 saquinavir; um inibidor de nucleosídeo de transcriptase reversa, tal como didanosina, lamivudina, estavudina, zalcitabina, zidovudina; um inibidor de transcriptase reversa que não de nucleosídeos, tal como nevirapina, efavirenz;

- um agente cardiovascular, tal como um bloqueador do canal de cálcio, bloqueador do beta-adrenoceptor, inibidor da enzima que converte

angiotensina (ACE), antagonista do receptor de angiotensin-2; agente que diminuidor de lipídeos, tais como uma estatina e/ou fibrato; um modulador da morfologia das células sanguíneas, tal como pentoxifilina; um trombolítico e/ou um anticoagulante, por exemplo um inibidor de agregação de plaquetas;

- um agente do SNC, tal como um antidepressivo (tal como sertralina), medicamento anti-parkinsoniano (tal como deprenila, L-dopa, ropinirol, pramipexol; inibidor de MAOB, tal como selegina e rasagilina; inibidor de comP, tal como tasmar; inibidor A-2, inibidor de reabastecimento de dopamina, antagonista de NMDA, agonista de nicotina, agonista de 5 dopamina e/ou inibidor de óxido nítrico neuronal sintase) e um medicamento anti-alzheimer, tal como donepezila, rivastigmina, tacrina, inibidor de COX-2, propentofilina ou metrifonato;

- um agente para o tratamento de dor aguda crônica, por exemplo um analgésico que age de modo central ou periférico, tal como um

análogo ou derivado de opióide, carbamazepina, fentoína, valproato de sódio, amitriptilina ou outro agente antidepressivo, paracetamol, ou agente anti- inflamatório não esteroidal;

- um agente anestésico local aplicado de modo parenteral ou tópico (incluindo inalado), tal como lignocaína ou um análogo deste;

- um agente anti-osteoporose, por exemplo um agente

hormonal, tal como raloxifeno, ou um bifosfonato, tal como alendronato;

(i) um inibidor de triptase; (ii) um antagonista do fator que ativa plaquetas (PAF); (iii) um inibidor de enzima que converte interleucina (ICE); (iv) um inibidor de IMPDH; (v) inibidores de molécula de adesão incluindo um antagonista de VLA-4; (vi) uma catepsina; (vii) um inibidor de cinase, por exemplo um inibidor de tirosina cinases (tais como os exemplos Btk, Itk, Jak3 MAP de inibidores podem incluir Gefitinib, mesilato de imatinib), um serina/treonina cinase (por exemplo um inibidor de MAP cinase, tal como p38, JNK, proteína cinases A, B e C e IKK), ou uma cinase envolvida na regulação do ciclo celular (por exemplo uma cilina dependente de cinase); (viii) um inibidor de fosfato de glicose-6 deidrogenase; (ix) um antagonista do receptor de kinin-B.subl. e/ou B.sub2.; (x) um agente anti- gota, por exemplo colchicina; (xi) um inibidor de xantino oxidase, por exemplo alopurinol; (xii) um agente úrico, por exemplo probenecid, sulfinpirazona, e/ou benzbromarona; (xiii) um secretagogo de hormônio de crescimento; (xiv) fator de transformação de crescimento (TGFR); (xv) fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF); (xvi) fator de crescimento do fibroblasto, por exemplo fator de crescimento do fibroblasto básico (bFGF);

(xvii) fator que simula a colônia de granulócito macrófago (GM-CSF); (xviii) creme de capsaicina; (xix) um antagonista do receptor de taquikinina NK.subl. e/ou NK.sub3., tal como NKP-608C, SB-233412 (talnetanto) e/ou D-4418; (xx) um inibidor de elastase, por exemplo UT-77 e/ou ZD-0892; (xxi) uma inibidor da enzima que converte TNF-alfa (TACE); (xxii) inibidor 10 ou sintase induzida por óxido nítrico (iNOS) (xxiii) uma molécula de receptor-homólogo quimioatrativa expressada nas células TH2 (tal como um antagonista de CRTH2); (xxiv) um inibidor de um P38 (xxv) agente que modula a função dos receptores semelhantes a dobre de sino (TLR) e (xxvi) um agente que modula a atividade dos receptores purinérgicos, tais como 15 P2X7; (xxvii) um inibidor da ativação do fator de transcrição, tal como NFkB, API, e/ou STATS.

Um inibidor pode ser específico ou pode ser um inibidor misturado, por exemplo um inibidor alvejando mais do que uma das moléculas (por exemplo receptores) ou classes moleculares acima mencionadas.

O membro de ligação também pode ser usado em associação com um agente quimioterapêutico ou outro inibidor de tirosina cinase em co- administração ou na forma de um imunoconjugado. Os fragmentos do dito anticorpo também pode ser usado nos anticorpos biespecíficos obtidos através 25 de mecanismos recombinantes ou ligação bioquímica e depois associando a especificidade do anticorpo acima descrito com a especificidade de outros anticorpos capazes de reconhecer outras moléculas envolvidas na atividade para qual o CXCL13 é associado.

Para o tratamento de uma doença inflamatória, por exemplo artrite reumatóide, osteoartrite, asma, rinite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), ou psoríase, um membro de ligação da invenção pode ser combinado com um ou mais agentes, tais como agentes anti- inflamatórios não esteroidais (em seguida, NSAIDs) incluindo ciclo- 5 oxigenase não seletiva inibidores de (COX)-l/COX-2 sejam aplicados topicamente sistematicamente, tais como piroxicam, diclofenaco, ácidos propiônicos, tais como naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, cetoprofeno e ibuprofeno, fenamatos, tais como ácido mefenâmico, indometacina, sulindac, azapropazona, pirazolonas, tais como fenilbutazona, salicilatos, tais como 10 aspirina); inibidores seletivos de COX-2 (tais como meloxicam, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, lumarocoxib, parecoxib e etoricoxib); ciclo-oxigenase que inibe doadores de óxido nítrico (CINODs); glucocorticosteróides (sejam administrados por vias tópicas, orais, intra-musculares, intra-venosas ou intra- articulares); metotrexato, leflunomida; hidroxicloroquina, d-penicilamina, 15 auranofina ou outras preparações de ouros parenterais ou orais; analgésicos; diacereína; terapias intra-articulares, tais como derivados do ácido hialurônico; e suplementos nutricionais, tais como glucosamina.

Um membro de ligação da invenção também pode ser usado em combinação com um agente terapêutico existente para o tratamento do câncer. As agentes adequados a ser usados em combinação incluem:

(1) medicamentos antiproliferativos/antineoplásticos e combinações destes, como usado na oncologia médica, tal como Gleevec (mesilato de imatinib), agentes de alquilação (por exemplo cis-platina, carboplatina, ciclofosfamida, nitrogênio mostarda, melfalan, cloram-bucil, 25 busulfan e nitrosouréias); antimetabólitos (por exemplo antifolatos, tais como fluoropirimidinas semelhantes a 5-fluorouracila e tegafiir, raltitrexed, metotrexato, citosina arabinosídea, hidroxiuréia, gencitabina e paclitaxel); antibióticos antitumorais (por exemplo antraciclinas semelhantes a adriamicina, bleomicina, doxorubicina, daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C, dactinomicina e mitramicina); agentes antimitóticos (por exemplo vinca alcalóides semelhantes a vincristina, vinblastina, vindesina e vinorelbina e taxóides como taxol e taxotere); e inibidores de topoisomerase (por exemplo epipodofilotoxinas semelhantes a etopósido e tenipósido, ansacrina, topotecano e canptotecinas);

(ii) agentes citoestáticos, tais como antioestrógenos (por exemplo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno e iodoxifeno), sub- reguladores do receptor de estrógeno (por exemplo fulvestrant), antiandrógenos (por exemplo bicalutamida, flutamida, nilutamida e acetato de

ciproterona), antagonistas de LHRH ou agonistas de LHRH (por exemplo goserelina, leuprorelina e buserelina), progestógenos (por exemplo acetato de megestrol), inibidores de aromatase (por exemplo como anastrozol, letrozol, vorazol e exemestano) e inibidores de 5a-redutase, tais como finasteride;

(iii) Agentes que inibem a invasão das células cancerosas (por exemplo inibidores de metaloproteínase como marimastat e inibidores da

função receptora do ativador de plasminogeno urocinase);

(iv) inibidores da função do fator de crescimento, por exemplo tais inibidores incluem anticorpos do fator de crescimento, anticorpos do receptor do fator de crescimento (por exemplo o anticorpo anti-erbb2

trastuzumab e o anticorpo anti-erbbl cetuximab [C225]), inibidores de famesil transferase, inibidores de tirosina cinase e inibidores de serina/treonina cinase, por exemplo inibidores da família do fator de crescimento epidérmico (por exemplo inibidores de tirosina cinase da família EGFR, tal como N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxi-6-(3-morfolinopropóxi) 25 quinazolin-4-amina (gefitinib, AZDl 839), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2- metoxietóxi)quinazolin-4-amina (erlotinib, OSI-774) e 6-acrilamido-N-(3- cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropóxi)-quinazolin-4-amina (Cl 1033)), por exemplo inibidores do fator de crescimento derivado da família das plaquetas e por exemplo inibidores da família do ator de crescimento hepatócito;

(v) agentes antiangiogênicos, tais como aqueles que inibem os efeitos do fator de crescimento vascular endotelial (por exemplo o anti- anticorpo do fator de crescimento da célula endotelial vascular bevacizumab, 5 compostos, tais como aqueles divulgados nos Pedidos de Patente Internacionais WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 e WO 98/13354, cada um dos quais é aqui incorporado na sua totalidade) e compostos que funcionam através de outros mecanismos (por exemplo linomida, inibidores da função avR3 integrina e angiostatina);

(vi) agentes de dano vascular, tais como combretastatina A4 e

compostos divulgados nos Pedidos de Patente Internacionais WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 e WO 02/08213 (cada um dos quais é aqui incorporado na sua totalidade);

(vii) terapias anti-sentido, por exemplo aquelas que são direcionadas aos alvos listados acima, tais como ISIS 2503, um anti-ras

antissentido;

(viii) métodos de terapia de gene, incluindo por exemplo métodos para substituir genes anômalos, tais como p53 anômalo ou BRCAl ou BRCA2 anômalos, métodos de GDEPT (terapia de pró-droga de enzima

direcionada ao gene), tais como aqueles utilizando citosine deaminase, timidina cinase ou uma enzima de nitroredutase bacteriana e métodos para aumentar a tolerância do paciente à quimioterapia ou radioterapia, tais como terapia de gene de resistência a múltiplos medicamentos; e

(ix) métodos imunoterapêuticos, incluindo por exemplo métodos ex vivo e in vivo para aumentar a imunogenicidade das células

tumorais do paciente, tais como transfecção com citocinas, tal como interleucina 2, interleucina 4 ou fator que simula a colônia de granulócito macrófago, métodos para diminuir a anergia da célula T, métodos que usam células imunes transfectadas, tais como células dendríticas —transfectadas com citocina, métodos que usam células tumorais transfectadas com citocinalinas e métodos que usam anticorpos anti-idiotípicos.

Um membro de ligação da invenção e um ou mais dos componentes médico adicionais acima podem ser usados na fabricação de um 5 medicamento. O medicamento pode ser para a administração separara ou combinada a um indivíduo, e portanto pode compreender o membro de ligação e o componente adicional como uma preparação combinada ou como preparações separadas. As preparações separadas podem ser usadas para facilitar a administração separada e seqüencial ou simultânea, e permitir a 10 administração dos componentes através de vias diferentes por exemplo administração oral e parenteral.

De acordo com a presente invenção, as composições fornecidas podem ser administradas a mamíferos. A administração normalmente está em uma “quantidade terapeuticamente eficaz”, esta sendo 15 suficiente para mostrar benefícios a um paciente. Tal benefício pode ser pelo menos a melhora de pelo menos um sintoma. A quantidade atual administrada, e as taxas de tempo-curso de administração, dependerão da natureza e gravidade a qual está sendo tratada, do mamífero em particular sendo tratado, da condição clínica do paciente individual, do distúrbio, do 20 local de liberação da composição, do tipo do membro de ligação, do método de administração, do horário de administração e outros fatores conhecidos aos médicos. A prescrição do tratamento, por exemplo as decisões quanto a dosagem etc, está dentro da responsabilidades dos clínicos gerais e outros doutores médicos e pode depender da gravidade dos sintomas e/ou progressão 25 de uma doença sendo tratada. As doses de anticorpo apropriadas são bem conhecidas na técnica [83, 84]. As dosagens específicas aqui indicadas ou na Physician’s Desk Reference (2003) como apropriado para o tipo de medicamento sendo administrado podem ser usadas. Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou dose adequada de um membro de ligação da invenção pode ser determinada comparando-se sua atividade in vitro e in vivo em um modelo animal. Os métodos para a extrapolação das dosagens eficazes em camundongos e outros animais de teste para seres humanos são conhecidos. A dose precisa dependerá de vários fatores, incluindo se o 5 anticorpo é para o diagnóstico, prevenção ou para tratamento, o tamanho e local da área a ser tratada, a natureza precisa do anticorpo (por exemplo anticorpo integral, fragmento ou diacorpo) e a natureza de qualquer rótulo detectável ou outra molécula ligada ao anticorpo. Uma dose de anticorpo típica será na faixa de 100 μg a 1 g para as aplicações sistêmicas, e de 1 μg a 10 1 mg para as aplicações tópicas. Uma dose de carga inicial superior, seguido por uma ou mais doses inferiores, pode ser administrada. Tipicamente, o anticorpo será um anticorpo integral, por exemplo o isótipo IgGl. Isto é uma dose para um tratamento único de um paciente adulto, que pode ser proporcionalmente ajustada para crianças e bebês, e também ajustada para 15 outros formatos de anticorpo na proporção ao peso molecular. Os tratamentos podem ser diariamente repetidos, duas vezes por semana, semanalmente ou em intervalos mensais, a critério do médico. Os tratamentos podem ser a cada duas ou quatro semanas para a administração subcutânea e a cada quatro a oito semanas para a administração intra-venosa. O tratamento pode ser 20 periódico, e o período entre as administrações é de cerca de duas semanas ou mais, por exemplo cerca de três semanas ou mais, cerca de quatro semanas ou mais, ou cerca de um mês. O Tratamento pode ser dado antes e/ou após a cirurgia, e/ou pode ser administrado ou aplicado diretamente no local anatômico do tratamento cirúrgico.

