BRPI0807739A2

BRPI0807739A2 - Composição para o tratamento de doenças da cartilagem

Info

Publication number: BRPI0807739A2
Application number: BRPI0807739-8A2A
Authority: BR
Inventors: Norimasa Iwasaki; Akio Minami; Yasuhiko Kasahara; Tatsuya Igarashi; Daisuke Kawamura; Fumiyoshi Kasahara; Chihiro Miyajima; Nobuo Ohzawa; Mariko Imai
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd; Univ Hokkaido Nat Univ Corp
Priority date: 2007-02-21
Filing date: 2008-02-21
Publication date: 2014-06-03
Also published as: EP2127687B1; CA2912930C; CA2912930A1; EP2127687A4; US20100015102A1; EP3189859B1; JP2011224378A; CN104906126B; US9216201B2; CN101951969A; EP3189859A1; BRPI0807739B1; WO2008102855A1; CN104906126A; US20130189231A1; US8372394B2; CA2677436A1; KR101440170B1; IL200342A; EP3189859B8

Description

COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DA CARTILAGEM

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção está relacionada a uma composição para regeneração de cartilagem ou tratamento de doença da cartilagem, incluindo aplicações veterinárias.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Por exemplo, a cartilagem articular é um cartucho hialino que é composto por um pequeno número de células, matriz extracelular colagenosa, proteoglicanos abundantes e

água. No caso dos ossos, como existem redes vasculares e neurais e o osso possui a habilidade de auto-regeneração, mesmo se tiver ocorrido uma fratura, a fratura é freqüentemente reparada completamente. No entanto, a cartilagem articular não possui redes vasculares e neurais.

Conseqüentemente, ela praticamente não possui potencial para auto-regeneração e, no caso da formação de grandes defeitos de cartilagem em particular, o defeito da cartilagem não é reparado adequadamente. Mesmo naquelas porções que são reparadas, a cartilagem fibrosa que é

2 0 formada possui propriedades mecânicas diferentes em relação

à cartilagem hialina. Conseqüentemente, quando um defeito de cartilagem é formado, surgem dor articular e perda de função que freqüentemente progridem até a osteoartrite. Além disso, um defeito de cartilagem pode variar amplamente

em conseqüência dos sintomas que progridem a partir dos estágios iniciais de osteoartrite que começam com desgaste da superfície da cartilagem articular em função do envelhecimento ou de uso excessivo da articulação.

Dessa forma, como a cartilagem articular não possui

3 0 uma habilidade de auto-regeneração adequada, são necessários procedimentos cirúrgicos para tratar lesões da cartilagem, cujos exemplos incluem mosaicoplastia, microfratura, perfuração, abrasão e debridamento. Dentre esses, microfratura, perfuração e abrasão são denominadas 5 técnicas de estimulação da medula, e promovem sangramento da medula óssea para induzir células precursoras de cartilagem derivadas da medula óssea na expectativa de sua diferenciação em cartilagem. No entanto, essas técnicas possuem limitações com relação aos defeitos de cartilagem 10 que cobrem grandes áreas, e a cartilagem regenerada por esses métodos está na forma de cartilagem fibrosa que possui propriedades mecânicas diferentes em relação à cartilagem hialina.

Peterson e cols. e Grande e cols. testaram uma técnica de implantação de condrócito autólogo (ACI) em cartilagem articular de espessura parcial de coelho em 1984 . A ACI é uma técnica que envolve a coleta e o cultivo de tecido de uma cartilagem normal do próprio paciente, a implantação das células cultivadas em uma área afetada enquanto suspensas em um meio, e a cobertura do defeito de cartilagem com o periósteo para evitar o extravasamento das células. A ACI foi aplicada inicialmente em 1994 e está atualmente em prática por mais de 15 anos. Foram relatados vários resultados bem sucedidos. No entanto, estudos clínicos recentes relatam que a ACI não gera resultados significativamente superiores quando comparada com outras técnicas para o reparo de defeitos da cartilagem articular.

Há duas razões principais para esses resultados desfavoráveis obtidos com a ACI. 0 primeiro é a dificuldade

3 0 técnica associada à fixação das células e da estrutura ao defeito de cartilagem e o recobrimento do defeito com uma aba de periósteo. A técnica de ACI exige uma ampla exposição da artrotomia da articulação para sutura da aba de periósteo para cobrir a suspensão de células. Além 5 disso, foram relatadas várias complicações associadas à aba de periósteo, incluindo hipertrofia do periósteo, formação de defeito e adesão intra-articular. A outra razão envolve limitações no uso de condrócitos. Os condrócitos perdem rapidamente seu fenótipo diferencial em culturas de

monocamadas, transformando-se em fibroblastos. Outro problema é que, embora a ACI exija que a cartilagem seja coletada de um local da articulação que não suporte peso, os locais doadores permanecem problemáticos, já que os condrócitos são coletados desses locais.

Por outro lado, estão em andamento tentativas de

utilizar polímeros naturais como, por exemplo, colágeno, quitosana, agarose e ácido algínico, na terapia regenerativa da cartilagem articular. Em particular, o ácido algínico é um polissacarídeo extraído de algas

2 0 marrons como, por exemplo, Ecklonia, Eisenia e Laminaria,

que possui a propriedade de entrecruzamento após a adição de cálcio ou outros íons metálicos divalentes, e foram feitas tentativas de aplicar o ácido algínico aos locais lesionados utilizando essa propriedade para incrustar

células como, por exemplo, condrócitos, fatores de crescimento e assim por diante, em um gel deste (veja, por exemplo, as Referências 1, 2, 3, 4 e 5).

Por exemplo, a Referência 1 revela um gel de alginato que compreende uma mistura de um alginato solúvel e um

3 0 alginato insolúvel/gel, enquanto as Referências 2, 3 e 4 revelam o uso de glóbulos de alginato. Na Referência 2, o ácido algínico pode ser usado como um veículo que não transmite quaisquer efeitos desvantajosos a um local lesionado, embora o próprio ácido algínico seja discutido como não tendo nenhum efeito terapêutico. Além disso, a Referência 4 revela que não foi observada a fusão de condrócitos embebidos em glóbulos de alginato no tecido do hospedeiro após transplante em um defeito de cartilagem de coelho. Além disso, embora seja necessário que os glóbulos de alginato sejam aplicados por pressão em um defeito, já que é necessário fazer com que glóbulos combinem com o tamanho do defeito, seu uso na prática clínica é tecnicamente difícil. A Referência 5 revela um enxerto no qual condrócitos estão suspensos em alginato de sódio e injetados em um defeito de cartilagem de coelho, seguido por cura da superfície com uma solução de CaCl2, em que, embora seja formado tecido cartilaginoso normal, forma-se cartilagem fibrosa no caso de se aplicar somente ácido algínico no defeito de cartilagem, sem a presença de células.

Além disso, há pesquisas em andamento sobre o uso de esponja de colágeno e semelhante como uma armação de células como um exemplo de tentativas de usar células- tronco mesenquimais para terapia regenerativa de 25 cartilagem. Embora métodos que envolvem o transplante de células-tronco mesenquimais após diferenciação in vitro em condrócitos e métodos que envolvem o transplante de células-tronco mesenquimais sem diferenciação tenham sido considerados, ainda há um debate em curso sobre qual método 30 de utilização é ideal (Referência 6). Na medida em que os defeitos de cartilagem na osteoartrite (OA) ocorrem de forma ampla e em regiões submetidas a cargas, seu reparo por transplante ou terapia regenerativa é considerado como sendo difícil. Aqueles 5 defeitos de cartilagem elegíveis à regeneração de cartilagem por transplante de células como descrito acima se limitam aos defeitos de cartilagem parciais causados principalmente por atividades ou traumas esportivos. 0 tratamento da osteoartrite se concentra primariamente na 10 remoção da dor e da inflamação na área afetada, e ela é comumente tratada no exterior com a administração de fármacos antiinflamatórios não esteróides. No entanto, uma vez que a função renal pode estar diminuída em pacientes idosos, a administração oral contínua de fármacos 15 antiinflamatórios não esteróides pode ser difícil do ponto de vista da segurança. Os produtos que incorporam ácido hialurônico, que é um componente do líquido sinovial da cartilagem, aumentam a função lubrificante das articulações ao serem administrados em uma articulação e, na medida em

2 0 que esses produtos também possuem ação analgésica, eles são

amplamente usados como agentes para melhora da função articular para a osteoartrite. No entanto, já que, no fim das contas, não há outra escolha além de substituir a articulação com uma articulação artificial em casos graves 25 de osteoartrite nos quais o dano articular progrediu, há um desejo pelo desenvolvimento de um novo fármaco terapêutico.

REFERÊNCIAS

1. Publicação Internacional WO 2006/044342.

2. Cay M. Mierisch e cols., "Transforming Growth

3 0 Factor β in Calcium Alginate Beads for the Treatment of Articular Cartilage Defects in the Rabbit", The Journal of Arthroscopic and Related Surgery, Vol. 18, N0 8 (outubro), 2002: páginas 892-900.

3. David R. Diduch e cols., "Marrow Stromal Cells Embedded in Alginate for Repair of Osteoehondral Defeets",

The Journal of Arthroscopic and Related Surgery, Vol. 16, N0 6 (setembro), 2000: páginas 571-577.

4. David R. Didueh e cols., "Chondrocyte Transplantation into Articular Cartilage Defeets with Use

of Calcium Alginate: The Fate of the Cells" , J. Bone Joint Surg. Am. 85: 2 003, páginas 1.757-1.767.

5. E. Fragonas e cols., "Articular Cartilage Repair in Rabbits by Using Suspensions of Allogenic Chondrocytes in Alginate", Biomaterials, Vol. 21, 2000: páginas 795-801.

6. "Life Science Report N0 4", 2005 (Editor:

"Intellectual Property Department, Tokyo Medicai and Dental University", Editor: Maruzen Co., Ltd.), páginas 235-243, Editor colaborador: Ichiro Sekiya.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO

2 0 Problemas a serem solucionados pela invenção

Quando são consideradas as reais aplicações clínicas para a terapia regenerativa de defeitos de cartilagem dessa forma, não havia terapia regenerativa capaz de ser compatível com o uso prático em termos de problemas como,

por exemplo, citotoxicidade, bioafinidade, facilidade de aplicação e efeitos terapêuticos. Especificamente, havia necessidade do desenvolvimento de uma composição para regeneração de cartilagem e tratamento de doenças da cartilagem, e um método de tratamento com sua utilização,

3 0 que possua praticabilidade superior por superação de problemas no campo da terapia regenerativa de cartilagem ao ser capaz de promover eficazmente a regeneração de cartilagem, sem necessitar de um procedimento cirúrgico excessivo como a ACI, que possua um procedimento simples, e 5 não coloque uma carga excessiva sobre o corpo em termos de coleta de condrócitos, periósteo e semelhantes, seja capaz de ser usada sobre uma ampla gama de formas de lesões da cartilagem, independentemente das condições de aplicação, reduzindo os efeitos prejudiciais dos agentes de

entrecruzamento e semelhantes aplicados a lesões da cartilagem, e que possua bioafinidade superior. Em particular, ela ainda deve ser uma composição capaz de regenerar cartilagem hialina com a utilização apenas de polímero, sem células embebidas.

Embora a osteoartrite seja uma doença degenerativa na

qual a cartilagem articular está desgastada em função do envelhecimento e do uso excessivo da articulação, além da causa mecânica do desgaste, respostas inflamatórias locais, por exemplo, a produção de citocinas inflamatórias por

2 0 células sinoviais e condrócitos e a indução de substâncias

algésicas e proteases por citocinas inflamatórias, também são consideradas como envolvidas na destruição articular. Especificamente, associada ao desgaste da cartilagem articular (dano mecânico), é induzida uma resposta

inflamatória dentro do tecido articular, o dano auto- destrutivo à cartilagem progride em conseqüência dessa resposta inflamatória, e o dano mecânico progride ainda mais em decorrência da função articular diminuída, resultando, dessa forma, em um círculo vicioso que exacerba

3 0 ainda mais a doença. Dessa forma, são necessários fármacos terapêuticos para osteoartrite que forneçam efeitos abrangentes, incluindo efeitos que protejam a cartilagem contra o desgaste, efeitos que inibam alterações degenerativas na cartilagem causadas pelo desgaste e pela inflamação, efeitos que reparem a lesão por trauma de cartilagem e efeitos que suprimam a inflamação e a dor. Caso fosse obtido um fármaco capaz de inibir inflamação e suprimir a dor nas articulações, ele seria aplicado ao tratamento do ombro congelado e na supressão da dor articular na artrite reumatóide crônica. O ácido hialurônico é inerentemente um componente importante do líquido sinovial, e sua reposição melhora a função articular. No momento, não há fármacos que comprovadamente possuam efeitos terapêuticos abrangentes sobre o tecido cartilaginoso além do ácido hialurônico. As preparações de ácido hialurônico são produzidas por extração de tecido animal ou fermentação, e buscam-se novos materiais que possam ser produzidos mais facilmente e ofereçam um nível de segurança maior. Além disso, embora as preparações de ácido hialurônico necessitem de cinco administrações semanais consecutivas inicialmente, seguidas por administrações repetidas posteriormente, busca-se uma nova composição que tenha uma duração mais longa e efeitos terapêuticos maiores a fim de reduzir o número de injeções na articulação do joelho.

Meios para solucionar os problemas

Os inventores da presente invenção realizaram estudos intensos para solucionar os problemas mencionados acima. Como resultado, verificou-se que, por aplicação em uma lesão por trauma de cartilagem de uma composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico para o qual o nível de endotoxina deste foi reduzido a um grau que não induza substancialmente febre ou inflamação, que possui a viscosidade de 400 a 20.000 mPa.s e que possui fluidez, a 5 regeneração de cartilagem pode ser promovida por uma técnica simples, sem necessitar de um procedimento cirúrgico excessivo.

Quando essa composição foi aplicada a um defeito da cartilagem articular e uma solução de CaCl2 foi aplicada à 10 superfície desta, a composição não saiu do local aplicado. Dessa forma, verificou-se de forma surpreendente que a composição pode ser aplicada até mesmo em locais submetidos a uma carga sob condições de movimentação extremamente duras como as de uma cartilagem articular. Pelo fato de a 15 viscosidade da composição da presente invenção ser de cerca de 2.000 mPa.s ou mais, a composição pode ser aplicada até mesmo se a superfície lesionada estiver virada para baixo.

A composição da presente invenção permitiu a obtenção de uma regeneração de cartilagem extremamente superior no

2 0 caso da incrustação de células-tronco mesenquimais da

medula óssea ou de células estromais nesta composição. Além disso, mesmo no caso de não se incrustar essas células, verificou-se que a composição da presente invenção permite a obtenção de regeneração de cartilagem hialina 25 satisfatória por condrócitos hialinos, levando, dessa forma, à finalização da presente invenção.

Além disso, verificou-se que as alterações cartilaginosas degenerativas eram inibidas e que os efeitos protetores da cartilagem eram obtidos por aplicação em uma

3 0 lesão por trauma de cartilagem em um modelo de osteoartrite de uma composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico para o qual o nível de endotoxina deste foi reduzido a um grau que não induza substancialmente febre ou inflamação. Além disso, verificou-se também que essa 5 composição possui efeitos que suprimem a dor em um modelo experimental de dor da artrite, levando, dessa forma, à finalização da presente invenção.

Essa é primeira vez em que foi demonstrado que uma substância, diferente do ácido hialurônico, que é um 10 componente importante do líquido sinovial, possui efeitos compostos sobre o tecido cartilaginoso dessa forma. Foi surpreendente verificar que o ácido algínico, que é um polímero que se origina em algas e não está inerentemente presente em animais, possui efeitos como esses.

Especificamente, a presente invenção fornece a

seguinte composição para regeneração de cartilagem que é aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem.

(1-1) Uma composição que é usada para regeneração de cartilagem e que é curada em uma área afetada por aplicação

2 0 em uma lesão por trauma de cartilagem, que contém um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico, que possui uma viscosidade de 400 mPa.s a 20.000 mPa.s, e que possui fluidez.

(1-2) A composição descrita em (1-1) acima, em que o sal de metal monovalente de ácido algínico é alginato de sódio.

(1-3) A composição descrita em (1-2) acima, em que o alginato de sódio é alginato de sódio que possui um peso molecular ponderai médio de 500.000 ou mais, como determinado por cromatografia por filtração em gel. (1-4) A composição descrita em qualquer um de (1-1) a (1-3) acima, em que a aplicação à lesão por trauma de cartilagem é: a) aplicação em um defeito de cartilagem, ou b) aplicação aos orifícios após a formação de um ou mais 5 dos orifícios em uma lesão por trauma de cartilagem ou em um defeito de cartilagem.

(1-5) A composição descrita em qualquer um de (1-1) a (1-4) acima, que não contém células para regeneração de tecido cartilaginoso.

(1-6) A composição descrita em qualquer um de (1-1) a

(1-4) acima, em que são incluídas células para regeneração de tecido cartilaginoso.

(1-7) A composição descrita em (1-6) acima, em que, antes da aplicação em uma lesão por trauma de cartilagem, a 15 composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico que possui células nela embebidas é embebida com células cultivadas in vitro em um ou mais estados selecionados do grupo que consiste em: a) um estado no qual

o número de células é de 1 x IO6 células/mL ou mais, b) um 20 estado no qual tecido cartilaginoso semelhante a hialina é detectado por coloração com safranina-0 ou coloração com H- E, c) um estado no qual é detectado colágeno do tipo II por anticorpo anticolágeno II ou análise genética, d) um estado no qual é detectado aglicano por anticorpo anti-aglicano ou 25 análise genética, e e) um estado no qual a matriz extracelular (colágeno, ácido hialurônico, proteoglicano) é secretada.

(1-8) A composição descrita em (1-6) ou (1-7) acima, em que as células para regeneração de tecido cartilaginoso 3 0 incluem células-tronco mesenquimais da medula óssea. (1-9) A composição descrita em qualquer um de (1-1) a (1-8) acima, em que a composição é aderida a um local lesionado por pelo menos 5 segundos no caso de aplicação a uma lesão por trauma de cartilagem no estado no qual uma 5 abertura no defeito de cartilagem ou uma abertura dos orifícios formados em uma lesão por trauma de cartilagem ou defeito de cartilagem está inclinada ou virada para baixo.

(1-10) A composição descrita em qualquer um de (1-1) a (1-9) acima, em que aplicação em uma lesão por trauma de cartilagem é possível com uma agulha 16 G.

(1-11) A composição descrita em qualquer um de (1-1) a (1-10) acima, em que a composição é aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem, e um agente de entrecruzamento é aplicado à superfície da composição.

(1-12) A composição descrita em (1-11) acima, em que o

agente de entrecruzamento é uma solução de CaCl2.

(1-13) A composição descrita em qualquer um de (1-1) a (1-12) acima, em que a lesão por trauma de cartilagem é cartilagem articular lesionada.

(1-14) A composição descrita em qualquer um de (1-1) a

(1-13) acima, em que a regeneração de cartilagem tem a finalidade de regenerar cartilagem hialina.

Além disso, a presente invenção fornece uma composição que permite a obtenção de efeitos terapêuticos por injeção em uma articulação de um paciente que possui uma doença da cartilagem.

(2-1) Uma composição que é usada para o tratamento de uma doença da cartilagem e que é injetada em uma articulação, que contém, como um ingrediente ativo desta, 3 0 um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(2-2) Uma composição que é usada para a inibição de alterações cartilaginosas degenerativas e que é injetada em uma articulação, que contém, como um ingrediente ativo desta, um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(2-3) Uma composição que é usada para proteção de cartilagem e que é injetada em uma articulação, que contém, como um ingrediente ativo desta, um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(2-4) Uma composição que é usada para reparo de cartilagem e que é injetada em uma articulação, que contém, como um ingrediente ativo desta, um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(2-5) Uma composição que é usada para supressão de dor

articular e que é injetada em uma articulação, que contém, como um ingrediente ativo desta, um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(2-6) Uma composição que é usada para a inibição de inflamação articular e que é injetada em uma articulação, que contém, como um ingrediente ativo desta, um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(2-7) Uma composição que é usada para melhora da função articular e que é injetada em uma articulação, que contém, como um ingrediente ativo desta, um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(2-8) Uma composição que é usada para o tratamento de osteoartrite e que é injetada em uma articulação, que contém, como um ingrediente ativo desta, um sal de metal 3 0 monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico. (2-9) Uma composição que é usada para o tratamento de ombro congelado e que é injetada em uma articulação, que contém, como um ingrediente ativo desta, um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(2-10) Uma composição que é usada para supressão de

dor articular associada à artrite reumatóide e que é injetada em uma articulação, que contém, como um ingrediente ativo desta, um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(2-11) Uma composição para injeção intra-articular que

possui o efeito de aliviar, melhorar ou curar sintomas associados à doença da cartilagem, que contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(2-12) A composição descrita em (2-11) acima, em que o

efeito de alívio, melhora ou cura dos sintomas associados à doença da cartilagem é pelo menos um efeito selecionado do grupo que consiste em inibição de alterações cartilaginosas degenerativas, proteção de cartilagem, reparo de 20 cartilagem, supressão de dor articular, inibição de inflamação articular e melhora da função articular.

(2-13) A composição descrita em qualquer um de (2-1) a (2-12) acima, em que o sal de metal monovalente de ácido algínico é alginato de sódio.

(2-14) A composição descrita em (2-13) acima, em que o

alginato de sódio é alginato de sódio que possui um peso molecular ponderai médio de 500.000 ou mais, como determinado por cromatografia por filtração em gel.

(2-15) Uma composição que é usada para o tratamento de

3 0 doença da cartilagem e que é injetada em uma articulação, que contém, como um ingrediente ativo desta, um alginato de sódio de endotoxina inferior que possui um peso molecular ponderai médio de 500.000 ou mais, como determinado por cromatografia por filtração em gel.

