BRPI0809634A2 - COMPOSIÇÃO-VEÍCULO PARA TRANSFERêNCIA RÁPIDA DE ÁCIDOS NUCLEICOS - Google Patents
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO-VEÍCULO PARA TRANSFERÊNCIA RÁPIDA DE ÁCIDOS NUCLEICOS".
CAMPO TÉCNICO
A presente invenção refere-se a uma composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos que pode transferir eficientemente um ácido nucleico para células quando um ácido nucleico é administrado a células derivadas de animais ou organismos, e que também apresenta baixa toxicidade e alta segurança; e a uma composição para transferência de ácidos nucleicos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Vários tipos de ácidos nucleicos que exercem funções fisiologicamente
ativas em células foram descobertos por meio de estudos recentes em biotecnologia. Por exemplo, sabe-se que RNA de pequena interferência (siRNA) induz degradação de mRNA de um gene-alvo existente em células e inibe expressão do gene-alvo (interferência de RNA). A função inibidora contra expressão de gene-alvo 15 devido à interferência de RNA é útil para mitigação ou tratamento de sintomas de doença causada por expressão irregular de genes particulares ou grupos de genes, e espera-se desenvolvimento de agentes terapêuticos mediante uso de siRNA. Para utilizar ácidos nucleicos, incluindo siRNA como agentes terapêuticos, é importante que siRNA funcione na célula-alvo, e, portanto, é essencial estabelecer técni20 cas eficientes de transferência dos ácidos nucleicos para células-alvo.
Uso de um veículo (vetor) é conhecido como uma técnica de transferência de moléculas ou genes exógenos de ácidos nucleicos para células. Vetores incluem vetores viróticos e vetores não-viróticos. Vetores viróticos apresentam alta eficiência de transferência de genes; entretanto, há vários aspectos de segurança 25 desconhecidos que incluem patogenicidade, imunogenicidade e citotoxicidade. Portanto, desenvolvimento de vetores não-viróticos mais seguros é esperado.
Como veículo de transferência de ácidos nucleicos não-virótico que promove transferência de um ácido nucleico, tal como siRNA, para células, por exemplo, um lipídio catiônico com estrutura específica encontra-se relatado no Do30 cumento de Patente 1. No entanto, o lipídio catiônico relatado no Documento de Patente 1 apresenta uma desvantagem que é mostrar toxicidade quando administrado a células cultivadas ou organismos vivos. Também, o Documento de Patente 2 descreve uma composição que contém um composto anfifílico e um policátion como composição-veículo que apresenta toxicidade comparativamente baixa e pode transferir siRNA para células. Contudo, a composição relatada no Documento de Patente 2 também apresenta um problema de segurança, uma vez que sua ci5 totoxicidade não se toma desprezível quando uma quantidade suficiente de siRNA é introduzida em células.
À Iuz do estado da técnica, deseja-se desenvolvimento de uma composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos que apresenta baixa toxicidade e pode eficientemente transferir um ácido nucleico, tal como siRNA, para células.
Documento de Patente 1 - Publicação de Patente Japanesa Não-examinada N0 2002-529439
Documento de Patente 2 - Publicação de Patente Japanesa Não-examinada N0 2005-508394 DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Problema Técnico
Assim, um objetivo da presente invenção é resolver os problemas acima do estado da técnica. Especificamente, um objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos que 20 pode transferir eficientemente ácido nucleico para células quando um ácido nucleico tal como siRNA é administrado a células derivadas de animais ou animais, e que também apresenta baixa toxicidade e alta segurança; e uma composição para transferência de ácidos nucleicos que contém a composição-veículo e ácido nucleico. Também, outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para 25 introdução de um ácido nucleico em células, que pode transferir eficientemente o ácido nucleico para células com alta segurança.
Meio de Resolver o Problema
Os presentes inventores estudaram intensivamente de modo a atingir o objetivo acima e verificaram que uma composição que contém (A) uma diacilfosfatidilcolina, (B) colesterol e/ou um derivado deste, e (C) uma amina primária alifática apresenta baixa toxicidade e alta segurança, pode transferir eficientemente um ácido nucleico para células, e é, portanto, útil como veículo para transferência de ácidos nucleicos. Os presentes inventores também verificaram que é possível proporcionar segurança e propriedades de introdução de ácidos nucleicos mais excelentes usando uma composição que contém os componentes (A) a (C) após produção em forma lipossômica. A presente invenção foi completada realizando aperfeiçoamento adicional com base nessas verificações.
A saber, a presente invenção proporciona as modalidades seguintes. Item 1. Uma composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos, compreendendo (A) uma diacilfosfatidilcolina, (B) pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em colesterol e derivados deste, e (C) uma amina primária alifática.
Item 2. A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos de acordo com o Item 1, na qual o componente (A) é uma diacilfosfatidilcolina cuja porção grupo acila apresenta 4 a 23 átomos de carbono.
Item 3. A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos de acordo com o Item 1 ou 2, na qual o componente (B) é colesterol.
Item 4. A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos de acordo com o Item 1, na qual o componente (C) é uma alquilamina que apresenta 10 a 20 átomos de carbono.
Item 5. A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos de acordo com o Item 1, na qual o componente (A) é pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e diestearoilfosfatidilcolina; o componente (B) é colesterol; e o componente (C) é estearilamina.
Item 6. A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos de acordo com o Item 1, na qual a razão molar de componente (A):componente (B):componente (C) é 5-9:1-5:1.
Item 7. A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos de acordo com o Item 1, que é um veículo para transferência de siRNA.
Item 8. A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos de acordo com o Item 1, que é uma preparação de Iipossomos em que uma membrana lipossômica é formada dos componentes (A) to (C).
Item 9. Uma composição para transferência de ácidos nucleicos, compreendendo um ácido nucleico e a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos do Item 1.
Item 10. A composição para transferência de ácidos nucleicos de acordo com o Item 9, na qual o ácido nucleico é siRNA.
Item 11. A composição para transferência de ácidos nucleicos de a
cordo com o Item 9, que é uma preparação de lipossomos.