Os membros de ligação da invenção podem ser usados ex vivo

para determinar o nível de CXCL13 em uma amostra como aqui descrita. Um tal método em geral compreende comunicar a amostra com um membro de ligação da invenção sob condições que permitem a ligação do membro de ligação ao CXCL13 e medir o nível de ligação ao CXCL13 na amostra. O nível de CXCL13 pode ser comparado com um padrão ou controle adequados.

0 método pode ser usado para o diagnóstico ou prognóstico de uma doença ou condição no indivíduo a partir dos quais a amostra foi obtida, e a partir das quais os níveis de CXCL13 são atribuíveis. Por exemplo, o

método pode ser usado para diagnosticar ou prognosticar a gravidade da doença em, artrite reumatóide, um tal método que compreende determinar o nível de CXCL13 em uma amostra adequada, por exemplo uma amostra fluida de soro ou sinovial, obtida a partir de um indivíduo que sofre da ou que suspeita-se estar sofrendo de artrite reumatóide. Os níveis elevados de 10 CXCL13 comparado a uma amostra de controle é um indicativo da doença, e existe uma correlação positiva entre os níveis de CXCL13 e a gravidade da doença.

Exemplos

Materiais e Métodos de Ensaio

Materiais

Células CHO Gqi5: células CHO Kl que expressam a proteína G Gqi5 (SEQID NO: 19).

Células CHO Gqi5 hCXCR5 ou células CHO Gqi5 hCXCR5 c4.4: células CHO Gqi5 que expressam estavelmente CXCR5 humano (SEQ ID NO: 17)

Meio essencial mínimo (Gibco 31095)

1 % de aminoácidos não essencial (Gibco 11140)

Meios de ensaio para ensaio HTRF® de cAMP:

Meio essencial mínimo (Gibco 31095) contendo 0,5 mM de 3- Isobutil- 1-metilxantina (Sigma 17018) 1 % de Aminoácidos não essenciais (Gibco 11140) 0,1 % de BSA

Solução de cAMP-XL665 para ensaio de HTRF: uma solução que compreende XL665 (um corante de aloficocianina, 80 kD no tamanho, diretamente ligado a cAMP) Tampão de Lise Conjugado para ensaio de HTRF de cAMP Solução Anti-cAMP de Ciptato de európio para ensaio de HTRF Solução Salina Balanceada de Hanks (Sigma H8264)

Meio de ensaio para o Ensaio de cAMP LANCE®:

Solução Salina Balanceada de Hanks (Sigma H8264) contendo mM de HEPES pH 7,4

0,5 mM de 3-Isobutil-1-metilxantina (Sigma 17018) 0,1 % de

BSA

Anticorpo anti-cAMP Alexa Fluor®-647 para o Ensaio de cAMP LANCE®: um anticorpo específico de cAMP rotulado com o corante Alexa Fluor®-647, formulado em 50 mM de solução salina de Tris HCl (pH 7,8), 0,9 % de cloreto de sódio, 0,1 % de BSA, 0,05 % de azida de sódio (preservativo).

Mistura de detecção LANCE®

Meio de Eagle modificado de Dulbecco COMM (Invitrogen) MEM-aminoácidos não essenciais sem L-glutamina (Invitrogen)

Meio de ensaio de liberação de Ca2+ induzida pela CXCLl 3: Meio de Eagle modificado Dulbecco (DMEM) contendo 10 % (v/v) soro bovino fetal inativado por calor (FES) (Invitrogen) 1 % (v/v) MEM-aminoácidos não essenciais sem L-glutamina (Invitrogen)

Solução de carga de corante para ensaio de liberação de Ca2+ induzida pela CXCL13

Mistura de corante Fluo-4 NW para ensaio de liberação de Ca2+ induzida pela CXCL13

Tampão de FLTPR:

125 mM de NaCl 5 mM de KCl

1 mM de MgCl2 1,5 mM de CaCl2 30 mM de Hepes 2,5 mM de probenecid (ácido 4-(dipropilsulfamoil) benzóico)

5 mM de glicose

1 % (v/v) de FBS inativado por calor

Células B300.19 hCXCR5: Uma linhagem celular pré-B de murino estavelmente transfectada com CXCR5 humano

Meio de cultura para o ensaio de quimiotaxia com células B300.19 hCXCR5: (RPMI-1640 Sigma, Cat % R0883), contendo 10 % de soro de bezerro fetal (FCS); 1 % de penicilina, estreptomicina e glutamina (PSG); 1 % de piruvato de sódio; 1,5 μg/ml de puramicina e 0,1 % de 2-p- mercaptoetanol.

Métodos

Ensaio de ligação de Receptor de CXCL13-ligando (FMAT)

O ensaio de ligação de Receptor de CXCL13-ligando mede a interação entre CXCL13 de ser humano biotinilada (Almac) e o receptor de CXCR5 super-expressado em células B300.19 (Almac) usando a Tecnologia de Ensaio de Microvolume de Fluorescência (FMAT) (Dietz et al 1996, Miraglia et al 1999, Mellentin-Michelotti et al. 1999). Este ensaio pode ser usado para triar extratos periplásmicos de scFv brutos ou scFv purificados para a inibição da interação CXCL13:CXCR5.

Os produtos de seleção foram triados como extratos periplásmicos contendo scFv bruto diluído preparado em 200 mM de tampão de Tris pH 7,4, 0,5 M de Sacarose. Todas as diluições de amostras e reagentes foram realizadas em solução salina balanceada de Hanks (Sigma H8264) contendo 0,025 % de Albumina Sérica Bovina (BSA) e 0,01 % de Azida de sódio. As amostras diluídas (20 μΐ) foram incubadas com I nM de CXCL13 de ser humano biotinilada, 25 ng/ml de estreptavidina FMAT-azul (Applied Biosystems 4362492) e células B300.19 CXCR5 (4000 células/reservatório) por 2 horas na temperatura ambiente em um volume de ensaio total de 50 μΐ em uma placa de superfície não aglutinante de fundo claro de 384 reservatórios (Costar 3655). Os controle de ligação total e ligação não específica (NSB) foram ajustados usando tampão de ensaio ou anticorpo monoclonal anti-CXCL13 de ser humano (R&D Systems MAB801) de 5 concentração de ensaio final de 3 nM respectivamente. As placas foram lidas no Applied Biosystems Cellular Detection System 8200 e os dados analisados usando o algoritmo de Wang Goldman com passagem de FL1<1600, tamanho <15 e razão de cor <0,4.

A % de ligação específica foi determinada a partir dos dados de FLl Total usando a equação 1 onde NSB FLl Total é o valor médio dos reservatórios de controle de ligação não específicos e o Total da ligação de FLl Total é o valor médio da ligação Total dos reservatórios de controle. Equação 1:

„ ,c (AmostraFLlTotal-NSBFLlTotal) vinn

/o de ligação especifica - (Total da ligação de FL1 Total. NSB FLl Total)

Ensaio de cAMP HTRF®

Os níveis de 3’,5’ monofosfato de adenosina cíclica (cAMP)

em células são aumentadas através da ativação da família de enzimas de adenilil ciclase, que catalisa a conversão de trifosfato de adenosina (ATP) para cAMP e pirofosfato. A ligação de CXCL13 ao seu receptor ligado à CXCR5 da proteína G pode resultar em uma infra regulagem da 20 atividade de adenilil ciclase e por este motivo diminui nos níveis de cAMP celular através da liberação da subunidade de proteína G Gai, que inibe a adenilil ciclase.

Nós usamos o kit de ensaio de cAMP de HTRF® (Fluorescência Resolvida com o Tempo Homogênea) (CisBio International 25 62AM4PEC) para a determinação dos níveis de cAMP celular. NO: ensaio de CXCL13 de cAMP HTRF®, diminuições mediadas pela CXCL13 nos níveis de cAMP em células CHO Gqi5 estavelmente que expressam CXCR5 são medidos. A co-estimulação das células com o ativador de adenilil ciclase, NKH477 (Tocris Cookson 1603), um derivado de forskolin solúvel em água, é realizado para garantir a resposta de CXCL13 está dentro da faixa linear de detecção do kit de ensaio de cAMP HTRF®.

Este ensaio pode ser usado para determinar as potências DE

scFvs para a inibição da modulação mediada pela CXCL13 de níveis de cAMP celular em células CHO Gqi5 hCXCR5.

As amostras de ScFv, reagentes e as células CHO Gqi5 hCXCR5 foram preparadas em meio de ensaio (Meio essencial mínimo (Gibco 31095) contendo 0,5 mM de 3-Isobutil-1-metilxantina (Sigma 17018),

1 % de aminoácidos não essenciais (Gibco 11140) e 0,1 % de BSA) a menos que de outro modo estabelecido. As células CHO Gqi5 hCXCR5 foram colhidas de frascos de cultura de tecido e recolocadas em suspensão a 1,2 X

IO6 células/ml em meio de ensaio. cAMP-XL665 e ciptato de európio anti- cAMP foram reconstituídos em água destilada de acordo com as instruções do fabricante (CisBio International)

ScFvs foram pré-incubados com 4 nM de CXCL13 de ser humano (SEQ ID NO: 14) ou de cinomolgo (SEQ ID NO: 16) (derivado de célula MEL) por 30 minutos na temperatura ambiente em uma placa de 20 volume baixo de 384 reservatórios (Costar 3676). 5 μΐ da amostra pré- incubada foram transferidos para a placa de ensaio (Costar 3676), depois 2,5 μΐ de NKH477 e 2,5 μί de suspensão de célula CHO Gqi5 hCXCR5 adicionadas para dar um volume de reação final de 10 μΐ contendo 0,5 μΜ de NKH477 e 3000 células/reservatório. Cada placa foi ajustada com os 25 seguintes controles: controle de NKH477 (células CHO Gqi5 hCXCR5 com 0,5 μΜ de NKH477), controle de CXCL13 (2 nM de CXCL13, 0,5 μΜ de NKH477 e células CHO Gqi5 hCXCR5), controle de cAMP basal (apenas células CHO Gqi5 hCXCR5) e controle negativo (apenas meio de ensaio). As titulações de CXCL13 e ΝΚΉ477 foram também conduzidas em cada experimento para garantir que as concentrações usadas no ensaio estivessem dentro da faixa de EC5O-ECss e consequentemente dentro da faixa linear de detecção do kit de ensaio de cAMP HTRF®. Depois da adição das células, as placas foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente, 5 depois as reações interrompidas pela adição de 5 μΐ de solução de cAMP- XL665.

Isto foi seguido pela adição de 5 μΐ de tampão de Iise conjugado aos reservatórios de controle negativo ou 5 μΐ de solução anti- cAMP de ciptato de európio a todos os outros reservatórios.

As placas de ensaio foram incubadas por 2 horas na

temperatura ambiente, antes de Ier a fluorescência de tempo determinado em comprimentos de onda de emissão de 620 nm e 665 nm usando uma leitora de placa EnVision (Perkin Elmer).

Os dados foram analisados calculando-se a % dos 15 valores Delta F para cada amostra. A % de Delta F foi determinada de acordo com a equação 2 onde a % de Delta F do controle de CXCL13 é o valor médio dos reservatórios de controle de CXCL13 e a % de Delta F do controle de NKH477 é o valor médio dos reservatórios de controle de NKH477.

Equação 2:

(valor da razão 665 nm/620 nm da amostra) -

% de Delta F = _(valor da razão 665 nm/620 nm do controle negativo)_ X 100

(valor da razão 665 nm/620 nm do controle negativo)

A % dos valores Delta F foram subsequentemente usados para calcular a % de inibição como descrito na equação 3.

Equação 3:

(% de Delta F da Amostra - n. , . ... „ % de Delta F do controle de CXCLl 3) v.nn % de imbiçao = -(%dÍDÍtaFd?^^Í^KH477^- X 100

% de Delta F do Controle de CXCL13)

Uma titulação de concentrações scFv foi usada de modo a estabelecer a potência do clone como medido pelos valores IC50 no ensaio. Os valores de IC50 foram determinados usando o software GraphPad Prism pelo ajuste de curva usando uma equação logística de quatro parâmetros (Equação

4).

Equação 4:

Y = Fundo + (Topo - Fundo)/(l+10A((LogEC50-X)*Inclinação de Hill))

X é o logaritmo da concentração. Y é a % de inibição

Ensaio de cAMP LANCE® de CXCL13 O princípio do Ensaio de cAMP LANCE® de CXCL13 é comparável àquele esboçado para o ensaio de cAMP HTRF® de CXCL13 mas os níveis de cAMP celular são medidos usando o kit de ensaio de cAMP 10 LANCE® (Perkin Elmer AD0263). O ensaio de cAMP LANCE® de CXCL13 pode ser usado para determinar a potência de IgGs para a inibição das diminuições mediadas pela CXCL13 nos níveis de cAMP nas células CHO Gqi5 hCXCR5 na co-estimulação com NKH477.

Todas as diluições foram realizadas em meio de ensaio (Solução salina balanceada de Hanks (Sigma H8264) contendo 5 mM de HEPES pH 7,4, 0,5 mM de 3-Isobutil-1-metilxantina (Sigma 17018) e 0,1 % de BSA) a menos que de outro modo estabelecido. As células CHO GgiS hCXCR5 foram colhidas dos frascos de cultura de tecido e recolocados em suspensão a 1,2 X IO6 células/ml em meio de ensaio. O anticorpo anti-cAMP Alexa Fluor®-647 foi adicionado à suspensão de célula a uma diluição de 1:100. A mistura de detecção LANCE® contendo Európio-W8044 Estreptavidina diluída 1:2250 e Biotina-cAMP diluído 1:750 vezes foi preparada pelo menos 15 minutos antes do uso como pelas instruções do fabricante. O Európio-W8044 é um ramo reativo do quelato de európio com DCA (diclorotriazinila).