Além disso, a presente invenção também fornece o

seguinte método de tratamento para uma lesão por trauma de cartilagem e uma composição usada naquele método de tratamento.

(3-1) Um método de tratamento de uma lesão por trauma

de cartilagem que compreende: aplicação em uma lesão por trauma de cartilagem de uma composição que contém um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico, que possui uma viscosidade de 400 mPa.s a 20.000 mPa.s e que possui fluidez.

(3-2) O método descrito em (3-1) acima, em que a

composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico é aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem, e um agente de entrecruzamento é aplicado à superfície da composição para curar a composição.

2 0 (3-3) O método descrito em (3-1) ou (3-2) acima, em

que células para regeneração de tecido cartilaginoso são embebidas na composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico, e a composição é aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem.

(3-4) 0 método descrito em qualquer um de (3-1) a (3-

3) acima, em que células para regeneração de tecido cartilaginoso são embebidas na composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico, e a composição é aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem após cultivo

3 0 in vitro em um ou mais estados selecionados do grupo que consiste em: a) um estado no qual o número de células é de

1 x IO6 células/mL ou mais, b) um estado no qual tecido cartilaginoso semelhante a hialina é detectado por coloração com safranina-0 ou coloração com H-E, c) um 5 estado no qual é detectado colágeno do tipo II por anticorpo anticolágeno II ou análise genética, d) um estado no qual é detectado aglicano por anticorpo anti-aglicano ou análise genética, e e) um estado no qual a matriz extracelular (colágeno, ácido hialurônico, proteoglicano) é

secretada.

(3-5) O método descrito em qualquer um de (3-2) a (3-

4) acima, em que o agente de entrecruzamento é uma solução de CaCl2.

(3-6) O método descrito em qualquer um de (3-1) a (3-

5) acima, em que a aplicação em uma lesão por trauma de cartilagem é: a) aplicação em um defeito de cartilagem, ou b) formação de um ou mais orifícios na lesão por trauma de cartilagem ou um defeito de cartilagem e aplicação nos orifícios formados.

2 0 (3-7) Uma composição usada no método descrito em

qualquer um de (3-1) a (3-6) acima, que contém um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico, que possui uma viscosidade de 400 mPa.s a 20.000 mPa.s e que possui fluidez.

(3-8) A composição descrita em (3-7) acima, em que a

composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico contém células para regeneração de tecido cartilaginoso.

(3-9) A composição descrita em (3-7) ou (3-8) acima,

3 0 em que o sal de metal monovalente de ácido algínico é alginato de sódio.

(3-10) Uma composição para o tratamento de uma lesão por trauma de cartilagem, que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico para o qual o nível de endotoxina deste foi reduzido a um grau que não induza substancialmente inflamação ou febre, que possui uma viscosidade de 400 mPa.s a 20.000 mPa.s e que possui fluidez, em que a composição é usada por via artroscópica por sua aplicação de modo a preencher suficientemente o vazio total de uma área afetada que é um local de aplicação de uma lesão por trauma de cartilagem que foi irrigado e seco previamente, uma solução de CaCl2 é aplicada à superfície da composição aplicada, seguido por remoção da solução de CaCl2 que permanece na superfície da composição aplicada, e a composição é curada na área afetada.

Além disso, a presente invenção fornece um método de tratamento para uma doença da cartilagem e dos sintomas a ela associados.

(4-1) Um método de tratamento de uma doença da

2 0 cartilagem que compreende: injeção em uma articulação de

uma composição que contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(4-2) Um método de inibição de alterações cartilaginosas degenerativas que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(4-3) Um método de proteção de cartilagem que

3 0 compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(4-4) Um método de reparo de cartilagem que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(4-5) Um método de supressão de dor articular que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(4-6) Um método de inibição de inflamação articular que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(4-7) Um método de melhora da função articular que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(4-8) Um método de tratamento de osteoartrite que

compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(4-9) Um método de tratamento de ombro congelado que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(4-10) Um método de supressão de dor articular associada à artrite reumatóide que compreende: injeção em

3 0 uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

(4-11) O método descrito em qualquer um de (4-1) a (4- 10) acima, em que o sal de metal monovalente de ácido algínico é alginato de sódio.

(4-12) 0 método descrito em (4-11) acima, em que o alginato de sódio é alginato de sódio que possui um peso molecular ponderai médio de 500.000 ou mais, como determinado por cromatografia por filtração em gel.

(4-13) Um método para o tratamento de uma doença da

cartilagem que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo desta um alginato de sódio de endotoxina inferior que possui um peso molecular ponderai médio de 500.000 ou mais, como

determinado por cromatografia por filtração em gel.

Efeitos da invenção

Como a composição para a regeneração de cartilagem da presente invenção pode ser injetada em uma lesão por trauma de cartilagem sem necessitar de um procedimento cirúrgico

excessivo, o procedimento é simples. A regeneração de cartilagem e, particularmente, a regeneração de cartilagem hialina, pode ser eficazmente promovida sem a colocação de uma carga excessiva sobre o corpo em termos de coleta de condrócitos, periósteo, e semelhantes.

2 5 A composição para a regeneração de cartilagem da

presente invenção possui curabilidade de gel como um resultado de entrar em contato com íons de Ca na área afetada. A composição pode ser retida na área afetada por cura da superfície desta beneficiando-se dessa propriedade.

3 0 No caso de células embebidas para regeneração de tecido cartilaginoso na composição da presente invenção, as células são facilmente dispersas no gel curado. Dessa forma, a composição pode ser usada para várias formas de lesões da cartilagem, e é capaz de acomodar várias condições de aplicação.

A composição para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção é capaz de demonstrar efeitos terapêuticos em uma ampla gama de lesões por trauma de cartilagem por injeção em uma articulação em um estado 10 líquido. A composição demonstra pelo menos um efeito selecionado do grupo que consiste em reparo de cartilagem em uma lesão por trauma de cartilagem como observado, por exemplo, no envelhecimento, trauma, osteoartrite, lesão discai, lesão do menisco ou osteocondrite dissecante, 15 inibição de alterações cartilaginosas degenerativas, e proteção de cartilagem.

Além disso, a composição para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção possui o efeito de inibição de inflamação articular e supressão de dor 20 associada à inflamação. A composição demonstra ação analgésica por inibição de respostas inflamatórias da articulação, por exemplo, na osteoartrite, ombro congelado e artrite reumatóide.

A composição para o tratamento de uma doença da 25 cartilagem da presente invenção é capaz de inibir a progressão de doença da cartilagem e aliviar ou curar sintomas ao demonstrar efeitos reparadores, protetores e inibidores da degeneração em lesões mecânicas à cartilagem, inibindo, ao mesmo tempo, respostas inflamatórias e dor no 30 tecido articular. Em particular, a composição é útil para o tratamento de osteoartrite, tratamento de ombro congelado e alívio da dor articular associada à artrite reumatóide.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A FIG. 1 é um gráfico que mostra as taxas de sobrevida de células versus a concentração de várias soluções de CaCl2 (Exemplo 4) .

A FIG. 2 é um gráfico que mostra os efeitos comparativos de glóbulos purificados e de grau alimentício de alginato sobre as taxas de sobrevida de células nos glóbulos (Exemplo 5).

A FIG. 3 é um gráfico que mostra os resultados de análises por RT-PCR durante cultivo in vitro do Exemplo 6.

A FIG. 4 mostra fotografias dos resultados da coloração durante cultivo in vitro do Exemplo 6. (A) 15 alginato de sódio purificado - 21 dias de cultivo; (B) alginato de sódio purificado - 28 dias de cultivo; (C) alginato de sódio de grau alimentício - 21 dias de cultivo; (D) alginato de sódio de grau alimentício - 28 dias de cultivo. A coloração foi realizada com, da esquerda para a 20 direita, coloração com H-E, coloração com safranina-O, anticorpos anticolágeno anti-tipo I, anti-tipo II e anti- tipo X.

A FIG. 5 mostra fotografias que apresentam imagens obtidas durante um procedimento em um modelo de reparo de cartilagem de coelho do Exemplo 7.

A FIG. 6 é um gráfico que mostra os critérios para observações globais do escore em um modelo de reparo de cartilagem de coelho do Exemplo 7.

A FIG. 7 é um gráfico que mostra os critérios para

3 0 escore dos resultados da coloração em um modelo de reparo de cartilagem de coelho do Exemplo 7.

A FIG. 8 mostra fotografias de coloração de tecido de um grupo de controle (A) (vazio) em um modelo de reparo de cartilagem de coelho do Exemplo 7. A FIG. 8A mostra os 5 resultados após 4 semanas, enquanto a FIG. 8B mostra os resultados após 12 semanas. Os resultados são mostrados para, da esquerda para a direita, coloração com H-E, coloração com safranina-O, e imunocoloração de colágeno do tipo I e colágeno do tipo II.

A FIG. 9 mostra fotografias de coloração de tecido de

um alginato de grau alimentício + células (grupo C) em um modelo de reparo de cartilagem de coelho do Exemplo 7. A FIG. 9A mostra os resultados após 4 semanas, enquanto a FIG. 9B mostra os resultados após 12 semanas. Os métodos de coloração são iguais àqueles da FIG. 8.

A FIG. 10 mostra fotografias de coloração de tecido de um alginato purificado (sem células) (grupo D) em um modelo de reparo de cartilagem de coelho do Exemplo 7. A FIG. IOA mostra os resultados após 4 semanas, enquanto a FIG. IOB 20 mostra os resultados após 12 semanas. Os métodos de coloração são iguais àqueles da FIG. 8.

A FIG. 11 mostra fotografias de coloração de tecido de um alginato purificado + células (grupo E) em um modelo de reparo de cartilagem de coelho do Exemplo 7. A FIG. IlA 25 mostra os resultados após 4 semanas, enquanto a FIG. IlB mostra os resultados após 12 semanas. Os métodos de coloração são iguais àqueles da FIG. 8.

A FIG. 12 mostra os resultados de observações globais do escore e coloração em um modelo de reparo de cartilagem

3 0 de coelho do Exemplo 7. A FIG. 13 é um gráfico que mostra os resultados da medida da resistência mecânica para um alginato purificado (grupos D e E) em um modelo de reparo de cartilagem de coelho do Exemplo 7.

A FIG. 14 mostra fotografias obtidas durante um

experimento em um modelo de cadáver do Exemplo 8.

A FIG. 15 é um gráfico que mostra o relacionamento entre as concentrações (%) e os tempos de adesão (segundos) de várias soluções de alginato de sódio.

A FIG. 16 é um gráfico que mostra o relacionamento

entre viscosidade (mPa.s) e tempo de adesão (segundos) de uma solução de alginato de sódio.

A FIG. 17 mostra fotografias da aparência de articulações do joelho em um modelo de osteoartrite em coelho do Exemplo 12.

A FIG. 18 mostra fotografias de coloração de tecido de tecido da articulação do joelho em um modelo de osteoartrite em coelho do Exemplo 12.

A FIG. 19 mostra fotografias da aparência de articulações do joelho em um modelo de osteoartrite em coelho do Exemplo 13 após coloração com tinta nanquim (India ink) . Nas fotografias, as áreas circuladas indicam os limites entre lesões por trauma de cartilagem coradas com tinta nanquim e cartilagem normal. A) Grupo de controle; B) grupo de dose de hialuronato de sódio 1%; C) grupo de dose de alginato de sódio 2% (peso molecular: 400.000); D) grupo de dose de alginato de sódio 2% (peso molecular: 1.000.000); E) grupo de dose de alginato de sódio 2% (peso molecular: 1.700.000). Além disso, as fotografias mostram exemplos de várias amostras. A FIG. 2 0 mostra os resultados de escore achados macroscópicos de articulações do joelho coradas com tinta nanquim em um modelo de osteoartrite em coelho do Exemplo 13. NS, HA, AL40, AL100 e AL170, respectivamente, correspondem a (A) a (E) (igual à FIG. 19). O Grau 1 indica uma superfície não lesionada não corada com tinta nanquim (sem captação de tinta nanquim, indicando superfície intacta). O Grau 2 indica coloração focal com tinta nanquim e lesão leve da superfície (captação focal mínima de tinta nanquim, irregularidade da superfície leve). O Grau 3 indica coloração bem definida, grande, com tinta nanquim e fibrilação óbvia (manchas escuras focais grandes evidentes de tinta nanquim, franca fibrilação). 0 Grau 4a indica erosão de cartilagem menor do que 2 mm (erosão de cartilagem <2 mm). 0 Grau 4b indica erosão de cartilagem de

2 a 5 mm (erosão de cartilagem 2-5 mm) . O Grau 4c indica erosão de cartilagem acima de 5 mm (erosão de cartilagem >5 mm) .

A FIG. 21 mostra fotografias da coloração de tecido da

2 0 articulação do joelho com safranina-O em um modelo de

osteoartrite em coelho do Exemplo 13. (A) a (E) são iguais à FIG. 19. Além disso, as fotografias mostram exemplos de várias amostras.

A FIG. 22 mostra os resultados do escore de avaliações histopatológicas gerais em um modelo de osteoartrite em coelho do Exemplo 13. NS, HA, AL40, AL100 e AL170, respectivamente, correspondem a (A) a (E) (igual à FIG. 19) .

A FIG. 23 mostra alterações baseadas no tempo nos

3 0 escores de marcha em um modelo experimental em rato de dor da artrite do Exemplo 15. A) Grupo de controle (NS); B) grupo de dose de hialuronato de sódio 1% (HA 1%) ; C) grupo de dose de alginato de sódio 2% (peso molecular: 1.000.000)

(AL100 2%) ; D) grupo de dose de alginato de sódio 1% (peso molecular: 1.700.000) (AL170 1%); E) grupo de dose de alginato de sódio 2% (peso molecular: 1.700.000) (AL170 2%). *: p<0,05 vs. NS.

[TEXTO LIVRE DE LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS]

ID. DE SEQ. N0 1: DNA sintético ID. DE SEQ. N0 2 : DNA sintético ID. DE SEQ. N0 3 : DNA sintético ID. DE SEQ. N0 4 : DNA sintético ID. DE SEQ. N0 5 : DNA sintético ID. DE SEQ. N0 6 : DNA sintético ID. DE SEQ. N0 7 : DNA sintético ID. DE SEQ. N0 8 : DNA sintético ID. DE SEQ. N0 9 : DNA sintético ID. DE SEQ. N0 10 DNA sintético MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

2 0 Embora seja apresentada a seguir uma explicação

detalhada da presente invenção, as modalidades seguintes são exemplares para explicar a presente invenção, e a presente invenção pode ser realizada de várias formas, sem se afastar de seus objetivos.

1. Introdução

"Cartilagem" é encontrada nas articulações; parede torácica; discos intervertebrais; menisco; estruturas tubulares como, por exemplo, na garganta, trato respiratório e orelhas; e assim por diante; e é

classificada em três tipos que consistem em cartilagem hialina, cartilagem elástica e cartilagem fibrosa. Por exemplo, a cartilagem articular é classificada como cartilagem hialina, é composta por condrócitos, matriz extracelular colagenosa, proteoglicano e água, e não possui 5 intervenção vascular. A cartilagem hialina é rica em colágeno do tipo II, e é corada por anticorpos para colágeno do tipo II. Ela também é caracterizada por ser corada por coloração com safranina-0 usada para corar proteoglicano. Um "trauma de cartilagem" refere-se a um 10 estado no qual a cartilagem foi danificada em conseqüência de envelhecimento, trauma ou outros fatores, e inclui um estado no qual a função de cartilagem diminuiu com, por exemplo, uma diminuição na viscoelasticidade característica da cartilagem (que permite que a cartilagem seja comprimida 15 lentamente quando submetida a uma carga e depois retorne lentamente ao seu estado original quando a carga é removida), causando, dessa forma, redução da habilidade da cartilagem para suportar uma carga, mantendo a mobilidade. A lesão da cartilagem é observada em doenças como 20 osteoartrite e artrite reumatóide. A presente invenção está relacionada a uma composição curável para a regeneração de cartilagem que pode ser aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem desse tipo. Um "defeito de cartilagem" refere-se a uma lesão por trauma de cartilagem na qual uma porção da 25 cartilagem está ausente, e indica um vazio no tecido cartilaginoso e no tecido circundante que forma o vazio. A composição da presente invenção é usada preferivelmente para o tratamento de um "defeito de cartilagem".

Mais especificamente, a presente invenção é uma

3 0 composição para a regeneração de cartilagem que é aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem, contém um sal de metal monovalente de ácido algínico para o qual o nível de endotoxina deste foi reduzido a um grau que não induza substancialmente febre ou inflamação, e possui a 5 viscosidade de 400 a 20.000 mPa.s.

Conseqüentemente, como a composição da presente invenção é capaz de promover eficazmente a regeneração de cartilagem em uma área afetada, demonstra aderência satisfatória à lesão por trauma de cartilagem e pode ser 10 aplicada com uma seringa ou semelhante, é facilmente aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem.

Na presente invenção, "regeneração de cartilagem" ou "regeneração de tecido cartilaginoso" refere-se à restauração da função de uma lesão por trauma de cartilagem para a qual a função de cartilagem foi prejudicada ou perdida. Na presente invenção, a restauração da função não exige necessariamente que a função seja completamente restaurada, e sim que a função seja restaurada em um grau maior do que o estado da lesão por trauma de cartilagem antes da aplicação da presente composição. Caso se atribua um valor de 100% ao estado da cartilagem normal antes da lesão e um valor de 0% ao estado de trauma de cartilagem antes da aplicação da presente composição, a função de cartilagem é preferivelmente restaurada até 3 0% ou mais desta, mais preferivelmente, até 50% ou mais desta, ainda mais preferivelmente, até 80% ou mais desta e, particularmente, de preferência, até um estado quase equivalente àquele antes da lesão. A proporção de cartilagem que não cartilagem hialina, por exemplo, cartilagem fibrosa, na cartilagem regenerada é preferivelmente baixa. Além disso, "tratamento de uma lesão por trauma de cartilagem" ou "tratamento de um defeito de cartilagem" refere-se ao alívio ou à cura dos sintomas deste por regeneração da cartilagem em lesões por trauma de 5 cartilagem ou defeitos de cartilagem observados no envelhecimento, trauma, osteoartrite, lesão discai ou lesão do menisco, osteocondrose dissecante, e semelhantes.

Além disso, "aplicação em uma lesão por trauma de cartilagem" refere-se ao uso de uma composição para a 10 regeneração de cartilagem e semelhantes por contato com uma lesão por trauma de cartilagem e, preferivelmente, ao uso da composição da presente invenção por injeção em um defeito de cartilagem para preencher aquele defeito de cartilagem. Alternativamente, a composição da presente 15 invenção pode ser usada para formar ainda um ou mais orifícios comparativamente pequenos em uma lesão por trauma de cartilagem e, preferivelmente, um defeito de cartilagem, e injeção da composição da presente invenção nos orifícios para preencher os orifícios. A aplicação na lesão por

2 0 trauma de cartilagem é realizada preferivelmente de tal

forma que o vazio total de uma área afetada seja preenchido suficientemente. A área afetada é preferivelmente submetida ao pré-tratamento necessário e irrigada, se necessários, antes da aplicação da presente composição. A irrigação da 25 área afetada refere-se à utilização de soro fisiológico, por exemplo, para remover componentes sangüíneos e outros tecidos e semelhantes desnecessários no local onde a composição da presente invenção for aplicada. Após a irrigação, a área afetada é preferivelmente seca, por

3 0 exemplo, enxugando-se quaisquer componentes líquidos desnecessários e semelhantes restantes, seguido por aplicação da composição da presente invenção.

Na presente invenção, "doença da cartilagem" refere-se a uma doença que ocorre pelo fato de a cartilagem, o tecido 5 cartilaginoso e/ou o tecido articular (por exemplo, a membrana sinovial, cápsula articular ou osso subcondral) ter sido lesionado por irritação mecânica ou resposta inflamatória. "Tratamento de doença da cartilagem" refere- se ao alívio, melhora e/ou cura de vários sintomas do 10 tecido que foi lesionado por irritação mecânica ou pela resposta inflamatória. Por exemplo, em casos de osteoartrite, há a ocorrência de sintomas compostos como, por exemplo, desgaste da cartilagem articular, degeneração de tecido cartilaginoso, inflamação da membrana sinovial ou 15 dor associada à inflamação. Por outro lado, em casos de ombro congelado, os sintomas consistem primariamente em inflamação da membrana sinovial e da cápsula articular, além da dor a ela associada, enquanto podem não ser observados desgaste e degeneração da cartilagem. Embora o

2 0 mecanismo de ocorrência da artrite reumatóide não seja

totalmente compreendido, acredita-se que sejam destruídos tecido sinovial e tecido cartilaginoso por citocinas inflamatórias resultantes de uma resposta autoimune. Dessa forma, a doença da cartilagem é uma doença que se apresenta 25 com sintomas compostos, e são necessários fármacos para o tratamento destes que tenham efeitos compostos, incluindo proteção de cartilagem contra o desgaste, inibição de alterações degenerativas na cartilagem em conseqüência de desgaste ou inflamação, reparo de lesões por trauma de

3 0 cartilagem, e inibição de inflamação e dor. A "composição que contém um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico" da presente invenção possui os efeitos de proteção da cartilagem contra irritação mecânica, inibição de alterações degenerativas na 5 cartilagem causadas por desgaste ou inflamação, reparo de lesões por trauma de cartilagem, e inibição de inflamação e dor do tecido articular. Como resultado, a composição é capaz de inibir o progresso da doença da cartilagem, e aliviar, melhorar e/ou curar os sintomas. Em particular, a 10 composição é útil para o tratamento de osteoartrite, tratamento de ombro congelado e alívio da dor articular associada à artrite reumatóide.

Além disso, "injeção em uma articulação" refere-se à injeção de uma composição líquida que possui fluidez, por 15 exemplo, em uma cavidade articular, bolsa sinovial ou região peritendínea. Quando usada para o tratamento de osteoartrite, a composição é injetada preferivelmente em uma cavidade articular. Além disso, embora a osteoartrite possa ocorrer em várias articulações do corpo, incluindo

2 0 aquelas dos joelhos, ombros, costelas, região lombar,

tornozelos, punhos e dedos, a composição da presente invenção pode ser aplicada a qualquer uma dessas articulações.

