BRPI0809663B1 - Composição de vírus vivo atenuado, usos da mesma, métodos de diminuição da inativação de vírus vivo atenuado, e kit para diminuir a inativação de uma composição de vírus vivo atenuado. - Google Patents

Composição de vírus vivo atenuado, usos da mesma, métodos de diminuição da inativação de vírus vivo atenuado, e kit para diminuir a inativação de uma composição de vírus vivo atenuado. Download PDF

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Jorge E. Osorio
O'Neil Wiggan
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Abstract

composição de vírus vivo atenuado, usos da mesma, métodos de diminuição da inativação de vírus vivo atenuado, e kit para diminuir a inativação de uma composição de vírus vivo atenuado as modalidàdes aqui relacionam-se com composições e métodos para vírus vivos. em certas modalidades, uma composição de vírus vivo atenuado inclui, mas, sem uma limitação, um ou mais vírus vivos atenuados e composições para reduzir a inativação e/ou a degradação do vírus vivo atenuado. em outras modalidades, a composição de vírus vivo atenuado pode ser uma composição de vacina. ainda em outras composições, uma composição de vírus vivo atenuado pode incluir pelo menos um carboidrato, pelo menos uma proteína e pelo menos um surfatante de peso molecular elevado para reduzir a inativação e/ou a degradação do vírus vivo atenuado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO DE
VÍRUS VIVO ATENUADO, USOS DA MESMA, MÉTODOS DE DIMINUIÇÃO
DA INATIVAÇÃO DE VÍRUS VIVO ATENUADO, E KIT PARA DIMINUIR A
INATIVAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO DE VÍRUS VIVO ATENUADO.
Este Pedido reivindica o benefício da prioridade do Pedido de Patente Provisório US 60/910.579, depositado em 06 de abril de 2007, que é aqui incorporado na sua totalidade.
Campo
Estas modalidades relacionam-se com composições e métodos para estabilizar vírus vivos atenuados. Outras modalidades relacionam-se com composições e métodos para reduzir a degradação de vírus vivos atenuados. Ainda outras modalidades relacionam-se com os usos destas composições em kits para aplicações portáteis e métodos.
Antecedentes
As vacinas para proteção contra infecções virais têm sido efetivamente usadas para reduzir a incidência das doenças humanas. Uma das tecnologias mais bem sucedidas para as vacinas virais é imunizar animais ou humanos com uma cepa do vírus enfraquecida ou atenuada do vírus (um vírus vivo atenuado). Devido à replicação limitada depois da imunização, a cepa atenuada não ocasiona a doença. Todavia, a replicação virai limitada é suficiente para expressar o repertório completo de antígenos virais e gera respostas imuno potentes e duradouras ao vírus. Deste modo, após a exposição subseqüente a uma cepa patogênica do vírus, o indivíduo imunizado fica protegido da
Petição 870180034054, de 26/04/2018, pág. 4/17
2/49 doença. Estas vacinas virais vivas atenuadas estão entre as vacinas mais bem sucedidas usadas na saúde pública.
Dez das dezesseis vacinas virais aprovadas para venda nos Estados Unidos são vírus vivos atenuados. Vacinas virais vivas altamente bem sucedidas incluem o vírus da febre amarela 17D, os tipos 1, 2 e 3 dos poliovirus de Sabin, vírus do sarampo, da caxumba, da rubéola, da varicella e da vacínia. O uso da vacina do vírus da vacínia para controlar erupções de varíola conduziu à primeira e única erradicação de uma doença humana. A vacina do poliovirus de Sabin ajudou a prevenir a doença incapacitante ao longo do mundo e está sendo usada nos esforços para erradicar a pólio. A vacinação de infância com as vacinas do sarampo, da caxumba, da rubéola e da varicela impedem milhões de mortes e enfermidades internacionalmente.
Avanços técnicos recentes, tais como rearranjo genético, genética de inversão e adaptação ao frio, levaram ao licenciamento de vírus vivos atenuados para gripe e rotavirus. Certo número de vacinas virais vivas desenvolvidas com tecnologias de DNA recombinantes está em testes clínicos humanos, incluindo vacinas para a doença do Nilo Oeste, febre da dengue, malária, tuberculose e HIV. Estas vacinas virais recombinantes contam com a manipulação de vacinas virais atenuadas bem caracterizadas, tais como adenovirus, vírus da vacínia, vírus da febre amarela 17D ou da dengue, DEN-2 PDK-53. Os vírus atenuados seguros são geneticamente engenhados para expressar antígenos protetores para outros patôgenos virais ou bacterianos. Várias vacinas virais recombinantes foram aprovadas para uso animal, incluindo um vírus recombinante canarypox/ leucemia felina, um vírus recombinante da varíola dos canários /cinomose, um vírus recombinante da varíola dos canários/Nilo Oeste e um vírus recombinante da febre amarela /Nilo Oeste. Como grupo, as vacinas de vírus vivos atenuados estão entre as intervenções médicas mais bem sucedidas na história
3/49 humana, segunda apenas para o advento de antibióticos e sustentam a promessa de melhorar a saúde pública através do mundo.
Para que as vacinas virais vivas atenuadas sejam efetivas, elas devem ser capazes de replicar depois da imunização. Deste modo, 5 quaisquer fatores que inativem o vírus podem incapacitar a vacina. Por exemplo, a distribuição e o uso difundidos da vacina de varíola antes da Segunda Guerra Mundial eram limitados, porque o vírus era inativado depois de apenas alguns dias às temperaturas ambientes. Nos anos 1920, a demonstração de cientistas franceses de que a vacina seca por 10 congelamento proporcionava estabilidade e técnicas de longo prazo para fabrico em ampla escala vacinas secas por congelamento foi desenvolvida nos anos 1940 (ver, por exemplo, Collier 1955). Além da secagem por congelamento, foram identificados vários aditivos que podem ajudar a estabilizar os vírus em vacinas virais vivas atenuadas (ver, por exem15 pio. Burke, Hsu e colaboradores 1999). Estes estabilizantes incluem tipicamente um ou mais dentre os componentes seguintes: cátions divalentes, soluções salinas tamponadas, quelantes, ureia, açúcares (por exemplo, sacarose, lactose, trehalose), poliois (por exemplo, glicerol, manitol, sorbitol, polietilenoglicol), aminoácidos, hidrolisatos de proteí20 na (por exemplo, hidrolisato de caseína, hidrolisato de lactoalbumina, peptona), proteínas (por exemplo, gelatina, albumina do soro humano) ou polímeros (por exemplo, dextrana).
Todavia, mesmo com estes agentes estabilizantes, muitas das vacinas comumente usadas ainda exigem refrigeração para estabili25 zação. Outras vacinas comumente usadas são sensíveis a temperaturas extremas; o calor excessivo ou o congelamento acidental podem inativar a vacina. Manter esta “cadeia de frio” ao longo da distribuição é particularmente difícil no mundo em desenvolvimento. Deste modo, permaneça uma necessidade de melhorar a estabilidade tanto das 30 vacinas virais vivas atenuadas existentes como das recentemente
4/49 desenvolvidas.
Os flavivírus estão entre os vírus mais instáveis. São vírus envoltos num genoma de RNA de aproximadamente 11.000 bases. A maior parte dos flavivírus é transmitida por um vetor de artrópode, 5 comumente mosquitos. Existem mais de 70 diferentes flavivírus que são agrupados em três categorias principais com base na sorologia: o grupo da dengue, o grupo da encefalite japonesa e o grupo da febre amarela. Entre os flavivírus conhecidos, 40 são transmitidos por mosquitos, 16 são transmitidos por carrapatos e 18 vírus não têm 10 nenhum vetor de inseto identificado. Deste modo, a maioria dos flavivírus evoluiu para replicar tanto no seu vetor de artrópode como nas espécies de anfitrião vertebrado (freqüentemente, pássaros ou mamíferos). A urbanização em expansão, as viagens mundiais e as mudanças ambientais (tais como desmatamento ou padrões de chuva) têm levado 15 ao aparecimento de vários flavivírus como ameaças para a saúde pública humana. Esses vírus incluem, mas, sem limitação, vírus da febre amarela, os vírus da dengue, os vírus do Nilo Oeste, os vírus da encefalite japonesa e o vírus da encefalite transportado por carrapatos.
Através do controle intensivo dos mosquitos e dos esforços 20 de vacinação, a febre amarela foi eliminada de muitas áreas da América do Norte, Central e do Sul, do Caribe e da Europa. Todavia, nos últimos 20 anos, aumentou o número de países que reportam casos. O vírus da febre amarela é, agora, endêmico em partes importantes da África e da América do Sul e algumas ilhas caribenhas. A Organização 25 Mundial da Saúde (WHO) estima que 200.000 casos de febre amarela acontecem anualmente levando a 30.000 mortes. Desde a Segunda Guerra Mundial, os flavivírus da dengue espalharam-se para regiões tropicais e subtropicais através do mundo e, agora, ameaçam mais de
3,5 bilhões de pessoas, mais ou menos metade da população do mundo. 30 A WHO estima que 50-100 milhões de casos de febre da dengue aconte
5/49 cem anualmente. 500.000 destes são as formas mais severas da doença, ameaçadoras da vida, da dengue chamada febre hemorrágica, que leva a mais de 25.000 mortes por ano. Uma forma particularmente virulenta do vírus do Nilo Oeste foi introduzida no hemisfério ocidental, presumivelmente por viagem, em Nova Iorque, em 1999. O vírus transmitido por mosquitos infetou pássaros como o anfitrião primário, mas também causou doença e mortalidade em pessoas humanas e cavalos. O vírus do Nilo Oeste espalhou-se através dos Estados Unidos e Canadá e México. Desde a sua introdução, o vírus do Nilo Oeste causou mais de 20.000 casos relatados da doença do Nilo Oeste, levando a 950 mortes nos Estados Unidos. O vírus da encefalite japonesa ocasiona de 30.000 a 50.000 casos de doença neurológica anualmente, principalmente na Ásia oriental e meridional. 25-30% dos casos reportados sáo fatais. Os vírus da encefalite transmitidos por carrapatos são endêmicos em partes da Europa e Ásia e continuam a causar surtos episódicos afetando milhares de indivíduos. Os vírus relacionados com uma expansão geográfica mais limitada incluem o vírus Kunjin (um parente próximo do Nilo Oeste) e o vírus da encefalite do Vale de Murray na Austrália e Nova Guiné, o vírus da encefalite de St. Louis na América do Norte e do Sul, os vírus Usutu, Koutango e Yaonde na África e o vírus de Cacipacore na América do Sul.
