BRPI0808551A2 - Composições de anticorpo para o receptor do fator de crescimento antiepidérmico recombinante - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES DE ANTICORPO PARA O RECEPTOR DO FATOR DE CRESCIMENTO ANTIEPIDÉRMICO RECOMBINANTE".

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo de anticorpos recom

binantes para uso na terapia de câncer em seres humanos. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) desempenha uma função importante na proliferação celular assim como na 10 apoptose, na angiogênese e no espalhamento metastásico, processos que são cruciais para a progressão de tumores (Salomon e outros, Crit. Rev. Oncology/Haematology, 19:183-232 (1995); Wu e outros, J. Clin. Invest., 95: 1897-1905 (1995); Karnes e outros, Gastroenterology, 114:930-939 (1998); Woodburn e outros, Pharmacol. Therap. 82: 241-250 (1999); Price e outros, 15 Eur. J. Cancer, 32A: 1977-1982 (1996)). De fato, estudos mostraram que o crescimento celular mediado pelo EGFR é aumentado em uma variedade de tumores sólidos incluindo câncer pulmonar de células não-pequenas, câncer de próstata, câncer de mama, câncer gástrico e tumores de cabeça e pescoço (Salomon DS e outros, Criticai Reviews in Oncology/Haematology, 20 19:183-232 (1995)). Além disso, é agora sabido que a ativação excessiva do EGFR na superfície das células cancerosas está associada com a doença avançada, o desenvolvimento de um fenótipo metastásico e um prognóstico fraco em pacientes com câncer (Salomon DS e outros, Criticai Reviews in Oncology/Haematology 19:183-232 (1995)).

Além disso, a expressão de EGFR é frequentemente acompa

nhada pela produção de Iigantes de EGFR, TGF-alfa e EGF entre outros, por células tumorais que expressam EGFR o que sugere que um ciclo autócrino participa da progressão destas células (Baselga e outros (1994) Pharmac. Therapeut. 64: 127-154; Modjtahedi e outros (1994) Int. J. Oncology. 4: 277- 30 296). O bloqueio da interação entre tais Iigantes de EGFR e EGFR, portanto, pode inibir o crescimento e a sobrevivência de tumores (Baselga e outros (1994) Pharmac. Therapeut. 64: 127-154). O EGFR é uma glicoproteína ligada à membrana com um peso molecular de aproximadamente 170 kDa. O EGFR consiste em um domínio de ligação ao Iigante externo glicosilado (621 resíduos) e um domínio citoplasmático (542 resíduos) conectados por um Iigador de transmembrana 5 curto de 23 aminoácidos. A parte extracelular do EGFR contém 25 pontes de dissulfeto e 12 sítios de glicosilação ligados a N e é geralmente considerada como consistindo em quatro subdomínios. As estruturas em cristal por raios X do EGFR sugerem que o receptor adota tanto uma conformação restrita autoinibida que não pode se ligar ao EGF (Ferguson e outros, Mol Cell, 10 2003, vol 11: 507-517) quanto uma conformação ativa que pode mediar a ligação ao Iigante de EGF e a dimerização do receptor (Garret e outros, Cell 2002, vol 110:763-773; Ogiso e outros, Cell, 2002, vol 110:775-787). Em particular, foi sugerido que o domínio I e o domínio Ill fornecem contribuições aditivas para a formação de um sítio de ligação ao Iigante de alta afinidade. 15 Os domínios Il e IV são regiões similares à Iaminina ricas em cisteína que estabilizam o dobramento das proteínas e contêm uma interface de dimerização de EGFR possível.

É sabido que o EGFR existe em um número de conformações diferentes na superfície celular, onde a conformação restrita ou fechada é a 20 mais freqüente. A conformação restrita não pode sofrer dimerização e, portanto, é inativa. O anticorpo terapêutico Erbitux é conhecido por estabilizar a conformação restrita através da ligação ao domínio Ill e do impedimento estérico do receptor em atingir o estado não restrito. Entretanto, alguns receptores ainda podem ser capazes de adotar a conformação não restrita, se 25 ligarem a Iigantes e sofrer dimerização. Um anticorpo monoclonal (mAb) será tipicamente eficiente somente na ligação contra uma das conformações e, portanto, não pode se dirigir eficientemente às células cancerosas que exibem outras conformações ou às células cancerosas que exibem uma variedade de conformações.

Os anticorpos monoclonais (mAbs) direcionados para o domínio

de ligação ao Iigante do EGFR podem bloquear a interação com os Iigantes do EGFR e, concomitantemente, a via de sinalização intracelular resultante. O Erbitux® (Cetuximab) é um anticorpo monoclonal quimérico de ser humano/camundongo recombinante que se liga especificamente ao domínio extracelular do (EGFR) humano. O Erbitux é composto das regiões Fv de um anticorpo anti-EGFR murino com regiões constantes de cadeias pe5 sada e leve kappa de IgGI humana e possui um peso molecular aproximado de 152 kDa. O Erbitux é produzido em cultura de células de mamífero (mieIoma murino). O Erbitux é aprovado para o tratamento de pacientes com câncer colorretal metastásico e cujo tumor expressa EGFR. Em adição, o Erbitux é utilizado em combinação com terapia de radiação para tratar paci10 entes com câncer de células escamosas de cabeça e pescoço que não pode ser removido por cirurgia ou como um tratamento de segunda linha de câncer de células escamosas de cabeça e pescoço que não teve sucesso com a terapia padronizada à base de platina.

O Vectibix® (panitumumab) é um anticorpo monoclonal kappa 15 lgG2 humano recombinante que se liga especificamente ao EGFR humano. O Vectibix possui um peso molecular aproximado de 147 kDa. O Panitumumab é produzido em células de mamíferos engenheiradas geneticamente (Ovário de Hamster Chinês). O Vectibix é aprovado para o tratamento de pacientes com câncer colorretal metastásico e cujo tumor expressa EGFR 20 com progressão da doença ou após regimes de quimioterapia contendo fluoropirimidina, oxaliplatina e irinotecano.

Um número de receptores de EGF mutantes foi identificado nas células tumorais humanas. Isto pode tornar a atividade do receptor independente da ligação ao Iigante (EGFRvIlI) levando à maior tumorigenicidade. Os 25 anticorpos monoclonais contra um EGFR mutante podem ser gerados, mas tal anticorpo monoclonal não será necessariamente eficiente contra o EGFR não-mutado.

Foram identificadas mutações de EGFR em pacientes humanos com câncer que afetam sua resposta à quimioterapia direcionada para o EGFR. A WO 2006/110478 (Novartis) divulgou 43 mutações assim como 18 SNPs nos quadros abertos de leitura do EGFR. Algumas mutações de sentido errado são identificadas em dois ou mais tipos de tumores. A WO 2006/091899 (Amgen) divulgou oito mutações adicionais identificadas em várias células cancerosas. Uma ou mais destas mutações podem estar localizadas no epitopo ou afetar a estrutura do epitopo ligado por um dos anticorpos monoclonais aprovados atualmente. Os pacientes que carregam tal(is) mutação(ões) não poderão ser tratados por um anticorpo monoclonal.

Além disso, há relatos na literatura que mostram a heterogeneidade na glicosilação de pelo menos um dos sítios de glicosilação (Whitson e outros, 2005 Biochemistry 44:14920-31; Zhen e outros 2003 Biochemistry 42; 5478-92). Tal heterogeneidade pode resultar diretamente ou indireta10 mente na exposição diferencial de epitopos que variam entre as células tumorais.

A citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) é um mecanismo alternativo através do qual os anticorpos mediam a morte das células tumorais. O nível de ADCC é dependente de vários fatores incluindo 15 o subtipo de IgG (lgM>lgG1>lgG2), a densidade de anticorpo nas célulasalvo, o padrão de glicosilação do anticorpo assim como as propriedades do próprio alvo.

Friedmann e outros (PNAS 2005, 102:1915-20) mostraram que dois anticorpos monoclonais murinos selecionados em relação à sua capaci20 dade de inibir a ligação do EGF ao EGFR através da ligação de epitopos de EGFR distintos são capazes de regular para menos de forma sinérgica a expressão do receptor em células KB e em células CHO que expressam de forma transitória EGFR. Os anticorpos de inibição de EGF de competição cruzada não exibiam qualquer sinergia.

Modjtahedi e outros (Cell Biophysics vol 22, 1993, 129-146) tes

taram combinações de vários anticorpos anti-EGFR de rato com epitopos que não se sobrepõem. Os anticorpos eram de isotipos diferentes. Em todos os casos o efeito de utilizar dois anticorpos era intermediário entre os efeitos de utilizar quantidades similares dos dois anticorpos monoclonais isoladamente. Isto foi confirmado tanto in vivo quanto in vitro.

A WO 2004/032960 (Merck Patent) descreve que o uso combinado de dois anticorpos monoclonais, Mab425 e Mab225 (Cetuximab), resulta em uma maior quantidade de anticorpos ligados à superfície de células cancerosas que expressam EGFR comparada a uma quantidade similar de cada um dos anticorpos monoclonais isoladamente. A publicação também descreve maior regulação para menos do EGFR quando é utilizada a combinação de anticorpos comparada com os dois anticorpos monoclonais.

Perera e outros (Clin Cancer Res 2005; 11(17):6390-99) descreveram um efeito sinérgico de tratamento de camundongos que carregam xenoenxertos de U87MG.de2-7 com uma combinação de dois anticorpos monoclonais murinos. Um dos anticorpos (mAb 528) se liga a todos os subtipos de EGFR com especificidade similar à do cetuximab. O outro (mAB 806) se liga apenas ao de2-7 EGFR. A linhagem de células U87MG.de2-7 é uma linhagem de células transfectada com de2-7EGFR. A linhagem de células U87MG.DK expressa uma variação inativa de quinase do de2-7 EGFR. Não foi observada sinergia quando os dois anticorpos foram utilizados contra os camundongos que carregam os xenoenxertos de U87MG.DK. Em um modelo de xenoenxerto com a linhagem de células A431 expressando EGFR do tipo selvagem, os autores não forneceram evidência de sinergia. O de2-7 EGFR está presente apenas em um número limitado de tipos de cânceres, tal como glioma, até alguma extensão câncer de mama e cânceres pulmonares.

Embora estes estudos tenham indicado que em alguns casos a sinergia possa existir entre dois anticorpos monoclonais murinos, estes também mostram que em muitos casos, não é observada sinergia. Os estudos também não fornecem uma composição de anticorpo anti-EGFR que é efici25 ente contra uma faixa ampla de linhagens de células cancerosas clinicamente relevantes.

Consequentemente, existe uma necessidade de anticorpos terapêuticos melhorados contra EGFR que sejam eficientes no tratamento e/ou na prevenção de doenças relacionadas à superexpressão de EGFR 30 quando administrados em dosagens baixas. Há ainda uma necessidade de anticorpos terapêuticos para câncer que possam ser amplamente aplicados que possam ser utilizados sem possuir conhecimento profundo em relação à estrutura do EGFR expresso pelas células cancerosas em questão. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição de anticorpos recombinantes que compreende pelo menos 3 moléculas de anti5 corpos anti-EGFR distintas, em que os anticorpos se ligam aos primeiro, segundo e terceiro epitopos distintos do EGFR.

Em um aspecto adicional a invenção refere-se a uma composição de anticorpos recombinantes que compreende pelo menos duas moléculas de anticorpos para EGFR distintas, em que uma molécula de anticorpo 10 anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste nos anticorpos: 992, 1024, 1030, 1042, 1208, 1229, 1254, 1257, 1260, 1261, 1277, 1284, 1308, 1320, 1344 e 1347 ou dos anticorpos que possuem as CDRs destes anticorpos.

Preferencialmente, pelo menos uma molécula de anticorpo anti15 EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste nos anticorpos 992, 1030, 1024, 1347, 1277, 1254, 1320, 1260, 1261 e 1284 ou dos anticorpos que possuem as CDRs destes anticorpos. Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, a composição de anticorpos compreende os anticorpos 992 e 1024 ou dois anticorpos baseados em suas seqüências 20 CDR3 ou em suas seqüências VL e VH ou compreende dois anticorpos com essencialmente a mesma especificidade de ligação.

As composições de anticorpos representativas da invenção provaram ser eficientes na inibição da proliferação de linhagens de células cancerosas representativas, que é indicativo de um uso in vivo no tratamento de 25 câncer. Estes resultados foram confirmados em um ensaio com esferoides de células cancerosas, que pode ser mais representativo da situação in vivo, quando as células cancerosas formam tumores. Além disso, uma composição de anticorpos da invenção parece reduzir a motilidade das células dos esferoides de câncer e assim reduz a propensão de formar metástases. A 30 eficiência in vivo em um modelo de xenoenxerto também foi demonstrada com uma composição de anticorpos representativa. Estes resultados foram confirmados com uma composição de anticorpos particularmente preferida que consiste nos anticorpos 992 e 1024.

Em um modelo de xenoenxerto de câncer humano em camundongos, uma composição de anticorpos representativa da invenção resultou em um grau significativamente maior de diferenciação terminal das células 5 tumorais quando comparado ao de anticorpos monoclonais disponíveis comercialmente, Vectibix e Erbitux. Parece que a composição de anticorpos preferida da invenção funciona através de um mecanismo de ação diferente comparado com o dos anticorpos monoclonais uma vez que nenhum novo crescimento de tumor foi observado após o término do tratamento com a 10 composição de anticorpos da invenção. Um novo crescimento do tumor é observado após o término do tratamento com anticorpos monoclonais.

Em estudos de ligação, os inventores demonstraram que parte dos anticorpos fornecidos com o presente relatório descritivo parece facilitar a ligação de anticorpos adicionais, aumentando assim a quantidade total de 15 anticorpo ligado ao receptor. Foi também demonstrado que a ligação de três anticorpos do Domínio Ill facilita a ligação subsequente de anticorpos adicionais. Estas observações apoiam claramente o conceito de utilização de uma composição com pelo menos 3 moléculas de anticorpos anti-EGFR distintas, em que os anticorpos se ligam aos primeiro, segundo e terceiro epitopos 20 distintos do EGFR. O efeito também pode ser obtido utilizando combinações específicas de dois anticorpos da invenção através da seleção de anticorpos que fornecem este efeito específico. Tais anticorpos são candidatos preferidos para a mistura com outros anticorpos.

As composições da invenção podem fornecer várias vantagens 25 adicionais. As células cancerosas expressam uma variedade de EGFR. A variação é observada na conformação, na glicosilação e na estrutura primária (mutações e SNPs). Um único anticorpo monoclonal pode ser direcionado, mas não a todas estas variações de EGFR. Os mutantes de EGFR podem ser mutantes de escape para anticorpos monoclonais. Um anticorpo 30 que compreende dois anticorpos da invenção ou três ou mais anticorpos distintos que se ligam a epitopos do EGFR distintos é menos suscetível a mutantes, SNPs, mutantes de deleção e variações na glicosilação. Isto é evidenciado pela eficiência ampla das misturas de anticorpos da presente invenção contra um conjunto de linhagens de células cancerosas humanas, representando diversas conformações e variações de EGFR.

A administração de um anticorpo monoclonal também pode não desativar a atividade de quinase do EGFR completamente. Uma inibição mais eficiente da sinalização pode ser conseguida através de uma combinação de anticorpos.

Pode ser, portanto, benéfico incluir anticorpos que se ligam a conformações de EGFR diferentes (por exemplo, a conformação não restrita e o dímero de receptor) em uma mistura de anticorpos. Tal mistura de anticorpos pode ser mais potente na inibição da atividade de EGFR que um anticorpo monoclonal que se liga apenas a uma das conformações.

Além disso, através da utilização de uma abordagem com três ou mais anticorpos anti-EGFR na composição pode ser possível aumentar a densidade dos anticorpos na superfície das células tumorais aumentando assim a morte através da ADCC quando comparada a dos anticorpos monoclonais.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para a produção de uma composição de anticorpos que compreende:

a) a transfecção de uma primeira população de células eucarió

ticas com um primeiro construto de expressão que codifica um primeiro anticorpo que compreende um primeiro par cognato de cadeias Vh e Vl capaz de se ligar a um primeiro epitopo de EGFR distinto;

b) a transfecção de uma segunda população de células eucarióticas com um segundo construto de expressão que compreende um segundo anticorpo que compreende um segundo par cognato de cadeias Vh e Vl capaz de se ligar a um segundo epitopo de EGFR distinto;

c) a repetição opcional da etapa b) para a terceira ou populações adicionais, construtos de expressão, pares cognatos e epitopos de

EGFR;

d) a seleção das primeira, segunda e opcionalmente populações de células adicionais transfectadas; e) a combinação das populações transfectadas em um recipiente para a obtenção de um banco de células;

f) a cultura das células do banco de células sob condições que permitam a expressão dos anticorpos; e

g) a recuperação e a purificação da composição de anticorpos

do sobrenadante.

Para facilitar a produção, o processamento a jusante e a caracterização de todos os anticorpos compreendem a mesma região constante de cadeia pesada.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um banco de

células que compreende pelo menos duas subpopulações de células eucarióticas; cada subpopulação transfectada ou transduzida com um construto de expressão que codifica um anticorpo que compreende um par cognato de cadeias Vh e Vl capaz de se ligar a um epitopo de EGFR distinto. Preferen15 cialmente, as células são transfectadas utilizando integração específica ao sítio.

Além disso, a invenção refere-se a um método de redução da sinalização de EGFR que compreende a administração a uma composição de células que expressam EGFR, de uma composição de anticorpos da invenção e a redução da sinalização do EGFR.

A invenção refere-se ainda a um método de morte das células que expressam EGFR que compreende a administração a uma composição de células que expressam EGFR, de uma composição de anticorpos de qualquer uma da invenção e a morte das células que expressam EGFR.

É também fornecido um método de indução da apoptose nas

células que expressam EGFR, que compreende a administração a uma composição de células que expressam EGFR, de uma composição de anticorpos da invenção, induzindo assim a apoptose.

Um aspecto adicional refere-se a um método de inibição da proliferação de células que expressam EGFR que compreende a administração a uma composição de células que expressam EGFR, de uma composição de anticorpos da invenção inibindo assim a proliferação. A invenção refere-se a um método de indução da diferenciação de células tumorais in vivo, que compreende a administração a um indivíduo que sofre de câncer, de uma composição de anticorpos da invenção, induzindo assim a diferenciação das células tumorais. Este aspecto baseia-se 5 nos efeitos observados na diferenciação terminal in vivo de células cancerosas quando expostas a uma composição de anticorpos da invenção.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a artigos farmacêuticos que compreendem uma composição de anticorpos da invenção e pelo menos um composto capaz de induzir a diferenciação de células cance10 rosas como uma combinação para a administração simultânea, separada ou sucessiva na terapia de câncer. Combinando as composições de anticorpos da invenção com agentes conhecidos por induzirem a diferenciação terminal das células cancerosas, o efeito pode ser adicionalmente aumentado.

Ainda em um aspecto adicional, a invenção refere-se a artigos 15 farmacêuticos que compreendem uma composição de anticorpos da invenção e pelo menos um composto quimioterapêutico ou antineoplásico como uma combinação para a administração simultânea, separada ou sucessiva na terapia de câncer. É provável que a composição de anticorpos da invenção possa ser utilizada para um tratamento de segunda linha, isto é, após ou 20 simultaneamente com o tratamento que utiliza agentes quimioterapêuticos ou antineoplásicos convencionais ou após ou simultaneamente com terapia de radiação e/ou cirurgia.

Em um aspecto separado é fornecido um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em um ácido nucleico que possui a sequên25 cia de ácido nucleico mostrada na Figura 23 (SEQ ID NO: 100); um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que possui a seqüência de aminoácidos mostrada na Figura 23 (SEQ ID NO: 101); um ácido nucleico que possui a seqüência de ácido nucleico mostrada na Figura 34A (SEQ ID NO: 102); e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que possui a seqüência de 30 aminoácidos mostrada na Figura 34B (SEQ ID NO: 103). Além disso, é fornecido um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na Figura 23 (SEQ ID NO: 101) e um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na Figura 34B (SEQ ID NO: 103), vetores de expressão que compreendem o dito ácido nucleico que é definido anteriormente ligado de forma operacional a uma seqüência promotora capaz de direcionar a expressão do dito ácido nucleico e uma célula transfectada ou transduzida com o dito vetor de expressão.

Estas seqüências constituem as seqüências de polinucleotídeos e de polipeptídeos de EGFR de Cinomólgo, isto é, de Macaca fascicularis. Esta espécie de macaco é um animal amplamente utilizado para estudos toxicológicos. Para uma espécie de animal ter valor em um estudo toxicoló10 gico envolvendo anticorpos contra antígenos próprios humanos, é essencial que os anticorpos também se liguem à proteína-alvo no tox-animal, preferencialmente com aproximadamente a mesma afinidade. O teste de anticorpos para a ligação ao EGFR de cinomólgo foi tornado agora possível com a contribuição dos presentes inventores. Os EGFR de cinomólgos e humano 15 são proteínas altamente homólogas, mas de forma surpreendente foi descoberto um número de anticorpos com afinidade muito diferente para EGFR humano e de cinomólogos. Isto enfatiza a importância de utilização da proteína EGFR exata de cinomólogos para a verificação, que foi fornecida pelos presentes inventores.

Além disso, é fornecido um método para a verificação de anti

corpos em relação à ligação ao EGFR de cinomólgo, que compreende as etapas de

- fornecimento de pelo menos um anticorpo de teste;

- realização de um ensaio para determinar a ligação do anticorpo ao domínio extracelular do EGFR de cinomólgo (Figura 23, SEQ ID NO:

101) ou ao EGFR de cinomólgo de comprimento completo (Figura 34B, SEQ ID NO: 103); ou à superfície das células que expressam o domínio extracelular de EGFR de cinomólgo ou a expressão do EGFR de cinomólgo de comprimento completo;

- e seleção de pelo menos um anticorpo que se liga ao domínio

extracelular do EGFR de cinomólgo.

O método pode compreender ainda a verificação em relação à ligação ao domínio extracelular do EGFR humano ou à ligação com as células que expressam o EGFR humano.

Em um aspecto adicional a invenção refere-se a um método para a identificação de anticorpos anti-EGFR capazes de aumentar a ligação simultânea de outro anticorpo anti-EGFR ao EGFR, o dito método compreendendo

a. Em um primeiro ensaio, a determinação da capacidade de ligação máxima de um primeiro anticorpo em relação a uma quantidade fixa de antígeno de EGFR,

b. Em um segundo ensaio, a saturação de uma quantidade fixa

de antígeno de EGFR com um segundo anticorpo anti-EGFR,

c. O contato do complexo EGFR-anticorpo com o dito primeiro anticorpo e a determinação da capacidade de ligação máxima e

d. A comparação das capacidades de ligação para determinar se a capacidade de ligação máxima da etapa c. excede a capacidade de

ligação máxima da etapa a.

Este ensaio pode ser utilizado para identificar combinações adicionais de anticorpos que possuem propriedades similares àquelas dos anticorpos 992 e 1024.

Definições

O termo "anticorpo" descreve um componente funcional do soro e é frequentemente referido como uma coleção de moléculas (anticorpos ou imunoglobulina) ou como uma molécula (a molécula de anticorpo ou a molécula de imunoglobulina). Uma molécula de anticorpo é capaz de se ligar ou 25 de reagir com um determinante antigênico específico (o antígeno ou o epitopo antigênico), que por sua vez pode levar à indução de mecanismos efetores imunológicos. Uma molécula de anticorpo individual é geralmente considerada monoespecífica e uma composição de moléculas de anticorpos pode ser monoclonal (isto é, consistindo em moléculas de anticorpos idênticas) ou 30 policlonal (isto é, consistindo em duas ou mais moléculas de anticorpos diferentes que reagem com o mesmo ou com epitopos diferentes no mesmo antígeno ou até mesmo em antígenos diferentes distintos). Cada molécula de anticorpo possui uma estrutura exclusiva que possibilita que se ligue especificamente ao seu antígeno correspondente e todas as moléculas de anticorpos naturais possuem a mesma estrutura básica geral de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Os anticorpos também são cole5 tivamente conhecidos como imunoglobulinas. É também pretendido que os termos anticorpo ou anticorpos como utilizados aqui incluam anticorpos quiméricos e de cadeia isolada, assim como fragmentos de ligação de anticorpos, tais como Fab, fragmentos Fv ou fragmentos scFv, assim como formas multiméricas tais como moléculas de IgA diméricas ou IgM pentavalentes. 10 Um anticorpo pode ser humano, murino, quimérico, humanizado ou remoldado.

O termo "par cognato codificador de Vh e VL" descreve um par original de seqüências que codificam Vh e Vl contidas dentro ou derivadas da mesma célula que produz anticorpo. Assim, um par cognato de Vh e Vl representa o pareamento de Vh e Vl originalmente presente no doador do qual tal célula é derivada. O termo "um anticorpo expresso partindo de um par codificador de Vh e VL" indica que um anticorpo ou um fragmento de anticorpo é produzido partindo de um vetor, plasmídeo ou similar que contém a seqüência que codifica Vh e Vl. Quando um par cognato que codifica Vh e Vl é expresso, na forma de um anticorpo completo ou na forma de um fragmento estável do mesmo, este preserva a afinidade e a especificidade de ligação do anticorpo originalmente expresso da célula do qual é derivado. Uma biblioteca de pares cognatos é também chamada de um repertório ou uma coleção de pares cognatos e pode ser mantida individualmente ou agrupada.

O termo "CDR" - região de determinação de complementaridade é como definida em Lefranc e outros (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-Iike domains. Dev. Comp Immunol 27, 55-77.

O termo "um membro distinto de uma proteína policlonal recom

binante" significa uma molécula de proteína de uma composição de proteínas que compreende moléculas de proteínas diferentes, mas homólogas, em que cada molécula de proteína é homóloga às outras moléculas da composição, mas também contém um ou mais filamentos de seqüência de polipeptídeo variável, que é/são caracterizado(s) por diferenças na seqüência de aminoácidos entre os membros individuais da proteína policlonal.

O termo "promotores cabeça-a-cabeça" refere-se a um par de

promotores que é colocado em proximidade íntima de forma que a transcrição de dois fragmentos gênicos controlada pelos promotores ocorre em direções opostas. Um promotor cabeça-a-cabeça também pode ser construído com um preenchimento ("stuffer") composto de ácidos nucleicos irrelevantes 10 entre os dois promotores. Tal fragmento de preenchimento pode conter facilmente mais de 500 nucleotídeos. Os promotores cabeça-a-cabeça também podem ser chamados de promotores bidirecionais.

O termo "imunoglobulina" é comumente utilizado como uma denominação coletiva da mistura de anticorpos encontrada no sangue ou no soro, mas também pode ser utilizada para denominar uma mistura de anticorpos derivada de outras fontes.

O termo "molécula de imunoglobulina" significa uma molécula de anticorpo individual, por exemplo, como sendo uma parte da imunoglobulina ou uma parte de qualquer composição de anticorpos policlonais ou monoclonais.

O termo "uma biblioteca de variações de moléculas de ácidos nucleicos de interesse" é utilizado para descrever a coleção de moléculas de ácidos nucleicos, que codificam coletivamente uma "proteína policlonal recombinante de interesse". Quando utilizada para transfecção, a biblioteca de 25 variações de moléculas de ácidos nucleicos de interesse está contida em uma biblioteca de vetores de expressão. Tal biblioteca possui tipicamente pelo menos 2, 3, 5, 10, 20, 50, 1000, 104, 105 ou 106 membros distintos.

O termo "transferência de massa" é utilizado para descrever a transferência de seqüências de ácidos nucleicos de interesse de uma população de vetores para uma outra população de vetores e fazendo isso para cada DNA simultaneamente sem recorrer ao isolamento dos DNAs individuais de interesse. Tais populações de vetores podem ser bibliotecas que contêm, por exemplo, regiões variáveis, promotores, líderes ou elementos intensificadores de interesse. Estas seqüências podem então ser movidas sem o isolamento prévio, por exemplo, de um vetor de fago para um vetor de expressão de mamífero. Especialmente para as seqüências de anticorpos, esta 5 técnica garante que a ligação entre a diversidade de Vh e Vl não é perdida enquanto que as bibliotecas são movidas, por exemplo, de um vetor de seleção (por exemplo, um vetor de exibição de fago) para um vetor de expressão de mamífero. Dessa maneira o pareamento original de Vh e Vl é mantido.

Como utilizado aqui, o termo "ligado de forma operacional" refe10 re-se a um segmento que está ligado a outro segmento quando colocado em uma relação funcional com o outro segmento. Por exemplo, o DNA que codifica uma seqüência sinal está ligado de forma operacional ao DNA que codifica um polipeptídeo se este for expresso na forma de um líder que participa na transferência do polipeptídeo para o retículo endoplasmático. Ainda, um 15 promotor ou um intensificador está ligado de forma operacional a uma seqüência codificadora se este estimular a transcrição da seqüência.

O termo "anticorpo policlonal" descreve uma composição de moléculas de anticorpos diferentes que é capaz de se ligar a ou de reagir com vários determinantes antigênicos específicos diferentes no mesmo ou 20 em antígenos diferentes. Geralmente, acredita-se que a variabilidade de um anticorpo policlonal esteja localizada nas assim chamadas regiões variáveis do anticorpo policlonal. Entretanto, no contexto da presente invenção, a policlonalidade pode também ser entendida para descrever diferenças entre as moléculas de anticorpos individuais que residem nas assim chamadas regi25 ões constantes, por exemplo, como no caso de misturas de anticorpos que contêm dois ou mais isotipos de anticorpos tais como os isotipos humanos IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2 ou os isotipos murinos IgGI, lgG2a, lgG2b, lgG3 e IgA. Para as finalidades da presente invenção tal anticorpo policlonal também pode ser denominado "uma composição de anticorpos".

O termo "epitopo" é comumente utilizado para descrever uma

proporção de uma molécula maior ou de uma parte de uma molécula maior (por exemplo, antígeno ou sítio antigênico) que possui atividade antigênica ou imunogênica em um animal, preferencialmente um mamífero e mais preferencialmente em um ser humano. Um epitopo que possui atividade imunogênica é uma parte de uma molécula maior que ativa uma resposta de anticorpo em um animal. Um epitopo que possui atividade antigênica é uma par5 te de uma molécula maior à qual um anticorpo se liga de forma imunoespecífica que é determinada através de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, através dos ensaios imunológicos descritos aqui. Os epitopos antigênicos não precisam necessariamente ser imunogênicos. Um antígeno é uma substância à qual um anticorpo ou um fragmento de anticorpo se liga 10 de forma imunoespecífica, por exemplo, toxina, vírus, bactérias, proteínas ou DNA. Um antígeno ou um sítio antigênico possui frequentemente mais de um epitopo, a não ser que seja muito pequeno e é frequentemente capaz de estimular uma resposta imunológica. Os epitopos podem ser lineares ou conformacionais. Um epitopo linear consiste em aproximadamente 6 até 10 15 aminoácidos adjacentes em uma molécula de proteína que são reconhecidos por um anticorpo. Em contraste, um epitopo conformacional consiste em aminoácidos que não estão dispostos seqüencialmente. Aqui o anticorpo reconhece apenas a estrutura tridimensional. Quando uma molécula de proteína se dobra em uma estrutura tridimencional, os aminoácidos que formam 20 o epitopo são justapostos possibilitando que o anticorpo reconheça a seqüência. Em uma proteína desnaturada somente o epitopo linear pode ser reconhecido. Um epitopo conformacional, por definição, tem que estar do lado de fora da proteína dobrada. Um anticorpo que reconhece o epitopo conformacional pode apenas se ligar sob procedimentos não desnaturantes 25 suaves. Os anticorpos que se ligam a epitopos diferentes no mesmo antígeno podem ter efeitos variáveis sobre a atividade do antígeno ao qual se ligam dependendo da localização do epitopo. Um anticorpo que se liga a um epitopo em um sítio ativo do antígeno pode bloquear a função do antígeno completamente, enquanto que um outro anticorpo que se liga a um epitopo 30 diferente pode não ter ou ter pouco efeito sobre a atividade do antígeno isoladamente. Tais anticorpos podem, entretanto, ainda ativar o complemento e resultar assim na eliminação do antígeno e pode resultar em efeitos sinérgicos quando combinados com um ou mais anticorpos que se ligam a epitopos diferentes no mesmo antígeno. Na presente invenção, o epitopo é preferencialmente uma proporção do domínio extracelular do EGFR. Os antígenos da presente invenção são preferencialmente proteínas, polipeptídeos ou 5 fragmentos dos mesmos do EGFR do domínio extracelular aos quais um anticorpo ou um fragmento de anticorpo se liga de forma imunoespecífica. Um antígeno associado ao EGFR pode também ser um análogo ou um derivado do domínio extracelular do polipeptídeo do EGFR ou de um fragmento do mesmo ao qual um anticorpo ou um fragmento de anticorpo se liga de 10 forma imunoespecífica.

Os anticorpos capazes de competir com cada outro em relação à ligação ao mesmo antígeno podem se ligar aos mesmos ou a epitopos sobrepostos ou podem ter um sítio de ligação na vizinhança próxima um do outro, de forma que a competição é principalmente causada por impedimen15 to estérico. Os métodos para a determinação da competição entre os anticorpos são descritos nos exemplos.

Como utilizado aqui, o termo "proteína policlonal" ou "policlonalidade" refere-se a uma composição de proteínas que compreende moléculas de proteínas diferentes, mas homólogas, preferencialmente selecionadas da superfamília das imunoglobulinas. Assim, cada molécula de proteína é homóloga às outras moléculas da composição, mas também contém um ou mais filamentos de seqüência de polipeptídeo variável, que é/são caracterizado(s) por diferenças na seqüência de aminoácidos entre os membros individuais da proteína policlonal. Os exemplos conhecidos de tais proteínas policlonais incluem moléculas de anticorpos ou de imunoglobulinas, receptores de células T e receptores de células B. Uma proteína policlonal pode consistir em um subconjunto definido de moléculas de proteínas, que foi definido por uma característica comum tal como a atividade de ligação compartilhada em direção a um alvo desejado, por exemplo, no caso de um anticorpo policlonal contra o antígeno-alvo desejado.

Por "proteína" ou "polipeptídeo" entende-se qualquer cadeia de aminoácidos, independentemente do comprimento ou da modificação póstradução. As proteínas podem existir na forma de monômeros ou de multímeros, que compreendem duas ou mais cadeias de polipeptídeos montadas, fragmentos de proteínas, polipeptídeos, oligopeptídeos ou peptídeos.

O termo "RFLP" refere-se a "polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição", um método através do qual o padrão de migração no gel dos fragmentos da molécula de ácido nucleico é analisado após a clivagem com enzimas de restrição.

O termo "mistura" descreve situações em que dois ou mais membros distintos de uma proteína policlonal compreendida de duas cadei10 as de polipeptídeos diferentes, por exemplo, da superfamília de imunoglobulina, são expressos partindo de uma célula individual. Esta situação pode ocorrer quando a célula individual tiver integrado, no genoma, mais de um par de segmentos gênicos, em que cada par de segmentos gênicos codifica um membro distinto da proteína policlonal. Em tais situações podem ser fei15 tas combinações inesperadas das cadeias de polipeptídeos expressas partindo dos segmentos gênicos. Estas combinações inesperadas de cadeias de polipeptídeos poderiam não ter qualquer efeito terapêutico.

O termo "mistura de cadeias Vh-Vl" é um exemplo da mistura definida anteriormente. Neste exemplo os segmentos gênicos que codificam Vh e Vl 20 constituem um par de segmentos gênicos. A mistura ocorre quando as combinações inesperadas de polipeptídeos de Vh e Vl são produzidas partindo de uma célula em que dois pares diferentes de segmentos gênicos que codificam Vh e Vl são integrados na mesma célula. Não é provável que tal molécula de mistura de anticorposda mantenha a especificidade original e assim 25 poderia não ter qualquer efeito terapêutico.

O termo "transfecção" é utilizado aqui como um termo amplo para a introdução de DNA estranho em uma célula. Entende-se ainda que o termo cubra outros métodos equivalentes funcionais para a introdução de DNA estranho em uma célula, tal como, por exemplo, transformação, infecção, transdução ou fusão de uma célula doadora e uma célula receptora.

Os termos "seqüência de polipeptídeo variável" e "região variável" são utilizados de forma intercambiável. O termo "epitopos distintos" significa que quando dois anticorpos diferentes se ligam a epitopos distintos, há uma competição menor que 100% pela ligação ao antígeno, preferencialmente uma competição menor que 50% pela ligação ao antígeno, mais preferencialmente essencialmente 5 nenhuma competição pela ligação ao antígeno. Uma análise em relação aos "epitopos distintos" de pares de anticorpos é tipicamente determinada através de experimentos de ligação sob condições de saturação de anticorpo com análise de FACS nas células que expressam EGFR e anticorpos marcados de forma fluorescente individualmente ou Ressonância de Plasmônio 10 de Superfície utilizando antígeno de EGFR capturado ou conjugado a uma superfície de célula de fluxo como descrito nos exemplos.

O termo sendo capaz de "inibir a ligação do EGF" quando aplicado a uma molécula de anticorpo significa que a molécula de anticorpo exibe um valor de IC 50 em relação à ligação do EGF ao EGFR menor que 10 nM, preferencialmente menor que 8 nM, mais preferencialmente menor que

7 nM, mais preferencialmente menor que 5 nM, mais preferencialmente menor que 4 nM, mais preferencialmente menor que 3 nM, mais preferencialmente menor que 2 nM, mais preferencialmente menor que 2 nM, mais preferencialmente menor que 1 nM.

Os termos "receptor do fator de crescimento epidérmico", "EG

FR" e "antígeno de EGFR" são utilizados aqui de forma intercambiável e incluem variações, isoformas e homólogos de espécies do EGFR humano. Em uma modalidade preferida, a ligação de um anticorpo da invenção ao antígeno de EGFR inibe o crescimento de células que expressam EGFR (por 25 exemplo, uma célula tumoral) através da inibição ou do bloqueio da ligação do Iigante de EGFR ao EGFR. O termo "ligante de EGFR" abrange todos (por exemplo, fisiológicos) os Iigantes para EGFR, incluindo, mas não limitados a EGF, TGF-alfa, EGF que se liga à heparina (HB-EGF), anfirregulina (AR), herregulina, beta-celulina e epirregulina (EPI). Em uma outra modali30 dade preferida, a ligação de um anticorpo da invenção ao antígeno de EGFR medeia a fagocitose das células efetoras e/ou a morte de células que expressam EGFR. Estrutura do domínio do EGFR: A parte extracelular do EGFR maduro (SwissProt acc.#P00533) consiste em 621 aminoácidos e quatro domínios receptores: O domínio I abrange os resíduos 1-165, o domínio Ii os resíduos 166-312, o domínio Ill os resíduos 313-481 e o domínio IV os 482- 5 621 (Cochran e outros 2004 J immunol. Methods 287, 147-158). Foi sugerido que os domínios I e Ill contribuem para a formação de sítios de ligação de alta afinidade para os ligantes. Os domínios Il e IV são regiões similares à Iaminina ricas em cisteína que estabilizam o dobramento das proteínas e contêm uma possível interface de dimerização de EGFR.

Como utilizado aqui, é pretendido que o termo "inibe o cresci

mento" (por exemplo, referindo-se às células) inclua qualquer decréscimo mensurável na proliferação (aumento no número de células) ou no metabolismo de uma célula quando colocada em contato com um anticorpo antiEGFR quando comparado com o crescimento das mesmas células que não 15 estão em contato com um anticorpo anti-EGFR, por exemplo, a inibição do crescimento de uma cultura de células em pelo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 100%.

Como utilizado aqui, os termos "inibe a ligação" e "bloqueia a ligação" (por exemplo, referindo-se à inibição/bloqueio da ligação do Iigante de EGFR ao EGFR) são utilizados de forma intercambiável e abrangem a inibição/bloqueio tanto parcial quanto completo. A inibição/bloqueio do Iigante de EGFR ao EGFR preferencialmente reduz ou altera o nível normal ou o tipo de sinalização celular que ocorre quando o Iigante de EGFR se liga ao EGFR sem inibição ou bloqueio. É também pretendido que a inibição e o bloqueio também incluam qualquer decréscimo mensurável na afinidade de ligação do Iigante de EGFR ao EGFR quando em contato com um anticorpo anti-EGFR quando comparado com o Iigante que não está em contato com um anticorpo anti-EGFR, por exemplo, o bloqueio dos ligantes de EGFR ao EGFR em pelo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%,50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 100%.

O termo "anticorpo recombinante" é utilizado para descrever uma molécula de anticorpo ou várias moléculas que são expressas partindo de uma célula ou uma linhagem de células transfectada com um vetor de expressão que compreende a seqüência codificadora do anticorpo que não está associado naturalmente com a célula.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1 Separação de esplenócitos (para detalhes, vide o

Exemplo 1). São realizadas as saídas a seguir (representadas):

• Saída 1: Células vivas (representação gráfica de FSC/lodeto de Propídio). (Painel esquerdo inferior)

• Saída 2: As células plasmáticas são passadas na forma de CD43 pos/CD138 pos. (painel direito inferior)

• Saída 3: discriminação de pares (painel direito superior)

Figura 2 mSymplex® PCR Murino. RT-PCR com extensão em

sobreposição Multiplex para a amplificação e a ligação cognata de genes de anticorpos de cadeias pesada e leve de uma única célula. Para detalhes, referência é feita ao Exemplo 1.

Figura 3 Clonagem do repertório murino. Um conjunto de produtos da mSymplex® PCR que codificam os pares gênicos de VH/VL de células plasmáticas isoladas foi unido ao gene que codifica a cadeia leve constante kappa humana através da junção pela extensão por sobreposição. O conjun20 to de genes, que codifica anticorpos quiméricos humanos-murinos completos, foi inserido em um vetor de expressão seguido por uma inserção de um cassete promotor bidirecional (2xCMV).

