BRPI0807661A2

BRPI0807661A2 - Microorganismo modificado

Info

Publication number: BRPI0807661A2
Application number: BRPI0807661-8A
Authority: BR
Inventors: Katsutoshi Ara; Hiroshi Kakeshita; Kouji Nakamura
Original assignee: Kao Corp
Priority date: 2007-04-02
Filing date: 2008-04-01
Publication date: 2014-05-20
Also published as: WO2008123622A1; EP2129782B1; AU2008235712A1; DK2129782T3; EP2129782A1; JP5294673B2; US20100093032A1; CN101631862B; US8236524B2; AU2008235712B2; CN101631862A; JP2008271956A

Description

“MICROORGANISMO MODIFICADO” Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um microorganismo usado para a produção de uma proteína ou polipeptídeo útil, e a um método de produção de tal proteína ou polipeptí- deo.

Antecedentes da Invenção

Microrganismos são usados para a produção industrial de várias substâncias úteis, as quais incluem alimentos como bebidas alcoólicas, miso e molho de soja, e também ami- noácidos, ácidos orgânicos, substâncias relacionadas com ácidos nucleicos, antibióticos, sacarídeos, lipídeos e proteínas. Essas substâncias têm uma vasta faixa de aplicação, tal como em alimentos, medicamentos, detergentes, cosméticos e outros itens de uso diário, e como matérias-primas para vários produtos químicos.

Dentre os microorganismos, bactérias gram-positivas como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, e Bacillus megaterium têm uma grande capacidade de secretar uma variedade de exoenzimas tais como amilases, proteases e lipases.

De fato, muitas exoenzimas produzidas por bacilos estão presentemente no uso industrial. A produção de certas proteínas por bactérias como secreções é útil, por exemplo, pelo fato de que a proteína secretada normalmente tem a sua estrutura natural, e pela facilidade com a qual a proteína secretada pode ser purificada. Consequentemente, é muito significativo melhorar tais cepas bacterianas par aaumentar a quantidade de uma dada proteína secretória eliminada e produzida.

Muitas das proteínas localizadas na membrana externa e no espaço periplásmico dos procariotos passaram pela membrana citoplasmática mediado por um mecanismo de translocação Sec. Um canal transmembranar feito de um complexo proteico de membrana heterotrimérico consistindo de SecY/SecE/SecG e de um Sec A dimérico perifericamente ligado, fracamente ligado a um complexo proteico de membrana heterotrimérica SecD/SecF/YajD é criado, e a proteína é translocada pela membrana com a ajuda de ener- gia da hidrólise de ATP por SecA. Sabe-se que se a bactéria for Escherichia coli, a proteína pré-secretória é reconhecida pelo acompanhante molecular SecB, e passado no SecA na superfície da membrana citoplasmática. O fator homólogo com o acompanhante molecular SecB não foi ainda identificado em Bacillus subtilis, nas acredita-se que o Bacillus subtilis tenha um SRP (sinal de reconhecimento de partícula), caracteristicamente envolvido na translocação pela membrana do retículo endoplasmático de eucariotos, e que a proteína secretória é conduzida do SRP para o SecA. Foi demonstrado que SEcA e Bacillus subtilis consiste de dois domínios, o domínio Neo domínio C, que o domínio N tem um sítio de li- gação ao ATP I (ABS I) e um sítio de ligação de peptídeo de sinal, que o domínio C tem sí- tios que participam na dimerização SecA e interação com SecY, e uma região homóloga com o sítio de ligação SecB de Escherichia coli, e que um sítio de ligação ATP Il (ABS II) está presente de modo que se alinhe com os dois domínios.

Até agora, as modificações genéticas, tais como anulação de uma protease (Documento Não-Patente 1), intensificação da produção de PrsA (Documento Não-Patente 2), superexpressão de SecD/SecE/SecDF (Documento Patente 1), e superexpressão de SecG (Documento Patente 2) foram reportadas como técnicas para aumentar a produção secretória das proteínas.

Entretanto, não há relatos de anulação de alguns dos resíduos de aminoácidos de SecA para aumentar a produção secretória das proteínas.

[Documento Não-Patente 1] Olmos-Soto J, Contreras-Flores R. Genetic system

constructed to overproduce and secrete proinsulin in Bacillus subtilis. Appl. Microbiol. Biote- chnol. Setembro de 2003; 62(4):369-73.

[Documento Não-Patente 2] Vitikainen M, Hyyrylainen HL, Kivimaki A, Kontinen VP, Sarvas M. Secretion of heterologous proteins in Bacillus subtilis can be improved by engineering cell components affecting post-translocational protein folding and degradation. J Appl Microbiol. 2005; 99(2):363-75.

