BRPI0808389A2 - Planta transgênica, semente, vetor de expressão, e, método para aumentar resistência a nematódeo em uma planta. - Google Patents

Description

“PLANTA TRANSGÊNICA, SEMENTE, VETOR DE EXPRESSÃO, E, MÉTODO PARA AUMENTAR RESISTÊNCIA A NEMATÓDEO EM UMA PLANTA”

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório U.S. de Número de Série No.60/894.987 depositado aos 15 de Março de 2007. CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se ao controle de nematódeos, em particular ao controle de nematódeos de cisto de feijão-soja. São aqui revelados métodos de produzir plantas transgênicas com resistência a nematódeo aumentada, vetores de expressão compreendendo polinucleotídeos codificadores de proteínas funcionais, e plantas transgênicas e sementes geradas das mesmas. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Nematódeos são animais vermiformes microscópicos que se alimentam de raízes, folhas, e caules de mais de 2.000 verduras/hortaliças, frutas, e plantas ornamentais, causando uma perda de plantação mundial estimada de 100 bilhões. Um tipo comum de nematódeo é o nematódeo das galhas (RKN), cuja alimentação causa as galhas características sobre raízes. Outros nematódeos alimentadores de raiz são os dos tipos de cisto e de lesão, que tendem a ser hospedeiros mais específicos.

Nematódeos estão presentes em todos os Estados Unidos, mas são principalmente um problema em áreas quentes, úmidas do Sul e do Oeste e em solos arenosos. Nematódeo de cisto de feijão-soja (SCN), Heterodera glycines, foi primeiro descoberto nos Estados Unidos na Carolina do Norte

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em 1954. E a peste mais séria de plantas de feijão-soja. Algumas áreas estão tão intensamente infestadas por SCN que a produção de feijão-soja não é mais economicamente possível sem medidas de controle. Embora feijão-soja seja a plantação econômica principal atacada por SCN, parasitas SCN somam no total cinqüenta hospedeiros, incluindo plantações de campo, verduras/hortaliças, plantas ornamentais, e ervas daninhas.

Sinais de dano de nematódeo incluem atrofiamento e amarelecimento de folhas, e murchamento das plantas durante períodos quentes. Contudo, nematódeos, incluindo SCN, podem causar perda de 5 rendimento significativa sem os sintomas óbvios acima do solo. Em adição, raízes infectadas com SCN são ananicadas ou atrofiadas. Infestação de nematódeo pode diminuir o número de nódulos fixadores de nitrogênio sobre as raízes, e podem tomar as raízes mais suscetíveis aos ataques por outros patógenos de planta provenientes do solo.

O ciclo de vida de nematódeo tem três estágios maiores: ovo,

juvenil, e adulto. O ciclo de vida varia entre espécies de nematódeos. Por exemplo, o ciclo de vida de SCN pode costumeiramente ser completado em

24 a 30 dias sob condições ótimas enquanto que outras espécies podem demorar tão longamente quanto um ano, ou mais demoradamente, para 15 completar o ciclo de vida. Quando os níveis de temperatura e de umidade tomam-se adequados no verão, nematódeos juvenis vermiformes eclodem de ovos no solo. Apenas nematódeos no estágio desenvolvente juvenil são capazes de infectar raízes de feijão-soja. Estes nematódeos juvenis são o único estágio de vida do nematódeo que pode infectar raízes de feijão-soja.

O ciclo de vida de SCN tem sido submetido a muitos estudos e

portanto pode ser usado como um exemplo para entender um ciclo de vida de nematódeo. Após penetrar nas raízes de feijão-soja, nematódeos juvenis SCN movem-se através da raiz até contatarem tecido vascular, onde param e começam a se alimentar. O nematódeo injeta secreções que modificam certas 25 células de raiz e as transformam em sítios de alimentação especializados. As células de raiz são morfologicamente transformadas em sincícios multinucleados grandes (ou células gigantes no caso de RKN), que são usados como uma fonte de nutrientes para os nematódeos. Os nematódeos ativamente se alimentando assim roubam nutrientes essenciais da planta resultando em perda de rendimento. À medida que os nematódeos se alimentam, eles se incham e eventualmente os nematódeos fêmeas tomam-se tão grandes que rompem o tecido da raiz e são expostos sobre a superfície da raiz.

Nematódeos SCN machos migram para fora da raiz e para dentro do solo e fertilizam as fêmeas adultas de forma de limão. Os machos então morrem, enquanto que as fêmeas permanecem fixadas no sistema de raiz e continuam a se alimentar. Os ovos nas fêmeas inchadas começam a se desenvolver, inicialmente em uma massa ou saco de ovos fora do corpo, então mais tarde dentro da cavidade do corpo. Eventualmente a cavidade corporal

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inteira da fêmea adulta está cheia de ovos, e o nematódeo fêmea morre. E o corpo cheio de ovos da fêmea morta que é chamado de cisto. Cistos eventualmente se desalojam e são encontrados livres no solo. As paredes do cisto tomam-se muito resistentes, proporcionam excelente proteção para os aproximadamente 200 a 400 ovos contidos dentro das mesmas. Ovos de SCN sobrevivem dentro do cisto até ocorrerem condições apropriadas de eclosão. Embora muitos destes ovos possam eclodir dentro do primeiro ano, muitos também sobreviverão dentro dos cistos por vários anos.

Nematódeos podem se mover por si mesmos através do solo apenas umas poucas polegadas por ano. Contudo, infestação de nematódeo pode ser espalhada por distâncias substanciais em uma variedade de maneiras. Qualquer coisa que possa mover solo infestado é capaz de espalhar a infestação, incluindo maquinário, veículos e ferramentas de fazenda, vento, água, animais, e trabalhadores de fazenda. Partículas de solo do tamanho de semente freqüentemente contaminam semente colhida. Conseqüentemente, infestação de nematódeo pode ser espalhada quando semente contaminada de campos infestados é plantada em campos não-infestados.

Práticas tradicionais para manejar infestação de nematódeo incluem: manutenção de níveis de pH de solo e de nutrientes de solo apropriados em terra infestada com nematódeo; controle de outras doenças de planta, bem como de pestes de ervas daninhas e de insetos; uso de práticas de sanitização tais com aração, plantio, e cultivo de campos infestados com nematódeos apenas após trabalhar campos não-infestados; limpeza cuidadosa de equipamento com vapor de água ou água de pressão alta após trabalho em 5 campos infestados; não uso de semente crescida em terra infestada para plantio de campos não-infestados a não ser que a semente tenha sido apropriadamente limpa; rotação de campos infestados e altemação de plantações hospedeiras com plantações não-hospedeiras; uso de nematicidas; e plantio de variedades de planta resistentes.

Quitina é um polímero formado das cadeias de resíduos β-1,4-

ligados de N-acetil-glicosamina presente em fungos, insetos, e nematódeos. Em muitos casos, quitina desempenha um papel estrutural em uma variedade de tecidos. Tem sido mostrado que quitina é um componente das cascas de ovo de muitos nematódeos, incluindo os parasitas de planta Meloidogyne 15 javanica e Globodera rostochiensis, bem como uma variedade de parasitas de animal incluindo duas espécies Onchocerca, Ascaris suum e Haemonchus contortus. Outros estudos têm sugerido que quitina também pode estar presente em outros tecidos de alguns nematódeos. Quitina tem sido detectada no aparelho de alimentação do nematódeo estrongilóide Oesophagostomum 20 dentatum. Estudos de ligação de lectina têm sugerido que quitina também está presente na cutícula de A. suum. Quitinase (EC 3.2.1.14) catalisa a hidrólise aleatória de 1,4-beta-ligações de N-acetil-beta-D-glicosaminida em quitina e quitodextrinas.

Patente U.S. Nos. 5.554.521 e 5.633.450 revelam transformação de um plasmídeo codificador de quitinase de Serratia marcescens QMB1466 em plantas de tabaco e tomateiro para aumentar doçura e resistência ao frio.

