BRPI0808972A2 - Novos microorganismos para a produção de 1,2-propanodiol obtidos através de uma combinação de evolução e design racional - Google Patents

Description

Relatório Descrito da Patente de Invenção para: "NOVOS MICROORGANISMOS PARA A PRODUÇÃO DE 1,2-PROPANODIOL OBTIDOS ATRAVÉS DE UMA COMBINAÇÃO DE EVOLUÇÃO E DESIGN RACIONAL"

A presente invenção se refere a um novo método combinando evolução e design racional para o preparo de um microorganismo para produzir 1,2-propanodiol, o microorganismo desse modo obtido e seu uso para o preparo de 1,2-propanodiol.

0 1,2-propanodiol ou propileno glicol, um C3 diálcool, é um produto químico amplamente usado. Ele é um componente de resinas de poliéster insaturado, detergentes líquidos, refrigerantes, fluidos anti-congelamento e de

descongelamento para aeronaves. 0 propileno glicol tem sido usado crescentemente desde 1993-1994 como um substituto para derivados de etileno, os quais são reconhecidos como sendo mais tóxicos do que derivados de propileno.

0 1,2-propanodiol é atualmente produzido através de meios químicos usando um processo de hidratação de óxido de propileno que consome grandes quantidades de água. Óxido de propileno pode ser produzido através de qualquer de dois processos, um usando epicloroidrina e o outro hidroperóxido. Ambas as vias usam substâncias altamente tóxicas. Além disso, a via com hidroperóxido gera subprodutos, tais como terc-butanol e 1-fenil etanol. Para que a produção de propileno seja proveitosa, deve ser encontrado um uso para esses subprodutos. A via química geralmente produz 1,2-propanodiol racêmico, enquanto que cada um dos dois estereoisômeros, (R)1,2-propanodiol e 5 (S)1,2-propanodiol, são de interesse para determinadas aplicações (por exemplo, materiais de partida quirais para produtos químicos e produtos farmacêuticos especiais).

As desvantagens dos processos químicos para a produção de 1,2-propanodiol tornam a síntese biológica uma alternativa atraente. Duas vias foram caracterizadas para a produção natural de 1,2-propanodiol a partir de açúcares por meio de microorganismos.

Na primeira via, β-deóxi açúcares (por exemplo, Lramnose ou L-fucose) são clivados em fosfato de 15 dihidroxiacetona e (S)-lactaldeído, o qual pode ser ainda reduzido em (S)-1,2-propanodiol (Badia e colaboradores, 1985) . Essa via é funcional em E. coli, mas pode não proporcionar um processo economicamente possível em virtude do custo elevado das deóxi-hexoses.

A segunda via é o metabolismo de açúcares comuns (por

exemplo, glicose ou xilose) através da via de glicólise, seguido pela via de metilglioxal. Fosfato de dihidroxiacetona é convertido em metilglioxal, que pode ser reduzido em lactaldeído ou em acetol. Esses dois compostos podem, então, sofrer uma segunda reação de redução que proporciona 1,2-propanodiol. Essa via é usada por produtores naturais de (R)-1,2-propanodiol, tais como Clostridium sphenoides e Thermoanaerobacter

thermosaccharolyticum. Clostridium sphenoides tem sido usado para produzir 1,2-propanodiol em uma titulação de 1,58 g/l sob condições com fosfato limitado (Tran Din e Gottschalk, 1985). Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum também foi investigado para a produção de 1,2-propanodiol 10 (Cameron e Cooney, 1986, Sanchez-Rivera e colaboradores, 1987). Os melhores desempenhos obtidos foram uma titulação de 9 g/l e um rendimento, a partir de glicose, de 0,2 g/g. Contudo, o aprimoramento dos desempenhos obtidos com esses organismos provavelmente é limitado em virtude da escassez 15 de ferramentas genéticas disponíveis.

TÉCNICA ANTERIOR

Cameron e colaboradores (1998) investigaram o uso de E. coli como uma plataforma de engenharia metabólica para a conversão de açúcares em 1,2-propanodiol. Sua análise 20 teórica mostrou que o limite máximo do rendimento de produto realístico (considerando-se os equilíbrios de massa e produção de energia para crescimento) é significativamente diferente, dependendo das condições de cultura. Sob condições anaeróbicas, acetato será produzido como um subproduto de forma a reciclar os co-fatores reduzidos e o melhor rendimento estará limitado a 1 mol de

1,2-propanodiol por mol de glicose (0,42 g/g)· Sob condições aeróbicas, reciclagem de co-fatores será assegurada pela cadeia respiratória usando oxigênio como um receptor de elétrons terminal e se tornaria possível produzir 1,2-propanodiol sem a produção de subprodutos. Sob essas condições, o rendimento poderia atingir no máximo 1,42 moles/mol (0,6 g/g). Considerando a titulação máxima de 1,2-propanodiol, Cameron e colaboradores discutiram sua dependência da toxicidade de produto e subproduto. 0 1,2- propanodiol é significativamente menos tóxico do que o 1,3- propanodiol e E. coli exibe uma taxa de crescimento residual de 0,5 h”1, com 100 g/l de 1,2-propanodiol. A inibição de crescimento é, mais provavelmente, em virtude do subproduto acetato, que é conhecido por ser altamente inibidor do crescimento. 0 desenvolvimento de um processo anaeróbico para a produção de 1,2-propanodiol com altas titulações e rendimentos teria de levar em conta o problema com o acetato. A conversão de acetato em acetona, a qual é menos inibitória e facilmente removida in situ, foi proposta (WO 2005/073364).

Várias investigações para modificações genéticas de E. coli foram feitas pelo grupo de Cameron (Cameron e colaboradores, 1998, Altaras e Cameron, 1999, Altaras e Cameron, 2000) e pelo grupo de Bennett (Huang e colaboradores, 1999, Berrios-Rivera e colaboradores, 2003), 5 de forma a obter um produtor de 1,2-propanodiol usando fontes de carbono simples. Esses estudos contam, por um lado, com a expressão de uma ou várias atividades enzimáticas na via a partir de fosfato de dihidroxiacetona em 1,2-propanodiol e, por outro lado, com a remoção de NADH 10 e vias que consomem oxigênio na cepa hospedeira. Os melhores resultados obtidos pelo grupo de Cameron são produção de 1,4 g/l de 1,2-propanodiol em um frasco de cultura anaeróbico com um rendimento de 0,2 g/g de glicose consumida. Quando extrapolada para um fermentador com 15 alimentação em batelada, a produção foi de 4,5 g/l de 1,2- propanodiol com um rendimento de 0,19 g/g a partir de glicose, no que diz respeito à avaliação teórica de Cameron e colaboradores. Esses desempenhos foram obtidos com a superexpressão do gene de sintase de metilglioxal de E. 20 coli (mgs) , o gene de dehidrogenase de glicerol de E. coli [gldA) e o gene de óxido-reductase de 1,2-propanodiol de E. coli (fucO) em uma cepa carecendo do gene que codifica dehidrogenase de lactato (IdhA) . Os resultados obtidos com a mesma abordagem, mas com menores titulações e rendimentos, também são descritos nas patentes US 6.087.140, US 6.303.352 e WO 98/37204.

0 grupo de Bennett também usou uma cepa hospedeira de E. coli carecendo de IdhA para a superexpressão do gene mgs 5 de Clostridium acetobutylicum e o gene gldA de E. coli. Culturas em frasco, sob condições anaeróbicas, proporcionaram uma titulação de 1,3 g/l e um rendimento de 0,12 g/g, enquanto que culturas microaeróbicas proporcionaram uma titulação de 1,2 g/l com um rendimento 10 de 0,13 g/g.

Um método alternativo para obter uma cepa que produz

1,2-propanodiol é dirigir a evolução de uma "cepa inicial" a um estado onde a "cepa evoluída" produz o composto desejado com melhores características. Esse método é 15 baseado na evolução estrutural de um microorganismo o qual é primeiro modificado através de atenuação de dois genes, tpiA e um gene envolvido na conversão de metilglioxal em lactato. A finalidade de atenuação do gene tpiA que codifica a isomerase de fosfato de triose é separar os dois 20 ramos metabólicos começando no gliceraldeído-3-fosfato (GA3P) e fosfato de dihidróxiacetona (DHAP) que são normalmente interconvertidos por essa enzima. A via de DHPA em 1,2-propanodiol será o "ramo de redução" que consome cofatores (NADH) reduzidos, enquanto que o metabolismo a partir de GA3P em acetato será o "ramo oxidativo" que produz NADH e energia para o crescimento da célula. Sem um gene tpiA funcional, o metabolismo da célula é "travado" e o crescimento da cepa, a produção de 1,2-propanodiol e a 5 produção de acetato estão intimamente associados. Sob pressão de seleção em um meio crescimento apropriado, essa cepa inicial evoluirá para um estado onde a produção de

1.2-propanodiol pela referida cepa é aprimorada. Esse procedimentos para obter uma "cepa evoluída" de

microorganismo para a produção de 1,2-propanodiol é descrito no pedido de patente WO

2005/073364. Esse processo de evolução e a etapa seguinte de fermentação são, de preferência, realizadas sob condições anaeróbicas. Essa tecnologia é um aprimoramento evidente com relação à técnica anterior. Uma titulação de

1.2-propanodiol de 1,8 g/l foi obtida, com um rendimento de 0,35 gramas por glicose consumida, próximo do resultado teórico de Cameron e colaboradores.