Figura 4 A Representação esquemática do vetor de expressão 00-VP-002 do anticorpo de comprimento completo de mamífero. Amp e Amp 25 pro, gene de resistência à ampicilina e seu promotor; origem de pUC, origem de replicação de PUC; CMV, promotor de mamífero que controla a expressão da cadeia leve e da cadeia pesada; Líder de IGHV, líder genômico da cadeia pesada humana; preenchimento H ("Stuffer"), inserto que é trocado pela seqüência codificadora da região variável de cadeia pesada; IGHG1, 30 seqüência que codifica a região constante da cadeia pesada do isotipo G1 da imunoglobulina genômica (a seqüência é mostrada no Apêndice 2); Bglobina A de coelho, seqüência poliA da beta-globina de coelho; Líder de IGKV1 líder kappa murino; Preenchimento L, inserto que é trocado pela seqüência codificadora da cadeia leve; SV40 term, seqüência terminadora do vírus símio 40; FRT1 sítio-alvo de reconhecimento de Flp; Neo1 gene de resistência à neomicina; poli A de SV40, seqüência sinal poli A do vírus símio 40.

Figura 5 Análise em grupo da diferença de absorbância em 450- 620 nm. Os sobrenadantes são agrupados em relação à reatividade que é indicada pelo número (1 até 4) após o N- do clone. Cinza-escuro indica um decréscimo no número de células metabolicamente ativas, enquanto que 10 cinza-claro indica um aumento no número de células metabolicamente ativas. Preto indica sobrenadantes sem efeito sobre o número de células metabolicamente ativas.

Figura 6 Grau de inibição de anticorpos Anti-EGFR com anticorpos de referência listados direcionados contra domínios de EGFR específi15 cos que é determinado em um ELISA competitivo. A) Cálculo da inibição. B) Classificação da inibição como a seguir: 25 - 49%: Competição moderada (+); 50 - 74%: Competição forte (++); 75 - 100%: Competição muito forte (+++). As caixas que exibem inibição significativa (50-100%) estão sombreadas em cinza. Erbitux e Vectibix são mostrados em duplicatas (quatro expe20 rimentos independentes) para ilustrar a capacidade de reprodução do ensaio. Ab2 (225) é o precursor murino que leva ao Erbitux.

Figura 7: Ilustração de um ciclo de mapeamento de epitopo realizado na máquina Biacore 3000 SPR, em que uma mAb da amostra é submetido à competição de ligação ao domínio extracelular de EGFR com quatro anticorpos de referência diferentes.

Figura 8: Grau de inibição de anticorpos Anti-EGFR com anticorpos de referência listados direcionados contra domínios de EGFR específicos que é determinado através da análise de competição com tecnologia de. A) Cálculo da inibição. B) Classificação da inibição como a seguir: 25 30 49%: Competição moderada (+); 50 - 74%: Competição forte (++); 75 100%: Competição muito forte (+++). As células que exibem inibição significativa (50-100%) estão sombreadas em cinza. O clone 1229 marcado com * não se ligava no ensaio Biacore.

Figura 9: Determinação de grupos de epitopos dentro do repertório de anticorpos Anti-EGFR através da análise de competição de SPR dos pares de anticorpos Anti-EGFR. Os anticorpos são agrupados de acordo 5 com o reconhecimento dos domínios de EGFR presumidos. As células nas quais foi observado que as combinações de anticorpos se ligavam aos epitopos sobrepostos resultando em mais de 50% de inibição estão sombreadas em cinza. As células nas quais as determinações não foram realizadas estão coloridas de preto. A) Cálculo da inibição. B) Classificação da inibição 10 como a seguir: 25 - 49%: Competição moderada (+); 50 - 74%: Competição forte (++); 75 -100%: Competição muito forte (+++).

Figura 10: Mapas de epitopos de anticorpos de referência e anticorpos Anti-EGFR direcionados contra o domínio extracelular de EGFR que são determinados através da análise Biacore. A) Mapa de epitopos de anti15 corpos direcionados contra o domínio I ou o domínio l/ll do Domínio Extracelular (ECD) do EGFR. B) Mapa de epitopos de anticorpos direcionados contra o domínio NI do ECD do EGFR.

Figura 11: Investigação da ligação simultânea de uma mistura oligoclonal de anticorpos direcionados contra epitopos que não se sobrepõem no EGFR. A) Adição seqüencial de anticorpos contra o domínio III, o domínio I ou especificidade desconhecida. Os valores de inibição de mAbs de amostras isoladas testados contra misturas de mAb diferentes ou mAb isolado são mostrados nas caixas sombreadas. Os valores de Ru max utilizados para calcular a inibição também são mostrados. B) Análise de competição de seis mAbs de amostras distintas direcionados contra epitopos que não se sobrepõem no EGFR e uma mistura de anticorpos contendo os seis anticorpos testados. As misturas de anticorpos quando o anticorpo da amostra testada não era incluído serviam como um controle positivo. Os valores de inibição de mAbs de amostras isoladas testados contra misturas de mAb diferentes são mostrados nas caixas sombreadas. Os valores de Ru max utilizados para calcular a inibição também são mostrados. C) Sensogramas correspondentes da análise em B ilustrando o bloqueio do anticorpo e, em alguns casos, o aumento da ligação do anticorpo. D) Teste de anticorpos adicionais direcionados contra os domínios I, l/ll e especificidade desconhecida contra as seis misturas de anticorpos mAb.

Figura 12: Determinação do bloqueio do Iigante de EGF media5 do por anticorpo através da titulação do anticorpo no EGFR de comprimento completo e detecção da ligação ao Iigante de EGF biotinilado com um reagente HRP com estreptavidina. Erbitux, Vectibix e Synagis IgG (palivizumab) foram utilizados como controles positivo e negativo respectivamente. Após o bloqueio do epitopo do anticorpo reconhecido com os anticorpos testados, o 10 grau de competição do Iigante de EGF foi visualizado através da adição de 0,1 pg/mL de Iigante de EGF biotinilado e um conjugado de EstreptavidinaHRP secundário para detecção.

Figura 13. Efeito do pré-tratamento com os anticorpos indicados sobre a fosforilação do EGFR induzida pelo EGF (50 ng/mL) em células 15 HN5. Os anticorpos (10 pg/mL) que são citados no gráfico foram incubados com as células durante 30 min antes da adição do EGF durante 7,5 min. Os conjuntos de dados marcados com * eram significativamente diferentes do conjunto de dados de controle ((-)ctrl) (p<0,05). A. 1208 tinha um efeito protetor significativo sobre a fosforilação do EGFR. B. 1277 e 1320 protegem 20 significativamente contra a fosforilação induzida por EGF. As barras de erro representam os desvios-padrão de três experimentos independentes.

Figura 14. Análise de western em célula de EGFR fosforilado (pEGFR) e EGFR nas células HN5. A mistura significa a mistura equimolar dos anticorpos 992, 1030 e 1042 a uma concentração final de 10 pg/mL, os 25 outros anticorpos foram utilizados em uma concentração de 10 pg/mL cada. 50 pg/mL de EGF foram adicionados durante 7,5 min antes da fixação para estimular a fosforilação do EGFR. As barras de erro representam os desviospadrão de 6 (ctlr-) ou de 3 pontos de dados separados (992, 1030, 1042, mistura ou erbitux). O 992, o 1030, a mistura e o erbitux tinham um efeito 30 protetor significativo (* = p<0,05) sobre a fosforilação.

Figura 15. O efeito da incubação de anticorpos na internalização do EGFR. Os dados são mostrados como a percentagem de receptores removidos da superfície celular em relação à coloração inicial. As barras de erros correspondem a SEM.

Figura 16: Curvas de crescimento de células A431-NS na presença de concentrações variáveis dos anticorpos 992, 1030 e 1042 e misturas dos mesmos que são medidas pela percentagem de células metabolicamente ativas quando comparadas ao controle não tratado. 1001 é um anticorpo não-funcional com isotipo similar utilizado como controle negativo.

Figura 17: Curvas de crescimento de células A431-NS na presença de 10 Mg/mL dos anticorpos 992, 1030 e 1042 e misturas dos mesmos e concentrações variáveis do EGF Iigante do EGFR que são medidas pela absorbância em 450 nm. 1001 é um anticorpo não-funcional com isotipo similar utilizado como controle negativo.

Figura 18: Curvas de crescimento de células A431-NS na presença de concentrações variáveis do anticorpo 992 e misturas do 992 e anticorpos com epitopos não-sobrepostos presentes no domínio I, Il ou III. 1001 é um anticorpo não-funcional com isotipo similar utilizado como controle negativo.

Figura 19. Apoptose em células A431NS. A mistura de EGFR, os anticorpos monoclonais individuais, Erbitux e Vectibix foram testados em diluições de 10 vezes. O complexo de histona-DNA de células apoptóticas foi medido utilizando um kit de ELISA da Roche.

Figura 20. Quatro grupos de 10 camundongos Balb/C Nu/Nu nus foram inoculados com 1x106 células A431NS. Quando os tumores tinham aproximadamente 100 mm3, o tratamento foi iniciado. Os grupos foram 25 injetados com 1 mg/mL de anticorpos cinco vezes durante o experimento como indicado com setas. Os diâmetros dos tumores foram medidos com calibres digitais. Os resultados são mostrados como o volume médio do tumor (± SEM).

Figura 21. Quando os camundongos individuais foram mortos no experimento mostrado na figura 20, os tumores foram cortados e pesados. São mostrados os valores médios ± SEM. As estrelas indicam significância em P<0,05. Figura 22. Crescimento de esferoides de A431-NS na presença de 10 pg/mL dos anticorpos 1001, Erbitux, Vectibix e uma mistura de três anticorpos com epitopos não-sobrepostos 992+1030+1042. 1001 é um anticorpo não-funcional com isotipo similar utilizado como controle negativo.

Figura 23: Seqüência de DNA (SEQ ID NO: 100) e de proteína

(SEQ ID NO: 101) do domínio extracelular de EGFR de cinomólogos clonado do cDNA derivado da epiderme da pele do macaco cinomólogos.

Figura 24: Alinhamento da seqüência de proteína obtida do ECD do EGFR de cinomólogos (SEQ ID NO: 101) com o ECD do EGFR humano (SEQ ID NO: 108) obtido no GENBANK número de acesso X00588. É também mostrada uma seqüência consenso (SEQ ID NO: 109).

Figura 25: Exemplo de discriminação por ensaio de ELISA entre espécies com reação cruzada e anticorpos específicos às espécies que se ligam ao ECD do EGFR Humano ou de cinomólogos ou ambos.

Figura 26: Fotomicrografias de seções representativas de tumo

res de cada um dos quatro grupos experimentais de camundongos que sofreram xenoenxertos. Em um aumento de 200x, as setas apontam para os focos de diferenciação terminal de células A431 in vivo. Observar focos notavelmente maiores e mais numerosos de diferenciação terminal no tumor 20 tratado com uma mistura de três clones anti-EGFR (992+1030+1042), dois painéis superiores.

Figura 27: A) Imagens feitas em um aumento de 40x de esferoides de HN5 24 horas após a adição de 10 pg/mL do anticorpo de controle. (Rituximab, anti CD-20) ou a mistura de anticorpos anti EGFR de 992 e 1024. B) Quantificação da área coberta pelas células utilizando o software Image J (* p<0,01).

Figura 28. Diagrama que mostra os níveis de Involucrin nos quatro grupos de tratamento na forma da percentagem do grupo de controle não tratado (*#np<0,005 quando comparado com Erbitux, Vectibix e o Grupo de controle negativo respectivamente).

Figura 29. A) Imagens feitas em aumentos de 60 x de células HN5 e A431NS incubadas com 10 pg/mL de Erbitux marcado com Alexa-488 TI ou 992+1024 durante 2 horas. B) Imagens feitas em aumentos de 60 x com um orifício pequeno de células A431NS incubadas com 10 Mg/mL de Erbitux marcado com Alexa-488 ou 992+1024 durante 2 horas.

Figura 30. A) Imagens feitas em aumentos de 60 x de células HN5 incubadas com 10 pg/mL de Erbitux marcado com Alexa-488 ou 992+1024 durante os períodos de tempo indicados.

Figura 31: Determinação da especificidade de apresentação de antígenos de Fabs 992, 1024 & 1030 através de titulações em série de anticorpos nas células A431-NS e EGFR de comprimento completo purificado 10 em ELISA. Os anticorpos Fab ligados foram visualizados através de um conjugado de HRP específico anti-Fab Humano de Cabra secundário. A) Anticorpos Fab testados contra o EGFR de comprimento completo purificado das células A431. B) Anticorpos Fab testados contra EGFR expresso na superfície de células A431-NS.

Figura 32: Determinação da afinidade funcional de IgG e frag

mentos Fab dos anticorpos 992, 1024, 1030, Erbitux & Vectibix através da titulação em série em células A431-NS fixas em paraformaldeído em ELISA. Os anticorpos Fab e IgG ligados foram visualizados através de um conjugado de HRP específico a anti-Fab Humano de Cabra secundário. O anticorpo 20 F antiproteína RSV Synagis foi empregado como um anticorpo de controle negativo e não exibia qualquer ligação no ensaio de ELISA empregado. A) Ligação funcional de anticorpos IgG às células A431-NS. B) Ligação funcional de anticorpos Fab às células A431-NS.

Figura 33: Determinação do aumento da ligação de IgG ao EG25 FR nas células A431-NS após a saturação prévia do receptor com fragmentos Fab que se ligam a epitopos que não se sobrepõem. Foi permitido que os fragmentos Fab indicados saturassem o epitopo de EGFR reconhecido nas células A431-NS durante 30 min após os quais os anticorpos IgG especificados foram titulados em série e o IgG ligado com ou sem a adição de 30 Fab foi visualizado através de um conjugado de HRP anti-Fc Humano de Camundongo secundário. A) Características de ligação do IgG 992 às células A431-NS com ou sem a saturação prévia do receptor com fragmentos Fab indicados. B) Características de ligação de IgG 1024 às células A431- NS com ou sem a saturação prévia do receptor com fragmentos Fab indicados. C) Características de ligação de IgG 1030 às células A431-NS com ou sem a saturação prévia do receptor com os fragmentos Fab indicados.

Figura 34: cDNA do EGFR de comprimento completo de cino

mólogos (Figura 34A; SEQ ID NO: 102) e proteína codificada (figura 34B; SEQ ID NO: 103).

Figura 35: Apoptose obtida em A431 NS com 1 pg/mL dos anticorpos/combinações indicados. Os complexos de Histona-DNA foram detectados em um kit de ELISA da Roche. Os níveis de apoptose foram relacionados a um controle positivo (apoptose máxima).

Figura 36: Os camundongos Balb/C nu/nu receberam injeção de 1x106 células A431NS. Quando os tumores tinham uma média de aproximadamente 100 mm3, os tratamentos foram iniciados. Os camundongos receberam 17 injeções com anticorpo. O primeiro tratamento começando no dia

8 e o último no dia 34. O anticorpo/composições foram injetados a 0,5 mg/dose ou 0,17 mg/dose. São mostrados os valores médios de volume de tumor ± SEM.

Figura 37: Inibição da proliferação de A431NS. O eixo X mostra combinações representativas diferentes de 3 anticorpos da invenção. O eixo Y mostra a atividade metabólica como a percentagem do controle não tratado (controle). As barras de erro representam + SEM. Para detalhes adicionais vide o Exemplo 6.

Figura 38. Efeito inibidor do crescimento de duas doses diferen25 tes da mistura de 992+1024 comparada com o Erbitux em xenoenxertos de tumor humano A431NS. Os camundongos BALB/c nu/nu foram inoculados com 106 células A431NS. Quando os tumores atingiram um tamanho médio de 100 mm3 (dia 8) os camundongos foram divididos aleatoriamente em grupos de 9 e o tratamento foi iniciado. Os anticorpos indicados foram injetados 30 a 0,5 mg/dose ou 1 mg/dose, duas vezes por semana ao longo de um total de 9 injeções. A área cinzenta clara no gráfico indica o período de tratamento. O início de uma linha pontilhada determina o ponto de tempo no qual o primeiro camundongo em um certo grupo foi submetido à eutanásia devido ao tamanho de tumor excessivo. As diferenças estatisticamente significativas entre 2 mg/semana 992+1024 vs. 2 mg/semana de Erbitux e 1 mg/semana 992+1024 vs. 2 mg/semana de Erbitux foram calculadas no dia 60 em que 5 todos exceto o grupo 992+1024 2 mg/semana foram interrompidos. O tamanho dos tumores de animais excluídos antes do dia 60 foi levado adiante, neste caso; o gráfico mostra o volume de tumor acumulado de todos os camundongos em um certo grupo. São mostrados valores médios ± SEM.

Figura 39. Representação gráfica de Kaplan-Meyer da sobrevi10 vência de camundongos tratados com a mistura de anticorpos 992+1024, Erbitux ou anticorpo de controle (o mesmo experimento que o mostrado na Figura 38). Resultados apresentados como a percentagem de sobrevivência de camundongos tratados. Uma diferença significativa entre a percentagem de sobrevivência de camundongos nos grupos de dose alta (2 mg/semana, 15 P = 0,0008) e de dose baixa (1 mg/semana, P = 0,0004) foi observada quando 992+1024 e Erbitux são comparados. Ainda, 992+1024 em dose baixa era significativamente melhor quando comparado com Erbitux em dose alta (P = 0,0087). A diferença estatística foi calculada utilizando um teste Log-rank (Mantel-Cox).

Figura 40: Análise da reatividade cruzada de IgGs 992, 1024 &

1320 contra células CHO transfectadas com EGFR Humano e de cinomólogos através da análise de FACS. O anticorpo ligado foi detectado com um FC de IgG anti humano F(ab')2 de cabra marcado com PE. A ligação foi realizada em células uniformes (propriedades SCC/FCS) expressando EGFR. A 25 ligação é expressa na forma da % de ligação máxima de anticorpo na concentração de 1 nM.

Figura 41: Alinhamento Clustalw2 das seqüências de aminoácidos das regiões variáveis das regiões variáveis candidatas murinas (chi) e humanizadas (hu) tanto das cadeias pesadas quanto leves de 992 (A) e 30 1024 (B). As regiões CDR que são definidas por IMGT estão sublinhadas; os espaços ("gaps") apresentados por (-), os aminoácidos idênticos por (*), as mutações conservativas como (:), semiconservativas (.). O aminoácido em negrito indica as posições de aminoácidos em que retromutações no resíduo murino identificado original serão realizadas se variações na estrutura humana completa exibir menor afinidade de ligação. Os números de ID de seqüência são como a seguir. 992 VH Humanizada (SEQ ID NO: 104). 992 VL 5 Humanizada (SEQ ID NO: 105). 1024 VH Humanizada (SEQ ID NO: 106). 1024 VL Humanizada (SEQ ID NO: 107). 992 VH Quimérica (aa 3-124 da SEQ ID NO: 40). 992 VL Quimérica (aa 3-109 da SEQ ID NO: 72). 1024 VH Quimérica (aa 3-120 da SEQ ID NO: 41). 1024 VL Quimérica (aa 3-114 da SEQ ID NO: 73).

Figura 42A: Representação esquemática do domínio variável

dual que codifica os genes para 992L1024; 992L1024 IGHV (751 pb) é representada desde o sítio de restrição 5' >Ascl seguido por 992 IGHV1 o Iigador ASTKGP1 1024 IGHV e terminando no sítio de restrição 3’ Xftol1 992L1024 IGKV (1071 pb) é representado desde o sítio de restrição 5' Nhe\ 15 seguido por 992 IGKV1 o Iigador TVAAP1 1024 IGKV1 IGKC e terminando no sítio de restrição 3’ Nott.

FIGURA 42B: Representação esquemática do domínio variável dual que codifica os genes para 1024L992; 1024L992 IGHV (751 pb) é representada desde o sítio de restrição 5'>Ascl seguido por 1024 IGHV, o Iiga20 dor ASTKGP1 992 IGHV e terminando no sítio de restrição 3’ Xftol1 1024L992 IGKV (1071 pb) é representado desde o sítio de restrição 5' NheI seguido por 1024 IGKV1 o Iigador TVAAP1 992 IGKV1 IGKC e terminando no sítio de restrição 3' Nott.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Misturas de anticorpos

Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma composição de anticorpos que compreende moléculas de anticorpos capazes de ligar pelo menos três epitopos de EGFR distintos, preferencialmente três epitopos não-sobrepostos de EGFR. A natureza não-sobreposta dos anticorpos é pre30 ferencialmente determinada utilizando anticorpos marcados de forma diferencial em uma análise de FACS com células que expressam EGFR ou através da utilização da Ressonância de Plasmônio de Superfície utilizando o antígeno de EGFR capturado ou conjugado à superfície de uma célula em fluxo. Os métodos baseados em ELISA que são descritos nos exemplos também podem ser utilizados. Uma composição que se liga a três epitopos não-sobrepostos de EGFR pode ser utilizada contra uma faixa mais ampla de tipos de cânceres dependentes de EGFR uma vez que pode ser menos vulnerável às diferenças na conformação do EGFR e menos vulnerável às mutações quando comparada à composição de anticorpos monoclonais que se direcionam a um ou dois epitopos. Além disso, a composição de anticorpos que se liga a três epitopos não-sobrepostos de EGFR pode fornecer eficácia superior comparada à composição que se direciona a menos epitopos. Em particular, a composição de anticorpos pode fornecer eficácia superior em relação à diferenciação terminal de células cancerosas in vivo. A Figura 37 mostra vários exemplos de composições de anticorpos potentes que se ligam a três epitopos de hEGFR distintos ilustrando a aplicabilidade geral do conceito.

Para uma terapia com anticorpo monoclonal anti-EGFR, uma certa proporção de pacientes não responderá eficientemente ao tratamento com anticorpo. Para alguns dos pacientes, isto pode ser devido à rápida eliminação do anticorpo ou devido ao fato de que o anticorpo gera uma respos20 ta imunológica no paciente contra o anticorpo. Para alguns pacientes, a ausência de resposta pode ser devida ao seu câncer dependente de EGFR particular que expressa EGFR em uma conformação em que o anticorpo monoclonal não pode se ligar ao seu epitopo. Isto poderia ser devido às diferenças na glicosilação, devido à deleção de domínios ou devido a mutações 25 e/ou SNP(s).

Ainda para alguns cânceres, a estimulação de EGFR autócrino causada pela produção das células cancerosas de Iigante tem importância, enquanto que em outros casos o EGFR expresso pelas células cancerosas não precisa de estímulo por ligante. Para os últimos tipos de cânceres, um anticorpo capaz de inibir a ligação ao ligante pode não ser eficiente.

Uma composição de anticorpos em que os anticorpos são capazes de se ligar a pelo menos três epitopos distintos no EGFR será mais ampiamente aplicável, uma vez que a probabilidade de que todos os três epitopos estejam alterados comparada com a do(s) epitopo(s) reconhecido(s) pelos anticorpos é diminuída. Além disso, a probabilidade de que todos os anticorpos sejam cada um eliminado pelo paciente é muito menor. Finalmente, os exemplos mostram que em ensaios funcionais, uma mistura que compreende três anticorpos que se ligam a epitopos distintos é superior a um anticorpo monoclonal e a uma mistura que compreende dois anticorpos. A superioridade foi mostrada mais claramente em termos da indução da diferenciação terminal das células cancerosas utilizando três anticorpos para o Domínio Ill com epitopos não-sobrepostos. Tal diferenciação terminal induzida eficiente por anticorpo de células cancerosas não foi relatada anteriormente e representa uma etapa significativa em direção ao planejamento de terapias para câncer baseadas em anticorpos. Os últimos resultados mostraram que resultados similares ou até mesmo superiores podem ser obtidos com uma combinação particular de dois anticorpos.

Para maior eficiência clínica e utilidade mais extensa contra uma faixa mais ampla de tipos de cânceres dependentes de EGFR, o número de anticorpos na composição pode ser aumentado. Assim, a composição pode compreender anticorpos capazes de se ligar a quatro epitopos não20 sobrepostos. A composição pode compreender anticorpos capazes de se ligar a cinco epitopos não-sobrepostos. A composição pode compreender anticorpos capazes de se ligar a seis epitopos não-sobrepostos. Os exemplos do presente pedido de patente mostram que pelo menos seis anticorpos distintos podem se ligar a EGFR de uma vez (Exemplo 3). Isto não exclui 25 que é possível ou ainda vantajoso planejar uma composição que compreende anticorpos capazes de se ligar a mais de seis, tal como sete ou oito epitopos não-sobrepostos através da seleção cuidadosa dos anticorpos.

Em uma outra modalidade, a composição compreende mais de uma molécula de anticorpo que se liga a um epitopo, tal como dois anticorpos que se ligam a epitopos sobrepostos, mas diferentes. Pode haver vantagens de incluir anticorpos com epitopos sobrepostos uma vez que isto aumenta a probabilidade do epitopo ser ligado. Um fundamento lógico por trás disso é que o epitopo em alguns pacientes e/ou em algumas células cancerosas pode ser alterado devido às alterações conformacionais ou mutações ou SNPs. Embora isto possa afetar a ligação de um anticorpo, pode não afetar a ligação de um outro anticorpo que se liga a um epitopo sobreposto. A5 lém disso, há um risco de que um dos anticorpos seja eliminado pelos pacientes, porque este é visto como um antígeno. Incluindo dois anticorpos que se ligam a epitopos sobrepostos, mas diferentes, a conseqüência da eliminação de um dos dois anticorpos e a conseqüência de uma mutação em um epitopo são diminuídas.

Assim, em uma modalidade, a composição compreende dois

anticorpos que se ligam a epitopos sobrepostos, mas diferentes. Em uma outra modalidade a composição compreende duas moléculas de anticorpos distintas que se ligam ao mesmo epitopo. Os anticorpos que se ligam ao mesmo ou a epitopos sobrepostos podem ser do mesmo ou de um isotipo diferente.

Uma composição de anticorpos que compreende anticorpos direcionados contra três epitopos não-sobrepostos pode assim compreender quatro, cinco ou seis moléculas de anticorpos distintas de forma que dois anticorpos se ligam a dois epitopos sobrepostos ou ao mesmo primeiro epi20 topo, dois outros anticorpos se ligam a dois outros epitopos sobrepostos ou ao mesmo segundo epitopo e dois anticorpos se ligam a dois outros epitopos sobrepostos adicionais ou ao mesmo terceiro epitopo. Evidentemente, a composição pode compreender mais de duas, tal como três ou quatro moléculas de anticorpos capazes de se ligar a epitopos sobrepostos ou capazes 25 de se ligar ao mesmo epitopo. Assim, o número total de anticorpos incluídos na composição pode exceder 6 por possuir mais de um anticorpo para cada epitopo ou por possuir vários anticorpos com epitopos sobrepostos. Mantendo a dosagem total de anticorpo constante, para cada anticorpo adicional incluído na composição, a concentração de cada anticorpo diminui. Portanto, 30 é esperado que haja um limite no número de anticorpos que podem ser incluídos em uma composição enquanto é mantida uma eficácia aceitável. Com base nas observações provenientes dos estudos de ligação por Ressonância de Plasmônio de Superfície e dos ensaios de proliferação e levando em consideração os desafios da produção, é esperado que a vantagem adicional limitada (se alguma) pode ser obtida através do aumento do número de anticorpos de 6 até 7, 8, 9, 10 ou mais. Evidentemente, isto não exclui 5 o fato de que a composição compreende mais de 10 anticorpos, tal como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 anticorpos ou mais, tal como 25 anticorpos ou mais, por exemplo, 30 anticorpos ou mais, tal como 40 anticorpos ou mais, tal como 50 anticorpos ou mais.

Embora seja preferido incluir em uma composição de anticorpos 10 da invenção, anticorpos capazes de se ligar a pelo menos três epitopos nãosobrepostos de EGFR, resultados superiores também foram obtidos com combinações específicas de anticorpos capazes de se ligar a dois epitopos não-sobrepostos de EGFR. Estas composições preferidas de "dois anticorpos" são descritas em maiores detalhes a seguir junto com a orientação em 15 relação a como planejar as composições de anticorpos da invenção. Foi descoberto que comparada com a composição de três anticorpos que compreende os anticorpos 992, 1030 e 1042, uma eficácia similar ou até mesmo maior poderia ser obtida quando era utilizada uma composição com apenas dois anticorpos: 992 e 1024. Uma vez que os anticorpos 1024 e 1042 per20 tencem ao mesmo grupo e, portanto, possuem a mesma especificidade de ligação, realmente, os resultados observados para a composição de três anticorpos incluindo o efeito sobre a diferenciação terminal podem ser atribuídos a apenas duas das especificidades de ligação (992 e 1024/1042) na composição.

Em uma modalidade pelo menos um anticorpo na composição

se liga a um epitopo do domínio III1 mais preferencialmente a composição compreende pelo menos dois anticorpos que se ligam a epitopos do domínio Illea composição pode também compreender três anticorpos que se ligam a epitopos do domínio III.

Preferencialmente, a composição compreende pelo menos um

anticorpo que se liga a um epitopo do domínio I e pode compreender pelo menos dois anticorpos que se ligam a epitopos do domínio I. Preferencialmente, a composição compreende pelo menos um anticorpo que se liga a um epitopo do domínio Il e pode compreender anticorpos que se ligam a dois epitopos do domínio II.

A composição pode também compreender um anticorpo que se liga a um epitopo do domínio l/ll como definido aqui.

A composição pode compreender um anticorpo capaz de se ligar a um epitopo do domínio IV.

Preferencialmente, a composição compreende pelo menos uma molécula de anticorpo capaz de inibir a ligação ao EGF.

Em uma outra modalidade preferida, a composição pode com

preender um anticorpo capaz de prevenir a fosforilação de EGFR.

Além disso, a composição pode compreender um anticorpo capaz de aumentar a internalização/degradação de EGFR.

Em uma modalidade preferida, a composição compreende pelo menos um anticorpo para o domínio Ill e pelo menos um anticorpo para o domínio l/ll. Em uma outra modalidade preferida, a composição compreende pelo menos dois anticorpos para o domínio Ill e um anticorpo para o domínio I.

Em uma modalidade preferida adicional, a composição compreende pelo menos dois anticorpos para o domínio III, tal como pelo menos três anticorpos para o domínio III.

Os anticorpos da composição podem ser anticorpos quiméricos com cadeias variáveis não-humanas e cadeias constantes humanas. As cadeias variáveis não-humanas podem ser de camundongo, rato, ovelha, por25 co, frango, primata não-humano ou outro animal adequado. Para a obtenção de anticorpos completamente humanos, os anticorpos podem ser gerados em um animal transgênico com genes de anticorpos humanos. Os anticorpos também podem ser os assim chamados anticorpos humanizados, em que as seqüências CDR não-humanas foram enxertadas em seqüências 30 estruturais humanas.

Preferencialmente a cadeia constante humana é do isotipo IgGI ou lgG2. Mais preferencialmente todos os anticorpos na composição possuem o mesmo isotipo para facilitar a produção. Entretanto, pode ser vantajoso incluir na composição anticorpos de isotipo diferente.

Preferencialmente as composições de anticorpos da invenção compreendem anticorpos capazes de se ligar a EGFR selecionado do grupo 5 que consiste em EGFR humano, EGFR humano mutado e variações de deleção de EGFR humano. Preferencialmente os anticorpos são capazes de se ligar ao EGFR tanto humano quanto de primata sem ser humano, de forma que podem ser testados em estudos toxicológicos relevantes antes dos experimentos clínicos. Preferencialmente, o primata não-humano é o macaco 10 cinomólgo (Macaca fascicularis).

Para apoiar o conceito identificado anteriormente de tratamento de câncer dependente de EGFR utilizando anticorpos que se ligam a três de mais epitopos distintos, os presentes inventores identificaram, produziram e caracterizaram uma série de anticorpos quiméricos de camundongo/ser hu15 mano direcionados contra o EGFR. Estes anticorpos quiméricos foram comparados individualmente e em misturas de anticorpos monoclonais do estado da técnica, exemplificados por Erbitux® e Vectibix®.

A Tabela 1 mostra um sumário dos anticorpos quiméricos individuais e as características associadas aos mesmos. O número do anticorpo é 20 um número de referência utilizado ao longo de todo o presente pedido de patente. A especificidade é o domínio de EGFR ao qual o anticorpo se liga como é evidenciado no Exemplo 3. deltaEGFR é a capacidade do anticorpo se ligar ao mutante de EGFR (EGFRvIlI) como descrito no exemplo 1. O EGFR de Cinomólgo é a capacidade do anticorpo de se ligar ao EGFR de 25 cinomólgo (exemplo 10). EGF inhib é a capacidade do anticorpo de inibir a ligação do EGF (Exemplo 4). Proliferação é a capacidade do anticorpo de inibir a proliferação de linhagens de células cancerosas, A431 e HN-5 (Exemplo 6). Tabela 1. Anticorpos da invenção

Anticorpo Especificidade deltaEGFR EGFR de EGF Proliferação N0 Cinomólgo inhib 992 Domínio Ill não/fraca sim sim/fraca sim 1030 Domínio Ill sim sim sim sim 1024 Domínio Ill sim sim sim 1042 Domínio Ill fraca sim (sim) sim 1277 Domínio Ill sim Sim sim HN5 1254 Domínio Ill sim Sim sim HN5 1208 Domínio Ill sim sim sim sim HN5±992 1320 Domínio Ill fraca não sim sim 1257 Domínio l/ll não sim não sim 1261 Domínio I não Sim não sim 1229 Não o domínio l/ll sim não não sim (A431) 1284 Domínio I não Sim sim sim 1344 Domínio l/ll não sim nd HN5 w/992 1260 Domínio l/ll não Sim sim A431 1308 Domínio I não sim nd HN5 w/992 1347 Domínio I não sim nd HN5 w/992 1428 Domínio I & Il não Sim sim HN5 w/992 Partindo dos dados gerados com os anticorpos quiméricos tes

tados isoladamente e em combinação nos ensaios de proliferação, ligação, degradação/inativação do receptor e motilidade e em modelos de animais, pode ser tirado um número de conclusões.

Os resultados obtidos com duas linhagens de células cancerosas, HN-5 e A431 (Exemplo 6) foram repetidos com linhagens de células cancerosas diferentes (MDA-MB-468 uma linhagem de células de câncer de mama; DU145 - linhagem de células de câncer de próstata). O que é eviden10 te partindo destes experimentos é que combinações de anticorpos fornecidas pelos presentes inventores exibem eficácia contra uma faixa muito ampla de linhagens de células cancerosas, apoiando a eficácia das composições de anticorpos contra uma faixa de conformações de EGFR.

Também foi mostrado que a superioridade de misturas de anticorpos é maior nos ensaios de proliferação em que concentrações fisiológicas de ligante (EGF) são adicionadas no meio de cultura do que quando o EGF não é adicionado (Figura 17). De acordo com a literatura (Hayashi e Sakamoto 1998 J Pharmacobiodyn 11; 146-51) o soro contém aproximadamente 1-1,8 ng/mL ou 0,2-0,3 nM de EGF enquanto que é relatado que o 5 suco gástrico contém 0,3 ng/mL (cerca de 0,05 nM) (Pessonen e outros 1987 Life Sei. 40; 2489-94). Em um arranjo in vivo, é provável que o EGF e outros ligantes de EGFR estejam presentes e a capacidade da mistura de anticorpos ser eficiente na presença do ligante de EGFR é, portanto, uma característica importante das misturas de anticorpos da presente invenção.

Os anticorpos quiméricos de camundongo/ser humano da pre

sente invenção fornecem melhores resultados quando utilizados em combinação do que quando utilizados isoladamente. Isto é exemplificado em vários experimentos (vide, por exemplo, o Exemplo 6)), em que os anticorpos quando testados isoladamente exibem apenas efeitos antiproliferativos mo15 derados sobre uma linhagem de células cancerosas (A431-NS), mas quando utilizados em qualquer combinação, exibem resultados notavelmente superiores. Estes resultados foram confirmados com várias combinações dos anticorpos quiméricos da presente invenção. Resultados particularmente superiores foram obtidos com uma composição que compreende os anticorpos 992 20 e 1024.

Por exemplo, vários dos anticorpos foram testados em um ensaio antiproliferação com A431-NS e HN-5 junto com qualquer dos Anticorpos 992, 1208, 1254 e 1277.

Estudos de ligação ao receptor mostraram que alguns anticor25 pos podem realmente estimular a ligação de anticorpos adicionais, de forma que um anticorpo particular se ligue em quantidades maiores ao receptor após a saturação do receptor com um ou vários anticorpos. A ligação do anticorpo 992, direcionado contra o domínio III, se benificia claramente deste efeito sinérgico obtido através da saturação prévia do receptor com um ou 30 mais anticorpos que se ligam a epitopos não-sobrepostos. Um outro exemplo deste efeito cooperativo é observado quando o anticorpo 1396 direcionado contra um epitopo desconhecido é testado contra EGFR saturado com anticorpos que se ligam a epitopos não-sobrepostos.

Estudos de ligação ao receptor também mostraram que é possível ligar pelo menos 6 anticorpos ao domínio extracelular de EGFR simultaneamente. Estes 6 anticorpos representam 3 anticorpos para o Domínio III, 5 um anticorpo para o Domínio I, um anticorpo para o Domínio l/l I e um anticorpo que se liga a um epitopo desconhecido. De forma interessante, a ligação dos três anticorpos para o Domínio Ill parece facilitar a ligação subsequente de anticorpos adicionais. Isto sustenta claramente o conceito de fornecer composições de anticorpos com vários anticorpos que se ligam a epi10 topos distintos.

Quando a composição de uma composição de anticorpos contra EGFR é planejada, os anticorpos com epitopos não-sobrepostos são preferencialmente utilizados uma vez que estes fornecem um efeito sinérgico maior.

É também preferível que pelo menos um dos anticorpos da mis

tura (quando testado isoladamente) seja capaz de inibir a ligação do Iigante ao EGFR, por exemplo, capaz de inibir a ligação ao EGF e/ou capaz de inibir a ligação ao TGFaIfa e/ou capaz de inibir a ligação à anfirregulina. Preferencialmente o anticorpo capaz de inibir a ligação ao EGF é selecionado do 20 grupo que consiste nos anticorpos 992, 1030, 1024, 1042, 1208, 1254, 1277, 1284, 1320 e 1428, mais preferencialmente do grupo que consiste nos anticorpos 1208, 1260, 1277 e 1320.

É similarmente preferível que pelo menos um membro de anticorpo na mistura de anticorpos seja capaz de reduzir a fosforilação do EGFR. Os exemplos de anticorpos da invenção com esta propriedade incluem: 992, 1030, 1042, 1208, 1277 e 1320.

O Domínio Ill do EGFR tem importância para a ligação do Iigante ao receptor. Além disso, o anticorpo que se liga ao Domínio Ill pode estabilizar o EGFR na conformação monomérica restrita, que não leva à sinali30 zação do receptor. Por estas razões é preferível que a composição de anticorpos contenha pelo menos um anticorpo com especificidade em relação ao Domínio III. Os anticorpos preferidos para o Domínio Ill incluem os anticorpos 992, 1024, 1030, 1208, 1254, 1277 e 1320. Mais preferencialmente o pelo menos um anticorpo para o domínio Ill é selecionado do grupo que consiste nos anticorpos 992, 1254, 1277, 1208 e 1320. A composição de anticorpos pode preferencialmente compreender mais de um anticorpo para 5 o Domínio Ill anticorpo tal como pelo menos 3 anticorpos para o domínio III, por exemplo, pelo menos 4 anticorpos para o domínio III, tal como pelo menos 5 anticorpos para o domínio III, por exemplo, pelo menos 6 anticorpos para o domínio III.

Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticor10 pos compreende pelo menos um anticorpo para o Domínio I. Preferencialmente o pelo menos um anticorpo para o Domínio I é selecionado do grupo que consiste nos anticorpos 1284, 1308, 1344 e 1347. Mais preferencialmente o pelo menos um anticorpo para o Domínio I é selecionado do grupo que consiste nos anticorpos 1284 e 1347.

Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticor

pos compreende pelo menos um anticorpo para o Domínio l/ll. Preferencialmente o pelo menos um anticorpo para o Domínio l/ll é selecionado do grupo que consiste nos anticorpos 1257, 1260, 1261, 1428 e 1434. Mais preferencialmente o pelo menos um anticorpo para o Domínio l/ll é selecionado do grupo que consiste nos anticorpos 1261 e 1260.

As combinações específicas eficientes de dois anticorpos da presente invenção incluem:

O anticorpo 1280 junto com 1024, 1320, 1308, 1284, 1260 ou 1030, preferencialmente com 1320 ou 1284.

O anticorpo 1254 junto com 1024, 1030, 1260, 1284, 1308 ou

1320, preferencialmente com 1320, 1284 ou 1260.

O anticorpo 1277 junto com 1024, 1030, 1260, 1284, 1308 ou 1320, preferencialmente com 1320, 1284 ou 1260.

O anticorpo 992 junto com 1030, 1260, 1284, 1308, 1320 ou 1024, preferencialmente com 1320, 1024 ou 1284.

Os exemplos de misturas superiores e preferidas de dois anticorpos incluem 992+1024; 992+1320; 992+1042; 1277+1320; 1208+1320. É particularmente preferida a 992+1024.

As misturas preferidas com três anticorpos incluem: Anticorpos 992+1030+1042; 992+1320+1024; 992+1024+1030; 1320+1284+1261 1320+1214+1320; 992+1284+1320; 992+1255+1024; 992+1030+1320 992+1024+1214; 992+1261+1320; 992+1024+1284; 992+1024+1211 992+1024+1030; 1260+1214+1254; 992+1255+1320; 992+1211+1320 992+1030+1261; 992+1260+1030; 992+1260+1320; 992+1030+1214.

As misturas preferidas com quatro anticorpos incluem: Anticorpos 992+1320+1024+1030; 992+1024+1030+1284; 1277+1320+1260+1347

1277+1320+1261+1347 1254+1320+1261+1347 1254+1024+1261+1347 1277+1024+1261+1347

1254+1320+1260+1347

1254+1024+1260+1347

1277+1024+1260+1347

1277+1320+1261+1284 1254+1320+1261+1284 1254+1024+1261+1284 1277+1024+1261+1284.