Patente U.S. No. 7.087.810 revela o isolamento de um gene codificador de quitinase de Zea mays e variantes rearranjadas de dito gene, que são intencionados para tomar mais lento o desenvolvimento in vitro de C. elegans.

Omatowski, et al. (2004) In vitro Cell. Dev. Biol-Plant 40, 260-265 revela transformação de feijão-soja embriônico com um gene codificador de quitinase de Manduca sexta (lagarta do tabaco). Plantas expressando a quitinase de inseto não manifestam resistência aumentada a SCN.

Assim continua a haver uma necessidade para identificar composições e métodos eficazes e seguros para controlar nematódeos parasitas, e para a produção de plantas tendo resistência aumentada aos nematódeos parasitas de planta.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores têm descoberto que quando polinucleotídeos que codificam uma quitinase de SCN são expressados como transgenes em raízes de feijão-soja, a planta transgênica de feijão-soja demonstra resistência aumentada a SCN.

Portanto, em uma primeira modalidade, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo isolado que codifica uma quitinase de nematódeo, sendo que a expressão do polinucleotídeo concede à planta resistência a nematódeo aumentada.

Outra modalidade da invenção fomece uma semente produzida por uma planta transgênica transformada com um vetor de expressão compreendendo um transgene que codifica uma quitinase de nematódeo. A semente é desenvolvimento verdadeiro para o polinucleotídeo codificador de quitinase de nematódeo.

Outra modalidade da invenção refere-se a um vetor de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado em um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo, sendo que expressão do polinucleotídeo concede a uma planta transgênica resistência a nematódeo, e sendo que o polinucleotídeo é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polinucleotídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:l; (b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo a 5 seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (c) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:5; (d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (e) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de 10 seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l; (f) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5; (g) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de seqüência 15 com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (h) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (i) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e 20 hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l ou com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5; e (j) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo de SEQ ID NO:2.

Outra modalidade da invenção refere-se a um método para 25 aumentar a resistência a nematódeo em uma planta, sendo que o método compreende as etapas de: introduzir em uma planta um vetor de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado em um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo, e selecionar plantas transgênicas para a resistência a nematódeo aumentada. DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS Figura 1 é uma tabela mostrando as SEQ ID NOs dos genes e promotores aqui referidos.

Figura 2 mostra as seqüências de DNA de quitinase de H. glycines (SEQ ID NO:l) e de proteína quitinase de H. glycines (SEQ ID N0:2).

Figura 3 mostra a seqüência de promotor At5gl2170 de Arabidopsis (SEQ ID NO:3).

Figura 4 mostra a seqüência de promotor Atlg35910 de trealose-6-fosfato-fosfatase TPP de Arabidopsis (SEQ ID N0:4).

Figura 5 mostra as seqüências parciais de DNA de quitinase de H. schactii (SEQ ID NO:5) e de proteína quitinase de H. schactii (SEQ ID NO:6).

Figura 6 mostra um alinhamento de aminoácidos da quitinase de comprimento total de H. glycines (SEQ ID NO:2) com a quitinase parcial de H. schactii (SEQ ID NO:6), e um sumário das homologias de nucleotídeos em forma tabular.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

A presente invenção pode ser entendida mais prontamente com referência à seguinte descrição detalhada das modalidades da invenção e dos exemplos aqui incluídos. E para ser entendido que a terminologia aqui usada é apenas para o propósito de descrever modalidades específicas e não é intencionada para ser limitante. A não ser que seja indicado de outro modo, os temos aqui usados são para serem entendidos em seu uso convencional por aquelas pessoas ordinariamente experientes na técnica relevante. E preciso ser notado que como aqui usadas e nas reivindicações anexadas, as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem as referências no plural a não ser que o contexto dite claramente o contrário. Como aqui utilizada, a palavra “ou” significa qualquer um de um membro de uma lista particular e também inclui qualquer combinação de membros daquela lista.

Em todo este pedido, é feita referência a várias publicações. As revelações de todas estas publicações e aquelas referências citadas dentro daquelas publicações em suas totalidades são por meio desta incorporadas como referências neste pedido com o propósito de mais completamente descrever o estado da técnica ao qual esta invenção pertence.

O termo “cerca de” é aqui usado para significar aproximadamente, em tomo de, ao redor de, ou nas regiões de. Quando o termo “cerca de” é usado conjuntamente com uma faixa numérica, ele 10 modifica aquela faixa pela extensão dos limites acima e abaixo dos valores numéricos mostrados. Em geral, o termo “cerca de” é aqui usado para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor indicado por uma variância de 10 por cento, para mais ou para menos (mais alto ou mais baixo).

Como aqui usada, a palavra “ácido nucleico”, “nucleotídeo”, 15 ou “polinucleotídeo” é intencionada para incluir moléculas de DNA (e.g., cDNA ou DNA genômico), moléculas de RNA (e.g., mRNA), moléculas de DNA ou de RNA de ocorrência natural, mutadas, sintéticas, e análogos de DNA ou RNA gerados usando análogos de nucleotídeo. Pode ser de fita dupla ou de fita única. Tais ácidos nucleicos ou polinucleotídeos incluem, mas não 20 são limitados a, seqüências codificadoras de genes estruturais, seqüências de anti-senso, e seqüências regulatórias não-codificadoras que não codificam mRNAs ou produtos de proteína. Um polinucleotídeo pode codificar uma característica fenotípica ou agronomicamente valiosa.

Como aqui usado, um polinucleotídeo “isolado” está substancialmente livre de outros materiais celulares ou do meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos quando quimicamente sintetizado.

O termo “gene” é usado amplamente para se referir a qualquer segmento de ácido nucleico associado com uma função biológica. Assim, genes incluem íntrons e éxons como em seqüência genética, ou apenas as seqüências codificadoras como em cDNAs e/ou as seqüências regulatórias exigidas para sua expressão. Por exemplo, gene refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa mRNA ou RNA funcional, ou codifica uma proteína específica, e que inclui seqüências regulatórias.

Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados aqui intercambiavelmente para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácido consecutivos.

O termo “operacionalmente ligado” ou “funcionalmente 10 ligado” como aqui usado refere-se à associação de seqüências de ácido nucleico em um fragmento único de ácido nucleico de modo que a função de uma é afetada pela outra. Por exemplo, um DNA regulatório é dito em estar “operacionalmente ligado em” um DNA que expressa um RNA ou codifica um polipeptídeo se os dois DNAs estão situados de tal modo que o DNA 15 regulatório afeta a expressão do DNA codificador.

O termo “expressão específica” como aqui usado refere-se à expressão de produtos de gene que é limitada a um ou a uns poucos tecidos de planta (limitação espacial) e/ou a um ou uns poucos estágios desenvolventes de planta (limitação temporal) e/ou a um ou uns poucos estágios

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desenvolventes (limitação temporal). E sabido que especificidade verdadeira é rara: promotores parecem ser preferivelmente acionados em alguns tecidos, enquanto que em outros tecidos pode haver nenhuma ou apenas pouca atividade. Este fenômeno é conhecido como expressão subnormal. Contudo, expressão específica como aqui definida inclui expressão em um ou uns 25 poucos tecidos de planta ou sítios específicos em uma planta.

O termo “promotor” como aqui usado refere-se a uma seqüência de DNA que, quando ligada em uma seqüência de nucleotídeos de interesse, é capaz de controlar a transcrição da seqüência de nucleotídeos de interesse em mRNA. Um promotor está tipicamente, embora não necessariamente, localizado 5' (e.g., a montante) de um nucleotídeo de interesse (e.g., próximo ao sítio de iniciação transcricional de um gene estrutural) cuja transcrição em mRNA ele controla, e fornece um sítio para ligação específica por RNA polimerase e outros fatores de transcrição para iniciação de transcrição.

