BRPI0808415A2 - Métodos para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas em relação às plantas de controle, e para produzir uma planta transgênica, planta, parte de planta ou célula de planta, construto, usos de um construto, de um ácido nucléico, e de uma seqüência de ácido nucléico, planta transgênica, partes colhíveis de uma planta, e, produtos. - Google Patents

Description

“MÉTODOS PARA APERFEIÇOAR CARACTERÍSTICAS RELACIONADAS AO RENDIMENTO EM PLANTAS EM RELAÇÃO ÀS PLANTAS DE CONTROLE, E PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA, PLANTA, PARTE DE PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA, CONSTRUTO, USOS DE UM CONSTRUTO, DE UM ÁCIDO NUCLEICO, E DE UMA SEQUÊNCLA DE ÁCIDO NUCLEICO, PLANTA TRANSGÊNICA, PARTES COLHÍVEIS DE UMA PLANTA, E, PRODUTOS”

A presente invenção refere-se em geral ao campo da biologia molecular e concerne a um método para aperfeiçoar várias características relacionadas ao rendimento economicamente importantes em plantas. Mais especificamente, a presente invenção concerne a um método para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas pela modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo de Fator G associado a Harpin-a (daqui em diante chamado de "HpaG"). A presente invenção também concerne às plantas tendo expressão modulada de uma ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG, cujas plantas têm características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação às plantas de controle. A invenção também fornece construtos compreendendo ácidos nucleicos codificadores de HpaG, úteis na realização dos métodos da invenção. A presente invenção também fornece um método para aperfeiçoar as características relacionadas ao rendimento em plantas em relação às plantas de controle, pela modulação (preferivelmente aumento) da expressão em uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWITCH 2/ SUCROSE NON-FERMENTING 2 (SWI2/SNF2). A presente invenção também concerne às plantas tendo expressão modulada de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2, cujas plantas têm características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação às plantas de controle. A invenção também fomece construtos úteis na realização dos métodos da invenção.

A população mundial sempre crescente e o fornecimento decrescente de terra arável disponível para agricultura estimulam a pesquisa na direção do aperfeiçoamento da eficiência de agricultura. Meios 5 convencionais para aperfeiçoamentos de colheita e horticulturais utilizam técnicas de geração seletivas para identificar plantas tendo características desejáveis. Contudo, tais técnicas de geração seletivas têm várias desvantagens, isto é estas técnicas são tipicamente laboriosamente intensas e resultam em plantas que muitas vezes contêm componentes genéticos 10 heterogêneos que nem sempre podem resultar na característica desejável sendo transferida das plantas parentais. Avanços em biologia molecular têm permitido que a humanidade modifique o plasma germinativo de animais e plantas. Engenharia genética de plantas exige o isolamento e a manipulação de material genético (tipicamente na forma de DNA ou RNA) e a subsequente 15 introdução daquele material genético em uma planta. Tal tecnologia tem a capacidade para dar colheitas ou plantas tendo várias características econômicas, agronômicas ou horticulturais aperfeiçoadas.

Uma característica de um interesse econômico particular é o rendimento. O rendimento é normalmente definido como o produto 20 mensurável de valor econômico de uma colheita. Isto pode ser definido em termos de quantidade e/ou qualidade. Rendimento é diretamente dependente de vários fatores, por exemplo, o número e o tamanho dos órgãos, a arquitetura da planta (por exemplo, o número de ramos), produção de sementes, senescência foliar e mais. Desenvolvimento de raiz, absorção de 25 nutrientes, tolerância ao estresse e vigor inicial também podem ser fatores importantes na determinação do rendimento. Otimização dos fatores acima mencionados pode portanto contribuir para o aumento do rendimento da colheita.

Rendimento de semente é uma característica particularmente importante, porque as sementes de muitas plantas são importantes para a nutrição humana e animal. Plantações tais como, milho, arroz, trigo, canola e feijão-soja responsabilizam-se por mais da metade da ingestão calórica humana total, seja através de consumo direto das próprias sementes seja 5 através do consumo de produtos de comida produzidos das sementes processadas. Também são uma fonte de açúcares, óleos e muitos tipos de metabólitos usados em processos industriais. Sementes contêm um embrião (a fonte de novos brotos e novas raízes) e um endosperma (a fonte de nutrientes para o crescimento do embrião durante germinação e durante o crescimento 10 inicial das plantas jovens). O desenvolvimento de uma semente envolve muitos genes, e exige a transferência de metabólitos das raízes, folhas e caules para dentro da semente em crescimento. O endosperma, em particular, assimila os precursores metabólicos de carboidratos, óleos e proteínas e os sintetiza em macromoléculas de armazenagem para encher o grão.

índice de colheita, a razão de rendimento de sementes para

peso seco acima do solo, é relativamente estável sob muitas condições ambientais e assim pode ser muitas vezes obtida uma correlação robusta entre tamanho de planta e rendimento de grãos (e.g. Rebetzke et al. 2002 Crop Science 42:739). Estes processos estão intrinsecamente ligados porque a 20 maioria da biomassa de grão é dependente da produtividade fotossintética armazenada ou corrente pelas folhas e caule da planta (Gardener et al. 1985 Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, pp68-73). Portanto, seleção do tamanho de planta, mesmo em estágios de desenvolvimento iniciais, tem sido usada como um indicador para rendimento potencial futuro 25 (e.g. Tittonell et al. 2005 Agric Ecosys & Environ 105: 213). Quando se testa o impacto de diferenças genéticas sobre tolerância ao estresse, a capacidade para padronizar propriedades de solo, temperatura, disponibilidade de água e nutriente e intensidade de luz é uma vantagem intrínseca de ambientes de câmara de crescimento de planta ou estufa comparado com o campo. Contudo, limitações artificiais sobre rendimento devido à polinização insatisfatória por causa da ausência de vento ou insetos, ou espaço insuficiente para maturação de raiz ou crescimento de copa, podem restringir o uso destes ambientes controlados para testar diferenças de rendimento. Por 5 isso, medições de tamanho de planta em desenvolvimento inicial, sob condições padronizadas em uma câmara de crescimento ou estufa, são práticas padrão para proporcionar indicação de vantagens de rendimento genético potencial.

Outra característica de interesse econômico particular é aquela das características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas de plantas crescidas sob condições de estresse abiótico. Estresse abiótico é uma causa primária de perda de plantação em todo o mundo, reduzindo os rendimentos médios das plantas de colheita mais importantes em mais de 50% (Wang et al., Planta (2003) 218: 1-14). Estresses abióticos podem ser causados por estiagem, salinidade, extremos de temperatura, toxicidade química e estresse oxidativo. A capacidade para aperfeiçoar as características relacionadas ao rendimento em plantas crescidas sob condições de estresse abiótico seria de grande vantagem econômica para agricultores em todo o mundo e permitiria o cultivo de plantações durante condições adversas e em territórios onde cultivo de plantações pode não ser possível sob outras situações.

A capacidade para aumentar o rendimento de planta teria muitas aplicações em áreas tais como agricultura, incluindo na produção de plantas ornamentais, arboricultura, horticultura e silvicultura. Rendimento crescente também pode encontrar uso na produção de algas para uso em 25 biorreatores (para a produção biotecnológica de substâncias tais como fármacos, anticorpos ou vacinas, ou para a bioconversão de resíduo orgânico) e outras tais áreas.

Fundamentos I. HARPIN O Sistema de Secreção de Tipo III (TTSS) é um maquinário exportador específico para bactérias Gram-negativas e é encontrado entre patógenos para plantas e animais, mas também em Rhizobia endossimbiótica. É postulado que TTSS fornece proteínas para a célula hospedeira à qual a bactéria está associada. Em bactérias patogênicas de planta, o TTSS é um agrupamento de genes de patogenicidade e de resposta hipersensível compreendendo cerca de 20 genes, o agrupamento Hrp. Nove destes genes (o harpin conservado ou hrc) estão conservados dentre ambos os patógenos de animal e planta, oito deles compartilham homologia com os genes codificadores do aparelho de flagella (Bogdanove et al., Mol. Microbiol. 20, 681-683, 1996), o nono, hrcC, é homólogo às secretinas de membrana externa GSP (Deng e Huang, J. Bacteriol. 180, 4523-4531, 1999). Os genes hpa (hrpassociados) contribuem para a patogenicidade e para a indução da resposta hipersensível (HR) em plantas não-hospedeiras, mas não são essenciais para as interações patogênicas de bactérias com plantas. E postulado que o aparelho de flagella e o TTSS são derivados de uma origem comum (Gophna et al., Gene 312, 151-163, 2003); o TTSS tem além disso se difundido dentre as espécies bacterianas evolucionariamente distantes via múltiplos eventos de transferência-horizontal (Nguyen et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 125- 144,2000).

Muitas bactérias gram-negativas patogênicas para planta possuem dois conjuntos de genes que modulam suas interações com as plantas. Os genes de avirulência determinam especificidade de hospedeiro baseada em interações de gene-para-gene, e os genes hrp (reação 25 hipersensível e patogenicidade) estão envolvidos em patogenicidade e na indução de respostas hipersensíveis em plantas não-hospedeiras. A HR é uma morte celular de planta elevadamente localizada que ocorre quando plantas não-hospedeiras ou cultivares residentes de plantas hospedeiras são infiltrados com um patógeno de planta ou moléculas causadoras de HR, tais como harpins e proteínas Avr. A HR é considerada como uma reação de resistência de plantas aos patógenos microbianos.

Harpins são um grupo de causadores de HR que são secretados pela rota de secreção de tipo III (TTSS) e causam HR quando infiltradas para 5 dentro do apoplasto de folhas de plantas não-hospedeiras. Diferentemente de proteínas Avr, que precisam ser liberadas dentro da célula para exercerem suas funções, harpins podem causar HR quando liberados no espaço intercelular das células de planta. Visto que o primeiro harpin, HrpN5 foi identificado de Erwinia amylovora, muitos harpins têm sido relatados de 10 várias espécies, incluindo Pseudomonas, Ralstonia, e Xanthomonas. Harpins são proteínas ricas em glicina, termicamente estáveis, e é postulado que estão presentes em todas as bactérias patogênicas de planta tendo um TTSS (Alfano e Colmer, Annu. Rev. Phytopathol. 42, 385-414, 2004). O mecanismo bioquímico de causação de HR por harpins em plantas não-hospedeiras 15 permanece obscuro. HrpZ de Pseudomonas syringae pv. syringae associa-se com as paredes celulares em vez de com as membranas das células de planta, e a proteína causa nenhuma resposta de protoplastos, que são faltantes de paredes (Hoyos et al. Mol. Plant-Microbe Internet. 9, 608-616, 1996). Contudo, HrpZ de P. syringae pv. phaseolicola liga-se em bicamadas lipídicas 20 e forma um poro condutor de íons (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98, 289-294, 2001). Os 109 aminoácidos N-terminais e os 216 aminoácidos Cterminais de HrpZ são capazes de causar HR em um nível similar ao de HrpZ de comprimento total (Alfano et al., Mol. Microbiol. 19, 715-728, 1996). Kim et al. e Charkowski et al. mostraram que os harpins HrpW de E. amylovora e 25 P. syringae pv. tomateiro são compostos de dois domínios — o domínio de harpin N-terminal e o domínio de Pel (pectato liase) C-terminal — e é proposto que HrpW atua na parede celular (Charkowski et al., J. Bacteriol. 180, 5211-5217, 1998; Kim e Beer, J. Bacteriol. 180, 5203-5210, 1998).

Além dos harpins, o agrupamento TTSS em bactérias também pode incluir genes codificadores de Fatores associados a Harpin. Polipeptídeos HpaG são menores do que harpins, e compartilham pouca homologia de seqüência. É postulado que estas diferenças de seqüência com harpins contribuem para a diferença na capacidade de causar HR em plantas 5 entre polipeptídeos HpaG e harpins (Kim et al, J. Bacteriol. 186, 6239-6247, 2004).

Pedido de Patente Coreana KR20030068302 revela proteína HpaG de Xanthomonas, que, quando aplicada em plantas ou sementes de planta, concede resistência à doença, em particular resistência à infecção de 10 Xanthomonas axonopodis. Fatores associados a Harpin têm sido usados para conceder resistência à doença em plantas; e como um resultado disto resistência ao estresse abiótico, plantas tiveram rendimento melhor comparadas com as plantas de controle sob condições de estresse abiótico.

Surpreendentemente agora tem sido verificado que modulação 15 da expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo de Fator G associado a Harpin (HpaG) dá às plantas características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação à planta de controle. Estas características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas foram obtidas em plantas que não foram expostas ao estresse.

II. SNF2

A presente invenção concerne a um método para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas em relação às plantas de controle pelo aumento da expressão em uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um Polipeptídeo SWITCH 2/ SUCROSE NON-FERMENTING 2 (SWI2/SNF2).

Muitos processos celulares associados ao cromossomo, tais como replicação, transcrição, reparo de DNA, ou recombinação, exigem DNA acessível. Para lidarem com estes eventos, células possuem atividades que podem modular cromatina em eucariotos ou interromper outros complexos de DNA:proteína em ambos procariotos e eucariotos, usando hidrólise de ATP. Um dos exemplos melhor estudados destas atividades é realizado pela família SWI2/SNF2 de ATPases, um grupo grande de proteínas implicadas em muitos processos semelhantes à remodelagem diferentes.

5 Proteínas da família SWI2/SNF2 são ubíquas, porque são

encontradas em bactérias, archaea e eucariotos. Têm sido recentemente classificadas em 24 subfamílias distintas, após alinhamento de múltiplas seqüências do domínio de SWI2/SNF2 ATPase compreendendo os sete motivos de seqüência conservados (I, Ia, II, III, IV, V, e VI) (Flaus et al. 10 (2006) Nucleic Acids Res. 2006; 34(10): 2887-2905). Estas subfamílias têm tradicionalmente tomado o nome do membro arquetípico. Uma subfamília é chamada SS01653, segundo o único membro da família SWI2/SNF2 em Sulfolobus solfataricus archaeal (Flaus et al, supra; Duur et al. (2005) Cell 121(3): 363-373), a subfamília exclusivamente archaeal e eubacteriana mais 15 similar às proteínas SWI2/SNF2 eucarióticas. A subfamília SSO1653 traz todas marcas estruturais e de seqüência da família SWI2/SNF2.

Pedido de Patente US de N0 US2003/233670 descreve polinucleotídeos e proteínas codificadas pelos polinucleotídeos. SEQ ID NO: 125 é uma seqüência de polinucleotídeo codificadora de um polipeptídeo 20 SWI2/SNF2 da subfamília SSO1653 de Synechocystis sp. PCC 6803. Pedido de Patente US de N0 US2005/108791 descreve 24149 seqüências de ácido nucleico e de polipeptídeo, dentre as quais uma seqüência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 57 codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 da subfamília SS01653 de Synechocystis sp. PCC 6803, como 25 representada por SEQ ID NO: 396.

Surpreendentemente, tem sido agora verificado que expressão aumentada em uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 dá plantas tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação às plantas de controle. Definições

Polipeptídeofs") / proteína(s)

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são aqui usados intercambiavelmente e referem-se aos aminoácidos em uma forma polimérica de qualquer comprimento.

Polinucleotídeoss) / ácido nucleicofs) / sequência(s) de ácido nucleico / sequênciafs) de nucleotídeos

Os termos "polinucleotídeo(s)", "sequência(s) de ácido nucleico", "sequência(s) de nucleotídeos" são aqui usados intercambiavelmente e referem-se aos nucleotídeos, quer ribonucleotídeos quer desoxirribonucleotídeos ou uma combinação de ambos, em uma forma polimérica de qualquer tamanho.

Plantais) de controle

A escolha de plantas de controle adequadas é uma parte 15 rotineira de uma instalação experimental e pode incluir plantas de tipo selvagem correspondentes ou plantas correspondentes sem o gene de interesse. A planta de controle é tipicamente da mesma espécie de planta ou até mesmo da mesma variedade da planta a ser avaliada. A planta de controle também pode ser um nulizigoto da planta a ser avaliada. Uma "planta de 20 controle" como aqui usada refere-se não apenas às plantas inteiras, mas também às partes de planta, incluindo sementes e partes de semente. Homólogo(s)

"Homólogos" de uma proteína incluem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas tendo substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido em relação à proteína não modificada em questão e tendo atividade biológica e funcional similar à da proteína não modificada da qual são derivados.

Uma deleção refere-se à remoção de um ou mais aminoácidos de uma proteína. Uma inserção refere-se a um ou mais resíduos de aminoácido sendo introduzidos em um sítio predeterminado em uma proteína. Inserções podem compreender fusões N-terminal e/ou C-terminal bem como inserções de intra-sequência de um ou múltiplos aminoácidos. Geralmente, inserções 5 dentro da seqüência de aminoácidos serão menores do que fusões N- ou Cterminais, da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos. Exemplos de peptídeos ou proteínas de fusão N- ou C-terminal incluem o domínio de ligação ou o domínio de ativação de um ativador transcricional como usado no sistema bihíbrido de levedura, proteínas de capa de fago, etiqueta-(histidina)-6, etiqueta10 glutationa S-transferase, proteína A, proteína ligante de maltose, diidro-folato redutase, epitopo Tag*100, epitopo c-myc, epitopo-FLAG®, IacZ, CMP (peptídeo ligante de calmodulina), epitopo HA, epitopo de proteína C e epitopo VSV.

Uma substituição refere-se à troca de aminoácidos da proteína 15 por outros aminoácidos tendo propriedades similares (tais como hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão para formar ou quebrar estruturas α-helicoidais ou estruturas de folha-β similares). Substituição de aminoácido são tipicamente de resíduos individuais, mas podem ser agrupados dependendo das restrições funcionais impostas ao 20 polipeptídeo; inserções costumeiramente serão da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácido. As substituições de aminoácido são preferivelmente substituições de aminoácido conservativas. Tabelas de substituições conservativas são bem conhecidas na arte (veja por exemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company e a Tabela 1 abaixo).

25 Tabela 1: Exemplos de substituições de aminoácido conservadas

Resíduo Substituições Resíduo Substituições Conservativas Conservativas Ala Ser Leu Ile; Val Arg Lys Lys Arg; Gln Asn Gin; His Met Leu; Ile Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr Gln Asn Ser Thr; Gly Cys Ser Thr Ser; Val Glu Asp Trp Tyr Gly Pro Tyr Trp; Phe His Asn; Gln Val Ile; Leu Ile Leu, Val Substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido podem ser prontamente feitas usando técnicas de síntese de peptídeo bem conhecidas na arte, tal como síntese de peptídeo em fase sólida e semelhantes, ou por 5 manipulação de DNA recombinante. Métodos para manipulação de seqüências de DNA para produzir variantes de substituição, inserção ou deleção de uma proteína são bem conhecidos na arte. Por exemplo, técnicas para preparar mutações de substituição em sítios predeterminados em DNA são bem conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte e incluem 10 mutagênese Ml3, mutagênese T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagênese Sitio-Direcionada QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagênese sítio-direcionada mediada por PCR ou outros protocolos de mutagênese sítio-direcionada.

Derivados

"Derivados" incluem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos

que podem, comparados com a seqüência de aminoácidos da forma naturalmente ocorrente da proteína, tal como aquela apresentada em SEQ ID NO: 2, compreender substituições de aminoácidos por resíduos de aminoácido não-naturalmente ocorrentes, ou adições de resíduos de aminoácido nãonaturalmente ocorrentes. "Derivados" de uma proteína também incluem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos que compreendem resíduos de aminoácido naturalmente ocorrentes alterados (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados etc.) ou não-naturalmente alterados comparados com a seqüência de aminoácidos de uma forma 5 naturalmente ocorrente do polipeptídeo. Um derivado também pode compreender um ou mais substituintes ou adições de não-aminoácido comparado com a seqüência de aminoácidos da qual ele é derivado, por exemplo uma molécula repórter ou outro ligante, covalentemente ou nãocovalentemente ligada(o) na seqüência de aminoácidos, tal como uma 10 molécula repórter que está ligada para facilitar sua detecção, e resíduos de aminoácido não-naturalmente ocorrentes relativos à seqüência de aminoácidos de uma proteína naturalmente ocorrente.

Ortólogoís) / parálogofs)

Ortólogos e parálogos incluem conceitos evolucionários usados para descrever os parentescos ancestrais de genes. Parálogos são genes dentro da mesma espécie que têm originado através de duplicação de um gene ancestral e ortólogos são genes de organismos diferentes que têm originado através de especiação.

Domínio

O termo "domínio" refere-se a um conjunto de aminoácidos

conservados em posições específicas ao longo de um alinhamento de seqüências de proteínas evolucionariamente relacionadas. Embora aminoácidos em outras posições possam variar entre homólogos, aminoácidos que estão elevadamente conservados em posições específicas indicam 25 aminoácidos que são provavelmente essenciais na estrutura, estabilidade ou atividade de uma proteína. Identificados por seu grau elevado de conservação em seqüências alinhadas de uma família de homólogos de proteína, podem ser usados como identificadores para determinar se algum polipeptídeo em questão pertence a uma família de polipeptídeos previamente identificada. Motivo / seqüência de consenso / assinatura

O termo "motivo" ou "seqüência de consenso" ou "assinatura" refere-se a uma região conservada curta na seqüência de proteínas evolucionariamente relacionadas. Motivos são frequentemente partes 5 elevadamente conservadas de domínios, mas também podem incluir apenas parte do domínio, ou estarem localizados fora do domínio conservado (se todos os aminoácidos do motivo caírem fora de um domínio definido). Hibridização

O termo "hibridização" como aqui definido é um processo no qual seqüências de nucleotídeos complementares substancialmente homólogas anelam-se uma na outra. O processo de hibridização pode ocorrer inteiramente em solução, i.e. ambos os ácidos nucleicos complementares estão em solução. O processo de hibridização também pode ocorrer com um dos ácidos nucleicos complementares imobilizados em uma matriz tal como glóbulos magnéticos, glóbulos de Sepharose ou qualquer outra resina. O processo de hibridização podem além disso ocorrer com um dos ácidos nucleicos complementares imobilizado em um suporte sólido tal como uma membrana de nitro-celulose ou de náilon ou imobilizado por e.g. fotolitografia em, por exemplo, um suporte vítreo silicoso (o último conhecido como arranjos ou microarranjos de ácido nucleico ou como chips de ácido nucleico). Com o propósito de permitir ocorrência da hibridização, as moléculas de ácido nucleico são geralmente térmica ou quimicamente desnaturadas para fusão de uma fita dupla em duas fitas individuais e/ou para remoção de harpins ou outras estruturas secundárias dos ácidos nucleicos de fita única.

O termo "estringência" refere-se às condições sob as quais ocorre uma hibridização. A estringência de hibridização é influenciada por condições tais como temperatura, concentração de sal, força iônica e composição de tampão de hibridização. Geralmente, condições de estringência baixa são selecionadas para estarem a cerca de 3 O0C mais baixo do ponto de fusão térmico (Tm) para a seqüência específica em uma força iônica e em um pH definidos. Condições de estringência média são quando a temperatura está 20°C abaixo de Tm, e condições de estringência alta são 5 quando a temperatura está 10°C abaixo de Tm. Condições de hibridização de estringência alta são tipicamente usadas para isolar seqüências hibridizadas que têm similaridade de seqüência alta com a seqüência de ácido nucleico alvo. Contudo, ácidos nucleicos podem se desviar em seqüência e ainda codificar um polipeptídeo substancialmente idêntico, devido à degeneração do 10 código genético. Portanto condições de hibridização de estringência média podem ser algumas vezes necessárias para identificar tais moléculas de ácido nucleico.

O Tm é temperatura sob força iônica e pH definidos, na qual 50% da seqüência alvo hibridiza com uma sonda perfeitamente combinada. O 15 Tm é dependente das condições de solução e da composição da base e do comprimento da sonda. Por exemplo, seqüências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. A velocidade máxima de hibridização é obtida de cerca de 16°C até 32°C abaixo de Tm. A presença de cátions monovalente na solução de hibridização reduz a repulsão eletrostática 20 entre as duas fitas de ácido nucleico promovendo deste modo a formação de híbrido; este efeito é visível para concentrações de sódio de até 0,4M (para concentrações mais altas, este efeito pode ser ignorado). Formamida reduz a temperatura de fusão de dúplices de DNA-DNA e DNA-RNA com 0,6 a 0,7°C para cada percentagem de formamida, e adição de formamida 50% 25 permite que hibridização seja realizada a de 30 a 45°C, ainda que a velocidade de hibridização seja bem diminuída. Más combinações de pares de bases reduzem a velocidade de hibridização e a estabilidade térmica dos dúplices. Em média e para sondas grandes, o Tm diminui cerca de 1°C por% de má combinação de bases. O Tm pode ser calculado usando as seguintes equações, dependendo dos tipos de híbridos: 1) híbridos de DNA-DNA (Meinkoth e Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):Tm= 81,5°C + 16,6xlogi0[Na+]a + 0,41x%[G/Cb] 500x[Lc]-l - 0,61x% formamida

2) híbridos de DNA-RNA ou RNA-RNA:Tm= 79,8 + 18,5 (logio[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 - 820/Lc

3) híbridos de oligo-DNA ou oligo-RNAd:

Para < 20 nucleotídeos: Tm= 2 (In)

Para 20-35 nucleotídeos: Tm= 22 + 1,46 (In) a ou para outro cátion monovalente, mas apenas acurada dentro da faixa de 0,01-0,4 M.

b apenas acurada para%GC dentro da faixa de 30% a 75%. cL = comprimento do duplex nos pares de bases. d Oligo, oligonucleotídeo; In, comprimento efetivo do iniciador = 2x(no. de G/C)+(no. de A/T).

Ligação não-específica pode ser controlada usando qualquer uma de numerosas técnicas conhecidas tais como, por exemplo, bloqueio da membrana com soluções contendo proteína, adições de RNA, DNA heterólogo, e SDS no tampão de hibridização, e tratamento com Rnase. Para sondas não-homólogas, uma série de hibridizações pode ser realizada por variação de uma de (i) abaixamento progressivo da temperatura de anelamento (por exemplo de 68°C para 42°C) ou (ii) abaixamento progressivo da concentração de formamida (por exemplo de 50% para 0%). O técnico experiente está ciente dos vários parâmetros que podem ser alterados durante a hibridização e que quer manterão quer modificarão as condições de estringência.

Além das condições de hibridização, especificidade de hibridização tipicamente também depende da função de lavagens de póshibridização. Para remover genótipo residual resultante de hibridização nãoespecífica, amostras são lavadas com soluções salinas diluídas. Fatores críticos de tais lavagens incluem a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final: quanto menos a concentração de sal e quanto mais alta a temperatura de lavagem, maior a estringência da lavagem. Condições de 5 lavagem são tipicamente realizadas em ou abaixo da estringência de hibridização. Uma hibridização positiva dá um sinal que é pelo menos o dobro daquele do genótipo residual. Geralmente, condições estringentes adequadas para ensaios de hibridização de ácido nucleico ou procedimentos de detecção de amplificação de gene são como mostradas acima. Condições 10 mais ou menos estringentes também podem ser selecionadas. O técnico experiente está ciente de vários parâmetros que podem ser alterados durante lavagem e que quer manterão quer mudarão as condições de estringência.

Por exemplo, condições de hibridização de estringência alta típicas para híbridos de DNA mais longos do que 50 nucleotídeos incluem hibridização a 65°C em Ix SSC ou a 42°C em Ix SSC e formamida 50%, seguida por lavagem a 65°C em 0,3x SSC. Exemplos de condições de hibridização de estringência média para híbridos de DNA mais longos do que 50 nucleotídeos incluem hibridização a 50°C em 4x SSC ou a 40°C em 6x SSC e formamida 50%, seguida por lavagem a 50°C em 2x SSC. O comprimento do híbrido é o comprimento antecipado para o ácido nucleico hibridizando. Quando ácidos nucleicos de seqüência conhecida são hibridizados, o comprimento do híbrido pode ser determinado por alinhamento das seqüências e identificação das regiões conservadas aqui descritas. IxSSC é NaCl 0,15M e citrato de sódio 15mM; a solução de hibridização e as soluções de lavagem podem adicionalmente incluir 5 x reagente de Denhardt, SDS 0,5-1,0%, DNA de esperma de salmão fragmentado 100 μg/ml, desnaturado, pirofosfato de sódio 0,5%.

Para propósitos de definição do nível de estringência, referência pode ser feita a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a Iaboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York ou a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 e atualizações anuais).

Rearranio de gene / evolução direcionada

Rearranjo de gene ou evolução direcionada consiste de iterações de rearranjo de DNA seguidas por triagem e/ou seleção apropriadas para gerar variantes de ácidos nucleicos ou suas porções codificadores(as) de proteínas tendo uma atividade biológica modificada (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; Patentes US 5.811.238 e 6.395.547).

Elemento regulatório / seqüência de controle / promotor

Os termos "elemento regulatório", "seqüência de controle" e "promotor" são todos aqui usados intercambiavelmente e são para serem tomados em um contexto amplo para se referirem às seqüências de ácido nucleico regulatórias capazes de efetuar expressão das seqüências nas quais estão ligadas. O termo "promotor" tipicamente se refere a uma seqüência de controle de ácido nucleico localizada a montante do início transcricional de um gene e que está envolvida no reconhecimento e na ligação de RNA polimerase e outras proteínas, dirigindo deste modo a transcrição de um ácido nucleico operacionalmente ligado. Incluídas nos termos acima mencionados estão as seqüências regulatórias transcricionais derivadas de um gene genômico eucariótico clássico (incluindo o box TATA que é exigido para iniciação de transcrição acurada, com ou sem uma seqüência de box CCAAT) e elementos regulatórios adicionais (i.e. silenciadores, intensificadores e seqüências ativadoras a montante) que alteram a expressão de gene em resposta aos estímulos desenvolventes e/ou externos, ou em uma maneira tempo-específica. Também está incluída no termo uma seqüência regulatória transcricional de um gene procariótico clássico, em cujo caso pode incluir uma seqüências regulatórias transcricionais box -35 e/ou box -10. O termo "elemento regulatório" também inclui um derivado ou uma molécula de fusão sintético(a) que concede, ativa ou intensifica a expressão de uma molécula de ácido nucleico èm uma célula, tecido ou órgão.

Um "promotor de planta" compreende elementos regulatórios, que medeiam a expressão de um segmento de seqüência codificadora em células de planta. Conformemente, um promotor de planta não precisa ser de origem de planta, mas pode se original de vírus ou microorganismos, por exemplo de vírus que atacam células de planta. O "promotor de planta" também pode ser originar de uma célula de planta, e.g. da planta que é transformada com a seqüência de ácido nucleico a ser expressada no processo da invenção e aqui descrita. Isto também se aplica a outros sinais regulatórios de "planta", tais como terminadores de "planta". Os promotores a montante das seqüências de nucleotídeos úteis nos métodos da presente invenção podem ser modificados por uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções sem interferirem com a funcionalidade ou atividade de qualquer um de os promotores, a matriz de leitura aberta (ORF) ou a região regulatória-3' tais como terminadores ou outras regiões regulatórias-3' que estão localizados longe da ORF. Além disso é possível que a atividade dos promotores seja aumentada pela modificação de sua seqüência, ou que sejam substituídos completamente por promotores mais ativos, até mesmo promotores de organismos heterólogos. Para expressão em plantas, a molécula de ácido nucleico precisa, como descrito acima, estar operacionalmente ligada em ou compreender um promotor adequado que expressa o gene no instante de tempo correto e com o padrão de expressão espacial exigido. Operacionalmente ligado O termo "operacionalmente ligado" como aqui usado refere-se

a uma ligação funcional entre a seqüência de promotor e o gene de interesse, de tal modo que a seqüência de promotor seja capaz de iniciar a transcrição do gene de interesse.

Promotor constitutivo Um "promotor constitutivo" refere-se a um promotor que é transcricionalmente ativo durante a maioria, mas não necessariamente todas as, fases de crescimento e desenvolvimento e sob a maioria das condições ambientais, em pelo menos uma célula, tecido ou órgão. Tabela 2a abaixo dá exemplos de promotores constitutivos.