As misturas preferidas com 5 anticorpos incluem: 992+1030+ 1024+1260+1347; 992+1030+1024+1261+1347; 992+1030+1024+1261+ 1284; 992+1030+1320+1260+1347; 992+1030+1320+1261+1347; 992+ 1030+1320+1261+1284;

Uma mistura preferida com 8 anticorpos inclui: 992+1030+ 1024+1277+1254+1320+1260+1261+1284+1347.

Além disso, para possibilitar a realização de um estudo toxicoló

gico em um primata não-humano, é preferível que todos os anticorpos na composição se liguem a EGFR humano assim como a pelo menos um de primata adicional, tal como o EGFR de chimpanzé, de Macaca mulatta, de macaco Rhesus e de outros macacos ou macaco cinomólgo. O macaco ci25 nomólgo é um animal relativamente pequeno e muito bem adequado para estudos toxicológicos, portanto, o EGFR de primata adicional é preferencialmente EGFR de cinomólgo. Preferencialmente os anticorpos se ligam com aproximadamente a mesma afinidade ao EGFR humano e de primata nãohumano.

A presente invenção mostrou resultados superiores em um ou

mais ensaios funcionais quando 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 anticorpos foram combinados em uma composição. Embora estes dados forneçam uma orientação na seleção do número de anticorpos na composição, estes estão atualmente de uma maneira que é interpretada de uma forma limitante. A composição pode compreender mais de 8 anticorpos, muito embora os dados experimentais exibam apenas a ligação simultânea de 6 anticorpos. Pode haver outras 5 razões para incluir mais de 6 anticorpos na composição, tal como, por exemplo, diferenças na taxa de eliminação dos membros de anticorpos.

Uma característica preferida adicional dos anticorpos das composições é a homogeneidade das proteínas, de forma que os anticorpos podem ser purificados facilmente. Para os membros de anticorpos individuais, 10 um perfil cromatográfico por troca iônica com um pico distinto é preferido para facilitar a caracterização. Um perfil cromatográfico por troca iônica claro é também preferido para facilitar a caracterização da composição de anticorpos final. Este também é preferível quando são combinados os anticorpos que podem ser distinguidos utilizando cromatografia por troca iônica, de for15 ma que a composição com todos os anticorpos possa ser caracterizada em uma rodada.

Os anticorpos podem ter qualquer origem tal como humana, murina, de coelho, frango, porco, lhama, ovelha. Os anticorpos também podem ser quiméricos como descrito nos exemplos ou podem ser versões humanizadas, super-humanizadas ou remoldadas dos mesmos utilizando métodos bem-conhecidos descritos na técnica.

Uma composição de anticorpos preferida

Como mostrado nos exemplos anexados, a composição antiEGFR baseada nos anticorpos 992 e 1024 possui propriedades únicas e 25 distintas. A ligação do anticorpo 992 é aumentada através da ligação de outros anticorpos incluindo 1024. Em contraste aos anticorpos comerciais, tanto 992 quanto 1024 se ligam preferencialmente a epitopos conformacionais apresentados nas células (Exemplos 14 e 15). Ambos os epitopos de 992 e 1024 se sobrepõem, mas são distintos do(s) epitopo(s) de Erbitux e Vectibix. 30 Em contraste a um número de outras composições de dois anticorpos em que os anticorpos individuais se ligam a epitopos não-sobrepostos, a composição baseada nas especificidades de ligação dos anticorpos 992 e 1024 ativa a internalização do receptor rapidamente e eficientemente. Um novo mecanismo de ação que envolve a diferenciação terminal acompanhada pela maior expressão da involucrina e do aparecimento de pérolas de queratina é observado em um modelo animal após o tratamento com composições de 5 anticorpos baseadas nos anticorpos 992 e 1024. Este mecanismo de ação exclusivo leva à inibição de crescimento mais eficiente e prolongada in vitro e in vivo. Isto é mais claramente observado nos exemplos in vivo em que os tumores continuam a diminuir após o término do tratamento. No grupo de controle que recebe Erbitux, os tumores começam a crescer logo após o 10 término do tratamento. Isto indica claramente um mecanismo de ação diferente.

Acredita-se que o novo mecanismo de ação é atingido através da utilização da combinação de duas especificidades de ligação exibidas pelos anticorpos 992 e 1024 em uma composição de anticorpos. Este meca15 nismo de ação é também observado quando um terceiro anticorpo que não compete com os anticorpos 992 e 1024 é utilizado, por exemplo, na combinação tripla dos anticorpos 992, 1024 e 1030.

Estas observações levaram ao planejamento de uma composição de anticorpos que compreende pelo menos 2 moléculas de anticorpo anti-EGFR humano distintas, em que uma primeira molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 992, um anticorpo que compreende as seqüências VL (aminoácidos 3-109 da SEQ ID NO: 72) e VH (aminoácidos 3-124 da SEQ ID NO: 40) do anticorpo 992, um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 992 (SEQ ID NO: 116 e 111), um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 992 e um anticorpo capaz de inibir a ligação do anticorpo 992 ao EGFR humano; e em que uma segunda molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 1024, um anticorpo que compreende as seqüências VL (aminoácidos 3-114 da SEQ ID NO: 73) e VH (aminoácidos 3-120 da SEQ ID NO: 41) do anticorpo 1024, um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 1024 (SEQ ID NO: 120 e 114), um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 1024 e um anticorpo capaz de inibir a ligação do anticorpo 1024 ao EGFR humano.

Preferencialmente, a dita primeira molécula de anticorpo antiEGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 992, um anticorpo que compreende as seqüências VL e VH do anticorpo 992, um 5 anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 992 e um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 992; e a dita segunda molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 1024, um anticorpo que compreende as seqüências VL e VH do anticorpo 1024, um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 1024 e um anticorpo 10 que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 1024.

A presente invenção estuda mutações nas seqüências CDR3 dos anticorpos 992 e 1024 para fornecer anticorpos com a mesma especificidade de ligação. Portanto, em uma modalidade, um anticorpo que possui a mesma especificidade de ligação que o anticorpo 992 compreende uma 15 CDRH3 que possui a fórmula a seguir: CTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13 X14X15W em que Xi atéXis são selecionados individualmente dos grupos de aminoácidos listados a seguir

XI = R ou K;

X2 = N, D e ou Q;

X3 = G, A, V ou S;

X4 = D, E, N ou Q;

X5 = Y, F, W ou H

X6 = Y, F, W ou H

X7 = V, I, L ou A;

X8 = S, T, G ou A;

X9 = S, T, G ou A;

X10 = G1AiVou S;

XII = D, E, Nou Q;

X12 = A, G1Vou S;

X13 = M, L, I ou V

X14 = D ou E; e

X15 = You F; e uma CDRL3 descrita pela fórmula a seguir: CX1X2X3X4X5X6 PPTF em que Xi até Χβ são selecionados individualmente dos grupos de aminoácidos listados a seguir:

Xi = Q ou H;

X2 = H e ou Q;

X3 = Y, F1Wou H;

X4 = N, Q ou H;

X5 = T, S, G ou A; e

X6 = V1 I, Lou A.

Em uma modalidade, um anticorpo que possui a mesma especi

ficidade de ligação que o anticorpo 1024 compreende uma CDRH3 que possui a fórmula a seguir: Cvx1X2Xsx4XsxexTxeXgXioXi 1W em que X1 atéXn são selecionados individualmente dos grupos de aminoácidos listados a seguir

XI = R ou K;

X2 = Y1F1WouH;

X3 = Y1 F1 W ou H;

X4 = G1 A1 V ou S;

X5 = Y1 F1Wou H;

X6 = D, E, N ou Q;

X7 = E ou D;

X8 = A, G, V ou S;

X9 = M, L1 I ou V;

X10 = D1 E1 N ou Q; e

XII = You F;

e uma CDRL3 descrita pela fórmula a seguir: CX1X2X3X4X5X6PX7TF em que Xi até X7 são selecionados individualmente dos grupos de aminoácidos listados a seguir:

X1 = A1 G ou V;

X2 = Q ou H;

X3 = N1 Q ou H;

X4 = L1I1Mou V;

X5 = E, D, N ou Q; Xe = L1 I, M ou V; e

X7 = Y, F, W ou Η.

Os anticorpos com CDR3s mutadas podem ser produzidos utilizando técnicas padronizadas e ser expressos e testados em relação à Iigação utilizando métodos descritos aqui.

Os anticorpos de acordo com este aspecto da invenção podem ser quiméricos, humanos, humanizados, remoldados ou super-humanizados. Isto pode ser feito utilizado métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos 992 e 1024 podem ser humanizados utilizando métodos descritos 10 no Exemplo 18. Os métodos para a "super-humanização" são descritos na US 6.881.557.

Mais preferencialmente, a dita primeira molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 992, um anticorpo que compreende as seqüências VL e VH do anticorpo 992 e 15 um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 992; e a dita segunda molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 1024, um anticorpo que compreende as seqüências VL e VH do anticorpo 1024 e um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 1024.

Mais preferencialmente a dita primeira molécula de anticorpo 20 anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 992 e um anticorpo que compreende as seqüências VL e VH do anticorpo 992; e a dita segunda molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 1024 e um anticorpo que compreende as seqüências VL e VH do anticorpo 1024.

Mais preferencialmente a composição compreende os anticor

pos 992 e 1024.

Como descrito, os primeiro e segundo anticorpos anti-EGFR preferencialmente não inibem a ligação ao EGFR humano de cada outro. Ainda mais preferencialmente, pelo menos um dos anticorpos é capaz de 30 aumentar a capacidade de ligação máxima do outro anticorpo em relação ao EGFR humano. Este efeito é observado para os anticorpos 992 e 1024 (Exemplo 16). A proporção entre os dois anticorpos não precisa ser exatamente uma proporção de 1:1. Consequentemente, a proporção do primeiro anticorpo em relação ao segundo anticorpo na composição pode estar entre 5 e 95%, tal como entre 10 e 90%, preferencialmente entre 20 e 80%, mais pre5 ferencialmente entre 30 e 70, mais preferencialmente entre 40 e 60, tal como entre 45 e 55, tal como aproximadamente 50%.

Preferencialmente os primeiro e segundo anticorpos são do isotipo IgGI ou lgG2.

Os exemplos de anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que o anticorpo 992 identificados pelos presentes inventores são anticorpos do grupo de anticorpos que compreende os clones 1209, 1204, 992, 996, 1033 e 1220.

Os exemplos de anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que o anticorpo 1024 identificados pelos presentes inventores são anticorpos do grupo de anticorpos que compreende os clones 1031, 1036, 1042, 984, 1024, 1210, 1217, 1221 e 1218.

A CDR3 determina a especificidade de ligação dos anticorpos. Em modalidades preferidas, o anticorpo que compreende a CDR3 do anticorpo 992 compreende adicionalmente a CDR1 e a CDR2 da VH e da VL do 20 anticorpo 992. Similarmente, o anticorpo que compreende a CDR3 do anticorpo 1024 preferencialmente compreende adicionalmente a CDR1 e a CDR2 da VH e da VL do anticorpo 1024. As seqüências CDR dos anticorpos podem ser encontradas na Tabela 12, exemplo 17.

Em outras modalidades, o anticorpo que compete com o anticorpo 992 é selecionado do grupo que consiste nos anticorpos 1208, 1254 e 1277. Similarmente, o anticorpo que compete com o anticorpo 1024 pode ser selecionado do grupo que consiste nos anticorpos 1042 e 1320.

Em uma modalidade, a composição não contém anticorpos adicionais em adição aos ditos primeiro e secundo anticorpos, mais preferencialmente não anticorpos anti-EGFR adicionais.

Em outras modalidades, a composição compreende ainda um terceiro anticorpo anti-EGFR distinto, em que a dita terceira molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 1030, um anticorpo que compreende as seqüências VL (aminoácidos 3-113 da SEQ ID NO: 74) e VH (aminoácidos 3-120 da SEQ ID NO: 42) do anticorpo 1030, um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 1030 (SEQ ID 5 NOs 112 e 119), um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 1030 e um anticorpo capaz de inibir a ligação do anticorpo 1030 ao EGFR humano. O dito terceiro anticorpo resulta preferencialmente em uma maior ligação ao EGFR humano do dito primeiro e/ou segundo anticorpo. Em uma modalidade, a composição não contém anticorpos adicionais em adição ao 10 primeiro, ao segundo e ao terceiro anticorpos, mais preferencialmente não anticorpos anti-EGFR adicionais.

O anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 1030 pode ser selecionado do grupo de anticorpos que consiste nos clones 1195, 1030, 1034, 1194, 980, 981, 1246 e 1223.

O anticorpo que compreende a CDR3 do anticorpo 1030 pode

compreender adicionalmente a CDR1 e a CDR2 da VH e da VL do anticorpo 1030.

Os anticorpos podem ser formulados em um recipiente para administração. Entretanto, podem ser produzidos, purificados e caracteriza20 dos individualmente e ser fornecidos em dois ou três recipientes separados na forma de um kit de partes, com um anticorpo em cada recipiente. Desta maneira, estes podem ser administrados simultaneamente, sucessivamente ou separadamente.

Em um aspecto adicional as duas especificidades de ligação 25 dos anticorpos 992 e 1024 são combinadas em uma molécula de ligação biespecífica. Preferencialmente, a molécula de ligação biespecífica compreende as CDRs dos anticorpos 992 e 1024, mais preferencialmente as seqüências VH e VL dos anticorpos 992 e 1024. A molécula de ligação biespecífica pode ser um anticorpo de domínio variável dual como descrito no e30 xemplo 19. Uma molécula de ligação biespecífica também pode ser planejada na forma de um fragmento Fab biespecífico, um scFV biespecífico ou um diacorpo como descrito in literatura. As composições de anticorpos baseadas nas especificidades de ligação dos anticorpos 992 e 1024 levam preferencialmente a uma ou mais da internalização do receptor, à regressão de tumores A431NS in vivo, à indução da diferenciação terminal em células A431NS in vivo e à regulação 5 para mais da expressão da involucrina do tumor in vivo.

O presente pedido de patente fornece vários exemplos de anticorpos que possuem os mesmos efeitos ou similares que os da combinação de anticorpos 992 e 1024. Os exemplos destes incluem os anticorpos obtidos da mesma imunização e que pertencem aos mesmos grupos e anticor10 pos que competem individualmente com um dos dois anticorpos. As composições de anticorpos com o mesmo efeito ou similar podem ser planejadas com base nas seqüências VL e VH dos anticorpos 992 e 1024 e também com base nas CDRs destes anticorpos, em particular, as CDR3s dos dois anticorpos.

Composições de anticorpos adicionais com os mesmos efeitos

ou similares podem ser produzidas através da realização da imunização e da verificação essencialmente como descrito nos exemplos. Os anticorpos com a mesma especificidade de ligação que o anticorpo 992 e 1024 podem ser identificados em dois ensaios de competição separados como descrito aqui. 20 Finalmente, as composições de anticorpos em que um anticorpo aumenta a ligação do outro anticorpo podem ser identificadas através da realização de experimentos de ligação essencialmente como descrito no Exemplo 16. As composições de anticorpos podem ser adicionalmente verificadas como descrito nos exemplos em relação aos efeitos sobre a internalização do re25 ceptor, à eficácia in vitro e in vivo, à afinidade de ligação etc.

Usos das composições de anticorpos da invenção

Para o uso no tratamento in vivo e na prevenção de doenças relacionadas com a expressão do EGFR (por exemplo, superexpressão), os anticorpos da invenção são administrados aos pacientes (por exemplo, indi30 víduos humanos) em dosagens terapeuticamente eficientes (por exemplo, dosagens que resultam na inibição do crescimento, fagocitose, redução de motilidade, diferenciação terminal e/ou morte de células tumorais que expressam EGFR) utilizando qualquer via de administração adequada, tal como injeção e outras vias de administração conhecidas na técnica para produtos clínicos baseados em anticorpos.

As doenças típicas relacionadas ao EGFR que podem ser trata5 das, melhoradas e/ou prevenidas utilizando os anticorpos da invenção incluem, mas não estão limitadas a doenças autoimunes e cânceres. Por exemplo, os cânceres que podem ser tratados, melhorados e/ou prevenidos incluem câncer da bexiga, de mama, uterino/cervical, de cólon, renal, de ovário, de próstata, de célula renal, de pâncreas, de cólon, de reto, de estômago, de 10 célula escamosa, pulmonar (de célula não-pequena), de esôfago, de cabeça e pescoço, de pele. As doenças autoimunes que podem ser tratadas incluem, por exemplo, psoríase.

Ainda em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um método para o tratamento, a melhoria e/ou a prevenção de glioblastoma, inclu15 indo glioblastoma multiforme; astrocitoma, incluindo astrocitoma infantil; glioma; neuroblastoma; tumores neuroendócrinos do trato gastrointestinal; carcinoma bronquioalveolar; sarcoma de células dentríticas foliculares; carcinoma de glândula salivar; ameloblastoma; tumor maligno de bainha do nervo periférico; tumores pancreáticos endócrinos; ou tumores de células germina20 tivas de testículo, incluindo seminoma, carcinoma embrionário, tumor de saco vitalino, teratoma e coriocarcinoma.

Isolamento e seleção de pares codificadores de cadeias pesadas variáveis e de cadeias leves variáveis

O processo de produção de uma composição de anticorpos re25 combinantes anti-EGFR envolve o isolamento de seqüências que codificam cadeias pesadas variáveis (Vh) e cadeias leves variáveis (Vl) partindo de uma fonte adequada, gerando assim um repertório de pares codificadores de Vh e Vl. Geralmente, uma fonte adequada para a obtenção de seqüências codificadoras de Vh e Vl são frações de células que contêm linfócitos tais 30 como amostras de sangue, baço ou de medula óssea de um animal nãohumano imunizado/vacinado com um polipeptídeo ou um peptídeo de EGFR humano ou com proteínas de EGFR derivadas de uma célula que expressa EGFR humano ou com células que expressam EGFR humano ou frações de tais células. Preferencialmente, as frações que contêm linfócitos são coletadas de mamíferos não-humanos ou de animais transgênicos com genes de imunoglobulinas humanas. A fração de células contendo linfócitos coletada 5 pode ser adicionalmente enriquecida para a obtenção de uma população de linfócitos particular, por exemplo, células da linhagem de linfócitos B. Preferencialmente, o enriquecimento é realizado utilizando a separação de células com esferas magnéticas (MACS) e/ou a separação de células ativadas por fluorescência (FACS), tirando vantagem de proteínas marcadoras de super10 fície celular específicas à linhagem, por exemplo, para células B, blastos do plasma e/ou células plasmáticas. Preferencialmente, a fração de células que contém linfócitos é enriquecida ou separada em relação às células B, aos blatos do plasma e/ou às células plasmáticas. Ainda mais preferencialmente, as células com alta expressão de CD43 e CD138 são isoladas do baço ou 15 do sangue. Estas células são algumas vezes denominadas de células plasmáticas circulantes, células plasmáticas precoces ou blastos do plasma. Para facilitar, são apenas denominadas células plasmáticas na presente invenção, embora os outros termos possam ser utilizados de forma intercambiável.

O isolamento de seqüências codificadoras de Vh e Vl pode

também ser realizado da maneira clássica em que as seqüências codificadoras de Vh e Vl são combinadas aleatoriamente em um vetor para gerar uma biblioteca combinatória de pares de seqüências codificadoras de Vh e VL. Entretanto, na presente invenção é preferido refletir a diversidade, a afinida25 de e a especificidade dos anticorpos produzidos em uma resposta imunológica humoral após a imunização com EGFR. Isto envolve a manutenção do pareamento de Vh e Vl originalmente presente no doador, gerando assim um repertório de pares de seqüências em que cada par codifica uma cadeia pesada variável (Vh) e uma cadeia leve variável (Vl) correspondendo a um 30 par de Vh e Vl originalmente presente em um anticorpo produzido pelo doador do qual as seqüências são isoladas. Este também é chamado de um par cognato de seqüências codificadoras de Vh e Vl e o anticorpo é chamado de um anticorpo cognato. Preferencialmente, os pares codificadores de Vh e Vl da presente invenção, combinatórios ou cognatos, são obtidos de camundongos doadores e, portanto, as seqüências são murinas.

Há várias abordagens diferentes para a produção de pares cog5 natos de seqüências codificadoras de Vh e VL, uma abordagem envolve a amplificação e o isolamento de seqüências codificadoras de Vh e Vl de células isoladas separadas de uma fração de células que contém linfócitos. Para a obtenção de um repertório de pares de seqüências codificadoras de Vh e Vl que corresponde à diversidade de pares de seqüências de Vh e Vl no 10 doador, é preferido um método de alto rendimento com o mínimo de mistura (combinação aleatória) dos pares de Vh e Vl possível, por exemplo, como descrito na WO 2005/042774 (incorporada aqui como referência).

As seqüências codificadoras de Vh e Vl podem ser amplificadas separadamente e pareadas em uma segunda etapa ou podem ser pareadas durante a amplificação (Coronella e outros 2000, Nucleic Acids Res. 28: E85; Babcook e outros 1996. PNAS 93: 7843-7848 e WO 2005/042774). Uma segunda abordagem envolve a amplificação em célula e o pareamento das seqüências codificadoras de Vh e Vl (Embleton e outros 1992. Nucleic Acids Res. 20: 3831-3837; Chapai e outros 1997. BioTechniques 23: 518-524). Uma terceira abordagem é o método de anticorpo de linfócito selecionado (SLAM) que combina um ensaio de placa hemolítico com a clonagem do cDNA de Vh e Vl (Babcook e outros 1996. PNAS 93:7843-7848). Um outro método que pode ser utilizado com camundongos é a técnica de hibridoma padronizada, seguida pela verificação e a seleção de candidatos principais e pela clonagem subsequente dos anticorpos codificados.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, é gerado um repertório de pares que codificam Vh e Vl, em que os pares de membros espelham os pares de genes responsáveis pela resposta imunológica humoral resultante de uma imunização com EGFR de acordo com um método que 30 compreende as etapas i) de fornecimento de uma fração de células que contém linfócitos de um doador animal imunizado com EGFR humano; ii) de enriquecimento opcional de células B ou de células plasmáticas da dita fração de células; iii) de obtenção de uma população de células únicas isoladas, que compreende a distribuição de células da dita fração de células individualmente em um grande número de recipientes; iv) de amplificação e realização de ligação dos pares que codificam Vh e VL, em um procedimento de 5 RT-PCR com extensão sobreposta multiplex, utilizando um molde derivado das ditas células únicas isoladas e v) de realização opcional de uma PCR aninhada dos pares que codificam Vh e Vl ligados. Preferencialmente, os pares que codificam Vh e Vl cognatos isolados são submetidos a um procedimento de verificação como descrito a seguir.

Uma vez que os pares de seqüências de Vh e Vl foram gerados,

é realizado um procedimento de verificação para identificar as seqüências que codificam os pares de Vh e Vl com reatividade de ligação em direção a um antígeno associado ao EGFR. Preferencialmente, o antígeno associado ao EGFR é compreendido de uma parte extracelular de EGFR tal como o 15 domínio III, II, I e/ou IV, fragmentos dos domínios ou o domínio extracelular completo. Outros antígenos incluem mutantes tais como mutantes de deleção de EGFR ou SNPs ou fragmentos dos mesmos. Se os pares de seqüências de Vh e Vl forem combinatórios, um procedimento de exibição em fagos pode ser aplicado para enriquecer os pares de Vh e Vl que codificam os 20 fragmentos de anticorpos que se ligam ao EGFR antes da verificação.

Para espelhar a diversidade, a afinidade e a especificidade dos anticorpos produzidos em uma resposta imunológica humoral após a imunização com EGFR, a presente invenção desenvolveu um procedimento de verificação para os pares cognatos, com a finalidade de obtenção da diversi25 dade mais ampla possível. Para as finalidades de verificação, o repertório de pares cognatos que codificam Vh e Vl é expresso individualmente na forma de fragmentos de anticorpos (por exemplo, scFv ou Fab) ou na forma de anticorpos de comprimento completo utilizando um vetor de verificação bacteriano ou de mamífero transfectado em uma célula hospedeira adequada. O 30 repertório de Fabs/anticorpos pode ser verificado - sem limitação - em relação à reatividade ao EGFR, em relação à atividade antiproliferativa contra uma linhagem de células cancerosas que expressa EGFR e em relação à capacidade de inibir a ligação do Iigante (por exemplo, EGF) ao EGFR1 em relação à inibição da fosforilação, à indução da apoptose, à internalização do EGFR.

Em paralelo, o repertório de Fabs/anticorpos é verificado contra antígenos selecionados tais como peptídeos de EGFR humanos e opcionalmente de cinomólgo ou de chimpanzé ou de macaco rhesus. Os peptídeos antigênicos podem, por exemplo, ser selecionados partindo do domínio extracelular do EGFR humano, do domínio extracelular do EGFR mutante humano e do domínio extracelular do EGFR de cinomólgo ou de fragmentos dos mesmos. Os peptídeos podem ser biotinilados para facilitar a imobilização sobre esferas ou placas durante a verificação. Meios de imobilização alternativos também podem ser utilizados. Os antígenos são selecionados com base no conhecimento da biologia do EGFR e no efeito de neutralização e/ou protetor esperado que os anticorpos capazes de se ligar a estes antígenos podem potencialmente fornecer. Este procedimento de verificação pode similarmente ser aplicado a uma biblioteca combínatória de exibição em fagos.

As proteínas EGFR recombinantes utilizadas para a verificação podem ser expressas em bactérias, células de insetos, células de mamíferos 20 ou outro sistema de expressão adequado. Para o processamento correto (incluindo a glicosilação) as proteínas são expressas em células de mamíferos. A proteína EGFR-ECD pode ser expressa na forma de uma proteína solúvel (sem a região transmembrana e intracelular) ou pode ser fundida a uma terceira proteína, para aumentar a estabilidade. Se a proteína EGFR for 25 expressa com uma marcação de fusão, o parceiro de fusão pode ser extraído por clivagem antes da verificação. Em adição à verificação primária descrita anteriormente, pode ser realizada uma verificação secundária, para garantir que nenhuma das seqüências selecionadas codifique falsos positivos.

Geralmente, os ensaios imunológicos são adequados para a verificação realizada na presente invenção. Tais ensaios são bem-conhecidos na técnica e constituem, por exemplo, ELISPOT, ELISA, FLISA, ensaios em membrana (por exemplo, Western blots), arranjos sobre filtros e FACS. Os ensaios podem ser realizados sem quaisquer etapas de enriquecimento prévias, utilizando polipeptídeos produzidos partindo das seqüências que codificam os pares de Vh e VL. No evento em que o repertório de pares que codificam Vh e Vl são pares cognatos, nenhum enriquecimento, por exemplo, 5 através da exibição em fagos é necessário antes da verificação. Entretanto, na verificação de bibliotecas combinatórias, os ensaios imunológicos são preferencialmente realizados em combinação com ou após métodos de enriquecimento tal como exibição em fagos, exibição em ribossomos, exibição na superfície de bactérias, exibição em leveduras, exibição em vírus eucarió10 ticos, exibição em RNA ou exibição covalente (revisado em FitzGeraId1 K., 2000, Drug Discov. Today 5, 253-258).

As seqüências codificadoras do par Vh e Vl selecionadas na verificação são geralmente submetidas ao sequenciamento e analisadas em relação à diversidade das regiões variáveis. Em particular, a diversidade nas 15 regiões CDR é interessante, mas também a representação da família de Vh e Vl é interessante. Com base nestas análises, são selecionadas as seqüências que codificam os pares de Vh e Vl que representam a diversidade total dos anticorpos que se ligam ao EGFR isolados de um ou mais doadores animais. Preferencialmente, são selecionadas as seqüências com dife20 renças em todas as regiões CDR (CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL1, CDRL2 e CDRL3). Se houver seqüências com uma ou mais regiões CDR idênticas ou muito similares que pertencem a famílias de Vh ou Vl diferentes, estas também são selecionadas. Preferencialmente, pelo menos a região CDR3 da cadeia pesada variável (CDRH3) difere entre os pares de sequên25 cias selecionados. Potencialmente, a seleção de pares de seqüências de Vh e Vl pode ser baseada fortemente na variabilidade da região CDRH3. Durante a iniciação e a amplificação das seqüências, podem ocorrer mutações nas regiões estruturais da região variável, em particular, na primeira região estrutural. Preferencialmente, os erros que ocorrem na primeira região estru30 tural são corrigidos com a finalidade de garantir que as seqüências correspondam completamente ou pelo menos a 98% daquelas de origem na linhagem germinativa, por exemplo, de forma que as seqüências de Vh e Vl sejam completamente murinas.

Quando é garantido que a diversidade total da coleção de seqüências selecionadas que codificam os pares de Vh e Vl é altamente representativa da diversidade observada no nível genético em uma resposta 5 humoral a uma imunização com EGFR, é esperado que a especificidade total dos anticorpos expressos partindo de uma coleção de pares selecionados que codificam Vh e Vl também seja representativa em relação à especificidade dos anticorpos produzidos nos animais imunizados com EGFR. Uma indicação do fato da especificidade dos anticorpos expressos partindo de 10 uma coleção de pares selecionados que codificam Vh e Vl ser representativa da especificidade dos anticorpos produzidos pelos doadores pode ser obtida através da comparação dos títulos dos anticorpos para os antígenos selecionados do sangue do doador com a especificidade dos anticorpos expressa partindo de uma coleção de pares selecionados que codificam Vh e 15 VL. Adicionalmente, a especificidade dos anticorpos expressos partindo de uma coleção de pares selecionados que codificam Vh e Vl pode ser adicionalmente analisada. O grau de especificidade se correlaciona com o número de antígenos diferentes para os quais a reatividade de ligação pode ser detectada. Em uma modalidade adicional da presente invenção, a especificida20 de dos anticorpos individuais expressos partindo de uma coleção de pares selecionados que codificam Vh e Vl é analisada através do mapeamento dos epitopos.

O mapeamento dos epitopos pode ser realizado através de um número de metodologias, que não necessariamente excluem cada outra. 25 Uma maneira de mapear a especificidade ao epitopo de uma molécula de anticorpo é avaliar a ligação aos peptídeos de comprimentos variáveis derivados da estrutura primária do antígeno-alvo. Tais peptídeos podem ser tanto lineares quanto conformacionais e podem ser utilizados em um número de formatos de ensaios, incluindo ELISA, FLISA e Ressonância de Plasmônio 30 de Superfície (SPR, Biacore, FACS). Além disso, os peptídeos podem ser selecionados de forma racional utilizando dados de seqüências e estruturais disponíveis para representar, por exemplo, regiões extracelulares ou regiões conservadas do antígeno-alvo ou podem ser planejados como um conjunto de peptídeos sobrepostos que representa uma parte selecionada ou todo o antígeno (Meloen RH, Puijk WC1 Schaaper WMM. Epitope mapping by PEPSCAN. Em: Immunology Methods Manual. Ed Iwan Lefkovits 1997, Aca5 demic Press, pp 982-988). A reatividade específica de um clone de anticorpo com um ou mais tais peptídeos será geralmente uma indicação da especificidade do epitopo. Entretanto, os peptídeos são em muitos casos fracos imitadores dos epitopos reconhecidos pelos anticorpos produzidos contra antígenos proteicos, tanto por causa de uma ausência de conformação natural 10 ou específica quanto devido à área de superfície inserida de interação geralmente maior entre um anticorpo e um antígeno proteico quando comparada à de um anticorpo e um peptídeo. Um segundo método para o mapeamento de epitopos, que permite a definição das especificidades diretamente no antígeno proteico, é através do mascaramento seletivo do epitopo utili15 zando anticorpos bem definidos existentes. A ligação reduzida de uma segundo anticorpo de sondagem ao antígeno após o bloqueio é geralmente indicativa de epitopos compartilhados ou sobrepostos. O mapeamento de epitopos através do mascaramento seletivo pode ser realizado através de um número de ensaios imunológicos, incluindo, mas não restritos a ELISA e 20 Biacore, que são bem-conhecidos na técnica (por exemplo, Ditzel e outros 1997. J. Mol. Biol. 267:684-695; Aldaz-Carroll e outros 2005. J. Virol. 79: 6260-6271). Ainda um outro método potencial para a determinação da especificidade ao epitopo de anticorpos anti-EGFR é a seleção de mutantes de escape na presença de anticorpo. Esta pode, por exemplo, ser realizada uti25 Iizando uma varredura de alanina. O sequenciamento do(s) gene(s) de interesse de tais mutantes de escape geralmente revelará quais aminoácidos no(s) antígeno(s) que são importantes para o reconhecimento pelo anticorpo e assim constituem (parte de) o epitopo.

Produção de uma composição de anticorpo anti-EGFR de pares selecionados que codificam Vh e Vi

Uma composição de anticorpos da presente invenção pode ser produzida partindo de uma linhagem de células de expressão policlonal em um ou alguns biorreatores ou equivalentes dos mesmos. Após esta abordagem os anticorpos anti-EGFR podem ser purificados do reator na forma de uma preparação única sem ter que separar os membros individuais que constituem a composição de anticorpo anti-EGFR durante o processo. Se a 5 composição de anticorpos for produzida em mais de um biorreator, a composição de anticorpo anti-EGFR purificada pode ser obtida através do agrupamento dos anticorpos obtidos partindo de sobrenadantes individualmente purificados de cada biorreator.

Uma maneira de produzir uma composição de anticorpos recombinantes é descrita na WO 2004/061104 e na WO 2006/007850 (estas referências são incorporadas aqui como referência). O método descrito nas mesmas baseia-se na integração específica ao sítio da seqüência codificadora do anticorpo dentro do genoma das células hospedeiras individuais, garantindo que as cadeias de proteínas de Vh e Vl sejam mantidas em seu pareamento original durante a produção. Além disso, a integração específica ao sítio minimiza os efeitos de posição e, portanto, é esperado que as propriedades de crescimento e de expressão das células individuais na linhagem de células policlonais sejam muito similares. Geralmente, o método envolve o seguinte: i) uma célula hospedeira com um ou mais sítios de reconhecimento da recombinase; ii) um vetor de expressão com pelo menos um sítio de reconhecimento da recombinase compatível com o da célula hospedeira; iii) produção de uma coleção de vetores de expressão através da transferência dos pares selecionados que codificam Vh e Vl do vetor de verificação para um vetor de expressão de forma que um anticorpo de comprimento completo ou um fragmento de anticorpo possa ser expresso partindo do vetor (tal transferência pode não ser necessária se o vetor de verificação for idêntico ao vetor de expressão); iv) transfecção da célula hospedeira com a coleção de vetores de expressão e um vetor que codifica uma recombinase capaz de combinar os sítios de reconhecimento da recombinase no genoma da célula hospedeira com aquele no vetor; v) obtenção/produção de uma linhagem de células policlonais partindo da célula hospedeira transfectada e vi) expressão e coleta da composição de anticorpos da linhagem de células policlonais.

Quando um número pequeno (2-3 ou mais) de anticorpos é utilizado para uma composição, estes podem ser expressos e purificados individualmente de uma maneira similar à produção de anticorpos monoclonais, 5 por exemplo, como descrito na WO 2004/085474. Os anticorpos purificados podem ser misturados após a purificação ou podem ser embalados em frascos separados para mistura antes da administração ou para administração separada.

Preferencialmente células de mamífero tais como células CHO1 células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, células Sp2/0 ou NSO), fibroblastos tal como NIH 3T3 e células humanas imortalizadas, tais como células HeLa, células HEK 293 ou PER.C6, são utilizadas. Entretanto, células eucarióticas sem ser de mamífero ou procarióticas, tais como células vegetais, células de insetos, células de levedura, fungo, E. coli etc., também podem ser empregadas. Uma célula hospedeira adequada compreende um ou mais sítios de reconhecimento da recombinase adequados em seu genoma. A célula hospedeira deve também conter um modo de seleção que está ligado de forma operacional ao sítio de integração, para possibilitar a seleção dos integrantes, (isto é, células que possuem uma cópia integrada de um vetor de expressão de Ab anti-EGFR ou um fragmento de vetor de expressão no sítio de integração). A preparação de células que possuem um sítio FRT em uma localização predeterminada no genoma foi descrita, por exemplo, na US 5.677.177. Preferencialmente, uma célula hospedeira possui apenas um único sítio de integração, que fica localizado em um sítio que permite a alta expressão do integrante (um assim chamado "hot-spot").

Um vetor de expressão adequado compreende um sítio de reconhecimento de recombinação que é compatível com o(s) sítio(s) de reconhecimento da recombinase da célula hospedeira. Preferencialmente o sítio de reconhecimento da recombinase está ligado a um gene de seleção ade30 quado diferente do gene de seleção utilizado para a construção da célula hospedeira. Os genes de seleção são bem-conhecidos na técnica e incluem o gene da glutamina sintetase (GS), o gene da di-hidrofolato redutase (DHFR) e a neomicina, em que o GS ou o DHFR pode ser utilizado para a amplificação gênica da seqüência Vh e Vl inserida. O vetor também pode conter dois sítios de reconhecimento da recombinase diferentes para permitir a troca de cassetes mediada pela recombinase (RMCE) da seqüência codificado5 ra do anticorpo ao invés da integração completa do vetor. A RMCE é descrita em (Langer e outros 2002; Schlake e Bode 1994). Os sítios de reconhecimento da recombinase adequados são bem-conhecidos na técnica e incluem os sítios FRT1 Iox e attP/attB. Preferencialmente o vetor de integração é um vetor que codifica isotipo, em que as regiões constantes (preferencial10 mente incluindo íntrons) estão presentes no vetor antes da transferência do par codificador de Vh e Vl do vetor de verificação (ou as regiões constantes já estão presentes no vetor de verificação se a verificação for realizada em anticorpos de comprimento completo. As regiões constantes presentes no vetor podem ser a região constante de cadeia pesada inteira (CHi até CH3 15 ou até CH4) ou a região constante que codifica a parte Fc do anticorpo (CH2 até CH3 ou até CH4). A região constante Kappa ou Lambda de cadeia leve também pode estar presente antes da transferência. A escolha do número de regiões constantes presentes, se alguma, depende do sistema de verificação e de transferência utilizado. As regiões constantes de cadeia pesada 20 podem ser selecionadas dos isotipos IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI, lgA2, IgM, IgD e IgE. Os isotipos preferidos são IgGI, lgG2 e/ou lgG3. Ainda, o vetor de expressão para a integração específica ao sítio do ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-EGFR contém promotores adequados ou seqüências equivalentes que direcionam altos níveis de expressão de cada 25 uma das cadeias Vh e Vl . A Figura 4 ilustra uma maneira possível de planejar o vetor de expressão, embora vários outros planejamentos sejam possíveis.

A transferência dos pares selecionados que codificam Vh e Vl partindo do vetor de verificação pode ser realizada através da clivagem com enzimas de restrição convencionais e ligação, de forma que cada molécula de vetor de expressão contenha um par que codifica Vh e Vl. Preferencialmente, os pares que codificam Vh e Vl são transferidos individualmente, estes podem, entretanto, também ser transferidos em massa se desejado. Quando todos os pares selecionados que codificam Vh e Vl são transferidos para o vetor de expressão uma coleção ou uma biblioteca de vetores de expressão é obtida. Meios alternativos de transferência também podem ser 5 utilizados se desejado. Se o vetor de verificação for idêntico ao vetor de expressão, a biblioteca de vetores de expressão é constituída dos pares de seqüências de Vh e Vl durante a verificação, que ficam situados no vetor de verificação/de expressão.

Os métodos para a transfecção de uma seqüência de ácido nucleico para dentro de uma célula hospedeira são conhecidos na técnica. Para garantir a integração específica ao sítio, uma recombinase adequada também tem que ser fornecida à célula hospedeira. Isto é preferencialmente realizado através da cotransfecção de um plasmídeo que codifica a recombinase. As recombinases adequadas são, por exemplo, Flp, Cre ou integrase do fago OC31, utilizada junto com um sistema de célula hospedeira/vetor com os sítios de reconhecimento da recombinase correspondentes. A célula hospedeira pode também ser transfectada em massa, significando que a biblioteca de vetores de expressão é transfectada na linhagem de células em uma única reação sendo obtida assim uma linhagem de células policlonais. Alternativamente, a coleção de vetores de expressão pode ser transfectada individualmente na célula hospedeira, gerando assim uma coleção de linhagens de células individuais (cada linhagem de células produz um anticorpo com uma especificidade particular). As linhagens de células geradas após a transfecção (individuais ou policlonais) são então selecionadas em relação aos integrantes específicos ao sítio e adaptadas para crescerem em suspensão e meios isentos de soro, se já não possuírem estas propriedades antes da transfecção. Se a transfecção tiver sido realizada individualmente, as linhagens de células individuais são analizadas adicionalmente em relação às suas propriedades de crescimento e à produção de anticorpo. Preferencialmente, as linhagens de células com taxas de proliferação e níveis de expressão de anticorpo similares são selecionadas para a produção da linhagem de células policlonais. A linhagem de células policlonais é então gerada através da mistura das linhagens de células individuais em uma proporção predefinida. Geralmente, um banco de células principais policlonais (pMCB), um banco de células de pesquisa policlonais (pRCB) e/ou um banco de células de trabalho policlonais (pWCB) é estabelecido partindo da Ii5 nhagem de células policlonais. A linhagem de células policlonais é gerada através da mistura das linhagens de células individuais em uma proporção predefinida. A linhagem de células policlonais é distribuída em ampolas gerando assim um banco de células de pesquisa policlonais (pRCB) ou um banco de células principais (pMCB) partindo do qual um banco de células de 10 trabalho policlonais (pWCB) pode ser gerado através da expansão das células partindo do banco de células de pesquisa ou principais. O banco de células de pesquisa é primariamente para provar os estudos de conceito, nos quais a linhagem de células policlonais pode não compreender tantos anticorpos individuais quanto a linhagem de células policlonais no banco de cé15 lulas principais. Normalmente, o pMCB é adicionalmente expandido para estabelecer um pWCB com finalidades de produção. Uma vez que o pWCB está exaurido, uma nova ampola do pMCB pode ser expandida para estabelecer um novo pWCB.