Têm sido desenvolvidas vacinas virais vivas atenuadas que são seguras e protegem contra as doenças dos flavivírus, tais como febre amarela e encefalite japonesa. A vacina viral viva atenuada, 17D, tem sido extensamente usada para prevenir a febre amarela. As vacinas dos flavivírus atuais são liofilizadas na presença de estabilizantes. Todavia, as vacinas exigem armazenamento e embarque a 2 - 8°C, um requisito que é difícil de conseguir no mundo em desenvolvimento e regiões mais remotas das nações desenvolvidas. Além disso, após a reconstituição, as vacinas perdem rapidamente a potência mesmo quando armazenadas a 2 - 8°C.
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A vacina de sarampo é outro exemplo de um vírus atenuado instável que é usado no mundo para prevenir a doença. O vírus do sarampo é um vírus de RNA de filamento negativo não segmentado envolvido da família da Paramyxovirus. O sarampo é uma doença sazonal altamente contagiosa, que pode afetar virtualmente todas as crianças antes da puberdade na ausência de vacinação. Em países em desenvolvimento, as taxas de mortalidade em crianças infectadas por sarampo podem ser tão altas quanto de 2 a 15%. Realmente, apesar dos esforços para instituir a imunização mundial, o sarampo ainda causa mais do que 7.000 mortes em crianças por ano. A vacina do sarampo é um vírus vivo atenuado que é fabricado em células primárias do fibroblasto da galinha. A vacina é estabilizada com gelatina e sorbitol e é, então, liofilizada. A vacina liofilizada estabilizada, tem uma vida de prateleira de 2 anos ou mais, se armazenada de 2 a 8°C. Todavia, a vacina liofilizada ainda exige uma cadeia de frio que é difícil de manter no mundo em desenvolvimento. Além disso, após a reconstituição, a vacina perde 50% de sua potência dentro de 1 hora à temperatura ambiente (de 20 a 25°C).
Deste modo, existe uma necessidade na técnica de formulações de vacina aperfeiçoadas.
Sumário
Estas modalidades referem-se a métodos e composições para reduzir ou prevenir a deterioração ou inativação de uma composição de vírus vivos atenuados. Certas composições reveladas podem incluir combinações de componentes que reduzem a deterioração de um ao vírus vivo atenuado. Outras modalidades aqui referem-se a combinações de excipientes que intensificam em muito a estabilidade dos vírus vivos atenuados. Ainda outras composições e métodos aqui são direcionados para reduzir a necessidade de temperaturas mais baixas (por exemplo, armazenamento refrigerado ou congelado), ao mesmo
7/49 tempo em que aumentam a vida de prateleira do vírus vivo atenuado aquoso e/ou reconstituído.
De acordo com estas modalidades, certos vírus vivos atenuados são direcionados para flavivírus. Algumas modalidades, dirigidas para composições podem incluir, mas, sem limitação, um ou mais vírus vivos atenuados, tais como um ou mais flavivírus vivos atenuados em combinação com um ou mais surfactantes de alto peso molecular, proteínas e carboidratos.
As composições aqui contempladas podem aumentar a estabilização e/ou reduzir a inativação e/ou degradação de um vírus vivo atenuado incluindo, mas, sem limitação, o Flavivírus, o Togavirus, o Coronavirus, o Rhabdovirus, o Filovirus, o Paramyxovirus, o Orthomyxovirus, o Bunyavirus, o Arenavirus, o Retrovirus, o Hepadnavirus, o Pestivirus, o Picornavirus, o Calicivirus, o Reovirus, o Parvovirus, o Papovavirus, o Adenovirus, o vírus do herpes ou o vírus do sarampo vivo atenuado.
Outras modalidades relacionam-se com composições e métodos de vírus vivos atenuados direcionados para composições de vacinas capazes de reduzir ou prevenir o início de uma condição médica causada por um ou mais dos vírus aqui contemplados. De acordo com estas modalidades, as condições médicas podem incluir, mas, sem limitação, a infecção do Nilo Oeste, a febre da dengue, a encefalite japonesa, a doença da floresta de Kyasanur, a encefalite do Vale de Murray, a febre hemorrágica de Alkhurma, a encefalite de St. Louis, a encefalite transmitida por carrapato, a febre amarela e a infecção do vírus da hepatite C.
Em certas modalidades, as composições aqui contempladas podem ser parcial ou completamente desidratadas ou hidratadas. Noutras modalidades, os agentes protéicos contemplados para uso em
8/49 composições aqui podem incluir, mas, sem limitação, a lactoalbumina, a albumina do soro humano, uma albumina recombinante do soro humano (rHSA), a albumina do soro bovino (BSA), outras albuminas do soro ou membros da família dos genes da albumina. Os sacarídios ou agentes poliois podem incluir, mas, sem limitação, monossacarídeos, dissacarídeos, álcoois do açúcar, trehalose, sacarose, maltose, isomaltose, celibiose, gentiobiose, laminaribose, xilobiose, manobiose, lactose, frutose, sorbitol, manitol, lactitol, xilitol, eritritol, rafinose, amilose, ciclodextrinas, quitosan ou celulose. Em certas modalidades, os agentes surfactantes podem incluir, mas, sem limitação, um surfactante não iônico tal como alquil poli(óxido de etileno), copolímeros de poli(óxido de etileno) e poli(óxido de propileno) (copolímeros de blocos EO-PO), poli(vinil pirrolidona), alquil poliglucosídeos (tais como sacarose monoestearato, lauril diglucosídeo ou sorbitan monolaureato, octil glucosídeo e decil maltosídeo), álcoois graxos (álcool cetílico ou álcool olelílico) ou cocamidas (cocamida MEA, cocamida DEA e cocamida TEA).
Em outras modalidades, os surfactantes podem incluir, mas, sem limitação, Plurônico F127, Plurônico F68, Plurônico P123 ou outros copolímeros de blocos EO-PO de pesos moleculares maiores do que 3.000-4.000.
Em algumas modalidades, as composições de vacinas podem incluir, mas, sem limitação, um ou mais agentes proteicos que são a albumina do soro; um ou mais agentes sacarídeos que são a trehalose; e um ou mais agentes de polímero surfactante que é o copolímero de blocos EO-PO Plurônico F 127.
Algumas destas modalidades relacionam-se com composições virais vivas atenuadas parcial ou completamente desidratadas. De acordo com estas modalidades, uma composição pode ser 20% ou mais; 30% ou mais; 40% ou mais; 50% ou mais; 60% ou mais; 70 % ou mais; 80% ou mais; ou 90% ou mais desidratada.
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Outras modalidades referem-se a métodos para diminuição da inativação de um vírus vivo atenuado incluindo, mas, sem limitação, combinar um ou mais vírus vivo atenuado com uma composição capaz de reduzir a inativação de um vírus vivo atenuado incluindo, mas, sem 5 limitação, um ou mais agentes proteicos; um ou mais sacarídeos ou agentes de poliois; e um ou mais surfactantes de peso molecular elevado, em que a composição diminui a inativação do vírus vivo atenuado. De acordo com estas modalidades, o vírus vivo atenuado pode incluir, mas, sem limitação, o Flavivirus, o Togavirus, o Coronavirus, o Rhabdo10 virus, o Filovirus, o Paramyxovirus, o Orthomyxovirus, o Bunyavirus, o Arenavirus, o Retrovirus, o Hepadnavirus, o Pestivirus, o Picornavirus, o Calicivirus, o Reovirus, o Parvovirus, o Papovavirus, o Adenovirus, o vírus do herpes ou o vírus do sarampo. Além disso, os métodos e composições aqui revelados podem incluir secagem por congelamento 15 ou outros métodos de desidratação para a combinação. De acordo com estes métodos e composições, os métodos e composições diminuem a inativação da secagem por congelamento ou desidratam parcial ou completamente o vírus vivo atenuado. Em outros métodos, as composições para diminuir a inativação de um vírus vivo atenuado podem 20 compreender uma composição aquosa ou podem compreender uma composição reidratada depois da desidratação. As composições aqui descritas são capazes de aumentar a vida de prateleira de um vírus vivo atenuado aquoso ou reidratado.
Em certas modalidades particulares, um vírus vivo atenua25 do para uso numa composição de vacina aqui contemplada pode incluir, mas, sem limitação, uma ou mais vacinas de flavivirus vivos atenuados, incluindo, mas, sem limitação, os vírus atenuados da febre amarela (tal como 17D), os vírus atenuados da encefalite japonesa, (tal como SA 14-14-2), os vírus atenuados da dengue (tal como DEN30 2/PDK-53 ou DEN-4A30) ou os flavivirus quiméricos recombinantes.
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Em certas modalidades, as composições aqui contempladas são capazes de diminuir a inativação e/ou a degradação de um vírus vivo atenuado hidratado para mais do que 24 horas a temperaturas ambientes (por exemplo, mais ou menos desde 20°C até cerca de 25°C) ou temperaturas de refrigeração (por exemplo, aproximadamente 0°C até mais ou menos 10°C). Em modalidades mais particulares, uma composição de combinação é capaz de manter mais ou menos 100 por cento do vírus vivo atenuado por mais do que 24 horas. Além disso, as composições de combinação aqui contempladas são capazes de reduzir a inativação de um vírus vivo atenuado hidratado durante pelo menos 2 ciclos de congelamento e descongelamento. Outros métodos referem-se a composições de combinação capazes de reduzir a inativação de um vírus vivo atenuado hidratado a mais ou menos 24 horas até cerca de 50 dias a temperaturas de refrigeração (por exemplo, aproximadamente 0o até mais ou menos 10°C). As composições contempladas nestes métodos podem incluir, mas, sem limitação, um ou mais agentes protéicos de albumina do soro; um ou mais agentes sacarídeos de trehalose; e um ou mais agente copolimero de blocos EO-PO de Plurônico F127. Em certas modalidades, a composição de vírus vivo atenuado permanece em título viral de aproximadamente 100% depois de 7 dias a aproximadamente 21 °C e em título viral de mais ou menos 100% depois de 50 dias a temperaturas de refrigeração ao redor de 4°C. Outras modalidades aqui podem incluir uma composição de vírus vivo atenuado permanecendo em título viral de aproximadamente 90% ou em título viral de cerca de 80% depois de 7 dias a aproximadamente 21 °C e em título viral de mais ou menos 90% ou aproximadamente 80% depois de 50 dias a temperaturas de refrigeração ao redor de 4°C. Outras modalidades contempladas incluem composições de vírus vivos atenuados que permanecem a aproximadamente 3x até mais ou menos lOx a concentração de título viral depois de várias horas (por exemplo, 20 horas) a cerca de 37°C em comparação com outras composições conhecidas na técnica (ver, por exemplo, as Figuras 4 e 5). As composições
11/49 aqui reveladas reduzem a degradação do vírus vivo atenuado, quando a composição é armazenada a aproximadamente 37°C.