O termo “elemento regulatório de transcrição” como aqui usado refere-se a um polinucleotídeo que é capaz de regular a transcrição de um polinucleotídeo operacionalmente ligado. Ele inclui, mas não é limitado a, promotores, intensificadores, íntrons, 5' UTRs, e 3' UTRs.

Como aqui usado, o termo “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico no qual tem estado ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Nó presente relatório descritivo, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados intercambiavelmente porque o plasmídeo é a forma mais comumente utilizada de vetor. Um vetor pode ser um vetor binário ou um T-DNA que compreende a borda esquerda e a borda direita e pode incluir um gene de interesse entre ambas as bordas. O termo “vetor de expressão” como aqui usado significa um vetor capaz de dirigir a expressão de um nucleotídeo particular em uma célula hospedeira apropriada. Um vetor de expressão compreende um elemento de ácido nucleico regulatório ligado em um ácido nucleico de interesse, que está - opcionalmente - operacionalmente ligado em um sinal de terminação e/ou outro elemento regulatório.

O termo “homólogos” como aqui usado refere-se a um gene relacionado a um segundo gene pela descendência de uma seqüência de DNA ancestral comum. O termo “homólogos” pode se aplicar ao parentesco entre genes separados pelo evento de especiação (e.g., ortólogos) ou ao parentesco entre genes separados pelo evento de duplicação genética (e.g., parálogos).

Como aqui usado, o termo “ortólogos” refere-se aos genes de espécies diferentes, mas que têm sido provenientes de um gene ancestral comum por especiação. Ortólogos retêm a mesma função no curso da evolução. Ortólogos codificam proteínas tendo funções iguais ou similares. Como aqui usado, o termo “parólogos” refere-se aos genes que estão 5 relacionados por duplicação dentro de um genoma. Parólogos costumeiramente têm funções diferentes ou funções novas, mas estas funções podem estar relacionadas.

O termo “identidade de seqüência” ou “identidade” no contexto de duas seqüências de ácido nucleico ou polipeptídeo faz referência aos resíduos nas duas seqüências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada, por exemplo, quer a seqüência inteira como em um alinhamento global quer a região de similaridade em um alinhamento local. Quando percentagem de identidade de seqüência é usada em referência às proteínas é reconhecido que as posições de resíduos que não são idênticos freqüentemente diferem por substituições de aminoácido conservativas, onde resíduos de aminoácido substituem outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas similares (e.g., carga ou hidrofobicidade) e portanto não muda as propriedades funcionais da molécula. Quando seqüências diferem em substituições conservativas, a identidade de seqüência percentual pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Seqüências que diferem em tais substituições conservativas são ditas em ter “similaridade de seqüência” ou “similaridade”. Meios para fazer este ajuste são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na técnica. Tipicamente isto envolve classificar uma substituição conservativa como uma má combinação parcial em vez de uma má combinação total, aumentando deste modo a percentagem de similaridade de seqüência.

Como aqui usado, “percentagem de identidade de seqüência” ou “identidade de seqüência percentual” significa o valor determinado por comparação de duas seqüências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação, quer global quer localmente, sendo que a porção da seqüência na janela de comparação pode compreender lacunas para alinhamento ótimo das duas seqüências. Em princípio, a percentagem é calculada pela determinação 5 do número de posições nas quais ocorre resíduo de aminoácido ou base de ácido nucleico idêntico em ambas as seqüências para dar o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de seqüência. 10 “Percentagem de similaridade de seqüência” para seqüências de proteína pode ser calculada usando o mesmo princípio, sendo que a substituição conservativa é calculada como uma má combinação parcial em vez de uma má combinação completa. Assim, por exemplo, onde um aminoácido idêntico recebe um escore de 1 e uma substituição não-conservativa recebe um escore 15 de zero, uma substituição conservativa recebe um escore entre zero e I. O escore de substituições conservativas pode ser obtido das matrizes de aminoácido conhecidas na técnica, por exemplo, matrizes Blosum ou PAM.

Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na técnica. A determinação de identidade percentual ou 20 similaridade percentual (para proteínas) entre duas seqüências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Exemplos preferidos, nãolimitantes de tais algoritmos matemáticos são, o algoritmo de Myers e Miller (“Optimal alignments in linear space”, Bioinformatics, 4(1):11-17, 1988), o algoritmo global de Needleman-Wunsch (J Mol Biol. 48(3):443-53, 1970), o 25 algoritmo local de Smith-Waterman (J. Mol. Biol., 147:195-197, 1981), o método de pesquisa-de-similaridade de Pearson e Lipman (PNAS, 85(8): 2444-2448, 1988), o algoritmo de Karlin e Altschul (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215(3):403-410, 1990; PNAS, 90:5873-5877,1993). Implementações computacionais destes algoritmos matemáticos podem ser usadas para comparação de seqüências para determinar identidade de seqüência ou para identificar homólogos.

“Hibridização” pode ser usada para indicar o nível de similaridade ou identidade entre duas moléculas de ácido nucleico, e também 5 para detectar a presença de molécula de ácido nucleico igual ou similar em análises de Southern ou Northern. Um exemplo preferido, não-limitante, de condições estringentes é hibridização em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguida por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, SDS 0,1% a 50-65°C. Como aqui usado, o termo “hibridiza sob condições 10 estringentes” é intencionado para descrever condições para hibridização e lavagem sob as quais seqüências de nucleotídeos pelo menos cerca de 60% similares ou idênticas entre si tipicamente permanecem hibridizadas uma na outra.

O termo “região conservada” ou “domínio conservado” como 15 aqui usado refere-se a uma região em seqüências heterólogas de polinucleotídeo ou de polipeptídeo onde há um grau relativamente alto de identidade de seqüência entre as seqüências distintas. A “região conservada” pode ser identificada, por exemplo, a partir de alinhamento de seqüências múltiplas usando qualquer um dos algoritmos conhecidos por aquelas pessoas 20 experientes em biotecnologia.

O termo “célula” ou “célula de planta” como aqui usado refere-se a uma célula individual, e também inclui uma população de células. A população pode ser uma população pura compreendendo um tipo de célula. Igualmente, a população pode compreender mais do que um tipo de célula. 25 Uma célula de planta dentro do significado da invenção pode estar isolada (e.g, em cultura em suspensão), ou compreendida em um tecido de planta, órgão de planta ou planta em qualquer estágio desenvolvente.

O termo “tecido” com respeito a uma planta (ou “tecido de planta”) significa arranjo de múltiplas células de planta, incluindo tecidos de plantas diferenciados ou não diferenciados. Tecidos de planta podem constituir parte de um órgão de planta (e.g., a epiderme de uma folha de planta) mas também pode constituir tecidos de tumor (e.g., tecido de calo) e vários tipos de células em cultura (e.g., células individuais, protoplastos, 5 embriões, calos, corpos semelhantes a protocormo, etc.). Tecidos de planta podem estar em planta, em cultura de órgão, cultura de tecido, ou cultura de célula.

O termo “órgão” com respeito a uma planta (ou “órgão de planta”) significa partes de uma planta e pode incluir, mas não é limitado a, por exemplo raízes, frutas, brotos, caules, folhas, hipocótilos, cotilédones, anteras, sépalas, pétalas, pólen, sementes, etc.

O termo “planta” como aqui usado pode, dependendo do contexto, ser entendido para se referir a plantas inteiras, células de planta, órgãos de planta, sementes de planta, e progênie dos mesmos. A palavra “planta” também se refere a qualquer planta, particularmente, às plantas de semente, e pode incluir, mas não é limitada a, plantas de colheita. Partes de planta incluem, mas não são limitadas a, caules, raízes, brotos, frutas, óvulos, estames, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, hipotócilos, cotilédones, anteras, sépalas, pétalas, pólen, sementes e semelhantes. A classe de plantas que pode ser usada no método da invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas inferiores e superiores sensíveis às técnicas de transformação, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias, cavalinhas, psilófitos, briófitos, e algas multicelulares.