Uma modalidade da presente invenção é uma linhagem de céluIas policlonais capaz de expressar uma composição de anticorpo anti-EGFR recombinante da presente invenção.

Uma modalidade adicional da presente invenção é uma linhagem de células policlonais em que cada célula individual é capaz de expressar um único par que codifica Vh e Vl e a linhagem de células policlonais 25 como um todo é capaz de expressar uma coleção de pares que codificam Vh e VL, em que cada par de Vh e Vl codifica um anticorpo anti-EGFR. Preferencialmente a coleção de pares que codificam Vh e Vl são pares cognatos gerados de acordo com os métodos da presente invenção.

Uma composição de anticorpos recombinantes da presente invenção pode ser produzida através da cultura de uma ampola de um pWCB em um meio apropriado durante um período de tempo que permita a expressão suficiente de anticorpo e em que a linhagem de células policlonais permaneça estável (A janela é de aproximadamente entre 15 dias e 50 dias). Podem ser utilizados métodos de cultura tal como batelada alimentada ou perfusão. A composição de anticorpos recombinantes é obtida do meio de cultura e purificada através de técnicas de purificação convencionais. A cro5 matografia por afinidade combinada com etapas de purificação subsequentes tais como cromatografia por troca iônica, interações hidrofóbicas e filtração em gel tem sido frequentemente utilizada para a purificação de IgG. Após a purificação, a presença de todos os membros individuais na composição de anticorpos policlonais é avaliada, por exemplo, através de cromato10 grafia por troca iônica. A caracterização de tal composição de anticorpos é descrita em detalhes na WO 2006/007853 (incorporada aqui como referência).

Um método alternativo de expressão de uma mistura de anticorpos em um hospedeiro recombinante é descrito na WO 2004/009618. 15 Este método produz anticorpos com cadeias pesadas diferentes associadas com a mesma cadeia leve proveniente de uma única linhagem de células. Esta abordagem pode ser aplicável se a composição de anticorpo anti-EGFR for produzida partindo de uma biblioteca combinatória.

Composições terapêuticas Um outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica

que compreende como um ingrediente ativo uma composição de anticorpos anti-EGFR ou de Fab recombinante anti-EGFR ou uma outra composição de fragmentos de anticorpos recombinantes anti-EGFR ou uma molécula de ligação biespecífica da invenção. Preferencialmente, o ingrediente ativo de 25 tal composição é uma composição de anticorpos recombinantes anti-EGFR como descrito na presente invenção. É pretendido que tais composições sejam para a melhora e/ou para a prevenção e/ou para o tratamento de câncer. Preferencialmente, a composição farmacêutica é administrada a um ser humano, um animal doméstico ou um animal de companhia.

A composição farmacêutica compreende ainda um excipiente

farmaceuticamente aceitável.

A composição de anticorpos anti-EGFR ou os fragmentos dos anticorpos da mesma podem ser administrados dentro de um diluente, um carreador ou um excipiente farmaceuticamente aceitável, em uma forma de dosagem unitária. A prática farmacêutica convencional pode ser empregada para fornecer formulações ou composições adequadas para a administração a pacientes com câncer. Em uma modalidade preferida, a administração é terapêutica, significando que é realizada após uma condição de câncer ter sido diagnosticada. Qualquer via apropriada de administração pode ser empregada, por exemplo, a administração pode ser administração parenteral, intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, por aerossol, por supositório ou oral. Por exemplo, as formulações farmacêuticas podem estar na forma de soluções ou de suspensões líquidas. Para a administração oral, é necessário que estas estejam protegidas contra a degradação no estômago. Para as formulações intranasais, os anticorpos podem ser administrados na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis.

As composições farmacêuticas da presente invenção são preparadas de uma maneira conhecida per se, por exemplo, através de processos convencionais de dissolução, liofilização, mistura, granulação ou preparação. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com a prá20 tica farmacêutica convencional (vide, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20â ed.), ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia, PA e Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick e J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nova York, NY).

Preferencialmente as soluções ou as suspensões do ingrediente

ativo e especialmente soluções ou suspensões aquosas isotônicas, são utilizadas para preparar as composições farmacêuticas da presente invenção. No caso de composições Iiofilizadas que compreendem o ingrediente ativo isoladamente ou junto com um carreador, por exemplo, manitol, tais solu30 ções ou suspensões podem, se possível, ser produzidas antes do uso. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou podem compreender excipientes, por exemplo, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes e/ou emulsificantes, solubilizantes, sais para a regulação da pressão osmótica e/ou tampões e são preparadas de uma maneira conhecida per se, por exemplo, através de processos convencionais de dissolução ou de Iiofilização. As ditas soluções ou suspensões podem compreender substâncias 5 que aumentam a viscosidade, tal como carboximetilcelulose de sódio, carboximetilcelulose, dextrano, polivinilpirrolidona ou gelatina.

As composições para injeção são preparadas de maneira costumeira sob condições estéreis; o mesmo também se aplica à introdução das composições em ampolas ou frascos e à vedação dos recipientes.

As composições farmacêuticas compreendem de aproximada

mente 1% até aproximadamente 95%, preferencialmente de aproximadamente 20% até aproximadamente 90% de ingrediente ativo. As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem, por exemplo, estar na forma de dose unitária, tal como na forma de ampolas, frascos, supositórios, 15 comprimidos, pílulas ou cápsulas. As formulações podem ser administradas a indivíduos humanos em quantidades terapeuticamente ou profilaticamente eficientes (por exemplo, quantidades que previnem, eliminam ou reduzem um estado de saúde patológico) para fornecer terapia para uma doença ou um estado de saúde. É provável que a dosagem preferida de agente tera20 pêutico que será administrada dependa de variáveis tais como a gravidade do câncer, da condição geral de saúde do paciente particular, da formulação dos excipientes do composto e de sua via de administração.

Usos terapêuticos das composições de acordo com a invenção

As composições farmacêuticas de acordo com a presente in25 venção podem ser utilizadas para o tratamento ou para a melhora de uma doença em um mamífero. Os estados de saúde que podem ser tratados ou prevenidos com as presentes composições farmacêuticas incluem a prevenção e o tratamento de pacientes com câncer pode ser preferencialmente submetido ao tratamento terapêutico com uma composição farmacêutica de 30 acordo com a presente invenção.

Uma modalidade da presente invenção é um método de prevenção, tratamento ou melhora de um ou mais sintomas associados com câncer em um mamífero, que compreende a administração de uma quantidade eficiente de uma composição de anticorpos recombinantes anti-EGFR da presente invenção ao dito mamífero.

Uma modalidade adicional da presente invenção é o uso de uma composição de anticorpos recombinantes anti-EGFR da presente invenção para a preparação de uma composição para o tratamento, a melhora ou a prevenção de um ou mais sintomas associados com câncer em um mamífero.

Preferencialmente, o mamífero nas modalidades anteriores é um ser humano, um animal doméstico ou um animal de companhia.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção são indicados no tratamento de certos tumores sólidos. Com base em um número de fatores, incluindo os níveis de expressão de EGFR, entre outros, os tipos de tumores a seguir parecem apresentar indicações preferidas: câncer de ma15 ma, de ovário, de cólon, retal, de próstata, de bexiga, pancreático, de cabeça e pescoço e pulmonar de células não-pequenas. Em associação com cada uma destas indicações, três vias clínicas parecem oferecer potenciais distintos para sucesso clínico:

Terapia adjunta: Na terapia adjunta, os pacientes seriam tratados com os anticorpos de acordo com a presente invenção em combinação com um agente quimioterapêutico ou antineoplásico e/ou uma terapia de radiação. Os alvos primários listados anteriormente serão tratados sob protocolo através da adição dos anticorpos da invenção à terapia padronizada de primeira e de segunda linhas. Os planejamentos do protocolo se dirigirão à eficiência que é avaliada pela redução na massa tumoral assim à capacidade de reduzir doses usuais de quimioterapia padronizada. Estas reduções na dosagem permitirão uma terapia adicional e/ou prolongada através da redução da toxicidade relacionada à dose do agente quimioterapêutico. Os anticorpos anti-EGFR da técnica anterior foram ou estão sendo utilizados em vários testes clínicos adjuntos em combinação com os agentes quimioterapêuticos ou antineoplásicos adriamicina (Erbitux: carcinoma avançado de próstata), cisplatina (Exbitux: carcinomas avançados de cabeça e pescoço e pulmonar), taxol (Erbitux: câncer de mama) e doxorrubicina (Erbitux).

A invenção fornece artigos farmacêuticos que compreendem uma composição de anticorpos da invenção e pelo menos um composto capaz de induzir a diferenciação de células cancerosas na forma de uma com5 binação para a administração simultânea, separada ou sucessiva na terapia de câncer. Através da combinação das composições de anticorpos da invenção com agentes conhecidos por induzirem a diferenciação terminal de células cancerosas, o efeito pode ser adicionalmente aumentado.

O pelo menos um composto pode ser selecionado do grupo que 10 consiste em ácido retinóico, ácidos trans-retinóicos, ácidos cis-retinóicos, fenilbutirato, fator de crescimento de nervos, sulfóxido de dimetila, vitamina D(3) forma ativa, receptor gama ativado pelo proliferador de peroxissomos, 13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol, hexametileno-bis-acetamida, fatorbeta de crescimento de transformação, ácido butírico, AMP cíclico e vesnari15 nona. Preferencialmente o composto é selecionado do grupo que consiste em ácido retinóico, fenilbutirato, ácido todo-trans-retinóico, vitamina D forma ativa.

Os artigos farmacêuticos que compreendem uma composição de anticorpos da invenção e pelo menos um composto quimioterapêutico ou 20 antineoplásico podem ser utilizados como uma combinação para a administração simultânea, separada ou sucessiva na terapia de câncer. O composto quimioterapêutico pode ser selecionado do grupo que consiste em adriamicina, cisplatina, taxol, doxorrubicina, topotecano, fluoropirimidina, oxaliplatina e irinotecano.

Monoterapia: Em associação com o uso dos anticorpos de a

cordo com a presente invenção na monoterapia de tumores, os anticorpos podem ser administrados a pacientes sem um agente quimioterapêutico ou antineoplásico. Os resultados pré-clínicos gerados através do uso de anticorpos de acordo com a presente invenção e discutidos aqui demonstraram resultados positivos como uma terapia independente.

Agente de Formação de Imagem: Através da ligação de um radionuclídeo (por exemplo, ítrio (90Y) aos anticorpos de acordo com a presente invenção, é esperado que os anticorpos marcados radioativamente de acordo com a presente invenção possam ser utilizados como um agente de formação de imagem para diagnóstico. Em tal função, os anticorpos da invenção serão localizados tanto em tumores sólidos quanto em lesões metas5 tásicas de células que expressam EGFR. Em associação ao uso dos anticorpos da invenção como agentes de formação de imagem, os anticorpos podem ser utilizados no auxílio do tratamento cirúrgico de tumores sólidos, tanto como uma verificação pré-cirúrgica quanto um acompanhamento pósoperatório para determinar qual tumor permanece e/ou retorna. Um anticor10 po (111In)-Erbitux foi utilizado como um agente de formação de imagem em um teste clínico humano de Fase I em pacientes que possuíam carcinomas pulmonares de células escamosas que não podiam ser removidos por cirurgia. (Divgi e outros J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991)). Os pacientes foram acompanhados com câmera gama padronizada anterior e posterior. Os 15 dados preliminares indicaram que todas as lesões primárias e as lesões metastásicas grandes foram identificadas, enquanto que somente a metade das lesões metastásicas pequenas (menores que 1 cm) não foram detectadas.

Os inibidores da tirosina quinase (TKIs) são moléculas sintéticas de baixo peso molecular principalmente derivadas de quinazolina que interagem com o domínio da tirosina quinase intracelular dos receptores e inibindo a fosforilação do receptor induzida pelo Iigante através da competição pelo sítio de ligação ao Mg-ATP intracelular. Vários TKIs no desenvolvimento clínico incluindo Gefitinib (Iressa, ZD1839), Erlobtinib (Tarceva, OSI-774), Lapatinib, (Tykerb, GW572016), Canertinib (CI-1033), EKB-569 e PKI-166 estão direcionados ao EGFR. O tratamento de combinação de TKIs e antiEGFR mostrou ser benéfico tanto in vivo quanto in vitro contra células cancerosas dependentes de EGFR. Os artigos farmacêuticos que compreendem uma composição de anticorpos da invenção e pelo menos um TKI que se direciona ao EGFR podem ser utilizados como uma combinação para a administração simultânea, separada ou sucessiva na terapia de câncer. Os inibidores adicionais de moléculas pequenas incluem: Sorafinib (raf e múltiplos RTKs), Sunitinib (Múltiplos RTKs), Temsirolimus (mTOR), RAD001 (mTOR) e AZD217 (VEGFR2).

Em outras modalidades, as composições de anticorpos da presente invenção são utilizadas em combinação com outros produtos terapêuticos de anticorpo. Os exemplos destes incluem, por exemplo, anticorpos 5 contra HER2 (Herceptina) e VEGF (avastina). Ainda em outras modalidades, as composições de anticorpos da presente invenção são utilizadas em combinação com um agente conhecido por estimular as células do sistema imunológico, tal tratamento de combinação levando a um maior aumento mediado pelo sistema imunológico da eficácia das composições de anticorpos da 10 invenção. Os exemplos de tais agentes de estímulo imunológico incluem, mas não estão limitados às interleucinas recombinantes (por exemplo, IL-21 e IL-2).

Dose e Via de Administração

Embora a dosagem específica para os anticorpos de acordo com a invenção não tenha sido ainda determinada, certas considerações de dosagem podem ser determinadas através da comparação com o produto similar (ImClone C225 (Erbitux)) que foi aprovado. O anticorpo C225 está sendo tipicamente administrado com doses na faixa de 5 até 400 mg/m2, com as doses mais baixes sendo utilizadas apenas em associação aos estudos de segurança. Consequentemente, seria esperado que a dosagem em pacientes com os anticorpos de acordo com a invenção pudesse estar nesta faixa ou inferior, talvez na faixa de 50 até 300 mg/m2 e ainda permanecer eficiente. A dosagem em mg/m2, ao contrário da medida convencional de dose em mg/kg, é uma medida baseada na área de superfície e é uma medida de dosagem conveniente que é planejada para incluir pacientes de todos os tamanhos de crianças até adultos.

A informação prescritiva disponível para o Erbitux (Cetuximab) inclui uma infusão IV inicial de 120 minutos de 400 mg/m2, seguida por infusões semanais de 60 min de 250 mg/m2. Estas dosagens são recomenda30 das para o tratamento independente assim como para combinação com a terapia de radiação. Para o Vectibix (panitumumab) a dose recomendada é de 6 mg/kg administrada ao longo de 60 minutos a cada 14 dias. A dosagem clínica esperada do anticorpo HuMaxEGFr (zumutumumab) da Genmab é uma dose inicial de 8 mg/kg de HuMax-EGFr, seguida por infusões semanais de uma dose de manutenção até a progressão da doença. A dose de manutenção será ajustada quando necessário até que 5 o paciente desenvolva uma erupção na pele Iimitante da dose, até uma dose máxima de 16 mg/kg de HuMax-EGFr (Dosagens para o estudo de Fase Ill principal, disponíveis na descrição do produto da Genmab).

É provável que a dosagem clínica das composições de anticorpos da presente invenção seja limitada pela extensão da erupção na pele que é observada com anticorpos monoclonais anti-EGFR (Erbitux e Vectibix) utilizados na clínica atualmente. Os dados provenientes de um estudo toxicológico de seis semanas em macacos cinomólogos não mostraram sinais de erupção na pele quando uma composição de anticorpos da invenção foi administrada em uma dose equivalente àquela que é utilizada para o tratamento com um dos anticorpos monoclonais utilizados na clínica (exemplo 20). Assim, as composições de anticorpos da invenção podem ser administradas de forma intravenosa e com uma dosagem semanal de 250 mg/m2 que é traduzida em 7,5 mg/kg para um ser humano com uma superfície corporal de 1,8 m2 e 60 kg de peso corporal. Além disso, uma dose de carga inicial de 400 mg/m2 (que é traduzida em 12 mg/kg para um ser humano com uma superfície corporal de 1,8 m2 e 60 kg de peso corporal) pode ser fornecida antes da dosagem semanal subsequente.

É esperado que três abordagens de fornecimento distintas sejam úteis para o fornecimento dos anticorpos de acordo com a invenção. O 25 fornecimento intravenoso convencional será presumidamente a técnica de fornecimento padronizada para a maioria dos tumores. Entretanto, em associação com os tumores na cavidade peritoneal, tais como tumores dos ovários, do duto biliar, de outros dutos e similares, pode ser provado que a administração intraperitoneal é favorável para a obtenção de uma dose alta de 30 anticorpo no tumor e para minimizar a eliminação do anticorpo. De uma maneira similar, certos tumores sólidos possuem sistema de vasos sanguíneos que é apropriado para a perfusão regional. A perfusão regional permitirá a obtenção de uma dose alta do anticorpo no local de um tumor e minimizará a eliminação em curto prazo do anticorpo.

Como com qualquer produto terapêutico baseado na infusão de proteínas ou anticorpos, as preocupações com a segurança estão relaciona5 das primariamente com (i) a síndrome de libreação de citocinas, isto é, hipotensão, febre, tremores, calafrios, (ii) o desenvolvimento de uma resposta imunogênica ao material (isto é, desenvolvimento de anticorpos humanos pelo paciente para o anticorpo terapêutico ou resposta HAHA ou HACA) e (iii) a toxicidade para as células normais que expressam o receptor do EGF, 10 por exemplo, hepatócitos que expressam EGFR. Os testes padronizados e o acompanhamento serão utilizados para monitorar cada uma destas preocupações com a segurança. Em particular, a função hepática será monitorada frequentemente durante os testes clínicos para avaliar danos no fígado, se algum.

Uso para diagnóstico

Uma outra modalidade da invenção está direcionada a kits para diagnóstico. Os kits de acordo com a presente invenção compreendem uma composição de anticorpos anti-EGFR preparada de acordo com a invenção cuja proteína pode ser marcada com uma marcação detectável ou não20 marcada para detecção sem marcação. O kit pode ser utilizado para identificar indivíduos sofrendo de câncer associado com a superexpressão de EGFR.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1 Clonagem de anticorpos anti-EGFR Imunizações

Fêmeas de camundongos BALB/c, da cepa A ou C57B16 (8-10 semanas de idade) foram utilizadas para imunizações através de injeções com proteínas purificadas diferentes em adição às células que superexpressam EGFR.

Proteínas EGFR disponíveis comercialmente (R&D systems

cat#1095-ER ou Sigma # E3641) foram utilizadas para algumas das imunizações. Para as outras imunizações o EGFR humano recombinante e o EGFRvIII produzidos na forma de proteínas de fusão foram utilizados consistindo no ECD do EGFR ou no EGFRvIlI e o hormônio de crescimento humano (hGH), também incluindo um sítio de clivagem do Vírus Etch do Tabaco (TEV) em adição a um His-tag descrito no Exemplo 10b. Em alguns casos, o 5 ECD do EGFR foi isolado através da clivagem com a protease do TEV e da purificação subsequente em uma coluna de Níquel.

A linhagem de células cancerosas de cabeça e pescoço humana, HN5 (Easty DM, Easty GC1 Carter RL, Monaghan P, Butler LJ. Br J Câncer. 1981 Jun;43(6):772-85. Ten human carcinoma cell Iines derived from 10 squamous carcinomas of the head and neck.) expressando aproximadamente 107 receptores/célula foi utilizada para imunizações baseadas em células. As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino), 3 mM de Glicerol, 5 mM de Piruvato de Sódio e 1% de Penicilina Estreptomicina. Antes de cada imunização as células foram Iava15 das em PBS, tratadas com tripsina com TrypLE e ressuspensas em meio de cultura. Subsequentemente as suspensões de células foram lavadas duas vezes em PBS por centrifugação a 250Xg durante 5 min, desalojando e ressuspendendo em 15 mL de PBS esterilizado.

As células ou o antígeno foi diluído em PBS e então misturado 1:1 com Adjuvante de Freund. O adjuvante é utilizado para aumentar e para modular a resposta imunológica. Para as primeiras imunizações o Adjuvante Completo de Freund (CFA) foi utilizado enquanto o Adjuvante Incompleto de Freund (IFA) foi utilizado para as imunizações subsequentes. O IFA é uma emulsão de óleo-em-água composta de óleos minerais e o CFA é o IFA ao qual são adicionadas espécies de Micobactérias secas mortas por tratamento térmico. Ambos os adjuvantes possuem um efeito de depósito. O CFA dá origem à persistência em longo prazo da resposta imunológica e é utilizado para as primeiras imunizações para estimular a resposta imunológica e o IFA é utilizado para imunizações subsequentes. As emulsões foram testadas através da adição de uma gota sobre a superfície de um vidro com água. Se a gota permanecer na forma de uma gota, a emulsão é estável e as injeções podem ser realizadas. Somente as emulsões estáveis foram administradas aos camundongos.

Dependendo do planejamento (vide a Tabela 2), 25-100 pg de antígeno ou 107 células foram utilizadas para cada injeção. No total, os camundongos receberam 4 injeções. Todos os camundongos receberam inje5 ções de 300 pL ou de 200 pL de emulsão. Dependendo do planejamento, as injeções foram realizadas de forma subcutânea (s.c.), intraperitoneal (i.p.) ou intravenosa (i.v.).

No término, os camundongos foram sacrificados através do deslocamento cervical e os baços foram removidos e transferidos para um filtro 10 de células de 74 pm (Corning#136350-3479). As células foram maceradas através do filtro, ressuspensas em RPMI 1640 gelado com 10% de FBS e centrifugadas a 300Xg durante 5 minutos. O pélete de células foi ressuspenso em RPMI 1640 com 1% de FBS, filtrado através de um filtro em seringa de 50 pm (BD# 340603) e coletado por centrifugação. O pélete de células foi 15 criopreservado após a ressuspensão em FCS com 10% de DMSO e as células congeladas foram armazenadas a -80°C até a separação por FACS. Separação por FACS de células plasmáticas murinas

Os frascos com esplenócitos congelados foram descongelados a 37°C e transferidos para um tubo de 15 ml_ com gelo ainda presente. 10 ml_ de RPMI resfriado em gelo, 10% de FBS (soro fetal bovino) foram adicionados em gotas no tubo durante agitação. Após uma lavagem em 10 ml_ de PBS para FACS, 5 mL de PBS para FCS são adicionados antes da filtração das células através de Filcon de 50 μηη. As células foram então peletizadas e ressuspensas em 1 mL de PBS com 2% de FBS (volume final) e coradas com anti-CD43-FITC e anti-CD138-PE de acordo com a diluição específica até uma concentração final de aproximadamente 5 pg/ml. As células foram incubadas a 4°C durante 20 min na escuridão. Subsequentemente, as células foram lavadas 2 vezes com 2 mL de tampão para FACS. Até 15 mL de PBS para FACS foram adicionados. O Iodeto de Propídio (PI) foi adicionado a 1:100 (1 parte de Pl para 100 partes de tampão PBS para FACS) e as células foram subsequentemente separadas em placas para PCR de 96 poços, contendo tampão de reação da PCR (vide abaixo) e centrifugadas durante 2 min 400Xg antes das placas serem congeladas a -80°C. As células plasmáticas foram captadas na forma de CD43-positivas/CD-138 positivas como mostrado na Figura 1.

Ligação de o ares de Vh e Vi cognatos 5 A ligação de seqüências que codificam Vh e Vl foi realizada nas

células isoladas capturadas como células plasmáticas, facilitando o pareamento de cognatos das seqüências que codificam Vh e Vl- O procedimento utilizou um procedimento de PCR de duas etapas baseado e uma RT-PCR com extensão em sobreposição multiplex em uma etapa seguido por uma 10 PCR aninhada. As misturas de iniciadores utilizadas no presente exemplo amplificam apenas as cadeias leves Kappa. Os iniciadores capazes de amplificar as cadeias leves Lambda poderiam, entretanto, ser adicionados na mistura de iniciadores multiplex e na mistura de iniciadores da PCR aninhada se desejado. Se iniciadores Lambda forem adicionados, o procedimento 15 de separação deve ser adaptado de forma que células positivas para Lambda não sejam excluídas. O princípio para a ligação de seqüências de Vh e Vl cognatas é ilustrado na Figura 2.

As placas para PCR de 96 poços produzidas foram descongeladas e as células separadas serviram como molde para a RT-PCR com ex20 tensão em sobreposição multiplex. O tampão de separação adicionado em cada poço antes da separação de células isoladas continha tampão de reação (OneStep RT-PCR Buffer; Qiagen), iniciadores para RT-PCR (vide a Tabela 3) e inibidor de RNase (RNasin, Promega). Este foi suplementado com OneStep RT-PCR Enzyme Mix (diluição de 25x; Qiagen) e mistura de 25 dNTPs (200 μΜ cada) para a obtenção da concentração final em um volume de reação de 20 μί. As placas foram incubadas durante 30 min a 55°C para permitir a transcrição reversa do RNA de cada célula. Após a RT, as placas foram submetidas ao ciclo de PCR a seguir: 10 min a 94°C, 35x(40 s a 94°C, 40 s a 60°C, 5 min a 72°C), 10 min a 72°C.

As reações de PCR foram realizadas em um H20BIT Thermal

cycler com um Peel Seal Basket para 24 placas de 96 poços (ABgene) para facilitar um alto rendimento. As placas para PCR foram armazenadas a 20°C após os ciclos.

Para a etapa de PCR aninhada, as placas para PCR de 96 poços foram preparadas com a mistura a seguir em cada poço (reações de 20 μΙ_) para a obtenção da concentração final determinada: 1x tampão FastStart 5 (Roche), mistura de dNTPs (200 μΜ cada), mistura de iniciadores aninhados (vide a Tabela 4), DNA Polimerase Phusion (0,08 U; Finnzymes) e FastStart High Fidelity Enzyme Blend (0,8 U; Roche). Como molde para a PCR aninhada, 1 μΙ_ foi transferido das reações de PCR com extensão em sobreposição multiplex. As placas para PCR aninhada foram submetidas ao ciclo 10 térmico a seguir: 35x (30 s a 95°C, 30 s a 60°C, 90 s a 72°C), 10 min a 72°C.

As reações selecionadas aleatoriamente foram analisadas em um gel de agarose a 1% para verificar a presença de um fragmento de extensão em sobreposição de aproximadamente 890 pares de bases (pb).

As placas foram armazenadas a -20°C até o processamento a

dicional dos fragmentos de PCR.

Os repertórios de pares codificadores ligados de Vh e Vl provenientes da PCR aninhada foram agrupados, sem misturar os pares de doadores diferentes e foram purificados através de eletroforese preparatória em 20 gel de agarose a 1%. A seqüência que codifica a cadeia leve constante kappa humana foi unida através da extensão com sobreposição à região codificadora de Vl dos produtos da PCR agrupados dos pares codificadores ligados de Vh e Vl (Figura 3). A seqüência que codifica a cadeia leve constante kappa humana foi amplificada partindo de um plasmídeo que contém a se25 quência codificadora de um anticorpo humano com uma cadeia leve kappa em uma reação contendo: Phusion Enzyme (2 U; Finnzymes), 1x tampão Phusion, mistura de dNTPs (200 μΜ cada), iniciador hKCforw-v2 e iniciador Kappa3' (Tabela 5) e o molde do plasmídeo pLL138 (10 ng/μί.) em um volume total de 50 μΙ_. A reação foi submetida ao ciclo térmico a seguir: 25x (30 30 s a 95°C, 30 s a 55°C, 45 s a 72°C), 10 min a 72°C. O fragmento de PCR resultante foi purificado por eletroforese preparatória em gel de agarose a 1%. Os fragmentos de PCR agrupados purificados de cada repertório foram unidos ao fragmento de PCR amplificado e purificado da região codificadora constante kappa humana (Apêndice 2) através da ligação a seguir por PCR com extensão em sobreposição (volume total de 50 μΙ_) con5 tendo: fragmento da região codificadora constante kappa humana (1,4 ng/pL), fragmento de PCR agrupado purificado (1,4 ng/pL), DNA Polimerase Phusion (0,5 U; Finnzymes) e FastStart High Fidelity Enzyme Blend (0,2 U; Roche), 1x tampão FastStart (Roche), mistura de dNTPs (200 μΜ cada), iniciador mhKCrev e iniciadores do conjunto mJH (vide a Tabela 5). A reação 10 foi submetida ao ciclo térmico a seguir: 2 min a 95°C, 25x(30 s a 95°C, 30 s a 55°C, 1 min a 72°C), 10 min a 72°C. O fragmento de PCR resultante (aproximadamente 1070 pb) foi purificado por eletroforese preparatória em gel de agarose a 1%.

Inserção de pares codificadores de Vh e Vi cognatos em um vetor de verificação

Para identificar anticorpos com especificidade de ligação ao EGFR, as seqüências que codificam Vh e Vl obtidas foram expressas na forma de anticorpos de comprimento completo. Isto envolvia a inserção do repertório de pares codificadores de Vh e Vl em um vetor de expressão e a transfecção em uma célula hospedeira.

Um procedimento de clonagem de duas etapas foi empregado para gerar um repertório de vetores de expressão contendo os pares codificadores de Vh e Vl ligados. Estatisticamente, se o repertório de vetores de expressão contiver dez vezes tantos plasmídeos recombinantes quanto o 25 número de produtos de PCR de Vh e Vl pareados cognatos utilizados para a produção do repertório de verificação, há uma probabilidade de 99% de que todos os pares de genes individuais estão representados. Assim, se fragmentos do gene V de extensão com sobreposição de 400 forem obtidos, um repertório de pelo menos 4000 clones foi gerado por verificação.

Sucintamente, o produto da PCR purificado dos repertórios de

pares codificadores de Vh e Vl ligados, unidos à região codificadora constante kappa humana, foi clivado com as DNA endonucleases Xho\ e Not\ nos sítios de reconhecimento introduzidos nos términos dos produtos da PCR. Os produtos clivados e purificados foram ligados em um vetor de expressão de IgG de mamífero digerido com Xhol/Nott, 00-VP-002 (Figura 4) através de procedimentos de ligação padronizados. A mistura de ligação foi subme5 tida à eletroporação em E. coli e adicionada em placas de 2xYT contendo o antibiótico apropriado e incubadas a 37°C durante a noite. O repertório de vetores amplificado foi purificado das células recuperadas das placas utilizando métodos de purificação de DNA padronizadas (Qiagen). Os plasmídeos foram preparados para a inserção de fragmentos de promotor-líder a10 través da clivagem utilizando as endonucleases >Ascl e Nhe\. Os sítios de restrição para estas enzimas estavam localizados entre os pares de genes que codificam Vh e VL. Após a purificação do vetor, um fragmento de promotor-líder de mamífero bidirecional digerido com Asc\-Nhe\ foi inserido nos sítios de restrição de /\scl e NheI através de procedimentos de ligação pa15 dronizados. O vetor ligado foi amplificado em E coli e o plasmídeo foi purificado utilizando métodos padronizados. O repertório gerado de vetores de verificação foi transformado em E. coli através de procedimentos convencionais. As colônias obtidas foram consolidadas em placas principas de 384 poços e armazenadas. O número de colônias dispostas excedia o número 20 de produtos da PCR de início em pelo menos 3 vezes, fornecendo assim uma probabilidade de 95% de presença de todos os pares de genes V individuais.

Verificação em relação à ligação ao domínio extracelular do EGFR

Em geral, a verificação era feita na forma de um procedimento 25 de duas etapas. As bibliotecas de anticorpos foram verificadas em relação à reatividade à proteína EGFR recombinante em ELISA após o qual o FMAT (FLISA) foi utilizado como uma abordagem baseada em células, com a linhagem de células NR6wtEGFR, para a detecção de anticorpos para EGFR que se ligam ao EGFR expresso na superfície celular. Para as bibliotecas 30 101 e 108/109 (Tabela 2) o ELISA foi realizado com EGFR recombinante representando o domínio extracelular do EGFR.

Sucintamente para o ELISA, placas maxisorb da Nunc (no de cat 464718) foram revestidas com 1 pg/mL de proteína (produzida no local), diluído em PBS a 4°C durante a noite. Antes do bloqueio em 50 pL de 2%Leite-PBS-T, as placas foram lavadas uma vez com PBS + 0,05% de Tween (PBS-T). As placas foram lavadas uma vez com PBS-T, 20 μΙ_ de 2%Ieite-PBS-T e 5 μ!_ dos sobrenadantes dos transfectantes FreeStyIe CHO-S (vide abaixo) foram adicionados e incubados durante 1 ΛΑ hora à temperatura ambiente após o que as placas foram lavadas uma vez com PBS-T 20 pL por poço. O anticorpo secundário (HRP-Goat-anti-human IgG, Jackson, no de cat 109-035-097) diluído 1:10000 em 2% de Ieite-PBS-T foi adicionado para detectar os anticorpos ligados aos poços e foi incubado durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez em PBS-T antes da adição de 25 pL de substrato (Kem-en-tec Diagnostics, no de cat 4390) que foram incubados durante 5 min. 25 μΙ_ de ácido sulfúrico a 1 M foram adicionados após a incubação para interromper a reação. O sinal específico foi detectado em uma leitora de ELISA em 450 nm.

Para a detecção por FMAT baseada em células dos anticorpos anti-EGFR, SKBR-3 (ATCC #HTB-30) ou NR6wtEGFR (Welsh e outros, 1991, J Cell Biol, 114, 3, 533-543) as células foram mantidas em meio de cultura como descrito. As células foram contadas e diluídas até 125.000 cé20 lulas/mL com o anticorpo IgG anti-humano de cabra conjugado (H-L) Alexa647 (Molecular probes N0 A21445, lote N0 34686A) diluído 1:40.000. Um total de 20 pL desta suspensão foi transferido para placas Nunc de fundo transparente de 384 poços. Subsequentemente, 10 pL de sobrenadante de transfecção foram adicionados às células. O sinal de FMAT proveniente da 25 reação foi medido após 6-10 horas de incubação.

Os dados da verificação indicam que 221 (4,8%) dos clones totais eram positivos no ELISA. 93 (2,0%) de tais clones também eram positivos no FMAT. No total, 220 (4,8%) dos clones eram positivos no FMAT e dentre estes 127 (220-93) eram exclusivamente positivos para o antígeno de 30 superfície celular. A biblioteca 111 foi verificada de uma maneira similar, mas uma vez que o procedimento de imunização foi realizado para gerar anticorpos específicos para o EGFRvI 11 receptor EGFR mutante de deleção, as verificações por ELISA incluíam ensaios para detectar tanto EGFR do tipo selvagem quanto EGFRvIll. Sete clones foram identificados como sendo específicos para o EGFRvIll no ELISA e, de forma interessante, tais clones eram negativos em relação à coloração de células que expressam wtEGFR no 5 FMAT. 13 clones foram identificados como sendo positivos para o wtEGFR no FMAT e no ELISA, mas não para o EGFRvIll, que eram exclusivos para esta biblioteca comparados com os das bibliotecas 101 e 108/109. Todos os clones positivos no ELISA foram selecionados para análise adicional.

Análise de seqüência e seleção de clones Os clones identificados como específicos ao EGFR no ELISA fo

ram recuperados das placas principais originais (formato de 384 poços) e consolidados em novas placas. O DNA foi isolado dos clones e submetido ao sequenciamento do DNA dos genes V. As seqüências foram alinhadas e todos os clones individuais foram selecionados. Vários alinhamentos das 15 seqüências obtidas revelaram a singularidade de cada clone particular e permitiram a identificação de anticorpos individuais. Após a análise de seqüência de 220 clones, foram identificados 70 grupos de seqüências de anticorpos geneticamente distintos. Cada grupo de seqüências relacionadas foi provavelmente produzido através de hipermutações somáticas de um clone 20 precursor comum. Em geral, um até dois clones de cada grupo foram escolhidos para a validação da seqüência e da especificidade. As seqüências de seqüências variáveis de anticorpos selecionados são mostradas no Apêndice 1. As seqüências de nucleotídeos incluem sítios de restrição em ambos os terminais. Consequentemente, as seqüências de aminoácidos traduzidas 25 correspondentes (utilizando o terceiro quadro de leitura da seqüência de DNA) incluem no N-terminal, dois aminoácidos que não fazem parte das seqüências de VH e VL de acordo com a definição de IMGT (Lefranc e outros (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-Iike domains. Dev. Comp Immunol 27, 55- 30 77). Todas as seqüências de VL mostradas incluem a mesma região Constante Kappa humana, que começa com os aminoácidos -TVAAP- e termina no C-terminal -NRGEC. Para as finalidades da presente invenção, o termo seqüência de VL quando refere-se a um anticorpo especifico exclui a região Constante Kappa e os dois aminoácidos N-terminais (LA-). O termo seqüência de VH quando refere-se a um anticorpo específico exclui os dois aminoácidos N-terminais (RA-).

Validação da seqüência e da especificidade

Para validar os clones que codificam anticorpos, o plasmídeo de DNA foi preparado e a transfecção de células CHO-S Freestyle (Invitrogen) na escala de 2 mL foi realizada para expressão. O sobrenadante foi coletado 96 horas após a transfecção. Os níveis de expressão foram estimados com 10 ELISA anti-lgG padronizado e a especificidade foi determinada através de ELISA específico para EGFR e EGFRvIll. Foi mostrado que 85% dos clones possuíam a especificidade e a seqüência corretas.

Verificação em relação aos efeitos antiproliferativos

Os danos celulares resultarão inevitavelmente na perda da ca15 pacidade da célula de manter e fornecer energia para a função celular metabólica e para o crescimento. Os ensaios de atividade metabólica baseiam-se nesta premissa. Geralmente estes medem a atividade mitocondrial. O Reagente de Proliferação de Célula (Cell Proliferation Reagent) WST-1 (Roche N0 de Cat. 11 644 807 001) é um substrato pronto para uso que mede a ati20 vidade metabólica de células viáveis. Assume-se então que a atividade metabólica se correlaciona com o número de células viáveis. Neste exemplo o ensaio com o WST-1 foi utilizado para medir o número de células metabolicamente ativas após o tratamento com sobrenadantes de culturas de células que contêm anticorpos anti-EGFR diferentes.

Antes da realização do ensaio com o WST-1, volumes diferen

tes de sobrenadantes de 2 mL (0, 10, 25, 50 e 150 μί) foram transferidos para poços apropriados em uma placa de 96 poços.

Células HN5 foram então lavadas com IxPBS e separadas através de tratamento com tripsina com 3 mL de solução de tripsina. 17 mL de meio completo foram então adicionados e as células foram centrifugadas a 300xg (1200 rcf) durante 5 min. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspensas em DMEM + 0,5% de FBS. As células foram contadas e sua concentração foi ajustada e 1500 células foram adicionadas nos poços com os sobrenadantes de forma que cada poço contivesse 200 pL de meio no total. As placas foram incubadas durante 4 dias em uma incubadora umedecida a 37°C. Então 20 pL do reagente WST-1 foram adicionados por 5 poço e as placas foram incubadas durante uma hora a 37°C. As placas foram então transferidas para um agitador de placas orbital e mantidas durante mais uma hora. A absorbância foi medida em 450 e 620 nm (comprimento de onda de referência) em uma leitora de ELISA. A diferença nos níveis de células metabolicamente ativas (MAC) foi calculada como a percentagem 10 dos sobrenandantes de controle como a seguir:

(iOD exp. - ODme io)

%MAC =

\

1 —

x 100

(OD não - tratado - ODmeio)y Estes valores foram então utilizados como a base para uma análise supervisionada de grupo hierárquico (agrupado com base na reatividade no ELISA) realizada utilizando os softwares livres Cluster e TreeView.

É preferível ser capaz de selecionar anticorpos funcionais em

um estágio inicial no processo de seleção de anticorpos. Os sobrenadantes de cultura de 83 transfecções de 2 mL foram utilizados para verificar funções inibidoras do crescimento em um ensaio de proliferação realizado utilizando células HN5 em 0,5% de FBS. Os resultados foram visualizados através da análise simples de grupos hierárquicos. Como pode ser observado na análise de grupos (Figura 5) foi observado que um número de sobrenadantes diminuía o número de células HN5 metabolicamente ativas (cinza-escuro) de uma maneira dependente da concentração (Grupo 2). Similarmente, alguns sobrenadantes aumentavam o número de células HN5 metabolicamente ativas (cinza-claro) de uma maneira dependente da concentração (Grupos 1, 3 e 4). Uma observação interessante era que os sobrenadantes, que diminuíam o número de células HN5 metabolicamente ativas, tinham reatividade 2 (setas em preto) enquanto que os sobrenadantes que aumentavam o número de células HN5 metabolicamente ativas tinham reatividade 1 (setas em cinza). Os sobrenadantes com reatividade 2 eram positivos nos ELISAs tanto para wtEGFR quanto para EGFRvIll, enquanto que os sobrenadantes com reatividade 1 tinham apenas reatividade em relação ao wtEGFR. Assim, tais análises podem fornecer relações entre a reatividade do anticorpo no ELISA e a funcionalidade nos ensaios celulares.

Reparo de clones

Quando é utilizada uma abordagem de PCR multiplex, um certo grau de iniciação cruzada intra e inter família do gene V é esperado devido à degeneração dos iniciadores e ao alto grau de homologia. A iniciação cruzada introduz aminoácidos que não ocorrem naturalmente na estrutura da imu10 noglobulina com várias conseqüências potenciais, por exemplo, alterações estruturais e maior imunogenicidade, tudo resultando em uma menor atividade terapêutica.

Para eliminar estas desvantagens e para garantir que os clones selecionados espelham a resposta imunológica humoral natural, tais mutações de iniciação cruzada foram corrigidas em um processo chamado reparo de clones.