Outras modalidades referem-se a kits para diminuir a inativação de uma composição de vírus vivo atenuado, incluindo, mas, sem limitação, um recipiente; e uma composição incluindo, mas, sem limitação, um ou mais agentes proteicos, um ou mais agentes sacarídeos ou de poliol e um ou mais agentes de copolímeros de blocos EOPO, em que a composição diminui a inativação e/ou a degradação de um vírus vivo atenuado. De acordo com estas modalidades, uma composição de kit pode incluir um ou mais agente protéico de albumina do soro; um ou mais agente sacarídeo de trehalose; e um ou mais agentes de copolímeros de blocos EO-PO. Adicionalmente, um kit aqui contemplado pode, além disso, incluir um ou mais vírus vivos atenuados, incluindo, mas, sem limitação, um Flavivírus, Togavirus, Coronavirus, Rhabdovirus, Filovirus, Paramyxovirus, Orthomyxovirus, Bunyavirus, Arenavirus, Retrovirus, Hepadnavirus, Pestivirus, Picornavirus, Calicivirus, Reovirus, Parvovirus, Papovavirus, Adenovirus, virus do herpes, ou virus do sarampo. Em certas modalidades, as composições aqui podem incluir trehalose como um agente sacarídeo. De acordo com estas modalidades, a concentração de trehalose pode ser igual ou maior do que 5% (p/v). Em certas modalidades, as composições aqui podem incluir o polímero F 127 como um agente copolímero de blocos EO-PO. De acordo com estas modalidades, a concentração de polímero F127 pode ser de mais ou menos 0,1 até cerca de 4 por cento (p/v).
Em outras modalidades, as composições aqui contempladas podem conter quantidades de traços ou nenhuns cátions divalentes. Por exemplo, as composições aqui contempladas podem ter quantidades de traços ou nenhum cálcio/magnésio(Ca+2/Mg+2).
Breve Descrição dos Desenhos
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Os desenhos seguintes formam parte do presente Relatório Descritivo e são incluídos para, além disso, demonstrar certos aspectos destas modalidades particulares. As modalidades podem ser melhor entendidas por referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada aqui apresentada.
A Figura 1 representa um histograma exemplificativo de experiências que usam várias composições para testar a estabilidade de um vírus exemplificativo, o flavivírus DEN-2 PDK 53, nas composições.
A Figura 2 representa um gráfico exemplificativo de uma análise cinética de um vírus exemplificativo, o flavivírus DEN-2 PDK 53, para inativação viral a 37°C em várias composições exemplificativos.
A Figura 3 representa um histograma exemplificativo de uma análise de um vírus exemplificativo, o vírus DEN-2 PDK 53, armazenados a 37°C por 21 horas. Os valores são expressos como porcentagem do título viral que permanece depois de incubação em relação ao título de entrada. As porcentagens de formulação referem-se a (p/v) do respectivo excipiente.
A Figura 4 representa um histograma exemplificativo de uma análise de um vírus exemplificativo, o vírus DEN-2 PDK 53, armazenado a 37°C por 23 horas em composições diferentes. Os valores são expressos como porcentagem do título viral que permanece depois da incubação em relação ao título de entrada.
A Figura 5 representa um histograma exemplificativo de uma análise de um vírus exemplificativo, o vírus DEN-2 PDK 53, armazenado a 37°C por 23 horas em diferentes composições. Os valores são expressos como porcentagem do título viral que permanece depois da incubação em relação ao título de entrada. As duas barras para cada formulação representam duplicatas na experiência.
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A Figura 6 representa uma análise de histograma exemplificativo de um vírus exemplificativo, o vírus DEN-2 PDK 53, depois de dois ciclos de congelamento-descongelamento quando armazenados em diferentes formulações. Os valores são expressos como porcentagem do título viral que permanece depois de ciclos de congelamentodescongelamento em relação ao título de entrada.
A Figura 7 representa um gráfico exemplificativo de uma análise cinética de um vírus exemplificativo, o flavivírus recombinante DEN-2 PDK 53/WN, em várias composições exemplificativas para inativação viral a 25°C durante o tempo de várias semanas.
A Figura 8 representa um gráfico exemplificativo de uma análise cinética de um vírus exemplificativo, o flavivírus recombinante DEN-2 PDK 53/WN, em várias composições exemplificativas para inativação viral a 4°C durante o tempo de várias semanas.
A Figura 9 representa uma análise de histograma exemplificativo de um vírus exemplificativo, o vírus DEN-2 PDK-53, depois de liofilização em várias composições exemplificativos. A inativação viral foi avaliada conforme descrito acima depois de duas semanas a temperaturas diferentes.
Descrição de Modalidades Ilustrativas
Definições
Conforme aqui usado, “um” ou “uma” pode significar um ou mais de um de um item.
Conforme aqui usado, “cerca de” pode significar até e incluindo mais ou menos cinco por cento, por exemplo, mais ou menos 100 pode significar 95 e até 105.
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Conforme aqui usado, agentes “sacarídeos” podem significar um ou mais monossacarídeos, (por exemplo, glicose, galactose, ribose, manose, ramnose, talose, xilose ou alose arabinose), um ou mais dissacarídeos (por exemplo, trehalose, sacarose, maltose, isomaltose, 5 celibiose, gentiobiose, laminaribose, xilobiose, manobiose, lactose ou frutose), trissacarídeos (por exemplo, acarbose, raíinose, melizitose, panose ou celotriose) ou polímeros de açúcar (por exemplo, dextrana, xantana, pululana, ciclodextrinas, amilose, amilopectina, amido, celoologossacarídeos, celulose, maltooligossacarídeos, glicogênio, 10 quitosan ou quitina).
Conforme aqui usado, agentes “poliois” podem significar qualquer álcool de açúcar (por exemplo, manitol, sorbitol, arabitol, eritritol, maltitol, xilitol, glicitol, glicol, poliglicitol, polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou glicerol). Conforme aqui usado, “surfactantes de 15 elevado peso molecular” podem significar uma molécula anfifilica de superfície ativa de peso molecular maior do que 1.500.
Conforme aqui usado, “copolímero de blocos EO-PO” pode significar um copolímero que consiste em blocos de poli(óxido de etileno) e poli(propileno) óxido. Além disso, conforme aqui usado, “Plurônico” 20 pode significar copolímeros de blocos EO-PO no EOx-POy-EOx. Esta configuração de copolímero de blocos EO-PO também é chamada de “Poloxâmero” ou “Sinperônico”.
Conforme aqui usado, “vírus atenuado” pode significar um vírus que demonstra sinais clínicos reduzidos ou nenhuns de doença, 25 quando administrado a um animal.
Descrições Detalhadas
Nas seções seguintes, são descritas diversas composições e métodos exemplificativos, a fim de detalhar várias modalidades. Será
15/49 óbvio para uma pessoa qualificada na técnica que a prática das várias modalidades náo exige o emprego de nenhum ou até alguns dos detalhes específicos aqui esboçados, mas, ao invés, que as concentrações, tempos e outros detalhes específicos podem ser modificados por experimentação de rotina. Em alguns casos, não foram incluídos na descrição métodos ou componentes bem conhecidos.
A estabilidade das vacinas de flavivírus foi avaliada tanto para vírus vivos atenuados da febre amarela como da encefalite japonesa existente. Quando testados em 1987, apenas cinco das doze vacinas de febre amarela fabricadas naquele tempo satisfizeram padrões mínimos de estabilidade. Subseqüentemente, foi demonstrado que a adição de uma mistura de açúcares, aminoácidos e cátions divalentes estabiliza a vacina liofilizada, de forma que a vacina perdeu menos que 1 log de potência depois de incubação a 37°C por 14 dias. Foi descrita a estabilização de formulações liofilizadas para a vacina de febre amarela (ver, por exemplo, a Patente US 4.500.512). A Patente US 4.500.512 descreve uma combinação de lactose, sorbitol, cátions divalentes, cálcio e magnésio e pelo menos um aminoácido. Embora esta formulação possa ajudar a estabilizar a vacina liofilizada, ela falha em proporcionar estabilidade à vacina na forma aquosa. Outro estudo examinou a possibilidade de várias formulações diferentes, incluindo as composições descritas acima e o efeito da sacarose, trehalose e da lactoalbumina na estabilidade da vacina liofilizada da febre amarela. As formulações que consistem em apenas 10% de sacarose, 2% de sorbitol com 4% de inositol ou 10% de sacarose com 5% de lactoalbumina, 0,lg/ 1 CaCh e 0,076 g/1 MgSCL foram apuradas proporcionarem a melhor estabilidade (ver, por exemplo, Adebayo, Sim-Brandenburg e colaboradores, 1998). Todavia, em todos os casos depois da ressuspensão, a vacina da febre amarela fica ainda muito instável e deve ser descartada depois de apenas mais ou menos uma hora (ver, por exemplo, Monath 1996; Adebayo, Sim-Brandenburg e colaboradores, 1998). Isto leva ao descar
16/49 te da vacina e à potencial de causar a administração de vacina ineficaz sob condições de campo, se for usada uma vacina instável.
Outra vacina de flavírus vivo atenuado para proteção contra a encefalite japonesa foi licenciada e está em uso difundido na China (ver, por exemplo, Halstead e Tsai, 2004). A cepa da vacina da encefalite japonesa, SA 14-14-2, é cultivada em células primárias de rim de hamster e a célula subrenadante é colhida e grosseiramente filtrada. Uma composição prévia incluiu 1% de gelatina e 5% de sorbitol adicionados como estabilizantes. Usando estes estabilizantes, a vacina é liofilizada e, então, fica estável a 2 a 8°C durante pelo menos 1,5 anos, mas apenas durante 4 meses à temperatura ambiente e 10 dias a 37°C. Tal como com a vacina da febre amarela, a vacina reconstituída é muito instável e é estável apenas por 2 horas à temperatura ambiente (ver, por exemplo, Wanf, Yang e colaboradores, 1990). Em certas modalidades aqui, são contempladas composições de vírus flavírus vivos atenuados para estabilizar ou reduzir a degradação da encefalite japonesa.
Nenhuma formulação para uma vacina de flavivírus vivo atenuado foi identificada que proporcione estabilidade de longo prazo de formulações liofilizadas a temperaturas maiores do que 2 - 8°C. Além disso, nenhuma formulação foi descrita que previnisse a perda de título, estabilizasse ou reduzisse a degradação de vacinas aquosas por mais do que algumas horas.