Item 12. Um método para introdução de um ácido nucleico, método este que compreende a etapa de introduzir o ácido nucleico em células levando a composição para transferência de ácidos nucleicos do Item 9 a contato com as células.
Item 13. Um método para introdução de um ácido nucleico de acordo com o Item 12, no qual as células são células cultivadas, células separadas de organismos vivos ou células que existem em organismos vivos.
Item 14. Uso de uma composição que compreende (A) uma diacilfosfatidilcolina, (B) pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em colesterol e derivados deste e (C) uma amina primária alifática, na produção de um veículo para transferência de ácido nucleico.
Item 15. Uso de acordo com o Item 14, no qual o veículo é usado para transferência de siRNA.
EFEITOS DA INVENÇÃO
A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos e a composição para transferência de ácidos nucleicos da invenção apresentam a vantagem de que elas podem transferir eficazmente um ácido nucleico para células, exercendo desse modo uma função útil do ácido nucleico em células, e também 25 apresentam baixa toxicidade e alta segurança. Portanto, a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos e a composição para transferência de ácidos nucleicos são úteis para tratamento de várias doenças por meio de introdução de um ácido nucleico, particularmente tratamento de doenças intratáveis que são difíceis de ser tratadas por um composto de baixo peso molecular.
A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos e a
composição para transferência de ácidos nucleicos da invenção são particularmente preferidas para introduzir siRNA em células, uma vez que indução de expressão de interferon, que é uma reação adversa de siRNA, pode ser suprimida eficazmente.
Adicionalmente, a composição para transferência de ácidos nucleicos da invenção também apresenta a vantagem de que a composição pode ser armazenada em estado seco por congelamento, uma vez que ela pode ser submetida a um tratamento de secagem por congelamento.
BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra os resultados do Exemplo de Teste 1, isto é, os resultados da avaliação de uma composição para transferência de ácidos nucleicos sob segurança para células.
A Figura 2 mostra os resultados da avaliação de introdução de siRNA em células mediada por meio de cada composição para transferência de ácidos nucleicos no Exemplo de Teste 2. A ordenada na Figura 2 indica a intensidade média de fluorescência por célula.
A Figura 3 mostra os resultados da avaliação de introdução de siRNA
em células quando a concentração dos lipídios constituintes (DSPC, colesterol e estearilamina) do veículo para transferência de ácidos nucleicos é mudada em uma composição para transferência de ácidos nucleicos no Exemplo de Teste 2.
A Figura 4 mostra os resultados da avaliação da inibição de indução de interferon por uma composição para transferência de ácidos nucleicos que contém siRNA no Exemplo de Teste 3.
MODALIDADE PREFERIDA PARA REALIZAR A INVENÇÃO
A presente invenção será agora descrita em detalhes.
Veículo para Transferência de Ácidos Nucleicos A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da in
venção compreende (A) uma diacilfosfatidilcolina, (B) colesterol e/ou um derivado deste, e (C) uma amina primária alifática.
A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da invenção é usada como veículo para transferência (introdução) de ácidos nucleicos para células.
O tipo e estrutura do ácido nucleico a que a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da presente invenção é aplicada não são limitados, contanto que satisfaçam a exigência da transferência para células. Exemplos específicos desses ácidos nucleicos incluem siRNA, mRNA, tRNA, rRNA, cDNA, miRNA (microRNA), ribozima, oligodesoxinucleotídeo antissenso, decoioligonucleotídeo, DNA de plasmídeo, ácido nucleico peptídico, oligonucleotídeo formador de 5 tripla hélice (TFO)1 aptâmero e genes. Particularmente, a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da invenção apresenta a característica útil de inibir indução de expressão de interferon, que é uma reação adversa de siRNA, e, assim, ela é útil para transferir siRNA para células. Ácidos nucleicos aos quais é aplicada a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da invenção poderão 10 ser derivados de seres humanos, animais, plantas, bactérias e vírus, e, também, poderão ser produzidos por meio de síntese química. Adicionalmente, esses ácidos nucleicos podem ser fitas simples, duplas ou triplas, e seu peso molecular não é especificamente limitado. Também, ácidos nucleicos podem ser modificados com compostos químicos, enzimas ou peptídeos. Na invenção, esses ácidos nucleicos 15 poderão ser usados isoladamente, ou duas ou mais espécies dos mesmos poderão ser usadas em combinação.
Diacilfosfatidilcolina (daqui por diante, referida como "componente (A)") usada na composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da invenção não é especificamente limitada, contanto que seja farmacologicamente aceitável, e 20 exemplos de diacilfosfatidilcolina incluem uma diacilfosfatidilcolina cuja porção grupo acila apresenta 4 a 23 átomos de carbono. O número de átomos de carbono de dois grupos acila que constituem a diacilfosfatidilcolina poderá ser o mesmo ou diferente.
Exemplos específicos da diacilfosfatidilcolina usada na presente in25 venção incluem dilauroilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoiIfosfatidiIcolina, diestearoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, dilinoleoilfosfatidilcolina, miristoilpalmitoilfosfatidilcolina, miristoilestearoilfosfatidilcolina, palmitoilestearoilfosfatidilcolina, dibutiloiIfosfatidiIcolina, diexanoilfosfatidilcolina, dieptanoilfosfatidilcolina, didecanoilfosfatidilcolina, diftanoilfosfatidilcolina, didodecilfosfatidilcolina, dieicose30 noilfosfatidilcolina, dienicosanoilfosfatidilcolina, dierucoilfosfatidilcolina, diaraquidonoilfosfatidilcolina e bis(tricosadinoil)fosfatidilcolina. Dessas diacilfosfatidilcolinas, uma diacilfosfatidilcolina cuja porção grupo acila apresenta 12 a 18 átomos de carbono é preferível; uma diadlfosfatidilcolina cuja porção grupo adia apresenta 13 a 17 átomos de carbono, tais como dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, mirístoiIpalmitoilfosfatidiicolina, miristoilestearoilfosfatidilcoIina e palmitoilestearoilfosfatidilcolina, é mais preferível; dimiristoilfosfatidilcolina, di5 palmitoilfosfatidilcolina e diestearoilfosfatidilcolina são particularmente preferíveis; e diestearoilfosfatidilcolina é ainda mais preferível. Essas diadlfosfatidilcolinas poderão ser usadas isoladamente, ou duas ou mais espécies das mesmas poderão ser usadas em combinação.