Na primeira etapa do processo de reparo de clones, a seqüência de Vh foi amplificada através da PCR com um conjunto de iniciadores contendo a seqüência que corresponde ao gene Vh do qual o clone de inte20 resse é originado, corrigindo assim quaisquer mutações introduzidas pela iniciação cruzada. O fragmento de PCR foi digerido com Xho\ e ,Ascl e ligado de volta no vetor de expressão de mamífero digerido com XhoUAsc\ (Figura 4) utilizando procedimentos de ligação convencionais. O vetor ligado foi amplificado em E. coli e o plasmídeo foi purificado através de métodos 25 padronizados. A seqüência de Vh foi sequenciada para verificar a correção e o vetor foi digerido com Nhe\/Not\ para prepará-lo para a inserção da cadeia leve.

Na segunda etapa a cadeia leve completa foi amplificada através da PCR com um conjunto de iniciadores contendo a seqüência que corresponde ao gene Vl do qual o clone de interesse é originado, corrigindo assim quaisquer mutações introduzidas pela iniciação cruzada. O fragmento de PCR foi digerido com NheMNoft e ligado no vetor contendo Vh preparado anteriormente. O produto de ligação foi amplificado em E. coli e o plasmídeo foi purificado através de métodos padronizados. Subsequentemente, a cadeia leve foi sequenciada para verificar a correção.

No caso em que a região constante Kappa de um clone selecio5 nado contém mutações, introduzidas durante a amplificação dos genes, esta é substituída por uma região constante não-mutada. Isto é feito em uma PCR com sobreposição em que o gene Vl reparado (amplificado sem a região constante) foi fundido com uma região constante com a seqüência correta (obtida em uma PCR separada). A seqüência inteira é amplificada e clonada 10 no vetor contendo Vh como descrito anteriormente e a cadeia leve reparada é sequenciada para verificar a correção. Tabela 2: Programas de imunização utilizados para gerar material de partida para a clonagem de anti-EGFR Programa, Cepa Injeção 1 Injeção 2 Injeção 3 Injeção 4 Término Grupo de camundongo 101 Ba I b/c Dia 1 Dia 35 Dia 56 Dia 70 Dia 73 25 Mg de rhEGFR (R&D 25 Mg de rhGH-EGFR 25 Mg de rhEGFR* 25 pg de rhEGFR* systems 1095-ER) (Symphogen) (Symphogen) (Symphogen) CFA s.c. IFA s.c IFA s.c IFA s.c 108 Ba I b/c Dia 1 Dia 28 Dia 42 Dia 56 Dia 59 1x107 células HN5 25 Mg de rhEGFR* 1x107 células HN5 25 Mg de rhEGFR*, CFA i.p. (Symphogen) IFA s.c. IFA i.p. (Symphogen) IFA s.c. 109 Balb/c Dia 1 Dia 28 Dia 42 Dia 56 Dia 59 1x107 células HN5 25 Mg de rhEGFR* 1x107 células HN5 25 Mg de rhEGFR* CFA i.p. (Symphogen) IFA s.c. IFA i.p. (Symphogen) PBS i.v. 111 Bal b/c Dia 1 Dia 28 Dia 42 Dia 56 Dia 59 25 pg de rhEGFR* 25 Mg de rhEGFR+ 25 Mg de rhEGFR+ 25 Mg de rhEGFR+ (Symphogen) rhEGFRvMI** rhEGFRvNI** rhEGFRvMI** CFA s.c. (Symphogen) IFA s.c. (Symphogen) IFA s.c. (Symphogen) IFA s.c. 118 Balb/c Dia 1 Dia 29 Dia 44 Dia 58 Dia 61 1x107 células HN5 100 Mg de rhGH-EGFR 1x107 células HN5 25 Mg de rhEGFR, CFA i.p. (Symphogen) IFA s.c. IFA i.p. (Sigma E3641) IFA s.c. 119 C57B Dia 1 Dia 29 Dia 44 Dia 58 Dia 61 1x107 células HN5 100 Mg de rhGH-EGFR 1x107 células HN5 25 Mg de rhEGFR, CFA i.p. (Symphogen) IFA s.c. IFA i.p. (Sigma E3641) IFA s.c. Tabela 3: Mistura de iniciadores para extensão em sobreposição multiplex através de RT-PCR

Nome do Conc. Seqüência SEQ iniciador (nM) ID mHCrevI 0,2 GACSGATGGGCCCTTGGTGG 1 mKapparl 0,2 GCT GTAGGTGCT GT CTTT GC 2 mVH set mVH A 0,04 TATTCCCATGGCGCGCCSAGGTCCARCTGC 3 ARCAGYCTG mVH B 0,04 TATTCCCATGGCGCGCCGARGTGMAGCTKG 4 TKGAGTC mVH C 0,04 TATTCCCATGGCGCGCCSAGGTGCAGCTKM 5 AG GAGTC mVH 8 0,04 TATTCCCATGGCGCGCCCAGGTTACTCTGA 6 AAGAGTC mVH 9 0,04 TATTCCCATGGCGCGCCCAGATCCAGTTGG 7 TGCAGTCTG mVK set mVK D 0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAYATC 8 CAGAT GAC H CARWCT mVK E 0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCRACATT 9 GTGMTGACHCAGTC mVKF 0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCSAMATT 10 GTKCT SAC CCART CT C mVK 1- 0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGATRTT 11 GT GAT GACBCARRCT W=AJT1 R=AZG, S=GZC, Y=CZT, K=GZT, M=AZC1 H=ACT, B=GCT; Cone. concentração final. Tabela 4: Conjunto de iniciadores aninhados

Nome do Conc. Seqüência SEQ iniciador (nM) ID mHCrev1-ext 0,2 GGACAGGGMTCCAKAGTTCCADKT 16 hmJK set hmJK1- 0,2 GACAGAT GGT GCAGCCACAGTT CGTTT G 17 ATTTCCAGCTTGGTG hmJK2- 0,2 GACAGAT GGT GCAGCCACAGTTCGTTTTA 18 TTT CCAGCTT GGT C hmJK4- 0,2 GACAGAT GGTGCAGCCACAGTT CGTTTTA 19 TTT CCAACTTT GT C hmJK5- 0,2 GACAGAT GGT GCAG CCAC AGTT CGTTT C 20 AGCTCCAGCTTGGTC K=GZT, M=ZkZC,D=AGT; Cone. - concentração final.

Tabela 5: Conjunto de iniciadores de ligação da constante Kappa

Iniciador Cone. Seqüência SEQ (nM) ID Amplificação da constante kappa humana h KCforw-v2 0,2 GAACTGTGGCTGCACCATCTGTC 21 Kappa3' 0,2 ACCGCCTCCACCGGCGGCCGCTTATTA 22 ACACTCTCCCCTGTTG Ligação através da extensão em sobreposição mhKCrev 0,2 ACCGCCTCCACCGGCGGCCGCTTATTA 23 ACACT CT CCCCTGTT GAAGCT CTT Conjunto mJH mJH1 0,2 GGAGGCGCTCGAGACGGT GACCGT GG 12 TCCC mJH2 0,2 GGAGGCGCT CGAGACT GT GAGAGT GG 13 TGCC mJH3 0,2 GGAGGCGCTCGAGACAGT GACCAGAG 14 TCCC mJH4 0,2 GGAGGCGCT CGAGACGGT GACT GAGG 15 TTCC EXEMPLO 2: Produção de anticorpos anti-EGFR em mamíferos

O sistema de expressão FreeStyIe MAX CHO (Invitrogen) foi utilizado para a expressão transitória de anticorpos anti-EGFR. Os anticorpos foram expressos em um volume de 200-2000 mL.

Aproximadamente 24 horas antes da transfecção, as células

CHO-S foram submetidas a passagens para atingir uma concentração de células de 0,5 x 10® células/mL. O plasmídeo (1,25 pg por mL de meio de cultura de células) foi diluído no meio isento de soro OptiPro e misturado com uma solução do reagente FreeStyIe MAX Transfection como recomen10 dado pelo fornecedor. Os reagentes de transfecção foram transferidos para a cultura de células e o sobrenadante foi coletado 6 dias depois.

Os anticorpos expressos foram purificados do sobrenadante de cultura utilizando uma etapa de cromatografia por afinidade empregando uma coluna de Proteína A-Sepharose (MabSeIect Sure, GE Health Care) 15 para a purificação de moléculas de IgGI. Os anticorpos foram eluídos da coluna utilizando 0,1 M de Glicina, 2.7. As frações contendo os anticorpos, determinadas através de medidas da absorbância em 280 nm, foram agrupadas e submetidas à diálise contra 5 mM de acetato de sódio, 150 mM de NaCI, pH 5. As amostras de anticorpos purificados foram testadas em rela20 ção à presença de endototoxina através do ensaio de LAL.

EXEMPLO 3: Determinação das especificidades do epitopo ELISA de competição com anticorpos de referência

Utilizando anticorpos de referência que se ligam a domínios de EGFR conhecidos como publicado em (J.R. Cochran e outros, JIM 2004: 25 287; 147-158), foi desenvolvido um ELISA de competição que podia distinguir entre os epitopos de ligação de anticorpos anti-EGFR através da incubação com um reagente secundário que era específico para a região Fc humana de anticorpos Anti-EGFR e exibindo nenhuma reatividade cruzada ao Fe da IgG de camundongo ou de rato. O ELISA foi adaptado das descrições 30 publicadas em Ditzel e outros, 1995, The Journal of Immunology, Vol 154, Edição 2 893-906.

Um ELISA que bloqueia os epitopos foi realizado através da diluição do antígeno do receptor EGFR de comprimento completo até 0,5 pg/mL em PBS; e revestindo 50 pL/poço de ELISA durante a noite a 4°C. Na manhã seguinte, os poços foram lavados duas vezes com PBS-T e bloqueados durante uma hora com PBS-T-1% de BSA à temperatura ambiente se5 guido pela lavagem duas vezes em PBS-T. Depois 25 pL de mAbs de referência murino ou de rato foram adicionados aos poços de ELISA independentes em uma diluição conhecida dos experimentos anteriores para fornecer ligação ao antígeno máxima de 200 vezes. Após 15 min, 25 pL de anticorpos Anti-EGFR foram adicionados em uma concentração de 2 pg/mL nos 10 poços pré-incubados com os anticorpos de referência ou nos poços contendo 25 pL de PBS. Isto forneceu uma concentração final de 1 pg/mL de anticorpo Anti-EGFR e uma ligação ao antígeno máxima de 100 vezes dos anticorpos de referência após a mistura. Os anticorpos foram incubados durante 45 min à temperatura ambiente após os quais os poços foram lavados qua15 tro vezes com PBS-T. Um conjugado de HRP anti-lgG Humana de Cabra secundário foi diluído 1:3000 e 50 pL foram adicionados em cada poço seguidos por uma incubação de 30 min à temperatura ambiente. Finalmente os poços foram lavados quatro vezes com PBS-T e as placas foram reveladas através da adição de 50 pL/poço de TMB e lidas em 620 nm a cada 5-15-30 20 min. O grau de inibição foi calculado partindo da fórmula: % de inibição = (1- (DO com competição/DO sem competição (PBS))) x 100,

Reagentes do ELISA:

1) Tampão de revestimento: 1 x PBS; Gibco cat:20012-019

2) Antígenos: EGFR de comprimento completo do tipo selvagem purificado de células A431; Sigma E3641

3) Placa de ELISA: NUNC Maxisorp; cat: 442404

4) Tampão de bloqueio/diluição: 1% de BSA em PBS-T (PBST-1% de BSA)

5) Tampão de lavagem: 1x PBS/0,05% de Tween 20 (PBS-T) 6) Controle positivo: Erbitux (Merck KGaA, 64271 Darmstadt,

Alemanha, Catálogo #: 018964; Cetuximab), Vectibix (Amgen Inc, One Amgen Center Drive, Thousand Oaks CA 91320-1799, USA, Cat # 3241400; Panitumumab)

10

5

) Anticorpos de referência:

ICR10 (de rato), Abcam, Ab231 199.12 (murino), Lab Vision Ab-11, MS-396-PABX EGFR.1 (murino), Lab Vision Ab-3, MS-311-PABX H11 (murino), LabVision Ab-5, MS-316-PABX B1D8 (murino), Lab Vision Ab-16, MS-666-PABX 111.6 (murino), Lab Vision Ab-10, MS-378-PABX 225 (murino), Lab Vision Ab-2, MS-269-PABX 528 (murino), Lab Vision Ab-1, MS-268-PABX

8) Conjugado de HRP anti-lgG Humana de Cabra; Serotec,

Star 106P

Os ensaios de ELISA de competição foram empregados para classificar os sobrenadantes de anticorpos Anti-EGFR de acordo com a especificidade ao domínio dos anticorpos de referência utilizados produzidos contra do domínio extracelular do EGFR. Valores de inibição de 50 - 100% foram conside20 rados como uma indicação de competição significativa entre pares de anticorpos que se ligam a epitopos sobrepostos ou a epitopos em proximidade íntima no antígeno, enquanto que valores de inibição abaixo de 50% indicavam que os epitopos reconhecidos pelos pares de anticorpos não estavam em proximidade íntima resultando em um menor impedimento estérico. Foi 25 observado que os anticorpos Anti-EGFR se ligam a uma variedade de epitopos no ECD do EGFR incluindo os domínios I, Il & III. Para alguns anticorpos esta análise não podia distinguir se o mAb específico estava direcionado contra o domínio I ou o domínio II. Tais especificidades foram marcadas como domínio l/ll. Ainda alguns anticorpos pareciam se ligar a epitopos exclu30 sivos que não podiam ser adicionalmente deduzidos no ELISA de competição empregado (Por exemplo, os clones 1229 & 1320, figura 6). É possível que alguns destes anticorpos sejam direcionados contra o domínio IV para o

15

9) TMB Plus; KemEnTec, cat # 4390L

10) 1 MdeH2SO4

O resultado do ELISA de competição é mostrado na Figura 6. qual não há quaisquer reatividades de anticorpo de referência. De forma interessante, os anticorpos para o domínio Ill podiam ser adicionalmente divididos em quatro subgrupos com base nos padrões de competição diferentes obtidos com os anticorpos de referência murinos testados contra este domí5 nio. O grupo I consistia somente no mAb 992 que foi observado que competia pela ligação com os anticorpos de referência Ab1 & Ab2. O grupo Il consistia nos mAbs 1024 & 1042 que eram ambos derivados do mesmo rearranjo de Ig e consequentemente exibiam homologia de seqüência muito próxima no nível de DNA e de aminoácidos. Foi observado que estes dois anti10 corpos competiam somente pela ligação com o Ab2. O grupo Ill consistia nos mAbs 1030, 1208 & 1277 que competiam pela ligação com os anticorpos de referência Ab1, Ab5 & Ab10. Finalmente, o grupo IV consistia no mAb 1254, que competia pela ligação com todos os anticorpos de referência Ab1, Ab2, Ab5 & Ab10 para o domínio Ill utilizados.

Análise de competição para epitopos distintos com anticorpos de referência ou da mesma espécie utilizando a tecnologia de ressonância de plasmônio de superfície

A análise de SPR foi realizada em uma máquina Biacore 3000 contendo quatro células de fluxo. Um chip CM5 Biacore foi conjugado com anticorpo anti-His policlonal com 10.000 unidades de Ressonância (Ru) às células de fluxo 1 - 4 de acordo com as instruções do fabricante. Utilizando uma vazão de 5 pL/min, 15 pL de 6xHis EGFR ECD em uma concentração de 20 pg/mL foram injetados e capturados em todas as quatro células de fluxo às quais o anticorpo policlonal anti-His foi conjugado. Imediatamente após a injeção do antígeno, a ligação máxima do mAb Anti-EGFR sem competição foi estabelecida em cada célula de fluxo durante uma corrida de referência. Sucintamente, 5 pL de anticorpo em uma concentração de 40 pg/mL foram injetados em todas as células de fluxo com o EGFR capturado seguido pela extração do complexo anticorpo/antígeno com uma lavagem ácida com pH baixo (tampo de contato de 10 s com 10 mM de Glicina-HCI, pH 2). Após a determinação da ligação máxima do anticorpo Anti-EGFR a cada célula de fluxo, foi realizada uma corrida de competição durante o mesmo ciclo de Biacore. As células de fluxo foram primeiramente saturadas com o antígeno do ECD do EGFR seguidas pela injeção de anticorpos de referência diferentes ou de anticorpos Anti-EGFR em células de fluxo separadas utilizando as mesmas condições de saturação do antígeno como descrito 5 anteriormente. Esta etapa foi imediatamente seguida por uma segunda injeção de anticorpo Anti-EGFR pela célula de fluxo saturada com o antígeno de EGFR e o anticorpo de competição para minimizar a dissociação do antígeno ou bloquear o anticorpo. Então os complexos anticorpo/antígeno foram extraídos com uma lavagem ácida com pH baixo (tempo de contato de 10 s 10 com 10 mM de Glicina-HCI, pH 2) e o ciclo completo começando com a corrida de referência foi repetido com um novo anticorpo Anti-EGFR. O grau de inibição de anticorpos Anti-EGFR testados foi determinado através da comparação do valor máximo de Ru do anticorpo Anti-EGFR individual antes e depois da competição através da introdução de pontos de informação regis15 trados dois segundos antes e depois da injeção de cada amostra. Um exemplo de um ciclo de Biacore é mostrado na Figura 7.

Reagentes:

1. Chip CM5; Biacore, N0 de Cat. BR-1000-14

2. NHS; Biacore BR-1000-50 3. EDC; Biacore BR-1000-50

4. 10 mM de Tampão acetato pH 4,5; Biacore, N0 de Cat. BR

1003-50

5. Anticorpo Tetra-His (isento de BSA); Qiagen, N0 de Cat.

34670

6. Etanolamina, 1,0 M pH 8,5; Biacore BR-1000-50

7. 10 x tampão de corrida de HBS-EP: 0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCI1 3 mM de EDTA, 0,005% v/v de Tensoativo P20

8. Antígeno: Domínio extracelular do EGFR humano recombinante produzido no local com 6xHis.

9. 10 mM de Glicina HCI pH 2,0

10. Anticorpos de referência:

• ICR10 (de rato), Abcam, Ab231 • 199.12 (murino), Lab Vision Ab-11, MS-396-PABX

• EGFR. 1 (murino), Lab Vision Ab-3, MS-311-PABX

• H11 (murino), Lab Vision Ab-5, MS-316-PABX

• B1D8 (murino), Lab Vision Ab-16, MS-666-PABX 5 · 111.6 (murino), Lab Vision Ab-10, MS-378-PABX

• 225 (murino), Lab Vision Ab-2, MS-269-PABX

• 528 (murino), Lab Vision Ab-1, MS-268-PABX

Para confirmar a análise de epitopo obtida no ELISA de competição e para realizar uma análise de epitopo adicional através de competição entre pares de anticorpos Anti-EGFR da mesma espécie, foi estabelecido um ensaio de competição baseado na ligação ao anticorpo medida em tempo real através da ressonância de plasmônio de superfície. O mapa de epitopos obtido dos clones Anti-EGFR testados contra o conjunto de anticorpos de referência é mostrado na Figura 8 abaixo. Os valores de inibição de 50 100% foram considerados como uma indicação de competição significativa entre pares de anticorpos que se ligam a epitopos sobrepostos ou a epitopos em proximidade íntima no antígeno, enquanto que os valores de inibição abaixo de 50% indicavam que os epitopos reconhecidos pelos pares de anticorpos não estavam em proximidade íntima resultando em um menor impedimento estérico. Os valores de inibição abaixo de 25% não foram incluídos na análise para os epitopos sobrepostos, porque foi julgado que estes representavam inibição não significativa. Foi observado que todos os anticorpos testados exceto o 1320 competiam com um ou mais dos anticorpos de referência empregados, indicando que o 1320 era direcionado contra um epitopo desconhecido para o qual não há quaisquer reatividades de anticorpo de referência. Os anticorpos completamente humanos ou humanizados Vectibix e Erbitux foram incluídos na análise e foi descoberto que se ligavam a epitopos sobrepostos. Os dados obtidos tanto do ELISA competitivo quanto da análise de SPR competitiva geralmente se correlacionavam bem em relação à especificidade ao domínio estabelecida dos anticorpos Anti-EGFR. Entretanto, pequenas diferenças no padrão de competição entre os anticorpos de referência individuais eram algumas vezes observadas nos dois ensaios, talvez devido ao fato de que o ensaio de ELISA de competição empregava o antígeno do receptor EGFR de comprimento completo enquanto que o ensaio de competição de SPR utilizava o EGFR do domínio extracelular recombinante.

Após o mapeamento de epitopos de anticorpos Anti-EGFR ter

sido confirmado em dois ensaios de competição diferentes, a análise de competição de combinações da mesma espécie de pares de anticorpos AntiEGFR foi verificada para determinar quais pares de anticorpos estavam reconhecendo epitopos distintos e se os pares de anticorpos que reconheciam 10 epitopos sobrepostos podiam ser adicionalmente divididos em grupos de epitopos. O resultado desta análise é mostrado na Figura 9. Novamente nesta análise, os valores de inibição de 50 - 100% foram considerados como uma indicação de competição significativa entre pares de anticorpos que se ligam a epitopos sobrepostos. Este critério parecia válido, uma vez que os 15 anticorpos testados contra eles mesmos e consequentemente que reconheciam epitopos sobrepostos completos resultavam em valores entre 70% 100% de inibição como mostrado na figura 9. Ainda, esta observação ilustrava que a dissociação do antígeno ou de pares de anticorpos dentro do período de tempo da análise não parecia ter um impacto sobre o resultado do 20 experimento para os anticorpos testados. Através do agrupamento dos anticorpos de acordo com a especificidade ao domínio ECD do EGFR presumido determinada nas seções anteriores, foi observado que os anticorpos que se ligam exclusivamente ao domínio I ou ao domínio I ou Il (l/ll) se agrupam principalmente com membros de anticorpos com as mesmas especificidades 25 e não com membros de anticorpos que reconhecem o domínio III. Similarmente, foi observado que os anticorpos para o domínio Ill competem pela ligação somente com membros de anticorpos que reconhecem o domínio Ill e não com anticorpos que reconhecem o domínio I ou l/ll do EGFR. Embora tenha sido observado que os dois anticorpos para o domínio Ill 1024 & 1042 30 derivados do mesmo rearranjo de Ig reconhecem epitopos sobrepostos, foi descoberto que as combinações em pares de qualquer um de 1024 ou 1042 com qualquer um de 992 ou 1030 não eram importantes para resultar em competição significativa. Consequentemente, foi concluído que os anticorpos 992, 1030 & 1024/1042 reconheciam três epitopos não-sobrepostos no domínio NI do ECD do EGFR. Finalmente, foi observado que o mAb 1320 competia pela ligação com os mAbs 1024 e 1449, ambos direcionados contra o 5 domínio Ill e não outros anticorpos para o domínio Ill testados (competição de 1320 com 1042 não determinada). Consequentemente, foi assumido que o mAb 1320 estava se ligando na periferia do domínio Ill no domínio extracelular do EGFR. Uma visão geral das especificidades do epitopo pode ser observada na figura 10, onde são ilustrados mapas de epitopos de anticor10 pos direcionados contra o domínio I, l/ll ou IN do ECD do EGFR.

Após a descoberta de que as combinações em pares de 992, 1030 & 1024/1042 não resultavam na competição significativa de anticorpos que é determinada através da SPR, novos experimentos de Biacore foram planejados para verificar quantos anticorpos que podiam se ligar ao antígeno 15 do receptor simultaneamente. Em primeiro lugar foi investigado qual impacto a saturação do Domínio Ill com os três anticorpos 992, 1024 e 1030 teria sobre a ligação de anticorpos direcionados contra outras especificidades do EGFR que não estavam no domínio III. O resultado desta análise é mostrado na Figura 11 A. As inibições de anticorpos isolados foram estabelecidas atra20 vés do teste dos mesmos em combinações com o anticorpo isolado ou com misturas de anticorpos de até três anticorpos gerados através da adição seqüencial de um anticorpo extra durante cada ciclo de Biacore. Para garantir o bloqueio completo do epitopo reconhecido, os anticorpos foram testados em concentrações individuais de 40 μg/mL. Como mostrado na figura 11 A, 25 foi observado que os três anticorpos para o domínio Ill 992, 1024 & 1030 se ligavam simultaneamente ao receptor sem qualquer inibição da ligação. Os valores negativos de inibição observados que aumentam para cada anticorpo adicionado sugeriu ainda uma sinergia na ligação para o anticorpo seguinte adicionado. De maneira importante, uma vez que o domínio Ill foi in30 cubado com os três anticorpos, outros anticorpos direcionados contra epitopos não-sobrepostos no domínio l/ll (mAb 1261), no domínio I (1347) ou uma especificidade desconhecida (1361) pareciam estar se ligando sem o bloqueio do epitopo da mistura dos três mAb. Ainda, estes anticorpos testados tinham valores negativos de inibição baixos indicando que estavam se ligando melhor após a saturação do receptor com a mistura dos três mAb. Consequentemente, este experimento sugeria que os seis anticorpos testados podiam se ligar ao ECD do EGFR simultaneamente. Para testar adicionalmente este fenômeno observado, uma mistura de anticorpos consistindo em todos os anticorpos testados (1261, 1347, 992, 1024, 1030 & 1361) foi produzida e testada em relação à inibição de cada anticorpo da amostra individual na mistura. As misturas de anticorpos em que o anticorpo da amostra testado não tinha sido incluído também foram testadas para servir como um controle positivo. Como apresentado na figura 11 B/C, foi observado que todos os seis anticorpos testados eram inibidos de 80 - 116% quando testados em relação à ligação ao receptor de EGF incubado com a mistura completa de anticorpos. Entretanto, quando anticorpos da amostra individuais foram removidos desta mistura, não foi observada uma inibição significativa do anticorpo da amostra particular, ilustrando que os anticorpos na mistura estavam bloqueados apenas em relação à ligação ao receptor de EGF por si mesmos. Este experimento ilustrou claramente que pelo menos seis anticorpos que reconhecem epitopos não-sobrepostos podem ser ligar ao EGFR simultaneamente. Como um experimento final, foi investigado se outros anticorpos direcionados contra o domínio I (1284), l/ll (1257) ou grupo de especificidade desconhecida (1183, 1255) poderiam se ligar ao EGFR, quando este foi incubado com a mistura de seis anticorpos. Como apresentado na figura 11 D, nenhum dos anticorpos testados era capaz de se ligar de forma significativa ao EGFR após a incubação prévia com a mistura de seis anticorpos. Isto pode ser devido ao fato de que a coleção de anticorpos não inclui anticorpos contra qualquer um dos sítios deixados desocupados pelos seis anticorpos ligados. Alternativamente, é possível que na realidade todos os sítios nos domínios testados estivessem bloqueados com o anticorpo. Tabela 6: Anticorpos disponíveis comercialmente com especificidades documentadas contra os domínios extracelulares do EGFR.

Clone Espécie Domínio I Domínio Il Domínio Ill ICR10 Rato X 199.12/Ab11 Camundongo X EGFR.1/Ab3 Camundongo X H11/Ab5 Camundongo X 111.6/AMO Camundongo X 528/Ab-1 Camundongo X 225/Ab-2 Camundongo X EXEMPLO 4: Inibição da ativação do EGFR

Determinação do bloqueio mediado por anticorpo da ligação ao Iigante de 5 EGF ao receptor EGFR por ELISA competitivo

Para verificar quais anticorpos Anti-EGFR testados se ligavam ao receptor EGFR e simultaneamente bloqueavam a ligação do Iigante de EGF Biotinilado, os poços de ELISA foram revestidos com 80 pL/poço de EGFR de comprimento completo em uma concentração de 0,5 pg/mL em 10 PBS durante a noite e 4°C. Na manhã seguinte os poços foram lavados duas vezes com PBS-T e bloqueados durante uma hora com 150 pL de PBS-T1% de BSA à temperatura ambiente, seguido pela lavagem duas vezes em PBS-T. Depois 80 pL de anticorpos Anti-EGFR diluídos em série e anticorpos de controle foram adicionados aos poços e incubados 30 min à tempera15 tura ambiente. Após a incubação do anticorpo, 20 pL do Iigante de EGF Biotinilado em uma concentração de 0,5 pg/mL foram adicionados em todos os poços contendo diluições de anticorpo Anti-EGFR ou aos poços contendo apenas PBS-T 1% de BSA e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. Subsequentemente, os poços foram lavados cinco vezes com PBS-T, 20 seguido pela incubação com 100 pL/poço de reagente secundário Estreptavidina-HRP diluído 1:1000 no tampão de bloqueio e pela incubação à temperatura ambiente durante 30 min. Finalmente os poços foram lavados cinco vezes com PBS-T e as placas foram reveladas através da adição de 100 pL/poço de substrato TMB e incubadas durante 60 min. Após a incubação, a reação foi interrompida através da adição de 1 M de H2SO4; 100 pL/poço e as placas foram lidas em DO de 450 nm.

Reaqentes do ELISA:

1) Tampão de revestimento: 1 x PBS; Gibco cat:20012-019

2) Antígeno: EGFR de comprimento completo do tipo selvagem purificado de células A431; Sigma E2645

3) Placa de ELISA: NUNC Maxisorp; cat: 442404

4) Tampão de bloqueio/diluição: 1% de BSA em PBS-T (PBST-1% de BSA)

5) Tampão de lavagem: 1x PBS/0,05% de Tween 20 (PBS-T)

6) Controle positivo: Erbitux, Vectibix

7) Controle negativo: Synagis (Medimmune Inc1 Palivizumab, cat. # NDC 60574-4111-1)

8) Ligante de EGF biotinilado; Invitrogen, cat E3477

9) Estreptavidina-HRP, ultrassensível: Sigma S 2438

10) TMB Plus; KemEnTec, cat#4390L

11) 1 M de H2SO4

Os ensaios de ELISA de competição foram empregados para classificar a capacidade dos anticorpos Anti-EGFR de inibir a ligação do Iigante de EGF Biotinilado ao receptor EGFR de comprimento completo revestido nos poços de ELISA. Como apresentado na figura 12, tanto Erbitux quanto Vectibix pareciam bloquear de forma muito potente a ligação do Iigante de EGF enquanto que o anticorpo de controle negativo Synagis, que não é direcionado contra o EGFR não inibia a ligação do Iigante de EGF. Como mostrado na figura 12A, os três anticorpos 992, 1030 e 1042 direcionados contra o domínio Ill e que reconhecem epitopos não-sobrepostos foram testados isoladamente ou em uma mistura equimolar em relação à sua capacidade de inibir a ligação do Iigante de EGF. Dos três anticorpos testados somente o mAb 1030 exibia uma atividade de inibição do Iigante de EGF modesta quando comparado ao Erbitux e ao Vectibix. A mistura equimolar dos mAbs 992, 1030 e 1042 parecia ser mais eficiente na inibição da ligação do Iigante de EGF que os anticorpos isolados testados sozinhos. Em uma concentração de IgG total de 1 pg/mL, foi observado que a mistura equimolar inibia a ligação do Iigante de EGF aproximadamente duas vezes mais eficientemente que o mAb 1030 e quatro vezes mais eficientemente que os 5 mAbs 992 & 1042 testados isoladamente, mostrando um efeito sinérgico da mistura dos três anticorpos para o domínio Ill que reconhecem epitopos nãosobrepostos. Como mostrado na figura 12B, os clones Anti-EGFR 1208, 1260, 1277 & 1320 também foram testados neste ensaio. Estes quatro clones eram capazes de inibir a ligação do Iigante de EGF de uma maneira de10 pendente da dose que era mais eficiente do que era observado para os clones 992, 1030 e 1042 quando comparados ao controle de Erbitux. Nas concentrações acima de 0,33 pg/mL os clones Anti-EGFR 1208, 1260, 1277 & 1320 pareciam ser tão eficientes no bloqueio da ligação do Iigante de EGF que o Erbitux testado nas mesmas concentrações.

Capacidade de inibir a fosforilacão do EGFR induzida pelo EGF em células HN5

Os anticorpos anti-EGFR foram testados em relação à reatividade sobre a fosforilação do EGFR em uma análise de western em células. O procedimento de western em células possibilita a detecção do EGFR e do 20 EGFR fosforilado (pEGFR) da mesma amostra, isto por sua vez torna possível comparar a proporção de EGFR em relação à expressão de pEGFR para cada tratamento de anticorpo e conjunto de dados. As células HN5 foram cultivadas de acordo com as instruções fornecidas pela ATCC em DMEM suplementado com 10% de FCS e pen/estrep. 43.000 células HN5 foram 25 semeadas em placas de 96 poços da Nunc (no de cat 167008) 24 h antes da privação de nutrientes. As células foram privadas de nutrientes em DMEM

16 h antes da adição dos anticorpos. Os anticorpos foram adicionados em uma concentração final de 10 pg/mL em 200 pL de DMEM e a mistura foi pipetada para cima e para baixo pelo menos cinco vezes para misturar. Após 30 30 min de tratamento com anticorpo o EGF foi adicionado em uma concentração de 50 pg/mL nos poços apropriados e mantido durante 7,5 min. Os westerns em células foram realizados essencialmente como as instruções fornecidas pelo fabricante do kit de western em célula (Odyssey, LI-COR biosciences).

As células foram fixadas em 3,7% de formaldeído (Sigma F8775, lote 71K500, contendo ~1% de metanol) durante 20 min após o estí5 mulo com EGF. Cinco lavagens de 5 min com PBS-Triton X-100 (0,1%) foram utilizadas para permeabilizar as membranas celulares antes do bloqueio no tampão de bloqueio LI-COR (927-40000). Os anticorpos primários foram adicionados em concentrações correspondentes às das instruções fornecidas e incubados com agitação suave à temperatura ambiente durante 2,5 h 10 (EGFR total de camundongo, diluição de 1:500 biosource International, no de cat AHR5062 e Phospho-EGFR Tyr1173, Coelho diluição de 1:100, biosource, No de cat 44-794G).

Após a incubação com os anticorpos primários as células foram lavadas cinco vezes durante cinco minutos em PBS-T (0,1% de Tween-20) 15 após os quais os anticorpos secundários foram adicionados (anticoelho de cabra IRDye 680, diluição de 1:200, LI-COR no de cat 926-32221 e anticamundongo de cabra, IRDye 800CW diluição de 1:800; LI-COR no de cat 926-32210) e incubados durante 1 h à temperatura ambiente com agitação suave da placa coberta em folha de alumínio.

Antes da medida na leitora de fluorescência Tecan a placa foi

lavada cinco vezes durante cinco min em PBS-T. Todas as lavagens foram terminadas através de um movimento de giro interrompido bruscamente das placas, com a parte aberta para baixo, para descartar a solução de lavagem, seguido pelo ato de bater a placa contra toalhas de papel. (Idêntico ao tra25 tamento de placas de ELISA, a coisa importante é a noção de que as células permanecem na placa durante este tratamento e que a solução de lavagem pode ser removida através deste procedimento ao invés de através de sucção, que perturbaria a integridade da monocamada de células). Qualquer solução de lavagem residual deixada da última lavagem foi removida através 30 de sucção suave na lateral dos poços com uma pipeta multicanal. O sinal fluorescente foi medido para o canal de 680 nm (excitação 675 nm e emissão 705 nm, ambas com largura de banda de 10 nm) e para o canal de 800 nm (excitação 762 nm e emissão 798 nm, ambas com largura de banda de 10 nm).

Utilizando a análise de Western em células, se torna evidente que os três anticorpos estão afetando significativamente (p<0,05) o status de pEGFR das células HN5; os anticorpos 1208, 1277 e 1320 (Figura 13).

A mistura anti-EGFR (992, 1030 e 1042) de anticorpos AntiEGFR e os anticorpos individuais contidos na mesma foram testados em relação ao efeito em uma análise de western em células de inibição da fosforilação do EGFR induzida pelo EGF. Como observado na Figura 14, 992 e 10 1030 e a mistura de anticorpos Anti-EGFR inibiam significativamente a fosforilação do EGFR induzida pelo EGF (p<0,05).

Exemplo 5 Internalizacão de receptores de EGF em células A431NS

As células A431NS (ATCC# CRL-2592) foram tratadas com tripsina partindo de um frasco de cultura T175 80-90% confluente utilizando TrypLE. As células separadas foram lavadas em PBS e suspensas em DMEM sem soro. As células foram divididas em porções de 1-2 ml_ e incubadas 30 min em gelo com os anticorpos verificados. A concentração de anticorpo era de 10 pg/mL. As células foram lavadas três vezes em DMEM (250 g, 4 min, 4°C) e ressuspensas em 1,8 mL de DMEM. Cada porção foi dividida em seis tubos de FACS cada um contendo 300 μΙ_ de suspensão de células. Três tubos de cada porção são colocados em banho de água a 37°C em exatamente 40 min e os outros três são colocados em gelo imediatamente. Após a incubação, as células são lavadas duas vezes a (250 g, 4 min, 4°C) e os péletes são redissolvidos em 100 pL de F(ab')2 de Fcy anti IgG humana de coelho-FITC em DMEM. As células são incubadas durante 30 min a 4°C antes de serem lavadas três vezes em DMEM a 4°C e analisadas em FACSCalibur.

Os resultados são mostrados na Figura 15. A incubação com Erbitux e Vectibix mostrou um nível equivalente de internalização de receptor em torno de 30% deixando 70% da coloração inicial da superfície. A incubação com 992 sozinho leva a uma regulação para menos do receptor de aproximadamente 45%. A incubação com misturas de anticorpos contendo dois anticorpos adicionais com epitopos não-sobrepostos leva a um aumento na regulação para menos do receptor: 992 + 1024, 74%; 992 + 1024 + 1030, 83%.

A adição de anticorpos adicionais não levou a um aumento adicional na internalização do receptor. Assim, pelo menos três anticorpos parecem ser necessários para atingir o nível máximo de internalização nas células A431.

EXEMPLO 6 - Ensaios de proliferação

Os danos celulares resultarão inevitavelmente na perda da ca10 pacidade da célula de manter e fornecer energia para a função celular metabólica e para o crescimento. Os ensaios de atividade metabólica baseiam-se nesta premissa. Geralmente estes medem a atividade mitocondrial. O Reagente de Proliferação Celular (Cell Proliferation Reagent) WST-1 (Roche N0 de Cat. 11 644 807 001) é um substrato pronto para uso que mede a ati15 vidade metabólica de células viáveis. Supõe-se então que a atividade metabólica se correlaciona com o número de células viáveis. Neste exemplo o ensaio de WST-1 foi utilizado para medir o número de células metabolicamente ativas após o tratamento com anticorpos diferentes em concentrações diferentes.

Antes de realizar o ensaio de WST-1, os anticorpos apropriados

e as misturas de anticorpos foram diluídos até uma concentração de anticorpo total final de 20 pg/mL em DMEM suplementado com 0,5% de FBS e 1% de P/S fornecendo uma concentração de anticorpo final de 10 pg/mL no poço com a concentração de anticorpo mais alta. 150 pL destas soluções fo25 ram então adicionados aos poços na coluna 2 de uma placa de 96 poços e foi feita uma diluição em série de três vezes até a coluna 9 de forma que cada poço contivesse 100 pL de solução de anticorpo. 100 pL do meio foram adicionados na coluna 11. 200 pL do meio foram adicionados nas Fileiras 1 e 8 assim como nas colunas 1 e 12 para diminuir o efeito da evaporação do 30 meio nos poços experimentais.

As células A431-NS são então lavadas com IxPBS e soltas através do tratamento com tripsina com 3 mL de solução de tripsina. 17 mL de meio completo são então adicionados e as células são centrifugadas a 300xg (1200 rcf) durante 5 min. O sobrenadante é removido e células são ressuspensas em DMEM + 0,5% de FBS. As células são contadas e sua concentração é ajustada em 15.000 células/mL. 100 μΙ_ da suspensão de 5 células (1500 células/poço) são então adicionados aos poços experimentais nas colunas 2-11. As placas são incubadas durante 4 dias em uma incubadora umedecida a 37°C. Então 20 μι. do reagente WST-1 são adicionados por poço e as placas são incubadas durante uma hora a 37°C. As placas são então transferidas para um agitador de placas orbital e mantidas durante 10 mais uma hora. A absorbância é medida em 450 e 620 nm (comprimento de onda de referência) em uma leitora de ELISA. A quantidade de células metabolicamente ativas (MAC) é calculada como a percentagem do controle não tratado como a seguir:

%MAC =

x 100

v (ODnão - tratado - ODmeio) /

Para os estudos de titulação do EGF1 o Iigante foi diluído até uma concentração de 20 nM/mL em DMEM+0,5% de FBS, fornecendo uma concentração final de 10 nM/mL no poço com a concentração de EGF mais alta. 150 pL desta solução foram então adicionados aos poços na coluna 2 de uma placa de 96 poços e uma diluição em série de três vezes foi feita até a coluna 9 de forma que cada poço contivesse 100 pL de solução de EGF. 100 pL de meio foram adicionados na coluna 11. 200 pL de meio foram adicionados nas Fileiras 1 e 8 assim como nas colunas 1 e 12 para diminuir o efeito da evaporação do meio nos poços experimentais. Os anticorpos apropriados e as misturas de anticorpos foram diluídos até uma concentração de anticorpo total final de 40 pg/mL em DMEM suplementado com 0,5% de FBS e 1% de P/S fornecendo uma concentração de anticorpo final de 10 pg/mL nos poços. 50 pL destas soluções foram então adicionados aos poços nas colunas 2-9 da placa de 96 poços.

