BRPI0809163A2 - Célula de planta trangeênica ou uma planta transgênica, polinucleotídeo isolado, polipeptídeo isolado, e, métodos de produzir uma planta transgênica, e de aumentar um crescimento e/ou rendimento da planta sob condições normais ou limitidas em água e/ou aumentar uma tolerância da planta a um estresse ambiental - Google Patents

Description

“CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA OU UMA PLANTA TRANSGÊNICA, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, E, MÉTODOS DE PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA, E DE AUMENTAR UM CRESCIMENTO E/OU RENDIMENTO DA PLANTA SOB CONDIÇÕES NORMAIS OU LIMITADAS EM ÁGUA E/OU AUMENTAR UMA TOLERÂNCIA DA PLANTA A UM ESTRESSE AMBIENTAL”

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito no geral às plantas transgênicas que superexpressam seqüências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos capazes de conferir tolerância ao estresse aumentada e consequentemente, crescimento de planta e rendimento de safra aumentados, sob condições de estresse normal ou abiótico. Adicionalmente, a invenção diz respeito a novas seqüências de ácido nucleico isoladas que codificam polipeptídeos que conferem em uma planta tolerância aumentada sob condições de estresse abiótico e/ou crescimento de planta aumentado e/ou rendimento aumentado sob condições de estresse normal ou abiótico.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Estresses ambientais abióticos, tais como seca, salinidade, calor e frio, são fatores limitantes principais de crescimento de planta e rendimento de safra. Rendimento de safra é aqui definido como o número de bushels de produto agrícola relevante (tal como grão, forragem ou semente) colhidos por acre. As perdas de safra e as perdas de rendimento de safra de safras principais tais como soja, arroz, milho (milho), algodão e trigo causada por estes estresses representam um fator econômico e político significante e contribuem para a escassez de alimento em muitos países subdesenvolvidos.

A disponibilidade de água é um aspecto importante do estresse abiótico e seus efeitos sobre o crescimento de planta. A exposição contínua às condições de seca causa alterações maiores no metabolismo da planta que por fim leva à morte da célula e consequentemente às perdas de rendimento. Porque o teor de sal alto em alguns sólidos resulta em menos água estando disponível para a captação pela célula, a concentração de sal alto tem um efeito sobre as plantas similar ao efeito da seca sobre as plantas.

5 Adicionalmente, sob temperaturas congelantes, as células vegetais perdem água como um resultado da formação de gelo dentro da planta. Consequentemente, o dano de safra do estresse pela seca, calor, salinidade e frio, é predominantemente devido à desidratação.

Porque as plantas são tipicamente expostas às condições de 10 disponibilidade de água reduzida durante o seu ciclo de vida, a maioria das plantas desenvolveram mecanismos protetores contra a dessecação causada pelos estresses abióticos. Entretanto, se a severidade e duração das condições de dessecação são muito grandes, os efeitos sobre o desenvolvimento, crescimento, tamanho da planta e rendimento da maioria das plantas de safra 15 são profundos. Desenvolver plantas eficientes no uso de água é portanto uma estratégia que tem o potencial para melhorar significantemente a vida humana em uma escala mundial.

As estratégias de cruzamento de planta tradicionais são relativamente lentas e requerem linhagens iniciadoras tolerantes ao estresse 20 abiótico para cruzar com outros germoplasma para desenvolver novas linhagens resistentes ao estresse abiótico. Recursos de germoplasma limitados para tais linhagens iniciadoras e a incompatibilidade nos cruzamentos entre espécies de planta distantemente relacionadas representam problemas significantes encontrados na geração convencional. A geração quanto a 25 tolerância tem sido amplamente mal sucedida.

Muitas companhias de biotecnologia agrícola têm tentado identificar genes que pudessem conferir tolerância às respostas ao estresse abiótico, em um esforço para desenvolver plantas de safra transgênicas tolerantes ao estresse abiótico. Embora alguns genes que estão envolvidos nas respostas ao estresse ou eficiência do uso da água em plantas tenham sido caracterizados, a caracterização e clonagem de genes vegetais que conferem tolerância ao estresse e/ou eficiência no uso da água permanece amplamente incompletas e fragmentadas. Até agora, o sucesso no desenvolvimento de 5 plantas de safra transgênicas tolerantes ao estresse abiótico tem sido limitado e nenhuma de tais plantas foram comercializadas.

De modo a desenvolver plantas de safra transgênicas tolerantes ao estresse abiótico, é necessário ensaiar vários parâmetros em sistemas de planta modelo, estudos em estufa de plantas de safra e em testes de campo. 10 Por exemplo, a eficiência no uso da água (WUE), é um parâmetro frequentemente correlacionado com a tolerância à seca. Estudos de uma resposta da planta à dessecação, choque osmótico e extremos de temperatura também são utilizados para determinar a tolerância ou resistência aos estresses abióticos da planta. Quando do teste quanto ao impacto da presença 15 de um transgene em uma tolerância ao estresse da planta, a capacidade para padronizar as propriedades do solo, temperatura, água e disponibilidade de nutriente e intensidade de luz é uma vantagem intrínseca de ambientes de estufa ou câmara de crescimento de planta comparadas com o campo.

A WUE foi definida e medida em modos múltiplos. Um 20 método é calcular a razão de peso seco da planta inteira, para o peso de água consumido pela planta por roda a sua vida. Uma outra variação é usar um intervalo de tempo mais curto quando o acúmulo de biomassa e o uso da água são medidos. Já um outro método é usar medições de partes restritas da planta, por exemplo, medir apenas o crescimento aéreo e o uso da água. A 25 WUE também foi definida como a razão de captação de CO2 para a perda de vapor d’água de uma folha ou porção de uma folha, frequentemente medido em um período de tempo muito curto (por exemplo, segundos/minutos). A

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razão de C/ C fixada no tecido vegetal e medido com um espectrômetro de massa de razão isotópica, também tem sido usado estimar a WUE em plantas usando a fotossíntese de C3.

Um aumento na WUE é informativo a cerca da eficiência relativamente melhorada de crescimento e consumo de água, mas esta informação tomada sozinha não indica se um destes dois processos tenha mudado ou ambos tenham mudado. Na seleção de traços para melhorar safras, um aumento na WUE devido a uma diminuição no uso da água, sem uma mudança no crescimento teria mérito particular em um sistema agrícola irrigado onde os custos de entrada de água foram altos. Um aumento na WUE direcionada principalmente por um aumento no crescimento sem um mudança súbita correspondente no uso da água teria aplicabilidade a todos os sistemas agrícolas. Em muitos sistemas agrícolas onde o fornecimento de água não é limitante, um aumento no crescimento, mesmo se ele vem às custas de um aumento no uso da água (isto é, nenhuma mudança na WUE), também aumentaria o rendimento. Portanto, novos métodos para aumentar tanto a WUE quanto o acúmulo de biomassa são requeridos para melhorar a produtividade agrícola.

Concomitante com as medições de parâmetros que se correlacionam com a tolerância ao estresse abiótico são medições de parâmetros que indicam o impacto potencial de um transgene sobre o 20 rendimento de safra. Para as safras de forragem como alfafa, milho de silagem e feno, a biomassa vegetal correlaciona-se com o rendimento total. Para as safras de grão, entretanto, outros parâmetros foram usados para estimar o rendimento, tal como tamanho da planta, como medido pelo peso seco da planta total, o peso seco acima do solo, o peso fresco acima do solo, área de 25 folha, volume do caule, altura da planta, diâmetro da roseta, comprimento da folha, comprimento da raiz, massa da raiz, número de brotos e número de folhas. O tamanho da planta em um estágio de desenvolvimento inicial tipicamente correlacionar-se-á com o tamanho da planta mais tarde no desenvolvimento. Um planta maior com uma área de folha maior pode tipicamente absorver mais luz e dióxido de carbono do que uma planta menor e portanto provavelmente ganhará um peso maior durante o mesmo período. Isto é, além da continuação potencial da vantagem micro-ambiental ou genética que a planta teve para alcançar o tamanho inicialmente maior. Existe 5 um componente genético forte para o tamanho da planta e taxa de crescimento e assim para uma faixa de genótipos diversos de tamanho da planta sob uma condição ambiental é provável correlacionar-se com o tamanho sob uma outra. Deste modo um ambiente padrão é usado para se aproximar dos ambientes diversos e dinâmicos encontrados em locais e tempos diferentes 10 pelas safras no campo.

O índice de colheita, a razão do rendimento de semente para o peso seco acima do solo, é relativamente estável sob muitas condições ambientais e assim uma correlação robusta entre o tamanho da planta e rendimento de grão é possível. O tamanho da planta e o rendimento do grão 15 estão intrinsecamente ligados, porque a maioria da biomassa de grão é dependente da produtividade fotossintética corrente ou armazenada pelas folhas e caules da planta. Portanto, selecionar quanto ao tamanho da planta, mesmo nos estágios iniciais de desenvolvimento, tem sido usado como para triar quanto a plantas que possam demonstrar rendimento aumentado quando 20 expostas ao teste de campo. Como com a tolerância ao estresse abiótico, as medições de tamanho da planta no desenvolvimento inicial, sob condições padronizadas em uma câmara de crescimento ou estufa, são práticas padrão para medir as vantagens de rendimento potencial conferidas pela presença de um transgene.

Existe uma necessidade, portanto, para identificar genes

adicionais expressados nas plantas tolerantes ao estresse e/ou plantas que são eficientes no uso da água que têm a capacidade para conferir tolerância ao estresse e/ou eficiência aumentada no uso da água para a planta hospedeira e para outras espécies vegetais. Plantas tolerantes ao estresse e/ou plantas com eficiência aumentada no uso da água recém geradas terão muitas vantagens, tais como uma faixa aumentada em que as plantas de safra possam ser cultivadas, por exemplo, pela diminuição das exigências de água de uma espécie vegetal. Outras vantagens desejadas incluem resistência aumentada 5 para fixação, a flexão de brotos ou caules em resposta ao vento, chuva, pragas ou doença.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores descobriram que transformar uma planta com certos polinucleotídeos resulta no realce do crescimento e/ou 10 resposta da planta ao estresse ambiental e consequentemente o rendimento dos produtos agrícolas da planta é aumentado, quando os polinucleotídeos estão presentes na planta como transgenes. Os polinucleotídeos capazes de mediar tais realces foram isolados de Physcomitrella patens, Brassiea napus, Zea mays, Linum usitatissimum, Oryza satvia, Glyeine max ou Tritieum 15 aestivum e são listados na Tabela 1 e as suas seqüências são apresentadas na Listagem de Seqüência como indicado na Tabela 1.

Tabela 1

Nome do BD do Gene Organismo SEQ DD NO do SEQ ID NO do Gene Polinucleotídeo Aminoácido PpTPT-I EST 214 P. patens 1 2 PpCDC2-l EST 280 P. patens 3 4 PpLRP-I EST 298a P. patens 5 6 EST 298b P. patens 55 56 EST 298c P. patens 57 58 PpRBP-I EST 300 P. patens 7 8 PpPD-I EST 362 P. patens 9 10 PpMSC-I EST 378 P. patens 11 12 PpMBP-I EST 398 P. patens 13 14 PpAK-I EST 407 P. patens 15 16 PpZF-6 EST 458 P. patens 17 18 PpCDK-I EST 479 P. patens 19 20 PpZF-7 EST 520 P. patens 21 22 PpMFP-I EST 544 P. patens 23 24 PpLRP-2 EST 545 P. patens 25 26 PpPPK-I EST 549 P. patens 27 28 PpSRP-I EST 554 P. patens 29 30 PpCBL-I EST 321 P. patens 31 32 PpCBL-2 EST 416 P. patens 33 34 PpHD-I EST 468 P. patens 35 36 BnHD-I BN51361834 B. napus 37 38 Nome do ED do Gene Organismo SEQ BD NO do SEQ ID NO do Gene Polinucleotídeo Aminoácido BnHD-2 BN50000854 B. napus 39 40 ZmHD-I ZM59324542 Z. mays 41 42 LuHD-I LU61552369 L. usitatissimum 43 44 OsHD-I OS34631911 O. sativa 45 46 GmHD-I GM59700314 G. max 47 48 GmHD-2 GM49753757 G. max 49 50 GmHD-3 GM50270592 G. max 51 52 TaHD-I TA60089198 T. aestivum 53 54 Em uma forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma tRNA 2’-fosfotransferase.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma quinase de proteína de controle da divisão celular.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de repetição rica em leucina.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína que liga Ran.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de divisão de plastídeo.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma

planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína carreadora do substrato mitocondrial.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de MADSbox.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína da adenosina quinase-1.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de dedo de zinco 6.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de subunidade reguladora da quinase dependente de ciclina.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de dedo de zinco 7.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma

planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de ligação de MAR.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína receptora da repetição rica em leucina.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína da quinase de proteína fitocrômica.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de sinaptobrevina.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína B de calcineurina.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína da caleosina.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína da histona desacetilase.

Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a uma semente produzida pela planta transgênica da invenção, em que a semente é geração verdadeira para um transgene que compreende o polinucleotídeo descrito acima. As plantas derivadas da semente da invenção 20 demonstram tolerância aumentada a um estresse ambiental e/ou crescimento de planta aumentado e/ou rendimento aumentado, sob condições normal ou de estresse quando comparadas com uma variedade do tipo selvagem da planta.

Ainda em um outro aspecto, a invenção diz respeito a produtos produzidos pelas ou das plantas transgênicas da invenção, suas partes vegetais ou suas sementes, tais como um gênero alimentício, ração, suplemento alimentar, suplemento de ração, cosmético ou produto farmacêutico.

A invenção fornece ainda os polinucleotídeos isolados identificados na Tabela 1 ou na Tabela 2 abaixo e polipeptídeos identificados na Tabela I. A invenção também é personificada em vetor recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado da invenção.

Ainda em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um método de produzir a planta transgênica supracitada, em que o método compreende transformar uma célula vegetal com um vetor de expressão que 5 compreende um polinucleotídeo isolado da invenção e gerar a partir da célula vegetal uma planta transgênica que expressa o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo. A expressão do polipeptídeo na planta resulta na tolerância aumentada a um estresse ambiental e/ou crescimento e/ou rendimento sob condições normais e/ou de estresse quando comparadas com uma variedade 10 do tipo selvagem da planta.

Ainda em uma outra forma de realização, a invenção fornece um método de aumentar uma tolerância da planta a um estresse ambiental e/ou crescimento e/ou rendimento. O método compreende as etapas de transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão que compreende 15 um polinucleotídeo isolado da invenção e gerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal, em que a planta transgênica compreende o polinucleotídeo.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

A Figura 1 é um diagrama que ilustra as relações filogenéticas 20 entre as seqüências de aminoácido de PpHD-I (SEQ ID NO:36), BnHD-I (SEQ ID NO:38), BnHD-2 (SEQ ID N0:40), ZmHD-I (SEQ ID NO:42), LuHD-I (SEQ ID NO:44), OsHD-I (SEQ ID NO:46), GmHD-I (SEQ ID NO:48), GmHD-2 (SEQ ID N0:50), GmHD-3 (SEQ ID NO:52) e TaHD-I (SEQ ID NO:54) divulgadas. O diagrama foi gerado usando Align X da 25 Vector NTI.