Têm sido também descritas formulações para outros vírus vivos atenuados (ver, por exemplo, Burke, Hsu e colaboradores, 1999). Um estabilizante comum, chamado de SPGA, é uma mistura de 2 a 10% de sacarose, fosfato, glutamato de potássio e 0,5 a 2% de albumina do soro (ver, por exemplo, Bovarnick, Miller e colaboradores, 1950). Várias modificações desta formulação básica foram identificadas com diferentes cátions, com substituições da sacarose por hidrolisato de amido ou dextrana e com substituições da albumina do soro por hidrolisato de
17/49 caseína ou poli-vinil pirrolidona. Outras formulações usam gelatina hidrolisada em vez de albumina do soro como fonte de proteína (Burke, Hsu e colaboradores, 1999). Todavia, a gelatina pode causar reações alérgicas em crianças imunizadas e poderia ser uma causa de eventos 5 adversos reportados da vacina. A Patente US 6.210.683 descreve a substituição da albumina purificada de soro humano em formulações de vacina por albumina do soro humano recombinante.
As modalidades aqui revelam composições que intensificam a estabilidade e/ou reduzem a deterioração de vacinas de vírus vivos 10 atenuados em comparação com aquelas do estado da técnica. Certas composições aqui descritas proporcionam estabilidade de vírus aquosos por até 2 horas; até 3 horas; até 4 horas e maiores do que 4 horas em ou mais ou menos a 37°C. Certas composições aqui reveladas proporcionam estabilidade de vírus aquosos durante até 1 dia até cerca de 1 15 semana ou mais, em ou cerca da temperatura ambiente (por exemplo, 25°C). As modalidades aqui contempladas proporcionam proteção aumentada de um vírus vivo atenuado contra, por exemplo, congelamento e/ou descongelamento e/ou temperaturas elevadas. Em certas modalidades, as composições aqui conseguem estabilizar, reduzir 20 deterioração e/ou prevenir a inativação de produtos virais vivos atenuados desidratados, em condições de temperatura ambiente (por exemplo, mais ou menos 25°C). Em outras modalidades, as composições aqui contempladas podem estabilizar, reduzir a deterioração e/ou prevenir a inativação de produtos virais vivos atenuados aquosos, a 25 aproximadamente 25°C ou até ou mais ou menos 37°C. As composições e métodos aqui descritos podem facilitar o armazenamento, a distribuição, a liberação e a administração de vacinas virais em regiões desenvolvidas e atrasadas.
Outras modalidades podem incluir composições para 30 vacinas de vírus vivos atenuados, incluindo, mas, sem limitação, os
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Picornavírus (por exemplo, o vírus da pólio, o vírus da doença do pé e da boca), os Calicivirus (por exemplo, o vírus SARS e o vírus da peritonite felina infecciosa), os Togavírus (por exemplo, o vírus sindbis, o vírus da encefalite equina, o vírus chikungunya, o vírus da rubéola, o vírus do Rio Ross, o vírus da diarréia bovina, o vírus da cólera do porco), os Flavivírus (por exemplo, o vírus da dengue, o vírus do Nilo Oeste, o vírus da febre amarela, o vírus da encefalite japonesa, o vírus da encefalite de St. Louis, o vírus da encefalite transmitida por carrapato), os Coronavirus (por exemplo, os coronavirus humanos (frio comum), o vírus da gastroenterite suína), os Rhabdovírus (por exemplo, o vírus da hidrofobia, o vírus da estomatite vesicular), os Filovírus (por exemplo, o vírus de Marburg, o vírus Ebola), os Paramyxovirus (por exemplo, o vírus do sarampo, o vírus da cinomose, o vírus da caxumba, o vírus da parainfluenza, o vírus sincicial respiratório, o vírus da doença de Newcastle, o vírus rinderpest), os Orthomyxovirus (por exemplo, o vírus da gripe humana, o vírus da gripe aviária, o vírus da gripe equina), os Bunyavírus (por exemplo, o hantavirus, o vírus de LaCrosse, o vírus da febre do Vale Rift), os Arenavirus (por exemplo, o vírus de Lassa, o vírus de Machupo), os Reovírus (por exemplo, os reovírus humanos, os rotavirus humanos), os Birnavírus (por exemplo, o vírus bursal infeccioso, o vírus da necrose pancreática do peixe), os Retrovirus (por exemplo, HIV 1, HIV 2, HTLV-1, HTL V-2, o vírus da leucemia bovina, o vírus da imunodeficiência felina, o vírus do sarcoma felino, o vírus do tumor mamário do camundongo), os Hepadnavírus (por exemplo, o vírus da hepatite B), os Parvovirus (por exemplo, o parvovirus B humano, o parvovirus canino, vírus da panleucopênia felina), os Papovavírus (por exemplo, os vírus do papiloma humano, SV40, os vírus do papiloma bovino), os Adenovirus (por exemplo, o adenovirus humano, o adenovirus canino, o adenovirus bovino, o adenovirus porcino), o vírus do herpes (por exemplo, o vírus do herpes simplex, o vírus da varicela zóster, o vírus da rinotraqueíte bovina infecciosa, o citomegalovírus humano, o herpesvirus humano 6) e o vírus do sarampo (por exemplo,
19/49 vacínia, os vírus do epitelioma, os vírus do sarampo do raccoon, o vírus do skunkpox, o vírus do sarampo do macaco, o vírus do sarampo da vaca, o vírus contagioso do músculo).
Aquelas pessoas qualificadas na técnica reconhecerão que as composições ou fórmulas aqui se relacionam com vírus que são atenuados de alguma forma, incluindo, mas, sem limitação, a passagem de cultura de células, o rearranjo genético, a incorporação de mutações em cópias infecciosas, a genética da inversão, outra manipulação de DNA ou RNA recombinantes. Além disso, aquelas pessoas qualificadas na técnica reconhecerão que outras modalidades se relacionam com vírus que são engenhados para expressar quaisquer outras proteínas ou RNA incluindo, mas, sem limitação, os flavivírus recombinantes, os adenovirus recombinantes, os vírus do sarampo recombinantes, os retrovirus recombinantes, os vírus adeno-associados recombinantes e os vírus recombinantes do herpes. Esses vírus podem ser usados como vacinas para doenças infecciosas, vacinas para tratar condições oncológicas ou vírus para introduzir proteínas expressas ou RNA (por exemplo, terapia dos genes, terapia antissentido, terapia da ribozima ou terapia de RNA inibitórios pequenos) para tratar desordens.
Em algumas modalidades, estas composições podem conter um ou mais vírus com envelopes de membrana (por exemplo, vírus envoltos) de famílias do Togavirus, do Flavivírus, do Coronavirus, do Rhabdovírus, do Filovirus, do Paramyxovirus, do Orthomyxovirus, do Bunyavírus, do Arenavirus, do Retrovirus, do Hepadnavírus, de Herpesvirus ou do vírus do sarampo. Em certas modalidades, as composições podem conter um ou mais vírus envoltos de famílias do RNA do Togavírus, do Flavivírus, do Coronavirus, do Rhabdovírus, do Filovírus, do Paramyxovirus, do Orthomyxovirus, do Bunyavírus, do Arenavirus ou do Retrovirus. Em outras modalidades, estas composições podem conter um ou mais vírus de RNA de dilamento positivo envolto das
20/49 famílias do Togavirus, do Flavivirus, do Coronavirus ou do Retrovirus. Em certas modalidades, as composições podem conter um ou mais Flavivirus vivos atenuados (por exemplo, o vírus da dengue, o vírus do Nilo Oeste, o vírus da febre amarela ou o vírus da encefalite japonesa).
Algumas modalidades aqui relacionam-se com composições para vírus vivos atenuados na forma aquosa ou liofilizada. Aquelas pessoas qualificadas na técnica reconhecerão que as formulações que melhoram a estabilidade viral térmica e previnem a inativação de congelamento-descongelamento melhorarão os produtos que são líquidos, pulverizados, secos por congelamento ou liofilizados e preparados por métodos conhecidos na técnica. Depois da reconstituição, essas vacinas estabilizadas podem ser administradas por uma variedade de rotas, incluindo, mas, sem limitação, administração intradérmica, administração subcutânea, administração intramuscular, administração intranasal, administração pulmonar ou administração oral. Uma variedade de dispositivos é conhecida na técnica para liberação da vacina, incluindo, mas, sem limitação, seringa e injeção de agulha, administração por agulha bifurcada, administração por patches (emplastros) ou bombas intradérmicas, liberação de jato sem agulha, liberação de partículas intradérmicas ou liberação de pó por aerossol.
As modalidades podem incluir composições que consistem em um ou mais vírus vivos atenuados (como descritos acima) e uma mistura de um ou mais surfactantes de peso molecular elevado e uma ou mais proteínas num tampão fisiológico aceitável. Em certas modalidades, as composições incluem, mas, sem limitação, um ou mais vírus vivos atenuados, um ou mais surfactantes de peso molecular elevado, uma ou mais proteínas e um ou mais carboidratos, num tampão fisiológico aceitável.
Em outras modalidades, as composições podem conter um ou mais surfactantes de peso molecular elevado que aumentam a
21/49 estabilidade térmica de vírus vivos atenuados. Os surfactantes têm sido incorporados em formulações de vacinas para prevenir a perda material para superfícies tais como frascos de vidro (ver, por exemplo, Burke, Hsu e colaboradores, 1999). Todavia, certas modalidades aqui incluem surfactantes de peso molecular elevado com algumas propriedades bioquímicas incomuns de utilidade para composições e métodos aqui revelados. Os copolímeros de blocos EO-PO podem incluir blocos de óxido de polietileno (-CH2CH2O- designado EO) e óxido de polipropileno (-CH2CHCH3O- designado PO). Os copolímeros de blocos podem ser flanqueado por dois blocos EO numa disposição EOx-POy-EOx. Visto que o componente PO é hidrofílico e o componente EO é hidrofóbico, a hidrofilicidade global, o peso molecular e as propriedades de surfactante podem ser ajustados variando x e y na estrutura de blocos de EOx-POyEOX. Em soluções aquosas, os copolímeros de blocos EO-PO autojuntar-se-ão em micelas com um núcleo PO e uma coroa de grupos hidrofílicos EO. As EO formulações de copolímeros de blocos -PO têm sido investigadas como agentes potenciais de liberação de droga para uma variedade de drogas hidrofóbicas e para proteínas, DNA ou vacinas inativadas (por exemplo, Todd, Lee e colaboradores, 1998; Kabanov, Lemieux e colaboradores, 2002). Em altas concentrações (por exemplo: > do que 10%) certos dos copolímeros de blocos EO-PO de peso molecular mais elevado sofrerão gelação invertida, formando um gel à medida que a temperatura aumenta. A formação de gel às temperaturas do corpo permite o uso de géis de copolímeros de blocos EO-PO para atuarem como um depósito em aplicações de liberação de drogas e vacina (ver, por exemplo, Coeshott, Smithson e colaboradores, 2004). Além disso, devido às suas propriedades de surfactante, estes polímeros têm sido usados em formulações adjuvantes e como emulsificante em cremes e géis topicamente aplicados. Os copolímeros de blocos EO-PO têm também sido mostrados acelerarem a cura de ferimentos e queimaduras e vedarem as membranas de células depois de danos mediados por radiação ou eletroporação.
