BRPI0809352A2 - Proteínas inseticidas - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNAS INSETICIDAS"

PRÁTICA

A presente invenção refere-se a campos de engenharia de proteínas, biologia molecular de plantas e controle de pestes. Mais particularmente a invenção refere-se às recentes proteínas de engenharia híbrida com atividade inseticida, ácidos nucleicos cuja expressão resulta nas proteínas inseticidas, e métodos para fazer e métodos para usar as proteínas inseticidas e ácidos nucleicos correspondentes para controlar insetos.

As pestes de insetos são a maior causa das perdas de safras. Só nos EUA bilhões de dólares são perdidos a cada ano em função da infestação de vários gêneros de insetos. Além das perdas nos campos de safra, as pestes de insetos também são uma carga para plantadores de vegetais e frutas, produtores de flores ornamentais e são um incomodo para os jardineiros e proprietários de residências.

As espécies de larva do milho são as pestes de milho com maior poder de destruição. Nos EUA, as três espécies importantes são Diabrotica virgifera virgifera, a larva do oeste, D. Iongicornis barberi, larva do norte e D. undecimpunctata howardi, larva do sul. Apenas as larvas do oeste e do norte são consideradas como pestes primárias de milho na Faixa do Milho nos EUA. Uma larva importante no sul dos EUA e a larva mexicana, Diabrotica virgifera zeae. As larvas causam os danos mais substancias nas plantas ao alimentar-se quase que exclusivamente das raízes do milho. Esta lesão foi comprovada de aumentar o alojamento da planta, reduzir o rendimento de grãos e rendimento vegetal assim como alterar o conteúdo e nutrientes do grão. A alimentação as larvas também causa efeitos indiretos no milho ao abrir avenidas nas raízes para infecções de bactérias e fungos que resultam em doenças de apodrecimento da raiz e do talo. As larvas adultas ficam ativas nos milharais no final do verão quando se alimentam das espigas de milho, sedas e pólen, interferindo assim com a polinização normal.

As larvas do milho são controladas geralmente com aplicações intensivas de pesticidas químicos que são ativos pela inibição do crescimento de insetos, prevenção da alimentação ou reprodução de insetos, ou causar a morte. Um controle eficaz da larva do milho pode ser obtido, porém estes produtos químicos podem ocasionalmente afetar também outros organismos benéficos. Outro problema que resulta do amplo uso de pesticidas 5 químicos é o aparecimento de variedades resistentes de insetos. Outro problema ainda se deve ao fato que a larva pode alimentar-seembaixo do solo dificultando assim a aplicação de tratamentos de resgate de inseticidas. Sendo assim, a maioria das aplicações de inseticida são realizadas de maneira profilática quando do plantio. Esta prática resulta em ampla carga am10 biental. Isto foi parcialmente aliviado por várias práticas de gestão de agricultura, porém existe uma crescente necessidade de mecanismos alternativos de controle de pestes.

Agentes biológicos de controle de pestes, tais como Bacillus thuringiensis (Bt) grupo que expressa toxinas pesticidas como δ-endotoxinas 15 (delta-endotoxinas; também denominadas toxinas de cristal ou proteínas Cry), também foram aplicados em plantas de safra com resultados satisfatórios contra pestes primárias de insetos lepidópteros. As δ-endotoxinas são proteínas contidas dentro de uma matriz cristalina que são conhecidas de possuir atividade inseticida quando ingeridas por certos insetos. As várias δ20 endotoxinas foram classificadas com base em seu espectro de atividade e homologia de seqüência. Antes de 1990, as classes maiores eram definidas por seu espectro de atividade com as proteínas Cryl ativas contra Lepidópteros (traças e borboletas), proteínas Cry2 ativas contra Lepidópteros e Dipteros (moscas e mosquitos), proteínas Cry3 ativas contra Coleópteros (be25 souros) e proteínas Cry4 ativas contra Dípteros (Hofte & Whitely1 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255). Uma nova nomenclatura foi desenvolvida em 1998 a qual sistematicamente classifica as proteínas Cry com base em homologia de seqüência de aminoácidos ao invés de especificidades-alvo de insetos (Crickmore etal. 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:807-813).

O espectro de atividade inseticida de uma δ-endotoxinas indivi

dual de Bt é bastante estrito, com dada δ-endotoxinas sendo ativa apenas contra algumas espécies dentro de uma Ordem. Por exemplo, uma toxina Cry3A é conhecida de ser bastante tóxica para o besouro de batata do Colorado, Leptinotarsa decemlineata, mas de ter muito pouco efeito ou nenhuma toxicidade com besouros relacionados no gênero Diabrotica (Johnson et ai, 1993, J. Econ. Entomol. 86:330-333). De acordo com Slaney et ai. (1992, 5 Insect Biochem. Molec. Biol. 22:9-18) uma toxina Cry3A é pelo menos 2000 vezes menos tóxica para a larva do sul que para o besouro da batata do Colorado. Também é sabido que a Cry3A possui pouca ou nenhuma toxicidade para a larva do oeste ou do norte.

A especificidade das δ -endotoxinas é o resultado da eficiência 10 dos vários passos envolvidos na produção de uma proteína tóxica ativa e a sua subsequente interação com as células epiteliais no intestino médio dos insetos. Para ser inseticida, a maioria das δ-endotoxinas conhecidas devem ser primeiramente ingeridas pelo inseto e ativadas proteoliticamente para formar uma toxina ativa. A ativação das proteínas de cristal inseticida (Cry) é 15 um processo com vários passos. Após a ingestão, os cristais devem ser primeiramente solubilizados no intestino do inseto. Uma vez solubilizadas as Ôendotoxinas são ativadas por segmentações proteolíticas especificas. As proteases no intestino do inseto podem desempenhar um papel na especificidade ao determinar onde a δ-endotoxinas é processada. Assim que a δ20 endotoxinas é solubilizada e processada, ela se junta com receptores específicos na superfície do epitélio do intestino médio do inseto e subsequentemente integra-se na dupla camada de lipídeo da membrana da borda em escova. Canais de íon formam-se interrompendo a função do intestino médio causando assim a morte do inseto.

Nos lepidópteros, que possuem intestino com pH alcalino, as

proteases do intestino processam δ-endotoxinas, por exemplo, CryIAa, CryIAb, CryIAc, CryIB e CrylF, de protoxinas 130-140 kDa para proteínas tóxicas de aproximadamente 60-70 kDa. O processamento da protoxina em toxina foi relatado de proceder por meio da remoção de ambos os aminoáci30 dos terminais N- e C- com a localização exata de processamento dependendo da δ-endotoxinas específica e os fluídos específicos de intestino de inseto envolvidos (Ogiwara et ai, 1992, J. Invert. Pathol. 60:121-126). Assim a ativação requer que toda a região da cauda protoxina C-terminal- seja transpassada. Esta ativação proteolitica de uma δ-endotoxinas pode ter um papel significante na determinação da sua especificidade.

Os insetos coleópteros possuem intestinos que são mais neutros a acidíferos e as δ-endotoxinas específicas de coleópteros são similares ao tamanho das toxinas ativadas específicas de lepidópteros. Portanto, o processamento das δ-endotoxinas específicas de coleópteros era previamente considerado desnecessário para toxicidade. Não obstante, dados sugerem que as δ-endotoxinas ativas de coleópteros são solubilizadas e proteolizadas para polipeptídios tóxicos menores. Uma proteína 73 kDa Cry3A δendotoxinas produzida por B. thuringiensis var. tenebrionis é na verdade processada pela bactéria no término N-, perdendo 49-57 resíduos durante ou após a formação de cristais para produzir a forma 67 kDa comumente isolado (Carroll et ai, 1989, Biochem. J. 261:99-105). McPherson et ai, (1988, Biotechnology 6:61-66) também demonstrou que uma seqüência de código nativa cryZfK contém dois códons funcionais translacionais de iniciação no mesmo quadro de leitura, uma codificação para proteína 73 kDa e a outra codificação para uma proteína 67 kDa começando no Met-1 e Met-48 respectivamente, da seqüência de aminoácido deduzida. Ambas as proteínas podem ser consideradas como proteínas Cry3A de extensão completa ocorrendo naturalmente.

Conforme mais conhecimentos são obtidos sobre a função das δ-endotoxinas, as tentativas de engenharia das δ-endotoxinas para ter novas atividades têm aumentado. A engenharia das δ-endotoxinas tornou-se mais 25 possível ao resolver a estrutura tridimensional de uma Cry3A em 1991 (Li et ai, 1991, Nature 353:815-821). Li et ai Determinou que uma proteína Cry3A possui três domínios estruturais: O domínio I do N-terminal-, de resíduos 58- 290, consiste em 7 α-hélices, domínio II, de resíduos 291-500, contém três folhas-β em uma chamada formação chave grega, e o domínio Ill de C30 terminal, de resíduos 501-644, é um sanduíche β-em conformação denominada rocambole. A estrutura tridimensional da toxina ativa CryIAa de Iepidóptero também foi resolvida (Grochulski et ai, 1995, J. Mol. Biol. 254:447- 464). A toxina CryIAa possui também três domínios: O domínio I N-terminal, de resíduos 33-253, domínio Il de resíduos 265-461, e domínio Ill de resíduos 463-609 com fita adicional externo é uma das folhas-β de resíduos 254-264. Se as estruturas Cry3A e CryIAa são projetadas em outras se5 quências Cry1, o domínio I corre aproximadamente de resíduo de aminoácido de 28 a 260, o domínio Il de aproximadamente 260 a 460 e o domínio Ill de aproximadamente 460 a 600. Ver, Nakamura et ai, Agric. Biol. Chem. 54(3): 715-724 (1990); Li et ai, Nature 353: 815-821 (1991); Ge et ai, J. Biol. Chem. 266(27): 17954-17958 (1991); e Honee et al., Mol. Microbiol. 10 5(11): 2799-2806 (1991); cada um dos quais aqui incorporados por referência. Assim, agora se sabe que com base na homologia de seqüência de aminoácidos, as δ-endotoxinas Bt possuem uma estrutura tridimensional similar compreendendo os três domínios.

As porções de toxina das proteínas Cry Bt são também caracterizadas por ter cinco blocos conservados atravessando sua seqüência de aminoácidos numerados CB1 a CB5 de terminais N a terminais C, respectivamente (Hofte & Whiteley, supra). O bloco conservado 1 (CB1) compõe aproximadamente 29 aminoácidos, o bloco conservado 2 (CB2) compõe aproximadamente 67 aminoácidos, o bloco conservado 3 (CB3) compõe aproximadamente 48 aminoácidos, o bloco conservado 4 (CB4) compõe aproximadamente 10 aminoácidos e o bloco conservado 5 (CB5) compõe aproximadamente 12 aminoácidos. As seqüências antes e depois destes cinco blocos conservados são altamente variáveis e, portanto designadas com as "regiões variáveis" V1-V6. O domínio I de uma δ-endotoxinas Bt tipicamente compõe a região variável 1, bloco conservado 1, região variável 2, e os 52 aminoácidos N-terminal do bloco conservado 2. O domínio Il tipicamente compõe aproximadamente os 15 aminoácidos C-terminal do bloco conservado 2, região variável 3, e aproximadamente os 10 aminoácidos do N-terminal do bloco conservado 3. O domínio Ill tipicamente compõe aproximadamente os 38 aminoácidos C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, o bloco conservado 4, região variável 5, e o bloco conservado 5. As toxinas ativas Cryl lepidópteras, entre outras delta-toxinas, possuem região variável 6 com aproximadamente 1-3 aminoácidos dentro do domínio III.

Muitas fitas Bt e δ-endotoxinas são ativas contra diferentes espécies de insetos e nematódeos. Não obstante, relativamente poucas destas fitas e toxinas possuem atividade contra insetos coleópteros. Adicionalmen5 te, a maioria das agora conhecidas δ-endotoxinas nativas ativas de coleópteros, por exemplo, Cry3A, Cry3B, Cry3C, Cry7A, Cry8A, Cry8B, e Cry8C, possuem toxicidade insuficiente oral contra a larva do milho para fornecer controle de campo adequado caso aplicadas, por exemplo, por meio de micróbios ou plantas transgênicas. Assim sendo, outras abordagens para a 10 produção de toxinas recentes ativas contra a larva do milho precisam ser exploradas.

As δ-endotoxinas lepidópteras ativas passaram por engenharia na tentativa de melhorar a atividade específica ou para ampliar o espectro da atividade inseticida. Por exemplo, o domínio de especificidade do bicho-da15 seda (Bombyx mori) de proteína CryIAa foi movida para uma proteína CryIAc, impondo assim nova atividade inseticida na proteína híbrida Bt resultante (Ge et al. 1989, PNAS 86: 4037-4041). Também, Bosch et al. 1998 (Patente US 5,736,131, incorporada aqui por referência) descreve toxinas híbridas de Bacillus thuringiensis compreendendo no seu C-terminal domínio 20 Ill de uma proteína de primeiro Cry e seus terminais N domínios I e Il de uma segunda proteína Cry. Tais toxinas híbridas mostraram possuir especificidade inseticida alterada contra insetos lepidópteros. Por exemplo, a toxina híbrida H04, que também é descrita em De Maagd et al., AppI. Environ. Microbiol. 62(5): 1537-1543 (1996) compõe os seus domínios I e Il de N-terminal 25 de CryIAb e seu domínio Ill de C-terminal de CrylC. H04 é relatado como sendo altamente tóxico ao inseto lepidóptero Spodoptera exigua comparado com a toxina CryIAb paterna e significativamente mais tóxico do que a toxina CryIC paterna. Também foi demonstrado que a substituição do domínio Ill das toxinas, que não são ativas contra o Spodoptera exigua tais como 30 CryIE e CryIAb, pelo domínio Ill de CrylC, que é ativo contra o Spodoptera exigua, pode produzir toxinas híbridas que são ativas contra referido inseto. Todos os híbridos descritos em Bosch et ai utilizam domínios de proteínas ativas Cry lepidópteras para fazer novas toxinas com atividade lepidóptera. Os resultados sugerem que o domínio NI de CryIC é um importante determinante da especificidade para o Spodoptera exigua. Ver também, Bosch et al., FEMS Microbiology Letters 118: 129-134 (1994); Bosch et al., Bi5 o/Technology 12: 915-918 (1994); De Maagd et al., AppI. Environ. Microbiol. 62(8): 2753-2757 (1996); e De Maagd et al., MoL Microbiol. 31(2): 463-471 (1999); cada um dos quais aqui incorporados por referência.

Várias tentativas de engenharia de δ-endotoxinas ativas coleópteras foram relatadas. Chen e Stacy (Patente US 7,030,295, aqui incorporada por referência) criaram com sucesso uma toxina ativa de larva do milho ao inserir um sítio de reconhecimento de protease de ocorrência não-natural no domínio I, domínio III, ou ambos os domínios I e Ill de uma proteína Cry3A. Uma das proteínas Cry3A modificadas resultantes, designada Cry3A055, com sítio de reconhecimento de protease inserido no domínio I, foi ativa contra várias espécies de Diabrotica. Van Rie et al., 1997, (Patente US N0 5.659.123) realizou engenharia de Cry3A ao repor aleatoriamente aminoácidos, acreditado de ser importante na acessibilidade de solvente, no domínio Il com o aminoácido alanino. Várias destas substituições aleatórias confinadas ao domínio Il foram reportadamente envolvidas na toxicidade incrementada da larva do milho do oeste. Não obstante, outras mostraram que algumas substituições de alanino no domínio Il de Cry3A resultam na interrupção da junção de receptor ou instabilidade estrutural (Wu e Dean, 1996, J. Mol. Biol. 255: 628-640). English et al., 1999, (Pedido de Patente Internacional Publicado N0 WO 99/31248) relatou substituições de aminoácidos em Cry3Bb que causaram aumentos na toxicidade para as larvas do milho do sul e do oeste. Porém, dos 35 mutantes de Cry3Bb relatados, apenas três, com mutações primariamente no domínio Il e na interface domínio l-domínio II, foram ativos contra a larva do milho do oeste. Adicionalmente, a variação em toxicidade do tipo selvagem de Cry3Bb contra a larva do milho do oeste nos mesmos estudos aparenta ser maior contra quaisquer das diferenças entre as toxinas Cry3Bb com mutação e Cry3Bb tipo selvagem. Shadenkov et al. (1993, Mol. Biol. 27:586-591), fez uma proteína híbrida ao fundir aminoácidos 48-565 de uma proteína Cry3A em aminoácidos 526-725 de uma proteína CryIAa. Assim sendo, o cruzamento entre a seqüência Cry3A e CryIAa ocorreu no bloco conservado 4 localizado no domínio III. A Cry3A é muito ativa contra o besouro da batata do Colorado (Leptinotarsa decemli5 neata). Não obstante, a proteína híbrida descrita por Shadenkov et al. não foi ativa contra o besouro da batata do Colorado apesar de que mais de 75% da proteína híbrida ser composta por uma seqüência Cry3A. Assim, a adição de apenas 25% de uma seqüência CryIAa destruiu a atividade contra inseto coleóptero que a Cry3A paterna era ativa contra. Isto sugere que proteínas 10 hibridas feitas com fusão de porções de proteína Cry ativa coleóptera.por exemplo Cry3A, e uma proteína ativa lepidóptera, por exemplo CrylA, não teriam atividade contra insetos coleópteros, particularmente um inseto coleóptero que normalmente não é suscetível a Cry3A como a larva do milho.

Em vista da discussão acima, resta a necessidade de desenhar 15 novos e eficazes agentes de controle de pestes que forneçam um beneficio econômico para fazendeiros e que seja ambientalmente aceitável. São de particular necessidade as toxinas que são tóxicas para espécies de Diabrotica, uma peste principal do milho, que tenham diferente modo de ação do que os produtos de controle de pestes existentes como forma de mitigar o 20 desenvolvimento da resistência. Adicionalmente, as entregas de agentes de controle em produtos que minimizam a carga ao meio ambiente, como por plantas transgênicas, são desejáveis.

SUMÁRIO

Em vista destas necessidades, é um dos objetivos da presente 25 invenção fornecer proteínas híbridas inseticidas recentes projetadas (eHIPs). Referidas eHIPs recentes são desenvolvidas ao fundir combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes e opcionalmente incluir uma região de cauda de protoxina de uma proteína Cry Bt no C-terminal ou fragmento terminal peptidila N-terminal 30 ou ambos. Por exemplo, sem-limitação, ao combinar regiões variáveis completas ou parciais e blocos conservados de uma primeira proteína Cry que possui atividade coleóptera com regiões variáveis, completas ou parciais, e blocos conservados de uma segunda proteína Cry com atividade lepidóptera, diferente da primeira proteína Cry1 e opcionalmente incluindo uma região de cauda de protoxina de proteína ativa lepidóptera Cry Bt1 ou fragmento de peptidila N-terminal ou ambos, novas proteínas híbridas inseticidas projeta5 das são criadas possuindo atividade contra um espectro de insetos diferente do que a primeira ou segunda proteína Cry paterna ou de ambas. Referidas eHiPs recentes podem compor regiões variáveis completas ou parciais, blocos conservados ou domínios de uma proteína Cry3A modificada e uma proteína Cry diferente da proteína Cry3A modificada. O fragmento de peptidila 10 pode conferir atividade inseticida ao eHIP, ou pode aumentar a atividade inseticida do eHIP sobre um eHIP sem fragmento de peptidila, ou tornar o eHIP mais estável do que um eHIP sem o fragmento de peptidila. Os eHIPs da invenção possuem surpreendente e inesperada toxicidade contra a larva do milho (Diabrotica sp.). A invenção é ainda mais puxada para ácidos nu15 cleicos que codificam o eHIPs ou que é complementar a um que se torna híbrido sob condições estritas com os ácidos nucleicos híbridos recombinantes de acordo com a invenção.

Também incluídos na invenção estão vetores contendo referidos aminoácidos recombinantes (ou complementares a estes); uma planta ou 20 micro-organismo que inclui e permite a expressão destes ácidos nucleicos; plantas transformadas com estes ácidos nucleicos, por exemplo, plantas de milho transgênico; a progênie destas plantas que contém os ácidos nucleicos estavelmente incorporados e hereditários de modo Mendelian, e/ou as sementes destas plantas e progênie.

A invenção também inclui composições e formulações contendo

os eHIPs, que são capazes de inibir a habilidade das pestes de insetos de sobreviver, crescer e reproduzir, ou de limitar danos ou perdas a plantas de safras relacionadas com insetos, por exemplo aplicando os eHIPs ou composições ou formulações em áreas infestadas com insetos, ou tratar de mo30 do profilático áreas ou plantas suscetíveis a insetos para oferecer proteção contra as pestes de insetos.

A invenção e adicionalmente puxada para um método de fazer os eHIPs e os métodos de usar os ácidos nucleicos, por exemplo em microorganismos para controlar insetos ou em plantas transgênicas para oferecer proteção contra danos causados por insetos.

Os eHIPs recentes aqui descritos são altamente ativos contra os 5 insetos. Por exemplo, os eHIPs da presente invenção podem ser utilizados para controlar pestes de insetos de importância econômica tais como a larva do milho do oeste (Diabrotica virgifera virgifera) a larva do milho do norte (D. Iongicornis barberi) e a larva do milho mexicana (D. virgifera zeae). Determinados eHIPs podem também ser utilizados para controlar a broca do milho 10 da Europa (Ostrinia nubilalis) e outros insetos lepidópteros. Os eHIPs podem ser utilizados de modo individual ou em combinação com outras estratégias de controle de pestes de insetos para oferecer maximização na eficiência de controle de pestes com impacto ambiental minimizado.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica de estudar a seguinte descrição da invenção e exemplos sem-limitação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os seguintes desenhos formam parte da presente especificação e são incluídos para adicionalmente demonstrar determinados aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor entendida por meio de referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada de incorporações específicas aqui apresentadas.

A figura 1A-1E mostra um alinhamento de seqüência de algumas incorporações de eHIP com proteínas Cry paternas ou Cry 3A modificado 25 utilizadas para construir os eHIPs, incluindo, um Cry3A, CryIAb1 e Cry3A055, e indica identidade de porcentagem. Os fragmentos de peptidila N-terminal estão sublinhados. Os 5 blocos conservados estão etiquetados CB1-CB5. A localização das junções entre os domínios I, Il e III, está designada por uma linha vertical pontilhada. Uma seqüência de reconhecimento 30 de protease de catepsina G, AAPF, está em negrito.

A figura 2A-2E ilustra um alinhamento de incorporações de eHIP que são ativas contra pelo menos a larva do milho do oeste e indicam identidade de porcentagem comparada com o eHIP 8AF. Os fragmentos de peptidila N-terminal estão sublinhados. As regiões de cauda de protoxinas Cterminal estão duplamente sublinhadas. Os 5 blocos conservados estão etiquetados CB1-CB5. As localizações das junções entre os domínios I, Il e Ill 5 estão indicadas pelo símbolo e etiquetadas de acordo. As localizações das posições dos cruzamentos estão indicadas pelo símbolo Uma seqüência de reconhecimento de protease de catepsina G1 AAPF, está em negrito.

A figura 3 mostra um mapa do vetor recombinante 12207, utilizado para transformar milho compreendendo umum cassete de expressão com promotor ubiquitina de milho operável relacionado com uma seqüência de codificação FRCG operável relacionada a um terminador NOS.

A figura 4 mostra um mapa do vetor recombinante 12161, utilizado para transformar milho compreendendo umum cassete de expressão com promotor ubiquitina de milho operável relacionado com uma seqüência de codificação FR8a operável relacionada a um terminador NOS.

A figura 5 mostra um mapa do vetor recombinante 12208, utilizado para transformar milho compreendendo umum cassete de expressão com um vírus amarelo de cestrum enrolador de folhas promotor (cmp) operável relacionado com uma seqüência de codificação FRCG operável relacionada a um terminador NOS.

A figura 6 mostra um mapa do vetor recombinante 12274, utilizado para transformar milho compreendendo umum cassete de expressão com um vírus amarelo de "Cestrum" enrolador de folhas promotor (cmp) operável relacionado com uma seqüência de codificação FR8a operável relacionada a um terminador NOS.

A figura 7 mostra um mapa do vetor recombinante 12473, utilizado para transformar milho compreendendo umum cassete de expressão com promotor ubiquitina (ubi) de milho operável relacionado com uma sequência de codificação FRD3 operável relacionada a um terminador NOS.

A figura 8 mostra um mapa do vetor recombinante 12474, utilizado para transformar milho compreendendo umum cassete de expressão com um vírus amarelo de cestrum enrolador de folhas promotor (cmp) operável relacionado com uma seqüência de codificação FRD3 operável relacionada a um terminador NOS.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS NA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

SEQ ID NO: 1 é a seqüência de nucleotídeo 20L-8a.

SEQ ID NO: 2 é o 20L-8a codificado pelo SEQ iD NO: 1.

SEQ ID NO: 3 é a seqüência de nucleotídeo FR8a.

SEQ ID NO: 4 é o FR8a codificado pelo SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5 é a seqüência de nucleotídeo FRCG.

SEQ ID NO: 6 é o FRCG codificado pelo SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 7 é a seqüência de nucleotídeo FR8a-9F.

SEQ ID NO: 8 é o FR8a-9F codificado pelo SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 9 é a seqüência de nucleotídeo FR-9F-catg.

SEQ ID NO: 10 é a cat. FR-9F codificada pelo SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 11 é a seqüência de nucleotídeo FR8a-12AA.

SEQ ID NO: 12 é o FR8a-12AA codificado pelo SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 13 é a seqüência de nucleotídeo \NR-9mut.

SEQ ID NO: 14 é o WR-9mut codificado pelo SEQ ID NO: 13.

SEQ ID NO: 15 é a seqüência de nucleotídeo FRD3.

SEQ ID NO: 16 é o FRD3 codificado pelo SEQ ID NO: 15.

SEQ ID NO: 17 é a seqüência de nucleotídeo FR-12-cg-dm3.

SEQ ID NO: 18 é a FR-12-cg-dm3 codificada pelo SEQ ID NO: 17.

SEQ ID NO: 19 é a seqüência de nucleotídeo 9F-cg-de16.

SEQ ID NO: 20 é a 9F-cg-de16 codificada pelo SEQ ID NO: 19.

SEQ ID NO: 21 é a seqüência de nucleotídeo FR-cg-dm3.

SEQ ID NO: 22 é a FR-cg-dm3 codificada pelo SEQ ID NO: 21.

SEQ ID NO: 23 é a seqüência de nucleotídeo 9F-cg-dm3.

SEQ ID NO: 24 é a 9F-cg-dm3 codificada pelo SEQ ID NO: 23.

SEQ ID NO: 25 é a seqüência de nucleotídeo B8a.