0 objetivo da presente invenção é o aprimoramento de 20 uma cepa produtora de 1,2-propanodiol através de evolução e subseqüente engenharia genética racional da cepa evoluída. Uma característica especial é a reconstrução de um gene tpiA funcional na cepa tpiA menos evoluída. Essas modificações levam a uma produção aprimorada de 1,2- propanodiol.

DESCRIÇÃO PA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um novo método combinando evolução e design racional para o preparo de uma cepa de microorganismo para a produção de 1,2-propanodiol a partir de uma fonte de carbono. 0 referido método compreende:

crescimento de uma cepa inicial sob pressão de seleção em um meio de crescimento apropriado, a referida 10 cepa bacteriana inicial compreendendo uma atenuação da expressão do gene tpiA e uma atenuação da expressão de pelo menos um gene envolvido na conversão de metilglioxal em lactato (tal como gloA, aIdAf aldB) , de forma a promover a evolução na referida cepa inicial,

- então, seleção e isolamento da cepa evoluída tendo

uma taxa de produção de 1,2-propanodiol aumentada (aumentada em pelo menos 20%),

- então, reconstrução de um gene tpiA funcional na cepa evoluída.

Em um aspecto da invenção, a síntese de subprodutos

indesejados é atenuada através de deleção dos genes que codificam enzimas envolvidas na síntese de lactato a partir de piruvato (IdhA)f formato (pflA, pflB), etanol (adhE) . Em outro aspecto da invenção, a via de Entner-Doudoroff é eliminada através de deleção do gene edd ou eda ou ambos. Vantajosamente, de forma a tornar mais NADH disponível para as etapas de redução na via biossintética de 1,2- propanodiol, pelo menos um gene selecionado dentre arcA e 5 ndh é atenuado.

0 microorganismo usado para o preparo de 1,2- propanodiol é selecionado dentre bactérias, leveduras e fungos mas, de preferência, é da espécie Escherichia coli ou Clostridium acetobutylicum.

A presente invenção também se refere à cepa evoluída

tal como obtido que pode ser, além disso, geneticamente modificada de forma a aperfeiçoar a conversão de uma fonte de carbono em 1,2-propanodiol sem subprodutos e com o melhor rendimento possível. Em um aspecto da invenção, a 15 atividade de desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato é reduzida de forma a redirecionar uma parte do gliceraldeído-3-fosfato disponível para a síntese de 1,2- propanodiol. Em um aspecto da invenção, a eficiência da importação de açúcar é aumentada usando uma importação de 20 açúcar independente de fosfoenol piruvato (PEP), tal como aquela codificada por galP ou fornecendo mais PEP ao sistema de açúcar-fosfotransferase. Isso é obtido eliminando as vias que consomem PEP, tais como quinases de piruvatos (codificadas pelos genes pykA e pykF) e/ou promovendo a síntese de PEP, por exemplo, através de superexpressão do gene ppsA que codifica a sintase de PEP. Adicionalmente, é valioso se a enzima de conversão de piruvato em acetil-CoA for resistente à altas concentrações 5 de NADH encontradas sob condições anaeróbicas. Isso pode ser obtido através de uma mutação específica no gene lpd. Vantajosamente, a síntese do subproduto acetato é impedida atenuando um ou vários dos genes ackA, pta, poxB.

A presente invenção também se refere a um método para a produção de 1,2-propanodiol em um ótimo rendimento, sob condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas, usando a referida cepa de E. coli evoluída e opcionalmente modificada geneticamente crescida em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples. Adicionalmente, a invenção se refere a um método para a produção de 1,2-propanodiol em um ótimo rendimento, sob condições anaeróbicas, usando a referida cepa de C. acetobutylicum evoluída e opcionalmente modificada geneticamente crescida em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples ou complexa. O 1,2- propanodiol produzido de acordo com esse método é subseqüentemente recuperado e opcionalmente purificado. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

O desenho anexado, que é incorporado e constitui uma parte do presente relatório descritivo, exemplifica a invenção e, junto com a descrição, serve para explicar os princípios da presente invenção.

A Figura 1 representa a engenharia genética do metabolismo central no desenvolvimento de um sistema de produção de 1,2-propanodiol a partir de carboidratos. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme aqui utilizado, os termos a seguir podem ser usados para interpretação das reivindicações e relatório descritivo.

0 termo "cepa" denota uma variante genética de uma espécie. Assim, o termo "cepa de microorganismo" denota uma variante genética de uma espécie de um microorganismo específico. As características fornecidas para qualquer 15 cepa também se aplicam para qualquer microorganismo correspondente ou vice-versa.

De acordo com a invenção, os termos "cultura", "crescimento" e "fermentação" são usados de maneira intercambiável para denotar o crescimento de bactérias em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples.

O termo "fonte de carbono", de acordo com a presente invenção, denota qualquer fonte de carbono que pode ser usada por aqueles habilitados na técnica para sustentar o crescimento normal de um microorganismo e que pode ser hexoses, pentoses, monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarideos, amido ou seus derivados, hemiceluloses, glicerol e combinações dos mesmos.

0 termo "meio de crescimento apropriado", de acordo

com a invenção, denota um meio de composição molecular conhecida adaptado ao crescimento do microorganismo e projetado de modo que ele promova a evolução desejada.

0 processo de evolução de acordo com a invenção é um

processo para o preparo de microorganismos evoluídos apresentando características de produção aprimoradas e compreende as seguintes etapas:

a) modificação de um microorganismo para obter uma cepa inicial com um metabolismo "travado", onde a evolução

pode ocorrer apenas na direção desejada quando as células da cepa inicial são crescidas sobre um meio apropriado,

b) crescimento da cepa inicial obtida acima sobre o referido meio de forma a fazer com que a mesma evolua, em que a cepa inicial é crescida sob condições aeróbicas,

microaeróbicas ou anaeróbicas,

c) seleção das "cepas evoluídas" capazes de crescer sob essas condições específicas, apresentando características de produção aprimoradas para o composto desej ado. Esse processo de evolução foi extensivamente descrito nos pedidos de patente WO 2004/076659 depositado em 17/02/2004 e WO 2005/073364 depositado em 12/01/2005, pelos mesmos requerentes.

O termo "seleção", de acordo com a invenção, denota um

processo em que as únicas cepas de microorganismos que são retidas no meio de cultura são aquelas que apresentam uma melhor adaptação sob as condições de pressão de seleção. Tipicamente, as cepas mais adaptadas crescem mais do que 10 seus competidores e são, então, selecionadas. Uma forma simples de selecionar uma cepa de microorganismo evoluida especifica em uma população consiste em crescimento da população em cultura contínua na qual as cepas de crescimento lento são eventualmente eluídas da cultura. 15 Esse não é um exemplo exclusivo para seleção e outros métodos de seleção conhecidos pelo técnico no assunto podem ser aplicados.

O termo "isolamento" denota um processo onde uma cepa individual que apresenta modificações genéticas específicas 20 é separada de uma população de cepas que apresenta características genéticas diferentes. Isso é feito através de amostragem da biomassa após o período de evolução e disseminação da mesma sobre placas de Petri para isolar colônias únicas. O termo "taxa de produção de 1,2-propanodiol" significa uma taxa de produção expressa em g/l/h, que é calculada como segue:

Concentração de 1,2-propanodiol produzido no meio (g/l) / tempo necessário para essa produção (hora)

Adicionalmente, uma taxa de produção específica expressa em g/g/h, levando-se em conta a quantidade de biomassa, pode ser calculada como segue:

Concentração de 1,2-propanodiol produzido no meio (g/l) / concentração de biomassa produzida no meio (q/l)/ tempo necessário para essas produções (h)

A concentração de biomassa é determinada medindo a absorbância do caldo de fermentação com uma leitura em espectrofotômetro, por exemplo, a 600 nm ou determinando o peso seco das células após secagem de um volume definido de caldo de fermentação.