[Documento Patente 1] WO 99/04007

[Documento Patente 2] WO 99/04006

Descoberta da Invenção A presente invenção apresenta os seguintes aspectos 1) a 3).

1) Um microorganismo geneticamente modificado para anular de 60 a 80 aminoáci- dos carboxiterminais de secA;

2) Um microorganismo recombinante construído pela introdução de um gene codifi- cando uma proteína ou polipeptídeo heterólogo em uma cepa do microorganismo modifica-

do; e

3) Um método de produção de uma proteína ou polipeptídeo usando o microorga- nismo recombinante.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1a é uma ilustração da estrutura genômica ao redor do local do gene secA das cepas SAN819 e SAN780;

Figura 1b é um padrão de eletroforese que confirma os tamanhos de SecA expres- so nas cepas SAN819 e SAN780;

Figura 2a é uma ilustração do método de construção de um vetor de expressão do interferon;

Figura 2b é uma ilustração da estrutura da proteína de fusão do peptídeo de sinal

AmyE da amilase de Bacillus subtilis, e a seqüência pró, e da região madura de interferon α introduzida no vetor de expressão do interferon Phkk3201; Figura 3a é uma ilustração do resultado da detecção, por Western blotting, do inter- feron a produzido depois da introdução de pHKK3201 nas cepas hospedeiras SAN780 e SAN819; Raia 1: quando a cepa de origem 168 foi a hospedeira. Raia 2: quando a cepa ASN780 foi a hospedeira. Raia 3: quando a cepa ASN819 foi a hospedeira.

Figura 3b é uma representação gráfica dos resultados do experimento da Figura 3a;

as quantidades de proteína de IFN alfa relativas foram comparadas com base nas intensi- dades de banda nos Western blots. A quantidade de IFN α na cepa do tipo selvagem foi estabelecida como sendo 100%, as barras de erro representam os desvios padrões; e

Figura 4 é uma ilustração do resultado da detecção, por Western blotting, do interfe- ron-β produzido depois da introdução de pHKK3202 nas cepas hospedeiras SAN780 e SAN819; Raia 1: quando a cepa de origem 168 foi a hospedeira. Raia 2: quando a cepa ASN780 foi a hospedeira. Raia 3: quando a cepa ASN819 foi a hospedeira.

Melhor Forma de Executar a Invenção

A presente invenção se refere ao fornecimento e um microorganismo com produção secretória intensificada de uma proteína ou polipeptídeo, e a um método de produção da proteína ou polipeptídeo usando o microorganismo.

Os presentes inventores examinaram os constituintes do mecanismo de transloca- ção da proteína secretória em bacilos, e descobriram que a capacidade de produção secre- tória melhorou quando o gene foi modificado para eliminar de 20 a 30 ou de 60 a 80, espe- cialmente de 60 a 80 aminoácidos carbóxi terminais de SecA, e que tais microorganismos geneticamente modificados são úteis na produção de proteínas e polipeptídeos.

SecA é um fator envolvido na secreção de proteínas secretórias para fora da célula bacteriana. Quando SecA é eliminado, não somente a produção da proteína é reduzida, mas a própria célula também morre. Consequentemente, SecA é considerado como sendo um 25 fator essencial do mecanismo de secreção. Deste modo, a descoberta de que a capacidade de produção secretória de proteína pela bactéria melhorou quando alguns dos resíduos de aminoácidos de SecA foram eliminados foi bastante inesperada.

A proteína ou polipeptídeo alvo pode ser produzido eficientemente pelo uso do mi- croorganismo modificado da presente invenção, e a proteína ou polipeptídeo pode ser facil- mente recuperado do fluido de cultura. Consequentemente, a presente invenção é útil para a produção industrial da proteína ou polipeptídeo alvo.

Na presente invenção, o método de Lipman-Pearson (Science, 227, 1435 (1985)) foi usado para determinar a identidade das seqüências de aminoácidos e as seqüências de base. Para ser mais específico, o programa de busca de homologia do software de proces- sarnento de informação genética Genetyx-Win (Software Development) é usado e a análise é efetuada considerando o parâmetro do Tamanho Unitário para Comparação (ktup) como

2, para computar a homologia. O microorganismo (microorganismo hospedeiro) da presente invenção pode ser uma bactéria gram-positiva ou uma gram-negativa, contanto que ela tenha um gene que codifique SecA, porém bactérias gram-positivas são preferíveis, uma vez que elas têm a capacidade de produzir proteínas extracelularmente por secreção. Dentre elas, os bacilos são preferidos, e Bacillus subtilis é particularmente preferido, uma vez que a sua informação genética total é disponível, e a engenharia genética e as técnicas de engenharia genética foram muito bem estabelecidas.