A Figura 2 mostra um alinhamento das seqüências de aminoácido divulgadas: PpHD-I (SEQ ID NO:36), BnHD-I (SEQ ID NO:38), BnHD-2 (SEQ ID N0:40), ZmHD-I (SEQ ID NO:42), LuHD-I (SEQ ID NO:44), OsHD-I (SEQ ID NO:46), GmHD-I (SEQ ID NO:48), GmHD-2 (SEQ ID N0:50), GmHD-3 (SEQ ID NO:52) e TaHD-I (SEQ ID NO:54). O alinhamento foi gerado usando Align X da Vector NTI.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS Por todo este pedido, várias publicações são dadas como

referência. As divulgações de todas estas publicações e daquelas referências citadas dentro destas publicações em suas totalidades são por meio deste incorporadas por referência neste pedido de modo a descrever mais completamente o estado da técnica à qual esta invenção pertence. A 10 terminologia aqui usada é com o propósito de descrever apenas as formas de realização específicas e não é intencionada a ser limitante. Como aqui usado, “um” ou “uma” podem significar um(a) ou mais, dependendo do contexto em que são usados. Assim, por exemplo, referência a “uma célula” pode significar que pelo menos uma célula pode ser usada.

Em uma forma de realização, a invenção fornece uma planta

transgênica que super expressa um polinucleotídeo isolado identificado na Tabela 1 ou um homólogo deste. A planta transgênica da invenção demonstra uma tolerância aumentada a um estresse ambiental quando comparada com uma variedade do tipo selvagem da planta. A super expressão de tais ácidos 20 nucleicos isolados na planta pode opcionalmente resultar em um aumento no crescimento de planta ou no rendimento de produtos agrícolas associados, sob condições normais ou de estresse, quando comparados com uma variedade do tipo selvagem da planta. Sem desejar estar ligado por qualquer teoria, acredita-se que a tolerância aumentada a um estresse ambiental, crescimento 25 aumentado e/ou rendimento aumentado de uma planta transgênica da invenção resulte de um aumento na eficiência no uso da água da planta.

Como aqui definido, uma “planta transgênica” é uma planta que foi alterada usando a tecnologia de DNA recombinante para conter um ácido nucleico isolado que de outro modo não estaria presente na planta. Como aqui usado, o termo “planta” inclui uma planta inteira, células vegetais e partes de planta. As partes de planta incluem, mas não são limitadas a, caules, raízes, óvulos, estames, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos e outros. A 5 planta transgênica da invenção pode ser estéril macho ou fértil macho e pode incluir ainda transgenes outros que não aqueles que compreendem os polinucleotídeos isolados aqui descritos.

Como aqui usado, o termo “variedade” refere-se a um grupo de plantas dentro de uma espécie que compartilha características constantes que as separam da forma típica e de outras variedades possíveis dentro desta espécie. Embora possuam pelo menos um traço distintivo, uma variedade também é caracterizada por alguma variação entre indivíduos dentro da variedade, com base primariamente na segregação Mendeliana de traços entre a progênie de gerações sucessoras. Uma variedade é considerada “geração verdadeira” quanto a um traço particular se a mesma é geneticamente homozigota para este traço até o grau em que, quando a variedade de geração verdadeira é auto-polinizada, uma quantidade significante de segregação independente do traço entre a progênie não é observada. Na presente invenção, o traço surge da expressão transgênica de um ou mais polinucleotídeos isolados introduzidos em uma variedade de planta. Como também aqui usado, o termo “variedade do tipo selvagem” refere-se a um grupo de plantas que são analisadas para propósitos comparativos como uma planta de controle, em que a planta da variedade do tipo selvagem é idêntica à planta transgênica (planta transformada com um polinucleotídeo isolado de acordo com a invenção) com a exceção de que a planta da variedade do tipo selvagem não foi transformada para conter um polinucleotídeo isolado da invenção.

Como aqui definido, o termo “ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são intercambiáveis e referem-se ao RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de filamento único ou duplo ou um híbrido deste. O termo também abrange híbridos de RNA/DNA. Uma molécula de ácido nucleico “isolada” é uma que é substancialmente separada de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural do ácido 5 nucleico (isto é, seqüências que codificam outros polipeptídeos). Por exemplo, um ácido nucleico clonado é considerado isolado. Um ácido nucleico também é considerado isolado se o mesmo foi alterado pela intervenção humana ou colocado em um local ou localização que não é o seu sítio natural ou se o mesmo é introduzido em uma célula pela transformação. IO Além disso, uma molécula de ácido nucleico isolada, tal como uma molécula de cDNA, pode estar livre de alguns dos outros materiais celulares com os quais está naturalmente associada ou meio de cultura quando produzida pelas técnicas recombinantes ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizadas. Embora possa opcionalmente abranger a 15 seqüência não traduzida localizada tanto na extremidade 3’ quanto na 5’ da região codificadora de um gene, pode ser preferível remover as seqüências que naturalmente flanqueiam a região codificadora no seu réplicon que ocorre naturalmente.

Como aqui usado, o termo “estresse ambiental” refere-se a 20 uma condição sub-óptima associada com a salinidade, seca, nitrogênio, temperatura, metal, produto químico, estresses patogênicos ou oxidativos ou qualquer combinação destes. Os termos “eficiência no uso da água” e “WUE” referem-se à quantidade de matéria orgânica produzida por uma planta dividida pela quantidade de água usada pela planta na sua produção, isto é, o 25 peso seco de uma planta em relação ao uso de água da planta. Como aqui usado, o termo “peso seco” refere-se a tudo na planta outro que não água e inclui, por exemplo, carboidratos, proteínas, óleos e nutrientes minerais.

Qualquer espécie vegetal pode ser transformada para criar uma planta transgênica de acordo com a invenção. A planta transgênica da invenção pode ser uma planta dicotiledônea ou uma planta monocotiledônea. Por exemplo e sem limitação, as plantas transgênicas da invenção podem ser derivadas de qualquer uma das seguintes famílias de planta dicotiledônea: Leguminosae, incluindo plantas tais como ervilha, alfafa e soja; Umbelliferae, incluindo plantas tais como cenoura e aipo; Solanaceae, incluindo plantas tais como tomate, batata, beringela, tabaco e pimentão; Crueiferae, particularmente o gênero Brassiea, que inclui plantas tais como colza, beterraba, repolho, couve-flor e brócolis); e Arabidopsis thaliana; Compositae, que inclui plantas tais como alface; Malvaeeae, que inclui o algodão; Fabaeeae, que inclui plantas tais como amendoim e outras. As plantas transgênicas da invenção podem ser derivadas de plantas monocotiledôneas, tais como, por exemplo, trigo, cevada, sorgo, painço, centeio, triticale, milho, arroz, aveia, switehgrass, miscanthus e cana de açúcar. As plantas transgênicas da invenção também são personificadas como árvores tais como macieira, pereira, marmeleiro, ameixeira, cerejeira, pessegueiro, de nectarina, albricoqueiro, mamoeiro, mangueira e outras espécies lenhosas incluindo árvores coníferas e decíduas tais como álamo, pinheiro, sequóia, cedro, carvalho, salgueiro e outros. Especialmente preferidas são Arabidopsis thaliana, Nieotiana tabaeum, colza, soja, milho (milho), trigo, linhaça, batata e tagetes.

Como mostrado na Tabela 1, uma forma de realização da invenção é uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo da tRNA 2’-fosfotransferase. Em leveduras, a proteína Tptl da RNA T25 fosfotransferase é uma proteína essencial que catalisa a etapa final da união do tRNA. Embora esta família de proteínas seja conservada em eucariotas, bactérias e arehaea, a sua função apenas foi bem caracterizada em levedura. A união do tRNA é conservada em todos os três reinos principais, mas os mecanismos e enzimas envolvidas diferem. Estas diferenças deixam a função exata das proteínas da RNA 2’-fosfotransferase em plantas incerta, embora a atividade enzimática tenha sido demonstrada em extratos nucleares de tabaco. Todos os membros da família da RNA 2’-fosfotransferase contêm um domínio de núcleo conservado, exemplificado pelos aminoácidos de 98 a 287 5 da SEQ ID NO: 2 e membros da Escherichia eoli, Arabidopsis thaliana, Schizosaccharomyces pombe e Homo sapiens são capazes de complementar o mutante tptl de Saccharomyees cerevisiae, indicando similaridade de função.

A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifica uma tRNA T10 fosfotransferase. Preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma tRNA 2’fosfotransferase tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 98 a 287 da SEQ ID NO: 2. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma tRNA 15 2’-fosfotransferase tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 323 da SEQ ID NO: 2.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma quinase de proteína 20 de controle da divisão celular 2 (CDC2). As proteínas CDC2 pertencem a uma família específica de quinases dependentes de ciclina (CDKs) em plantas habitualmente aludidas como a família CDKA. Todas as proteínas CDKA contêm um domínio da quinase de núcleo altamente conservada com um motivo PSTAIRE que é o sítio fundamental para a interação da ciclina para 25 formar complexos de CDK-ciclina ativos. Um motivo PSTAIRE exemplar é representado como os aminoácidos de 4 a 287 da SEQ ID NO: 4. As proteínas CDKA também são submetidas à modificação pós traducional. A fosforilação das treonina 14 e tirosina 15 conservadas inativa a CDKA e a fosforilação da posição treonina 161 conservada ativa a CDKA. Em levedura estas CDKs estão envolvidas especificamente nos controles de Gl/S e G2/M. Em plantas, as CDKA’s são propostas funcionar na progressão tanto da fase S quanto da M e estar envolvidas na proliferação celular e manutenção da competência da divisão celular em tecidos diferenciadores. Na Arabidopsis thaliana por 5 exemplo, uma mutação do gene CDKAl leva à letalidade gametofítica masculina e prejudica o desenvolvimento de semente pela redução do tamanho da semente.

A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma quinase de proteína 10 CDC2. Preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína CDKA tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 4 a 287 da SEQ ID NO: 4. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína CDKA tendo uma 15 seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 294 da SEQ ID NO: 4.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de repetição rica em leucina (LRR). As LRRs são tipicamente encontradas em 20 proteínas como repetições de 20 a 29 aminoácidos, cada uma contendo uma região conservada de 11 aminoácidos com a seqüência de consenso de LXXLXLXXN/CXL com X como qualquer aminoácido e L como valina, leucina ou fenilalanina. A proteína LRR da presente invenção contém uma LRR representada pelos aminoácidos 422 a 441 da SEQ ID NO: 6. A função 25 principal no geral aceita das LLRs é fornecer um esqueleto estrutural para a formação de interações de proteína-proteína. As proteínas contendo LLR são conhecidas por estarem envolvidas nas interações receptoras de hormônio, inibição de enzima, adesão celular, tráfico celular, resistência a doença de planta e virulência bacteriana. A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína LRR tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 422 a 441 da SEQ ID NO: 6. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização 5 compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de LRR tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 646 da SEQ ID NO: 6.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína que liga 10 Ran. As proteínas Ran GTPase (RanGTP) pertencem a uma subfamília de proteínas de ligação de GTP pequena que estão envolvidas no transporte nucleocitoplásmico e estão envolvidas no controle das funções nucleares por todo o ciclo celular. As proteínas que ligam Ran I (RanBPls) são proteínas citoplásmicas que formam um complexo com a forma GTP de RanGTP. O 15 domínio de ligação de RanBPls que interage com RanGTP foi identificado e é representado pelos aminoácidos de 51 a 172 da SEQ ID NO: 8. A formação deste complexo RanGTP-RanBPl é chave para promover a dissociação inicial de RanGTP a partir dos fatores de transporte que são exportados do núcleo para o citoplasma.

A planta transgênica desta forma de realização pode

compreender qualquer polinucleotídeo que codifique a proteína RanBPl tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 51 a 172 da SEQ ID NO: 8. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína RanBPl tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 213 da SEQ ID NO: 8.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de divisão de plastídeo. As proteínas de divisão de plastídeo FtsZ são caracterizadas pelos domínios representados pelos aminoácidos 139 a 332 da SEQ ID NO: 10. A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína de divisão de plastídeo tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 139 a 332 da SEQ 5 ID NO: 10. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de divisão de plastídeo tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de

1 a 490 da SEQ ID NO: 10.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína carreadora do substrato mitocondrial. As proteínas carreadoras do substrato mitocondrial são caracterizadas pelos domínios representados pelos aminoácidos de 1 a 98 da SEQ ID NO: 12. A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína carreadora do substrato mitocondrial tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 98 da SEQ ID NO: 12. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína carreadora do substrato mitocondrial tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 297 da SEQ ID NO: 12.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de MADSbox. Os domínios de ligação e dimerização de DNA de fatores de transcrição 25 do tipo SRF compreendem os domínios MADS-box representados pelos aminoácidos de 9 a 59 da SEQ ID NO: 14. A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína do fator de transcrição do tipo SRF que compreende um domínio MADS-box tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 9 a 59 da SEQ ID NO: 14. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de MADS-box tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 187 da SEQ ID NO: 14.

5 Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma

planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína da adenosina quinase 1 (ADK-1). A família pfkB de carboidrato quinases designada ADK-1 compreende domínios representados pelos aminoácidos de 10 23 a 339 da SEQ ID NO: 16. A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína de ADK-1 compreendendo um domínio tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 23 a 339 da SEQ ID NO: 16. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que 15 codifica uma proteína de ADK-I tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 343 da SEQ ID NO: 16.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de dedo de 20 zinco 6 (ZF-6). Estas proteínas compreendem um domínio IBR representado pelos aminoácidos de 210 a 272 da SEQ ID NO: 18. A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína ZF-6 compreendendo um domínio tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 210 a 272 da SEQ ID NO: 18. 25 Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína ZF-6 tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 594 da SEQ ID NO: 18.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína da subunidade reguladora da quinase dependente de ciclina (CDK). Estas proteínas compreendem um domínio representado pelos aminoácidos de 1 a 72 da SEQ ID NO: 20. A planta transgênica desta forma de realização pode 5 compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína CDK compreendendo um domínio tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 72 da SEQ ID NO: 20. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína CDK tendo uma seqüência que compreende os 10 aminoácidos de 1 a 91 da SEQ ID NO: 20.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de dedo de zinco 7 (ZF-7). Estas proteínas compreendem um domínio do tipo C3HC4 15 representado pelos aminoácidos de 20 a 60 da SEQ ID NO: 22. A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína ZF-7 compreendendo um domínio tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 20 a 60 da SEQ ID NO: 22. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de 20 realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína ZF-7 tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 347 da SEQ ID NO: 22.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que 25 compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de ligação de MAR. A planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de ligação de MAR tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 814 da SEQ ID NO: 24.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína receptora da repetição rica em leucina quinase. A proteína de LRP-2 da presente invenção contém diversas LRRs, representadas pelos aminoácidos de 111 a 133 da SEQ 5 ID NO: 26, aminoácidos de 135 a 158 da SEQ ID NO: 26, aminoácidos de 160 a 182 da SEQ ID NO: 26 e aminoácidos de 184 a 207 da SEQ ID NO: 26. A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína LRP-2 tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 111 a 133 da SEQ ID NO: 26, aminoácidos de 10 135 a 158 da SEQ ID NO: 26, aminoácidos de 160 a 182 da SEQ ID NO: 26 e aminoácidos de 184 a 207 da SEQ ID NO: 26. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína LRR tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 251 da SEQ ID NO: 26.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma

planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína da quinase de proteína fitocrômica. A planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína da quinase de 20 proteína fitocrômica tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 689 da SEQ ID NO: 28.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína relacionada com a 25 sinaptobrevina. Estas proteínas compreendem um domínio da sinaptobrevina representado pelos aminoácidos de 127 a 215 da SEQ ID NO: 30. A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína relacionada com a sinaptobrevina compreendendo um domínio tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 127 a 215 da SEQ ID NO: 30. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína relacionada com a sinaptobrevina tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 222 da SEQ ID NO: 30.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma

planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína B de calcineurina. Em plantas, uma família de proteínas foi descoberta que são proteínas sensoriais de cálcio com similaridade tanto com a subunidade B reguladora de 10 calcineurina quanto com os sensores de cálcio neuronais dos animais. Estas proteínas foram chamadas de proteínas equivalentes à calcineurina B (CBL). Estas proteínas CBL contêm motivos de controle de EF que são estruturalmente importantes para a ligação de cálcio e interagem especificamente com um grupo de proteína quinases Ser/Thr, designada como 15 quinases de proteína que interagem com CBL (CIPK). CIPKs mais provavelmente representam alvos de cálcio sentidos e transduzidos pelas proteínas de CBL.