A quantidade de 1,2-propanodiol produzido é medida através de cromatografia de líquido de alto desempenho (HPLC) com uma coluna adaptada de acordo com um estado do protocolo na técnica.

Na presente invenção, cepas evoluídas são selecionadas com relação às seguintes características: uma taxa de captação de glicose aumentada e uma taxa de produção de

1,2-propanodiol aprimorada. As cepas mostrando essas características são, então, isoladas e, vantajosamente, comparadas umas com as outras, de forma a identificar o melhor produtor.

A taxa de captação de glicose, expressa em g/l/h, é calculada como segue:

Concentração de glicose consumida pela cultura (g/l) / tempo necessário para esse consumo (h)

Uma taxa de captação de glicose específica pode ser calculada levando-se em conta a concentração de biomassa no meio, conforme previamente descrito.

A taxa de captação de glicose e taxa de produção de

1,2-propanodiol são intimamente relacionadas. Se o consumo de glicose é aumentado, a produção dos produtos a partir do metabolismo de glicose é aumentada na mesma proporção.

Após seleção e isolamento, as cepas melhor evoluídas

apresentam uma captação de glicose que é cerca de 20% maior do que a captação da cepa inicial, de preferência cerca de 30% maior ou mais, mais preferivelmente 50% maior.

A taxa de produção de 1,2-propanodiol aumentada é cerca de 20% maior do que a taxa de produção da cepa inicial, de preferência cerca de 30% maior ou mais, mais preferivelmente cerca de 50% maior.

O gene tpiA codifica a enzima "isomerase de fosfato de triose", a qual catalisa a interconversão de DHAP e GA3P (ver Figura 1) . A finalidade da atenuação desse gene é manipular o metabolismo da célula de uma forma tal que a evolução ã produção mais eficiente de 1,2-propanodiol se torna possível.

5 0 termo "atenuação da expressão de um gene", de acordo

com a invenção, denota a supressão parcial ou completa da expressão de um gene o qual é, então, dito como sendo "atenuado". Essa supressão de expressão pode ser uma inibição da expressão do gene, a supressão de um mecanismo 10 de ativação do gene, uma deleção de toda ou parte da região promotora necessária para a expressão do gene ou uma deleção na região de codificação do gene. De preferência, a atenuação de um gene é essencialmente a deleção completa desse gene, gene o qual pode ser substituído por um gene 15 marcador de seleção que facilita a identificação, isolamento e purificação das cepas de acordo com a invenção. Um gene é, de preferência, inativado através da técnica de recombinação homóloga, conforme descrito em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation 20 of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 6640-6645. Outros métodos são descritos abaixo.

O termo "expressão" se refere à transcrição e tradução de uma seqüência gênica, levando à geração da proteína correspondente, produto do gene.

0 termo "reconstrução de um gene tpiA funcional na cepa evoluída" significa que a cepa evoluída selecionada é modificada após o processo de evolução através de 5 introdução de um gene tpiA funcional; isso pode ser realizado através de substituição, via recombinação homóloga, da cópia atenuada do gene por uma cópia do tipo silvestre, assim, restaurando uma atividade de isomerase de fosfato de triose similar à atividade medida na cepa 10 inicial ou através da introdução de um gene tpiA funcional sobre um locus cromossômico diferente ou através de introdução de um gene tpiA funcional sobre um plasmídeo. Essa restauração pode permitir um rendimento de produção de

1.2-propanodiol a partir de glicose de mais de 1 mol/mol por meio de reciclagem parcial de GA3P em DHAP para a

produção de 1,2-propanodiol através da ação da isomerase de fosfato de triose.

Δ finalidade da atenuação da expressão de pelo menos um gene envolvido na conversão de metilglioxal (2-oxo propanal) em lactato é inibir a conversão de metilglioxal em lactato, de modo que o metilglioxal presente seja usado pela maquinaria celular essencialmente para a síntese de

1.2-propanodiol.

Os genes envolvidos na conversão de metilglioxal em lactato são, em particular:

- um gene que codifica uma glioxalase, por exemplo, o gene gloA que codifica glioxalase I, que catalisa a sintese de lactoil glutationa a partir de metilglioxal;

-os genes aldA e aldB que codificam uma dehidrogenase

de lactaldeido (que catalisa a síntese de (S) lactato a partir de (S) lactaldeido).

A expressão de um ou mais desses genes é, vantajosamente, atenuada (ou o gene é completamente deletado) na cepa inicial. De preferência, o gene gloA é deletado.

Uma modificação adicional é, vantajosamente, feita na cepa inicial consistindo em supressão das vias naturais de fermentação de glicose, as quais consomem equivalentes de redução como NADH e, portanto, competem com a via biossintética de 1,2-propanodiol.

Em particular, é vantajoso atenuar a expressão do gene IdhA que codifica dehidrogenase de lactato que catalisa a síntese de lactato a partir de piruvato e a expressão do gene adhE que codifica dehidrogenase de álcool-aldeído que catalisa a síntese de etanol a partir de acetil-CoA.

Similarmente, é possível forçar o microorganismo a usar o complexo de dehidrogenase de piruvato para produzir acetil-CoA e NADH a partir de piruvato. Isso pode ser obtido através de atenuação da expressão dos genes pflA e pflB que codificam liase de formato de piruvato.

Atenuação de pelo menos um dos genes edd e eda que codificam as enzimas envolvidas na via de Entner-Doudoroff 5 é também útil para impedir o metabolismo direto de glicose em gliceraldeído-3-fosfato e piruvato que pode superar a via da síntese de 1,2-propanodiol.

Sob condições anaeróbicas ou microaeróbicas, a disponibilidade de NADH para a redução dos precursores em 10 1,2-propanodiol é, vantajosamente, aumentada. Isso é obtido aliviando a repressão sobre o ciclo de ácido tricarboxílico mediada pelo regulador global ArcA (codificado pelo gene arcA) . A concentração de NADH na célula pode também ser aumentada através de inativação da dehidrogenase de NADH II 15 codificada pelo gene ndh. Portanto, de preferência, pelo menos um gene selecionado dentre arcA e ndh tem sua expressão atenuada.

De preferência, a cepa inicial é selecionada do grupo consistindo de bactérias, leveduras e fungos.

Mais preferivelmente, a cepa inicial é selecionada do

grupo consistindo de Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteriaceae.

Em uma modalidade preferida da invenção, a cepa inicial é Escherichia coli ou Clostridium acetobutylicum. A cepa evoluída passível de ser obtida e a cepa evoluída tal como obtido através do processo previamente descrita são também um objetivo da invenção.

Essa cepa evoluída é vantajosa para modificar a expressão de genes específicos, isto é, aumentar ou atenuar a expressão do gene. Essas modificações permitem melhorar o desempenho de produção de 1,2-propanodiol.

Para obter uma superexpressão de um gene de interesse, aqueles habilitados na técnica conhecem diferentes métodos, por exemplo:

- Substituição do promotor endógeno por um promotor forte.

Introdução, no microorganismo, de um vetor de expressão trazendo o referido gene de interesse.

- Introdução de cópias adicionais do gene de interesse

no cromossoma.

Aqueles versados na técnica conhecerem várias técnicas para introdução de DNA em uma cepa bacteriana. Uma técnica preferida é eletroporação, a qual é bem conhecida por aqueles versados na técnica.

Para obter a atenuação da expressão de um gene, diferentes métodos são conhecidos por aqueles versados na técnica e são descritos abaixo.

Em uma modalidade específica da invenção, a cepa evoluída é modificada através de uma atenuação da atividade de desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) de forma a reduzir o fluxo na parte inferior de glicólise e redirecioná-lo à síntese de DHAP e, finalmente, 1,2- 5 propanodiol (ver Figura 1) . Essa atividade diminuída pode, em particular, ser obtida através de uma atenuação da expressão do gene gapA.

0 termo "atenuação da atividade de uma enzima" se refere a uma diminuição de atividade da enzima de interesse 10 comparada com a atividade observada em uma cepa evoluída antes de qualquer modificação. Aqueles versados na técnica conhecem numerosos meios para obter esse resultado, por exemplo:

introdução de uma mutação no gene que diminui o nível de expressão desse gene ou o nível de atividade da proteína codificada

substituição do promotor natural do gene por um promotor de baixa resistência, resultando em uma menor expressão

- uso de elementos que desestabilizam o RNA mensageiro

correspondente ou a proteína

- deleção do gene se nenhuma expressão em geral é desej ada.