O termo “transgênica” como aqui usado é intencionado para se referir às células e/ou plantas que contêm um transgene, ou cujo genoma tem sido alterado pela introdução de um transgene, ou que têm incorporado genes ou polinucleotídeos exógenos. Células, tecidos, órgãos e plantas transgênicas podem ser produzidas por vários métodos incluindo a introdução de um “transgene” compreendendo polinucleotídeo (costumeiramente DNA) em uma célula alvo ou integração do transgene em um cromossomo de uma célula alvo por meio de intervenção humana, tal como por métodos aqui descritos.

O termo “desenvolvimento verdadeiro” como aqui usado refere-se a uma variedade de planta para uma característica particular se é geneticamente homozigótica para aquela característica de modo que, quando a variedade de desenvolvimento verdadeiro é auto-polinizada, não é observada 10 uma quantidade significativa de segregação independente da característica dentre a progênie.

O termo “de tipo selvagem” como aqui usado refere-se a uma célula de planta, semente, componente de planta, tecido de planta, órgão de planta, ou planta inteira que não tem sido geneticamente modificada ou tratada em um sentido experimental.

O termo “planta de controle” como aqui usado refere-se a um célula de planta, um explante, semente, componente de planta, tecido de planta, órgão de planta, ou planta inteira usada(o) para comparar contra planta transgênica ou geneticamente modificada para o propósito de identificar um 20 fenótipo intensificado ou uma característica desejável na planta transgênica ou geneticamente modificada. Uma “planta de controle” podem em alguns casos ser uma linhagem de planta transgênica que compreende um vetor vazio ou gene marcador, mas não contém o polinucleotídeo recombinante polinucleotídeo de interesse que está presente na planta transgênica ou 25 geneticamente modificada sendo avaliada. Uma planta de controle pode ser uma planta de mesma linhagem ou variedade que a da planta transgênica ou geneticamente modificada sendo testada, ou pode ser outra linhagem ou variedade, tal como uma planta conhecida em ter um fenótipo específico, uma característica específica, ou um genótipo conhecido. Uma planta de controle adequada incluiria uma planta geneticamente inalterada ou não-transgênica da linhagem parental usada para gerar aqui uma planta transgênica.

O termo “resistência à infecção de nematódeo” ou “uma planta tendo resistência a nematódeo” como aqui usado refere-se à capacidade de uma planta para evitar infecção por nematódeos, para matar nematódeos ou para impedir, reduzir ou parar o desenvolvimento, o crescimento ou a multiplicação de nematódeos. Isto pode ser realizado por um processo ativo, e.g. pela produção de uma substância prejudicial ao nematódeo, ou por um processo passivo, como tendo um valor nutricional reduzido para o nematódeo ou estruturas não-desenvolventes induzidas pelo sítio de alimentação de nematódeo como células sinciciais ou células gigantes. O nível de resistência a nematódeo de uma planta pode ser determinado em várias maneiras, e.g. por contagem de nematódeos sendo capazes de estabelecer parasitismo sobre aquela planta, ou medição de tempos de desenvolvimento de nematódeos, proporção de nematódeos machos e fêmeas ou o número de cistos ou ovos de nematódeo produzidos. Uma planta com resistência aumentada à infecção por nematódeo é uma planta, que é mais resistente à infecção por nematódeo em comparação com outra planta tendo um genótipo similar ou preferivelmente idêntico enquanto que é faltante de gene ou genes que concedem resistência aumentada a nematódeos, e.g., uma planta de controle ou de tipo selvagem.

Os termos “sítio de alimentação”, “sincícios” ou “sítio de sincícios” são usados intercambiavelmente e se referem ao sítio de alimentação formado em raízes de planta após infestação de nematódeo. O 25 sítio é utilizado como uma fonte de nutrientes para os nematódeos. Sincícios são os sítios de alimentação para nematódeos de cisto e células gigantes sãos os sítios de alimentação de nematódeos das galhas.

“Quitinase” como aqui usada refere-se a qualquer proteína degradadora de quitina derivada de um nematódeo parasita de planta que concede ou aumenta resistência ao dito nematódeo quando transformada em plantas suscetíveis. A quitinase de H. glycines mostrada em SEQ ID NO:2 corresponde ao acesso no Genbank # AF468679. O fragmento de quitinase de H. schactii mostrado em SEQ ID NO:6 corresponde ao acesso no Genbank # 5 CD750591. O alinhamento de Figura 6 mostra que a quitinase de H. glycines e o fragmento de quitinase de H. schactii compartilham similaridade e identidade de seqüências significativas através de aminoácidos 1 a 189, indicando que o gene de quitinase está conservado dentre as espécies de nematódeo. Quitinases de nematódeo adicionais adequadas para uso na 10 presente invenção podem ser identificadas baseando-se na identidade de seqüência global ou local com a quitinase de H. glycines mostrada em SEQ ID NO:2 e/ou o fragmento de quitinase de H. schactii mostrado em SEQ ID NO:6, usando técnicas conhecidas por aquelas pessoas experientes em biotecnologia.

Em uma primeira modalidade, a invenção fornece uma planta

transgênica transformada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo isolado que codifica uma quitinase de nematódeo, sendo que a expressão do polinucleotídeo concede à planta resistência a nematódeo aumentada. Preferivelmente, o polinucleotídeo de quitinase de nematódeo é 20 selecionado do grupo consistindo de: (a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:l; (b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (c) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:5; (d) um polinucleotídeo codificador de um 25 polipeptídeo compreendendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (e) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l; (f) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5; (g) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (h) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase 5 de nematódeo e compreende uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (i) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l ou com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5; e (j) um 10 polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo de SEQ ID NO:2.

De acordo com a invenção, o polinucleotídeo de quitinase de nematódeo codifica uma quitinase enzimaticamente ativa e é pelo menos 15 cerca de 50-60%, ou pelo menos cerca de 60-70%, ou pelo menos cerca de 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, ou pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico ou similar ao polinucleotídeo de SEQ ID NO:l ou a um gene de quitinase de nematódeo compreendendo o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5. Ademais de acordo com a invenção, o polinucleotídeo de 20 quitinase de nematódeo codifica um polipeptídeo de quitinase de nematódeo funcional que é pelo menos cerca de 50-60%, ou pelo menos cerca de 60- 70%, ou pelo menos cerca de 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, ou pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico ou similar ao polipeptídeo de SEQ ID NO:2 ou a uma quitinase de nematódeo 25 compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO:6. Variantes alélicas do polinucleotídeo de quitinase de nematódeos de SEQ ID NO:l e de genes de quitinase de nematódeo compreendendo o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5, do polipeptídeo de SEQ ID NO:2, ou quitinases de nematódeo compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO:6 também podem ser utilizadas nas plantas transgênicas e nos métodos da invenção. Como aqui usado, o termo “variante alélica” refere-se a um polinucleotídeo contendo polimorfismos que ocasionam mudanças nas seqüências de aminoácidos de uma proteína codificada pelo nucleotídeo e que existem dentro de uma 5 população natural (e.g., uma espécie ou variedade de planta). Tais variações alélicas naturais podem tipicamente resultar em 1-5% de variância em um polinucleotídeo codificador de uma proteína, ou 1-5% de variância na proteína codificada.

Alternativamente, polinucleotídeos de quitinase de nematódeo 10 isolados adequados para uso na invenção podem hibridizar sob condições estringentes com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l, o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5, qualquer polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO:2, ou qualquer polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO:6, desde que o 15 polinucleotídeo codifique uma quitinase funcional.