Tabela 2a: Exemplos de promotores constitutivos

Fonte de Gene Referência Actina McElroy et al., Plant Cell, 2: 163-171, 1990 HMGP WO 2004/070039 CAMV 35S Odell etal., Nature, 313: 810-812, 1985 CaMV 19S Nilsson et al., Physiol. Plant. 100:456-462, 1997 GOS2 de Pater et al., Plant J Nov; 2(6):837-44, 1992, WO 2004/065596 Ubiquitina Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992 Ciclofilina de arroz Buchholz et al, Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994 Histona H3 de milho Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992 Histona H3 de alfafa Wuei al, Plant Mol. Biol. 11:641-649, 1988 Aetina 2 An et al., Plant J. 10(1); 107-121, 1996 34S FMV Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443 Subunidade pequena US 4.962.028 de Rubisco OCS Leisner (1988) Proe Natl Aead Sci USA 85(5): 2553 SADl Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696 SAD2 Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696 Nos Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20)7831-7846 V-ATPase WO 01/14572 Super promotor WO 95/14098 Proteínas G-box WO 94/12015 Promotor ubíquo

Um promotor ubíquo é ativo em substancialmente todos os tecidos ou células de um organismo.

Promotor desenvolvimentalmente-regulado

Um promotor desenvolvimentalmente-regulado é ativo durante certos estágios desenvolventes ou em partes da planta que sofrem mudanças desenvolventes.

Promotor induzível

Um promotor induzível tem iniciação de transcrição induzida ou aumentada em resposta a um estímulo químico (para uma revisão veja 5 Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), ambiental ou físico, ou pode ser "induzível por estresse", i.e. ativado quando uma planta é exposta a várias condições de estresse, ou um "induzível por patógeno" i.e. ativado quando uma planta é exposta a vários patógenos.

Promotor específico de órgão / específico de tecido Um promotor específico de órgão ou específico de tecido é um

que é capaz de preferencialmente iniciar a transcrição em certos órgãos ou tecidos, tais como as folhas, raízes, tecido de semente etc. Por exemplo, um "promotor específico de raiz" é um promotor que é transcricionalmente ativo predominantemente em raízes de planta, substancialmente excluindo 15 quaisquer outras partes de uma planta, enquanto que ainda permite alguma expressão subnormal nestas outras partes de planta. Promotores capazes de iniciar transcrição em certas células são aqui apenas chamados de "específicos de célula".

Exemplos de promotores específicos de raiz são listados em Tabela 2b abaixo:

Tabela 2b: Exemplos de promotores específicos de raiz:

Fonte de Gene Referência RCc3 Plant Mol Biol. 1995 Jan; 27(2):237-48 PHTl de Arabidopsis Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31:341) Transportador de fosfato de Xiao et al., 2006 Medicago PyklO de Arabidopsis Nitz et al. (2001) Plant Sci 161 (2): 337-346 genes expressáveis em raiz Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987. gene induzível por auxina de Van der Zaal et al, Plant Mol. Biol. 16, 983, tabaco 1991. β-tubulina Oppenheimer, etal, Gene 63: 87, 1988. genes específicos de raiz de tabaco Conkling, et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990. gene Gl-3 b de B. napus Patente dos Estados Unidos No. 5.401.836 SbPRPl Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109-119, 1993. LRXl Baumberger et al. 2001, Genes & Dev. 15:1128 BTG-26 Brassica napus US 20050044585 LeAMTl (tomateiro) Lauter et al. (1996, PNAS 3:8139) O LeNRTl-I (tomateiro) Lauter et al. (1996, PNAS 3:8139) gene de patatina de classe I Liu et al., Plant Mol. Biol. 153:386-395, 1991. (batateira) KDCl (Daucus carota) Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275:39420) gene TobRB7 W Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA OsRAB 5 a (arroz) Wang et al. 2002, Plant Sei. 163:273 ALF5 (Arabidopsis) Diener et al. (2001, Plant Cell 13:1625) NRT2;lNp (N. plumbaginifolia) Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34:265) Um promotor específico de semente é transcricionalmente

ativo predominantemente em tecido de semente, mas não necessariamente exclusivamente em tecido de semente (em casos de expressão subnormal). O promotor específico de semente pode ser ativo durante desenvolvimento e/ou 5 germinação de semente. O promotor específico de semente pode ser específico de endosperma e/ou aleurona e/ou embrião. Exemplos de promotores específicos de semente (específicos de endosperma/aleurona/embrião) são mostrados em Tabelas 2c, d, e, f abaixo. Outros exemplos de promotores específicos de semente são dados em Qing 10 Qu e Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004), cuja revelação é aqui incorporada como referência como se totalmente descrita.

Tabela 2c: Exemplos de promotores específicos de semente:

Fonte de Gene Referência genes específicos de semente Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985; Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.; Baszczynski et al, Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990. Albumina de castanha-do-pará Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992. Legumina Ellis etal, Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988. glutelina (arroz) Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987. Zeína Matzke et al. PlantMolBiol, 14(3):323-32 1990 napA Stalberg et al., Planta 199: 515-519, 1996. glutenina-1 LMW e HMW de Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461- trigo 2, 1989 SPA de trigo Albani et al., Plant Cell, 9: 171-184, 1997 α, β, γ-gliadinas de trigo EMBO J. 3:1409-15, 1984 promotor Itrl de cevada Diaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8 BI, C, D, hordeína de cevada Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996 DOF de cevada Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998 blz2 EP99106056.7 promotor sintético Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998. prolaminaNRP33 de arroz Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998 α-globulina Glb-I de arroz Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998 OSHl de arroz Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 8117-8122, 1996 α-globulina REB/OHP-1 de Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997 arroz ADP-glicose pirofosfatase de TransRes 6:157-68, 1997 arroz família de gene ESR de milho Plant J 12:235-46,1997 okafirina de sorgo DeRose et al., Plant Mol. Biol 32:1029-35, 1996 KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39:257- 71, 1999 oleosina de arroz Wu et al., J. Biochem. 123:386,1998 oleosina de girassol Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992 PROOl 17, proteína ribossomal WO 2004/070039 40S de arroz putativa PROO136, alanina amino- não publicado transferase de arroz, PROO147, inibidor de tripsina não publicado ITRl (cevada) PR00151, WSI18 de arroz WO 2004/070039 PR00175, RAB21 de arroz WO 2004/070039 PR0005 WO 2004/070039 PR00095 WO 2004/070039 α-amilase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4:203-211, 1992; Skriver et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:7266- 7270, 1991 gene de catepsina-P-semelhante Cejudo et al., Plant Mol Biol 20:849-856, 1992 Ltp2 de cevada Kalla et al., Plant J. 6:849-60,1994 Chi26 Leah et al., Plant J. 4:579-89, 1994 B-Peru de milho Selinger et al., Genetics 149; 1125-38,1998 Tabela 2d: Exemplos de promotores específicos de endosperma:

Fonte de Gene Referência glutelina (arroz) Takaiwa et al. (1986) Mol Gen Genet 208:15- 22; Takaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221:43- 47 Zeína Matzke et al., (1990) Plant Mol Biol 14(3): 323- 32 glutenina-1 LMW e HMW de trigo Colot et al. (1989) Mol Gen Genet 216:81-90, Anderson et al. (1989) NAR 17:461-2 SPA de trigo Albani et al. (1997) Plant Cell 9:171-184 gliadinas de trigo Rafalski et al. (1984) EMBO 3:1409-15 promotor Itrl de cevada Diaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8 BI, C, D, hordeína de cevada Cho et al. (1999) Theor Appl Genet 98:1253- 62;Muller et al. (1993) Plant J 4:343- 55;Sorenson et al. (1996) Mol Gen Genet 250:750-60 DOF de cevada Mena et al., (1998) Plant J 116(1): 53-62 blz2 Onate et al. (1999) J Biol Chem 274(14):9175- 82 Promotor sintético Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J 13:629- 640 prolaminaNRP33 de arroz Wu et al., (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885- 889 globulina Glb-I de arroz Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885- 889 globulina REB/OHP-1 de arroz Nakase et al. (1997) Plant Molec Biol 33: 513- 522 ADP-glicose pirofosforilase de Russell et al. (1997) Trans Res 6:157-68 arroz família de gene ESR de milho Opsahl-Ferstadeia/. (1997) PlantJ 12:235-46 cafirina de sorgo DeRose et al. (1996) Plant Mol Biol 32:1029-35 Tabela 2e: Exemplos de promotores específicos para embrião:

Fonte de Gene Referência OSHl de arroz Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 8117-8122, 1996 KNOX Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999 PROOl 51 WO 2004/070039 PROO175 WO 2004/070039 PR0005 WO 2004/070039 PR00095 WO 2004/070039 Tabela 2f: Exemplos de promotores específicos para aleurona:

Fonte de Gene Referência α-amilase (Amy3 2b) Lanahan et al., Plant Cell 4:203-211, 1992; Skriver et al., ProcNatl Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991 Gene de Catepsina β- Cejudo et al., Plant Mol Biol 20:849-856, 1992 semelhante Ltp2 de cevada Kalla et al., Plant J. 6:849-60, 1994 Chi26 Leah et al., Plant J. 4:579-89, 1994 B-Peru de milho Selinger et al., Genetics 149;1125-38,1998 Um promotor específico de tecido verde como aqui definido é um promotor que é transcricionalmente ativo predominantemente em tecido verde, substancialmente excluindo quaisquer outras partes de uma planta, enquanto que ainda permite alguma expressão subnormal nestas outras partes de planta.

Exemplos de promotores específicos de tecido verde que podem ser usados para realizar os métodos da invenção são mostrados em Tabela 2g abaixo.

Tabela 2g: Exemplos de promotores específicos de tecido verde:

Gene Expressão Referência Ortofosfato diquinase de milho Especifico de folha Fukavama et al., 2001 Fosfoenolpiruvato carboxilase de milho Específico de folha Kausch et al.,2001 Fosfoenolpiruvato carboxilase de arroz Específico de folha Liu et al., 2003 Subunidade pequena de Rubisco de arroz Específico de folha Nomura et al., 2000 beta-expansina EXBP9 de arroz Específico de broto WO 2004/070039 subunidade pequena de Rubisco de guandu Específico de folha Panguluri et al., 2005 RBCS3A de ervilha Específico de folha Outro exemplo de um promotor específico de tecido é um promotor específico de meristema, que é transcricionalmente ativo predominantemente em tecido meristemático, substancialmente excluindo quaisquer outras partes de uma planta, enquanto que ainda permite alguma 5 expressão subnormal nestas outras partes de planta. Exemplos de promotores específicos de meristema verde que podem ser usados para realizar os métodos da invenção são mostrados em Tabela 2h abaixo.

Tabela 2h: Exemplos de promotores específicos de meristema

Fonte de Gene Padrão de expressão Referência OSHl de arroz Meristema apical de broto, do Sato et al. (1996) Proc. Natl. estágio globular de embrião ao Acad. Sei. USA, 93: 8117-8122 estágio de planta jovem Metalotioneína de Específico de meristema BAD87835.1 arroz WAKl & WAK 2 Meristemas apicais de raiz e Wagner & Kohom (2001) Plant broto, e em folhas e sépalas Cell 13(2): 303-318 em expansão Terminador

O termo "terminador" inclui uma seqüência de controle que é

uma seqüência de DNA na extremidade de uma unidade transcricional que sinaliza processamento 3' e poliadenilação de um transcrito primário e terminação de transcrição. O terminador pode ser derivado do gene natural, de uma variedade de outros genes de planta, ou de T-DNA. O terminador a ser 15 adicionado pode ser derivado de, por exemplo, genes de nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de outro gene de planta, ou menos preferivelmente de qualquer outro gene eucariótico.

(Gene) marcador selecionável / gene repórter

"Marcador selecionável", "gene marcador selecionável" ou " 20 gene repórter " inclui qualquer gene que concede um fenótipo a uma célula na qual é expressado para facilitar a identificação e/ou seleção de células que estão transfectadas ou transformadas com um construto de ácido nucleico da invenção. Estes genes marcadores permitem a identificação de uma transferência bem sucedida de moléculas de ácido nucleico via uma série de princípios diferentes. Marcadores adequados podem ser selecionados de marcadores que concedem resistência a herbicida ou antibiótico, que introduzem uma nova característica metabólica ou que permitem seleção visual. Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem genes que 5 concedem de resistência a antibióticos (tais como nptll que fosforila neomicina e canamicina, ou hpt, que fosforila higromicina, ou genes que concedem resistência a, por exemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina ou blasticidina), a herbicidas (por exemplo bar que fornece resistência a Basta®; 10 aroA ou gox que fornece resistência contra glifosato, ou os genes que concedem resistência a, por exemplo, imidazolinona, fosfinotricina ou sulfonil-uréia), ou genes que fornecem uma característica metabólica (tal como manA que permite que as plantas usem manose como a única fonte de carbono ou xilose isomerase para a utilização de xilose, ou marcadores anti15 nutritivos tal como a resistência à 2-desóxi-glicose). Expressão de genes marcadores visuais resulta na informação de cor (por exemplo βglicuronidase, GUS ou β-galactosidase com seus substratos coloridos, por exemplo X-Gal), luminescência (tal como o sistema luciferina/luceferase) ou fluorescência (Proteína Fluorescente Verde, GFP, e seus derivados). Esta lista 20 representa apenas um número pequeno de marcadores possíveis. O trabalhador experiente está familiarizado com tais marcadores. Marcadores diferentes são preferidos, dependendo do organismo e do método de seleção. Transgênico / transgene / recombinante

Para os propósitos da invenção, "transgênico", "transgene" ou 25 "recombinante" significa com relação, por exemplo, a uma seqüência de ácido nucleico, um cassete de expressão, construto de gene ou um vetor compreendendo a seqüência de ácido nucleico ou um organismo transformado com as seqüências de ácido nucleico, cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção, todas aquelas construções preparadas por métodos recombinantes nos quais qualquer uma de (a) as seqüências de ácido nucleico codificadoras de proteínas úteis nos métodos da invenção, ou(b) sequência(s) de controle genético que está(ão) operacionalmente ligada(s) na seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção, por exemplo um promotor, ou (c) 5 a) e b) não estão localizadas em seu ambiente genético natural ou têm sido modificadas por métodos recombinantes, sendo possível que a modificação tome a forma de, por exemplo, uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. O ambiente genético natural é entendido com o significado de o locus cromossômico ou genômico natural 10 na planta original ou a presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genômico natural da seqüência de ácido nucleico é preferivelmente mantido, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a seqüência de ácido nucleico pelo menos em um lado e tem um comprimento de seqüência de pelo menos 50 pb, preferivelmente pelo menos 15 500 pb, especialmente preferivelmente pelo menos 1000 pb, muito mais preferivelmente pelo menos 5000 pb. Um cassete de expressão naturalmente ocorrente - por exemplo a combinação naturalmente ocorrente do promotor natural das seqüências de ácido nucleico com a seqüência de ácido nucleico correspondente codificadora de um polipeptídeo útil nos métodos da presente 20 invenção, como definido acima - toma-se um cassete de expressão transgênico quando este cassete de expressão é modificado por métodos nãonaturais, sintéticos ("artificiais") tal como, por exemplo, tratamento mutagênico. Métodos adequados são descritos, por exemplo, em US 5.565.350 ou WO 00/15815.

Uma planta transgênica para os propósitos da invenção é

portanto entendida com o significado, como acima, de que os ácidos nucleicos usados no método da invenção não estão em seu locus natural no genoma de dita planta, sendo possível que os ácidos nucleicos sejam expressados homologamente ou heterologamente. Contudo, como mencionado, transgênico também significa que, embora os ácidos nucleicos de acordo com a invenção ou usados no método da invenção estejam em sua posição natural no genoma de uma planta, a seqüência tem sido modificada com relação à seqüência natural, e/ou que as seqüências regulatórias das seqüências naturais 5 têm sido modificadas. Transgênico é preferivelmente entendido com o significado de a expressão dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção em um locus não natural no genoma, i.e. ocorre expressão homóloga ou, preferivelmente, heteróloga dos ácidos nucleicos. Plantas transgênicas preferidas são aqui mencionadas.

Transformação

O termo "introdução" ou "transformação" como aqui referido inclui a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, sem considerar o método usado para transferência. Tecido de planta capaz de propagação clonal subsequente, quer por organogênese quer 15 por embriogênese, pode ser transformado com um construto genético da presente invenção em uma planta inteira regenerada do mesmo. O tecido particular escolhido variará dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis para, e melhor adaptado para, a espécie particular sendo transformada. Alvos de tecido exemplares incluem discos foliares, pólen, 20 embriões, cotilédones, hip ocótilos, megagametófitos, tecido de calo, tecido meristemático existente (e.g., meristema apical, botões axilares, e meristemas de raiz), e tecido de meristema induzido (e.g., meristema de cotilédone e meristema de hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser transientemente ou estavelmente introduzido em uma célula hospedeira e pode ser mantido não25 integrado, por exemplo, como um plasmídeo. Alternativamente, pode ser integrado no genoma do hospedeiro. A célula de planta transformada resultante pode ser então usada para regenerar uma planta transformada em uma maneira conhecida por pessoas experientes na arte.

A transferência de genes estranhos no genoma de uma planta é chamada de transformação. Transformação de espécie de planta é agora uma técnica regularmente rotineira. Vantajosamente, qualquer um de vários métodos de transformação pode ser usado para introduzir o gene de interesse em uma célula progenitora adequada. Os métodos descritos para a 5 transformação e a regeneração de plantas a partir de tecidos de planta ou de células de planta podem ser utilizados para transformação transiente ou estável. Métodos de transformação incluem o uso de lipossomos, eletroporação, agentes químicos que aumentam a absorção de DNA livre, injeção do DNA diretamente na planta, bombardeio por pistola de partículas, 10 transformação usando vírus ou pólen e microprojeção. Métodos podem ser selecionados do método de cálcio/poli(etileno-glicol) para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); eletroporação de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinjeção em material de planta 15 (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeio de partícula revestida com DNA ou RNA (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infecção com vírus (não-integrativos) e semelhantes. Plantas transgênicas, incluindo plantas de colheita transgênicas, são preferivelmente produzidas via transformação mediada por Agrobacterium. Um método de transformação 20 vantajoso é a transformação em planta. Para este fim, é possível, por exemplo, permitir que agrobactérias atuem em sementes de planta ou inocular o meristema de planta com agrobactérias. Tem sido provado particularmente conveniente de acordo com a invenção a permissão de que uma suspensão de agrobactérias transformadas atue sobre a planta intacta ou pelo menos sobre 25 primórdios de flor. A planta é subsequentemente crescida até que as sementes da planta tratada sejam obtidas (Clough e Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Métodos para transformação mediada por Agrobacterium de arroz incluem métodos bem conhecidos para transformação de arroz, tais como aqueles descritos em qualquer um dos seguintes: Pedido de Patente Européia EP 1198985 Al, Aldemita e Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cujas revelações são aqui incorporadas como referências como se fossem totalmente descritas. No caso de transformação de milho, o método 5 preferido é como descrito em quer Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745- 50, 1996) quer Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002), cujas revelações são aqui incorporadas como referências como se fossem totalmente descritas. Ditos métodos são adicionalmente descritos por meio de exemplo em B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic 10 Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Os ácidos nucleicos ou o construto a ser expressado é preferivelmente clonado em um vetor, que é adequado para transformação de Agrobacterium tumefaciens, por exemplo pBinl9 (Bevan et 15 al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobactérias transformadas por um tal vetor podem ser então usadas na maneira conhecida para a transformação de plantas, tais como plantas usadas como um modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana está dentro do escopo da presente invenção não considerada como uma planta de cultivo), ou plantas de colheita tais como, 20 por meio de exemplo, plantas de tabaco, por exemplo por imersão de folhas lesionadas ou folhas cortadas em uma solução de agrobactéria e então cultura delas em meio adequado. A transformação de plantas por meio de Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hofgen e Willmitzer em Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecida inter alia de F.F. White, 25 Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Em adição à transformação de células somáticas, que então têm que ser regeneradas em plantas intactas, é possível transformar as células de meristemas de planta e em particular aquelas células que se desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametas transformados seguem o desenvolvimento de planta natural, produzindo plantas transgênicas. Assim, por exemplo, sementes de Arabidopsis são tratadas com agrobactérias e 5 sementes são obtidas das plantas desenvolventes cuja uma proporção está transformada e portanto é transgênica [Feldman, KA e Marks AID (1987). Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992). Em: C Koncz, N-H Chua e J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289]. Métodos alternativos são baseados na remoção das 10 inflorescências e incubação do sítio de excisão no centro da roseta com agrobactérias transformadas, células transformadas deste modo podem ser igualmente obtidas em um instante de tempo mais tardio (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Contudo, um método especialmente eficaz é o método de infiltração a vácuo com suas 15 modificações tais como o método de "imersão floral". No caso de infiltração a vácuo de Arabidopsis, plantas intactas sob pressão reduzida são tratadas com uma suspensão agrobacteriana [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sei, 316: 1194-1199], enquanto que no caso do método de "imersão floral" o tecido floral desenvolvente é incubado brevemente com uma suspensão 20 agrobacteriana tratada com tensoativo [Clough, SJ e Bent, AF (1998). The Plant J. 16, 735-743]. Uma certa proporção de sementes transgênicas é colhida em ambos os casos, e estas sementes podem ser distinguidas de sementes não-transgênicas por crescimento sob as condições descritas acima. Em adição a transformação estável de plastídeos é vantajosa porque plastídeos 25 são maternalmente herdados na maioria das plantações reduzindo ou eliminando o risco de fluxo de transgene através do pólen. A transformação do genoma de cloroplasto é geralmente realizada por um processo que tem sido esquematicamente exibido em Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Resumidamente as seqüências a serem transformadas são clonadas juntas com um gene marcador selecionável entre seqüências flanqueadoras homólogas ao genoma de cloroplasto. Estas seqüências flanqueadoras homólogas dirigem a integração sítio-específica para dentro do plastoma. Transformação plastidal tem sido descrita para muitas espécies de 5 planta diferentes e uma visão geral é dada em Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology". J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425-38 ou Maliga, P (2003) "Progress towards commercialization of plastid transformation technology". Trends Biotechnol. 21, 20-28. Progresso biotecnológico adicional tem sido recentemente relatado na forma de 10 transformantes de plastídeo livres de marcador, que podem ser produzidos por um gene marcado co-integrado transiente (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

TILLING

TILLING ("Targeted Induced Local Lesions In Genomes") é 15 uma tecnologia de mutagênese útil para gerar e/ou identificar ácidos nucleicos codificadores de proteínas com atividade e/ou expressão modificada. TILLING também permite a seleção de plantas trazendo tais variantes mutantes. Estas variantes mutantes podem exibir expressão modificada, quer em força quer em localização quer em tempo adequado (se as mutações 20 afetam o promotor por exemplo). Estas variantes mutantes podem exibir atividade mais alta do que aquela exibida pelo gene em sua forma natural. TILLING combina métodos de mutagênese de densidade alta com métodos de triagem de produtividade alta. As etapas tipicamente seguidas em TILLING são: (a) mutagênese EMS (Redei GP e Koncz C (1992) Em Methods in 25 Arabidopsis Research, Koncz C, Chua ΝΉ, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et al, (1994) Em Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J e Caspar T (1998) Em J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) preparação e reunião de DNA de indivíduos; (c) amplificação por PCR de uma região de interesse; (d) desnaturação e anelamento para permitir a formação de heterodúplices; (e) DHPLC, onde a presença de um heteroduplex em uma reunião é detectada 5 como um pico extra no cromatograma; (f) identificação do indivíduo mutante; e (g) sequenciamento do produto mutante da PCR. Métodos para TILLING são bem conhecidos na arte (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455- 457; revisto por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

Rendimento

O termo "rendimento" em geral significa um produto

mensurável de valor econômico, tipicamente relacionado com uma colheita especificada, uma área especificada, e um período de tempo especificado. Partes de planta individuais contribuem diretamente para o rendimento baseado em seu número, tamanho e/ou peso, ou o rendimento real é o 15 rendimento por acre para uma colheita e ano, que é determinado pela divisão da produção total (inclui produção tanto colhida quanto estimada) por acres plantados.

Aumento / aperfeiçoamento / intensificação

Os termos "aumento", "aperfeiçoamento" ou "intensificação" 20 são intercambiáveis e devem significar no sentido do relatório descritivo pelo menos um rendimento e/ou crescimento de 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%, preferivelmente pelo menos 15% ou 20%, mais preferivelmente 25%, 30%, 35% ou 40% mais em comparação com as plantas de controle como aqui definidas.

Rendimento de semente

Rendimento de semente aumentado pode se manifestar como um ou mais dos seguintes: a) um aumento em biomassa de semente (peso total de semente) que pode ser de uma base de semente individual e/ou por planta e/ou por hectare ou acre; b) número aumentado de flores por planta; c) número aumentado de sementes (cheias); d) taxa de enchimento de semente aumentada (que é expressada como a razão entre o número de sementes cheias dividido pelo número total de sementes); e) índice de colheita aumentado, que é expressado como uma razão do rendimento de partes 5 colhíveis, tais como sementes, dividido pela biomassa total; e f) peso de mil sementes (TKW) aumentado, que é extrapolado do número de sementes cheias contado e de seu peso total. Um TKW aumentado pode resultar de um tamanho e/ou peso de semente aumentado, e também pode resultar de um aumento em tamanho de embrião e/ou endosperma.

Um aumento em rendimento de semente também pode ser

manifestado como um aumento em tamanho de semente e/ou volume de semente. Ademais, um aumento em rendimento de semente também pode se manifestar como um aumento em área de semente e/ou largura de semente e/ou perímetro de semente. Rendimento aumentado também pode resultar em 15 arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada. Planta

O termo "planta" como aqui usado inclui plantas inteiras, progenitoras e progênie das plantas e partes de planta, incluindo sementes, rebentos, caules, folhas, raízes (incluindo tubérculos), flores, e tecidos e 20 órgãos, sendo que cada um dos acima mencionados compreendem o gene / ácido nucleico de interesse. O termo "planta" também inclui células de planta, culturas em suspensão, tecido de calo, embriões, regiões meristemáticas, gametófitos, esporófitos, pólen, e microesporos, de novo sendo que cada um dos acima mencionados compreendem o gene / ácido nucleico de interesse.

Plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção

incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo forragem ou legumes de forragem, plantas ornamentais, plantações alimentícias, árvores ou arbustos selecionadas da lista compreendendo Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (e.g. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, 5 Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassiea spp. (e.g. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, turnip rape (nabo, Brassiea rapa)]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa 10 macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinetorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Cojfea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cueurbita spp., Cueumis spp., Cynara spp., Daueus earota, Desmodium spp., 15 Dimocarpus longan, Dioseorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (e.g. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuea arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glyeine spp. (e.g. Glyeine max, Soja hispida or Soja 20 max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (e.g. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiseus spp., Hordeum spp. (e.g. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuea sativa, Lathyrus spp., Lens eulinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Lujf a acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatiea, Lycopersicon spp. (e.g. Lyeopersieon eseulentum, 25 Lyeopersieon lycopersicum, Lyeopersieon pyriforme), Maerotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (e.g. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaea sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum erispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., 5 Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (e.g. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium or 10 Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (e.g. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybemum, Triticum macha, Triticum sativum or Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaeeinium spp., 15 Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., dentre outras.

Descrição detalhada da invenção I. HARPIN

De acordo com uma primeira modalidade, a presente invenção fornece um método para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas, compreendendo modular a expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo de Fator G associado a Harpin (daqui em diante denominado"HpaG").

Um método preferido para modular (preferivelmente, aumentar) a expressão de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG é pela introdução e expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG.

Qualquer referência daqui em diante a uma "proteína útil nos métodos da invenção" é tomada para significar um polipeptídeo HpaG como aqui definido. Qualquer referência daqui em diante a um "ácido nucleico útil nos métodos da invenção" é tomada para significar um ácido nucleico capaz de codificar um tal polipeptídeo HpaG. O ácido nucleico a ser introduzido em uma planta (e portanto útil na realização dos métodos da invenção) é qualquer 5 ácido nucleico codificador do tipo de proteína que agora será descrito, daqui em diante também denominado "ácido nucleico HpaG" ou "gene HpaG".

Um polipeptídeo HpaG como aqui definido compreende qualquer polipeptídeo tendo as seguintes características:

(i) em ordem crescente de preferência, pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de

identidade de seqüência com a seqüência de polipeptídeo HpaG representada pela SEQID NO: 2; e

(ii) uma composição de aminoácidos na qual o teor de glicina varia de entre cerca de 13% e cerca de 25%, o teor de glutamina varia de entre

cerca de 13% e cerca de 20%, o teor de cisteína varia de entre cerca de 0% e cerca de 1%, o teor de histidina varia de entre cerca de 0% e cerca de 1%, e sendo que triptofano está ausente.

Preferivelmente, o comprimento do polipeptídeo HpaG varia entre cerca de 121 e cerca de 143 aminoácidos.

Preferivelmente, a proteína HpaG também compreende o

motivo 1 conservado (SEQ ID NO: 3)

G (G/E/D) (N/E) X (Q/R/P) Q (A/S) GX (N/D) G sendo que X em posição 4 pode ser qualquer aminoácido, preferivelmente um de S, N, P, R, ou Q, e sendo que X em posição 9 pode ser qualquer aminoácido, preferivelmente um de Q, E, S, ou P; e/ou o motivo 2 conservado (SEQ ID NO: 4)

(P/A/V) S (P/Q/A) (F/L/Y) TQ (M/A) LM (H/N/Q) IV (G/M) (E/D/Q)

Opcionalmente, a proteína HpaG também tem o motivo 3 conservado:

QGISEKQLDQLL

E/ou o motivo 4 conservado:

ILQAQN

Ademais, polipeptídeos HpaG (pelo menos em sua forma

nativa) causam uma resposta hipersensível em Arabidopsis thaliana ecótipo Cvi-O (Kim et al., J. Bacteriol. 185, 3155-3166, 2003).

Alternativamente, o homólogo de uma proteína HpaG tem em ordem crescente de preferência pelo menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de seqüência total com o aminoácido representado pela SEQ ID NO: 2, desde que a proteína homóloga compreenda os motivos conservados como esboçados acima. A identidade de seqüência total é determinada usando um algoritmo de alinhamento global, tal como o algoritmo de Needleman Wunsch no programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), preferivelmente com parâmetros padrão. Comparada coma identidade de seqüência total, a identidade de seqüência geralmente será maior apenas quando motivos ou domínios conservados são considerados.

O termo "domínio" e "motivo" é como aqui definido na seção de "definições". Há banco de dados especializados para a identificação de 25 domínios, por exemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244, InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318, Prosite (Bucher e Bairoch (1994), "A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation". (Em) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004), ou Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 5 30(1): 276-280 (2002). Um conjunto de ferramentas para análise in silico de seqüências de proteína está disponível no servidor de proteômica ExPASY (hospedado pelo Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: "the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003)). Domínios também podem ser identificados 10 usando técnicas de rotina, tal como por alinhamento de seqüências.

Métodos para o alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na arte, tais métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar o alinhamento global (i.e. abarcando as 15 seqüências completas) de duas seqüências que maximiza o número de combinações e minimiza o número de lacunas. O algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula a identidade de seqüência percentual e realiza uma análise estatística da similaridade entre as duas seqüências. O programa de computador para realizar análise BLAST está 20 publicamente disponível através do National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Homólogos podem ser prontamente identificados usando, o algoritmo de alinhamento de múltiplas seqüências ClustalW (version 1.83), com os parâmetros de alinhamento pareado padrão, e um método de apresentar escore em percentagem. Percentagens globais de 25 similaridade e de identidade também podem ser determinadas usando um dos métodos disponíveis no pacote de programas de computador MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: "an application that generates similarity/identity matrices using protein ou DNA sequences"). Edição manual diminuta pode ser realizada para otimizar o alinhamento entre motivos conservados, como seria evidente para uma pessoa experiente na arte. Ademais, em vez do uso de seqüências de comprimento total para a identificação de homólogos, domínios específicos também podem ser usados. Os valores de identidade de seqüência podem ser determinados 5 sobre a seqüência de aminoácidos ou de ácido nucleico inteira ou sobre os domínios selecionados ou o(s) motivo(s) conservado(s), usando os programas mencionados acima utilizando os parâmetros padrão.