Cada controle de EF consiste de uma alça de 12 aminoácidos flanqueados pelas duas hélices alfa, que liga um único íon cálcio por 20 intermédio do domínio de alça. Estas proteínas também foram descobertas ligar íons magnésio. As proteínas com quanto motivos de controle EF usualmente têm dois domínios estruturais, cada um formado por um par de motivos de controle de EF separados por um ligador flexível. A ligação do íon metálico à proteína de controle EF leva a uma mudança conformacional que 25 expõem uma superfície hidrofóbica, que se liga a uma seqüência alvo. Muitas proteínas contendo controles EF também contêm um sítio de miristoilação no terminal N, com a seqüência de consenso de MGXXXS/T, com X representando qualquer aminoácido. A miristoilação neste sítio promove a interação de proteína-proteína ou proteína-membrana. Este sítio de miristoilação não está presente na seqüência EST321 (SEQ ID NO: 32), potencialmente indicando que a proteína EST321 poderia pertencer a uma classe diferente de proteínas contendo domínio de controle EF.

A proteína da subunidade B da calcineurina da presente invenção contém diversos motivos de controle EF, representados pelos aminoácidos de 37 a 65 da SEQ ID NO: 32, aminoácidos de 106 a 134 da SEQ ID NO: 32 e aminoácidos de 142 a 170 da SEQ ID NO: 32. A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína da subunidade B da calcineurina tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 37 a 65 da SEQ ID NO: 32, aminoácidos de 106 a 134 da SEQ ID NO: 32 e aminoácidos de 142 a 170 da SEQ ID NO: 32. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína da subunidade B da calcineurina tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 182 da SEQ ID NO: 32.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína relacionada com a caleosina. As caleosinas são uma família de proteínas que são 20 presumivelmente moduladas pela ligação de cálcio e estado de fosforilação e são consideradas como estando envolvidas na fusão de membranas e corpos oleosos. Estas proteínas contêm diversos domínios, uma região de terminal N com um único motivo de controle de EF que liga íon cálcio, uma região hidrofóbica central com uma âncora de membrana potencial e uma região de 25 terminal C com sítios de fosforilação da quinase de proteína conservados. A presença apenas de um único motivo de controle EF é inusitado para a maioria das proteínas contendo controle EF. Foi postulado que este domínio de controle EF único pode interagir com a superfície de membrana ou uma outra proteína de modo a formar a interação de domínio de controle EF duplo coordenado encontrado na maioria das outras proteínas de controle EF.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína relacionada com a 5 caleosina. Estas proteínas compreendem um domínio da caleosina representado pelos aminoácidos de 26 a 229 da SEQ ID NO: 34. A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína relacionada com a caleosina compreendendo um domínio tendo uma seqüência que compreende os 10 aminoácidos de 26 a 229 da SEQ ID NO: 34. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína relacionada com a caleosina tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 239 da SEQ ID NO: 34.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína da histona desacetilase. Nucleossomas consistem de histonas e DNA, que são essenciais para empacotar DNA em cromossomas. A lisina nas extremidades de terminal N de histonas de núcleo são os sítios predominantes para a acetilação e metilação e as histona desacetilases catalisam a remoção do grupo acetila destas cadeias laterais de lisina. Os genes ativos são preferencialmente associados com histonas altamente acetiladas e genes inativos são associados com histonas hipoacetiladas. A acetilação resulta na neutralização de carga de histonas e enfraquecem os contatos da histona/DNA. Em plantas, a hiperacetilação de histona está correlacionada com a atividade de gene.

As histonas são descobertas como estando associadas com complexos de multi-subunidade grande. Três famílias distintas de histona desacetilases são encontradas em plantas, a família RPD3/HDA, a família SIR2 e a família HD2 específica de planta. A família RPD3/HDA1 é encontrada em todos os organismos eucarióticos e os membros possuem um domínio de histona desacetilase completo. Algumas proteínas da histona desacetilase possuem regiões únicas fora do domínio da histona desacetilase que pode ser importante para a função e/ou especificidade destas proteínas.

As histona desacetilases da presente invenção são

caracterizadas pelos seguintes domínios: dos aminoácidos 6 a 318 da SEQ ID NO: 36; dos aminoácidos 6 a 318 da SEQ ID NO: 38; dos aminoácidos 20 a 332 da SEQ ID NO: 40; dos aminoácidos 8 a 322 da SEQ ID NO: 42; dos aminoácidos 6 a 318 da SEQ ID NO: 44; dos aminoácidos 23 a 333 da SEQ 10 ID NO: 46; dos aminoácidos 8 a 321 da SEQ ID NO: 48; dos aminoácidos 6 a 318 da SEQ ID NO: 50; dos aminoácidos 56 a 382 da SEQ ID NO: 52; e dos aminoácidos 23 a 333 da SEQ ID NO: 54.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que 15 compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína da histona desacetilase. A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína da histona desacetilase que compreende um domínio tendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste dos aminoácidos de 6 a 318 da SEQ ID NO: 36; 20 aminoácidos de 6 a 318 da SEQ ID NO: 38; aminoácidos de 20 a 332 da SEQ ID NO: 40; aminoácidos de 8 a 322 da SEQ ID NO: 42; aminoácidos de 6 a 318 da SEQ ID NO: 44; aminoácidos de 23 a 333 da SEQ ID NO: 46; aminoácidos de 8 a 321 da SEQ ID NO: 48; aminoácidos de 6 a 318 da SEQ ID NO: 50; aminoácidos de 56 a 382 da SEQ ID NO: 52; e aminoácidos de 23 25 a 333 da SEQ ID NO: 54. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína da histona desacetilase selecionada do grupo que consiste de uma proteína tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 431 da SEQ ID NO: 36; uma proteína tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de I a 426 da SEQ ID NO: 38; uma proteína tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 470 da SEQ ID NO: 40; uma proteína tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 363 da SEQ ID NO: 42; uma proteína tendo uma seqüência que compreende 5 os aminoácidos de 1 a 429 da SEQ ID NO: 44; uma proteína tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 518 da SEQ ID NO: 46; uma proteína tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 334 da SEQ ID NO: 48; uma proteína tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 429 da SEQ ID NO: 50; uma proteína tendo uma 10 seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 417 da SEQ ID NO: 52; e uma proteína tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 519 da SEQ ID NO: 54.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de repetição rica em leucina (LRR). As LRRs são tipicamente encontradas em proteínas como repetições de 20 a 29 aminoácidos, cada uma contendo uma região conservada de 11 aminoácidos com a seqüência de consenso de LXXLXLXXN/CXL com X como qualquer aminoácido e L como valina, leucina ou fenilalanina. A proteína LRR da presente invenção contém uma LRR representada pelos aminoácidos de 422 a 441 da SEQ ID NO: 56. A função principal no geral aceita das LLRs é fornecer um esqueleto estrutural para a formação de interações de proteína-proteína. As proteínas contendo LLR são conhecidas como estando envolvidas nas interações receptoras de hormônio, inibição de enzima, adesão celular, tráfico celular, resistência a doença de planta e virulência bacteriana.

A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína LRR tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 422 a 441 da SEQ ID NO: 56. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína LRR tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 698 da SEQ ID NO: 56.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de repetição rica em leucina (LRR). As LRRs são tipicamente encontradas em proteínas como repetições de 20 a 29 aminoácidos, cada uma contendo uma região conservada de 11 aminoácidos com a seqüência de consenso de LXXLXLXXN/CXL com X como qualquer aminoácido e L como valina, leucina ou fenilalanina. A proteína LRR da presente invenção contém uma LRR representada pelos aminoácidos de 422 a 441 da SEQ ID NO: 58. A função principal no geral aceita das LLRs é fornecer um esqueleto estrutural para a formação de interações de proteína-proteína. As proteínas contendo LLR são conhecidas por estarem envolvidas em interações receptoras de hormônio, inibição de enzima, adesão celular, tráfico celular, resistência a doença de planta e virulência bacteriana.

A planta transgênica desta forma de realização pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifique uma proteína LRR tendo 20 uma seqüência que compreende os aminoácidos de 422 a 441 da SEQ ID NO: 58. Mais preferivelmente, a planta transgênica desta forma de realização compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína LRR tendo uma seqüência que compreende os aminoácidos de 1 a 665 da SEQ ID NO: 58.

A invenção fornece ainda uma semente produzida por uma 25 planta transgênica que expressa os polinucleotídeos listados na Tabela 1, em que a semente contém o polinucleotídeo e em que a planta é de geração verdadeira quanto ao crescimento e/ou rendimento aumentados sob condições normais e/ou de estresse e/ou tolerância aumentada a um estresse ambiental quando comparada com uma variedade do tipo selvagem da planta. A invenção também fomece um produto produzido pelas ou das plantas transgênicas que expressam o polinucleotídeo, suas partes de planta ou suas sementes. O produto pode ser obtido usando vários métodos bem conhecidos na técnica. Como aqui usada, a palavra “produto” inclui, mas não é limitado 5 a, um gênero alimentício, ração, um suplemento alimentar, suplemento de ração, cosmético ou produto farmacêutico. Os gêneros alimentícios são considerados como composições usadas para nutrição ou para a nutrição suplementar. As rações de animal e suplementos de ração de animal, em particular, são consideradas como gêneros alimentícios. A invenção fomece 10 ainda um produto agrícola produzido por qualquer uma das plantas transgênicas, partes de planta e sementes de planta. Os produtos agrícolas incluem, mas não são limitados a, extratos de planta, proteínas, aminoácidos, carboidratos, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas e outros.

Em uma forma de realização preferida, um polinucleotídeo 15 isolado da invenção compreende um polinucleotídeo tendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste das seqüências de polinucleotídeo listadas na Tabela I. Estes polinucleotídeos podem compreender seqüências da região codificadora, assim como seqüências 5’ não traduzidas e seqüências 3’ não traduzidas. A Tabela 2 descreve posições de partida e término potenciais das 20 regiões codificadoras dos polinucleotídeos de P. patens da invenção e matrizes de leitura aberta alternativas que podem estar presentes nos filamentos de sentido ou de anti-sentido destes polinucleotídeos. Alternativamente, os polinucleotídeos da invenção podem compreender apenas a região codificadora das seqüências de nucleotídeo listadas na Tabela 25 1, como indicado na Tabela 2 ou os polinucleotídeos podem conter fragmentos genômicos inteiros isolados do DNA genômico. Assim a invenção também é personificada como um polinucleotídeo isolado tendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste das seqüências listadas na Tabela 1 ou Tabela 2. Tabela 2

Nome do Gene

ID do GFNF,

SEQID

NO

ORFs

Número de Orf

Filamento

Posição de partida

Posição final

PpTPT-I

EST 21

113

1104

PpCDC2-l

EST 28

37

921

PpCDC2-l

EST 28

380

42

PpLRP-I

EST 29

144

2084

EST 29

143

2236

EST 29

1998

PpRBP-I

EST 30

55

696

PpPD-I

EST 36

47

1519

PpPD-I

EST 36

1197

604

PpMSC-I

EST 37

453

1346

PpMSC-I

EST 37

1314

1027

PpMBP-I

EST 39

33

878

PpAK-I

EST 40

25

1056

PpAK-I

EST 40

381

632

PpAK-I

EST 40

506

270

PpZF-6

EST 45

126

1910

PpCDK-I

EST 47

248

523

PpCDK-I

EST 47

304

104

PpZF-7

EST 52

276

1319

PpZF-7

EST 52

583

813

PpMFP-I

EST 54

127

2571

PpLRP-2

EST 54

225

980

PpLRP-2

EST 54

416

694

PpLRP-2

EST 54

469

167

PpPPK-I

EST 54

145

2214

PpSRP-I

EST 55

20

688

PpCBL-I

EST 32

43

591

PpCBL-I

EST 32

803

1171

PpCBL-2

EST 41

16

735

PpHD-I

EST 46

166

1461

PpHD-I

EST 46

420

175

10

Um polinucleotídeo da invenção pode ser isolado usando técnicas da biologia molecular padrão e a informação de seqüência aqui fornecida. Por exemplo, cDNAs de P. patens da invenção foram isolados a partir de uma biblioteca de P. patens usando uma porção das seqüências aqui divulgadas. Os iniciadores de oligonucleotídeo sintético para a amplificação pela reação da cadeia da polimerase podem ser planejados com base na seqüência de nucleotídeo mostrada na Tabela I. Uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser amplificada usando cDNA ou, alternativamente, DNA genômico, como um padrão e iniciadores de oligonucleotídeo apropriados de acordo com as técnicas de amplificação da

^ PCR padrão. A molécula de ácido nucleico assim amplificada pode ser clonada em um vetor apropriado e caracterizada pela análise de seqüência de DNA. Além disso, oligonucleotídeos que correspondem às seqüências de nucleotídeo listadas na Tabela 1 podem ser preparadas pelas técnicas 5 sintéticas padrão, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automatizado.

“Homólogos” são aqui definidos como dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos que têm seqüências de nucleotídeo ou aminoácido similares ou substancialmente idênticas, respectivamente. Homólogos incluem variantes alélicas, análogos e ortólogos, como definido abaixo. Como aqui usado, o termo “análogos” referem-se a dois ácidos nucleicos que têm a mesma ou função similar, mas que evoluíram separadamente em organismos não relacionados. Como aqui usado, o termo “ortólogos” refere-se a dois ácidos nucleicos de espécies diferentes, mas que evoluíram de um gene ancestral comum pela especiação. O termo homólogo abrange ainda moléculas de ácido nucleico que diferem de uma das seqüências de nucleotídeo mostradas na Tabela 1 devido à degenerescência do código genético e assim codificam o mesmo polipeptídeo. Como aqui usado, uma molécula de ácido nucleico “que ocorre naturalmente” refere-se a uma molécula de RNA ou DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo que ocorre na natureza (por exemplo, codifica um polipeptídeo natural).