A presente invenção também fornece semente transgênica compreendendo os polinucleotídeos de quitinase de nematódeo descritos acima, partes da planta transgênica, e plantas de progênie da planta transgênica, incluindo híbridos e endógamos. A invenção também fornece um 20 método de desenvolvimento de planta, e.g., para preparar uma planta transgênica fértil cruzada. O método compreende cruzar uma planta transgênica fértil compreendendo um vetor de expressão particular da invenção com ela mesma ou com uma segunda planta, e.g., uma faltante do vetor de expressão particular, para preparar a semente de uma planta 25 transgênica fértil cruzada compreendendo o vetor de expressão particular. A semente é então plantada para obter uma planta transgênica fértil cruzada. A planta transgênica fértil cruzada pode ter o vetor de expressão particular herdado através de uma planta parental fêmea ou através de uma planta parental macho. A segunda planta pode ser uma planta endogâmica. A planta transgênica fértil cruzada pode ser um híbrido. Também estão incluídas dentro do escopo da presente invenção as sementes de qualquer uma destas plantas transgênicas férteis cruzadas.

Outra modalidade da invenção refere-se a um vetor de 5 expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado em um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo, sendo que expressão do polinucleotídeo concede a uma planta transgênica resistência a nematódeo, e sendo que o polinucleotídeo é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polinucleotídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID 10 NO:l; (b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (c) um polinucleotídeo compreendendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:5; (d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo compreendendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (e) um polinucleotídeo que codifica uma 15 quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l; (f) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5; (g) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de 20 nematódeo e tem pelo menos 50%) de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (h) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (i) 25 um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l ou com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5; e (j) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo de SEQID NO:2. De acordo com a invenção, o promotor pode ser capaz de regular a expressão constitutiva de um polinucleotídeo operacionalmente ligado. Um “promotor constitutivo” refere-se a um promotor que é capaz de expressar a matriz de leitura aberta ou o elemento regulatório que ele controla em todos ou quase todos os tecidos de planta durante todos ou quase todos os estágios desenvolventes da planta. Promotores constitutivos incluem, mas não são limitado a, o promotor 35S CaMV de vírus de planta (Franck et al., 1980, Cell 21:285-294), o promotor Nos, o promotor de ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1992 e 18:581-8, (1991)), o promotor MAS (Velten et al., EMBO J. 3:2723-30, (1984)), o promotor de histona H3 de milho (Lepetit et al., Mol Gen. Genet 231:276-85, 1992), o promotor ALS (W096/30530), promotor 19S CaMV (US 5.352.605), o super-promotor (US 5.955.646), o promotor do vírus do mosaico de escrofulária (US 6.051.753), o promotor de actina de arroz (US 5.641.876), e o promotor de subunidade pequena de Rubisco (US 4.962.028).

Alternativamente, o promotor é um promotor regulado. Um “promotor regulado” refere-se a um promotor que dirige a expressão de gene não constitutivamente, mas em uma maneira temporal e/ou espacialmente, e inclui promotores tanto específicos para tecido quanto indutíveis. Promotores 20 diferentes podem dirigir a expressão de um gene ou elemento regulatório em tipos de célula ou tecidos diferentes, ou em estágios de desenvolvimento diferentes, ou em resposta às condições ambientais diferentes.

O “promotor específico para tecido” refere-se a um promotor regulado que não é expressado em todas as células de planta mas apenas em 25 um ou mais tipos de célula em órgãos específicos (tais como folhas ou sementes), tecidos específicos (tais como embriões ou cotilédone), ou tipos de célula específicas (tais como parênquima foliar ou células de armazenagem de semente, ou sítios de alimentação de nematódeo). Estes também incluem promotores que são temporalmente regulados, tais como em embriogênese inicial ou tardia, durante amadurecimento de fruta em sementes ou fruta desenvolventes, em folha totalmente diferenciada, ou no início de seqüência. Promotores adequados incluem o promotor de gene de napina de colza (US 5.608.152), o promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991 Mol Gen 5 Genet. 225(3):459-67), o promotor de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), o promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5.504.200), o promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980) ou o promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992 Plant Journal, 2(2):233-9) bem como os promotores concedentes de expressão específica em semente em plantas 10 monocotiledôneas como milho, cevada, trigo, centeio, arroz, etc. Promotores adequados para anotar são o promotor de gene Ipt2 ou Iptl de cevada (WO 95/15389 e WO 95/23230) ou aqueles descritos em WO 99/16890 (promotores do gene de hordeína de cevada, gene de glutelina de arroz, gene de orizina de arroz, gene de prolamina de arroz, gene de gliadina de trigo, 15 gene de glutelina de trigo, gene de zeína de milho, gene de glutelina de aveia, gene de casirina de sorgo e gene de secalina de centeio). Promotores adequados para expressão preferencial em tecidos de raiz de planta incluem, por exemplo, o promotor derivado de gene de nicotianamina sintase de milho (US 20030131377) e promotor RCC3 de arroz (US 11/075.113). Promotores 20 adequados para expressão preferencial em tecidos verdes de planta incluem os promotores dos genes tais como gene FDA de aldolase de milho (US 20040216189), aldolase e piruvato orto-fosfato diquinase (PPDK) (Taniguchi et. al., Plant Cell Physiol. 41(l):42-48, 2000).

“Promotores indutíveis” referem-se àqueles promotores 25 regulados que podem ser ligados em um ou mais tipos de célula por um estímulo externo, por exemplo, um agente químico, luz, hormônio, estresse, ou um patógeno tal como nematódeos. Promotores quimicamente indutíveis são especialmente adequados se é desejada ocorrência de expressão em uma maneira específica de tempo. Exemplos de tais promotores são um promotor indutível por ácido salicílico (WO 95/19443), um promotor indutível por tetraciclina (Gatz et al., 1992 Plant J. 2:397-404), o promotor indutível por luz de uma subunidade pequena de Ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase (ssRUBISCO), e um promotor indutível por etanol (WO 93/21334). Também, promotores adequados responsivos às condições de estresse biótico ou abiótico são aqueles tais como o promotor de gene - PRPl indutível por patógeno (Ward et al., 1993 Plant. Mol. Biol. 22:361-366), o promotor hsp-80 indutível por calor do tomateiro (US 5187267), promotor de alfa-amilase indutível por frio da batateira (WO 96/12814), o promotor indutível por estiagem do milho (Busk et. al., Plant J. 11:1285-1295, 1997), o promotor indutível por frio, estiagem, e concentração salina alta da batateira (Kirch, Plant Mol. Biol. 33:897-909, 1997) ou o promotor RD29A de Arabidopsis (Yamaguchi-Shinozalei et. al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993), muitos promotores indutíveis por frio tais como o promotor corl5a de Arabidopsis (Número de Acesso no Genbank de UO1377), bltlOl e blt4.8 de cevada (Números de Acesso no Genbank de AJ310994 e U63993), wcsl20 de trigo (Número de Acesso no Genbank de AF031235), mlipl5 de milho (Número de Acesso no Genbank de D26563), bnll5 de Brassica (Número de Acesso no Genbank de UO13 77), e promotor pinll indutível por ferimento (Patente Européia de No. 375091).

Em uma modalidade preferida, o gene de quitinase de nematódeo está operacionalmente ligado em um promotor específico de raiz, específico de sítio de alimentação, e.g. em promotor específico de sincícios ou de célula gigante ou promotor indutível por patógeno. Mais preferivelmente, o

gene de quitinase de nematódeo está operacionalmente ligado em um promotor indutível por nematódeo.

A invenção também é representada por modalidade em um método para aumentar a resistência a nematódeo em uma planta, sendo que o método compreende as etapas de introduzir o vetor de expressão descrito acima na planta e selecionar a população resultante de plantas transformadas para plantas transgênicas que demonstram resistência aumentada a nematódeo. A etapa de seleção de resistência a nematódeo pode ser realizada usando um ensaio in vitro tal como o ensaio de raiz peluda, o ensaio descrito 5 em Patente U.S. No. 5.770.786, e semelhante. Um ensaio preferido para selecionar plantas transgênicas tendo resistência a nematódeo é mostrado em Exemplo 3 abaixo.