A presente invenção é ilustrada por plantas transformadas com a seqüência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 1, codificadora 10 da seqüência de polipeptídeo SEQ ID NO: 2. Contudo, realização da invenção não está restringida a estas seqüências; os métodos da invenção podem ser vantajosamente executados usando qualquer ácido nucleico codificador de HpaG ou qualquer polipeptídeo semelhante a HpaG como aqui definido.

Exemplos de ácidos nucleicos codificadores de polipeptídeos 15 HpaG são dados aqui em Tabela A de Exemplo I. Tais ácidos nucleicos são úteis na realização dos métodos da invenção. As seqüências de aminoácidos dadas em Tabela A de Exemplo 1 são seqüências exemplares de ortólogos e parálogos do polipeptídeo HpaG representado pela SEQ ID NO: 2, os termos "ortólogos" e "parálogos" sendo como aqui definidos. Outros ortólogos e 20 parálogos podem ser prontamente identificados pela realização de uma denominada pesquisa por blast recíproca. Tipicamente, esta envolve um primeiro BLAST envolvendo realização de BLAST de uma seqüência inquirida (por exemplo usando qualquer uma das seqüências listadas em Tabela A de Exemplo 1) contra qualquer banco de dados de seqüências, tal 25 como os bancos de dados NCBI publicamente disponíveis. BLASTN ou TBLASTX (usando valores pré-estabelecidos padrão) são geralmente usados quando se parte de uma seqüência de nucleotídeos, e BLASTP ou TBLASTN (usando valores pré-estabelecidos padrão) quando se parte de uma seqüência de proteína. Os resultados de BLAST podem ser opcionalmente filtrados. As seqüências de comprimento total quer dos resultados filtrados quer dos resultados não filtrados são então submetidos a BLAST de volta (segundo BLAST) contra seqüências do organismo do qual a seqüência inquirida é derivada (onde a seqüência inquirida é SEQ ID NO: I ou SEQ ID NO: 2, o 5 segundo BLAST seria portanto contra seqüências de Xanthomonas). Os resultados dos primeiro e segundo BLASTs são então comparados. Um parálogo é identificado se um sucesso de classificação alta do primeiro blast é da mesma espécie da qual a seqüência inquirida é derivada, um BLAST de volta então idealmente resulta na seqüência inquirida dentre os sucessos mais 10 altos; um ortólogo é identificado se um sucesso de classificação alta no primeiro BLAST não é da mesma espécie da qual a seqüência inquirida é derivada, e preferivelmente resulta do BLAST de volta na seqüência inquirida sendo dentre os sucessos mais altos.

Sucessos de classificação alta são aqueles tendo um valor E 15 baixo. Quanto menor o valor E, mais significativo o escore (ou em outras palavras menor a chance de que o sucesso foi encontrado por acaso). Computação do valor E é bem conhecida na arte. Em adição aos valores E, comparações também são registradas por identidade percentual. Identidade percentual refere-se ao número de nucleotídeos (ou aminoácidos) idênticos 20 entre as duas seqüências de nucleotídeos (ou aminoácidos) comparadas sobre um comprimento particular. No caso de famílias grandes, ClustalW pode ser usado, seguido por uma árvore filogenética, para ajudar a visualizar o agrupamento de genes relacionados e para identificar ortólogos e parálogos.

Variantes de ácido nucleico também podem ser úteis na prática 25 dos métodos da invenção. Exemplos de tais variantes incluem ácidos nucleicos codificadores de homólogos e derivados de qualquer uma das seqüências de aminoácidos dadas em Tabela A de Exemplo 1, os termos "homólogo" e "derivado" sendo como aqui definidos. Também úteis nos métodos da invenção são os ácidos nucleicos codificadores de homólogos e derivados de ortólogos ou parálogos de qualquer uma das seqüências de aminoácidos dadas em Tabela A de Exemplo 1. Homólogos e derivados úteis nos métodos da presente invenção têm substancialmente a mesma atividade biológica e funcional que a da proteína não modificada da qual são derivados.

Outras variantes de ácido nucleico úteis na prática dos

métodos da invenção incluem porções de ácidos nucleicos codificadores de polipeptídeos HpaG5 ácidos nucleicos que hibridizam com os ácidos nucleicos codificadores de polipeptídeos HpaG, e variantes de ácidos nucleicos codificadores de polipeptídeos HpaG obtidos por rearranjo de gene. Os 10 termos seqüência de hibridização, e rearranjo de gene são como aqui descritos.

r

Acidos nucleicos codificadores de polipeptídeos HpaG não necessitam ser ácidos nucleicos de comprimento total, porque a realização dos métodos da invenção não se baseia no uso de seqüências de ácido nucleico de 15 comprimento total. De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas, compreendendo introduzir e expressar em uma planta uma porção de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dadas em Tabela A de Exemplo 1, ou uma porção de um ácido nucleico codificador de um ortólogo, 20 parálogo ou homólogo de qualquer uma das seqüências de aminoácidos dadas em Tabela A de Exemplo 1.

Uma porção de um ácido nucleico pode ser preparada, por exemplo, por realização de uma ou mais deleções no ácido nucleico. As porções podem ser usadas na forma isolada ou podem ser fusionadas em 25 outras seqüências codificadoras (ou não-codificadoras) com o propósito de, por exemplo, produzir uma proteína que combina várias atividades. Quando fusionado em outras seqüências codificadoras, o polipeptídeo resultante produzido da tradução pode ser maior do que o predito para a porção de proteína. Porções úteis nos métodos da invenção, codificam um polipeptídeo HpaG como aqui definido, e têm substancialmente a mesma atividade biológica que a das seqüências de aminoácidos dadas em Tabela A de Exemplo 1. Preferivelmente, a porção é uma porção de qualquer um dos 5 ácidos nucleicos dados em Tabela A de Exemplo 1, ou é uma porção de um ácido nucleico codificador de um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das seqüências de aminoácidos dadas em Tabela A de Exemplo 1. Preferivelmente a porção é, em ordem crescente de preferência pelo menos de 70, 90, 110, 130 nucleotídeos consecutivos em comprimento, os nucleotídeos 10 consecutivos sendo de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dadas em Tabela A de Exemplo 1, ou de um ácido nucleico codificador de um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das seqüências de aminoácidos dadas em Tabela A de Exemplo I. Mais preferivelmente a porção é uma porção do ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. Preferivelmente, a porção codifica uma 15 seqüência de aminoácidos que quando usada na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela mostrada em Figura.2, tende a se agrupar com o grupo de polipeptídeos HpaG compreendendo a seqüência de aminoácidos representada pela SEQID NO: 2 em vez de com qualquer outro grupo.

Outra variante de ácido nucleico útil nos métodos da invenção é um ácido nucleico capaz de hibridizar, sob condições de estringência reduzida, preferivelmente sob condições estringentes, com um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG como aqui definido, ou com uma porção como aqui definida.

De acordo com a presente invenção, é fornecido um método 25 para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas, compreendendo introduzir e expressar em uma planta um ácido nucleico capaz de hibridizar com qualquer um dos ácidos nucleicos dados em Tabela A de Exemplo 1, ou compreendendo introduzir e expressar em uma planta um ácido nucleico capaz de hibridizar com um ácido nucleico codificador de um ortólogo, parálogo ou homólogo de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dadas em Tabela A de Exemplo 1.

Seqüências de hibridização úteis nos métodos da invenção codificam um polipeptídeo HpaG como aqui definido, e têm substancialmente 5 a mesma atividade biológica que a das seqüências de aminoácidos dadas em Tabela A de Exemplo 1. Preferivelmente, a seqüência de hibridização capaz de hibridizar com qualquer um dos ácidos nucleicos dados em Tabela A de Exemplo 1, ou com uma porção de qualquer uma destas seqüências, é uma porção sendo como definida acima, ou sendo que a seqüência de hibridização 10 é capaz de hibridizar com um ácido nucleico codificador de um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das seqüências de aminoácidos dadas em Tabela A de Exemplo I. Muito mais preferivelmente, a seqüência de hibridização é capaz de hibridizar com um ácido nucleico como representada pela SEQ ID NO: 1 ou com uma sua porção.

Preferivelmente, a seqüência de hibridização codifica uma

seqüência de aminoácidos que quando usada na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela mostrada em Figura 2, tende a se agrupar com o grupo de polipeptídeos HpaG compreendendo a seqüência de aminoácidos representada pela SEQID NO: 2 em vez de com qualquer outro grupo.

Rearranjo ou evolução dirigida de gene também pode ser

usada para gerar variantes de ácidos nucleicos codificadores de polipeptídeos HpaG como aqui definidos; o termo "rearranjo de gene " sendo como aqui definido.

De acordo com a presente invenção, é fornecido um método 25 para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas, compreendendo introduzir e expressar em uma planta a variante de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dadas em Tabela A de Exemplo 1, ou compreendendo introduzir e expressar em uma planta uma variante de um ácido nucleico codificador de um ortólogo, parálogo ou homólogo de qualquer uma das seqüências de aminoácidos dadas em Tabela A de Exemplo

1, cuja variante de ácido nucleico é obtida por rearranjo de gene.

Preferivelmente, a seqüência de aminoácidos codificada pela variante de ácido nucleico obtida por rearranjo de gene, quando usada na 5 construção de uma árvore filogenética tal como aquela mostrada em Figura 2, tende a se agrupar com o grupo de polipeptídeos HpaG compreendendo a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 em vez de com qualquer outro grupo.

Ademais, variantes de ácido nucleico também podem ser obtidas por mutagênese sítio-direcionada. Vários métodos estão disponíveis para realizar mutagênese sítio-direcionada, os mais comuns sendo métodos baseados em PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).

Ácidos nucleicos codificadores de polipeptídeos HpaG podem ser derivados de qualquer fonte natural ou artificial. O ácido nucleico pode ser 15 modificado de sua forma nativa em composição e/ou ambiente genômico através de manipulação humana deliberada. Preferivelmente o ácido nucleico codificador de polipeptídeo HpaG é de origem procariótica, preferivelmente de uma bactéria Gram-negativa possuindo um TTS S, adicionalmente preferivelmente de uma bactéria patogênica de planta possuindo um TTS S, 20 mais preferivelmente da família de Pseudomonaceae, adicionalmente preferivelmente do gênero Xanthomonas, muito mais preferivelmente o ácido nucleico é de Xanthomonas axonopodis.

Realização dos métodos da invenção dá plantas tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas. Em particular 25 realização dos métodos da invenção dá plantas tendo rendimento aumentado, especialmente biomassa aumentada e/ou rendimento de semente aumentado em relação às plantas de controle. Os termos "rendimento" e "rendimento de semente" são descritos aqui com mais detalhe na seção de "definições".

Referência aqui às características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas é tomada para significar um aumento em biomassa (peso) de uma ou mais partes de uma planta, que podem incluir partes acima do solo (capazes de serem colhidas) e/ou partes abaixo do solo (capazes de serem colhidas). Em particular, tais partes colhíveis são sementes, e a realização dos 5 métodos da invenção resulta em plantas tendo rendimento de semente aumentado em relação ao rendimento de semente de plantas de controle adequadas.

Tomando-se milho como um exemplo, um aumento de rendimento pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes: aumento no número de plantas por hectare ou acre, um aumento no número de espigas por planta, um aumento no número de filas, número de grãos por fila, peso de grãos, peso de mil grãos, comprimento/diâmetro de espiga, aumento na taxa de enchimento de semente (que é o número de sementes cheias dividido pelo número total de sementes e multiplicado por 100), dentre outros. Tomando-se arroz como um exemplo, um aumento de rendimento pode se manifestar como um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por hectare ou acre, número de panículas por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores (flósculos) por panícula (que é expressado como uma razão de número de sementes cheias sobre o número de panículas primárias), aumento na taxa de enchimento de semente (que é o número de sementes cheias dividido pelo número total de sementes e multiplicado por 100), aumento em peso de mil grãos, dentre outros.

A presente invenção fornece um método para aumentar o rendimento, especialmente a biomassa e/ou o rendimento de semente de 25 plantas, em relação às plantas de controle, cujo método compreende modular a expressão, preferivelmente aumentar a expressão, em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG como aqui definido. Deve ser notado que aumento de rendimento não é o resultado de resistência aumentada ao estresse biótico. Visto que as plantas transgênicas de acordo com a presente invenção têm rendimento aumentado, é provável que estas plantas exibam uma taxa de crescimento aumentada (durante pelo menos parte de seu ciclo de vida), em relação à taxa de crescimento de plantas de controle em um estágio 5 correspondente em seu ciclo de vida. Além da capacidade de rendimento aumentado, uma eficiência aumentada de absorção de nutrientes também pode contribuir para o aumento em rendimento. É observado que as planta de acordo com a presente invenção mostram uma eficiência mais alta em absorção de nutrientes.

A taxa de crescimento aumentada pode ser específica para uma

ou mais partes de uma planta (incluindo sementes), ou pode ser inteiramente substancialmente para a planta inteira. Plantas tendo uma taxa de crescimento aumentada pode ter um ciclo de vida mais curto. O ciclo de vida de uma planta pode ser considerado com o significado do tempo necessário para 15 crescimento de uma semente madura até o estágio onde a planta tem produzido sementes maduras, similar ao material inicial. Este ciclo de vida pode ser influenciado por fatores tais como vigor inicial, taxa de crescimento, índice de verdor, tempo de floração e velocidade de maturação de semente. O aumento em taxa de crescimento pode ocorrer em um ou mais estágios no 20 ciclo de vida de uma planta. Taxa de crescimento aumentada durante os estágios iniciais no ciclo de vida de uma planta pode refletir vigor intensificado. O aumento em taxa de crescimento pode alterar o ciclo de colheita de uma planta permitindo que plantas sejam semeadas mais tarde e/ou colhidas mais cedo do que de outro modo seria possível (um efeito 25 similar pode ser obtido com tempo de floração mais cedo). Se a taxa de crescimento é suficientemente aumentada, ela pode permitir a semeadura adicional de sementes da mesma espécie de planta (por exemplo semeadura e colheita de plantas de arroz seguidas por semeadura e colheita de outras plantas de arroz todas dentro de um período de crescimento convencional). Similarmente, se a taxa de crescimento é suficientemente aumentada, ela pode permitir semeadura adicional de sementes de espécies de plantas diferentes (por exemplo a semeadura e a colheita de plantas de milho seguidas por, por exemplo, a semeadura e a colheita opcional de feijão-soja, batateira ou 5 qualquer outra planta adequada). Tempos de colheita adicionais do mesmo rizoma no caso de algumas plantas de colheita também podem ser possíveis. Alteração do ciclo de colheita de uma planta pode levar a um aumento em produção de biomassa anual por acre (devido a um aumento no número de tempos (por exemplo em um ano) que qualquer planta particular pode ser 10 crescida e colhida). Um aumento em taxa de crescimento também pode permitir o cultivo de plantas transgênicas em uma área geográfica mais ampla do que a de suas contra-partes de tipo selvagem, porque as limitações territoriais para crescimento de uma colheita são muitas vezes determinadas pelas condições ambientais adversas quer no momento do plantio (estação 15 inicial) quer no momento da colheita (estação tardia). Tais condições adversas podem ser evitadas se o ciclo de colheita for encurtado. A taxa de crescimento pode ser determinada pela derivação de vários parâmetros de curvas de crescimento plotando-se experimentos de crescimento, tais parâmetros podem ser: T-Mid (o tempo demorado para as plantas alcançarem 50% de seu 20 tamanho máximo) e T-90 (tempo demorado para as plantas alcançarem 90% de seu tamanho máximo), dentre outros.

De acordo com uma característica preferida da presente invenção, realização dos métodos da invenção dá plantas tendo uma taxa de crescimento aumentada em relação às plantas de controle. Portanto, de acordo 25 com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar a taxa de crescimento de plantas, cujo método compreende modular a expressão, preferivelmente aumentar a expressão, em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG como aqui definido. Deve ser notado que o aumento na taxa de crescimento não é o resultado de resistência ao estresse biótico.

Um aumento em rendimento e/ou taxa de crescimento ocorre se a planta está sob condições de não-estresse ou se a planta é exposta a vários estresses abióticos comparada com as plantas de controle. Plantas tipicamente respondem à exposição ao estresse abiótico pelo crescimento mais lento. Em condições de estresse severo, a planta pode até mesmo parar inteiramente de crescer. Estresse suave por outro lado é aqui definido como sendo qualquer estresse ao qual uma planta é exposta que não resulta na cessação da planta em crescer inteiramente sem a capacidade para continuar a crescer. Estresse suave no sentido da invenção acarreta uma redução no crescimento das plantas estressadas de menos do que 40%, 35% ou 30%, preferivelmente menos do que 25%, 20% ou 15%, mais preferivelmente menos do que 14%, 13%, 12%, 11% ou 10% ou menos em comparação com a planta de controle sob condições de não-estresse. Devido aos avanços em práticas agrícolas (irrigação, fertilização, tratamentos com pesticida) estresses severos não são frequentemente encontrados em plantas de colheita cultivadas. Como uma conseqüência, o crescimento comprometido induzido por estresse suave é frequentemente uma característica indesejada para agricultura. O termo "estresses suaves" refere-se aos estresses abióticos (do ambiente) de cada dia aos quais uma planta é exposta. Estresses abióticos podem ser devido à estiagem ou ao excesso de água, estresse anaeróbico, estresse salino, toxicidade química, estresse oxidativo e temperaturas congelantes, quentes ou frias. O estresse abiótico pode ser então um estresse osmótico causado por um estresse aquoso (particularmente devido à estiagem), excesso de sal, estresse oxidativo ou um estresse iônico.

O termo "estresse abiótico" como aqui definido é tomado para significar qualquer um ou mais de: estresse aquoso (devido à estiagem ou ao excesso de água), estresse anaeróbico, estresse salino, estresse de temperatura (devido às temperaturas quentes, frias ou congelantes), estresse de toxicidade química e estresse oxidativo. De acordo com um aspecto da invenção, o estresse abiótico é um estresse osmótico, selecionado de estresse aquoso, estresse salino, estresse oxidativo e estresse iônico. Preferivelmente, o estresse aquoso é estresse de estiagem. O termo estresse salino não é restrito 5 ao sal comum (NaCl), mas pode ser qualquer um ou mais de: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2, dentre outros.

Outro exemplo de estresse ambiental abiótico é a disponibilidade reduzida de um ou mais nutrientes que necessitam ser assimilados pelas plantas para crescimento e desenvolvimento. Devido à influência forte da eficiência de utilização de nutrição sobre o rendimento de planta e a qualidade de produto, uma quantidade enorme de fertilizante é derramada nos campos para otimizar o crescimento e a qualidade da planta. Produtividade de plantas é ordinariamente limitada por três nutrientes principais, fósforo, potássio e nitrogênio, que destes três é costumeiramente o elemento limitante de velocidade em crescimento de planta. Portanto o elemento nutriente principal exigido para crescimento de planta é nitrogênio (N). Ele é um constituinte de numerosos compostos importantes encontrados em células vivas, incluindo aminoácidos, proteínas (enzimas), ácidos nucleicos, e clorofila. 1,5% a 2% da matéria seca de planta é nitrogênio e aproximadamente 16% da proteína de planta total. Assim, disponibilidade de nitrogênio é um fator limitante maior para produção e crescimento de planta de cultivo (Frink et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(4): 1175-1180), e tem como um impacto maior sobre o acúmulo de proteína e a composição de aminoácidos. Portanto, de interesse maior são as plantas de colheita com um rendimento aumentado quando crescidas sob condições limitantes de nitrogênio.

Estresses bióticos são tipicamente aqueles estresses causados por patógenos, tais como bactérias, vírus, fungos, nematódeos e insetos.

Em particular, os métodos da presente invenção podem ser realizados sob condições de não-estresse ou sob condições de estiagem para dar plantas tendo rendimento aumentado em relação às plantas de controle. Como relatado em Wang et al. (Planta (2003) 218: 1-14), estresse abiótico causa uma série de mudanças morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e 5 moleculares que adversamente afetam crescimento e produtividade de planta.

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E sabido que estresses de estiagem, salinidade, temperaturas extremas e oxidativo estão interconectados e podem induzir crescimento e dano celular através de mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) descrevem um grau particularmente alto de "conversa cruzada" 10 entre estresse de estiagem e estresse de salinidade alta. Por exemplo, estiagem e/ou salinização são manifestadas primariamente como estresse osmótico, resultando na disrupção de homeostasia e distribuição de íons na célula. Estresse oxidativo, que frequentemente acompanha temperatura alta ou baixa, estresse de salinidade ou estiagem, pode causar desnaturação de proteínas 15 funcionais e estruturais. Como uma conseqüência, estes diversos estresses ambientais frequentemente ativam rotas de sinalização de célula e respostas celulares, tais como a produção de proteínas de estresse, supra-regulação de antioxidantes, acúmulo de solutos compatíveis e parada de crescimento.

O termo condições de "não-estresse" como aqui usado significa aquelas condições ambientais que permitem o crescimento ótimo de plantas. Pessoas experientes na arte estão cientes das condições climáticas e de solo normas para qualquer dada localização.

Realização dos métodos da invenção dá plantas, crescidas sob condições de não-estresse ou sob condições de estresse de estiagem, 25 rendimento aumentado relativo às plantas de controle sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento em plantas crescidas sob condições de não-estresse ou condições de estiagem, cujo método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG.

Ademais, a realização dos métodos da invenção dá plantas crescidas sob condições de deficiência de nutriente, particularmente sob condições de deficiência de nitrogênio, rendimento aumentado em relação às 5 plantas de controle crescidas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, também é fornecido um método para aumentar o rendimento em plantas crescidas sob condições de deficiência de nutriente, cujo método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG.

A realização dos métodos da invenção também dá plantas

tendo vigor de planta aumentado em relação às plantas de controle, particularmente durante os estágios iniciais de desenvolvimento da planta (tipicamente três, quatro semanas após germinação no caso de arroz e milho, mas isto variará de espécie para espécie) causando o vigor inicial. Portanto, de 15 acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar o vigor inicial de planta, cujo método compreende modular, preferivelmente aumentar, a expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG. Preferivelmente o aumento em vigor de planta jovem é realizado pela expressão do ácido nucleico codificador do polipeptídeo HpaG 20 sob o controle de um promotor específico de broto. Também é fornecido um método para produzir plantas tendo vigor inicial em relação às plantas de controle, cujo método compreende modular, preferivelmente aumentar, a expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG.

Vigor inicial também pode resultar de aptidão de planta

aumentada devido a, por exemplo, as plantas estarem melhor adaptadas ao seu ambiente (i.e. otimização do uso de recursos de energia e partição entre broto e raiz). Plantas tendo vigor inicial também mostram sobrevivência de planta jovem aumentada e um melhor estabelecimento da plantação, que frequentemente resulta em campos elevadamente uniformes (com plantação crescendo em maneira uniforme, i.e. com a maioria das plantas alcançando os vários estágios de desenvolvimento substancialmente ao mesmo tempo), e frequentemente rendimento melhor e maior. Portanto, vigor inicial pode ser 5 determinado por medição de vários fatores, tais como peso de mil sementes, germinação percentual, emergência percentual, crescimento de planta jovem, altura de planta jovem, comprimento de raiz, biomassa de raiz e broto e muito mais.

A presente invenção inclui plantas ou suas partes (incluindo sementes) obteníveis pelos métodos de acordo com a presente invenção. As plantas ou suas partes compreendem um ácido nucleico transgênico codificador de um polipeptídeo HpaG como definido acima.

A invenção também fornece vetores e construtos genéticos para facilitar a introdução e/ou a expressão em plantas de ácidos nucleicos 15 codificadores de polipeptídeos HpaG. Os construtos de gene podem ser inseridos em vetores, que podem estar comercialmente disponíveis, adequados para transformação em plantas e adequados para expressão do gene de interesse nas células transformadas. A invenção também fornece o uso de um construto de gene como aqui definido nos métodos da invenção.

Mais especificamente, a presente invenção fornece um

construto compreendendo:

(a) um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG como definido acima;

(b) uma ou mais seqüências de controle capazes de dirigir a expressão da seqüência de ácido nucleico de (a); e opcionalmente

(c) uma seqüência de terminação de transcrição.

Preferivelmente, o ácido nucleico codificador de HpaG é

(i) um ácido nucleico como apresentado por SEQ ID NO: 1 ou o seu complemento, (ii) um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG como definido acima.

Os termos "seqüência de controle " e "seqüência de terminação" são como aqui definidos.

Plantas são transformadas com um vetor compreendendo 5 qualquer um dos ácidos nucleicos descritos acima. O técnico experiente está bem ciente dos elementos genéticos que precisam estar presentes no vetor com o propósito de bem sucedidamente transformar, selecionar e propagar as células hospedeiras contendo qualquer um dos ácidos nucleicos descritos acima. O técnico experiente está bem ciente dos elementos genéticos que 10 precisam estar presentes no vetor com o propósito de bem sucedidamente transformar, selecionar e propagar as células hospedeiras contendo a seqüência de interesse. A seqüência de interesse está operacionalmente ligada em uma ou mais seqüências (pelo menos em um promotor).

Vantajosamente, qualquer tipo de promotor, seja natural seja sintético, pode ser usado para dirigir a expressão da seqüência de ácido nucleico. Um promotor constitutivo ou um promotor específico de tecido verde é particularmente útil nos métodos, veja a seção de "Definições" aqui para definições dos vários tipos de promotor.

Preferivelmente, o ácido nucleico HpaG ou sua variante está 20 operacionalmente ligado em um promotor constitutivo. Um promotor constitutivo preferido é um que também é substancialmente ubiquamente expressado. Adicionalmente preferivelmente o promotor é derivado de uma planta, mais preferivelmente de uma planta monocotiledônea. Muito mais preferido é o uso de um promotor GOS2 (de arroz) (SEQ ID NO: 5). Deve 25 ficar claro que a aplicabilidade da presente invenção não é restringida ao ácido nucleico HpaG representado pela SEQ ID NO: 1, nem é a aplicabilidade da invenção restringida à expressão de um ácido nucleico HpaG quando dirigida por um promotor GOS2. Exemplos de outros promotores constitutivos que também podem ser usados para dirigir a expressão de um ácido nucleico HpaG são aqui mostrados em Tabela 2a na seção Definições.

Preferivelmente, o promotor constitutivo é de força média e tem atividade mais fraca do que o promotor CaMV 35S.

Alternativamente, o ácido nucleico HpaG ou sua variante está

operacionalmente ligado em um promotor específico de tecido verde. Um promotor específico de tecido verde como aqui definido é um promotor que é transcricionalmente ativo predominantemente em tecido verde, substancialmente excluindo quaisquer outras partes de uma planta, enquanto 10 que ainda permite alguma expressão subnormal nestas outras partes de planta. O promotor específico de tecido verde é preferivelmente um promotor de protoclorofilida redutase, mais preferivelmente o promotor de protoclorofilida redutase representado por uma seqüência de ácido nucleico substancialmente similar à SEQ ID NO: 6, muito mais preferivelmente o promotor é como 15 representado pela SEQ ID NO: 6. Deve ficar claro que a aplicabilidade da presente invenção não é restrita ao ácido nucleico codificador de HpaG representado pela SEQ ID NO: 1, nem a aplicabilidade da invenção é restrita à expressão de um tal ácido nucleico codificador de HpaG quando dirigida por um promotor de protoclorofilida redutase. Exemplos de outros promotores 20 específicos de tecido verde que também podem ser usados para realizar os métodos da invenção são mostrados aqui na seção de definições.

Para a identificação de promotores funcionalmente equivalentes, o padrão de expressão e/ou a força do promotor de um promotor candidato podem ser analisados por exemplo por ligação operacional do 25 promotor em um gene repórter e ensaio dos padrão e nível de expressão do gene repórter em vários tecidos da planta. Genes repórter bem conhecidos adequados incluem por exemplo beta-glicuronidase ou beta-galactosidase. A atividade do promotor é ensaiada pela medição da atividade enzimática da beta-glicuronidase ou beta-galactosidase. O padrão de expressão e/ou a força do promotor pode ser então comparado com aquele de um promotor de referência (tal como aqueles usado nos métodos da presente invenção). Alternativamente, força de promotor pode ser ensaiada por quantificação dos níveis de mRNA ou por comparação dos níveis de mRNA do ácido nucleico usado nos métodos da presente invenção, com níveis de mRNA de genes housekeeping tal como 18S rRNA, usando métodos conhecidos na arte, tal como Northern blotting com análise densitométrica de autorradiogramas, PCR em tempo real quantitativa ou RT-PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Geralmente um "promotor fraco" refere-se a um promotor que dirige a expressão de uma seqüência codificadora em um nível baixo. "Nível baixo" é intencionado em níveis de cerca de 1/10.000 transcritos a cerca de 1/100.000 transcritos, a cerca de 1/5.000.000 transcritos por célula. De modo inverso, um "promotor forte" dirige a expressão de uma seqüência codificadora em nível alto, ou a cerca de 1/10 transcritos a cerca de 1/100 transcritos a cerca de 1/1.000 transcritos por célula.

Opcionalmente, uma ou mais seqüências de terminador podem ser usadas no construto introduzido em uma planta. Elementos regulatórios adicionais podem incluir intensificadores tanto de transcrição quanto de tradução. Aquelas pessoas experientes na arte estarão cientes das seqüências 20 de terminador e de intensificador que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. Tais seqüências seriam conhecidas ou poderiam ser prontamente obtidas por uma pessoa experiente na arte.

Uma seqüência de íntron também pode ser adicionada na região 5' - não-traduzida (UTR) ou na seqüência codificadora para aumentar a 25 quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol. Tem sido mostrado que a inclusão de um íntron editorável na unidade de transcrição em ambos os construtos de expressão em planta e em animal aumenta a expressão de gene em níveis tanto de mRNA quando de proteína em até 1.000-vezes (Buchman e Berg, Mol. Cell Biol. 8:4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987)). Tal intensificação por íntron da expressão de gene é tipicamente mais alta quando posicionada próxima da extremidade 5' da unidade de transcrição. É conhecido na arte o uso de íntrons de milho Adhl-S íntron 1, 2, e 6, íntron Bronze-1. Para informação geral, veja The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Outras seqüências de controle (além de seqüências de promotor, intensificador, silenciador, íntron, regiões 3'UTR e/ou 5'UTR) podem ser elementos estabilizadores de proteína e/ou de RNA. Tais seqüências seriam conhecidas ou podem ser prontamente obtidas por uma 10 pessoa experiente na arte. Ademais, o uso de códon da seqüência codificadora a ser inserida no construto pode ser otimizado com referência à célula hospedeira na qual o construto será introduzido. Enquanto o código genético está degenerado, organismos tendem a usar um códon particular para um aminoácido diferente de outros códons para aquele mesmo aminoácido. 15 Tabelas com uso de códon preferido para vários organismos são conhecidas na arte.

Os construtos genéticos da invenção podem adicionalmente incluir uma seqüência de origem de replicação que é exigida para manutenção e/ou replicação em um tipo de célula específico. Um exemplo é quando um 20 construto genético é exigido para ser mantido em uma célula bacteriana como um elemento genético epissomal (e.g. molécula de plasmídeo ou cosmídeo). Origens de replicação preferidas incluem, mas não são limitadas a, fl-ori e colEl.