Vantajosamente, na cepa evoluída, a eficiência de importação de açúcar é aumentada. Uma atenuação forte da expressão do gene gapA que resulta em uma diminuição do fluxo de carbono na reação de GAPDH em maior de 50% resultará na sintese de menos de 1 mol de fosfoenol 5 piruvato (PEP) por mol de glicose importada. O sistema de açúcar-fosfotransferase (PTS), que usualmente assegura a importação de açúcares simples para a célula, está associado a uma reação de fosforilação que proporciona glicose-6-fosfato. O fosfato necessário para essa reação é 10 fornecido através da conversão de PEP em piruvato. Assim, diminuição da quantidade de PEP produzido, por meio de redução do fluxo através do gliceraldeído-3-fosfato, reduz a importação de açúcar.

Em uma modalidade específica da invenção, o açúcar 15 poderia ser importado para o microorganismo através de um sistema de importação de açúcar independente da disponibilidade de fosfoenol piruvato. O simporter de galactose-prótons codificado pelo gene galP, que não envolve fosforilação, pode ser utilizado. Nesse caso, a 20 glicose importada precisa ser fosforilada pela quinase de glicose codificada pelo gene glk. Para promover essa via, a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre galP e glk é aumentada. Como um resultado, o PTS se torna dispensável e pode ser eliminado através de atenuação da expressão de pelo menos um gene selecionado dentre ptsH, ptsl ou err.

Em outra modalidade específica da invenção, a eficiência do PTS é aumentada através de aumento da 5 disponibilidade do metabólito PEP. Em virtude da atenuação da atividade de gapA e do menor fluxo de carbono ao piruvato, a quantidade de PEP na cepa modificada da invenção poderia ser limitada, levando a uma menor quantidade de glicose transportada para a célula.

Existem vários meios que podem ser usados para

aumentar a disponibilidade de PEP em uma cepa de microorganismo. Em particular, uma forma é atenuar a reação PEP -> piruvato. De preferência, a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre pykA e pykE, que codificam a 15 enzima quinase de piruvato, é atenuada na referida cepa para obter esse resultado. Outra forma para aumentar a disponibilidade do PEP é favorecer a reação piruvato —> PEP, catalisada pela sintase de fosfoenol piruvato através de aumento da atividade da enzima. Essa enzima é codificada 20 pelo gene ppsA. Portanto, de preferência, no microorganismo, a expressão do gene ppsA é aumentada. Ambas as modificações podem estar presentes no microorganismo simultaneamente. Especialmente, sob condições anaeróbicas ou microaeróbicas, é vantajoso se o complexo de dehidrogenase de piruvato (PDC), que converte piruvato em acetil-CoA, tem baixa sensibilidade à inibição pelo NADH. 0 termo "baixa 5 sensibilidade" é definido com referência à sensibilidade de uma enzima não modificada, conforme já demonstrado no WO 2005/073364. Em particular, tal característica pode ser obtida através de introdução de uma mutação específica no gene Ipd (que codifica a subunidade dehidrogenase de 10 lipoamida da PDC), resultando na substituição de alanina na seqüência da proteína da enzima por uma valina.

Em outra modalidade específica da invenção, a síntese do subproduto acetato é impedida. Sob condições totalmente aeróbicas, o co-fator reduzido NADH é, de preferência, 15 oxidado em NAD+ via a cadeia respiratória, com oxigênio como um aceitador de elétrons terminal. Portanto, a síntese de um co-produto (por exemplo, acetato) não é obrigatória. É preferível evitar tal síntese de acetato para aperfeiçoar a produção de 1,2-propanodiol.

Para impedir a produção de acetato, vantajosamente, a

atividade de pelo menos uma enzima envolvida na síntese de acetato é atenuada. De preferência, a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre ackA, pta e poxB é atenuada, todos esses genes codificando as enzimas envolvidas em diferentes vias biossintéticas de acetato (ver Figura 1).

Outro objetivo da invenção é um método para preparo de

1,2-propanodiol em que uma cepa evoluída, tal como descrito 5 previamente, é crescida em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono e, então, o 1,2- propanodiol produzido é recuperado. A produção de 1,2- propanodiol é realizada sob condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas.

As condições de cultura (fermentação) para os

microorganismos de acordo com a invenção podem ser prontamente definidas por aqueles habilitados na técnica. Em particular, bactérias são fermentadas em temperaturas entre 20°C e 55°C, de preferência entre 25°C e 40°C e, de 15 preferência, em torno de 35°C para C. acetobutylicum e em torno de 37°C para E. coli.

Esse processo pode ser realizado em um processo em batelada, em um processador alimentado em batelada ou em um processo contínuo.

A cepa evoluída pode ser usada para produzir 1,2-

propanodiol sob condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas.

"Sob condições aeróbicas" significa que oxigênio é fornecido à cultura através de dissolução do gás na fase líquida. Isso poderia ser obtido (1) purgando gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) na fase líquida ou (2) agitando o vaso contendo o meio de cultura de forma a transferir o oxigênio contido no espaço superior para a fase líquida.

5 Vantagens da fermentação sob condições aeróbicas ao invés de condições anaeróbicas é que a presença de oxigênio como um aceitador de elétrons melhora a capacidade da cepa de produzir mais energia na forma de ATP para processos celulares. Portanto, a cepa tem seu metabolismo geral 10 aprimorado.

Condições microaeróbicas são definidas como condições de cultura em que baixos percentuais de oxigênio (por exemplo, usando uma mistura de gás contendo entre 0,1 e 10% de oxigênio, completo até 100% com nitrogênio) são dissolvidos na fase líquida.

Condições anaeróbicas são definidas como condições de cultura em que nenhum oxigênio é fornecido ao meio de cultura. Condições estritamente anaeróbicas são obtidas através de purgação de um gás inerte, tal como nitrogênio, 20 no meio de cultura para remover traços de outro gás. Nitrato pode ser usado como um aceitador de elétrons para melhorar a produção de ATP pela cepa e melhorar seu metabolismo.

A cultura de cepas, durante o processo de evolução e o processo de fermentação para produção de 1,2-propanodiol, é conduzida em f ermentadores com um meio de cultura de composição conhecida adaptada à bactéria usada, contendo pelo menos uma fonte de carbono. Em particular, um meio de 5 crescimento mineral para E. coli pode, assim, ser de composição idêntica ou similar ao meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 32: 120-128), meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related 10 Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ou um meio tal como aquele definido por Schaefer e colaboradores (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96) e, em particular, o meio de cultura mínimo denominado MPG descrito abaixo:

K2HPO4 1,4 g/l Ácido nitrilo 0,2 g/l Solução de 10 ml/l (NH4)2SO4 1 g/l NaCl 0,2 g/l NaHCO3 0,2 g/l MgSO4 0,2 g/l glicose 20 a 100 NaNO3 0,424 g/l tiamina 10 mg/l FeSO4, 7 H2O 50 mg/l Extrato de levedo 4 g/l 15 O pH do meio é ajustado para 7,4 com hidróxido de sódio.

* Solução de elementos vestiqiais: 4,37 g/L de ácido citrico, 3 g/L de MnSO4, 1 g/L de CaCl2, 0,1 g/L de CoCl2.2H20, 0,10 g/L de ZnSO4.7H20, 10 mg/L de CuSO4.5H20, 10 mg/L de H3BO3, 8,31 mg/L de Na2MoO4.

Em uma modalidade especifica da invenção, o método é realizado com uma cepa evoluída de E. coli em um meio de crescimento contendo uma fonte de carbono simples que pode 10 ser: arabinose, frutose, galactose, glicose, lactose, maltose, sacarose ou xilose. Uma fonte de carbono simples especialmente preferida é glicose.

Em outra modalidade específica da invenção, o método é realizado com uma cepa evoluída de Clostridium acetobutylicum em um meio de crescimento contendo uma fonte de carbono simples ou complexa.

0 meio para C. acetobutylicum pode, assim, ser de composição idêntica ou similar ao meio de Crescimento Clostridial (CGM, Wiesenborn e colaboradores, Appl. 20 Environm. Microbiol., 54: 2717-2722) ou um meio de crescimento mineral conforme fornecido por Monot e colaboradores (Appl. Environm. Microbiol., 44: 1318-1324) ou Vasconcelos e colaboradores (J. Bacteriol., 176: 1443- 1450) . A fonte de carbono usada para a cultura de C. acetobutylicum é um carbono simples ou complexo. A fonte de carbono simples pode ser arabinose, frutose, galactose, glicose, lactose, maltose, sacarose ou xilose. Uma fonte de 5 carbono complexa pode ser amido ou hemicelulose. Uma fonte de carbono complexa especialmente preferida é amido.