As amostras de IgG foram pré-incubadas com 4 nM de CXCL13 de ser humano (SEQ ID NO: 14) ou cinomolgo (SEQ ID NO: 16) (derivado de célula MEL) e 2 μΜ de NKH477 (Tocris Cookson 1603) por 1 hora na temperatura ambiente em uma placa de volume baixo de 384 reservatórios (Costar 3676). 5 μΐ da amostra pré-incubada foram transferidos para uma placa de ensaíio de 384 reservatórios Proxiplate Plus branca (Perkin Elmer Cat no. 6008280). O anticorpo anti-cAMP Alexa Fluor®- 5 647/suspensão de célula CHO Gqi5 hCXCR5 (5 μΐ) foi adicionado para dar um volume de reação final de 10 μΐ contendo 1 μΜ de NKH477, 3000 células CHO Gqi5 hCXCRS/reservatório e anticorpo anti-cAMP Alexa Fluor®-647 diluído 1:200. Cada placa foi ajustada com os seguintes controles: controle NKH477 (células CHO Gqi5 hCXCR5/anticorpo anti-cAMP Alexa Fluor®- 10 647 e 1 μΜ de NKH477) e controle CXCL13 (2 nM de CXCL13, 1 μΜ de NKH477 e células CHO Gqi5 hCXCR5/anticorpo anti-cAMP Alexa Fluor®- 647). As titulações de CXCL13 e NKH477 também foram conduzidas em cada experimento para garantir que as concentrações usadas no ensaio estivessem dentro da faixa de EC5O-ECss e por este motivo dentro da faixa 15 linear de detecção do kit de ensaio de cAMP LANCE®. Depois da adição da suspensão de célula as placas foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente, depois as reações interrompidas pela adição de 10 μL de mistura de detecção LANCE® a todos os reservatórios de ensaio. As placas foram incubadas por 3 horas na temperatura ambiente depois da emissão a 665 nm 20 de comprimento de onda determinada usando uma leitora de placa EnVision (Perkin Elmer).

Os dados de emissão a 665 nm foram usados para calcular a % de inibição como descri to na equação 7, onde a emissão a 665nm do controle de CXCL13 é o valor médio dos reservatórios de controle de CXCL13 e a emissão a 665 nm do controle de NKH477 é o valor médio dos reservatórios de controle de NKH477.

Equação 7:

(Emissão a 665 nm da amostra - são a 665 nm do controle de CXC >são a 665nm do controle de NKH emissão a 665 nm do controle de CXCLl 3)

n. , ^ emissão a 665 nm do controle de CXCL13)

% de inibição = -(Emissão a 665nm do controle de NKH477 -- X 100 Os valores de IC50 foram determinados usando o software GraphPad Prism pelo ajuste de curva usando uma equação logística de quatro parâmetros (ver a Equação 4).

Ensaio de liberação de Ca2+ induzida por CHO Gq i5 hCXCR5

c4.4 CXCL13

As células CHO Gqi5 hCXCR5 c4.4 foram semeadas em placas de ensaio de cultura de tecido tratadas com Poli-D-Lisina de parede preta de 96 reservatórios (BD) a 1 x IO5 células/reservatório. As células foram depois cultivadas durante a noite em 100 μΐ de meio de ensaio (meio de Eagle 10 modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen), 10 % (v/v) de soro bovino fetal inativado por calor (FBS) (Invitrogen), 1 % (v/v) de MEM-aminoácidos não essenciais sem L-glutamina (Invitrogen)) em uma atmosfera umidificada a 37° C e 5 % de CO2.

Um protocolo FLIPR sem lavagem foi utilizado como segue, usando um kit comercialmente disponível (Kit de ensaio de Calcium Fluo-4 sem lavafem F36206, Molecular Probes). A solução de carga de corante foi preparada pela adição de 10 ml de tampão de ensaio (20 mM de HEPES em

IX solução salina balanceada de Hanks) e 100 μΐ de solução de estoque de probenecid (250 mM em tampão de ensaio) a um único frasco de mistura de 20 corante Fluo-4 NW. O meio foi aspirado das células, e 70 μΐ/reservatório de solução de carga de corante foram adicionados e incubados a 37° C por 30 minutos, seguidos por 30 minutos na temperatura ambiente. Durante este período de incubação, as titulações de IgGs purificados foram preparadas em tampão FLIPR (125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, I mM de MgCl2, 1,5 mM de 25 CaCl2, 30 mM de Hepes, 2,5 mM de probenecid, 5 mM de glicose e 1 % (v/v) de FBS inativado por calor) e pré-incubados com CXCL13 (100 nM de concentração final) também em tampão de FLIPR por 30 minutos a 37° C.

A seguir da incubação, as respostas de células rotuladas para as titulações de CXCL13/IgG foram medidas no Sistema de Leitora de Placa de Formação de Imagem Fluorimétrica (FLIPR). A fluorescência do corante sensível ao cálcio intracelular foi ensaiada usando um filtro de excitação de 470 a 495 nm e filtro de emissão de 515 a 575 nm em um período de x 120 segundos.

Os dados foram analisados pela exportação da altura de pico

máximo para cada reservatório para Excel (Microsoft). Os dados de inibidor foram normalizados para a porcentagem de Ca2+ intracelular induzido pelo CXCL13 usando a resposta ao CXCL13 na ausência de inibidor, e subtraindo a resposta para o tampão de ensaio sozinho, análise adicional foi realizada em 10 Prism (GraphPad) onde os dados foram plotados como porcentagem da resposta de controle contra a concentração Iog de IgG. Os valores IC50 foram calculados usando o software de ajuste de curva Prism (Graphpad).

Ensaio Imunossorvente Ligado à Fluorescência (ELISAs) de

CXCL13

O ELISA de CXCL13 mede a interação entre CXCL13 de ser

humano biotinilada (Almac) ligado a uma pérola de estreptavidina e membros de ligação de CXCL13 no formato de IgG usando a Tecnologia de Ensaio de Microvolume de Fluorescência (Dietz et al 1996, Swartzman et al 1999). Este ensaio pode ser usado para determinar a especificidade de IgGs para CXCL13 20 de ser humano biotinilada comparado com os membros da família da quimiocina relacionados em um formato de ensaio de competição.

As amostras e reagentes foram diluídos em Tampão de Ensaio (Solução Salina Tamponada com Fosfato com 0,1 % de BSA, 0,1 % de Tween-20 e 0,01 % de azida de sódio). 0,25 nM de CXCL13 biotinilado 25 (Almac) foi pré-incubado com 0,004 % p/v de partículas de poliestireno de 6 a 8 μιη revestidas com estreptavidina (Spherotec SVP-60-5) por 1 hora na temperatura ambiente. As pérolas foram depois centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante descartado e a pelota recolocada em suspensão no volume original de tampão de ensaio para dar uma mistura de pérola a 0,004 % p/v/CXCL13 de ser humano biotinilada. 10 μΐ de competidor, tampão de ensaio (controle de ligação total) ou CXCL13 de ser humano em excesso (controle de ligação não específica (NSB)) foi adicionado a uma placa de ensaio de superfície não aglutinante de fundo claro de 384 reservatórios 5 (Costar 3655). 10 μΐ de Alexa Fluor®-647 Anti-ser humano de cabra (H+L) a 5 nM (Invitrogen A21445), 10 μΐ de Anticorpo 1 a 0,31 nM (da linhagem germinativa IgG) e 20 μΐ de mistura de pérola/CXCL13 biotinilado foram depois adicionados e as placas incubadas por 4 horas na temperatura ambiente. O sinal de FLl foi lido no Sistema de detecção Celular 8200 da 10 Applied Biosystems. Os dados foram analisados usando o algoritmo de Wang Goldman com passagem de tamanho 3-12, razão de cor <0,4, contagem mínima 20.

A % de ligação específica foi determinada a partir dos dados de FLl usando a equação 8, onde NSB FLl é o valor médio dos reservatórios de controle de ligação não específica e FLl de ligação total é o valor médio dos reservatórios de controle de ligação total.

Equação 8:

T. (AmostraFLl-NSBFLl) V1 Ligaçao espec.fica = -(LigaçSo total de FLl- NSBTlÍ)- X 100

Os valores de IC5o foram determinados usando software

GraphPad Prism pelo ajuste de curva usando uma equação logística de quatro

parâmetros (ver a Equação 4).

Avaliação BIAcore da interação do anticorpo 1 (da linhagem

germinativa IgG) com CXCL13 de ser humano e de cinomolgo

Reagentes:

CXCL13

CXCL13 de ser humano (expressado em célula MEL)

0,1 mg mL-1, massa média esperada 9.694,53 Da, 10,31 μΜ.

A diluição para 6 nM foi de 4 μΐ em 6,869 μΐ de HBS-EP. CXCL13 de cinomolgo (expressado em célula MEL) 0,6 mg mL-1 diluído a 0,3 mg mL-1, massa média esperada 9.670 Da, 31,02 μΜ). A diluição a 6 nM foi de 4 μΐ em 20,678 μΐ de HBS-EP.

Imunoglobulinas

Anticorpo 1 (da linhagem germinativa)

4,42 mg mL-1 (por exemplo 3a); 1,06 mg mL-1 (por exemplo

3b)

Metodologia para o Exemplo 3 a

Ver o exemplo 3 a para a preparação de chip.

Para cada ciclo experimental (orientação 1) a superfície da Proteína G Fc 2 foi usada para capturar 240 a 385 RUs de Anticorpo 1 (da linhagem germinativa IgGi) pela titulação com uma solução a 0,5 μΐ ml-1 em HBS-EP de Anticorpo 1 (da linhagem germinativa IgGi) a 5 μΐ min-1 por 2 minutos.

Uma diluição especificada de CXCL13 de ser humano ou 15 cinomolgos (0,25, 0,3125, 0,50, 0,625, 1,0, 1,25, 2,5, 5,0, 10,0 e 20,0 nM para CXCL13 de ser humano ou 0,125, 0,25, 0,50, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 20,0 e 40,0 nM para CXCL13 de cinomolgo) em tampão HBS-EP foi depois fluído na superfície do chip a uma vazão de 100 μΐ min-1 (tempo de associação de 2,5 minutos, dissociação por 10 minutos e regeneração com um pulso de 20 μΐ de 20 Glicina a 10 mM pH 1,75 seguido por um pulso de 20 μΐ de Glicina a 10 mM pH 1,50). Injeções em branco foram feitas com o HBS-EP sozinho. Todas as soluções foram preparadas e armazenadas em polipropileno.

Metodologia para o exemplo 3 b

Os anticorpos foram diluídos a 1,0 μg mL-1 em tampão de 25 acetato a 10 mM pH 4,5. A química da amina padrão (usando kit de ligação de amina BR-1000-50) foi utilizado para criar superfícies em branco (Fe 1) e de 500 RU de IgG em um chip CM3 (BLAcore, BR-1005-41, lote: 1160100 expiração em Abril de 2007). A solução de lavagem utilizada foi Glicina pH 2,0. Fluxo de CXCL13 de ser humano e de cinomolgo sobre as superfícies do chip.

Uma série de diluições de cada CXCL13 (0,10, 0,20, 0,30, 0,40, 0,50 e 0,60 nM) foi construída em tampão HBS-EP e fluída a 30 μΐ min- 5 1 sobre todas as células do fluxo (tempo de associação de 4 minutos, dissociação por 10 minutos e regeneração com dois pulsos de 20 μΐ de Glicina a 10 mM pH 2,0). As injeções em branco foram feitas com o mesmo tampão. Todas as soluções foram preparadas e armazenadas em polipropileno.

Reforma de scFv para IgG^

Os clones foram convertidos de scFv para o formato IgG pela

sub-clonagem dos domínios VH e VL em vetores que expressam as cadeias pesadas e leves de anticorpo total respectivamente. O domínio VH foi clonado em um vetor (pEU15.1) contendo os domínios constantes da cadeia pesada humana e elementos reguladores para expressar cadeia pesada IgGj total em 15 células mamíferas. De modo similar, o domínio VL foi clonado em um vetor para a expressão dos domínios constantes da cadeia leve humana e elementos regulatórios para expressar cadeia leve de IgG total em células de mamífero (pEU3.4 para as cadeias leve capa, pEU4.4 para lambda). Os vetores para a expressão de cadeias pesadas e cadeias leves foram originalmente descritas 20 em Persic et al, 1997. Os vetores foram engendrados para permitir a replicação epissômica dos vetores.

Para obter IgGs, os vetores que expressam IgG de cadeia pesada e leve foram transfectados em células de mamífero EBNA-HEK293. As IgGs foram expressadas e secretadas no meio isento de soro. As colheitas 25 foram reunidas e filtradas antes da purificação. A IgG foi purificada usando a cromatografia Proteína A. Os sobrenadantes de cultura são carregados em uma coluna de tamanho apropriado de Proteína A Cerâmica (BioSepra) e lavada com 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 250 mM de NaCl. A IgG ligada foi eluída da coluna usando 0,1 M de Citrato de Sódio (pH 3,0) e neutralizada pela adição de Tris-HCl (pH 9,0). O material eluído foi trocado em tampão em PBS usando colunas NaplO (Amersham, 417-0854-02) e a concentração de IgG foi determinada espectrofotometricamente usando um coeficiente de extinção com base na seqüência de aminoácido da IgG (Março de 1992). As 5 IgGs purificadas foram analisadas quanto a agregação ou degradação usando SEC-HPLC e pela SDS-PAGE.