Para a detecção da transferência bem sucedida das seqüências 25 de ácido nucleico como usadas nos métodos da invenção e/ou seleção de plantas transgênicas compreendendo estes ácidos nucleicos, é vantajoso usar genes marcadores (ou genes repórter). Portanto, o construto genético pode opcionalmente compreender um gene marcador selecionável. Marcadores selecionáveis são descritos aqui com mais detalhe na seção de "definições". Também é sabido que sob integração transiente ou estável de ácidos nucleicos nas células de planta, apenas uma minoria das células captura o DNA estranho e, se desejado, o integra em seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e da técnica de transfecção utilizada. Para 5 identificar e selecionar estes integrantes, um gene codificador de um marcador selecionável (tal como aquele descrito acima) é costumeiramente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Estes marcadores podem ser por exemplo usados em mutantes nos quais estes genes não são funcionais por, por exemplo, deleção por métodos convencionais. 10 Ademais, moléculas de ácido nucleico codificadoras de um marcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesmo vetor que compreende a seqüência codificadora dos polipeptídeos da invenção ou usadas nos métodos da invenção, ou então em um vetor separado. Células que têm sido estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido 15 podem ser identificadas por exemplo por seleção (por exemplo, células que têm integrado o marcador selecionável sobrevivem enquanto que as outras células morrem).

Visto que os genes marcadores, particularmente os genes para resistência a antibióticos e herbicidas, não são mais exigidos ou são 20 indesejados na célula hospedeira transgênica uma vez tendo sido introduzidos com sucesso os ácidos nucleicos, o processo de acordo com a invenção para introdução dos ácidos nucleicos vantajosamente emprega técnicas que permitem a remoção ou excisão destes genes marcadores. Um tal método é o que é conhecido como co-transformação. O método de co-transformação 25 utiliza dois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor possuindo o ácido nucleico de acordo com a invenção e um segundo vetor possuindo o(s) gene(s) marcador(es). Uma proporção grande de transformantes recebe ou, no caso de plantas, compreende (até 40% ou mais dos transformantes), ambos vetores. No caso da transformação com Agrobactérias, os transformantes costumeiramente recebem apenas uma parte do vetor, i.e. a seqüência flanqueada pelo T-DNA, que costumeiramente representa o cassete de expressão. Os genes marcadores podem ser subsequentemente removidos da planta transformada por realização de 5 cruzamentos. Em outro método, genes marcadores integrados em um transposon são usados para a transformação juntos com o ácido nucleico desejado (conhecida como a tecnologia Ac/Ds). Os transformantes podem ser cruzados com uma fonte de transposase ou os transformantes são transformados com um construto de ácido nucleico que concede expressão de 10 uma transposase, transientemente ou estável. Em alguns casos (aproximadamente 10%), o transposon pula para fora do genoma da célula hospedeira uma vez tendo ocorrido com sucesso a transformação e é perdido. Em numerosos outros casos, o transposon pula para uma localização diferente. Nestes casos o gene marcador precisa ser eliminado por realização 15 de cruzamentos. Em microbiologia, foram desenvolvidas técnicas que possibilitam ou facilitam, a detecção de tais eventos. Um outro método vantajoso baseia-se no que é conhecido como sistemas de recombinação; cuja vantagem é que eliminação por cruzamento pode ser omitida. O sistema melhor conhecido deste tipo é o que é conhecido como o sistema Cre/lox. 20 Crel é uma recombinase que remove as seqüências localizadas entre as seqüências IoxP. Se o gene marcador está integrado entre as seqüências IoxP, ele é removido uma vez tendo ocorrido com sucesso a transformação, por expressão da recombinase. Outros sistemas de recombinação são os sistemas HIN/fflX, FLP/FRT e REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 25 22255-22267; Velmurugan et al, J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Uma integração sítio-específica no genoma de planta das seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção é possível. Naturalmente, estes métodos também podem ser aplicados em microorganismos tais como levedura, fungos ou bactérias. A invenção também fomece um método para a produção de plantas transgênicas tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação às plantas de controle, compreendendo introdução e expressão em uma planta de qualquer ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG como definido aqui acima.

Mais especificamente, a presente invenção fomece um método para a produção de plantas transgênicas tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas aumentadas, particularmente biomassa e/ou rendimento de semente aumentada(o), cujo método compreende:

(i) introduzir e expressar em uma planta ou célula de planta um

ácido nucleico codificador de polipeptídeo HpaG; e

(ii) cultivar a célula de planta sob condições que promovem o crescimento e o desenvolvimento da planta.

O ácido nucleico de (i) pode ser qualquer um dos ácidos nucleicos capazes de codificarem um polipeptídeo HpaG como aqui definido.

O ácido nucleico pode ser introduzido diretamente em uma célula de planta ou na própria planta (incluindo introdução em um tecido, órgão, ou qualquer outra parte de uma planta). De acordo com uma característica preferida da presente invenção, o ácido nucleico é 20 preferivelmente introduzido em uma planta por transformação. O termo "transformação" é aqui descrito com mais detalhe na seção de "definições".

As células de planta geneticamente modificadas podem ser regeneradas via todos os métodos com os quais o trabalhador experiente está familiarizado. Métodos adequados podem ser encontrados nas publicações acima mencionadas por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hofgen e Willmitzer.

Geralmente após a transformação, as células de planta ou os agrupamentos de células são selecionadas(os) para a presença de um ou mais marcadores que são codificados pelos genes expressáveis em planta cotransfectados com o gene de interesse, após o qual o material transformado é regenerado em uma planta inteira. Para selecionar plantas transformadas, o material de planta obtido na transformação é, como uma regra, submetido às condições seletivas de modo que as plantas transformadas possam ser 5 distinguidas das plantas não-transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas na maneira descrita acima podem ser plantadas e, após um período de crescimento inicial, submetidas a uma seleção adequada por borrifo. Uma outra possibilidade consiste em crescimento das sementes, se apropriado após esterilização, sobre placas de ágar usando um agente de seleção adequado de 10 modo que apenas as sementes transformadas possam crescer em plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são selecionadas para a presença de um marcador selecionável tal como aqueles descritos acima.

Após transferência de DNA e regeneração, plantas putativamente transformadas também podem ser avaliadas, por exemplo 15 usando análise de Southern, para a presença do gene de interesse, número de cópias e/ou organização genômica. Alternativamente ou adicionalmente, níveis de expressão do DNA recém introduzido podem ser monitorados usando análise de Northern e/ou Western, ambas as técnicas sendo bem conhecidas por aquelas pessoas ordinariamente experientes na arte.

As plantas transformadas geradas podem ser propagadas por

uma variedade de meios, tais como por técnicas de geração clássica ou propagação clonal. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou Tl) pode ser auto-fertilizada e transformantes homozigóticos de segunda geração (ou T2) selecionados, e as plantas T2 podem ser então depois propagadas através de técnicas de geração clássicas.

Os organismos transformados gerados podem adquirir uma variedade de formas. Por exemplo, podem ser quimeras de células transformadas e células não-transformadas; transformantes clonais (e.g., todas as células transformadas para conterem o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não-transformados (e.g., em plantas, um rizoma transformado enxertado em um rebento não-transformado).

A presente invenção claramente se estende a qualquer célula de planta ou planta produzida por qualquer um dos métodos aqui descritos, e a 5 todas as partes de planta e seus propágulos. A presente invenção se estende adicionalmente para incluir a progênie de uma célula, tecido, órgão ou planta inteira transfectada ou transformada primária que tem sido produzida por qualquer um dos métodos acima mencionados, a única exigência sendo que a progênie exiba a(s) mesma(s) característica(s) genotípica(s) e/ou fenotípica(s) 10 que daquelas produzidas pela planta parental nos métodos de acordo com a invenção.

A invenção também inclui células hospedeiras contendo um ácido nucleico isolado codificador de um polipeptídeo HpaG como definido aqui acima. Células hospedeiras preferidas de acordo com a invenção são 15 células de planta. Plantas hospedeiras para os ácidos nucleicos ou o vetor usados no método de acordo com a invenção, o vetor ou construto ou cassete de expressão são, em princípio, vantajosamente todas as plantas, que são capazes de sintetizar os polipeptídeos usando no método da invenção.

Os métodos da invenção são vantajosamente aplicáveis a qualquer planta.

Plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo forragem ou legumes de forragem, plantas ornamentais, plantações alimentícias, árvores 25 ou arbustos. De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a planta é uma planta de cultivo. Exemplos de plantas de colheita incluem feijão-soja, girassol, canola, alfafa, colza, algodoeiro, tomateiro, batateira e tabaco. Adicionalmente preferivelmente, a planta é uma planta monocotiledônea. Exemplo de planta monocotiledônea inclui cana-de-açúcar. Mais preferivelmente a planta é um cereal. Exemplos de cereais incluem arroz, milho, trigo, cevada, painço, triticale, centeio, sorgo e aveia.

A invenção também se estende às partes colhíveis de uma planta tais como, mas não limitadas a sementes, folhas, frutas, flores, caules, 5 rizomas, tubérculos e bulbos. A invenção adicionalmente se refere aos produtos derivados, preferivelmente diretamente derivados, de uma parte capaz de ser colhida de uma tal planta, tal como pelotas ou pós secos, óleo, gordura e ácidos graxos, amido ou proteínas.

De acordo com uma característica preferida da invenção, a expressão modulada é expressão aumentada. Métodos para aumentar a expressão de ácidos nucleicos ou genes, ou produtos de gene, estão bem documentados na arte e incluem, por exemplo, sobre-expressão dirigida por promotores apropriados, o uso de intensificadores de tradução ou

r

intensificadores de transcrição. Acidos nucleicos isolados que servem como 15 elementos promotores ou intensificadores podem ser introduzidos em uma posição apropriada (tipicamente a montante) de uma forma não-heteróloga de um polinucleotídeo de modo a supra-regular a expressão. Por exemplo, promotores endógenos podem ser alterados in vivo por mutação, deleção, e/ou substituição (veja, Kmiec, Pat. U.S. No. 5.565.350; Zarling et al, 20 PCT/US93/03868), ou promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula de planta nas orientação e distâncias apropriadas de um gene da presente invenção de modo a controlar a expressão do gene.

Se expressão de polipeptídeo é desejada, é geralmente desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade-3' de uma 25 região codificadora de polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de genes de planta, ou de T-DNA. A seqüência de extremidade 3' a ser adicionada pode ser derivada de, por exemplo, os genes de nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de outro gene de planta, ou menos preferivelmente de qualquer outro gene eucariótico.

A presente invenção também inclui o uso de ácidos nucleicos codificadores de polipeptídeos HpaG como aqui descritos e o uso destes polipeptídeos HpaG em intensificação de qualquer uma das características relacionadas com rendimento acima mencionadas em plantas.

Os métodos de acordo com a presente invenção resultam em plantas tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas, como descrito aqui acima. Estas características também podem ser combinadas com outras características economicamente vantajosas, tais como outras 10 características intensificadoras de rendimento, tolerância a outros estresses bióticos e abióticos, características modificadoras de várias características arquitetônicas e/ou características bioquímicas e/ou fisiológicas.

II. SNF2

De acordo com uma primeira modalidade, a presente invenção fomece um método para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas em relação às plantas de controle, compreendendo aumentar a expressão em uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2.

Um método preferido para aumentar a expressão de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 é pela introdução e expressão em uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2.

Qualquer referência daqui em diante a uma "proteína útil nos métodos da invenção" é tomada para significar um polipeptídeo SWI2/SNF2 25 como aqui definido. Qualquer referência daqui em diante a uma "seqüência de ácido nucleico útil nos métodos da invenção" é tomada para significar uma seqüência de ácido nucleico capaz de codificar um tal polipeptídeo SWI2/SNF2. A seqüência de ácido nucleico a ser introduzida em um planta (e portanto útil na realização dos métodos da invenção) é qualquer seqüência de ácido nucleico codificadora do tipo de proteína, que agora será descrita, daqui em diante também chamada de "seqüência de ácido nucleico SWI2/SNF2" ou " gene SWI2/SNF2 ".

Um "polipeptídeo SWI2/SNF2" como aqui definido refere-se a qualquer polipeptídeo que compreende um domínio de ATPase compreendendo da terminação-N até a terminação-C pelo menos cinco, preferivelmente seis, mais preferivelmente sete, muito mais preferivelmente oito dos seguintes motivos:

(i) Motivo I LADDMGLGK(T/S), como representado pela

SEQ ID NO: 103 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência

pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo I;

(ii) Motivo Ia L(L/V/I)(V/I/L)(A/C)P(T/M/V)S(V/I/L) (V/I/L) XNW, como representado pela SEQ ID NO: 104 ou um motivo tendo em

ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo Ia;

(iii) Motivo II DEAQ(N/A/H)(V/I/L)KN, como representado pela SEQ ID NO: 105 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência

pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo II;

(iv) Motivo III A(L/M)TGTPXEN, como representado pela SEQ ID NO: 106 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%,

99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo III;

(v) Motivo IV (L/I)XF(T/S)Q(F/Y), como representado pela SEQ ID NO: 107 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo IV; (vi) Motivo V S(LA/)KAGG(V/T/L)G(L/I)(N/T) LTXA (N/S/T)HV, como representado pela SEQ ID NO: 108 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência

com a seqüência de Motivo V;

(vii) Motivo Va DRWWNPAVE, como representado pela SEQ ID NO: 109 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo Va; e

(viii) Motivo VI QA(T/S)DR(A/TA/)(F/Y)R(I/L)GQ, como

representado pela SEQ ID NO: 110 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo VI,onde X em Motivo Ia, Motivo III, Motivo IV, e Motivo V, é qualquer aminoácido.

Alternativamente ou adicionalmente, um "polipeptídeo SWI2/SNF2" como aqui definido refere-se a qualquer seqüência de polipeptídeo que quando usada na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela mostrada em Figura 7 (descrita em Flaus et al. (2006), supra), 20 tende a agrupar com o ciado SS01653depolipeptídeos SWI2/SNF2 compreendendo a seqüência de polipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 30, em vez de com qualquer outro ciado SWI2/SNF2.

Alternativamente ou adicionalmente, um "polipeptídeo SWI2/SNF2" como aqui definido refere-se a qualquer seqüência de 25 polipeptídeo compreendendo um domínio de ATPase tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com o domínio de ATPase como representado pela SEQ ID NO: 111, compreendido em SEQ ID NO: 30. Alternativamente ou adicionalmente, um "polipeptídeo SWI2/SNF2" como aqui definido refere-se a qualquer polipeptídeo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de 5 identidade de seqüência com o polipeptídeo SWI2/SNF2 como representado pela SEQ ID NO: 30 ou com qualquer uma das seqüências de polipeptídeo dadas aqui em Tabela E.

Os termos "domínio" e "motivo" são aqui definidos na seção de "definições". Há bancos de dados especializados para a identificação de domínios, por exemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318, Prosite (Bucher e Bairoch (1994), "A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation". (Em) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., (2004) Nucl. Acids. Res. 32: D134-D137), ou Pfam (Bateman et al., (2002) Nucleic Acids Research 30(1): 276-280). Um conjunto de ferramentas para análise in silico de seqüências de proteína está disponível no servidor de proteômica ExPASY (hospedado pelo Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., (2003) "ExPASy: the proteomies server for in-depth protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res 31: 3784-3788). Domínios também podem ser identificados usando técnicas de rotina, tal como alinhamento de seqüências. Análise da seqüência de polipeptídeo SEQ ID NO: 30 é apresentada abaixo em Exemplos 9 e 11.

Métodos para o alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na arte, tais métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar o alinhamento global (i.e. abarcando as seqüências completas) de duas seqüências que maximiza o número de combinações e minimiza o número de lacunas. O algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula a identidade de seqüência 5 percentual e realiza uma análise estatística da similaridade entre as duas seqüências. O programa de computador para realizar análise BLAST está publicamente disponível através do National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Homólogos podem ser prontamente identificados usando, o algoritmo de alinhamento de múltiplas seqüências ClustalW 10 (version 1.83), com os parâmetros de alinhamento pareado padrão, e um método de apresentar escore em percentagem. Percentagens globais de similaridade e de identidade também podem ser determinadas usando um dos métodos disponíveis no pacote de programas de computador MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: "an 15 application that generates similarity/identity matrices using protein ou DNA sequences"). Edição manual diminuta pode ser realizada para otimizar o alinhamento entre motivos conservados, como seria evidente para uma pessoa experiente na arte. Ademais, em vez do uso de seqüências de comprimento total para a identificação de homólogos, domínios específicos também podem 20 ser usados. Os valores de identidade de seqüência, que são indicados abaixo no Exemplo 3 como uma percentagem foram determinados sobre a seqüência de polipeptídeo ou de ácido nucleico inteira (Tabela F aqui), e/ou sobre domínios selecionados (tal como o domínio de ATPase como representado pela SEQ ID NO: 111, compreendido em SEQ ID NO: 30; Tabela Fl aqui) ou 25 o(s) motivo(s) conservado(s), usando os programas mencionados acima utilizando os parâmetros padrão.

A presente invenção é ilustrada pela transformação de plantas com a seqüência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 29, codificadora da seqüência de polipeptídeo SEQ ID NO: 30. Contudo, realização da invenção não é restringida a estas seqüências; os métodos da invenção podem ser vantajosamente realizados usando qualquer uma de a seqüência de ácido nucleico codificadora de SWI2/SNF2 ou polipeptídeos SWI2/SNF2s como aqui definido.

5 Exemplos de seqüências de ácido nucleico codificadoras de

polipeptídeos SWI2/SNF2 de planta são dados em Tabela E de Exemplo 8 aqui. Tais seqüências de ácido nucleico são úteis na realização dos métodos da invenção. As seqüências de polipeptídeo dadas em Tabela E de Exemplo 8 são seqüências exemplares de ortólogos e parálogos do polipeptídeos 10 SWI2/SNF2 representado pela SEQ ID NO: 30, os termos "ortólogos" e "parálogos" sendo como aqui definidos. Outros ortólogos e parálogos podem ser prontamente identificados pela realização de uma denominada pesquisa por blast recíproca. Tipicamente, esta envolve um primeiro BLAST envolvendo realização de BLAST de uma seqüência inquirida (por exemplo 15 usando qualquer uma das seqüências listadas em Tabela E de Exemplo 8) contra qualquer banco de dados de seqüências, tal como os bancos de dados NCBI publicamente disponíveis. BLASTN ou TBLASTX (usando valores pré-estabelecidos padrão) são geralmente usados quando se parte de uma seqüência de nucleotídeos, e BLASTP ou TBLASTN (usando valores pré20 estabelecidos padrão) quando se parte de uma seqüência de proteína. Os resultados de BLAST podem ser opcionalmente filtrados. As seqüências de comprimento total quer dos resultados filtrados quer dos resultados não filtrados são então submetidos a BLAST de volta (segundo BLAST) contra seqüências do organismo do qual a seqüência inquirida é derivada (onde a 25 seqüência inquirida é SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 30, o segundo BLAST seria portanto contra seqüências de Synechocystis). Os resultados dos primeiro e segundo BLASTs são então comparados. Um parálogo é identificado se um sucesso de classificação alta do primeiro blast é da mesma espécie da qual a seqüência inquirida é derivada, um BLAST de volta então idealmente resulta na seqüência inquirida dentre os sucessos mais altos; um ortólogo é identificado se um sucesso de classificação alta no primeiro BLAST não é da mesma espécie da qual a seqüência inquirida é derivada, e preferivelmente resulta do BLAST de volta na seqüência inquirida sendo dentre os sucessos 5 mais altos.

Sucessos de classificação alta são aqueles tendo um valor E baixo. Quanto menor o valor E, mais significativo o escore (ou em outras palavras menor a chance de que o sucesso foi encontrado por acaso). Computação do valor E é bem conhecida na arte. Em adição aos valores E, 10 comparações também são registradas por identidade percentual. Identidade percentual refere-se ao número de nucleotídeos (ou aminoácidos) idênticos entre as duas seqüências de nucleotídeos (ou polipeptídeo) comparadas sobre um comprimento particular. No caso de famílias grandes, ClustalW pode ser usado, seguido por uma árvore filogenética, para ajudar a visualizar o 15 agrupamento de genes relacionados e para identificar ortólogos e parálogos (veja Figura 7).

Variantes de ácido nucleico também podem ser úteis na prática dos métodos da invenção. Exemplos de tais variantes incluem seqüências de ácido nucleico codificadoras de homólogos e derivados de qualquer uma das 20 seqüências de aminoácidos dadas em Tabela E de Exemplo 8, os termos "homólogo" e "derivado" sendo como aqui definidos. Também úteis nos métodos da invenção são as seqüências de ácido nucleico codificadoras de homólogos e derivados de ortólogos ou parálogos de qualquer uma das seqüências de polipeptídeo dadas em Tabela E de Exemplo 8. Homólogos e 25 derivados úteis nos métodos da presente invenção têm substancialmente a mesma atividade biológica e funcional que a da proteína não modificada da qual são derivados.

Outras variantes de ácido nucleico úteis na prática dos métodos da invenção incluem porções de seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos SWI2/SNF2, seqüências de ácido nucleico que hibridizam com polipeptídeos SWI2/SNF2, variantes de editoração de seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos SWI2/SNF2, variantes alélicas de seqüência de ácido nucleico codificadoras de 5 polipeptídeos SWI2/SNF2, e variantes de seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos SWI2/SNF2 obtidas por rearranjo de gene. Os termos seqüência de hibridização, variante de editoração, variante alélica, e rearranjo de gene são como aqui descritos.

Seqüências de ácidos nucleicos codificadores de polipeptídeos 10 SWI2/SNF2 não necessitam ser seqüências de ácido nucleico de comprimento total, porque a realização dos métodos da invenção não se baseia no uso de seqüências de ácido nucleico de comprimento total. De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas, compreendendo introduzir e expressar em uma 15 planta uma porção de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dadas em Tabela E de Exemplo 8, ou uma porção de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um ortólogo, parálogo ou homólogo de qualquer uma das seqüências de polipeptídeo dadas em Tabela E de Exemplo 8.

Uma porção de uma seqüência de ácido nucleico pode ser 20 preparada, por exemplo, por realização de uma ou mais deleções na seqüência de ácido nucleico. As porções podem ser usadas para em forma isolada ou podem ser fiisionadas em outras seqüências codificadoras (ou nãocodificadoras) com o propósito de, por exemplo, produzir uma proteína que combina várias atividades. Quando fíisionada em outras seqüências 25 codificadoras, o polipeptídeo resultante produzido sob tradução pode ser maior do que aquele predito para a porção de proteína.

Porções úteis nos métodos da invenção, codificam polipeptídeos SWI2/SNF2 como aqui definidos, e têm substancialmente a mesma atividade biológica (i.e., aperfeiçoamento de características relacionadas ao rendimento) que a das seqüências de polipeptídeo dadas em Tabela E de Exemplo 8. Preferivelmente, a porção é uma porção de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dada em Tabela E de Exemplo 8, ou é uma porção de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das seqüências de polipeptídeo dadas em Tabela E de Exemplo 8. Preferivelmente a porção é, em ordem crescente de preferência pelo menos de 1000, 1100, 1200, 1300 ou 1400 nucleotídeos consecutivos em comprimento, os nucleotídeos consecutivos sendo de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dadas em Tabela E de Exemplo 8, ou de um seqüência de ácido nucleico codificadora de um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das seqüências de polipeptídeo dadas em Tabela E de Exemplo 8. Mais preferivelmente a porção é uma porção de seqüência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 29. Preferivelmente, a porção codifica uma seqüência de polipeptídeo que compreendendo qualquer um ou mais dos domínios ou motivos aqui definidos. Preferivelmente, a porção codifica uma seqüência de polipeptídeo que quando usada na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela mostrada em Figura 7, tende a se agrupar com o ciado SSOl653 de polipeptídeos SWI2/SNF2 compreendendo a seqüência de polipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 30 em vez de com qualquer outro ciado SWI2/SNF2.

Outra variante de ácido nucleico útil nos métodos da invenção é uma seqüência de ácido nucleico capaz de hibridizar, sob condições de estringência reduzida, preferivelmente sob condições estringentes, com uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como aqui definido, ou com uma porção como aqui definida.

De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas, compreendendo introduzir e expressar em uma planta uma seqüência de ácido nucleico capaz de hibridizar com qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dadas em Tabela E de Exemplo 8, ou compreendendo introduzir e expressar em uma planta uma seqüência de ácido nucleico capaz de hibridizar com uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um ortólogo, parálogo ou homologue de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dadas em Tabela E de Exemplo 8.

Seqüências de hibridização úteis nos métodos da invenção codificam um polipeptídeo SWI2/SNF2 como aqui definido, e têm substancialmente a mesma atividade biológica (i.e., aperfeiçoamento de características relacionadas ao rendimento) que a das seqüências de 10 aminoácidos dadas em Tabela E de Exemplo 8. Preferivelmente, a seqüência de hibridização capaz de hibridizar com qualquer um dos ácidos nucleicos dados em Tabela E de Exemplo 8, ou com uma porção de qualquer uma destas seqüências, é uma porção sendo como definida acima, ou sendo que a seqüência de hibridização é capaz de hibridizar com uma seqüência de ácido 15 nucleico codificadora de um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das seqüências de polipeptídeo dadas em Tabela E de Exemplo 8. Muito mais preferivelmente, a seqüência de hibridização é capaz de hibridizar com uma seqüência de ácido nucleico como representada pela SEQ ID NO: 29 ou com uma sua porção. Preferivelmente, a seqüência de hibridização codifica uma 20 seqüência de polipeptídeo compreendendo qualquer um ou mais dos motivos ou domínios como aqui definidos. Preferivelmente, a seqüência de hibridização codifica uma seqüência de polipeptídeo que quando usada na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela mostrada em Figura 7, tende a se agrupar com o ciado SSO1653 de polipeptídeos SWI2/SNF2 25 compreendendo a seqüência de polipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 30 em vez de com qualquer outro ciado SWI2/SNF2.

Outra variante de ácido nucleico útil nos métodos da invenção é uma variante de editoração codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como definido aqui acima, uma variante de editoração sendo como aqui definida.

De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aperfeiçoar as características relacionadas ao rendimento em plantas, compreendendo introduzir e expressar em uma planta uma variante de 5 editoração de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dadas em Tabela E de Exemplo 8, ou uma variante de editoração de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um ortólogo, parálogo ou homólogo de qualquer uma das seqüências de polipeptídeo dadas em Tabela E de Exemplo 8.

As variantes de editoração úteis nos métodos da presente

invenção têm substancialmente a mesma atividade biológica (i.e., aperfeiçoamento de características relacionadas ao rendimento) que a do polipeptídeo SWI2/SNF2 de SEQ ID NO: 30 e qualquer uma das seqüências de polipeptídeo mostradas Tabela E de Exemplo 8. Preferivelmente, a 15 seqüência de polipeptídeo codificada pela variante de editoração compreende qualquer um ou mais dos motivos ou domínios como aqui definidos. Preferivelmente, a seqüência de polipeptídeo codificada pela variante de editoração, quando usada na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela mostrada em Figura 7, tende a se agrupar com o ciado SSO1653 de 20 polipeptídeos SWI2/SNF2 compreendendo a seqüência de polipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 30 em vez de com qualquer outro ciado SWI2/SNF2.

Outra variante de ácido nucleico útil na realização dos métodos da invenção é uma variante alélica de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como definida aqui acima, uma variante alélica sendo como aqui definida.

De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas, compreendendo introduzir e expressar em uma planta uma variante alélica de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dadas em Tabela E de Exemplo 8, ou compreendendo introduzir e expressar em uma planta uma variante alélica de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um ortólogo, parálogo ou homólogo de qualquer uma das seqüências de 5 polipeptídeo dadas em Tabela E de Exemplo 8.

As variantes alélicas úteis os métodos da presente invenção têm substancialmente a mesma atividade biológica (i.e., aperfeiçoamento de características relacionadas ao rendimento) que a do polipeptídeo SWI2/SNF2 de SEQ ID NO: 30 e de qualquer uma das seqüências de polipeptídeo 10 mostradas em Tabela E de Exemplo 8. Variantes alélicas existem na natureza, e está incluído nos métodos da presente invenção o uso destes alelos naturais. Preferivelmente, a variante alélica é uma variante alélica de SEQ ID NO: 29 ou uma variante alélica de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um ortólogo ou parálogo de SEQ ID NO: 30. Preferivelmente, a seqüência de 15 polipeptídeo codificada pela variante alélica compreende qualquer um ou mais dos motivos ou domínios como aqui definidos. Preferivelmente, a seqüência de polipeptídeo codificada por uma variante alélica, quando usada na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela mostrada em Figura 7, tende a se agrupar com o ciado SS01653 de polipeptídeos 20 SWI2/SNF2 compreendendo a seqüência de polipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 30 em vez de com qualquer outro ciado SWI2/SNF2.

A evolução direcionada ou o rearranjo de gene também pode ser usado para gerar variantes de seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos SWI2/SNF2 como definidos acima; o termo "rearranjo de gene" sendo como aqui definido.

De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas, compreendendo introduzir e expressar em uma planta uma variante de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico dadas em Tabela E de Exemplo 8, ou compreendendo introduzir e expressar em uma planta uma variante de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um ortólogo, parálogo ou homólogo de qualquer uma das seqüências de polipeptídeo dadas em Tabela E de Exemplo 8, cuja seqüência de variante de ácido nucleico é 5 obtida por rearranjo de gene.

As seqüências de variante de ácido nucleico obtidas por rearranjo de gene úteis nos métodos da presente invenção têm substancialmente a mesma atividade biológica que a do polipeptídeo SWI2/SNF2 de SEQ ID NÕ: 30 e de qualquer uma das seqüências de 10 polipeptídeo mostradas em Tabela E de Exemplo 8. Preferivelmente, a seqüência de variante de ácido nucleico obtida por rearranjo de gene codifica uma seqüência de polipeptídeo compreendendo qualquer um ou mais dos motivos ou domínios como aqui definidos. Preferivelmente, a seqüência de polipeptídeo codificada pela seqüência de variante de ácido nucleico obtida 15 por rearranjo de gene, quando usada na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela mostrada em Figura 7, tende a se agrupar com o ciado SSO1653 de polipeptídeos SWI2/SNF2 compreendendo a seqüência de polipeptídeo como representada pela SEQID NO: 30 em vez de com qualquer outro ciado SWI2/SNF2.

Ademais, variantes de ácido nucleico também podem ser

obtidas por mutagênese sítio-direcionada. Vários métodos estão disponíveis para realizar mutagênese sítio-direcionada, os mais comuns sendo métodos baseados em PCR (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Eds.).

Seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos 25 SWI2/SNF2 podem ser derivadas de qualquer fonte natural ou artificial. A seqüência de ácido nucleico pode ser modificada de sua forma nativa em composição e/ou ambiente genômico através de manipulação humana deliberada. Preferivelmente a seqüência de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo SWI2/SNF2 é de um genoma microbiano, adicionalmente preferivelmente de archea (tal como dos seguintes filos: Crenarcheaota, Euryarchaeota (compreendendo Halobacteria, Methanobacteria, Methanococci, Methanopyri, Archaeoglobi, Thermoplasmata, e Thermococci classes), Korarchaeota, ou Nanoarchaeota) ou bactériaa (tal como dos 5 seguintes filos: Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes/Chlorobi, Chlamydiae, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrobacteres/Acidobacteria, Firmicutes5 Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, 10 Thermomicrobia, Thermotogae, Verrucomicrobia), mais preferivelmente de cianobactérias, tais como Synechocystis sp., Nostoe sp., Synechocoeeus sp., Prochlorococcus sp., Anaebena sp., Gloeobaeter sp., ou Thermosynechoeoecus sp., more preferivelmente from Synechoeystis sp., muito mais preferivelmente de Synechocystis sp. PCC6803.

Realização dos métodos da invenção dá plantas tendo

características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação às plantas de controle.

Referência aqui às "características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas" é tomada para significar um aumento em biomassa (peso) de 20 uma ou mais partes de uma planta, que podem incluir partes acima do solo (capazes de serem colhidas) e/ou partes abaixo do solo (capazes de serem colhidas). Em particular, tais partes colhíveis são sementes, e a realização dos métodos da invenção resulta em plantas tendo rendimento de semente aumentado em relação às plantas de controle adequadas.