Uma variedade de métodos para introdução de polinucleotídeos no genoma de plantas e para a regeneração de plantas a partir 10 de tecidos de planta ou de células de planta é conhecida em, por exemplo, Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), chapter 6/7, pp. 71-119 (1993); White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; Transgenic Plants, vol. I, Engineering and Utilization, Ed.: Kung e Wu R, Academic Press, 15-38; Jenes B et al. (1993) 15 Techniques for Gene Transfer; Transgenic Plants, vol. I, Engineering and Utilization, Ed.: Kung e R. Wu, Academic Press, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225; Halford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56(l):62-73.

Métodos de transformação podem incluir métodos diretos e 20 indiretos de transformação. Métodos diretos adequados incluem absorção de DNA induzida por poli(etileno-glicol), transformação mediada por lipossomo (US 4.536.475), métodos biolísticos usando pistola de gene (“bombardeio de partículas”, Fromm ME et al., (1990) Bio/Technology 8(9):833-9; GordonKamm et al. (1990) Plant Cell 2:603), eletroporação, incubação de embriões 25 secos em solução compreendendo DNA, e micro injeção. No caso destes métodos diretos de transformação, o plasmídeo usado não necessita atender às exigências particulares. Plasmídeos simples, tais como aqueles da série pUC, pBR322, da série M13mp, pACYC184 e semelhantes podem ser usados. Se plantas intactas são para serem regeneradas a partir das células transformadas, um gene marcador selecionável adicional é preferivelmente localizado no plasmídeo. As técnicas de transformação diretas são igualmente adequadas para plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

Transformação também pode ser realizada por infecção bacteriana por meio de Agrobacterium (por exemplo EP 0.116.718), infecção viral por intermédio de vetores virais (EP 0.067.553; US 4.407.956; WO 95/34668; WO 93/03161) ou por meio de pólen (EP 0.270.356; WO 85/01856; US 4.684.611). Técnicas de transformação baseadas em Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledôneas) são bem conhecidas na técnica. A cepa de Agrobacterium (e.g., Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes) compreende um plasmídeo (plasmídeo Ti ou Ri) e um elemento T-DNA que é transferido para a planta após infecção com Agrobacterium. O T-DNA (DNA transferido) é integrado no genoma da célula de planta. O T-DNA pode estar localizado no plasmídeoRi ou -Ti ou pode estar separadamente compreendido em um denominado vetor binário. Métodos para a transformação mediada por Agrobacterium são descritos, por exemplo, em Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229f. A transformação mediada por Agrobacterium está melhor adaptada para plantas dicotiledôneas mas também tem sido adaptada para plantas monocotiledôneas. A transformação de plantas por Agrobacteria é descrita em, por exemplo, White FF, Yectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec. Biol 42:205- 225.

Transformação pode resultar em expressão e transformação estáveis ou transientes. Embora uma seqüência de nucleotídeos possa ser inserido em qualquer planta ou célula de planta caindo dentro destas classes amplas de acordo com a presente invenção, é particularmente útil em células de planta de colheita.

Os nucleotídeos da presente invenção podem ser diretamente transformados no genoma da plastídeo. Expressão em plastídeo, no qual genes 5 são inseridos por recombinação homóloga em várias milhares de cópias de genoma de plastídeo circular presentes em cada célula de planta, se beneficia do número enorme de cópias sobre os genes expressados no núcleo para permitir níveis altos de expressão. Em uma modalidade, os nucleotídeos são inseridos em um vetor selecionador de plastídeo e transformados no genoma 10 de plastídeo de uma planta hospedeira desejada. Plantas homoplásmicas para genomas de plastídeo contendo as seqüências de nucleotídeos são obtidas, e são preferencialmente capazes de expressão alta dos nucleotídeos

Tecnologia de transformação de plastídeo é por exemplo extensivamente descrita em Patente U.S. Nos. 5.451.513, 5.545.817, 15 5.545.818, e 5.877.462 em WO 95/16783 e WO 97/32977, e em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 7301-7305, todas aqui incorporadas em suas totalidades como referências. A técnica básica para transformação de plastídeo envolve introdução de regiões de DNA plastídeo clonado flanqueando um marcador selecionável junto com a seqüência de nucleotídeos 20 em um tecido alvo adequado, e.g., usando transformação biolística ou de protoplasto (e.g., transformação mediada por cloreto de cálcio ou PEG). As regiões flanqueadoras de 1 a 1,5 kb, chamadas seqüências selecionadoras, facilitam recombinação homóloga com o genoma de plastídeo e assim permitem a substituição ou modificação de regiões específicas do plastoma. 25 Inicialmente, mutações pontuais nos genes de cloroplasto 16S rRNA e rpsl2 concedentes de resistência à espectinomicina e/ou estreptomicina são utilizadas como marcadores selecionáveis para transformação (Svab et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 8526-8530; Staub et al., (1992) Plant Cell 4, 39-45). A presença de sítios de clonagem entre estes marcadores permite criação de um vetor selecionador de plastídeo para introdução de genes estranhos (Staub et al., (1993) EMBO J. 12, 601-606). Aumentos substanciais em freqüência de transformação são obtidos por substituição de genes de resistência a antibiótico de proteína-r ou rRNA recessivos por um 5 marcador selecionável dominante, o gene aadA bacteriano codificador da enzima espectinomicina-destoxificadora amino-glicosídeo-3'

adeniltransferase (Svab et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 913- 917). Outros marcadores adequados úteis para transformação de plastídeo são conhecidos na técnica e estão incluídos dentro do escopo da invenção.

A planta ou planta transgênica pode ser qualquer planta, tal

como, mas não limitada a árvores, flores cortadas, plantas ornamentais, verduras/hortaliças ou plantas de colheita. A planta pode ser de um gênero selecionado do grupo consistindo de Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, Solanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Populus, 15 Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triticale, Secale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthus, Nicotiana, Cucurbita, Rosa, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, trifolium, Trigonella, Vigna, Citras, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, 20 Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Browaalia, Phaseolus, Avena5 e Allium, ou a planta pode ser selecionada do grupo consistindo de cereais incluindo trigo, cevada, 25 sorgo, centeio, triticale, milho, arroz, cana-de-açúcar, e árvores incluindo macieira, pereira, marmeleiro, ameixeira, cerejeira, pessegueiro, nectarina, albricoqueiro, mamoeiro papaia, mangueira, álamo, pinheiro, sequóia, cedro, e carvalho. O termo “planta” como aqui usado pode ser plantas de colheita dicotiledôneas, tais como ervilha, alfafa, feijão-soja, cenoura, aipo, tomateiro, batateira, algodoeiro, tabaco, pimenteira, colza, beterraba, repolho, couveflor, brócolis, alface e Arabidopsis thaliana. Em uma modalidade a planta é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea.

Preferivelmente a planta é uma planta de colheita. Plantas de colheita são todas as plantas, usadas em agricultura. Conformemente em uma modalidade a planta é uma planta monocotiledônea, preferivelmente uma planta da família Poaceae, Musaceae, Liliaceae ou Bromeliaceae, preferivelmente da família Poaceae. Conformemente, em ainda outra modalidade a planta é uma planta Poaceae do gênero Zea, Triticum, Oryza, Hordeum, Secale, Avena, Saccharum, Sorgo, Pennisetum, Setaria, Panicum, Eleusine, Miscanthus, Brachypodium, Festuca ou Lolium. Quando a planta é do gênero Zea, a espécie preferida é Z. mays. Quando a planta é do gênero Triticum, a espécie preferida é T. aestivum, T. speltae ou T. durum. Quando a planta é do gênero Oryza, a espécie preferida é O. sativa. Quando a planta é do gênero Hordeum, a espécie preferida é H. vulgare. Quando a planta é do gênero Secale, a espécie preferida S. cereale. Quando a planta é do gênero Avena, a espécie preferida é A. sativa. Quando a planta é do gênero Saccarum, a espécie preferida é S. officinarum. Quando a planta é do gênero Sorgo, a espécie preferida é S. vulgare, S. bicolor ou S. sudanense. Quando a planta é do gênero Pennisetum, a espécie preferida é P. glaucum. Quando a planta é do gênero Setaria, a espécie preferida é S. italica. Quando a planta é do gênero Panicum, a espécie preferida é P. miliaceum ou P. virgatum. Quando a planta é do gênero Eleusine, a espécie preferida é E. coracana. Quando a planta é do gênero Miscanthus, a espécie preferida é M. sinensis. Quando a planta é uma planta do gênero Festuca, a espécie preferida é F. arundinaria, F. rubra ou F. pratensis. Quando a planta é do gênero Lolium, a espécie preferida é L. perenne ou L. multiflorum. Alternativamente, a planta pode ser Triticosecale.