De preferência, o 1,2-propanodiol recuperado é, além disso, purificado. Aqueles versados na técnica conhecem métodos para recuperação e purificação do 1,2-propanodiol produzido. Esses métodos são processos usuais.

A invenção é descrita acima, abaixo e nos Exemplos com relação a E. coli. Assim, os genes que podem ser atenuados, deletados ou superexpressos para as cepas inicial e evoluída de acordo com a invenção são definidos 15 principalmente usando a denominação dos genes a partir de E. coli. Contudo, essa designação tem um significado mais geral de acordo com a invenção e abrange os genes correspondentes em outros microorganismos usando as referências no GenBank dos genes de E. coli, aqueles 20 habilitados na técnica podem determinar genes equivalentes em outros organismos que não E. coli. Os meios de identificação de seqüências homólogas e suas homologias percentuais são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e incluem, em particular, os programas BLAST que podem ser usados no website

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros de default indicados nesse website. As seqüências obtidas podem ser exploradas (alinhadas) usando, por exemplo, os 5 programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) com os parâmetros de default indicados nesse website.

O banco de dados PFAM (banco de dados de famílias de proteína de alinhamentos e modelos ocultos de Markov http://www.sanqer.ac.uk/Software/Pfam/) é uma grande 10 coleção de alinhamentos de seqüências de proteína. Cada PFAM torna possível visualizar múltiplos alinhamentos, ver domínios de proteína, avaliar distribuições entre organismos, obter acesso a outros bancos de dados e visualizar estruturas de proteínas conhecidas.

COGs (agrupamentos de grupos ortólogos de proteínas

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) são obtidos comparando seqüências de proteína derivadas de 66 genomas totalmente seqüenciados representando 44 linhagens filogenéticas principais. Cada COG é definido a partir de pelo menos três 20 linhagens, tornando possível identificar domínios conservados ancestrais.

REFERÊNCIAS na ordem de citação no texto

I. Badia J, Ros J, Aguilar J (1985), J. Bacteriol. 161: 435-437 2. Tran Din K e Gottschalk G (1985), Arch. Microbiol. 142: 87-92

3. Cameron DC e Cooney CL (1986), Bio/Technology, 4: 651-654

4. Sanchez-Rivera F, Cameron DC, Cooney CL (1987),

Biotechnol. Lett. 9: 449-454

5. Altaras NE e Cameron DC (1999), Appl. Environ. Microbiol. 65: 1180-1185

6. Cameron DC, Altaras NE, Hoffman ML, Shaw AJ (1998), Biotechnol. Prog. 14: 116-125

7. Altaras NE e Cameron DC (2000), Biotechnol. Prog. 16: 940-946

8. Huang K, Rudolph FB, Bennett GN (1999), Appl. Environ. Microbiol. 65: 3244-3247

9. Berrios-Rivera SJ, San KY, Bennett GN (2003), J.

Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: 34-40

10. Datsenko KA e Wanner BL (2000), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 6640-6645

11. Anderson EH (1946), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 32: 120-128

12. Miller (1992), A Short Course in Baeterial Geneties: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 13. Schaefer U, Boos W, Takors R, Weuster-Botz D

(1999), Anal. Biochem. 270: 88-96

14. Wiesenborn DP, Rudolph RB, Papoutsakis ET (1987), Appl. Environ. Microbiol, 54: 2717-2722

15. Monot F, Martin JR, Petitdemange H, Gay R (1982),

Appl. Environ. Microbiol. 44: 1318-1324

16. Vasconcelos I, Girbal L, Soucaille P (1994), J. Bacteriol. 176: 1443-1450 EXEMPLOS

Os exemplos a seguir mostram:

1. A construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AarcA, Andh.

2. A evolução da referida cepa inicial.

3. A reconstrução do gene tpiA na cepa evoluída

selecionada.

4. Atenuação do gene gapA; deleção dos genes pykA e pykF; superexpressão do gene ppsA.

5. A deleção dos genes ackA, pta, poxB.

6. Comparação de várias cepas obtidas com relação à

produção de 1,2-propanodiol sob condições aeróbicas.

7. Produção de 1,2-propanodiol em cultura alimentada em batelada com a melhor cepa. Exemplo 1: Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflABr AadhE, AldhAr AgloAr AaldAr AaldBr Aeddr AarcAr Andh capaz de evoluir à produção aprimorada de 1,2-propanodiol 5 a) Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655

Ipd*r AtpiAr ApflABr AadhEr IdhA::Kmr AgloAr AaldAr AaldBr Aedd

0 cassete de resistência ao clorafenicol foi eliminado na cepa de E. coli MG1655 Ipd* r AtpiAr ApflABr AadhEr IdhA::kmr AgloAr AaldAr AaldBr Aedd::cm (ver W02005073364) de acordo com o Protocolo 1.

Protocolo 1: Eliminação de cassetes de resistência

Os cassetes de resistência ao clorafenicol e/ou canamicina foram eliminados de acordo com a seguinte 15 técnica. O plasmideo pCP20 trazendo a recombinase FLP que atua nos sítios FRT dos cassetes de resistência ao clorafenicol e/ou canamicina foi introduzido na cepa através de eletroporação. Após cultura serial a 42°C, a perda dos cassetes de resistência a antibiótico foi 20 verificada através de análise por PCR com os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 1.

A presença das modificações feitas previamente na cepa foi verificada usando os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela I.

A cepa obtida foi denominada E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, Apf1AB, AadhE, IdhA::km, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd. Tabela 1: Oligonucleotídeos usados para verificar a inserção de um cassete de resistência ou a perda de um cassete de resistência

Nome da região Nomes dos SEQ ID Homologia com região oligos cromossômica Gene tpiA cdh N0 1 Ver W02005073364 (deleção) YHQ N°2 Gene pflAB pfIABF N0 3 Ver W0200507 3364 pfIABR N0 4 Gene adhE ychGf N0 5 Ver W02005073364 adhECr N0 6 Gene IdhA hsIJC Γ" 00 Ver W02005073364 (inserção de IdhAC2 O o cassete) Gene gloA NemACd N0 9 Ver W02005073364 RntCr N0 10 Gene aIdA Ydc FCf N0 11 Ver W02005073364 gapCCr N0 12 Gene aldB aldB C f N0 13 Ver W02005073364 YiaYCr N0 14 Gene edd Edad N0 15 Ver W02005073364 Zwf r N0 16 Gene IdhA IdhAF N0 17 1439724 a 1439743 (deleção) IdhAR N0 18 1441029 a 1441007 Gene arcA arcAF N0 19 4638292 a 4638273 arcAR N0 20 4636854 a 4636874 Gene ndh ndh F N0 21 1164722 a 1164742 ndhR N0 22 1167197 a 1167177 Gene tpiA YHQ N0 2 4109599 a 4109580 (reconstrução) tpiAR N0 23 4108953 a 4108973 Promotor de yeaAF N0 24 1860259-1860287 gapA (Ptrcl6- gapAR N0 25 1861068-1861040 gapA) Gene pykA pykAF N0 26 1935338 a 1935360 pykAR N0 27 1937425 a 1937401 Gene pykF pykFF CO CTi 1753371 a 1753392 pykFR CM CM 1755518 a 1755495 o o Z Z Genes ackA-pta B2295 N0 30 2410900 a 2410919 YfcCR N0 31 2415164 a 2415145 Gene poxB poxBF N0 32 908475 a 908495 poxBR N0 33 910375 a 910352 b) Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd

De forma a eliminar o cassete de resistência à canamicina e inativar o gene IdhAr o cassete de resistência 5 ao clorafenicol foi inserido no gene IdhA deletando o gene em questão de acordo com o Protocolo 2.

Protocolo 2: Introdução de um produto de PCR para recombinação e seleção dos recombinantes

Os oligonucleotídeos escolhidos e fornecidos na Tabela 2 para substituição de um gene ou uma região intergênica foram usados para amplificar o cassete de resistência ao clorafenicol a partir do pKD3 ou o cassete de resistência à canamicina do plasmídeo pKD4 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L.

(2000) ) . O produto de PCR obtido foi, então, introduzido 15 através de eletroporação na cepa recipiente trazendo o plasmídeo pKD46 no qual o sistema λ Red (γ, β, exo) expresso favorece grandemente a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes a antibiótico foram, então, selecionados e a inserção do cassete de resistência foi 20 verificada através de análise por PCR com os oligonucleotídeos apropriados fornecidos na Tabela 1.