Tomando-se milho como um exemplo, um aumento de

rendimento pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes: aumento no número de plantas estabelecidas por hectare ou acre, um aumento no número de espigas por planta, um aumento no número de filas, número de grãos por fila, peso de grãos, peso de mil grãos, comprimento/diâmetro de espiga, aumento na taxa de enchimento de semente (que é o número de sementes cheias dividido pelo número total de sementes e multiplicado por 100), dentre outros. Tomando-se arroz como um exemplo, um aumento de rendimento pode se manifestar como um aumento em um ou mais dos 5 seguintes: número de plantas por hectare ou acre, número de panícuias por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores (flósculos) por panícula (que é expressado como uma razão de número de sementes cheias sobre o número de panículas primárias), aumento na taxa de enchimento de semente (que é o número de sementes cheias dividido pelo número total de 10 sementes e multiplicado por 100), aumento em peso de mil grãos, dentre outros.

A presente invenção fornece um método para aperfeiçoamento de características relacionadas ao rendimento de plantas em relação às plantas de controle, cujo método compreende aumentar a expressão em uma planta de 15 uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como aqui definido. Preferivelmente, características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas são uma ou mais de: (i) número aumentado de flores por panícula; (ii) peso total de sementes aumentado por planta; (iii) número aumentado de sementes (cheias); ou (iv) índice de colheita 20 aumentado.

Visto que as plantas transgênicas de acordo com a presente invenção têm características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas, é provável que estas plantas exibam uma taxa de crescimento aumentada (durante pelo menos parte de seu ciclo de vida), em relação à taxa de 25 crescimento de plantas de controle em um estágio correspondente em seu ciclo de vida. Além da capacidade de rendimento aumentado, uma eficiência aumentada de absorção de nutrientes também pode contribuir para o aumento

r

em rendimento. E observado que as planta de acordo com a presente invenção mostram uma eficiência mais alta em absorção de nutrientes. Eficiência aumentada de absorção de nutrientes permite melhor crescimento da planta, a planta crescida sob condições quer de estresse quer de não-estresse.

A taxa de crescimento aumentada pode ser específica para uma ou mais partes de uma planta (incluindo sementes), ou pode ser inteiramente 5 substancialmente para a planta inteira. Plantas tendo uma taxa de crescimento aumentada pode ter um ciclo de vida mais curto. O ciclo de vida de uma planta pode ser considerado com o significado do tempo necessário para crescimento de uma semente madura seca até o estágio onde a planta tem produzido sementes maduras secas, similar ao material inicial. Este ciclo de 10 vida pode ser influenciado por fatores tais como vigor inicial, taxa de crescimento, índice de verdor, tempo de floração e velocidade de maturação de semente. O aumento em taxa de crescimento pode ocorrer em um ou mais estágios no ciclo de vida de uma planta. Taxa de crescimento aumentada durante os estágios iniciais no ciclo de vida de uma planta pode refletir vigor 15 intensificado. O aumento em taxa de crescimento pode alterar o ciclo de colheita de uma planta permitindo que plantas sejam semeadas mais tarde e/ou colhidas mais cedo do que de outro modo seria possível (um efeito similar pode ser obtido com tempo de floração mais cedo). Se a taxa de crescimento é suficientemente aumentada, ela pode permitir a semeadura 20 adicional de sementes da mesma espécie de planta (por exemplo semeadura e colheita de plantas de arroz seguidas por semeadura e colheita de outras plantas de arroz todas dentro de um período de crescimento convencional). Similarmente, se a taxa de crescimento é suficientemente aumentada, ela pode permitir semeadura adicional de sementes de espécies de plantas diferentes 25 (por exemplo a semeadura e a colheita de plantas de milho seguidas por, por exemplo, a semeadura e a colheita opcional de feijão-soja, batateira ou qualquer outra planta adequada). Tempos de colheita adicionais do mesmo rizoma no caso de algumas plantas de colheita também podem ser possíveis. Alteração do ciclo de colheita de uma planta pode levar a um aumento em produção de biomassa anual por acre (devido a um aumento no número de tempos (por exemplo em um ano) que qualquer planta particular pode ser crescida e colhida). Um aumento em taxa de crescimento também pode permitir o cultivo de plantas transgênicas em uma área geográfica mais ampla 5 do que a de suas contra-partes de tipo selvagem, porque as limitações territoriais para crescimento de uma colheita são muitas vezes determinadas pelas condições ambientais adversas quer no momento do plantio (estação inicial) quer no momento da colheita (estação tardia). Tais condições adversas podem ser evitadas se o ciclo de colheita for encurtado. A taxa de crescimento 10 pode ser determinada pela derivação de vários parâmetros de curvas de crescimento plotando-se experimentos de crescimento, tais parâmetros podem ser: T-Mid (o tempo demorado para as plantas alcançarem 50% de seu tamanho máximo) e T-90 (tempo demorado para as plantas alcançarem 90% de seu tamanho máximo), dentre outros.

De acordo com uma característica preferida da presente

invenção, realização dos métodos da invenção dá plantas tendo uma taxa de crescimento aumentada em relação às plantas de controle. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar a taxa de crescimento de plantas, cujo método compreende aumentar a expressão em 20 uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como aqui definido.

Um aumento em rendimento e/ou crescimento ocorre se a planta é crescida sob condições de não-estresse ou se a planta é exposta a vários estresses comparada com as plantas de controle.

Plantas tipicamente respondem à exposição ao estresse pelo

crescimento mais lento. Em condições de estresse severo, a planta pode até mesmo parar de crescer completamente. Estresse suave por outro lado é aqui definido como sendo qualquer estresse ao qual uma planta é exposta que não resulta na cessação completa de crescimento da planta sem a capacidade de retomar o crescimento. Estresse suave por outro lado é aqui definido como sendo qualquer estresse ao qual uma planta é exposta que não resulta na cessação da planta em crescer inteiramente sem a capacidade para continuar a crescer. Estresse suave no sentido da invenção acarreta uma redução no 5 crescimento das plantas estressadas de menos do que 40%, 35% ou 30%, preferivelmente menos do que 25%, 20% ou 15%, mais preferivelmente menos do que 14%, 13%, 12%, 11% ou 10% ou menos em comparação com a planta de controle sob condições de não-estresse. Devido aos avanços em práticas agrícolas (irrigação, fertilização, tratamentos com pesticida) estresses 10 severos não são frequentemente encontrados em plantas de colheita cultivadas. Como uma conseqüência, o crescimento comprometido induzido por estresse suave é frequentemente uma característica indesejada para agricultura. Estresses suaves são os estresses bióticos e/ou abióticos (do ambiente) de cada dia aos quais uma planta é exposta. Estresses abióticos 15 podem ser devido à estiagem ou ao excesso de água, estresse anaeróbico, estresse salino, toxicidade química, estresse oxidativo e temperaturas congelantes, quentes ou frias. O estresse abiótico pode ser um estresse osmótico causado por um estresse aquoso (particularmente devido à estiagem), excesso de sal, estresse oxidativo ou um estresse iônico. Estresses 20 bióticos são tipicamente aqueles estresses causados por patógenos, tais como bactérias, vírus, fungos, nematódeos, e insetos. O termo condições de "nãoestresse" como aqui usado refere-se preferivelmente àquelas condições ambientais que não significativamente vão além das condições climáticas ou outras condições abióticas diárias que as plantas podem encontrar mais 25 preferivelmente aquelas condições que permitem o crescimento ótimo das plantas. Pessoas experientes na arte estão cientes das condições de solo normais e das condições climáticas normais para uma dada localização.

Realização dos métodos da invenção dá plantas crescidas sob condições de não-estresse ou sob condições de estiagem suave tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação às plantas de controle crescidas sob condições de estresse comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas crescidas sob condições 5 de não-estresse ou sob condições de estiagem suave, cujo método compreende aumentar a expressão em uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como definida acima.

Realização dos métodos de acordo com a presente invenção resulta em plantas crescidas sob condições de estresse abiótico tendo 10 características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação às plantas de controle crescidas sob condições de estresse comparáveis. Como relatado em Wang et al. (Planta (2003) 218: 1-14), estresse abiótico causa uma série de mudanças morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e moleculares que afetam adversamente o crescimento e a produtividade da planta. Sabe-se 15 que estiagem, salinidade, temperaturas extremas e estresse oxidativo estão interconectadas e podem induzir dano de crescimento e celular através de mecanismos similares. Por exemplo, estiagem e/ou salinização são manifestadas primariamente como estresse osmótico, resultando na disrupção de homeostasia e distribuição de íons na célula. Estresse oxidativo, que 20 frequentemente acompanha estresse de temperatura alta ou baixa, salinidade ou estiagem pode causar desnaturação de proteínas funcionais e estruturais. Como uma conseqüência, estes diversos estresses ambientais frequentemente ativam rotas de sinalização celular e respostas celulares similares, tais como a produção de proteínas de estresse, supra-regulação de antioxidantes, acúmulo 25 de solutos compatíveis e parada de crescimento. Visto que diversos estresses ambientais ativam rotas similares, a exemplificação da presente invenção com estresse de estiagem não deve ser vista como uma limitação ao estresse de estiagem, mas mais como uma projeção para indicar o envolvimento de polipeptídeos SWI2/SNF2 como definidos acima, em aperfeiçoamento de características relacionadas ao rendimento em relação às plantas de controle crescidas em condições de estresse comparáveis, em estresses abióticos em geral.

Um grau particularmente alto de "conversa cruzada" é relatado 5 entre estresse de estiagem e estresse de salinidade alta (Rabbani et al. (2003) Plant Physiol 133: 1755-1767). Portanto, seria evidente que polipeptídeos SWI2/SNF2, juntamente com sua utilidade em aperfeiçoamento de características relacionadas ao rendimento em plantas em relação às plantas de controle crescidas sob condições de estresse de estiagem, também 10 encontrariam uso em aperfeiçoamento de características relacionadas ao rendimento em plantas, em relação às plantas de controle crescidas sob várias outras condições de estresse abiótico.

O termo "estresse abiótico" como aqui definido é tomado para significar qualquer um ou mais de: estresse aquoso (devido à estiagem ou ao 15 excesso de água), estresse anaeróbico, estresse salino, estresse de temperatura (devido às temperaturas quentes, frias ou congelantes), estresse de toxicidade química e estresse oxidativo. De acordo com um aspecto da invenção, o estresse abiótico é um estresse osmótico, selecionado de estresse aquoso, estresse salino, estresse oxidativo e estresse iônico. Preferivelmente, o 20 estresse aquoso é estresse de estiagem. O termo estresse salino não é restrito ao sal comum (NaCl), mas pode ser qualquer um ou mais de: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2, dentre outros.

Em particular, as características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em plantas crescidas sob condições de estresse abiótico 25 (preferivelmente sob condições de estresse de estiagem) em relação às plantas de controle crescidas em condições de estresse comparáveis, podem incluir uma ou mais das seguintes: (i) área acima do solo aumentada; (ii) biomassa de raiz total aumentada; (iii) biomassa de raiz espessa aumentada; (iv) biomassa de raiz fina aumentada; (v) número aumentado de flores por panícula; (vi) taxa de enchimento de semente aumentada; (vii) peso total de sementes aumentado por planta; (viii) número aumentado de sementes (cheias); ou (ix) índice de colheita aumentado.

Desempenho dos métodos da invenção dá plantas tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas sob condições de estresse abiótico em relação às plantas de controle crescidas em condições de estresse comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em plantas crescidas sob condições de estresse abiótico, cujo método compreende aumentar a expressão em uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2. De acordo com um aspecto da invenção, o estresse abiótico é um estresse osmótico, selecionado de um ou mais dos seguintes: estresse aquoso, estresse salino, estresse oxidativo e estresse iônico. Preferivelmente, o estresse aquoso é estresse de estiagem.

Outro exemplo de estresse ambiental abiótico é a disponibilidade reduzida de um ou mais nutrientes que necessitam ser assimilados pelas plantas para crescimento e desenvolvimento. Devido à influência forte da eficiência de utilização de nutrição sobre o rendimento de 20 planta e a qualidade de produto, uma quantidade enorme de fertilizante é derramada nos campos para otimizar o crescimento e a qualidade da planta. Produtividade de plantas é ordinariamente limitada por três nutrientes principais, fósforo, potássio e nitrogênio, que destes três é costumeiramente o elemento limitante de velocidade em crescimento de planta. Portanto o 25 elemento nutriente principal exigido para crescimento de planta é nitrogênio (N). Ele é um constituinte de numerosos compostos importantes encontrados em células vivas, incluindo aminoácidos, proteínas (enzimas), ácidos nucleicos, e clorofila. 1,5% a 2% da matéria seca de planta é nitrogênio e aproximadamente 16% da proteína de planta total. Assim, disponibilidade de nitrogênio é um fator limitante maior para produção e crescimento de planta de cultivo (Frink et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(4): 1175-1180), e tem como um impacto maior sobre o acúmulo de proteína e a composição de aminoácidos. Portanto, de interesse maior são as plantas de colheita com um 5 rendimento aumentado quando crescidas sob condições limitantes de nitrogênio.

A presente invenção inclui plantas, suas partes (incluindo sementes), ou células de planta obteníveis pelos métodos de acordo com a presente invenção. As plantas, partes de planta ou células de planta compreendem um transgene de ácido nucleico isolado codificador de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como definido acima.

A invenção também fornece vetores e construtos genéticos para facilitar a introdução e/ou expressão em plantas de seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos SWI2/SNF2. Os construtos de gene 15 podem ser inseridos em vetores, que podem estar comercialmente disponíveis, ser adequados para transformação em plantas e adequados para expressão do gene de interesse nas células transformadas. A invenção também fornece o uso de um construto de gene como aqui definido nos métodos da invenção.

Mais especificamente, a presente invenção fornece um construto compreendendo:

(d) uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como definida acima;

(e) uma ou mais seqüências de controle capazes de dirigir a expressão da seqüência de ácido nucleico de (a); e opcionalmente

(f) uma seqüência de terminação de transcrição.

Os termos "seqüência de controle" e "seqüência de terminação" são como aqui definidos.

Em uma modalidade, uma das seqüências de controle de um construto é um promotor específico de tecido, preferivelmente um promotor para a expressão em tecidos jovens expansíveis. Um exemplo de um promotor específico de tecido para expressão em tecidos jovens expansíveis é um promotor de beta-expansina, por exemplo um promotor de beta-expansina de arroz como representado pela SEQ ID NO: 112.

5 Plantas são transformadas com um vetor compreendendo

qualquer uma das seqüências de ácido nucleico descritas acima. O técnico experiente está ciente dos elementos genéticos que precisam estar presentes no vetor com o propósito de bem sucedidamente transformar, selecionar e propagar células hospedeiras contendo a seqüência de interesse. A seqüência 10 de interesse é operacionalmente ligada em uma ou mais seqüências de controle (pelo menos em um promotor).

Vantajosamente, qualquer tipo de promotor pode ser usado para dirigir a expressão da seqüência de ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor constitutivo, que se refere a um promotor que é 15 transcricionalmente ativo durante a maioria das, mas não necessariamente de todas as, fases de seu crescimento e desenvolvimento e está sob a maioria das condições ambientais, em pelo menos uma célula, tecido ou órgão. Alternativamente, o promotor pode ser um promotor induzível, i.e. tendo iniciação de transcrição induzida ou aumentada em resposta a um estímulo 20 químico (para uma revisão veja Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), ambiental ou físico. Outro exemplo de um promotor induzível é um promotor induzível por estresse, i.e. um promotor ativado quando uma planta é exposta a várias condições de estresse, ou um promotor induzido por patógeno.

Adicionalmente ou alternativamente, o promotor pode ser um

promotor específico de órgão ou específico de tecido, i.e. um que é capaz de preferencialmente iniciar transcrição em certos órgãos ou tecidos, tais como as folhas, raízes, tecido de semente etc; ou o promotor pode ser um promotor ubíquo, que é ativo em substancialmente todos os tecidos ou células de um organismo, ou o promotor pode ser desenvolvimentalmente regulado, sendo deste modo ativo durante estágios de desenvolvimento ou em partes da planta que sofrem mudanças desenvolventes. Promotores capazes de iniciar transcrição em apenas certos órgãos ou tecidos são aqui chamados de 5 "específicos de órgão" ou "específicos de tecido" respectivamente, similarmente, promotores capazes de iniciar transcrição em apenas certas células são aqui chamados de "específicos de célula".

Em uma modalidade, uma seqüência de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo SWI2/SNF2 como definido acima, tal como a 10 seqüência de ácido nucleico como representada pela SEQ ID NO: 29, está operacionalmente ligada em um promotor específico de tecido, preferivelmente um promotor capaz de preferencialmente expressar a seqüência de ácido nucleico em tecidos jovens expansíveis, ou no meristema apical.

Preferivelmente, o promotor capaz de preferencialmente

expressar a seqüência de ácido nucleico em tecidos jovens expansíveis tem um perfil de expressão comparável com um promotor de beta-expansina. Mais especificamente, o promotor capaz de preferencialmente expressar a seqüência de ácido nucleico em tecidos jovens expansíveis é um promotor 20 capaz de dirigir a expressão na zona de expansão de célula de um broto ou de uma raiz. Mais preferivelmente, o promotor capaz de preferencialmente expressar a seqüência de ácido nucleico em tecidos jovens expansíveis é um promotor de beta-expansina, por exemplo um promotor de beta-expansina de arroz como representado pela SEQID NO: 112.

Para a identificação de promotores funcionalmente

equivalentes, o padrão de expressão e/ou a força do promotor de um promotor candidato podem ser analisados por exemplo por ligação operacional do promotor em um gene repórter e ensaio dos padrão e nível de expressão do gene repórter em vários tecidos da planta. Genes repórter bem conhecidos adequados incluem por exemplo beta-glicuronidase ou beta-galactosidase. A atividade do promotor é ensaiada pela medição da atividade enzimática da beta-glicuronidase ou beta-galactosidase. O padrão de expressão e/ou a força do promotor pode ser então comparado com aquele de um promotor de 5 referência (tal como aqueles usado nos métodos da presente invenção). Alternativamente, força de promotor pode ser ensaiada por quantificação dos níveis de mRNA ou por comparação dos níveis de mRNA do ácido nucleico usado nos métodos da presente invenção, com níveis de mRNA de genes housekeeping tal como 18S rRNA, usando métodos conhecidos na arte, tal 10 como Northern blotting com análise densitométrica de autorradiogramas, PCR em tempo real quantitativa ou RT-PCR (Heid et al, 1996 Genome Methods 6: 986-994). Geralmente um "promotor fraco" refere-se a um promotor que dirige a expressão de uma seqüência codificadora em um nível baixo. "Nível baixo" é intencionado em níveis de cerca de 1/10.000 15 transcritos a cerca de 1/100.000 transcritos, a cerca de 1/5.000.000 transcritos por célula. De modo inverso, um "promotor forte" dirige a expressão de uma seqüência codificadora em nível alto, ou a cerca de 1/10 transcritos a cerca de 1/100 transcritos a cerca de 1/1.000 transcritos por célula.

Opcionalmente, uma ou mais seqüências de terminador podem 20 ser usadas no construto introduzido em uma planta. Elementos regulatórios adicionais podem incluir intensificadores tanto de transcrição quanto de tradução. Aquelas pessoas experientes na arte estarão cientes das seqüências de terminador e de intensificador que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. Tais seqüências seriam conhecidas ou poderiam ser 25 prontamente obtidas por uma pessoa experiente na arte.

Uma seqüência de íntron também pode ser adicionada na região 5' - não-traduzida (UTR) ou na seqüência codificadora para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol. Tem sido mostrado que a inclusão de um íntron editorável na unidade de transcrição em ambos os construtos de expressão em planta e em animal aumenta a expressão de gene em níveis tanto de mRNA quando de proteína em até 1.000-vezes (Buchman e Berg, Mol. Cell Biol. 8:4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987)). Tal intensificação por íntron da expressão de gene 5 é tipicamente mais alta quando posicionada próxima da extremidade 5' da unidade de transcrição. É conhecido na arte o uso de íntrons de milho Adhl-S íntron 1, 2, e 6, íntron Bronze-1. Para informação geral, veja The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Outras seqüências de controle (além de seqüências de promotor, intensificador, silenciador, íntron, regiões 3'UTR e/ou 5'UTR) podem ser elementos estabilizadores de proteína e/ou de RNA. Tais seqüências seriam conhecidas ou podem ser prontamente obtidas por uma pessoa experiente na arte.

Os construtos genéticos da invenção podem adicionalmente 15 incluir uma seqüência de origem de replicação que é exigida para manutenção e/ou replicação em um tipo de célula específico. Um exemplo é quando um construto genético é exigido para ser mantido em uma célula bacteriana como um elemento genético epissomal (e.g. molécula de plasmídeo ou cosmídeo). Origens de replicação preferidas incluem, mas não são limitadas a, fl-ori e 20 colEl.

Para a detecção da transferência bem sucedida das seqüências de ácido nucleico como usadas nos métodos da invenção e/ou seleção de plantas transgênicas compreendendo estas seqüências de ácido nucleico, é vantajoso usar genes marcadores (ou genes repórter). Portanto, o construto 25 genético pode opcionalmente compreender um gene marcador selecionável. Marcadores selecionáveis são descritos aqui com mais detalhe na seção de "definições".

E sabido que sob integração transiente ou estável de seqüências de ácido nucleico nas células de planta, apenas uma minoria das células captura o DNA estranho e, se desejado, o integra em seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e da técnica de transfecção utilizada. Para identificar e selecionar estes integrantes, um gene codificador de um marcador selecionável (tal como aquele descrito acima) é costumeiramente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Estes marcadores podem ser por exemplo usados em mutantes nos quais estes genes não são funcionais por, por exemplo, deleção por métodos convencionais. Ademais, moléculas de ácido nucleico codificadoras de um marcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesmo vetor que compreende a seqüência codificadora dos polipeptídeos da invenção ou usadas nos métodos da invenção, ou então em um vetor separado. Células que têm sido estavelmente transfectadas com a seqüência de ácido nucleico introduzido podem ser identificadas por exemplo por seleção (por exemplo, células que têm integrado o marcador selecionável sobrevivem enquanto que as outras células morrem).

Visto que os genes marcadores, particularmente os genes para resistência a antibióticos e herbicidas, não são mais exigidos ou são indesejados na célula hospedeira transgênica uma vez tendo sido introduzidos com sucesso as seqüências de ácido nucleico, o processo de acordo com a 20 invenção para introdução das seqüências de ácido nucleico vantajosamente emprega técnicas que permitem a remoção ou excisão destes genes marcadores. Um tal método é o que é conhecido como co-transformação. O método de co-transformação utiliza dois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor possuindo a seqüência de ácido nucleico de acordo 25 com a invenção e um segundo vetor possuindo o(s) gene(s) marcador(es). Uma proporção grande de transformantes recebe ou, no caso de plantas, compreende (até 40% ou mais dos transformantes), ambos vetores. No caso da transformação com Agrobactérias, os transformantes costumeiramente recebem apenas uma parte do vetor, i.e. a seqüência flanqueada pelo T-DNA, que costumeiramente representa o cassete de expressão. Os genes marcadores podem ser subsequentemente removidos da planta transformada por realização de cruzamentos. Em outro método, genes marcadores integrados em um transposon são usados para a transformação juntos com a seqüência de 5 ácido nucleico desejado (conhecida como a tecnologia Ac/Ds). Os transformantes podem ser cruzados com uma fonte de transposase ou os transformantes são transformados com um construto de ácido nucleico que concede expressão de uma transposase, transientemente ou estável. Em alguns casos (aproximadamente 10%), o transposon pula para fora do genoma da 10 célula hospedeira uma vez tendo ocorrido com sucesso a transformação e é perdido. Em numerosos outros casos, o transposon pula para uma localização diferente. Nestes casos o gene marcador precisa ser eliminado por realização de cruzamentos. Em microbiologia, foram desenvolvidas técnicas que possibilitam ou facilitam, a detecção de tais eventos. Um outro método 15 vantajoso baseia-se no que é conhecido como sistemas de recombinação; cuja vantagem é que eliminação por cruzamento pode ser omitida. O sistema melhor conhecido deste tipo é o que é conhecido como o sistema Cre/lox. Crel é uma recombinase que remove as seqüências localizadas entre as seqüências IoxP. Se o gene marcador está integrado entre as seqüências IoxP, 20 ele é removido uma vez tendo ocorrido com sucesso a transformação, por expressão da recombinase. Outros sistemas de recombinação são os sistemas HIN/HIX, FLP/FRT e REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Uma integração sítio-específica no genoma de planta das seqüências de ácido 25 nucleico de acordo com a invenção é possível. Naturalmente, estes métodos também podem ser aplicados em microorganismos tais como levedura, fungos ou bactérias.

A invenção também fornece um método para a produção de plantas transgênicas tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação às plantas de controle, compreendendo a introdução e a expressão em uma planta de qualquer seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como definida aqui acima.

Mais especificamente, a presente invenção fornece um método para a produção de plantas transgênicas tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação às plantas de controle, cujo método compreende:

(i) introduzir e expressar em uma planta ou célula de planta uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo

SWI2/SNF2; e

(ii) cultivar a célula de planta sob condições que promovem o crescimento e o desenvolvimento da planta.

A seqüência de ácido nucleico pode ser introduzido diretamente em uma célula de planta ou na própria planta (incluindo

introdução em um tecido, órgão, ou qualquer outra parte de uma planta). De acordo com uma característica preferida da presente invenção, a seqüência de ácido nucleico é preferivelmente introduzida em uma planta por transformação. O termo "transformação" é aqui descrito com mais detalhe na seção de "definições".

As células de planta geneticamente modificadas podem ser

regeneradas via todos os métodos com os quais o trabalhador experiente está familiarizado. Métodos adequados podem ser encontrados nas publicações acima mencionadas por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hofgen e Willmitzer.

Geralmente após a transformação, as células de planta ou os

agrupamentos de células são selecionadas(os) para a presença de um ou mais marcadores que são codificados pelos genes expressáveis em planta cotransfectados com o gene de interesse, após o qual o material transformado é regenerado em uma planta inteira. Para selecionar plantas transformadas, o material de planta obtido na transformação é, como uma regra, submetido às condições seletivas de modo que as plantas transformadas possam ser distinguidas das plantas não-transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas na maneira descrita acima podem ser plantadas e, após um período de 5 crescimento inicial, submetidas a uma seleção adequada por borrifo. Uma outra possibilidade consiste em crescimento das sementes, se apropriado após esterilização, sobre placas de ágar usando um agente de seleção adequado de modo que apenas as sementes transformadas possam crescer em plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são selecionadas para a presença 10 de um marcador selecionável tal como aqueles descritos acima.

Após transferência de DNA e regeneração, plantas putativamente transformadas também podem ser avaliadas, por exemplo usando análise de Southern ou PCR quantitativa, para a presença do gene de interesse, número de cópias e/ou organização genômica. Alternativamente ou 15 adicionalmente, níveis de expressão do DNA recém introduzido podem ser monitorados usando análise de Northern e/ou Western, ambas as técnicas sendo bem conhecidas por aquelas pessoas ordinariamente experientes na arte.

As plantas transformadas geradas podem ser propagadas por 20 uma variedade de meios, tais como por técnicas de geração clássica ou propagação clonal. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou Tl) pode ser auto-fertilizada e transformantes homozigóticos de segunda geração (ou T2) selecionados, e as plantas T2 podem ser então depois propagadas através de técnicas de geração clássicas.

Os organismos transformados gerados podem adquirir uma

variedade de formas. Por exemplo, podem ser quimeras de células transformadas e células não-transformadas; transformantes clonais (e.g., todas as células transformadas para conterem o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não-transformados (e.g., em plantas, um rizoma transformado enxertado em um rebento não-transformado).

A presente invenção claramente se estende a qualquer célula de planta ou planta produzida por qualquer um dos métodos aqui descritos, e a todas as partes de planta e seus propágulos. A presente invenção se estende 5 adicionalmente para incluir a progênie de uma célula, tecido, órgão ou planta inteira transfectada ou transformada primária que tem sido produzida por qualquer um dos métodos acima mencionados, a única exigência sendo que a progênie exiba a(s) mesma(s) característica(s) genotípica(s) e/ou fenotípica(s) que daquelas produzidas pela planta parental nos métodos de acordo com a 10 invenção.

A invenção também inclui células hospedeiras contendo uma seqüência de ácido nucleico isolada codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2como definido aqui acima. Células hospedeiras preferidas de acordo com a invenção são células de planta. Plantas hospedeiras para as 15 seqüências de ácido nucleico ou o vetor usados no método de acordo com a invenção, o vetor ou construto ou cassete de expressão são, em princípio, vantajosamente todas as plantas, que são capazes de sintetizar os polipeptídeos usando no método da invenção.

Os métodos da invenção são vantajosamente aplicáveis a 20 qualquer planta. Plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo forragem ou legumes de forragem, plantas ornamentais, plantações alimentícias, árvores ou arbustos. De acordo com uma modalidade preferida 25 da presente invenção, a planta é uma planta de cultivo. Exemplos de plantas de colheita incluem feijão-soja, girassol, canola, alfafa, colza, algodoeiro, tomateiro, batateira e tabaco. Adicionalmente preferivelmente, a planta é uma planta monocotiledônea. Exemplo de planta monocotiledônea inclui cana-deaçúcar. Mais preferivelmente a planta é um cereal. Exemplos de cereais incluem arroz, milho, trigo, cevada, painço, triticale, centeio, sorgo e aveia.

A invenção também se estende às partes colhíveis de uma planta tais como, mas não limitadas a sementes, folhas, frutas, flores, caules, rizomas, tubérculos e bulbos. A invenção adicionalmente se refere aos 5 produtos derivados, preferivelmente diretamente derivados, de uma parte capaz de ser colhida de uma tal planta, tal como pelotas ou pós secos, óleo, gordura e ácidos graxos, amido ou proteínas.

Métodos para aumentar a expressão de seqüências de ácido nucleico ou genes, ou produtos de gene, estão bem documentados na arte e incluem, por exemplo, sobre-expressão dirigida por promotores apropriados, o uso de intensificadores de tradução ou intensificadores de transcrição. Seqüências de ácido nucleico isoladas que servem como elementos promotores ou intensificadores podem ser introduzidas em uma posição apropriada (tipicamente a montante) de uma forma não-heteróloga de um polinucleotídeo de modo a supra-regular a expressão. Por exemplo, promotores endógenos podem ser alterados in vivo por mutação, deleção, e/ou substituição (veja, Kmiec, Pat. U.S. No. 5.565.350; Zarling et al., PCT/US93/03868), ou promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula de planta nas orientação e distâncias apropriadas de um gene da presente invenção de modo a controlar a expressão do gene.

Se expressão de polipeptídeo é desejada, é geralmente desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade-3' de uma região codificadora de polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de genes de planta, ou de T-DNA. 25 A seqüência de extremidade 3' a ser adicionada pode ser derivada de, por exemplo, os genes de nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de outro gene de planta, ou menos preferivelmente de qualquer outro gene eucariótico.

Como mencionado acima, um método preferido para aumentar a expressão de = uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 é pela introdução e expressão em uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2; contudo os efeitos da realização do método, i.e. aperfeiçoamento 5 de características relacionadas ao rendimento, também podem ser alcançados usando outras técnicas bem conhecidas. Uma descrição de algumas destas técnicas seguirá agora.

Uma tal técnica é etiquetagem de ativação de T-DNA (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353), que envolve a inserção de T-DNA, costumeiramente contendo um promotor (também pode ser um intensificador de tradução ou um íntron), na região genômica do gene de interesse ou 10 kb a montante ou a jusante da região de codificação de um gene em uma configuração tal que o promotor dirige a expressão do gene selecionado. Tipicamente, a regulação da expressão do gene selecionado por seu promotor natural é interrompida e o gene cai sob o controle do promotor recém introduzido. O promotor está tipicamente embebido em um T-DNA. Este TDNA é aleatoriamente inserido no genoma da planta, por exemplo, através de infecção de Agrobacterium e causa a expressão modificada de genes próximos do T-DNA inserido. As plantas transgênicas resultantes mostram fenótipos dominantes devido à expressão modificada de genes próximos do promotor introduzido.