No microorganismo modificado da presente invenção, o gene alvo para a modifica- ção é o gene codificando secA.

SEcA é um dos fatores (proteínas) envolvidas nas vias de transporte de proteínas em bactérias. Ele tem a função de secretar a proteína secretória para fora das células bacte- rianas juntamente com o canal transmembranar (SecY/SecE/SecG). SecA de Bacillus subtilis (841 aminoácidos, peso molecular de 95,3 KDa) consiste de dois domínios, o domí- nio N e o domínio C. O domínio N tem o sítio de ligação ao ATP I (ABS I), e um sítio de liga- ção de peptídeo de sinal. O domínio C tem sítios que participam na dimerização de SecA e interação com SecY, e uma região homóloga com o sítio de ligação de SecB de Eseheriehia eoli, e um sítio de ligação ao ATP Il (ABS II) é conhecido por estar presente de modo que alinhe os dois domínios.

SecA de Bacillus subtilis e proteínas funcionalmente equivalentes a ele podem ser listadas como exemplos de SecA adequados para modificação na presente invenção, e ge- nes codificando SecA de Bacillus subtilis ou proteínas funcionalmente equivalentes a ele podem ser listadas como exemplos de genes codificando SecA.

Mais especificamente, “SecA de Bacillus subtilis ou proteínas funcionalmente equi- valentes a ele” significa uma proteína descrita em (A) a (C) abaixo.

(A) Uma proteína com uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID

NO: 2;

(B) Uma proteína com uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 com eliminação, substituição ou adição de um ou de alguns aminoácidos, e ainda com as mesmas funções que SecA; e

(C) uma proteína com uma seqüência de aminoácidos com 80% ou mais de identi- dade com a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, e ainda com as mesmas funções que o SecA.

Aqui, “seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 com eliminação, substituição ou adição de um ou mais aminoácidos” inclui seqüências de aminoácidos com eliminação, substituição ou adição de um ou de alguns, preferivelmente de 1 a 10 aminoáci- dos, e “adição” aqui inclui a adição de 1 a alguns aminoácidos em alguns dos terminais.

Aqui, “seqüência de aminoácidos com 80% ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2” é preferivelmente uma seqüência de ami- noácidos com 90% ou mais de identidade, mais preferivelmente 95% ou mais de identidade, e ainda mais preferivelmente 99% ou mais de identidade.

Além disso, “tendo as mesmas funções que SecA” significa ter funções que são praticamente as mesmas que aquelas da SecA, tal como atividade ATPase como SecA, e a capacidade de se ligar com o complexo SecY/SecE.

Aqui, “genes codificando SecA de Bacillus subtilis ou proteínas que são funcional- mente equivalentes a ele” significa genes que codificam as proteínas descritas em (A) até (C) acima. Porém mais preferivelmente, significa genes descritos de (a) até (c) abaixo.

(a) DNA com a seqüência de base representada pela SEQ ID NO: 1;

(b) DNA que hibridiza sob condições rigorosas com DNA com uma seqüência de base que é complementar à seqüência de base representada pela SEQ ID NO: 1, e que também codifica uma proteína com a mesma função que SecA; e

(c) DNA com uma seqüência de base com 80% ou mais de identidade com a se- quência de base representada pela SEQ ID NO: 1, e que também codifica uma proteína com

as mesmas funções que SecA.

Aqui, o método descrito em Molecular Cloning - A LABORATORY MANUAL TERCEIRA EDIÇÃO [Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory- Press] pode ser citado como um exemplo de “condições rigorosas”. Por exemplo, isto pode 20 ser as condições de hibridização efetuadas, com uma sonda, em uma solução contendo 6 x SSC (composição de 1 x SSC: cloreto de sódio 0,15 M, citrato de sódio 0,015 M, pH 7,0), SDS 0,5% e 5 x solução de Denhardt, e 100 mg/mL de DNA de esperma de arenque, por de 8 a 16 h na temperatura constante de 65 0C.

Aqui, “a seqüência de base com 80% ou mais de identidade com a seqüência de base representada pela SEQ ID NO: 1” é preferivelmente uma seqüência de base com 90% ou mais de identidade, mais preferivelmente 95% ou mais de identidade, e ainda mais prefe- rivelmente 99% ou mais de identidade.

O DNA pode ser obtido a partir de fontes naturais. Porém é possível prepará-lo u- sando técnicas conhecidas tais como indução de mutação sítio específica. Por exemplo, ele pode ser preparado pela introdução de mutações usando o kit de indução de mutação [Kit Mutant-super Express Km (Takara)], o qual usa o método de indução de mutação sítio- específica.