Ensaio de competição de Epítopo de HTRF®

O ensaio de competição de epítopo de HTRF® pode ser usado para determinar a competição entre os membros de ligação para a ligação de CXCL13 biotinilado. As moléculas de anticorpos testadas neste ensaio por exemplo podem estar no formato scFv ou IgG.

Os princípios da tecnologia HTRF® são como aqui descritos.

Em um ensaio de competição de epítopo HTRF® para determinar a capacidade de um membro de ligação para competir quanto a 15 ligação ao CXCL13 com uma molécula scFv de anticorpo tendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 11, um complexo FRET é formado entre ScFv rotulado com criptato (SEQ ID NO: 11), CXCL13 de ser humano biotinilada e estreptavidina XLent (estreptavidina reticulada com XL665, ligada sob condições otimizadas). Um ScFv ou IgG que reconhece o mesmo (ou 20 possivelmente sobrepõem) epítopo como o ScFv rotulado com criptato competirá para ligar ao CXCL13 biotinilado e deste modo reduzir o sinal do ensaio.

Todas as diluições de amostras e reagentes são realizadas em tampão de ensaio (Solução Salina Tamponada com Fosfato, 0,1 % de BSA, 25 0,4 M de Fluoreto de Potássio). CXCL13 de ser humano biotinilada (AlmacAlmac) e Estreptavidina-XLent (CisBio International 611SAXLB) são pré-incubados na temperatura ambiente por 30 minutos. 10 μΐ de amostra (scFv ou IgG), tampão de ensaio (controle de ligação total) ou 5OX a concentração de ensaio final de IgG não rotulado (para definir a ligação não específica (NSB)) são adicionados a uma placa de volume baixo de 384 reservatórios (Costar 3676) seguidos por 5 μΐ da mistura de CXCL13 biotinilado/Estreptavidina XLent pré-incubados. As placas são incubadas por

1 hora na temperatura ambiente depois do que 5 μΐ de ScFv rotulado com criptato é adicionado. As placas são incubadas por 3 horas na temperatura ambiente antes da determinação da fluorescência de tempo determinado em comprimentos de onda de emissão de 620 nm e 665 nm usando uma leitora de placa EnVision (Perkin Elmer).

As concentrações ótimas de CXCLl3, estreptavidina-XLent e IgG rotulado com criptato pode ser titulado para estabelecer a concentração de cada reagente que forneça um sinal de ensaio apropriado.

Os dados são analisados calculando-se os valores de % de Delta F para cada amostra (refere-se à equação 5).

Equação 5:

(razão de 665 nm/620 nm da amostra) -

% de Delta = _(razão de 665 nm/620 nm de NSB)_ X 100

(razão de 665 nm/620 nm de NSB)

Os valores de % de Delta F são subsequentemente usados para

calcular % de ligação específica como descrito na equação 6, onde a % de Delta F de NSB é o valor médio dos reservatórios de controle de ligação não específica e % de Delta F de ligação total é o valor médio dos reservatórios de controle de ligação total.

Equação 6:

(% de Delta F % da Amostra -

n/ j ,. _ ,,, % de Delta F de NSB) vin„ % de ligação especfica = -(% de Delta F de ligação toST-- X 100

% de Delta F de NSB) os valores de IC50 são determinados usando o software GraphPad Prism pelo ajuste de curva usando uma equação logística de quatro parâmetros (ver a Equação 4).

Equação 4 :

Y = Fundo + (Topo - Fundo)/( 1+10A((LogEC50-X)* Inclinação de Hill)) X é o logaritmo da concentração. Y é a % de inibição Ensaio de Quimiotaxia Acionado pela CXCL13 de Célula B3 PO. 19 hCXCR5

As células B300.19 hCXCR5 foram ajustadas a 5 x IO5 células/ml por pelo menos 2 dias antes de conduzir o ensaio usando meio de cultura (RPMI-1640 Sigma, Cat# R0883) contendo 10 % de soro de bezerro fetal (FCS); 1 % de penicilina, estreptomicina e glutamina (PSG); 1 % de piruvato de sódio; 1,5 μg/ml de puramicina e 0,1 % de 2-(3-mercaptoetanol) em uma atmosfera umidificada a 37° C, 5 % de CO2. NO: dia do ensaio, as células B300.19 hCXCR5 foram contadas e ajustadas para 6 x IO6 células/ml depois de serem giradas e lavadas uma vez em tampão (RPMI-1640 (Sigma Cat# R0883) + 0,35 % de BSA (Sigma Cat# A2153)).

As titulações de IgGs foram feitas em tampão de ensaio. As IgGs foram pré-incubadas com uma concentração de ED80 de CXCL13 por

min em uma atmosfera umidificada a 37° C, 5 % de CO2.

A seguir deste período de incubação, 31 μΐ/reservatório do CXCL13 e IgG pré-incubados foram transferidos para a câmara inferior de uma placa de quimiotaxia (Receptor Technologies, Cat# 106-5) usando a pipetagem reversa para evitar bolhas. O filtro de membrana foi depois aplicado sobre os reservatórios prendendo em cada canto. 50 μΐ das células B300.19 hCXCR5 (6 x IO6 células/ml) foram depois dispensadas nas áreas circundadas na câmara superior do filtro de quimiotaxia. A tampa foi colocada sobre a placa de quimiotaxia e incubada em uma atmosfera umidificada (37° C, 5 % de CO2) por 2 horas.

A seguir de 2 horas de incubação, as placas foram removidas do incubador e lavadas para remover as células em excesso da superfície do filtro. Isto foi feito vertendo-se PBS sobre a superfície da membrana e usando um raspador de célula (Corning, Cat# 3011) para remover todas as células/PBS em excesso. A placa de quimiotaxia foi depois centrifugada a 1500 rpm por 10 min, deixando a placa de lado.

A seguir de girar, a membrana de filtro foi removida e os conteúdos da câmara inferior da placa de quimiotaxia foram transferidas a uma placa de fundo chato de poliestireno de 96 reservatórios (Corning, Cat# 5 3598) (placa enzimática) contendo 80 μΐ/reservatório de tampão de ensaio e 15 μΐ/reservatório de tampão de Iise (H2O + 9 % de Triton-X). A placa foi incubada por 1 hora em uma atmosfera umidificada (37° C, 5 % de CO2).

Cada placa foi depois submetida a um ensaio de citotoxicidade não radioativo que mede a lactato desidrogenase (LDH), uma enzima citossólica estável, liberada na Iise de célula. O ensaio fornece uma medida quantitativa do número de célula. O ensaio de citotoxicidade não radioativa CitoTox 96 (Promega Cat# Gl 780) consiste dos seguintes reagentes: 5 frascos de Mistura de Substrato; 60 ml de Tampão de Ensaio; 25 μΐ de Controle Positivo de LDH (NÃO USADO); 3 ml de Solução de Lise (IOX) (NÃO USADA); 65 ml de Solução Stopo (Ácido Acético 1 M); protocolo I. Para a Medição de LDH o Tampão de ensaio foi descongelado; 12 ml foram removidos e a porção não usada prontamente armazenada a -20° C. Um banho de água a 37° C pode ser usado para descongelar o Tampão de ensaio. Os 12 ml de Tampão de Ensaio foram aquecidos até a temperatura ambiente (mantidos protegidos da luz). Os 12 ml de Tampão de Ensaio na temperatura ambiente foram adicionados a um frasco de Mistura de Substrato. Este foi invertido e suavemente agitado para dissolver a Mistura de Substrato.

Um frasco fornecerá substrato suficiente para duas placas de 96 reservatórios. Uma vez recolocado em suspensão, o substrato deve ser 25 protegido da luz direta forte e usado imediatamente. 50 μΐ de Mistura de Substrato reconstituídos foram adicionados a cada reservatório da placa de ensaio enzimático contendo amostras lisadas transferidas da placa de ensaio de quimiotaxia. A placa foi coberta com folha ou uma caixa opaca para protegê-la da luz e incubada por 30 minutos na temperatura ambiente. 50 μΐ de Solução Stopo foram adicionados a cada reservatório. Quaisquer bolhas grandes foram estouradas usando uma agulha de seringa, e a absorbância a 490 ou 492 nm dentro de 1 hora depois da adição de Solução Stopo foi registrada.

Os dados foram carregados no GraphPad Prism 4 e este

software gerou os valores de IC50 com base nas curvas de resposta de dose geradas.

Ensaio de Quimiotaxia Acionado pelo CXCL13 de Célula B de Amígdala Humana As tonsilas humanas foram obtidas depois da cirurgia de

amigdalotomia de pacientes sob a aprovação dos comitês de ética locais. As amostras foram enviadas em meio RPMI-1640 (Sigma: R0883) contendo 10 % de Soro de bezerro fetal, 1 % de Penicilina (10.000 unidades/ml) + Estreptomicina (10 mg/ml) + solução de Glutamina (200 mM) (Sigma: 15 Gl 146) para fornecer uma concentração final de 100 Unidades/ml de Penicilina + 0,1 mg/ml Estreptomicina + 2 mM de solução de Glutamina, 100 μg/ml de Gentamicina (Sigma: Gl 522), 0,1 % de Beta mercaptoetanol (Gibco: 31350-010), 1 % de Piruvato de Sódio (Sigma: S8636), 1 % de Aminoácidos Não Essenciais (Gibco: 11140-035).

As células B de amígdalas primárias foram isoladas do tecido

da tonsila usando uma peneira de dissociação de célula (tamanho de malha 60) (Sigma: CDl). A suspensão de célula foi depois lavada pela centrifugação a 300g (1500 rpm) por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e a pelota de célula recolocada em suspensão em um total de 20 ml de meio de cultura de 25 tecido frio. A suspensão de célula foi disposta em camada em 20 ml de Ficoll hypaque (Lymphoprep) (Axis Shields: 1114544) e centrifugada a 2000 rpm por 15 min para remover células mortas, fragmentos de célula e eritrócitos. As células na interface de lymphoprep e meio de cultura de tecido foram removidos com uma pipeta de pasteur plástica e transferida para um tubo de centrífuga de 15 ml. A suspensão de célula foi completada a um volume de 15 ml com meio de cultura de tecido frio e centrifugada a 1500 rpm por 5 min. O sobrenadante foi descartado e a pelota de célula recolocada em suspensão em 10 ml de meio de cultura de tecido frio. Uma contagem de célula viável é 5 realizada usando um contador coulter. As células foram ajustadas a uma concentração de 5 x IO6 células por ml e cultivadas durante a noite com 1 μg/ml de LPS aproximadamente 20 horas. A seguir da incubação as células tonsilares foram ajustadas a 1 x IO7 células/ml depois de serem giradas e lavadas uma vez em tampão (RPMI-1640 (Sigma Cat# R0883) + 0,35 % de 10 BSA (Sigma Cat# A2153)).

O ensaio de quimiotaxia foi depois realizado como anteriormente descrito para as células B300.19 hCXCR5.

Ligação de hCXCL13 Nativo ao Anticorpo 1 (da linhagem germinativa IgG1) em um ELISA O sangue integral de foi coletado de em um recipiente

Iieparinizadoi sob a aprovação dos comitês de éticas locais. O sangue foi lentamente disposto em camada sobre um volume igual de Lymphoprep usando um stripette em um tubo Falcon de 50 ml. Os tubos foram girados a 2000 rpm por 25 min na temperatura ambiente com o freio desligado.

A camada de linfócito foi removida usando uma pipeta de

Pasteur e transferida em um tubo de 50 ml de Fisher fresco. As células foram depois lavadas com meio RPMI-1640 pré-aquecido (Sigma: R0883). As células foram depois lavadas pela centrifugação a 1500 rpm por 10 min com o frei ligado. O sobrenadante foi descartado e as células foram depois lavadas duas vezes mais pela centrifugação usando RPMI a 1500 rpm por 10 min com

o freio ligado. Para a lavagem final, a pelota foi recolocada em suspensão em

50 ml de RPMI e uma amostra de 200 μΐ removida para contagem usando o Contador Coulter.

A seguir da lavagem final, as células foram recolocadas em suspensão na quantidade apropriada de meio de cultura (RPMI-1640 (Sigma: R0883) contendo 10 % de Soro de bezerro fetal, 1 % de Penicilina (10.000 unidades/ml) + Estreptomicina (10 mg/ml) + solução de Glutamina (200 mM) (Sigma: Gl 146) para fornecer uma concentração final de 100 Unidades/ml de 5 Penicilina + 0,1 mg/ml de Estreptomicina + 2 mM de Glutamina) para obter uma concentração de célula de 3,3 x IO6 células/ml.

As células foram depois dispensadas em placas de cultura de tecido de poliestireno de 6 reservatórios placas de cultura de tecido, 3 ml por reservatório. Isto fornece um número de célula final de aproximadamente 1 x IO7 célula/reservatório. Tantas placas quanto possível foram montadas para o estímulo do dia 6.

As placas foram depois incubadas a 37° C, 5 % de CO2 por 3 a

4 horas. Durante esta incubação os monócitos devem grudar ao fundo dos reservatórios deixando outras populações de célula em suspensão.

A seguir da incubação, os 3 ml de meio de cultura contendo

células não aderentes foi suavemente drenados de cada reservatório e descartados deixando apenas os monócitos aderentes com base em cada reservatório. A cada reservatório de cada placa, 3 ml de meio de cultura fresco foram adicionados. Os seguinte estimulantes foram adicionados:

M-CSF Humano (R&D Systems: 216-MC-025) para se obter

uma concentração final de 50 ng/ml + IL-4 humana (R&D Systems: 204-MC- 025) para se obter uma concentração final de 25 ng/ml.

1 reservatório foi deixado não estimulado como um controle, contendo apenas meio.