Os efeitos da invenção também podem ser reproduzidos usando a técnica TILLING ("Targeted Induced Local Lesions In Genomes"); para uma descrição da mesma veja a seção de "definições".

Os efeitos da invenção também podem ser reproduzidos

usando recombinação homóloga; para uma descrição da mesma veja a seção de "definições".

A presente invenção também inclui o uso de seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos SWI2/SNF2 como aqui descritas e o uso destes polipeptídeos SWI2/SNF2 em aperfeiçoamento de características relacionadas ao rendimento em plantas em relação às plantas de controle. Preferivelmente, características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas são uma ou mais de: (i) número aumentado de flores por 5 panícula; (ii) peso total de sementes aumentado por planta; (iii) número aumentado de sementes (cheias); ou (iv) índice de colheita aumentado.

A presente invenção adicionalmente inclui o uso de seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos SWI2/SNF2 como aqui descritas e o uso destes polipeptídeos SWI2/SNF2 em aperfeiçoamento de 10 características relacionadas ao rendimento em plantas crescidas sob condições de estresse abiótico (preferivelmente sob condições de estresse de estiagem), em relação às plantas de controle crescidas sob condições de estresse comparáveis. Preferivelmente, características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas são uma ou mais de: (i) área acima do solo aumentada; (ii) 15 biomassa total de raiz aumentada; (iii) biomassa de raiz espessa aumentada; (iv) biomassa de raiz fina aumentada; (v) número aumentado de flores por panícula; (vi) taxa de enchimento de semente aumentada; (vii) peso total de sementes aumentado por planta; (viii) número aumentado de sementes (cheias); ou (ix) índice de colheita aumentado.

Seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos

SWI2/SNF2 aqui descritas, ou os próprios polipeptídeos SWI2/SNF2, podem encontrar uso em programas de geração nos quais um marcador de DNA é identificado, o qual pode ser geneticamente ligado em um gene codificador de um polipeptídeo SWI2/SNF2. Os genes / as seqüências de ácido nucleico ou 25 os próprios polipeptídeos SWI2/SNF2 podem ser usados para definir um marcador molecular. Este marcador de proteína ou de DNA pode ser então usado em programas de geração para selecionar plantas tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas como definidas aqui acima nos métodos da invenção. Variantes alélicas de um gene / uma seqüência de ácido nucleico codificador(a) de um polipeptídeo SWI2/SNF2 também podem encontrar uso em programas de geração auxiliados por marcador. Tais programas de geração algumas vezes exigem a introdução de uma variação 5 alélica por tratamento mutagênico das plantas, usando por exemplo mutagênese EMS; alternativamente, o programa pode iniciar com uma coleção de variantes alélicas da denominada origem "natural" causada não intencionalmente. Identificação de variantes alélicas então ocorre, por exemplo, por PCR. Esta é seguida por uma etapa para seleção de variantes 10 alélicas superiores da seqüência em questão e que dão características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas. Seleção é tipicamente realizada por monitoração do desempenho de crescimento de plantas contendo variantes alélicas diferentes da seqüência em questão. Desempenho de crescimento pode ser monitorado em uma estufa ou no campo. Outras etapas 15 opcionais incluem cruzamento de plantas nas quais a variante alélica superior foi identificada com outra planta. Isto poderia ser usado, por exemplo, para preparar uma combinação de características fenotípicas interessantes.

Seqüências de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos SWI2/SNF2 também podem ser usadas como sondas para mapeamento 20 genético e físico dos genes dos quais elas são uma parte, e como marcadores para características ligadas àqueles genes. Tal informação pode ser útil em geração de planta com o propósito de desenvolver linhagens com os fenótipos desejados. Tal uso de seqüências de ácido nucleico codificadoras de um polipeptídeo SWI2/SNF2 exige apenas uma seqüência de ácido nucleico de 25 pelo menos 15 nucleotídeos em comprimento. As seqüências de ácido nucleico codificadoras de um polipeptídeo SWI2/SNF2 podem ser usadas como marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP). Southern blots (Sambrook J, Fritsch EF e Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de DNA genômico de planta digerido por restrição podem ser sondados com as seqüências de ácido nucleico codificadoras do polipeptídeo SWI2/SNF2. Os padrões de banda resultantes podem ser então submetidos a análises genéticas usando programas de computador tal como MapMaker (Lander et al. (1987) 5 Genomics 1: 174-181) com o objetivo de construir um mapa genético. Em adição, as seqüências de ácido nucleico podem ser usadas para sondas Southern blots contendo DNAs genômicos tratados com endonuclease de restrição de um conjunto de indivíduos representando planta parental e progênie de um cruzamento genético definido. Segregação dos polimorfismos 10 de DNA é notada e usada para calcular a posição da seqüência de ácido nucleico codificadora do polipeptídeo SWI2/SNF2 no mapa genético previamente obtido usando esta população (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).

A produção e o uso de sondas derivadas de gene de planta para 15 utilização em mapeamento genético são descritos em Bematzky e Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Repórter 4: 37-41. Numerosas publicações descrevem mapeamento genético de clones de cDNA específicos usando a metodologia esboçada acima ou suas variações. Por exemplo, populações de intercruzamento F2, populações de retro-cruzamento, populações 20 aleatoriamente acasaladas, linhagens isogênicas próximas, e outros conjuntos de indivíduos podem ser usados para mapeamento. Tais metodologias são bem conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte.

As sondas de ácido nucleico também podem ser usadas para mapeamento físico (i.e., posicionamento de seqüências em mapas físicos, veja Hoheisel et al. Em: "Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide", Academic press 1996, pp. 319-346, e referências lá citadas).

Em outra modalidade, as sondas de ácido nucleico podem ser usadas em mapeamento por hibridização in situ com fluorescência direta (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Embora métodos correntes de mapeamento por FISH favoreçam o uso de clones grandes (vários kb a várias centenas de kb; veka Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), melhorias em sensibilidade podem permitir a realização de mapeamento por FISH usando sondas mais curtas.

Uma variedade de métodos baseados em amplificação de ácido

nucleico para mapeamento genético e físico pode ser realizada usando as seqüências de ácido nucleico. Exemplos incluem amplificação específica de alelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), polimorfismo de fragmentos amplificador por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 10 16:325-332), ligação específica de alelo (Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080), reações de extensão de nucleotídeo (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Mapeamento de Híbrido por Radiação (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) e Mapeamento Contente (Dear e Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estes métodos, a seqüência de um 15 ácido nucleico é usada para planejar e produzir pares de iniciadores para uso na reação de amplificação ou em reações de extensão de iniciador. O planejamento de tais iniciadores é bem conhecido por aquelas pessoas experientes na arte. Em métodos utilizando mapeamento genético baseado em PCR, pode ser necessária a identificação de diferenças de seqüência de DNA 20 entre as plantas parentais do cruzamento de mapeamento na região correspondendo à presente seqüência de ácido nucleico. Isto, contudo, não é geralmente necessário para métodos de mapeamento.

Os métodos de acordo com a presente invenção resultam em plantas tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em 25 relação às plantas de controle, como descritas aqui acima. Esta característica também pode ser combinada com outras características economicamente vantajosas, tais como características e aperfeiçoamento de rendimento (sob condições de crescimento normal ou com estresse), tolerância a outros estresses abióticos e bióticos, características que transformam outras características arquitetônicas e/ou características bioquímicas e/ou fisiológicas.

Descrição das figuras

A presente invenção será agora descrita com referência às seguintes figuras nas quais:

Fig. 1 mostra um alinhamento de polipeptídeos HpaG com motivos 1 e 2 indicados em negrito e sublinhado para SEQ ID NO: 2.

Fig. 2 mostra uma árvore filogenética com o grupo de polipeptídeos HpaG delineada de outras proteínas bacterianas e de planta (as várias seqüências são indicadas em seus números de acesso de GenBank e/ou números gi).

Fig. 3 mostra o vetor binário para expressão aumentada em Oryza sativa de um ácido nucleico codificador de proteína HpaG de Xanthomonas sob o controle de um promotor GOS2 de arroz (pGOS2).

Fig. 4 detalha exemplos de seqüências Harpin úteis na

realização dos métodos de acordo com a presente invenção.

Fig. 5 mostra um esquema da estrutura de polipeptídeos SWI2/SNF2 úteis na realização dos métodos da invenção. Os polipeptídeos SWI2/SNF2 úteis na realização dos métodos da invenção compreendem um 20 domínio N-terminal e um domínio de ATPase, ambos marcados como um box [retângulo] aberto. Os 8 motivos típicos I, Ia, II, III, IV, V, Va e VI compreendidos no domínio de ATPase dos polipeptídeos SWI2/SNF2 úteis na realização dos métodos da invenção estão marcados como linhas verticais pretas.

Fig. 6 mostra o logo de seqüência do domínio de ATPase dos

149 membros de subfamília SWI2/SNF2 SSO1653 como em Flaus et al., (2006). O domínio de ATPase como representado pela SEQ ID NO: 111, e compreendido em SEQ ID NO: 30, está de acordo com este logo de seqüência. Fig. 7 mostra uma árvore filogenética radial não-enraizada de polipeptídeos SWI2/SNF2 de numerosas subfamílias SWI2/SNF2 (incluindo os 149 membros de subfamília SWI2/SNF2 SS01653) construída por Flaus et al., (2006). O polipeptídeo como representado pela SEQ ID NO: 30 está 5 compreendido dentro do agrupamento SSOl653 (circundado em Figura), junto com todos os polipeptídeos SWI2/SNF2 archeal e bacterianos (coletivamente chamados de microbianos).

Fig. 8 mostra um alinhamento de múltiplas seqüências por CLUSTAL W (1;83) de polipeptídeos SWI2/SNF2 de vários micróbios, usando valores padrão. Polipeptídeos SWI2/SNF2 compartilham conservação de seqüência essencialmente em Motivos I, Ia, II, III, IV, V, Va e VI, compreendidos no domínio de ATPase. Estes estão dentro de retângulo e identificados como tais. Outra característica que está realçada é o domínio de ATPase, por exemplo como representado pela SEQ ID NO: 111, compreendido em SEQ ID NO: 30. O domínio de ATPase está compreendido (da terminação N para C) entre o primeiro resíduo de aminoácido de Motivo 1 e o último resíduo de aminoácido na terminação C do polipeptídeo SWI2/SNF2. O início e o final do domínio de ATPase estão marcados, e o próprio domínio de ATPase é identificado usando um bloco preto acima dos polipeptídeos alinhados.

Fig. 9 mostra o vetor binário para expressão aumentada em Oryza sativa de uma seqüência de ácido nucleico PCC6803 de Synechocystis sp. codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 sob o controle de um promotor de beta-expansina.

Fig. 10 detalha exemplos de seqüências SNF2 úteis na

realização dos métodos de acordo com a presente invenção.

Exemplos

A presente invenção agora será descrita com referência aos seguintes exemplos, que são apenas por meio de ilustração. Os seguintes exemplos não são intencionados para completamente definirem ou diferentemente limitarem o escopo da invenção.

Exemplo 1: Identificação de seqüências HpaG

Seqüências (cDNA de comprimento total, ESTs ou genômicas) relacionadas com SEQ ID NO: 1 e/ou seqüências de proteína relacionadas com SEQ ID NO: 2 foram identificadas dentre aquelas mantidas no banco de dados Entrez Nucleotides no National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando as ferramentas de pesquisa de seqüências de banco de dados, tal como a Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389- 3402). O programa foi usado para encontrar regiões de similaridade local entre seqüências por comparação de seqüências de ácido nucleico ou de polipeptídeo com banco de dados de seqüências e pelo cálculo da significância estatística das combinações. O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO: 1 foi usado para o algoritmo TBLASTN, com ajustes padrão e o filtro para ignorar set off de seqüências de complexidade baixa. O resultado da análise foi visto por comparação pareada, e classificado de acordo com o escore de probabilidade (valor E), onde o escore reflete a probabilidade que um alinhamento particular ocorre ao acaso (quanto menor o valor E, mais significativo é o sucesso). Em adição aos valores E, comparações também foram classificadas pela identidade percentual, identidade percentual refere-se ao número de nucleotídeos (ou aminoácidos) idênticos entre as duas seqüências de ácido nucleico (ou polipeptídeo) comparadas sobre um comprimento particular. Em algumas situações, os parâmetros padrão podem ser ajustados para modificarem a estringência da pesquisa. Tabela A fornece uma lista de seqüências de ácido nucleico e de proteína relacionadas com a seqüência de ácido nucleico como representado pela SEQ ID NO: Iea seqüência de proteína representada pela SEQ ID NO: 2. Tabela A: Seqüências de ácido nucleico codificadoras de HpaG e

polipeptídeos HpaG úteis nos métodos da presente invenção.

Nome Organismo Fonte Ácido nucleico Polipeptídeo Estado SEQ ID NO: SEQ ID NO: HpaG Xanthomonas axonopodis 1 2 Comprimento total HpaG_T44C Construto sintético 7 8 Comprimento total HpaG-T Construto sintético 9 10 Comprimento total Hpal Xanthomonas axonopodis pv. citri 11 12 Comprimento str. 306 total HpaG-N Construto sintético 13 14 Comprimento total HpaGG Xanthomonas axonopodis 15 16 Comprimento total Hrp Xanthomonas smithii subsp. smithii 17 18 Comprimento total Fator A Xanthomonas oryzae pv. oryzae 19 20 Comprimento funcional de cepa JXOIII total resposta hipersensível Hpal Xanthomonas oryzae pv. oryzae 21 22 Comprimento total Hpal Xanthomonas oryzae pv. oryzae 23 24 Comprimento total hpaGXooc Xanthomonas oryzae pv. oryzicola 25 26 Comprimento total Hpal Xanthomonas campestris pv. 27 28 Comprimento campestris str. ATCC 33913 total Exemplo 2: Alinhamento de seqüências de polipeptídeo HpaG

Alinhamento de seqüências de polipeptídeo (Figura 1) foi 5 realizado usando o programa ClustalW que é baseado no algoritmo Clustal popular de alinhamento progressivo (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31:3497-3500). Valores padrão são para a penalidade de lacuna de 10, para a penalidade de extensão de lacuna de 0,1 e a matriz de peso selecionada é Blosum 62 (se 10 polipeptídeos são alinhados). Edição manual menor foi feita para adicionalmente otimizar o alinhamento.

Uma árvore filogenética de HpaG (Figura 2) foi construída usando um algoritmo de agrupamento de junção de vizinhos como fornecido no programa AlignX do Vector NTI (Invitrogen). Exemplo 3: Cálculo da identidade de percentagem global entre seqüências de polipeptídeo úteis na realização dos métodos da invenção

Percentagens globais de similaridade e de identidade entre seqüências de polipeptídeo de comprimento total úteis na realização dos 5 métodos da invenção foram determinadas usando um dos métodos disponíveis na arte, o programa de computador MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: uma aplicação que gera matrizes de similaridade / identidade usando seqüências de proteína ou de DNA). Programa de computador MatGAT gera matrizes de 10 similaridade / identidade ara seqüências de DNA ou de proteína sem a necessidade de pré-alinhamento dos dados. O programa realiza uma série de alinhamentos pareados usando o algoritmo de alinhamento global de Myers e Miller (com uma penalidade de abertura de lacuna de 12, e uma penalidade de extensão de lacuna de 2), calcula similaridade e identidade usando por 15 exemplo Blosum 62 (para polipeptídeos), e então posiciona os resultados em uma matriz de distância. Similaridade de seqüência é mostrada na metade inferior da linha divisória e identidade de seqüência é mostrada na metade superior da linha divisória diagonal.

Parâmetros usados na comparação foram:

Matriz de escore: Blosum62

PrimeiraLacuna: 12

Lacuna de extensão: 2

Resultados da análise do programa de computador são mostrados em Tabela B para as similaridade e identidade globais sobre o comprimento total das seqüências de polipeptídeo (excluindo as seqüências de polipeptídeo parciais).

Identidade percentual é dada acima da diagonal em negrito e similaridade percentual é dada abaixo da diagonal (face normal).

A identidade percentual entre as seqüências de polipeptídeo HpaG úteis na realização dos métodos da invenção podem ser tão baixas quanto 37% de identidade de aminoácido comparada com SEQ ID NO: 9. Tabela B: Resultados de MatGAT para similaridade e identidade globais sobre o comprimento total das seqüências de polipeptídeo.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 I. SEQ ID NO: 2 99,2 94,0 91,2 91,0 90,2 85,4 66,7 66,7 66,7 59,6 37,7 2. ABK51589 99,2 93,2 90,5 90,2 89,5 84,7 67,4 67,4 67,4 60,3 37,7 3. ABK51587 94,0 93,2 85,4 85,0 92,0 79,6 60,3 60,3 60,3 56,4 33,3 4. AAM35307 92,0 91,2 86,1 82,5 81,8 89,8 70,9 70,9 70,9 61,4 36,6 5. ABK51590 91,0 90,2 90,4 83,2 81,2 76,6 57,4 57,4 57,4 50,7 32,8 6. ABK51588 90,2 89,5 92,0 82,5 89,3 75,2 58,2 58,2 58,2 56,4 33,8 7. ABG36696 89,5 88,7 83,5 92,7 80,5 79,7 70,7 70,7 70,7 58,8 37,0 8. ABJ97680 77,0 77,7 70,5 80,6 67,6 68,3 81,3 100,0 100,0 64,5 35,0 9. AAC95121 77,0 77,7 70,5 80,6 67,6 68,3 81,3 100,0 100,0 64,5 35,0 10.BAD29979 77,0 77,7 70,5 80,6 67,6 68,3 81,3 100,0 100,0 64,5 35,0 11.ABB72197 72,9 73,7 72,8 73,7 68,0 72,8 72,9 72,7 72,7 72,7 34,6 12.AAM40538 51,9 51,9 48,0 49,6 46,3 50,4 50,4 45,3 45,3 45,3 53,6 Exemplo 4: Clonagem e construção de vetor

A não ser que seja indicado de outra maneira, as técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolos padrão descritos em (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) ou em Volumes 1 e 2 10 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Métodos e materiais padrão para trabalho molecular de planta são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications (UK).

A seqüência codificadora de HpaG de Xanthomonas foi

amplificada por PCR de uma biblioteca de DNA de Xanthomonas axonopodis. 0 fragmento de PCR do comprimento esperado foi purificado e subsequentemente clonado em um vetor Gateway® usando tecnologia padrão. O clone de entrada compreendendo SEQ ID NO: 1 foi então usado em uma reação LR com um vetor de destinação usando para transformação de Oryza sativa. Este vetor continha como elementos funcionais dentro das bordas de T-DNA: um marcador selecionável de plana; um cassete de expressão de 5 marcador detectável; e um cassete Gateway intencionado para recombinação LR in vivo com a seqüência de ácido nucleico de interesse já clonada no clone de entrada. Um promotor GOS2 de arroz (SEQ ID NO: 5) para expressão constitutiva estava localizado a montante deste cassete Gateway. Alternativamente, foi mostrado que um promotor específico de tecido verde, 10 tal como o promotor de protoclorofilida redutase (SEQ ID NO: 6), é igualmente útil.

Após a etapa de recombinação LR, o vetor de expressão resultante pGOS2::HpaG foi transformado em Agrobacterium cepa LBA4044 de acordo com métodos bem conhecidos na arte.

Exemplo 5: Transformação de planta Transformação de arroz

A Agrobacterium contendo o vetor de expressão foi usada para transformar plantas de Oryza sativa. Sementes secas maduras de arroz japonica cultivar Nipponbare foram descascadas. Esterilização foi realizada 20 por incubação por um minuto em etanol 70%, seguido por 30 minutos em HgCl2 0,2%, seguido por 6 lavagens de 15 minutos cada com água destilada estéril. As sementes estéreis foram então germinadas sobre um meio contendo 2,4-D (meio de indução de calo). Após incubação no escuro por quatro semanas, calos embriogênicos, derivados de escutelo foram excisados e 25 propagados sobre o mesmo meio. Após duas semanas, os calos foram multiplicados ou propagados por subcultura sobre o mesmo meio por outras 2 semanas. Pedaços de calo embriogênicos foram subcultivados sobre meio novo 3 dias antes de co-cultura (para reforçar atividade de divisão celular).

Agrobacterium cepa LBA4404 contendo o vetor de expressão foi usada para co-cultivo. Agrobacterium foi inoculada sobre meio AB com os antibióticos apropriados e cultivada por 3 dias a 28°C. As bactérias foram então colhidas e suspensas em meio de co-cultivo líquido para uma densidade (OD6oo) de cerca de 1. A suspensão foi então transferida para uma placa de 5 Petri e os calos foram imersos na suspensão por 15 minutos. Os tecidos de calo foram então secos com um papel de filtro e transferidos para meio de cocultura, solidificado, e incubados por 3 dias no escuro a 25°C. Calos cocultivados foram crescidos sobre meio contendo 2,4-D por 4 semanas no escuro a 28°C na presença de um agente de seleção. Durante este período, se 10 desenvolveram ilhas de calo resistente de crescimento rápido. Após transferência deste material para um meio de regeneração e incubação na luz, o potencial embriogênico foi liberado e brotos se desenvolveram nas quatro a cinco semanas seguintes. Brotos foram excisados dos calos e incubados por 2 a 3 semanas sobre meio contendo auxina do qual foram transferidos para o 15 solo. Brotos endurecidos foram crescidos sob umidade alta e dias curtos em uma estufa.

Aproximadamente 35 transformantes de arroz TO independentes foram gerados para um construto. Os transformantes primários foram transferidos de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa. Após 20 uma análise de PCR quantitativa para verificar o número de cópias do inserto de T-DNA, apenas plantas transgênicas de cópia única que exibiram tolerância ao agente de seleção foram mantidas para colheita de semente Tl. Sementes foram colhidas três a cinco meses após a transplantação. O método deu transformante de locus único em uma taxa acima de 50% (Aldemita e 25 Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Transformação de milho

Transformação de milho (Zea mays) é realizada com uma modificação do método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. Transformação é dependente de genótipo e apenas genótipos específicos são suscetíveis à transformação e à regeneração. A linhagem congênita Al88 (University of Minnesota) ou híbridos com Al88 como um parental são fontes boas de material doador para transformação, mas outros genótipos também podem ser usados com sucesso. Espigas são colhidas da 5 planta de milho aproximadamente 11 dias após polinização (DAP) quando o comprimento do embrião imaturo é cerca de 1 a 1,2 mm. Embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão, e plantas transgênicas são recuperadas através de organogênese. Embriões excisados são crescidos sobre meio de indução de calo, então sobre 10 meio de regeneração de milho, contendo o agente de seleção (por exemplo imidazolinona mas vários agentes de seleção podem ser usados). As placas de Petri são incubadas na luz a 250C por 2-3 semanas, ou até desenvolvimento de brotos. Os brotos verdes são transferidos de cada embrião para meio de enraizamento de milho e incubados a 25°C por 2-3 semanas, até 15 desenvolvimento de raízes. Os brotos enraizados são transplantados para solo na estuda. Sementes Tl são produzidas das plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma cópia única do inserto de T-DNA. Transformação de trigo

Transformação de trigo é realizada com o método descrito por 20 Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. O cultivar Bobwhite (disponível na CIMMYT, México) é comumente usado em transformação. Embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão, e plantas transgênicas são recuperadas através de organogênese. Após incubação com Agrobacterium, os embriões são 25 crescidos in vitro sobre meio de indução de calo, então sobre meio de regeneração, contendo o agente de seleção (por exemplo imidazolinona mas vários outros marcadores de seleção podem ser usados). As placas de Petri são incubadas na luz a 250C por 2-3 semanas, ou até desenvolvimento de brotos. Os brotos verdes são transferidos de cada embrião para o meio de enraizamento e incubados a 250C por 2-3 semanas, até desenvolvimento de raízes. Os brotos enraizados são transplantados para solo na estufa. Sementes Tl são produzidas das plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma cópia única do inserto de T-DNA.

5 Transformação de feijão-soja

Feijão-soja é transformado de acordo com uma modificação do método descrito na Patente US 5.164.310 de Texas A&M. Diversas variedades de feijão-soja comerciais são suscetíveis à transformação por este método. O cultivar Jack (disponível na Illinois Seed Foundation) é 10 comumente usado para transformação. Sementes de feijão-soja são esterilizadas para semeadura in vitro. O hipocótilo, a radícula e um cotilédone são excisados de plantas jovens de sete dias de idade. O epicótilo e a cotilédone restante são adicionalmente crescidos para desenvolver nódulos axilares. Estes nódulos axilares são excisados e incubados com 15 Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão. Após o tratamento de co-cultivo, os explantes são lavados e transferidos para meio de seleção. Brotos regenerados são excisados e posicionados sobre um meio de alongamento de broto. Brotos não mais longos do que 1 cm são posicionados sobre meio de enraizamento até desenvolvimento de raízes. Os brotos 20 enraizados são transplantados para solo na estufa. Sementes Tl são produzidas das plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma cópia única do inserto de T-DNA.

Transformação de colza / canola

Pecíolos e hipocótilos cotiledonários de plantas jovens de 5-6 25 dias de idade são usados como explantes para cultura de tecido e transformados de acordo com Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). O cultivar comercial Westar (Agriculture Canada) é a variedade padrão usada para transformação, mas outras variedades também podem ser utilizada. Sementes de canola são esterilizadas em superfície para semeadura in vitro. Os explantes de pecíolo cotiledonário com o cotilédone ligado são excisados das planta jovens in vitro, e inoculados com Agrobacterium (contendo o vetor de expressão) por imersão da extremidade cortada do explante de pecíolo na suspensão bacteriana. Os explantes são então cultivados por 2 dias sobre meio 5 MSBAP-3 contendo 3 mg/L de BAP, 3% de sacarose, 0,7% de Phytagar a 23°C, 16 h de luz. Após dois dias de co-cultura com Agrobacterium, os explantes de pecíolo são transferidos para meio MSBAP-3 contendo 3 mg/L de BAP, cefotaxima, carbenicilina, ou timentina (300 mg/L) por 7 dias, e então cultivados sobre meio MSBAP-3 com cefotaxima, carbenicilina, ou 10 timentina e agente de seleção até regeneração de broto. Quando os brotos são de 5 -10 mm de comprimento, eles são cortados e transferidos para meio de alongamento de broto (MSBAP-0.5, contendo 0,5 mg/L de BAP). Brotos de cerca de 2 cm de comprimento são transferidos para o meio de enraizamento (MSO) para indução de raiz. Os brotos enraizados são transplantados para solo 15 na estufa. Sementes Tl são produzidas das plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma cópia única do inserto de T-DNA. Transformação de alfafa

Um clone de regeneração de alfafa (Medicago sativa) é transformado usando o método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 20 839-847). Regeneração e transformação de alfafa são dependentes de genótipo e portanto uma planta regenerada é exigida. Métodos para obter plantas regeneradas têm sido descritos. Por exemplo, estas podem ser selecionadas do cultivar Rangelander (Agriculture Canada) ou qualquer outra variedade de alfafa comercial como descrito por Brown DCW e A Atanassov 25 (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112). Alternativamente, a variedade RA3 (University of Wisconsin) tem sido selecionada para uso em cultura de tecido (Walker et al., 1978 Am J Bot 65:654-659). Explantes de pecíolo são co-cultivados com uma cultura noturna de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839- 847) ou LBA4404 contendo o vetor de expressão. Os explantes são cocultivados por 3 dias no escuro sobre meio de indução SH contendo 288 mg/L de Pro, 53 mg/L de tioprolina„35 g/L de K2SO4, e 100 μg de acetosiringinona. Os explantes são lavados em meio de Murashige-Skoog de meia5 força (Murashige e Skoog, 1962) e plaqueados sobre o mesmo meio de indução SH sem aceto-siringinona mas com um agente de seleção adequado e antibiótico apropriado para inibir crescimento de Agrobacterium. Após várias semanas, embriões somáticos são transferidos para meio de desenvolvimento BOÍ2Y não contendo reguladores de crescimento, sem antibióticos, e com 50 10 g/L de sacarose. Embriões somáticos são subsequentemente germinados sobre meio Murashige-Skoog de meia-força. As plantas jovens enraizadas são transplantadas para potes e crescidas em uma estufa. Sementes Tl são produzidas das plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma cópia única do inserto de T-DNA.

Transformação de algodão

Algodão é transformado usando Agrobacterium tumefaciens de acordo com o método descrito em US 5.159.135. Sementes de algodoeiro são esterilizadas na superfície em solução de hipoclorito de sódio 3% durante 20 minutos e lavadas em água destilada com 500 μg/ml de cefotaxima. As 20 sementes são então transferidas para meio SH com 50 μg/ml de benomil para germinação. Hipocótilos de plantas jovens de 4 a 6 dias de idade são removidos, cortados em pedaços de 0,5 cm e posicionados sobre ágar 0,8%.

o

Uma suspensão de Agrobacterium (aproximadamente 10 células por ml, diluída de uma cultura noturna transformada com o gene de interesse e 25 marcadores de seleção adequados) é usada para inoculação dos explantes de hipocótilo. Após 3 dias na temperatura ambiente e sob iluminação, os tecidos são transferidos para um meio sólido (Gelrite 1,6 g/l) com sais de Murashige e Skoog com vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50:151-158 (1968)), 0,1 mg/L 2,4-D, 0,1 mg/L de 6-furfuril-amino-purinea e 750 μg/ml MgCl2, e com 50 a 100 μ§/πι1 cefotaxima e 400-500 μ^πιΐ de carbenicilina para matar bactérias residuais. Linhagens celulares individuais são isoladas após dois a três meses (com subculturas cada quatro a seis semanas) e são adicionalmente cultivadas sobre meio seletivo para amplificação de tecido (3 0°C, fotoperíodo 5 de 16 h). Tecidos transformados são subsequentemente mais adiante cultivados sobre meio não-seletivo durante 2 a 3 meses para dar embriões somáticos. Embriões de aparência saudável de pelo menos 4 mm de comprimento são transferidos para tubos com meio SH em vermiculita fina, suplementada com 0,1 mg/L de ácido indol-acético, 6-furfuril-amino-purina e 10 ácido giberélico. Os embriões são cultivados a 30°C com um fotoperíodo de

16 h, e plântulas no 2o ao 3o estágio foliar são transferidas para potes com vermiculita e nutrientes. As plantas são endurecidas e subsequentemente movidas para a estufa para cultivo ulterior.

Exemplo 6: Procedimento de avaliação fenotípica 6.1 Configuração de avaliação

Aproximadamente 35 transformantes de arroz TO independentes foram gerados. Os transformantes primários foram transferidos de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa para crescimento e colheita de semente Tl. Seis eventos, dos quais a progênie Tl segregou 3:1 20 para presença/ausência de transgene, foram retidos. Para cada um destes eventos, aproximadamente 10 plantas jovens Tl contendo o transgene (hetero- e homo-zigotos) e aproximadamente 10 plantas jovens faltantes de transgene (nulizigotos) foram selecionadas por monitoração de expressão de marcador visual. As plantas transgênicas e os nulizigotos correspondentes 25 foram crescidos lado a lado em posições aleatórias. Condições de estufa foram de dias curtos (luz de 12 horas), 28°C na luz e 22°C no escuro, e uma umidade relativa de 70%.

Quatro eventos Tl foram mais tarde avaliados na geração T2 seguindo o mesmo procedimento de avaliação que o para a geração Tl mas com mais indivíduos por evento. Do estágio de semeadura até o estágio de maturidade as plantas foram passadas sete vezes através de uma cabine de imagem digital. Em cada instante de tempo imagens digitais (2048x1536 pixéis, 16 milhões de cores) foram tiradas de cada planta de pelo menos 6 ângulos diferente.