As células A431-NS são então lavadas com IxPBS e soltas através do tratamento com tripsina com 3 mL de solução de tripsina. 17 mL de meio completo são então adicionados e as células são centrifugadas a 300xg (1200 rcf) durante 5 min. O sobrenadante é removido e as células são ressuspensas em DMEM + 0,5% de FBS. As células são contadas e sua concentração é ajustada em 40.000 células/mL. 50 pL da suspensão de células (2000 células/poço) são então adicionados aos poços experimentais 5 nas colunas 2-11. As placas são incubadas durante 4 dias em uma incubadora umedecida a 37°C. Então 20 pL do reagente WST-1 são adicionados por poço e as placas são incubadas durante uma hora a 37°C. As placas são então transferidas para um agitador de placas orbital e mantidas durante mais uma hora. A absorbância é medida em 450 e 620 nm (comprimento de 10 onda de referência) em uma leitora de ELISA. As quantidades de células metabolicamente ativas são indicadas pela absorbância em 450 nm subtraída a absorbância no comprimento de onda de referência de 620 nm.

A quantidade de células metabolicamente ativas (MAC) é calculada como a percentagem do controle não tratado como a seguir:

(OD exp. - ODmeio)

f __________Λ

xlOO

v (ODnão — tratado - ODmeio)y

%MAC =

Resultados

Para mostrar que uma mistura de três anticorpos Anti-EGFR com epitopos não-sobrepostos dentro do domínio Ill é superior aos anticorpos isoladamente, foi realizado um experimento que investigou a inibição do crescimento de A431-NS. Como pode ser observado na Figura 16A, os anti20 corpos são fracos inibidores do crescimento de A431-NS por si só, mas quando combinados, é obtido um efeito inibidor sinérgico sobre o crescimento de 431-NS. Embora as misturas de 992 com qualquer um de 1042 ou 1030 sejam também muito potentes, a mistura de todos os três é superior a estas em relação a todas as faixas de concentração de anticorpo.

Os efeitos de anticorpos individuais e misturas de anticorpos

sobre o crescimento de células A431-NS estimulado com concentrações variáveis de EGF foram investigados e os resultados são mostrados na Figura 17. Como pode ser observado na Figura 17 concentrações de EGF acima de

0,1 nM na ausência de anticorpos são tóxicas para as células. Entretanto, é evidente que uma mistura de três anticorpos com epitopos não-sobrepostos dentro do domínio IN de EGFR (992, 1030 e 1042) atua de forma sinérgica para inibir o crescimento das células A431-NS na presença de EGF quando testada até pelo menos 0,3 nM de EGF e a mistura é superior a todos os anticorpos monoclonais.

5 A seguir é demonstrado que o efeito inibidor sinérgico sobre o

crescimento de A431-NS também pode ser obtido através da combinação de dois anticorpos com epitopos não-sobrepostos no domínio Ill de EGFR com anticorpos com epitopos dentro do domínio I ou Il de EGFR. Como pode ser observado na Figura 18, combinações dos anticorpos 992 e 1024 que são 10 ambos domínio Ill de EGFR, com qualquer um anticorpo reativo com o domínio I (1284) ou com o domínio l/ll (1434) de EGFR são tão potentes quanto três anticorpos que reagem com epitopos não-sobrepostos dentro do domínio IN de EGFR (992+1024+1030). Em adição, estas misturas de anticorpos são mais potentes na inibição do crescimento de A431-NS que os anti15 corpos anti EGFR terapêuticos Erbitux e Vectibix.

Ensaios similares foram realizados utilizando duas outras linhagens de células cancerosas, DU145 (ATCC#HTB-81) e MDA-MB-468 (ATCC#HTB-132). Os resultados destes ensaios de proliferação são mostrados nas Figuras 16B e 16C. Em ambos os casos, uma mistura de três 20 anticorpos (992, 1030 e 1042) era superior às misturas de dois anticorpos e anticorpos isolados. Nas células DU145, a mistura de três anticorpos era superior ao Vectibix em todas as concentrações e em MDA-MB-468 em concentrações altas.

Utilizando um método similar ao descrito anteriormente, foram testadas combinações diferentes de três anticorpos Anti-EGFR.

Resultados

Os efeitos de combinações diferentes de três anticorpos foram investigados na linhagem de células A431NS. A atividade inibidora do crescimento das vinte mais potentes destas é mostrada na Figura 37. Todas as 30 combinações inibiam a proliferação da linhagem de células A431NS mais de 60% comparada à de um controle não tratado. Uma outra observação interessante é que com a exceção das combinações (992+1024+1254 e 992+1024+1320 e 992+1277+1320) as combinações contêm anticorpos com epitopos não-sobrepostos. Isto mostra que é possível planejar várias combinações de três anticorpos que se ligam a epitopos distintos.

EXEMPLO 7 - apoptose.

A apoptose é um mecanismo biológico que leva à morte da cé

lula. Este mecanismo foi relatado anteriormente através do uso de anticorpos Anti-EGFR, tal como o Erbitux (Baselga J. The EGFR as a target for anticancer therapy - focus on cetuximab. Eur J Cancer. 2001 setembro: 37, Suplemento 4:S16-22). Foi, portanto, verificado até qual extensão os anticorpos 10 individuais Anti-EGFR 992, 1042 e 1030 assim como a mistura (992+1042+ 1030) eram capazes de induzir a apoptose.

1x104 células A431NS foram incubadas em DMEM suplementado com 0,5% de FBS e antibióticos em determinações triplas em placas de cultura de 96 poços na presença da mistura de EGFR (partes iguais de 15 992,1030,1042), 992,1030,1042, Erbitux ou Vectibix, em concentrações variando de 0,01 pg/mL até 10 pg/mL. As células e os anticorpos foram incubados durante 22 h. Então os sobrenadantes foram coletados e medidos em um kit de ELISA da Roche, No de Cat: 11774425001 (Basel, Suíça), em relação à presença de complexos de histona-DNA.

O efeito da mistura foi comparado com cada um dos anticorpos

monoclonais isolados assim como com os anticorpos de referência Vectibix e Erbitux utilizando células A431NS (resultados na Figura 19). Os anticorpos foram testados na diluição de 10 vezes. A mistura é significativamente (P<0,05) mais eficiente comparada com os anticorpos monoclonais individu25 ais assim como o Vectibix quando testada nas concentrações de 1 pg/mL e 10 pg/mL. A mistura aumentou a apoptose de forma estatisticamente significativa (p<0,05) comparada com o Erbitux em 1 pg/mL.

EXEMPLO 7b

Em adição ao exemplo 7, a mistura de 992+1024 assim como a mistura de 992+1024+1030 foram investigadas em relação à atividade apoptótica de acordo com o mesmo método que é descrito no exemplo 7 (figura 35). O nível factual de apoptose foi relacionado a um controle positivo máximo. Ambas as misturas foram comparadas com o Erbitux e com os anticorpos monoclonais individuais 992, 1024 e 1030 assim como com um anticorpo de controle em 1 pg/mL utilizando células A431NS. A mistura de 992+1024 era significativamente melhor que o Erbitux e os anticorpos monoclonais individuais (todos P<0,05).

EXEMPLO 8 Eficácia in vivo

A mistura anti-EGFR consistindo nos anticorpos 992, 1030 e 1042 foi investigada em relação à eficácia in vivo no modelo de xenoenxerto de camundongos nus utilizando células A431NS. Este é um modelo ampla10 mente utilizado para a investigação da potência de anticorpos anticâncer monoclonais, incluindo anticorpos Anti-EGFR. Os camundongos nus são imunocomprometidos e não possuem células T. Isto permite o crescimento de células humanas nos camundongos.

Dois grupos de camundongos nus com 6-8 semanas receberam 15 injeção subcutânea de 1x106 células A431NS. Quando o tamanho médio do tumor atingiu 100 mm3, o tratamento foi iniciado. Os camundongos receberam cinco injeções de 1 mg de anticorpo, de forma intraperitoneal, com intervalo de 2-3 dias. Os tamanhos dos tumores foram medidos em dois diâmetros utilizando calibres digitais e o volume foi calculado utilizando a fórmula: 20 Volume do tumor (mm3) = L x W2 x 0,5, em que L é o diâmetro mais longo e W é o diâmetro mais curto (Teicher BA, Tumor Models in Cancer Research. Humana Press, NJ, USA 2002, p596). No final do experimento, os tumores foram cortados e pesados.

O Synagis foi utilizado como o anticorpo de controle. O experimento também incluía o tratamento com Erbitux e Vectibix na mesma quantidade utilizando a mesma programação que para a mistura de anti-EGFR (anticorpos 992, 1030 e 1024).

Como observado na figura 20, a mistura de 992, 1030 e 1042 inibia significativamente o crescimento de tumor de A431NS (P<0,05). Os pesos médios são mostrados na Figura 21. O resultado se correlacionava com os tamanhos dos tumores medidos. Há uma diferença significativa entre o grupo de tratamento e o grupo de controle. Exemplo 8b Eficácia in vivo

Em adição ao experimento in vivo descrito no exemplo 8, as misturas de 992+1024 e 992+1024+1030 foram investigadas no modelo de xenoenxerto de A431NS descrito anteriormente (figura 36). Quatro grupos cada de 9 camundongos nus, com 6-8 semanas, receberam injeção subcutânea de 1x106 células A431NS. Quando o tamanho médio dos tumores atingiu 100 mm3, os camundongos receberam a primeira injeção de anticorpo. Os três grupos receberam a mistura de 992+1024, 992+1024+1030, Erbitux ou o anticorpo de controle, Synagis. Em todos, os camundongos receberam 17 injeções de 0,5 mg 4 vezes uma semana. A primeira injeção foi fornecida no dia 8 e a última injeção foi fornecida no dia 34. Os tamanhos dos tumores foram medidos durante 56 dias. Após o término do tratamento com anticorpo, os tumores dos camundongos que receberam Erbitux começaram a expandir em relação ao tamanho, enquanto que os tumores continuaram a diminuir em relação ao tamanho nos dois grupos que receberam a mistura de 992+1024 ou 992+1024+1030. Não foi observada expansão no tamanho dos tumores para o grupo de 992+1024 no dia 91 (57 dias após o término do tratamento). O tamanho médio dos tumores para a combinação de 992+1024 era significativamente menor (P<0,01) no dia 56 que o tamanho médio dos tumores para os camundongos que receberam Erbitux.

A sobrevivência dos camundongos no experimento também foi monitorada. Os camundongos foram classificados como mortos quando os tumores atingiram os tamanhos máximos permitidos. A tabela a seguir mostra o número de camundongos que sobreviveram 56 dias após a inoculação 25 de células tumorais. Uma maior sobrevivência é observada para ambas as combinações comparadas com o Erbitux.

Grupo 992+1024 992+1024+1030 Erbitux Ab de Controle Número inicial de 9 9 9 9 camundongos Camundongos rema¬ 9 9 2 0 nescentes no dia 56 Experimentos adicionais

Dados preliminares de Iisados de tumores provenientes do experimento de xenoenxerto descrito no exemplo 8 mostram que a combinação de 992+1042+1030 induz uma regulação para menos potente da produ5 ção de VEGF por A431NS, o primeiro sendo um mediador importante da angiogênese. A maior formação de vasos sanguíneos é um fenômeno observado em muitos tumores sólidos, um mecanismo que participa do suprimento de nutrientes etc., afetando assim as condições de sobrevivência.

Além disso, outros dados preliminares mostram que um nível maior da combinação de anticorpos de 992+1042+1030 pode ser observado nos Iisados de tumores provenientes do experimento de xenoenxerto descrito no exemplo 8, quando comparada com Erbitux e Vectibix.

Exemplo 8c. Maior diferenciação de células tumorais in vivo

A diferenciação terminal de células é um processo complexo que inclui a ativação de programas de expressão gênica específica ao tipo celular, levando em um processo de várias etapas a uma perda reversível de sua capacidade proliferativa. Na doença maligna, as células cancerosas estão frequentemente em um estado desdiferenciado caracterizado por uma maior taxa de proliferação e foi sugerido que fármacos capazes de induzir a diferenciação terminal de células cancerosas seriam capazes de eliminar as células malignas e restabelecer a homeostase celular normal (Pierce GB, Speers WC: Tumors as caricatures of the process of tissue renewal: prospects for therapy by directing differentiation. Cancer Res 48:1996-2004, 1988). Sob certas condições experimentais, foi previamente relatado que anticorpos anti-EGFR monoclonais são capazes de aumentar a taxa de diferenciação terminal de células cancerosas escamosas humanas crescidas na forma de tumores de xenoenxerto em camundongos imunocomprometidos (Milas L, Mason K, Hunter N, Petersen S, Yamakawa M, Ang K, Mendelsohn J, Fan Z: In vivo enhancement of tumor radioresponse by C225 antiepidermal growth factor receptor antibody. Clin Cancer Res 6:701-8, 2000; Modjtahedi H, Eccles S, Sandle J, Box G, Titley J, Dean C: Differentiation or immune destruction: two pathways for therapy of squamous cell carcinomas with antibodies to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res 54:1695- 701, 1994).

Foi verificada histologicamente a extensão da diferenciação terminal em células A431NS tratadas com anti-EGFR crescidas na forma de 5 xenoenxertos em camundongos. O estudo histológico incluía 3 tumores de xenoenxerto de camundongo selecionados aleatoriamente de cada um dos quatro grupos experimentais descritos no exemplo 8.

Os tecidos foram dissecados e congelados rapidamente, então montados com Tecido-Tek sobre um criomicrótomo (Leitz, modelo 1720), cortados em seções de 5 μηι e amostrados em lâminas superfrost plus, então processados para coloração com hematoxilina/eosina. Dois observadores independentes então conduziram a verificação microscópica de todas as seções de tecido de uma maneira cega, classificando as áreas queratinizadas ("pérolas de queratina") como uma medida da extensão da diferenciação terminal (Modjtahedi e outros, 1994). A Tabela 7 lista o resultado obtido. Os camundongos tratados com uma mistura de três anticorpos Anti-EGFR (992+1024+1030, grupo 1) tinham focos notavelmente maiores e mais numerosos de células cancerosas diferenciadas de forma terminal quando comparados com os camundongos tratados com os anticorpos de referência Erbitux e Vectibix (Grupos 2 e 3. respectivamente). Não foi detectada qualquer diferenciação terminal no grupo de controle que recebeu PBS ao invés de anticorpo (grupo 4).

Imagens microscópicas representativas foram obtidas utilizando um microscópio ajustado com uma câmera digital, vide a figura 26.

Em conclusão, uma combinação de três anticorpos Anti-EGFR

com epitopos não-sobrepostos dentro do domínio Ill (clones 992, 1030 e 1042) exibia um efeito indutor de diferenciação maior inesperado sobre as células tumorais in vivo quando comparada aos anticorpos monoclonais Erbitux e Vectibix. Os efeitos observados sobre a diferenciação terminal levam 30 à conclusão de que as composições de anticorpos da invenção podem ser utilizadas na terapia de combinação com outros agentes indutores da diferenciação, tais como ácido retinóico, butirato de 4-fenila. Tabela 7

Grupo N0 do Classificação do N0 de Comentários Tumor pérolas de queratina 1 16 ++++ Pérolas de queratina grandes 1 17 +++ Pérolas de queratina grandes 1 54 ++++ Pérolas de queratina grandes 2 14 ++ Pérolas de queratina pequenas 2 45 ++ Pérolas de queratina pequenas 2 49 ++ Pérolas de queratina pequenas 3 11 ++ Pérolas de queratina pequenas 3 34 ++ Pérolas de queratina pequenas 3 56 ++ Pérolas de queratina pequenas 4 43 4 60 4 31 Exemplo 8d. Efeito inibidor do crescimento prolongado de uma composição de anticorpos da invenção.

Uma repetição do experimento de xenoenxerto de tumor apresentado nos exemplos 8 e 8b foi realizada para investigar a eficácia in vivo da mistura de anticorpos 992+1024. Sucintamente, camundongos BALB/c nu/nu receberam injeção subcutânea de 106 células A431NS no flanco. Foi permitido que os xenoenxertos de tumor crescessem até um tamanho médio de tumor de 100 mm3 (dia 7) em cujo ponto os camundongos foram separados aleatoriamente em cinco grupos de nove animais e os tratamentos com anticorpo foram iniciados. Os cinco grupos receberam uma dose alta (2 mg/semana) ou baixa (1 mg/semana) da mistura 992+1024 ou do anticorpo de referência Erbitux ou uma dose alta (2 mg/semana) do anticorpo de controle Synagis. Todos os camundongos receberam um total de 9 injeções de 0,5 ou 1 mg de anticorpo duas vezes por semana começando no dia 7 e terminando no dia 33.

A mistura 992+1024 em dose alta (2 mg/semana) era muito eficiente no controle do crescimento inicial do tumor e na indução da regressão do tumor em longo prazo quando comparada com o Erbitux (P = 0,0002, figura 38). Nenhum dos animais que receberam 2 mg/semana da mistura 992+1024 foi eliminado no período do estudo (118 dias após o início do experimento, figuras 38 e 39) um resultado significativamente melhor que no 5 grupo de Erbitux de dose alta de 2 mg/semana em que restou apenas um dos nove animais no dia 60 (P = 0,0008, figura 39). Isto mostra o efeito prolongado do tratamento com 992+1024 sobre a sobrevivência em longo prazo. Embora menos eficiente que a dose alta, a dose baixa da mistura 992+1024 (1 mg/semana) também era capaz de controlar o crescimento do 10 tumor e era significativamente melhor comparada com a dose alta de Erbitux de 2 mg/semana quando eram observadas tanto a supressão do tumor (P = 0,0135, figura 38) quanto a sobrevivência (P = 0,0087, Figura 39). Estes resultados demonstram a potência superior da combinação 992+1024 quando comparada com o Erbitux mesmo na dosagem baixa. Os resulta15 dos demonstram também a inibição prolongada do crescimento causada pela combinação 992+1024 comparada com um anticorpo monoclonal aprovado.

EXEMPLO 9: Crescimento esferoide

Para o estudo de esferoides, a uma placa de 96 poços de fundo redondo são adicionados 35 pL de 120 mg/mL de solução de PoIy-HEMA e deixados até a evaporação durante a noite em um fluxo laminar. O PolyHEMA previne a adesão das células. As células A431-NS são tratadas como anteriormente, contadas e sua concentração é ajustada em 100.000 células/mL. 50 pL da suspensão de células (5.000 células/poço) são então adicionados aos poços experimentais nas colunas 2-11 junto com 50 pL de uma solução de matrigel a 5%. 200 pL de meio foram adicionados nas Fileiras 1 e 8 assim como nas colunas 1 e 12 para diminuir o efeito da evaporação do meio nos poços experimentais. As placas são centrifugadas a 300xg durante 5 minutos e deixadas para se ordenarem durante a noite em uma incubadora umedecida a 37°C. No dia seguinte os anticorpos apropriados e as misturas de anticorpos foram diluídos até uma concentração de anticorpo total final de 20 pg/mL em uma placa de 96 poços vazia. Isto foi feito em DMEM suplementado com 0,5% de FBS e 1% de P/S fornecendo uma concentração de anticorpo final de 10 pg/mL no poço com a concentração mais alta de anticorpo. 150 pL destas soluções foram então adicionados aos poços na coluna 2 de uma placa de 96 poços e uma diluição em série de três 5 vezes foi feita até a coluna 9 de forma que cada poço contivesse 100 pL de solução de anticorpo. 100 pL de meio foram adicionados à coluna 11. 100 pL destas soluções são então transferidos para a placa contendo os esferoides e foi deixado que incubasse durante 7 dias. Então 20 pL do reagente WST-1 são adicionados por poço e as placas são incubadas durante uma hora a 10 37°C. As placas são então transferidas para um agitador de placas orbital e mantidas durante mais uma hora. A absorbância é medida em 450 e 620 nm (comprimento de onda de referência) em uma leitora de ELISA. A quantidade de células metabolicamente ativas (MAC) é calculada como a percentagem do controle não tratado como a seguir:

%MAC =

x 100

v (<ODnão - tratado - ODmeio) y Uma mistura de três anticorpos com epitopos não-sobrepostos

dentro do domínio Ill (992+1030+1042) inibe eficientemente o crescimento de esferoides A431-NS e é mais potente que os anticorpos anti-EGFR terapêuticos monoclonais Erbitux e Vectibix (Figura 22).

EXEMPLO 10. Ligação ao ECD do EGFR de cinomóloqos Clonagem do domínio extracelular de EGFR de cinomóloqos.

O domínio extracelular de EGFR de cinomólogos excluindo o peptídeo sinal foi clonado partindo do cDNA de cinomólogos isolado da epiderme através da utilização da PCR aninhada e iniciadores específicos à seqüência derivados da seqüência publicada do EGFR humano de compri25 mento completo (GENBANK X00588, UIIrich1A. e outros Nature 309(5967), 418-425 (1984)).

Reagentes de PCR:

cDNA de Macaco Cinomólgo isolado da epiderme da pele normal:

CytoMoI Unimed, Cat. N0: ccy34218, Lote N0: A711054. Tampão de reação Phusion (5X): Finnzymes, Cat. N0: F-518,

Lote N0: 11.

Enzima Phusion: Finnzymes, F-530S (2 ϋ/μί).

dNTP 25 mM: Bioline, Cat. N0: Bl0-39029, Lote N0: DM-103F.

Iniciadores para a amplificação do ECD de EGFR de cinomólo

gos incluindo a seqüência sinal parcial e o domínio transmembrana:

Iniciador 5' ATG: 5'-TCTTCGGGAAGCAGCTATGC-3' (SEQ ID NO: 135) Iniciador 3' Tm 2: 5'-TTCTCCACTGGGCGTAAGAG-3' (SEQ ID NO: 136)

Iniciadores para a amplificação através da PCR aninhada do ECD de EGFR de cinomólogos pb 1-1863 e incorporação dos sítios de restrição Xbal, Mlul e do códon de término antes do domínio transmembrana:

5' EGFR Xbal: 5'-ATCTGCATTCTAGACTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGC-3' (SEQ ID NO: 137)

3' EGFR Mlul: 5'-TACTCGATGACGCGTTTAGGATGGGATCTTAGGCCCGTTCC-3' (SEQ ID NO: 138)

Condições da PCR:

30 ciclos: 98°C/30 s de fusão, 55°C/30 s de anelamento, 72°C/60 s de alongamento. Após 30 ciclos foi permitido que os produtos da PCR fossem alongados durante 5 min adicionais.

As reações de PCR foram realizadas com 1 μί de molde e 2 u

nidades da Enzima Phusion em um volume total de 50 μί de tampão de reação contendo 0,2 mM de dNTP, 0,5 μΜ de iniciador.

Uma banda de PCR final com um comprimento aparente de aproximadamente 1800 -1900 pb foi obtida e clonada no vetor de expres25 são. As seqüências de DNA e de proteína do domínio extracelular de EGFR de cinomólogos clonado são mostradas na Figura 23 e a seqüência de proteína do ECD de EGFR de cinomólogos alinhada com o ECD de EGFR humano é mostrada na Figura 24. O alinhamento das seqüências de DNA do ECD de EGFR humano e do ECD de EGFR de cinomólogos exibia 30 97,6% de identidade de seqüência, enquanto que o alinhamento das seqüências de proteínas correspondentes exibia 98,6% de identidade de seqüência. Demonstração da reatividade cruzada do anticorpo entre o domínio extracelular de EGFR Humano e de cinomólogos em ELISA.

Para verificar se os anticorpos Anti-EGFR testados se ligavam igualmente bem ao ECD de EGFR tanto Humano quanto de cinomólogos e, consequentemente, permitindo estudos toxicológicos em macacos cinomólogos, diluições em série de quatro vezes de anticorpos partindo de 1 pg/mL foram testadas por ELISA em relação à ligação às proteínas recombinantes do ECD de EGFR Humano e de Cinomólogos. Os anticorpos exibindo perfis de ligação idênticos neste ensaio foram interpretados como uma indicação de boa reatividade cruzada do EGFR das espécies. Os poços de ELISA foram revestidos com 50 pL/poço de EGFR de comprimento completo em uma concentração de 1 pg/mL em PBS durante a noite e 4°C. Na manhã seguinte os poços foram lavados duas vezes com PBS-T e bloqueados durante uma hora com 100 pL de PBS-T-1% de BSA à temperatura ambiente, seguido pela lavagem duas vezes em PBS-T. A seguir, 50 pL de anticorpos AntiEGFR diluídos em série e anticorpos de controle foram adicionados aos poços e incubados durante uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação do anticorpo os poços foram lavados cinco vezes com PBS-T, seguido pela incubação com 50 pL/poço do reagente secundário Estreptavidina-HRP diluído 1:3000 no tampão de bloqueio e pela incubação à temperatura ambiente durante 30 min. Finalmente os poços foram lavados cinco vezes com PBS-T e as placas foram reveladas através da adição de 50 pL/poço de substrato TMB e incubadas à temperatura ambiente. Após a incubação a reação foi interrompida através da adição de 1 M de H2SO4; 100 pL/poço e as placas foram lidas em DO de 450nm.

Reaqentes do ELISA:

1. Placa de ELISA; NUNC Maxisorp; cat: 442404

2. Antígeno: ECD do rEGFR Humano; ECD do rEGFR de cinomólogos

3. Tampão de revestimento: 1 x PBS; Gibco cat:20012-019 4. Tampão de lavagem: 1xPBS/0,05% de Tween 20 (PBS-T)

5. Tampão de bloqueio/diluição: 1% de BSA em PBS-T

6. Conjugado de HRP anti-lgG Humana de Cabra: Serotec, Star 106P 7. TMB Plus (KemEnTec cat # 4390L)

8. (1 M de H2SO4)

Como mostrado na figura 25, o ensaio de ELISA descrito podia discriminar entre os anticorpos para anti-ECD do EGFR Humano e de cino5 mólogos com ligação cruzada (Figura 25 A) e os anticorpos específicos à espécie reconhecendo apenas o ECD de EGFR Humano utilizado para as imunizações de camundongos (Figura 25B).

EXEMPLO 11. Inibição da motilidade

A maior parte das mortes causadas por câncer é derivada da 10 disseminação de células tumorais e do crescimento subsequente em localizações distantes. A invasão local do tecido normal adjacente compromete as funções homeostáticas e impede a remoção cirúrgica ou radiológica do tumor. Investigações recentes evidenciaram a função central que a motilidade induzida desempenha na promoção deste espalhamento. É sabido que o 15 EGFR facilita a motilidade e o espalhamento celular e, portanto, a inibição da motilidade mediada pelo EGFR é um mecanismo importante de fármacos direcionados para o EGFR.

O efeito de uma mistura dos dois anticorpos 992 e 1024 sobre a motilidade das linhagens de células de carcinoma de cabeça e pescoço foi 20 investigado. Os esferoides consistindo em 10.000 células foram preparados durante a noite como descrito no exemplo 9. Os esferoides foram então transferidos para frascos de cultura de células NUNC T25 e a adesão foi permitida durante a noite. 10 pg/mL da mistura de anticorpos 992+1024 ou de um anticorpo de controle negativo foram então adicionados e os esferoi25 des foram incubados durante mais 24 horas. Foram otidas imagens no aumento de 40x e a área coberta pelas células foi medida utilizando o software Image J.

Resultados: Como pode ser observado na Figura 27A a adição dos anticorpos 992 e 1024 específicos ao EGFR leva a um decréscimo significativo na área coberta pelas células tumorais. A motilidade é quantificada na Figura 27B, que mostra que a motilidade é diminuída aproximadamente 60% quando comparada com o anticorpo de controle negativo. Este decréscimo na motilidade é altamente significativo p<0,01.

Assim, uma combinação dos anticorpos 992 e 1024 inibe potencialmente a motilidade das células tumorais mediada por EGFR, o que indica que as combinações de anticorpos anti EGFR poderiam ser utilizadas para o tratamento da doença disseminada.

Exemplo 12. Regulação para mais da Involucrina pela composição de anticorpo Svm 004

A Involucrina é um marcador da diferenciação precoce de células escamosas e uma proteína que está envolvida na formação do envelope cornificado. Os níveis de involucrina podem, portanto, ser utilizados como uma medida do número de células tumorais que se diferenciaram. Os níveis de Involucrina foram estimados nos Iisados de proteínas de tumores de xenoenxerto de A431NS não tratados ou tratados com Erbitux, Vectibix ou uma mistura dos anticorpos 992+1030+1042 utilizando um kit de ELISA para Involucrina disponível comercialmente (Biomedical Technologies). Os Iisados de tumor foram preparadas através da homogeneização de 30-40 mg de tecidos tumorais em 1 mL de tampão RIPA utilizando o TissueLyzer da Qiagen. A concentração de proteína em cada Iisado clarificado foi determinada utilizando o kit de ensaio da proteína BCA da Pierce e o nível de involucrina foi estimado utilizando o ensaio de ELISA em 0,4 pg de proteína de cada amostra.

Resultados: Como pode ser observado na Figura 27 a Involucrina é encontrada em níveis significativamente maiores no grupo de tratamento com 992+1030+1042 quando comparados aos dos grupos de tratamento 25 com o controle negativo e com Erbitux ou Vectibix. Assim, uma combinação dos anticorpos 992, 1030 e 1042 aumenta os níveis de involucrina nos tumores de xenoenxerto de A431NS e, portanto, induz presumidamente um grau maior de diferenciação de A431NS. Um resultado que se correlaciona bem com o alto número de pérolas de queratina encontrado neste grupo de tra30 tamento particular (vide exemplo 8).

Exemplo 13 Internalização do EGFR pela composição de anticorpo Svm004 Alguns anticorpos funcionam através da indução da internalização de seu alvo de superfície. É sabido que o EGFR sofre internalização quando ativado por Iigante tal como EGF.

A capacidade de uma mistura dos dois anticorpos 992 e 1024 de induzir a internalização do EGFR foi investigada utilizando microscopia 5 confocal. As células A431NS e HN5 foram semeadas em lâminas com câmaras de 8 poços da LabTek e incubadas durante a noite em DMEM contendo 0,5% de FBS. Foram então adicionados às células 10 pg/mL da mistura de anticorpos de 992+1024 marcada com Alexa-488 ou do anticorpo de controle Erbitux e então incubados durante períodos de tempo 10 diferentes. Foram obtidas imagens em um aumento de 60x utilizando um microscópio confocal da Biorad com um orifício grande ou um orifício pequeno.

Resultados: Como mostrado na Figura 29A a adição dos anticorpos 992 e 1024 específicos ao EGFR marcados com Alexa-488 durante 2 15 horas leva ao acúmulo dos anticorpos nas vesículas intracelulares em ambas as linhagens de células A431NS e HN5. O Erbitux, em contraste, é principalmente encontrado na superfície celular. A Figura 29B mostra imagens de células A431NS utilizando um orifício menor, que resulta em imagens de seções mais finas das células. É evidente partindo destas imagens que os 20 anticorpos 992+1024 estão localizados dentro das células enquanto que o Erbitux é principalmente encontrado na superfície celular. A Figura 30 mostra um período de tempo da internalização mediada por 992+1024 e tão logo quanto 30 minutos após a adição de anticorpos estes podem ser encontrados nas vesículas intracelulares. Após 4 horas quase todos os anticorpos 25 992+1024 são encontrados dentro das células com coloração na superfície baixa ou muito fraca. O Erbitux, em contraste, permanece na superfície celular. Também foi obtida uma evidência que mostra que a internalização induzida por 992+1024 leva a uma degradação prolongada e à remoção do EGFR nas células.

Assim, uma combinação dos anticorpos 992 e 1024 rapidamen

te e potencialmente induz a internalização do EGFR enquanto que o Erbitux não. Exemplo 14 Medida das afinidades dos anticorpos com ressonância de plasmônio de superfície.

Medida das afinidades monovalentes dos anticorpos IgG Sym004 contra o ECD do EGFR solúvel recombinante.

5 A análise cinética dos anticorpos IgG de comprimento completo

da invenção foi realizada em um BIAcore 2000, empregando um ensaio que é descrito em (Canziani, Klakamp e outros 2004, Anal. Biochem, 325:301- 307) que permite a medida das afinidades monovalentes de moléculas de IgG inteiras contra um antígeno solúvel. Sucintamente, aproximadamente 10 10.000 Ru de um anticorpo Fc anti-lgG humana policlonal foram conjugadas à superfície de um chip CM5 de acordo com as instruções do fabricante, seguido pela captura de 25 pg de anticorpos Anti-EGFR individuais da invenção ou do controle negativo Synagis na superfície do anti-Fc Chip. A densidade da IgG capturada foi otimizada para cada clone, de forma que a ligação 15 da concentração mais alta do antígeno empregado no ensaio não excedesse 25 Ru. Depois 250 pL de ECD de EGFR humano solúvel, que foi mostrado previamente que continha somente proteína monovalente através de cromatografia por exclusão em gel, foram injetados a uma vazão de 25 pL/min em diluições em série de duas vezes em tampão HBS-EP para gerar curvas de 20 resposta. A superfície do chip foi regenerada entre ciclos através da extração dos complexos de anticorpo/antígeno capturados com uma injeção de 10 segundos de 100 mM de H3PO4. A análise cinética foi realizada primeiro subtraindo a resposta da célula de fluxo contendo o anticorpo de controle negativo Synagis seguida pela subtração da resposta gerada pela injeção de 25 tampão HBS-EP sozinho ("referência dupla"). A constante da taxa de associação (ka) e a constante de dissociação (kd) foram avaliadas de forma global partindo dos sensogramas gerados com o software 4.1 de avaliação BIA fornecido pelo fabricante.

Reaqentes:

1. Chip CM5: Biacore, N0 de Cat. BR-1000-14

2. NHS: Biacore BR-1000-50

3. EDC: Biacore BR-1000-50 4. 10 mM de Tampão acetato pH 4,5: Biacore, N0 de Cat. BR-1003-50

5. Fc anti-lgG Humana de Cabra: Caltag, N0 de Cat. H10500

6. Etanolamina, 1,0 M pH 8,5: Biacore BR-1000-50

7. 10 x tampão de corrida HBS-EP: 0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de

NaCI, 3 mM de EDTA, 0,005% v/v de Tensoativo P20

8. Antígeno: Domínio extracelular do EGFR Humano com 6xHis.

9. IOOmMdeH3PO4

As afinidades monovalentes calculadas das IgGs de comprimento completo da invenção contra o ECD de EGFR Humano solúvel são mostradas na Tabela 8 a seguir.

Afinidades medidas dos anticorpos IgG anti-EGFR contra o receptor solúvel. As medidas dos anticorpos foram realizadas através da Ressonância de Plasmônio de Superfície em um BIAcore 2000 empregando o software de avaliação fornecido pelo fabricante. * A afinidade de 992 foi determinada através da Análise de Scatchard.

Tabela 8

IgG koN (Μ'1 S1) koff (1/s) ti/2 (min) K0 (nM) 992* N.A. N.A. 0,2 170,0 1024 1.8E+05 4,9E-03 2,4 26,7 1030 1.3E+04 3,7E-04 31,1 29,2 1254 8,5E+04 1,0E-03 11,3 12,7 1260 3.7E+04 1,6E-04 74,1 4,2 1261 1.7E+05 3,2E-03 3,6 18,6 1277 1.3E+05 5,3E-05 217,6 0,4 1284 3,2E+04 1.5E-04 78,1 4,6 1320 1.2E+05 2,8E-03 4,1 24,2 1347 2,4E+04 5.0E-04 22,9 21,4 N.A.: Não aplicável.

Os anticorpos Sym004 mais testados reconheciam o ECD de EGFR humano solúvel com afinidades na faixa de 10 - 20 nM, exceto 1260, 1277 e 1284 que tinham afinidades mais altas de 4,2 nM, 0,4 nM e 4,6 nM respectivamente. Finalmente foi observado que 992 se liga ao ECD de EGFR solúvel com uma afinidade muito menor que os outros anticorpos testados. Consequentemente, a análise cinética deste anticorpo tinha que ser determinada através da análise de Scatchard que revelou uma afinidade de 5 170 nM contra o ECD de EGFR humano solúvel.

Medida das afinidades de anticorpos Fab Sym004 contra o ECD de EGFR recombinante imobilizado.

Para verificar diferenças possíveis na apresentação de antígenos entre o ECD de EGFR apresentado na forma solúvel e imobilizada, foi 10 realizada uma nova medida de afinidade em um antígeno do Receptor EGFR quimérico imobilizado chamado de EGFR-Fc (R&D Systems, 344-ER), consistindo no ECD de EGFR Humano fundido ao Fe de IgG Humana. Para esta finalidade, foram gerados fragmentos Fab dos anticorpos IgG 992, 1024

& 1030 para permitir a medida das afinidades monovalentes.

Produção de Fab:

Os fragmentos Fab de 992, 1024 e 1030 foram produzidos através da digestão com Papaína utilizando um Kit de preparação de Fab da Pierce e seguindo as instruções do fabricante. Sucintamente 2 mg de cada anticorpo IgG sofreram troca de tampão em colunas NAP-5 (Amersham Bi20 osciences) pelo tampão de digestão recém-preparado contendo 20 mM de Cisteína-HCI, pH 7,0 seguindo as instruções do fabricante. Então uma suspensão de 350 pL de esferas de Papaína foi lavada duas vezes no mesmo tampão de digestão antes das esferas serem centrifugadas e o sobrenadante foi descartado. Os anticorpos foram digeridos através da adição de 1 25 mL de anticorpo IgG que sofreu troca de tampão às esferas e de incubação durante a noite a 37°C com agitação a 1000 rpm. Na manhã seguinte, a IgG não digerida foi separada do Fab bruto através da eliminação de IgG de comprimento completo em colunas HiTrap Protein A (Ge Healthcare). O Fab produzido foi finalmente submetido à diálise contra PBS durante a noi30 te e analisado com SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras. Uma banda de proteína de aproximadamente 50 kDa sob as condições não redutoras foi interpretada como uma indicação da produção bem-sucedida de Fab.

Reagentes:

1. Kit de preparação de Fab ImmunoPure; Pierce; N0 de Cat. 44885

2. Coluna de dessalinização NAP5; Amersham, N0 de Cat. 17-0853-02 3. PBS pH 7,2; Gibco; #20012-019

4. HiTrap Protein A HP, coluna de 1 mL; GE Healthcare; #17-0402-01

5. NuPAGE 4-12% Novex Bis-Tris Gel; Invitrogen; #NP0322BOX

6. Marcador molecular; Seeblue Plus 2; Invitrogen; # LC5925

7. Anticorpos anti-EGFR - 2,0 mg de cada.

A análise cinética dos anticorpos Fab da invenção foi realizada

em um Biacore 2000, utilizando antígeno recombinante imobilizado sobre a superfície do sensor a uma densidade muito baixa para evitar limitações no transporte de massa. Sucintamente, um total de 285 Ru de quimera ECD de EGFR-Fc recombinante (R&D Systems, N0 de Cat. 344-ER) foi conjugado 15 com a superfície de um chip CM5 de acordo com as instruções do fabricante. Então os fragmentos Fab derivados dos anticorpos da invenção foram testados em diluições em série de duas vezes, partindo de uma concentração otimizada que não resultava em valores máximos de Ru acima de 25 quando testados sobre o chip com EGFR imobilizado. A análise cinética foi 20 realizada primeiro subtraindo a resposta gerada pela injeção do tampão HBS-EP sozinho. A constante da taxa de associação (kA) e a constante de dissociação (kd) foram avaliadas de forma global partindo dos sensogramas gerados com o software 4.1 de avaliação BIA fornecido pelo fabricante.

As afinidades calculadas dos fragmentos Fab testados da in

venção contra o ECD de EGFR Humano imobilizado são mostradas na Tabela 9 a seguir. Afinidades medidas de anticorpos Fab anti-EGFR contra o receptor imobilizado. As medidas do anticorpo foram realizadas através da Ressonância de Plasmônio de Superfície em um BIAcore 2000 empregando o software de avaliação fornecido pelo fabricante. * A afinidade de 992 foi determinada através da Análise de Scatchard.

Tabela 9

Fab '</) koff (1/s) ti/2 (min) Kd (nM) Z O Fab 992* N.A. N.A. 0,2 150,0 Fab 1024 1.9E+05 4.9E-03 2,3 25,6 Fab 1030 8,7E-04 2,0E-04 57,5 2,3 N.A.: Não aplicável.

Como apresentado na Tabela 9 acima, foi observado que os fragmentos Fab de 992 e 1024 possuem afinidades de 150 nM e 26 nM res10 pectivamente em concordância com as afinidades apresentadas no exemplo anterior, ilustrando diferenças sem significância no reconhecimento do anticorpo contra o EGFR solúvel e imobilizado para estes dois anticorpos. Entretanto, o anticorpo 1030 exibia uma afinidade dez vezes maior de 2,3 nM contra o antígeno imobilizado quando comparada à do receptor solúvel e, con15 sequentemente, reconhecia preferencialmente um epitopo exposto no antígeno imobilizado.

EXEMPLO 15: Investigação da apresentação do antígeno EGFR e classificação das afinidades funcionais nas células A431-NS.

Comparação entre a apresentação de antígenos nas células A431-NS e o receptor EGFR purificado de comprimento completo.

Uma vez que a análise cinética revelou que o anticorpo 992 reconhecia o ECD de EGFR recombinante com uma afinidade entre 150-170 nM, foi verificado se esta afinidade fraca era devido ao fato de que o mAb 992 se ligava preferencialmente às conformações nativas de EGFR que são 25 expressas nas células A431-NS ao contrário das conformações apresentadas no ECD de EGFR recombinante ou no EGFR de comprimento completo purificado de células A431. Para verificar as diferenças nas preparações de antígeno do receptor de EGF, estudos de ligação de ELISA concorrentes de uma subpopulação dos anticorpos da invenção foram realizados com fragmentos Fab para evitar os efeitos de avidez sobre as células A431-NS testadas e EGFR de comprimento completo purificado das mesmas células.

Produção de Fab: A produção de fragmentos Fab foi realizada como descrito no exemplo 14.