As outras modificações dà cepa foram verificadas com os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 1. A cepa resultante foi denominada E. coli MG1655 Ipd*, Aldh::cm, AtpiA, ApflAB, AadhE, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd. Tabela 2: Oligonucleotídeos usados para substituição de uma região cromossômica através de recombinação com um produto de PCR na cepa de E. coli MG1655

Nome da Nomes dos SEQ ID Homologia com região região oligos cromossômica Gene IdhA DldhAF N0 34 1440865-1440786 DldhAR N0 35 1439878-1439958 Gene arch DarcAF N0 36 4637868-4637791 DarcAR N0 37 4637167-4637245 Gene ndh DndhF N0 38 1165071-1165149 DndhR N0 39 1166607-1166528 Gene tpiA tpiA::kmF N0 40 4109264-4109195 (reconstrução tpiA::kmR N0 41 4109109-4109193 ) Promotor gapA Ptrc-gapAF CM OO 1860478-1860536 (Ptrcl6-gapA) Ptrc-gapAR O O 1860762-1860800 Gene pykA DpykAF N0 44 1935756-1935836 DpykAR N0 45 1937055-1937135 Gene pykF DpykFF VD Γ-- 1753689-1753766 DpykFR O O 1755129-1755051 Gene ackA-pta DackAF 00 2411494-2411573 o DptaR N0 49 2414906-2414830 Gene poxB DpoxBF N0 50 908557-908635 DpoxBR N0 51 910262-910180 c) Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 AarcA:: km

0 gene arcA foi inativado na cepa de E. coli MG1655 5 através de inserção de um cassete de resistência ao antibiótico canamicina e deleção da maioria do gene em questão usando a técnica descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 2. A cepa resultante foi denominada E coli MG1655 AarcA::km.

d) Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, AplfABr AadhEr AldhAr AgloAr AaldAr AaldBr Aeddr AarcA

A deleção do gene arcA através de substituição do gene por um cassete de resistência à canamicina na cepa E. coli MG1655 Ipd*r AtpiAr AflABr AadhEr AldhA::cmr AgloAr AaldAr AaldBr Aedd foi realizada através da técnica de transdução com fago PI.

Protocolo 3: Transdução com fago PI para deleção de um gene

A deleção do gene escolhido através de substituição do gene por um cassete de resistência (clorafenicol ou canamicina) na cepa de E. coli recipiente foi realizada através da técnica de transdução com fago Pl. 0 protocolo foi em duas etapas, (i) o preparo do lisato de fago sobre a cepa MG1655 com um único gene deletado e (ii) a transdução da cepa recipiente através desse lisato de fago.

Preparo do lisato de fago

- Cultura com 100 μΐ de uma cultura noturna da cepa MG1655 com um único gene deletado de 10 ml de LB + 30 μg/ml de Cm + glicose a 0,2% + CaCl2 a 5 mM.

- Incubação durante 30 min a 37°C com agitação.

- Adição de 100 μΐ de lisato de fago Pl preparado sobre a cepa MG1655 do tipo silvestre (aprox. 1 x IO9 fagos/ml).

- Agitação a 37 0C durante 3 horas até que todas as células tenham sido submetidas à Iise.

- Adição de 200 μΐ de clorofórmio e turbilhonamento.

- Centrifugação durante 10 min a 4500 g para eliminar os residuos celulares.

- Transferência do sobrenadante para um tubo estéril e adição de 200 μΐ de clorofórmio.

- Armazenamento do lisato a 4°C.

Transdução

- Centrifugação durante 10 min a 1500 g de 5 ml de uma cultura noturna da cepa recipiente de E. coli em meio LB. - Suspensão da pelota de células em 2,5 ml de MgSO4 a mM, CaCl2 a 5 mM.

- Tubos de Controle: 100 μΐ de células

100 μΐ de fagos Pl da cepa MG1655 com um único gene deletado

- Tubo de ensaio: 100 μΐ de células + 100 μΐ de fagos Pl da cepa MG1655 com um único gene deletado.

- Incubação durante 30 min a 30°C sem agitação.

- Adição de 100 μΐ de citrato de sódio a IM em cada tubo e turbilhonamento.

- Adição de 1 ml de LB.

- Incubação durante 1 hora a 370C com agitação.

- Colocação de 30 μg/ml sobre discos LB + CM após centrifugação dos tubos durante 3 min a 7000 rpm.

- Incubação a 370C durante a noite.

Os transformantes resistentes a antibiótico foram, então, selecionados e a inserção da deleção foi verificada através de uma análise por PCR com os oligonucleotídeos apropriados fornecidos na Tabela 1.

A cepa resultante foi denominada E. coli MG1655 Ipd*, AtpiAr ApflABr AadhEr AldhA::cm, AgloAr AaldAr AaldBr Aeddr AarcA::km. Os cassetes de resistência ao clorafenicol e canamicina foram, então, eliminados de acordo com o Protocolo I. A cepa obtida foi denominada E. coli MG1655 Ipd*, AtpiAf ApflABf AadhEr AldhAr AgloAr AaldAr AaldBr Aeddr AarcA.

e) Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 Andh::km

0 gene ndh foi inativado através de inserção de um cassete de resistência ao antibiótico canamicina e deleção 10 da maioria do gene em questão usando a técnica descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 2. A cepa resultante foi denominada E. coli MG1655 Andh::km.

f) Construção de uma cepa de E. coli MG1655 Ipd*r AtpiAr AplfABr AadhEr AldhAr AgloAr AaldAr AaldBr Aeddr AarcAr

Andh

A deleção do gene ndh através de substituição do gene por um cassete de resistência à canamicina na cepa de E. coli MG1655 Ipd*r AtpiAr AplfABr AadhEr AldhAr AgloAr 20 AaldAr AaldBr Aeddr AarcA foi realizada conforme previamente usando a técnica de transdução com o fago PI descrita no Protocolo 3.

A cepa resultante foi denominada E. coli MG1655 Ipd*, AtpiAf ApflABf AadhEf AldhAf AgloAf AaldAf AaldBf Aeddf AarcAf Andh::km.

O cassete de resistência à canamicina foi, então, eliminado de acordo com o Protocolo I. A cepa obtida foi denominada E. coli MG1655 Ipd*f AtpiAf ApflABf AadhEf AldhAf AgloAf AaldAf AaldBf Aeddf AarcAf Andh.

Em cada etapa, a presença das modificações feitas previamente na cepa foi verificada usando os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 1.

Exemplo 2: Evolução da cepa modificada E. coli MG1655 Ipd* AtpiAf ApflABf AadhEf AldhA::cm, AgloAf AaldAf AaldBf Aedd em cultura em Chemostat sob condições microaeróbicas e caracterização fisiológica de evolução

Para evoluir à produção aprimorada de 1,2-propanodiol, 15 a cepa de E. coli MG1655 Ipd* AtpiAf ApflABf AadhEf AldhA::cmf AgloAf AaldAf AaldBf Aedd foi cultivada em cultura contínua sob condições anaeróbicas por um lado e sob condições microaeróbicas (1% de oxigênio) por outro lado no meio de cultura MPG, tal como descrito 20 anteriormente, com glicose em excesso (de 20 g/l inicialmente com adição se a glicose se torna esgotada). A temperatura foi ajustada a 37°C e o pH foi regulado a 6,5 através da adição de uma base. A evolução da cepa nos Chemostats foi acompanhada através do aumento da concentração de biomassa associada ao aumento das concentrações do produto, 1,2-propanodiol, e do co-produto acetato, durante várias semanas (de 4 semanas até 6 meses).

Isso denotou o aprimoramento dos desempenhos das cepas. Quando as culturas atingiram um estado uniforme sem mais nenhum aumento das concentrações sob essas condições, a evolução foi feita.

As características das cepas antes e após evolução 10 foram avaliadas. Colônias únicas representando clones individuais foram isoladas sobre discos de Petri. Esses clones foram avaliados usando a cepa inicial como controle em um ensaio em frasco de Erlenmeyer usando o mesmo meio MPG usado na cultura em Chemostat. Dentre esses clones, 15 vários apresentaram melhoras taxas específicas de produção de 1,2-propanodiol quando comparado com o controle. Esses clones foram selecionados para as etapas seguintes. Os resultados obtidos com o melhor clone para cada condição de evolução são reportados nas Tabelas 4 e 5 abaixo.