Teste de estiagem

Plantas de seis eventos (sementes T2) foram crescidas em solo de pote sob condições normais até alcançarem o estágio de cabeça. Foram então transferidas para uma seção "seca" onde irrigação foi impedida. Sondas 10 de umidade foram inseridas em potes aleatoriamente escolhidos para monitorar o teor de água do solo (SWC). Quando o SWC ficou abaixo de certos limites, as plantas foram automaticamente re-irrigadas continuamente até um nível normal ser de novo alcançado. As plantas foram então retransferidas de novo para condições normais. O resto do cultivo (maturação 15 de planta, colheita de semente) foi o mesmo que para as plantas não crescidas sob condições de estresse abiótico. Parâmetros de crescimento e rendimento são registrados conforme detalhado para crescimento sob condições normais. Teste de eficiência de uso de nitrogênio

Plantas de arroz de sementes T2 são semeadas em solo de pote sob condições normais exceto para a solução de nutriente. Os potes são irrigados da transplantação até maturação com uma solução de nutriente específica contendo teor de nitrogênio (N) reduzido, costumeiramente entre 7 e 8 vezes menos.

O resto do cultivo (maturação de planta, colheita de semente) é o mesmo que para plantas não crescidas sob estresse abiótico. Parâmetros de crescimento e rendimento são registrados conforme detalhado para crescimento sob condições normais.

Teste de estresse salino

Plantas são crescidas sobre um substrato feito de fibras de coco e argex (razão de 3 para I). Uma solução de nutriente normal é usada durante as duas primeiras semanas após transplantação das plântulas na estuda. Após as primeiras duas semanas, sal (NaCl) 25 mM é adicionado na solução nutriente, até que as plantas serem colhidas. Parâmetros relacionados com semente foram então medidos.

6.2 Análise estatística: teste-F

Uma ANOVA (análise de variância) de dois fatores foi usada como um modelo estatístico para a avaliação total de características fenotípicas de planta. Um teste-F foi realizado sobre todos os parâmetros de 10 todas as plantas de todos os eventos transformados com o gene da presente invenção. O teste-F foi realizado para checar um efeito do gene sobre todos os eventos de transformação e para verificar um efeito total do gene, também conhecido como efeito de gene global. O limite para significância para um efeito de gene global verdadeiro foi ajustado em um nível de probabilidade de 15 5% para o teste-F. Um valor de teste-F significativo aponta para um efeito de gene, significando que não é apenas a mera presença ou posição do gene que é causadora de diferenças em fenótipo.

Devido ao fato de terem sido realizados dois experimentos com eventos sobrepostos, uma análise combinada foi realizada. Isto é útil para 20 checar a consistência dos efeitos sobre os dois experimentos, e se este for o caso, para acumular evidência de ambos experimentos com o propósito de aumentar a confiança na conclusão. O método usado foi uma abordagem de modelo misto que leva em consideração a estrutura de multiníveis dos dados (i.e. experimento - evento - segregantes). Valores P foram obtidos por 25 comparação do teste de razão de probabilidade com as distribuições de qui quadrado.

6.3 Parâmetros medidos

Medição de parâmetros relacionados com biomassa

Do estágio de semeadura até o estágio de maturidade as plantas foram passadas várias vezes através de uma cabine de imagem digital. Em cada instante de tempo imagens digitais (2048x1536 pixéis, 16 milhões de cores) foram tiradas de cada planta de pelo menos 6 ângulos diferentes. A área acima do solo da planta (ou biomassa foliar) foi determinada pela 5 contagem total do número de pixéis sobre as imagens digitais das partes de planta acima do solo discriminadas do fundo. Este valor foi tomado na média para as fotografias tiradas no mesmo instante de tempo de ângulos diferentes e foi convertido para um valor de superfície física expressado em mm quadrado por calibração. Experimentos mostram que a área de planta acima 10 do solo medida nesta maneira correlaciona-se com a biomassa de partes de planta acima do solo. A área acima do solo é a área medida no instante de tempo no qual a planta tinha alcançado sua biomassa foliar máxima. O vigor inicial é a área acima do solo de planta (planta jovem) três semanas após a germinação. Aumento em biomassa de raiz é expressado como um aumento 15 em biomassa de raiz total (medido como biomassa máxima de raízes observada durante o período de vida de uma planta); ou como um aumento no índice de raiz/broto (medido como a razão entre a massa de raiz e a massa de broto no período de crescimento ativo de raiz e broto).

Vigor inicial foi determinado por contagem do número total de 20 pixéis das partes de planta acima do solo discriminadas do fundo. Este valor foi tomado na média para as fotografias tiradas no mesmo instante de tempo de ângulos diferentes e foi convertido em um valor de superfície física expressado em mm quadrado por calibração. Os resultados descritos abaixo são para plantas de três semanas após a germinação.

Medições de parâmetros relacionados com semente

As panículas primárias maduras foram colhidas, contadas, ensacadas, rotuladas com código de barras e então secas por três dias em um forno a 37°C. As panículas foram então debulhadas e todas as sementes foram colhidas e contadas. As cascas cheias foram separadas das vazias usando um dispositivo de sopro de ar. As cascas vazias foram jogadas fora e a fração restante foi contada de novo. As cascas cheias foram pesadas em uma balança analítica. O número de sementes cheias foi determinado por contagem do número de cascas cheias que restaram após a etapa de separação. O rendimento 5 de semente total foi medido por pesagem de todas as cascas cheias colhidas de uma planta. O número total de sementes por planta foi medido por contagem do número de cascas colhidas de uma planta. Peso de mil sementes (TKW) é extrapolado do número de sementes cheias contado e de seu peso total. O

r

índice de Colheita (HI) na presente invenção é definido como a razão entre o

2 e

rendimento de semente total e a área acima do solo (mm ), multiplicado por um fator de IO6. O número total de flores por panícula como definido na presente invenção é a razão entre o número total de sementes e o número de panículas primárias maduras. A taxa de enchimento de semente como definida na presente invenção é a proporção (expressada como uma%) do número de 15 sementes cheias sobre o número total de sementes (ou flósculos).

Exemplo 7: Resultados da avaliação fenotípica das plantas transgênicas

Os resultados da avaliação de plantas transgênicas de arroz expressando um ácido nucleico HpaG sob condições de não-estresse são apresentados abaixo. Um aumento foi observado para biomassa acima do solo 20 (AreaMáx), vigor de emergência (vigor inicial), rendimento de semente total, número de sementes cheias, taxa de enchimento, número de flores por panícula, índice de colheita, e peso de mil sementes (veja tabela C).

Tabela C: Resultados das medições para aumento de rendimento sob condições de não-estresse

Parâmetro Aumento total (em%) Valor-p de teste-F AreaMáx 13 0,0000 Vigor inicial 25 0,0041 Peso total de sementes 30 0,0000 Número de sementes cheias 26 0,0000 Taxa de enchimento 9 0,0000 Flores por panícula 12 0,0371 índice de colheita 18 0,0000 Peso de mil sementes 4 0,0000 Os resultados da avaliação de plantas transgênicas de arroz expressando um ácido nucleico HpaG sob condições de estresse são apresentados aqui abaixo. Um aumento foi observado para peso total de semente, número de sementes cheias, taxa de enchimento, índice de colheita e peso de mil sementes (Tabela D).

Tabela D: Resultados das medições para aumento de rendimento sob condições de estresse de estiagem

Parâmetro Aumento total (em%) valor-p de teste-F Peso total de sementes 40 0,0000 Número de sementes cheias 37 0,0000 Taxa de enchimento 30 0,0000 índice de colheita 37 0,0000 Peso de mil sementes 3 0,0001 Exemplo 8: Identificação de seqüências relacionadas SEQ ID NO: 29 e SEQID NO: 30

Seqüências (cDNA de comprimento total, ESTs ou genômico)

relacionadas com SEQ ID NO: 29 e/ou seqüências de proteína relacionadas com SEQ ID NO: 30 foram identificadas dentre aquelas mantidas no banco de dados Entrez Nucleotides no National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando as ferramentas de pesquisa de seqüência de banco de dados,

tal como o Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389- 3402). O programa foi usado para encontrar regiões de similaridade local entre seqüências por comparação de seqüências de ácido nucleico ou polipeptídeo com bancos de dados de seqüências e pelo cálculo da

significância estatística de combinações. O polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO: 29 foi usado para o algoritmo TBLASTN, com ajustes padrão e o filtro para ignorar set off de seqüências de complexidade baixa. O resultado da análise foi visto por comparação pareada, e classificado de acordo com o escore de probabilidade (valor E), onde o escore reflete a probabilidade de 10

que um alinhamento particular ocorre ao acaso (quando menor o valor E, mais significativo o sucesso). Em adição aos valores E, também foram determinados os escores de comparações por identidade percentual. Identidade percentual refere-se ao número de nucleotídeos (ou aminoácidos) idênticos entre as duas seqüências de ácido nucleico (ou polipeptídeo) sobre um comprimento particular. Em algumas situações, os parâmetros padrão podem ser ajustados para modificar a estringência da pesquisa.

Tabela E fornece uma lista de seqüências de ácido nucleico e de polipeptídeo relacionadas com a seqüência de ácido nucleico como representada pela SEQ ID NO: 29 e a seqüência de polipeptídeo representada pela SEQ ID NO: 30.

Nome Organismo fonte Número de SEQ ID NO SEQ ID NO acesso NCBI de NA de AA do (nucleotídeos) (aminoácidos) polipeptídeo Synecho PCC6803 Synechoeystis sp. PCC NP 442847.1 29 30 SNF2 6803 BA000022 Anava_SNF2 Anaebena variabilis ATCC YP 323780.1 31 32 29413 Archaeon RC-LSNF2 Arehaeon metanogênieo CAJ35100.1 33 34 não-eultivado RC-LSNF2 Baeee ATCC10987 Baeillus cereus ATCC AAS44264.1 35 36 SNF2 10987 Crowa_SNF2 Croeosphaera watsonii ZP 00516613. 37 38 WH 8501 etg336 1 Glovi_SNF2 Gloeobaeter violaeeus NP925212 39 40 PCC 7421 Lyn_sp_SNF2 Lyngbyasp. PCC 8106 ZP 01622333. 41 42 1 Metac_C2A_SNF2 Methanosareina NP615162.1 43 44 acetivorans C2Á MethuJF- 1_SNF2 Methanospirillum hungatei AB D41401.1 45 46 JF-I Metma_Go 1_SNF2 Methanosarcina mazei NP 633503.1 47 48 Goel Mycbo_SNF2 Myeobacterium bovis CAL72108.1 49 50 BCG Pasteur 1173P2 Myctu_SNF2 Myeobaeterium BX842578.1 51 52 tuberculosis H37Rv Myxxa_DK_SNF2 Myxoeoeeus xanthus YP_635387.1 53 54 DK1622 NocfaJFM NocardiafarcinicalFM BAD55876.1 55 56 10152 SNF2 10152 Nodsp_SNF2 Nodulariaspumigena ZP 01629192. 57 58 1 Nos sp PCC7120 S Nostoesp. PCC7120 BAB78256.1 59 60 NF2 Nos sp PCC7120 S Nostoesp. PCC 7120 ZP 00106150. 61 62 NF211 1 Nospu PCC73102 S Nostoc punctiforme PCC NP_488438 63 64 NF2 73102 Pelph_BU-1 SNF2 Pelodictyon ZP 00589405. 65 66 phaeoclathratiforme BU-I 1 Proma CCMP1375 Prochlorococcus marinus NP 874441.1 67 68 SNF2 str. CCMP1375 Proma MIT9211 SN Proehlorocoecus marinus ZP 01006255. 69 70 F2 str. MIT 9211 1 Proma.MIT Prochloroeoceus marinus YP 00101883 71 72 9303 SNF2 str. MIT 9303 3.1 Proma MIT9313 SN Prochlorococcus marinus NP895982.1 73 74 F2 str. MIT 9313 Rho_spJRHAl_SNF Rhodococcus sp. RHAl ABG93371.1 75 76 2 Saltr CNB- Salinispora tropiea CNB- ZP01431310 77 78 440 SNF2 440 Symth IAM Symbiobaeterium BAD39642 79 80 14863 SN F2 thermophilum IAM 14863 Syn sp WH5701 S Synechococcus sp. WH ZP 01083591. 81 82 NF2 5701 1 Syn sp BL107 SNF Synechococcus sp. BL107 ZP 01469219. 83 84 2 1 Syn sp CC9311 SN Synechococcus sp. YP_731958.1 85 86 F2 CC9311 Syn sp CC9605 SN Synechococcus sp. YP_382805.1 87 88 F2 CC9605 Syn sp CC9902 SN Synechococcus sp. YP_378176.1 89 90 F2 CC9902 Syn sp RS9916 SN Synechococcus sp. ZP_01471362 91 92 F2 RS9916 Syn sp WH Synechococcus sp. WH ZP 01125039. 93 94 7805 SNF2 7805 1 Syn sp WH8102 S Synechococcus sp. WH NP_898451.I 95 96 NF2 8102 Synel PCC6301 SN Synechococcus elongatus YPJ71376 97 98 F2 PCC 6301 Synel PCC7942 SN Synechococcus elongatus YP_3 99891.1 99 100 F2 PCC 7942 Theel BP-I SNF2 Thermosynechococcus NP 682403.1 101 102 elongatus BP-I Fontes adicionais de polipeptídeos SWI2/SNF2 úteis na

realização dos métodos da invenção podem ser encontradas na tabela suplementar SlC fornecida por Flaus et al. (2006). Os autores escanearam 24 genomas archeal completos e 269 genomas bacterianos completos, e identificaram 149 SWI2/SNF2 do tipo de subfamília SS01653.

Exemplo 9: Alinhamento de seqüências de polipeptídeo SWI2/SNF2

Alinhamento de seqüências de polipeptídeo foi realizado com algoritmo Clustal (1.83) de alinhamento progressivo, usando valores padrão (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna et al.

(2003). Nucleic Acids Res 31:3497-3500). Resultados em Figura 8 mostram que os polipeptídeos SWI2ZSNF2 compartilham conservação se seqüência essencialmente em Motivos I, Ia, II, III, IV, V, Va e VI (que estão dentro de retângulo) representados como segue s:

(i) Motivo I LADDMGLGK(T/S), como representado pela SEQ ID NO: 103 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência

pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo I;

(ii) Motivo Ia L(L/V/I)(V/I/L)(A/C)P(T/MAA)S(V/I/L)(V/I/L) XNW, como representado pela SEQ ID NO: 104 ou um motivo tendo em

ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo Ia;

(iii) Motivo II DEAQ(N/A/H)(V/I/L)KN, como representado pela SEQ ID NO: 105 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência

pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo II;

(iv) Motivo III A(L/M)TGTPXEN, como representado pela SEQ ID NO: 106 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%,

99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo III;

(v) Motivo IV (LZI)XF(TZS)Q(FAr), como representado pela SEQ ID NO: 107 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo IV;

(vi) Motivo V S(LA/)KAGG(VZTZL)G(LZI)(NZT)LTXA

(NZSZT)HV, como representado pela SEQ ID NO: 108 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%>, 85%>, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo V; (vii) Motivo Va DRWWNPAVE, como representado pela SEQ ID NO: 109 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo Va; e 5 (viii) Motivo VI QA(T/S)DR(A/TA/)(F/Y)R(I/L)GQ, como

representado pela SEQ ID NO: 110 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo VI,

onde X em Motivo Ia, Motivo III, Motivo IV, e Motivo V, é qualquer aminoácido.

Estes oito motivos estão compreendidos dentro do domínio de ATPase. O domínio de ATPase é compreendido (de terminação-N à terminação-C) entre o primeiro resíduo de aminoácido de Motivo Ieo último 15 resíduo de aminoácido na terminação-C do polipeptídeo SWI2/SNF2. O início e o término do domínio de ATPase estão marcados em Figura 8, e o próprio domínio de ATPase está identificado usando um bloco preto acima dos polipeptídeos alinhados. Um exemplo de um domínio de ATPase é o domínio de ATPase de SEQ ID NO: 30, representada pela SEQ ID NO: 111.

O logo de seqüência do domínio de ATPase dos 149 membros

de superfamília SWI2/SNF2 SSOl653 é representado em Flaus et al., (2006), e mostrado em Figura 6. Logos de seqüência são uma representação gráfica de um alinhamento de múltiplas seqüências de aminoácidos ou de ácido nucleico. Cada logo consiste de pilhas de símbolos, uma pilha para cada 25 posição na seqüência. A altura total da pilha indica a conservação de seqüência naquela posição, enquanto que a altura dos símbolos dentro da pilha indica a frequência relativa de cada aminoácido ou ácido nucleico naquela posição. Em geral, um logo se seqüência fornece uma descrição mais rica e mais precisa de, por exemplo, um sítio de ligação, do que forneceria uma seqüência de consenso. O algoritmo (WebLogo) para produzir tais logos está disponível no servidor da University of Califórnia, Berkeley. O domínio de ATPase como representado pela SEQ ID NO: 111, e compreendido em SEQ ID NO: 30, está de acordo com o logo de seqüência como representado 5 em Figura 6.

Uma árvore de junção de vizinhos radial não enraizada de polipeptídeos SWI2/SNF2 de numerosas subfamílias SWI2/SNF2 (incluindo SS01653) foi construída Flaus et al., (2006), como mostrado em Figura 7. O polipeptídeo como representado pela SEQ ID NO: 30 está compreendido 10 dentro do agrupamento SSO1653 (circulado na Figura), junto com todos os polipeptídeos archeal e bacterianos (coletivamente chamados de microbianos) polipeptídeos SWI2/SNF2.

Exemplo 10: Cálculo de identidade percentual global entre seqüências de polipeptídeo úteis na realização dos métodos da invenção

Percentagens globais de similaridade e identidade entre

seqüências de polipeptídeo de comprimento total úteis na realização dos métodos da invenção foram determinadas usando um dos métodos disponíveis na arte, o programa de computador MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. "MatGAT: an application that generates 20 similarity/identity matrices using protein or DNA sequences". Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; programa de computador hospedado por Ledion Bitincka). Programa de computador MatGAT gera matrizes de similaridade / identidade para seqüências de DNA ou proteína sem a necessidade de préalinhamento dos dados. O programa realiza uma série de alinhamentos 25 pareados usando o algoritmo de alinhamento global de Myers e Miller (com uma penalidade de abertura de lacuna de 12, e uma penalidade de extensão de lacuna de 2), calcula a similaridade e a identidade usando por exemplo Blosum 62 (para polipeptídeos), e então aplica os resultados em uma matriz de distância. Similaridade de seqüência é mostrada na metade inferior da linha divisória e identidade de seqüência é mostrada na metade superior da linha divisória diagonal.

Parâmetros usados na comparação foram:

Matriz de escore: Blosum62 Primeira lacuna: 12

Extensão de lacuna de: 2

Resultados da análise de programa de computados são mostrados em Tabela F para a similaridade e a identidade globais sobre as seqüências de polipeptídeo de comprimento total (excluindo as seqüências de polipeptídeo parciais). Identidade percentual é dada acima da diagonal e similaridade percentual é dada abaixo da diagonal.

A identidade percentual entre as seqüências de polipeptídeo SWI2/SNF2 de comprimento total da subfamília SS01653, úteis na realização dos métodos da invenção, varia entre 33 e 52% de identidade de aminoácido comparada com SEQ ID NO: 30 (Tabela F).

A identidade percentual entre o domínio de ATPase das seqüências de polipeptídeo SWI2/SNF2 da subfamília SSO1653, úteis na realização dos métodos da invenção, varia entre 45 e 70% de identidade de aminoácido comparadas com o domínio de ATPase como representado pela SEQ ID NO: 111, compreendido em SEQ ID NO: 30 (Tabela Fl). Tabela F: Resultados de MatGAT para similaridade e identidade globais sobre o comprimento total das seqüências de polipeptídeo SWI2/SNF2.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 l.Synco_SNF2 48 38 33 52 46 48 38 33 37 37 37 38 36 47 34 40 49 37 41 41 41 41 36 38 37 42 40 42 43 43 43 42 43 47 47 46 2. Anava_SNF2 64 40 32 53 52 60 38 34 37 38 38 38 35 76 36 66 94 38 42 40 41 41 36 40 37 43 38 43 42 42 43 43 42 48 48 48 3. Archaeon_RC-l_SNF2 57 60 34 39 40 40 41 34 40 42 42 39 36 41 36 32 41 38 36 36 37 37 36 39 38 38 33 37 37 36 37 37 37 39 39 39 4. Bacce_ATCC 10987_SNF2 49 48 52 33 34 33 33 33 32 34 34 31 34 32 32 26 32 34 30 30 28 28 33 32 35 29 27 29 30 30 30 29 29 33 33 34 5. Crowa_SNF2 68 70 60 51 47 53 36 34 36 36 36 35 32 52 35 43 53 38 41 40 38 38 33 36 34 39 34 39 38 38 38 39 39 44 44 45 6. Giovi_SNF2\ 62 67 59 51 65 53 38 34 39 40 40 38 37 52 37 41 52 39 41 40 40 40 37 40 40 43 39 43 41 42 42 42 42 46 46 49 7. Lyn_sp_SNF2 64 75 60 51 71 68 37 34 37 37 37 36 33 59 35 47 60 38 41 40 39 39 34 38 37 41 36 40 41 40 41 40 40 48 48 47 8. Metac_C2A_SNF2 55 56 60 50 56 56 57 34 90 42 42 38 36 38 36 30 38 47 36 35 35 35 36 41 38 37 33 36 36 36 36 37 36 36 36 38 9. MethuJF-1_SNF2 53 53 55 48 56 52 53 52 34 35 35 32 33 33 31 27 34 33 30 31 31 31 33 33 32 30 29 31 32 32 31 32 31 33 33 34 10. Metma_Goel_SNF2 55 56 60 48 55 56 57 95 52 41 41 38 35 38 36 29 38 47 35 34 35: 35 36 41 37 36 33 36 36 36 35 36 36 35 35 37 ll.Mycbo_SNF2 53 54 58 50 56 57 53 57 52 57 99 41 43 39 35 31 38 40 35 35 35 35 41 52 39 38 33 36 36 36 37 37 37 39 39 39 12. Myctu_SNF2 53 54 58 50 56 57 53 57 52 57 99 41 42 39 35 31 38 40 35 35 35 35 41 52 39 38 33 36 36 36 37 37 37 39 39 39 13. Myxxa_DK 1622_SNF2 53 55 56 46 53 54 54 55 49 56 54 54 38 39 33 30 38 37 33 33 36 36 37 43 41 37 34 36 37 36 37 37 36 37 37 37 14. Nocfa_IFM10l52_SNF2 51 51 52 51 51 55 51 50 48 51 55 55 50 35 33 27 35 37 31 33 35 35 64 43 40 35 32 35 36 35 36 36 36 37 37 37 15. Nodsp_SNF2 64 87 60 49 68 67 73 56 52 56 55 55 55 50 36 68 76 37 41 41 41 41 34 39 37 41 38 42 42 41 41 42 42 46 46 48 16. Nos_sp_PCC7120_SNF2 II 53 56 58 51 56 55 55 56 51 56 54 54 52 51 55 29 37 37 33 31 30 30 32 35 32 32 29 32 32 32 32 31 31 34 34 35 17. Nospu_PCC73102_SNF2 56 75 51 47 60 60 63 47 44 46 48 48 44 47 76 48 67 30 34 34 34 34 27 30 29 33 35 34 35 34 34 35 35 36 36 39 18. Nostoc_SNF2 64 97 60 48 70 67 76 57 53 56 54 54 55 51 86 58 76 38 43 41 41 41 36 39 37 42 38 42 42 42 42 43 43 48 48 48 19. Pe!ph_BU-l_SNF2 55 55 57 51 56 57 56 63 52 62 58 58 53 53 54 54 48 54 35 36 37 36 37 40 39 36 35 37 38 38 37 36 38 37 37 38 20. Proma_CCMP1375_SNF2 58 60 56 47 60 58 62 56 51 55 52 52 50 48 59 52 51 59 52 63 60 60 32 34 36 58 57 61 62 61 62 61 61 41 41 40 21. Proma_MIT9211_SNF2 58 58 55 46 60 58 61 55 50 54 53 53 50 50 59 52 51 59 54 78 66 66 32 35 35 61 61 66 66 65 65 66 65 42 42 40 22. Proma_MIT9303_SNF2 58 59 54 45 59 57 59 54 50 54 51 50 52 49 58 49 50 58 51 76 80 99 35 38 37 73 75 83 82 80 84 83 82 44 44 40 23. Proma_MIT9313_SNF2 58 58 54 43 58 57 59 54 50 54 51 51 52 49 58 49 50 58 51 76 80 99 35 38 37 72 75 84 82 79 84 83 82 44 44 39 24. Rho_sp_RHAl_SNF2 51 51 51 52 52 54 51 52 49 52 55 55 49 75 50 50 48 51 54 49 51 49 49 43 40 36 31 35 35 35 35 35 35 37 37 38 25. Saltr_CNB-440_SNF2 55 56 58 49 56 56 55 58 49 57 65 65 55 56 56 54 48 55 58 52 53 52 52 55 42 39 35 39 39 39 39 39 39 40 40 39 26. SymthJAM 14863_SNF2 53 53 56 51 53 58 52 53 50 53 55 55 53 54 53 52 47 53 55 52 52 51 51 55 56 38 35 37 38 38 37 37 38 37 37 39 27. Syn_sp_WH5701_SNF2 60 59 57 46 61 60 60 54 51 54 53 53 52 50 58 50 51 60 52 73 77 81 81 51 54 53 68 74 73 73 75 75 74 47 47 42 28. Syn_sp_BL107_SNF2 56 56 53 44 57 57 57 50 47 50 49 49 48 47 55 48 53 56 51 73 75 83 83 48 50 51 79 78 85 93 78 79 85 42 42 38 29. Syn_sp_CC9311_SNF2 59 60 56 44 60 60 61 55 51 54 52 52 51 49 59 52 51 60 52 77 81 89 89 49 54 51 83 86 84 83 89 91 85 45 45 41 30. Syn_sp_CC9605_SNF2 59 60 57 46 60 59 61 55 52 55 52 52 52 50 59 52 51 60 54 78 81 88 88 51 54 53 82 90 91 90 85 85 92 45 45 41 31. Syn_sp_CC9902_SNF2 59 59 56 46 61 59 61 55 51 54 52 52 51 50 59 52 52 60 54 77 80 88 88 50 54 54 82 94 91 95 83 84 91 46 46 41 32. Syn_sp_RS9916_SNF2 59 60 56 45 59 59 60 56 50 55 53 53 52 50 58 52 51 60 53 79 81 90 90 49 55 51 83 87 94 92 92 89 85 46 46 41 33. Syn_sp_WH7805_SNF2 58 60 55 45 60 58 61 55 52 55 52 52 51 49 59 51 51 60 52 77 81 89 89 49 54 51 83 85 94 91 90 94 85 46 46 41 34. Syn_sp_WH8102_SNF2 60 60 56 45 62 59 61 54 51 55 53 53 51 50 59 51 51 60 54 78 81 89 89 51 54 53 83 91 92 96 96 92 92 46 46 41 35. Synei_PCC6301_SNF2 63 65 58 50 63 64 66 53 52 53 54 54 51 52 65 54 57 66 56 59 59 59 59 53 56 53 62 58 60 61 61 60 60 61 99 48 36. Synel_PCC7942_SNF2 63 65 58 51 63 64 66 53 52 53 54 54 51 52 65 53 57 66 56 59 59 59 59 53 56 53 62 58 60 61 61 60 60 61 99 48 37. Theel_BP-l_SNF2 60 62 56 51 63 65 63 55 51 53 55 55 51 52 61 54 55 63 54 57 55 54 54 53 54 56 58 55 56 56 57 56 56 56 64 64 Tabela Fl: Resultados de MatGAT para a similaridade e a identidade globais entre o domínio de ATPase das seqüências de polipeptídeo SWI2/SNF2.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 1. ATPase_Synec_SNF2 65 52 50 70 63 63 63 54 50 52 52 52 52 51 65 48 45 65 53 54 55 57 57 52 52 57 49 56 57 58 58 56 57 63 63 62 2. ATPase_Anava_SNF2 77 55 50 70 69 69 72 54 50 53 54 54 54 52 85 51 60 97 53 55 52 55 55 54 51 56 47 56 56 55 56 56 56 65 65 67 3. ATPase_Archaeon\RC-I_SNF2 70 74 51 53 56 56 56 54 50 53 56 55 53 54 56 52 37 54 55 49 49 52 52 53 54 52 44 51 52 52 52 51 51 53 53 55 4. ATPaseJBacce_ ATCC10987_SNF2 67 67 72 50 49 49 50 49 51 49 49 49 46 48 50 49 35 50 50 46 46 46 46 49 50 46 38 45 46 44 47 45 45 49 49 50 5. ATPase_Crowa_SNF2 82 84 74 68 64 64 68 52 51 52 52 52 51 50 71 51 48 70 55 56 54 56 56 51 50 55 47 55 .55 55 55 56 56 63 63 63 6. ATPase_Glovi_SNF2 77 82 74 69 81 99 68 52 50 53 52 52 53 51 70 52 44 68 54 53 52 55 55 52 54 54 47 54 55 56 54 54 55 61 61 64 7. ATPase_Glovi_SNF2\ 77 82 74 69 81 99 68 52 50 53 52 52 53 51 70 52 44 68 54 53 52 55 55 52 54 54 47 54 55 56 54 54 55 61 61 64 8. ATPase_Lyn_sp_SNF2 77 86 75 69 83 82 82 53 51 52 51 51 51 49 72 49 47 72 53 53 51 54 54 51 51 55 46 54 55 55 55 55 55 64 64 62 9. ATPase_Metac_C2A_SNF2 70 71 74 67 71 71 71 72 49 92 55 55 51 52 55 53 36 53 65 49 49 51 51 53 53 51 43 51 51 52 51 51 51 50 50 54 10. ATPase_Methu_JF- 1_SNF2 69 70 71 69 73 70 70 70 67 48 51 51 47 48 49 49 35 50 49 43 43 45 45 ,50 50 43 38 43 44 44 44 44 43 50 50 52 11. ATPase__Metma_Goel_SNF2 70 70 74 67 70 70 70 71 96 67 54 54 51 51 54 52 34 52 64 48 48 50 50 52 51 50 43 50 51 51 49 49 50 50 50 53 12. ATPase_Mycbo_SNF2 68 70 73 67 70 71 71 69 69 69 69 99 54 60 54 50 36 54 55 47 46 48 48 59 52 50 40 48 48 48 48 48 49 51 51 54 13. ATPase_Myctu_SNF2 68 70 73 67 70 71 71 69 69 69 68 99 54 60 54 49 36 54 55 47 46 48 48 59 52 50 40 48 48 48 48 48 49 51 51 54 14, ATP ase_Myxxa_DK 1622_SNF2 67 69 70 63 67 70 70 69 69 63 69 68 68 55 53 46 35 53 50 45 47 49 49 •52 56 49 41 48 49 49 49 49 48 51 51 52 15. ATPase_Nocfa_IFM\l 0152_SNF2 68 69 69 65 69 70 70 66 68 65 68 73 73 67 51 49 35 52 55 46 47 49 49 75 55 49 41 49 49 48 48 49 50 50 50 52 16. ATPase_Nodsp_SNF2 77 91 76 69 85 82 82 85 71 70 71 71 71 69 70 52 58 86 53 55 53 57 57 53 52 56 47 56 57 56 56 56 56 65 65 68 17. ATPase_Nos_sp_PCC7120_SNF2\II 68 71 74 70 70 71 71 70 70 68 70 68 68 66 67 72 35 51 52 46 44 46 46 49 48 46 38 46 46 46 46 46 46 49 49 51 18. ATPase_Nospu_PCC\73102_SNF2 55 63 51 50 58 55 55 57 48 50 48 49 49 45 48 64 49 60 36 37 36 39 39 35 36 38 41 39 39 39 38 39 39 41 41 45 19. ATPase_Nostoc_SNF2 77 99 74 67 84 82 82 85 71 69 70 70 70 69 69 92 71 63 53 55 53 55 55 53 51 55 46 56 56 55 55 56 56 65 65 66 20. ATPase_Pelph_BU- 1_SNF2 70 71 72 70 73 73 73 71 79 68 79 72 72 68 71 72 70 49 71 51 52 55 55 55 56 52 45 54 54 54 53 53 54 52 52 54 21. ATPase_Proma_CCMP 1375_SNF2 71 71 69 66 73 72 72 71 67 64 67 66 66 64 63 73 64 49 72 68 71 71 71 48 50 69 61 70 70 70 70 71 70 57 57 56 22. ATPase_Proma_MIT\921 l_SNF2 72 70 69 63 73 72 72 72 67 63 67 67 66 63 65 72 65 48 71 69 83 74 73 47 49 69 61 72 73 72 71 72 72 56 56 54 23. ATPase_Proma_MlT\9303_SNF2 74 73 70 64 75 75 75 72 69 65 69 66 66 64 65 74 64 51 72 69 84 87 99 50 53 85 75 87 OO 86 87 86 88 59 59 57 Oo 24. ATPase_Proma_MIT9313_SNF2 74 73 69 64 75 75 75 72 69 65 69 66 66 64 65 74 64 51 72 69 84 87 99 50 53 85 75 87 88 86 87 86 88 59 59 57 25. ATPase_Rho_sp_RHAl_SNF2 69 71 70 66 72 70 70 69 71 67 71 74 74 67 83 73 68 50 71 73 66 65 66 66 55 50 42 50 50 50 50 50 50 52 52 52 26. ATPase_Symth_lAMI4863_SNF2 67 67 71 68 67 71 71 68 70 67 68 68 68 69 69 69 68 47 67 70 65 66 68 68 69 51 44 51 53 53 52 52 52 51 51 53 27. ATPase_Syn_sp_WH5701_SNF2 74 73 69 64 75 73 73 73 68 65 68 67 67 65 65 73 64 51 73 70 83 85 93 93 66 67 73 84 84 84 85 85 86 59 59 57 28. ATPase_Syn_sp_BL107_SNF2 64 62 60 57 66 65 65 63 58 54 58 56 55 55 57 63 55 54 62 60 73 74 81 82 59 58 80 74 79 84 75 74 79 51 51 49 29. ATPase_Syn_sp_CC9311JNF2 74 73 69 63 74 74 74 73 68 65 68 65 65 64 65 73 64 51 73 68 84 85 94 94 65 66 91 81 87 85 91 92 88 59 59 58 30. ATPase_Syn_sp_CC9605_SNF2 74 72 71 64 74 75 75 73 69 64 69 65 65 64 66 74 64 50 72 69 85 87 93 93 67 68 91 83 93 92 88 87 95 59 59 57 31. ATPase_Syn_sp_CC9902_SNF2 74 71 70 64 75 74 74 72 69 64 69 65 64 64 66 73 65 51 71 69 84 86 93 94 66 68 91 87 92 96 87 85 92 60 60 57 32. ATPase_Syn_sp_RS9916_SNF2 74 73 69 62 74 74 74 72 69 64 69 66 65 65 64 72 65 50 72 69 84 86 94 94 66 .66 91 81 96 94 93 92 88 60 60 57 33. ATPase_Syn_sp_WH\7805_SNF2 72 72 68 62 73 73 73 72 68 64 68 65 65 64 63 72 64 50 72 67 83 85 92 92 65 66 91 79 95 92 91 96 88 60 60 57 34. ATPase_Syn_sp_WH\8102_SNF2 74 72 70 63 75 75 75 73 69 64 69 66 65 64 65 73 64 50 72 69 84 87 94 94 66 68 92 84 93 97 96 94 92 59 59 56 35. ATPase_Synel_PCC6301_SNF2 75 79 70 70 78 76 76 79 67 68 67 66 66 66 67 79 69 52 78 70 73 72 74 74 66 68 74 63 74 73 73 74 73 74 99 63 36. ATPase_Synel_PCC7942_SNF2 75 79 70 70 78 76 76 79 67 68 67 66 66 66 67 79 69 52 78 70 73 72 74 74 66 68 74 63 74 73 73 74 73 74 99 63 37. ATPase_Theel_BP- 1_SNF2 75 78 72 69 79 79 79 76 69 71 69 68 68 66 67 79 70 54 78 71 71 70 71 71 69 69 72 63 72 71 71 72 71 71 76 76 Exemplo 11: Identificação de domínios compreendidos em seqüências de polipeptídeo úteis na realização dos métodos da invenção