2. Sal de metal monovalente de ácido algínico 0 "sal de metal monovalente de ácido algínico" contido

na composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção é um sal hidrossolúvel formado por troca iônica entre um átomo de hidrogênio de ácido carboxílico na posição 6 do

3 0 ácido algínico e um íon de metal monovalente como, por exemplo, Na+ ou K+. Embora exemplos específicos de sais metálicos monovalentes do ácido algínico incluam alginato de sódio e alginato de potássio, o alginato de sódio que pode ser adquirido como um produto comercialmente 5 disponível é particularmente preferível. Uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico forma um gel quando misturada com um agente de entrecruzamento.

0 "ácido algínico" usado na presente invenção é um polissacarídeo biodegradável de alto peso molecular, que é 10 um polímero obtido por polimerização linear de dois tipos de ácidos urônicos na forma de ácido D-manurônico (M) e ácido L-glurônico (G) . Mais especificamente, o ácido algínico é um copolímero em bloco no qual uma fração de homopolímero de ácido D-manurônico (fração MM), uma fração 15 de homopolímero de ácido L-glurônico (fração GG) e uma fração, nas quais ácido D-manurônico e ácido L-glurônico estão dispostos aleatoriamente (fração MG) , são ligadas arbitrariamente. A proporção composta do ácido D-manurônico para o ácido L-glurônico do ácido algínico (proporção M/G)

2 0 varia principalmente de acordo com o tipo de alga ou de outro organismo que serve como sua origem, é afetada pelo habitat e a estação daquele organismo, e varia em uma grande faixa de um tipo rico em G que possui uma proporção M/G de cerca de 0,4, até um tipo rico em M que possui uma

2 5 proporção M/G de cerca de 5.

Um sal de metal monovalente de ácido algínico é um polissacarídeo e, embora seja difícil determinar precisamente o peso molecular, ele geralmente possui um peso molecular ponderai médio de 10.000 a 10.000.000 e preferivelmente 50.000 a 3.000.000. Como o efeito de regeneração de cartilagem em lesões por trauma de cartilagem e, particularmente, o efeito de regeneração de cartilagem hialina, diminui se o peso molecular for excessivamente baixo, o sal de metal monovalente de ácido algínico usado na presente invenção preferivelmente possui um peso molecular ponderai médio de 500.000 ou mais. Em particular, o alginato de sódio que possui um peso molecular ponderai médio de 500.000 ou mais possui o efeito inesperado de regenerar cartilagem hialina, mesmo no estado que não contém células embebidas, e é adequado ao uso como uma composição para regeneração de cartilagem. Além disso, como o efeito de regeneração de cartilagem também contribui vantajosamente para o reparo de lesões por trauma de cartilagem em doenças da cartilagem, ele também é adequado ao uso como uma composição para o tratamento de uma doença da cartilagem. Na verdade, foram observados efeitos terapêuticos superiores para o ácido algínico com alto peso molecular, comparado com o ácido algínico com baixo peso molecular em um modelo de OA em coelho. 0 alginato de sódio que possui um peso molecular ponderai médio de 1.000.000 e

1.700.000, como determinado por cromatografia por filtração em gel, demonstrou efeitos inibidores de alteração cartilaginosa degenerativa, efeitos protetores da cartilagem e efeitos de reparo de cartilagem superiores, 25 comparado com o alginato de sódio que possui um peso molecular de 410.000. No cálculo do peso molecular de um polissacarídeo por cromatografia por filtração em gel, há normalmente o potencial para um erro na medida de 10 a 20%. Por exemplo, um peso molecular de 400.000 pode flutuar em

3 0 uma faixa de 320.000 a 480.000, um peso molecular de 500.000 pode flutuar em uma faixa de 400.000 a 600.000, e um peso molecular de 1.000.000 pode flutuar em uma faixa de

800.000 a 1.200.000. Dessa forma, a faixa de peso molecular ponderai médio preferível de um sal de metal monovalente de

ácido algínico para os quais os efeitos sobre a cartilagem são particularmente superiores é de pelo menos 500.000 ou mais, mais preferivelmente 650.000 ou mais, e ainda mais preferivelmente 800.000 ou mais. Além de a produção ser difícil, na medida em que ocorrem problemas como, por

exemplo, viscosidade sendo excessivamente elevada quando se prepara uma solução aquosa, ou diminuição da solubilidade caso o peso molecular seja excessivamente elevado, o peso molecular ponderai médio é preferivelmente 5.000.000 ou menos e, mais preferivelmente, 3.0 0 0.000 ou menos.

Como substâncias com alto peso molecular derivadas de

uma origem natural tipicamente não possuem um peso molecular único, mas sim consistem em um agregado de moléculas que possuem vários pesos moleculares, o peso molecular é medido na forma de uma distribuição de peso

2 0 molecular que possui uma certa faixa. Uma técnica de

medição típica é a cromatografia por filtração em gel. Exemplos típicos de informações obtidas da distribuição de peso molecular, como determinada por cromatografia por filtração em gel, incluem o peso molecular ponderai médio

(Mw), peso molecular médio (Mn) e proporção de variância (Mw/Mn).

O peso molecular ponderai médio enfatiza a contribuição do peso molecular médio de polímeros que possuem um peso molecular grande, e é representado com a

3 0 seguinte fórmula: Mw = Σ (WiMi)/W = Σ (HiMi)/Σ (Hi)

O peso molecular médio é calculado dividindo-se o peso total de polímeros pelo número total de polímeros.

Mn = W/ΣΝϊ = Σ(MiNi)/Σνϊ = Σ(Hi)/Σ(Hi/Mi)

Aqui, W representa o peso total de todos os polímeros,

Wi representa o peso do polímero ith, Mi representa o peso molecular no tempo de eluição de ith, Ni representa o número de pesos moleculares Mi, e Hi representa a altura no tempo de eluição de ith.

Como os efeitos da regeneração de cartilagem (e

particularmente os efeitos de regeneração de cartilagem hialina) em lesões por trauma de cartilagem, os efeitos de reparo de cartilagem, os efeitos de inibição de alterações cartilaginosas degenerativas e/ou os efeitos protetores da

cartilagem no tratamento da doença da cartilagem são considerados como sendo grandemente influenciados pelas espécies moleculares que possuem pesos moleculares grandes, o peso molecular ponderai médio podendo ser usado como um indicador do peso molecular.

2 0 Sabidamente ocorrem diferenças nos valores de acordo

com os métodos de medição na medida de pesos moleculares de substâncias com alto peso molecular derivadas de uma origem natural (exemplo de ácido hialurônico: Chikako Yomota e cols., Buli. Natl. Health Sci., Vol. 117, páginas 135-139

(1999), Chikako Yomota e cols., Buli. Natl. Health Sci., Vol. 121, páginas 30-33 (2003)) . Os métodos para a medição do peso molecular de alginato descritos na literatura incluem um método no qual o peso molecular é calculado a partir da viscosidade intrínseca, e um método no qual o

3 0 peso molecular é calculado por cromatografia por exclusão de tamanho com Detecção de Dispersão de Luz de Laser por Múltilpos Ângulos (SEC-MALLS) (ASTM F2064-00 (2006), publicado por ASTM International). Além disso, também está descrito na literatura que, na medição do peso molecular por cromatografia por exclusão de tamanho (cromatografia por filtração em gel) , o cálculo a partir de uma curva de calibração usando pululana para a substância-padrão é insuficiente, e recomenda-se que a medição do peso molecular seja usada em combinação com detector de dispersão de luz de laser por múltilpos ângulos (MALLS) (especificamente, medição por SEC-MALLS). Além disso, também há exemplos do uso de pesos moleculares determinados por SEC-MALLS que são utilizados como especificações de catálogo de alginatos (FMC Biopolimer Inc., "PR0N0VA™ Sodium Alginates Catalog").

Os inventores da presente invenção verificaram que há diferenças nos efeitos terapêuticos de alginato de sódio com diferentes pesos moleculares em um modelo de OA, e mediram os pesos moleculares desses alginatos por 20 cromatografia por filtração em gel e SEC-MALLS. Como resultado, os pesos moleculares foram determinados por cromatografia por filtração em gel para demonstrar uma correlação maior com a viscosidade e os efeitos terapêuticos dos alginatos. Especificamente, foi agora 25 constatado que, em vez do método SEC-MALLS geralmente recomendado, o peso molecular determinado por cromatografia por filtração em gel é adequado como parâmetro para a especificação da faixa de peso molecular preferível de alginatos usados em uma composição para regeneração de

3 0 cartilagem ou tratamento de doença da cartilagem. Dessa forma, quando se especifica o peso molecular de um alginato na presente especificação, aquele peso molecular é o peso molecular ponderai médio calculado por cromatografia por filtração em gel, a menos que especificamente estabelecido de forma diferente.

As condições preferíveis para a cromatografia por filtração em gel são como indicadas nos exemplos. Uma condição típica consiste no uso de uma curva de calibração usando pululana para a substância-padrão. De preferência, é

usada pululana com um peso molecular de pelo menos

1.600.000, 788.000, 404.000, 212.000 e 112.000 para a substância-padrão. Além disso, o eluato (solução de nitrato de sódio 200 mM) , as condições da coluna e semelhantes também podem ser especificadas. As condições da coluna

preferivelmente consistem na utilização de um enchimento baseado em resina de polimetacrilato e usando pelo menos uma coluna com um valor de corte do peso molecular de

10.000.000 ou mais. Um exemplo típico de uma coluna é a coluna TSkgel GMPWxl (diâmetro: 7,8 mm x 300 mm) (Tosoh

2 0 Corp.).

Embora um sal de metal monovalente de ácido algínico possua um peso molecular grande e alta viscosidade quando inicialmente isolado de algas marrons, o peso molecular diminui e a viscosidade se reduz durante a evolução do

processo de secagem por aquecimento, Iiofilização, purificação, e semelhantes. Dessa forma, podem ser produzidos sais metálicos monovalentes de ácido algínico com diferentes pesos moleculares controlando-se adequadamente a temperatura em cada etapa de produção. Sais

3 0 metálicos monovalentes de ácido algínico que possuem um peso molecular elevado são obtidos por controle da temperatura em cada uma das etapas de produção para que ela seja um pouco baixa, enquanto os sais metálicos monovalentes de ácido algínico com um peso molecular baixo 5 são obtidos por controle da temperatura em cada etapa de produção para que ela seja um pouco elevada. Além disso, também podem ser produzidos sais metálicos monovalentes de ácido algínico com diferentes pesos moleculares por uma técnica como, por exemplo, selecionando-se adequadamente as 10 algas marrons usadas como matéria-prima, ou fracionando-se de acordo com o peso molecular no processo de produção. Além disso, um sal de metal monovalente de ácido algínico com um peso molecular-alvo também pode ser obtido misturando-se um sal de metal monovalente de ácido algínico 15 produzido de acordo com vários processos de produção com um lote diferente do sal de metal monovalente de ácido algínico com um peso molecular ou viscosidade diferente após ter sido medido o peso molecular ou a viscosidade deste.

2 0 Embora o ácido algínico usado na presente invenção

possa ser de origem natural ou sintético, ele preferivelmente é derivado de uma origem natural. Exemplos de ácidos algínicos de ocorrência natural incluem aqueles extraídos de algas marrons. Embora algas marrons que contêm 25 ácido algínico sejam encontradas predominantemente ao longo dos litorais em todo o mundo, as algas que realmente podem ser usadas como matérias-primas de ácido algínico são limitadas, com exemplos típicos destas incluindo espécies de Lessonia encontradas na América do Sul, espécies de

3 0 Macrocystis encontradas na América do Norte, espécies de Laminaria e Ascophyllum encontradas na Europa e espécies de Durvillea encontradas na Austrália. Exemplos de algas marrons que servem como matérias-primas de ácido algínico incluem espécies de Lessonia, espécies de Macrocystis, 5 espécies de Laminaria, espécies de Ascophyllum, espécies de Durvillea, espécies de Eisenia, e espécies de Ecklonia.

3. Tratamento de redução de endotoxina

0 sal de metal monovalente de ácido algínico contido na composição para regeneração de cartilagem ou tratamento 10 de uma doença da cartilagem da presente invenção é um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico. Endotoxina inferior refere-se ao fato de que o nível de endotoxina deste foi substancialmente reduzido até um grau que não induz inflamação ou febre. Especificamente, 15 o sal de metal monovalente de ácido algínico foi submetido ao tratamento de redução de endotoxina. Foi constatado surpreendentemente que, ao ser submetida a esse tratamento de redução de endotoxina, além de ser capaz de aumentar a ação regenerativa da cartilagem da composição quando

2 0 aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem, a regeneração de osso subcondral pode ser promovida e a resistência mecânica da área afetada pode ser aumentada. Especificamente, utilizando-se ácido algínico com endotoxina inferior na composição da presente invenção, 25 pode ser obtida uma composição que possui bioafinidade elevada e que não induz degeneração e respostas inflamatórias na cartilagem circundante.

0 tratamento de redução de endotoxina pode ser realizado por um método conhecido ou por um método compatível. Por exemplo, esse tratamento pode ser realizado pelo método de Suga e cols. que envolve a purificação de hialuronato de sódio (veja, por exemplo, Pedido de Patente Japonesa em aberto N0 H9-324001), pelo método de Yoshida e cols. que envolve a purificação de pi,3-glucano (veja, por exemplo, Pedido de Patente Japonesa em aberto N0 H8- 269102), pelo método de William e cols. que envolve a purificação de um biopolímero como, por exemplo, alginato ou goma gelana (veja, por exemplo, Tradução Japonesa Publicada N0 2002-530440 da Publicação Internacional PCT), pelo método de James e cols. que envolve a purificação de polissacarídeo (veja, por exemplo, Publicação Internacional panfleto N0 93/13136), pelo método de Lewis e cols. (veja, por exemplo, Patente U.S. N0 5589591), pelo método de Hermanfranck e cols. que envolve a purificação de alginato (veja, por exemplo, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1994), 40: 638-643), ou por um método compatível. 0 tratamento de redução de endotoxina da presente invenção não se limita a esses métodos, mas sim pode ser realizado por um método conhecido como, por exemplo, limpeza, purificação com a utilização de filtração com filtro (filtro de remoção de endotoxina ou filtro de eletrificação), ultrafiltração ou uma coluna (por exemplo, uma coluna de afinidade de adsorção de endotoxina, coluna de filtração em gel ou coluna de troca iônica), adsorção a uma substância hidrofóbica, resina ou carbono ativado, e semelhantes, tratamento com solvente orgânico (por exemplo, extração com um solvente orgânico ou precipitação ou deposição por adição de solvente orgânico), tratamento com tensoativo (veja, por exemplo, Pedido de Patente Japonesa em aberto N0 2005-036036), ou uma combinação adequada destas. Um método conhecido como, por exemplo, separação por centrifugação, pode ser adequadamente combinado com essas etapas de tratamento. De preferência, o tratamento de redução de endotoxina é adequadamente selecionado de acordo com o tipo 5 de ácido algínico.

O nível de endotoxina pode ser confirmado por um método conhecido, e pode ser medido usando um método conhecido como, por exemplo, um método que utiliza um reagente limulus (LAL) ou um método que utiliza um conjunto 10 Endospecy (marca registrada) ES-24S (Seikagaku Corp.). Embora não haja limitações específicas sobre o método de tratamento de endotoxina do ácido algínico contido na composição da presente invenção, o teor de endotoxina do sal de metal monovalente de ácido algínico, quando se mede 15 a endotoxina usando um reagente limulus (LAL), é preferivelmente de 500 unidades de endotoxina (EU)/g ou menos, mais preferivelmente 100 EU/g ou menos, ainda mais preferivelmente 50 EU/g ou menos e, em especial, preferivelmente 3 0 EU/g ou menos como resultado desse

2 0 método. O alginato de sódio que passou por tratamento de redução de endotoxina pode ser adquirido como produtos comercialmente disponíveis como, por exemplo, "Sea Matrix" (esterilizado) (Kimica Corp., Mochida International Ltd.) e Pronova™ UP LVG (FMC) .

2 5 4. Preparação de uma solução de sal de metal

monovalente de ácido algínico

A composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem pode ser preparada por utilização de uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico. A solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico pode ser preparada por um método conhecido ou por um método compatível. Especificamente, o sal de metal monovalente de ácido algínico usado na presente invenção pode ser produzido por 5 um método conhecido como, por exemplo, um método de ácido ou um método de cálcio usando as algas marrons descritas previamente. Mais especificamente, após extração dessas algas marrons usando uma solução aquosa alcalina como, por exemplo, uma solução aquosa de carbonato de sódio, por 10 exemplo, o ácido algínico pode ser obtido por adição de um ácido (por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico), e um sal de ácido algínico pode ser obtido por troca iônica do ácido algínico. O tratamento de redução de endotoxina é então efetuado como descrito previamente. Não há limitações 15 específicas sobre o solvente do sal de ácido algínico, desde que seja um solvente que possa ser aplicado in vivo, e exemplos desses solventes incluem água purificada, água destilada, água de troca iônica, água Milli-Q, soro fisiológico, e solução salina tamponada com fosfato (PBS). 20 Esses são preferivelmente esterilizados e preferivelmente submetidos ao tratamento de redução de endotoxina. Por exemplo, pode ser usada água Milli-Q após esterilização por filtração. A composição de regeneração de cartilagem ou de tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção 25 também pode ser obtida, por exemplo, por mistura de um sal de metal monovalente de ácido algínico em um meio que contém células, sem dissolução do sal de metal monovalente de ácido algínico no solvente mencionado acima. Além disso, o procedimento para a obtenção da composição da presente

3 0 invenção é preferivelmente realizado em um ambiente com níveis baixos de endotoxinas e bactérias. Por exemplo, o procedimento é preferivelmente realizado em uma bancada limpa usando aparelhos esterilizados, e os aparelhos usados podem ser tratados com um agente de remoção de endotoxina disponível comercialmente.

Quando se produz uma composição como descrita acima com a utilização de um sal de metal monovalente de ácido algínico que foi purificado até um nível de endotoxina preferível, o teor de endotoxina da composição é

normalmente de 500 EU/g ou menos, mais preferivelmente 300 EU/g ou menos e, em especial, preferivelmente 150 EU/g ou menos.

5. Viscosidade da composição para regeneração de cartilagem ou para tratamento de uma doença de cartilagem

Embora não haja limitações específicas sobre a

viscosidade da composição para a regeneração de cartilagem da presente invenção desde que sejam obtidos os efeitos da presente invenção, ela é preferivelmente de 400 a 20.000 mPa.s. A composição da presente invenção pode ser ajustada

2 0 até uma viscosidade adequada por utilização, por exemplo,

do solvente mencionado acima. Caso a viscosidade esteja dentro dessa faixa, a aderência a uma lesão por trauma de cartilagem é favorável e a composição pode ser injetada em uma cavidade articular ou lesão por trauma de cartilagem

com uma seringa ou semelhante. Além disso, caso a viscosidade da composição para a regeneração de cartilagem seja de cerca de 2.000 mPa.s ou mais, a aderência a uma lesão por trauma de cartilagem será ainda mais favorecida, e caso a viscosidade seja de cerca de 5.000 mPa.s ou mais

3 0 em particular, mesmo se a abertura de um defeito de cartilagem estiver virada para baixo como, por exemplo, no caso da manipulação artroscópica de um trauma de cartilagem na superfície de uma articulação femoral humana, por exemplo, a composição da presente invenção poderá ser 5 colocada em contato com a superfície da lesão por trauma de cartilagem por injeção da composição da presente invenção no defeito de cartilagem e deixando-se que ela seja nele aderida por pelo menos um minuto na ausência de fixação. A superfície da composição pode ser fixada, se necessário, 10 durante o tempo em que estiver aderindo. A aderência à lesão por trauma de cartilagem aumenta ainda mais à medida que a viscosidade aumenta e, no caso de uma viscosidade de

10.000 mPa.s, por exemplo, a composição pode ser aderida sem fixação por um período de tempo mais longo, em 15 comparação com uma viscosidade de 5.000 mPa.s. Dessa forma, quando a composição da presente invenção for aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem no estado no qual uma abertura de um defeito de cartilagem ou uma abertura de um orifício formado em uma lesão por trauma de cartilagem ou 20 defeito de cartilagem esteja inclinada ou virada para baixo, a composição da presente invenção será aderida à lesão por trauma de cartilagem por pelo menos 5 segundos, preferivelmente por pelo menos 10 segundos, mais preferivelmente por pelo menos 3 0 segundos e, em especial, 25 preferivelmente por pelo menos 1 minuto, sem a utilização de um meio de fixação. Em conseqüência do ajuste de sua viscosidade, a composição da presente invenção pode permanecer por tempo suficiente até que um meio de fixação seja aplicado à superfície da composição. Aqui, "aderência

3 0 a uma lesão por trauma de cartilagem" refere-se à permanência da composição da presente invenção na lesão por trauma de cartilagem, sem sair dela. Dessa forma, em conseqüência do ajuste de sua viscosidade, a composição da presente invenção oferece a vantagem de permitir o 5 tratamento a ser realizado por um procedimento simples na forma de injeção, mesmo se a área afetada estiver posicionada de tal forma que seja difícil realizar o tratamento por um cirurgião, por exemplo, quando a área afetada estiver virada para baixo.