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Em outras modalidades, as composições de vacinas podem incluir um ou mais surfactantes com peso molecular de 1.500 ou maior. Numa certa modalidade, o surfactante é um copolímero de blocos não iônico, hidrofilico, de polioxietileno-polioxipropileno (ou copolímero de blocos EO-PO). Embora os copolímeros de blocos EO-PO tenham sido usados como adjuvantes e veículos de liberação para vacinas inativadas, vacinas de proteína ou vacinas de DNA, o seu uso para prevenir a inativação de um vírus vivo não é antecipado na técnica. Numa modalidade particular, uma formulação pode conter um ou mais polímeros EO-PO com um peso molecular de 3.000 ou maior. Em modalidades adicionais, as composições podem incluir em parte um copolímero de blocos EO-PO Plurônico F 127 ou Plurônico P 123. Aquelas pessoas qualificadas na técnica reconhecerão que podem ser quimicamente feitas modificações dos surfactantes. É aqui reconhecido que são considerados, quaisquer polímeros de surfactantes essencialmente equivalentes
Estas modalidades podem incluir composições de um ou mais vírus vivos atenuados, um ou mais surfactantes e uma ou mais proteínas. Em certas modalidades, uma proteína pode ser uma albumina. A albumina do soro é uma das proteínas mais comuns no sangue de vertebrados e tem funções múltiplas. A proteína é de 585 aminoácidos com um peso molecular de 66.500. A albumina do soro humano não é glicosada e tem um único grupo tiol livre implicado em algumas das suas miríades de atividades vinculadas. A albumina do soro é predominantemente de hélice <x com três domínios estruturais, cada um subdividido em dois subdomínios. A albumina é conhecida por se ligar especificamente a uma variedade de moléculas, incluindo drogas tais como aspirina, ibuprofeno, halotane, propofol e warfarin assim como também ácidos graxos, aminoácidos, esteróides, glutationa, metais, bilirrubina, lisolecitina, hematina e prostaglandinas. Os diferentes domínios estruturais estão implicados na ligação à droga; a
23/49 maioria das drogas e hormônios de moléculas pequenas ligam-se a um de dois sítios primários localizados em subdomínios IIA e IIIA. Devido à sua falta de imunogenicidade, a albumina é comumente usada como proteína portadora em produtos biológicos. Visto que a dose de proteína contida numa vacina viral viva atenuada pode ser de frações de um micrograma (derivadas a partir de 103 até 105 partículas virais), é usada uma proteína portadora inerte para prevenir perda devido a absorção e ligação não específica a vidro, plástico ou outras superfícies. Todavia, conforme aqui demonstrado, uma melhoria inesperada na estabilidade foi observada com a combinação de uma albumina e copolimeros de blocos EO-PO sugerindo interações entre os dois componentes e/ou entre os componentes e as partículas virais. Além disso, a estabilização intensificada de vírus na presença de albumina não é provávelmente devida a uma função como uma proteína portadora geral: outras proteínas tais como gelatina e lactoferrina falham em melhorar a estabilidade de vírus.
Em certas modalidades, a albumina do soro pode ser a partir de uma pessoa humana ou outra origem mamífera. Para vacinas pretendidas para uso humano, modalidades particulares podem incluir albumina humana ou outros produtos humanos, conforme necessário, a fim de reduzir ou eliminar respostas imuno adversas. Aquelas pessoas qualificadas na técnica reconhecerão que podem ser usadas albuminas específicas para cada espécie em vacinas animais (por exemplo, albumina canina para produtos caninos, albumina bovina para produtos bovinos). Em modalidades adicionais, a proteína é uma albumina humana recombinante. Existem métodos padrão para expressar a albumina humana recombinante ou partes da mesma numa variedade de sistemas de expressão incluindo bactérias, leveduras, algas, plantas ou sistemas de células ou animais transgênicos mamíferos. Além disso, a albumina do soro ou partes da mesma podem ser produzidas em sistemas isentos de células ou quimicamente sintetizadas. A albumina
24/49 humana recombinante produzida nestes ou em qualquer sistema semelhante é aqui incorporada. Aquelas pessoas qualificadas na técnica reconhecerão que outras proteínas podem substituir a albumina. Por exemplo, a albumina é um membro de uma família de genes múltiplos. Devido às suas semelhanças estruturais e de seqüências, outros membros da família (por exemplo, cx-fetoproteína, proteína de ligação à vitamina D ou afamina) podem substituir a albumina em composições e métodos aqui contemplados. Aquelas pessoas qualificadas na técnica também reconhecerão que podem ser feitas modificações na albumina de alguma forma conhecida na técnica, por exemplo, por tecnologia de DNA recombinante, por modificação pós-translacional, por divisão proteolítica e/ou por meios químicos. São aqui contempladas aquelas substituições e alterações na albumina que proporcionam função estabilizante essencialmente equivalente à albumina do soro sem substituições nem alterações.
Em certas modalidades, são descritas as composições que têm um surfactante de peso molecular elevado, uma proteína e um carboidrato num tampão farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o carboidrato é um açúcar ou um poliol. Os açúcares podem incluir, mas, sem limitação, monossacarídeos, (por exemplo, glicose, galactose, ribose, manose, ramnose, talose, xilose ou alose arabinose), dissacarídeos (por exemplo trehalose, sacarose, maltose, isomaltose, celibiose, gentiobiose, laminaribose, xilobiose, manobiose, lactose ou frutose.), trissacarídeos (por exemplo, acarbose, rafinose, melizitose, panose ou celotriose) ou polímeros de açúcar (por exemplo dextrana, xantana, pululana, ciclodextrinas, amilose, amilopectina, amido, celoologossacarídeos, celulose, maltooligossacarídeos, glicogénio, quitosan ou quitina). Os poliois podem incluir, mas, sem limitação, manitol, sorbitol, arabitol, eritritol, maltitol, xilitol, glicitol, glicol, poliglicitol, polietilenoglicol, polipropilenoglicol e glicerol.
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Numa modalidade particular, formulações podem conter uma combinação de um ou mais copolímeros de blocos EO-PO, uma ou mais proteínas e trehalose num tampão farmacologicamente aceitável. Em certas modalidades, a trehalose pode estar presente em concentrações variando de 5 a 50% (p/v). A trehalose tem sido usada para intensificar a estabilidade de formulações de proteína. É extensamente conhecido na técnica como um criopreservante e é usado na natureza para proteger organismos da tensão. Os organismos anidrobióticos que podem tolerar condições de baixo suprimento de água contêm grandes quantidades de trehalose. Foi mostrado que a trehalose prevene tanto os eventos de fusão de membrana como transições de fase que podem causar a desestabilização da membrana durante a secagem. A análise estrutural sugere que a trehalose ajusta bem entre os grupos de cabeçotes polares em camadas de lípidos. A trehalose também previne a desnaturação de proteínas instáveis durante a secagem. Pensa-se que a trehalose estabilize proteínas por ligações de hidrogênio com resíduos polares da proteína. A trehalose é um dissacarídeo que consiste em duas moléculas de glicose num encadeamento 1:1. Devido ao encadeamento 1:1, a trehalose tem pequena ou nenhuma energia de redução e é, deste modo, essencialmente não reativa com aminoácidos e proteínas. Esta falta de atividade de redução pode melhorar o efeito de estabilização da trehalose em proteínas. Em certas modalidades, a trehalose proporciona estabilidade para vírus vivos atenuados. Esta atividade da trehalose pode ser devida à sua capacidade de estabilizar tanto as membranas como as proteínas de revestimento dos vírus.
Em modalidades adicionais, as composições podem incluir um ou mais copolímeros de blocos EO-PO, uma ou mais proteínas e um ou mais carboidratos, onde um dos carboidratos é quitosan, num tampão fisiológico aceitável para proporcionar estabilidade melhorada para vírus vivos atenuados. Em certas modalidades, as composições podem incluir quitosan em concentrações que variam desde 0,001 a 2%
26/49 (por exemplo, num pH de cerca de 6,8). O quitosan é um polissacarídeo catiônico derivado por desacetilação da quitina, o polímero estrutural dos exosesqueletos de crustáceos. É um polímero de N-acetilglucosamina e glucosamina; o conteúdo dos dois carboidratos depende da extensão da desacetilação. A carga positiva do quitosan permite que se ligue a superfícies e moléculas negativamente carregadas. Deste modo, ele liga-se a superfícies de mucosas e pensa-se que promova a absorção pelas mucosas. O quitosan também pode ligar-se e formar nanopartículas com DNA, RNA e outros oligonucleotídeos e tem sido usado na liberação de genes não virais. Certas modalidades aqui demonstram que o quitosan aumenta a estabilidade de vírus vivos atenuados.
Em certas modalidades, podem ser descritas composições que incluem tipicamente um tampão fisiologicamente aceitável. Aquelas pessoas qualificadas na técnica reconhecem que existe uma variedade de tampões fisiologicamente aceitáveis, incluindo, mas, sem limitação, tampões contendo fosfato, TRIS, MOPS, HEPES, bicarbonate, outros tampões conhecidos na técnica e combinações de tampões. Além disso, aquelas pessoas qualificadas na técnica reconhecem que ajustando as concentrações salinas a níveis fisiológicos próximos (por exemplo, salinas ou sal total 0,15 M) pode ser favorável à administração parenteral de composições para prevenir dano e/ou dor celular no sítio da injeção. Aquelas qualificadas na técnica também reconhecerão que, à medida que aumentam as concentrações de carboidrato, as concentrações de sais podem ser diminuídas para manter osmolaridade equivalente para a formulação. Em certas modalidades, é tido em consideração um meio tampão com pH maior do que 6,8; alguns vírus vivos atenuados (por exemplo, flavivírus) são instáveis em pH baixo. Em outra modalidade, um tampão fisiologicamente aceitável pode ser salino tamponado por fosfato (PBS).