SEQ ID NO: 26 é o B8a codificado pelo SEQ ID NO: 25.

SEQ ID NO: 27 é a seqüência de nucleotídeo 5*B8a. SEQ ID NO: 28 é a 5*B8a codificado pelo SEQ ID NO: 27. SEQ ID NO: 29 é a seqüência de nucleotídeo V3A.

SEQ ID NO: 30 é o V3A codificado pelo SEQ ID NO: 29.

SEQ ID NO: 31 é a seqüência de nucleotídeo V4F.

SEQ ID NO: 32 é o V4F codificado pelo SEQ ID NO: 31.

SEQ ID NO: 33 é a seqüência de nucleotídeo 5*V4F.

SEQ ID NO: 34 é a 5*V4F codificado pelo SEQ ID NO: 33. SEQ ID NO: 35 é a seqüência de nucleotídeo 20L-7.

SEQ ID NO: 36 é o 20L-7 codificado pelo SEQ ID NO: 35.

SEQ ID NO: 37 é a seqüência de nucleotídeo T7-20L-7.

SEQ ID NO: 38 é o T7-20L-7 codificado pelo SEQ ID NO: 37. SEQ ID NO: 39 é a seqüência de nucleotídeo 5*20L-7.

SEQ ID NO: 40 é o 5*20L-7 codificado pelo SEQ ID NO: 39. SEQ ID NO: 41 é a seqüência de nucleotídeo 20L-10.

SEQ ID NO: 42 é o 20L-10 codificado pelo SEQ ID NO: 41. SEQ ID NO: 43 é a seqüência de nucleotídeo 5*20L-10.

SEQ ID NO: 44 é o 5*20L-10 codificado pelo SEQ ID NO: 43. SEQ ID NO: 45 é a seqüência de nucleotídeo 20L-12A.

SEQ ID NO: 46 é o 20L-12A codificado pelo SEQ ID NO: 45. SEQ ID NO: 47 é a seqüência de nucleotídeo 20L-13.

SEQ ID NO: 48 é o 20L-13 codificado pelo SEQ ID NO: 47. SEQ ID NO: 49 é a seqüência de nucleotídeo V5&6.

SEQ ID NO: 50 é o V5&6 codificado pelo SEQ ID NO: 49. SEQ ID NO: 51 é a seqüência de nucleotídeo 5*V5&6.

SEQ ID NO: 52 é a 5*V5&6 codificado pelo SEQ ID NO: 51. SEQ ID NO: 53 é a seqüência de nucleotídeo 88A-dm3.

SEQ ID NO: 54 é o 88A-dm3 codificado pelo SEQ ID NO: 53. SEQ ID NO: 55 é a seqüência de nucleotídeo FR(IFa).

SEQ ID NO: 56 é o FR(IFa) codificado pelo SEQ ID NO: 55. SEQ ID NO: 57 é a seqüência de nucleotídeo FR(IAc).

SEQ ID NO: 58 é o FR(IAc) codificado pelo SEQ ID NO: 57. SEQ ID NO: 59 é a seqüência de nucleotídeo FR(Ha). SEQ ID NO: 60 é o FR(1 Ia) codificado pelo SEQ ID NO: 59.

SEQ ID NO: 61 é a seqüência de nucleotídeo DM23A.

SEQ ID NO: 62 é o DM23A codificado pelo SEQ ID NO: 61.

SEQ ID NO: 63 é a seqüência de nucleotídeo 8AF.

SEQ ID NO: 64 é o 8AF codificado pelo SEQ ID NO: 63.

SEQ ID NO: 65 ê a seqüência de nucleotídeo 5*cry3A055.

SEQ ID NO: 66 é a 5*Cry3A055 codificado pelo SEQ ID NO: 65.

SEQ ID NO: 67 é uma seqüência de nucleotídeo cry3A otimizada de milho. SEQ ID NO: 68 é o Cry3A codificado pelo SEQ ID NO: 67.

SEQ ID NO: 69 é a seqüência de nucleotídeo cry3A055.

SEQ ID NO: 70 é o Cry3A055 codificado pelo SEQ ID NO: 69.

SEQ ID NO: 71 é uma seqüência de nucleotídeo crylAb otimizada de milho. SEQ ID NO: 72 é o CryIAb codificado pelo SEQ ID NO: 71.

SEQ ID NO: 73 é uma seqüência de nucleotídeo cryIBa otimizada de milho. SEQ ID NO: 74 é o CryIBa codificado pelo SEQ ID NO: 73.

SEQ ID NO: 75 é uma seqüência de nucleotídeo crylFa otimizada de milho. SEQ ID NO: 76 é o CryIFa codificado pelo SEQ ID NO: 75.

SEQ ID NO: 77 é uma seqüência de nucleotídeo cry8Aa.

SEQ ID NO: 78 é o Cry8Aa codificado pelo SEQ ID NO: 77.

SEQ ID NO: 79 é uma seqüência de nucleotídeo crylAc.

SEQ ID NO: 80 é o CryIAc codificado pelo SEQ ID NO: 79.

SEQ ID NO: 81 é uma seqüência de nucleotídeo crylla.

SEQ ID NO: 82 é o Cryl Ia codificado pelo SEQ ID NO: 81.

SEQ ID NOs 83-125 são seqüências iniciador úteis na presente invenção.

SEQ ID NOs 126-134 são fragmentos peptidila N-terminal.

SEQ ID NO: 135 é uma proteína Cry3A de extensão completa.

SEQ ID NO: 136-143 são seqüências iniciador úteis na presente invenção. SEQ ID NO: 144 é o código de seqüência T7-8AF.

SEQ ID NO: 145 é o T7-8AF codificado pelo SEQ ID NO: 144.

SEQ ID NO: 146 é o código de seqüência -catG8AF.

SEQ ID NO: 147 é o -CatG8AF codificado pelo SEQ ID NO: 146.

SEQ ID NO: 148 é o código de seqüência 8AFdm3. SEQ ID NO: 149 é o 8AFdm3 codificado pelo SEQ ID NO: 148.

SEQ ID NO: 150 é o código de seqüência 8AFIongdm3.

SEQ ID NO: 151 é o 8AFIongdm3 codificado pelo SEQ ID NO: 150.

SEQ ID NO: 152 é o código de seqüência cap8AFdm3.

SEQ ID NO: 153 é o cap8AFdm3 codificado pelo SEQ ID NO: 152.

SEQ ID NO: 154 é o código de seqüência 8AFdm3T.

SEQ ID NO: 155 é o 8AFdm3T codificado pelo SEQ ID NO: 154.

SEQ ID NO: 156 é o código de seqüência 8AFIongdm3T.

SEQ ID NO: 157 é o 8AFIongdm3T codificado pelo SEQ ID NO: 156.

SEQ ID NO: 158 é o código de seqüência cap8AFdm3T.

SEQ ID NO: 159 é o cap8AFdm3T codificado pelo SEQ ID NO: 158.

SEQ ID NO: 160 é o FR8a+34 eHIP.

DEFINIÇÕES

Para clareza, alguns termos utilizados na especificação são definidos e apresentados como segue:

"Atividade" dos eHIPs da invenção significa que a função do eHIPs como agentes ativos de controle de insetos oralmente, possuem efeito tóxico, ou são capazes de interromper ou deter a alimentação de insetos, o que pode ou não causar a morte do inseto. Quando um eHIP da invenção é 20 colocado no inseto, o resultado é tipicamente a morte do inseto, ou o inseto não se alimenta da fonte que torna o eHIP disponível ao inseto.

"Associado com/relacionado operacionalmente" refere-se a dois ácidos nucleicos que estão física ou funcionalmente relacionados. Por exemplo, uma seqüência de DNA promotora ou reguladora é relatada de estar 25 "associada com" uma seqüência de DNA que codifica para RNA ou uma proteína caso as duas seqüências sejam relacionadas operacionalmente, ou situada de forma que a seqüência reguladora de DNS afetará o nível de expressão da seqüência de codificação ou estrutural de DNA.

No contexto da presente invenção, uma "proteína inseticida quimérica" (CIP) é uma proteína inseticida que compõe um fragmento de peptidila fundido no N-terminal de um eHIP. O fragmento de peptidila pode conferir atividade inseticida ao eHIP, pode aumentar a atividade inseticida do eHIP sobre um eHIP sem fragmento de peptidila, ou tornar o eHIP mais estável do que um eHIP sem o fragmento de peptidila, particularmente contra a larva do milho do oeste. O fragmento de peptidila é uma seqüência de aminoácido que é tipicamente heteróloga para (não-derivada de) uma proteína Cry Bt, 5 mas pode ser derivada de uma proteína Cry Bt. Referidos fragmentos peptidila estendem-se dos terminais N da proteína inseticida e não correm de forma natural no N-terminal das proteínas Cry Bt. Um exemplo de um fragmento de peptidila N-terminal possui a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRP (N0 ID SEQ: 129) que não é derivada de uma proteína Cry Bt. 10 Uma "seqüência de codificação" é uma seqüência de ácido nu

cleico que é transcrita em um RNA tal como um mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, RNA senso ou RNA antissenso. Preferivelmente o RNA é traduzido em um organismo para produzir uma proteína.

No contexto da presente invenção, "conectar" ácidos nucleicos 15 significa juntar dois ou mais ácidos nucleicos utilizando quaisquer meios conhecidos na técnica. Por exemplo, sem-limitação, os ácidos nucleicos podem ser ligados utilizando, por exemplo, Iigase de DNA, ou pode ser recozido utilizando PCR. Os ácidos nucleicos podem também ser juntados ao sintetizar quimicamente um ácido nucleico utilizando a seqüência de dois ou 20 mais ácidos nucleicos separados.

Para "Controlar" insetos significa inibir, por meio de efeito tóxico, a habilidade das pestes de insetos de sobreviver, crescer, alimentar-se, e/ou se reproduzir ou de limitar os danos nas plantas de safra relacionados a insetos. "Controlar" insetos pode ou não significar matar os insetos, apesar de preferencialmente significar matar os insetos.

No contexto da presente invenção, "correspondente a" significa que quando as seqüências de aminoácido de certas proteínas (por exemplo, proteínas Cry Bt ou proteínas Cry3A modificadas) são alinhadas uma com a outra, os aminoácidos que alinham com certas posições enumeradas em, 30 por exemplo, mas não-limitado a, uma toxina Cry3A (seja SEQ ID NO: 68 ou N0 ID SEQ: 134); uma toxina Cry3A055 (SEQ ID NO: 70); ou uma toxina CryIAb (N0 ID SEQ: 72), mas que não estão necessariamente nestas posições numéricas exatas relativas a seqüência de aminoácidos referência, particularmente conforme se relaciona com a identificação dos domínios I, Il e III, e/ou os blocos conservados e regiões variáveis, estas posições de aminoácidos "correspondem" uma a outra. Por exemplo, na delineação do do5 mínio I de uma proteína híbrida, aminoácidos 11-244 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70) correspondem a aminoácidos 58-290 de uma toxina nativa Cry3A (SEQ ID NO: 135) ou a aminoácidos 11-243 de uma toxina nativa Cry3A (SEQ ID NO: 68) ou a aminoácidos 33-254 de uma toxina nativa CryIAb.

No contexto da presente invenção as palavras "proteína Cry"

podem ser utilizadas intercambiadamente com as palavras "deltaendotoxina" ou "õ -endotoxina."

No contexto da presente invenção, uma "proteína híbrida inseticida projetada" (eHIP) é uma proteína inseticida criada ao fundir combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes. Referidas eHIPs recentes podem compor regiões variáveis completas ou parciais, blocos conservados ou domínios de uma proteína Cry3A modificada e uma proteína Cry diferente da proteína Cry3A modificada. Os eHIPs da invenção podem opcionalmente incluir uma região de cauda de proteína Cry Bt ou um fragmento de peptidila N-terminal ou ambos. Por exemplo, sem-limitação, um eHIP é criado ao combinar um Nterminal para direção C-terminal, aminoácidos 1-468 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compõe a região variável 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e o Nterminal 24 aminoácidos do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compõe o C-terminal 24 aminoácidos do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5 e região variável 6, e uma região de 38 aminoácidos de uma cauda de protoxina CryIAb. Um eHIP que compõe o fragmento de peptidila N-terminal pode também ser designado como uma "proteína quimérica inseticida (CIP)."

Para "Entregar" um eHIP significa que o eHIP entra em contato com um inseto, resultando em efeito tóxico e controle do referido inseto. O eHIP pode ser entregue de muitas maneiras reconhecidas, por exemplo, por meio de planta transgênica expressando o eHIP, composição(ões) de proteína(s) formulada(s), composição(ões) de proteína(s) borrifável(is), uma ma5 triz isca, ou qualquer outro sistema de entrega de toxina reconhecido.

"Quantidade eficaz de controle de inseto" significa que a concentração de um eHIP que inibe por meio de efeito tóxico a habilidade dos insetos de sobreviver, crescer, alimentar-se e/ou se reproduzir ou de limitar os danos ou perdas nas plantas de safra relacionados a insetos. "Quantidade 10 eficaz de controle de inseto" pode ou não significar matar os insetos, apesar de preferencialmente significar matar os insetos.

"Cassete de expressão" conforme utilizado aqui significa uma seqüência de ácido nucleico capaz de direcionar expressão de uma seqüência de nucleotídeo em particular em uma célula hospedeira apropriada, com15 preendendo um promotor operacionalmente relacionado com a seqüência de nucleotídeo de interesse que é operacionalmente relacionada a os sinais de terminação. Também tipicamente compõe seqüências requeridas para a adequada translação da seqüência de nucleotídeo. O cassete de expressão que compõe a seqüência de nucleotídeo de interesse pode ter pelo menos 20 um dos seus componentes heterólogos com relação a pelo menos um dos seus outros componentes. O cassete de expressão pode adicionalmente ser de ocorrência natural porém tem sido obtido em forma recombinante útil para expressão heteróloga. Tipicamente, não obstante, o cassete de expressão é heterólogo em relação ao hospedeiro, isto é, a seqüência particular de ácido 25 nucleico do cassete de expressão não ocorre naturalmente em uma célula hospedeira e deve ser introduzida na célula hospedeira ou um antecessor da célula hospedeira por meio de evento de transformação. A expressão de uma seqüência de nucleotídeo no cassete de expressão pode estar sob controle de um promotor constitutivo ou de um promotor de indução que inicia a 30 transcrição apenas quando a célula hospedeira é exposta a alguns estímulos externos em particular. No caso de organismo multicelular, tal como uma planta, o promotor pode também ser especifico para um tecido em particular, um órgão, ou estágio de desenvolvimento.

Um "gene" é uma região definida que está localizada dentro de um genoma e que, além da acima referida codificação de seqüência de ácido nucleico, compõe outros ácidos nucleicos primariamente regulatórios res5 ponsáveis pelo controle da expressão, o que significa a transcrição e translação, da porção de codificação. Um gene pode também compor outras seqüências 5' e 3' não-traduzidas e seqüências de terminação. Elementos adicionais que podem estar presentes podem, por exemplo, ser íntrons. A seqüência regulatória de ácido nucleico do gene pode normalmente não ser 10 operacionalmente relacionada a a seqüência de ácido nucleico associada conforme encontrado na natureza e portanto seria um gene quimérico.

"Gene de interesse" refere-se a qualquer gene que, quando transferido para uma planta, confere à referida planta a característica desejada tal como uma resistência antibiótica, resistência contra vírus, resistência 15 contra inseto, resistência contra doenças, ou resistência a outras pestes, tolerância herbicida, valor nutricional melhorado, desempenho melhorado em processo industrial ou capacidade reprodutiva alterada. O "gene de interesse" pode ser também um que seja transferido para plantas para a produção de enzimas de valor comercial ou metabólitos na planta.

Uma seqüência de ácido nucleico "heteróloga" é uma seqüência

de ácido nucleico não-naturalmente associada com a célula hospedeira na qual é introduzida, incluindo cópias múltiplas de ocorrência não-natural de uma seqüência de ácido nucleico de ocorrência natural. Uma seqüência heteróloga de aminoácido é aquela que não está naturalmente associada com 25 uma seqüência nativa de aminoácido, por exemplo, uma seqüência de aminoácido de uma proteína Cry.

Uma seqüência de ácido nucleico "homóloga" é uma seqüência de ácido nucleico naturalmente associada com uma célula hospedeira na qual é introduzida.

"Recombinação homóloga" é a troca recíproca de fragmentos de

ácido nucleico entre moléculas de ácido nucleico homóloga.

"Identidade" ou "identidade de porcentagem" refere-se ao grau de similaridade entre duas seqüências de ácido nucleico ou proteína. Para comparação de seqüência, tipicamente uma seqüência age como seqüência de referência com a qual as seqüências de teste são comparadas. Ao utilizar um algoritmo de comparação de seqüência, as seqüências de teste e de re5 ferência são introduzidas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas caso necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de seqüência são designados. O algoritmo de comparação de seqüência então calcula a identidade de porcentagem de seqüência para a(s) sequência(s) de teste(s) relativas à seqüência de referência, com base nos parâmetros de 10 programa designados.

O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido, exemplo, pelo algoritmo local de homologia de Smith & Waterman, Adv. AppI. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pelo método 15 de busca de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. NaVi. Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), ou por inspeção visual (ver, Ausubel et al., infra).

Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar

identidade de porcentagem de seqüência e similaridade de seqüência é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul et ai, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). O software para realização de análises BLAST está disponível publicamente por meio do National Center for Biotechnology Information (Centro 25 Nacional de Informação de Biotecnologia) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de seqüência de alta pontuação (HSPs) ao identificar palavras curtas de extensão W na seqüência de consulta, que combinam ou satisfazem determinada pontuação T de limite com valor positivo quando alinhado com a palavra de mesma ex30 tensão em uma seqüência de base de dados. T é referido como o limite de pontuação de palavra vizinha (Altschul et al., 1990). Estes indícios iniciais de palavra vizinha agem como sementes para iniciar as buscas para encontrar HSP's mais longos contendo estes. Os indícios de palavra são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada seqüência até que a pontuação de alinhamento cumulativo possa ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas utilizando, para as seqüências de nucleotídeo, os pa5 râmetros M (pontuação recompensa para um par de resíduos que combinam; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos que não combinam; sempre < 0). Para as seqüências de aminoácidos, uma matriz de pontuação pode ser utilizada pra calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos indícios de palavra em cada direção é parada quando a pontuação 10 de alinhamento cumulativa cair para a quantidade de X a partir do valor máximo alcançado, a pontuação cumulativa vai a zero ou abaixo em função da acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduo de pontuação negativa, ou o final de qualquer uma das seqüências seja alcançado. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e a velocidade do 15 alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotídeo) utiliza como padrões uma extensão de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos os fitas. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como padrões uma extensão de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pon20 tuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. NatL Acad. Sei. USA 89: 10915 (1989)).

Adicionalmente para calcular identidade de porcentagem de seqüência, o algoritmo BLAST também realiza análise estatística da similaridade entre duas seqüências (ver, e.g., Karlin & Altschul, Proc. Nat'1. Acad. Sei. 25 USA 90: 5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de menor soma (P(N))1 que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma combinação entre duas seqüências de aminoácido ou nucleotídeo poderiam ocorrer por acaso. Por exemplo, uma seqüência de teste de ácido nucleico é considerada similar a uma 30 seqüência de referência caso a probabilidade de menor soma em comparação com a seqüência de teste de ácido nucleico com a seqüência de ácido nucleico de referência seja menos de aproximadamente 0,1, mais preferencialmente menos de aproximadamente 0,01, e mais preferivelmente menos de aproximadamente 0,001.

Outro programa de computador amplamente utilizado e aceito para a realização de alinhamento de seqüências é o CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al. Nuc. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). O número de bases que combinam ou aminoácidos é dividido pelo número total de bases ou de aminoácidos e multiplicado por 100 para obter uma identidade de porcentagem. Por exemplo, caso duas seqüências de par de base de 580 tivessem 145 bases combinadas, seriam 25 por cento idênticas. Caso as duas sequências comparadas sejam de extensões diferentes, o número de combinações é dividido pela mais curta das duas extensões. Por exemplo, caso existissem 100 aminoácidos combinados entre 200 e 400 proteínas de aminoácido, estas são 50 por cento idênticas em relação à seqüência mais curta. Caso a seqüência mais curta seja menos de 150 bases ou 50 aminoácidos em extensão, o número de combinações é dividido por 150 (para bases de ácido nucleico) ou 50 (para aminoácidos), e multiplicadas por 100 para obter uma identidade de porcentagem.

Outra indicação que os dois ácidos nucleicos são substancialmente idênticos é que as duas moléculas hibridizam uma com a outra sob 20 condições estritas. A frase "hibridizando especificamente a" refere-se a juntar, duplicar, ou hibridizar uma molécula apenas a uma seqüência particular de nucleotídeo sob condições estritas quando essa seqüência está presente em uma mistura complexa (exemplo, celular total) DNA ou RNA. "Junta substancialmente" refere-se a hibridização complementar entre um ácido 25 nucleico sonda e um ácido nucleico-alvo e engloba combinações malsucedidas menores que podem ser acomodadas ao reduzir a severidade do meio de hibridização para obter a detecção desejada da seqüência de ácido nucleico-alvo desejada.

"Condições estritas de hibridização" e "condições estritas de Iavagem de hibridização" no contexto dos experimentos de hibridização de ácido nucleico tais como hibridizações do sul e do norte são dependentes de seqüências e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. As sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais elevadas. Um guia extensivo sobre a hibridização de ácidos nucleicos pode ser encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 5 "Visão Geral da Hibridização e da estratégia para estudos de sonda de ácido nucleico" Elsevier1 New York. Geralmente, condições mais estritas de hibridização e de lavagem de hibridização são selecionadas para serem aproximadamente 5°C mais baixos que o ponto térmico de derretimento (Tm) para a seqüência específica na potência iônica definida e pH. Tipicamente, sob 10 "condições estritas" uma sonda hibridiza na sua subsequência-alvo, mas não a outras seqüências.

Tm é a temperatura (sob potência iônica definida e pH) na qual 50% da sequência-alvo hibridiza a uma sonda perfeitamente combinada. Condições muito estritas são selecionadas para serem iguais a Tm para uma 15 sonda em particular. Um exemplo de condições estritas de hibridização de ácidos nucleicos complementares que possuem mais de 100 resíduos complementares em um filtro em um borrão do sul ou do norte é 50% formamida com 1mg de heparina a 42°C, com a hibridização sendo realizada em pernoite. Um exemplo de condições muito estritas de lavagem é 0,1 5M NaCI a 20 72°C por aproximadamente 15 minutos. Um exemplo de condições estritas de lavagem é lavagem 0,2x SSC a 65°C por 15 minutos (ver, Sambrook, infra, para obter descrição do SSC tampão). Com frequência, uma lavagem de alta restrição é precedida de uma lavagem de baixa restrição para remover o sinal de sonda de fundo. Um exemplo de lavagem de restrição média para 25 um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 1x SSC a 45°C por 15 minutos. Um exemplo de lavagem de restrição baixa para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 4-6x SSC a 45°C por 15 minutos. Para sondas curtas (exemplo, aproximadamente 10 a 50 nucleotídeos), as condições estritas geralmente envolvem concentrações de sal de menos que 30 aproximadamente 1,0 M Na íon, tipicamente aproximadamente concentração de 0,01 a 1,0 M Na íon (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente pelo menos aproximadamente 30°C. Condições estritas também podem ser obtidas com a adição de agentes desestabilizadores tais como formaldeído. Em geral, uma taxa de sinal para ruído de 2x (ou maior) que aquela observada para sonda não-relacionada no estudo particular de hibridização indica detecção de uma hibridização específica. Os ácidos nucleicos 5 que não hibridizam uns aos outros sob condições estritas ainda são substancialmente idênticos caso as proteínas que codificam sejam substancialmente idênticas. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de ácido nucleico é criada utilizando a degenerância máxima de códon permitida pelo código genético.

A seguir estão exemplos de conjuntos de condições de hibridi

zação/lavagem que podem ser utilizados para clonar as seqüências homólogas de nucleotídeo que são substancialmente idênticas às seqüências de referência de nucleotídeos da presente invenção: uma seqüência referência de nucleotídeo preferivelmente hibridiza para seqüência referência de nucle15 otídeo em 7% sulfato dodecila de sódio (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente em 7% sulfato dodecila de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem a 1X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente ainda em 7% sulfato dodecila de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA a 50°C com Ia20 vagem em 0,5X SSC, 0,1% SDS a 50°C, preferivelmente em 7% sulfato dodecila de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais preferivelmente em 7% sulfato dodecila de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1X SSC, 0,1% SDS a 65°C.

Uma indicação adicional que dois ácidos nucleicos ou proteínas

são substancialmente idênticos é que a proteína codificada pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente de reatividade cruzada com, ou especificamente se junta com, a proteína codificada pelo segundo ácido nucleico. Assim, uma proteína é tipicamente substancialmente idêntica à segunda pro30 teína, por exemplo, onde as duas proteínas diferem apenas por substituições conservadoras.

"Inseticida" é definido como uma atividade biológica tóxica capaz de controlar insetos, preferivelmente por meio da morte destes.

Uma seqüência de ácido nucleico está "isocodificando com" uma seqüência de ácido nucleico referencia quando a seqüência de ácido nucleico codifica um polipeptídio tendo a mesma seqüência de aminoácido que o polipeptídio codificado pela seqüência de ácido nucleico de referência.

Uma molécula "isolada" de ácido nucleico ou uma toxina isolada é uma molécula de ácido nucleico ou toxina que pela mão do homem, existe aparte do seu ambiente nativo e, portanto, não é um produto da natureza. Uma molécula isolada de ácido nucleico ou toxina pode existir em forma pu10 rificada ou pode existir em um ambiente não-nativo tal como, por exemplo, sem-limitação, uma célula microbial recombinante, célula de planta, tecido de planta ou planta.

Uma "toxina Cry3A modificada" ou "Cry3A055" desta invenção refere-se a uma toxina derivada de Cry3A tendo pelo menos um sítio adicional de reconhecimento de protease que é reconhecido por uma protease de intestino do inseto-alvo, que não ocorre naturalmente em uma toxina Cry3A, como descrito na Patente US 7,030,295, aqui incorporada por referência.

Uma "seqüência de codificação cry3A modificada" de acordo com esta invenção pode ser derivada de uma seqüência de codificação 20 cry3A nativa ou de uma seqüência de codificação cry3A sintética e compõe a seqüência de codificação de pelo menos um sítio adicional de reconhecimento de protease que não ocorre de forma natural em um gene cry3A não modificado.