A seguir do dia 6 de estimulação, a 37° C, 5 % de CO2, LPS

foi adicionado durante a noite a todos os reservatórios estimulados a uma concentração final de 1 μg/ml. Depois da estimulação durante a noite com LPS, os sobrenadantes foram coletados de cada reservatório usando um stripette. Todo o sobrenadante foi reunido e depois dispensado em tubos de 15 ml (10 ml por tubo). -500 μΐ foram coletados em um tubo de eppendorff para a quantificação pelo ELISA. A quantificação de CXCLl3 pelo ELISA foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. (R&D Systems: Imunoensaio de Quantikine CXCL13 de ser humano/BLC/BCA-1. Cat. N°: DCX130)

O sobrenadante contendo CXCL13 nativo foi depois purificado em uma resina de troca catiônica e dialisado em PBS e requantificado usando ELISA.

Para mostrar a ligação do CXCL13 nativo ao Anticorpo 1 (da 10 linhagem germinativa IgGi), placas de 96 reservatórios de alta ligação maxi- sorp foram revestidos com CAZ-1040 (5 μg/ml 200 μΐ por reservatório). Também, dentro do kit de ELISA, placas foram fornecidas com anticorpo anti-CXCL-13 não especificado. O CXCL13 nativo purificado foi depois adicionado tanto às placas revestidas com o Anticorpo 1 quanto as fornecidas 15 com o kit. O ELISA foi depois realizado de acordo com as instruções dos fabricantes (R&D Systems: Quantikine Human CXCL13/BLC/BCA-1 Imunnoassay. Cat. N°: DCX130).

O Anticorpo 1 liga-se tanto ao CXCL13 nativo quanto ao CXCL13 recombinante (padrões fornecidos no kit) com concentrações equivalentes de ligandos dando um sinal equivalente no ensaio.

Perturbação de taxa de troca de H/D de CXCL-13 pelo membro de ligação

CXCLl3 foi usado a 0,5 mg/ml em 50 mM de Tris.HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl. O anticorpo foi usado a 10,6 mg/ml em PBS (1,54 mM 25 de KH2P04, 2,71 mM de Na2HP04, 155 mM de NaCl pH 7,2). O anticorpo foi ligado à resina POROS AL (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante para preparar uma coluna de 100 μΐ que foi mantido a 1°C.

A coluna foi lavada em 50 mM de Tris.HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl preparada em 75 % de D20. CXCL13 foi diluído em tampão preparado com 75 % de D20 a 0,125 mg/ml e incubados por 150, 500, 1500 e 5000 s antes da injeção na coluna de anticorpo. A coluna foi rapidamente lavada com 0,2 ml de tampão em H2O e depois incubados durante o mesmo 5 período de tempo isto é, a amostra que foi trocada em D20 por 150 s foi trocada de volta para H20 por 150 s e similarmente para as amostras a 500, 1500 e 5000s. Os pontos de tempo diferentes foram eluídos pela injeção primeiro 80 μΐ e depois 40 μΐ de ácido fórmico a 0,8 %. O último 441 foi coletado e 20 μΐ de uréia 2 M, TCEP I M pH 3 a 1 ° C adicionados. A mistura 10 inteira foi injetada em uma coluna de 100 μΐ contendo pepsina para digerir a proteína em peptídeos que foram separados pela rpHPLC usando um gradiente de acetonitrila de 12 a 28,5 % e as massas determinadas tanto em um espectrômetro de massa de eletropulverização Thermo Finnigan LCQ e um espectrômetro de massa Micromass Q-TOF. O programa de software 15 SEQUEST (Thermo Finnigan São José, CA) foi usado para identificar seqüências dos íons de peptídeo precursor.

O efeito do anticorpo na taxa de troca de partes diferentes de CXCL13 foi determinado essencialmente como descrito acima, com as seguintes exceções: o CXCL13 foi primeiro diluído a 0,125 mg/ml em tampão 20 contendo H20, depois injetados na coluna que foi pré-lavada com 50 mM de Tris.HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl preparados em H20. Depois da ligação, a coluna foi lavada com 50 mM de Tris.HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl preparados em H20 e depois incubados com 50 mM de Tris.HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl preparados em 75 % de D20 por 150, 500, 1500 e 5000 s antes 25 de serem trocado de volta em H20 e tratado como acima.

Exemplo 1: Isolação de anticorpo guia cDNA de baço humano foi usado como um padrão para PCR a matriz de leitura aberta de CXCL13 de ser humano. Este foi clonado em um vetor de expressão de mamífero (pEV3) para a transfecção estável de células MEL. A linha celular clonal que expressa CXCL13 mais alto MEL foi identificada pelo western blot de sobrenadantes de cultura celular usando um anticorpo anti-CXCL13 comercialmente disponível. CXCL13 recombinante foi purificado a partir do meio de cultura de células MEL que expressam a 5 proteína pelo ajuste do pH para 6 e depois carregando-o em uma coluna de troca de cátion. CXCL13 foi eluído em um tampão MES no pH 6 contendo NaCl 1 M. A amostra foi carregada diretamente em uma coluna Resource rpc e eluído com um gradiente de até 90 % de acetonitrila em 0,1 % de TFA. Frações contendo CXCL13 foram reunidas, concentradas e purificadas pela 10 cromatografia em uma coluna Superdex75 para gerar material de >95 % de pureza. A proteína purificada foi analisada pelo SDS-PAGE e LCMS e mostrou ter uma massa de 9690 Da.

1.1 Seleções da biblioteca de demonstração de fago de scFv As bibliotecas de anticorpo humano Fv de cadeia única grande (scFv) clonados em um vetor de fagomídeo com base no fago filamentoso M13 foram usadas para as seleções (Vaughan 1996, Hutchings 2001). Os anticorpos scFv anti-CXCL13 específicos foram isolados das bibliotecas de apresentação de fago usando uma série de ciclos de seleção no CXCL13 de ser humano biotinilada quimicamente sintetizado (Almac) essencialmente como anteriormente descrito (Vaughan 1996). Em resumo o fago purificado em PBS-Marvel (3 % p/v) foram deixados ligar ao CXCL13 biotinilado de ser humano em solução por 1 h. ScFv-fago ligados ao antígeno foram depois capturados em pérolas paramagnéticas revestidas com estreptavidina (Dynabeads® M-280) seguindo as recomendações do fabricante. As partículas de fago não ligadas foram removidas por uma série de ciclos de lavagem usando PBS-Tween (0,1 % v/v) e PB S. As partículas de fago ligadas foram eluídas, infectadas em bactérias e recuperadas para a etapa seguinte de seleção (Vaughan 1996).

Um número representativo de clones individuais da segunda rodada de seleções foi cultivado em placas de 96 reservatórios. ScFvs foram expressados no periplasma bacteriano e triados quanto à sua capacidade para inibir a ligação de CXCL13 biotinilado de ser humano (Almac) ao seu receptor CXCR5 expressado em células B300.19 hCXCR5 usando a 5 Tecnologia de Ensaio de Microvolume de Fluorescência (FMAT). ScFvs que mostraram um efeito inibitório significante como amostras de periprep brutas na interação CXCLl 3: CXCR5 no ensaio foram submetidas ao sequenciamento de DNA (Vaughan 1996, Osboum 1996).

Os scFvs únicos foram expressados mais uma vez em bactérias 10 e purificados pela cromatografia de afinidade (como descrito em Bannister 2006). Os valores de IC50 foram determinados testando-se as séries de diluição de scFvs purificados em um ensaio de HTRFk cAMP (3’, 5’ monofosfato de adenosina cíclica) contra CXCL13 de ser humano e primata não humano cinomolgo (cino) (ambos derivados de célula MEL).

1.2 Determinação da atividade funcional. Inibição da formação

de AMP cíclico estimulado pela CXCL13

No ensaio de CXCL13 da inibição de cAMP HTRF® pelos scFvs guias das diminuições mediadas pela CXCL13 nos níveis de cAMP na co-estimulação de células CHO Gqi5 hCXCR5 com o ativador da 20 adenilil ciclase NKH477 (0,5 μΜ), foi medido. Os valores de IC50 foram determinados contra as concentrações de reação finais de 2 nM de CXCL13 de ser humano (derivado de célula MEL) ou 2 nM de CXCL13 de cinomolgo (derivado de célula MEL) (ver a Tabela I). Para os detalhes do método de ensaio, reportar-se à seção “Materiais e Métodos de 25 Ensaio”.

NO:me do clone CXCL13 de ser humano CXCL13 de cino IC50 nM ± SD (número n) IC50 nM (n = 1) Anticorpo 1 5 ± 1 3 (que não da linhagem (n = 3) germinativa) Tabela 1. Exemplos de potências do anticorpo 1 scFv (que não da linhagem germinativa) contra CXCL13 de ser humano (IC50 médio ± desvio padrão, número n) ou CXCL13 de cinomolgo (n = 1 apenas dados) no ensaio de cAMP de HTRF® CXCL13

1.3 Potência de IgGs no ensaio de cAMP LANCE® CXCL13 A atividade dos clones reformados para IgGi (ver

Materiais e Métodos) foi determinada no ensaio de cAMP LANCE®. O princípio deste ensaio é comparável com aquele do ensaio de cAMP HTRF® mas usa o kit de Ensaio de cAMP LANCE® (Perkin Elmer) para a determinação dos níveis de cAMP celular. Para detalhes do método de 10 ensaio, ver a seção “Materiais e Métodos de Ensaio”. NO: Ensaio de cAMP LANCE® CXCL13 os valores de IC50 para as diminuições mediadas pela inibição de IgG de derivado de célula MEL CXCL13 (2 nM de CXCL13 de ser humano ou 2 nM de CXCL13 de cino) nos níveis de cAMP na co-estimulação de células CHO Gqi5 hCXCR5 com o ativador da adenilil 15 ciclase NKH477 (1 μΜ), foram determinados (para dados de exemplo ver a Tabela 2).

Nome do clone CXCLl 3 de ser humano CXCLl3 de Cino IC50 nM ± SD (número n) IC50 nM ± SD (número n) Anticorpo 1 1,4 ± 0,5 (n= 10) 0,3 ± 0,1 (n = 6) (IgG que não da linhagem germinativa) Tabela 2. Exemplos de potências do anticorpo I IgG (que não da linhagem germinativa) contra derivado de célula MEL CXCL13 de ser humano (IC50 Médio ± desvio padrão, número n) ou CXCL13 de cinomolgo (n = 6 dados)

no ensaio LANCE® CXCL13 de cAMP.

1.4 Inibição da quimiotaxia induzida pela CXCL13 em células B300.19 que expressam CXCR5 recombinante

As IgGs foram testadas em um ensaio de quimiotaxia usando células B300.19 hCXCR5, uma linha celular pré-B de murino as quais foram transfectadas com CXCR5 recombinante humano. IgGs foram tituladas contra uma concentração de CXCL13 de ser humano não glicosilado que deu uma resposta de aproximadamente ED80 (12,32 nM) A tabela abaixo ilustra os valores de IC50 (nM) ± SEM para a IgG de Anticorpo 1 (que não da linhagem germinativa). Cada IgG foi testada pelo menos 3 vezes.

IgG 1C50 (nM ± SEM) hCXCL13 não glicosilado Anticorpo 1 (que não da linhagem 5,26 ± 0,62 germinativa) Tabela 3. Exemplo de valores de IC50 (nM) ± SEM para IgG de Anticorpo 1 (que não da linhagem germinativa) no ensaio de quimiotaxia de B300.19

hCXCR5.

1.5 Inibição da liberação de cálcio induzida pela CXCL13 A atividade de IgG na liberação de cálcio induzida pela

CXCL13 foi avaliada usando uma linhagem de célula CHO transfectada

com a proteína G Gqi5 e CXCR5 humano. A estimulação destas

2_|_

células de CXCL13 de ser humano dá origem a aumentos no Ca citoplásmico em uma maneira dependente da concentração pela 15 indução da liberação de materiais intracelulares e influxo de meio extracelular. Isto pode ser medido usando tinturas sensíveis ao cálcio em uma Leitora de Placa de Formação de Imagem por Fluorescência (FLIPR). Neste ensaio, a atividade inibidora, como determinado pelos seu valores de IC50, de IgG anti-CXCL13 foi determinada contra 100 nM de CXCL13 de ser 20 humano (derivado de célula MEL). As potências de IgG obtidas para o Anticorpo 1 (que não da linhagem germinativa) são apresentadas na tabela 4. Os controles de ensaio positivos foram incluídos em todos os ensaios. Para detalhes completos do método de ensaio ver “Materiais e Métodos de Ensaio”.

NO:me do Clone IgG IC50nM (n = 8) Anticorpo 1 17,1 ± 11,2 (que não da linhagem germinativa) Tabela 4. Potência de IgG de Anticorpo 1 (que não da linhagem germinativa) no ensaio de liberação de Ca2+ em CHO Gqi 5 hCXCR5 mediado pela CXCL13 (IC5o médio ± desvio padrão)

Exemplo 2: Linhagem germinativa de Anticorpo

2.1 Linhagem germinativa de Anticorpo

As seqüências de aminoácido dos domínios VH e VL dos anticorpos anti-CXCL3 foram alinhados com as seqüências da linhagem germinativa humana conhecida na base de dados VBASE (Tomlinson 1997), e a linhagem germinativa mais próxima foi identificada pela

similaridade de seqüência. Para os domínios VH do anticorpo 1 esta foi VH3-23. Para os domínios VL esta foi VKl L12. Sem considerar os resíduos de Vemier (Foote 1992), que foram deixados inalterados, houve 8 mudanças nas regiões de estrutura do domínio VH e 3 mudanças no domínio VL todos os quais foram revertidos para a seqüência da linhagem germinativa indicada pelas técnicas de mutagênese de loco-direcionada usando iniciadores mutagênicos apropriados (Q1E, V5L, Rl 6G, V23A, G24A, H39Q, G83R e R105Q no VH e I15V, A58V e D70E no VL) para formar a IgGi da linhagem germinativa.