Por outro lado, a composição da presente invenção é

injetada mais facilmente com uma seringa ou semelhante quando sua viscosidade for de cerca de 20.000 mPa.s ou menos. Embora a composição possa ser injetada com uma seringa ou semelhante mesmo se, por exemplo, sua 15 viscosidade for de cerca de 20.000 mPa.s, quando a injeção for difícil em função da viscosidade excessivamente elevada, a composição da presente invenção poderá ser aplicada à superfície de uma lesão por trauma de cartilagem utilizando-se outros meios. Do ponto de vista de facilidade 20 de manipulação da seringa, a viscosidade da composição da presente invenção é preferivelmente de 20.000 mPa.s ou menos e, mais preferivelmente, 15.000 mPa.s ou menos. Dessa forma, a viscosidade da composição da presente invenção aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem no estado no 25 qual uma abertura de um defeito de cartilagem ou uma abertura de um orifício formado em uma lesão por trauma de cartilagem ou defeito de cartilagem esteja inclinada ou virada para baixo é preferivelmente de cerca de 2.000 mPa.s ou mais do ponto de vista de aderência, preferivelmente

3 0 cerca de 2 0.000 mPa.s ou menos do ponto de vista de facilidade de manipulação da composição e, preferivelmente,

3.000 a 15.000 mPa.s, mais preferivelmente 4.000 a 10.000 mPa.s e, particularmente, de preferência 5.000 a 6.000 mPa.

Caso a viscosidade da composição da presente invenção seja de cerca de 400 mPa.s ou mais, a composição será capaz de demonstrar adequadamente os efeitos da presente invenção ao ser aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem. Por exemplo, quando a presente invenção é capaz de funcionar no estado no qual o lado que contém uma abertura de um defeito de cartilagem estiver virado para cima, a composição da presente invenção poderá ser injetada na lesão por trauma de cartilagem para que haja um contato da composição da presente invenção com a superfície da lesão por trauma de cartilagem, seguida por fixação da superfície da composição. A injeção com uma seringa ou semelhante pode ser realizada facilmente em função da baixa viscosidade da composição. Caso a viscosidade da composição seja de cerca de 5000 mPa.s, por exemplo, a composição poderá ser aplicada em toda a lesão por trauma de cartilagem por formação de um ou mais orifícios extremamente pequenos na lesão por trauma de cartilagem como, por exemplo, quando há cartilagem residual no local da lesão por trauma de cartilagem.

Embora não haja limitações específicas sobre a 25 viscosidade da injeção da composição para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção em uma articulação desde que sejam obtidos os efeitos terapêuticos sobre a doença da cartilagem, a viscosidade é preferivelmente de 100 a 20.000 mPa.s. A viscosidade é 30 preferivelmente de 200 a 15.000 mPa.s, mais preferivelmente 400 a 10.000 mPa.s e, particularmente, de preferência 1.000 a 6.00 0 mPa.s. O uso de uma viscosidade adequada torna possível demonstrar o efeito de compensação da função amortecedora do líquido sinovial, tornando possível, dessa 5 forma, demonstrar o efeito de tratamento de uma doença da cartilagem em um estado disperso no líquido sinovial.

A viscosidade da composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem pode ser ajustada, por exemplo, pelo controle da 10 concentração de ácido algínico na solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico ou pelo controle do peso molecular do ácido algínico.

A viscosidade da solução do sal de metal monovalente de ácido algínico aumenta quando a concentração de ácido 15 algínico na solução é elevada e diminui quando a concentração de ácido algínico na solução é baixa. Embora não seja possível estabelecer de forma inequívoca a influência do peso molecular, a concentração preferível de ácido algínico na solução do íon de metal monovalente de

2 0 ácido algínico é aproximadamente de 1 a 5% p/v, mais preferivelmente, 1,5 a 3% p/v e, em especial, preferivelmente 2 a 2,5% p/v.

O sal de metal monovalente de ácido algínico inicialmente possui um peso molecular elevado e viscosidade

2 5 aumentada quando extraído de algas marrons, embora a

concentração seja constante, e o peso molecular diminui durante o processo de secagem por aquecimento, Iiofilização, purificação e semelhantes, eventualmente resultando em uma viscosidade um pouco baixa. A viscosidade

3 0 varia constantemente para o ácido algínico extraído das mesmas algas marrons. Além disso, os valores medidos de viscosidade também variam de acordo com o instrumento de medição e com as condições de medição. Dessa forma, uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico 5 com aderência superior a uma lesão por trauma de cartilagem e para a qual o nível de endotoxina desta foi reduzido está incluída dentro do escopo da presente invenção.

Pode ser selecionado um sal de metal monovalente de ácido algínico que possua um peso molecular elevado para se 10 obter uma composição com aderência superior a uma área afetada e viscosidade elevada por uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico com uma concentração baixa.

Como a viscosidade da solução de um sal de metal 15 monovalente de ácido algínico é afetada pela proporção M/G, pode ser adequadamente selecionado um ácido algínico que possua uma proporção M/G mais preferível para a viscosidade da solução e semelhantes. A proporção M/G de ácido algínico usado na presente invenção é de cerca de 0,4 a 4,0, 20 preferivelmente cerca de 0,8 a 3,0 e, mais preferivelmente, cerca de 1,0 a 1,6.

Como descrito previamente, como a proporção M/G é determinada primariamente pelo tipo de algas, o tipo de algas marrons usado para a matéria-prima possui um efeito 25 sobre a viscosidade da solução do sal de metal monovalente de ácido algínico. 0 ácido algínico usado na presente invenção é derivado preferivelmente de algas marrons dos gêneros Lessonia, Macrocystis, Laminaria, Ascophyllum e Durvillea, mais preferivelmente, derivado de algas marrons

3 0 dos gêneros Lessonia e, particularmente, de preferência, algas marrons de Lessonia nigrescens.

Além disso, a viscosidade da composição pode ser ajustada, por exemplo, pela quantidade de células embebidas (veja a descrição abaixo) presente na solução do sal de metal monovalente de ácido algínico. Caso a composição da presente invenção possua células embebidas, a viscosidade da composição da presente invenção será ajustada preferivelmente com base na viscosidade da composição após as células terem sido embebidas. No entanto, quando se utilizam células embebidas na prática clínica, é difícil efetuar uma etapa para ajuste da viscosidade após as células terem sido embebidas. Dessa forma, quando a composição da presente invenção possui células embebidas, a viscosidade da composição antes que as células sejam embebidas pode ser considerada como sendo a viscosidade da composição da presente invenção.

Um aspecto da composição da presente invenção é uma composição para a regeneração de cartilagem por aplicação em uma lesão por trauma de cartilagem em que células-tronco 20 mesenquimais da medula óssea e/ou células estromais mesenquimais da medula óssea são incluídas em uma composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico para o qual o nível de endotoxina deste foi reduzido a um grau que não induza substancialmente febre ou 25 inflamação, que possui a viscosidade de 400 a 20.000 mPa.s, e que possui fluidez.

6. Células embebidas

A composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente

3 0 invenção pode ter células embebidas para a regeneração de tecido cartilaginoso em uma composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico e, preferivelmente, pode ter células embebidas para a regeneração de tecido cartilaginoso em uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico. 0 termo "embebida", como usado na presente invenção, refere-se à suspensão de células para a regeneração de tecido cartilaginoso em uma composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico e, preferivelmente, à suspensão de células para a geração de tecido cartilaginoso em uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico. Como resultado, a regeneração de cartilagem pode ser promovida mais eficazmente e a resistência da cartilagem à qual a composição da presente invenção foi aplicada pode ser ainda mais aumentada. De preferência, as células são dispersas na composição da presente invenção. Embora exemplos dessas células incluam células-tronco e células estromais, e não haja limitações específicas sobre sua origem, exemplos destas incluem células da medula óssea, adipócitos e sangue do cordão umbilical. Essas células são preferivelmente células-tronco mesenquimais da medula óssea ou células estromais mesenquimais da medula óssea. Outros exemplos incluem células precursoras de cartilagem, condrócitos, sinoviócitos, células-tronco eritropoiéticas e células ES. Uma ou mais dessas células podem ser embebidas. Como "células-tronco" em particular possuem auto-regeneração e habilidade de diferenciação múltipla, a utilização dessas células-tronco para a regeneração de cartilagem permite a regeneração de cartilagem histologicamente superior com resistência mecânica superior. Embora as células-tronco incluam células-tronco embrionárias e células-tronco mesenquimais da medula óssea, como as células-tronco mesenquimais da medula óssea permitem o uso de células autólogas adultas, elas são adquiridas facilmente e são 5 adequadas ao uso para regeneração de cartilagem. Além disso, como as células-tronco mesenquimais da medula óssea podem se diferenciar tanto em osso quanto em cartilagem, nos casos em que, por exemplo, uma lesão se estende até o osso, além da cartilagem, essas células são capazes de 10 regenerar osso no local do osso e cartilagem no local da cartilagem. Por suspensão de células-tronco mesenquimais da medula óssea em uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico e injeção em uma articulação, a suspensão pode ser usada para tratar uma doença da cartilagem. Dessa 15 forma, embora as células usadas na presente invenção consistam preferivelmente em uma proporção elevada de células-tronco mesenquimais da medula óssea, na medida em que é difícil isolar essas células completamente, as células-tronco mesenquimais da medula óssea estão entre as

2 0 células para a regeneração de tecido cartilaginoso da presente invenção preferivelmente a 30% ou mais, mais preferivelmente a 50% ou mais, ainda mais preferivelmente a 70% ou mais e, em especial, preferivelmente a 90% ou mais. Um aspecto da composição da presente invenção é uma 25 composição na qual as células-tronco mesenquimais da medula óssea e/ou as células estromais mesenquimais da medula óssea são usadas para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem.

Embora as células embebidas possam ser células heterólogas ou células autólogas, as células autólogas são preferivelmente coletadas e usadas do ponto de vista de se evitar reações de rejeição em particular. As células coletadas são usadas preferivelmente após proliferação por cultivo de células. Nesse momento, as células podem 5 inicialmente ser embebidas em uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico e depois cultivadas enquanto naquele estado, ou as células podem ser embebidas em uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico após o cultivo das células em um meio de cultura. 10 As células podem ser cultivadas de acordo com um

método comum, e as células podem ser cultivadas enquanto embebidas em uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico, ou podem ser cultivadas sem estar embebidas em uma solução de um sal de metal monovalente de ácido 15 algínico. Um meio que permita que o cultivo de células embebidas em uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico, bem como de células não embebidas nessa solução, seja realizado eficientemente é preferível para o meio de cultura, e o meio de cultura pode ser selecionado

2 0 adequadamente por aqueles habilitados na técnica dentre os meios conhecidos.

Exemplos de meios que podem ser usados incluem o meio DMEM (Virology, Vol. 8, 396 (1959)), meio MEM (Science, Vol. 122, 501 (1952)), meio RPMI1640 (The Journal of the 25 American Medicai Association, Vol. 199, 519 (1967)) e F12, e soro, aminoácidos, glicose ou antibióticos e semelhantes podem ser adicionados, se necessário. 0 pH é preferivelmente de cerca de 6 a 8. 0 cultivo é normalmente efetuado em torno de 30 a 40°C por 5 a 120 horas e, 30 preferivelmente, por 5 a 100 horas. Além disso, os meios podem ser trocados, aerados ou agitados, se necessário.

Em um aspecto da presente invenção, a composição contém uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico misturada com células para a regeneração de tecido cartilaginoso e, particularmente, células-tronco

mesenquimais da medula óssea ou células estromais mesenquimais da medula óssea, e não contém fator de crescimento como, por exemplo, TGF-β. Além disso, a diferenciação celular não precisa necessariamente ser 10 induzida in vitro. Nesse caso, caso seja coletado líquido da medula da margem anterior do ilíaco de um paciente com um trauma de cartilagem, por exemplo, as células-tronco mesenquimais da medula óssea serem imediatamente removidas do líquido da medula óssea e o número de células obtidas 15 dessa região for certo número de células ou mais, as células poderão ser aplicadas ao paciente diretamente na forma da composição da presente invenção. Como não há a preocupação de cultivar e diferenciar as células coletadas in vitro, o procedimento é extremamente vantajoso para o 20 cirurgião, os custos podem ser reduzidos, e a carga sobre o paciente pode ser atenuada.

Além disso, células-tronco mesenquimais da medula óssea possuem praticabilidade superior em termos de permitir que sejam aplicadas células alogênicas sem incidentes em função da sua baixa imunogenicidade.

Por outro lado, uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico embebida com as células descritas acima pode ser usada como uma composição, em que as células embebidas são cultivadas in vitro antes da

3 0 aplicação em uma lesão por trauma de cartilagem em qualquer estado selecionado do grupo que consiste em: a) um estado no qual o número de células é de 1 x IO6 células/mL ou mais, b) um estado no qual tecido cartilaginoso semelhante a hialina é detectado por coloração com safranina-0 ou 5 coloração com H-E, c) um estado no qual é detectado colágeno do tipo II por anticorpo anticolágeno II ou análise genética, d) um estado no qual é detectado aglicano por anticorpo anti-aglicano ou análise genética, e e) um estado no qual a matriz extracelular (colágeno, ácido 10 hialurônico, proteoglicano) é secretada. 0 estado pode ser selecionado adequadamente de acordo com o estado da lesão e o estado do paciente.

Embora não haja limitações específicas sobre a quantidade de células embebidas, ela pode ser, por exemplo, 15 1,0 x IOs a 3,0 x IO7 células/mL e, preferivelmente, 2,0 x IO7 a 3,0 x IO7 células/mL. A regeneração de cartilagem pode ser promovida mais eficazmente por utilização desse número de células.

Por outro lado, é preferível utilizar uma composição 20 que não contenha células para facilitar o procedimento cirúrgico, bem como reduzir o risco de infecção por vírus e semelhantes atribuíveis ao corpo ou ao processo de cultivo, sem a colocação de uma carga excessiva sobre o corpo por procedimentos como a coleta de condrócitos, periósteo ou 25 medula óssea. Um exemplo preferível de uma composição desse tipo é uma composição para a regeneração de cartilagem com uma viscosidade de 400 a 20.000 mPa.s e que possui fluidez para cura em uma área afetada por aplicação em uma lesão por trauma de cartilagem, que compreende uma composição sem

3 0 células que contém alginato de sódio de endotoxina inferior que possui ura peso molecular ponderai médio como determinado por cromatografia por filtração em gel de

500.000 ou mais. Além disso, a composição para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção é uma 5 composição que possui como ingrediente ativo um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico, e se baseia no achado de que o próprio ácido algínico possui um efeito terapêutico sobre a doença da cartilagem. Um exemplo de uma composição terapêutica preferível é uma 10 composição para o tratamento de uma doença da cartilagem que é injetada em uma articulação, que compreende uma composição sem células que contém como um ingrediente ativo desta alginato de sódio de endotoxina inferior que possui um peso molecular ponderai médio como determinado por 15 cromatografia por filtração em gel de 500.000 ou mais, e é capaz de demonstrar efeitos terapêuticos que são superiores aos de preparações de ácido hialurônico usadas na técnica estabelecida.

7. Gelificação da superfície da composição Na presente invenção, uma composição que contém uma

solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico pode ser aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem, e um agente de entrecruzamento pode ser aplicado à superfície da composição. A gelificação da superfície da composição 25 para solidificar a superfície torna possível evitar eficazmente o extravasamento da composição da lesão por trauma de cartilagem.

Não há limitações específicas sobre o agente de entrecruzamento, desde que ele seja capaz de solidificar

3 0 uma superfície de uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico por entrecruzamento daquela solução, e exemplos incluem compostos de íon de metal divalente ou mais como, por exemplo, Ca2+, Mg2+, Ba2+ ou Sr2+, e reagentes de entrecruzamento que possuem 2 a 4 5 grupos amino em uma molécula deste. Exemplos específicos de compostos de íon de metal divalente ou mais incluem CaCl2, MgCl2, CaSO4 e BaCl2, enquanto exemplos específicos de reagentes de entrecruzamento que possuem 2 a 4 grupos amino em uma molécula deste incluem diaminoalcanos que 10 opcionalmente possuem um grupo lisil (-CoCH(NH2)-(CH2)4-NH2) em um átomo de nitrogênio, especificamente derivados que formam grupos lisilamino em conseqüência da substituição de um grupo diaminoalcano e amino com um grupo lisil. Embora exemplos específicos destes incluam diaminoetano, 15 diaminopropano e N-(lisil)-diaminoetano, uma solução de CaCl2 é particularmente preferível por razoes como facilidade de aquisição e resistência do gel.

Não há limitações específicas sobre o método usado para adicionar um íon de metal divalente ou mais à 20 superfície da composição, e um exemplo de um método desse tipo consiste na aplicação de uma solução de um íon de metal divalente ou mais à superfície da composição com uma seringa ou vaporizador. 0 agente de entrecruzamento pode ser aplicado à superfície da composição da presente

2 5 invenção depois ou ao mesmo tempo em que a aplicação da

composição da presente invenção em um defeito de cartilagem.

A quantidade de agente de entrecruzamento aplicada é, de preferência, ajustada adequadamente de acordo com o

3 0 tamanho do defeito onde a composição da presente invenção for aplicada. 0 agente de entrecruzamento penetra gradualmente no interior da superfície da composição à qual é aplicado, e depois o entrecruzamento progride. A quantidade do agente de entrecruzamento aplicada é ajustada 5 de forma a não estar em excesso para evitar que o agente de entrecruzamento tenha um efeito excessivamente forte no local onda a composição da presente invenção entra em contato com uma lesão por trauma de cartilagem. Não há limitações específicas sobre a quantidade de íon de metal 10 divalente ou mais aplicada, desde que ela seja capaz de solidificar a superfície da composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico. No entanto, quando se adiciona uma solução de 10 0 mM de CaCl2, por exemplo, a quantidade adicionada é preferivelmente de cerca de 0,3 a 15 0,6 ml, no caso de um defeito que possui um diâmetro de cerca de 5 mm, e uma profundidade de cerca de 2 mm, e a dosagem também pode ser determinada em proporção à área de superfície da parte afetada. Por exemplo, a quantidade adicionada é preferivelmente de cerca de 1 a 12 mL e, mais 20 preferivelmente, de cerca de 2 a 10 ml, no caso de um defeito que possui uma largura (10 mm x 2 0 mm) e profundidade de cerca de 5 mm. A quantidade adicionada pode ser ajustada adequadamente por observação do estado da lesão por trauma de cartilagem. O agente de entrecruzamento 25 pode ser aplicado, por exemplo, por aplicação contínua e lenta à superfície da composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico de dez a vários segundos ou mais .

Além disso, pela presença na composição da presente 3 0 invenção de um agente de entrecruzamento pelo qual a gelificação é promovida por alterações ambientais como, por exemplo, uma diferença de tempo, diferença de temperatura ou contato com íon cálcio dentro do corpo, pode ser obtida uma composição que mantenha um estado líquido antes da 5 administração e géis espontaneamente após a administração no corpo. Exemplos desses agentes de entrecruzamento incluem gliconato de cálcio, CaSO4 e alginato de cálcio.

Aqui, quando o cálcio entra em contato com o agente de entrecruzamento, sabe-se que uma concentração maior de cálcio resulta na gelificação rápida e na formação de um gel mais rígido. No entanto, na medida em que o cálcio é citotóxico, caso sua concentração seja excessivamente elevada, há o risco de ter um efeito prejudicial sobre a ação regenerativa da cartilagem da composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção. Portanto, quando se utiliza uma solução de CaCl2 para solidificar a superfície de uma composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico, por exemplo, a concentração de cálcio é preferivelmente de 25 a 200 mM e, mais preferivelmente, 50 a 100 mM.

Aqui, os glóbulos de alginato são produzidos, por exemplo, por gotejamento de uma solução de alginato de sódio em uma solução de CaCl2 seguido por gelificação. Os 25 glóbulos alginato embebidos com células são reconhecidamente usados para a regeneração de cartilagem (veja, por exemplo, as Referências 2 e 3) . No entanto, embora seja necessário que os glóbulos de alginato sejam aplicados por pressão em um defeito de cartilagem, já que é 3 0 preciso que sejam produzidos glóbulos que combinem com o tamanho do defeito, seu uso na prática clínica é tecnicamente difícil. Além disso, quando se utiliza uma solução de CaCl2 como agente de entrecruzamento, já que os íons de Ca na superfície do glóbulos entram em contato com 5 a superfície da lesão por trauma de cartilagem, também há problema de citotoxicidade causada pelo cálcio. Em contraste, como a composição da presente invenção está na forma de uma solução, ela pode ser facilmente aplicada em um defeito de qualquer formato, e toda a lesão por trauma 10 de cartilagem é capaz ser recoberta com a composição, e a aderência ao defeito de cartilagem é satisfatória. Como a concentração de cálcio no local onde a composição entra em contato com a superfície da lesão por trauma de cartilagem pode ser mantida em um nível baixo, há poucos problemas com 15 relação à citotoxicidade do cálcio. Na medida em que o efeito do agente de entrecruzamento sobre a superfície da lesão por trauma de cartilagem contatada pela composição da presente invenção é pequeno, a composição da presente invenção é capaz de entrar facilmente em contato com

2 0 células e tecido nos locais de trauma de cartilagem no

corpo. Cerca de quatro semanas após a aplicação em uma lesão por trauma de cartilagem, a composição da presente invenção se funde com o tecido em um grau no qual passa a ser indistinguível no local aplicado, demonstrando, dessa forma, alta bioafinidade.

Quando se aplica a composição da presente invenção em uma lesão por trauma de cartilagem, se aplicada misturando- se primeiro com um agente de entrecruzamento de modo a gelificar toda a composição com o agente de

3 0 entrecruzamento, ou colocando-se um agente de entrecruzamento à superfície da composição, a composição da presente invenção pode ser curada na área afetada e nela localizada no estado de ser aderida à lesão por trauma de cartilagem onde aplicada. Como resultado, quando tiverem 5 sido embebidas células e semelhantes, componentes como, por exemplo, células, podem ser localizados na área afetada. Além disso, em conseqüência da adesão da composição da presente invenção em uma lesão por trauma de cartilagem, os efeitos de regeneração de cartilagem da composição da 10 presente invenção e, particularmente, os efeitos de regeneração de cartilagem hialina podem ser demonstrados de forma mais potente.