Uma "molécula de ácido nucleico" ou "seqüência de ácido nucleico" é um segmento de um DNA ou RNA de fita único ou duplo que pode ser isolado de qualquer fonte. No contexto da presente invenção, a molécula de ácido nucleico é tipicamente um segmento de DNA.

Uma "planta" é qualquer planta em qualquer estágio de desenvolvimento, particularmente uma planta de semente.

Uma "célula de planta" é uma unidade estrutural e fisiológica de

uma planta, compreendendo uma protoplasta e uma parede de célula. A célula de planta pode estar na forma de uma célula única isolada ou uma céluIa de cultura, ou como parte de uma unidade mais organizada como por exemplo, tecido de planta, um órgão de planta, ou uma planta inteira.

"Cultura de células de planta" significa culturas de unidades de planta tais como, por exemplo, protoplastas, células de cultura de células, 5 células em tecido de plantas, pólen, tubos de pólen, óvulos, sacos de embrião, zigotos e embriões em vários estágios de desenvolvimento.

"Material de planta" refere-se a folhas, talos, raízes, flores ou partes de flores, frutas, pólen, ovos de células, zigotos, sementes, cortes, culturas de células ou tecido, ou qualquer outra parte ou produto de uma planta.

Um "órgão de planta" é uma parte distinta e visivelmente estruturada e diferenciada de uma planta tal como a raiz, talo, folha, botão de flor, ou embrião.

"Tecido de planta" conforme aqui utilizando refere-se a um grupo 15 de células de planta organizado em uma unidade estrutural e funcional. Qualquer tecido de planta in planta ou em cultura é incluído. Este termo inclui, mas não está limitado a, plantas inteiras, órgãos de planta, sementes de planta, cultura de tecido e quaisquer grupos de células de planta organizados em unidades estruturais e/ou funcionais. O uso deste termo em conjunto 20 com, ou na ausência de, qualquer tipo específico de tecido de planta conforme acima listado ou de outra forma englobado por esta definição não visa ser exclusiva de qualquer outro tipo de tecido de planta.

Um "promotor" é uma seqüência não-traduzida de DNA a montante da região de codificação que contém o sítio de junção para polimerase RNA e inicia a transcrição do DNA. A região de promotor pode também incluir outros elementos que agem como reguladores de expressão de gene.

"Elementos regulatórios" referem-se às seqüências envolvidas no controle da expressão de uma seqüência de nucleotídeos. Os elementos regulatórios compõem um promotor operacionalmente relacionado com a 30 seqüência de nucleotídeos de interesse e os sinais de terminação. Também tipicamente englobam seqüências requeridas para a adequada translação da seqüência de nucleotídeo. A "transformação" é um processo para introduzir ácido nucleico heterólogo em uma célula ou organismo hospedeiro. Em particular, "transformação" significa uma integração estável da molécula de DNA em um genoma de um organismo de interesse.

5 "Transformado/transgênico/recombinante" referem-se a um or

ganismo hospedeiro tal como uma bactéria ou uma planta na qual uma molécula heteróloga de ácido nucleico foi introduzida. A molécula de ácido nucleico pode ser integrada de maneira estável no genoma do hospedeiro ou a molécula de ácido nucleico também pode estar presente como molécula de 10 extracromossoma. Tal molécula de extracromossoma pode ser autorreplicante. Células transformadas, tecidos, ou plantas são entendidos de englobar não apenas o produto final do processo de transformação, mas também a prole deste. Um hospedeiro "não-transformado", "não-transgênico", ou "não- recombinante" refere-se a um tipo de organismo selvagem, exemplo, 15 uma bactéria ou planta, que não contém a molécula heteróloga de ácido nucleico.

Os nucleotídeos são indicados por suas bases pelas seguintes abreviações padrão: adenina (A), citosina (C), timina (T), e guanina (G). Os aminoácidos são da mesma forma indicados pelas seguintes abreviações: 20 alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteina (Cys; C), glutamina (Gin; Q), ácido glutâmico (Glu; E), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (lie; 1), Ieucina (Leu; L), Iisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofan (Trp; W), tirosina (Tyr; Y), e valina (Vai; V).

DESCRIÇÃO

Esta invenção refere-se a recentes proteínas inseticidas híbridas projetadas (eHIPS), criadas para ter atividade contra pelo menos a larva do milho do oeste, e pode adicionalmente incluir a larva do milho do norte, larva do milho mexicana e/ou o besouro da batata do Colorado. Alguns eHIPs 30 possuem atividade contra a peste lepidóptera, broca do milho da Europa. Referidas eHIPs recentes são desenvolvidas ao fundir combinações únicas de regiões variáveis e blocos, completos ou parciais, conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes e opcionalmente incluem uma região de cauda de protoxina de uma proteína Cry Bt no C-terminal ou fragmento terminal peptidil N-terminal ou ambos.[0001] Por exemplo, sem-limitação, ao combinar regiões variáveis completas ou parciais com blocos conserva5 dos de uma primeira proteína Cry que possui atividade coleóptera com regiões variáveis, completas ou parciais, com blocos conservados de uma segunda proteína Cry com atividade lepidóptera, diferente da primeira proteína Bt e opcionalmente incluindo uma região de cauda de protoxina de proteína Cry Bt no C-terminal, ou um fragmento de peptidila N-terminal ou ambos, 10 novas proteínas híbridas inseticidas projetadas são criadas possuindo atividade contra um espectro de insetos diferente do que a primeira ou segunda proteína Cry paterna ou de ambas é criado. Referidas eHIPs recentes podem também compor regiões variáveis completas ou parciais, blocos conservados ou domínios de uma proteína Cry3A modificada e uma proteína 15 Cry diferente da proteína Cry3A modificada. O fragmento de peptidila Nterminal ou região de cauda de protoxina pode conferir atividade inseticida ao eHIP, pode aumentar a atividade inseticida do eHIP sobre um eHIP sem fragmento de peptidila ou região de cauda de protoxina, e/ou tornar o eHIP mais estável do que um eHIP sem o fragmento de peptidila ou região de 20 cauda da protoxina, particularmente pelo menos contra a larva do milho do oeste. A seqüência de aminoácido do fragmento de peptidila é tipicamente heteróloga a (isto é, não-derivada de) uma proteína Cry Bt. Não obstante, com base nos ensinamentos aqui descritos, uma pessoa com habilidade reconhecerá que o fragmento de peptidila N-terminal pode ser gerado utilizan25 do uma seqüência de aminoácido derivada de uma proteína Cry Bt. Os eHIPs da invenção possuem uma surpreendente e inesperada toxicidade para a larva do milho, particularmente para a larva do milho do oeste e a larva do milho mexicana. A presente invenção também refere-se a ácidos nucleicos cuja expressão resulta em eHIPs, e na realização e uso de eHIPs para con30 trolar pestes de insetos. A expressão de ácidos nucleicos resulta em eHIPs que podem ser utilizados para controlar insetos coleópteros tais como a larva do milho do oeste, do norte ou a lavra do milho mexicana, ou usada para controlar insetos lepidópteros tais como a broca do milho da Europa particularmente quando expressa em planta transgênica tal como uma planta transgênica de milho.

Em uma modalidade, a invenção engloba uma proteína insetici5 da híbrida projetada compreendendo uma seqüência de aminoácido de uma primeira proteína (Bt) Cry Bacillus thuringiensis compreendendo regiões variáveis completas ou parciais e blocos conservados da primeira proteína Cry fundida a uma seqüência de aminoácido a partir de uma segunda proteína Cry Bt diferente da primeira proteína Cry Bt compreendendo regiões variá10 veis parciais ou completas e blocos conservados da segunda proteína Cry, e opcionalmente compreendendo: (a) uma região de cauda de protoxina de uma proteína Cry Bt localizada no C-terminal ou (b) um fragmento de peptidila N-terminal; ou ambos (a) e (b), em que o eHIP possui atividade contra pelo menos a larva do milho do oeste.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba um eHIP

compreendendo uma região N-terminal de uma primeira proteína Cry Bt fundida a uma região C-terminal de uma segunda proteína Cry Bt diferente da primeira proteína Cry Bt1 em que pelo menos a posição de cruzamento entre a primeira e a segunda proteína Cry Bt está localizada no bloco conservado 20 2, bloco conservado 3, região variável 4 ou bloco conservado 4, e opcionalmente compreendendo: (a) uma região de cauda de protoxina de uma proteína Cry Bt localizada no C-terminal; ou (b) um fragmento de peptidila Nterminal; ou ambos (a) e (b), em que o eHIP possui atividade inseticida contra pelo menos a larva do milho do oeste.

Em ainda outra modalidade, um eHIP de acordo com a invenção

compõe a região variável 1 do N-terminal ao C-terminal ou a porção Cterminal da região variável 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e uma porção N-terminal do bloco conservado 3 de uma primeira proteína Cry Bt fundida em uma porção de C30 terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6 de uma segunda proteína Cry Bt. Em outra modalidade, uma eHIP da invenção compõe pelo menos duas posições de cruzamento entre uma seqüência de aminoácidos da primeira proteína Cry Bt e uma seqüência de aminoácidos da segunda proteína Cry Bt. Em uma modalidade, uma primeira posição de cruzamento está 5 localizada no bloco conservado 2 uma segunda posição de cruzamento está localizada no bloco conservado 3. Em outra modalidade, a primeira junção de cruzamento está localizada no bloco conservado 3 e a segunda posição de cruzamento está localizada no bloco conservado 4.

Em outra modalidade, um eHIP da invenção compõe C-terminal de região de cauda de protoxina de uma proteína Cry Bt. A região de cauda de protoxina pode conferir atividade inseticida ao eHIP, significando que sem a região de cauda de protoxina o eHIP não seria ativo, pode aumentar a atividade do eHIP sobre um eHIP sem a região de cauda de protoxina, ou pode tornar o eHIP mais estável do que um eHIP sem a região de cauda de protoxina. Em uma modalidade, a região de cauda de protoxina é de uma proteína Cry Bt ativa lepidóptera. Em outra modalidade, a região de cauda de protoxina é de uma proteína CrylA. Em ainda outra modalidade, a região de cauda de protoxina é de uma proteína CryIAa ou de uma proteína CryIAb. A região de cauda de protoxina da invenção pode compor uma cauda inteira de protoxina de uma proteína Cry Bt ou qualquer fragmento desta. Em um aspecto desta modalidade, a região de cauda de protoxina de um eHIP compõe pelo menos 38 aminoácidos do N-terminal de uma cauda de protoxina de uma proteína CryIAb. Em outro aspecto desta modalidade, a região de cauda de protoxina compõe uma seqüência de aminoácido correspondente a aminoácidos 611-648 de SEQ ID NO: 72. Ainda em outro aspecto desta modalidade, a região de cauda de protoxina compõe aminoácidos 611 648 de SEQ ID NO: 72.

Ainda em outra modalidade, um eHIP compõe um fragmento de peptidila N-terminal. O fragmento de peptidila N-terminal pode conferir atividade inseticida ao eHIP, significando que sem o fragmento de peptidila Nterminal a proteína não possui atividade inseticida, ou o fragmento de peptidila N-terminal pode aumentar a atividade inseticida do eHIP sobre um eHIP sem o fragmento de peptidila N-terminal, ou o fragmento de peptidila Nterminal pode tornar o eHIP mais estável do que um eHIP sem o fragmento de peptidila N-terminal. Em um aspecto desta modalidade, o fragmento de peptidila compõe uma seqüência de aminoácido que é heteróloga a (isto é, 5 não-derivada de) uma proteína Cry Bt. Em outro aspecto desta modalidade, o fragmento de peptidila N-C-terminalompõe pelo menos 9 aminoácidos. Em ainda outro aspecto desta modalidade, o fragmento de peptidila compõe pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 10 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 70, 80, 90 ou 100 aminoácidos. Em outro aspecto desta modalidade, o fragmento de peptidila compõe além de 100 aminoácidos. Em ainda outro aspecto desta modalidade, o fragmento de peptidila N-C-terminalompõe a seqüência de aminoácido YDGRQQHRG (SEQ ID NO: 133) ou TSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 134). Em 15 ainda outro aspecto desta modalidade, o fragmento de peptidila N-Cterminalompõe uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo no SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, e SEQ ID NO: 132.

Em ainda outra modalidade, as regiões variáveis e os blocos conservados de uma primeira proteína Cry ativa contra insetos coleópteros são utilizadas para fazer o eHIP da invenção em combinação com regiões variáveis e blocos conservados de uma segunda proteína Cry ativa contra um inseto lepidóptero. As proteínas Cry ativas coleópteras incluem, mas não estão limitadas a Cry3, Cry7, Cry8, e Cry34/Cry35. As proteínas Cry ativas lepidópteras incluem, mas não estão limitadas a Cryl e Cry9. Em um aspecto desta modalidade, a primeira proteína Cry é uma Cry3A e a segunda proteína Cry é CrylA. Em outro aspecto, a proteína Cry3A pode ser substituída por uma proteína Cry3A modificada, por exemplo, sem-limitação, a proteína Cry3A055 descrita na patente US 5,659,123, aqui incorporada por referência. Em ainda outro aspecto desta modalidade, a proteína Cry3A é uma Cry3Aa e a proteína CryIA é uma CryIAa ou uma CryIAb. Em outro aspecto desta modalidade, a Cry3Aa é selecionada do seguinte grupo e possui o Número de Acessão no GenBank indicado: Cry3Aa1 (M22472), Cry3Aa2 (J02978), Cry3Aa3 (Y00420), Cry3Aa4 (M30503), Cry3Aa5 (M37207), Cry3Aa6 (U10985), Cry3Aa7 (AJ237900), Cry3Aa8 (AAS79487), Cry3Aa9 (AAW05659), Cry3Aa10 (AAU29411), e Cry3Aa11 (AY882576). Em outro 5 aspecto desta modalidade, a CryIAa é selecionada do seguinte grupo e possui o Número de Acessão no GenBank indicado: CryIAaI (M11250), Cry1Aa2 (M10917), Cry1Aa3 (D00348), Cry1Aa4 (X13535), Cry1Aa5 (D17518), Cry1Aa6 (U43605), Cry1Aa7 (AF081790), Cry1Aa8 (126149), Cry1Aa9 (AB026261), CryIAaIO (AF154676), Cry1Aa11 (Y09663), 10 Cry1Aa12 (AF384211), Cry1Aa13 (AF510713), Cryl Aa 14(AY197341), e Cry1Aa15 (DQ062690). Em ainda outro aspecto desta modalidade, a CryIAb é selecionada do seguinte grupo e possui o Número de Acessão no GenBank indicado: CryIAbI (M13898), Cry1Ab2 (M12661), Cry1Ab3 (M15271), Cry1Ab4 (D00117), Cry1Ab5 (X04698), Cry1Ab6 (M37263), Cry1Ab7 15 (X13233), Cry1Ab8 (M16463), Cry1Ab9 (X54939), Cry1Ab10 (A29125), CryIAb11 (112419), Cry1Ab12 (AF059670), Cry1Ab13 (AF254640), Cry1Ab14 (U94191), Cry1Ab15 (AF358861), Cry1Ab16 (AF37560), Cry1Ab17 (AAT46415), Cry1Ab18 (AAQ88259), Cry1Ab19 (AY847289), Cry1Ab20 (DQ241675), Cry1Ab21 (EF683163), e Cry1Ab22 (ABW87320). 20 Em ainda mais um aspecto desta modalidade, a primeira proteína Cry compõe uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo no SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, e SEQ ID NO: 135, e a segunda proteína Cry compõe uma seqüência de aminoácido listada no SEQ ID NO: 72.

Em uma modalidade, a presente invenção engloba um eHIP da 25 invenção que compõe pelo menos um cruzamento entre a região N-terminal da primeira proteína Cry e a região C-terminal de uma segunda proteína Cry localizada no bloco conservado 3, região variável 4, ou bloco conservado 4. Em um aspecto desta modalidade, a posição de cruzamento no bloco conservado 3 está localizada imediatamente em seguida de um aminoácido cor30 respondente a Ser451, Phe454, ou Leu468 de SEQ ID NO: 70. Em outro aspecto desta modalidade, a posição de cruzamento está localizada no bloco conservado 3 logo em seguida de Ser451, Phe454, ou Leu468 de ID SEQ: 70 ou Ser450, Phe453, ou Leu467 do N°de ID de SEQ: 68; ou Ser497, PhelOO, Leu114 do SEQ ID NO: 135. As posições de cruzamento em determinadas incorporações de Cry3A/Cry1Ab eHIP ou incorporações modificadas de Cry3A/Cry1Ab eHIP de acordo com a invenção estão indicadas na 5 Figura 2, que indica a identidade de porcentagem.

Em outra modalidade, uma eHIP da invenção compõe pelo menos duas posições de cruzamento entre uma seqüência de aminoácidos da primeira proteína Cry Bt e uma seqüência de aminoácidos da segunda proteína Cry Bt. Em um aspecto desta modalidade, uma posição de cruzamento 10 entre Cry3A ou Cry3A modificada e uma CryIAb ou uma CryIAa está localizada no bloco conservado 2 imediatamente depois de um aminoácido correspondente a Asp232 do SEQ ID NO: 70 e uma segunda posição de cruzamento entre CryIAb e Cry3A ou Cry3A modificada está localizada no bloco conservado 3 imediatamente após um aminoácido correspondente a 15 Leu476 do N de ID de SEQ: 72. Em outro aspecto desta modalidade, uma posição de cruzamento entre uma Cry3A ou Cry3A modificada e uma CryIAb ou uma CryIAa está localizada no bloco conservado 2 imediatamente após Asp232 do SEQ ID NO: 70, ou Asp231 do SEQ ID NO: 68, ou Asp278 do N0 SEQ ID NO: 135, e uma segunda posição de cruzamento en20 tre CryIAb e Cry3A ou Cry3A modificada está localizada no bloco conservado 3 imediatamente após Leu476 do SEQ ID NO: 72.

Em ainda outro aspecto desta modalidade, uma primeira posição de cruzamento entre Cry3A ou Cry3A modificada e uma CryIAb está localizada no bloco conservado 3 imediatamente após um aminoácido correspon25 dente a Leu468 do SEQ ID NO: 70 e uma segunda posição de cruzamento entre CryIAb e Cry3A ou Cry3A modificada está localizada no bloco conservado 4 imediatamente após um aminoácido correspondente a Ile527 do SEQ ID NO: 72. Em ainda outro aspecto desta modalidade, a primeira posição de cruzamento entre Cry3A ou Cry3Aa modificada e uma CryIAb está Iocaliza30 da no bloco conservado 3 imediatamente após um Leu468 do SEQ ID NO: 70, ou Leu467 do SEQ ID NO: 68, ou Leu114 do SEQ ID NO: 135, e a segunda posição de cruzamento entre CryIAb e Cry3A ou Cry3A modificada está localizada no bloco conservado 4 imediatamente após Ile527 do SEQ ID NO: 72. Em ainda outro aspecto desta modalidade, o eHIP compõe a seqüência de aminoácido do SEQ ID NO: 28 ou N0ID SEQ: 34.

Em uma modalidade, a presente invenção engloba um eHIP em 5 que a primeira proteína Cry é uma Cry3A ou Cry3A modificada e a segunda proteína Cry é uma CryIAa ou CryIAb e em que o eHIP compõe uma seqüência de aminoácido que possui pelo menos 80% identidade para o SEQ ID NO: 64. Em outra modalidade eHIP compõe uma seqüência de aminoácido que possui pelo menos 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 10 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% identidade para o SEQ ID NO: 64. Um alinhamento de determinadas incorporações de eHIP da invenção com o SEQ ID NO: 64 é ilustrado na Figura 2, que indica a porcentagem de identidade.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba um eHIP em que a primeira proteína Cry é uma Cry3A ou Cry3A modificada e a segunda 15 proteína Cry é uma CryIAa ou CryIAb e em que o eHIP compõe uma seqüência de aminoácido que possui pelo menos 75% identidade para o SEQ ID NO: 70. Em outra modalidade o eHIP compõe uma seqüência de aminoácido que possui pelo menos 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% identidade para o SEQ ID NO: 20 70. Um alinhamento de determinadas incorporações de eHIP da invenção com o SEQ ID NO: 70 é ilustrado na Figura 1, que indica a porcentagem de identidade.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba um eHIP tendo uma primeira posição de cruzamento entre uma Cry3A ou Cry3A mo25 dificada e uma CryIAa ou CryIAb no bloco conservado 2 e uma segunda posição de cruzamento entre uma CryIAa ou CryIAb e Cry3A ou Cry3A modificada no bloco conservado 3 e em que o eHIP compõe uma seqüência de aminoácido que possui pelo menos 56% de identidade para o SEQ ID NO: 64. Em um aspecto desta modalidade, o eHIP possui pelo menos 60, 70 30 ou 80% de identidade para o SEQ ID NO: 64. Em outro aspecto desta modalidade o eHIP possui pelo menos 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% identidade para o SEQ ID NO: 64. Em ainda outra modalidade, a presente invenção engloba um eHIP que compõe uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste do SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID 5 NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159 e SEQ ID NO: 160.

Em uma modalidade o eHIPs da invenção possui atividade contra outras pestes de insetos incluindo mas não-limitado a larva do milho do norte, larva do milho mexicana, besouro da batata do Colorado, e/ou a broca de milho da Europa.

Em outra modalidade a presente invenção engloba uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um eHIP da invenção. Em um aspecto desta modalidade a molécula 15 de ácido nucleico compõe uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo no SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 20 154 e SEQ ID NO: 158. Ensinamentos especificamente exemplificados dos métodos para fazer moléculas de ácido nucleico que codificam eHIPs podem ser encontrados nos Exemplos 1-41. Aqueles com habilidade na técnica reconhecerão que modificações podem ser realizadas aos métodos exemplificados para fazer eHIPs englobados pela presente invenção.

A presente invenção ainda engloba cassetes que compõem as

moléculas de ácido nucleico e vetores recombinantes e células hospedeiras transgênicas não-humanas tais como células bacterianas ou células de plantas, compreendendo os cassetes de expressão da invenção.

A presente invenção também engloba vetores recombinantes compreendendo os ácidos nucleicos desta invenção. Nos referidos vetores, os ácidos nucleicos são preferencialmente compostos de cassetes de expressão que compõem elementos regulatórios para expressão das sequências de nucleotídeo em uma célula hospedeira capaz de expressar as seqüências de nucleotídeo. Referidos elementos regulatórios geralmente compõem sinais de promotor e terminação e preferivelmente também compõem elementos que permitem eficiente translação de polipeptídios codificados pelos ácidos nucleicos da presente invenção. Vetores que compõem os ácidos nucleicos podem ser capazes de ser replicados em determinadas células hospedeiras, preferivelmente como moléculas extracromossomais, e são, portanto, utilizados para aplicar os ácidos nucleicos desta invenção nas células hospedeiras. Em uma modalidade, as células hospedeiras para referidos vetores são micro-organismos, tais como bactérias, em particular Bacillus thuringiensis ou E. coli. Em outra modalidade, as células hospedeiras de referidos vetores recombinantes são endófitos ou epífitos. Em ainda outra modalidade estes vetores são vetores virais e são utilizados para replicação das seqüências de nucleotídeo em determinadas células hospedeiras,por exempio células de inseto ou células de planta. Os vetores recombinantes também são utilizados para transformação das seqüências de nucleotídeo desta invenção em células hospedeiras, onde as seqüências de nucleotídeo são integradas estavelmente ao DNA de um hospedeiro transgênico. Em uma modalidade, o hospedeiro transgênico é uma planta tal como a planta do milho.

Os eHIPs da presente invenção possuem atividade de controle de insetos quando testados contra pestes de insetos em bioestudos. Em uma modalidade, os eHIPs da invenção são ativos contra insetos coleópteros ou insetos lepidópteros ou contra ambos os insetos. Em um aspecto des25 ta modalidade, os eHIPs da invenção são ativos contra a larva do milho do oeste, larva do milho do norte, larva do milho mexicana e/ou o besouro da batata do Colorado. Em outro aspecto desta modalidade, os eHIPs da invenção são ativos contra a broca do milho da Europa. As propriedades de controle de inseto dos eHIPs da invenção são adicionalmente ilustrados nos E30 xemplos 43, 45 e 46.

A presente invenção também engloba uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de controle de inseto de um eHIP de acordo com a invenção.

Em outra modalidade, a invenção engloba um método de produzir um eHIP que é ativo contra insetos, compreendendo: (a) obter uma célula hospedeira compreendendo um gene, que em si compõe uma seqüência de 5 promotor heteróloga que é operacionalmente relacionada a uma molécula de ácido nucleico da invenção; e (b) desenvolver a célula transgênica de maneira a expressar um eHIP que seja ativo contra insetos.

Em ainda outra modalidade, a invenção engloba um método de produzir uma planta transgênica resistente a insetos, compreendendo intro10 dução de uma molécula de ácido nucleico da invenção em uma planta transgênica, em que a molécula de ácido nucleico causa a expressão de eHIP na planta transgênica em quantidade eficaz para controlar insetos. Em um aspecto desta modalidade, os insetos são insetos coleópteros ou insetos lepidópteros. Em um aspecto desta modalidade, os insetos coleópteros são, a 15 larva do milho do oeste, larva do milho do norte, larva do milho mexicana e/ou o besouro da batata do Colorado. Em ainda outro aspecto desta modalidade, os insetos lepidópteros são a broca do milho de Europa.

Em ainda mais uma modalidade, a invenção engloba um método de controlar insetos, que compõe a entrega aos insetos de uma quantidade 20 eficaz de um eHIP da invenção. Em um aspecto desta modalidade, os insetos são insetos coleópteros ou insetos lepidópteros. Em um aspecto desta modalidade, os insetos coleópteros são, a larva do milho do oeste, larva do milho do norte, larva do milho mexicana e/ou o besouro da batata do Colorado. Em ainda outro aspecto desta modalidade, os insetos lepidópteros são a 25 broca do milho de Europa. Tipicamente, o eHIP é entregue aos insetos oralmente. Em um aspecto o eHIP é entregue oralmente por meio de uma planta transgênica que compõe uma seqüência de ácido nucleico que expressa um eHIP da presente invenção.

A presente invenção adicionalmente engloba um método de controle de insetos em que a planta transgênica adicionalmente compõe uma segunda molécula de ácido nucleico ou grupos de moléculas de ácido nucleico que codificam um segundo princípio pesticida. Exemplos destes segundos ácidos nucleicos são aqueles que codificam uma proteína Cry Bt1 os que codificam a Proteína Inseticida Vegetativa, descrita nas Patentes US 5,849,870 e 5,877,012, aqui incorporadas por referência, ou que codificam um caminho para a produção do princípio não-proteinácio.