O banco de dados Recurso Integrado de Famílias de Proteínas, Domínios e Sítios [Integrated Resource of Protein Families, Domains and 5 Sites] (InterPro) é uma interface integrada para bancos de dados de assinatura comumente usados para pesquisas baseadas em seqüência e texto. O banco de dados InterPro combina estes bancos de dados, que usam metodologias diferentes e graus variados de informação biológica sobre proteínas bem caracterizadas para derivar assinaturas de proteína. Bancos de dados 10 colaboradores incluem SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRtNTS, ProDom e Pfam, Smart e TIGRFAMs. Interpro está hospedado no European Bioinformatics Institute no Reino Unido.

Os resultados relevantes da varredura de InterPro da seqüência de polipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 30 são apresentados em 15 Tabela G. Polipeptídeos SWI2/SNF2 (ou enzimas de remodelagem) compartilham similaridade de seqüência com helicases (particularmente helicases SF2), que são enzimas capazes de catalisar a separação de fitas de DNA usando hidrólise de ATP. A similaridade de seqüência é limitada ao domínio de ATPase de ambos os tipos de enzimas.

Tabela G: Resultados de varredura de InterPro (números de acesso maiores) da seqüência de polipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 2.

Número de acesso em Descrição de InterPro Banco de dados Número de Nome de acesso InterPro originário acesso original IPR000330 SNF2 relacionado Pfam PFOO176 SNF2_N IPROO1650 Helicase, C-terminal Pfam PF00271 Helicase_C SMART SM00490 HELICc Profile PS51194 Helicase_CTER IPRO14001 DEAD- SMART SM00487 DEXDc semelhantehelicases, N-terminal IPRO14021 superfamília a de PROFILE PS51192 HelicaseATPBINDl Helicase e ligação de 2 ATP Exemplo 12: Clonagem de seqüência de ácido nucleico como representada pela SEQID NO: 29

A não ser que seja indicado de outro modo, técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolos padrão descritos em 5 (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) ou em Volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Métodos e materiais padrão para trabalho molecular de planta são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy, 10 publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications (UK).

O gene Synechocystis sp. PCC6803 SWI2/SNF2 foi amplificado por PCR usando como modelo DNA genômico Synechocystis sp. PCC6803. Iniciadores prm08774 (SEQ ID NO: 113; senso,: 5'ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgactatccacggtaattgg-3') e

prm08779 (SEQ ID NO: 114; inverso, complementar,: 5'ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcaatcggacgcttcggctt -3'), que incluem os sítios AttB para recombinação Gateway, foram usados para amplificação por PCR amplification. PCR foi realizada usando Hifi Taq DNA polimerase em 20 condições padrão. Um fragmento de PCR de comprimento esperado (incluindo sítios attB) foi amplificado e purificado também usando métodos padrão. A primeira etapa do procedimento Gateway, a reação BP, foi então realizada, durante a qual o fragmento de PCR recombinado in vivo com o plasmídeo pDONR201 para produzir, de acordo com a terminologia Gateway, 25 um "clone de entrada". Plasmídeo pDONR201 foi adquirido de Invitrogen, como parte da tecnologia Gateway®.

Exemplo 13: Construção de vetor de expressão usando a seqüência de ácido nucleico como representada pela SEQID NO: 29

O clone de entrada compreendendo SEQ ID NO: 29 foi subsequentemente usado em uma reação LR com um vetor de destinação usado para transformação de Oryza sativa. Este vetor continha como elementos funcionais dentro das bordas de T-DNA: um marcador selecionável de planta; um cassete de expressão detectável; um cassete Gateway 5 intensionado para recombinação LR in vivo com a seqüência de ácido nucleico de interesse já clonada no clone de entrada. Um promotor de betaexpansina de arroz (SEQ ID NO: 112) para expressão em tecidos jovens expansíveis estava localizado a montante deste cassete Gateway.

Após a etapa de recombinação LR, o vetor de expressão resultante pExp::SWI2/SNF2 (Figura 8) foi transformado em Agrobacterium cepa LBA4044 de acordo com métodos bem conhecidos na arte.

Exemplo 14: Transformação de planta

Veja Exemplo 5 acima para transformação de arroz Exemplo 15: Procedimento de avaliação fenotipica 15.1 Configuração de avaliação

Aproximadamente 35 transformantes de arroz TO independentes foram gerados. Os transformantes primários foram transferidos de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa para crescimento e colheita de semente Tl. Seis eventos, dos quais a progênie Tl segregou 3:1 20 para presença / ausência do transgene, foram retidos. Para cada um destes eventos, aproximadamente 10 plantas jovens Tl contendo o transgene (hetero- e homo-zigotos) e aproximadamente 10 plantas jovens Tl faltantes do transgene (nulizigotos) foram selecionadas por monitoração da expressão de marcador visual. As plantas transgênicas e os nulizigotos correspondentes 25 foram crescidas lado a lado em posições aleatórias. Condições da estufa foram de dias curtos (12 horas de luz), 28°C na luz e 22°C no escuro, e uma umidade relativa de 70%.

Cinco eventos Tl foram depois avaliados na geração T2 seguindo o mesmo procedimento de avaliação que o para a geração Tl mas com mais indivíduos por evento. Do estágio de semeadura até o estágio de maturidade as plantas foram passadas várias vezes através de uma cabine de imagem digital. Em cada instante de tempo imagens digitais (2048x1536 pixéis, 16 milhões de cores) foram tiradas de cada planta de pelo menos 6 ângulos diferentes.

Teste de estiagem

Plantas de cinco eventos (sementes T2) foram crescidas em solo de pote sob condições normais até alcançarem o estágio de cabeça. Foram então transferidas para uma seção "seca" onde irrigação foi impedida. 10 Sondas de umidade foram inseridas em potes aleatoriamente escolhidos para monitorar o teor de água do solo (SWC). Quando o SWC ficou abaixo de certos limites, as plantas foram automaticamente re-irrigadas continuamente até um nível normal ser de novo alcançado. As plantas foram então retransferidas de novo para condições normais. O resto do cultivo (maturação 15 de planta, colheita de semente) foi o mesmo que para as plantas não crescidas sob condições de estresse abiótico. Parâmetros de crescimento e rendimento são registrados conforme detalhado para crescimento sob condições normais. Teste de estresse salino

As plantas de arroz são crescidas sobre um substrato feito de fibras de coco e argex (razão de 3 para I). Uma solução de nutriente normal é usada durante as duas primeiras semanas após transplantação das plântulas na estuda. Após as primeiras duas semanas, sal (NaCl) 25 mM é adicionado na solução nutriente compreendendo os seguintes componentes listados abaixo.

• Mistura de nutrientes NPK, 20-20-20 Peters professional (Scotts, Marysville, OH, USA) em uma concentração de 1 kg/m .

• Quelato de magnésio, Chelal Mg (BMS, Bomem, Bélgica) a

333,33 ml/m3

• Quelato de ferro, Libfer (CIBA, Bradford, UK) a 21,67 g/m3

• NaCl 1.425 kg/cm3 Concentração de sal é monitorada em uma base semanal e adições são feitas onde necessário. Plantas são crescidas sob estas condições até o início do enchimento de grãos. São então transferidas para um compartimento diferente da estufa onde são irrigadas diariamente com água 5 fresca até colheita de semente. Parâmetros de rendimento e crescimento são registrados como para crescimento sob condições normais.

Teste de disponibilidade de nutriente (nitrogênio) reduzida

Plantas de arroz são crescidas em solo de pote sob condições normais exceto para a solução de nutriente. Os potes são irrigados da 10 transplantação até maturação com uma solução de nutriente específica contendo teor de nitrogênio (N) reduzido, costumeiramente entre 7 e 8 vezes menos. O resto do cultivo (maturação de planta, colheita de semente) é o mesmo que para plantas não crescidas sob estresse abiótico. Parâmetros de crescimento e rendimento são registrados conforme detalhado para 15 crescimento sob condições normais.

15.2 Análise estatística: teste-F

Uma ANOVA (análise de variância) de dois fatores foi usada como um modelo estatístico para a avaliação total de características fenotípicas de planta. Um teste-F foi realizado sobre todos os parâmetros de 20 todas as plantas de todos os eventos transformados com o gene da presente invenção. O teste-F foi realizado para checar um efeito do gene sobre todos os eventos de transformação e para verificar um efeito total do gene, também conhecido como efeito de gene global. O limite para significância para um efeito de gene global verdadeiro foi ajustado em um nível de probabilidade de 25 5% para o teste-F. Um valor de teste-F significativo aponta para um efeito de gene, significando que não é apenas a mera presença ou posição do gene que é causadora de diferenças em fenótipo.

15.3 Parâmetros medidos

Medição de parâmetros relacionados com biomassa Do estágio de semeadura até o estágio de maturidade as plantas foram passadas várias vezes através de uma cabine de imagem digital. Em cada instante de tempo imagens digitais (2048x1536 pixéis, 16 milhões de cores) foram tiradas de cada planta de pelo menos 6 ângulos diferentes. A área acima do solo da planta (ou biomassa foliar) foi determinada pela contagem total do número de pixéis sobre as imagens digitais das partes de planta acima do solo discriminadas do fundo. Este valor foi tomado na média para as fotografias tiradas no mesmo instante de tempo de ângulos diferentes e foi convertido para um valor de superfície física expressado em mm quadrado por calibração. Experimentos mostram que a área de planta acima do solo medida nesta maneira correlaciona-se com a biomassa de partes de planta acima do solo. A área acima do solo é a área medida no instante de tempo no qual a planta tinha alcançado sua biomassa foliar máxima. O vigor inicial é a área acima do solo de planta (planta jovem) três semanas após a germinação.

Para medir os parâmetros relacionados com raiz, plantas foram crescidas em potes especialmente projetados com fundos transparentes para permitir visualização das raízes. Uma câmara digital registrou imagens através do fundo do pote durante o crescimento da planta. Aumento em 20 biomassa de raiz é expressado como um aumento na biomassa total de raiz (medida como biomassa máxima de raízes observada durante o período de vida de uma planta); ou como um aumento no índice de raiz/broto (medido como a razão entre a massa de raiz e a massa de broto no período de crescimento ativo de raiz e broto). Ademais, o biomassa máxima de raízes 25 acima de uma certo limite de espessura observado durante o período de vida de uma planta é calculada (raízes espessas), bem como a biomassa máxima de raízes abaixo de um certo limite (raízes finas).

Medições de parâmetro relacionado com semente

As panículas primárias maduras foram colhidas, contadas, ensacadas, rotuladas com código de barras e então secas por três dias em um forno a 37°C. As panículas foram então debulhadas e todas as sementes foram colhidas e contadas. As cascas cheias foram separadas das vazias usando um dispositivo de sopro de ar. As cascas vazias foram jogadas fora e a fração 5 restante foi contada de novo. As cascas cheias foram pesadas em uma balança analítica. O número de sementes cheias foi determinado por contagem do número de cascas cheias que restaram após a etapa de separação. O peso total de sementes foi medido por pesagem de todas as cascas cheias colhidas de uma planta. O número total de sementes por planta foi medido por contagem 10 do número de cascas colhidas de uma planta. Peso de mil sementes (TKW) é extrapolado do número de sementes cheias contado e de seu peso total. O

r

índice de Colheita (HI) na presente invenção é definido como a razão entre o

2 · ·

peso total de sementes e a área acima do solo (mm ), multiplicado por um fator de IO6. O número total de flores por panícula como definido na presente 15 invenção é a razão entre o número total de sementes e o número de panículas primárias maduras. A taxa de enchimento de semente como definida na presente invenção é a proporção (expressada como uma%) do número de sementes cheias sobre o número total de sementes (ou flósculos).

Exemplo 16: Resultados da avaliação fenotípica das plantas transgênicas de arroz expressando a seqüência de ácido nucleico SWI2/SNF2, crescidas sob condições normais

Os resultados da avaliação das plantas transgênicas de arroz expressando a seqüência de ácido nucleico SWI2/SNF2, sob condições de crescimento normais, são mostrados em Tabela H abaixo.

Houve um aumento no número de flores por panícula, no peso

total de sementes por planta, no número total de sementes, no número de sementes cheias, e no índice de colheita das plantas transgênicas comparadas com os nulizigotos (controles). Tabela H. Resultados de avaliação de plantas transgênicas de arroz expressando a seqüência de ácido nucleico SWI2/SNF2, sob condições de crescimento normais.

Aumento% médio de eventos Aumento% médio de de melhor desempenho em eventos de melhor genação Tl desempenho em genação T2 Número de flores por panícula 11% 3% Peso total de sementes por planta 13% 28% Número total de sementes 14% 6% Número de sementes cheias 14% 25% índice de colheita 10% 25% Exemplo 17: Resultados da avaliação fenotípica de plantas transgênicas de

arroz, crescidas sob condições de estresse de estiagem

Os resultados da avaliação das plantas transgênicas de arroz expressando a seqüência de ácido nucleico SWI2/SNF2, sob condições de crescimento sob estresse de estiagem são apresentados em Tabela I.

Houve um aumento na área acima do solo, na biomassa de raiz total, no número de flores por panícula, na taxa de enchimento de semente, no peso total de sementes por planta, no número total de sementes, no número de sementes cheias, e no índice de colheita das plantas transgênicas comparadas com nulizigotos (controles).

Tabela I Resultados da avaliação de plantas transgênicas de arroz expressando a seqüência de ácido nucleico SWI2/SNF2, sob condições de crescimento sob estresse de estiagem.

Aumento% médio de eventos de melhor desempenho em genação T2 Area acima do solo 16% Biomassa total de raiz 13% Biomassa de raízes espessas 10% Biomassa de raízes finas 13% Número de flores por panícula 7% Taxa de enchimento de semente 28% Peso total de sementes por planta 57% Número total de sementes 44% Número de sementes cheias 54% índice de colheita 31% Exemplo 18: Exemplos de transformação de milho, alfafa, algodoeiro, feijão-soja, colza / canola, trigo

Veja Exemplo 5 acima.

Claims (47)

1. Método para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas em relação às plantas de controle, caracterizado pelo fato de compreender modular a expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG compreendendo: 23) em ordem crescente de preferência, pelo menos 35%, 40%,45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,95% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de polipeptídeo HpaG representada pela SEQ ID NO: 2; e24) uma composição de aminoácidos na qual o teor de glicina varia entre 13% e 25%, o teor de glutamina varia entre 13% e 20%, o teor de cisteína varia entre 0% e 1%, o teor de histidina varia entre 0% e 1%, e sendo que triptofano está ausente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo HpaG adicionalmente compreende um ou mais dos seguintes motivos: (i) (motivo 1): G(G/E/D)(N/E)X(Q/R/P)Q(A/S)GX(N/D)G (SEQ ID NO: 3), sendo que X em posição 4 pode ser qualquer aminoácido, preferivelmente um de S, N, P, R, ou Q, e sendo que X em posição 9 pode ser qualquer aminoácido, preferivelmente um de Q, E, S, ou P; e (ii) (motivo 2): (P/A/V)S(P/Q/A)(F/L/Y) TQ(M/A) LM(H/N/Q)IV(G/M)(E/D/Q) (SEQ ID NO: 4),

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que dita expressão modulada é realizada pelas introdução e expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG.

4. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que dito ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG é representado por qualquer um dos ácidos nucleicos listados em Tabela A ou uma sua porção, ou uma seqüência capaz de hibridizar com qualquer um dos ácidos nucleicos dados em Tabela A.

5. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que dita seqüência de ácido nucleico codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das proteínas dadas em Tabela A.

6. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que ditas características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas compreendem rendimento aumentado, preferivelmente biomassa aumentada e/ou rendimento de sementes aumentado em relação às plantas de controle.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que ditas características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas são obtidas sob condições de não-estresse.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que ditas características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas são obtidas sob condições de estresse abiótico.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, caracterizado pelo fato de que dito ácido nucleico está operacionalmente ligado em um promotor constitutivo, preferivelmente em um promotor GOS2, mais preferivelmente em um promotor GOS2 de arroz.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, caracterizado pelo fato de que dito ácido nucleico está operacionalmente ligado em um promotor específico de tecido verde, preferivelmente em um promotor de protoclorofilida redutase, mais preferivelmente em um promotor de protoclorofilida redutase de arroz.

11. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que dito ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG é de origem procariótica, preferivelmente de uma bactéria patogênica de planta possuindo um Sistema de Secreção de Tipo Três (TTSS), adicionalmente preferivelmente da família Pseudomonaceae, mais preferivelmente do gênero Xanthomonas, muito mais preferivelmente de Xanthomonas axonopodis.

12. Planta ou parte da mesma, incluindo sementes, caracterizada pelo fato de ser obtenível pelo método como definido em qualquer reivindicação precedente, sendo que dita planta ou sua parte compreende um ácido nucleico recombinante codificador de um polipeptídeo HpaG.

13. Construto, caracterizado pelo fato de compreender: (a) ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG como definido nas reivindicações 1 ou 2; (b) uma ou mais seqüências de controle capazes de dirigir a expressão da seqüência de ácido nucleico de (a); e opcionalmente (c) uma seqüência de terminação de transcrição.

14. Construto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que uma das ditas seqüências de controle é selecionada de: (i) um promotor constitutivo, preferivelmente um promotor GOS2, mais preferivelmente um promotor GOS2 de arroz; ou (ii) um promotor específico de tecido verde, preferivelmente um promotor de protoclorofilida redutase, mais preferivelmente um promotor de protoclorofilida redutase de arroz.

15. Uso de um construto como definido na reivindicação 13 ou14, caracterizado pelo fato de ser em um método de preparar plantas tendo rendimento aumentado, particularlmente biomassa aumentada e/ou rendimento de semente aumentado em relação às plantas de controle.

16. Planta, parte de planta ou célula de planta, caracterizada pelo fato de estar transformada com um construto como definido em qualquer uma das reivindicações 13 ou 14.

17. Método para produzir uma planta transgênica tendo rendimento aumentado, particularmente biomassa aumentada e/ou rendimento de semente aumentado, em relação às plantas de controle, caracterizado pelo fato de compreender: (i) introduzir e expressar em uma planta um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG como definido na reivindicação 1 ou 2; e (ii) cultivar a célula de planta sob condições que promovem o crescimento e o desenvolvimento da planta.

18. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de ter rendimento aumentado, particularmente biomassa aumentada e/ou rendimento de semente aumentado, em relação às plantas de controle, resultante da expressão aumentada de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HpaG como definido na reivindicação 1 ou 2, ou uma célula de planta transgênica derivada de dita planta transgênica.

19. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 12, 16 ou 18, ou uma célula de planta transgênica derivada da mesma, caracterizada pelo fato de que dita planta é uma planta de cultivo ou uma monocotiledônea ou um cereal, tal como arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, sorgo e aveia.

20. Partes colhíveis de uma planta como definida na reivindicação 19, caracterizadas pelo fato de ditas partes colhíveis serem preferivelmente sementes.

21. Produtos, caracterizados pelo fato de serem derivados de uma planta como definida na reivindicação 19 e/ou de partes colhíveis de uma planta como definida na reivindicação 18.

22. Uso de um ácido nucleico codificador de polipeptídeo HpaG, caracterizado pelo fato de ser em aumento de rendimento, particularmente em aumento de rendimento de semente, em plantas em relação às plantas de controle.

23. Método para aperfeiçoar características relacionadas ao rendimento em plantas em relação às plantas de controle, caracterizado pelo fato de compreender aumentar a expressão em uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWITCH 2/ SUCROSE NON-FERMENTING 2 (SWI2/SNF2), cujo polipeptídeo SWI2/SNF2 compreende um domínio de ATPase compreendendo da terminação-N até a terminação-C pelo menos cinco, preferivelmente seis, mais preferivelmente sete, muito mais preferivelmente oito dos seguintes motivos: (i) Motivo I LADDMGLGK(T/S), como representado pela SEQ ID NO: 103 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo I; (ii) Motivo Ia L(L/V/I)(V/I/L)(A/C)P(TMV)S(V/I/L) (V/I/L)XNW, como representado pela SEQ ID NO: 104 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%), 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo Ia; (iii) Motivo II DEAQ(N/A/H)(V/I/L)KN, como representado pela SEQ ID NO: 105 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo II; (iv) Motivo III A(L/M)TGTPXEN, como representado pela SEQ ID NO: 106 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo III; (v) Motivo IV (L/I)XF(T/S)Q(F/Y), como representado pela SEQ ID NO: 107 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo IV; (vi) Motivo VS(LA/)KAGG(V/T/L)G(L/I)(N/T)LTXA (N/S/T)HV, como representado pela SEQ ID NO: 108 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,75%), 80%, 85% , 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo V; (vii) Motivo Va DRWWNPAVE, como representado pela SEQ ID NO: 109 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ,99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo Va; e (viii) Motivo VI QA(TZS)DR(AZTAZ)(FAr)R(IZL)GQ, como representado pela SEQ ID NO: 110 ou um motivo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50%», 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ,90%), 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de Motivo VI, onde X em Motivo Ia, Motivo III, Motivo IV, e Motivo V, é qualquer aminoácido.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo SWI2ZSNF2, quando usado na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela mostrada em Figura 7, tende a se agrupar com o ciado SS01653 de polipeptídeos SWI2ZSNF2 compreendendo a seqüência de polipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 30 em vez de com qualquer outro ciado SWI2ZSNF2.

25. Método de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo SWI2ZSNF2 compreende um domínio de ATPase tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com o domínio de ATPase como representado pela SEQ ID NO: 111, compreendido em SEQ ID NO: 30.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações23 a 25, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo SWI2ZSNF2 tem em ordem crescente de preferência pelo. menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com o polipeptídeo SWI2/SlSnF2 como representado pela SEQ ID NO: 30 ou com qualquer uma das seqüências de polipeptídeo dadas aqui em Tabela E.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações23 a 26, caracterizado pelo fato de que dita seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 é representada por qualquer uma das seqüências de ácido nucleico SEQ ID NO dadas em Tabela E ou uma sua porção, ou uma seqüência capaz de hibridizar com qualquer uma das seqüências de ácido nucleico SEQ ID NO dadas em Tabela E.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações23 a 27, caracterizado pelo fato de que dita seqüência de ácido nucleico codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das SEQ ID NO dadas em Tabela E.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações23 a 28, caracterizado pelo fato de que dita expressão aumentada é realizada pelas introdução e expressão em uma planta de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações23 a 29, caracterizado pelo fato de que ditas características relacionadas ao rendimento são uma ou mais de: (i) número aumentado de flores por panícula; (ii) peso total de sementes aumentado por planta; (iii) número aumentado de sementes (cheias); ou (iv) índice de colheita aumentado.

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações23 a 30, caracterizado pelo fato de que ditas características relacionadas ao rendimento estão aperfeiçoadas em plantas crescidas sob condições de estresse abiótico, preferivelmente sob condições de estresse aquoso, mais preferivelmente sob condições de estresse de estiagem, em relação às plantas de controle crescidas sob condições de estresse comparáveis.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que ditas características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas são uma ou mais de: (i) área acima do solo aumentada; (ii) biomassa total de raiz aumentada; (iii) biomassa de raiz espessa aumentada; (iv) biomassa de raiz fina aumentada; (v) número aumentado de flores por panícula; (vi) taxa de enchimento de semente aumentada; (vii) peso total de sementes aumentado por planta; (viii) número aumentado de sementes (cheias); ou (ix) índice de colheita aumentado.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações23 a 32, caracterizado pelo fato de que dita seqüência de ácido nucleico está operacionalmente ligada em um promotor específico de tecido, preferivelmente em um promotor capaz de preferencialmente expressar a seqüência de ácido nucleico em tecidos jovens expansíveis, muito mais preferivelmente em um promotor de beta-expansina.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações23 a 33, caracterizado pelo fato de que dita seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 é de um genoma microbial, adicionalmente preferivelmente de archea ou bactérias, mais preferivelmente de cianobactérias, tais como Synechocystis sp., Nostoc sp., Synechococcus sp., Prochlorococcus sp., Anaebena sp., Gloeobacter sp., ou Thermosynechococcus sp., mais preferivelmente de Synechocystis sp., muito mais preferivelmente de Synechocystis sp. PCC6803.

35. Plantas, partes das mesmas (incluindo sementes), ou células de planta obteníveis por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 23 a 34, caracterizadas pelo fato de que dita planta, sua parte ou célula compreende um transgene de ácido nucleico isolado codificador de um polipeptídeo SWI2/SNF2.

36. Construto, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como definida em qualquer uma das reivindicações23 a 28; (b) uma ou mais seqüências de controle capazes de dirigir a expressão da seqüência de ácido nucleico de (a); e opcionalmente (c) uma seqüência de terminação de transcrição.

37. Construto de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que dita uma das ditas seqüências de controle é um promotor específico de tecido, preferivelmente um promotor para expressão em tecidos jovens expansíveis, muito mais preferivelmente um promotor de betaexpansina.

38. Uso de construto como definido nas reivindicações 36 ou37, caracterizado pelo fato de ser em um método para preparar plantas tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação às plantas de controle.

39. Planta, parte de planta ou célula de planta, caracterizada pelo fato de estar transformada com um construto como definido na reivindicação 36 ou 37.

40. Método para produzir plantas transgênicas tendo características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação às plantas de controle, caracterizado pelo fato de compreender: (i) introduzir e expressar em uma planta uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como definida em qualquer uma das reivindicações 23 a 28; e (ii) cultivar a célula de planta sob condições que promovem o crescimento e o desenvolvimento da planta.

41. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de ter características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas em relação às plantas de controle, resultante de expressão aumentada de uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como definida em qualquer uma das reivindicações 23 a 28, ou uma célula de planta transgênica derivada de dita planta transgênica.

42. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 35, 39 ou41, caracterizada pelo fato de que dita planta é uma planta de cultivo ou uma monocotiledônea ou um cereal, tal como arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, triticale, sorgo e aveia, ou uma planta transgênica derivada de dita planta transgênica.

43. Partes colhíveis de uma planta como definida na reivindicação 42, caracterizadas pelo fato de que ditas partes colhíveis são preferivelmente sementes.

44. Produtos, caracterizados pelo fato de serem derivados de uma planta como definida na reivindicação 42 e/ou de partes colhíveis de uma planta como definida na reivindicação 43.

45. Uso de uma seqüência de ácido nucleico codificador de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como definida em qualquer uma das reivindicações 23 a28, caracterizado pelo fato de ser no aperfeiçoamento de características relacionadas ao rendimento em plantas, preferivelmente em aumento de um ou mais de: (i) número aumentado de flores por panícula; (ii) peso total de sementes aumentado por planta; (iii) número aumentado de sementes (cheias); ou (iv) índice de colheita aumentado.

46. Uso de uma seqüência de ácido nucleico codificador de um polipeptídeo SWI2/SNF2 como definida em qualquer uma das reivindicações23 a28, caracterizado pelo fato de ser no aperfeiçoamento de características relacionadas ao rendimento em plantas, sendo que ditas características relacionadas ao rendimento estão aperfeiçoadas em plantas crescidas sob condições de estresse abiótico, preferivelmente sob condições de estresse aquoso, mais preferivelmente sob condições de estresse de estiagem, em relação às plantas de controle crescidas sob condições de estresse comparáveis.

47. Uso de uma seqüência de ácido nucleico como definida na reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que ditas características relacionadas ao rendimento aperfeiçoadas são uma ou mais de: (i) área acima do solo aumentada; (ii) biomassa total de raiz aumentada; (iii) biomassa de raiz espessa aumentada; (iv) biomassa de raiz fina aumentada; (v) número aumentado de flores por panícula; (vi) taxa de enchimento de semente aumentada; (vii) peso total de sementes aumentado por planta; (viii) número aumentado de sementes (cheias); ou (ix) índice de colheita aumentado.