8. Formulação e aplicação de uma composição para regeneração de cartilagem ou tratamento de uma doença da cartilagem que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico

A composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção é aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem 20 de um mamífero humano ou não humano como, por exemplo, uma vaca, um macaco, um pássaro, um gato, um camundongo, um rato, um porquinho-da-índia, um hamster, um porco, um cão, um coelho, um carneiro ou um cavalo, e é usada para promover regeneração de cartilagem ou tratar doença da 25 cartilagem por injeção em uma articulação.

A forma da composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção é preferivelmente um líquido fluido, especificamente uma solução. Na presente invenção, a frase "que possui fluidez" refere-se ao fato de ter uma propriedade que faz com que a forma desta se altere para uma forma amorfa, e não exige que a forma tenha constantemente a propriedade de fluidez na forma de um líquido, por exemplo. Por exemplo, a composição 5 preferivelmente possui uma fluidez tal que a torna capaz de ser lacrada em uma seringa ou semelhante, e injetada em uma área afetada. A composição da presente invenção na forma de uma solução pode ser facilmente aplicada em uma lesão por trauma de cartilagem ou em uma articulação com uma seringa, 10 uma pipeta de gel ou uma seringa específica. Além disso, ela é compatível com qualquer formato de lesão por trauma de cartilagem ou defeito, e é capaz de preencher ou entrar em contato com todo o defeito de cartilagem.

A composição para a regeneração de cartilagem da 15 presente invenção demonstra superior ação regenerativa da cartilagem em, por exemplo, um defeito de cartilagem de cartilagem hialina na forma de cartilagem articular. Além disso, a composição para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção demonstra efeitos

2 0 terapêuticos em uma doença da cartilagem como, por exemplo,

osteoartrite, por ter efeitos de reparo de cartilagem, efeitos que inibem alterações cartilaginosas degenerativas, efeitos protetores da cartilagem, efeitos que inibem inflamação de tecido articular e/ou efeitos que suprimem a dor atribuível à inflamação de tecido articular.

Um aspecto da composição para a regeneração de cartilagem da presente invenção é uma composição para a regeneração de cartilagem hialina. Um objetivo de uma composição para a regeneração de cartilagem hialina é a

3 0 regeneração de cartilagem com uma proporção elevada de cartilagem hialina, comparada com cartilagem fibrosa, e visa regenerar tecido cartilaginoso rico em colágeno do tipo II e proteoglicano.

Além disso, um aspecto da composição para o tratamento 5 de uma doença da cartilagem da presente invenção é uma composição para o tratamento de osteoartrite. Caso um trauma de cartilagem se estenda sobre uma área ampla de cartilagem articular na forma de osteoartrite, ou quando se deseja tratar um tipo de trauma de cartilagem 10 freqüentemente observado em um estágio comparativamente precoce de osteoartrite de tal forma que a uniformidade da superfície da cartilagem seja alterada e alterações degenerativas já tenham começado, muito embora defeitos de cartilagem bem definidos ainda não tenham ocorrido, a 15 composição da presente invenção será aplicada preferivelmente por injeção em uma cavidade articular e será permitido que ela se disperse por todo o líquido sinovial. O contato de um sal de metal monovalente de ácido algínico com uma lesão por trauma de cartilagem promove o

2 0 reparo da articulação na lesão por trauma de cartilagem, inibe alterações degenerativas causadas por inflamação e desgaste, e protege a cartilagem. Além disso, pelo fato de o ingrediente ativo na forma de um sal de metal monovalente de ácido algínico estar disperso por todo o líquido 25 sinovial, as respostas inflamatórias do tecido circundante, incluindo tecido sinovial, são inibidas e os efeitos que suprimem a dor são demonstrados. Ao mesmo tempo, a presença de um sal de metal monovalente de ácido algínico dentro do líquido sinovial desempenha o papel de compensar a função 30 do líquido sinovial ao servir como um amortecedor e lubrificante.

Outro aspecto da composição para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção é uma composição para o tratamento de ombro congelado (periartrite úmero- 5 escapular). 0 ombro congelado se apresenta primariamente com inflamação da membrana sinovial e da cápsula articular acoplada à dor a ela associada, e desgaste e degeneração da cartilagem podem não ser observados. Como um sal de metal monovalente de ácido algínico demonstra os efeitos de

inibição de respostas inflamatórias do tecido circundante, incluindo o tecido sinovial, e supressão de dor, o ombro congelado deve ser tratado por administração da composição da presente invenção na cavidade articular do ombro, na bolsa subacromial ou bainha do tendão do músculo bíceps.

Outro aspecto da composição para o tratamento de uma

doença da cartilagem da presente invenção é uma composição para a supressão de dor articular. A dor articular é freqüentemente um problema na artrite reumatóide, assim como na osteoartrite, no ombro congelado, e semelhantes,

2 0 como descrito previamente. Um aspecto preferível da

presente invenção é uma composição para o tratamento de dor articular associada à artrite reumatóide, e é particularmente preferível uma composição para a supressão de dor articular de joelho associada à artrite reumatóide

crônica. Embora o mecanismo de ocorrência de artrite reumatóide ainda não seja totalmente compreendido, acredita-se que o tecido sinovial e o tecido cartilaginoso sejam destruídos por citocinas inflamatórias resultantes de respostas autoimunes. Como um sal de metal monovalente de

3 0 ácido algínico demonstra efeitos que inibem respostas inflamatórias do tecido circundante, incluindo tecido sinovial, e suprime a dor, a composição da presente invenção é capaz de inibir respostas inflamatórias e suprimir a dor a elas associada por administração em uma 5 articulação que sofre de artrite reumatóide. Por outro lado, também é necessário suprimir uma resposta autoimune a fim de fundamentalmente tratar artrite reumatóide, e ainda está para ser determinado se um sal de metal monovalente de ácido algínico possui ou não ação imunossupressora em uma 10 área afetada por artrite reumatóide.

Outro aspecto da composição para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção é uma composição para alívio, melhora e/ou cura de vários sintomas associados a uma doença da cartilagem. Em uma doença da 15 cartilagem, a cartilagem, o tecido cartilaginoso e/ou o tecido articular (por exemplo, a membrana sinovial, a cápsula articular ou o osso subcondral) são lesionados por irritação mecânica ou por resposta inflamatória, e ocorrem sintomas compostos como, por exemplo, alterações 20 degenerativas no tecido cartilaginoso, inflamação da membrana sinovial, e outra dor do tecido articular e da articulação atribuível à inflamação em função de desgaste e irritação mecânica da cartilagem articular, juntamente com respostas inflamatórias. Como a composição da presente 25 invenção contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico, ela possui múltiplos efeitos de proteção da cartilagem da irritação mecânica, inibição de alterações degenerativas na cartilagem causadas por desgaste e inflamação, reparo de

3 0 lesões por trauma de cartilagem e supressão de inflamação de tecido articular e dor. Como resultado, a composição da presente invenção é capaz de inibir o progresso de uma doença da cartilagem, e aliviar, melhorar e/ou curar sintomas. Além disso, a composição para o tratamento de uma 5 doença da cartilagem da presente invenção possui o efeito de melhora da função articular por meio do alívio, melhora e/ou cura dos sintomas desta. A melhora da função articular refere-se ao aumento da amplitude de movimento da articulação, aumento do movimento realizado durante as 10 atividades da vida diária, e semelhantes.

Quando se aplica a composição para a regeneração de cartilagem da presente invenção na forma de preenchimento em um defeito de cartilagem, na medida em que é difícil aplicar a composição com uma seringa caso a viscosidade 15 seja elevada, pode ser usada uma seringa pressurizada ou motorizada. A composição também pode ser aplicada em um defeito de cartilagem, por exemplo, com uma espátula ou bastão, sem que haja necessidade de usar uma seringa ou semelhante. No caso de injeção com uma seringa, 20 preferivelmente é usada uma agulha de 16 a 18G, por exemplo. No caso da aplicação da composição para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção por injeção em uma articulação, preferivelmente é usada uma agulha de 18 a 27G.

A quantidade aplicada da composição para a regeneração

de cartilagem da presente invenção é determinada de acordo com o tamanho do orifício (ou orifícios) formado na lesão por trauma de cartilagem ou defeito de cartilagem onde for aplicada e, embora não haja limitações específicas, no caso

3 0 de se injetar diretamente em um defeito de cartilagem, por exemplo, a quantidade aplicada será preferivelmente de 0,05 a 10 mL e, mais preferivelmente, 0,1 a 2 mL. A aplicação de uma lesão por trauma de cartilagem preferivelmente consiste na injeção de forma a preencher adequadamente o vazio total 5 da área afetada. No caso de aplicação da composição para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção por injeção em uma articulação, a dose será adequadamente determinada de acordo com a quantidade de líquido sinovial da articulação na qual a composição será injetada e, embora 10 não haja limitações específicas, quando a administração é feita em uma articulação do joelho ou em uma articulação do ombro de um ser humano, a dose será normalmente de 1 a 5 mL e, mais preferivelmente, 2 a 3 mL. Além disso, o método de administração pode consistir, por exemplo, na administração 15 em cinco administrações consecutivas em intervalos de uma semana, seguidas por administrações contínuas a cada 2 a 4 semanas. Embora não haja limitações específicas sobre a dose, a dose pode ser ajustada adequadamente de acordo com os sintomas e os efeitos. Por exemplo, pode ser adotado um 20 método de administração no qual a administração é adequadamente continuada por uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês. Como o ácido algínico não está inerentemente presente no corpo, os animais não possuem uma enzima capaz de degradar especificamente o ácido algínico. 25 Embora o ácido algínico normalmente seja decomposto gradualmente por hidrólise no corpo de um animal, na medida em que sua decomposição no corpo é lenta em comparação com polímeros como, por exemplo, ácido hialurônico, podem ser esperados efeitos de longo prazo quando for administrado em

3 0 uma articulação. A composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção contém como um ingrediente ativo desta um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico.

Os inventores da presente invenção verificaram, pela primeira vez, que o próprio ácido algínico demonstra efeitos regenerativos e terapêuticos no tecido cartilaginoso e no tecido articular quando se administra ácido algínico em uma articulação do corpo. 0 fato de 10 conter ácido algínico como um ingrediente ativo significa que o ácido algínico está presente em uma quantidade que o permite demonstrar efeitos regenerativos e terapêuticos sobre o tecido cartilaginoso e tecido articular quando aplicado em uma área afetada, e que a quantidade é 15 preferivelmente de pelo menos 0,1% p/v ou mais de toda a composição, mais preferivelmente 0,5% p/v ou mais e, particularmente, de preferência 1 a 3% p/v.

2 0 invenção também pode conter componentes normalmente usados

em substâncias farmacêuticas, tais como outros ingredientes farmaceuticamente ativos e comumente usados como, por exemplo, estabilizantes, emulsificantes, agentes de ajuste da pressão osmótica, tampões, agentes isotônicos, conservantes, analgésicos ou corantes, se necessário.

Além disso, em um aspecto da presente invenção, a composição da presente invenção não contém um componente que demonstra ação farmacológica sobre cartilagem ou tecido articular além de um sal de metal monovalente de endotoxina

3 0 inferior de ácido algínico. Uma composição que contém como um ingrediente ativo desta apenas um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico também é capaz de demonstrar efeitos adequados para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem.

Além disso, a composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção também pode conter um fator que promova o crescimento celular, cujos exemplos incluem BMP,

FGF, VEGF, HGF, TGF-β, IGF-1, PDGF, CDMP, CSF, EPO, IL e IF. Esses fatores podem ser produzidos por uma técnica de recombinação, ou podem ser purificados de uma composição protéica.

Além disso, em um aspecto da presente invenção, a

composição da presente invenção não contém esses fatores de crescimento. Mesmo quando não contém fator de crescimento, no entanto, a regeneração de cartilagem é adequadamente satisfatória, e a segurança é maior do que quando se promove agressivamente o crescimento celular.

2 0 9. Método de tratamento

Além disso, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma lesão por trauma de cartilagem e um método de tratamento de uma doença da cartilagem que utiliza a composição de regeneração de cartilagem ou de

2 5 tratamento de uma doença da cartilagem da presente

invenção, como descrito acima.

0 termo "tratamento de uma lesão por trauma de cartilagem" ou "tratamento de uma doença da cartilagem" é como explicado previamente na seção 1 intitulada

3 0 "Introdução". Não há limitações específicas sobre o método para a aplicação da composição para a regeneração de cartilagem da presente invenção em uma lesão por trauma de cartilagem, e a composição pode ser aplicada, por exemplo, injetando-se 5 diretamente em um defeito de cartilagem com uma seringa, pipeta de gel ou injetor específico e semelhante, tanto por via artroscópica quanto por via endoscópica. Alternativamente, a composição pode ser injetada diretamente em um defeito de cartilagem com uma seringa, 10 pipeta de gel ou injetor específico e semelhante, após exposição da área afetada por uma técnica cirúrgica conhecida como, por exemplo, artrotomia, usando uma abordagem parapatelar mediai.

Além disso, fármacos concomitantes, incluindo 15 antibióticos como, por exemplo, estreptomicina, penicilina, tobramicina, amicacina, gentamicina, neomicina ou anfotericina B, ou fármacos antiinflamatórios como, por exemplo, aspirina, fármacos antiinflamatórios não esteróides (NSAIDs) ou acetaminofeno, também podem ser

2 0 administrados antes, durante ou depois da aplicação da

composição da presente invenção em uma lesão por trauma de cartilagem. Esses fármacos também podem ser usados por mistura na composição da presente invenção.

Além disso, um ou mais orifícios podem ser formados em 25 uma lesão por trauma de cartilagem, e a composição da presente invenção pode ser injetada nos orifícios formados. Além disso, a composição também pode ser usada da mesma forma por formação de um ou mais orifícios em um defeito de cartilagem.

3 0 Por exemplo, no caso de uma técnica que envolve a exposição de uma área afetada por um procedimento cirúrgico, diversos defeitos (defeitos de espessura total) que possuem um diâmetro comparativamente pequeno de, por exemplo, cerca de 1,5 mm, e que se estendem até o osso 5 subcondral, podem ser formados usando uma furadeira elétrica ou um fio de aço e semelhantes, em um defeito de cartilagem onde cartilagem residual esteja presente, antes da injeção da composição da presente invenção, seguida por injeção da composição nesse defeito. Em conseqüência da 10 formação de defeitos de espessura total, ocorre sangramento da medula óssea, o que permite que células precursoras de cartilagem na medula óssea migrem para o defeito de cartilagem. A regeneração da cartilagem é promovida pelos efeitos das células precursoras de cartilagem migradas e da 15 composição da presente invenção, o que torna possível, dessa forma, aumentar a função de toda a cartilagem.

Alternativamente, defeitos parciais que possuem um diâmetro comparativo pequeno de, por exemplo, cerca de 1,5 mm, mas que não se estendem até o osso subcondral, podem

2 0 ser formados em um defeito de cartilagem onde cartilagem

residual esteja presente, seguido por aplicação da composição da presente invenção nesses defeitos. No caso de formação de defeitos parciais, não há sangramento de medula óssea no defeito e não há infiltração de células 25 precursoras de cartilagem na medula óssea. Também nesse caso, os efeitos da composição da presente invenção são demonstrados por aplicação da composição aos orifícios de pequeno diâmetro, a regeneração da cartilagem é satisfatória, e a função de toda a cartilagem pode ser

3 0 melhorada. Essas técnicas são eficazes quando está presente cartilagem residual no defeito de cartilagem.

10. Kit para regeneração de cartilagem e de tratamento de uma doença de cartilagem

Além disso, a presente invenção fornece um kit para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem. Esse kit inclui a composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção, como descrito acima, um agente de entrecruzamento, seringa, pipeta de gel, injetor específico, instruções, e semelhantes. Um exemplo específico preferível de um kit é aquele em que um sal de metal monovalente de ácido algínico está lacrado em um compartimento de uma seringa composta por dois compartimentos formados integralmente divididos por uma divisão, e uma solução na forma de soro fisiológico ou uma solução que contém um agente de entrecruzamento na forma de íon cálcio como, por exemplo, CaCl2, está lacrada no outro compartimento, e é composta de tal forma que a divisão entre os compartimentos possa ser penetrada facilmente no momento da utilização para permitir que os conteúdos de ambos os compartimentos sejam usados por mistura e dissolução no momento da utilização. Outro exemplo de um kit é aquele em que uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico está lacrado em uma seringa pré-preenchida, o que permite que ela seja administrada diretamente no momento da utilização, sem necessitar de um procedimento de preparação. Outro exemplo é um kit em que uma solução de ácido algínico e um agente de entrecruzamento são lacrados em seringas separadas e embalados juntos em uma embalagem única. A "composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem", o "agente de entrecruzamento" e a "seringa" são como explicados previamente. Além disso, células podem ser embebidas na composição que contém um sal 5 de metal monovalente de ácido algínico, como descrito previamente. Além disso, o kit também pode conter fármacos concomitantes, incluindo antibióticos como, por exemplo, estreptomicina, penicilina, tobramicina, amicacina, gentamicina, neomicina ou anfotericina B, ou fármacos 10 antiinflamatórios como, por exemplo, aspirina, fármacos antiinflamatórios não esteróides (NSAIDs) ou acetaminofeno.

A utilização desse kit permite que a terapia regenerativa de cartilagem e a terapia de uma doença da cartilagem sejam realizadas com facilidade.

Além disso, todas as publicações citadas na presente

especificação, por exemplo, documentos da técnica estabelecida, pedidos de patente em aberto, publicações de patente e outros documentos de patentes, são incorporadas em sua totalidade na presente especificação como 20 referências. Além disso, a presentes especificação incorpora o conteúdo das especificações do Pedido de Patente Japonesa N° 2007-41520 e do Pedido de Patente Japonesa N° 2007-277005, que servem como a base para as reivindicações do presente pedido.

Embora seja apresentada a seguir uma explicação

detalhada da presente invenção por meio de exemplos desta especificação, a presente invenção não se limita a esses exemplos.

Exemplo 1 3 0 Preparação de solução de alginato de sódio No presente exemplo, foram usados dois tipos de alginato de sódio, que consistem em alginato de sódio purificado (Kimica Corp., Mochida International Ltd., Sea Matrix (sterilized), N0 de Série B5Y01) e alginato de sódio 5 de grau alimentício, não purificado (também denominado alginato de sódio de grau comercial, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., alginato de sódio 500, 199-09961). 0 alginato de sódio purificado foi esterilizado e liofilizado. 0 alginato de sódio de grau alimentício foi 10 esterilizado por filtração com um filtro que possui um diâmetro de poro de 0,22 μιη.

Quando os níveis de endotoxina foram medidos usando um kit de ensaio LAL disponível comercialmente ("Limulus Color KY Test Wako", Wako, Japão), o nível de endotoxina do alginato de sódio purificado era de 5,76 EU (unidades de endotoxina)/g, e o do alginato de sódio de grau alimentício era de 75.950 EU/g, indicando, dessa forma, que o nível de endotoxina do alginato de sódio purificado era bem menor do que o do alginato de sódio de grau alimentício. Especificamente, o alginato de sódio purificado foi submetido ao tratamento de redução de endotoxina. Além disso, o teor de metal pesado do alginato de sódio purificado era de 20 ppm ou menos, o teor de sulfato de chumbo era de 0,98% ou menos, e o teor de arsênico era de 2 ppm ou menos.

Além disso, foram preparadas concentrações de 1% p/v e 2% p/v de soluções de alginato de sódio de cada alginato de sódio usando água esterilizada por filtração Milli-Q. A viscosidade de cada concentração de solução de alginato de

3 0 sódio a 2 O0C foi então medida usando um viscômetro rotacional (do tipo cone e placa, TVE-2 OLT, Toki Sangyo Co., Ltd., Japão). As velocidades de rotação foram de 1 rpm, quando medidas as soluções 1% de alginato de sódio, e de 0,5 rpm, quando medidas as soluções 2% de alginato de 5 sódio, e as faixas de medição consistiam em M, quando medidas as soluções 1% de alginato de sódio, e 5 M, quando medidas as soluções 2% de alginato de sódio. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1

Ácido Conc. Viscosidade (rtiPa.s) Ia 2 1 3a Média Desvio medida medida medida padrão Grau ali¬ 1 533, 5 537, 0 531, 5 534, 0 2, 27 mentício Grau ali¬ 2 5 . 377,0 5.336,0 5.325,0 5.346,0 22,38 mentício Purifi¬ 1 435,4 434, 1 429,3 432, 9 2, 62 cado Purifi¬ 2 5.359,0 5.496,0 5.488, 0 5.447,7 62, 78 cado Como mostrado na Tabela 1, a viscosidade do alginato

de sódio purificado foi de cerca de 43 0 mPa.s para a solução de 1% p/v e de cerca de 5.400 mPa.s para a solução de 2% p/v. A viscosidade do alginato de sódio de grau alimentício foi de cerca de 53 0 mPa.s para a solução de 1% 15 p/v e de cerca de 53 00 mPa.s para a solução de 2% p/v. Com base nos resultados para ambos os grupos, verificou-se que a viscosidade de cada solução do alginato de sódio purificado e do alginato de sódio de grau alimentício usados no presente exemplo é de cerca de 400 a 600 mPa.s em uma concentração de 1% p/v e de cerca de 5.000 a 6.000 mPa.s em uma concentração de 2% p/v.