ELISA Indireto: Para o ELISA indireto, o EGFR de comprimento completo (Sigma E2645) foi revestido a 1 pg/mL em tampão Carbonato (50 pL/poço) durante a noite a 4°C. Na manhã seguinte, os poços foram lavados duas vezes com PBS-T e bloqueados durante uma hora com PBS-T conten10 do 1% de BSA à temperatura ambiente seguido pela lavagem duas vezes em PBS-T. A seguir, diluições em série de 50 pL de anticorpos Fab em DMEM contendo 1% de BSA foram adicionados em poços de ELISA independentes e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente, após a qual os poços foram lavados quatro vezes com PBS-T. A seguir, 50 pL de um 15 conjugado de HRP anti-Humano de Cabra (específico ao Fab) secundário diluído 1:5000 em DMEM contendo 1% de BSAforam adicionados e incubados em gelo durante 30 min. Finalmente, os poços foram lavados quatro vezes com PBS-T e as placas foram reveladas através da adição de 50 pL/poço de substrato TMB e lidas em 620 nm a cada 5-15-30 min. Após a 20 incubação com o substrato, a reação foi interrompida através da adição de 1 M de H2SO4 e absorbância foi lida em 450 nm.

Reaqentes. ELISA indireto:

1) Tampão de revestimento: 50 mM de tampão Carbonato, pH 9,8

2) Antígenos: EGFR de comprimento completo do tipo selvagem purificado de células A431; Sigma E2645

3) Placa de ELISA: NUNC Maxisorp; Cat. N0: 442404

4) Tampão de lavagem: 1x PBS/0,05% de Tween 20 (PBS-T)

5) Tampão de bloqueio/diluição: 1% de BSA em PBS-T (PBS-T-1% de BSA)

6) Tampão de diluição do anticorpo: DMEM contendo 1% de BSA

7) Conjugado de HRP anti-Humano de Cabra (específico ao Fab): Jackson, N0 de Cat. 109-035-097 8) Substrato TMB Plus: KemEnTec, N0 de Cat. 4390L

9) 1 M de H2SO4

ELISA de células: As afinidades de ligação relativas definidas como a concentração molar que fornece a metade da DO máxima (ED50) foram determinadas através de titulações do anticorpo em células A431-NS. Sucintamente, 10.000 células A431-NS foram crescidas em placas de ELISA de 96 poços contendo DMEM com adição de 0,5% de FCS e 1% de P/S a 37°C, 5% de CO2 durante a noite. Na manhã seguinte, as células confluentes (aproximadamente 20.000/Poço) foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas através da incubação com uma solução de paraformaldeído a 1% durante 15 min à temperatura ambiente seguida pela lavagem quatro vezes com PBS. A seguir, os anticorpos para EGFR testados e o anticorpo de controle negativo Synagis foram diluídos em série em DMEM contendo 1% de BSA e 50 pL de cada diluição adicionada nos poços e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente, após a qual os poços foram lavados quatro vezes com PBS. Então 50 pL de um conjugado de HRP anti-Humano de Cabra (específico ao Fab) diluído 1:5000 em DMEM contendo 1% de BSA foram adicionados e incubados em gelo durante 30 min. Finalmente os poços foram lavados quatro vezes com PBS e as placas foram reveladas através da adição de 50 pL/poço de substrato TMB Plus e lidas em 620 nm a cada 5-15-30 min. Após a incubação com o substrato a reação foi interrompida através da adição de 1 M de H2SO4 e absorbância foi lida em 450 nm. A afinidade funcional expressa na forma de valores de ED50 foi calculada através da subtração da ligação residual média somente com o reagente secundário, seguida pela normalização de curvas de ligação através da representação gráfica da % de ligação máxima em relação a cada anticorpo testado.

Reagentes. ELISA de células:

1) Meio DMEM: Gibco, Cat. N0 41966-029 2) FCS: Gibco, N0 de Cat. 10099-141

3) Pen strep (P/S): Gibco, N0 de Cat. 15140-122

4) Placa de ELISA: Costar, N0 de Cat. 3595 5) Tampão de lavagem (PBS): Gibco cat. 20012-019

6) Tampão de diluição de anticorpo: DMEM contendo 1% de BSA

7) Solução de fixação de células: BD Biosciences1 N0 de Cat. 340181

8) Conjugado de HRP anti-Humano de Cabra (específico ao Fab): Jackson, N0 de Cat. 109-035-097

9) Substrato TMB Plus: KemEnTec, N0 de Cat. 4390L

10) IMdeH2SO4

As diferenças na apresentação de antígeno no receptor de EGF expresso em células A431-NS e no receptor purificado das mesmas células foram determinadas com estudos de ligação em ELISA concorrente, empregando o mesmo reagente de anticorpo secundário e períodos de tempo de incubação. Os resultados são mostrados na Figura 31. O experimento mostrou claramente que os anticorpos Fab 992 e 1024 se ligavam fracamente ao EGFR de comprimento completo purificado revestido nos poços de ELISA quando comparados à ligação das mesmas concentrações de Fab 1030. Entretanto, esta atividade de ligação fraca de 992 e 1024 foi restaurada quando os anticorpos foram testados em células A431-NS contra as quais todos os três Fabs exibiam atividade de ligação forte. A comparação dos dois ELISAs diferentes ilustrava claramente uma preferência dos Fabs 992 e 1024 pela ligação às conformações de EGFR nativas que são expressas nas superfícies celulares ao contrário das conformações apresentadas no antígeno purificado nos poços de ELISA. O resultado também sugeria que a afinidade fraca aparente de 992 medida com ressonância de plasmônio de superfície no ECD de EGFR solúvel ou imobilizado recombinante era divida à apresentação desfavorável do epitopo do anticorpo 992 nos sistemas testados.

Classificação das afinidades funcionais nas células A431-NS.

Os ELISAs de células realizados como descrito anteriormente foram utilizados para classificar as afinidades funcionais de IgG e fragmentos Fab de 992, 1024, 1030, Vectibix e Erbitux através do cálculo dos valores de metade da DO máxima expressos na forma de valores de ED50. O resultado desta análise é mostrado na Fig. 32 e os valores de ED50 calculados são apresentados na Tabela 10 a seguir.

Tabela 10: Classificação das afinidades funcionais expressas na forma de valores de ED50 com base nos efeitos de avidez de IgG ou da afinidade monovalente de Fab. Os valores de ED50 foram determinados através das titulações em série do anticorpo nas células A431-NS. SD: Desvio padrão do ajuste da curva.

Avidez de IgG Afinidade de Fab

IgG Log ED50 ED50nM SD 992 -0,56 0,3 0,04 1024 -0,49 0,3 0,05 1030 0,17 1,5 0,02 Vectibix -0,15 0,7 0,04 Erbitux -0,23 0,6 0,04 Fab Log ED50 ED50 nM SD 992 1,00 9,9 0,11 1024 0,30 2,0 0,02 1030 0,27 1,8 0,05 Vectibix 0,08 1,2 0,04 Erbitux -0,07 0,8 0,06 O experimento mostrava claramente que quando os efeitos de avidez eram levados em consideração, as IgG 992 e 1024 pareciam estar ligadas às células A431-NS com avidez maior que tanto Erbitux quanto Vec10 tibix, embora a IgG 1030 tivesse a afinidade mais baixa dos anticorpos IgG testados. Entretanto, quando a afinidade monovalente nas células foi determinada utilizando fragmentos Fab, 992 tinha a afinidade mais baixa de aproximadamente 10 nM. Todavia, esta afinidade monovalente funcional era ainda pelo menos 15 vezes menor que a testada com BIAcore.

EXEMPLO 16: Investigação do aumento da ligação induzido por anticorpo.

O experimento de competição BIAcore realizado em pares de anticorpos da invenção revelou que a ligação de 992 e 1024 era aumentada aproximadamente 55% e 58% respectivamente (Figura 9A), quando estes anticorpos eram testados contra cada outro em ambas as direções. Para 20 investigar adicionalmente este fenômeno, foi planejado um ELISA de células utilizando células não fixadas para verificar o efeito da ligação de IgG de um clone de anticorpo após a saturação prévia do receptor com o fragmento Fab de um anticorpo que se liga a um epitopo não-sobreposto.

ELISA de células: O ELISA foi realizado essencialmente como descrito no exemplo 15 com modificações. As células foram mantidas não fixadas para permitir a flexibilidade conformacional do EGFR após as adições de anticorpo. Sucintamente, 10.000 células A431-NS foram crescidas em placas de ELISA de 96 poços contendo DMEM com adição de 0,5% de FCS e 1% de P/S a 37°C, 5% de CO2 durante a noite. Na manhã seguinte, as células confluentes (aproximadamente 20.000/Poço) foram lavadas duas 5 vezes com PBS e os poços para investigação dos aumentos da ligação induzidos por anticorpo foram pré-incubados com 25 pL de 40 nM de fragmentos Fab isolados de qualquer um de 992, 1024 ou 1030 ou 12,5 pL de 80 nM de cada Fab isolado em combinações duplas previamente mostradas que forneciam ligação saturada. 25 pL de DMEM contendo 1% de BSA foram 10 adicionados aos poços utilizados para o teste dos anticorpos IgG sem fragmentos Fab adicionados. Após a adição de Fab e meio, os poços de ELISA foram incubados durante 30 min à temperatura ambiente, após os quais 25 pL de diluições em série de três vezes de IgGs da invenção ou do controle negativo Synagis, partindo de uma concentração de 360 nM foram adicio15 nados aos poços e incubados em gelo durante uma hora. A seguir, os poços foram lavados quatro vezes com PBS e 50 pL de um conjugado de HRP anti-Humano de camundongo (específico ao Fe) monoclonal secundário diluído 1:5000 em DMEM contendo 1% de BSA foram adicionados e incubados em gelo durante 30 min. Finalmente os poços foram lavados quatro vezes com 20 PBS e as placas foram reveladas através da adição de 50 pL/poço do substrato TMB e lidas em 620 nm a cada 5-15-30 min. Após a incubação com o substrato a reação foi interrompida através da adição de 1 M de H2SO4 e a absorbância foi lida em 450 nm. A afinidade funcional expressa na forma de valores de ED50 foi calculada através da subtração da ligação residual mé25 dia com o reagente secundário sozinho, seguida pela normalização de curvas de ligação através da representação gráfica da % de ligação máxima em relação a cada anticorpo testado.

Reagentes. ELISA de células:

1) Meio DMEM: Gibco, Cat. N0 41966-029 2) FCS: Gibco, N0 de Cat. 10099-141

3) Pen strep (P/S): Gibco, N0 de Cat. 15140-122

4) Placa de ELISA: Costar, N0 de Cat. 3595 5) Tampão de lavagem (PBS): Gibco cat. 20012-019

6) Tampão de diluição de anticorpo: DMEM contendo 1% de BSA

7) Conjugado de HRP anti-Humano de Camundongo (específico ao Fc): Ab-direct, N0 de Cat. MCA647P

8) Substrato TMB Plus: KemEnTec1 N0 de Cat. 4390L

9) 1 M de H2SO4

As investigaçãos dos aumentos da ligação induzidos por anticorpo foram determinadas através de estudos de ligação em ELISA concorrente, empregando o mesmo reagente de anticorpo secundário e períodos de tempo de incubação. O resultado do estudo é mostrado na Figura 33 e os valores de ED50 calculados na Tabela 11a seguir.

Tabela 11: Classificação das afinidades funcionais expressas na forma de valores de ED50 com base nos efeitos de avidez de IgG com ou sem a saturação prévia do receptor com os fragmentos Fab listados. Os valores de ED50 foram determinados através de titulações em série do anticorpo IgG em células A431-NS. SD: Desvio padrão do ajuste da curva.

IgG Log ED50 ED50nM SD IgG 992 -0,24 0,6 0,07 IgG 992/Fab 1024 -0,31 0,5 0,02 IgG 992/Fab 1030 -0,38 0,4 0,05 IgG 992/Fab 992 e 1030 -0,34 0,5 0,04 IgG Log ED50 ED50nM SD IgG 1024 -0,01 1,0 0,01 IgG 1024/Fab 992 -0,05 0,9 0,04 IgG 1024/Fab 992 e 1030 -0,08 0,8 0,02 IgG Log ED50 ED50nM SD IgG 1030 0,33 2,2 0,06 IgG 1030/Fab 992 0,20 1,6 0,03 IgG 1030/Fab 992 e 1024 0,34 2,2 0,06 Como apresentado na figura 33 e na Tabela 11 acima, a IgG 992 exibia um aumento evidente de ligação após a saturação prévia do receptor com fragmentos Fab de qualquer um de 1024 ou 1030 ou 1024 junto com 1030. A incubação com fragmentos Fab resultou em valores de ED50 menores de 0,5; 0,4 & 0,5 nM respectivamente comparados com 0,6 nM quando a IgG 992 foi testada sozinha. Similarmente as IgGs 1024 e 1030 também exibiram maior ligação quando as células foram primeiramente satu5 radas com Fab 992 e apenas 1024 quando ambos os Fabs 992 e 1030 foram adicionados às células antes da IgG. Este resultado ilustrava claramente o benefício de ter mais de um anticorpo contra epitopos não-sobrepostos no mesmo receptor-alvo.

Afinidades funcionais ligeiramente menores foram determinadas 10 neste experimento quando comparadas às do exemplo 2. Este resultado é provavelmente devido ao fato de que um reagente secundário diferente foi utilizado no presente exemplo e devido ao fato de que as IgGs testadas foram incubadas com células não fixadas em gelo para evitar a internalização. Exemplo 16B. CIonaaem de EGFR de comprimento completo de cinomólogos. 15 O EGFR de cinomólogos de comprimento completo incluindo o

peptídeo sinal foi clonado partindo do cDNA de cinomólogos isolado da epiderme através da utilização da PCR aninhada e de iniciadores específicos à seqüência derivados da seqüência publicada do EGFR humano de comprimento completo (GENBANK X00588, Ullrich, A. e outros Nature 309(5967), 418-425(1984)).

Reaqentes de PCR:

cDNA de Macaco Cinomólgo isolado da epiderme da pele normal:

CytoMoI Unimed, Cat. N0: ccy34218, Lote N0: A711054.

Tampão de reação FastStart (10X): Roche, Cat. N0: 03 553 361 001

Enzima FastStart: Roche, Roche, Cat. N0: 03 553 361 001 Enzima Phusion: Finnzymes, F-530S (2 U/pL). dNTP 25 mM: Bioline1 Cat. N0: Bl0-39029 Iniciadores para a amplificação de EGFR de cinomólogos de comprimento completo incluindo a seqüência sinal:

Iniciador 5' ATG: 5'-TCTTCGGGAAGCAGCTATGC-3' (SEQ ID

NO: 135) Iniciador 3' STOP: 5'- TCATGCTCCAATAAATTCACTG -3' (SEQ

ID NO: 139)

Condições da PCR:

95°C/2 min, 40 ciclos: 95°C/30 s, 55°C/30 s, 72°C/3 min 30 s com uma incubação final a 72°C durante 5 min.

Iniciadores para a PCR aninhada que amplificam o EGFR de cinomólogos de comprimento completo e que incorporam os sítios de restrição Not e Xho:

E579 Cyn Not5' 5' - GGAGTCGGCGGCCGCACCATGCGACC CTCCGGGACGG-3 (SEQ ID NO: 140)

E580 Cyn Xho5’ 5’ - GCATGTGACTCGAGTCATGCTCCAATAA ATTCACTGC-3 (SEQ ID NO: 141)

Condições da PCR:

95°C/ 2 min, então 30 ciclos: 95°C/30 s de fusão, 55°C/30 s de anelamento, 72°C/3 min de alongamento. Após 30 ciclos, foi permitido que os produtos da PCR sofressem alongamento durante 10 min adicionais.

As reações da PCR foram realizadas com 0,5 μΙ_ de molde e 0,1 μΙ_ de Enzima Phusion, 0,4 μΙ_ de enzima FastStart em um volume total de 50 μΙ_ de tampão de reação com uma concentração final de 1x tampão FastStart, 0,2 mM de dNTP e 0,2 μΜ de cada iniciador.

Um fragmento de PCR com um comprimento aparente de aproximadamente 4000 pb foi obtido e clonado utilizando o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen, Part N0 4506-41) e sequenciado. As seqüências de DNA e de proteína do EGFR de cinomólogos clonado são mostradas na Figura 25 34. Um alinhamento das seqüências de proteínas de EGFR humano e de EGFR de cinomólogos exibia 99,2% de identidade de seqüência. Demonstração da reatividade cruzada do anticorpo entre EGFR Humano e de cinomólogos de comprimento completo através da análise de FACS.

Os EGFRs Humano e de cinomólogos de comprimento completo foram expressos na superfície de células CHO através de transfecção estável e as células foram testadas em relação à ligação a um conjunto de anticorpos diluídos em série para EGFR através da análise de FACS. As determinações foram feitas sob condições dependentes de KD) mantendo um excesso molar de anticorpo que era pelo menos 5 vezes maior que o número de moléculas de antígeno do EGFR expressas na superfície celular de um número fixo de células em todas as séries de diluição de anticorpo. Esta 5 configuração permitiu a análise de FACS do anticorpo que se liga na saturação completa do receptor para todas as concentrações de anticorpo testadas.

Sucintamente a análise de FACS quantitativa foi realizada em um BD FACS array Bioanalyzer System para determinar o número de moléculas de EGFR expressas na superfície de células CHO transfectadas com 10 qualquer um de EGFR Humano ou de cinomólogos de comprimento completo. A análise foi realizada através da titulação da IgG de Erbitux marcado com PE nas células e para determinar o número de moléculas de PE equivalente através da comparação com uma curva padrão feita partindo de partículas de calibração Rainbow com densidade de PE conhecida. A análise 15 quantitativa revelou que as células CHO transfectadas com EGFR exibiam aproximadamente 350.000 moléculas na superfície de cada célula. A seguir, diluições em série de 5 vezes de anticorpos da invenção começando em 5 nM foram comparadas através da incubação com 10.000 células CHO transfectadas com EGFR em volumes crescentes, permitindo um excesso molar 20 de anticorpo de pelo menos 5 vezes em relação ao antígeno de EGFR exibido na superfície em cada determinação. Os anticorpos foram incubados com as células durante 14 horas em um agitador, para promover a saturação total do antígeno em todas as concentrações de anticorpo testadas, enquanto o tampão de FACS foi adicionado 0,02% de NaN3 e a temperatura foi mantida 25 a 4°C para prevenir a internalização do receptor. Após a incubação, as células foram peletizadas a 1200 RPM durante 5 min a 4 0C e ressuspensas em 200 μι. de tampão de FACS. A seguir, as células foram coradas com um FcGamma PE anti-lgG Humana F(ab')2 de Cabra secundário diluído 1:500 e incubadas durante 30 min a 4°C em um agitador. Finalmente as células fo30 ram lavadas duas vezes em tampão de FACS e analisadas em um BD FACS array Bioanalyzer System com captura nas células CHO expressando EGFR exibindo propriedades de difusão uniforme para frente/lateral. Reagentes de FACS:

Partículas de calibração Rainbow: BD1 Cat. N0: 559123 Tampão de FACS: IxPBS + 2% de FCS + 0,02% de NaN3 FcGamma PE anti-lgG Humana F(ab')2 de Cabra: Jackson Im5 munoResearch, N0 de Cat. 109-116-170

O ensaio de ligação de FACS descrito foi utilizado para a determinação da reatividade cruzada dos anticorpos para EGFR IgG 992 e 1024 e comparada à de um anticorpo de controle IgG 1320, que não fazia reação cruzada com o EGFR de cinomólogos. Como mostrado na Figura 40 10 abaixo, o ensaio de FACS descrito era muito bom na discriminação de anticorpos exibindo boa reatividade cruzada entre EGFR Humano e de cinomólogos de comprimento completo (Figura 40A, IgG 992 e Figura 40B, IgG 1024) e anticorpos específicos à espécie que reconhecem apenas o EGFR Humano de comprimento completo (Figura 40C, IgG 1320). Partindo desta 15 análise foi concluído que ambas as IgGs 992 e 1024 exibiam excelente reatividade cruzada contra ambos os EGFRs Humano e de cinomólogos de comprimento completo expressos na superfície de células CHO transfectadas de forma estável. A diferença na ligação entre EGFR de cinomólgos e humano é surpreendente em vista do alto grau de similaridade de seqüência e enfatiza a 20 importância de testar os anticorpos em relação à ligação com a sequênciaalvo exata nos animais utilizados para estudos toxicológicos pré-clínicos. Exemplo 17. CIones homólogos a 992, 1024 e 1030

A seleção de clones de Anticorpos que se ligam ao EGFR, baseada em ensaios imunoabsorventes (ELISA e ensaios baseados em céluIas), levou à identificação de clones 992, 1024, 1030 como descrito nos exemplos anteriores. Também foram identificados clones específicos ao EGFR, homólogos a 992, 1024, 1030 (Tabela 12).

É esperado que os clones que pertencem ao mesmo grupo possuam a mesma especificidade de ligação, mas podem se ligar com afinidades diferentes. Portanto, os clones dentro de um grupo podem substituir um outro nas composições de anticorpos da presente invenção, contanto que as afinidades de ligação dos clones não difiram muito. Tabela 12 IGHV Grupo Nome do Gene IGHV Gene IGHJ CDR3 SEQ ID Número de Mutações somáticas clone NO mutações somáticas 992 1209 IGHV1S22*01 IGHJ4*01 CTRNGDYYISSGDAMDYW 110 4 H46P,G61 R,G76A,H90Q 1204 IGHV1S22*01 IGHJ4*01 CTRNGDYWSSGDAMDYW 111 5 H46P,G59D,G61R,G76A,H90Q 992 IGHV1S22*01 IGHJ4*01 CTRNGDYYVSSGDAMDYW 111 4 H46P,G61 R,G76A,H90Q 996 IGHV1S22*01 IGHJ4*01 CTRNGDYYVSSGDAMDYW 111 4 H46P,G61R,G76A,H90Q 1033 IGHV1S22*01 IGHJ4*01 CTRNG DYYVSSG DAM DYW 111 4 H46P,G61R,G76A,H90Q 1220 IGHV1 S22*01 IGHJ4*01 CTRNGDYYVSSGDAMDYW 111 4 H46P.G61 R,G76A,H90Q 1030 1195 IGHV5S9*01 IGHJ4*01 CARGSDGYFYAMDYW 112 12 K14R,M39L,T55S,S58G,G59V,Y62T,T63 Y,Y66-,Y67F,I78M,K84R,T86I 1030 IGHV5S9*01 IGHJ4*01 CARGS DGYFYAM DYW 112 12 M39L,K48R,T55S,S58G,G59V,Y62T,T63 Y,Y66-,Y67F,I78M,K84R,T86I 1034 IGHV5S12*01 IGHJ4*01 CARGSDGYFYAMDYW 112 12 M39L,T55S,I56T,S58G,G59V,Y62T,T63 Y,Y66-,Y67F,I78M,K84R,T86I 1194 IGHV5S9*01 IGHJ4*01 CARGSDGYFYAMDYW 112 12 M39L,T55S,S58G,G59V,Y62T,T63Y, Y66-,Y67F,D69G,I78M,K84R,T86I 980 IGHV5S12*01 IGHJ4*01 CARGSDGYFYAMDYW 112 11 M39L,T55S,S58G,G59V,Y62T,T63Y, Y66-,Y67F,I78M,K84R,T86I Tabela 12 - continuação IGHV Grupo Nome do Gene IGHV Gene IGHJ CDR3 SEQ ID Número de Mutações somáticas clone NO mutações somáticas 981 IGHV5S9*01 IGHJ4*01 CARGSDGYFYAMDYW 112 11 M39L,T55S,S58G,G59V,Y62T,T63Y, Y66-.Y67F, I78M, K84R.T86I 1246 IGHV5S9*01 IGHJ4*01 CARGSDGYFYAMDYW 112 11 M39L,T55S,S58G,G59V,Y62T,T63Y, Y66-,Y67F,I78M,K84R,T86I 1223 IGHV5S9*01 IGHJ4*01 CARGSDGYFYAMDYW 112 12 S32N,M39L,T55S,S58G,G59V,Y62T,T63 Y,Y66-,Y67F,I78M,K84R,T86I 1024 1031 IGHV1S128*01 IGHJ4*01 CARYYGYDDAMDYW 113 6 Y33H,K43Q,N57H,S74N,S84P,P94L 1036 IGHV1S128*01 IGHJ4*01 CARYYGYDDAMDYW 113 6 Y33H,K43Q,N57H,S74N,S84P,P94L 1042 IGHV1S128*01 IGHJ4*01 CARYYGYDDAMDYW 113 6 Y33H,K43Q,N57H,S74N,S84P,P94L 984 IGHV1S128*01 IGHJ4*01 CARYYGYDDAMDYW 113 7 Y33H,K43Q,N57H,S74N,T79A,S84P, P94L 1024 IGHV1S128*01 IGHJ4*01 CVRYYGYDEAMDYW 114 7 K14E,A17G,Y33H,N60S,T63N,L91F,P94L 1210 IGHV1S128*01 IGHJ4*01 CVRYYGYDEVMDYW 115 7 K14E,A17G,Y33H,N60S,T63N,L91F,P94L 1217 IGHV1S128*01 IGHJ4*01 CVRYYGYDEVMDYW 115 7 K14E, A17G.Y33H, N60S,T63N, L91F1P94L 1221 IGHV1S128*01 IGHJ4*01 CVRYYGYDEVMDYW 115 7 K14E,A17G,Y33H,N60S,T63N,L91F,P94L Tabela 12 - continuação IGHV Grupo Nome do Gene IGHV Gene IGHJ CDR3 SEQID Número de Mutações somáticas clone NO mutações somáticas 992 1209 IGKV10-96*01 IGKJ 1*02 CQHYNTVPPTF 116 6 A25T,S30G,Y87F,S92N,L94V,I99V 1204 IGKV10-96*01 IGKJ 1*02 CQHYNTVPPTF 116 6 A25T,S30G,Y87F,S92N,L94V,I99V 992 IGKV10-96*01 IGKJ 1*02 CQHYNTVPPTF 116 6 A25T,S30G,Y87F,S92N,L94V,I99V 996 IGKV10-96*01 IGKJ1*02 CQHYNTVPPTF 116 7 T8A, A25T, S30G, Y87F, S92 N, L94V, 199 V 1033 IGKV10-94*03 IGKJ2*01 CQQFTTSPFTF 117 8 A25T,I29V,S30G,Y87F,N93S,L94M,P96 G.I99V 1220 IGKV10-96*01 IGKJ 1*02 CQHYNTVPPTF 118 6 A25T,S30G,Y87F,S92N,L94V,I99V 1030 1195 IGKV3-12*01 IGKJ2*01 CQHSREFPLTF 119 3 K27Q,Y36F,Q44L 1030 IGKV3-12*01 IGKJ2*01 CQHSREFPLTF 119 2 Y36F.Q44L 1034 IGKV3-12*01 IGKJ2*01 CQHSREFPLTF 119 2 Y36F.Q44L 1194 IGKV3-12*01 IGKJ2*01 CQHSREFPLTF 119 2 Y36F,Q44L 980 IGKV3-12*01 IGKJ2*01 CQHSREFPLTF 119 3 Y36F,Q44L,Q48R 981 IGKV3-12*01 IGKJ2*01 CQHSREFPLTF 119 3 Y36F,Q44L,H92Y 1246 IGKV3-12*01 IGKJ2*01 CQHSREFPLTF 119 2 Y36F.Q44L 1223 IGKV3-12*01 IGKJ2*01 CQHSREFPLTF 119 2 Y36F.Q44L Tabela 12 - continuação IGHV Grupo Nome do Gene IGHV Gene IGHJ CDR3 SEQ ID Número de Mutações somáticas clone NO mutações somáticas 1024 1031 IGKV2-109*01 IGKJ2*01 CAQNLELPYTF 120 0 1036 IGKV2-109*01 IGKJ2*01 CAQNLELPYTF 120 1 T85A 1042 IGKV2-109*01 IGKJ2*01 CAQNLELPYTF 120 1 G84R 984 IGKV2-109*01 IGKJ2*01 CAQNLELPYTF 120 0 1024 IGKV2-109*01 IGKJ2*01 CAQNLELPYTF 120 0 1210 IGKV2-109*01 IGKJ2*01 CAQNLELPYTF 120 1 T17A 1217 IGKV2-109*01 IGKJ2*01 CAQNLELPYTF 120 0 1221 IGKV2-109*01 IGKJ2*01 CAQNLELPYTF 120 1 S32N 1218 IGKV2-109*01 IGKJ2*01 CAQNLELPYTF 120 0 Exemplo 18: Humanizacão dos anticorpos 922 e 1024

Todos os anticorpos contêm o potencial de ativar uma resposta antianticorpo humano. A resposta se correlaciona até alguma extensão com

o grau de "natureza humana" do anticorpo terapêutico aplicado. É possível 5 prever a imunogenicidade e dessa maneira o antianticorpo humano, mas há uma tendência em direção à preferência por anticorpos com um alto grau de natureza humana para uso clínico. A natureza humana dos anticorpos descritos na presente invenção pode ser aumentada através de um processo de humanização [Reichert JM. Monoclonal antibodies in the clinic. Nature Bio10 technol, 2001;19:819-822; Reichert JM1 Rosensweig CJ, Faden LB e Dewitz MC. Monoclonal antibodies successes in the clinic. Nature Biotechnol, 2005; 23:1073-1078],

A humanização de um mAb murino é em princípio conseguida através do enxerto das regiões de determinação da complementaridade (ΟΙ 5 DRs) nas regiões estruturais humanas (FRs) dos domínios de IGHV e IGKV com seqüência intimamente relacionada através de um procedimento comumente referido como enxerto de CDR (Jones PT, Dear PH, Foote J, Neuberger MS e Winter G. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature, 1986;321:522-525). Entretanto, o enxerto simples de CDR de apenas regiões hipervariáveis pode resultar em uma menor afinidade devido ao fato de que alguns aminoácidos ou regiões estruturais fazem contatos cruciais com o antígeno ou sustentam a conformação das alças da CDR que se ligam ao antígeno [Queen C, Schneider WP1 Selick HE, Payne PW, Landolfi NF, Duncan JF1 Avdalovic NM, Levitt M, Junghans RP e Waldmann TA. A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc Natl Acad Sci U.S.A, 1989; 86:10029-10033; Al-Lazikani B, Lesk AM e Chothia C. Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J Mol Biol, 1997;273:927-948], Consequentemente a humanização de anticorpos deve envolver o enxerto de ambas as alças de CDR das regiões variáveis derivadas do murino em uma estrutura humana quase homóloga enquanto são mantidos os resíduos estruturais murinos principais com influência documentada sobre a atividade de ligação ao antígeno (Winter, G. e W. J. Harris. "Humanized antibodies." Immunol. Today 14.6 (1993): 243-46). Vários métodos foram desenvolvidos e aplicados de forma bem-sucedida para conseguir a humanização enquanto que a afinidade e a função do anticorpo são mantidas (revisado em Almagro1 5 J. C. e J. Fransson. "Humanization of antibodies." Front Biosci. 13 (2008): 1619-33.). A humanização pode ser conseguida através de métodos lógicos, por exemplo, enxerto de CDR, remoldagem da superfície, super-humanização, otimização do conteúdo do filamento humano dos quais todos baseiam-se na construção de alguns candidatos a anticorpos humanizados. A 10 seqüência de aminoácidos dos candidatos baseia-se no entendimento e na previsão da estrutura do anticorpo e na contribuição dos aminoácidos individuais à ligação ao antígeno tanto diretamente quanto indiretamente através da estabilização da estrutura geral das regiões de interação com o antígeno. Geralmente, os candidatos têm que ser refinados e alguns aminoácidos mu15 tados de volta para o resíduo murino original porque cada anticorpo possui algumas limitações individuais inesperadas. É comum para os métodos que várias rodadas sucessivas de planejamento, teste e replanejamento possam ser necessárias para manter a afinidade e as funções. As alternativas são os métodos mais empíricos em que bibliotecas combinatórias grandes são ge20 radas e os anticorpos com as características desejadas são enriquecidos partindo do grupo de variantes através de uma seleção por métodos tal como exibição em levedura ou em fago ou métodos de seleção alternativos.

Os anticorpos anti-EGFR descritos na presente invenção podem ser humanizados através do enxerto de CDR nas regiões V humanas. No 25 cenário preferido, a região V humana é selecionada com base na homologia em relação à região V murina original. As regiões do gene V humano com outras características desejadas tal como baixa imunogenicidade também podem ser utilizadas. O presente exemplo descreve um método que será utilizado para a humanização dos anticorpos quiméricos anti-EGFR 992 e 30 1024. As seqüências humanizadas fornecidas na Figura 41A foram geradas através do enxerto das regiões CDR definidas do IMGT do 992 IGHV em IGHV1-46/IGHJ4 e do 992 IGKV em IGKV1-27/IGKJ1-01. As seqüências de aminoácidos fornecidas na Figura 41B foram geradas in silico através do enxerto das regiões CDR definidas do IMGT do 1024 IGHV em IGHV1- 2*02/IGHJ6*02 e do 1024 IGKV em IGKV2-28*01/IGKJ2*01. Os genes artificiais que codificam os anticorpos humanizados especificados são sintetiza5 dos e inseridos no vetor de expressão de mamífero. Os anticorpos são expressos, purificados e testados em relação à atividade como descrito no Exemplo 3. Após o teste inicial, a cinética de ligação dos anticorpos humanizados pode ser determinada através da ressonância de plasmônio de superfície como descrito no Exemplo 14. Similarmente, a ligação ao hEGFR ex10 presso na superfície de células pode ser determinada como descrito no Exemplo 15.

Se a atividade de ligação dos aminoácidos humanizados for significativamente menor que a observada para os anticorpos originais, um esquema de retromutação seqüencial será empregado para a regeneração da afinidade, partindo dos resíduos estruturais humanizados localizados na zona de Vernier ou dos resíduos propostos por sustentarem a estrutura das regiões CDR (Foote, J. e G. Winter. "Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops." J Mol.Biol. 224.2 (1992): 487- 99; Padlan, E. A. "Anatomy of the antibody molecule." Mol.Immunol 31.3 (1994): 169-217.). Estes resíduos estão na numeração do IMGT para o 992 IGHV nos números de aminoácidos 13, 45 e 80; 992 IGKV aminoácido 25; 1024 IGHV aminoácidos 13, 45, 80 e 82; 1024 IGKL aminoácido 78. Estes mutantes podem ser construídos através da utilização da mutagênese direcionada ao sítio mediada pela PCR utilizando métodos de biologia molecular padronizados. Os mutantes construídos serão testados como descrito anteriormente. É esperado que estes conjuntos de candidatos resultem em anticorpos humanizados com as propriedades de ligação ao antígeno mantidas. Entretanto, retromutações adicionais ou a maturação da afinidade através da introdução de substituições de aminoácidos nas regiões CDR através da mutagênese direcionada ao sítio não pode ser excluída.

Exemplo 19 Anticorpo com domínio variável dual

Uma proteína de anticorpo com domínio variável dual (DVD) é engenheirada através da fusão dos domínios de IGHV de 992 e 1024 em tandem com um Iigante de 6 aminoácidos (ASTKGP) e dos domínios de IGKV de 992 e 1024 com um Iigante de 5 aminoácidos (TVAAP) [Wu C1 Ying H1 Grinnell C1 Bryant S, Miller R, Clabbers A, Bose S, McCarthy D, Zhu RR, Santora L, vis-Taber R, Kunes Y1 Fung E, Schwartz A, Sakorafas P, Gu J, Tarcsa E1 Murtaza A e Ghayur T. Simultaneous targeting of multiple disease mediators by a dual-variable-domain immunoglobulin. Nature Biotechnol1 2007;25:1290-1297], As fusões dos domínios duais de IGHV e IGKV são seguidas pelos domínios de IGHC e IGKC1 respectivamente. Em um anticorpo DVD de comprimento completo (992L1024), os IGHV e IGKV do 992 são N-terminais, seguidos pelo Iigador e os IGHV e IGKV do 1024, respectivamente. Em um segundo anticorpo DVD de comprimento completo (1024L992), os IGHV e IGKV do 1024 são N-terminais, seguidos pelo Iigador e os IGHV e IGKV do 992, respectivamente. O DNA plasmideal que codifica os anticorpos 992 e 1024 é utilizado como molde para uma construção mediada pela PCR em duas etapas dos genes que codificam DVD. As duas regiões codificadoras do domínio variável de IGHV e IGKV são primeiramente amplificadas separadamente de forma que contenham regiões de extensão sobrepostas na posição da região codificadora do Iigador (para o molde e as combinações de iniciadores, vide a Tabela 13 e a Tabela 14). O Gene IGKV que codifica o domínio variável proximal no terminal C é amplificado de forma que o gene que codifica o domínio constante da cadeia leve humana (IGKC) é incluído na seqüência codificadora. As seqüências codificadoras e as seqüências de aminoácidos das subunidades dos anticorpos com domínio variável dual são mostradas no Apêndice 3.

A primeira PCR é preparada com a mistura a seguir em cada tubo (reações de 50 μΙ_) para a obtenção da concentração final determinada:

1 x tampão FastStart (Roche), mistura de dNTPs (200 μΜ cada), iniciadores (10 pmoles cada) (vide a Tabela 14), FastStart High Fidelity Enzyme Blend (2,2 U; Roche) e 100 ng de molde do plasmídeo (vide a Tabela 14). A PCR foi submetida ao ciclo térmico a seguir: 2 min a 95°C, 20 x (30 s a 95°C, 30 s a 55°C, 1 min a 72°C), 10 min a 72°C. Os produtos resultantes da PCR com o tamanho correto provenientes da primeira reação da PCR (vide a Tabela 14) são purificados através da eletroforese preparatória em gel de agarose e utilizados em uma segunda etapa em que os dois domínios variáveis são unidos através da PCR com extensão por sobreposição. A segunda PCR1 5 união dos fragmentos de DNA através da PCR com extensão por sobreposição, é preparada com a mistura a seguir em cada tubo (reações de 50 μ!_) para a obtenção da concentração final determinada: 1x tampão FastStart (Roche), mistura de dNTPs (200 μΜ cada), iniciadores (10 pmoles cada, vide a Tabela 15), FastStart High Fidelity Enzyme Blend (2,2 U; Roche) e mol10 de (100 ng de fragmento de PCR, vide a Tabela 15). A PCR foi submetida ao ciclo térmico que é definido anteriormente. Os produtos resultantes da segunda etapa de PCR são purificados através da eletroforese preparatória em gel de agarose e tratados com enzimas de restrição, >4scl e Xho\ para o IGHV dual e NheI e Λ/ofl para o IGKV dual (IGKC inclusive). Os fragmentos 15 são ligados de forma consecutiva em um vetor de expressão de IgG de mamífero, 00-VP-002 (Figura 4), através de procedimentos padronizados de digestão com enzimas de restrição e ligação. O vetor plasmideal de expressão resultante é amplificado em E. coli e a preparação de plasmídeos é purificada através de métodos padronizados. Os anticorpos DVD são expressos 20 e purificados como no Exemplo 2 e caracterizados em relação à atividade como nos Exemplos 3-13.

Outros Iigadores podem ser testados se os anticorpos resultantes exibirem ligação reduzida ou nenhuma ao hEGFr-alvo. Tabela 13: Iniciadores para a construção de anticorpos DVD partindo de 992 e 1024 SEQ ID NO Nome do iniciador Seqüência 121 3'J H GGAGGCGCTCGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGAC 122 992_5'VH CCAGCCGGGGCGCGCCGAGGTCCAACTGCAGCAACCTGGGTCTGAGCTGGTG 123 1024_5'VH CCAGCCGGGGCGCGCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTG 124 992_5'VK catgggaatagctagccGACATT CAGAT GACT CAGACTACATCCTCCCT G 125 1024_5'VK catgggaatagctagccGACATCGT GAT GACACAAGCT GCATT CT CCAAT C 126 Kappa3' ACCGCCTCCACCGGCGGCCGCTTATTAACACTCTCCCCTGTTG 127 992H03' CT GGGGGCCCTT GGTGCTGGCT GACGAGACGGT GACT GAGGTT C 128 1024H_05' GCC AGCACC AAGGGCCCCC AGGT CCAACT GC AGC AGC 129 1024H03' CGGGGCCCTTGGTGCTGGCTGACGAGACGGTGACTGAG 130 992H_05' GCCAGCACCAAGGGCCCCGAGGTCCAACTGCAGCAAC 131 992K_03' GT CTGGT GCAGCCACAGTT CGTTT GATTTCCAGCTTGGT G 132 1024K05' CGAACTGTGGCTGCACCAGACATCGTGATGACACAAGC 133 1024K03' GTCTGGIGCAGCCACAGTTCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCC 134 992K_05' CGAACT GTGGCT GCACCAGACATT CAGAT GACT CAGACTAC Tabela 14: Combinações de iniciadores e moldes para a 1- etapa de PCR

para a construção de genes que codificam DVD partindo de 992 e 1024

DVD Molde Iniciadores para Iniciadores para para a amplificação a amplificação PCR do Gene IGHV do Gene IGKV 1-etapa 1° produto 15 etapa 1° produto de PCR da PCR de PCR da PCR (tamanho pb) (tamanho pb) 992L1024 992 992_5'VH 992HO 992_5'VK 992KO 992H_03' (406 pb) 992K_03' (359 pb) 1024 1024H_05' H01024 1024K_05' K01024* 3'J H (381 pb) Kappa3' (702 pb) 1024L992 992 992H_05' H0992 992K_05' K0992 3'JH (393 pb) Kappa3' (687 pb) 1024 1024_5'VH 1024HO 1024_5'VK 1024KO* 1024H_03' (392 pb) 1024K_03' (374 pb) *A seqüência codificadora amplificada inclui o gene IGKC.

Tabela 15: Combinações de iniciadores e moldes para a 2- etapa de PCR1

ligação através da extensão em sobreposição, para a construção de genes

que codificam DVD partindo de 992 e 1024

IGHV IGKV DVD Molde Iniciadores Produto Molde Iniciadores Produto (Pb) (Pb) 992L1024 992HO 992_5'VH 766 992KO 992_5'VK 1040 H01024 3'JH K01024 Kappa3' 1024L992 H0992 1024_5'VH 766 K0992 1024_5'VK 1040 1Q24HO 3'JH 1024KQ Kappa3' Exemplo 20: Estudo de Toxicidade com Administração Intravenosa de 6

Semanas em Combinação com Erbitux no Macaco cinomólogos

Obietivo do estudo: O objetivo do estudo era determinar a toxicidade do artigo de teste, 992+1024, após a administração intravenosa uma vez por semana ao macaco cinomólgos durante 6 semanas.