5 A presente invenção também engloba um método de fazer uma

proteína inseticida híbrida projetada (eHIP), compreendendo: (a) obter uma primeira proteína Cry Bt ou proteína modificada Cry Bt; (b) obter uma segunda proteína Cry Bt que é diferente da primeira proteína Cry Bt ou proteína modificada Cry Bt; (c) combinar regiões variáveis completas ou parciais e 10 blocos conservados da primeira proteína Cry Bt ou proteína modificada Cry Bt com regiões variáveis completas ou parciais e blocos conservados da segunda proteína Cry Bt para fazer um eHIP que possua atividade contra pelo menos a larva do milho do oeste; e opcionalmente (d) inserir um fragmento de peptidila no N-terminal ou uma região de cauda de protoxina de uma pro15 teína Cry Bt no C-terminal do eHIP, ou ambos, em que o fragmento de peptidila N-terminal ou a região protoxina C-terminal ou ambos conferem atividade ao eHIP, ou aumentam a atividade inseticida do eHIP ou tornam o eHIP mais estável que um eHIP sem o fragmento de peptidila ou região de cauda de protoxina ou ambos.

Em outra modalidade, a presente invenção também engloba um

método de fazer uma proteína inseticida híbrida projetada (eHIP), compreendendo: (a) obter um primeiro ácido nucleico que codifica uma primeira proteína Cry Bt ou proteína modificada Cry Bt e um segundo ácido nucleico que codifica uma segunda proteína Cry diferente da primeira proteína Cry ou pro25 teína modificada Cry Bt; (b) isolar do primeiro e do segundo ácido nucleico, uma seqüência de nucleotídeos que codifica regiões variáveis completas ou parciais e blocos conservados da primeira proteína Cry Bt ou proteína modificada Cry Bt e a segunda proteína Cry Bt; (c) conectar os ácidos nucleicos isolados resultantes do passo (b) de maneira a fazer um novo ácido nucleico 30 híbrido que codifique uma proteína e opcionalmente fundir a uma extensão de 5' referido ácido nucleico híbrido um ácido nucleico que codifica um fragmento de peptidila resultando em extensão de 5' ou fundir a uma extensão de 3' de referido ácido nucleico hibrido um ácido nucleico que codifica uma região de cauda de protoxinade uma proteína Cry Bt resultando em extensão de 3', ou ambos; (d) inserir o ácido nucleico híbrido com ou sem uma ou ambas das extensões de 5' ou 3' em um cassete de expressão; (e) transformar 5 o cassete de expressão em uma célula hospedeira, resultando em referida célula hospedeira produzindo um eHIP; e (f) bio-estudo do eHIP contra pelo menos a larva do milho do oeste que resulta em atividade inseticida contra a larva do milho do oeste.

Em outras incorporações do método da invenção, a primeira proteína Cry Bt ou proteína modificada Cry Bt é uma proteína Cry3A ou modificada Cry3A e a segunda proteína Cry Bt é uma A CryIAa ou CryIAb.

Em outra modalidade do método da invenção, o fragmento de peptidila N-terminal se compõe de 9 aminoácidos. Em outro aspecto desta modalidade, o fragmento de peptidila N-C-terminalompõe a seqüência de 15 aminoácido YDGRQQHRG (SEQ ID NO: 132) ou a seqüência de aminoácido TSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 133). Em outro aspecto desta modalidade, o fragmento de peptidila N-terminal é selecionado a partir do grupo consistindo no SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQID NO: 131, e SEQ ID NO: 132.

Ainda em outra modalidade dos métodos da invenção, a região

de cauda da protoxina é de uma CryIAa ou CryIAb. Em outro aspecto desta modalidade, a região de cauda da protoxina se compõe de pelo menos 38 aminoácidos. Em outro aspecto desta modalidade, a região de cauda de protoxina compõe uma seqüência de aminoácido que corresponde a aminoáci25 dos 611-648 de SEQ ID NO: 72. Ainda em outro aspecto desta modalidade, a região de cauda de protoxina compõe aminoácidos 611-648 de SEQ ID NO: 72.

Ensinos especificamente exemplificados dos métodos da confecção dos ácidos nucleicos híbridos e os eHIPs da invenção podem ser encontrados nos Exemplos 1-41.

Em novas incorporações, as seqüências de nucleotídeo da invenção, em particular uma seqüência que codifica o fragmento de peptidila, a cauda da protoxina, e/ou blocos conservados 2, 3, e 4, podem ser além disso modificadas pela modalidade de mutações aleatórias em uma técnica conhecida como recombinação in vitro ou troca de DNA. Esta técnica é descrita em Stemmer et al., a Nature 370:389-391 (1994) e na Patente US 5 5,605,793, que são incorporados aqui por referência. Milhões de cópias mutantes de uma seqüência de nucleotídeo são produzidas com base em uma seqüência do nucleotídeo Original desta invenção e variantes com propriedades melhoradas, como atividade inseticida aumentada, estabilidade realçada, ou a especificidade diferente ou as variedades de insetos objetivo são 10 recuperadas. O método abrange a formação de um polinucleotídeo mutagenizado com fitas duplas de um padrão de polinucleotódeos de fitas duplas que abrangem uma seqüência de nucleotídeos desta invenção, em que o padrão de polinucleotídeos de fitas duplas foi dividido em fragmentos aleatórios de fitas duplas de um tamanho desejado, e compreende os passos da 15 soma à população resultante de fragmentos aleatórios de fita dupla um ou vários oligonucleotídeos de fitas únicos ou duplos, em que os oligonucleotídeos compreendem uma área da identidade e uma área de heterologia ao padrão de polinucleotídeos de fita dupla; desnaturar da mistura resultante de fragmentos aleatórios duplamente encalhados e oligonucleotídeos em frag20 mentos de fita simples; incubação da população resultante de fragmentos de fita simples com polimerase em condições que resultam no recozimento do dito fragmento de fita simples em áreas ditas da identidade para formar pares de fragmentos recozidos, onde áreas da identidade suficientes para um membro de um par para a réplica principal do outro, por meio deste forman25 do um polinucleotídeo mutagenizado de fita dupla; e repetindo os segundos e terceiros passos de pelo menos dois novos ciclos, em que a mistura resultante no segundo passo de um novo ciclo inclui o polinucleotídeo mutagenizado de fita dupla do terceiro passo do ciclo anterior, e o novo ciclo forma um novo polinucleotídeo mutagenizado de fita dupla. Em uma modalidade 30 preferida, a concentração de uma espécie única de fragmento aleatório com fita dupla na população de fragmentos aleatórios de fragmentos duplos é menor que 1% por peso no DNA total. Em outra modalidade preferida, o modelo de polinucleotídeo de fita dupla compreende pelo menos cerca de 100 espécies de polinucleotídeos. Em outra modalidade preferida, o tamanho dos fragmentos aleatórios de fita dupla é de cerca de 5 pb a 5 kb. Em outra modalidade preferida, um quarto passo do método compreende repetir o se5 gundo e o terceiro passo por pelo menos 10 ciclos.

Como agentes de controle de insetos biológico, os eHIPs são produzidos pela expressão dos ácidos nucleicos em células hospedeiras heterólogas capazes de expressar os ácidos nucleicos. Em uma modalidade, as células do B. thuringiensis que compõe modificações de ácido nucleico 10 desta invenção são feitas. Tais modificações compreendem mutações ou deleções de elementos regulatórios existentes, levando assim à expressão alterada do ácido nucleico, ou à modalidade de novos elementos regulatórios controlando a expressão do ácido nucleico. Em outra modalidade, cópias adicionais de um ou mais dos ácidos nucleicos são adicionadas às célu15 Ias do Bacillus thuringiensis seja pela inserção no cromossomo ou pela introdução de moléculas de replicação extracromossômica contendo os ácidos nucleicos.

Em outra modalidade, ao menos um dos ácidos nucleicos da invenção é inserido no cassete da expressão apropriada, compreendendo um sinal promotor e de terminação. A expressão do ácido nucleico é constitutiva, ou é utilizado um promotor indutivo respondendo a vários tipos de estímulos para iniciar a transcrição. Em outra modalidade, a célula na qual o eHIP é expressado é um microorganismo, tal como um vírus, bactéria ou fungo. Ainda em outra modalidade, um vírus, tal como um baculovírus, contém um ácido nucleico da invenção em seu genoma e expressa grandes volumes de proteína inseticida correspondente após a infecção das células eucariontes apropriadas que são adequadas para replicação do vírus e expressão do ácido nucleico. A proteína inseticida assim produzida é utilizada como agente inseticida. Como alternativa, os baculovírus transformados para incluir o ácido nucleico são utilizados para infectar insetos in vivo e os matam ou pela expressão da toxina inseticida ou por uma combinação de infecção viral e expressão da toxina inseticida. As células bacterianas são também hospedeiras para a expressão dos ácidos nucleicos da invenção. Em uma modalidade, bactérias simbióticas não-patogênicas, que conseguem viver e se reproduzir dentro dos tecidos da planta, as chamadas endófitas, ou bactérias simbióticas não5 patogênicas, que conseguem colonizar a filosfera ou a rizosfera, chamadas de epífitas, são utilizadas. Tais bactérias incluem bactérias do gênero Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces e Xanthomonas. Fungos simbióticos, tais como Tricho10 derma e Glioeladium são também possíveis hospedeiros para a expressão dos ácidos nucleicos da invenção pelo mesmo propósito.

Técnicas para estas manipulações genéticas são específicas para os diferentes hospedeiros disponíveis e são conhecidas na técnica. Por exemplo, os vetores da expressão pKK223-3 e pKK223-2 podem ser utilizados para expressar genes heterológos em E. eoli, ou em fusão transcripcional ou translacional, por trás do promotor tac ou trc. Para a expressão de operons de ORFs de codificação múltipla, o procedimento mais simples é inserir o operon em um vetor tal como pKK223- 3 na fusão transcricional, permitindo ser utilizado o sítio de ligação do ribossomo cognato dos genes heterológos. Técnicas de sobre-expressão em espécies gram-positivas tais como Bacillus são também conhecidas na técnica e podem ser utilizadas no contexto desta invenção (Quax et al. Inilndustrial MicroorganismsiBasic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)). Sistemas alternativos de sobre-expressão se baseiam por exemplo, em vetores de levedura e incluem o uso de Pichia, Saccharomyces e Kluyveromyces (Sreekrishna, Inilndustrial microorganismsibasic and applied molecular genetics, Baltz, Hegeman, e Skatrud eds., American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2:173- 177 (1994); van den Berg et al., Biotechnology 8:135-139 (1990)).

Em uma modalidade, ao menos um dos eHIPs da invenção é expresso em um organismo mais alto tal como uma planta. Neste caso, plantas transgênicas expressando volumes efetivos do eHIP se protegem de pestes de insetos. Quando o inseto começa a alimentar-se em tal planta transgênica, ele também ingere o eHIP expressado. Isto deterá o inseto de continuar mordendo o tecido da planta ou pode mesmo danificar ou matar o 5 inseto. Um ácido nucleico da presente invenção é inserido em um cassete de expressão, que pode então ser estavelmente integrado no genoma da planta. Em outra modalidade, o ácido nucleico é incluído em um vírus autorreplicante não-patogênico. As plantas transformadas conforme a presente invenção podem ser monocotiledôneas ou dicotiledôneas e incluem, mas 10 não são limitadas a, grão, trigo, cevada, centeio, batata doce, feijão, ervilha, chicória, alface, repolho, couve-flor, brócolis, nabo, rabanete, espinafre, aspargo, cebola, alho, pimentão, aipo, abóbora, abóbora moranga, cânhamo, abobrinha, maçã, pêra, marmelo, melão, ameixa, cereja, pêssego, nectarina, damasco, morango, uva, framboesa, amora-preta, abacaxi, abacate, ma15 mão, manga, banana, soja, tomate, sorgo, cana-de-açúcar, beterraba, girassol, colza, trevo, fumo, cenoura, algodão, alfafa, arroz, batata, berinjela, pepino, Arabidopsis, e plantas arborizadas como árvores coníferas e decíduas.

Uma vez que um ácido nucleico desejado tenha sido transformado em uma espécie particular de planta, pode se propagar nesta espécie ou se mover em outras variedades da mesma espécie, particularmente incluindo variedades comerciais, utilizando técnicas de cultivo tradicional.

Um ácido nucleico desta invenção é preferivelmente expresso em plantas transgênicas, causando assim a biossíntese do eHIP correspondente nas plantas transgênicas. Desta forma, plantas transgênicas com re25 sistência aumentada a insetos, particularmente contra a larva do milho do oeste, são geradas. Para sua expressão em plantas transgênicas, os ácidos nucleicos da invenção podem requerer outras modificações e otimização. Ainda que em muitos casos os genes de organismos microbianos possam ser expressados em plantas em altos níveis sem modificação, a baixa ex30 pressão em plantas transgênicas pode resultar de ácidos nucleicos microbianos com códons que não são preferidos nas plantas. Sabe-se na técnica que todos os organismos têm preferências específicas para o uso de códon, e os códons dos ácidos nucleicos descritos nesta invenção podem ser alterados conforme as preferências da planta, enquanto mantêm os aminoácidos codificados assim. Além disso, a alta expressão em plantas é melhor conseguida das seqüências de codificação que têm ao menos cerca de 35% 5 de conteúdo de GC1 de preferência mais de 45%, mais preferivelmente mais de 50%, e mais preferivelmente mais que 60%. Os ácidos nucleicos microbiais que têm baixo conteúdo de GC podem se expressar pobremente em plantas devido à existência de motivos ATTTA que podem desestabilizar mensagens, e motivos AATAAA que podem causar poliadenilação imprópria. 10 Embora as seqüências genéticas preferidas possam ser apropriadamente expressas tanto em monocotiledênoas como em espécies de plantas dicotiledônoeas, as seqüências podem ser modificadas para contar as preferências de códon específicas e as preferências de conteúdo de GC das monocotiledôneas ou dicotiledôneas como essas preferências foram mostradas 15 diferenciando-se (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)). Além disso, os ácidos nucleicos são protegidos contra a existência de sítios de junção ilegítimos que podem causar o truncamento de mensagem. Todas as modificações que necessitam ser feitas dentro dos ácidos nucleicos como os descritos acima são feitas utilizando as técnicas bem-conhecidas de muta20 gêneses dirigida ao sítio, PCR, e construção genética sintética que utiliza os métodos descritos nos pedidos de patente publicados EP 0 385 962, EP 0 359 472, e WO 93/07278.

Em uma modalidade da invenção, um eHIP codificando a seqüência e/ou uma proteína mãe Cry Bt codificando a seqüência é(são) fei25 to(s) segundo o procedimento descrito na Patente US 5,625,136, aqui incorporada por referência. Neste procedimento, os códons preferidos do milho, isto é, o códon único que mais frequentemente codifica este aminoácido no milho, é utilizado. O códon preferido do milho para um determinado aminoácido pode ser derivado, por exemplo, de seqüências genéticas conhecidas 30 do milho. O uso do códon de milho para 28 genes de plantas de milho é encontrado em Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989), cuja divulgação é incorporada aqui por referência. Desta maneira, as seqüências de nucleotídeos podem ser otimizadas para a expressão em qualquer planta. É reconhecido que toda ou qualquer parte da seqüência genética pode ser otimizada ou sintética. Ou seja, seqüências sintéticas ou parcialmente otimizadas podem também ser 5 utilizadas.

Para início eficaz da translação, as seqüências adjacentes da metionina inicial podem requerer modificação. Por exemplo, elas podem ser modificadas pela inclusão de seqüências conhecidas como eficientes em plantas. Joshi sugere um consenso apropriado para plantas (NAR 15:6643- 10 6653 (1987)) e Clonetech sugere mais outro consenso de iniciador de translação (1993/1994, catálogo, pag. 210). Estes consensos são adequados para uso com ácidos nucleicos desta invenção. As seqüências são incorporadas em construções que compreendem os ácidos nucleicos, até e inclusive o ATG (deixando o segundo aminoácido não modificado), ou como alternativa 15 até e inclusive o subsequente GTC ao ATG (com a possibilidade de modificar o segundo aminoácido da transgene).

A expressão dos ácidos nucleicos em plantas transgênicas é direcionada por promotores naquela função em plantas. A escolha do promotor variará dependendo das exigências temporais e espaciais da expres20 são, e também dependendo das espécies objetivo. Assim, a expressão dos ácidos nucleicos desta invenção em folhas, em talos ou troncos, em orelhas, em inflorescências (por exemplo espinhos, panículas, espigas de milho, etc.), em raízes, e/ou plantas cultivadas de sementes é preferida. Em muitos casos, contudo, a proteção contra mais de um tipo de inseto é buscada, e 25 assim a expressão em múltiplos tecidos é desejável. Embora muitos promotores de dicotiledôneas tenham sido mostrados como operacionais em monocotiledôneas e vice-versa, de maneira ideal dicotiledôneas promotoras são selecionadas para expressão em dicotiledôneas, e monocotiledôneas promotoras da expressão em monocotiledôneas. Contudo, não há nenhuma 30 restrição quanto a proveniência de promotores selecionados; é suficiente que eles sejam operacionais na condução da expressão dos ácidos nucleicos na célula desejada. Em uma modalidade os promotores são utilizados, o que é expresso constitutivamente incluindo o actina ou ubiquitina ou promotores cmp ou promotores CaMV 35S e 19S. Os ácidos nucleicos desta invenção também podem ser expressos sob a regulação de promotores que são quimi5 camente regulados. Isto permite aos eHIPs serem sintetizados só quando as plantas colhidas são tratadas com os produtos químicos de indução. A tecnologia preferida para indução química da expressão do gene é detalhada na aplicação publicada EP O 332 104 (para Ciba- Geigy) e Patente US 5.614.395. Um promotor preferido para indução química é o promotor de 10 tabaco PR-1 a.

Em outra modalidade uma categoria de promotores que é indutora de lesões pode ser utilizada. Numerosos promotores foram descritos e que são expressos em sítios de lesão e também nos sítios de infecção de fitopatógenos. Idealmente, referido promotor deve apenas ser ativo Iocal15 mente nos locais da infecção, e desta forma os eHIPs apenas acumulam em células que precisam sintetizar os eHIPs para matar as pestes de insetos invasores. Os promotores preferidos deste tipo incluem aqueles descritos por Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), 20 Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), e Warner etal. Plant J. 3:191-201 (1993).

Os promotores de tecido específico ou tecido preferencial úteis para expressão dos genes que codificam eHIPs em plantas, particularmente milho, são aqueles que direcionam expressão na raiz, folha ou pólen, parti25 cularmente raiz. Referidos promotores exemplo, aqueles isolados de PEPC ou trpA, são descritos na Patente US 5,625,136, ou MTL, descrita na Patente US 5,466,785. Ambas as patentes US aqui incorporadas por referência na íntegra.

As incorporações adicionais são plantas transgênicas expressando os ácidos nucleicos em modo indutor de lesão ou indutor de patógeno de infecção.

Adicionalmente aos promotores, uma variedade de terminadores transcricionais também estão disponíveis para uso em construção de ácidos nucleicos híbridos utilizando os genes de eHIP da presente invenção. Os terminadores transcricionais são responsáveis pela terminação da transcrição além do transgene e na sua correta poliadenilação. Terminadores trans5 cricionais adequados e aqueles que são conhecidos de funcionar em plantas incluem o terminador CaMV 35S, terminador tml, o terminador sintase nopaIina (NOS), o terminador pea rbcS E9 e outros conhecidos na técnica. Estes podem ser utilizados em monopcotiledoneas e dicotiledôneas. Qualquer terminador disponível conhecido de funcionar em plantas pode ser utilizado no 10 contexto desta invenção.

Numerosas outras seqüências podem ser incorporadas nos cassetes de expressão descritos nesta invenção. Estes incluem as seqüências que mostraram melhorar a expressão tal como seqüências de íntron (por exemplo de Adhl e bronzel) e seqüências de líder viral (por exemplo de TMV, MCMV eAMV).

Pode ser preferível visar expressão dos ácidos nucleicos da presente invenção para diferentes localizações celulares na planta. Em alguns casos, a localização no citosol pode ser desejável, onde em outros casos, a localização em órgão subcelular pode ser preferida. A localização subcelular 20 de enzimas de transgene codificado é realizada utilizado técnicas bemconhecidas na técnica. Tipicamente, o DNA codificando o peptídeo alvo de um produto de órgão visado conhecido é manipulado e fundido com o ácido nucleico. Muitas das referidas sequências-alvo são conhecidas pelo cloroplasta e seu funcionamento nas construções tem sido mostrado. A expres25 são de ácidos nucleicos da presente invenção também é visada ao retículo endoplásmico ou aos vacúoios das células hospedeiras. Técnicas para obter isto são bem-conhecidas na técnica.

Vetores adequados para transformação de planta são descritos em outros pontos desta especificação. Para transformação mediada para agrobactéria, os vetores binários ou vetores que carregam pelo menos uma seqüência de borda de T-DNA são adequados, onde para a transferência direta de genes qualquer vetor é adequado e DNA linear contendo apenas a construção de interesse pode ser preferido. No caso de transferência direta de gene, a transformação com uma espécie única de DNA ou cotransformação pode ser utilizada (Schocher et al. Biotechnology 4:1093- 1096 (1986)). Tanto para a transferência direta de gene e para a transferência mediada por 5 agrobactéria, a transformação geralmente (mas não necessariamente) é realizada com um marcador selecionável que pode fornecer resistência a um antibiótico (Canamicina, higromicina ou metotrexato) ou um herbicida (basta). Os vetores de transformação de planta compreendendo os genes de eHIP da presente invenção podem também compor genes (por exemplo, 10 fosfomanose isomerase; PMI) que providencia seleção positiva das plantas transgênicas conforme descrito nas Patentes US 5.767.378 e 5.994.629, aqui incorporadas por referência. A escolha de marcadores selecionáveis não é, entretanto, crítica para a invenção.

Em outra modalidade, um ácido nucleico da presente invenção é diretamente transformado em um genoma plastídeo. Uma grande vantagem da transformação plastídea é que os plastídeos são geralmente capazes de expressar genes bactericidas sem otimização substancial de códon, e os plastídeos são capazes de expressar quadros múltiplos abertos de leitura sob controle de um único promotor. A tecnologia de transformação plastídea é extensamente descrita nas patentes US 5.451,513. 5.545.817 e 5.545.818, na aplicação PCT N0 WO 95/16783, e em McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sei. USA 91, 7301-7305. A técnica básica para transformação cloroplasta envolve introduzir regiões de DNA plastídeo clonadas flanqueando um marcador selecionável junto com o gene de interesse em um tecido-alvo adequado, exemplo, utilizando transformação biolística ou protoplasta (exemplo, cloreto de cálcio ou transformação mediada por PEG). As regiões de flanqueio 1 a 1,5 kb, denominadas sequências-alvo, facilitam a recombinação homóloga com o genoma plastídeo e assim permite a reposição ou modificação de regiões específicas do plastoma. Inicialmente, mutações de ponto no cloroplasta 16S rRNA e genes rps12 conferindo resistência a espectinomicina e/ou estreptomicina são utilizadas como marcadores selecionáveis para transformação (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., e Maliga, P. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub1 J. M., e Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Isto resultou em transformantes homoplásmicos estáveis em frequência de aproximadamente um por 100 bombardeios de folhasalvo. A presença de sítios de clonagem entre estes marcadores permitiu a 5 criação de vetor de alvo plastídeo para introdução de genes estrangeiros (Staub, J.M., e Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606). Aumentos substanciais na frequência de transformação são obtidos por reposição do rRNA recessivo ou genes resistentes a antibióticos proteína-r sem marcador selecionável dominante, o gene bactéria aadA codificando a enzima espectino10 micina-"cletoxifying" aminoglicosídeo-3' adeniltransferase (Svab, Z., e Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Previamente, este marcador era utilizado para transformação de alta frequência do genoma plastídeo da alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt- Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089). Outros marcadores selecionáveis 15 que são úteis para a transformação plastídea são conhecidos na técnica e englobados dentro do escopo desta invenção. Tipicamente, aproximadamente 15-20 ciclos de divisão celular em seguida da transformação são requeridos para obter o estado homoplastídico. A expressão plastídea, em genes que são inseridos por recombinação homóloga em todas as milhares de có20 pias do genoma plastídeo presente em cada célula de planta, tira vantagem do enorme número de cópias sobre genes de expressão nuclear para permitir níveis de expressão que podem prontamente exceder 10% da proteína solúvel total da planta. Em uma modalidade preferida, um ácido nucleico da presente invenção é inserido em um vetor de alvo plastídeo e transformado 25 no genoma plastídeo de uma planta hospedeira desejada. As plantas homoplasticas para genomas plastídeos que contêm um ácido nucleico da presente invenção são obtidas, e são preferencialmente capazes da alta expressão do ácido nucleico.

Os eHIPs da invenção podem ser utilizados em combinação com outros princípios pesticidas (por exemplo proteína Cry Bt) para aumentar a variedade pestes-alvo. Além disso, o uso de eHIPs da invenção em combinação com toxinas Cry3A modificadas, proteínas de Cry Bt, ou outros princípios CRW-ativos, como RNAi, que têm um modo diferente da ação ou visam um receptor diferente no intestino do inseto, tem uma utilidade em particular na prevenção e/ou gerenciamento na resistência da larva do milho do oeste. Outros princípios inseticidas incluem, mas não se limitam a, lectinas, a5 amilase, peroxidase, e oxidase colesterol. Genes vip, como descrito na Patente US N0 5.889.174 e aqui por incorporados por referência, são também úteis em combinação com os eHIPs da presente invenção.

Esta coexpressão de mais de um princípio inseticida na mesma planta transgênica pode ser atingida fazendo uma compreensão de vetor 10 recombinante única que codifica seqüências de mais de um princípio inseticida em uma assim chamada pilha molecular e geneticamente projetando uma planta para conter e expressar todos os princípios inseticidas na planta transgênica.

Tais pilhas moleculares podem também ser feitas utilizando mi15 nicromossomos como descritos, por exemplo na Patente US 7,235,716. Como alternativa, uma planta transgênica compreendendo um ácido nucleico codificando um primeiro princípio inseticida pode ser retransformada com um ácido nucleico diferente codificando um segundo princípio inseticida e assim por diante. Como alternativa, uma planta, Original 1, pode ser geneticamente 20 modificada para a expressão de genes da presente invenção. Uma segunda planta, Original 2, pode ser geneticamente modificada para a expressão de um princípio de controle de insetos suplementar. Cruzando a Original 1 com a Original 2, as plantas progênes são obtidas que expressam todos os genes introduzidos na Original 1 e 2.