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Algumas composições de vacinas virais vivas atenuadas referem-se aqui a composições que aumentam a estabilidade e/ou reduzem a deterioração do vírus vivo atenuado, além de terem reduzida imunogenicidade ou serem não imunogênicas. De acordo com estas modalidades, as composições podem incluir um ou mais agentes proteicos; um ou mais agentes sacarídios ou poliois; e um ou mais surfactantes de peso molecular elevado, em que a composição diminui a inativação do vírus vivo atenuado. Portanto, certas composições aqui tidas em consideração têm reação adversa reduzida, quando administradas a um sujeito. Em algumas composições exemplificativas, o(s) agente(s) surfactante(s) consiste(mO em um ou mais copolímeros de blocos EO-PO; o(s) agente(s) protéico(s) são selecionadas a partir do grupo que consiste em lactoalbumina, albumina do soro, (Xfetoproteína, proteína de ligação à vitamina D, afamina derivada a partir de uma espécie vertebrada; e o(s) agente(s) de carboidrato é(são) um ou mais de um sacarídeo e/ou um poliol. Em certas modalidades, as composições podem incluir um ou mais do(s) agente(s) de carboidrato selecionado(s) a partir do grupo que consiste em trehalose, sacarose, quitosan, sorbitol e manitol. Em certas modalidades mais particulares, a fim de reduzir a reação imunológica a uma vacina, a albumina do soro pode ser derivada a partir de uma espécie vertebrada ou, em outras modalidades, a partir da mesma fonte que o sujeito (por exemplo, humano). Em outras modalidades, o agente de carboidrato é a trehalose. Em certas modalidades, pelo menos um agente surfactante é o copolímero de blocos EO-PO Pluonic F127. Em algumas composições de vacinas virais vivas atenuadas, pelo menos um agente de carboidrato é a trehalose. Certas composições de vacinas virais vivas atenuadas incluem o copolímero de blocos EO-PO Plurônico F 127 onde a concentração é de 0,1 até 4% (p/v); e/ou a concentração de albumina do soro de 0,001 até 3% (p/v) e/ou a concentração de trehalose pode ser de 5 até 50% (p/v).
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Composições Farmacêuticas
Estas modalidades proporcionam a administração de composições a sujeitos numa forma biologicamente compatível apropriada para a administração farmacêutica in vivo. Por “forma biologicamente compatível apropriada para administração in vivo” significa-se uma forma do agente ativo (por exemplo, composição de vírus vivo atenuado das modalidades) a ser administrada em que quaisquer efeitos tóxicos são excedidos em valores pelos efeitos terapêuticos dos agentes ativos. A administração de uma quantidade terapeuticamente ativa das composições terapêuticas é definida como uma quantidade efetiva, em dosagens e durante períodos de tempo necessários para alcançar um resultado desejado. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente ativa de um composto pode variar de acordo com os fatores como o estado da doença, a idade, o sexo e o peso do indivíduo e as formulações de capacidade para produzir uma resposta desejada no indivíduo. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta terapêutica ótima.
Em algumas modalidades, a composição (por exemplo, substância química farmacêutica, proteína, peptídeo de uma modalidade) pode ser administrada de uma maneira conveniente tal como subcutânea, intravenosa, por administração oral, inalação, aplicação transdérmica, aplicação intravaginal, aplicação tópica, intranasal ou administração retal. Numa modalidade mais particular, o composto pode ser administrado oral ou subcutaneamente. Noutra modalidade, o composto pode ser administrado por via intravenosa. Numa modalidade, o composto pode ser administrado intranasalmente, tal como por inalação.
Um composto pode ser administrado a um sujeito num veículo ou diluente apropriado, co-administrado com a composição. Pretende-se que o termo “veículo farmaceuticamente aceitável” confor
29/49 me aqui usado, inclua diluentes tais como soluções tampão salinas e aquosas. Os agentes ativos podem também ser administrados parenteral ou intraperitonealmente. As dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietileno glicois líquidos e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições ordinárias de armazenamento e uso, estas preparações podem conter um preservante para prevenir o crescimento de microorganismos.
Composições farmacêuticas apropriadas para uso injetável podem ser administradas por meios conhecidos na técnica. Por exemplo, podem ser usadas soluções aquosas estéreis (onde água solúvel) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a composição pode ser estéril e pode ser fluida na extensão em que exista condição fácil de ser colocada na seringa. Pode, além disso, ser preservada contra a ação contaminante de microorganismos tais como bactérias e fungos. O veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes) e misturas apropriadas dos mesmos. A fluência adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho exigido de partículas no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes.
Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando um composto ativo numa quantidade com um solvente apropriado ou com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme exigido, seguida de esterilização.
Após a formulação, as soluções podem ser administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade que seja terapeuticamente efetiva. As formulações são facilmente administradas numa variedade de formas de dosagem, tais como o
30/49 tipo de soluções injetáveis acima descritas. É tido em consideração que cápsulas de liberação lenta, micropartículas de liberação no tempo e semelhantes podem também ser empregados para administrar estas composições. Estas soluções aquosas particulares são especialmente apropriadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal.
Os agentes terapêuticos ativos podem ser formulados dentro de uma mistura pode incluir mais ou menos de 0,0001 a 1,0 miligramas ou cerca de 0,001 a 0,1 miligramas ou aproximadamente de 0,1 a 1,0 ou mesmo mais ou menos de 1 a 10 gramas por dose. A dose única ou doses múltiplas também podem ser administradas num horário apropriado para uma situação predeterminada. Em algumas modalidades, as doses podem ser administradas antes, durante e/ou depois da exposição a um vírus aqui tido em consideração.
Noutra modalidade, podem ser usadas soluções ou sprays nasais, aerossóis ou inalantes para liberar o composto de interesse. As formulações adicionais que são apropriadas para outros modos de administração incluem supositórios e pessários. Pode também ser usado um pessário retal ou supositório. Em geral, para supositórios, os ligantes e veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicols ou triglicerídeos; esses supositórios podem ser formados a partir de misturas que contêm o ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10%, de preferência de 1% a 2%.
As formulações orais incluem esses excipientes normalmente empregados tais como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas orais podem incluir um diluente inerte ou veículo comestível assimilável ou podem ser inclusas em cápsula de gelatina de concha dura ou mole ou podem ser comprimidas em table
31/49 tes ou podem ser diretamente incorporadas na comida da dieta. Para administração terapêutica oral, os compostos ativos podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de tabletes ingeríveis, tabletes bucais, troches, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers e semelhantes. Essas composições e preparações devem conter pelo menos 0,1% do composto ativo. A porcentagem das composições e preparações podem, obviamente, ser variadas e podem estar de modo conveniente entre cerca de 2 até mais ou menos 75% do peso da unidade ou, de preferência, entre 25-60%. A quantidade de compostos ativos nessas composições terapeuticamente úteis é tal que uma dosagem apropriada possa ser obtida.
Kits
Modalidades adicionais dizem respeito a kits para uso com métodos e composições aqui descritas. Podem ser proporcionadas composições e formulações de vírus vivos no kit. Os kits podem também incluir um recipiente apropriado, composições de vírus vivos atenuados aqui detalhados e opcionalmente um ou mais agentes adicionais tais como outros agentes anti-virais, agentes anti-fungos ou antibacteriano s.
Os kits podem incluir, além disso, uma composição aliquotada adequada de uso num sujeito necessitado da mesma. Além disso, estas composições podem ser parcial ou completamente desidratadas ou aquosas. Os kits aqui contemplados podem ser armazenados em temperaturas ambientes ou em temperaturas refrigeradas, conforme aqui revelado, dependendo da formulação particular.
O meio de recipiente dos kits geralmente incluirá pelo menos um frasco, um tubo de ensaio, um vidro, uma garrafa, uma seringa ou outro meio de recipiente, em que possa ser colocada uma composição e, de preferência, adequadamente aliquotada. Nos casos
32/49 em que é proporcionado um componente adicional, o kit também conterá geralmente um ou mais recipientes adicionais em que pode ser colocado este agente ou componente. Estes kits também incluirão tipicamente um meio para contenção do reagente, composição e quaisquer outros recipientes de reativos em confinamento fechado para venda comercial. Esses recipientes podem incluir recipientes de plástico moldados por injeção ou sopro em que os frascos desejados ficam retidos.
Exemplos
Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar certas modalidades aqui apresentadas. Deve ser observado por aqueles de capacidade na técnica que as técnicas reveladas nos Exemplos que se seguem representam técnicas descritas para funcionar bem nas práticas aqui reveladas e, deste modo, podem ser consideradas constituir modos preferências para a sua prática. Todavia, aquelas pessoas de capacidade na técnica devem, levando em conta a presente revelação, observar que podem ser feitas muitas mudanças nas modalidades específicas que são descritas e ainda obter um resultado parecido ou semelhante sem sair deste espírito e escopo.
Exemplo 1
Estabilidade de Base do Flavivírus DEN-2 PDK 53 em Fase Liquida
Num método ilustrativo, foi investigada a estabilidade térmica para o flavivírus em fase líquida. De acordo com este método, foi determinada a estabilidade de base do vetor de vacina parental DEN2 PDK 53, armazenado em solução salina tamponada com fosfato (PBS), a temperaturas diferentes (Tabela 1). Num exemplo, foi incubado lxlO4 pfu de vírus DEN-2 PDK 53 num volume total de 0,5ml PBS, em 2ml
33/49 frascos de tampa roscada a 4°C, à temperatura ambiente (~21°C) ou a 37°C. Depois de 24 horas de incubação, foi determinado o título viral e a atividade por um ensaio de titulação de placa de revestimento de agarose de Neutro Vermelho em células Vero. Como ilustrado na Tabela 1, a incubação de DEN-2 PDK 53 em PBS a 4°C resulta numa diminuição quádrupla média no título viral e na perda completa da atividade viral, quando incubada a 37°C durante o mesmo período. Estes resultados demonstram a estabilidade relativamente deficiente do flavivírus DEN-2 PDK 53 na ausência de excipientes estabilizantes.
Tabela 1
Estabilidade do Vírus Den-2 de PDK53
Armazenado por 24 Horas a Temperaturas Diferentes.
Temperatura Formulação Perda Percentual do Título Viral
4°C PBS 75
~21°C PBS 78
37°C PBS 100
Exemplo 2
Efeitos de Estabilização das Composições
Em certas composições exemplificativas, os excipientes farmaceuticamente aceitáveis aqui tidos em consideração que ajudam na estabilidade térmica de vacinas virais vivas são conhecidos na técnica. Num método exemplificativo, o PBS foi usado como uma composição de base para avaliar os efeitos estabilizantes de diferentes excipientes. Nestes exemplos, foi feita uma solução de estoque de cada excipiente em PBS e o pH ajustado para aproximadamente 7,1 com
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NaOH, com exceção de quitosan, onde o pH da solução de estoque foi ajustado para aproximadamente 6,8. Os excipientes foram diluídos em PBS para as concentrações finais indicadas (p/v) (Tabela 2). De acordo com este método, IxlO4 pfu de vírus DEN-2 PDK 53, em meio livre de 5 soro, foram adicionados a 0,5ml de cada composição e armazenados a
37°C por 24 horas. A seguir à incubação, a atividade e o título viral foram determinados por titulação em placa em células Vera, como descrito acima. Segundo ilustrado na Tabela 2, os efeitos estabilizantes de composições que incluem um excipiente único, a várias concentra10 ções comparáveis aos exemplos experimentais prévios, foram mínimos.