2.2 Potência De IgG Da Linhagem germinativa De Anticorpo

1 NO: Ensaio de cAMP LANCE®

As potências da IgG de Anticorpo 1 da linhagem germinativa e precursor (que não da linhagem germinativa), para a inibição da modulação de CXCL13 de ser humano ou cino (derivado de célula MEL) de níveis de cAMP em células CHO Ggi5 hCXCR5, foram comparadas usando o ensaio LANCE® CXCL13 de cAMP como esboçado na seção 1.3. os valores de IC5o são apresentados na tabela 5.

Clones CXCLl 3 de ser humano CXCL13 de Cino

IC50 nM (número n) IC50 nM (número n)

Precursor do Anticorpo 1 1,4 ± 0,5 (n = 10) 0,3 ±0,1 (n = 6)

Anticorpo 1 da linhagem 1,6 ± 0,3 (n = 4) 0,3 ±0,1 (n = 4) germinativa Tabela 5. Potência da IgG de Anticorpo 1 da linhagem germinativa e precursor contra CXCL13 de ser humano ou cinomolgo (IC50 média ± Desvio Padrão, número n) no Ensaio LANCE® CXCL13 de cAMP

A IgG de Anticorpo 1 precursora e da linhagem germinativa mostraram atividades comparáveis neste ensaio.

2.3 Potência da IgG de Anticorpo 1 da linhagem germinativa no ensaio de quimiotaxia usando células B300.19 hCXCR5

As IgGs totais de Anticorpo 1 da linhagem germinativa foram testadas no ensaio de quimiotaxia usando as células B300.19 hCXCR5. As IgGs foram tituladas contra concentrações ED80 de CXCL13 de ser humano não glicosilado e glicosilado e de cino glicosilado. Os resultados estão apresentados na tabela 6 abaixo como valores de IC5o (nM) ± SEM. As IgGs foram testadas pelo menos 3 vezes.

IgG IC50nM±SEM CXCL13 de ser humano CXCLl3 de cino Não glicosilado Glicosilado Glicosilado Anticorpo 1 6,22 ± 0,7 3,94 ± 1,5 4,53 ± 0,6 (da linhagem germinativa) Tabela 6. Exemplo de valores de IC50 (nM) ± SEM para a IgG de Anticorpo 1 da linhagem germinativa no ensaio de quimiotaxia de B300.19 hCXCR5.

2.4 Inibição da liberação de cálcio induzida pela CXCL13 pela IgG de Anticorpo 1 da linhagem germinativa

A potência da IgG de Anticorpo 1 da linhagem germinativa e precursor (que não da linhagem germinativa), foi comparada no ensaio de FLIPR como esboçado na seção 1.5.

NO:me do clone IgG IC50 nM ± SD Precursor do Anticorpo 1 17,1 ± 11,2 (n = 8) Anticorpo 1 da linhagem germinativa 10,4 ±6,3 (n = 7) Tabela 7. Exemplos de potências de IgG no ensaio de liberação de Ca2+ em CHO Gqi5 hCXCR5 c4.4 mediada pela CXCL13 (IC50 Média ± desvio padrão, número n).

2.5 Especificidade de IgG de Anticorpo 1 da linhagem germinativa para CXCL13 de ser humano

A especificidade da IgGj de Anticorpo 1 da linhagem germinativa para CXCL13 de ser humano (derivado de célula MEL) em relação a outros membros da família CXC de quimiocinas foi determinada usando o ELISA CXCL13 (Ensaio imunossorvente ligado à fluorescência). Neste ensaio as quimiocinas CXCL3 (R&D Systems), CXCL5 (R&D Systems), CXCL6 (R&D Systems), CXCL8 (R&D Systems), CXCL10 (R&D Systems) e CXCL12 (Peprotech) foram testadas quanto a competição com CXCL13 de ser humano biotinilada (Almac) imobilizada em uma pérola de estreptavidina para ligar à IgGi de Anticorpo 1 da linhagem germinativa. A interação da ligação de anticorpo de CXCL13 biotinilada de ser humano foi detectada com um anticorpo IgG anti-humano fluorescentemente rotulado usando a Tecnologia de Ensaio de Microvolume de Fluorescência (reportar-se ao “Materiais e Métodos de Ensaio” para detalhes). Os resultados são apresentados na tabela 8. Os nomes da quimiocina padrão (Zlotnik e Yoshie,

2000) são dados juntos com seus sinônimos mais habitualmente usados.

Quimiocina Inibição da ligação de IgGi de Anticorpo 1 da linhagem germinativa ao CXCL13 de ser humano biotinilado IC50 (nM) CXCLl3 Humano 0,2 (derivada de célula MEL) CXCLl3 de Cino 0,8 (derivada de célula MEL) CXCL3 (GROy) > 1 μΜ CXCL5 (ENA-78) > 1 μΜ CXCL6 (GCP-2) > 1 μΜ CXCL8 (IL-8) > 1 μΜ CXCLlO (IPlO) > I CXCL12 (SDF-Ia) > 1 μΜ Tabela 8. Exemplos da inibição da ligação da quimiocina CXCL13 de ser

humano biotinilada à IgGi de Anticorpo 1 da linhagem germinativa (n = 1 apenas dados) A CXCL13 de ser humano e CXCL13 de cinomolgo competiram com CXCL13 de ser humano biotinilada quanto à ligação à IgGi de Anticorpo 1 da linhagem germinativa. Nenhuma das outras quimiocinas testadas mostraram inibição da interação da ligação da IgG de Anticorpo 1 da CXCL13 de ser humano biotinilada até uma concentração de 1 μΜ.

Exemplo 3 a: Afinidade de anticorpos para a CXCL13 de ser humano e de cino

3.1 Determinação da afinidade do anticorpo pelas medições de

BIAcore

IO Determinação de parâmetros de ligação cinéticos foi feita pela

ressonância de plasmon de superfície (SPR) usando o biossensor óptico BIAcore 2000 (BIAcore AB, Upsalla, Suécia) essencialmente como descrito por Karlsson et al, 1991. Ver também a seção Materiais e Métodos de Ensaio. Orientação 1.

A química da ligação de amina padrão foi utilizada para criar

superfícies em branco e 265 RU da Proteína G’ (Sigma P4689) nas células de fluxo (Fe) 1 e 2, respectivamente, de um chip CM5 normalizado (BIAcore, BR-1000-14). Esta superfície de Proteína G’ Fc 2 foi usado para capturar Anticorpo 1 240-385 RUs (da linhagem germinativa IgGi).

Célula de fluxo Ligando Resposta 1 (Fe) (RU ligado) 1 Branco (HBS-EP) n/a 2 Proteína G’ (diluído a 20 μg mL-1 em 10 mM de 265 tampão de acetato pH 4,5) Tabela 9.

As diluições de CXCL13 de ser humano e cinomolgo (em tampão HBS-EP) foram depois fluidas sobre a superfície do chip a uma vazão de 100 μΕ min-1.

Ajustes do modelo de Langmuir 1:1 com limitação de transporte de massa para os dados de Fc 2-1

Condições de ajuste (realizadas no BIAevaluation 3.2): Branco duplo subtraído (célula de fluxo em branco subtraída dos dados de célula de fluxo de IgG e uma injeção em branco (0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005 % v/v de Tensoativo P20, HBS-EP) foi subtraído do resto do conjunto de dados). As contribuições de RI volumoso foram todas ajustadas a zero localmente.

Usando o modelo de Langmuir 1:1 com limitação de transporte de massa, a subtração de HBS-EP e RI ajustado a zero, os seguintes parâmetros foram obtidos, com base nas curvas de CXCL13 de ser humano de

0,25 a 20 nM (10 concentrações).

flVI-1 s-1) kd Rmax Kd Chiz (s-1) (RU) (M) 238 RUs 2,13 e7 6,84 e-4 37,2 3,22 e-11 0,425 Anticorpo 1 (da linhagem germinativa, 385 RUs 1,42 e7 7,15 e-4 58,2 5,04 e-11 0,529 Anticorpo 1 (da linhagem germinativa, 347 RUs 1,76 e7 7,36 e-4 52,9 4,17 e-11 0,690 Anticorpo 1 (da linhagem germinativa, Tabela 10a.

ka kd Kd (M-l s-1) (s-1) (M) Valores médios das 3 experiências 1,77 e7 7,12 e-4 4,14 e-11 Tabela 10b.

Usando o modelo de Langmuir 1:1 com limitação de transporte de massa, subtração de HBS-EP e RI ajustado a zero; os seguinte parâmetros foram obtidos para IgG, com base nas curvas de CXCL13 de cino de 0,125 a 40 nM (concentrações de 12 e 9). _

Ka s-1) Kd Rmax Kd Chi2 (M-l (s-1) (RU) (M) 303 RUs 1,97 e7 6,50 e-4 49,6 3,30 e-11 1,35 Anticorpo 1 (da linhagem germinativa) 296 RUs 2,05 cl 5,99 e-4 47,2 2,91 e-11 0,683 Anticorpo 1 (da linhagem germinativa) Tabela 11. ka kd Kd (M-l s-1) (s-1) (M) Valores médios das 2 experiências 2,01 e7 6,25 e-4 3,11 e-11 Tabela 1 lb.

O ajuste da CXCL13 de cino para o Anticorpo 1 (da linhagem germinativa) fornece um valor Kd muito similar ao CXCL13 de ser humano sugerindo que a afinidade para cada variante é muito similar.

Orientação 2.

A química da ligação de amina padrão foi utilizada para criar superfícies em branco (Fe 1) e 228 e 303 RU de Estreptavidina (Perbio/Pierce 21125) nas células de fluxo (Fe) 2 e 3, respectivamente, de um chip CM5 normalizado (BIAcore, BR-1000-14). Esta superfície de estreptavidina Fc 3 foi usada para capturar 28 RUs de CXCL13 de ser humano biotinilada próximo ao terminal C (síntese feita de encomenda pela Almac).

Diluições de fragmentos Fab monomerizados do Anticorpo 1 pela Cromatografia de Exclusão de Tamanho (diluídos em tampão HBS-EP) foram depois fluídas sobre a superfície do chip a uma razão de fluxo de 30 μΕ min-1.

Ajustes do modelo de Langmuir 1:1 para os dados de Fc 3-1

Condições de ajuste (realizado em BIAevaluation 3.2):

Branco duplo subtraído (célula de fluxo em branco subtraída dos dados de célula de fluxo de IgG e uma injeção em branco (0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005 % v/v de Tensoativo P20, HBS-EP) foi subtraído do resto do conjunto de dados). As contribuições de RI volumoso foram todas ajustadas a zero localmente.

Usando o modelo de Langmuir 1:1 com limitação de transporte de massa, a subtração de HBS-EP e RI ajustado a zero, os seguintes parâmetros foram obtidos, com base nas curvas de Fab de Anticorpo I (IgG1 da linhagem germinativa) de 0,065 a 2,105 nM (6 concentrações). ka kd Rmax Kd Chi2 (M-l s-1) (s-1) (RU) (M) 28 RUs 8,98 e6 1,66 e-3 41,6 1,85 e-10 0,394 CXCLl 3 de ser humano Tabela 13

Exemplo 3b: Afinidade de Anticorpos para CXCL13 de Ser

Humano

Antes dos dados mais compreensivos apresentados no Exemplo 3a, os dados de afinidade inicial (n = 1) foram determinados usando uma disseminação mais baixa de concentrações CXCL-13 como descrito abaixo. Ver também a seção Materiais e Métodos de Ensaio.

3.1b Determinação da afinidade de anticorpo pelas medições

de BIAcore

A determinação dos parâmetros de ligação cinética foi feita

pela ressonância de plasmon de superfície (SPR) usando o biossensor óptico BIAcore 2000 (BIAcore AB, Upsalla, Suécia) essencialmente como descrito por Karlsson et al, 1991.

A química da ligação de amina padrão foi utilizada para criar superfícies do anticorpo 1 em branco (Fe 1) e 500 RU (IgGi da linhagem germinativa) diluídos em 10 mM de tampão de acetato pH 4,5 em um chip CM3 (BIAcore, BR-1005-41).

Célula de fluxo Ligando Resposta 1 Planejado para (Fe) (RU ligado) (RU) 1 Branco(HBS-EP) n/a - 2 Anticorpo 1 (da linhagem 579,9 500 germinativa) Tabela 14.

As diluições de CXCL13 de ser humano e de cinomolgo foram depois fluidas sobre a superfície do chip.

Ajustes de Langmuir para os dados de Fc 2-1 e 3-1 Condições de Ajuste (realizadas no BIAevaluation 3.2):

Branco duplo subtraído (célula de fluxo em branco subtraída dos dados de célula de fluxo de IgG e uma injeção em branco (0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl5 3 mM de EDTA, 0,005 % v/v de Tensoativo P20, HBS-EP) foi subtraído do resto do conjunto de dados). As contribuições de RI volumoso foram todas ajustadas a zero localmente.

Usando o modelo de Langmuir 1:1, a subtração de HBS-EP e

RI ajustado a zero, os seguintes parâmetros foram obtidos, com base nas curvas de CXCL13 de ser humano de 0,10 a 0,60 nM.

ka kd Rmax K-D Chi2 (M-l s-1) (s-1) (RU) (M) 579 RUs linhagem 2,02 e6 5,24 e-4 54,2 2,59 e-10 0,183 Anticorpo 1 (da germinativa) Tabela 15.

Usando o modelo de Langmuir 1:1, a subtração de HBS-EP e RI ajustado a zero; os seguinte parâmetros foram obtidos para cada IgG, com base nas curvas de CXCL13 de 0,10 a 0,60 nM.

ka kd Rmax Kd Chi2 (M-l s-1) (s-1) (RU) (M) 579 RUs 3,63 e6 1,04 e-4 38 2,85 e-10 0,161 Anticorpo 1 (da linhagem germinativa) Tabela 16.