Alternativamente, em uma modalidade a planta é uma planta dicotiledônea, preferivelmente uma planta da família Fabaceae5 Solanaceae5 Brassicaceae, Chenopodiaceae, Asteraceae5 Malvaceae5 Linacea5 Euphorbiaeeae5 Convolvulaceae Rosaceae, Cucurbitaceae5 Theaeeae5 Rubiaceae5 Stereuliaeeae ou Citrus. Em uma modalidade a planta é uma 5 planta da família Fabaeeae5 Solanaeeae ou Brassicaceae. Conformemente5 em uma modalidade a planta é da família Fabaceae5 preferivelmente do gênero Glycine, Pisum5 Arachis5 Cicer5 Vicia5 Phaseolus5 Lupinus, Medicago ou Lens. Espécies preferidas da família Fabaceae são M. truncatula, M5 sativa, G. max5 P. sativum, A. hypogea, C. arietinum, V. faba, P. vulgaris, Lupinus 10 albus, Lupinus Iuteus5 Lupinus angustifolius ou Lens culinaris. Mais preferidas são as espécies G. max A. hypogea e M. sativa. Mais preferida é a espécie G. max. Quando a planta é da família Solanaceae5 o gênero preferido é Solanum5 Lycopersicon, Nicotiana ou Capsicum. Espécies preferidas da família Solanaceae são S. tuberosum, L. esculentum, N. tabaccum ou C. 15 chinense. Mais preferida é S. tuberosum. Conformemente, em uma modalidade a planta é da família Brassicaceae, preferivelmente do gênero Brassica ou Raphanus. Espécies preferidas da família Brassicaceae são as espécies B. napus, B. oleracea, B. juncea ou B. rapa. Mais preferida é a espécie B. napus. Quando a planta é da família Chenopodiaceae, o gênero 20 preferido é Beta e a espécie preferida é a B. vulgaris. Quando a planta é da família Asteraceae, o gênero preferido é Helianthus e a espécie preferida é H. annuus. Quando a planta é da família Malvaceae, o gênero preferido é Gossypium ou Abelmoschus. Quando o gênero é Gossypium, a espécie preferida é G. hirsutum ou G. barbadense e a espécie mais preferida é G. 25 hirsutum. Uma espécie preferida do gênero Abelmoschus é a espécie A. esculentus. Quando a planta é da família Linacea, o gênero preferido é Linum e a espécie preferida é L. usitatissimum. Quando a planta é da família Euphorbiaceae, o gênero preferido é Manihot, Jatropa ou Rhizinus e as espécies preferidas são M. esculenta, J. curcas ou R. comunis. Quando a planta é da família Convolvulaceae, o gênero preferido é Ipomea e a espécie preferida é I. batatas. Quando a planta é da família Rosaceae, o gênero preferido é Rosa, Malus, Pyrus, Prunus, Rubus, Ribes, Vaccinium ou Fragaria e a espécie preferida é o híbrido Fragaria x ananassa. Quando a planta é da família Cucurbitaceae, o gênero preferido é Cucumis, Citrullus ou Cucurbita e a espécie preferida é Cucumis sativus, Citrullus lanatus ou Cucurbita pepo. Quando a planta é da família Theaceae, o gênero preferido é Camellia e a espécie preferida é C. sinensis. Quando a planta é da família Rubiaceae, o gênero preferido é Coffea e a espécie preferida é C. arabica ou C. canephora. Quando a planta é da família Sterculiaceae, o gênero preferido é Theobroma e a espécie preferida é T. cacao. Quando a planta é do gênero Citrus, a espécie preferida é C. sinensis, C. limon, C. reticulata, C. maxima e híbridos de espécie Citrus, ou semelhantes. Em uma modalidade preferida da invenção, a planta é uma planta de feijão-soja, uma planta de batateira ou uma planta de milho.

As plantas transgênicas da invenção podem ser usadas em um método de controlar infestação de uma plantação por um nematódeo parasita de planta, que compreende a etapa de crescer dita plantação a partir das sementes compreendendo um vetor de expressão da invenção, sendo que o vetor de expressão está estavelmente integrado nos genomas das sementes.

A presente invenção pode ser usada para reduzir a destruição de plantação por nematódeos parasitas de planta ou para conceder a uma planta resistência a nematódeo. O nematódeo pode ser qualquer nematódeo parasita de planta, em particular nematódeos das famílias Longidoridae, 25 Trichodoridae, Aphelenchoidida, Anguinidae, Belonolaimidae, Criconematidae, Heterodidae, Hoplolaimidae, Meloidogynidae, Paratylenchidae, Pratylenchidae, Tylenchulidae, Tylenchidae, ou semelhantes. Preferivelmente, os nematódeos parasitas pertencem às famílias de nematódeo indutores de células gigantes ou sinciciais. Nematódeos indutores de células gigantes ou sinciciais são encontrados nas famílias Longidoridae, Trichodoridae, Heterodidae, Meloidogynidae, Pratylenchidae ou Tylenchulidae. Em particular nas famílias Heterodidae e Meloidogynidae.

Conformemente, os nematódeos parasitas selecionados pela presente invenção pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Naccobus5 Cactodera, Dolichodera5 Globodera5 Heterodera5 Punctodera5 Longidorus ou Meloidogyne. Em uma modalidade preferida os nematódeos parasitas pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Naccobus, Cactodera, Dolichodera5 Globodera5 Heterodera5 Punctodera ou Meloidogyne. Em uma modalidade mais preferida os nematódeos parasitas pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Globodera, Heterodera, ou Meloidogyne. Em uma modalidade ainda mais preferida os nematódeos parasitas pertencem a um ou ambos os gêneros selecionados do grupo de Globodera ou Heterodera. Em outra modalidade os nematódeos parasitas pertencem ao gênero Meloidogyne.

Quando os nematódeos parasitas são do gênero Globodera, as espécies são preferivelmente do grupo consistindo de G. achilleae, G. artemisiae, G. hypolysi, G. mexicana, G. millefolii, G. mali, G. pallida, G. rostochiensis, G. tabacum, e G. virginiae. Em outra modalidade preferida os 20 nematídeos parasitas Globodera incluem pelo menos uma das espécies G. pallida, G. tabacum, ou G. rostochiensis. Quando os nematódeos parasitas são do gênero Heterodera, a espécie pode ser preferivelmente do grupo consistindo de H. avenae, H. carotae, H. ciceri, H. cruciferae, H. delvii, H. elachista, H. filipjevi, H. gambiensis, H. glycines, H. goettingiana, H. graduni, 25 H. humuli, H. hordecalis, H. latipons, H. major, H. medicaginis, H. oryzicola,

H. pakistanensis, H. rosii, H. sacchari, H. schachtii, H. sorghi, H. trifolii, H. urticae, H. vigni e H. zeae. Em outra modalidade preferida os nematódeos parasitas Heterodera incluem pelo menos uma das espécies H. glycines, H. avenae, H. cajani, H. gottingiana, H. trifolii, H. zeae ou H. schachtii. Em uma modalidade mais preferida os nematódeos parasitas incluem pelo menos uma das espécies H. glycines ou H. schachtii. Em uma modalidade muito mais preferida o nematódeo parasita é a espécie H. glycines.