A seqüência genética (SEQ ID NO: 1) codificando SecA de Bacillus subtilis foi pu- blicada em JAFAN (Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB), http://bacillus.aenome.ad.ip/. atualizado em 18 de janeiro de 2006), e os genes que codifi- cam SecA que não é de Bacillus subtilis, tal como de Escherichia coli, estão listados no ban- co de dados Colibri (http://qenolist.pasteur.fr/Colibri/). Uma grande quantidade de genomas de bactérias gram-positivas e gram-negativas são publicadas em TIGER (http://cmr.tiqr.ora/tiar-scripts/CMR/CmrHomePaae.cqi).

A quantidade de aminoácidos carbóxi terminais de SecA a serem eliminados na presente invenção é de 20 a 30 ou de 60 a 80. É preferível eliminar de 60 a 80 aminoácidos.

No Bacillus subtilis, SecA consiste de 841 aminoácidos (SEQ ID NO: 2). A elimina-

ção dos aminoácidos 820 a 841, inclusive (também chamado N819) ou a eliminação dos aminoácidos 781 a 841, inclusive (também chamado N780) da SEQ ID NO: 2 é preferível. A eliminação dos aminoácidos 781 a 841, inclusive (N780) é mais preferível.

SEcA de Bacillus subtilis tem, em seu terminal carboxila, uma região CTD (domínio 10 da região C-terminal; ver J.B.C. (2004) 279 (21), p22490-22497). Vinte e dois aminoácidos C-terminais da região CTD constituem a região homóloga com o sítio de ligação SecB de Escherichia coli, e a região CTD tem, em seu N-terminal, uma região consistindo de 61 ami- noácidos chamada de região CTL (ligante terminal C-terminal; ver Science (2002) 297 (5589), p2018-2026). Em Bacillus subtilis, a ligação com Ffh (homólogo cinqüenta e quatro, 15 homólogo SRP 54), o qual é um constituinte da partícula de reconhecimento de sinal (SRP), ocorre nesta região. Incidentalmente, as regiões de CTL, as quais correspondem à região de ligação Ffh, se encontra na região dos aminoácidos 781 a 819.

Consequentemente, a modificação genética da presente invenção inclui a anulação das regiões anteriormente mencionadas, ou regiões homólogas com elas, individualmente ou em combinações, e é preferível que a modificação genética elimine a região de ligação Ffh ou uma região homóloga com ela.

O método de recombinação homóloga pode ser usado, por exemplo, como o méto- do de modificação do gene codificando SecA, na presente invenção. Em outras palavras, o fragmento de DNA contendo uma parte do gene alvo pode ser clonado em um vetor de 25 plasmídeo adequado e o plasmídeo recombinante circular obtido dessa forma pode ser en- tão incorporado em uma célula de um microorganismo de origem. A seguir, por recombina- ção homóloga em uma região que é uma parte do gene alvo, o segmento alvo do gene secA no genoma do microorganismo de origem pode ser cortado para eliminação.

Especialmente ao usar Bacillus subtilis como o microorganismo de origem para construir o microorganismo da presente invenção, uma vez que há vários métodos relatados de eliminação de genes alvos por recombinação homóloga (Mol. Gen. Genet., 223, 268, 1990, etc) qualquer tal método pode ser usado para produzir o microorganismo hospedeiro da invenção.

Na parte a seguir, nós iremos descrever mais especificamente o método de elimi- nação de uma parte de SecA, usando um fragmento de DNA preparado por tecnologia do DNA recombinante.

O fragmento de DNA usado para eliminar uma parte de SecA é uma seqüência ge- nética na qual a região do gene no terminal 3’ do gene secA é parcialmente modificada. Ela tem pelo menos um sítio de reconhecimento de enzima de restrição em cada extremidade. O fragmento de DNA pode ser preparado por um método padrão usando esses sítios de enzima de restrição, por exemplo, através de amplificação por PCR usando o DNA genômi- co de Bacillus subtilis como o molde, e iniciadores contendo esses sítios de enzimas de res- trição. Além disso, o iniciador da extremidade 3’ do fragmento de DNA tem uma seqüência genética inserida codificando um códon de parada imediatamente à montante do gene codi- ficando a região C-terminal da proteína SecA que é almejada para eliminação.

Para construir um plasmídeo, esse fragmento é inserido no sítio de multiclonagem de um vetor de integração tal como pDH88, etc. que permite a recombinação homóloga a- través da transformação genética de uma bactéria gram-positiva geneticamente transformá- vel tipo Bacillus subtilis.