Exemplo 4: Inibição da quimiotaxia induzida CXCL13 de células B primárias

4.1 Inibição da quimiotaxia induzida por CXCL13 de linfócitos primários isolados do baço de um camundongo

Os linfócitos primários foram recém isolados a partir dos baços de camundongos e cultivados durante a noite com LPS. As células foram depois usadas em um ensaio de quimiotaxia estimulado pelo CXCL13 de murino comercialmente disponível (R&D Systems) ou CXCL13 de ser humano (derivado de célula MEL). Os dados IC50 (nM) para IgG de Anticorpo 1 (que não da linhagem germinativa)é apresentado na tabela 12 abaixo (n = 1 e n = 2 apenas dados).

IgG IC50 (nM) CXCL13 de ser humano CXCL13 de camundongo IgG de Anticorpo 1 29,76 (n = 2) [27,3, n=l] Não mensurável (que não da linhagem germinativa) Tabela 12.

Exemplo 5: Ensaio de Quimiotaxia Direcionado à CXCL13 de Célula B Tonsilar Humana

1.4 Inibição da quimiotaxia induzida pela CXCL13 em células B tonsilares humanas

As células B tonsilares primárias foram recém isoladas a partir de tonsilas humanas e cultivadas durante a noite com LPS. As 10 células foram depois usadas em um ensaio de quimiotaxia usando CXCL13 não glicosilado humano (ABL - derivado de célula MEL) a uma concentração de ED80 (100 nM). Para detalhes de método de ensaio, ver a seção “Materiais e Métodos Ensaio”. Os dados de IC50 (nM) para Anticorpo 1 (da linhagem germinativa IgGi) são apresentados na tabela 15 17 (n = 4 dados).

IgG Anticorpo 1 (da linhagem germinativa IgGO IC50 (nM) 9,59+/- 1,6 Tabela 17

Exemplo 6: A ligação de hCXCL13 Nativo para Anticorpo 1 QgG1 da linhagem germinativa) em um ELISA

Como apresentado na seção “Materiais e Métodos de Ensaio”, o Anticorpo I (IgGi da linhagem germinativa) liga-se tanto à CXCL13 nativa quanto à CXCL13 recombinante com concentrações equivalentes de ligandos dando um sinal equivalente no ensaio.

Exemplo ]\ Perturbação da taxa de troca H/D de CXCL-13 pelo Anticorpo I (IgG1 da linhagem germinativa)

No primeiro experimento CXCL13 foi trocado por D2O em solução e depois ligado ao anticorpo I (IgGl) imobilizado em uma coluna. O mesmo foi depois trocado em H2O enquanto ainda ligado à coluna de anticorpo, resultando no epítopo sendo protegido durante a reação de retro troca e consequentemente rotulado com deuterons. NO:

segundo experimento a CXCL13 foi primeiro ligada ao Anticorpo 1 na coluna, depois rotulada com D20 e finalmente trocada de volta em H2O enquanto ainda ligada à coluna, tal que nenhuma parte da CXCL13 fosse rotulado com deuterons. A diferença nas massas de peptídeos entre as duas experiências foi depois determinada. A diferença nos níveis de

deuteração entre as duas experiências é uma medida do retardo da troca quando ligado ao anticorpo. Um método detalhado para este protocolo é fornecido na seção Materiais e Métodos.

A CXCL13 de ser humano expressada em células MEL foi usada neste estudo com a seqüência apresentada na SEQID NO: 14.

A região que mostrou a maior perturbação na taxa de troca

H/D foi entre os aminoácidos 31 a 42 da CXCL-13 humana (SEQ ID NO: 20).

NO: pH 7 a taxa de troca é muito rápida através de quase toda a molécula na ausência de anticorpo sugerindo uma estrutura muito flexível.

A troca foi tomada menos ativa através do núcleo central da molécula quando ligada ao anticorpo. Isto sugere que provavelmente existam outros sítios de interação com ligação mais fraca além do principal de 31 a 42.

A Tabela 18 mostra a diferença em porcentagem nos níveis de deuteração comparando a deuteração e mudança de volta para prótons

quando ligados ao Anticorpo 1 com deuteração em solução e troca de volta para prótons quando ligado ao anticorpo. As diferenças de mais do que 10 % quando calculadas em média os quatro pontos de tempo foram considerados ser significantes. A numeração de resíduo é com a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 14. Número do resíduo Ponto(s; I de tempo início fim 150 500 1500 5000 3 5 4 3 -3 1 3 6 4 2 1 -1 6 9 4 -1 -5 -4 7 9 4 3 -2 -2 16 RO 25 13 2 -5 21 24 5 6 11 6 21 28 6 16 25 20 23 28 11 18 27 19 31 42 29 28 19 14 33 42 31 30 31 16 45 53 24 11 15 6 45 54 24 15 11 6 56 61 11 21 30 24 57 61 10 23 31 22 63 65 24 12 -5 -4 64 67 30 11 -4 -3 68 69 48 23 2 -2 68 82 13 3 -5 -5 70 82 3 1 -5 -4 78 82 11 5 -5 -5 Tabela 18 Referências Todas as referências citadas em qualquer lugar neste relatório descritivo, incluindo aquelas citadas em qualquer lugar acima, são aqui incorporadas por referência na sua totalidade e para todos os propósitos.

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<150> US60/908,041 <151> 2007-03-26

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticorpol <4 00> 1

gaggtgcagc tgctggagtc tgggggaggc ttggtgcagc caggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttggt aattcttgga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg agctgaggac acggctgtgt attactgtac gagagatctt 300 ccgggtatag cagtggctgg ttactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcgagt 357

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticorpol <400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn Ser 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Arg Asp Leu Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 3 <211> 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Anticorpol <400> 3

Asn Ser Trp Met Ser 1 5

<210> 4 <211> 17 <212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Anticorpol <400> 4

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 10 15

Gly

<210> 5 <211> 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Antieorpol <400> 5

Asp Leu Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Tyr I 5 10

<210> 6

<211> 324

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticorpol <400> 6

gacacccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 atcacctgcc gggccagtga gggtatttat cactggttgg cctggtatca gcagaagcca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcctctagtt tagccagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacaa tatagtaatt atccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagc tggagatcaa acgt 324 <210> 7 <211> 108 <212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Anticorpol <400> 7

Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticorpol <400> 8

Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 9 <211> 7 <212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Anticorpol <400> 9

Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser 1 5

<210> 10 <211> 9 <212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Anticorpol <4 00> 10

Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 11 <211> 242 <212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Seqüência de aminoácido scFv do Anticorpo I (VH seguido por VL com seqüência ligadora)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn Ser 20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg His Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Arg Asp Leu Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Tyr Trp Gly Arg Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr 130 135 140

Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 145 150 155 160

Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 165 170 175

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala 180 185 190

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 195 200 205

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 215 220

Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240

Lys Arg

<210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<223> Seqüência de aminoácido CXCL13 humano de comprimento total <4 00> 12

Met Lys Phe Ile Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser 10 15

Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg 20 25 30

Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile 35 40 45

Asp Arg Ile Gln Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu 50 55 60

Ile Ile Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln 65 70 75 80

Ala Glu Trp Ile Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser 85 90 95

Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro 100 105

<210> 13 <211> 87 <212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Seqüência de aminoácido CXCL13 humano maduro <4 00> 13

Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu 10 15

Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Leu 20 25 30

Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys 35 40 45

Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg 50 55 60 Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser Ser Thr Leu Pro Val Pro 65 70 75 80

Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro 85

<210> 14 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens

<2 20>

<223> Seqüência de aminoácido CXCL13 humano maduro com truncamento C terminal

<4 00> 14

Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu 10 15

Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Leu 20 25 30

Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys 35 40 45

Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg 50 55 60

Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser Ser Thr Leu Pro Val Pro 65 70 75 80

Val Phe

<210> 15 <211> 87 <212> PRT

<213> Macaca fascicularis <220>

<223> Seqüência de aminoácido CXCL13 de cinomolgo maduro <400> 15

Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr His Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu 10 15

Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Ser 20 25 30

Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys 35 40 45 Asn Lys Ser Val Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg 50 55 60

Ile Met Glu Met Leu Arg Lys Lys Ser Ser Ser Thr Pro Pro Val Pro 65 70 75 80

Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro 85

<210> 16 <211> 82 <212> PRT

<213> Macaca fascicularis <220>

<223> Seqüência de aminoácido CXCL13 de cinomolgo maduro com truncamento C terminal

<400> 16

Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr His Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu 10 15

Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Ser 20 25 30

Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys 35 40 45

Asn Lys Ser Val Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg 50 55 60

Ile Met Glu Met Leu Arg Lys Lys Ser Ser Ser Thr Pro Pro Val Pro 65 70 75 80

Val Phe

<210> 17 <211> 372 <212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Seqüência de aminoácido de isoforma 1 CXCR5 humano <4 00> 17

Met Asn Tyr Pro Leu Thr Leu Glu Met Asp Leu Glu Asn Leu Glu Asp 10 15 Leu Phe Trp Glu Leu Asp Arg Leu Asp Asn Tyr Asn Asp Thr Ser Leu 20 25 30

Val Glu Asn His Leu Cys Pro Ala Thr Glu Gly Pro Leu Met Ala Ser 35 40 45

Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val Ala Tyr Ser Leu Ile Phe Leu Leu 50 55 60

Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val Leu Val Ile Leu Glu Arg His Arg 65 70 75 80

Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr Phe Leu Phe His Leu Ala Val Ala 85 90 95

Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile Leu Pro Phe Ala Val Ala Glu Gly Ser 100 105 110

Val Gly Trp Val Leu Gly Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val Ile Ala Leu 115 120 125

His Lys Val Asn Phe Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala 130 135 140

Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala Tyr Arg His 145 150 155 160

Arg Arg Leu Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile Trp Leu Val 165 170 175

Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys Val Ser Gln 180 185 190

Gly His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gln Glu Asn 195 200 205

Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr His Val 210 215 220

Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr Val Gly 225 230 235 240

Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln Arg Gln Lys 245 250 255

Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe Leu Cys Trp 260 265 270 Ser Pro Tyr His He Val Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala Arg Leu Lys 275 280 285

Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly Ser Leu Pro Val Ala Ile 290 295 300

Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys Leu Asn Pro Met 305 310 315 320

Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg Ser Asp Leu Ser Arg Leu 325 330 335

Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln Leu Phe 340 345 350

Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser 355 360 365

Leu Thr Thr Phe 370

<210> 18

<211> 327

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Seqüência de aminoácido de isoforma 2 CXCR5 humano <400> 18

Met Ala Ser Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val Ala Tyr Ser Leu Ile 10 15

Phe Leu Leu Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val Leu Val Ile Leu Glu 20 25 30

Arg His Arg Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr Phe Leu Phe His Leu 35 40 45

Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile Leu Pro Phe Ala Val Ala 50 55 60

Glu Gly Ser Val Gly Trp Val Leu Gly Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val 65 70 75 80

Ile Ala Leu His Lys Val Asn Phe Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala 85 90 95 Cys Ile Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala 100 105 HO

Tyr Arg His Arg Arg Leu Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile 115 120 125

Trp Leu Val Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys 130 135 140

Val Ser Gln Gly His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser 145 150 155 160

Gln Glu Asn Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu 165 170 175

Tyr His Val Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys 180 185 190

Tyr Val Gly Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln 195 200 205

Arg Gln Lys Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe 210 215 220

Leu Cys Trp Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala 225 230 235 240

Arg Leu Lys Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly Ser Leu Pro 245 250 255

Val Ala Ile Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys Leu 260 265 270

Asn Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg Ser Asp Leu 275 280 285

Ser Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro Ala Ser Leu Cys 290 295 300

Gln Leu Phe Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn 305 310 315 320

Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe 325

<210> 19 <211> 353 <212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Seqüência de aminoácido Gqi5 de proteína G <4 00> 19

Met Ala Cys Cys Leu Ser Glu Glu Ala Lys Glu Ala Arg Arg Ile Asn 10 15

Asp Glu Ile Glu Arg Gln Leu Arg Arg Asp Lys Arg Asp Ala Arg Arg 20 25 30

Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Gly Thr Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr 35 40 45

Phe Ile Lys Gln Met Arg Ile Ile His Gly Ser Gly Tyr Ser Asp Glu 50 55 60

Asp Lys Arg Gly Phe Thr Lys Leu Val Tyr Gln Asn Ile Phe Thr Ala 65 70 75 80

Met Gln Ala Met Ile Arg Ala Met Asp Thr Leu Lys Ile Pro Tyr Lys 85 90 95

Tyr Glu His Asn Lys Ala His Ala Gln Leu Val Arg Glu Val Asp Val 100 105 110

Glu Lys Val Ser Ala Phe Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Ile Lys Ser 115 120 125

Leu Trp Asn Asp Pro Gly Ile Gln Glu Cys Tyr Asp Arg Arg Arg Glu 130 135 140

Tyr Gln Leu Ser Asp Ser Thr Lys Tyr Tyr Leu Asn Asp Leu Asp Arg 145 150 155 160

Val Ala Asp Pro Ser Tyr Leu Pro Thr Gln Gln Asp Val Leu Arg Val 165 170 175

Arg Val Pro Thr Thr Gly Ile Ile Glu Tyr Pro Phe Asp Leu Gln Ser 180 185 190

Val Ile Phe Arg Met Val Asp Val Gly Gly Gln Arg Ser Glu Arg Arg 195 200 205

Lys Trp Ile His Cys Phe Glu Asn Val Thr Ser Ile Met Phe Leu Val 210 215 220 Ala Leu Ser Glu Tyr Asp Gln Val Leu Val Glu Ser Asp Asn Glu Asn 225 230 235 240

Arg Met Glu Glu Ser Lys Ala Leu Phe Arg Thr Ile Ile Thr Tyr Pro 245 250 255

Trp Phe Gln Asn Ser Ser Val Ile Leu Phe Leu Asn Lys Lys Asp Leu 260 265 270

Leu Glu Glu Lys Ile Met Tyr Ser His Leu Val Asp Tyr Phe Pro Glu 275 280 285

Tyr Asp Gly Pro Gln Arg Asp Ala Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Leu 290 295 300

Lys Met Phe Val Asp Leu Asn Pro Asp Ser Asp Lys Ile Ile Tyr Ser 305 310 315 320

His Phe Thr Cys Ala Thr Asp Thr Glu Asn Ile Arg Phe Val Phe Ala 325 330 335

Ala Val Lys Asp Thr Ile Leu Gln Leu Asn Leu Lys Asp Gly Gly Leu 340 345 350

Phe

<210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<223> Peptideo CXCL-13 humano <400> 20

Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu 1 5 10

Claims (66)

1. Membro de ligação isolado para CXCL13, caracterizado pelo fato de que o membro de ligação inibe a ligação de CXCL13 ao CXCR5, e em que o membro de ligação compete para ligar ao CXCL13 com uma molécula de anticorpo scFv tendo uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 11.