Colesterol e/ou um derivado deste (daqui por diante referido às vezes como "componente (B)") usado na composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da presente invenção não é especificamente limitado, contanto que seja farmacologicamente aceitável. O derivado de colesterol é um lipídio catiônico que apresenta um esqueleto de colesterol, e exemplos específicos do mesmo incluem 3(-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-caibamoil]colesterol (DC-Col), iodeto 3(-[N', N',N’-trimetilaminoetano]colesterol (TC-Col), bis(guanídio)-tren-colesterose (BGTC), N-colesteriloxicarbonil-3,7-diazanonano-1,9-diamina, (alanino-dietanolamino-colesterol, carbamato de N4-espermino colesterila (GL-67), carbamato de N[N4-3-aminopropilspermidino]colesterila (GL-78), carboxamida de N4-espermine colesterila (GL-90), carbamato de N1,N8-bis(carboxamida argíninca)-N4-espermidino colesterila e carbamato de N-[N1 ,N4,N8-tris(3-aminopropil)espermidino]colesterila (GL-96). Na invenção, o componente (B) é preferencialmente colesterol. Na invenção, como componente (B), colesterol e derivados deste poderão ser usados isoladamente, ou duas ou mais espécies dos mesmos poderão ser usadas em combinação.
A amina primária alifática (daqui por diante referida às vezes como "componente (C)") usada na composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da invenção não é especificamente limitada, contanto que seja farmacologicamente aceitável, e exemplos da mesma induem uma alquilamina cuja porção grupo alquila apresenta 10 a 20 átomos de carbono.
Exemplos específicos da amina primária alifática usada na presente invenção incluem laurilamina, miristilamina, palmitilamina, estearilamina, oleilamina, decanoilamina e ftanoilamina. Dessas aminas primárias alifáticas, uma alquilamina cuja porção grupo alquila apresenta 12 a 18 átomos de carbono é preferível; estearilamina, oleilamina e palmitoilamina são mais preferíveis; e estearilamina é particularmente preferível. Essas diaminas primárias alifàticas poderão ser usadas isoldamente, ou duas ou mais espécies das mesmas poderão ser usadas em combinação.
5 A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da pre
sente invenção poderá conter uma combinação dos componentes (A) a (C). Em vista do aumento adicional de eficiência de transferência de ácido nucleico para células e da baixa toxicidade mediante emprego das combinações seguintes, uma combinação de (A) uma diacilfosfatidilcolina cuja porção grupo acila apresenta 4 a 10 23 átomos de carbono, (B) colesterol e/ou um derivado deste e (C) uma alquilamina que apresenta 10 a 20 átomos de carbono é preferível, e uma combinação de (A) dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e/ou diestearoilfosfatidilcolina, (B) colesterol e (C) estearilamina é mais preferível.
Na composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da 15 presente invenção, a razão dos componentes (A) a (C) não é especificamente limitada. Por exemplo, a razão molar componente (A):componente (B):componente (C) é 5-9:1-5:1, preferencialmente 6-9:1-4:1 e mais preferencialmente 7-8:2-3:1. Eficiência de transferência de um ácido nucleico para células e baixa toxicidade podem ser adicionalmente elevadas por satisfação da razão molar.
A quantidade total dos componentes (A) a (C) com base na quantida
de total da composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da presente invenção é, por exemplo, de 1 a 100% em peso, preferencialmente de 20 a 90% em peso, e mais preferencialmente de 30 a 70% em peso.
A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da pre25 sente invenção poderá conter, além dos componentes (A) a (C), outros lipídios catiônicos. Exemplos específicos dos lipídios catiônicos incluem lipídios catiônicos ligados a um esteroide, tais como esqualamina, 3a,7a,12a-tris(3-aminopropóxi)-5p-colano-24-(N,N-bis(3-aminopropil)amina, 3a,7a, 12a-tris(3-aminopropóxi)-5p-colano-24-(N-(N-(3-aminopropil))-3-aminopropil)-amina), 3a,7a, 12a-tris(3-azi30 dopropóxi)-5p-colano-24-(N,N-bis(2-cianoetil)amina), e 3a,7a,12a-tris(3-azidopropóxi)-5p-colano-24-(N-(benziloxicarbonil)-N-(3-hidroxipropil)-amina)); lipídios catiônicos ligados a ácido cólico, tais como conjugados água-viva-espermina; lipídios catiônicos ligados à esterolglicosídeo; lipídios catiônicos ligados a esteroidossaponina; e lipídios catiônicos do tipo amônio quaternário tais como brometo de dimetildioctadecilamônio (DDAB), 1,2-dimiristoil-3-trimetilamoniopropano, 1,2-dioleoil-3-trimetilamoniopropano (DOTAP)1 sulfato de 1,2-dioleoil-3-trimetilamoniopropanometila, 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamoniopropano, 1,2-distearoil-3-trimetilamoniopropano, cloridreto de N-(1-(2,3-bis(oleoilóxi)propil)-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), brometo de dimiristoiloxipropildimetilidroxietilamônio (DMRIE), brometo de dioleoiIoxipropildimetiIidroxietilamônio (DORIE), brometo de dimetildidodecilamônio, cloridreto de N-(a-trimetilamonioacetil)-didodecil-D-glutamina, cloridreto de N-(a-trimetilamonioacetil)-0,0'-bis-(1H,1H,2H,2H-perfluordecil)-L-glutamina, cloridreto de 0,0'-didodecanoil-N-(a-trimetilamonioacetil)dietanolamina, brometo de metilalildidodecilamônio, cloridreto de N-{p-(w-trimetilamôniobutilóxi)-benzoil}-didodecil-L-glutamina, brometo de 9-(w-trimetilamôniobutil)-3,6-bis(dodecanoil)carbazol, cloridreto de dimetildioctadecilamônio, brometo de N-w-trimetilamôniodecanoil-diexadecil-D-glutamina, brometo de N-{p-(w-trimetilamôniohexilóxi)-benzoil}-ditetradecil-L-glutamina, brometo de p-(w-trimetilamôniodecilóxi)-p'-octiloxiazobenzeno (MC-1-0810), p-{w-(b-hidroxietil)dimetil-amônio-decilóxi}-p'-octiloxiazobenzeno brometo (MC-3-0810), 0,0', 0"-tridodecanoil-N-(w-trimetil-amôniodecanoil)-tris(hidroximetil)aminometano brometo, (TC-1-12), 1,2-dilauril-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dimiristoil-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dipalmitoil-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-distearoil-glicero-3-etilfosfocolina,
1,2-dioleoil-glicero-3-etilfosfocolina e 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-€tilfosfocolina.