Uma vez que a toxicidade é um fator Iimitante da dose na prática clínica com inibidores de EGFR como Erbitux e Vectibix, foi considerado importante em um estágio inicial avaliar a capacidade de tolerância de 992+1024 em uma dose clinicamente relevante. Isto foi enfatizado pelo fato de que 992+1024 parece estar agindo através de um mecanismo diferente que os outros produtos que se direcionam ao EGFR. Isto poderia potencial5 mente levar a novos efeitos adversos ou a uma piora dos efeitos observados com outros inibidores de EGFR.

Grupos de três fêmeas de macacos cinomólgos foram tratados com doses IV semanais de 992+1024 a 4/2,7 e 12/8 mg/kg e 12/8 mg/kg de Erbitux durante 6 semanas. As primeiras doses de 4 e 12 mg/kg sendo do10 ses de carga e 2,7 e 8 mg/kg sendo doses de manutenção administradas 5 vezes. A dose de 12/8 mg/kg é equivalente à dose clínica humana de Erbitux administrada na prática clínica.

Planejamento do Estudo

Número Descrição do Nível da Volume Números do grupo Dose da dose de animais grupo (mg/kg/dia) (mL/kg) Fêmeas 1 Controle 0 19/12# 1-3 2 992+1024 Baixo 4,2/2,7# 19/12# 4-6 3 992+1024 Alto 12,6/8# 19/12# 7-9 4 Erbitux 12,6/8# 19/12# 10-12 # O primeiro nível de dose é para a dose de carga, o segundo nível de dose é para a administração do Dia 8 em diante.

Os parâmetros a seguir foram acompanhados durante o estudo: Mortalidade, Sinais clínicos, Pesos corporais, Consumo de alimentos, Hematologia, Química clínica, Pesos dos órgãos, Observações macroscópicas. Resultados

Mortalidade: Não houve mortes não programadas durante o

curso do estudo.

Sinais clínicos: Nenhuma observação clínica adversa relacionada ao tratamento

Pesos corporais: Não havia efeito do tratamento com 992+1024 ou Erbitux sobre o peso corporal. Consumo de alimentos: Não havia efeitos óbvios sobre o consumo de alimentos.

Hematologia: Não havia efeitos sobre os parâmetros hematológicos que sugerissem um efeito do tratamento com 992+1024 ou Erbitux.

Química clínica: Não havia alterações nos parâmetros químicos

clínicos que sugerissem um efeito do tratamento com qualquer um dos artigos de teste.

Na Semana 4, um animal que recebeu dose de 4,2/2,7 mg/kg de 992+1024/dia tinha níveis maiores de aspartato aminotransferase e alanina 10 aminotransferase, em comparação aos valores pré-tratamento. Estes níveis voltaram para as faixas normais na Semana 6. Na ausência de um efeito similar em outros animais tratados, a significância toxicológica deste aumento nas enzimas do fígado é desconhecida.

Pesos dos órgãos: Não havia diferenças de significância toxicológica nos pesos dos órgãos entre os animais tratados e os de controle.

Observações macroscópicas: Não havia observações coerentes notadas na necropsia para sugerir um efeito de 992+1024 ou do Erbitux.

Conclusão preliminar: Os dados preliminares mostram que 992+1024 era bem-tolerado nas doses testadas e não foram observados quaisquer efeitos adversos relacionados ao tratamento.

Exemplo 21. Inibição do crescimento de linhagens de câncer de células pulmonares.

É sabido que as linhagens de células cancerosas pulmonares expressam EGFR com mutações no domínio da tirosina quinase (Steiner e 25 outros Clin Cancer Res 13.5 (2007): 1540-51). Através de um método similar ao utilizado no exemplo 6, foi investigada a capacidade de uma combinação dos dois anticorpos 992 e 1024 de inibir o crescimento das linhagens de células cancerosas pulmonares HCC827 e H1975 que possuem mutações diferentes de EGFR.

Resultados

Como pode ser observado na Tabela 16 e na Tabela 17, a combinação de 992 e 1024 é capaz de inibir o crescimento de ambas as linhagens de células. A combinação é superior aos anticorpos monoclonais 992 e 1024 e ao Vectibix. Tabela 16: Valores de IC50 e inibição máxima do crescimento dos anticorpos indicados contra a linhagem de células HCC827

HCC827 IC50 (pg/mL) Inibição máxima Erbitux 0,013 80% Vectibix 0,100 60% 992 0,050 80% 1024 0,034 40% 992+1024 0,031 80% Tabela 17: Valores de IC50 e inibição máxima do crescimento dos anticorpos indicados contra a linhagem de células H1975

H1975 IC50 (pg/mL) Inibição máxima Erbitux 0,010 30% Vectibix 0,141 30% 992 0,056 30% 1024 - 0% 992+1024 0,024 30% Apêndice 1. Seqüências da região variável do anticorpo >992VH (seq. N0 24)

cgcgccgaggtccaactgcagcaacctgggtctgagctggtgaggcctggagcttcagtgaagctgtcct 10 gcaaggcttctggctacacattcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggcct tgagtggattgggaatatttatcctggtagtcgtagtactaactacgatgagaagttcaagagcaaggcc acactgactgtagacacatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaggactctg cggtctattactgtacaagaaatggggattactacgttagtagcggggatgctatggactactggggtca aggaacctcagtcaccgtctcg 15 >1024VH (seq. N0 25)

cgcgcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtggagcctgggggttcagtgaagctgtcct

gcaaggcttctggctacaccttcaccagtcactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggcct

tgagtggataggtgagattaatcctagcagcggtcgtaataactacaatgagaagttcaagagtaaggcc

acactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaattcagcagcctgacatctgaggactctg cggtctattattgtgtaagatactatggttacgacgaagctatggactactggggtcaaggaacctcagt

caccgtctcg

>1030VH (Seq. N0 26)

cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcct 5 gtgcagcctctggattcactttcagtagttatgccctgtcttgggttcgccagactccagagaggaggct ggagtgggtcgcatccattagtggtgttggtagcacctactttccagacagtgtgaagggccgtttcacc atgtccagagataatgccaggaacatcctgtacctccaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggcca tgtattactgtgcaagaggttctgatggttacttctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagt caccgtctcg 10 >1042VH (seq. N0 27)

cgcgcccaggtgcagcttcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcct gtaaggcttctggctacaccttcaccagccactggatgcactgggtgcagcagaggcctggacaaggcct tgagtggattggagagattcatcctagcaacggtcgtactaactacaatgagaagttcaagaacaaggcc acactgactgtagacaaatctcccagcacagcctacatgcaactcagcagtttgacatctgaggactctg 15 cggtctattactgtgcaagatactatggttacgacgatgctatggactactggggtcaaggaacctcagt caccgtctcg

>1208VH (Seq. N0 28)

cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcct gtgcagcctctggattcgctttcagtagctatgacatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggct 20 ggagtgggtcgcatacattggtagtggtgatgataatacccactatccagactctgtgaagggccgattc accatctccagacacaatgccaaaaacaccctatacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacag ccatgtattactgtgcaagacagaagtatggtaactacggggacactatggactactggggtcaaggaac ctcagtcaccgtctcg >1229\VH (Seq. N0 29)

cgcgcccaggttcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcactt gctctgtctctggtttttcattaaccatctatggtgtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtct ggagtggctgggagttatgtgggctggtggaaatacagattataattcggctctcatgtccagactgaac atcagcaaggacaattccaagagccaagttttcttaaaagtgaacagtctacaaactgatgacacagcca tgtactattgtaccagagatcccgatggttactacgtggggtggttcttcgatgtctggggcgcggggac 30 cacggtcaccgtctcg

>1254VH (Seq. N0 30)

cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcct gtgcagcctctggattcgcttacagtacctatgacatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggct ggagtgggtcgcatacattagtagtggtggtgatgccgcctactatcccgacactgtgaagggccgattc accatctccagagacaatgccaaaaacaccctatacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacag ccatgtattactgtgcgaggtctcgctatggaaactacggggacgctatggactactggggtcaaggaac ctcagtcaccgtctcg

>1257VH (Seq. N0 BI)

cgcgccgaggtccagctgcaacagtctggacctgagctggtgaaacctggggcttcagtgaagataccct gcaagacttctggatacactttcactgactacaacatggcctgggtgaagcagagccatggaaagagcct tgagtggattggagatattattcctaacaatggtggtgctatctacaaccagaaattcaagggcaaggcc 10 actttgactgtagacaaatcctccagtacagcctccatggagctccgcagcctgacatctgaggacactg cagtctatttctgtgcaagaaagaatatctactataggtacgacggggcaggtgctctggactactgggg tcaaggaacctcagtcaccgtctcg >1260vh (seq. N0 32)

cgcgcccaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcactt gcactgtctctgggttttcattaaccacctatggggtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtct ggagtggctgggagtaatatgggctggtggaagcacaaattataattcggctctcatgtccagactgagc atcaagaaagacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagcca tgtactactgtgccagagcctatggttacaactttgactattggggccaaggcaccactctcacagtctc

9

>1261VH (Seq. N0 33)

cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcct gtgcagtctctggattcactttcagtagctatgtcatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggct ggagtgggtcgcaaccattactagtggtggtaggaacatctactatctagacagtgtgaaggggcgattc actatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacgg 25 ccatgtattactgtgcaagacatgaggactataggtacgacggttactatgctatggactactggggtca aggaacctcagtcaccgtctcg >1277VH (Seq. N0 34)

cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagagtccttgaaactctcct gtgcagcctctggattcgctttcagttactctgacatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggct ggagtgggtcgcatacatgagtagtgctggtgatgtcaccttctattcagacactgtgaagggccgattc accatctccagagacaatgccaagaacaccctgtatctgcaagtgagcagtctgaagtctgaggacacag ccatatattactgtgtaagacaccgggacgtggctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgt ctcg

>1284VH (Seq. N0 35)

cgcgcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcct gcaaggcttctggctacaccttcaccagcgactggatgcactggatgaaacagaggcctggacaaggcct 5 tgagtggattggagagattaatcctagtaacggtcgctctagctacaatgagaagttcaagagcaaggcc acactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctg cggtctattactgtgcaagaataggtggtatctacgtggagacttactggggccaagggactctggtcac tgtctcg

>1308VH (Seq. N0 36)

cgcgccgaggtccagcttcagcagtctggagctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcct gcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaggcagaggcctggacagggtct tgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtagagcc acactgactgcaaacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctaacatctgaggactctg cggtctatttctgtgcaagaagggcatcttccctctatgatgtttacccctactactttgactactgggg 15 ccaaggcaccactctcacagtctcg >1320VH (seq. N0 37)

cgcgcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcaatgaagctgtcct gcaaggcttctggctacaccttcaccaactactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggcct tgaatggattggagaaattaatcctagcaacggtcgtactaattacaatgagaagttcaagagcaaggcc 20 acactgactgtagacaaatcgtccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctg gggtctattactgtgcaaaaggggggaactactatgattacgactgggactactggggccaaggcaccac tctcacagtctcg >1344VH (Seq. N0 38)

cgcgcccaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcactt gcactgtctctgggttttcattaaccatctatggtgtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtct ggagtggctgggagtaatatgggctggtggaaacacaaattataattcggctctcatgtccagactgagc atcagcaaagacaactccaagagtcaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagcca tgtacttctgtgccagaggctatggctacaatttagactattggggccaaggcaccactctcacagtctc

9

>1347VH (Seq. N0 39)

cgcgcccaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacat

gcaccgtctcaggattctcattaaccggccatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtct ggagtggctgggaatgatatggggtgatggaagcacggactataattcaactctcaaatccagactgagt atcagcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcagactgatgacaccgcca ggtactactgtgccagaggctacggctacctttactactttgactactggggccaaggcaccactctcac agtctcg >992VH (Seq. N0 40)

RAEVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSRST

NYDEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRNGDYYVSSGDAMDYWGQGTS

VTVS

>1024VH (seq. N0 41)

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RAQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSHWMHWVQQRPGQGLEWIGEIHPSNGRT NYNEKFKNKATLTVDKSPSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYGYDDAMDYWGQGTSVTVS >1208vh (Seq. N0 44)

RAEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYIGSGDDNT HYPDSVKGRFTISRHNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARQKYGNYGDTMDYWGQGTSVT VS

>1229vh (Seq. N0 45)

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YNSALMSRLNISKDNSKSQVFLKVNSLQTDDTAMYYCTRDPDGYYVGWFFDVWGAGTTVT

VS

>1254VH (Seq. N0 46)

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YYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARSRYGNYGDAMDYWGQGTSVT

VS

>1257VH (Seq. N0 47)

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IYNQKFKGKATLTVDKSSSTASMELRSLTSEDTAVYFCARKNIYYRYDGAGALDYWGQGT SVTVS

>1260vh (Seq. N0 48)

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RAEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSSYVMSWVRQTPEKRLEWVATITSGGRNI YYLDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARHEDYRYDGYYAMDYWGQGTS VTVS

>1277VH (Seq. N0 50)

RAEVQLVESGGGLVKPGESLKLSCAASGFAFSYSDMSWVRQTPEKRLEWVAYMSSAGDVT FYSDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQVSSLKSEDTAIYYCVRHRDVAMDYWGQGTSVTVS >1284VH CSeq. N0 51)

RAQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSDWMHWMKQRPGQGLEWIGEINPSNGRS SYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARIGGIYVETYWGQGTLVTVS >1308vh (Seq. N0 52)

RAEVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVRQRPGQGLEWIGQIYPGDGDT

NYNGKFKGRATLTANKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRASSLYDVYPYYFDYWGQGT

TLTVS

>1320VH (Seq. N0 53)

RAQVQLQQPGAELVKPGASMKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRT NYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSGVYYCAKGGNYYDYDWDYWGQGTTLTV S

>1344VH (Seq. N0 54)

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RAQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGHGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTD YNSTLKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARGYGYLYYFDYWGQGTTLTVS >992vl (Seq. N0 56)

ctagccgacattcagatgactcagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatca gttgcaggacaagtcaggacattggcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa actcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgga acagatttttctctcaccattaacaacgtggagcaagaggatgttgccacttacttttgccaacactata atacggttcctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgt cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga 5 gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc ttcaacaggggagagtgt >1024VL (Seq. N0 57)

ctagccgacatcgtgatgacacaagctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatct 10 cctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattggtatctgcagaagcc aggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcagt agcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttatt actgtgctcaaaatctagaacttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgt ggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtg 15 tgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgg gtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgac gctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcg cccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt >1030VL (Seq. N0 58)

ctagccgacattgtgctgactcagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccattt catgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttttatgcactggtaccaactgaaaccagg acagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggc agtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaagaggaggatgctgcaacctattact gtcagcacagtagggagtttccgttaacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgtggc 25 tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt 30 >1042VL (Seq. N0 59)

gatattgtgatgactcaggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgca

ggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattggtatctgcagaagccaggcca gtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcagtagcagt gggtcaagaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtg ctcaaaatctagaacttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgtggctgc accatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctg 5 ctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaact cccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgag caaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtc acaaagagcttcaacaggggagagtgt >1208VL (Seq. N0 60)

ctagccgatgttgtgatgactcagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatct cttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagcc aggccagtctccaaaactcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagt ggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatt tctgctctcaaagtacacatgttcccacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaacgaactgtggc 15 tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt 20 >1229VL (Seq. N0 61)

ctagccgacattgtgatgacccagtctcacaaattcatgtccacatcagtgggagacagggtcagcatca cctgcaaggccagtcaggatgtgactaatgccgtagcctggtatcaacaaaaaccaggacaatctcctaa actactgatttactgggcatccatccgacacactggagtccctgatcgcttcacaggcagtagatctggg acagattatactctcaccatcaacagtgtgcaggctgaagacctggccctttattattgtcagcaacatt 25 ataacactccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggaaataaaacgaactgtggctgcaccatctgt cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc 30 ttcaacaggggagagtgt >1254VL (Seq. N0 62)

ctagccgatgttgtgatgacacagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatct cttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggtaacacctatttacattggtacctgcagaagcc aggccagtctccaaagctcctgctctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagt ggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggagtctgaggatctgggagtttatt tctgctctcaaaatacacatgtgtacacgttcggaggggggacaaagttggaaataaaacgaactgtggc 5 tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt 10 >1257VL (Seq. N0 63)

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>1260VL (Seq. N0 64)

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>1277VL (Seq. N0 66)

ctagccgatgttgtgatgacccagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatct cttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagcc aggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagt 15 ggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatt tctgctctcaaagtacacatgttccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggc tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct 20 gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt >1284VL (seq. N0 67)

ctagccgacattgtgctaacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatct catgcagggccagccaaagtgtcagtacatctacctatagttatatgcactggtatcaacagaaatcagg 25 acagccacccaaactcctcatcaagtatgcatccaacctagagtctggggtccctgccaggttcagtggc agtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatactgcaacatattact gtcagcacagttgggagattccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggc tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta 30 actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt >1308vl (Seq. N0 68)

ctagccgacatccagatgacacaaactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatca gttgcagggcaagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa agtcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgga 5 acagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggta atacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgtggctgcaccatctgt cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga 10 ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc ttcaacaggggagagtgt >1320VL (Seq. N0 69)

ctagccgacattcagatgacccagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatca gttgcagtgcaagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa 15 actcctgatctatcacacatcaactttacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggg acagattattctctcaccatcagcaacctggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcaatata gtaagcttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgt cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga 20 gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc ttcaacaggggagagtgt >1344VL (Seq. N0 70)

ctagccgacattcagatgacacagactacttcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatta 25 gttgcagtgcaagtcagggcattagtaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa actcctgatctattacacatcaagtttacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggg acagattattctctcaccatcagcaacctggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcagtata gtaagcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgt cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac 30 ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc ttcaacaggggagagtgt >1347VL (Seq. N0 71)

ctagccgaaaatgtgctgactcagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaaaaggtcaccatga cctgcagggccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcaaaagtcaggtgcctcccc 5 caaactctggatttatagcacatccaacttggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtct gggacctcttactctctcacagtcaacagtgtggagactgaagatgctgccacttattactgccaccagt acagtggtttcccattcacgttcggctcggggaccaagctggagctgaaacgaactgtggctgcaccatc tgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaat aacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccagg 10 agagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagc agactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag agcttcaacaggggagagtgt >992VL (Seq. N0 72)

LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDIGNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGV PSRFSGSGSGTDFSLTINNVEQEDVATYFCQHYNTVPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1024VL (Seq. N0 73)

LADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSN LASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >103Ovl (Seq. N0 74)

LADIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSFMHWYQLKPGQPPKLLIYLASNL ESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPLTFGGGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1042VL (seq. N0 75)

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLA SGVPDRFSSSGSRTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1208VL (seq. N0 76)

LADWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPTFGGGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1229VL (seq. N0 77)

LADIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVTNAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASIRHTGV PDRFTGSRSGTDYTLTINSVQAEDLALYYCQQHYNTPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1254VL (Seq. N0 78)

LADWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLLYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVESEDLGVYFCSQNTHVYTFGGGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1257VL (Seq. N0 79)

LAQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPGSSPRLLIYDASNLASGVP VRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPITFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1260VL (Seq. N0 80)

LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGITNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYSSSLHSGV PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSEIPYTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1261VL (Seq. N0 81)

LAQIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVP ARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPYTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1277VL (Seq. N0 82)

LADWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPTFGGGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTVS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1284vl (seq. N0 83)

LADIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSTYSYMHWYQQKSGQPPKLLIKYASNL ESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPWTFGGGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1308vl (Seq. N0 84)

LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKVLIYYTSRLHSGV PSRFSGSGSGTDYSLTISN LEQEDIATYFCQQGNTL PYTFGGGTKL EIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1320VL (Seq. N0 85)

LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSTLHSGV PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1344VL (Seq. N0 86)

LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGV PSRFSGSGSGTDYSLTISN L EPEDIATYYCQQYSKL PYTFGGGTKL EIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTL S KADYEKH KVYAC EVTHQG L SS PVTKS FN RG EC >1347VL (Seq. N0 87)

LAENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASG VPARFSGSGSGTSYSLTVNSVETEDAATYYCHQYSGFPFTFGSGTKLELKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Apêndice 2. Seqüências da região constante do anticorpo >Região do IGKC humano (Seq. N0 88)

ttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataact

tctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagag tgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagac tacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagct tcaacaggggagagtgttaataagcggccgccggtggaggcggt >Região do IGKC humano (Seq. N0 89)

5 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Éxonl 1..298 íntron 299..689 Éxon2 690..734

íntron 735..852 Éxon3 853..1182 Íntron 1183..1279 Éxon4 1280..1602

>sequência genômica do domínio constante do IGHGl humano (Seq. N0 90) agtgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacag cggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccct gaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtg accgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacca aggtggacaagagagttggtgagaggccagcacagggagggagggtgtctgctggaagccaggctcagcg ctcctgcctggacgcatcccggctatgcagtcccagtccagggcagcaaggcaggccccgtctgcctctt cacccggaggcctctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggctttttccccaggctctg ggcaggcacaggctaggtgcccctaacccaggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctcagacctg ccaagagccatatccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactctccactccc tcagctcggacaccttctctcctcccagattccagtaactcccaatcttctctctgcagagcccaaatct tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggc gggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtccacctcca tctcttcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacac cctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtc aagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtaca acagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaa gtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggtgggacc cgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgaccgctgta ccaacctctgtccctacagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggaga tgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttc ttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtga 5 tgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga >IGHG1 (Seq. N0 91)

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Apêndice 3. Seqüências de anticorpo com domínio variável dual

>992Ll024\IGHV (Seq. N0 92)

ggcgcgccgaggtccaactgcagcaacctgggtctgagctggtgaggcctggagcttcagtgaagctgtc ctgcaaggcttctggctacacattcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggc cttgagtggattgggaatatttatcctggtagtcgtagtactaactacgatgagaagttcaagagcaagg ccacactgactgtagacacatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaggactc tgcggtctattactgtacaagaaatggggattactacgttagtagcggggatgctatggactactggggt caaggaacctcagtcaccgtctcgtcagccagcaccaagggcccccaggtccaactgcagcagcctgggg ctgaactggtggagcctgggggttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttcaccagtca ctggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggataggtgagattaatcctagcagc ggtcgtaataactacaatgagaagttcaagagtaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacag cctacatgcaattcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattattgtgtaagatactatggtta cgacgaagctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcgag >992L1024\IGKV (Seq. N0 93)

gctagccgacattcagatgactcagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatc agttgcaggacaagtcaggacattggcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgtta aactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgg aacagatttttctctcaccattaacaacgtggagcaagaggatgttgccacttacttttgccaacactat 30 aatacggttcctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccagaca tcgtgatgacacaagctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgcaggtc tagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattggtatctgcagaagccaggccagtct cctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcagtagcagtgggt caggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtgctca aaatctagaacttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgtggctgcacca tctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctga 5 ataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactccca ggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaa gcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaa agagcttcaacaggggagagtgttaataagcggccgc >1024L992\lGHV (Seq. N0 94)

ggcgcgcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtggagcctgggggttcagtgaagctgtc ctgcaaggcttctggctacaccttcaccagtcactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggc cttgagtggataggtgagattaatcctagcagcggtcgtaataactacaatgagaagttcaagagtaagg ccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaattcagcagcctgacatctgaggactc tgcggtctattattgtgtaagatactatggttacgacgaagctatggactactggggtcaaggaacctca 15 gtcaccgtctcgtcagccagcaccaagggccccgaggtccaactgcagcaacctgggtctgagctggtga ggcctggagcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacacattcaccagctactggatgcactg ggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattgggaatatttatcctggtagtcgtagtactaac tacgatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacacatcctccagcacagcctacatgcagc tcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtacaagaaatggggattactacgttagtag 20 cggggatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcgag >1024l992\IGKV (Seq. N0 95)

gctagccgacatcgtgatgacacaagctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatc tcctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattggtatctgcagaagc caggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcag 25 tagcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttat tactgtgctcaaaatctagaacttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactg tggctgcaccagacattcagatgactcagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcac catcagttgcaggacaagtcaggacattggcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaact gttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggt 30 ctggaacagatttttctctcaccattaacaacgtggagcaagaggatgttgccacttacttttgccaaca ctataatacggttcctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcacca tctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctga ataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactccca ggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaa gcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaa agagcttcaacaggggagagtgttaataagcggccgc >992l1024\IGHV (Seq. N0 96)

RAEVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSRST

NYDEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRNGDYYVSSGDAMDYWGQGTS

vtvssastkgpqvqlqqpgaelvepggsvklsckasgytftshwmhwvkqrpgqglewig

EINPSSGRNNVNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCVRWGYDEAMDYW GQGTSVTVS

>992L1024\IGKV (Seq. N0 97)

LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDIGNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGV PSRFSGSGSGTDFSLTINNVEQEDVATYFCQHYNTVPPTFGGGTKLEIKRTVAAPDIVMT QAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPD 15 RFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >1024l_992\lGHV (Seq. N0 98)

RAQVQLQQPGAELVEPGGSVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSSGRN NYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCVRYYGYDEAMDYWGQGTSVTVS SASTKGPEVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIYP GSRSTNYDEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRNGDYYVSSGDAMDYW GQGTSVTVS

>1024l_992\lGKV (Seq. N0 99)

LADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSN LASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKRTVAAP DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDIGNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPS RFSGSGSGTDFSLTINNVEQEDVATYFCQHYNTVPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT 30 LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Claims (86)

1. Composição de anticorpos recombinantes que compreende pelo menos 3 moléculas de anticorpo anti-EGFR distintas, em que os anticorpos se ligam a um primeiro, um segundo e um terceiro epitopos distintos de EGFR.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que os epitopos são não-sobrepostos.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos uma molécula de anticorpo distinta é capaz de inibir a ligação do EGF.

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos uma molécula de anticorpo distinta é capaz de prevenir a fosforilação de EGFR.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos uma molécula de anticorpo distinta é capaz de aumentar a internalização/degradação de EGFR.

6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, que compreende pelo menos uma molécula de anticorpo anti-EGFR distinta adicional, em que o dito anticorpo adicional se liga a um quarto epitopo distinto.

7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 6, que compreende pelo menos uma molécula de anticorpo anti-EGFR distinta adicional, em que o dito anticorpo adicional se liga a um quinto epitopo distinto.

8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, que compreende pelo menos uma molécula de anticorpo anti-EGFR distinta adicional, em que o dito anticorpo adicional se liga a um sexto epitopo distinto.

9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, que compreende pelo menos um anticorpo para o domínio Ille pelo menos um anticorpo para o domínio l/ll.

10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, que compreende pelo menos dois anticorpos para o domínio Ill e um anticorpo para o domínio I.

11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, que compreende pelo menos dois anticorpos para o domínio III, tais como pelo menos três anticorpos para o domínio III.

12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, que compreende pelo menos um anticorpo que é capaz de aumentar a ligação de pelo menos um anticorpo adicional a um epitopo distinto diferente.

13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que os anticorpos são anticorpos quiméricos com cadeias variáveis murinas e cadeias constantes humanas.

14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13, em que a cadeia constante humana é IgGI ou lgG2.

15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um anticorpo é um anticorpo humanizado.

16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um anticorpo é um anticorpo humano.

17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o EGFR é selecionado do grupo que consiste em EGFR humano, EGFR humano mutado e variações de deleção de EGFR humano.

18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 17, em que o EGFR é EGFR tanto humano quanto de primata não-humano.

19. Composição de anticorpos recombinantes que compreende pelo menos 2 moléculas de anticorpos para EGFR distintas, em que uma molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste em anticorpos que possuem as CDRs dos anticorpos: 992, 1024, 1030, 1042, 1208, 1229, 1254, 1257, 1260, 1261, 1277, 1284, 1308, 1320, 1344 e 1347.

20. Composição de anticorpos recombinantes de acordo com a reivindicação 19, em que pelo menos uma molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste em anticorpos que possuem as CDRs dos anticorpos 992, 1030, 1024, 1347, 1277, 1254, 1320, 1260, 1261 e 1284.

21. Composição de anticorpos recombinantes de acordo com a reivindicação 19, em que duas moléculas de anticorpos para EGFR distintas são selecionadas do grupo de combinações que consistem em anticorpos com as CDRs dos anticorpos: 992+1030, 992+1024, 992+1042, 992+1320, 1277+1024.

22. Composição de anticorpos que compreende pelo menos 2 moléculas de anticorpos anti-EGFR humano distintas, a. em que uma primeira molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 992, um anticorpo que compreende as seqüências da VL (aminoácidos 3-109 da SEQ ID NO: 72) e da VH (aminoácidos 3-124 da SEQ ID NO: 40) do anticorpo 992, um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 992 (SEQ ID NO: 116 e 111), um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 992 e um anticorpo capaz de inibir a ligação do anticorpo 992 ao EGFR humano; e b. em que uma segunda molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 1024, um anticorpo que compreende as seqüências da VL (aminoácidos 3-114 da SEQ ID NO: 73) e da VH (aminoácidos 3-120 da SEQ ID NO: 41) do anticorpo 1024, um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 1024 (SEQ ID NO: 120 e 114), um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 1024 e um anticorpo capaz de inibir a ligação do anticorpo 1024 ao EGFR humano.

23. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que a. a dita primeira molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 992, um anticorpo que compreende as seqüências da VL e da VH do anticorpo 992, um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 992 e um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 992; e b. a dita segunda molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 1024, um anticorpo que compreende as seqüências da VL e da VH do anticorpo 1024, um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 1024 e um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 1024.

24. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que a. a dita primeira molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 992, um anticorpo que compreende as seqüências da VL e da VH do anticorpo 992 e um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 992; e b. a dita segunda molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 1024, um anticorpo que compreende as seqüências da VL e da VH do anticorpo 1024 e um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 1024.

25. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que a. a dita primeira molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 992 e um anticorpo que compreende as seqüências da VL e da VH do anticorpo 992; e b. a dita segunda molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 1024 e um anticorpo que compreende as seqüências da VL e da VH do anticorpo 1024.

26. Composição de acordo com a reivindicação 22, que compreende os anticorpos 992 e 1024.

27. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que os primeiro e segundo anticorpos anti-EGFR não inibem a ligação ao EGFR humano de cada outro.

28. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que pelo menos um dos anticorpos é capaz de aumentar a capacidade de ligação máxima do outro anticorpo em relação ao EGFR humano.

29. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que a proporção do primeiro anticorpo em relação ao segundo anticorpo na composição está entre 5 e 95%, tal como entre 10 e 90%, preferencialmente entre 20 e 80%, mais preferencialmente entre 30 e 70, mais preferencialmente entre 40 e 60, tal como entre 45 e 55, tal como aproximadamente 50%.

30. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que os primeiro e segundo anticorpos são do isotipo IgGI ou lgG2.

31. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que o anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 992 é selecionado do grupo de anticorpos que compreende os clones de 1209, 1204, 992, 996, 1033 e 1220.

32. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que o anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 1024 é selecionado do grupo de anticorpos que compreende os clones de 1031, 1036, 1042, 984, 1024, 1210, 1217, 1221 e 1218.

33. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que o anticorpo que compreende a CDR3 do anticorpo 992 compreende adicionalmente a CDR1 e a CDR2 da VH e da VL do anticorpo 992.

34. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que o anticorpo que compreende a CDR3 do anticorpo 1024 compreende adicionalmente a CDR1 e a CDR2 da VH e da VL do anticorpo 1024.

35. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que o anticorpo que compete com o anticorpo 992 é selecionado do grupo que consiste nos anticorpos 1208, 1254 e 1277.

36. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que o anticorpo que compete com o anticorpo 1024 é selecionado do grupo que consiste nos anticorpos 1042 e 1320.

37. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que a composição não contém anticorpos anti-EGFR adicionais em adição ao primeiro e ao segundo anticorpos.

38. Composição de acordo com a reivindicação 22, que compreende ainda um terceiro anticorpo anti-EGFR distinto, em que a dita terceira molécula de anticorpo anti-EGFR distinta é selecionada do grupo que consiste no anticorpo 1030, um anticorpo que compreende as seqüências da VL (aminoácidos 3 a 114 da SEQ ID NO: 74) e da VH (aminoácidos 3-120 da SEQ ID NO: 42) do anticorpo 1030, um anticorpo que possui as CDR3s do anticorpo 1030 (SEQ ID NOs 112 e 119), um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 1030 e um anticorpo capaz de inibir a ligação do anticorpo 1030 ao EGFR humano.

39. Composição de acordo com a reivindicação 37, em que o dito terceiro anticorpo resulta em uma maior ligação ao EGFR humano do dito primeiro e/ou segundo anticorpo.

40. Composição de acordo com a reivindicação 37, em que o anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo 1030 é selecionado do grupo de anticorpos que consiste nos clones de 1195, 1030, 1034, 1194,980, 981, 1246 e 1223.

41. Composição de acordo com a reivindicação 37, em que o anticorpo que compreende a CDR3 do anticorpo 1030 compreende adicionalmente a CDR1 e a CDR2 da VH e da VL do anticorpo 1030.

42. Composição de acordo com a reivindicação 38, em que a composição não contém anticorpos anti-EGFR adicionais em adição aos ditos primeiro, segundo e terceiro anticorpos.

43. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que os anticorpos distintos são preparados para administração simultânea, sucessiva ou separada.

44. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que a composição leva à internalização do receptor.

45. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que a composição leva à regressão de tumores A431NS in vivo.

46. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que a composição é capaz de induzir a diferenciação terminal em células A431NS in vivo.

47. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que a composição é capaz de regular para mais a expressão da involucrina do tumor in vivo.

48. Molécula de ligação biespecífica que possui as especificidades de ligação da composição de anticorpos como definida na reivindicação 22.

49. Molécula de ligação biespecífica de acordo com a reivindicação 48, que compreende as CDRs dos anticorpos 992 e 1024.

50. Molécula de ligação biespecífica de acordo com a reivindicação 48, que é um anticorpo com domínio variável dual.

51. Molécula de ligação biespecífica de acordo com a reivindicação 48, que é um fragmento Fab biespecífico ou um scFV biespecífico.

52. Processo para a produção de composição de anticorpos que compreende: a) a transfecção de uma primeira população de células eucarióticas com um primeiro construto de expressão que codifica um primeiro anticorpo que compreende um primeiro par cognato de cadeias de Vh e Vl capaz de se ligar a um primeiro epitopo de EGFR distinto; b) a transfecção de uma segunda população de células eucarióticas com um segundo construto de expressão que codifica um segundo anticorpo que compreende um segundo par cognato de cadeias de Vh e Vl capaz de se ligar a um segundo epitopo de EGFR distinto; c) a repetição opcional da etapa b) para as terceiras ou populações adicionais, construtos de expressão, pares cognatos e epitopos de EGFR; d) a seleção da primeira, da segunda e opcionalmente populações de células adicionais transfectadas; e) a combinação das populações transfectadas em um recipiente para a obtenção de um banco de células; f) o cultivo das células partindo do banco de células sob condições que permitem a expressão dos anticorpos; e g) a recuperação e a purificação da composição de anticorpos do sobrenadante.

53. Processo de acordo com a reivindicação 52, em que a composição de anticorpos é uma composição de anticorpos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

54. Processo de acordo com a reivindicação 52, em que as céluIas são transfectadas com integração específica ao sítio.

55. Processo de acordo com a reivindicação 52, em que as cadeias de VH e de VL são murinas e as regiões constantes dos anticorpos são humanas.

56. Processo de acordo com a reivindicação 55, em que todos os anticorpos compreendem a mesma região constante de cadeia pesada.

57. Banco de células que compreende pelo menos duas subpopulações de células eucarióticas; cada subpopulação transfectada ou transduzida com um construto de expressão que codifica um anticorpo que compreende um par cognato de cadeias de Vh e Vl capaz de se ligar a um epitopo de EGFR distinto.

58. Banco de células de acordo com a reivindicação 57, em que o banco de células codifica uma composição de anticorpos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

59. Banco de células de acordo com a reivindicação 57, em que as células são transfectadas utilizando integração específica ao sítio.

60. Processo de redução da sinalização do EGFR que compreende a administração a uma composição de células que expressam EGFR de uma composição de anticorpos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou da molécula de ligação biespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 51 e a redução da sinalização do EGFR.

61. Processo para matar células que expressam EGFR que compreende a administração a uma composição de células que expressam EGFR de uma composição de anticorpos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou da molécula de ligação biespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 51 e a morte das células que expressam EGFR.

62. Processo de indução da apoptose em células que expressam EGFR, que compreende a administração a uma composição de células que expressam EGFR de uma composição de anticorpos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou da molécula de ligação biespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 51, induzindo assim à apoptose.

63. Processo de inibição da proliferação de células que expressam EGFR que compreende a administração a uma composição de células que expressam EGFR de uma composição de anticorpos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou da molécula de ligação biespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 51, inibindo assim a proliferação.

64. Processo de indução da diferenciação de células tumorais in vivo, que compreende a administração a um indivíduo que sofre de câncer de uma composição de anticorpos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou da molécula de ligação biespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 51, induzindo assim à diferenciação das células tumorais.

65. Processo de acordo com a reivindicação 64, em que a dita diferenciação é terminal.

66. Processo de acordo com a reivindicação 64, em que a dita diferenciação é acompanhada por um aumento na expressão da involucrina.

67. Processo para indução da internalização do EGFR que compreende a administração às células que expressam EGFR de uma quantidade eficaz de uma composição de anticorpos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou da molécula de ligação biespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 51, induzindo assim à internalização do EGFR.

68. Composição farmacêutica que compreende dois ou mais anticorpos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou a molécula de ligação biespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 51, na forma de uma combinação para a administração simultânea, separada ou sucessiva na terapia de câncer.

69. Artigos de acordo com a reivindicação 68, que compreendem ainda pelo menos um composto capaz de induzir à diferenciação de células cancerosas na forma de uma combinação para a administração simultânea, separada ou sucessiva na terapia de câncer.

70. Artigos de acordo com a reivindicação 69, em que o composto é selecionado do grupo que consiste no ácido retinóico, do fenilbutirato, do ácido todo-trans-retinóico, da forma ativa da vitamina D.

71. Artigos de acordo com a reivindicação 68, que compreendem ainda e pelo menos um composto quimioterapêutico ou antineoplásico na forma de uma combinação para a administração simultânea, separada ou sucessiva na terapia de câncer.

72. Artigos de acordo com a reivindicação 71, em que o composto quimioterapêutico é selecionado do grupo que consiste em adriamicina, cisplatina, taxol, doxorrubicina, topotecano, fluoropirimidina, oxaliplatina e irinotecano.

73. Polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em a. Um ácido nucleico que possui a seqüência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 100; b. um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que possui a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 101; c. um ácido nucleico que possui a seqüência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 102; d. um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que possui a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 103; e e. um ácido nucleico que possui a seqüência complementar de qualquer um de a. a d.

74. Vetor de expressão que compreende um ácido nucleico como definido na reivindicação 73, ligado de forma operacional a uma seqüência promotora capaz de direcionar a expressão do dito ácido nucleico.

75. Célula transfectada ou transduzida com o vetor de expressão como definido na reivindicação 74.

76. Polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 101.

77. Polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 103.

78. Processo para a seleção de anticorpos em relação à ligação ao EGFR de cinomólgo, que compreende as etapas de a. fornecimento de pelo menos um anticorpo de teste; b. realização de um ensaio para determinar a ligação do anticorpo i) ao domínio extracelular do EGFR de cinomólgo (SEQ ID NO: 101) ou do EGFR de cinomólgo de comprimento completo (SEQ ID NO: 103); ou ii) à superfície das células que expressam o domínio extraceluIar do EGFR de cinomólgo (SEQ ID NO: 101) ou que expressam o EGFR de cinomólgo de comprimento completo (SEQ ID NO: 103); c. e seleção de pelo menos um anticorpo que se liga ao domínio extracelular do EGFR de cinomólgo.

79. Processo de acordo com a reivindicação 78, que compreende ainda a seleção em relação à ligação ao domínio extracelular do EGFR humano ou à ligação às células que expressam o EGFR humano.

80. Processo para a identificação de anticorpos anti-EGFR capazes de aumentar a ligação simultânea de outro anticorpo anti-EGFR ao EGFR, o dito processo compreendendo a. em um primeiro ensaio, a determinação da capacidade de ligação máxima de um primeiro anticorpo em relação a uma quantidade fixa de antígeno de EGFR, b. em um segundo ensaio, a saturação de uma quantidade fixa de antígeno de EGFR com um segundo anticorpo anti-EGFR, c. o contato do complexo EGFR-anticorpo com o dito primeiro anticorpo e a determinação da capacidade de ligação máxima e d. a comparação das capacidades de ligação para determinar se a capacidade de ligação máxima da etapa c. excede a capacidade de ligação máxima da etapa a.

81. Processo de acordo com a reivindicação 80, em que o dito antígeno de EGFR é uma proteína recombinante imobilizada sobre uma superfície sólida.

82. Processo de acordo com a reivindicação 80, em que o dito antígeno de EGFR é apresentado na superfície de uma célula que expressa EGFR.

83. Processo de acordo com a reivindicação 82, em que a célula compreende um construto de expressão que codifica EGFR.

84. Processo de acordo com a reivindicação 80, em que o primeiro anticorpo é uma imunoglobulina e o dito segundo anticorpo é um fragmento Fab.

85. Processo de acordo com a reivindicação 80, em que os ensaios são ELISA.

86. Processo de acordo com a reivindicação 80, em que o antígeno de EGFR compreende o domínio extracelular do EGFR humano (SEQ ID NO: 108) ou o domínio extracelular do EGFR de cinomólgo (SEQ ID NO: 101).