Para determinar a identidade de seqüência percentual de duas seqüências de aminoácido (por exemplo, uma das seqüências de polipeptídeo da Tabela 1 e um homólogo desta), as seqüências são alinhadas com 25 propósitos de comparação ótima (por exemplo, intervalos podem ser introduzidos na seqüência de um polipeptídeo para alinhamento ótimo com o outro polipeptídeo ou ácido nucleico). Os resíduos de aminoácido nas posições de aminoácido correspondentes são depois comparados. Quando uma posição em uma seqüência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido como a posição correspondente na outra seqüência então as moléculas são idênticas nesta posição. O mesmo tipo de comparação pode ser fabricada entre duas seqüências de ácido nucleico.

Preferivelmente, os homólogos, análogos e ortólogos de aminoácido isolados dos polipeptídeos da presente invenção são pelo menos cerca de 50 a 60 %, preferivelmente pelo menos cerca de 60 a 70 % e mais preferivelmente pelo menos cerca de 70 a 75 %, 75 a 80 %, 80 a 85 %, 85 a 90 % ou 90 a 95 % e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais idênticos a uma seqüência de aminoácido inteira identificada na Tabela I. Em uma outra forma de realização preferida, um homólogo de ácido nucleico isolado da invenção compreende uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos cerca de 40 a 60 %, preferivelmente pelo menos cerca de 60 a 70 %, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70 a 75 %, 75 a 80 %, 80 a 85 %, 85 a 90 % ou 90 a 95 % e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais idêntica a uma seqüência de nucleotídeo mostrada na Tabela 1 ou Tabela 2.

Para os propósitos da invenção, a identidade de seqüência percentual entre duas seqüências de ácido nucleico ou polipeptídeo é determinada usando o pacote de software Vector NTI 9.0 (PC) (Invitrogen, 20 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA92008). Uma penalidade de abertura de intervalo de 15 e uma penalidade de extensão de intervalo de 6,66 são usadas para determinar a identidade percentual de dois ácidos nucleicos. Uma penalidade de abertura de intervalo de 10 e uma penalidade de extensão de intervalo de 0,1 são usadas para determinar a identidade percentual de dois 25 polipeptídeos. Todos os outros parâmetros são definidos nos ajustes de default. Para os propósitos de um alinhamento múltiplo (o algoritmo Clustal W), a penalidade de abertura de intervalo é 10 e a penalidade de extensão de intervalo é 0,05 com matriz blosum62. Deve ser entendido que para os propósitos de determinar a identidade de seqüência quando da comparação de uma seqüência de DNA com uma seqüência de RNA, um nucleotídeo de timidina é equivalente a um nucleotídeo de uracila.

As moléculas de ácido nucleico que correspondem aos homólogos, análogos e ortólogos dos polipeptídeos listados na Tabela 1 5 podem ser isolados com base na sua identidade com os ditos polipeptídeos, usando os polinucleotídeos que codificam os respectivos polipeptídeos ou iniciadores com base neles, como sondas de hibridização de acordo com técnicas de hibridização padrão sob condições de hibridização estringentes. Como aqui usado com respeito à hibridização para DNA a uma mancha de 10 DNA, o termo “condições estringentes” refere-se à hibridização durante a noite a 60° C em IOX solução de Denhart, 6X SSC, 0,5 % de SDS e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. As manchas são lavadas seqüencialmente a 62° C por 30 minutos de cada vez em 3X SSC/0,1 % de SDS, seguido por IX SSC/0,1 % de SDS e finalmente 0,1X SSC/0,1 % de 15 SDS. Como também aqui usado, em uma forma de realização preferida, a frase “condições estringentes” refere-se à hibridização em uma solução 6X SSC a 65° C. Em uma outra forma de realização, “condições altamente estringentes” refere-se à hibridização durante a noite a 65° C em 10X solução de Denhart, 6X SSC, 0,5 % de SDS e 100 μg/ml de DNA de esperma de 20 salmão desnaturado. As manchas são lavadas seqüencialmente a 65° C por 30 minutos de cada vez em 3X SSC/0,1 % de SDS, seguido por IX SSC/0,1 % de SDS e finalmente 0,1 X SSC/0,1 % de SDS. Os métodos para as hibridizações de ácido nucleico estão descritas em Meinkoth e Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138: 267-284; bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, 25 Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel et al., eds., Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova Iorque, 1995; e Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hibridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, Nova Iorque, 1993). Preferivelmente, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção que hibridiza sob condições estringentes ou altamente estringentes a uma seqüência de nucleotídeo listada na Tabela 1 corresponde a uma molécula de ácido nucleico que ocorre naturalmente.

Existe uma variedade de métodos que podem ser usados para 5 produzir bibliotecas de homólogos potenciais de uma seqüência de oligonucleotídeo degenerada. A síntese química de uma seqüência de gene degenerada pode ser realizada em um sintetizador de DNA automático e o gene sintético é depois ligado em um vetor de expressão apropriado. O uso de um conjunto degenerado de genes permite o fornecimento, em uma mistura, 10 de todas as seqüências que codificam o conjunto desejado de seqüências potenciais. Os métodos para sintetizar oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Narang, 1983, Tetrahedron 39: 3; Itakura et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., 1984, Science 198: 1056; Ike et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11: 477).

Adicionalmente, os ácidos nucleicos otimizados podem ser

criados. Preferivelmente, um ácido nucleico otimizado codifica um polipeptídeo que tem uma função similar àquela dos polipeptídeos listados na Tabela 1 e/ou modula um crescimento e/ou rendimento da planta sob condições normais e/ou limitadas em água e/ou tolerância a um estresse 20 ambiental e mais preferivelmente aumenta um crescimento e/ou rendimento sob condições normais e/ou limitadas em água e/ou tolerância a um estresse ambiental da planta na sua super expressão na planta. Como aqui usado, “otimizado” refere-se a um ácido nucleico que é geneticamente engendrado para aumentar a sua expressão em uma dada planta ou animal. Para fornecer 25 ácidos nucleicos otimizados na planta, a seqüência de DNA do gene pode ser modificado para: 1) compreender códons preferidos pelos genes vegetais altamente expressados; 2) compreender um teor de A+T na composição de base de nucleotídeo em relação àquela substancialmente encontrada em plantas; 3) formar uma seqüência de iniciação de planta; 4) eliminar as seqüências que causam desestabilização, poliadenilação inadequada, degradação e terminação de RNA ou que formam grampos de cabelo de estrutura secundária ou sítios de união de RNA; ou 5) eliminação de matrizes de leitura aberta de anti-sentido. A expressão aumentada de ácidos nucleicos 5 em plantas pode ser obtida pela utilização da frequência de distribuição do uso de códon em plantas no geral ou em uma planta particular. Os métodos para a otimização da expressão de ácido nucleico em plantas podem ser encontrados na EPA 0359472; EPA 0385962; Pedido PCT Ns WO 91/16432; Patente U.S. Na 5.380.831; Patente U.S. N- 5.436.391; Perlack et al., 1991, 10 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 3324-3328; e Murray et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:477-498.

Um polinucleotídeo isolado da invenção pode ser otimizado tal que a sua frequência de distribuição do uso de códon desvia, preferivelmente, não mais do que 25 % daquele de genes vegetais altamente expressados na planta e, mais preferivelmente, não mais do que cerca de 10 %. Além disso, consideração é dada ao teor de Gr+C percentual da terceira base degenerada (os monocotiledôneas parecem favorecer G+C nesta posição, ao passo que os dicotiledôneas não). Também é reconhecido que o nucleotídeo XCG (onde X é A, T, C ou G) é o códon menos preferido em dicotiledôneas, ao passo que o códon XTA é evitado tanto em monocotiledôneas quanto em dicotiledôneas. Os ácidos nucleicos otimizados desta invenção também preferivelmente têm índices de evitação dos dubletos CG e TA que intimamente se aproximam daqueles da planta hospedeira escolhida. Mais preferivelmente, estes índices desviam daqueles do hospedeiro em não mais do que cerca de 10 a 15 %.

A invenção fomece ainda um vetor de expressão recombinante isolado que compreende um polinucleotídeo como descrito acima, em que a expressão do vetor em uma célula hospedeira resulta no crescimento e/ou rendimento aumentado da planta sob condições normais ou limitadas em água e/ou tolerância aumentada ao estresse ambiental quando comparada com uma variedade do tipo selvagem da célula hospedeira. Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para a expressão do ácido nucleico em uma célula 5 hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para a expressão, que é operativamente ligada à seqüência de ácido nucleico a ser expressada. Como aqui usado com respeito a um vetor de expressão recombinante, “operativamente ligado” é 10 intencionado a significar que a seqüência de nucleotídeo de interesse está ligada à(s) sequência(s) reguladora(s) em uma maneira que permita a expressão da seqüência de nucleotídeo (por exemplo, em uma célula hospedeira bacteriana ou vegetal quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo “seqüência reguladora” é intencionada a incluir 15 promotores, realçadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Tais seqüências reguladoras são bem conhecidas na técnica. As seqüências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeo em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que direcionam a expressão da 20 seqüência de nucleotídeo apenas em certas células hospedeiras ou sob certas condições. Será avaliado por aqueles habilitados na técnica que o planejamento do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão do polipeptídeo desejado, etc. Os vetores de expressão 25 da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para produzir deste modo polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos como aqui descritos.

A expressão de gene vegetal deve estar operativamente ligada a um promotor apropriado para conferir expressão de gene em uma maneira conveniente, específica de célula ou específica de tecido. Os promotores úteis nos cassetes de expressão da invenção incluem qualquer promotor que seja capaz de iniciar a transcrição em uma célula vegetal. Tais promotores incluem, mas não são limitados àqueles que podem ser obtidos de plantas, 5 vírus vegetais e bactérias que contêm genes que são expressados em plantas, tais como Agrobacterium e Rhizobium.

O promotor pode ser constitutivo, indutível, preferido do estágio de desenvolvimento, preferido pelo tipo de célula, preferido de tecido ou preferido de órgão. Os promotores constitutivos são ativos sob a maioria 10 das condições. Os exemplos de promotores constitutivos incluem os promotores 19S e 35S do CaMV (Odell et al., 1985, Nature 313: 810-812), o promotor 35S da CaMV sX (Kay et al., 1987, Science 236: 1299-1302) o promotor Sep 1, o promotor da actina do arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2: 163-171), o promotor da actina de Arabidopsis, o promotor da 15 ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18: 675-689), pEmu (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81: 581-588), o promotor 35S do vírus mosaico da escrofulária, o promotor Smas (Velten et al., 1984, EMBO J 3: 2723-2730), o super promotor (Patente U.S. N- 5.955.646), o promotor GRP1-8, o promotor da cinamil álcool desidrogenase (Patente U.S. N° 20 5.683.439), promotores do T-DNA de Agrobacterium, tais como manopina sintase, nopalina sintase e octopina sintase, o promotor da subunidade pequena da ribulose bifosfato carboxilase (ssuRUBISCO) e outros.

Os promotores indutíveis são preferencialmente ativos sob certas condições ambientais, tais como a presença ou ausência de um 25 nutriente ou metabólito, calor ou frio, luz, ataque de patógeno, condições anaeróbicas e outros. Por exemplo, o promotor hsp80 de Brassica é induzido pelo choque térmico; o promotor PPDK é induzido pela luz; os promotores PR-I do tabaco, Arabidopsis e milho são indutíveis pela infecção com um patógeno; e o promotor Adhl é induzido pela hipoxia e estresse ao frio. A expressão de gene vegetal também pode ser facilitada por intermédio de um promotor indutível (Para uma revisão, ver Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108). Os promotores quimicamente indutíveis são especialmente adequados se a expressão de gene é desejada 5 ocorrer em uma maneira específica de tempo. Os exemplos de tais promotores são um promotor indutível pelo ácido salicílico (Pedido PCT N- WO 95/19443), um promotor indutível pela tetraciclina (Gatz et al., 1992, Plant J. 2: 397-404) e um promotor indutível pelo etanol (Pedido PCT NP WO 93/21334).

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o

promotor indutível é um promotor indutível pelo estresse. Para os propósitos da invenção, os promotores indutíveis pelo estresse são preferencialmente ativos sob um ou mais dos seguintes estresses: condições subótimas associadas com salinidade, seca, nitrogênio, temperatura, metal, produto 15 químico, estresses patogênicos e oxidativo. Os promotores indutíveis pelo estresse incluem, mas não são limitados a, Cor78 (Chak et al., 2000, Plant 210: 875-883; Hovath et al., 1993, Plant Physiol. 103: 1047-1053), Corl5a (Artus et al., 1996, PNAS 93(23): 13404-09), Rci2A (Medina et al., 2001, Plant Physiol. 125: 1655-66; Nilander et al., 2001, Plant Mol. Biol. 45: 341- 20 52; Navarre e Goffeau, 2000, EMBO J. 19: 2515-24; Capel et al., 1997, Plant Physiol. 115: 569-76), Rd22 (Xiong et al., 2001, Plant Cell 13: 2063-83; Abe et al., 1997, Plant Cell 9: 1859-68; Iwasaki et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 247: 391-8), cDet6 (Lang e Palve, 1992, Plant Mol. Biol. 20: 951-62), ADHl (Hoeren et al., 1998, Genetics 149: 479-90), KATl (Nakamura et al., 1995, 25 Plant Physiol. 109: 371-4), KSTl (Müller-Rõber et al., 1995, EMBO 14: 2409-16), Rhal (Terryn et al., 1993, Plant Cell 5: 1761-9; Terryn et al., 1992, FEBS Lett. 299(3): 287-90), ARSKl (Atkinson et al., 1997, Acesso no GenBank # L22302 e Pedido PCT Ns WO 97/20057), PtxA (Plesch et al., Acesso no GenBank # X67427), SbHRGP3 (Ahn et al., 1996, Plant Cell 8: 1477-90), GH3 (Liu et al., 1994, Plant Cell 6: 645-57), o promotor do gene PRPl indutível por patógeno (Ward et al., 1993, Plant. Mol. Biol. 22: 361- 366), o promotor hsp80 indutível por calor do tomate (Patente U.S. Na 5187267), o promotor da alfa-amilase indutível pelo frio da batata (Pedido 5 PCT N2 WO 96/12814) ou o promotor pinll indutível por ferimento (Patente Européia Na 375091). Para outros exemplos de promotores indutíveis por seca, frio e sal, tais como o promotor RD29A, ver Yamaguchi-Shinozalei et al., 1993, Mol. Gen. Genet. 236: 331-340.