Na invenção, quando lipídios catiônicos diferentes dos componentes
(A) a (C) estão contidos na composição, a proporção dos lipídios catiônicos não é especificamente limitada, contanto que os efeitos da invenção não sejam adversa25 mente afetados. A proporção dos lipídios catiônicos é de 1 a 10 partes em peso, preferencialmente de 2 a 8 partes em peso, e mais preferencialmente de 4 a 6 partes em peso, por 100 partes em peso da quantidade total dos componentes (A) a (C).
Adicionalmente, a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da invenção poderá conter uma base oleosa, se necessário. Ao incluir uma base oleosa e usar suas características, toma-se possível controlar a eficiência do ácido nucleico a ser introduzido pela composição-veículo para transferência. Por exemplo, ajuste da densidade da composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos mediante inclusão da base oleosa controla contato entre o ácido nucleico e a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos e permite aperfeiçoamento de eficiência de introdução in vitro. Adicionalmente, por exemplo, inclu5 indo como base oleosa um composto com função sensível à temperatura, flutuação na superfície de uma célula pode ser induzida devido a ruptura do núcleo de uma composição-veículo de ácido nucleico sob uma dada condição de temperatura; desse modo, toma-se possível aperfeiçoamento de eficiência de introdução de ácido nucleico. Adicionalmente, por exemplo, incluindo como base oleosa um com10 posto com propriedade de ruptura por estimulação externa, flutuação na superfície da célula pode ser induzida devido à ruptura do núcleo de uma composição-veículo de ácido nucleico causada por estimulação externa; desse modo, toma-se possível aperfeiçoamento de eficiência de introdução de ácido nucleico.
Exemplos da base oleosa incluída na composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da presente invenção incluem perfluorcarbono, perfluorpentano, brometo de perfluoroctila, perfluorexano, perfluortributilamina, óleo de soja, óleo de soja refinado, óleo de soja endurecido, óleo de soja não-saponificado, esqualeno, óleo de rícino, óleo de cravo, trioleato de sorbitano, óleo de terebintina, óleo de açafroa, ácido graxo de óleo de açafroa, ácido oleico, óleo de coco, óleo de colza, óleo fúsel, óleo de oliva, óleo de linhaça, óleo de sésamo, óleo de clorofila, óleo de cróton, óleo de bergamota, óleo de cedro, óleo de laranja, óleo de füncho, óleo de eucalipto, óleo de milho, óleo de lavanda, óleo de manjerona, óleo de limão, óleo de caroço de algodão, óleo de gema de ovo, óleo de rosas, óleo de pinho, óleo de amêndoas, óleo de amendoim, óleo de camélia, óleo branco de cânfora, óleo de camomila, óleo de canela, óleo de hortelã-pimenta, óleo de milho esterificado, óleo de pão, óleo de Anthemis nobilis, óleo de cobra, óleo de hortelã, óleo de girassol, manteiga de cacau, óleo de germe de trigo, óleo de óxido de zinco, óleo endurecido, óleo vegetal hidrogenado, parafina líquida leve, parafina líquida, triglicerídeo de ácido graxo de cadeia média, óleo de vison, óleo de casca de laranja, polioxietileno óleo de rícino, polioxietileno óleo de rícino endurecido, polioxietileno óleo de rícino endurecido 10, polioxietileno óleo de rícino endurecido 100, polioxietileno óleo de rícino endurecido 20, polioxietileno óleo de rícino endurecido 40, polioxietileno óleo de rícino endurecido 5, polioxietileno óleo de rícino endurecido 50, polioxietileno óleo de rícino endurecido 60, polioxila 35 óleo de rícino e óleo de processo. Dessas bases oleosas, perfluorpentano apresenta sensibilidade a temperatura e também características de volatilização a 29,5°C. Também, perfluorexano, brometo de perflu5 oroctila e perfluortributilamina apresentam propriedade de ruptura por estimulação externa características em que cavitação é gerada no núcleo da composição-veículo por meio de estimulação externa tal como estimulação causada por irradiação com ultrassom, levando desse modo a ruptura do núcleo.
Quando a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos 10 contém a base oleosa, a proporção da base oleosa não é especificamente limitada, contanto que os efeitos da invenção não sejam adversamente afetados. A proporção da base oleosa é de 0,1 a 50 partes em peso, preferencialmente de 1 a 30 partes em peso, e mais preferencialmente de 5 a 20 partes em peso, por 100 partes em peso da quantidade total dos componentes (A) a (C).