A semente transgênica da presente invenção pode também ser

tratada com uma semente de cobertura inseticida como descrito nas Patentes US de 5.849.320 e 5.876.739, aqui incorporadas por referência. Onde tanto o revestimento de semente inseticida como a semente transgênica da invenção estão ativos contra o mesmo inseto-alvo, a combinação é útil (i) 30 em um método para realçar a atividade de um eHIP da invenção contra o inseto-alvo e (ii) em um método para prevenir o desenvolvimento da resistência a um eHIP da invenção fornecendo um segundo mecanismo da ação contra o inseto-alvo. Assim, a invenção fornece um método de realçar a atividade contra ou prevenir o desenvolvimento da resistência em um insetoalvo, por exemplo, a larva do milho do oeste, compreendendo a aplicação de um revestimento de semente inseticida a uma semente transgênica que 5 compreende um ou vários eHIPs da invenção.

Mesmo onde o revestimento de semente inseticida é ativo contra um inseto diferente, o revestimento da semente inseticida é útil para estender a variedade do controle de insetos, por exemplo, acrescentando uma cobertura à semente inseticida que tem a atividade contra insetos lepidópte10 ros à semente transgênica da invenção, que tem a atividade contra insetos coleópteros, a cobertura das sementes transgênicas produzem controles tanto contra lepidópteros como contra insetos coleópteros.

EXEMPLOS

A invenção será mais descrita por referência aos seguintes exemplos detalhados. Estes exemplos são fornecidos com o objetivo de ilustração apenas, e não destinados a limitar a menos que de outra maneira especificado. O padrão recombinante de DNA e técnicas de clonagem moleculares aqui utilizados são bem-conhecidos na técnica e descritos por J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); por T.J. Silhavy, M.L. Berman, e L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons Inc., (1988), Reiter1 et al., Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press (1992), e Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998).

Exemplo 1: Seqüências de Codificação Parental

Seqüências codificadas cry3Aa, crylAb, cryIBa e crylFa otimizadas de milho; aqui designadas mocry3Aa, mocrylAb, mocryIBa e mocrylFa, respectivamente, foram feitas de acordo com o procedimento descrito na Patente US 5,625,136, cujo conteúdo é aqui incorporado por citação.

A seqüência de codificação cry3A055 (SEQ ID NO: 67), que codifica uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 68) foi feita modificando-se a seqüência de codificação mocry3A inserindo-se uma seqüência de nucleotídeo que codifica um sítio de reconhecimento de protease Catepsina G no domínio I de acordo com a Patente US 7,030,295, cujo conteúdo é aqui in5 corporado por citação.

A seqüência de codificação mocry3Aa (SEQ ID NO: 67), que codifica a proteína fixada no SEQ ID NO: 68, cry3A055 (SEQ ID NO: 69), que codifica a proteína fixada no SEQ ID NO: 70, mocrylAb (SEQ ID NO:

71), que codifica a proteína fixada no SEQ ID NO: 72, mocryIBa (SEQ ID 10 NO: 73), que codifica a proteína fixada no SEQ ID NO: 74, mocrylFa (SEQ ID NO: 75), que codifica a proteína fixada no SEQ ID NO: 76, cry8Aa (SEQ ID NO: 77), que codifica a proteína fixada no SEQ ID NO: 78, crylAc (SEQ ID NO: 79), que codifica a proteína fixada no SEQ ID NO: 80, and crylla (SEQ ID NO: 81), que codifica a proteína fixada no SEQ ID NO: 82, foram 15 utilizadas na construção dos ácidos nucleicos híbridos e das proteínas que eles codificaram e descritos nos seguintes Exemplos.

Exemplo 2: Uso de iniciadores PCR para construir ácidos nucleicos híbridos.

A Reação de Cadeia de Polimerase (PCR) é uma síntese repetitiva, enzimática e causada de uma seqüência de ácido nucleico. Este procedimento é bem-conhecido e comumente utilizado por aqueles versados nesta técnica (Vide Mullis, Patentes US N^f 4.683.195. 4.683.202, e 4,800,159; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich1 Norman Arnheim [1985] "Enzymatic Amplification of .beta.-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia," Science 230:1350-1354.). A PCR é baseada na amplificação enzimática de um fragmento de DNA de interesse que é flanqueado por dois iniciadores de oligonucleotídeo que hibridizam as margens opostas da seqüência objetivada. Os iniciadores são orientados com as extremidades 3' apontando umas para as outras. Os ciclos repetitivos de desnaturação por calor do modelo, recozimento dos iniciadores às suas seqüências complementares, e extensão dos iniciadores recozidos com uma polimerase DNA resultam na amplificação do segmento definido pelas extremidades 5' dos iniciadores PCR. Uma vez que o produto de extensão de cada iniciador pode servir como um modelo para outro iniciador, cada ciclo essencialmente dobra o montante do fragmento de DNA produzido no ciclo anterior. Isto resulta no acúmulo exponencial do fragmento objetivado espe5 cífico, em até vários milhões de duplicações em poucas horas. Utilizando uma polimerase DNA termoestável tal como uma polimerase Taq, que é isolada da bactéria Thermus aquaticus termofílica, o processo de amplificação pode ser completamente automatizado.

As seqüências de codificação quiméricas descritas nos exempios a seguir foram construídas utilizando várias combinações dos iniciadores exemplificados exibidos na Tabela 1. As misturas de reação PCR e protocolos termocíclicos PCR utilizados nos experimentos são listadas nas Tabelas 2 e 3, respectivamente. Em cada um dos exemplos a seguir, os iniciadores PCR são referidos pelo nome e "SEQ ID NO:" e as misturas de reação PCR e os protocolos termocíclicos são referidos por seus respectivos números. Será reconhecido por pessoas versados que outros iniciadores PCR e condições de reação PCR podem ser utilizados para construir as seqüências de codificação quiméricas da invenção e listando os iniciadores e condições PCR exemplificados que foram utilizados na presente invenção não pretendem ser Iimitativos de forma alguma.

Tabela 1: Iniciadores utilizados para construir seqüências de codificação codificando eHIPs.

Nome do Seqüência SEQ ID NO: Iniciador 5'3A-1- 5'- SEQ ID NO:83 bam CCGGATCCATGACGGCCGACAACAACACCGAGGC-3' C3-3A-6 5'-CAGGGGCAGCTGGGTGATCT-3' SEQ ID NO:84 C3-1Ab-3 5'-AGAT CACCCAGAT CCCCCT G-3' SEQ ID NO:85 1Ab-6- 5- SEQ ID NO:86 sac CCGAGCT CAGCT CCT ACACCT GAT CGATGTGGTAGTCGG-3' Nome do Seqüência SEQ ID NO: Iniciador 8A-atg- 5'- SEQ ID NO:87 delRI CCGGATCCACCATGACTAGTAACGGCCG CCAGTGTG CTG GT ATT CGCCCTT AT GAC3' C2-3A-4 5'-GTCCAGCACGGTCAGGGTCA-3' SEQ ID NO:88 reverse 5'-GCGT GCAGT CAAGT CAGAT C-3' SEQ ID NO:89 FR8a- 5'- SEQ ID N0:90 OL-1 GGTGTTGTTGTCGGCCGTCATAGGGCGAATACCAGCAC-3' FR8a- 5'- SEQ ID N0:91 OL-2 GCCGACAACAACACCGAGGCCCTGGACAGCAGCACCACC-3' C1-3A-2 5’- SEQ ID NO:92 CAGGTGGGTGTTGGCGGCCTGGGCGTA3' 5'FR8a 5'-GGATCCACCATGACTAGTAAC-3' SEQ ID NO:93 5'FR8a- 5’- SEQ ID NO:94 12aa CCG G AT CCACCAT GT AT G ACG GCCG ACAACAACACC-3' C2-3A-3 5'-T GACCCT G ACCGTGCT G G AC-3' SEQ ID NO:95 3'1Ab- 5'- SEQ ID NO:96 dm3 GAGCTCCTAGGTCACCTCGGCGGGCAC3’ 5'FR- 5'- SEQ ID NO:97 del6 GGAT CCACCAT GTGTGCTGGTATTCG CCCTAT-3' 5'1Ab- 5'- SEQ ID NO:98 bam CCGGATCCATGGACAACAACCCCAACATCAAC-3' C3-3A-8 5-GAT GT CGCCGCCGGT GAAGC-3' SEQ ID NO:99 C3-3A-7 5'-GCTTCACCGGCGGCGACATC-3' SEQ ID N0:100 1B-5 5'- SEQ ID CCGCCGCGACCT - N0:101 GACCCTGGGCGTGCTGGAC-3' 1B-10 5'-CCGAGCT CCT AGAACAGGGCGTT CAC- SEQ ID 3' N0:102 Nome do Seqüência SEQ ID NO: Iniciador 3A-22 5’- SEQ ID GGCCTTCACCAGGGGCAGCTGGGTGAT- N0:103 3' 1B-7 5’- SEQ ID AT CACCCAG AT CCCCATGGT G AAG G CC-3' NO: 104 C3-1Ab-2 5'-C AG G G G GAT CTG G GT GAT CT-3' SEQ ID N0:105 C3-3A-5 5'-AGAT CACCCAGCTGCCCCTG-3' SEQ ID NO: 106 3A-12- 5'- SEQ ID sac CCGAG CT CAG CT CAGAT CT AGTT CACG G N0:107 G GAT G AACTCG AT CTT -3' C4-3A-10 5'-TGGTGCTGGCGTAGTGGATGCGG-3' SEQ ID N0:108 C4-3A-9 5'-CCGCAT CCACT ACGCCAGCACCA-3' SEQ ID NO: 109 C1-1Ab-1 5’- SEQ ID TACGTGCAGGCCGCCAACCTGCACCTG-3' N0:110 5'8Aa- 5'- SEQ ID dm3 AGATCACCCAGCTGCCCCTGGTAAAGG- NO:111 GAGACAT GTT AT AT C-3' 3'8Aa- 5'- SEQ ID dm3 G AG CT CCT AT GT CT CAT CTACTG G G AT- NO:112 GAA-3' tant-OL-2 5'- SEQ ID GAGGGTGTGGGCCTTCACCAGGGG- NO:113 CAGCTGGGT-3' tant-OL-1 5'- SEQ ID ACCCAGCTGCCCCTGGTGAAGGCCCA- NO:114 CACCCTC-3' tant- 5'- SEQ ID 3'sac GAGCT CT AGCTT AAGCAGT CCAC- NO:115 GAGGTT-3' IAc-OL-2 5'- SEQ ID TAAAAAGAAAGTTTCCCTTCACCAGGGG- NO:116 CAGCTGGGT-3’ 1 Ac-OL-1 5'- SEQ ID ACCCAGCTGCCCCTGGT G AAGGG AA- NO:117 ACTTT CTTTTT A-3' Nome do Seqüência SEQ ID NO: Iniciador 1Ac- 5'- SEQ ID 3'sac GAGCTCCTATGTTGCAGTAACTGGAATA- NO:118 AA-3' 1 la-OL-2 5'- SEQ ID AAGACAGATTGAAAGCTTTTACT- NO:119 CAGGGGCAGCTGGGT-3' 1la-OL-1 5’- SEQ ID ACCCAGCTGCCCCTGAGTAAAAGCTTT- N0:120 CAAT CT GT CTT-3' 1 la-3'sac 5'- SEQ ID G AG CTCCT ACAT GTT ACG CT CAAT AT G- NO:121 GAGT-3' FR-IAb- 5'- SEQ ID 2 GAT GTTGTT GA- NO:122 ACT CGGCGCT CTT GTGGGT CCA-3' FR-IAb- 5- SEQ ID 1 TGGACCCACAAGAGCGCCG AGTT CAA- NO:123 CAACATC-3' FR-IAb- 5'- SEQ ID 4 GGCTCGTGGGGATGATGTTGTTGA- NO:124 AGTCGACGCTCTTGTGG-3' FR-IAb- 5'- SEQ ID 3 CC ACAAG AG CGTCG ACTT CAACACAT - NO:125 CAT CCCCAGCAGCC-3' CMS94 5’- SEQ ID GGCGCGCCACCATGGCTAGCAT- NO:136 GACTGGTGG-3' CMS95 5'-GCAGGAACAGGTGGGTGTTG-3' SEQ ID NO:137 CMS96 5-CCT GAACACCAT CTGGCCCA-3' SEQ ID NO:138 CMS97 5- SEQ ID CTGGCTGCTGGGGATGATGTTGTTGA- NO:139 AGTCGACGCTCTT-3' CMS98 5'-GAGCTCTTAGGTCACCTCGGC-3' SEQ ID N0:140 CMS99 5’- SEQ ID AAGAGCGT CGACTTCAACAACAT - NO:141 CATCCCCAGCAGCCAG-3' Nome do Seqüência SEQ ID NO: Iniciador CMS100 5'- SEQ ID GAAGTACCGCGCCCGCATCCGCTACGC- NO:142 CAGCACCACCAAC-3' CMS101 5’- SEQ ID GTTGGTGGTGCTGGCGTAGCG- NO:143 GATGCGGGCGCGGTACTTC-3' Tabela 2: Misturas de reação PCR.

Mistura 1 Mistura 2 Mistura 3 50 a100ng 50 a100ng 50 a100ng modelo de DNA modelo de DNA modelo de DNA 0,8 μΜ iniciador 1 0,8 μΜ iniciador 1 0,8 μΜ iniciador 1 0,8 μΜ iniciador 2 0,8 μΜ iniciador 2 0,8 μΜ iniciador 2 1X Pfu tampão 1X Taq tampão 1X cDNA tampão 0,4 mM dNTPs 0,4 mM dNTPs de Vantagem 2% formamida 2% formamida 0,4 mM dNTPs 1,25 unidades Pfu Poli¬ 2,5 unidades Taq Polime¬ x unidades cDNA merase rase (Qiagen) Vantagem Polime¬ (Estratagene) água a um volume rase (CIontech) 2,5 unidades Taq Poli¬ total de 50 μΙ água a um volume merase (Qiagen) total de 50 μΙ água a um volume total de 50 μΙ Mistura 4 Mistura 5 50 a100ng 50 a100ng modelo de DNA modelo de DNA 0,4 μΜ iniciador 1 0,4 μΜ iniciador 1 0,4 μΜ iniciador 2 0,4 μΜ iniciador 2 1X PCR tampão 1X Pfu tampão (Invitrogen) (Estratagene) 0,4 mM dNTPs 0,2 mM dNTPs 2,5 unidades 1,25 unidades Pfu "HotStart Taq Polimera¬ Polimerase Turbo se" água a um volume água a um volume total de 50 μΙ total de 50 μΙ Tabela 3: Perfis termocíclicos PCR.

Perfil Perfil Perfil Termocíclico 1 Termocíclico 2 Termocíclico 3 94°C - 5 minutos 94°C - 5 minutos 94°C - 5 minutos ciclos: 20 ciclos: 20 ciclos: 94°C - 30 segundos 94°C - 30 segundos 94°C - 30 segundos 65°C - 30 segundos 55°C - 30 segundos 55°C - 30 segundos 72°C - 30 segundos 72°C - 30 segundos 68°C - 30 segundos 72°C - 7 minutos 72°C - 7 minutos 68°C - 7 minutos mantido a 4°C mantido a 4°C mantido a 4°C Perfil Perfil Perfil Termocíclico 4 Termocíclico 5 Termocíclico 6 94°C -15 minutos 94°C - 5 minutos 94°C - 5 minutos ciclos: 20 ciclos: 20 ciclos: 94°C - 30 segundos 94°C - 30 segundos 94°C - 30 segundos 50-70°C - 30 segundos 55-75°C - 30 segundos 55-75°C - 30 segundos 72°C - 30 segundos 72°C -1 minuto 72°C - 2 minutos 72°C - 7 minutos 72°C -15 minutos 72°C -15 minutos mantido a 4°C mantido a 4°C mantido a 4°C A Tabela 4 apresenta a relação entre os três domínios de

Cry3A055, CryIAb e Cry3A com suas respectivas regiões variáveis e blocos conservados. Os aminoácidos compreendidos nos domínios, blocos conservados e regiões variáveis são exibidos para cada proteína.

Tabela 4:

Domí¬ Regi¬ Cry3A055 CryIAb Cry3A Cry3A nio ão (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 70) 72) 68) 131) V1 1-10 1-32 1-10 1-57 I V1 11-142 33-152 11-141 58-188 CB1 143-172 153-182 142-171 189-218 V2 173-192 183-202 172-191 219-238 CB2 193-244 203-254 192-243 239-290 Il 245-259 255-269 244-258 291-305 V3 260-444 270-452 259-443 306-490 CB3 445-454 453-462 444-453 491-500 Ill ■455-492 463-500 454-491 501-538 V4 493-513 501-520 492-512 539-559 CB4 514-523 521-531 '? 513-522 560-569 Domí¬ Regi¬ Cry3A055 CryIAb Cry3A Cry 3 A nio ão (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 70) 72) 68) 131) V5 524-586 532-596 523-585 570-632 CB5 587-598 597-606 586-597 633-644 V6 607-610 Proto- J 611-648 xina Exemplo 3: Construção de 20L-8a.

Um primeiro fragmento de ácido nucleico codificando uma porção N-terminal de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70) foi amplificada PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizan5 do iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e C3-3A-6 (SEQ ID NO: 84) e a Mistura de reação PCR 1 e o Perfil termocíclico 1. Esta reação PCR induziu uma mutação de ponto pela exclusão do nucleotídeo 28 do SEQ ID NO: 69 (cry3A055), que causou uma troca estrutural na estrutura de leitura cry3A055, e excluiu o sítio BamHI e seqüência Kozak (Kozak, M., 1986. Cell 10 44:283-92) na extremidade 5' do amplicon resultante.

Um segundo fragmento de ácido nucleico codificando uma porção C-terminal de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72) foi amplificada PCR de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores C3-1Ab-3 (SEQ ID NO: 85) e 1Ab-6-Sac (SEQ ID NO: 86) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Os primeiro e segundo ácidos nucleicos descritos acima foram conectados utilizando-os como modelos em uma reação PCR sobreposta (Horton et al., 1989. Gene 77: 61-68) utilizando os iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e 1Ab-6-Sac (SEQ ID NO: 86) utilizando a Mistura de rea20 ção PCR 2 e Perfil termocíclico 1, exceto um gradiente de 45-65°C foi utilizado para a temperatura de recozimento.

O amplicon resultante foi ligado a um fragmento de extremidade inflexível a um vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad1 CA) cortado com Smal para formar plasmídeo p20L8a/CR2.1. Um fragmento BamHI-SacI de p20L8a/CR2.1 foi ligado ao pET21a (EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA), que foi cortado com BamHI-SacI1 e transformado em E. coli. O fragmento BamHI-SacI de p20L8a/CR2.1 composto de 40 nucleotídeos derivados do vetor pCR2.1-TOPO adjacente ao amplicon estrutural externo da primeira reação PCR. Ligando este fragmento BamHI-SacI ao pET21a criado em uma estrutura de leitura aberta iniciada com o códon inicial (ATG) de 5 uma etiqueta T7 e terminando com o sítio Sacl do DNA inserido. Esta estrutura de leitura aberta foi designada 20L-8a (SEQ ID NO: 1) e codifica a proteína inseticida quimérica 20L-8a (SEQ ID NO: 2). Então, a proteína inseticida quimérica 20L-8a compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido 10 MASMTGGQQMGRGSTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 126), aminoácidos 10-468 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende regiões variáveis 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 15 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6; e 38 aminoácidos da região dorsal da protoxina CryIAb.

Os nucleotídeos que codificam os aminoácidos 1-14 do fragmento de peptidila são derivados da etiqueta T7 e sítio de clivagem BamHI do 20 vetor pET21a. Os nucleotídeos que codificam os aminoácidos 15-26 do fragmento de peptidila são derivados do vetor pCR2.1-TOPO. E os nucleotídeos que codificam os aminoácidos 27- 35 do fragmento de peptidila são derivados de cry3A055 que estão fora da estrutura com o remanescente da seqüência de codificação cry3A055.

Exemplo 4: Construção de FR8a.

A seqüência codificada FR8a foi construída pelo posicionamento de uma seqüência Kozak (ACC) e um códon inicial (ATG) logo abaixo de um sítio BamHI N-terminal em 20L-8a (Vide Exemplo 3). Adicionalmente, um sítio EcoRI em 20L-8a foi interrompido para auxiliar na vetorização futura de 30 FR8a. Todas estas mudanças foram realizadas utilizando-se uma reação PCR com 20L-8a como o modelo e os iniciadores: 8a-atg-delRI (SEQ ID NO: 87) e C2-3A-4 (SEQ ID NO: 88) utilizando a Mistura de reação PCR 2 e Perfil termocíclico 2.

O amplicon resultante foi ligado a um vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Um fragmento BamHI-PpuMI do produto PCR clonado foi então ligado a um fragmento PpuMI-Ncol de 20L8a/pCR2.1 (Vide Exemplo 3) e um fragmento NcoI-BamHI de 20L8a/pCR2.1 para criar FR8a (SEQ ID NO: 3) que codifica a proteína inseticida quimérica FR8a (SEQ ID NO: 4). Então, a proteína inseticida quimérica FR8a compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos 10-468 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende regiões variáveis 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6; e 38 aminoácidos da região dorsal da protoxina CryIAb.

O FR8a eHIP foi bastante ativo contra verme de raiz de milho ocidental conforme mostrado na Tabela 5. Então, a eliminação da seqüência de aminoácido T7 do fragmento de peptidila N-terminal de 20L-8a eHIP não teve um impacto negativo sobre a atividade inseticida.

Adicionando aminoácidos 34 adicionais ao N-termino de FR8a criou um eHIP, designado FR8a+34 (SEQ ID NO: 160), com um fragmento de peptidila N-terminal de aminoácidos 56 (SEQ ID NO: 131). O fragmento de peptidila N-terminal de aminoácido 56 não teve efeito negativo sobre a 25 atividade de FR8a contra verme de raiz de milho ocidental (Vide Tabela 5). Exemplo 5: Construção de FRCG.

Para determinar se um sítio de reconhecimento de protease G catepsina era necessário para atividade inseticida de uma proteína híbrida compreendendo um fragmento N-terminal de Cry3A055, um constructo foi 30 realizado que eliminou o sítio de G catespina da proteína híbrida FR8a (Exemplo 4). Um primeiro fragmento de ácido nucleico MIul-PpuMI de um plasmídeo compreendendo FR8a (SEQ ID NO: 3) e um segundo fragmento de ácido nucleico MIul-PpuMI de um plasmídeo compreendendo mocry3Aa (SEQ ID NO: 67) foram ligados utilizando técnicas de biologia molecular padrão para criar FRCG (também designado FR8a-catg) (SEQ ID NO: 5) que codifica a proteína híbrida FRCG (SEQ ID NO: 6). Então, a proteína insetici5 da quimérica FRCG compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos 10-467 de uma proteína Cry3A (SEQ ID NO: 68), que compreende regiões variáveis 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os a10 minoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6; e 38 aminoácidos da região dorsal da protoxina CryIAb.

A proteína FRCG foi tão ativa contra o verme de raiz de milho

ocidental quanto a proteína FR8a (Vide Tabela 5) sugerindo que o sítio de protease de catespina G não é requerido para atividade inseticida de um eHIP.

Exemplo 6: Construção de FR8a-9F.

Um primeiro fragmento de ácido nucleico de aproximadamente

323 pb foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo FR8a (SEQ ID NO: 3) utilizando reversão de iniciadores (SEQ ID NO: 89) e FR8a-OL-1 (SEQ ID NO: 90) e Mistura de reação PCR 2 e Perfil termocíclico 2. Um segundo fragmento de ácido nucleico de aproximadamente 470 pb foi amplifi25 cado PCR de um plasmídeo compreendendo FR8a utilizando iniciadores FR8a-OL-2 (SEQ ID NO: 91) e C1-3A-2 (SEQ ID NO: 92) e Mistura de reação PCR 2 e Perfil termocíclico 2. Os dois amplicons resultantes foram conectados utilizando-os como modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores 5FR8a (SEQ ID NO: 93) e C1-3A-2 (SEQ ID NO: 92) utilizando 30 Mistura de reação PCR 2 e Perfil termocíclico 2 para amplificar a extremidade 5' de FR8a-9F. O produto PCR sobreposto foi clonado em um vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen) designado 5'FR-9F/pCR2.1. Um fragmento BamHI/PpuMI de 5'FR-9F/pCR2.1 foi então ligado a um fragmento PpuMI/BamHI de FR8a para criar FR8a-9F (SEQ ID NO: 7) que codifica a proteína quimérica FR8a-9F (SEQ ID NO: 8). Então, a proteína inseticida quimérica FR8a-9F compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de pep5 tidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 129), aminoácidos 1-468 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende regiões variáveis 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-648 de uma proteína CryIAb 10 (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6; e 38 aminoácidos da região dorsal da protoxina CryIAb.

A FR8a-9F eHIP foi levemente menos ativa contra o verme de raiz de milho ocidental do que FR8a eHIP (Vide tabela 5) sugerindo que os aminoácidos 9 C-terminal do fragmento de peptidila do SEQ ID NO: 127 desempenham uma função na concessão de atividade inseticida total a FR8a. Exemplo 7: Construção de FR-9F-catg.

A seqüência codificada FR-9F-catg foi criada para posicionar os nucleotídeos derivados cry3A055 fora de estrutura de FR8a novamente em estrutura e eliminar o sítio de reconhecimento de protease G catepsina. Um fragmento BamHI/PpuMI de 5'FR-9F/pCR2.1 (Vide Exemplo 6) foi ligado com um fragmento PpuMI/BamHI de FRCG (Vide Exemplo 5) para criar a seqüência codificada FR-9F-catg (SEQ ID NO: 9) que codifica a proteína quimérica FR-9F-catg (SEQ ID NO: 10). Então, a proteína quimérica FR-9Fcatg compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 129), aminoácidos 1-467 de uma proteína Cry3Aa (SEQ ID NO: 68), que compreende regiões variáveis 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6; e 38 aminoácidos da região dorsal da protoxina CryIAb.

A FR8a-9F-catg eHIP forneceu o mesmo nível de atividade de FR8a contra verme de raiz de milho ocidental (Vide Tabela 5) confirmando 5 que um eHIP pode ser feito a partir de Cry3A modificado ou uma seqüência Cry3 nativa.

Exemplo 8: Construção de FR8a-12aa.