Os promotores preferidos do estado de desenvolvimento são preferencialmente expressados em certos estágios de desenvolvimento. Os promotores preferidos de tecido e órgão incluem aqueles que são preferencialmente expressados em certos tecidos ou órgãos, tais como folhas, raízes, sementes ou xilem. Os exemplos de promotores preferidos de tecido e preferidos de órgão incluem, mas não são limitados a promotores preferidos de fruta, preferidos de óvulo, preferidos de tecido masculino, preferidos de semente, preferidos de tegumento, preferidos de tubérculo, preferidos de talo, preferidos de pericarpo, preferidos de folha, preferidos de estigma, preferidos de pólen, preferidos de antera, preferidos de pétala, preferidos de sépala, preferidos de pedicelo, preferidos de síliqua, preferidos de caule, preferidos de raiz e outros. Os promotores preferidos de semente são preferencialmente expressados durante o desenvolvimento e/ou germinação da semente. Por exemplo, promotores preferidos de semente podem ser preferidos de embrião, preferidos de endosperma e preferidos de revestimento de semente (Ver Thompson et al., 1989, BioEssays 10: 108). Os exemplos de promotores preferidos de semente incluem, mas não são limitados a, celulose sintase (celA), Cim 1, gama-zeína, globulina-1, 19 kD zeína do milho (cZ19Bl) e outros.

Outros promotores preferidos de tecido ou preferidos de órgão adequados incluem o promotor do gene napin da colza (Patente U.S. Ns 5.608.152), o promotor USP da Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 225(3): 459-67), o promotor da oleosina de Arabidopsis (Pedido PCT N- WO 98/45461), o promotor da faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente U.S. N2 5.504.200), o promotor Bce4 de Brassica (Pedido PCT N- WO 5 91/13980) ou o promotor B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2): 233-9), assim como promotores que conferem a expressão específica de semente em plantas monocotiledôneas como milho, cevada, trigo, centeio, arroz, etc. os promotores adequados para mencionar são o promotor dos genes lpt2 ou Iptl da cevada (Pedido PCT N- WO 95/15389 e 10 Pedido PCT Ne WO 95/23230) ou aqueles descritos no Pedido PCT N2 WO 99/16890 (promotores do gene da hordeína da cevada, gene da glutelina do arroz, gene da orizina do arroz, gene da prolamina do arroz, gene da gliadina do trigo, gene da glutelina do trigo, gene da glutelina da aveia, gene da casirina do sorgo e gene da secalina do centeio).

Outros promotores úteis nos cassetes de expressão da invenção

incluem, mas não são limitados ao promotor da proteína de ligação da clorofila a/b maior, promotores da histona, o promotor Ap3, o promotor da βconglicina, o promotor de napina, o promotor da lectina da soja, o promotor da zeína de 15 kD do milho, o promotor da zeína de 22 kD, o promotor da 20 zeína de 27 kD, o promotor da g-zeína, os promotores ceroso, encolhido 1, encolhido 2 e bronze, o promotor Zml3 (Patente U.S. N2 5.086.169), os promotores da poligalacturonase do milho (PG) (Patentes U.S. N~ 5.412.085 e 5.545.546) e o promotor SGB6 (Patente U.S. N2 5.470.359), assim como promotores sintéticos ou outros naturais.

Flexibilidade adicional na expressão do gene heterólogo de

controle em plantas pode ser obtida usando-se domínios de ligação de DNA e elementos de resposta de fontes heterólogas (isto é, domínios de ligação de DNA de fontes que não de planta). Um exemplo de um tal domínio de ligação de DNA heterólogo é o domínio de ligação de DNA LexA (Brent e Ptashne, 1985, Cell 43: 729-736).

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, os polinucleotídeos listados na Tabela 1 são expressados nas células vegetais a partir de plantas superiores (por exemplo, os espermatófitos, tais como 5 plantas de safra). Um polinucleotídeo pode ser “introduzido” em uma célula vegetal por quaisquer meios, incluindo transfecção, transformação ou transdução, eletroporação, bombardeamento de partícula, agroinfecção e outros. Os métodos adequados para transformar ou transfectar células vegetais são divulgadas, por exemplo, usando bombardeamento de partícula como 10 apresentado nas Pats. U.S. N— 4.945.050, 5.036.006, 5.100.792, 5.302.523, 5.464.765, 5.120.657, 6.084.154 e outros. Mais preferivelmente, a semente de milho transgênica da invenção pode ser fabricada usando a transformação em Agrobacterium, como descrito nas Patente U.S. N— 5.591.616, 5.731.179, 5.981.840, 5.990.387, 6.162.965, 6.420.630, publicação do pedido de Patente 15 U.S. número 2002/0104132 e outros. A transformação de soja pode ser realizada usando por exemplo uma técnica descrita na Patente Européia N2 EP 0424047, Patente U.S. Ne 5.322.783, Patente Européia N2 EP 0397 687, Patente U.S. N2 5.376.543 ou Patente U.S. N2 5.169.770. Um exemplo específico de transformação de trigo pode ser encontrado no Pedido PCT N2 20 WO 93/07256. O algodão pode ser transformada usando métodos divulgados nas Patente U.S. N— 5.004.863; 5.159.135; 5.846.797 e outros. Arroz pode ser transformado usando métodos divulgados nas Patente U.S. N25 4.666.844, 5.350.688, 6.153.813, 6.333.449, 6.288.312, 6.365.807, 6.329.571 e outros. Outros métodos de transformação de planta são divulgados, por exemplo, nas 25 Patente U.S. N- 5.932.782, 6.153.811, 6.140.553, 5.969.213, 6.020.539 e outros. Qualquer método de transformação de planta adequado para inserir um transgene em uma planta particular pode ser usado de acordo com a invenção.

De acordo com a presente invenção, o polinucleotídeo introduzido pode ser mantido na célula vegetal estavelmente se o mesmo for incorporado em um réplicon autônomo que não cromossômico ou integrado nos cromossomas vegetais. Alternativamente, o polinucleotídeo introduzido pode estar presente em um vetor que não replica extra-cromossômico e pode 5 ser transitoriamente expressado ou transitoriamente ativo.

Um outro aspecto da invenção diz respeito a um polipeptídeo isolado tendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste das seqüências de polipeptídeo listadas na Tabela I. Um polipeptídeo “isolado” ou “purificado” é livre de alguns dos materiais celulares quando produzidos 10 pelas técnicas de DNA recombinante ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. A linguagem “substancialmente livre de material celular” inclui preparações de um polipeptídeo em que o polipeptídeo é separado de alguns dos componentes celulares das células em que o mesmo é natural ou recombinantemente 15 produzido. Em uma forma de realização, a linguagem “substancialmente livre de material celular” inclui preparações de um polipeptídeo da invenção tendo menos do que cerca de 30 % (em peso seco) de polipeptídeos contaminantes, mais preferivelmente menos do que cerca de 20 % de polipeptídeos contaminantes, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10 % de 20 polipeptídeos contaminantes e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5 % de polipeptídeos contaminantes.

A determinação de atividades e parâmetros cinéticos de enzimas é bem estabelecida na técnica. Experimentos para determinar a atividade de qualquer enzima alterada dada deve ser feita de encomenda para 25 a atividade específica da enzima do tipo selvagem, que está bem dentro da capacidade de uma pessoa habilitada na técnica. Resumos a cerca de enzimas no geral, assim como detalhes específicos concernentes à estrutura, cinéticas, princípios, métodos, aplicações e exemplos para a determinação de muitas atividades de enzima são abundantes e bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica.

A invenção também é personificada em um método de produzir uma planta transgênica que compreende pelo menos um polinucleotídeo listado na Tabela 1 ou Tabela 2, em que a expressão do 5 polinucleotídeo na planta resulta no crescimento e/ou rendimento aumentado da planta sob condições normais e/ou limitadas em água e/ou tolerância aumentada a um estresse ambiental quando comparada com uma variedade do tipo selvagem da planta que compreende as etapas de: (a) introduzir em uma célula vegetal um vetor de expressão que compreende pelo menos um 10 polinucleotídeo listado na Tabela 1 ou Tabela 2 e (b) gerar a partir da célula vegetal uma planta transgênica que expresse o polinucleotídeo, em que a expressão do polinucleotídeo na planta transgênica resulta no crescimento e/ou rendimento aumentados da planta sob condições normais ou limitadas em água e/ou tolerância aumentada ao estresse ambiental quando comparada 15 com uma variedade do tipo selvagem da planta. A célula vegetal pode ser, mas não é limitada a, um protoplasto, célula que produz gameta e uma célula que regenera em uma planta inteira. Como aqui usado, o termo “transgênico” refere-se a qualquer planta, célula vegetal, calo, tecido vegetal ou parte de planta, que contenha pelo menos um polinucleotídeo recombinante 20 listado na Tabela 1 ou Tabela 2. Em muitos casos, o polinucleotídeo recombinante é estavelmente integrado em um cromossoma ou elemento extra-cromossômico estável, de modo que o mesmo seja passado para as gerações sucessivas.

A presente invenção também fornece um método de aumentar 25 um crescimento e/ou rendimento da planta sob condições normais e/ou limitadas em água e/ou aumentar uma tolerância da planta a um estresse ambiental que compreende as etapas de aumentar a expressão de pelo menos um polinucleotídeo listado na Tabela 1 ou Tabela 2 na planta. A expressão de um polinucleotídeo listado na Tabela 1 ou Tabela 2 pode ser aumentada por qualquer método conhecido por aqueles de habilidade na técnica.

O efeito da modificação genética sobre o crescimento de planta e/ou rendimento e/ou tolerância ao estresse pode ser avaliado pelo crescimento da planta modificada sob condições normais e/ou menos do que 5 adequadas e depois analisar as características de crescimento e/ou metabolismo da planta. Tais técnicas de análise são bem conhecidas por uma pessoa habilitada na técnica e incluem peso seco, peso úmido, síntese de polipeptídeo, síntese de carboidrato, síntese de lipídeo, taxas de evapotranspiração, rendimento de planta e/ou safra geral, florescimento, 10 reprodução, plantio de semente, crescimento de raiz, taxas de respiração, taxas de fotossíntese, composição de metabólito, etc., usando métodos conhecidos por aqueles de habilidade na biotecnologia.

A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, que não deve ser interpretados de nenhum modo como impondo limitações no seu escopo.

EXEMPLO 1 - Identificação de Matrizes de Leitura Aberta de

P. patens

As bibliotecas de cDNA feitas a partir de plantas da espécie P. patens (Hedw.) B.S.G. da coleção da seção de estudos genéticos da 20 University of Hamburg foram sequenciadas usando métodos padrão. As plantas originadas da cepa 16/14 coletada pela H.L.K. Whitehouse em Gransden Wood, Huntingdonshire (Inglaterra), que foi subcultivada a partir de um esporo por Engel (1968, Am. J. Bot. 55: 438-446).

As seqüências foram processadas e anotadas usando o pacote 25 de software EST-MAX comercialmente fornecido pela Bio-Max (Munich, Alemanha). O programa incorpora praticamente todos os métodos de bioinformática importantes para a caracterização funcional e estrutural das seqüências de proteína. Para referência, ver o sítio da web em pedant.mips.biochem.mpg.de. Os algoritmos mais importantes incorporados em EST-MAX são: FASTA (Pesquisas de base de dados de seqüência muito sensíveis com estimativas de significância estatística; Pearson, 1990, Methods Enzymol. 183: 63-98); BLAST (Pesquisas de base de dados de seqüência muito sensíveis com estimativas de significância estatística; Altschul et al., 5 1990, Journal of Molecular Biology 215: 403-10); PREDATOR (Prognóstico de estrutura secundária de alta precisão a partir de seqüências únicas e múltiplas; Frishman e Argos, 1997, Proteins 27: 329-335); CLUSTALW (Alinhamento de seqüência múltipla; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680); TMAP (Prognóstico de região de transmembrana a 10 partir de seqüências multiplamente alinhadas; Persson e Argos, 1994, J. Mol. Biol. 237: 182-192); ALOM2 (Prognóstico da região de transmembrana a partir de seqüências únicas; Klein et al., 1984, Biochim. Biophys. Acta 787: 221-226. Versão 2 por Dr. K. Nakai); PROSEARCH (Detecção de padrões de seqüência de proteína PROSITE; Kolakowski et al., 1992, Biotechniques 13, 15 919-921); BLIMPS (Pesquisas de similaridade contra uma base de dados de blocos sem intervalos, Wallace e Henikoff, 1992, Comput Appl Biosci. 8(3): 249-54); PATMAT (um programa de pesquisa e extração para as dúvidas de seqüência, padrão e bloco e bases de dados, CABIOS 8: 249-254. Escrito por Bill Alford).

cDNAs parciais de P. patens (ESTs) foram identificados no

programa de sequenciamento de EST de P. patens usando o programa ESTMAX através da análise BLAST. As seqüências de cDNA de nucleotídeo de tamanho natural foram determinadas usando métodos conhecidos. A identidade e similaridade das seqüências de aminoácido das seqüências de 25 polipeptídeo divulgadas para as seqüências de proteína conhecidas são mostradas nas Tabelas 2 a 19 (A comparação aos pares foi usada: penalidade de intervalo: 10; penalidade de extensão de intervalo: 0,1; matriz de contagem: blosum 62). Tabela 3

Comparação de PpTPT-I (SEQ ID NO: 2) com as RNA 2’ fosfotransferases

conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) XP 550615 O. sativa 45,4 56,2 NP 197750 A. thaliana 34,1 43,0 NP 182058 A. thaliana 39,6 48,9 NP 594515 Schizosaccharomyces pombe 21,3 29,1 NP 788477 Drosophila melanogaster 25,5 34,7 Tabela 4

5 Comparação de PpCDC2-l (SEQ ID NO: 4) com a Proteína de Controle da

Divisão Celular 2 Conhecida

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) S42049 Picea abies 92,9 96,3 Q40790 Pinus eontorta 92,5 96,3 CDC2 CHOERU Chenopodium rubrum 91,5 95,9 Q9AUH4 Populus tremula x P. tremuloides 90,5 95,9 Q8W2D3 Helianthus annuus 89,5 95,2 Tabela 5

Comparação de PpLRP-I (SEQ ID NO: 6) com as Proteínas da Família de

Repetição Rica em Leucina Conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) NP 912570 O. sativa 27,6 42,1 NP 921136 O. sativa 27,2 40,3 AAF71805 A. thaliana 24,4 33,6 NP 177947 A. thaliana 28,1 38,5 G96811 A. thaliana 28,8 40,3 Tabela 6

Comparação de PpRBP-I (SEQ ID NO: 8) com a proteína de ligação de Ran

1 conhecida

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) Q94K24 Lycopersicon eseulentum 50,7 63,3 Q9LUZ8 A. thaliana 39,4 51,9 NP 200667 A. thaliana 44,3 58,3 004149 A. thaliana 44,1 55,1 NP 172194 A. thaliana 44,4 55,1 Tabela 7

Comparação de PpPD-I (SEQ ID NO: 10) com as proteínas ftsZ de divisão de

plastídeo conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) Q70ZZ6 P. patens 100 100 Q75ZR3 Nannochloris bacillaris 42,6 53,0 ZP 00177632 Crocosphaera watsonii 41,3 51.8 NP 440816 Synechoeystis sp. 41,0 52,1 T51092 Synechoeystis sp. 40,0 51,5 Tabela 8

Comparação de PpMSC-I (SEQ ID NO: 12) com proteínas carreadoras de

substrato mitocondrial conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) NP 194188 A. thaliana 56,6 70,0 T05577 A. thaliana 56,7 69.8 Q66PX4 Saceharum offieinarum 55,4 69,9 NP 179836 A. thaliana 54,3 71,4 D84613 A. thaliana 54,5 71,2 Tabela 9