Adicionalmente, a composição-veículo para transferência de ácidos
nucleicos da invenção poderá conter um lipídio fusogênico com membrana (lipídio auxiliador), se necessário. Isso toma possível aumentar adicionalmente a eficiência de transferência do ácido nucleico para células ao conter tal lipídio fusogênico com membrana. Exemplos do lipídio fusogênico com membrana incluem dioleoilfosfati20 diletanolamina, dioleoilfosfatidilcolina, transfosfatidilfosfatidiletanolamina, 1,2-bis(10, 12-tricosadinoil)-fosfoetanolamina, 1,2-dielaidoilfosfoetanolamina, 1,2-diexadecilfosfoetanolamina, 1,2-diexanoilfosfoetanolamina, 1,2-dilauroilfosfoetanolamina, 1,2-dilinoleoilfosfoetanolamina, 1,2-dimiristoilfosfoetanolamina, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina, 1,2-dipalmitoleilfosfoetanolamina, 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina, 1,2-difitanoil25 fosfoetanolamina, 1,2-distearoilfosfoetanolamina, 1-palmitoil-2-oleoilfosfoetanolamina, 1 -palmitoil-2-(10,12-tricosadinoil)fosfoetanolamina, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-caproilamina, 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina-N-caproilamina, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N,N-dimetila, 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina-N,N-dimetila, 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina-N-dodecanoíla, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-dodecanoíla, 30 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-dodecanilamina, 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina-Ndodecanilamina, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-glutarila, 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina-N-glutarila, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-lactose, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-[4(p-maleimidometil)cicloexano-carboxilato], dipalmitolilfosfoetanolamina-N-[4 (p-maleimidometil)cicloexano-carboxilato], 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina-N-[4(pmaleimidofenil)butiramida], 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-[4(p-maleimidofenil)butirato], 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-metila, dipalmitoilfosfoetanolamina-N-metila, 5 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)propionato], 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)propionato], 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-(succinil) e
1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina-N-(succinil). Desses lipídios fusogênicos com membranas, dioleoilfosfatidiletanolamina é preferencialmente usada na composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da invenção.
Quando a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos
contém o lipídio fusogênico com membrana, a proporção do lipídio fusogênico com membrana não é especificamente limitado, contanto que os efeitos da invenção não sejam adversamente afetados. A proporção do lipídio fusogênico com membrana é de 1 a 500 partes em peso, preferencialmente de 10 a 250 partes em peso, e mais 15 preferencialmente de 25 a 100 partes em peso, com base em 100 partes em peso da quantidade total dos componentes (A) a (C).
A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da invenção pode conter vários aditivos tais como agentes isotonizantes, excipientes, diluentes, espessantes, estabilizantes, tampões e conservantes; e excipientes a20 quosos tais como água purificada, uma solução aquosa de sacarídeo, uma solução-tampão, uma solução salina fisiológica, uma solução polimérica aquosa e água sem RNase, de acordo com sua forma. As quantidades dos aditivos e excipientes aquosos podem ser apropriadamente ajustadas de acordo com a forma do veículo para transferência de ácido nucleico.
A forma da composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos
da invenção não é especificamente limitada, contanto que ela possa incluir o ácido nucleico-alvo a ser transferido para células, e a composição apresenta-se preferencialmente na forma de um lipossomo.
Quando a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da invenção é de forma lipossômica, os componentes (A) a (C) e outros lipídios, que são opcionalmente adicionados, formam uma membrana lipossômica. Quando um lipossomo é formado, ele pode ser pequenas vesículas unilamelares (SUV), grandes vesículas unilamelares (LUV) ou vesículas multilamelares (MLV). Além disso, o diâmetro das partículas pode ser apropriadamente ajustado de acordo com a espécie de células a receberem transferência, por exemplo, o diâmetro das partículas é de 20 a 100 nm para SUV, de 200 a 1.000 nm para LUV e de 400 a 3.500 nm para 5 MLV. O diâmetro das partículas é determinado usando um método dinâmico de espalhamento de luz.
Produção do lipossomo e ajuste de seu diâmetro de partículas são implementados de acordo com métodos que são conhecimento comum daquele habilitado no estado da técnica. Mais especificamente, o lipossomo pode ser for10 mado usando uma fase oleosa que contém os componentes (A) a (C) e uma fase aquosa (excipiente aquoso) por meio de um método de película fina, um método de evaporação em fase inversa, um método de infusão de éter, um método de tensoativo e um método de aquecimento. Adicionalmente, o diâmetro das partículas pode ser ajustado por um método de extrusão, método da prensa francesa (método 15 French Press) e um método de homogeneização.
A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da invenção é preparada misturando os componentes (A) e (B) e, se necessário, outros componentes, e constituindo apropriadamente a mistura em uma preparação de acordo com a forma desejada.
Composição para transferência de ácidos nucleicos
A composição para transferência de ácidos nucleicos da invenção contém a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos e ácido nucleico. Assim, a composição para transferência de ácidos nucleicos é usada para introduzir em células o ácido nucleico contido na composição, que se tomam o alvo da transferência.
Quando a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos é de forma lipossômica, em uma composição para transferência de ácidos nucleicos o ácido nucleico poderá existir em um estado incluído na fase aquosa do lipossomo, ou um estado ligado ao interior ou exterior de uma membrana lipossômica 30 por meio de uma ligação iônica ou hidrofóbica. Adicionalmente, se a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos não é de forma lipossômica, na composição para transferência de ácidos nucleicos é apenas necessário formar um complexo do ácido nucleico com componentes da composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos por meio de uma ligação iônica ou hidrofóbica.
A composição para transferência de ácidos nucleicos da invenção é preparada misturando a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos e ácido nucleico, e levando a mistura a uma forma desejada, ou produzida misturando em qualquer ordem o ácido nucleico e componentes das composições-veículo para transferência de ácidos nucleicos.
Na composição para transferência de ácidos nucleicos da presente invenção, a razão de mistura do ácido nucleico e da composição-veículo para 10 transferência de ácidos nucleicos varia dependendo da espécie de ácido nucleico, da composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos usada e da espécie de células do alvo de transferência. A proporção de ácido nucleico é de 1,0 * 10'5a 1,0 parte em peso, preferencialmente de 1,0 * 10-4 a 1,0 * 10'1 parte em peso, e mais preferencialmente de 1,0 * 10'3 a 1,0 χ 10'2 parte, por 100 partes em peso da 15 quantidade total dos componentes (A) a (C) contidos na composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos.