Através da introdução do plasmídeo em Bacillus subtilis, ou semelhante, e efetuan- do a recombinação homóloga, nós podemos obter uma cepa (cepa com SecA parcialmente eliminado) onde o plasmídeo é incorporado no cromossomo. A estrutura genômica no cro- mossomo para a cepa obtida dessa forma é ilustrada na Figura 1a. Nas cepas com a inser- ção, a tradução da proteína SecA expressa no cromossomo é interrompida na metade devi- do ao códon de parada localizado antes da região a ser eliminada. Consequentemente, so- mente a proteína desejada sem a região C-terminal de SecA pode ser expressa.

O microorganismo recombinante da presente invenção pode ser obtido pela intro- dução, em uma cepa do microorganismo modificado obtido dessa forma, de um gene que codifica a proteína ou polipeptídeo heterólogo desejado.

Não há restrição particular na proteína ou polipeptídeo alvo a ser produzido pelo microorganismo recombinante da presente invenção. Por exemplo, ele pode ser um peptí- deo fisiologicamente ativo, ou uma enzima industrial usada em detergentes, alimentos, fi- bras, rações, produtos químicos, produtos medicinais e de diagnóstico, etc.

Exemplos de peptídeos fisiologicamente ativos incluem proteínas codificadas pelos genomas dos vírus patogênicos, tais como o vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, HIV e vírus influenza, e o receptor conjugado da proteína G, fatores de crescimento (fator de cres- cimento plaquetário, fator de crescimento de células tronco sanguíneas, fator de crescimen- to de células hepáticas, fator de crescimento transformante, fator de crescimento/trófico de nervos, fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento tipo insulina, etc), fator de necrose tumoral, interferon, interleucina, eritropoietina, fator estimulante de colônia de gra- nulócito, fator estimulante de colônias de macrófagos, albumina e hormônio de crescimento humano.

Enzimas industrialmente usadas incluem oxidorredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases/sintetases, e mais adequadamente, hidrolases tipo celulase, a- amilase e protease. O gene da proteína ou polipeptídeo alvo introduzido no microorganismo da presente invenção tem preferivelmente, no seu lado à montante, regiões e controle envolvidas com a transcrição de genes, e subsequente tradução e secreção. Em outras palavras, ele preferi- velmente tem uma ou mais regiões adequadamente combinadas selecionadas de uma regi- ão de controle de iniciação de transcrição a qual inclui um promotor e um ponto de início de transcrição, uma região de início de tradução que inclui um sítio de ligação à ribossomo e um códon de iniciação, e uma região de peptídeo de sinal secretora.

Aqui, a região de controle de início de transcrição é uma região que inclui um pro- motor, e um ponto de início de transcrição, e o sítio de ligação de ribossomo é o sítio cor- respondendo à seqüência Shine-Dalgarno (SD), (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463 (1974)), a qual juntamente com o códon de iniciação forma a rejgião de controle de início de tradução.

O fragmento de DNA anteriormente mencionado contendo o gene da proteína ou polipeptídeo heterólogo desejado e um vetor de plasmídeo adequado são combinados para formar um plasmídeo recombinante. O microorganismo recombinante dessa invenção pode ser obtido pela introdução desse plasmídeo recombinante na célula microbiana hospedeira por técnicas normais de transformação genética. O microorganismo recombinante da pre- sente invenção pode também ser obtido pela incorporação direta do fragmento de DNA an- teriormente mencionado, ao qual uma região adequada homóloga com o genoma do micro- organismo hospedeiro é ligada, no genoma do microorganismo hospedeiro.

A produção da proteína ou polipeptídeo desejado usando o microorganismo recom- binante da presente invenção pode ser experimentada pela inoculação da cepa bacteriana em um meio contendo fontes de carbono e nitrogênio assimiláveis e outros componentes essenciais, cultivo por um método comum de cultivo microbiano e coleta e purificação da proteína ou peptídeo depois do cultivo. Conforme é demonstrado nos exemplos descritos posteriormente, a produtividade da proteína ou polipeptídeo alvo é aumentada, em compa- ração com os casos onde microorganismos com SecA geneticamente não-modificado são usados.

Posteriormente, nós vamos descrever em maiores detalhes o método de constru- ção do microorganismo recombinante da presente invenção, e o método de produção de uma proteína usando o microorganismo recombinante.