Comparação de PpMBP-I (SEQ ID NO: 14) com as proteínas de MADS-box

conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) Q8LPA5 P. patens 63,0 63,0 Q6QAF0 P. patens 62,6 62,6 Q9FE71 P. patens 53,4 55.8 Q9FE89 P. patens 49,1 53,7 Q8LLC8 Lyeopodium annotinum 46,1 59,5 Tabela 10:

Comparação de PpAK-I (SEQ ID NO: 16) com as proteínas quinases de

adenosina conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) ADK PHYPA P. patens 100 100 NP 195950 A. thaliana 66,3 77.8 XP 466836 O. sativa 68,2 77,6 Q84P58 O. sativa 62,9 71,5 NP 187593 A. thaliana 64,7 76,6 Tabela 11

Comparação de PpZF-6 (SEQ ID NO: 18) com proteínas de dedo de zinco

conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) NP 180709 A. thaliana 61,1 71,0 XP 472997 O. sativa 63,4 12,\ NP 176722 A. thaliana 61.8 72,4 T02366 A. thaliana 54,7 64,1 NP 172080 A. thaliana 58,9 69,0 Tabela 12

5 Comparação de PpCDK-I (SEQ ID NO: 20) com as subunidades reguladoras

de quinase dependentes de ciclina conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) Q6JJ57 Ipomoea trifida 76,9 83,5 Q6T300 G. max 79,1 82,4 NP 180364 A. thaliana 74,7 82,4 XP 470214 O. sativa 80,2 84,6 Q8GZU5 Populus tremula x P. tremuloides 75,8 80,2 Tabela 13

Comparação de PpZF-7 (SEQ ID NO: 22) com as proteínas de dedo de zinco

RING conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) Q6F3A0 O. sativa 34,7 47,3 Q852N7 O. sativa 35,5 48,5 Q7XJB5 O. sativa 33,1 45,9 NP 851050 A. thaliana 35,3 46,2 NP 851051 A. thaliana 35,3 46,2 Tabela 14

Comparação de PpMFP-I (SEQ ID NO: 24) com a proteína 1 equivalente ao

filamento de ligação de MAR conhecida

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) MFPl TOBAC Nicotiana tabacum 18,0 30,5 NP 914440 O. sativa 16,8 30,1 MFPl ARATH A. thaliana 19,2 30,3 NP 188221 A. thaliana 20,1 31,1 T07111 Lyeopersieon eseulentum 19,6 31,6 Tabela 15

Comparação de PpLRP-2 (SEQ ID NO: 26) com as quinases de proteína

equivalentes ao receptor de repetição rico em leucina conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) Q9XGG1 Sorghum bicolor 9,3 16,1 NP 189183 A. thaliana 9,2 14,6 Q708X5 Cicer arietinum 18,0 28,6 XP 474976 O. sativa 5,9 10,3 Q9LSU7 A. thaliana 9,2 14,0 Tabela 16

5 Comparação de PpPPK-I (SEQ ID NO: 28) com as quinases de proteína de

sensor de luz conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) S27396 Ceratodon purpureus 5,7 11,4 P93098 Ceratodon purpureus 5,8 11,5 PHYl CERPU Ceratodon purpureus 5,7 11,4 NP 564829 A. thaliana 19,0 32,1 H96666 A. thaliana 19,5 31,6 Tabela 17

Comparação de PpSRP-I (SEQ ID NO: 30) com proteínas relacionadas com a

Sinaptobrevina

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) NP 180871 A. thaliana 73,0 84,2 Q7X9C5 Pyrus pyrifolia 64,9 75,2 NP 180826 A. thaliana 55,4 63,8 Q681H0 A. thaliana 71,2 83,8 Tabela 18

Comparação de PpCBL-I (SEQ ID NO: 32) com proteínas de Calcineurina B

conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade Pública Seqüência de Seqüência Acesso # (%) (%) XP 313573 Anopheles gambiae 19,1 36,7 NP 505885 Caenorhabditis elegans 16,6 34,8 Q95P81 Bombyx mori 18,7 36,4 NP 524874 D. melanogaster 17,1 35,3 Tabela 19

Comparação de PpCBL-2 (SEQ ID NO: 34) com proteínas relacionadas com

caleosina conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade de Pública Seqüência Seqüência Acesso # (%) (%) Q9SQ57 Sesamum indicum 64,9 78,4 T07092 G. max 67,5 74,6 NP 194404 A. thaliana 61,2 74,7 NP 200335 A. thaliana 62,1 72,8 XP 473140 O. sativa 60,2 73,0 Tabela 20

5 Comparação de PpHD-I (SEQ ID NO: 36) com as proteínas da histona

desacetilase conhecidas

Base de Dados Espécie Identidade de Similaridade Pública Seqüência de Seqüência Acesso # (%) (%) Q8W508 Zea mays 81,9 88,6 NP 190054 A. thaliana 78,7 88,2 T47443 A. thaliana 76,1 85,8 Q6JJ24 Ipomoea trifida 68,2 75,6 Q7XLX3 Oryza sativa 70,1 77,5 EXEMPLO 2 - Clonagem de cDNAs de tamanho natural a

partir de outras plantas

Plantas de canola, soja, arroz, milho, linhaça e trigo foram cultivadas sob uma variedade de condições e tratamentos e tecidos diferentes foram colhidos em vários estágios de desenvolvimento. O crescimento de planta e a colheita foram feitos em uma maneira estratégica tal que a probabilidade de colher todos os genes expressáveis em pelo menos uma ou mais das bibliotecas resultantes fosse maximizada. O mRNA foi isolado de cada uma das amostras coletadas e as bibliotecas de cDNA foram construídas. Nenhuma etapa de amplificação foi usada no processo de produção da biblioteca de modo a minimizar a redundância de genes dentro da amostra e para reter a informação de expressão. Todas as bibliotecas foram 3’ geradas a partir de mRNA purificado em colunas de oligo dT. As colônias da transformação da biblioteca de cDNA em E. coli foram aleatoriamente escolhidas e colocadas em placas microtituladoras.

O DNA plasmídico foi isolado das colônias de E. coli e depois manchadas em membranas. Uma bateria de 288 oligonucleotídeos 7-mer radiorrotulados com P foram seqüencialmente hibridizados a estas membranas. Para aumentar o rendimento, membranas em duplicata foram processadas. Depois de cada hibridização, uma imagem de mancha foi capturada durante uma varredura de fosforimagem para gerar um perfil de hibridização para cada oligonucleotídeo. Esta imagem de dados brutos foi automaticamente transferida a um computador. A identidade absoluta foi mantida pelo código de barras quanto o cassete de imagem, filtro e orientação dentro do cassete. Os filtros foram depois tratados usando condições relativamente brandas para despojar as sondas ligadas e retomados para as câmaras de hibridização para uma outra rodada de hibridização. O ciclo de hibridização e formação de imagem foi repetido até que o conjunto de 288 oligômeros foi completado.

Depois da conclusão das hibridizações, um perfil foi gerado para cada mancha (representando um inserto de cDNA), quanto a qual dos 288 oligonucleotídeos 7-mer radiorrotulado com P ligou a esta mancha 20 particular (inserto de cDNA) e em qual grau. Este perfil é definido como a assinatura gerada deste clone. Cada assinatura do clone foi comparada com todas as outras assinaturas geradas do mesmo organismo para identificar grupos de assinaturas relacionadas. Este processo “classifica” todos os clones de um organismo em grupos antes de sequenciar.

Os clones foram classificados em vários grupos com base em

ter assinaturas de hibridização idênticas ou similares. Um grupo deve ser indicativo da expressão de um gene individual ou família de gene. Um subproduto desta análise é um perfil de expressão para a abundância de cada gene em uma biblioteca particular. O sequenciamento de um caminho a partir da extremidade 5’ foi usada para prognosticar a função dos clones particulares pelas pesquisas de similaridade e motivo nas bases de dados de seqüência.

A seqüência de DNA de tamanho natural de P. patens PpHD-I (SEQ ID NO: 35) foi submetido a blast contra bases de dados patenteadas de cDNAS de canola, soja, arroz, milho, linhaça e trigo em um valor e de e'10 (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Todos os acertos contíguos foram analisados quanto às seqüências de tamanho natural putativas e os clones mais longos representando os contíguos de tamanho natural putativo foram completamente sequenciados. Dois homólogos de canola (BnHD-1, SEQ ID NO: 38 e BnHD-2, SEQ ID NO: 40), um homólogo do milho (ZmHD-1, SEQ ID NO: 42), um homólogo da linhaça (LuHD-1, SEQ ID NO: 44), uma seqüência do arroz (OsHD-1, SEQ ID NO: 46), três seqüências da soja (GmHD-1, SEQ ID NO: 48, GmHD-2, SEQ ID NO: 50 e GmHD-3, SEQ ID NO: 52) e uma seqüência do trigo (TaHD-1, SEQ ID NO: 54) foram identificados. O grau de identidade de aminoácido e similaridade destas seqüências com a seqüência pública mais próxima conhecida são indicados na Tabela 21 (A Comparação aos Pares foi usada: penalidade de intervalo: 10; penalidade de extensão de intervalo: 0,1; matriz de contagem: blosum62).

Tabela 21

Grau de Identidade e Similaridade de Aminoácido das Histona Desacetilases

Nome do Gene Base de Dados Pública Espécie Identidade de Similaridade (SEQ ID NO) Acesso # Seqüência de Seqüência (%) (%) BnHD-I NP_190054 A. thaliana 96% 98,1 % (SEQ ID NO: 38) BnHD-2 NP_201116 A. thaliana 92,6 % 95,3 % (SEQ ID NO: 40) ZmHD-I NP_563817 A. thaliana 66,4 % 77,2 % (SEQ ID NO: 42) LuHD-I NP190054 A. thaliana 87,4 % 94,4 % (SEQ ID NO: 44) OsHD-I Q7Y0Y8 O. sativa 100% 100 % (SEQ ID NO: 46) Nome do Gene Base de Dados Pública Espécie Identidade de Similaridade (SEQ ID NO) Acesso # Seqüência de Seqüência (%) (%) GmHD-I NP563817 A. thaliana 63,1 % 74% (SEQ ID NO: 48) GmHD-2 NPl90054 A. thaliana 85,6 % 92,1 % (SEQ ID NO: 50) GmHD-2 NP_567921 A. thaliana 67,2 % 77,4 % (SEQ ID NO: 52) TaHD-I Q7Y0Y8 O. sativa 89,4 % 93,8 % (SEQ ID NO: 54) EXEMPLO 3 - Plantas de Arabidopsis tolerantes ao estresse Um fragmento contendo o polinucleotídeo P. patens foi ligado em um vetor binário contendo um gene marcador selecionável. O vetor recombinante resultante conteve o polinucleotídeo correspondente listado na Tabela 1 na orientação de sentido sob o super promotor constitutivo. Os vetores recombinantes foram transformados em plantas Agrobacterium tumefaciens C58C1 e PMP90 de acordo com as condições padrão. As plantas de A. thaliana ecotipo C24 foram cultivadas e transformadas de acordo com as condições padrão. As plantas Tl foram triadas quanto a resistência ao agente de seleção conferido pelo gene marcador selecionável e sementes Tl foram coletadas.

Os polinucleotídeos de P. patens foram super expressados em A. thaliana sob o controle de um promotor constitutivo, sementes T2 e/ou T3 foram triadas quanto a resistência ao agente de seleção conferido pelo gene 15 marcador selecionável nas placas e as plantas positivas foram transplantadas no solo e cultivadas em uma câmara de crescimento por 3 semanas. A umidade do solo foi mantida por todo este tempo em aproximadamente 50 % da capacidade máxima de contenção de água do solo.

A perda de água total (transpiração) pela planta durante este tempo foi medida. Depois de 3 semanas, o material vegetal inteiro acima do solo foi coletado, secado a 65° C por 2 dias e pesado. A razão de peso seco da planta acima do solo (DW) para o uso de água pela planta é a eficiência no uso da água (WUE). As Tabelas 22 a 41 apresentam WUE e DW para eventos de transformação independentes (linhagens) de plantas transgênicas que super expressam os polinucleotídeos de P. patens. As médias dos quadrados mínimos (LSM), erros padrão e valor significante (P) de uma linhagem comparada com os controles do tipo selvagem de uma Análise de Variação 5 são apresentados. A melhora percentual de cada linhagem de polinucleotídeo de P. patens quando comparada com as plantas de controle do tipo selvagem para WUE e DW também é apresentada.

Tabela 22

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpTPT-I (SEQ ID NO: 2)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,136 0,011 PpTPT-I 8 0,217 0,025 60 0,0033 6 0,222 0,028 64 0,0047 0,226 0,032 67 0,0085 0,228 0,025 68 0,0009 2 0,230 0,032 70 0,0063 WUE tipo selvagem 2,270 0,085 - PpTPT-I 8 2,274 0,190 0 0,9822 6 2,308 0,212 2 0,8656 2 2,426 0,245 7 0,5465 2.675 0,245 18 0,1207 Tabela 23

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpCDC2-l (SEQ ID NO: 4)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,088 0,009 --- PpCDC2-l 4 0,117 0,016 33 0,1147 1 0,125 0,016 42 0,0473 WUE tipo selvagem 1,446 0,097 --- PpCDC2-l 4 1,890 0,186 31 0,036 1 1,947 0,186 35 0,0183 Tabela 24

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpLRP-I (SEQ ID NO: 6)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,109 0,033 --- PpLRP-I 10 0,161 0,034 48 0,2835 (SEQ ID NO: 6) WUE tipo selvagem 1,782 0,119 --- PpLRP-I 10 2,205 0,169 24 0,0529 (SEQ ID NO: 6) Tabela 25 Linhagens de A. thaliana que super expressam PpRBP-I (SEQ ID NO: 8)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,088 0,008 PpRBP-I 2 0,130 0,017 48 0.0276 (SEQ ID NO: 8) WUE tipo selvagem 1,446 0,102 PpRBP-I 2 2,301 0,214 59 0.0004 (SEQ ID NO: 8) Tabela 26

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpPD-I (SEQ ID NO: 10)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,114 0,006 PpPD-I 3 0,171 0,019 50 0.0045 1 0,171 0,017 50 0,0019 8 0,174 0,019 53 0,0026 2 0,182 0,019 60 0,0007 11 0,191 0,017 67 <,0001 0,201 0,019 76 <,0001 9 0,204 0,017 79 <,0001 WUE tipo selvagem 1,958 0,058 --- PpPD-I 11 2,328 0,165 19 0,0353 1 2,343 0,165 20 0,0286 8 2,354 0,180 20 0,0383 2 2,450 0,180 25 0,0102 3 2,517 0,180 29 0,0036 2,552 0,180 30 0,002 9 2,572 0,165 31 0,0006 Tabela 27

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpMSC-I (SEQ ID NO: 12)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,136 0,011 PpMSC-I 3 0,227 0,027 68 0.0026 2 0,240 0,025 77 0,0002 1 0,247 0,025 82 <,0001 4 0,271 0,022 100 <,0001 WUE tipo selvagem 2,270 0,085 PpMSC-I 2 2,343 0,191 3 0.7268 4 2,631 0,174 16 0,0654 1 2,820 0,191 24 0,0097 Tabela 28 Linhagens de A. thaliana que super expressam PpMBP-I (SEQ ID NO: 14)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,110 0,005 - PpMBP-I 1 0,154 0,017 39 0,0146 (SEQ JD NO: 14) WUE tipo selvagem 1,620 0,066 PpMBP-I 1 2,144 0,209 32 0,0182 (SEQ ID NO: 14) Tabela 29