As propriedades físicas foram confirmadas para as soluções de alginato de sódio purificado e de grau 5 alimentício que possuem concentrações de 1, 2 ou 3% p/v. Quando várias gotas de cada concentração das soluções de alginato de sódio eram aplicadas de baixo a uma placa plástica invertida, embora a maioria das soluções 1% p/v de alginato de sódio (viscosidade: aproximadamente 400 a 600 10 mPa.s) tenha gotejado da placa em poucos segundos em função da gravidade, um pouco do alginato de sódio permaneceu aderido ao fundo da placa. Com base nesse resultado, se uma composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico possuísse uma viscosidade de cerca de 400 a 600 15 mPa.s ou mais, sugeriu-se que os efeitos da presente invenção seriam obtidos, uma vez que a composição possui aderência e a propriedade de permanecer na área afetada. Em contraste, as soluções de alginato de sódio que possuem uma concentração de 2% p/v (viscosidade: aproximadamente 5.000

2 0 a 6.000 mPa.s) não escorreram da placa e permaneceram aderidas na placa por pelo menos cerca de um minuto. Até mesmo depois de um pouco das soluções ter gotejado da placa, uma grande quantidade do alginato de sódio permaneceu aderido a ela. Soluções de alginato de sódio que

2 5 possuem uma concentração de 3% p/v permaneceram aderidas à placa por mais tempo do que as soluções 2% p/v.

Por outro lado, com relação à facilidade de manipulação da composição, as soluções 3% p/v de alginato de sódio precisaram de algum tempo para dissolver em água Milli-Q e, embora fosse um pouco difícil o seu preenchimento na pipeta e na seringa, a pipeta e a seringa foram capazes de ser acionadas. As soluções 1% e 2% p/v de alginato de sódio foram manipuladas facilmente.

Aqui, como se acreditava que o alginato de sódio aqui usado era similar à solução de alginato de sódio com uma concentração de 1% e viscosidade de 570 mPa.s usada no Experimento 10, a viscosidade das soluções 3% p/v de alginato de sódio foi determinada como sendo de cerca de

20.000 mPa.s. Dessa forma, foi sugerido que a viscosidade da composição que contém um sal de metal monovalente de

ácido algínico fosse preferivelmente de cerca de 20.000 mPa.s ou menos com relação à facilidade de manipulação quando se utiliza uma pipeta ou uma seringa.

Com base nos resultados acima, quando se tornava a viscosidade das soluções de alginato de sódio de 5.000 a

6.000 mPa.s, obteve-se preparação e manipulação mais fáceis, e essa viscosidade foi indicada como sendo adequada ao uso como uma composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem. Na

2 0 prática clínica, há muitos casos em que a lesão por trauma de cartilagem está virada para baixo ou para o lado, por exemplo, quando se manipula por artroscopia uma lesão por trauma de cartilagem na superfície de uma articulação femoral, por exemplo. Em conseqüência do ajuste da 25 viscosidade da composição da presente invenção, a composição foi indicada como sendo capaz de ser usada em uma ampla gama de várias formas de lesões da cartilagem, até mesmo com relação às lesões da cartilagem que envolvem um procedimento difícil dessa forma. Além disso, a 30 concentração pode ser ajustada até cerca de 2% p/v com a utilização de água Milli-Q a fim de se obter uma viscosidade de 5.000 a 6.000 mPa.s, no caso da solução de alginato de sódio purificado usada no presente exemplo.

Exemplo 2

Produção de células de transplante

Células estromais mesenquimais da medula óssea (BMSC) foram isoladas e cultivadas para se obter células de transplante. BMSC incluem células eritropoiéticas e semelhantes, além de células-tronco mesenquimais da medula 10 óssea. Dez mL de medula óssea foram coletados da tíbia de coelhos brancos japoneses com 4 meses de idade, seguido por lavagem duas vezes com PBS sem Ca-Mg (Gibco BRL Lab. ) e suspensão em "DMEM-High Glucose" (DMED-HG, Sigma Chemical, St. Louis, MO). Os coágulos sangüíneos foram removidos com 15 um coador de células que possui um diâmetro de poro de 7 0 μιη (Falcon Co., Ltd.) . As células foram então incubadas durante umidifição a 37°C e CO2 5% em uma placa de cultura de 100 mm contendo um meio de cultura que consiste em DMEM- HG, soro bovino fetal 10% (FBS, Gibco, Life Technology, 20 Grand Island, NY) e antibióticos 1% (Penicilina- Estreptomicina-Fungizona concentrados 100 X, Cambrex Biosciences, Walkersville, MD). O meio de cultura era trocado a cada três dias, e as células não aderentes foram removidas. Após o cultivo da monocamada das células 25 aderentes por 10 a 14 dias, as células foram removidas com tripsina-EDTA (10 mM, Sigma, GB) e contadas, seguido por subcultivo a cada três dias.

Exemplo 3 Produção de glóbulos de alginato As células obtidas no Exemplo 2 foram suspensas a 2,5 χ IO7 células/mL em uma solução de alginato de sódio ajustada até uma concentração de 2% p/v com água esterilizada por filtração Milli-Q. A suspensão foi gelificada por gotejamento em solução de CaCl2 com uma 5 pipeta e, após lavagem por duas vezes das microcápsulas que se formaram 10 minutos mais tarde com PBS sem Ca-Mg, as microcápsulas foram lavadas uma vez com DMED-HG. Os glóbulos resultantes continham 1 x IO6 células por 4 0 μΐ por glóbulo.

As células foram coletadas dos glóbulos de alginato

por lavagem três vezes com PBS e incubação a 370C e CO2 5% em 5 0 mM de EDTA (Gibco BRL Laboratories) , seguido por centrifugação por 5 minutos a 1.500 g 10 minutos mais tarde para coletar as células.

Exemplo 4

Toxicidade do cálcio sobre células em glóbulos de alginato Método

As taxas de sobrevida de células encapsuladas em ácido algínico por gotejamento em solução de CaCl2 foram medidas

2 0 usando o Kit de Contagem de Células 8 (CCK-8, Dojindo

Laboratories, Tóquio, Japão). As células obtidas no Exemplo

2 foram suspensas a 2,5 x IO7 células/mL em uma solução de alginato de sódio ajustada até uma concentração de 2% p/v e gotejada em concentrações de 50, 100, 200 e 400 mM de

solução de CaCl2 de acordo com o procedimento do Exemplo 3, e imersas por 15 minutos para a obtenção de glóbulos contendo 1 x IO6 células por 4 0 μΐ por glóbulo. Após lavagem dos glóbulos de alginato duas vezes com PBS, as células nos glóbulos foram coletadas usando o método

3 0 descrito em Exemplo 3, e depois suspensas em DMED-HG. As células de cada grupo foram semeadas em uma placa de 96 poços e incubadas por 1 hora, seguida pela adição de 20 μΐ de solução CCK-8 a cada poço e incubação por mais 4 horas. As taxas de sobrevida celular foram obtidas por medida da 5 absorbância a 450 nm usando uma leitora de microplacas (Bio-Rad Japan Life Science Research, Tóquio, Japão).

Resultados

As taxas de sobrevida das células em cada concentração de solução de CaCl2 são mostradas na FIG. 1.

As taxas de sobrevida celular nos glóbulos de alginato

diminuíram de uma forma dependente da concentração de cálcio, e diminuíram significativamente começando em uma concentração de 2 00 mM. Dessa forma, foi demonstrado que CaCl2 possui citotoxicidade. Além disso, verificou-se que

era adequado fazer com que a concentração de cloreto de cálcio que entra em contato com o alginato de sódio fosse de cerca de 100 mM para minimizar os efeitos sobre as células e permitir que o alginato de sódio se gelificasse o mais rapidamente e firmemente possível.

2 0 Exemplo 5

Comparação de taxas de sobrevida de células em glóbulos de

alginato

Método

As taxas de sobrevida de células em glóbulos de

alginato foram comparadas para alginato de sódio purificado submetido ao tratamento de redução de endotoxina e para o alginato de sódio de grau alimentício não submetido ao tratamento de redução de endotoxina. Cada um dos glóbulos de alginato foi produzido por suspensão das células obtidas

3 0 no Exemplo 2 em solução 2% p/v de alginato de sódio de acordo cora o procedimento do Exemplo 3, seguido por gotejamento em 100 mM de solução de CaCl2. Cada glóbulo foi feito para conter 1 x IO6 células por 4 0 μΐ por glóbulo. Os dois tipos de cápsulas de ácido algínico foram cultivados 5 por 0, 1, 2, 3, 7 ou 14 dias em DMED-HG contendo 10% FBS e antibiótico 1%. As células foram coletadas de cada cápsula de acordo com o método descrito em Exemplo 3, e os números de células viáveis foram contados usando o kit CCK-8.

Resultados

Os resultados são mostrados na FIG. 2. O número de

células viáveis restantes foi significativamente maior quando se utilizou a solução de alginato de sódio purificado submetido ao tratamento de redução de endotoxina, quando comparado com o uso da solução de 15 alginato de sódio de grau alimentício não submetido ao tratamento de redução de endotoxina nos Io, 3o e 7o dias. Foi confirmado que a solução de alginato sódio submetida ao tratamento de redução de endotoxina oferece a vantagem, por exemplo, de ter menos toxicidade sobre as células, em 20 particular no início do procedimento (em até 7 dias), quando comparada com as soluções que não são submetidas ao tratamento de redução de endotoxina.

Exemplo 6

Cultivo em glóbulos de alginato in vitro

Método

(Cultivo)

Glóbulos contendo 1 x IO6 células por ,40 μΐ por glóbulo, similares àqueles no Exemplo 5, foram produzidos de acordo com o Exemplo 3 para o alginato de sódio

3 0 purificado e para o alginato de sódio de grau alimentício, respectivamente. Os glóbulos individuais foram colocados em cada poço de placas de cultura de 24 poços e cultivados em

1 mL do meio de cultura padronizado descrito abaixo. Especificamente, o meio de cultura padronizado usado consistiu em DMEM-HG contendo 10 0 pg/mL de piruvato de sódio (ICN Biochemicals, Aurora, OH), 4 0 pg/mL de prolina (ICN Biochemicals, Aurora, OH) , 50 pg/mL de 2-fosfato de ácido ascórbico (Wako, Osaka, Japão), 1 x 10’7 M de dexametasona (ICN Biochemicals, Aurora, OH) , ITS Plus Mix 1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), antibióticos 1% e 10 ng/mL de fator de transformação de crescimento humano β3 recombinante (R&D System, Minneapolis, MN) dissolvidos em 4 mM de HCl contendo 1 mg/mL de albumina sérica bovina. As placas de cultura foram incubadas a 37°C e o meio foi trocado a cada três dias.

Análise de RNA por RT-PCR em tempo real

Após cultivo por 14 dias, o RNA total foi removido de células homogeneizadas e a expressão gênica de colágeno do tipo I, II e X, agrecana e Sox 9 foi analisada. Todos os experimentos foram realizados por métodos convencionais.

Especificamente, o rendimento de RNA foi determinado por medida de absorbâncias a 260 e 280 nm. A seguir, o cDNA foi sintetizado a partir de 0,05 pg de RNA usando o Sistema de Transcrição Reversa ImProm-II™ (Promega, Madison, WI) 25 de acordo com o manual. Nesse momento, o produto de ligação do RNA total e um iniciador aleatório foram desnaturados por 5 minutos a 70°C, seguido imediatamente por resfriamento por 5 minutos em água gelada e efetuando-se a transcrição reversa por 60 minutos a 42°C usando a

3 0 transcriptase reversa ImProm-II™. A seguir, o cDNA resultante foi diluído com água de grau de PCR (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) para ajustar a concentração para menos de 4 0 ng/μΐ. A PCR foi então realizada em um volume de reação de 20 μΐ e monitorada usando o sistema de 5 detecção contínua de fluorescência "DNA Engine Opticon™ 2" (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Os sinais foram detectados com o Kit "SYBR Green qPCR" (Finzyme, Espoo, Finlândia) usando iniciadores gene-específicos designados por DNASIS (Hitachi Software Engineering, Tóquio, Japão).

Mais especificamente, os iniciadores usados são os

indicados abaixo.

Colágeno de coelho do Tipo I: (5'-3') TAAGAGCTCCAAGGCCAAGA (ID. DE SEQ. N0 1) e (3'-5') TGTACCTACTCCTTTGACCG (ID. DE SEQ. N0 2).

Colágeno de coelho do Tipo II: (5'-3')

AGAGACCTGAACTGGGCAGA (ID. DE SEQ. N0 3) e (3'-5') ACCACGATATGAGGCACAGTTT (ID. DE SEQ. N0 4) .

Colágeno de coelho do Tipo X: (5'-3') GCCAGGACCTCCAGGACTAT (ID. DE SEQ. N0 5) e (3'-5')

2 0 CTTTGGACCTGTTGTCCCT (ID. DE SEQ. N0 6).

Agrecana de coelho: (5'-3') GAGGTCGTGGTGAAAGGTGT (ID. DE SEQ. N0 7) e (3'-5') TGACAGT C C ATGGGGT AGGT (ID. DE SEQ. N0 8) .

Sox 9 de coelho: (5'-3') AAGGGCTACGACTGGACGCT (ID. DE

SEQ. N0 9) e (3'-51) GTGCAGTTCGCCGGGT (ID. DE SEQ. N0 10).

Após uma etapa de desnaturação inicial por 10 minutos a 95°C, os produtos de cDNA foram amplificados por 40 ciclos de PCR. Cada ciclo consistiu em uma etapa de desnaturação por 10 segundos a 94°C, uma etapa de

3 0 anelamento por 20 segundos a 58 0C e uma etapa de alongamento por 3 0 segundos a 72°C. Os dados foram analisados usando o software Opticon Monitor™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). 0 valor obtido para cada amostra quando a intensidade da fluorescência alcançava 5 0,03 foi determinado como sendo o valor de Ct (limiar do ciclo). Esse valor foi selecionado por confirmação de que todas as curvas estavam em fase de amplificação exponencial dentro dessa faixa. 0 nível de expressão relativa de cada gene foi calculado usando o método comparativo de Ct 10 modificado a partir dos valores de Ct de cada gene-alvo e o gene de referência (GAPDH).

Coloração

Os glóbulos foram lavados com PBS após 21 e 28 dias de cultivo, e, após fixação por 24 horas com paraformaldeído 15 10% tamponado com fosfato, os glóbulos foram embebidos em parafina. Os glóbulos foram cortados em cortes de 5 μιη do centro dos glóbulos, seguido por realização de coloração com H-E e coloração com safranina-0 de acordo com métodos comuns. Além disso, a formação de colágeno dos tipos I, II 20 e X foi confirmada com anticorpos anticolágeno anti-tipo I, anti-tipo II (Fuji Pharm. Lab., Toyama, Japão) e anti-tipo X (Sigma, St. Louis, MO).

Resultados

Os resultados da análise de RNA por RT-PCR em tempo 25 real são mostrados na FIG. 3. Além disso, os resultados da coloração são mostrados na FIG. 4. A FIG. 4A e a FIG. 4B mostram os resultados quando se utiliza alginato de sódio purificado, enquanto a FIG. 4C e a FIG. 4D mostram os resultados quando se utiliza alginato de sódio de grau 30 alimentício. Além disso, a FIG. 4A e a FIG. 4C mostram os resultados para 21 dias de cultivo, enquanto a FIG. 4B e a FIG. 4D mostram os resultados para 28 dias de cultivo. Além disso, a FIG. 4A à FIG. 4D mostram, respectivamente, da esquerda para a direita, os resultados para a coloração com 5 H-E, coloração com safranina-0 e anticorpos anticolágeno anti-tipo I, anti-tipo II e anti-tipo X.

Com referência aos resultados de RT-PCR (FIG. 3), foram observados aumentos no colágeno do tipo II, agrecana e Sox 9, que indicam diferenciação de células em 10 cartilagem, quando se utiliza alginato de sódio purificado ou alginato de sódio de grau alimentício. Uma comparação dos dois tipos revelou que o cultivo com o alginato de sódio purificado gerou níveis significativamente maiores de agrecana e Sox 9.

Além disso, com referência aos resultados de coloração

(FIG. 4) , foi produzida uma matriz extracelular que foi corada com safranina-0 e imunocoloração de colágeno do tipo

II, o que indica diferenciação de cartilagem, para ambos os tipos de glóbulos de alginato, e foi observada diferenciação de cartilagem.

Exemplo 7

Modelo de reparo de cartilagem de coelho

Procedimento

Quarenta fêmeas de coelhos brancos japoneses (pesos 25 corporais: 2,6 a 2,9 kg) foram anestesiadas com isoflurano em gás O2 e injeção intravenosa de pentobarbital (0,05 mg/kg) , seguida por injeção intramuscular de antibiótico (Penicilina G, Meiji-Seika, Japão) e tricotomia das pernas. Foi feita uma incisão ântero-medial de 2 cm na pele e o

3 0 sulco troclear foi acessado usando uma abordagem parapatelar mediai. Foram criados defeitos osteocondrais (diâmetro: 5 mm, profundidade: 2 mm) na tróclea femoral usando uma furadeira elétrica (Rexon, Japão). Os joelhos foram então irrigados com soro fisiológico, a ausência de 5 sangramento nos defeitos foi confirmada, e deixou-se que os defeitos secassem.

No presente exemplo, o experimento foi realizado dividindo-se os animais em cinco grupos.

A) Grupo de controle (vazio)

B) Grupo de alginato de grau alimentício (sem células)

C) Grupo de alginato de grau alimentício + células (2,5 x 107/ml)

D) Grupo de alginato purificado (sem células)

E) Grupo de alginato purificado + células (2,5 x 107/ml)

Os defeitos permaneceram sem tratamento no grupo de controle (A) . Além disso, solução 2% p/v de alginato de sódio de grau alimentício foi aplicada aos defeitos no grupo de alginato de grau alimentício (B) (sem células) . A 20 solução 2% p/v de alginato de sódio purificado foi aplicada aos defeitos no grupo de alginato purificado (D) (sem células). Além disso, as células obtidas no Exemplo 2 foram suspensas em solução 2% p/v de alginato de sódio de grau alimentício ou solução 2% p/v de alginato de sódio 25 purificado, e aplicadas aos defeitos da cartilagem articular no grupo de alginato de grau alimentício + células (C) e no grupo de alginato purificado + células (E), respectivamente. Células autólogas de coelho preparadas de acordo com o método descrito em Exemplo 2

3 0 foram usadas para as células nesse momento. A razão para tornar a concentração das soluções de alginato de sódio 2% p/v é que a viscosidade pode ser ajustada até um nível de 5.000 a 6.000 mPa.s, adequado ao procedimento com base nos resultados do Exemplo 1.

Os coelhos foram imobilizados com os defeitos virados

para cima, e a composição da presente invenção foi aplicada nos defeitos usando uma pipeta de gel.

Como a viscosidade da solução de alginato de sódio foi adequada nos grupos (B) a (E) , as soluções de alginato de 10 sódio não fluíram para fora dos defeitos, apesar das condições que facilitam o fluxo em função do líquido sinovial. Subseqüentemente, aproximadamente 0,5 mL de uma solução de 100 mM de CaCl2 foi lenta e continuamente aplicado ao longo de 10 segundos à superfície do enxerto 15 usando uma seringa de 27G. A camada da superfície do enxerto gelificou imediatamente, e as células não saíram da área afetada. A solução de CaCl2 foi lavada com soro fisiológico. Não foi necessária imobilização adicional, e a área afetada foi suturada após o procedimento. Os coelhos

2 0 eram capazes de se mover livremente.

Os coelhos em questão foram sacrificados por injeção intravenosa de uma dose excessiva de pentobarbital em 4 semanas ou 12 semanas após o procedimento. As extremidades distais dos fêmures foram removidas com uma serra elétrica. 25 A FIG. 5 mostra fotografias tiradas no momento do procedimento.

Observações globais

A aparência global foi observada macroscopicamente e pontuada. A aparência global foi pontuada de acordo com os critérios da FIG. 6 com referência ao método de Gabriele, G. e cols. (Biomaterial, 21 (2000), 2.561-2.574).

Coloração

Subseqüentemente, as amostras foram fixadas com paraformaldeído, descalcifiçadas e embebidas em parafina.

Os cortes localizados a 5 μιη do centro do defeito foram corados com safranina-O, coloração com H-E e imunocorados com anticolágeno do tipo I e anti- colágeno do tipo II. 0 sistema de pontuação descrito na FIG. 7 foi usado para avaliar o tecido cartilaginoso recém-formado, e o tecido 10 foi avaliado microscopicamente. Observadores cegos independentes realizaram a pontuação.

Medida da resistência mecânica

A resistência mecânica da área afetada foi medida usando um teste de indentação. As amostras foram pinçadas 15 firmemente com a articulação fêmuro-patelar virada para cima, e o teste foi realizado em temperatura ambiente. 0 indentador era movido automaticamente em direção ao centro da cartilagem regenerada e o deslocamento (mm) era registrado em relação à carga (N) . A espessura do tecido 20 regenerado foi medida dos cortes histológicos. Foi então obtido o módulo de Young da região linear das curvas de carga-deslocamento.

Resultados

Os resultados da coloração são mostrados na FIG. 8 até a FIG. 11.

Em conseqüência da coloração com H-E, da coloração com safranina-0 e da imunocoloração anticolágeno do tipo II, a formação mais proeminente de cartilagem hialina e de colágeno do tipo II em comparação com os outros grupos foi

3 0 confirmada no grupo de alginato purificado + células (E) (FIG. 11) em um estágio inicial 4 semanas após o procedimento. Foi observado que aproximadamente 80% da cartilagem estavam regenerados em 12 semanas após o procedimento. A formação de osso subcondral foi 5 extremamente favorável com base nos resultados de coloração com H-E. A coloração com safranina-0 revelou a formação de proteoglicano, e a formação de uma matriz extracelular também pode ser confirmada. Por outro lado, foi observada pouca ou nenhuma formação de cartilagem fibrosa com base 10 nos resultados da coloração com H-E e da imunocoloração anticolágeno do tipo I.

0 grupo de alginato purificado (sem células) (D) (FIG. 10) demonstrou formação favorável de cartilagem hialina, colágeno do tipo II e osso subcondral, quando comparado com 15 o grupo de alginato de grau alimentício + células (C) (FIG. 9) . No grupo (D) , no qual não foram embebidas células, foi constatado surpreendentemente que a regeneração de cartilagem foi obtida por condrócitos hialinos. Além disso, também foi verificado de forma inesperada que o grupo (D),

2 0 no qual não foram embebidas células, demonstrou uma

habilidade superior para regenerar o trauma da cartilagem, quando comparado com o grupo (C) , no qual foram embebidas células.