Os aminoácidos 2-13 codificando nucleotídeos do fragmento de peptidila compreendido em FR8a (SEQ ID NO: 4) foram removidos utilizando PCR. Um fragmento foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo FR8a (SEQ ID NO: 3) utilizando iniciadores 5'FR8a-12aa (SEQ ID NO: 94) e C1-3A-2 (SEQ ID NO: 90) e Mistura de Reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1. O amplicon resultante foi clonado em pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Um fragmento BamHI-PpuMI do clone pCR2.1-TOPO foi então ligado com um fragmento PpuMI-BamHI de um plasmídeo compreendendo FR8a para criar FR8a-12aa (SEQ ID NO: 11) que codifica a proteína inseticida quimérica FR8a-12aa (SEQ ID NO: 12). Então, a proteína inseticida quimérica FR8a12aa compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 128), aminoácidos 10-468 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende regiões variáveis 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6; e 38 aminoácidos da região dorsal da protoxina CryIAb.

A FR8a-12aa eHIP forneceu o mesmo nível de atividade contra verme de raiz de milho ocidental do que FR8a (Vide tabela 5) sugerindo que os aminoácidos 12 N-terminal do fragmento de peptidila do SEQ ID NO: 127 não são necessários para atividade inseticida total de FR8a.

Exemplo 9: Construção de Wr-9mut.

Um fragmento de ácido nucleico foi amplificado PCR de FR8a/pCR2.1 (Exemplo 2) utilizando iniciadores 5'FR8a-12aa (SEQ ID NO:

94) e C1-3A-2 (SEQ ID NO: 92) e Mistura de Reação PCR 1 e Perfil termocíclico 2. O amplicon resultante foi clonado em pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Um fragmento BamHI/PpuMI foi então ligado a um fragmento PpuMI/BamHI 5 de FR8a (SEQ ID NO: 3) para criar Wr-9mut (SEQ ID NO: 13) que codifica a proteína WR-9mut (SEQ ID NO: 14), que compreende, do N-termino ao Ctermino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 128), e aminoácidos 10-598 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70). Então a proteína WR-9mut é Cry3A055 10 com um fragmento de peptidila N-terminal da invenção.

A proteína WR-9mut não foi ativa contra o verme de raiz de milho ocidental. Então, a adição de um fragmento de peptidila N-terminal a uma proteína Cry3a modificada não híbrida destruiu a atividade inseticida. Isto sugere que pode haver alguma interação entre a porção C-C15 terminalrylAb de FR8a e o fragmento de peptidila N-terminal que confere atividade inseticida total a FR8a.

Exemplo 10: Construção de FRD3.

A extremidade 3' desta seqüência de codificação foi feita por amplificação PCR de um fragmento de um plasmídeo compreendendo FR8a (SEQ ID NO: 3) utilizando iniciadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) e 3'1Ab-dm3 (SEQ ID NO: 96) e Mistura de Reação PCR 2 e Perfil termocíclico 2. O amplicon resultante foi clonado em pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Um fragmento 364bp Apal/Sacl do amplicon clonado, designado 3'FRD3/pCR2.1, foi ligado com um fragmento Sacl/Apal de FR8a para criar FRD3 (SEQ ID NO: 15) que codifica a proteína quimérica FRD3 (SEQ ID NO: 16). A proteína quimérica FRD3 compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos 10-468 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende região variável 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-610 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6. Então, a proteína inseticida quimérica proteína inseticida quimérica FRD3 é uma variante de uma proteína inseticida quimérica FR8a com a região de aminoácido 38 da proteína dorsal 5 excluída.

A FRD3 eHIP forneceu o mesmo nível de atividade que FR8a contra verme de raiz de milho ocidental (Vide Tabela 5) sugerindo que a região dorsal de protoxina de aminoácido 38 de FR8a não é necessária para atividade inseticida total.

Exemplo 11: Construção de FR-12-cg-dm3

Um fragmento 3082bp Sacl/PpuMI de uma plasmídeo compreendendo FR8a-12 (Vide Exemplo 8), um fragmento 721 bp PpuMI/MIul de FRCG (Vide Exemplo 5) e um fragmento 923bp Mlul/Sacl de FRD3 (Vide Exemplo 10) foram combinados para criar a seqüência de codificação FR15 12-cg-dm3 (SEQ ID NO: 17) que codifica a proteína quimérica FR-12-cgdm3 (SEQ ID NO: 18). A proteína quimérica FR-12-cg-dm3 compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 129), aminoácidos 10-467 de uma proteína Cry3Aa (SEQ ID NO: 70), que compreende região 20 variável 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-610 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6. 25 Então, a proteína quimérica FR-12-cg-dm3 é uma variante de FR8a com aminoácidos 12 N-terminal do fragmento de peptidila, o sítio de reconhecimento de protease G catepsina, e com a região de aminoácido 38 da proteína dorsal excluída.

A FR-12-cg-dm3 eHIP não teve atividade contra os verme de raiz de milho ocidental como FR8a (Vide Tabela 5) sugerindo que alguma interação entre a porção C-terminal de FR8a e o fragmento de peptidila Nterminal é requerido para atividade inseticida total. Exemplo 12: Construção de 9F-cg-del6

A extremidade 5' desta seqüência de codificação era feita pela amplificação PCR de um fragmento de um plasmídeo compreendendo FR9F-catg (Vide Exemplo 7) utilizando iniciadores 5'FR-del6 (SEQ ID NO: 97) e C1-3A-2 (SEQ ID NO: 92) e Mistura de Reação PCR 3 e Perfil termocíclico 3. O amplicon resultante foi clonado em pCR2.1-TOPO. Um fragmento 215bp BamHI/PpuMI foi então ligado com um fragmento 4668bp PpuMI/BamHI de FR-9F-catg para criar FR-9F-cg-del6 (SEQ ID NO: 19) que codifica a proteína quimérica FR-9F-cg-del6 (SEQ ID NO: 20). A proteína quimérica FR-9F-cg-del6 compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MCAGIRP (SEQ ID NO: 130), aminoácidos 1-467 de uma proteína Cry3A (SEQ ID NO: 68), que compreende regiões variáveis 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6; e 38 aminoácidos da região dorsal da protoxina CryIAb. Então, a proteína quimérica FR-9F-cg-del6 é uma variante de FR8a-9F-catg com aminoácidos 2 a 7 do fragmento de peptidila excluído.

A FR-9F-cg-del6 não foi ativa contra o verme de raiz de milho ocidental sugerindo que o fragmento de peptidila N-terminal precisa de pelo menos 7 aminoácidos dos aminoácidos C-terminal 9 do SEQ ID NO: 127 para ser ativo contra o verme de raiz de milho ocidental.

Exemplo 13: Construção de FR-cg-dm3

Um fragmento 3839bp Mlul/Sacl de FRCG (Exemplo 5) e um fragmento 923bp Mlul/Sacl de FRD3 (Exemplo 10) foram ligados para criar FR-cg-dm3 (SEQ ID NO: 21) que codifica a proteína FR-cg-dm (SEQ ID NO: 22). A proteína inseticida quimérica FR-cg-dm3 compreende, do N-termino 30 ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos 10-467 de uma proteína Cry3A (SEQ ID NO: 68), que compreende regiões variáveis 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-610 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do bloco conservado 3, região variá5 vel 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6.

A FRD3 eHIP teve o mesmo nível de atividade contra o verme de raiz de milho ocidental que FR8a (Vide Tabela 5) confirmando que o sítio de catepsina Gea região dorsal de protoxina de FR8a não eram requeridos para atividade inseticida total contra o verme de raiz de milho ocidental. Exemplo 14: Construção de 9F-cg-dm3.

Um fragmento Mlul/Sacl de um plasmídeo compreendendo FR9F-cg (Vide Exemplo 7) foi ligado com um fragmento 923bp Mlul/Sacl de um plasmídeo compreendendo FRD3 (Vide Exemplo 10) para criar 9F-cg-dm3 15 (SEQ ID NO: 23) que codifica a proteína quimérica 9F-cg-dm3 (SEQ ID NO: 24). A proteína inseticida quimérica 9F-cg-dm3 compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 129), aminoácidos 1-467 de uma proteína Cry3A (SEQ ID NO: 68), que compreende regiões variáveis 1, 20 bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477- 610 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6.

A 9F-cg-dm3 eHIP forneceu o mesmo nível de atividade contra o

verme de raiz de milho (Vide Tabela 5) confirmando que os aminoácidos Cterminal 9 do fragmento de peptidila podem conferir atividade quando o domínio I do eHIP era composto de regiões variáveis e blocos conservados de Cry3A (Cry3A055) ou regiões variáveis e blocos conservados de Cry3A.

Exemplo 15: Construção de B8a.

Um fragmento de ácido nucleico codificando uma porção Nterminal de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e C3-3A-8 (SEQ ID NO: 99) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1. Um fragmento de ácido nucleico codificando uma porção C-terminal de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 5 72), compreendendo regiões variáveis 4-6, foi amplificado de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores C3-3A-7 (SEQ ID NO: 100) e 1Ab-6-sac (SEQ ID NO: 86) e Mistura de Reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1. O amplicon resultante foi designado 20L-8b.

Um fragmento de ácido nucleico codificando uma porção Nterminal da proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e C2-3A-4 (SEQ ID NO: 88) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Um segundo fragmento de ácido nucleico codificando uma por15 ção C-terminal de uma proteína CryIBa (SEQ ID NO: 74) foi amplificada PCR de um plasmídeo compreendendo mocryIBa (SEQ ID NO: 73) utilizando iniciadores 1B-5 (SEQ ID NO: 101) e 1B-10 (SEQ ID NO: 102) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1, exceto uma temperatura de recozimento de 60°C foi utilizada.

Os dois produtos PCR descritos acima foram então utilizados

como os modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores 5’3A-1- bam (SEQ ID NO: 83) e 1B-10 (SEQ ID NO: 102) utilizando Mistura de Reação PCR 1 e Perfil termocíclico 2. O amplicon resultante foi designado B10.

A seguir, um fragmento de ácido nucleico de cry3A055 (SEQ ID 25 NO: 69) foi amplificado PCR utilizando 20L-8b (vide acima) como o modelo e iniciadores 5’3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e 3A-22 (SEQ ID NO: 103) com as seguintes condições PCR: Mist. 1, perfil termocíclico: 94°C - 45 segundos, 50°C-70°C gradiente - 45 segundos, 72°C-90 segundos por 30 ciclos. Outro fragmento de ácido nucleico foi amplificado PCR utilizando B10 (vide 30 acima) como o modelo e iniciadores 1B-7 (SEQ ID NO: 104) e 1B-10 (SEQ ID NO: 102) utilizando Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 2, exceto uma temperatura de recozimento de 60°C foi utilizada. Os dois produtos PCR resultantes foram então utilizados como os modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e 1B-10 (SEQ ID NO: 102) utilizando as seguintes condições PCR: Mist. 2, perfil termocíclico: 94°C - 30 segundos, 40°C-60°C gradiente - 30 segundos, 72°C 5 60 segundos por 30 ciclos.

O produto PCR resultante foi ligado a um vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen) e designado B10/pCR2.1. Um fragmento BamHi-SacI de B8a/pCR2.1 foi então ligado a pET21a (Novagen), que foi cortado com BamHi/SacI, para criar a seqüência de codificação B8a (SEQ ID NO: 25) que 10 codifica a toxina híbrida B8a (SEQ ID NO: 26). A proteína híbrida B8a compreende, do N-termino ao C-termino, 1-468 aminoácidos de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), e aminoácidos 505-656 de uma proteína CryIBa (SEQ ID NO: 74).

Exemplo 16: Construção de 5*B8a.

Um fragmento BamHI-XbaI de um plasmídeo compreendendo

20L-8a (Vide Exemplo 3) e um fragmento Xbal-Sacl de um plasmídeo compreendendo B8a (Vide Exemplo 15) foram ligados para criar 5*B8a (SEQ ID NO: 27) que codifica a proteína quimérica 5*B8a (SEQ ID NO: 28). A proteína 5*B8a compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidi20 Ia compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos 10-467 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), e aminoácidos 505-656 de uma proteína CryIBa (SEQ ID NO: 74). Então, a proteína quimérica 5*B8a é a proteína híbrida B8a a qual um fragmento de peptidila N-terminal foi adicionado.

Exemplo 17: Construção de V3A.

Este gene foi amplificado PCR utilizando 3 fragmentos juntos como modelos: o primeiro fragmento foi amplificado de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e C2-3A-4 (SEQ ID NO: 88) e Mistura de reação PCR 1 e 30 Perfil termocíclico 1; o segundo fragmento foi amplificado de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) e C3-1Ab-2 (SEQ ID NO: 105) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1; e o terceiro fragmento foi amplificado de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores C3- 3A-5 (SEQ ID NO: 106) e 3A-12-sac (SEQ ID NO: 107) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1. Estes 3 produtos PCR foram então utilizados 5 como modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e 3A-12-sac (SEQ ID NO: 107) utilizando Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1, para produzir a seqüência de codificação v3A (SEQ ID NO: 29) que codifica a proteína híbrida V3A (SEQ ID NO: 30). A proteína híbrida V3A compreende, do N-termino ao C-termino, aminoáci10 dos 1-226 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende região variável 1, bloco conservado 1, região variável 2, e os aminoácidos 34 N-terminal do bloco conservado 2, e aminoácidos 237-474 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 33 C-terminal do bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 20 N-terminal do 15 bloco conservado 3, e aminoácidos 467-598 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende os aminoácidos 28 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5 e bloco conservado 5.

A V3A eHIP compreende duas posições de cruzamento. O pri20 meiro cruzamento entre Cry3A055 e CryIAb é localizado no bloco conservado 2 e o segundo cruzamento entre CryIAb e Cry3A055 está localizado no bloco conservado 3. Então, V3A é uma variante de Cry3A055 onde toda a região variável 3 foi substituída pela região variável 3 de uma proteína CryIAb. A V3A eHIP não foi tão ativa contra o verme de raiz de milho oci25 dental quanto FR8a, sugerindo que ter a seqüência CryIAb no bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5 e/ou região variável 6 é importante para a atividade inseticida total de FR8a.

A seqüência de codificação v3A foi alinhada a um vetor pCR2.1- TOPO e então subclonada em pET21a utilizando um fragmento BamHI/Sacl. A proteína V3A expressa pelo vetor pET21a possui uma etiqueta T7 no Ntermino. Esta proteína era designada T7-V3A. Exemplo 18: Construção de V4F.

Um primeiro fragmento de ácido nucleico codificando regiões variáveis 1-3 de uma Cry3A055 foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e C3-3A-6 (SEQ ID NO: 84) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Um segundo fragmento de ácido nucleico codificando região variável 4 de uma CryIAb foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores C3-1Ab-3 (SEQ ID NO: 85) e C4-3A-10 (SEQ ID NO: 108) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Um terceiro fragmento de ácido nucleico codificando regiões variáveis 5-6 de uma Cry3A055 foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores C4-3A-9 (SEQ ID NO: 109) e 3A-12-sac (SEQ ID NO: 107) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Todos os três amplicons PCR foram combinados e utilizados como os modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores 5'3A-1- bam (SEQ ID NO: 83) e 3A-12-sac(SEQ ID NO: 107) utilizando as seguintes 20 condições PC: Mist. 1 e perfil termocíclico: 94°C - 30 segundos, 50°C-70°C gradiente - 30 segundos, 72°C - 30 segundos por 20 ciclos. O amplicon resultante, designado a seqüência de codificação v4F (SEQ ID NO: 31) que codifica a toxina híbrida V4F (SEQ ID NO: 32), foi clonado em um vetor pCR2.1-TOPO e designado v4F/pCR2.1 . A proteína híbrida V4F compreen25 de, do N-termino ao C-termino, 1-468 aminoácidos de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), aminoácidos 477-520, compreendendo região variável 4, de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), e aminoácidos 512- 598 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70).

A proteína V4F teve duas posições de cruzamento. O primeiro cruzamento entre Cry3A055 e CryIAb está localizado no bloco conservado 3 e o segundo cruzamento entre CryIAb e Cry3A055 está localizado no bloco conservado 4. Então, V4F é uma variante de Cry3A055 onde toda a região variável 4 foi substituída pela região variável 4 de uma proteína CryIAb. A proteína híbrida V4F não foi ativa contra o verme de raiz de milho ocidental sugerindo que a seqüência CryIAb na porção C-terminal de FR8a contribui para a atividade inseticida de FR8a.

Um fragmento BamHI-SacI de v4F/pCR2.1 foi sub-clonado em

pET21. A proteína expressa pelo plasmídeo resultante foi designada T7- V4F.

Exemplo 19: Construção de 5*V4F.

Um fragmento BamHI-XbaI de um plasmídeo compreendendo 10 FR8a (Vide Exemplo 4) e um fragmento Xbal-Sacl de V4F/pCR2.1 (Vide Exemplo 18) foram ligados a pET21 cortado com BamHI-SacI para formar 5*V4F/pET21. A seqüência de codificação 5*V4F (SEQ ID NO: 33) codifica a proteína quimérica 5*V4F (SEQ ID NO: 34). A proteína inseticida quimérica 5*V4F compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila 15 compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos 10-491 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), aminoácidos 501-520, compreendendo compreendendo a região variável 4, de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), e aminoácidos 512-598 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70).

A 5*V4F eHIP é a proteína híbrida V4F com um fragmento de

peptidila N-terminal (SEQ ID NO: 127) adicionado. A 5*V4F eHIP forneceu atividade inseticida contra o verme de raiz de milho ocidental embora não no mesmo nível de FR8a. Então, o N-C-terminalonferiu atividade inseticida a V4F confirmando que pode haver interação contribuinte entre a porção Cterminal e o fragmento de peptidila N-terminal de FR8a.

A proteína expressa pelo plasmídeo 5*V4F/pET21 foi designada T7-5*V4F e possui uma etiqueta T7 N-terminal ao fragmento de peptidila 5*V4F.

Exemplo 20: Construção de 20L-7.

Um fragmento de ácido nucleico codificando região variável 1 de

uma Cry3A055 foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e C1-3A-2 (SEQ ID NO: 92) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Um fragmento de ácido nucleico codificando regiões variáveis 2-

6 de uma CryIAb foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores C1-1Ab-1 (SEQ ID NO: 110) e 1Ab-6-sac (SEQ ID NO: 86) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Os dois amplicons resultantes foram utilizados como os modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e 1Ab-6-sac (SEQ ID NO: 86) utilizando Mistura de reação PCR 2 e Perfil termocíclico 1, para criar a seqüência de codificação 20L-7 (SEQ ID NO: 35) que codifica a proteína híbrida 20L-7 (SEQ ID NO: 36). A proteína híbrida 20L-7 compreende, do N-termino ao C-termino, 1-156 aminoácidos de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende região variável 1 e os aminoácidos 14 N-terminal do bloco conservado 1, e aminoácidos 167- 648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 15 C-terminal do bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5 e região variável 6, e 38 aminoácidos das regiões dorsais de protoxina CryIAb. Então, 20L-7 é uma variante de uma proteína CryIAb com região variável 1 substituída pela região variável 1 de uma proteína Cry3A055.

A seqüência de codificação 20L-7 foi clonada em pCR2.1-TOPO (Invitrogen) e então movida para pET21a utilizando BamHI/SacI que foi designado 20L-7/pET21a. A seqüência de codificação em 20L-7/pET21a foi designada T7-20L-7 (SEQ ID NO: 37). A proteína expressa pelo vetor 20L7/pET21a foi designada T7-20L-7 (SEQ ID NO: 38).

Exemplo 21: Construção de 5*20L-7.

Um fragmento BamHI/Xbal de FR8a (Vide Exemplo 4), um fragmento PpuMI/SacI 20L-7 (Vide Exemplo 20) e um fragmento BamHI/SacI de pET21a foram ligados para produzir 5*20L-7/pET21a. A seqüência de codificação 5*20L-7 (SEQ ID NO: 39) codifica a proteína quimérica 5*20L-7 (SEQ ID NO: 40). A proteína 5*20L-7 compreende, do N-termino ao Ctermino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos ΙΟΙ 56 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), e aminoácidos 167-643 de 5 uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72). Então, a proteína híbrida 5*20L-7 é a proteína híbrida 20L-7 com um fragmento de peptidila N-terminal adicionado.

Exemplo 22: Construção de 20L-10.

Um fragmento de ácido nucleico codificando uma porção Nterminal de uma proteína Cry3A055 foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores 5'3A-1- bam (SEQ ID NO: 83) e C2-3A-4 (SEQ ID NO: 88) e Mistura de reação PCR

1 e Perfil termocíclico 1. Um fragmento de ácido nucleico codificando uma porção C-terminal de uma proteína CryIAb foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) e 1Ab-6-sac (SEQ ID NO: 86) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1. Estes 2 produtos PCR foram então utilizados como modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e 1Ab-6-sac (SEQ ID NO: 86) utilizando as seguintes condições PCR: Mist. 2, perfil termocíclico: 94°C - 30 segundos, 45°C-65°C gradiente - 30 segundos, 72°C - 30 segundos por 20 ciclos, resultando na seqüência de codificação 20L-10 (SEQ ID NO: 41) que codifica a toxina híbrida 20L-10 (SEQ ID NO: 42). A proteína 20L-10 compreende, do N-termino ao C-termino, 1-232 aminoácidos de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), e aminoácidos 243-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72). Então, a proteína híbrida 20L-10 é substancialmente Domínio I de uma proteína Cry3A055 e Domínios Il e Ill de uma proteína CryIAb.

A seqüência de codificação 20L-10 foi clonada em pCR2.1- TOPO (Invitrogen) e então movida a pET21a utilizando BamHI/SacI. A proteína expressa por 20L-10/pET21a foi designada T7-20L-10.

Exemplo 23: Construção de 5*20L-10.

Um fragmento BamHI-XbaI de um plasmídeo compreendendo FR8a (Vide Exemplo 4) e um fragmento Xbal-Sacl de 20L-10/pCR2.1 (Vide Exemplo 22) foram ligados a pET21 cortado com BamHI-SacI para formar 5*20L-10/pET21. A seqüência de codificação 5*20L-10 (SEQ ID NO: 43) codifica a proteína quimérica 5*20L-10 (SEQ ID NO: 44). A proteína 5*20L5 10 compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos 10-232 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), e aminoácidos 243-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72). Então, a proteína quimérica 5*20L-10 é a proteína híbrida 20L-10 com um 10 fragmento de peptidila N-terminal adicionado.

Exemplo 24: Construção de 20L-12A.

Um primeiro fragmento de ácido nucleico codificando uma porção N-terminal de CryIAb foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores 5'1Ab-bam (SEQ ID NO: 98) e C3-1Ab-2 (SEQ ID NO: 105) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Um segundo fragmento de ácido nucleico codificando uma porção C-terminal de Cry3A055 foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores C3-3A-5 (SEQ ID NO: 106) e 3A-12-sac (SEQ ID NO: 107) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Os primeiro e segundo fragmentos de ácido nucleico descritos acima foram conectados utilizando-os como modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores 5'1Ab-bam (SEQ ID NO: 98) e 3A-12-sac (SEQ 25 ID NO: 107) utilizando Mistura 1 e Perfil termocíclico 1, para criar a seqüência de codificação 20L-12A (SEQ ID NO: 45) que codifica a proteína híbrida 20L-12A eHIP (SEQ ID NO: 46). A proteína 20L-12A compreende, do Ntermino ao C-termino, 1-476 aminoácidos de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), e aminoácidos 469-598 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 30 70).

A 20L-12A eHIP não foi ativa contra o verme de raiz de milho ocidental, porém foi ativa contra a broca de milho européia (Vide Tabela 6). Isto demonstra que eHIP pode ser construída utilizando proteínas Cry Iepidopteran ativa e coleopteran ativa sem perda de atividade contra as espécies de insetos lepidopteran.

A seqüência de codificação 20L-12A foi clonada em pCR2.1- TOPO (Invitrogen) e então movida a pET21a com BamHI/SacI. A proteína expressa pelo vetor 20L-12A/pET21a foi designada T7-20L-10A.

Exemplo 25: Construção de 20L-13.

Quatro fragmentos de ácido nucleico foram gerados conforme a seguir: o fragmento 1 foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e C1-3A-2 (SEQ ID NO: 92) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1; o fragmento 2 foi amplificado de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) e C3-1Ab-2 (SEQ ID NO: 105) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1; o fragmento 3 foi PCR amplificado de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores C3-1Ab-3 (SEQ ID NO: 85) e C4-3A-10 (SEQ ID NO: 108) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1; e o fragmento 4 foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores C4-3A-9 (SEQ ID NO: 109) e 3A-12-sac (SEQ ID NO: 107) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Todos os quatro fragmentos foram então utilizados como modelos em uma reação PCR sobreposta utilizando iniciadores 5'3A-bam (SEQ ID NO: 83) e 3A-12-sac (SEQ ID NO: 107) utilizando Mistura de reação PCR 25 1 e Perfil termocíclico 1, para criar a seqüência de codificação 20L-13 (SEQ ID NO: 47) que codifica a toxina híbrida 20L-13 (SEQ ID NO: 48). A proteína 20L-13 compreende, do N-termino ao C-termino, 1-159 aminoácidos de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), aminoácidos 170-522 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), e aminoácidos 515-598 de uma proteína 30 Cry3A055 (SEQ ID NO: 70). Então, a toxina híbrida 20L-13 é composta de V1 e a porção N-terminal de CB1 de uma proteína Cry3A055; a porção Cterminal de CB1, V2, CB2, V3, CB3 e V4 de uma proteína CryIAb; e CB4, V5 e CB5 de uma proteína Cry3A055.

A seqüência de codificação 20L-13 foi clonada em pCR2.1- TOPO (Invitrogen) e então movida a pET21a utilizando BamHI/SacI. A proteína expressa pelo vetor 20L-13/pET21a foi designada T7-20L-13.

Exemplo 26: Construção de 20L-20.

Um fragmento BamHI/NspI de um plasmídeo compreendendo mocry3A (SEQ ID NO: 67), um fragmento Nspl/Hindlll de um plasmídeo compreendendo 20L-8A (SEQ ID NO: 1), e um fragmento Hindlll/BamHI de pET21a foram ligados para fazer 20L-20/pET21a.

Exemplo 27: Construção de V5&6.

Um fragmento de ácido nucleico codificando uma porção Nterminal de Cry3A055 foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e C4-3A-10 (SEQ ID NO: 108) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Um fragmento de ácido nucleico codificando uma porção Cterminal de uma proteína CryIAb foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores C4-3A-9 (SEQ ID NO: 109) e 1Ab-6-sac (SEQ ID NO: 86) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Estes dois produtos PCR foram então utilizados como os modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e 1Ab-6-sac (SEQ ID NO: 86) utilizando Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 2, para criar a seqüência de codificação V5&6 (SEQ ID 25 NO: 49) que codifica a toxina híbrida V5&6 (SEQ ID NO: 50). A proteína V5&6 compreende, do N-termino ao C-termino, 1-524 aminoácidos de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende V1, CB1, V2, CB2, V3, CB3, V4 e CB4, e aminoácidos 533-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende V5, CB5 e V6, e 38 aminoácidos de uma região 30 dorsal de protoxina Cryl Ab.