Também, a quantidade total dos componentes (A) a (C) contida na composição para transferência de ácidos nucleicos é de 10 a 90% em peso, preferencialmente de 30 a 80% em peso, e mais preferencialmente de 40 a 60% em peso, com base na quantidade total da composição.
A composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos da invenção pode conter vários aditivos tais agentes isotonizantes, excipientes, diluentes, espessantes, estabilizantes, agente de tamponamento e conservantes; e excipientes aquosos tais como água purificada, uma solução aquosa de sacarídeo, um 25 tampão, uma solução salina fisiológica, de acordo com sua forma. As quantidades dos aditivos e excipientes aquosos podem ser apropriadamente ajustadas de acordo com a forma do veículo para transferência de ácidos nucleicos.
Na invenção, exemplos das células às quais o ácido nucleico é transferido incluem células cultivadas, células separadas de organismos vivos (incluindo linhagens de células estabelecidas) e células existentes em organismos vivos tais como seres humanos.
A forma da composição para transferência de ácidos nucleicos da invenção não é especificamente limitada, contanto que uma quantidade apropriada da composição para transferência de ácidos nucleicos seja aplicada de modo a ser levada a contanto com células-alvo em que o ácido nucleico é introduzido. Quando um ácido nucleico é transferido para células existentes em organismos vivos tais 5 como seres humanos, exemplos da aplicação incluem infusão direta em tecido orgânico; injeções intravenosas, subcutâneas, intramusculares, intraperitoneais, intraoculares, orgânicas digestivas e endodônticas; administração por inalação na cavidade nasal, cavidade bucal e pulmões; administração oral; administração percutânea através da pele; e administração mucosa através da membrana mucosa 10 oral, membrana mucosa vaginal, membrana mucosa ocular, membrana mucosa retal e membrana mucosa uterina. Alternativamente, quando um ácido nucleico é transferido para células separadas de organismos vivos e células cultivadas, é exemplificado um método de cultivo de células na presença de uma quantidade apropriada da composição para transferência de ácidos nucleicos adicionada antes 15 de incubação. Adicionalmente, quando um ácido nucleico é transferido para células separadas de organismos vivos ou células cultivadas, o ácido nucleico pode também ser transferido para células mesmo na presença de soro.
Quantidade da composição para transferência de ácidos nucleicos da invenção aplicada às células-alvo de transferência é determinada de acordo com a 20 espécie de ácido nucleico usada, a espécie de composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos usada e a espécie de células-alvo. Por exemplo, quando o alvo de transferência são células em ser humano, quantidade terapeuticamente eficaz da composição para transferência de ácidos nucleicos da invenção é administrada ao paciente de quem se espera ganho terapêutico por administração do 25 ácido nucleico.
EXEMPLOS
A invenção será agora descrita em detalhes com base em Exemplos e similares, mas a invenção não se limita aos mesmos. Nos Exemplos seguintes, diestearoilfosfatidilcolina é abreviada como "DSPC", dipalmitoilfosfatidilcolina é a30 breviada como "DPPC" e dimiristoilfosfatidilcolina é abreviada como "DMPC". Nos Exemplos de Teste 1 e 2 seguintes, GL3-siRNA (siRNA to firefly luciferase; Dharmacon Co., Boulder, CO, EUA; senso: 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT, antissenso: 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT) foi usado como siRNA. No Exemplo de Teste 3, ΜΜΡ-9-siRNA Humano (Samchully Pharm. Co., Ltd, Coréia; senso: 5'-CCAACUAUGACCAGGAUAAdTdT-3', antissenso: 5’-UUAUCCUGGUC AUAGUUGGdTdT-31) foi usado como siRNA.
Exemplo 1
Preparação de Composicão-Veículo para Transferência de Ácidos Nucleicos Contendo DSPC
DSPC1 colesterol e estearilamina foram pesados sob uma razão molar de 7:3:1 e, em seguida, dissolvidos em clorofórmio usando um frasco de recupera10 ção. A solução foi secada sob pressão reduzida usando um evaporador rotativo para formar uma fina membrana de lipídio. Após água tratada com DEPC (produzida por Ambion Co.] água sem Rnase) ser adicionada à solução de tal maneira que sua concentração de DSPC se tomasse 30 mg/mL, o diâmetro das partículas da solução resultante foi ajustado passando-a através de uma membrana apre15 sentando um diâmetro de poros de 100 nm, mediante uso de um extrusor para preparar uma composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos sob uma forma lipossômica catiônica.
Exemplo 2
Preparação de Composicão-Veículo para Transferência de Ácidos Nucleicos Contendo DPPC
Da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto que DPPC foi usada em lugar de DSPC, foi preparada uma composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos sob forma lipossômica catiônica.
Exemplo 3
Preparação de Composicão-Veículo para Transferência de Ácidos Nucleicos Contendo DMPC
Da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto que DMPC foi usada em lugar de DSPC, foi preparada uma composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos sob forma lipossômica catiônica.
Exemplo 4
Preparação de Composicão-Veículo para Transferência de Ácidos Nucleicos Con
tendo DSPC Uma solução contendo siRNA sob uma concentração de 2 μΜ (solução de siRNA) foi preparada usando uma solução preparada mediante diluição 20 χ tampão Tris-EDTA (TE) (produzido por Invitrogen Co.), 20 vezes, com água tratada com DEPC (produzida por Ambion Co., água sem Rnase). Em seguida, quantida5 des iguais da composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos do Exemplo 1 e da solução de siRNA foram misturadas para formar um Iipoplexo (complexo), obtendo, assim, uma composição para transferência de ácidos nucleicos.
Exemplo 5
Preparação de Composicão-Veículo para Transferência de Ácidos Nucleicos Contendo DPPC
Uma solução contendo siRNA sob uma concentração de 2 μΜ (solução de siRNA) foi preparada usando uma solução preparada mediante diluição 20 χ tampão Tris-EDTA (TE) (produzido por Invitrogen Co.), 20 vezes, com água tratada com DEPC (produzida por Ambion Co., água sem Rnase). Em seguida, quantida15 des iguais da composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos do Exemplo 2 e da solução de siRNA foram misturadas para formar um Iipoplexo (complexo), obtendo, assim, uma composição para transferência de ácidos nucleicos.