Exemplos

Cepas bacterianas, plasmídeos e meios usados

(1) Cepas bacterianas usadas

Bacillus subtilis cepa Marburg 168trpC2 (Kunst et al. Nature 1997)

Bacillus subtilis cepa SAN819 (N819); marcador de resistência (cloranfenicol) Bacillus subtilis cepa SAN780 (N780); marcador de resistência (cloranfenicol) Escherichia eoli cepa C600 (Takara Bio)

Eseheriehia eoli cepa JM109 (Takara Bio)

(2) Plasmideos

pDH88; Henner et. al. (Proc Natl Acad Sci USA. Janeiro de 1984 81(2): 439-43),

marcadores de resistência (ampicilina e cloranfenicol).

pHKK1101; marcadores de resistência (ampicilina e cloranfenicol), vetor recombi- nante para criar uma cepa com SecA parcialmente eliminado (cepa SAN819)

pHKK1002; marcadores de resistência (ampicilina e cloranfenicol), vetor recombi- nante para criar uma cepa com SecA parcialmente eliminado (cepa SAN780)

pWH1520; MoBiTec, marcadores de resistência (ampicilina e tetraciclina) pHKK3200; marcadores de resistência (ampicilina e tetraciclina), genes inseridos (peptídeo de sinal amilase AmyE e região pró)

pHKK3201; marcadores de resistência (ampicilina e tetraciclina), genes inseridos (proteína de fusão do peptídeo de sinal da amilase AmyE e região pró, e região madura do IFN a)

pHKK3202; marcadores de resistência (ampicilina e tetraciclina), genes inseridos (proteína de fusão do peptídeo de sinal da amilase AmyE, e região pró, e região madura do IFN β)

Meio

Meio L: Bactotriptona (Difco) 1%, extrato de levedura (Difco) 0,5%, NaCI (Wako)

0,5%

2 x meio L: Bactotriptona (Difco) 2%, extrato de levedura (Difco) 1%, NaCI (Wako)

1%

As concentrações dos antibióticos usados foram de 15 μg de cloranfenicol e de 50

μg de ampicilina. Uma concentração de xilose final de 0,6% foi usada para a indução do promotor da xilose presente em pWH1520. Isopropil-p-tiogalactopiranosídeo (IPTG) foi usa- do em uma concentração final de 100 μΜ.

Exemplo 1

Construção dos plasmídeos e cepas com SEcA parcialmente eliminado

(1) Vetores recombinantes para criar cepas com SecA parcialmente eliminado Para criar a cepa de Bacillus subtilis SAN819, primeiramente, um segmento de 360 pb na extremidade 3’ do gene secA foi amplificado por PCR usando o cromossomo da cepa de Bacillus subtilis 168 como molde, e secAC-01 (gatcAAGCTTcccgggagaagagcgatatcttcgg 35 (SEQ ID NO: 3), as letras maiúsculas representam Hindlll) e secAC-02 (gatcagaTCTAGAt- taaatctcagctttcatcacaaa (SEQ ID NO: 4), as letras maiúsculas representam Xbal, as letras sublinhadas representam o códon de parada inserido) como iniciadores. O segmento ampli- ficado foi a seguir inserido no sitio Hindlll-Xbal de pDH88 para construir pHKK1001. Seme- lhantemente, para criar a cepa de Bacillus subtilis SN780, pHKK1002 foi construído usando os iniciadores secAC-03 (gatcAAGCTTcccgggagaagagcgatatcttcgg (SEQ ID NO: 5), as le- tras maiúsculas representam Hindlll) e secAC-04 (gatcagaTCTAGAttagatatcaaccactttgcgaac 5 (SEQ ID NO: 6), as letras maiúsculas representam Xbal, as letras sublinhadas representam o códon de parada inserido).

(2) Criação de cepas com cepa de Bacillus subtillis SAN819 parcialmente eliminada foi obtida pela incorporação Campbell do plasmídeo pHKK1001 no cromossomo da cepa de Baeillus subtilis 168 (Figura 1a). A cepa SAN780 também foi obtida por um método seme-

lhante, usando o plasmídeo pHKK1002. Foi confirmado que esses plasmídeos foram ade- quadamente incorporados nos cromossomos de SAN819 e SAN870 respectivamente por análise de hibridização Southern. O tamanho do SecA expresso nas cepas SAN819 e SAN780 também foi confirmado usando anticorpos anti-SecA (Figura 1b).

(3) Efeito no crescimento de cepas com SecA parcialmente eliminado

O efeito no crescimento foi observado nas cepas SAN819 e SAN780 criadas em

(2). Meio líquido L, meio de placa L e meio líquido 2 x L foram usados para a cultura (IPTG) foi adicionado na concentração final de 100 μΜ em todos os casos). O cultivo foi feito a 30 0C, 37 0C e 47 0C.

Os resultados mostraram que as cepas de Bacillus subtilis SAN819 e SAN780 tive- ram crescimento comparável com a cepa de origem, cepa de Bacillus subtilis 168, sob todas as condições testadas.