Por outro lado, foi observada muito pouca neogênese de cartilagem e colágeno do tipo II no grupo de controle (A) (FIG. 8), no qual os defeitos ficaram sem tratamento.

Os resultados da avaliação obtidos pontuando-se macroscopicamente a aparência global (Macro) e os resultados da avaliação obtidos pela pontuação das

3 0 observações com base na coloração descrita acima (Histológica) são mostrados na FIG. 12.

As pontuações totais obtidas combinando-se as pontuações Macro e Histológica na 12a semana foram de 22,71 para o grupo de alginato purificado + células (E), 19,57 5 para o grupo de alginato purificado (sem células) (D) , 14,75 para o grupo de alginato de grau alimentício + células (C), 10,25 para o grupo de alginato de grau alimentício (sem células) (B), e 8,43 para o grupo de controle (A) (vazio). Dessa forma, o grupo de alginato 10 purificado + células (E) demonstrou a maior pontuação, seguido pelo grupo de alginato purificado (sem células) (D) e pelo grupo de alginato de grau alimentício + células (C), nessa ordem. Foi completamente inesperado que o grupo (D), no qual não foram embebidas células, tenha gerado uma 15 pontuação total maior e, assim, demonstrando habilidade superior para regenerar cartilagem em lesões da cartilagem, quando comparado com o grupo (C) , no qual foram embebidas células.

Os resultados de pontuação tanto para a avaliação

2 0 macroscópica da aparência global (Macro total) quanto para a avaliação por coloração (Histológica total) foram os maiores no grupo de alginato purificado + células (E) , da mesma forma como descrito acima, e a maior pontuação seguinte foi observada no grupo de alginato purificado (sem 25 células) (D).

Observando-se os parâmetros da avaliação Macro, os grupos (D) e (E) , nos quais foi usado alginato purificado, foram superiores para todos os parâmetros de integração da margem (tecido novo em relação à cartilagem nativa), uniformidade da superfície da cartilagem, superfície da cartilagem, grau de preenchimento e cor da cartilagem, opacidade ou translucidez da neocartilagem, quando comparados com os grupos (B) e (C) , nos quais foi usado alginato de grau alimentício.

Observando-se os parâmetros da avaliação Histológica,

os grupos (D) e (E) , nos quais foi usado alginato purificado, demonstraram pontuações maiores do que os grupos (B) e (C) , nos quais foi usado alginato de grau alimentício, para os parâmetros de natureza do tecido 10 predominante, regularidade da superfície, integridade e homogeneidade estruturais, espessura, união à cartilagem adjacente, alterações degenerativas na cartilagem adjacente, e resposta inflamatória.

Com base nesses achados, a composição da presente 15 invenção, como representada pelos grupos (D) e (E) , demonstrou formação extremamente favorável de condrócitos e tecido cartilaginoso em um trauma de cartilagem, incluindo a formação de cartilagem hialina, colágeno do tipo II e osso subcondral. Foi observada pouca formação de cartilagem

2 0 fibrosa.

A união do tecido regenerado ao tecido do hospedeiro também foi favorável, houve pouca degeneração ou inflamação na cartilagem adjacente, e a bioafinidade foi determinada como sendo elevada.

Dessa forma, foi confirmado que a composição da

presente invenção promove eficazmente a regeneração de cartilagem em uma lesão por trauma de cartilagem.

Os resultados da medida da resistência mecânica para os grupos de alginato purificado (D) e (E) são mostrados na FIG. 13. «

Em conseqüência da medida da resistência mecânica para os grupos de alginato purificado, a resistência mecânica no grupo de alginato purificado + células (E) era um módulo de Young de 8 versus um módulo de Young de 10 em tecido 5 cartilaginoso normal, indicando, dessa forma, que a resistência foi recuperada quase ao normal, de um estado sem lesão. Esse achado também apoiou a reivindicação de que a composição da presente invenção embebida com células possui resistência mecânica superior, e é favorável com

relação à regeneração de cartilagem hialina forte e à formação de osso subcondral.

Exemplo 8

Modelo de cadáver do sexo masculino submetido a um

tratamento adequado

Método

Um cadáver humano do sexo masculino que havia sido submetido a um tratamento adequado foi fixado com formalina. Não havia instabilidade ou deformidade do joelho em temperatura ambiente. 0 côndilo lateral do fêmur foi

2 0 exposto usando uma abordagem parapatelar mediai. A

cartilagem articular era lisa e não foi observada degeneração ou deterioração. Um defeito de espessura total de cartilagem medindo 10 mm x 20 mm de largura e 5 mm de profundidade foi produzido na seção com a altura máxima do

côndilo mediai usando vários tipos de punções e depois suturado. Um artroscópio foi inserido em um ângulo de 3 0° pelo lado ântero-lateral. Todos os instrumentos cirúrgicos foram inseridos pelo lado ântero-lateral. Após aplicação de soro fisiológico na área afetada, o líquido remanescente na

3 0 articulação foi drenado, seguido por enxugamento com um cotonete seco. Uma solução 2% p/v de alginato de sódio purificado (sem células) corada com azul tripano e com uma viscosidade de 5.000 a 6.000 mPa.s foi injetada lentamente no defeito de cartilagem com uma seringa com uma agulha de 5 18G. Embora a área afetada estivesse virada para baixo no momento do procedimento, a composição da presente invenção não saiu da lesão e lá permaneceu. Dez mL de solução 100 mM de CaCl2 foram aplicados na área afetada para gelificar a superfície. A articulação do joelho foi lavada 10 adequadamente por refluxo com soro fisiológico, e a área afetada foi preenchida com 20 mL de soro fisiológico para evitar o ressecamento.

Após o procedimento, o joelho foi estendido manualmente e flexionado em uma amplitude de 0 a 120°, 200 vezes cada, em intervalos de seis horas. A área afetada foi avaliada 24 horas após o procedimento.

Resultados

Fotografias que revelam este experimento são mostradas na FIG. 14. A FIG. 14A é uma fotografia que mostra a 20 criação do defeito de cartilagem. Além disso, a FIG. 14B mostra uma solução corada de alginato de sódio transplantada no defeito de cartilagem. A FIG. 14C mostra a superfície do alginato de sódio sendo gelificada (curada) por aplicação da solução de CaCl2. Finalmente, a FIG. 14D 25 mostra os resultados da observação do movimento da articulação 24 horas após cirurgia.

Esse experimento foi realizado para confirmar se a composição da presente invenção pode ser transplantada no caso de ter sido criado um grande defeito não apenas em

3 0 coelhos, mas também em um cadáver humano. Como mostrado na fotografia da FIG. 14B, a solução de alginato de sódio não escorreu para fora da área afetada, mesmo se a superfície da solução de alginato de sódio não fosse gelificada após injeção no defeito. Além disso, a solução de alginato de sódio permaneceu no defeito, mesmo após a articulação ter sido movida após a cirurgia e observada 24 horas mais tarde após a gelificação da superfície da solução de alginato de sódio. Foi surpreendente verificar que uma composição dessa forma era capaz de permanecer no defeito no local submetido às condições rígidas que consistem na aplicação de uma carga e movimento violento. Com base nesse achado, foi determinado que a composição para a regeneração de cartilagem ou para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção possui propriedades físicas que a permitem ser aplicada a uma ampla gama de aplicações clínicas com relação às várias formas de lesões da cartilagem e condições de uso.

Exemplo 9

Técnica para formar um a vários orifícios em uma lesão de

cartilagem

(1) Primeiro exemplo

Nos casos nos quais há permanência de cartilagem em uma lesão por trauma de cartilagem ou em um defeito de cartilagem, um a vários defeitos de espessura total com diâmetro comparativamente pequeno que possuem um diâmetro de cerca de 1,5 mm e profundidade de cerca de 5 a 10 mm e que se estendem até o osso subcondral são produzidos em uma lesão por trauma de cartilagem ou cartilagem residual usando uma furadeira elétrica de acordo com o método dos Exemplos 7 e 8. Após injetar lentamente nesses orifícios uma solução de alginato de sódio purificado (sem células) com uma viscosidade de 3.000 a 4.000 mPa.s com uma agulha de 18G, 1,0 mL de solução 100 mM de CaCl2 é aplicado à superfície da solução de alginato de sódio injetada no defeito para gelificar a superfície desta. Em conseqüência da produção do defeito de espessura total (ou defeitos), ocorre sangramento pela medula óssea do paciente, o que permite que células precursoras de cartilagem na medula óssea migrem para o defeito de cartilagem. A regeneração da cartilagem é promovida pelos efeitos das células precursoras de cartilagem migradas e pela composição da presente invenção, o que torna possível, dessa forma, melhorar a função de toda a cartilagem.

(2) Segundo exemplo

Um defeito parcial que não se estende até o osso subcondral é produzido em uma lesão por trauma de cartilagem ou em um defeito de cartilagem no qual está presente cartilagem residual, similar ao primeiro exemplo descrito acima. Uma solução de alginato de sódio purificado (sem células) com uma viscosidade de 2.000 a 3.000 mPa.s e uma solução 100 mM de CaCl2 são então aplicadas da mesma forma que o primeiro exemplo. Como não há sangramento no defeito pela medula óssea do paciente, não há infiltração de células precursoras de cartilagem na medula óssea do indivíduo. No entanto, também nesse caso, em conseqüência da aplicação da composição aos orifícios de pequeno diâmetro, os efeitos da composição da presente invenção são demonstrados, a regeneração da cartilagem é favorável, e a função de toda a cartilagem pode se melhorada. Essas técnicas são eficazes em casos nos quais uma lesão por trauma de cartilagem cobre uma área ampla e naqueles nos quais cartilagem residual danificada está presente.

Exemplo 10

Teste de aderência da solução de alginato de sódio

O relacionamento entre viscosidade e aderência da

composição da presente invenção foi examinado usando uma solução aquosa de alginato de sódio (Kimica Corp.).

Método

Foram preparadas soluções aquosas de alginato de sódio 10 (Tabela 2) usando três tipos de soluções de alginato de sódio para as quais a viscosidade de uma solução aquosa 1% de alginato de sódio demonstra um valor de 110, 360 ou 570 mPa.s pelo fato de terem diferentes pesos moleculares. Uma quantidade predeterminada de cada solução foi derramada em 15 um microtubo de centrífuga (diâmetro interno: 9 mm, altura:

3 9 mm), evitando-se a entrada de bolhas de ar, seguida por medida imediata da quantidade de tempo até que cada solução comece a escorrer para fora do microtubo quando inclinada em um ângulo de 135°.

2 0 Nesse momento, as viscosidades das soluções de

alginato de sódio foram medidas usando um viscômetro do tipo B (Toki Sangyo Co., Ltd., Japão) em uma temperatura de 2 0°C.

Tabela 2

Amostra

Solução aquosa de Concentração (%) alginato de sódio Viscosidade 110 mPa.s 0,5 1,0 1,5 2, 0 2,5 3,0 3 60 mPa.s 0,5 1,0 1,5 2 , 0 2,5 3,0 570 mPa.s 0,5 1,0 1,5 2, 0 2,5 3,0 Resultados

Os relacionamentos entre a concentração de cada solução de alginato de sódio e o tempo de adesão são mostrados na FIG. 15. Os tempos de adesão de cada um dos 5 três tipos de soluções de alginato de sódio aumentaram à medida que a concentração das soluções ficava maior, e foi determinado que a aderência aumenta. Além disso, uma comparação dos três tipos de soluções de alginato de sódio revelou que a seleção de uma solução de alginato de sódio 10 que possui uma viscosidade elevada em uma concentração de 1% de gerou alta aderência e permitiu a obtenção de um tempo de adesão mais longo.

Os relacionamentos entre a viscosidade de cada tipo de solução de alginato de sódio e o tempo de adesão são 15 mostrados na FIG. 16. O tempo de adesão ficou mais longo e foi demonstrada aderência maior à medida que as viscosidades das soluções de alginato de sódio aumentavam. Dessa forma, foi demonstrado que foi obtida uma correlação constante entre viscosidade e aderência de uma composição 20 que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico.

Com base nesses achados, quando se aplica a composição da presente invenção em um defeito de cartilagem inclinado ou virado para baixo, e quando umidade, sangue e semelhantes na área afetada foram removidos e as condições 25 desse experimento foram satisfeitas, a viscosidade da composição da presente invenção pode ser ajustada com base nesse resultado. Por exemplo, a viscosidade da composição da presente invenção pode ser ajustada até cerca de 2.000 mPa.s ou mais para se obter um tempo de adesão de cerca de

3 0 5 segundos, até uma viscosidade de cerca de 3.000 a 4.000 mPa.s ou mais, para se obter um tempo de adesão de cerca de 10 segundos, até cerca de 7.000 a 8.000 mPa.s ou mais para se obter um tempo de adesão de cerca de 20 segundos e até uma viscosidade de cerca de 8.000 a 9.000 mPa.s ou mais para se obter um tempo de adesão de cerca de 3 0 segundos.

No entanto, quando realmente se aplica em uma área afetada, o tempo de adesão varia de acordo com fatores como, por exemplo, a quantidade da composição injetada e o formato do local injetado. Particularmente, quando apenas uma pequena quantidade da composição é injetada, já que fatores como a tensão superficial também têm um efeito, além da viscosidade, a aderência de longo prazo é possível, mesmo em uma baixa viscosidade.

0 tempo de adesão-alvo pode ser obtido de acordo com o tipo de procedimento usado levando-se em conta adequadamente outros fatores, tais como as características do viscômetro usado para a medida, temperatura ambiente, quantidade de células embebidas, e estado da composição da presente invenção.

Exemplo 11

Medida da distribuição do peso molecular de alginato de

sódio purificado

(1) Método

A distribuição de peso molecular de alginato de sódio purificado foi medida por cromatografia por filtração em gel sob as condições indicadas abaixo.

Coluna: TSkgel GMPWxl, 2 colunas + TSkgel G2500PWxl, 1 coluna (Tosoh Corp.) (diâmetro 7,8 mm x 300 mm x 3 colunas)

Temperatura da coluna: 4O0C

Eluato: solução aquosa 2 00 mM de nitrato de sódio Concentração da amostra: 0,05%

Taxa de fluxo: 1,0 ml/min Volume de injeção: 2 00 μΐ Detector: RI (refratômetro diferencial)

Padrões: Pululana, glicose (pesos moleculares:

1.600.000, 788.000, 404.000, 212.000, 112.000, 47.300, 22.800, 11.800, 5.900, 180)

(2) Resultados

Tabela 3

Amostra da Peso Peso Proporção (Referência) medida molecular molecular da Viscosidade médio (Mn) ponderai variância de uma médio (Mw) (Mw/Mn) solução aquosa 1% Alginato de 430 . 000 1.700.000 4,0 400 a 500 sódio purificado mPa. s (Kimica Corp., Mochida International Ltd., Sea Matrix™ (esterilizado), N° de Série B5Y01) Alginato de 66 . 000 440.000 6, 6 20 a 100 sódio purificado mPa. s (Pronova™ SLG2 0, FMC Biopolimer Inc. 10

(3) Discussão O peso molecular ponderai médio do alginato de sódio purificado usado no modelo de reparo de cartilagem de coelho do Exemplo 7 foi de 1.700.000, medido usando o método descrito acima. Como indicado no Exemplo 7, o alginato de sódio demonstrou efeitos regenerativos em cartilagem hialina no modelo de reparo de cartilagem de coelho, com e sem células. Por outro lado, embora um experimento similar tenha sido realizado usando ácido algínico com endotoxina inferior (Pronova™ LVG, atualmente Pronova™ UP LVG, FMC Biopolimer Inc.), como descrito na Referência 5, é revelado que se forma cartilagem fibrosa no caso de se aplicar apenas ácido algínico que não contém células em um defeito de cartilagem. Além disso, a versão esterilizada de Pronova™ LVG é designada como Pronova™ SLG2 0, cujo peso molecular ponderai médio, determinado pelo método descrito acima, foi de 440.000. Embora Sea Matrix™ e Pronova™ possuam uma característica comum de serem ácidos algínicos de endotoxina inferior, seus ácidos algínicos diferem em termos de peso molecular, e acredita- se que essa diferença leve a diferenças em termos dos efeitos regenerativos na cartilagem. Embora a viscosidade possa ser ajustada pela concentração de ácido algínico, em um experimento em que diferentes concentrações de géis de ácido algínico (0,5 a 4%) foram embebidas com condrócitos, transplantadas abaixo da pele de camundongos e confirmadas para a geração de cartilagem, foi relatado que a concentração de ácido algínico não possui efeitos sobre os efeitos de geração de cartilagem (Keith T. Paige e cols., "De Novo Cartilage Generation Using Calcium Alginate- Chondrocyte Constructs", Plastic and Reconstructive Surgery, Vol. 97: 1996, páginas 168-178) . Dessa forma, acredita-se que a diferença nos efeitos regenerativos na cartilagem entre Sea Matrix™ e Pronova™ seja atribuível ao peso molecular. Especificamente, embora o uso de ácido algínico com endotoxina inferior permita a obtenção de uma composição com bioafinidade maior com níveis baixos de degeneração e respostas inflamatórias na cartilagem circundante, também quando se utiliza ácido algínico com um peso molecular elevado, verificou-se que pode ser obtida uma composição para a regeneração de cartilagem ou uma composição terapêutica que possui efeitos regenerativos na cartilagem extremamente superiores, permitindo a regeneração da cartilagem, mesmo sem células nela embebidas. 0 ácido algínico com endotoxina inferior com um peso molecular ponderai médio de pelo menos 500.000 ou mais e, preferivelmente, 650.000 ou mais, é útil para a regeneração de cartilagem, sendo mais preferível que tenha um peso molecular ponderai médio de 1.000.000 a 2.000.000, e sendo particularmente preferível que tenha um peso molecular ponderai médio de cerca de 1.500.000 a 2.000.000.

Exemplo 12

Modelo de osteoartrite em coelho (modelo de ressecção do ligamento cruzado anterior (ACL))

(1) Método

Foi criado um modelo de OA em ambas as articulações do

joelho de fêmeas de coelhos brancos japoneses (pesos corporais: 2,6 a 2,9 kg) de acordo com o método de Vignon, E. e cols. (Vignon, E., Bejui, J., Mathieu, P., Hartmann, JD, Ville, G., Evreux, JC, e cols., "Histological cartilage changes in a rabbit model of osteoarthritis", J. Rheumatol., 1987: 14 (N° especial): 104-6). Três animais (6 joelhos) foram distribuídos nos quatro grupos seguintes:

A) Grupo de controle (soro fisiológico)

B) Grupo de dose de solução 1% de hialuronato de sódio (peso molecular: aproximadamente 900.000, viscosidade:

aproximadamente 2.3 00 mPa.s)

C) Grupo de dose de solução 1% de alginato de sódio purificado (peso molecular: aproximadamente 1.700.000, viscosidade: aproximadamente 500 mPa.s)

D) Grupo de dose de solução 2% de alginato de sódio

purificado (peso molecular: aproximadamente 1.700.000, viscosidade: aproximadamente 5.000 mPa.s)

As soluções de (B) a (D) foram preparadas usando soro fisiológico. O alginato de sódio purificado de (C) e (D)

era igual ao alginato de sódio purificado usado nos Exemplos 1 e 7 (Kimica Corp., Mochida International Ltd., Sea Matrix (esterilizado), N0 de Série B5Y01).

Após ressecção do ligamento cruzado anterior, cada uma das soluções (A) a (D) acima foi administrada dentro da

2 0 cavidade articular nas 4a, 5a, 6a, 7a e 8a semanas (total

de 5 administrações dadas uma vez por semana). As soluções foram administradas usando uma agulha de 27G penetrando-se o tendão patelar e injetando-se 0,3 ml/joelho por administração. Os coelhos foram sacrificados na 9a semana

para a retirada de amostras de tecido da articulação do joelho. A inflamação decorrente de infecções, reações de corpo estranho e semelhantes não foram observadas em nenhum dos joelhos.

(2) Resultados

3 0 Observações gerais A aparência de toda a articulação do joelho (cartilagem articular do joelho do fêmur e da tíbia) foi observada macroscopicamente. Esses resultados são mostrados na FIG. 17. No grupo A (grupo de dose de soro fisiológico),

vários achados de osteoartrite, incluindo defeitos de cartilagem e osteófitos, foram observados

macroscopicamente. O grau de trauma de cartilagem (tamanho, profundidade) foi mais leve nos outros grupos do que no grupo A. A pontuação dos achados macroscópicos gerou resultados similares.

Coloração

As amostras de tecido da articulação do joelho foram fixadas com paraformaldeído, descalcifiçadas e embebidas em parafina. As amostras foram avaliadas histologicamente por 15 coloração com safranina-0. Esses resultados são mostrados na FIG. 18. As porções superiores de cada figura indicam cartilagem femoral, enquanto as porções inferiores indicam cartilagem tibial, e alterações cartilaginosas

degenerativas foram avaliadas na cartilagem em ambas as 20 localizações. A coloração diminuída da cartilagem matriz e a aspereza aumentada da superfície da cartilagem foram observadas no grupo A (grupo de dose de soro fisiológico) . No grupo B (grupo de dose de solução 1% de hialuronato de sódio), embora a superfície da cartilagem estivesse mais 25 lisa do que no grupo A, foi observada diminuição da coloração. No grupo C (grupo de dose de solução 1% de alginato de sódio purificado) e no grupo D (grupo de dose de solução 2% de alginato de sódio purificado), a superfície da cartilagem estava lisa e as diminuições da

3 0 coloração eram mais leves, comparadas com grupos Ae B. Além disso, ácido algínico residual estava presente na superfície da cartilagem.

Com base nos achados acima, a injeção intra-articular de alginato de sódio demonstrou ação que inibiu a 5 degeneração da cartilagem e protegeu a cartilagem em um modelo de OA por ressecção do ACL, e foram observados efeitos que eram iguais ou melhores do que a administração da solução 1% de hialuronato de sódio usada como fármaco terapêutico para a osteoartrite. Além disso, na medida em 10 que o alginato de sódio estava aderido na superfície da cartilagem, foi confirmado que o alginato de sódio demonstra afinidade com cartilagem articular, bem como cobre e protege superfícies de cartilagem.