Exemplo 6
Preparação de Composicão-Veículo para Transferência de Ácidos Nucleicos Contendo DMPC
Uma solução contendo siRNA sob uma concentração de 2 μΜ (solução de siRNA) foi preparada usando uma solução preparada mediante diluição 20 χ tampão Tris-EDTA (TE) (produzido por Invitrogen Co.), 20 vezes, com água tratada com DEPC (produzida por Ambion Co., água sem Rnase). Em seguida, quantida25 des iguais da composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos do Exemplo 3 e da solução de siRNA foram misturadas para formar um Iipoplexo (complexo), obtendo, assim, uma composição para transferência de ácidos nucleicos.
Exemplo de Teste 1 Teste para Avaliação de Segurança para as Células
A avaliação foi realizada usando um ensaio MTS. Um Ensaio de Proliferação Celular em Solução Aquosa CeIITiter 96 produzido por Promega Co. foi utilizado para o ensaio MTS. Especificamente, células A594 (ATCC, EUA) foram inoculadas sob 3,16 χ 104 células/poço em 200 μΙ de Modificação de Meio de Eagle da Dulbecco (DMEM) contendo soro bovino fetal (FBS) 10% em volume em uma placa de 96 poços, e incubadas a 37°C por 24 horas. Após ligeira lavagem mínima com Solução Salina Tamponada de Hank (HBSS), 3 vezes, o meio foi mudado para DMEM sem FBS; em seguida, 20 μΙ de cada uma das composições para 5 transferência de ácidos nucleicos dos Exemplos 4 a 6 foram adicionados a cada poço e incubados a 37°C sob 5% de CO2 por 4 horas. Em seguida, o sobrenadante da cultura nos poços foi mudado para DMEM com 10% em volume de FBS e incubado a 37°C sob 5% de CO2 por 20 horas novamente. 20 μΙ de um reagente de MTS (MetanotiossuIfonato) e 100 μΙ de um meio DMEM com 10% em volume de 10 FBS foram adicionados em cada poço, incubados por 2 horas, seguidos de determinação de absorbância a 492 nm e adicionalmente cálculo de viabilidade celular. A viabilidade celular foi calculada por meio de ajuste da absorbância a 492 nm, determinada sem adição da composição para transferência de ácidos nucleicos que foi incubada sob as condições acima como 100%.
Os resultados são mostrados na Figura 1. Como mostrado na Figura 1,
tomou-se evidente que todas as composições para transferência de ácidos nucleicos dos Exemplos 4 a 6 apresentam baixa citotoxicidade e alta segurança. Particularmente, confirmou-se que a segurança foi significativamente alta nas composições para transferência de ácidos nucleicos usando DSPC ou DPPC como diacilfosfatidilcolina (Exemplo 4 ou 5).
Exemplo de Teste 2 Teste para Avaliação de Eficiência de Transferência de de siRNA para Células
Introdução intracelular de siRNA foi avaliada medindo a intensidade de fluorescência de siRNA marcado com FITC usando fluxocitometria. Neste teste, foi 25 usada uma composição para transferência de ácidos nucleicos preparada com siRNA pré-marcado com FITC. Especificamente, células A594 (ATCC, EUA) foram inoculadas sob 5 χ 105 células/poço em 500 μΙ de DMEM com 10% em volume de FBS em uma placa de 24 poços, e incubadas a 37°C sob 5% de CO2 por 24 horas. Após ligeira lavagem mínima três vezes com HBSS, o meio foi mudado para 30 DMEM sem conter FBS, e, em seguida, 0,05 ml de cada uma das composições para transferência de ácidos nucleicos dos Exemplos 4 a 6 foi adicionada em cada poço e incubado a 37°C sob 5% de CO2 por 4 horas. Em seguida, o sobrenadante da cultura nos poços foi mudado para DMEM com 10% em volume de FBS e incubado a 37°C sob 5% de CO2 por 20 horas novamente. Cada poço foi lavado ligeiramente com HBSS uma vez e 0,2 mL de CeIIScrubBuffer (Gene Therapy Systems, Inc.) foi adicionado, seguido de incubação a 37°C sob 5% de CO2 por 15 mi5 nutos. Outra vez, os poços foram lavados ligeiramente com HBSS duas vezes e células ligadas ao fundo do poço foram desprendidas usando tripsina e coletadas por centrifugação, e, em seguida, as células resultantes foram suspensas em HBSS. A suspensão foi filtrada através de uma membrana apresentando um diâmetro de poros de 41 μιτι. Intensidade de fluorescência das células foi medida utilizando flu10 xocitometria 2 horas e 24 horas após a adição das composições para transferência de ácidos nucleicos. Como controle, intensidade de fluorescência de uma composição de controle de transferência de ácidos nucleicos obtida misturando uma solução de Lipofectamine 2000® (Jnvitrogen), frequentemente usada como vetor genético comercialmente disponível diluído com meio OptiMEM em 0,1 mg/mL, e solu15 ção de siRNA diluída com tampão TE sob uma concentração de 2 μΜ sob uma razão volumétrica de 1:1, foi também medida da mesma maneira descrita acima.
Os resultados são mostrados ma Figura 2. Desses resultados, confirmou-se que siRNA é incorporado em células em qualquer caso de composições para transferência de ácidos nucleicos dos Exemplos 4 a 6. Particularmente, nas 20 composições para transferência de ácidos nucleicos usando DSPC ou DMPC como diacilfosfatidilcolina (Exemplos 4 e 6), toma-se evidente que introdução de siRNA 2 horas após adição foi significativamente alta em comparação com Upofectamine® 2000 frequentemente usada como vetor genético comercialmente disponível e que as composições apresentam características favoráveis sob excelente ação 25 rápida.