A seqüência de codificação V5&6 foi clonada em pCR2.1-TOPO e então movida para pET21 com BamHI/SacI. A proteína expressa por V5&6/pET21a foi designada T7-V5&6.

Exemplo 28: Construção de 5*V5&6.

Um fragmento BamHI/Xbal de FR8a (Vide Exemplo 4), um fragmento Xbal/Sacl de V5&6 (Vide Exemplo 27) e um fragmento BamHI/SacI de pET21a foram ligados para formar 5*V5&6/pET21. A seqüência de codificação 5*V5&6 (SEQ ID NO: 51) codifica a proteína quimérica 5*V5&6 (SEQ ID NO: 52). A proteína inseticida quimérica 5*V5&6 compreende, do Ntermino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos 10-524 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende V1, CB1, V2, CB2, V3, CB3, V4 e CB4, e aminoácidos 533-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende V5, CB5 e V6, e 38 aminoácidos de uma região dorsal de protoxina CryIAb. Então, a proteína inseticida quimérica 5*V5&6 é a proteína híbrida V5&6 com um fragmento de peptidila N-terminal adicionado.

Exemplo 29: Construção de 88A-dm3.

Um fragmento de ácido nucleico codificando uma porção Cterminal de uma proteína Cry8Aa (SEQ ID NO: 78) foi amplificada PCR de um plasmídeo compreendendo cry8Aa (SEQ ID NO: 77) utilizando iniciado20 res 5'8Aa-dm3 (SEQ ID NO: 111) e 3'8Aa-dm3 (SEQ ID NO: 112) e Mistura de Reação PCR 2 e Perfil termocíclico 2. O amplicon resultante foi clonado em pCR2.1-TOPO (Invitrogen) e designado 88A-dm3/pCR2.1.

Um fragmento Mlul/Sacl de 88A-dm3/pCR2.1 e um fragmento Sacl/MIul de um plasmídeo compreendendo FRSa {Vide Exemplo 4) foram 25 ligados para criar a seqüência de codificação 88A-dm3 (SEQ ID NO: 53) que codifica a proteína híbrida 88A-dm3 (SEQ ID NO: 54). A proteína 88A-dm3 compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos 10-468 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID 30 NO: 70), e aminoácidos 532-664 de uma proteína Cry8Aa (SEQ ID NO: 78).

A seqüência de codificação 88A-dm3 foi também transformada em pET21a utilizando uma digestão restrita e ligação BamHI/SacI. A proteína expressa por 88A-dm3/pET21a foi designada T7-88A-dm3.

Exemplo 30: Construção de FR(IFa)

Um fragmento de ácido nucleico codificando uma porção Nterminal de FR8a (Vide Exemplo 3) foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo FR8a (SEQ ID NO: 1) utilizando iniciadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) e tant-OL-2 (SEQ ID NO: 113) e Mistura de reação PCR 3 e Perfil termocíclico 3.

Um fragmento de ácido nucleico codificando uma porção Cterminal de uma proteína Cryl Fa (SEQ ID NO: 76) foi amplificada PCR de um plasmídeo compreendendo mocrylFa (SEQ ID NO: 75) utilizando iniciadores tant-OL-1 (SEQ ID NO: 114) e tant-3'sac (SEQ ID NO: 115) e Mistura de reação PCR 3 e Perfil termocíclico 3.

Estes dois produtos PCR resultantes foram então utilizados como modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) e tant-3'sac (SEQ ID NO: 115) utilizando Mistura de Reação PCR 3 e Perfil termocíclico 3. O produto PCR resultante foi clonado em pCR2.1- TOPO (Invitrogen). Um fragmento de BamHI/MIul de um plasmídeo compreendendo FR8a, um fragmento Mlul/Sacl do produto PCR sobreposto em pCR2.1 e um fragmento BamHI/SacI de pET21a foram então ligados para criar FR(1Fa)/pET21a. A seqüência de codificação FR(IFa) (SEQ ID NO: 55) codifica a proteína quimérica FR(IFa) (SEQ ID NO: 56). A proteína FR(IFa) compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos 10-468 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), e aminoácidos 470-649 de uma proteína CrylFa (SEQ ID NO: 76). Exemplo 31: Construção de FR(IAc)

Os Domínios I & Il de FR8a foram amplificados PCR de um plasmídeo compreendendo FR8a (SEQ ID NO: 1) utilizando iniciadores C2- 3A-3 (SEQ ID NO: 95) e 1Ac-OL-2 (SEQ ID NO: 116) e Mistura de reação 30 PCR 3 e Perfil termocíclico 3. O Domínio Ill de CryIAc (SEQ ID NO: 80) foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo crylAc (SEQ ID NO: 79) utilizando iniciadores 1Ac-OL-1 (SEQ ID NO: 117) e 1Ac-3'sac (SEQ ID NO: 118) e Mistura de reação PCR 3 e Perfil termocíclico 3.

Estes 2 produtos PCR resultantes foram utilizados como modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores C2-3A-3 (SEQ ID NO:

95) e 1Ac-3'sac (SEQ ID NO: 118) e as seguintes condições: Mist. 3 e perfil 5 termocíclico: 94°C - 30 segundos, 68°C - 30 segundos, 68°C - 30 segundos por 20 ciclos. O produto PCR sobreposto foi clonado em pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Um fragmento de BamHI/MIul de um plasmídeo compreendendo FR8a, o fragmento Mlul/Sacl do produto PCR sobreposto em pCR2.1 e um fragmento BamHI/SacI de pET21a foram ligados para criar FR(1Ac)/pET21a. 10 A proteína FR(IAc) compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos 10-468 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), e aminoácidos 477-608 de uma proteína CryIAc (SEQ ID NO: 80).

Exemplo 32: Construção de FR(IIa)

Um fragmento de nucleotídeo codificando os Domínios I e Il de FR8a foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo FR8a (SEQ ID NO: 3) utilizando iniciadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) e 1la-OL-2 (SEQ ID NO: 119) e Mistura de reação PCR 3 e Perfil termocíclico 3. Um segundo 20 fragmento nucleotídeo codificando o Domínio Ill de uma proteína Crylla (SEQ ID NO: 82) foi amplificada PCR de um plasmídeo compreendendo crylla (SEQ ID NO: 81) utilizando iniciadores Ha-OL-1 (SEQ ID NO: 120) e 1la-3'sac (SEQ ID NO: 121) e Mistura de reação PCR 3 e Perfil termocíclico 3. Estes dois produtos PCR foram utilizados como modelos em uma reação 25 PCR sobreposta com iniciadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) e 1 la-3'sac (SEQ ID NO: 121) e Mistura de reação PCR 3 e perfil termocíclico: 94°C - 30 segundos, 68°C - 45 segundos por 20 ciclos. O produto PCR sobreposto foi clonado em pCR2.1-TOPO (Invitrogen). O fragmento de BamHI/MIul de um plasmídeo compreendendo FR8a, o fragmento Mlul/Sacl do produto PCR 30 sobreposto em pCR2.1 e um fragmento BamHI/SacI de pET21a foram ligados para criar FR(1la)/pET21a. A proteína FR(IIa) compreende, do Ntermino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a sequência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), aminoácidos 10-468 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), e aminoácidos 513-719 de uma proteína Crylla (SEQ ID NO: 82).

Exemplo 33: Construção de Dm2-3A Parte da extremidade 5' desta seqüência de codificação foi am

plificada PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) e FR-1Ab-2 (SEQ ID NO: 122) e Mistura de reação PCR 3 e Perfil termocíclico 2. Um fragmento de nucleotídeo codificando o Domínio IN de CryIAb foi PCR amplificado de um 10 plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores FR1Ab-1 (SEQ ID NO: 123) e 1Ab-6-sac (SEQ ID NO: 86) e Mistura de reação PCR 3 e Perfil termocíclico 2. Estes dois produtos PCR foram utilizados como modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores C2-3A-3 (SEQ ID NO: 95) e 1Ab-6-sac (SEQ ID NO: 86) e Mistura de Reação PCR 3 15 e Perfil termocíclico 2. O amplicon resultante foi clonado em pCR2.1-TOPO (Invitrogen). FR8a BamHI/MIul, e o produto PCR acima em pCR2.1-TOPO AflllI, FR8a Afllll/Sacl foram ligados a pET21a BamHI/SacI. Toda a seqüência de codificação (BamHI/SacI) foi então movida para 1454. A proteína inseticida quimérica DM2-3A compreende, do N-termino ao C-termino, um frag20 mento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO : 127), aminoácidos 10-451 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende região variável 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 7 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 460-648 25 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 41 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6. Então, a DM2-3A eHIP foi uma junção cruzada entre Cry3A055 e CryIAb localizada no bloco conservado 3 seguindo seguindo imediatamente Ser451 que está a jusante 30 da junção do domínio Il e domínio III. A DM2-3A teve atividade inseticida contra o verme de raiz de milho ocidental, porém a atividade foi menor do que de a 8AF e FR8a eHIPs conforme apresentado na Tabela 5. Exemplo 34: Construção de T7-8AF.

Um fragmento de ácido nucleico codificando uma porção Nterminal de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70) foi amplificada PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e C3-3A-6 (SEQ ID NO: 84) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Um fragmento de ácido nucleico codificando uma porção Cterminal de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72) foi amplificada PCR de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores C3-1Ab-3 (SEQ ID NO: 85) e 1Ab-6-Sac (SEQ ID NO: 86) e Mistura de reação PCR 1 e Perfil termocíclico 1.

Os dois produtos PCR descritos acima foram depois utilizados como modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) e 1Ab-6-Sac (SEQ ID NO: 86) utilizando Mistura de reação PCR 2 e Perfil termocíclico 1.

O amplicon resultante foi ligado como um fragmento de extremidade inflexível a um vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) cortado com Smal para formar plasmídeo p8AF/CR2.1. Um fragmento BamHI-SacI de p8AF/CR2.1 foi então ligado a pET21a (EMD Biosciences, Inc., San Die20 go, CA), que foi cortado com BamHI-SacI, e transformado em E. coli. A estrutura de leitura aberta foi designada T7-8AF (SEQ ID NO: 144) e codifica a proteína híbrida T7-8AF (SEQ ID NO: 145). A proteína híbrida T7-8AF compreende, do N-termino ao C-termino, um fragmento de peptidila compreendendo a seqüência de aminoácido MASMTGGQQMGRGS (aminóaeidos 1- 25 14 de SEQ ID NO: 126), aminoácidos 1-468 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende região variável 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do 30 bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6; e 38 aminoácidos da região dorsal da protoxina CryIAb. A proteína híbrida T7-8AF teve pouca ou nenhuma atividade inseticida contra o verme de raiz de milho ocidental.

Exemplo 35: Construção de 8AF.

Um fragmento BamHI-SacI do plasmídeo p8AF/CR2.1 (Vide Exemplo 34) foi ligado a um plasmídeo contendo um promotor CryIAc constitutivo que foi modificado do descrito por Schnepf et al. (1985. J. Biol. Chem. 260:6264-6272) para corrigir um códon inicial ATG interno que existe no promotor de Schnepf et al. a um códon ATC1 que foi cortado com BamHISacl, e transformado em E. coli. A estrutura de leitura aberta foi designada 8AF (SEQ ID NO: 63) e codifica a 8AF eHIP (SEQ ID NO: 64). A 8AF eHIP é similar a FR8a eHIP, porém não contém o fragmento de peptidila N-terminal opcional. A 8AF eHIP compreende, do N-termino ao C-termino, 1-468 aminoácidos de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende região variável 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 24 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 477-648 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende os aminoácidos 24 C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6; e 38 aminoácidos da região dorsal de uma protoxina CryIAb. Então, a 8AF eHIP teve uma junção cruzada entre Cry3A055 e CryIAb Iocalizada no bloco conservado 3 imediatamente seguindo Leu468 do SEQ ID NO: 70 que é a jusante da junção do domínio Il e domínio III. A 8AF eHIP teve alta atividade contra o verme de raiz de milho ocidental.

Exemplo 36: Construção de -catG8AF.

Um constructo foi feito sem o sítio Catepsina G (Cat G) para de25 terminar se o sítio Cat G no domínio I da 8AF eHIP foi necessário para atividade contra o verme de raiz. Um fragmento 1359 pb BamHI/Sall de um plasmídeo compreendendo moCry3A (SEQ ID NO: 67) e um fragmento 3483 pb BamHI/Sall de um plasmídeo compreendendo 20L-8a (SEQ ID NO: 1) foram ligados para criar -catG8AF (SEQ ID NO: 146) que codifica -catG8AF 30 eHIP (SEQ ID NO: 147).

A -catG8AF eHIP foi muito activa contra o verme de raiz de milho ocidental demonstrando que o sítio de reconhecimento de protease Catepsina G na 8AF eHIP não é requerido para atividade inseticida.

Exemplo 37: Construção de 8AFdm3

A 8AF eHIP descrita no Exemplo 35 teve um ponto cruzado entre Cry3A055 e CryIAb localizado em CB3 a jusante da junção dos domínios 5 \\/\\\, resultando no domínio Ill da 8AF eHIP tendo uma pequena região Nterminal do domínio Ill de Cry3A055 e o remanescente do domínio Ill sendo seqüência de domínio Ill CryIAb. Para determinar se a pequena região Nterminal do domínio Ill de Cry3A055 era requerida para atividade inseticida em 8AF, outro constructo foi feito tendo o cruzamento entre Cry3A055 e 10 CryIAb localizado em CB3 exatamente na junção domínio ll-domínio III.

Um fragmento de ácido nucleico codificando porção do domínio I e domínio Il de Cry3A055 foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo FR8a (SEQ ID NO: 3) utilizando iniciadores CMS96 (SEQ ID NO: 138) e CMS97 (SEQ ID NO: 139) e Mistura de reação PCR 5 e Perfil termocíclico 5.

Um fragmento de ácido nucleico codificando o domínio Ill de moCrylAb foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores CMS98 (SEQ ID NO: 140) e CMS99 (SEQ ID NO: 141) e Mistura de reação PCR 5 e Perfil termocíclico 5.

Os dois amplicons resultantes foram utilizados como modelos

em uma reação PCR sobreposta com iniciadores CMS96 (SEQ ID NO: 138) e CMS98 (SEQ ID NO: 140) utilizando a Mistura de Reação PCR 5 e Perfil termocíclico 6. O amplicon resultante foi clonado em pCR4 Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA). Um fragmento 1633bp Stul/Sacl do amplicon clonado, desig25 nado pCR4Blunt-OLWrdm3, e um fragmento Stul/Sacl de 3089 pb de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) foram combinados para criar 8AFdm3 (SEQ ID NO: 148) que codifica a proteína híbrida 8AFdm3 (SEQ ID NO: 149).

A proteína híbrida 8AFdm3 compreende, do N-termino ao Ctermino, aminoácidos 1-454 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende os domínios I e II, que compreende a região variável 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 10 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 463- 610 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO: 72), que compreende todo o domínio III, compreendendo os 38 aminoácidos C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6.

Então, a proteína 8AFdm3 teve uma junção cruzada entre Cry3A055 e CryIAb imediatamente após Phe454 do SEQ ID NO: 70 que está na junção do domínio Il e domínio III. A proteína 8AFdm3 não teve atividade contra o verme de raiz de milho ocidental. Isto sugere que a região N10 terminal de aminoácido 24 de CB3 de Cry3A055 ou Cry3A, uma vez que possuem a mesma seqüência nesta região, são necessárias para a atividade de um 8AF eHIP.

Exemplo 38: Construção de 8AFIongdm3

Para determinar se a localização da junção cruzada em CB3 entre Cry3A ou Cry3A005 e CryIAb era crítica para atividade de verme de raiz, um constructo foi feita onde a junção cruzada foi posicionada em CB4 imediatamente após do aminoácido 519 de uma proteína Cry3A055.

Um primeiro fragmento de ácido nucleico codificando parte do domínio I e todo o domínio Il e parte do domínio Ill de Cry3A055 foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo cry3A055 (SEQ ID NO: 69) utilizando iniciadores CMS96 (SEQ ID NO: 138) e CMS101 (SEQ ID NO: 143) e Mistura de reação PCR 5 e Perfil termocíclico 5.

Um fragmento de ácido nucleico codificando parte do domínio Ill de CryIAb foi amplificado PCR de um plasmídeo compreendendo mocrylAb (SEQ ID NO: 71) utilizando iniciadores CMS98 (SEQ ID NO: 140) e CMS100 (SEQ ID NO: 142) e Mistura de reação PCR 5 e Perfil termocíclico 5.

Os dois amplicons resultantes foram utilizados como modelos em uma reação PCR sobreposta com iniciadores CMS96 (SEQ ID NO: 138) e CMS98 (SEQ ID NO: 140) utilizando a Mistura de Reação PCR 5 e Perfil 30 termocíclico 6. O amplicon resultante foi clonado em pCR4 Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA). Um fragmento Sall/Sacl de aproximadamente 460bp do amplicon clonado, designado pCR4Blunt-OL8AFIongdm3, e um fragmento Sall/Sacl de aproximadamente 4265bp de um plasmídeo compreendendo 8AFdm3 (SEQ ID NO: 147) foram combinados para criar 8AFIongdm3 (SEQ ID NO: 150) que codifica a proteína híbrida 8AFIongdm3 (SEQ ID NO: 151).

A proteína híbrida 8AFIongdm3 compreende, do N-termino ao C5 termino, aminoácidos 1-519 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende os domínios I e II, que compreende a região variável 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco conservado 2, região variável 3, bloco conservado 3, região variável 4 e os aminoácidos 6 N-terminal do bloco conservado 4, e aminoácidos 528-610 de uma proteína CryIAb (SEQ ID 10 NO: 72), que compreende uma região C-terminal do domínio III, compreendendo os aminoácidos 4 C-terminal do bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6.

Então, a proteína 8AFIongdm3 teve uma junção cruzada entre Cry3A055 e CryIAb no bloco conservado 4 imediatamente após Ile519 do 15 SEQ ID NO: 70. A proteína Cry híbrida 8AFIongdm3 não teve atividade contra o verme de raiz de milho ocidental. Isto sugere que uma região crítica para atividade de verme de raiz de milho de uma Cry3A-Cry1 A eHIP repousa em uma região entre aminoácidos correspondentes a aminoácido 6 de CB3 a aminoácido 7 de CB4.

Exemplo 39: Construção de cap8AFdm3

Um fragmento BamHI/Sall de aproximadamente 1363 pb de um plasmídeo compreendendo 8AFdm3 (SEQ ID NO: 148) e um fragmento BamHI/Sall de aproximadamente 3362bp de um plasmídeo compreendendo FR8a (SEQ ID NO: 3) foram ligados para criar cap8AFdm3 (SEQ ID NO: 152) que codifica a cap8AFdm3 eHIP (SEQ ID NO: 153).

A proteína cap8AFdm3 teve alguma atividade contra o verme de raiz de milho ocidental conforme indicado na Tabela 5. A única diferença entre a proteína híbrida 8AFdm3, que não foi inseticida, e a cap8AFdm3 eHIP é a presença de um fragmento de peptidila N-terminal (SEQ ID NO: 30 127). Então, adicionando um fragmento de peptidila a uma proteína Cry híbrida não-ativa criou uma proteína inseticida híbrida projetada ativa contra o verme de raiz. Exemplo 40: Construção de 8AFdm3T

Um fragmento Pmll/Sacl de aproximadamente 4654bp de um plasmídeo compreendendo 8AFdm3 (SEQ ID NO: 148) e um fragmento Pmll/SacI de aproximadamente 190bp de um plasmídeo compreendendo 5 FR8a (SEQ ID NO: 3) foram ligados para criar 8AFdm3T (SEQ ID NO: 154) que codifica 8AFdm3T eHIP (SEQ ID NO: 155). A 8AFdm3T eHIP compreende, do N-termino ao C-termino, aminoácidos 1-454 de uma proteína Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), que compreende os domínios I e II, que compreende a região variável 1, bloco conservado 1, região variável 2, bloco 10 conservado 2, região variável 3, e os aminoácidos 10 N-terminal do bloco conservado 3, e aminoácidos 463-610 de uma proteína CryIAb (SEQ ID NO:

72), que compreende todo o domínio III, compreendendo os 38 aminoácidos C-terminal do bloco conservado 3, região variável 4, bloco conservado 4, região variável 5, bloco conservado 5, e região variável 6; e 38 aminoácidos da região dorsal de uma protoxina Cryl Ab.

A única diferença entre a proteína híbrida 8AFdm3 e a 8AFdm3T eHIP é a adição de região dorsal de protoxina CryIAb de aminoácido 38 indicando que a adição de região dorsal de protoxina pode alterar uma proteína Cry híbrida não-ativa em uma eHIP ativa.

Exemplo 41: Construção de 8AFIongdm3T

Um fragmento Pmll/Sacl de aproximadamente 4693bp de um plasmídeo compreendendo 8AFIongdm3 (SEQ ID NO: 150) e um fragmento Pmll/Sacl de aproximadamente 190bp de um plasmídeo compreendendo FR8a (SEQ ID NO: 3) foram ligados para criar 8AFIongdm3T (SEQ ID NO: 156) que codifica a proteína Cry híbrida 8AFIongdmT (SEQ ID NO: 157).

A única diferença entre a proteína Cry híbrida 8AFIongdm3 e a proteína Cry híbrida 8AFIongdm3T, que não foi ativada contra o verme de raiz de milho ocidental, é a adição de uma região dorsal de protoxina CryIAb de aminoácido 38 indicando que a região de protoxina não foi por si só sufi30 ciente para conferir atividade inseticida à proteína Cry híbrida 8AFIongdm3. Isto indica que a combinação das regiões variáveis e blocos conservados em adição a uma região dorsal de protoxina e/ou um fragmento de peptidila Nterminal pode ser necessária para criar algumas eHIPs.

Exemplo 42: Construção de cap8AFdm3 T

Um fragmento Pmll/Sacl de aproximadamente 4693bp de um plasmídeo compreendendo cap8AFdm3 (SEQ ID NO: 152) e um fragmento Pmll/Sacl de aproximadamente 190bp de um plasmídeo compreendendo FR8A (SEQ ID NO: 3) foram ligados para criar cap8AFdm3T (SEQ ID NO: 158) que codifica a cap8AFdm3T eHIP (SEQ ID NO: 159).

A proteína cap8AFdm3T teve atividade aprimorada contra o verme de raiz de milho ocidental sobre a cap8AFdm3 eHIP conforme indica10 do na Tabela 5. A única diferença entre cap8AFdm3 eHIP, que teve alguma atividade inseticida contra o verme de raiz de milho, e a cap8AFdm3T eHIP é a presença da região dorsal de protoxina de aminoácido 38 de CryIAb. Então, algumas proteínas Cry híbridas podem ser ativadas pela adição de um fragmento de peptidila N-terminal a uma região dorsal de protoxina.

Exemplo 43: Teste de proteínas híbridas por atividade inseticida Verme de Raiz de Milho Ocidental

As proteínas híbridas geradas nos Exemplos descritos acima foram testadas por atividade inseticida contra o verme de raiz de milho ocidental em bioanálises laboratoriais. As bioanálises foram realizadas utilizan20 do um método de modalidade de dieta. Clones E. coli que expressam uma das proteínas que cresceram durante a noite. 500 μΙ de uma cultura noturna foram sonicados e o montante de proteína a ser testado foi determinado. A solução de proteína foi então misturada com 500 μΙ de dieta artificial fundida similar a aquela descrita em Marrone et al. (1985, J. of Economic Entomo25 Iogy 78:290-293). Depois que a dieta solidificou, ela foi depositada em um prato petri e 20 vermes de raiz de milho recém-nascidos foram posicionados na dieta. Os pratos petri foram mantidos em aproximadamente 30°C. A mortalidade foi registrada após 6 dias.