Todavia, alguns excipientes, por exemplo, a trehalose e a albumina do soro humano recombinante (rHSA), foram mais efetivos do que outros para estabilizar o vírus DEN-2 PDK 53 a 37°C. Os resultados do estudo representados na Tabela 2 também revelaram que podem ser obtidos 15 efeitos estabilizantes aumentados de vários excipientes, incluindo rHSA e trehalose, dentro certas faixas de concentrações destes excipientes. Neste exemplo particular, a trehalose foi mais efetiva a concentrações acima 15% (p/v) e F127 a concentrações entre 0,5 e 3%.
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Tabela 2
Efeitos de Diferentes Excipientes Sobre a Estabilidade do DEN-2
PDK53, Quando Armazenado a 37°C, Durante 24 horas
Formulação Perda Percentual do Título Viral
PBS 100,0
10% de sucrose 99,9
15% de sucrose 98,3
20% de sucrose 96,4
25% de sucrose 93,4
2% de Trehalose 98,3
5% de Trehalose 97,0
10% de Trehalose 93,3
15% de Trehalose 83,3
2% de Manitol 100,0
5% de Manitol 100,0
10% de Manitol 99,8
15% de Manitol 86,7
5% de Sorbitol 100
10% de Sorbitol 99,9
15% de Sorbitol 99,9
1% de Polivinil Pirrolidona 100,0
5% de Polivinil Pirrolidona 100,0
10% de Polivinil Pirrolidona 100,0
0,2% de F127 99,6
0,5% de F127 99,6
1% de F127 99,5
2% de F127 99,5
10% de F127 99,9
0,1% de rHSA 91,2
36/49
0,5% de rHSA 95,0
1,0% de rHSA 89,0
3,0% de rHSA 89,0
5,0% de rHSA 97,5
0,05% de Quitosan 99,0
0,1% de Quitosan 99,0
Exemplo 3
Efeitos Estabilizantes de Composições que Incluem Combinações Especificas de Excipientes
No procedimento ilustrativo seguinte, foram testadas composições que incluiam excipientes múltiplos em diferentes combinações e concentrações quanto aos efeitos estabilizantes sobre a vacina flaviviral pai DEN -2 PDK 53. Os excipientes foram diluídos às concentrações finais indicadas em PBS a partir de soluções de estoque conforme descrito no Exemplo 2. Foram incubados 1x104 pfu de vírus da vacina DEN-2 PDK 53 a 37°C em 0,5ml de cada composição por 21 horas (Figura 1) ou num período de 48 horas (Figura 2). Nos intervalos de tempo especificados, foi determinado o título e a atividade viral por um ensaio de titulação de placa como descrito no Exemplo 1. A Figura 1 representa resultados exemplificativos desta demonstração expressos como porcentagem do título viral que permanece depois da incubação, em relação à entrada, e como logio da perda do título na Figura 2. A análise de combinações diferentes de excipientes, nesta ilustração particular, revelou que as formulações que consistem num sacarídeo, um surfactante não iônico de co-polímero plurônico e uma proteína foram ótimas para melhorar a estabilidade de DEN-2 PDK 53 a 37°C. Formulações incluindo a trehalose, F127 e rHSA tiveram os maiores efeitos estabilizantes. Inesperadamente, os efeitos estabilizantes combinados destes três excipientes foram muito maiores do que a soma
37/49 daqueles observados em cada componente individual, sugerindo sinergismo entre os componentes. A estabilidade térmica melhorada do flavivírus DEN-2 PDK 53 foi obtida pelas atividades sinergéticas da combinação de trehalose, F 127 e rHSA e não poderia ter sido antecipada com base nos exemplos da técnica anterior. As Figuras 1 e 2 também ilustram que o efeito estabilizante da mistura de trehalose/F127/rHSA foram ainda intensificados pela adição de 0,05% de quitosan. A Figura 2 mostra que a taxa de inativação viral, quando armazenada num período de 48 horas a 37°C, é significativamente reduzida por composições contendo trehalose, F 127 e rHSA. Os exemplos da técnica sugerem que a estabilidade do flavivírus pode ser intensificada por formulações contendo cátions divalentes de Ca2+ e Mg2+. Todavia, como representado nas Figuras 1 e 2, a adição de Ca2+ (0,0009M) e Mg2+ (0,0005M) a uma formulação não confere nenhuns benefícios estabilizantes adicionais. Os resultados a partir da Figura 2 sugerem que a adição de cátions divalentes pode ter um impacto negativo para a estabilidade viral em fase líquida a longo prazo no contexto de modalidades particulares.
Num método exemplificativo, foi avaliada uma composição incluindo trehalose, F 127 e rHSA quanto às suas propriedades estabilizantes com flavivírus múltiplos. Foi determinada a estabilidade do flavivírus quimérico DEN-2 que expressa a membrana e proteínas de envelope a partir dos vírus do Nilo Oeste (DEN-2/WN), da Dengue 1 (DEN-2/D1), da Dengue 3 (DEN-2/D3 ou da Dengue 4 (DEN-2/D4) como descrito para o Exemplo 1. Os resultados ilustrativos na Tabela 3 revelam uma estabilidade muito melhorada na fase líquida de todos os flavivírus quiméricos, quando armazenados numa composição que inclui trehalose, F127 e rHSA. As diferentes quimeras expressam proteínas de envelope e membrana diferentes de cinco flavivírus serologicamente distintos. Além disso, o vírus do Nilo Oeste e os vírus da dengue são significativamente divergentes. Este resultado sugere que
38/49 estas composições podem ser úteis para a estabilização na fase líquida de diversos membros da família de Flaviviradae assim como também outras famílias de vírus. A capacidade de estabilizar os flavivírus à temperatura ambiente (~21°C) e a 4°C foi examinada por procedimentos 5 representativos conforme esboçado pelo Exemplo 1. Os resultados exemplificativos, ilustrados na Tabela 4, revelam que uma composição que inclui trehalose, F127 e rHSA efetivamente preserva a atividade viral por 7 dias a 21 °C e por 48 dias a 4°C.
39/49
Tabela 3
Estabilidade de Diferentes Flavivirus Quiméricos Armazenados a
37°C por 21 horas em PBS ou uma Composição (Fl) que Inclui 15% de Trehalose, 2% de F127 e 1% de rHSA
Vírus Formulação Perda Percentual do Titulo Viral
DEN-2/WN PBS 2
Fl 45
DEN-2/D1 PBS 0,2
Fl 22
DEN-2/D3 PBS 0,3
Fl 30
DEN-2/D4 PBS 1
Fl 28
Vírus Temperatura Formulação Percentagem Remanescente do Título Viral
7 dias 48 dias
DEN-2 PDK-53 21°C PBS 0 0
21°C Fl 100 0
4°C PBS 0 0
4°C Fl 100 100
DEN-2/WN 21°C PBS 0 0
21°C Fl 100 0
4°C PBS 0 0
4°C Fl 100 100
40/49
Exemplo 4
Uso de Componentes Alternativos
Foi usado outro método exemplificativo para comparar os efeitos estabilizantes da albumina do soro bovino (BSA) e gelatina com aquele da rHSA e dos diferentes copolímeros plurônicos. Foram conduzidos ensaios de estabilidade viral de DEN-2 PDK 53 conforme delineados previamente pelos Exemplos 1 e 2. Os exemplos prévios sugeriram que as formulações incluindo trehalose, F127 e rHSA melhoraram otimamente a estabilidade térmica do vírus da vacina parental DEN-2 PDK 53. Conforme mostrado, por exemplo, na Figura 3, os efeitos estabilizantes da albumina do soro bovino são comparáveis àqueles da rHSA só ou em combinação com trehalose e F127. A Figura 3 também demonstra que, como excipientes isolados, a gelatina é comparável a rHSA para estabilizar DEN-2 PDK 53 a 37°C. Todavia, neste método exemplificativo, diferentemente de BSA, a gelatina não parece ser um substituto efetivo para o rHSA em composições também contendo trehalose e F127. Deste modo, embora possam ser usadas proteínas diferentes de rHSA em combinação com a trehalose e F127 para ajudar na estabilização de vacinas flavivirais, o uso de uma albumina do soro ou proteínas estreitamente relacionadas é mais apropriado de acordo com este método exemplificativo. Além disso, a Figura 3 ilustre que, como excipientes isolados, o polímero Plurônico P123 é comparável ao Plurõnico F127 quanto à sua capacidade de estabilizar o vírus DEN-2 PDK-53. Todavia, neste método exemplificativo, P123 não parece ser um substituto efetivo para F127 em composições também contendo trehalose e albumina do soro. Como exemplificado na Figura 4, as composições contendo trehalose, rHSA e outros surfactantes farmacêuticos comumente usados tais como Polisorbate 20 (Tween 20), em vez de um co-polímero plurônico, não são efetivos para estabilizar DEN-2 PDK 53 em relação a formulações contendo um co-polímero plurônico. Estes
41/49 métodos exemplificativos sugerem melhores eficiências de estabilização de formulações contendo distintos surfactantes de co-polímeros plurônicos de elevado peso molecular.
Dados exemplificativos são, além disso, ilustrados na Figura 4. A Figura 4 representa a estabilidade do vírus DEN-2 PDK 53 em composições contendo diferentes surfactantes. DEN-2 PDK 53 foi armazenado a 37°C por 23 horas em cada formulação. Os surfactantes avaliados neste exemplo incluem n-octil-p-D-glucopiranosídeo (β-OG), Polisorbate 20 (P 20), Polisorbate 80 (P 80) e F127 (F). Outros componentes de formulação incluem trehalose (T) e rHSA (A). Os valores são expressos como porcentagem do título viral que permanece depois da incubação em relação ao título da entrada.
Exemplo 5
Comparação dos Efeitos Estabilizantes de Diferentes Composições
As propriedades estabilizantes de uma composição exemplificativa foram comparadas com aquelas de composições conhecidas na técnica. Uma composição de estabilizante para vacinas flavivirais vivas, descrita na técnica (Patente US 4.500.512) inclui 4% de lactose, 2% de sorbitol, O,lg/L de CaCU, 0,076 de MgSCU e aminoácidos na ordem de 0,0005M a 0,05M em PBS. Outra composição reportada por Adebayo e colaboradores (1998) consiste em 10% de sacarose, 5% de lactoalbumina, 0,1 g/L de CaCh e 0,076 g/L de MgSO4. Num método exemplificativo, as propriedades estabilizantes destas formulações foram comparadas com uma modalidade particular aqui. Numa composição de exemplo, Fl, esta composição inclui 15% de trehalose, 2% de F127 e 1% de HSA recombinante. F2 é a formulação da Patente US 4.500.512 sem aminoácidos e F3 é a mesma formulação com os aminoácidos histidina
42/49 e alanina. F4 é a composição de Adebayo e colaboradores. Foram incubados lx 104 pfu de vírus da vacina DEN-2 PDK 53 a 37°C em 0,5ml de cada composição por 23 horas, depois do que a atividade e o título viral foram analisados conforme descrito no Exemplo 1. Como exemplificado na Figura 5, algumas modalidades, por exemplo, a formulação Fl, representam uma melhoria significativa sobre aquelas composições previamente descritas. No exemplo mostrado, virtualmente nenhuma atividade viral foi recuperada depois de armazenagem nas formulações conhecidas na técnica (formulações F3 e F4), ao passo que acima de 50% do título viral inicial foram recuperados depois de armazenagem numa composição aqui descrita. Estes resultados revelam que as formulações prévias são ineficazes para promover a estabilidade de vacinas virais vivas durante a armazenagem em fase líquida.