O crescimento foi suprimido quando nenhum IPTG foi adicionado, devido ao seu efeito no gene prfB localizado à jusante de secA, o qual forma um operon com SecA.

Esses fatos revelam que o CTD (domínio da região C-terminal), o qual é a região C- terminal de SecA, não é essencial para o crescimento de Bacillus subtilis.

Exemplo 2

Expressão da proteína heteróloga

(1) Construção de um vetor para expressar a proteína heteróloga

Uma seqüência de sinal é necessária para a secreção da proteína heteróloga para 30 fora da célula. Consequentemente, o vetor básico pHKK3200 para expressão da proteína secretória, com a seqüência de sinal e a seqüência pro da proteína amilase (amyE) de Baeil- Ius subtilis foi criada. Para criar pHKK3200, a região codificadora de 175 pb da seqüência de sinal do gene amyE e a seqüência pro foi amplificada por PCR usando o cromossomo da cepa de Bacillus subtilis 168 como o molde, e amyESF-1 (ggceACTAGTcttcaaaaaatcaaa 35 (SEQ ID NO: 7), as letras maiúsculas representam Spel) e amyESR-2 (ggccGGTACCct- cattcgatttgttcgc (SEQ ID NO: 8), as letras maiúsculas representam Kpnl) como iniciadores, e o produto amplificado foi inserido no sítio Spel-Kpnl de pWH1520. Para criar o plasmídeo expressando interferon-α, o segmento de 521 pb contendo a região madura do gene ifna foi amplificada por PCR usando pORF5-hlFN-a (InvivoGen) como molde, e ifnaF (ggccGGTACCctcctggtgctcagctgc (SEQ ID NO: 9), as letras maiúsculas representam Kpnl) e ifnaR (ggccGGATCCttttcattccttacttct (SEQ ID NO: 10), as letras maiús- 5 cuias representam BamHI) como os iniciadores, e inserido no sítio KpnI-BamHI de pHKK3200, deste modo construindo pHKK3201 (Figura 2a) e b)).

Por um procedimento semelhante, o plasmídeo pHKK3202 expressando interferon- β foi criado usando pORF-hlFN-β (InvivoGen) como o molde, e ifnbF (ggccGGTACCatgagc- tacaactt (SEQ ID NO: 11), as letras maiúsculas representando Kpnl) e ifnbR (ggccGGATC- Cagctcagtttcggaggta (SEQ ID NO: 12), as letãs maiúsculas representando BamHI) como iniciadores.

(2) Criação de cepas nas quais um vetor de expressão de proteína heteróloga foi incorporado

O vetor de expressão de interferon-α pHKK3201 e o plasmídeo pHKK30 expres- sando interferon-β criado em (1) foram respectivamente incorporados pelo método de trans- formação genética nas cepas SN780 e SAN8190 para obter cepas incorporadas com vetor de expressão de interferon.

A transformação genética foi efetuada por um método apropriado usando os meios SPI e SPII, e as cepas bacterianas que cresceram no meio Agar LB contendo 15 μg/mL de cloranfenicol foram tomadas como as cepas transformadas.

(3) Cultivo

O meio 2 x L (Tripton 2% (Difco), extrato de levedura 1% (Difco), NaCI 1%) foi usa- do. Tetraciclina (Wako) foi adicionada a uma concentração final de 15 μg/mL quando neces- sário. O meio foi inoculado com 2% da cultura preparatória, e cultivado a 30 0C até a fase do 25 meio da multiplicação celular (OD66O = 0,3), xilose foi adicionada até uma concentração final de 0,6%, e o cultivo continuou. As células bacterianas foram separadas e o fluido da cultura obtido 24 h depois do início do cultivo.

A amostra contendo interferon foi analisada por Western blotting, e a intensidade das bandas detectadas foi medida e usada para fins de comparação.

(4) Confirmação da proteína secretória (interferon (IFN))

1) Western blotting

Western blotting foi efetuado usando um sistema semi-seco (Bio-Rad). Depois de separar as proteínas por SDS-PAGE, elas foram transferidas para uma membrana PVDF Immobilon (Millipore). As proteínas foram detectadas usando um sistema de detecção ECL (Amersham, atualmente GE Healthcare).

Os anticorpos anti-interferon-α e anti-interferon-β usados foram produtos de Pepro- Tech EC LTD. Os anticorpos secundários marcados com HRP usados foram produtos da Amersham (atualmente GE Healthcare).