2. Membro de ligação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o membro de ligação compreende uma seqüência de aminoácidos HCDR3 SEQ ID NO: 5.

3. Membro de ligação isolado de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende um conjunto de anticorpos I CDRs: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDRl5 LCDR2 e LCDR3, definidos em que: HCDRl tem uma seqüência de aminoácidos SEQID NO: 3; HCDR2 tem seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 4; HCDR3 tem uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 5; LCDRl tem uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 8; LCDR2 tem uma seqüência de aminoácidos SEQID NO: 9; e LCDR3 tem uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 10; ou que compreende o conjunto de anticorpo 1 das CDRs com uma ou mais substituições, exclusões ou inserções de aminoácidos.

4. Membro de ligação isolado para CXCL13, caracterizado pelo fato de que o membro de ligação inibe a ligação de CXCL13 ao CXCR5 e em que o membro de ligação compreende um conjunto de anticorpo 1 das CDRs: HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDRl, LCDR2 e LCDR3, definido em que: HCDRl tem uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 3; HCDR2 tem uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 4; HCDR3 tem uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 5; LCDRl tem uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 8; LCDR2 tem uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 9; e LCDR3 tem uma seqüência de aminoácidos SEQID NO: 10; ou compreende o conjunto de anticorpo 1 das CDRs com uma ou mais substituições, exclusões ou inserções de aminoácidos.

5. Membro de ligação de acordo com a reivindicação 3 ou reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende o conjunto de anticorpo 1 das CDRs ou que compreende o conjunto de anticorpo 1 das CDRs com 1 ou 2 substituições.

6. Membro de ligação de acordo com a reivindicação 3 ou 4 caracterizado pelo fato de que compreende o conjunto de anticorpo 1 das CDRs.

7. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o membro de ligação compreende uma molécula de anticorpos que compreende um domínio de anticorpos VH e um domínio de anticorpos VL, em que a molécula de anticorpos compreende um conjunto de CDRs: HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDRl, LCDR2 e LCDR3, em que o domínio VH compreende HCDRl, HCDR2, HCDR3 e uma estrutura e o domínio VL compreende LCDRl, LCDR2, LCDR3 e uma estrutura.

8. Membro de ligação de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpos é um scFv.

9. Membro de ligação de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpos compreende uma região de anticorpos constante.

10. Membro de ligação de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpos é um IgGl.

11. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpos compreende as regiões estruturais de seqüências de segmento de gene da linhagem germinativa humana.

12. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 11, caracterizado pelo fato de que o domínio de anticorpos VH compreende uma estrutura VH3-23 da linhagem germinativa humana.

13. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 12, caracterizado pelo fato de que o domínio de anticorpos VH tem uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de igualdade de seqüência com a SEQ ID NO: 2.

14. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 11, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domínio de anticorpos VH é a SEQ ID NO: 2.

15. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 11 a 14, caracterizado pelo fato de que o domínio de anticorpos VL compreende a estrutura de linhagem germinativa humana VKl L12.

16. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 11 a 15, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpos compreende um domínio VL tendo uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 90 % de igualdade de seqüência com a SEQ ID NO: 7.

17. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 11 a 14, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domínio VL é a SEQID NO: 7.

18. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domínio de anticorpos VH é a SEQ ID NO: 2; e a seqüência de aminoácidos do domínio de anticorpos VL é a SEQ ID NO: 7.

19. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a potência do membro de ligação para neutralizar a ligação de CXCL13 humano ao CXCR5 se difere em não mais do que 10 vezes da potência do membro de ligação para neutralizar CXCL13 cinomolgo que liga ao CXCR5, em que a potência do membro de ligação para neutralizar a ligação de CXCL13 humano ao CXCR5 é representada por IC5o como medido em um ensaio de cAMP com uma concentração de CXCL13 humano de não mais do que 2 nM, e em que a potência do membro de ligação para neutralizar a ligação de CXCL13 cinomolgo ao CXCR5 é representada pelo IC50 como medido em um ensaio de cAMP com uma concentração final de 2 nM de CXCL13 cinomolgo.

20. Membro de ligação de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a potência para neutralizar a ligação de CXCL13 humano que liga ao CXCR5 se difere em não mais do que 5 vezes da potência para neutralizar a ligação de CXCL13 cinomolgo ao CXCR5.

21. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o membro de ligação tem um IC50 de não mais do que 12 nM como medido em um ensaio de cAMP de CXCL13 humano com uma concentração final de 2 nM de CXCLl 3.

22. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o membro de ligação tem um IC50 de não mais do que 40 nM como medido em um ensaio de liberação de cálcio de CXCL13 humano com uma concentração final de IOOnMde CXCL13.

23. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o membro de ligação tem um IC50 de não mais do que 12 nM em um ensaio de quimiotaxia da célula B de CXCL13 humano com uma concentração final de CXCL13 humano que fornece uma resposta de aproximadamente ED80 , e uma linha de células B não primárias.

24. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o membro de ligação liga ao CXCL13 humano com uma afinidade menor do que 400 pM como medido usando a ressonância de plasmon de superfície.

25. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o membro de ligação liga ao CXCL13 cinomolgo com uma afinidade menor do que 400 pM como medido usando ressonância de plasmon de superfície.

26. Membro de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o membro de ligação liga a um epítopo de CXCL-13 humano e em que o dito epítopo inclui pelo menos um resíduo da seqüência Ile-Leu-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Cys-Pro- Arg-Lys-Glu (SEQ ID NO: 20) nas posições de 31 a 42 do IL-17A humano maduro.

27. Domínio VH isolado, caracterizado pelo fato de ser de uma molécula de anticorpos como definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 26.

28. Domínio VL isolado, caracterizado pelo fato de ser de uma molécula de anticorpos como definidos em qualquer uma das reivindicações de 7 a 26.

29. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um membro de ligação isolado como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 26 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

30. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um membro de ligação isolado como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 26 para o uso em um método de tratamento do corpo humano ou animal através da cirurgia ou terapia.

31. Composição de acordo com a reivindicação 30 caracterizada pelo fato de que é para o uso na inibição da ligação de CXCL13 ao CXCR5.

32. Uso de um membro de ligação isolado como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 26, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para inibir a ligação de CXCL13 ao CXCR5.

33. Composição de acordo com a reivindicação 31 ou uso acordo com a reivindicação 32, caracterizados pelo fato de que são para o uso na inibição da formação e/ou desenvolvimento anômalos dos folículos linfóides.

34. Composição de acordo com a reivindicação 31 ou uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizados pelo fato de que são para o uso na inibição, destruição e/ou remodelação dos ossos e/ou cartilagem.

35. Composição de acordo com a reivindicação 31 ou uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizados pelo fato de que são para o uso na inibição da quimiotaxia dos linfócitos e/ou proliferação dos linfomas.

36. Composição de acordo com a reivindicação 31 ou uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizados pelo fato de que são para o uso no tratamento da artrite reumatóide, osteoartrite, síndrome de Sjogrens, esclerose múltipla, miastenia grave, eritematose de lupus sistêmico, doença da tireóide autoimune, Neuroborreliose de Lyme, infecção por HTV e/ou leucemia.

37. Composição de acordo com a reivindicação 31 ou uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizados pelo fato de que são para o tratamento da artrite reumatóide.

38. Método para tratar um distúrbio associado com a expressão de CXCL13 e/ou atividade de CXCL13 anômalas em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um membro de ligação como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 26 ao indivíduo.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a atividade de CXCL13 está ligando ao CXCR5.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que compreende inibir a formação e/ou desenvolvimento anômalos de folículos linfóides no indivíduo.

41. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que compreende inibir a destruição e/ou remodelação dos ossos e/ou cartilagem no indivíduo.

42. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que compreende inibir a quimiotaxia dos linfócitos e/ou proliferação de linfomas no indivíduo.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 38 a 39, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é artrite reumatóide, osteoartrite, síndrome de Sjogren, esclerose múltipla, miastenia grave, eritematose de lupus sistêmico, doença da tireóide autoimune, Neuroborreliose de Lyme, infecção por HTV e/ou leucemia.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é artrite reumatóide.

45. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica um membro de ligação, ou um domínio VH ou VL isolado de um membro de ligação, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 28.

46. Célula hospedeira in vitro, caracterizada pelo fato de que é transformada com ácido nucleico como definido na reivindicação 45.

47. Método para produzir um membro de ligação ou um domínio de anticorpos VH ou VL, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar as células hospedeiras como definidas na reivindicação 46 sob condições para a produção do membro de ligação ou domínios de anticorpos VH ou VL.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente isolar e/ou purificar o membro de ligação, domínio VH ou domínio VL.

49. Método de acordo com a reivindicação 47 ou reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente formular o membro de ligação, domínio VH ou domínio VL em uma composição que compreende pelo menos um componente adicional.

50. Método para produzir um domínio que liga ao antígeno do anticorpo para CXCLl3, caracterizado pelo fato de que o que compreende: fornecer, por via de adição, exclusão, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos na seqüência de aminoácidos de um domínio VH de origem que compreende HCDRl, HCDR2 e HCDR3, em que os domínios VH HCDRl, HCDR2 e HCDR3 de origem são um conjunto de anticorpos 1 HCDR, um domínio VH que é uma variante da seqüência de aminoácidos do domínio VH de origem, e opcionalmente combinar o domínio VH deste modo fornecido com um ou mais domínios VL para fornecer uma ou mais combinações de VH/VL; e testar o dito domínio VH que é uma variante da seqüência de aminoácidos do domínio VH de origem ou a combinação ou combinações de VH/VL para identificar um domínio que liga ao antígeno do anticorpo para CXCL13.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o domínio VH de origem é um domínio VH de acordo com a reivindicação 27.

52. Método de acordo com a reivindicação 50 ou reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o dito um ou mais domínios VL é fornecido por intermédio da adição, exclusão, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos na seqüência de aminoácidos de um domínio VL de origem que compreende LCDRl, LCDR2 e LCDR3, em que os domínios VL LCDRl, LCDR2 e LCDR3 de origem são um conjunto de anticorpos I de CDR VL5 produzindo um ou mais domínios VL cada um o qual é uma variante da seqüência de aminoácidos do domínio VL de origem.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o domínio VL de origem é um domínio VL de acordo com a reivindicação 28.

54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 50 a 53, caracterizado pelo fato de que o dito domínio VH que é uma variante da seqüência de aminoácidos do domínio VH de origem é fornecido pela mutagênese de CDR.

55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 50 a 53, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente produzir o domínio que liga ao antígeno dos anticorpos como um componente das molécula de anticorpos IgG, scFv ou Fab.

56. Método para produzir um membro de ligação que liga ao CXCLl3, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer o ácido nucleico de partida que codifica um domínio VH ou um repertório de partida de ácidos nucleicos cada um dos quais codifica um domínio VH, em que o domínio VH ou domínios VH cada um compreende um HCDRl, HCDR2 e/ou HCDR3 a ser substituído ou carece de uma região que codifica HCDRl, HCDR2 e/ou HCDR3; combinar o dito ácido nucleico ou repertório de partida com a codificação do doador de ácido nucleico ou doadores de ácidos nucleicos ou produzidos pela mutação da seqüência de aminoácidos de um HCDRl, HCDR2, e/ou HCDR3 do anticorpo 1, tal que o dito ácido nucleico doador ou ácidos nucleicos doadores são inseridos na região CDRl, CDR2 e/ou CDR3 no ácido nucleico de partida ou repertório de partida, de modo a fornecer um repertório de ácidos nucleicos que codificam os domínios VH do produto; expressar os ácidos nucleicos do dito repertório do produto para produzir os domínios VH do produto; opcionalmente combinar os ditos domínios VH do produto com um ou mais domínios VL; selecionar um membro de ligação para CXCLl3, cujo membro de ligação compreende um domínio VH do produto e opcionalmente um domínio VL; e recuperar o dito membro de ligação ou ácido nucleico que o codifica.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que os ácidos nucleicos doadores são produzidos pela mutação dos ditos HCDRl e/ou HCDR2.

58. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico doador é produzido pela mutação de HCDR3.

59. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que compreende fornecer o ácido nucleico doador pela mutação aleatória do ácido nucleico.

60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 56 a 59, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente ligar um domínio VH do produto que é compreendido dentro do membro de ligação recuperado a uma região de anticorpos constante.

61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 56 a 60, caracterizado pelo fato de que compreende fornecer uma molécula de anticorpos IgG, scFv ou Fab que compreende o domínio VH e o domínio VL do produto.

62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 50 a 61, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente testar o domínio que liga ao antígeno dos anticorpos ou membro de ligação que liga ao CXCL13 quanto a capacidade de neutralizar o CXCLl3.

63. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que um membro de ligação que compreende uma molécula de anticorpos que liga ao e neutraliza o CXCL13 é obtida.

64. Método de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpos é um scFv.

65. Método de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpos é um IgG.

66. Método para produzir uma composição de molécula de anticorpos, caracterizado pelo fato de que compreende obter uma molécula de anticorpos usando um método como definido em qualquer uma das reivindicações de 50 a 65, e formular a molécula de anticorpos em uma composição que compreende pelo menos um componente adicional.