Tabela 4: Comparação do clone melhor evoluído após evolução sob condições anaeróbicas com a cepa inicial

Cepa E. coli MG1655 Cepa inicial Clones melhor Ipd* AtpiA ApflAB AadhE antes de evoluídos AldhA::cm AgloA Aaldr evolução (desempenhos AaldB Aedd (desempenhos medidos após 2 medidos após 2 dias de cultura) dias de cultura) Taxa específica de 0,12 0,21 (+ 75%) consumo de glicose (g de glicose /g de biomassa /h) Taxa específica de 0, 02 0,07 (+250%) produção de 1,2- propanodiol (g de 1,2- propanodiol /g de biomassa /h) Taxa específica de 0,04 0,08 (+ 100%) produção de 1,2- propanodiol + hidróxiacetona (g de 1,2-propanodiol + hidróxiacetona /g de biomassa /h) Tabela 5: Comparação do clone melhor evoluido após evolução sob condições microaeróbicas com a cepa inicial Cepa E. coli MG1655 Cepa inicial Clones melhor Ipd* AtpiA ApflAB AadhE antes de evoluídos AldhA::cm AgloA Aaldf evolução (desempenhos AaldB Aedd (desempenhos medidos após 2 medidos após 2 dias de cultura) dias de cultura) Taxa especifica de 0,10 0,22 (+ 120%) consumo de glicose (g de glicose /g de biomassa /h) Taxa específica de 0, 01 0,08 (+700%) produção de 1,2- propanodiol (g de 1,2- propanodiol /g de biomassa /h) Taxa específica de 0, 04 0,08 (+ 100%) produção de 1,2- propanodiol + hidróxiacetona (g de 1,2-propanodiol + hidróxiacetona /g de biomassa /h) Uma vez que esses clones foram cultivados durante um período de tempo prolongado sobre meio de cultura com extrato de levedo, eles precisaram ser adaptados para crescimento em meio mínimo. Os dois melhores clones cujos desempenhos são fornecidos nas Tabelas 4 e 5 foram 5 adaptados através de cultura serial sobre meio mínimo de forma a aumentar suas taxas de crescimento sob tais condições e a adaptação foi cessada quando suas taxas de crescimento estavam estáveis. Os clones da cultura final foram isolados e verificados como sendo representativos da 10 população adaptada.

Exemplo 3: Reconstrução do gene tpiA na cepa evoluída selecionada de E. coli MG1655 Ipd*, AtpiAf ApflABf AadhEf AldhA::cmf AgloAf AaldAf AaldBf Aedd:

a) Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 tpiA:: km

Um cassete de resistência ao antibiótico canamicina foi inserido a montante do gene tpiA de acordo com a técnica descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 2. A cepa resultante é denominada E. coli MG1655 tpiA::km.

Então, a reconstrução do gene tpiA na cepa evoluída de E. coli MG1655 Ipd*f AtpiAf AplfABf AadhEf AldhA::cmf AgloAf AaldAf AaldBf Aeddf AarcAf Andh foi realizada usando a técnica de transdução com o fago PI descrito no Protocolo 3.

A cepa resultante foi denominada E. coli evoluída MG1655 Ipd*, tpiArc::km AplfABr AadhEr AldhA::cmr AgloAr AaldAr AaldBr Aeddr AarcAr Andh.

Os cassetes de resistência à canamicina e clorafenicol foram, então, eliminados de acordo com o Protocolo 2. A cepa obtida foi denominada yE. coli evoluída tpiArc’.

A presença das modificações feitas previamente na cepa foi verificada usando os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 1.

Exemplo 4: Modificações da '£. coli evoluída tpiArc’ : atenuação do gene gapA; deleção dos genes pykA e pykF; superexpressão do gene ppsA com um vetor pJB137-PgapA-ppsA a) Substituição do promotor de gapA natural pelo promotor curto sintético Ftrcl6:

A substituição do promotor de gapA natural pelo promotor curto sintético Ptrcl6 (SEQ ID NO 52: gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtggaa) na cepa 20 coli evoluída tpiArc' foi feita através de substituição de 225 pb da seqüência do gapA a montante por FRT-CmR-FRT e um promotor manipulado.

A técnica usada é descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 2. A cepa resultante é denominada Έ. coli evoluída tpiArc' Ptrcl6-gapA::cm.

0 cassete de resistência ao clorafenicol foi, então, eliminado de acordo com o Protocolo I. A cepa obtida foi denominada coli evoluída tpiArc’ Ptrcl6-gapA.

b) Deleção do gene pykA

0 gene pykA é inativado através de inserção de um cassete de resistência ao antibiótico canamicina e deleção da maioria do gene em questão usando a técnica descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 2. A cepa resultante é denominada coli evoluída tpiArc’

Ptrcl6-gapA ApykA::km.

O cassete de resistência à canamicina é, então, eliminado de acordo com o Protocolo I. A cepa obtida é denominada E. coli evoluída tpiArc' Ptrcl6-gapA ApykA.

c) Deleção do gene pykF

O gene pykF é inativado através de inserção de um cassete de resistência ao antibiótico canamicina e deleção da maioria do gene em questão usando a técnica descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela

2. A cepa resultante é denominada E. coli evoluída tpiArc'Ptrcl6-gapA, ApykA ApykF::km.

Conforme previamente, o cassete de resistência à canamicina ê, então, eliminado de acordo com o Protocolo 1. A cepa obtida é denominada E. coli evoluída tpiArc'Ptrcl6- gapA, ApykAr ApykF.

d) Introdução de um vetor de expressão pJB137-PgapA-ppsA na cepa

Para aumentar a produção de fosfoenol piruvato, o gene ppsA foi expresso a partir do plasmídeo pJB137 usando o promotor de gapA. Para a construção do plasmídeo pJB137- PgapA-ppsA, o gene ppsA foi amplificado por PCR a partir do 10 DNA genômico de E. coli MG1655 usando os seguintes oligonucleotídeos:

1. gapA-ppsAF, consistindo de 65 bases (SEQ ID NO 53) ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTC

ACCGCTGGTGC com:

- uma região (letras maiúsculas) homóloga à seqüência (1785106-1785136) do gene ppsA (1785136 a 1782758), uma seqüência de referência no website

http://qenolist.pasteur.fr/Colibri/) e - uma região (letras minúsculas) homóloga ao promotor

de gapA (1860794 - 1860761).

2. ppsAR, consistindo de 43 bases (SEQ ID NO 54) aatcgcaaqcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC

com: - uma região (letras maiúsculas) homóloga à seqüência (1782758 - 1782780)

- a região do gene ppsA (1785136 a 1782758)

- um sítio de restrição Hindlll (letras sublinhadas)

Ao mesmo tempo, a região promotora de gapA do gene

gapA de E. coli foi amplificada usando os seguintes oligonucleotídeos:

1. gapA-ppsAR, consistindo de 65 bases (SEQ ID NO 55) GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttag

tgaataaaagg com:

- uma região (letras maiúsculas) homóloga à seqüência (1785106 -1785136) do gene ppsA (1785136 a 1782758) e

- uma região (letras minúsculas) homóloga ao promotor de gapA (1860794 - 1860761).

2. gapAF, consistindo de 33 bases (SEQ ID NO 56) ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc

com:

- uma região (letras minúsculas) homóloga ao promotor de gapA (1860639 - 1860661).

- um sítio de restrição Smal (letras sublinhadas)

Ambos os fragmentos foram subseqüentemente fundidos

usando os oligonucleotídeos ppsAR e gapAF (Horton e colaboradores, 1989 Gene 77: 61-68). O fragmento amplificado por PCR foi cortado com as enzimas de restrição Hindlll e Smal e clonado nos sítios Hindlll/Smal do vetor pJB137 (Número de Acesso ao EMBL: U75326), proporcionando o vetor pJB137-PgapA-ppsA. Plasmídeos recombinantes foram verificados através de seqüenciamento de DNA.

0 plasmídeo pBl37-PgapA-ppsA é introduzido na cepa evoluída de E. coli tpiArc Ptrcl 6-gapA, ApykA, ApykF.

A cepa obtida é denominada E. coli evoluída tpiArc Ptrcl6-gapA, ApykAr ApykF, (pJB13 7-PgapA-ppsA) .

Em cada etapa, a presença das modificações previamente

feitas na cepa foi verificada usando os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 1.

Exemplo 5: Construção de uma cepa de E. coli evoluída tpiArc Ptrcl6~gapA, ApykA, ApykFf AackA-pta, ApoxB (pJB137-PgapA-ppsA) capaz de produzir 1,2-propanodiol sem acetato como subproduto

a) Construção de uma cepa de E. coli modificada M1655 ZlackA-pta: : cm

Os genes ackA e pta são inativados através de inserção de um cassete de resistência ao antibiótico clorafenicol e deleção da maioria do gene em questão usando a técnica descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 2. A cepa resultante é denominada E. coli MG1655 zla ckA-pta : : cm.

b) Construção de uma cepa de E. coli evoluída tpiArc Ptrcl6-gapA, ApykAr ApykF, AackA-pta

A deleção dos genes ackA e pta na cepa de E. coli evoluída tpiArc Ptrcl-gapA, ApykA, ApykF é realizada conforme previamente usando a técnica de transdução com fago PI conforme descrito no Protocolo 3.