2) Medição da atividade de interferon

O fluido da cultura a partir do qual células foram removidas por centrifugação de- pois de 24 h de cultivo foi usado como a amostra contendo interferon. Xilose foi adicionada 5 até uma concentração final de 0,6% em um momento quando OD66O se tornou 0,3 depois do início do cultivo, para induzir o interferon. A atividade física do interferon no fluido da cul- tura foi medida usando células animais. Essa medição experimental foi contratada para Mit- subishi BCL. O interferon secretado pela ação do vetor de expressão de interferon usado nesse experimento tinha atividade fisiológica.

(5) Método para avaliar as quantidades secretadas

O fluido de culturas foi desenvolvido por SDS-PAGE, as proteínas foram marcadas em uma membrana PVDF e detectadas pelo método de Western blotting usando o anticorpo IFNa (PeproTech EC LTD). A intensidade da banda obtida por Western blotting foi converti- da em um valor numérico usando NIH Image (National Institutes of Health, ÈUA) para medir 15 a quantidade secretada. A quantidade produzida quando a cepa mutante foi a hospedeira foi avaliada como um valor relativo com referência ao controle, isto é, a quantidade produzida quando a cepa do tipo selvagem foi a hospedeira.

(6) Resultados

As quantidades do interferon α produzido pelas cepas SAN780 e SAN819 foram maiores do que aquelas produzidas pela cepa de origem 168 (Figura 3). Uma melhoria simi- lar foi observada na produção de interferon-β (Figura 4).

(7) Avaliação da produção de celulase

Uma plasmídeo recombinante pHY-S237 foi introduzido, pelo método de transfor- mação genética de protoplastos, na cepa SAN780, e também a cepa de Bacillus subtilis 168 25 como controle. O plasmídeo recombinante foi produzido pela inserção de um fragmento de DNA (3,1 Kb) codificando o gene da celulase alcalina derivado da cepa de Bacillus KSM- S237 (FERMBP-7875) (ver a Patente Japonesa em aberto No. 2000-210081) no sítio da enzima de restrição BamHI do vetor de transporte pHY300PLK.

A cepa geneticamente transformada obtida dessa forma foi submetida à agitação 30 cultivando por 15 h a 30 0C em 5 ml_ de meio LB. 0,6 mL desse fluido de cultura foi inocula- do em 30 mL de meio 2 x L maltose (2% de triptona, 1% de extrato de levedura, 1% de clo- reto de sódio, 7,5% de maltose, 7,5 ppm de sulfato de manganês 4-5 hidratado e 15 ppm de tetraciclina) e cultivada sob agitação por 3 dias a 30 0C. Depois do cultivo, as células bacte- rianas foram removidas por centrifugação, e a atividade da celulase alcalina do sobrenadan- 35 te do fluido de cultura foi medida ou pelo método dado na referência de patente anteriormen- te mencionada ou pela medição da alteração na absorvância (420 nm) em pH 7,0 e tempe- ratura de 30 0C, usando p-nitrofenil-p-celotriosídeo (Seikagaku Corp.) como o substrato, e a quantidade de celulase alcalina produzida fora das células bacterianas foi determinada. Os resultados estão exibidos na Tabela 1.

Tabela 1

Cepa bacteriana SecA Quantidade de celulase alcalina secretada e pro¬ duzida (valor relativo) Cepa 168 Tipo selvagem (1-841) 100 Cepa SAN780 1-780 125 Conforme demonstrado na Tabela 1, houve uma produção secretória maior de ce u- Iase alcalina quando a cepa SAN780 foi a hospedeira, em comparação com o controle onde a cepa 168 (tipo selvagem) foi a hospedeira.

Claims

1. Microorganismo geneticamente modificado, CARACTERIZADO pelo fato de ser modificado para eliminar 60 a 80 aminoácidos carbóxi-terminais de SecA.

2. Microorganismo modificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a eliminação dos aminoácidos carbóxi-terminais é a eliminação da região de ligação Ffh ou uma região homóloga com ela.

3. Microorganismo modificado, de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindi- cação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que SecA é uma proteína descrita de (A) a (C) abaixo: (A) Uma proteína representada por uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2; (B) Uma proteína representada por uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 com eliminação, substituição ou adição de um ou de alguns aminoáci- dos, e ainda com as mesmas funções que SecA; e (C) uma proteína representada por uma seqüência de aminoácidos com 80% ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, e ainda com as mesmas funções que o SecA.

4. Microorganismo recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de ser construído pela introdução de um gene codificando uma proteína ou polipeptídeo heterólogo em uma cepa do microorganismo modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Microorganismo modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, ou o microorganismo recombinante de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo é uma bactéria pertencendo ao gê- nero Bacillus.

6. Método de produção de uma proteína ou polipeptídeo, CARACTERIZADO pelo fato de usar o microorganismo recombinante de acordo com a reivindicação 4 ou com a rei- vindicação 5.