Os resultados das bioanálises são apresentados na Tabela 5. A coluna 1 indica os nomes das proteínas Cry híbridas, proteínas inseticidas híbridas projetadas e inseticidas projetadas quiméricas. A coluna 2 indica os níveis relativos de atividade de verme de raiz de milho ocidental ("-" = < 40% de mortalidade; "+" = 40-49% de mortalidade; "++" = 50- 59% de mortalidade; "+++" = 60-80% de mortalidade; e "++++" = >80% de mortalidade). A coluna 3 indica níveis relativos das proteínas apropriadas detectadas por Western blot. A coluna 4 indica a presença de fragmento de peptidila ("-" = 5 Sem fragmento de peptidila; #1 = SEQ ID NO: 126; #2 = SEQ ID NO: 127; #3 = SEQ ID NO: 128; #4 = SEQ ID NO: 129; #5 = SEQ ID NO: 130; #6 = SEQ ID NO: 131; #7 = SEQ ID NO: 132). As colunas 5-7 apresentam as combinações e arranjos das regiões variáveis (V1-V6), blocos conservados (C1-C5) e domínios associados (Domínio l-lll) de uma primeira proteína Cry 10 Bt ou proteína Cry modificada e uma segunda proteína Cry Bt diferente da primeira proteína Cry ou proteína Cry modificada que forma uma proteína híbrida central, que não é ativada contra verme de raiz de milho ocidental e eHIPs, que possui atividade contra verme de raiz de milho ocidental. A coluna 8 indica o número de aminoácidos na região dorsal de uma protoxina e 15 proteína Cry da qual a região dorsal é derivada ("1Ab-38" = 38 aminoácidos de região dorsal de uma protoxina; "1Ba-18" = 18 aminoácidos de região dorsal de uma protoxina Cryl Ba). Tabela 5: Resultados de bioanálises de verme de raiz de milho ocidental. Proteínas Acti- Pro¬ Frag¬ Domínio I Domínio Il Domínio Região testadas vida- teí¬ mento Ill de de nas de Pep¬ Protoxina CRW ex¬ tidila pres¬ sas V1 C1 V2 C2 V3 C3 V4 C4 V5 C5 V6 8AF ++++ ++ - 3A055 3A055 3A055 1Ab 1Ab-38 T7-8AF - + #7 3A055 3A055 3A055 1Ab 1 Ab-38 -CatG8AF ++++ ++ - 3A 3A 3A 1Ab 1Ab-38 8AFdm3 - + - 3A055 3A055 1Ab 8AFdm3T +++ ++ - 3A055 3A055 1Ab 1 Ab-38 8AFIongdm3 - + - 3A055 3A055 3A055 1Ab 8AFIongdm3 - + - 3A055 3A055 3A055 1Ab 1 Ab-38 T Cap8AFdm3 + + #2 3A055 3A055 1Ab Cap8AFdm3 ++ ++ #2 3A055 3A055 1Ab 1 Ab-38 T 20L-8a ++++ ++ #1 3A055 3A055 3A055 1Ab 1 Ab-38 FR8a +34 ++++ ++ #6 3A055 3A055 3A055 1Ab 1 Ab-38 FR8a ++++ ++ #2 3A055 3A055 3A055 1Ab 1 Ab-38 FRCG ++++ + + #2 3A 3A 3A 1Ab 1 Ab-38 Tabela 5: (continuação) Proteínas Acti- Pro¬ Frag¬ Domínio I Domínio Il Domínio Região testadas vida- teí¬ mento Ill de de nas de Pep¬ Protoxina CRW ex¬ tidila pres¬ sas < C3 0 O < j 01 s 8 sl έ < CO FR8a-9F +++ ++ #5 3A055 3A055 3A055 1Ab 1 Ab-38 FR8a-9F- ++++ ++ #5 3A 3A 3A 1Ab 1 Ab-38 catg FR8a-12aa ++++ ++ #3 3A055 3A055 3A055 1Ab 1 Ab-38 Cry3A055 ++++ ++ - 3A055 3A055 3A055 5*Cry3A055 - ++ #2 3A055 3A055 3A055 Wr-9mut - ++ #3 3A055 3A055 3A055 FRD3 ++++ ++ #2 3A055 3A055 3A055 1Ab FR-12-cg- ++ ++ #3 3A055 3A055 3A055 1Ab dm3 9F-cg-del6 - ++ #5 3A 3A 3A 1Ab 1 Ab-38 FR-cg-dm3 ++++ ++ #2 3A 3A 3A 1 Ab 9F-cg-dm3 ++++ ++ #5 3A 3A 3A 1Ab B8a - + - 3A055 3A055 3A055 1Ba 1Ba-18 5*B8a - + #2 3A055 3A055 3A055 1Ba 1Ba-18 Tabela 5: (continuação) Proteínas Acti- Pro¬ Frag¬ Domínio I Domínio Il Domínio Região testadas vida- teí¬ mento Ill de de nas de Pep¬ Protoxina CRW ex¬ tidila pres¬ sas V1 C1 V2 C2 V3 C3 V4 C4 V5 C5 V6 V3A ++ + - 3A055 I 1Ab 3A055 V4F - ++ - 3A055 3A055 1Ab 3A055 5*V4F ++ + #2 3A055 3A055 1Ab 3A055 20L-7 - ++ - 3A055 1Ab 1Ab 1Ab 1 Ab-38 5*20L-7 - + #2 3A055 1Ab 1 Ab 1Ab 1 Ab-38 20L-10 - + - 3A055 1Ab 1Ab 1 Ab-38 5*20L-10 +/- +/- #2 3A055 1Ab 1Ab 1 Ab-38 20L-12A - ++ - 1Ab 1Ab 3A 20L-13 - - - 3A055 1Ab 1 Ab 3A055 20L-20 - + - 3A 3A 3A 1Ab 1 Ab-38 V5&6 - ++ - 3A055 3A055 3A055 1Ab 1 Ab-38 5*V5&6 - ++ #2 3A055 3A055 3A055 1Ab 1 Ab-38 88A-dm3 - ++ #2 3A055 3A055 3A055 8Aa FR(IFa) - ++ #2 3A055 3A055 3A055 1Fa Tabela 5: (continuação) Proteínas Aeti- Pro¬ Frag¬ Domínio I Domínio Il Domínio Região testadas vida- teí¬ mento Ill de de nas de Pep¬ Protoxina CRW ex¬ tidila pres¬ sas V1 C1 V2 C2 V3 C3 CO > IO O £ O . > FR(IAc) - + #2 3A055 3A055 3A055 1Ac FR(IIa) - - #2 3A055 3A055 3A055 11a DM23A + + #2 3A055 3A055 3A055 1Ab 1 Ab-38 As proteínas inseticidas quiméricas, 20L-8a e FR8a, e a 20L12A eHIP, foram testadas contra diversas espécies de insetos para determinar o espectro de atividade. Os insetos testados incluíam verme de raiz de milho ocidental (WCR), verme de raiz de milho do norte (NCR), verme de 5 raiz de milho do sul (SCR), besouro de batata do Colorado (CPB), e broca de milho européia (ECB). Os resultados das análises são apresentados na Tabela 6. Um "+" indica atividade inseticida. Um indica sem atividade. As CIPs 20L-8a e FR8a foram ativadas contra WCR, NCR e CPB. A 20L-12A eHIP foi surpreendentemente ativada contra ECB.

Tabela 6: Espectro de atividades de CIPs.

Espectro de Atividade Proteína WCR NCR SCR CPB ECB 20L-8a + + - + FR8a + + - + 20L-12A - nt nt nt + Cry3A055 + + - + Cry 3 A - - - + CryIAb - - - - + Exemplo 44: Inserção de genes codificando eHIPs em plantas

Três genes codificando as proteínas inseticidas quiméricas

FR8a, FRCG e FRD3 foram selecionados para transformação em plantas de milho. Umum cassete de expressão compreendendo a seqüência de codifi

cação FR8a ou FRCG ou FRD3 foi transferida a um vetor adequado para transformação de milho mediada por Agrobacterium. Para este exemplo, os seguintes vetores foram utilizados nos experimentos de transformação: 12207 (figura 3), 12161 (figura 4), 12208 (figura 5), 12274 (figura 6), 12473 (figura 7) e 12474 (figura 8).

A transformação de embriões de milho imaturos foi realizada

essencialmente conforme descrito em Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803. Para este exemplo, todos os constituintes de meio foram essencialmente conforme descrito em Negrotto et ai, supra. Contudo, vários constituintes de meio conhecidos na técnica podem ser utilizados. Os genes utilizados para transformação foram clonados em um vetor adequado para transformação de milho. Os vetores utilizados neste exemplo contêm o gene fosfomanose isomerase (PMI) para seleção de linhas transgênicas (Negrotto et al., supra).

Resumidamente, a cepa Agrobacterium LBA4404 (pSB1) con

tendo um plasmídeo de transformação de planta foi cultivada em YEP (extrato de levedura (5 g/L), peptona (10g/L), NaCI (5g/L), 15g/l agar, pH 6,8) meio sólido por 2-4 dias a 28°C. Aproximadamente 0,8X 109 Agrobacterium foram suspensas em meio LS-inf suplementado com 100 μΜ As (Negrotto et al., supra). As bactérias foram pré-induzidas neste meio por 30-60 minutos.

Embriões imaturos de A188 ou outros genótipos adequados foram cortados de 8 -12 dias de idade em LS-inf + 100 μΜ As líquido. Os embriões foram lavados uma vez com meio de infecção fresco. Solução de Agrobacterium foi então adicionada e os embriões foram vertidos por 30 se15 gundos e deixados para assentar com a bactéria por 5 minutos. Os embriões foram então transferidos scutellum lateralmente para meio LSAs e cultivados no escuro por dois a três dias. Subsequentemente, entre 20 e 25 embriões por prato petri foram transferidos a meio LSDc suplementado com cefotaxima (250 mg/l) e nitrato de prata (1,6 mg/l) e cultivados no escuro a 28°C por 20 10 dias.

Os embriões imaturos, produzindo callus embriogênico foram transferidos para meio LSD1M0.5S. As culturas foram selecionadas neste meio por cerca de 6 semanas com um passo de subcultura em cerca de 3 semanas. Os calli sobreviventes foram transferidos para meio Regl suple25 mentado com mannose. Seguindo cultura na Iuz (regime de 16 horas de Iuz/ 8 horas no escuro), tecidos verdes foram transferidos a meio Reg2 sem reguladores de cultura e incubados por cerca de 1-2 semanas. As plantas foram transferidas para caixas Magenta GA-7 (Magenta Corp, Chicago III.) contendo meio Reg3 e cultivadas à luz. Após cerca de 2-3 semanas, as 30 plantas foram testadas pela presença de gene pmi e os genes FR8a ou FRCG por PCR. Plantas positivas da análise PCR foram transferidas para a estufa e testadas para resistência ao verme de raiz de milho. Exemplo 45: Análise de Plantas de Milho Transgênicas para Eficácia contra Vermes de Raiz de Milho: Bioanálise de Excisão de Raiz

Normalmente, as plantas de milho são amostradas conforme são transferidas das caixas Magenta GA-7 para o solo. Isto permite que as raí5 zes sejam amostradas a partir de um ambiente razoavelmente estéril para condições de solo. A amostragem consiste do corte de uma pequena parte da raiz (ca. 2-4 cm comp.) e posicioná-la em phytagar enriquecido (phytagar, 12 g., sacarose, 9 g., sais MS, 3 ml., vitaminas MS, 3 ml., Nistatina(25mg/ml), 3 ml., Cefotaxima (50mg/ml), 7 ml., Aureomicina (50 mg/ml), 7 10 ml., Estreptomicina (50mg/ml), 7 ml., dH20, 600 ml) em um pequeno prato petri. Controles negativos são plantas transgênicas que são negativas PCR para o gene FR8a ou FRCG do mesmo experimento de transformação, ou de plantas não-transgênicas (de um tamanho similar das plantas de teste) que estão sendo cultivadas em phytotron.

As raízes são também amostradas depois que as plantas te

nham crescido no solo. Se as amostras de raízes são do solo, os pedaços de raiz são lavados com água para remover resíduo de solo, mergulhadas em solução de Nistatina (5mg/ml), removidas do mergulho, secas com papel toalha e posicionadas em um prato phytagar conforme acima.

As amostras de raiz são inoculadas com vermes de raiz de milho

ocidental posicionando-se cerca das 10 primeiras larvas na superfície interna de um controle de cada prato phytagar e os controles são então suavemente soltos sobre o pedaço de raiz exposto. As larvas foram manejadas utilizando uma camada fina de tinta. Depois que todos os pratos foram inoculados, a 25 bandeja de pratos foi colocada no escuro a temperatura ambiente até a data da coleta.

Em cerca de 2-4 dias após a inoculação de raiz, os dados foram coletados. A mortalidade percentual das larvas foi calculada com classificação de dano visual das raízes. Danos de alimentação foram classificados 30 através da observação do número de orifícios de alimentação (FH) no pedaço de raiz causados pelas larvas de vermes de raiz e foram classificados como alto, moderado, baixo ou ausente e dado um valor numérico de categoria 3, 2 ou 1, respectivamente (com Categoria 1 incluindo classificações de dano de ausente e/ou baixo). As plantas de Categoria 1 tiveram normalmente O-FH a 2-FH; plantas de Categoria 2 tiveram 3 a 4-FH; e plantas de Categoria 3 tiveram >5-FH. As amostras de raiz tendo uma classificação de 5 dano na Categoria 1 foram consideradas excelentes, categoria 2: médias e categoria 3: pobres. As plantas de Categoria 1 foram selecionadas para maiores testes na estufa e em campo.

Os resultados na Tabela 7 mostram as plantas expressando uma das raízes protegidas FR8a e FRCG eHIPs de danos de alimentação 10 causados pelo verme de raiz de milho ocidental. A maioria dos eventos expressando a proteína inseticida quimérica foram considerados plantas de categoria 1, considerando que plantas de controle não expressaram uma proteína inseticida quimérica quando em categoria 3. As plantas expressando FRD3 eHIP forneceram níveis de controle comparáveis de verme de raiz 15 de milho ocidental.

Tabela 7: Eficácia de plantas transgênicas expressando FR8a e FRCG contra WCR.

Vetor Evento Classif. De Categoria Vetor Evento Classif. Cate¬ Dano (N0 FH) de Dano goria (N0 FH) 12161 1 1 1 12207 1 0 1 2 1 1 2 2 1 3 0 1 3 1 1 4 3 4 2 1 5 2 1 5 1 1 6 0 1 6 2 1 7 0 1 7 4 2 8 0 1 8 3 2 9 1 1 9 4 2 10 1 1 11 4 2 Controle 1 7 3 12 0 1 2 9 3 3 8 3 Controle 1 6 3 4 11 3 2 6 3 5 7 3 Vetor Evento Classif. De Categoria Vetor Evento Classif. Cate¬ Dano (N0 FH) de Dano goria (N0 FH) 3 6 3 6 12 3 4 18 3 12208 1 0 1 12274 1 3 2 2 0 1 2 0 1 3 3 2 3 3 2 4 4 2 4 3 2 5 1 1 5 0 1 6 4 2 6 3 2 7 0 1 7 3 2 8 4 2 8 0 1 9 4 2 9 3 2 10 1 1 10 3 2 11 1 1 11 0 1 12 1 1 13 0 1 Controle 1 10 3 2 10 3 Controle 1 10 3 3 10 3 2 5 3 4 7 3 3 7 3 5 8 3 4 7 3 6 6 3 5 8 3 6 8 3 Exemplo 46: Análise de Plantas de Milho Transgênicas para Eficácia no Campo contra Vermes de Raiz de Milho

Algumas plantas positivas identificadas utilizando a bioanálise de excisão de raiz descrita acima foram avaliadas no campo. Dezoito plantas de 5 cada evento foram removidas dos planos de campo e avaliadas por danos nas raízes. Os danos na raiz foram classificados utilizando a escala de dano de raiz linear de 0 a 3 do Estado de Iowa (Oleson, J.D. et ai, 2005. J. Econ Entomol. 98(1): 1-8), onde 0,00 = sem dano alimentar (menor classificação que pode ser dada); 1,00 = nenhum nódulo (círculo de raízes), ou o equiva10 lente de um nódulo inteiro, mordidas dentro de aproximadamente 1/4 polegadas do caule (linha de solo no 7o nódulo); 2,00 = dois nódulos completos mordidos; 3,00 = três ou mais nódulos mordidos (maior classificação que pode ser dada); e dano entre nódulos completos mordidos foi notado conforme o percentual do nódulo faltante, isto é, 1,50 = 1 1/2 nódulos mordidos, 0,25 = 1/4 de um nódulo mordido, etc.

Os resultados de exames de campo contra o verme de raiz de milho ocidental e do norte são apresentados na Tabela 8 e contra o verme de raiz de milho mexicano na Tabela 9. Todo o milho transgênico expressando a proteína inseticida quimérica FR8a teve desempenho melhor do que 10 um inseticida comercial padrão contra verme de raiz de milho ocidental, do norte e mexicano.

Tabela 8: Resultados de testes de campo de verme de raiz de milho ocidental e do norte.

Evento Plasmídeo Classificação de Raiz 1 12161 (ubi:FR8a) 0,08 2 12161 0,05 3 12161 0,09 4 12161 0,04 12274 (cmp:FR8a) 0,04 6 12274 0,08 7 12274 0,05 Químico 0,15 Verif. 0,87 Negativa Tabela 9: Resultados de testes de verme de raiz de milho mexicano.

Evento Plasmídeo Classificação de Raiz 1 12161 (ubi:FR8a) 0,04 12274 (cmp:FR8a) 0,22 6 12274 0,05 Químico 0,15 Verif. 1,04 Negativa 15

Claims (46)

1. Proteína inseticida híbrida projetada compreendendo ou brocas de milho européias de uma região /V-terminus a C-terminus, uma região N-terminal de uma primeira proteína Cry Bacillus thuringiensis (Bt) fundida a uma região C-terminal de uma segunda proteína Cry Bt diferente da primeira proteína Cry Bt1 em que pelo menos uma posição cruzada entre a primeira e a segunda proteínas Cry Bt está localizada no bloco conservado 2, bloco conservado 3, região variável 4 ou bloco conservado 4, e opcionalmente compreendendo: (a) uma região dorsal de protoxina de uma proteína Cry Bt localizada no Ctermino; ou (b) um fragmento de peptidila N-terminal; ou (c) ambos (a) e (b), em que a proteína inseticida híbrida projetada possui atividade contra o verme de raiz de milho ocidental ou brocas de milho européias.

2. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira proteína Cry Bt possui atividade contra um inseto coleopteran e a segunda proteína Cry Bt possui atividade contra um inseto Iepidopteran.

3. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 2, em que a primeira proteína Cry Bt é uma Cry3A ou Cry3A modificada e a segunda proteína Cry Bt é uma Cryl A.

4. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 3, em que a Cry3A é uma Cry3Aa ou CrySAa modificada é uma Cry3Aa modificada e a CryIA é uma CryIAa ou uma CryIAb.

5. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 4, em que a proteína inseticida híbrida projetada compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 80% da identidade do SEQ ID NO: 64.

6. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 15, em que: (a) a Cry3Aa compreende o SEQ ID NO:68 ou SEQ ID NO:135; ou (b) a Cry3Aa modificada compreende o SEQ ID N0:70, e em que o CryIAb compreende o SEQ ID NO:72.

7. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 compreendendo na região de C-terminal, uma região dorsal de protoxina de uma proteína Bt Cry.

8. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 7, em que a região dorsal de protoxina é de uma proteína Cry Bt que é ativada contra um inseto lepidopteran.

9. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 8, em que a região dorsal de protoxina é CrylA.

10. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 9, em que a CryIA é uma CryIAa ou uma CryIAb.

11. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 10, em que a região dorsal de protoxina CryIAb compreende pelo menos 38 aminoácidos.

12. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 11, em que a região dorsal de protoxina Cryl Ab: (a) compreende uma seqüência de aminoácido que corresponde aos aminoácidos 611-648 do SEQ ID NO:72; ou (b) compreende aminoácidos 611-648 do SEQ ID NO:72.

13. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, compreendendo no N-terminal, um fragmento de peptidila, em que o fragmento de peptidila compreende pelo menos 9 aminoácidos.

14. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 13, em que o fragmento de peptidila compreende a seqüência de aminoácido YDGRQQHRG (SEQ.ID N0: 132) ou TSNGRQCAGIRP (SEQ ID N0: 133).

15. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 14, em que o fragmento de peptidila é selecionado do grupo que consiste no SEQ.ID N°:126, SEQ.ID N°:127, SEQ.ID N°:128; SEQ.ID N0:129, SEQ.ID N°:130, SEQ.ID N°:131 e SEQ.ID N°:132.

16. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o fragmento de peptidila confere atividade inseticida, aumenta atividade inseticida ou estabiliza a proteína inseticida híbrida projetada em comparação com uma proteína inseticida híbrida projetada sem o fragmento de peptidila.

17. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 16, em que uma posição cruzada entre Cry3A e CryIA ou Cry3A e CryIA modificada está localizada no bloco conservado 3 imediatamente seguindo um aminoácido correspondente a Ser450, Phe454, ou Leu468 do SEQ ID NO: 70.

18. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 17, em que uma posição cruzada está localizada no bloco conservado 3 imediatamente seguindo Ser450, Phe454, ou Leu468 do SEQ ID NO: 70.

19. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, compreendendo pelo menos duas posições cruzadas entre uma seqüência de aminoácido a partir da primeira proteína Cry Bt e uma seqüência de aminoácido a partir da segunda proteína Cry Bt.

20. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 19, em que (a) a primeira posição cruzada está localizada no bloco conservador 2 e a segunda posição cruzada estar localizada no bloco conservador 3; ou (b) a primeira posição cruzada está localizada no bloco conservador 3 e a segunda posição cruzada está localizada no bloco conservador 4.

21. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 20, em que (a) a primeira posição cruzada entre Cry3A e CryIA ou Cry3A e CryIA modificada está localizada no bloco conservador 2, imediatamente seguido por um aminoácido correspondendo a Asp232 do SEQ ID N0: 70 e a segunda posição cruzada entre CryIA e Cry3A ou CryIA e Cry3A modificada está localizada no bloco conservador 3, imediatamente a seguir a um aminoácido que corresponde a Leu 476 do SEQ ID N0: 72; ou (b) a primeira posição cruzada entre Cry3A e CryIA ou Cry3A e CryIA modificada está localizada no bloco conservador 3, imediatamente seguida de um aminoácido correspondente a Leu468 do SEQ ID N0: 70 e a segunda posição cruzada entre CryIA e Cry3A ou CryIA e Cry3A modificada está localizada no bloco conservador 4 imediatamente seguindo um aminoácido correspondente a Ile527 do SEQ ID N°: 72.

22. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com a reivindicação 21, em que (a) a primeira posição cruzada entre Cry3Aa e CryIAb ou Cry3Aa e CryIAb modificada está localizada no bloco conservador 2, imediatamente seguido por Asp232 do SEQ ID N0: 70 e a segunda posição cruzada entre CryIAb e Cry3Aa ou CryIAb e Cry3Aa modificada está localizada no bloco conservador 3, imediatamente seguindo Leu 476 do SEQ ID N0: 72; ou (b) a primeira posição cruzada entre Cry3Aa e CryIAb ou Cry3Aa e CryIAb modificada está localizada no bloco conservador 3, imediatamente seguindo Leu468 do SEQ ID N0: 70 e a segunda posição cruzada entre CryIAb e Cry3Aa ou CryIAb e Cry3Aa modificada está Iocalizada no bloco conservador 4 imediatamente seguindo Ile527 do SEQ ID N0: 72.

23. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionados do grupo consistindo no SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 153 e SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 159; SEQ ID NO: 160.

24. Proteína inseticida híbrida projetada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, em que a proteína inseticida é ativada contra o verme de raiz de milho do norte ou o verme de raiz de milho mexicano.

25. Molécula de ácido nucleico codificando uma proteína inseticida híbrida projetada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.

26. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 24, compreendendo uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo no SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154 e SEQ ID NO: 158.

27. Expressão cassete compreendendo uma seqüência promotora hetoróloga ligada operacionalmente a uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 25 ou 26.

28. Vetor recombinante compreendendo uma expressão cassete como definido na reivindicação 27.

29. Célula hospedeira transgênica compreendendo uma expressão cassete como definido na reivindicação 27.

30. Célula hospedeira transgênica de acordo com a reivindicação 29, a qual é uma célula bacteriana.

31. Célula hospedeira transgênica de acordo com a reivindicação 29, ou o qual é uma célula de planta.

32. Planta transgênica compreendendo a célula de planta transgênica como definida na reivindicação 31.

33. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 32, em que a planta é uma planta de milho.

34. Semente transgênica da planta transgênica como definida na reivindicação 32 ou 33.

35. Composição inseticida compreendendo uma proteína inseticida como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.

36. Método de produção de uma proteína inseticida híbrida projetada que é ativada contra insetos, compreendendo: (a) obtenção da célula hospedeira transgênica como definida na reivindicação 29; e (b) cultivo da célula hospedeira transgênica sob condições que permitam que o hospedeiro expresse uma proteína inseticida híbrida projetada que seja ativada contra insetos.

37. Método de produção de uma planta transgênica resistente a insetos, compreendendo a introdução de uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 25 ou 26 numa planta, assim produzindo uma planta transgênica, em que uma proteína inseticida híbrida projetada é expressa na planta transgênica em uma quantidade de efetiva para controlar insetos.

38. Método de controle de insetos, compreendendo a administração a tais insetos de uma quantidade eficaz de uma toxina inseticida como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.

39. Método de produção de uma proteína inseticida híbrida projetada (eHIP) como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de compreendendo: (a) obtenção de uma primeira proteína (Bt) Cry Bacillus thuringiensis ou proteína Bt Cry modificada; (b) obtenção de uma segunda proteína Cry Bt que seja diferente da primeira proteína Cry Bt ou proteína Cry modificada; (c) fusão numa direcção N-termino a C-termino, uma região N-terminal da primeira proteína Cry Bt fundida numa região C-terminal da segunda proteína Cry Bt1 em que pelo menos uma posição cruzada entre a primeira e segunda proteína Cry Bt está localizada no bloco conservador 2, bloco conservador 3, região variável 4 ou bloco conservador 4 para fazer com que uma eHIP tenha atividade contra pelo menos o verme de raiz de milho ocidental; e opcionalmente (d) inserção de um fragmento de peptidila em um N-termino ou uma região dorsal de protoxina C-termino de uma proteína Cry Bt, ou ambas, em que o fragmento de peptidila ou a região de protoxina ou ambos conferem atividade sob a eHIP, ou aumentam a atividade inseticida da eHIP ou fazem da eHIP mais estável do que uma eHIP sem o fragmento de peptidila ou região dorsal de protoxina ou ambos.

40. Método de produção de uma proteína inseticida híbrida projetada (eHIP) como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, compreendendo: (a) obtenção de um primeiro ácido nucleico codificando uma primeira proteína (Bt) Cry Bacillus thuringiensis ou proteína Cry Bt modificada e um segundo ácido nucleico codificando uma segunda proteína Cry Bt diferente da primeira proteína Cry Bt ou proteína Cry Bt modificada; (b) isolamento de tais primeiro e segundo ácidos nucleicos, uma seqüência de nucleotídeo que codifique regiões variáveis e blocos conservados completos ou parciais de tal primeira proteína Cry Bt ou proteína Cry Bt modificada e tal segunda proteína Cry Bt; (c) conexão dos ácidos nucleicos isolados resultantes da etapa (b) de tal forma a fazer um novo ácido nucleico híbrido que codifique uma proteína, e opcionalmente fundindo-se a uma extremidade 5' de tal ácido nucleico híbrido um ácido nucleico que codifique um fragmento de peptidila resultando em uma extensão 5' ou fusão a uma extremidade 3’ de tal ácido nucleico híbrido um ácido nucleico que codifique uma região dorsal de protoxina de uma proteína Cry Bt resultando em uma extensão 3', ou ambos; (d) inserção de ácido nucleico híbrido com ou sem uma ou ambas das extensões 5' ou 3' em um cassete de expressão; (e) transformação de um cassete expressão em uma célula hospedeira, resultando em tal célula hospedeira produzindo uma eHIP.

41. Método de acordo com a reivindicação 39 ou 40, em que a primeira proteína Cry Bt ou proteína Cry Bt modificada é uma Cry3A ou Cry3A modificada e a segunda proteína Cry Bt é uma CryIAa ou CryIAb.

42. Método de acordo com a reivindicação 39 ou 41, em que o fragmento de peptidila compreende pelo menos 9 aminoácidos.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, em que o fragmento de peptidila é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132 e SEQ ID NO: 133.

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 43, em que a região dorsal de protoxina é de uma proteína CryIAa ou CryIAb.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, em que tal região dorsal de protoxina compreende pelo menos 38 aminoácidos.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, em que a região dorsal de protoxina: (a) compreende uma seqüência de aminoácido que corresponde a aminoácidos 611-648 do SEQ ID NO: 72; ou (b) compreende aminoácidos 611-648 da SEQ ID N0 72.