A cepa resultante é denominada E. coli evoluída tpiArc Ptrcl6-gapA, ApykAf ApykFr AackA-pta::cm.

Conforme previamente, o cassete de resistência ao

clorafenicol é, então, eliminado de acordo com o Protocolo I. A cepa obtida é denominada E. coli evoluída tpiArc Ptrcl6-gapAr ApykAr ApykFr AackA-pta.

c) Construção de uma cepa modificada evoluída de E. coli tpiArc Ptrcl-gapAr ApykAr ApykFr AackA-pta r ApoxB (pJB137-

PgapA-ppsA)

O gene poxB é inativado através de inserção de um cassete de resistência ao antibiótico clorafenicol e deleção da maioria dos genes em questão usando a técnica descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 2.

A cepa resultante é denominada E. coli evoluída tpiArc Ptrcl6-gapAr ApykAr ApykFr AackA-ptar ApoxB::cm. Conforme previamente, o cassete de resistência ao clorafenicol é, então, eliminado de acordo com o Protocolo

I. A cepa obtida é denominada E. coli evoluída tpiArc Ptrcl6-gapA, ApykAf ApykFr AackA-pta, ApoxB.

0 plasmídeo pB137-PgapA-ppsA é introduzido na cepa de

E. coli evoluída tpiArc Ptrcl-gapA, ApykA, ApykF, AackApta, ApoxB. A cepa obtida é denominada E. coli evoluída tpiArc Ptrcl6-gapA, ApykA, ApykF, AackA-pta, ApoxB (pJBl 3 7-PgapA-ppsA) .

Em cada etapa, a presença das modificações previamente

feitas na cepa é verificada usando os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 1.

Exemplo 6: Comparação das diferentes cepas evoluídas com relação à produção de 1,2-propanodiol sob condições aeróbicas

As cepas obtidas conforme descrito no Exemplo 4 e as cepas de controle (controle 1: MG1655 Ipd* AtpiA ApflAB AadhE AldhA::Cm AgloA Aald, AaldB Aedd evoluída sob condições anaeróbicas e controle 2: MG1655 Ipd* AtpiA 20 ApflAB AadhE AldhA::Cm AgloA Aald, AaldB Aedd evoluída sob condições microaeróbicas) foram cultivadas em um ensaio em frasco de Erlenmeyer sob condições aeróbicas em meio mínimo suplementado com extrato de levedo e com glicose como fonte de carbono. A cultura foi realizada a 34 0C e o pH foi mantido através de tamponamento do meio de cultura com MOPS. Ao final da cultura, 1,2-propanodiol, acetol e glicose residual no caldo de fermentação foram analisados 5 através de HPLC e os rendimentos de 1,2-propanodiol com relação à glicose e 1,2-propanodiol + acetol com relação à glicose foram calculadas. A melhor cepa é, então, selecionada para uma cultura de alimentação em batelada em um fermentador.

Cepa Titulação Titulação Rendimento Rendimento de 1,2- de acetol de 1,2- de 1,2- propanodiol (g/l) propanodiol propanodiol (g/l) (g/g de + acetol glicose) (g/g de glicose) Controle 1 1,88 2,1 0,16 0, 34 Controle 2 0,7 3, 56 0,06 ΓΓΟ o '£. coli 0,5 2,77 0,06 0, 42 evoluída tpiArc', Ptrcl6-gapA, (pJB137 PgapA-ppsA) (construída a partir do controle 1) 'E. coli 3,71 3, 85 O *---I evoluída CM o tpiArc', O Ptrcl6-gapA, (p JBl 37- PgapA-ppsA) (construída a partir do controle 2) Exemplo 7: Produção de 1,2-propanodiol em cultura alimentada em batelada com a melhor cepa

A melhor cepa selecionada no experimento anterior foi 5 cultivada em um fermentador de 2 1 usando um protocolo de alimentação em batelada.

A temperatura da cultura é mantida constante a 370C e o pH é permanentemente ajustado para valores entre 6,5 e 8 usando uma solução de NH4OH. A agitação é mantida entre 200 10 e 300 rpm durante a fase de batelada e é aumentada para até 1000 rpm no final da fase de alimentação em batelada. A concentração de oxigênio dissolvido é mantida em valores entre uma saturação de 30 e 40% usando um controlador de gás. Quando a densidade óptica atinge um valor entre três e cinco, a alimentação em batelada é iniciada com uma taxa de fluxo inicial entre 0,3 e 0,5 ml/h e um aumento progressivo 5 até valores de taxa de fluxo entre 2,5 e 3,5 ml/h. Nesse ponto, a taxa de fluxo é mantida constante durante 24 a 48 horas. O meio da alimentação é baseado em meio mínimo contendo glicose em concentrações entre 300 e 500 g/l.

Claims (27)

1. Método para o preparo de uma cepa evoluída de microorganismo para a produção de 1,2-propanodiol a partir de uma fonte de carbono, o referido método caracterizado pelo fato de compreender: crescimento de uma cepa inicial sob pressão de seleção em um meio de crescimento apropriado, a referida cepa bacteriana compreendendo uma atenuação da expressão do gene tpiA e uma atenuação da expressão de pelo menos um gene envolvido na conversão de metilglioxal em lactato, de forma a promover a evolução na referida cepa inicial, então - seleção e isolamento da cepa evoluída tendo uma taxa de produção aumentada de 1,2-propanodiol, então reconstrução de um gene tpiA funcional na cepa evoluída.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene envolvido na conversão de metilglioxal em lactato é selecionado do grupo consistindo de: gloA, aldA e aldB e combinações dos mesmos.

3. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a cepa inicial compreende, além disso, a atenuação da expressão de pelo menos um dos genes selecionados dentre o grupo consistindo de IdhA, pflA, pflF, adhE, edd e eda.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cepa inicial compreende, além disso, a atenuação de pelo menos um gene selecionado dentre o grupo consistindo de arcA e ndh.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a cepa evoluída é selecionada e isolada com base em sua taxa de produção de 1,2-propanodiol, aumentada em pelo menos 20% comparado com a taxa de produção da cepa inicial.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a cepa inicial é selecionada do grupo consistindo de bactérias, levedos e fungos.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cepa inicial é selecionada do grupo consistindo de Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteriaceae.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a cepa inicial é Escherichia coli ou Clostridium acetobutylicum.

9. Cepa evoluída de microorganismo caracterizada pelo fato de ser obtida através do método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. Cepa evoluída, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a atividade de dehidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato é atenuada.

11. Cepa evoluída, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a expressão do gene gapA é atenuada.

12. Cepa evoluída, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizada pelo fato de que a eficiência da importação de açúcar é aumentada.

13. Cepa evoluída, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o sistema de importação de açúcar independente de fosfoenol piruvato é usado.

14. Cepa evoluída, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre galP e glk é aumentada.

15. Cepa evoluída, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a eficiência do sistema de açúcar-fosfotransferase é aprimorada através de aumento da disponibilidade do metabólito fosfoenol piruvato.

16. Cepa evoluída, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a atividade de pelo menos uma quinase de piruvato é atenuada.

17. Cepa evoluída, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre pykA e pykF é atenuada.

18. Cepa evoluída, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizada pelo fato de que a atividade de sintase de fosfoenol piruvato é aumentada.

19. Cepa evoluída, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a expressão do gene ppsA é aumentada.

20. Cepa evoluída, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 19, caracterizada pelo fato de que a enzima que favorece o metabolismo de piruvato em acetil-CoA tem uma menor sensibilidade à inibição pelo NADH do que a enzima não modificada.

21. Cepa evoluída, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o gene Ipd tem uma mutação de ponto que leva a uma substituição de alanina por valina.

22. Cepa evoluída, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 21, caracterizada pelo fato de que a atividade de pelo menos uma enzima envolvida na síntese de acetato é atenuada.

23. Cepa evoluída, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre ackA, pta, poxB é atenuada.

24. Método para preparo de 1,2-propanodiol caracterizado pelo fato de que uma cepa evoluída conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 23 é crescida em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono e o 1,2-propanodiol produzido é recuperado.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que uma cepa evoluída de Escherichia coli é crescida em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples e o 1,2-propanodiol produzido é recuperado.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que uma cepa evoluída de Clostridium acetobutylicum é crescida em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples ou complexa e o 1,2-propanodiol produzido é recuperado.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que o 1,2-propanodiol recuperado é ainda purificado.