Adicionalmente, um veículo para transferência de ácidos nucleicos que apresenta uma concentração de DSPC de 7,5 a 30 mg/mL foi produzido de acordo com a mesma maneira do Exemplo 1, usando DSPC, colesterol e estearilamina (DSPC:colesterol:estearilamina = 7:3:1 sob uma razão molar, daqui por diante, co30 letivamente referida como "constituinte lipídeo no veículo para transferência de ácidos nucleicos"). Um Iipoplexo (complexo) foi formado misturando quantidades iguais desse veículo para transferência de ácidos nucleicos e tampão TE contendo 200 nM de siRNA, e a composição para transferência de ácidos nucleicos foi preparada. Usando a composição para transferência de ácidos nucleicos preparada dessa maneira, introdução de siRNA em células foi avaliada da mesma maneira descrita acima. Os resultados são mostrados na Figura 3. Desses resultados, 5 quando a concentração do constituinte lipídeo do veículo para transferência de ácidos nucleicos foi mudada, a quantidade de ácido nucleico introduzido nas células mediado por uma composição para transferência de ácidos nucleicos mudou consequentemente. Também, verificou-se que o constituinte lipídeo do veículo para transferência de ácidos nucleicos mostra um baixo valor de quantidade de siRNA 10 introduzida 24 horas após adição em comparação com 2 horas após adição sob qualquer concentração, e que desaparecimento de siRNA começou 24 horas após adição. Portanto, os resultados também revelaram que é possível transferir siRNA para células dentro de um curto tempo de 2 horas após adição, usando a combinação de DSPC, colesterol e estearilamina como veículo para transferência de á15 cidos nucleicos, e que as composições apresentam características favoráveis de excelente ação rápida.
Exemplo de Teste 3 Teste para Avaliação de Inibição de Indução de Interferon
Células A594 (ATCC, EUA) foram inoculadas sob 5 χ 105 células/poço em 500 μΙ de DMEM com 10% em volume de FBS em uma placa de 24 poços, e incubadas a 37°C sob 5% de CO2 por 24 horas. Após ligeira lavagem mínima três vezes com HBSS, 450 μΙ de meio DMEM sem conter FBS foram adicionados em cada poço; adicionalmente, 50 μΙ da composição para transferência de ácidos nucleicos do Exemplo 4 foram adicionados em cada poço e incubados a 37°C sob 5% de CO2 por 4 horas. Em seguida, o sobrenadante da cultura nos poços foi mudado para DMEM com 10% em volume de FBS e incubado a 37°C sob 5% de CO2 por horas novamente. Após ligeira lavagem mínima três vezes com HBSS, células ligadas ao fundo do poço foram desprendidas usando tripsina e coletadas por centrifugação. RNA foi extraído das células resultantes usando Rneasy Plus Mini (Q/ageri), e, em seguida, cDNA foi obtido por transcrição usando QutantiTect Reverse Transcription (Qiagen). Usando o cDNA resultante, QutantiTeetPrimer Assay (Q/ageri) e iCyeleriQ (Bio-RAD), mRNA de IFIT-1, que um gene indutor de interferon, foi quantificado com RCP de tempo real. Como controle, mRNA de IFIT-1 foi quantificado em uma composição de controle de transferência de ácidos nucleicos obtida misturando uma solução de Lipofectamine 2000® (Invitrogen), frequentemente usada como vetor genético comercialmente disponível diluído com meio OptiMEM em 0,1 mg/mL, e solução de siRNA diluída com tampão TE sob concentração de 2 5 μΜ sob uma razão volumétrica de 1:1 da mesma maneira descrita acima. Como gene organizador para corrigir quantificação, foi usado 18rRNA. Também, como espaço em branco, mRNA de IFIT-1 foi quantificado com as condições acima sem a adição de uma composição para transferência de ácidos nucleicos.
Os resultados são mostrados na Figura 4. A composição para trans10 ferência de ácidos nucleicos do Exemplo 4 usando DSPC indicou indução significativamente baixa de interferon em comparação com a composição de controle de transferência de ácidos nucleicos usando UpofecPamine 2000. Os resultados revelaram que é possível inibir indução de interferon, que é um efeito adverso de siRNA, usando a composição para transferência de ácidos nucleicos da presente 15 invenção.
Claims (15)
1. Composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos, a qual compreende (A) uma diacilfosfatidilcolina, (B) pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em colesterol e derivados deste, e (C) uma amina primária alifática.
2. Composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1, na qual o componente (A) é uma diacilfosfatidilcolina cuja porção grupo acila apresenta 4 a 23 átomos de carbono.
3. Composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, na qual o componente (B) é colesterol.
4. Composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1, na qual o componente (C) é uma alquilamina que apresenta 10 a 20 átomos de carbono.
5. Composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1, na qual o componente (A) é pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em dimiristoilfosfatidilcolina, dipaImitoilfosfatidilcolina e diestearoilfosfatidilcolina; o componente (B) é colesterol; e o componente (C) é estearilamina.
6. Composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1, na qual a razão molar de componente (A):componente (B):componente (C) é 5-9:1-5:1.
7. Composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1, que é um veículo para transferência de siRNA.
8. Composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1, que é uma preparação de Iipossomos em que uma membrana lipossômica forma-se dos componentes (A) a (C).
9. Composição para transferência de ácidos nucleicos, a qual compreende um ácido nucleico e a composição-veículo para transferência de ácidos nucleicos como definida na reivindicação 1.
10. Composição para transferência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 9, na qual o ácido nucleico é siRNA.
11.Composição para transferência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 9, a qual é uma preparação de lipossomos.
12. Método para introdução de um ácido nucleico, método este que compreende a etapa de introduzir o ácido nucleico em células, levando a uma composição para transferência de ácidos nucleicos como definida na reivindicação 9, a contato com as células.
13.Método para introdução de um ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 12, no qual as células são células cultivadas, células separadas de organismos vivos ou células existentes em organismos vivos.
14. Uso de uma composição que compreende (A) uma diacilfosfatidilcolina, (B) pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em colesterol e derivados deste e (C) uma amina primária alifática, na produção de um veículo para transferência de ácidos nucleicos.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, na qual o veículo é usado para transferência de siRNA.
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