Quando os nematódeos parasitas são do gênero Meloidogyne, 5 o nematódeo parasita pode ser selecionado do grupo consistindo de M. acronea, M. arabica, M. arenaria, M. artiellia, M. brevicauda, M. camelliae, M. chitwoodi, M. cofeicola, M. esigua, M. graminicola, M. hapla, M. incógnita, M. indica, M. inomata, M. javanica, M. lini, M. mali, M. microcephala, M. microtyla, M. naasi, M. salasi e M. thamesi. Em uma 10 modalidade preferida os nematódeos parasitas incluem pelo menos uma das espécies M. javanica, M. incógnita, M. hapla, M. arenaria ou M. chitwoodi.

Embora as composições e os métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de certas modalidades, será evidente para aquelas pessoas experientes na técnica que variações podem ser aplicadas na 15 composição, nos métodos e nas etapas ou na seqüência de etapas do método aqui descritos sem se desviarem do conceito, do espírito e do escopo da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Clonagem de um gene codificador de quitinase de Hederodera glycines

O gene de quitinase usado para transformar feijão-soja foi gerado via síntese de nobo e clonado em vetores base contendo os promotores descritos abaixo. A seqüência de DNA para a quitinase de H. glycines foi obtida do Genbank número de acesso AF468679.

Exemplo 2: Construção de vetor para transformação

Para avaliar a função do gene codificador de quitinase clonado, um fragmento de gene correspondendo ao polinucleotídeo de SEQ ID NO:l foi clonado a jusante de um promotor para criar os vetores de expressão como descritos em Tabela 1. os promotores preferidos de sincícios incluíram o promotor pAt5gl2170 de Arabidopsis de SEQ ID NO:3 (Pedido Provisório US 60/899,693 e PCT/EP2008/051329), o promotor de trealose-6- fosfato-fosfatase TPP de Arabidopsis de SEQ ID NO:4 (pAtlg35910) (Pedido Provisório US 60/874,375 e PCT/EP2007/063761). O Super-promotor 5 constitutivo (U.S.5.955.646) também posicionado em associação operativa com o polinucleotídeo de quitinase de nematódeo de SEQ ID NO:l. O marcador de seleção de planta nos vetores foi um gene de aceto-hidróxiácido-sintase (AHAS) mutado de A. thaliana que concedeu tolerância ao herbicida ARSENAL (imazapir, BASF Corporation, Elorham Park, NJ). O 10 gene marcador AGAS selecionável mutado foi dirigido pelo promotor de AHAS de Arabidopsis.

Tabela I. Vetor de expressão compreendendo SEQ ID NO:l

Vetor Composição do cassete de expressão (promotor: :gene codificador de quitinase) RCB678 Super-promotor::SEQ ID NO:l RCB686 pAt5gl2170::SEQIDNO:l RCB690 pAtlg35910::SEQIDNC>:l EXEMPLO 3: Preparação de raízes transgênicas e bioensaio

de nematódeo

Um ensaio de explante enraizado patenteado foi utilizado para

testar resistência a nematódeo. Este ensaio pode ser encontrado em pedido copendente comumente pertencente USSN 12/001.234, aqui incorporado como referência, e pela descrição que segue.

Sementes de feijão-soja limpas do cultivar de feijão-soja foram 20 esterilizadas na superfície e germinadas sete dias antes da inoculação de Agrobacterium. Cotilédones excisados foram usados para transformação. Após os explantes terem sido cortados das plantas jovens, a extremidade cortada foi imediatamente imersa nas colônias espessas de A. rhizogenes contendo os diferentes construtos de vetor descritos acima. Os explantes 25 foram posicionados sobre ágar 1% em placas de Petri para co-cultivo por 6 dias. Após transformação e co-cultivo, explantes de feijão-soja foram transferidos para um meio de indução de raiz com um agente de seleção. Duas a três semanas após a indução de raiz, as raízes alongadas foram removidas e os explantes de raiz foram transferidos para um meio de seleção apropriado. Raízes transgênicas proliferaram bem dentro de uma semana no meio e foram 5 sub-cultivados. As pontas de raízes principais foram removidas para induzir crescimento de raiz secundária.

Um a cinco dias após subcultura, as raízes foram inoculadas com nematódeos juvenis esterilizados na superfície em placas de multicavidades para ensaio quer de gene de interesse quer de construto de 10 promotor. Raízes de vetor de controle de feijão-soja de cultivar Williams 82 e de vetor de controle de feijão-soja cultivar Jack foram usadas como controles. As culturas de raiz de cada linhagem foram inoculadas com race 3 descontaminado em superfície de SCN juvenis de segundo estágio (J2).

Várias linhagens de raiz independentes foram geradas de cada 15 transformação de vetor binário e as linhagens foram usadas para bioensaio. Quatro semanas após inoculação de nematódeo, os cistos em cada cavidade foram contados. Resultados de bioensaio para construtos RCB678, RCB686, e RCB690 mostram uma redução estatisticamente significativa (valor-p < 0,05) em contagem de cisto sobre múltiplas linhagens transgênicas e uma tendência 20 geral de contagem de cistos reduzida na maioria das linhagens transgênicas testadas.

Claims (19)

1. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de estar transformada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo isolado que codifica uma quitinase de nematódeo, sendo que a expressão do polinucleotídeo concede à planta resistência a nematódeo aumentada.

2. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO: 1; (b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (c) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como definida em SEQID NO:5; (d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (e) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1; (f) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ED NO:5; (g) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (h) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (i) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l ou com o polinucleotídeo de SEQID NO:5; e (j) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo de SEQ ID NO:2.

3. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo tem a seqüência como definida em SEQIDNO:l.

4. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:2.

5. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l.

6. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:2.

7. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a seqüência como definida em SEQ ID NO:5.

8. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica a quitinase de nematódeo compreendendo o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:6.

9. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica a seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5.

10. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica a quitinase de nematódeo compreendendo a seqüência de aminoácidos tendo pelo menos50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:6.

11. Planta de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a planta é uma monocotiledônea.

12. Planta de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a planta é uma dicotiledônea.

13. Planta de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo de ervilha, alfafa, feijão-soja, cenoura, aipo, tomateiro, batateira, algodoeiro, tabaco, pimenteira, colza, beterraba, repolho, couve-flor, alface e , Arabidopsis thaliana.

14. Planta de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a planta é feijão-soja.

15. Semente, caracterizada pelo fato de ser desenvolvimento verdadeiro para um transgene compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo.

16. Semente de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO: 1; (b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (c) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como definida em SEQ ED NO:5; (d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (e) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l; (f) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5; (g) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (h) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (i) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l ou com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5; e (j) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo de SEQ ID NO:2.

17. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender um promoter operacionalmente ligado em um polinucleotídeo isolado selecionado do grupo consistindo de: (a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO: 1; (b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (c) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:5; (d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (e) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l; (f) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5; (g) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (h) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQID NO:6; (i) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l ou com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5; e (j) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo de SEQ ID NO:2; sendo que a expressão do polinucleotídeo concede a ma planta transgênica resistência aumentada a nematódeo.

18. Método para aumentar resistência a nematódeo em uma planta, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) introduzir em uma planta um vetor de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado em um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo, e b) selecionar plantas transgênicas para a resistência a nematódeo aumentada.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como definida em SEQID NO: 1; (b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:2; (c) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:5; (d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (e) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l; (f) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5; (g) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQID NO:2; (h) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e compreende uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência como definida em SEQ ID NO:6; (i) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:l ou com o polinucleotídeo de SEQ ID NO:5; e (j) um polinucleotídeo que codifica uma quitinase de nematódeo e hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo de SEQ ID NO:2.