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpAK-I (SEQ ID NO: 16)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,136 0,011 - PpAK-I 1 0,185 0,022 36 0,049 0,216 0,022 59 0,0014 3 0,217 0,027 60 0,0063 7 0,217 0,024 60 0,0026 8 0,227 0,024 68 0,0008 4 0,230 0,024 69 0,0006 WUE tipo selvagem 2,270 0,084 PpAK-I 8 2,285 0,188 I 0,9394 7 2,358 0,188 4 0,6683 2,374 0,172 5 0,5851 3 2,377 0,211 5 0,6369 4 2,403 0,188 6 0,5191 Tabela 30

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpZF-6 (SEQ ID NO: 18)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,107 0,015 PpZF-6 4 0,131 0,018 22 0.3001 (SEQ ID NO: 18) WUE tipo selvagem 1,897 0,316 - PpZF-6 4 2,026 0,371 7 0,7946 (SEQ DD NO: 18) Tabela 31

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpCDK-I (SEQ ID NO: 20)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,088 0,009 - PpCDK-I 7 0,148 0,017 69 0,0029 (SEQ ID NO: 20) WUE tipo selvagem 1,446 0,102 PpCDK-I 7 1,963 0,195 36 0,0207 (SEQ ID NO: 20) Tabela 32

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpZF-7 (SEQ ID NO: 22)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,114 0,006 PpZF-7 1 0,151 0,019 32 0.0617 0,153 0,019 35 0,0456 2 0,159 0,019 39 0,0226 7 0,160 0,019 40 0,0198 3 0,163 0,019 43 0,0139 6 0,175 0,019 54 0,0021 9 0,176 0,019 55 0,0018 0,177 0,019 56 0,0014 8 0,196 0,019 72 <,0001 4 0,217 0,019 90 <,0001 WUE tipo selvagem 1,958 0,057 PpZF-7 2 2,185 0,176 12 0.2224 2,237 0,176 14 0,1331 7 2,242 0,176 15 0,1262 9 2,327 0,176 19 0,0479 3 2,359 0,176 20 0,0318 6 2,378 0,176 21 0,0245 1 2,435 0,176 24 0,0108 2,490 0,176 27 0,0045 8 2,537 0,176 30 0,002 4 2,707 0,176 38 <,0001 Tabela 33

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpMFP-I (SEQ ID NO: 24)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,110 0,005 PpMFP-I 4 0,128 0,016 16 0,3008 2 0,130 0,016 18 0,25 0,145 0,016 31 0,0465 3 0,146 0,016 32 0,0417 6 0,159 0,016 44 0,0048 7 0,164 0,016 48 0,0022 0,166 0,016 50 0,0015 1 0,168 0,016 52 0,0011 8 0,172 0,016 56 0,0004 WUE tipo selvagem 1,620 0,064 PpMFP-I 3 1,979 0,203 22 0,0929 8 2,049 0,203 26 0,0451 7 2,049 0,203 26 0,0449 4 2,095 0,203 29 0,0267 1 2,113 0,203 30 0,0215 6 2,178 0,203 34 0,0094 2,217 0,203 37 0,0055 2,324 0,203 43 0,0011 2 2,345 0,203 45 0,0008 Tabela 34 Linhagens de A. thaliana que super expressam PpLRP-2 (SEQ ID NO: 26)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,136 0,011 PpLRP-2 4 0,199 0,029 47 0.042 2 0,206 0,023 52 0,0078 3 0,224 0,029 65 0,0049 1 0,227 0,023 67 0,0007 0,235 0,026 74 0,0006 8 0,266 0,040 96 0,0026 WUE tipo selvagem 2,270 0,090 --- PpLRP-2 4 2,360 0,224 4 0,7073 2,402 0,200 6 0,5481 1 2,404 0,183 6 0,5095 8 2,471 0,317 9 0,5426 Tabela 35

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpPPK-I (SEQ ID NO: 28)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,108 0,007 PpPPK-I 4 0,157 0,020 45 0.023 2 0,159 0,018 47 0,0097 0,175 0,020 62 0,0018 9 0,177 0,022 64 0,0037 WUE tipo selvagem 1,951 0,078 PpPPK-I 4 2,043 0,219 5 0.6913 9 2,158 0,245 11 0,4225 2 2,177 0,200 12 0,2948 2,523 0,219 29 0,0149 Tabela 36

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpSRP-I (SEQ ID NO: 30)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,114 0,006 --- PpSRP-I 7 0,152 0,018 33 0,0495 6 0,159 0,018 39 0,0196 1 0,162 0,020 42 0,026 0,164 0,017 44 0,0054 9 0,167 0,015 46 0,0015 8 0,174 0,018 53 0,0019 2 0,179 0,018 57 0,0008 WUE tipo selvagem 1,958 0,057 PpSRP-I 10 2,109 0,161 8 0.3776 8 2,197 0,177 12 0,1991 9 2,239 0,149 14 0,0802 2 2,302 0,177 18 0,0659 6 2,405 0,177 23 0,017 1 2,450 0,197 25 0,0178 Tabela 37 Linhagens de A. thaliana que super expressam PpCBL-I (SEQ ID NO: 32)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,114 0,006 - PpCBL-I 5 0,156 0,019 37 0,034 8 0,163 0,019 43 0,0153 4 0,179 0,019 57 0,0012 3 0,180 0,019 58 0,0011 6 0,181 0,017 59 0,0003 1 0,182 0,017 59 0,0003 9 0,214 0,017. 87 <,0001 WUE tipo selvagem 1,958 0,057 PpCBL-I 3 2,109 0,177 8 0.4181 2,152 0,177 10 0,2991 8 2,158 0,177 10 0,2836 1 2,298 0,162 17 0,0489 6 2,306 0,162 18 0,0438 9 2,319 0,162 18 0,0367 4 2,440 0,177 25 0,0105 Tabela 38

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpCBL-2 (SEQ ID NO: 34)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,114 0,006 PpCBL-2 9 0,156 0,017 37 0.0226 0,170 0,017 49 0,0027 1 0,179 0,017 57 0,0005 4 0,188 0,017 65 <,0001 7 0,188 0,017 65 <,0001 3 0,192 0,017 68 <,0001 8 0,194 0,017 70 <,0001 2 0,203 0,017 78 <,0001 WUE tipo selvagem 1,958 0,054 PpCBL-2 9 1,944 0,168 -1 0.9357 2 2,314 0,168 18 0,0451 2,322 0,168 19 j 0,0405 8 2,448 0,168 25 0,0061 3 2,545 0,168 30 0,0011 4 2,569 0,168 31 0,0007 1 2,617 0,168 34 0,0003 7 2,771 0,168 42 <,0001 Tabela 39

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpHD-I (SEQ ID NO: 36)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 1,620 0,065 PpHD-I 7 1,976 0,207 22 0.1027 3 1,985 0,207 23 0,0944 6 2,144 0,207 32 0,0169 2 2,374 0,207 47 0,0007 8 2,444 0,207 51 0,0002 WUE tipo selvagem 0,110 0,005 - PpHD-I 2 0,126 0,016 14 0,3655 8 0,143 0,016 30 0,0566 6 0,149 0,016 35 0,0246 3 0,152 0,016 37 0,0177 7 0,191 0,016 73 < ,0001 Tabela 40

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpLRP-I (SEQ ID NO: 56)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW tipo selvagem 0,109 0,033 PpLRP-I 10 0,161 0,034 18 0,2835 (SEQ ID NO: 56) WUE tipo selvagem 1,782 0,119 PpLRP-I 10 2,205 0,169 24 0.0529 (SEQ ID NO: 56) Tabela 41

Linhagens de A. thaliana que super expressam PpLRP-I (SEQ ID NO: 58)

Medição Genótipo Linhagem LSM Erro % de P Padrão Melhora DW Tipo selvagem 0,109 0,033 PpLRP-I 10 0,161 0,034 48 0,2835 (SEQ ID NO: 58) WUE Tipo selvagem 1,782 0,119 PpLRP-I 10 2,205 0,169 24 0,0529 (SEQ ID NO: 58) EXEMPLO 4 - Plantas de Colza/Canola Tolerantes ao Estresse

Pecíolos cotiledonários de Canola de mudas jovens de 4 dias de idade são usados como explantes para a cultura de tecido e transformados de acordo com a EP1566443. O cultivar comercial Westar (Agriculture Canada) é a variedade padrão usada para a transformação, mas outras 10 variedades podem ser usadas. A. tumefaciens GV3101:pMP90RK contendo um vetor binário é usada para a transformação de canola. O vetor binário padrão usado para a transformação é pSUN (WO 02/00900), mas sistemas de vetor binário muito diferentes foram descritos para a transformação de planta (por exemplo, Na, G. em Agrobacterium Protocols, Methods in Molecular 15 Biology vol 44, pp 47-62, Gartland KMA e MR Davey eds. Humana Press, Totowa, New Jersey). Um cassete de expressão de gene vegetal que compreende um gene marcador de seleção e um promotor vegetal que regula a transcrição do cDNA que codifica o polinucleotídeo é utilizado. Vários genes marcadores de seleção podem ser usados incluindo o gene da ácido acetohidróxi sintase (AHAS) mutado divulgado nas Pat. US N— 5.767.366 e 5 6.225.105. Um promotor adequado é usado para regular o gene traço para fornecer a regulagem constitutiva, de desenvolvimento, tecido ou ambiental de transcrição do gene.

As sementes de canola são esterilizadas na superfície em 70 % de etanol por 2 min, incubadas por 15 min em água de torneira quente a 55° C 10 e depois em hipoclorito de sódio a 1,5 % por 10 minutos, seguido por três enxágues com água destilada esterilizada. As sementes são depois colocadas em meio MS sem hormônios, contendo vitaminas B 5 Gamborg, 3 % de sacarose e 0,8 % de Oxoidagar. As sementes são germinadas a 24° C por 4 dias em luz baixa (< 50 μΜοΙ/m s, 16 horas de luz). Os explantes do pecíolo 15 cotiledonário com o cotilédone ligado são excisado das mudas in vitro e inoculados com Agrobacterium pela imersão da extremidade do corte do explante de pecíolo na suspensão bacteriana. Os explantes são depois cultivados por 3 dias em meio MS incluindo vitaminas contendo 3,75 mg/l de BAP, 3 % de sacarose, 0,5 g/l de MES, pH 5,2, 0,5 mg/l GA3, 0,8 % de 20 Oxoidagar a 24° C, 16 horas de luz. Depois de três dias de co-cultivo com Agrobacterium, os explantes de pecíolo são transferidos para o meio de regeneração contendo 3,75 mg/l de BAP, 0,5 mg/l de GA3, 0,5 g/l de MES, pH 5,2, 300 mg/l de timentina e agente de seleção até a regeneração de broto. Tão logo os explantes comecem a desenvolver brotos, eles são transferidos 25 para o meio de alongamento de broto (A6, contendo o meio MS na concentração total incluindo vitaminas, 2 % de sacarose, 0,5 % de Oxoidagar, 100 mg/l de mio-inositol, 40 mg/l de sulfato de adenina, 0,5 g/l de MES, pH 5,8, 0,0025 mg/l de BAP, 0,1 mg/l de IBA, 300 mg/l de timentina e agente de seleção). As amostras tanto do material in vitro quando da estufa das plantas transgênicas primárias (TO) são analisadas pela qPCR usando sondas TaqMan para confirmar a presença de T-DNA e para determinar o número de integrações de T-DNA.

5 A semente é produzida a partir das plantas transgênicas

primárias pela auto-polinização. As plantas da segunda geração são cultivadas em condições de estufa e auto-polinizadas. As plantas são analisadas pela qPCR usando sondas TaqMan para confirmar a presença de T-DNA e para determinar o número de integrações de T-DNA. As plantas homozigotas 10 transgênicas, heterozigotas transgênicas e azigotas (transgênico nulo) são comparadas quanto a sua tolerância ao estresse, por exemplo, nos ensaios descritos no Exemplo 3 e quanto ao rendimento, tanto nos estudos em estufa quanto no campo.

EXEMPLO 5 - Triagem quanto a plantas de arroz tolerantes ao

estresse

Plantas de arroz transgênicas que compreendem um polinucleotídeo da invenção são geradas usando métodos conhecidos. Aproximadamente 15 a 20 transformantes independentes (TO) são gerados. Os transformantes primários são transferidos das câmaras de cultura de tecido 20 para uma estufa para crescimento e colheita das sementes Tl. Cinco eventos da progênie Tl segregaram 3:1 quanto a presença/ausência do transgene são retidos. Para cada um destes eventos, 10 mudas Tl contendo o transgene (hetero- e homozigotas) e 10 mudas Tl carecendo do transgene (nulizigotas) são selecionados pela triagem de marcador visual. As plantas Tl selecionadas 25 são transferidas a uma estufa. Cada planta recebe um único rótulo de código de barras para ligar de modo sem ambigüidade os dados da fenotipagem com a planta correspondente. As plantas Tl selecionadas são cultivadas no solo em vasos de 10 cm de diâmetro sob os seguintes ajustes ambientais: fotoperíodo = 11,5 h, intensidade da luz do dia = 30.000 Iux ou mais, temperatura diutuma = 28° C ou mais alta, temperatura noturna = 22° C, umidade relativa = 60 a 70 %. As plantas transgênicas e os nulizigotos correspondentes são cultivados lado a lado em posições aleatórias. A partir do estágio de semeadura até o estágio de maturidade, as plantas são passadas diversas vezes através de uma 5 cabina de formação de imagem digital. Em cada ponto de tempo imagens digitais (2048 x 1536 pixéis, 16 milhões de cores) de cada planta são tiradas de pelo menos 6 ângulos diferentes.

Os dados obtidos no primeiro experimento com plantas Tl são confirmados em um segundo experimento com plantas T2. As linhagens que 10 têm o padrão de expressão correta são selecionados para outra análise. Os lotes de semente das plantas positivas (tanto hetero- quanto homozigotas) em Tl são triadas pela monitoração da expressão do marcador. Para cada evento escolhido, os lotes de semente heterozigota são depois retidos para a avaliação T2. Dentro de cada lote de semente, um número igual de plantas positivas e 15 negativas são cultivadas na estufa para avaliação.

As plantas transgênicas são triadas quanto ao seu crescimento e/ou rendimento e/ou tolerância ao estresse melhorados, por exemplo, usando os ensaios descritos no Exemplo 3 e quanto ao rendimento, tanto em estudos na estufa quanto no campo.

EXEMPLO 6 - Plantas de soja tolerantes ao estresse

Os polinucleotídeos das Tabelas 1 e 2 são transformados em soja usando os métodos descritos no pedido internacional copendente de propriedade em comum número WO 2005/121345, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência. As plantas transgênicas são depois triadas 25 quanto ao seu crescimento melhorado sob condições limitadas em água e/ou tolerância à seca, sal e/ou frio, por exemplo, usando os ensaios descritos no Exemplo 3 e quanto ao rendimento, tanto em estudos na estufa quanto no campo.