Exemplo 13

Avaliação dos efeitos terapêuticos do ácido algínico de diferentes pesos moleculares em um modelo de osteoartrite em coelhos (modelo de ressecção do ligamento cruzado

anterior (ACL))

(1) Método

2 0 Foi criado um modelo de OA em ambas as articulações do

joelho de fêmeas de coelhos brancos japoneses (pesos corporais: 2,6 a 2,9 kg) de acordo com o método de Vignon, E. e cols. (Vignon, E., Bejui, J., Mathieu, P., Hartmann, JD, Ville, G., Evreux, JC, e cols., "Histological cartilage 25 changes in a rabbit model of osteoarthritis, J. Rheumatol., 1987: 14 (N° especial): 104-6). Cinco animais cada (10 joelhos) foram distribuídos nos cinco grupos seguintes:

A) Grupo de controle (soro fisiológico)

B) Grupo de dose de solução 1% de hialuronato de sódio (ARTZ (marca registrada), Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., peso molecular: aproximadamente 900.000, viscosidade: aproximadamente 2.3 00 mPa.s)

C) Grupo de dose de solução 2% de alginato de sódio purificado (Pronova™ SLM2O, FMC Biopolimer Inc., peso

molecular: aproximadamente 4 00.000)

D) Grupo de dose de solução 2% de alginato de sódio purificado (Kimica Corp., esterilizado, peso molecular: aproximadamente 1.000.000)

E) Grupo de dose de solução 2% de alginato de sódio purificado (Sea Matrix (esterilizado), Kimica Corp., peso

molecular: aproximadamente 1.700.000)

As soluções de (C) a (E) foram preparadas usando soro fisiológico.

Após ressecção do ligamento cruzado anterior, cada uma 15 das soluções (A) a (E) acima foi administrada dentro da cavidade articular nas 4a, 5a, 6a, 7a e 8a semanas (total de 5 administrações dadas uma vez por semana). As soluções foram administradas usando uma agulha de 2 7G penetrando-se o tendão patelar e injetando-se 0,3 ml/joelho por 20 administração. Os coelhos foram sacrificados na 9a semana para a retirada de amostras de tecido da articulação do joelho. Inflamação decorrente de infecções, reações de corpo estranho e semelhantes não foram observadas em nenhum dos joelhos.

(2) Resultados

Observações gerais

A aparência de toda a articulação do joelho (cartilagem articular do joelho do fêmur e da tíbia) foi observada macroscopicamente. A fim de avaliar o grau de

3 0 lesão da superfície da cartilagem, as amostras foram coradas em tinta nanquim de acordo com o método de Choji Shimizu e cols. e depois pontuadas (J. Rheumatol., Vol. 25, páginas 1.813-1.819, 1998). Os achados macroscópicos são mostrados na FIG. 19. Quando se utiliza a coloração com 5 tinta nanquim, os limites entre as lesões por trauma de cartilagem e a cartilagem normal são corados. No grupo A (grupo de dose de soro fisiológico), vários achados de osteoartrite, incluindo defeitos profundos e amplos da cartilagem e osteófitos, foram observados

macroscopicamente. 0 grau de trauma de cartilagem (tamanho, profundidade) foi mais leve nos outros grupos do que no grupo A. Os resultados da pontuação dos achados macroscópicos são mostrados na FIG. 20. As articulações do joelho foram observadas em quatro localizações: côndilo

femoral mediai (MFC), platô tibial mediai (MTP), côndilo femoral lateral (LFC) e platô tibial lateral (LTP). 0 grau de trauma de cartilagem foi mais leve nos grupos B a E do que no grupo A em todos esses locais. Além disso, o grau de trauma de cartilagem tendia a ser mais leve nos grupos D e

2 0 E do que nos grupos B e C. Acredita-se que as diferenças

nos efeitos inibidores de alteração cartilaginosa degenerativa, nos efeitos protetores da cartilagem e nos efeitos de reparo de cartilagem estejam presentes em função de diferenças no peso molecular do ácido algínico.

Coloração com proteoglicano

As amostras de tecido da articulação do joelho foram fixadas em paraformaldeido, descalcifiçadas e embebidas em parafina. As amostras foram avaliadas histologicamente por coloração com safranina-O. Esses resultados são mostrados

3 0 na FIG. 21. As porções superiores de cada figura indicam cartilagem femoral, enquanto as porções inferiores indicam cartilagem tibial, e alterações cartilaginosas

degenerativas foram avaliadas na cartilagem em ambas as localizações. A coloração diminuída da cartilagem matriz e 5 a aspereza aumentada da superfície da cartilagem foram observadas no grupo A (grupo de dose de soro fisiológico) . No grupo B (grupo de dose de solução 1% de hialuronato de sódio), embora a superfície da cartilagem estivesse mais lisa do que no grupo A, foi observada diminuição da 10 coloração. Nos grupos de dose de solução de alginato de sódio (grupos CaE), a superfície da cartilagem estava lisa e as diminuições da coloração eram mais leves, comparadas com grupos Ae B. Além disso, ácido algínico residual estava presente na superfície da cartilagem.

Avaliação histopatológica global

Observações macroscópicas e observações por coloração foram avaliadas de forma abrangente por pontuação de acordo com o método de Toshiyuki Kikuchi e cols. para avaliar os efeitos dos fármacos administrados (Osteoarthritis and 20 Cartilage, Vol. 4, páginas 99-110, 1996). Os côndilos femorais mediais foram avaliados para um de quatro níveis quanto aos 8 parâmetros indicados abaixo, e a pontuação total foi usada como uma pontuação de lesão por osteoartrite.

(I) Perda da superfície da cartilagem, (2) erosão de

cartilagem, (3) fibrose e rachadura, (4) perda de proteoglicano corável, (5) distúrbios no arranjo de condrócitos, (6) perda de condrócitos, (7) perda de osso subcondral, e (8) formação de agrupamentos de condrócito.

3 0 AN0VA foi usada para testar a presença de uma diferença significante entre grupos, e subseqüentes comparações entre cada grupo foram feitas em um nível de significância de p<0,05 usando um teste pôs-hoc.

Os resultados são mostrados na FIG. 22. As pontuações 5 da lesão por osteoartrite foram significativamente menores nos grupos BaE versus grupo A. Além disso, embora tenham sido observados efeitos superiores nos grupos de dose de ácido algínico com alto peso molecular (grupos DeE) comparados com o grupo de dose de ácido hialurônico (grupo 10 B), os efeitos do grupo de dose de ácido algínico com baixo peso molecular (grupo C) foram aproximadamente iguais àqueles do grupo de dose de ácido hialurônico.

Com base nos achados acima, a injeção intra-articular de alginato de sódio demonstrou ação que inibiu alterações 15 cartilaginosas degenerativas e protegeu a cartilagem em um modelo de OA por ressecção do ACL, e foram observados efeitos que eram iguais ou melhores do que a administração da solução 1% de hialuronato de sódio usada como fármaco terapêutico para a osteoartrite. Em particular, o ácido 20 algínico com alto peso molecular demonstrou efeitos terapêuticos superiores aos do ácido hialurônico. Além disso, embora os três tipos de ácido algínico diferissem em termos de viscosidade, como foi observado que o ácido algínico que possui viscosidade menor do que a do ácido 25 hialurônico demonstrou efeitos iguais ou maiores do que aqueles do ácido hialurônico, acredita-se que as diferenças nos efeitos terapêuticos sejam atribuíveis às diferenças na substância usada e no peso molecular, e não às diferenças de viscosidade.

3 0 No modelo de OA por ressecção do ACL usado neste experimento, os fármacos foram administrados começando 4 semanas após a ressecção do ACL. Dessa forma, acredita-se que as diminuições das pontuações da lesão por osteoartrite observadas nos grupos de dose de fármaco sejam o resultado combinado de efeitos que inibem a progressão de lesões em função da inibição de alterações cartilaginosas degenerativas e proteção de cartilagem e da ação de reparo de cartilagem em lesões da cartilagem que já ocorreram. De acordo com o trabalho de Toshiyuki Kikuchi mencionado acima citado como uma referência neste experimento, há relatos de que as pontuações de OA alcancem 2 0 a 2 5 nos grupos de dose de soro fisiológico. Como a administração do fármaco foi iniciada na 4a semana após a ressecção do ACL neste experimento, há a possibilidade de que as pontuações de OA tenham diminuído em conseqüência da melhora do estado da cartilagem em função dos efeitos dos fármacos após o início da administração a partir de um estado em que as pontuações de OA eram de cerca de 20 a 25. Além disso, na medida em que a pontuação para articulações normais é de 8 no sistema de avaliação usado neste experimento, pode-se considerar que a pontuação de OA média (11,3) no grupo E (ácido algínico com um peso molecular de 1.700.000) se aproxima da pontuação para articulações normais, podendo ser considerada uma pontuação extremamente boa.

Exemplo 14

Estudo do método de medição do peso molecular de ácido

algínico

Sabe-se que podem ser obtidos valores diferentes quando se mede o peso molecular de substâncias com alto peso molecular derivadas de uma origem natural, dependendo do método de medição. De acordo com ASTM F2064-00 (Publicação Internacional ASTM (2006); a "American Society for Testing and Materials" é uma organização envolvida na padronização internacional e no estabelecimento de especificações de padrões de material industrial e padrões de método de teste), o uso de SEC-MALLS (cromatografia por exclusão de tamanho com Detecção de Dispersão de Luz de Laser por Múltilpos Ângulos) é recomendado para a medição do peso molecular. Portanto, foi feita uma comparação entre as medidas do peso molecular do alginato de sódio usado no Exemplo 13 por SEC-MALLS e por cromatografia por filtração em gel, como descrito no Exemplo 11. Além disso, SEC-MALLS combina o uso de um detector de dispersão de luz de laser por múltilpos ângulos (MALLS) com cromatografia por filtração em gel.

(1) Método

A medição por cromatografia por filtração em gel foi realizada da mesma forma que no Exemplo 11. A medição por SEC-MALLS foi realizada sob as condições indicadas abaixo. Detector de dispersão de luz de laser por múltilpos

ângulos: DAWN HELEOS, Wyatt Technology

Coluna: Shodex SB-8 06M, 2 colunas (Showa Denko K.K.) Eluato: Solução aquosa 2 00 mM de nitrato de sódio Taxa de fluxo: 1,0 ml/min (2) Resultados

Tabela 4

AL17 0 ALlOO AL4 0 Peso molecular ponderai 1.700.000 1.000 . 000 410.000 médio determinado por cromatografia por filtração em gel Peso molecular ponderai 185.000 149.000 128.000 médio determinado por SEC- MALLS (Referência) Efeitos Muito Muito Bons farmacológicos no Exemplo bons bons 13 O mesmo alginato de sódio purificado (endotoxina inferior) usado no Exemplo 13 é usado para AL170, AL100 e AL4 0 .

ALl70: Kimica Corp., Mochida International Ltd., Sea Matrix (esterilizado), viscosidade 1%: aproximadamente 500 mPa.s.

AL100: Kimica Corp., sterilized, viscosidade 1%: aproximadamente 10 0 mPa.s.

AL40: FMC Biopolimer Inc., Pronova™ SLM20/ viscosidade 1%: aproximadamente 30 mPa.s

(3) Discussão

Como mostrado na Tabela 4, diferenças nos pesos moleculares de três tipos de alginatos determinados por SEC-MALLS só foram observadas em uma faixa que não indicou 15 definitivamente uma diferença entre eles, e aqueles valores diferiram consideravelmente dos resultados de medição obtidos por cromatografia por filtração em gel. Como mostrado no Exemplo 13, como havia diferenças bem definidas nos efeitos farmacológicos entre as amostras usadas, 20 verificou-se que os pesos moleculares determinados por cromatografia por filtração em gel demonstram uma correlação maior com os efeitos terapêuticos de alginatos do que os pesos moleculares determinados por SEC-MALLS, e constatou-se que os pesos moleculares determinados por cromatografia por filtração em gel são adequados como parâmetros para especificação de uma faixa de peso molecular preferível de alginatos usados na composição para a regeneração de cartilagem ou para a composição para o tratamento de uma doença da cartilagem.

Exemplo 15

Efeitos do ácido algínico sobre dor de artrite experimental

em ratos

(1) Método

Ratos com artrite induzida por injeção intra-articular de cristais de urato monossódico em forma de agulha (MSU) se apresentam com uma marcha anormal causada por dor. Um modelo experimental de dor da artrite em ratos por administração de MSU foi preparado de acordo com o método de Shizuhiko Ihara, e cols. (Folia Pharmacol. Japon, Vol. 100, páginas 359-365 (1992)) para avaliar os efeitos da administração intra-articular de alginato de sódio.

Machos de ratos Crl: CD foram adquiridos com 5 semanas de idade e usados no experimento após um período de aclimação de uma semana. Foi injetado 0,05 mL de uma suspensão de soro fisiológico 5,0% de MSU na articulação do joelho direito dos ratos sob anestesia, seguida por observação da marcha em 2, 4, 6 e 24 horas após a injeção. A marcha foi avaliada por pontuação de um a cinco graus que consistem em marcha normal (0 ponto), claudicação leve (1 ponto), claudicação moderada (2 pontos), andando sobre os dedos dos pés (3 pontos) , e andando sobre três pernas (4 pontos). Dez animais foram distribuídos a cada um dos cinco grupos indicados abaixo:

A) Grupo de controle (grupo de dose de soro fisiológico)

B) Grupo de dose de solução 1% de hialuronato de sódio

(ARTZ (marca registrada), Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., peso molecular: aproximadamente 900.000)

C) Grupo de dose de solução 2% de alginato de sódio purificado (Kimica Corp., esterilizado, peso molecular:

aproximadamente 1.000.000)

D) Grupo de dose de solução 1% de alginato de sódio purificado (Sea Matrix (esterilizado), Kimica Corp., peso molecular: aproximadamente 1.700.000)

molecular: aproximadamente 1.700.0 00)

Cinqüenta μΐ de cada solução foram administrados no mesmo local da articulação, uma hora antes da injeção de MSU.

(2) Resultados e discussão

As alterações baseadas no tempo nas pontuações da marcha são mostradas na FIG. 23. As pontuações da marcha do grupo de dose de solução 1% de hialuronato de sódio (grupo B) e dos grupos de dose de solução 2% de alginato de sódio 25 (grupos CeE) foram significativamente menores do que as do grupo de controle (grupo A) , e foram observados efeitos de supressão de dor. Foram observados efeitos de supressão de dor dose-dependentes em uma comparação das soluções 1% e 2% que contêm alginato de sódio com um peso molecular de 30 cerca de 1.700.00 (grupos DeE). Além disso, as soluções 2% de alginato de sódio com pesos moleculares de 1.000.000 e 1.700.000 demonstraram efeitos de supressão de dor iguais, apesar de terem viscosidades diferentes de cerca de 300 mPa.s e de cerca de 5.000 mPa.s, respectivamente.

Nas articulações, MSU atua direta ou indiretamente

sobre as células sinoviais e neutrófilos, e acredita-se que cause artrite por meio da produção de citocinas e semelhantes (publicação por Shizuhiko Ihara, e cols. mencionada acima). Especificamente, MSU induz dor em 10 conseqüência da reação inflamatória por ele induzida. A solução de alginato sódio demonstrou efeitos de supressão de dor nesse modelo, e os efeitos observados foram iguais àqueles do hialuronato de sódio, que é usado como fármaco terapêutico para a osteoartrite e como fármaco de supressão 15 de dor articular para artrite reumatóide crônica. Foi confirmado que um sal de metal monovalente de ácido algínico possui efeitos que inibem inflamação e dor, e acredita-se que seja útil como fármaco terapêutico para osteoartrite, ombro congelado, e semelhantes, ao mesmo 20 tempo sendo capaz de ser aplicado à dor articular associada à artrite reumatóide.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL Como a composição para a regeneração de cartilagem da presente invenção não exige um procedimento cirúrgico excessivo e pode ser injetada em uma lesão por trauma de cartilagem, o procedimento cirúrgico é simples e pode ser eficazmente promovida a regeneração de cartilagem e, particularmente, regeneração de cartilagem hialina, sem a colocação de uma carga excessiva sobre o corpo em termos de coleta de condrócitos, periósteo, e semelhantes. A composição para a regeneração de cartilagem da presente invenção possui curabilidade de gel após entrar em contato com Ions de Ca na área afetada. A composição pode ser retida na área afetada por cura da superfície desta 5 beneficiando-se dessa propriedade. No caso de células embebidas para regeneração de tecido cartilaginoso na composição para a regeneração de cartilagem da presente invenção, as células são facilmente dispersas no gel curado. A composição pode ser usada para várias formas de 10 lesões da cartilagem, e é capaz de acomodar várias condições de aplicação.

A composição para a regeneração de cartilagem da presente invenção é capaz de demonstrar efeitos regenerativos em cartilagem hialina, até mesmo sem conter 15 células pelo fato de conter um sal de metal monovalente de endotoxina inferior de ácido algínico. Caso não contenha células, o risco de infecção por vírus e semelhantes atribuível ao corpo ou ao processo de cultivo pode ser reduzido, tornando, dessa forma, o procedimento mais

2 0 simples.

A composição para o tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção possui efeitos de reparo de cartilagem, efeitos que suprimem alterações cartilaginosas degenerativas, efeitos protetores da cartilagem, efeitos 25 que inibem inflamação de tecido articular e/ou efeitos que suprimem a dor causada por inflamação de tecido articular ao ser injetada em uma articulação em um estado líquido, permitindo, dessa forma, que ela demonstre efeitos terapêuticos em uma doença da cartilagem. A composição é

3 0 particularmente útil para o tratamento de osteoartrite, tratamento de ombro congelado e alívio da dor articular associada à artrite reumatóide. 10

15

20

25

30

35

40

45

50

1/3

Listagem de Seqüência

<110> MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD.

NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY

<120> COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DA CARTILAGEM

<13 0 > PCT08- 0 00 9

<150> JP 2007-41520

<151> 21/02/2007

<150> JP 2007-277005

<151> 24/10/2007

< 160 > 10 < 170 > PatentIn na versão 3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213 > Seqüência artificial <220> <223> DNA sintético <4 0 0 > 1 taagagctcc aaggccaaga <210> 2 <211> 20 <212 > DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> DNA sintético <4 0 0 > 2 tgtacctact cctttgaccg <21Q> 3 <211> 20 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial <2 2 0 > <223 > DNA sintético 10

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Claims

1. Uso de um sal de metal monovalente inferior de endotoxina de ácido algínico, caracterizado por ser usado para a fabricação de uma composição farmacêutica que é usada para o tratamento de uma doença da cartilagem, em que a composição é adaptada para ser injetada em uma articulação, e a composição não contém células para regeneração de tecido cartilaginoso.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida doença da cartilagem é osteoartrite.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida doença da cartilagem é ombro congelado.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida doença da cartilagem é dor articular associada à artrite reumatóide.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida composição é usada para a inibição de alterações cartilaginosas degenerativas.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida composição é usada para a proteção de cartilagem.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida composição é usada para o reparo de cartilagem.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida composição é usada para a supressão de dor articular.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida composição é usada para a inibição de inflamação articular.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida composição é usada para a melhora da função articular.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida composição é usada para a regeneração de cartilagem hialina.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um agente de reticulação é aplicado à superfície da composição para curar a composição.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sal de metal monovalente de ácido algínico é alginato de sódio.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o alginato de sódio é alginato de sódio que possui um peso molecular ponderai médio de 500.000 ou mais, como determinado por cromatografia de filtração em gel.

15. Uso de um sal de metal monovalente inferior de endotoxina de ácido algínico, caracterizado por ser usado na fabricação de uma composição farmacêutica que é usada para a regeneração de cartilagem hialina, e que é aplicada a uma lesão por trauma de cartilagem, contendo células- tronco mesenquimais da medula óssea, que possuem uma viscosidade de 4 00 mPa.s a 5.000 mPa.s, e que possuem fluidez.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que um agente de reticulação é aplicado à superfície da composição para curar a composição.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que as células são incluídas na composição após cultivo in vitro, sem indução de diferenciação.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a aplicação a uma lesão por trauma de cartilagem é: a) aplicação a um defeito de cartilagem, ou b) formação de um ou mais orifícios na lesão por trauma de cartilagem ou em um defeito de cartilagem e aplicação nos orifícios formados.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a composição é aderida por pelo menos 5 segundos a uma lesão por trauma de cartilagem que possui uma abertura ou defeito que está inclinado ou virado para baixo.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicável à lesão por trauma de cartilagem com uma agulha 16 G.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o sal de metal monovalente de ácido algínico é alginato de sódio.

22. Composição caracterizada por ser usada para o tratamento de uma doença da cartilagem contendo como um ingrediente ativo da mesma um sal de metal monovalente inferior de endotoxina de ácido algínico, em que a composição não contém células para regeneração de tecido cartilaginoso.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que um agente de reticulação é aplicado à superfície da composição para curar a composição.

24. Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o sal de metal monovalente de ácido algínico é alginato de sódio.

25. Composição, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o alginato de sódio é alginato de sódio que possui um peso molecular ponderai médio de 500.000 ou mais, como determinado por cromatografia de filtração em gel.

26. Composição, caracterizada por ser usada para a regeneração de cartilagem hialina, contendo um sal de metal monovalente inferior de endotoxina de ácido algínico e células-tronco mesenquimais da medula óssea, que possuem uma viscosidade de 400 mPa.s a 5.000 mPa.s, e que possuem fluidez.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que um agente de reticulação é aplicado à superfície da composição para curar a composição.

28. Composição, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que as células são incluídas na composição após cultivo in vitro, sem indução de diferenciação.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o sal de metal monovalente de ácido algínico é alginato de sódio.