EXEMPLO 7 - Plantas de trigo tolerantes ao estresse A transformação de trigo é realizada com o método descrito por Ishida et al., 1996, Nature Biotech. 14745-50. Embriões imaturos são cocultivados com Agrobacterium tumefaciens que carrega vetores “super binários” e plantas transgênicas são recuperadas através da organogênese.

5 Este procedimento fornece uma eficiência de transformação entre 2,5 % e 20 %. As plantas transgênicas são depois triadas quanto ao seu crescimento e/ou rendimento melhorados sob condições limitadas em água e/ou tolerância ao estresse, por exemplo, é o ensaio descrito no Exemplo 3 e quanto ao rendimento, tanto em estudos na estufa quanto no campo.

EXEMPLO 8 - Plantas de milho tolerantes ao estresse

As células de Agrobacterium que abrigam os genes e o gene ahas do milho no mesmo plasmídeo são cultivadas em meio YP suplementado com antibióticos apropriados por 1 a 3 dias. Uma alça de células de Agrobacterium é coletada e recolocada em suspensão em 1,5 ml de meio ΜΙ 5 LS-002 (LS-inf) e o tubo contendo células de Agrobaeterium é mantida em um agitador por 1 a 4 horas a 1.000 rpm.

Espigas de milho [genótipo J553x(HIIIAxA188)] são colhidas em 7 a 12 dias depois da polinização. As espigas são esterilizadas em solução a 20 % de Clorox por 15 minutos seguido por enxágüe cuidadoso com água estéril. Os embriões imaturos com tamanho de 0,8 a 2,0 mm são dissecados no tubo contendo células de Agrobaeterium em solução LS-inf.

A agro-infecção é realizada mantendo-se o tubo horizontalmente na capela laminar na temperatura ambiente por 30 minutos. A mistura da agro infecção é vertida em uma placa contendo o meio de co25 cultivo (M-LS-011). Depois a agro-solução líquida é pipetada, os embriões transferidos para a superfície de um papel de filtro que é colocado no meio de co-cultivo de ágar. A solução bacteriana em excesso é removida com uma pipeta. Os embriões são colocados sobre o meio de co-cultivo com escutelo para cima e cultivados no escuro a 22° C por 2 a 4 dias. Os embriões são transferidos para o meio de M-MS-IOl sem seleção. Sete a dez dias mais tarde, os embriões são transferidos para meio MLS-401 contendo 0,50 μΜ de imazethapyr e cultivados por 4 semanas (duas transferências de 2 semanas) para selecionar quanto as células de calo 5 transformada. A regeneração da planta é iniciada pela transferência de calos resistentes ao meio de M-LS-504 suplementado com 0,75 μΜ de imazethapyr e cultivados sob luz de 25 a 27° C por duas a três semanas. Os brotos regenerados são depois transferidos para a caixa de enraizamento com meio M-MS-618 (0,5 μΜ de imazethapyr). As plantinhas com raízes são 10 transferidas para mistura de vaso em vasos pequenos na estufa e depois da aclimatização são então transplantadas para vasos maiores e mantidas na estufa até a maturidade.

O número de cópia do transgene em cada plantinha é ensaiado usando a análise de Taqman de DNA genômico e a expressão de transgene é ensaiada usando qRT-PCR de RNA total isolado das amostras de folha.

Usando ensaios tais como o ensaio descrito no Exemplo 3, cada uma destas plantas é rotulada de modo único, amostrada e analisada quanto ao número de cópias do transgene. As plantas positivas e negativas em transgene são marcadas e emparelhadas com tamanhos similares para 20 transplantar junto para vasos maiores. Isto fornece um ambiente uniforme e competitivo para as plantas positivas e negativas em transgene. Os vasos grandes são regados a uma certa porcentagem da capacidade de água no campo do solo dependendo da severidade de estresse pela água desejado. O nível de água no solo é mantido regando-se todos os dias. O crescimento da 25 planta e os traços fisiológicos tais como altura, diâmetro do caule, enrolamento da folha, emurchecimento da planta, taxa de extensão da folha, situação de água da folha, teor de clorofila e taxa de fotossíntese são medidos durante o período de crescimento. Depois de um período de crescimento, a porção acima do solo das plantas é colhida e o peso fresco e peso seco de cada planta são tirados. Uma comparação do fenótipo de tolerância à seca entre as plantas positivas e negativas em transgene é então feita.

Usando ensaios tais como o ensaio descrito no Exemplo 3, os vasos são cobertos com tampas que permitem que as mudas cresçam através 5 dela mas minimizem a perda de água. Cada vaso é pesado periodicamente e água adicionada para manter o teor de água inicial. No final do experimento, o peso fresco e seco de cada planta é medido, a água consumida por cada planta é calculada e a WUE de cada planta é computada. O crescimento da planta e os traços fisiológicos tais como WUE, altura, diâmetro do caule, 10 enrolamento da folha, emurchecimento da planta, taxa de extensão da folha, situação de água da folha, teor de clorofila e taxa de fotossíntese são medidos durante o experimento. Uma comparação do fenótipo WUE entre as plantas positivas e negativas em transgene é depois feita.

Usando ensaios tais como o ensaio descrito no Exemplo 3, estes vasos são mantidos em uma área na estufa que tem condições ambientais uniformes e cultivadas otimamente. Cada uma destas plantas é unicamente rotulada, amostrada e analisada quanto ao número de cópia de transgene. As plantas são deixadas crescer sob estas condições até que elas atinjam um estágio de crescimento pré definido. A água é depois negada. O crescimento de planta e os traços fisiológicos tais como altura, diâmetro do caule, enrolamento da folha, emurchecimento da planta, taxa de extensão da folha, situação de água da folha, teor de clorofila e taxa de fotossíntese são medidos como aumentos na intensidade de estresse. Uma comparação do fenótipo de tolerância à dessecação entre plantas positivas e negativas em transgene é depois feita.

Sementes de milho transgênico segregantes quanto a um evento de transformação são plantadas em vasos pequenos para testar em um ensaio de seca cíclica. Estes vasos são mantidos em uma área na estufa que tivesse condições ambientais uniformes e cultivadas otimamente. Cada uma destas plantas é unicamente rotulada, amostrada e analisada quanto ao número de cópia de transgene. As plantas são deixadas crescer sob estas condições até que elas atingissem um estágio de crescimento pré definido. As plantas são depois repetidamente regadas até a saturação em um intervalo fixo de tempo.

5 Este ciclo de água/seca é repetido pela duração do experimento. O crescimento de planta e os traços fisiológicos tais como altura, diâmetro do caule, enrolamento da folha, emurchecimento da planta, taxa de extensão da folha, situação de água da folha, teor de clorofila e taxa de fotossíntese são medidos durante o período de crescimento. No final do experimento, as 10 plantas são colhidas para peso fresco e seco acima do solo. Uma comparação do fenótipo de tolerância à seca cíclica entre plantas positivas e negativas em transgene é depois feita.

De modo a testar o milho transgênico segregante quanto a tolerância à seca sob condições isentas de chuva, o estresse à seca controlado 15 em uma única localização ou localizações múltiplas é usado. A disponibilidade de água da safra é controlada pela irrigação por gotejamento ou suspensa em uma localização que tem menos do que 10 cm de chuva e temperaturas mínimas maiores de 5o C esperados durante uma estação média de 5 meses ou uma localização com precipitação na estação esperada 20 interceptada por uma cobertura contra chuva automatizada que retrai para fornecer condições de campo aberto quando não requerido. As práticas agronômicas padrão na área são seguidas quanto a preparação do solo, plantio, fertilização e controle de praga. Cada vaso é semeado com semente segregante quanto a presença de um único evento de inserção transgênica. Um 25 ensaio do número de cópias de transgene Taqman é usado em amostras de folha para diferenciar os transgênicos de plantas de controle nulas em segregantes. As plantas que foram genotipadas desta maneira também são contadas quanto a uma faixa de fenótipos relacionados com a tolerância à seca, crescimento e rendimento. Estes fenótipos incluem a altura da planta, peso do grão por planta, número de grão por planta, número de espigas por planta, peso seco acima do solo, condutância da folha para vapor d’água, captação de CO2 pela folha, teor de clorofila da folha, parâmetros de fluorescência da clorofila relacionada com a fotossíntese, eficiência no uso da 5 água, potencial de água na folha, teor de água relativa da folha, taxa de fluxo da seiva do caule, condutividade hidráulica do caule, temperatura da folha, reflectância da folha, absorptância de luz da folha, área da folha, dias para florescer, intervalo de formação de seda da antese, duração do enchimento de grão, potencial osmótico, ajuste osmótico, tamanho da raiz, taxa de extensão 10 da folha, ângulo da folha, enrolamento e sobrevivência da folha. Todas as medições são feitas com instrumentação comercialmente disponível para a fisiologia de campo, usando os protocolos padrão fornecidos pelos fabricantes. As plantas individuais são usadas como a unidade de réplica por evento.

De modo a testar o milho transgênico não segregante quanto a

tolerância à seca sob condições isentas de chuva, o estresse pela seca controlada em uma única localização ou localizações múltiplas é usado. A disponibilidade de água da safra é controlada pela irrigação por gotejamento ou suspensa em uma localização que tem menos do que 10 cm de chuva e 20 temperaturas mínimas maiores de 5o C esperados durante uma estação média de 5 meses ou uma localização com precipitação na estação esperada interceptada por uma “cobertura contra chuva” automatizada que retrai para fornecer condições de campo aberto quando não requerido. As práticas agronômicas padrão na área são seguidas quanto a preparação do solo, 25 plantio, fertilização e controle de praga. O esquema de teste é designado para emparelhar uma plotagem contendo um evento transgênico não segregante com uma plotagem adjacente de controles de segregante nulo. Um segregante nulo é a progênie (ou linhagens derivadas da progênie) de uma planta transgênica que não contém o transgene devido à segregação Mendeliana. As plotagens aos pares de réplicas adicionais para um evento particular são distribuídas em tomo do teste. Uma faixa de fenótipos relacionados com a tolerância à seca, crescimento e rendimento é contada nas plotagens emparelhadas e estimadas ao nível da plotagem. Quando a técnica de medição apenas pôde ser aplicada às plantas individuais, estas são selecionadas ao acaso de cada vez de dentro da plotagem. Estes fenótipos incluem altura da planta, peso do grão por planta, número de grão por planta, número de espigas por planta, peso seco acima do solo, condutância da folha para vapor d’água, captação de CO2 pela folha, teor de clorofila da folha, parâmetros de IO fluorescência da clorofila relacionada com a fotossíntese, eficiência no uso da água, potencial de água na folha, teor de água relativa da folha, taxa de fluxo da seiva do caule, condutividade hidráulica do caule, temperatura da folha, reflectância da folha, absorptância de luz da folha, área da folha, dias para florescer, intervalo de formação de seda da antese, duração do enchimento de grão, potencial osmótico, ajuste osmótico, tamanho da raiz, taxa de extensão da folha, ângulo da folha, enrolamento e sobrevivência da folha. Todas as medições são feitas com instrumentação comercialmente disponível para a fisiologia de campo, usando os protocolos padrão fornecidos pelos fabricantes. As plotagens individuais são usadas como a unidade de réplica por evento.

Para realizar o teste em localização múltipla de milho transgênico quanto a tolerância à seca e rendimento, de cinco a vinte localizações abrangendo as regiões de maior cultivo de milho são selecionadas. Estas são amplamente distribuídas para fornecer uma faixa de 25 disponibilidades de água de safra esperadas com base na temperatura, umidade, precipitação e tipo de solo médios. A disponibilidade de água de safra não é modificada além das práticas agronômicas padrão. O esquema de teste é planejado para emparelhar uma plotagem contendo um evento transgênico não segregante com uma plotagem adjacente de controles de segregante nulo. Uma faixa de fenótipos relacionados com a tolerância à seca, crescimento e rendimento é contada nas plotagens emparelhadas e estimadas ao nível da plotagem. Quando a técnica de medição seria apenas aplicada às plantas individuais, estas são selecionadas ao acaso de cada vez de dentro da 5 plotagem. Estes fenótipos incluem altura da planta, peso do grão por planta, número de grão por planta, número de espigas por planta, peso seco acima do solo, condutância da folha para vapor d’água, captação de CO2 pela folha, teor de clorofila da folha, parâmetros de fluorescência da clorofila relacionada com a fotossíntese, eficiência no uso da água, potencial de água na folha, teor 10 de água relativa da folha, taxa de fluxo da seiva do caule, condutividade hidráulica do caule, temperatura da folha, reflectância da folha, absorptância de luz da folha, área da folha, dias para florescer, intervalo de formação de seda da antese, duração do enchimento de grão, potencial osmótico, ajuste osmótico, tamanho da raiz, taxa de extensão da folha, ângulo da folha, 15 enrolamento e sobrevivência da folha. Todas as medições são feitas com instrumentação comercialmente disponível para a fisiologia de campo, usando os protocolos padrão fornecidos pelos fabricantes. As plotagens individuais são usadas como a unidade de réplica por evento.

Claims (22)

1. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma tRNA 2’-fosfotransferase.

2. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma quinase de proteína CDC2.

3. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de repetição rica em leucina.

4. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína que liga Ran.

5. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de divisão de plastídeo.

6. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína carreadora do substrato mitocondrial.

7. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de MADS-box.

8. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína da adenosina quinase-1.

9. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de dedo de zinco 6.

10. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de subunidade reguladora da quinase dependente de ciclina.

11. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de dedo de zinco 7.

12. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de ligação de MAR.

13. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína LRP-2.

14. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína da quinase de proteína fitocrômica.

15. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de sinaptobrevina.

16. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína B de calcineurina.

17. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de caleosina.

18. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica, caracterizadas pelo fato de que são transformadas com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína da histona desacetilase.

19. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste de (a) uma molécula de ácido nucleico que compreende uma seqüência de polinucleotídeo apresentada na Tabela 1 ou Tabela 2; (b) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de (a);e (c) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (a) a (b) sob condições de hibridização estringentes.

20. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste de (a) uma seqüência de polipeptídeo apresentada na Tabela 1; e (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de polipeptídeo de (a).

21. Método de produzir uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polinucleotídeo como definido na reivindicação 19, em que a expressão do polinucleotídeo na planta resulta no crescimento e/ou rendimento aumentado da planta sob condições normais ou limitadas em água e/ou tolerância aumentada a um estresse ambiental quando comparada com uma variedade do tipo selvagem da planta que compreende as etapas de: (a) introduzir em uma célula vegetal um vetor de expressão que compreenda pelo menos um polinucleotídeo como definido na reivindicação 19 e (b) gerar a partir da célula vegetal uma planta transgênica que expresse o polinucleotídeo, em que a expressão do polinucleotídeo na planta transgênica resulta no crescimento e/ou rendimento aumentados da planta sob condições normais ou limitadas em água e/ou tolerância aumentada ao estresse ambiental quando comparada com uma variedade do tipo selvagem da planta.

22. Método de aumentar um crescimento e/ou rendimento da planta sob condições normais ou limitadas em água e/ou aumentar uma tolerância da planta a um estresse ambiental, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de aumentar a expressão de pelo menos um polinucleotídeo como definido na reivindicação 19 na planta.