Exemplo 6
Preservação da Atividade Viral
Depois de Múltiplos Congelamentos-Descongelamentos
Num método exemplificativo, foi demonstrada a capacidade de selecionar composições para preservar a atividade viral depois de ciclos de congelamento-descongelamento. Foram suspensos 1x104 pfu de DEN-2 PDK 53 de vírus de vacina em 0,5 ml de cada composição em frascos de tampa de rosca. Para o primeiro ciclo de congelamentodescongelamento, foram congelados frascos a -80°C por 24 horas e descongelados rapidamente a 37°C. Isto foi imediatamente seguido por um segundo ciclo de congelamento-descongelamento onde os frascos f coram congelados a -80°C por 1 hora e descongelados rapidamente a 37°C. O título e a atividade viral foram, então avaliados por um ensaio de titulação de placa como descrito no Exemplo 1. Como ilustrado na Figura 6, composições particulares que incluem trehalose, F127 e rHSA preservaram efetivamente a atividade viral completa por dois ciclos de
43/49 congelamento-descongelamento. Adicionalmente, as composições incluindo estes três excipientes foram mais efetivas do que aquelas contendo apenas um excipiente único. Os resultados desta experiência ilustrativa particular sugerem que as composições e métodos aqui descritos são um efetivo crioprotetor para vacinas flavivirais e podem facilitar a preservação viral durante a secagem por congelamento, secagem por spray ou outras técnicas de desidratação.
Exemplo 7
Estabilização de Outro Vírus Vivos Atenuados
Os exemplos previamente ilustrados revelam a estabilização efetiva em fase líquida de vários flavivírus vivos atenuados em composições que incluem trehalose, F127 e rHSA. Ê antecipado que modalidades aqui descritas podem também ser efetivas para estabilizar outros vírus vivos atenuados. Por exemplo, uma formulação incluindo trehalose, F 127 e rHSA pode ser usada para estabilizar vírus vivos atenuados do sarampo, um vírus atenuado sindbis, um vírus atenuado da gripe, um adenovirus atenuado recombinante ou um vírus da vacínia atenuado recombinante. Num método exemplificativo, estes vírus não flavivirais podem ser suspensos e mantidos em fase líquida, numa composição que inclui trehalose, F127 e rHSA diretamente depois da colheita a partir da cultura de células. Noutro método ilustrativo, vírus não flavivirais podem ser suspensos numa composição antes ou subseqüente ao congelamento ou secagem por spray. A estabilidade viral estatisticamente melhorada pode demonstrar que a formulação desta modalidade é aplicável a outras vacinas virais atenuadas fora da família do Flavivírus. Aquelas pessoas qualificadas na técnica reconhecem que a aplicação pode, então, ser estendida a outros vírus vivos atenuados.
Exemplo 8
44/49
Segurança e imunogenicidade in vivo
Interações moleculares entre excipientes e componentes moleculares ou celulares podem servir não só para intensificar a estabilidade de vacinas virais, mas também para ocasionar danos aumentados nas células ou de tecidos in vivo. As formulações podem diminuir a imunogenicidade destas vacinas virais em animais vivos. Neste exemplo, é demonstrado que as composições exemplificativas são seguras depois da injeção subcutânea e são essencialmente inertes do ponto de vista imunológico. Quatro diferentes composições exemplificativas foram selecionadas para teste em camundongos como se segue.
Formulação 1: 15% de Trehalose, 2% de F-127, 1% de rHSA
Formulação 2: 15% de Trehalose, 2% de F-127, 1% de rHSA, ImM CaCl2/0,5mM MgSO4
Formulação 3: 15% de Trehalose, 2% de F-127, 1% de rHSA, 0,5% de quito san
Formulação 4: 22,5% de Trehalose, 3% de F-127, 1,5% de rHSA
Formulação 5: PBS
Em certos métodos aqui descritos, grupos de 8 ou 9 camundongos NIH suíços foram imunizados por injeção subcutânea com 1x105 pfu de uma vacina de flavivírus recombinante formulada DEN-2 PDK-53/WN no dia 0 (dO), foram reforçados com a mesma vacina formulada em d29 e foram, então, provocados (sujeitos a teste) com 103 pfu sobre uma cepa patogênica do Nilo Oeste (NY99) em d45. Camundongos de controle (quatro grupos de 8) receberam formulações 1 - 4 só, sem vírus. Não foi observado nenhum evento adverso depois da administração em nenhum dos ratos imunizados. Deste modo, neste exemplo, nenhum evento adverso aparente são causados pelas formulações exemplificativas com ou sem vírus da vacina. Os soros foram coletados antes da imunização no dO, antes do reforço em d28, antes da provocação em d44 e pós-provocação em d75. Os títulos de anticorpos de neutralização do Nilo Oeste foram determinados por testes de neutrali5 zação de redução de placa (PRNT). Os resultados do estudo são representados na Tabela 5.
σ> ΜΌ
Μ10 rt <υ
% de Sobrevivência 100 100 100 88,9 100 21,9
Sobrevivência oo 00 8/8 00 00 8/9 6/6 7/32
Pós-Provocação (d75) %SC i 100 100 100 1 100 100 100
GMT ίο 830 1.810 1.660 1.742 1.280
Pós-Reforço (d44) %sc 100 100 100 i I 100 100 o
GMT 123 226 123 co 109 i-H
Pós-Prime (d280 o ω sp 0s 87,5 in of 10 100 io 10 66,7 o
rd S O 30 O 40 O o r-H
Número oo 00 oo σ> 32
Formulação r-H CM co v· in Controle
2 % SC =porcentagem de animais que foram soro-convertidos com títulos PRNT >10.
47/49
Uma maioria de animais que receberam a vacina DEN2/WN soro-converteram-se depois da primeira dose, não importando se não foi usada nenhuma formulação (Formulação 5) ou uma das formulações exemplificativas (Formulações 1-4). Além disso, todos os animais vacinados soro-converteram-se depois da administração do reforço. Os títulos PRNT de médias geométricas (GMT) demonstram poucas diferenças entre os grupos de vacinas. Os títulos eram baixos depois da imunização primária, aumentaram 3-10 vezes depois do reforço e, então, mostraram uma drástica resposta anamnéstica após a provocação. 100% de todos os animais vacinados sobreviveram à provocação, novamente independentemente da formulação da vacina. Apenas 22% dos animais de controle sobreviveram; aqueles que sobreviveram mostraram evidências de potentes respostas de anticorpos de neutralização depois da provocação. Uma vantagem é que este exemplo demonstra que as formulações exemplificativas não reduzem a capacidade de uma vacina DEN-2/WN recombinante exemplificativa em prevenir a doença do Nilo Oeste num camundongo.
Exemplo 9
Noutro exemplo, foram usadas composições líquidas contendo trehalose, rHSA e F127 para estabilizar um flavivírus quimérico do Nilo Oeste armazenado durante vários períodos a 25°C ou 4°C. Foram incubados IxlO4 pfu de vírus quimérico da vacina DEN-2/WN a cada temperatura e a atividade viral foi avaliada em intervalos de uma ou duas semanas, conforme descrito no Exemplo 1. Como ilustrado nas Figuras 7 e 8, formulações contendo trehalose, rHSA e F127 melhoraram significativamente a estabilidade térmica do vírus da vacina DEN-2/WN durante a armazenagem a 25°C e 4°C, respectivamente. A 25°C, a perda da atividade viral foi menor do que um log durante 7 dias. A 4°C, a inativação viral foi desprezível para períodos até 12 semanas, quando armazenadas em formulações exemplificativas incluindo treha48/49 lose, F127 e rHSA.
Exemplo 10
Noutro método exemplificative, foram demonstrados os efeitos estabilizantes de composições que incluíam trehalose, rHSA e um co-polímero plurônico com vacinas DEN-2 PDK 53 desidratadas. IxlO4 pfu de vírus de vacina DEN-2 PDK 53 formulada conforme procedimentos aqui descritos. As vacinas formuladas foram colocadas em frascos de soro e sujeitas a procedimentos convencionais de liofilização. As vacinas secas foram tampadas sob vácuo, armazenadas a 37°C ou 4°C por 14 dias, seguido de reconstituição da vacina para o seu volume líquido original por adição de água estéril. A atividade viral da vacina reconstituída foi avaliada conforme antes esboçado. A 37°C, na presença de composições contendo trehalose, rHSA e um co-polímero plurônico formulado em solução salina tamponada com fosfato, foi observada uma perda média de título viral de 1 log (Figura 9). Nenhuma perda na atividade viral foi observada para vacinas virais formuladas DEN-2 PDK 53 desidratadas armazenadas a 4°C por 14 dias. Estes resultados demonstram a preservação efetiva de uma vacina viral desidratada utilizando as composições aqui descritas.
A Figura 9 representa a estabilidade de DEN-2 PDK 53 liofilizadas a diferentes temperaturas. Perda de título em log de vírus da vacina formulada liofilizada DEN-2 PDK 53 a seguir á incubação a 37°C ou 4°C por 2 semanas como indicado. As formulações F1 (15% de trehalose, 2% de F127, 1% de rHSA) e F2 (15% de trehalose, 2% de F127, 0,01% de rHSA) foram formulada em solução salina tamponada com fosfato. A formulação F3 (15% de trehalose, 2% de F127, 0,01% de rHSA) foi formulada em base Tris 10 mM.
Todas as composições e os métodos aqui descritos e reivindicados podem ser feitos e executados sem experimentação indevida,
49/49 levando em conta a presente revelação. Embora as composições e os métodos tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, é evidente para aquelas pessoas de capacidade na técnica que podem ser aplicadas variações às Composições e Métodos e nas etapas ou na 5 seqüência de etapas dos métodos aqui descritos sem sair deste conceito, espírito e escopo. Mais especificamente, certos agentes que são tanto química como fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes aqui descritos, enquanto seriam alcançados os mesmos resultados ou semelhantes. Todos esses substitutos semelhan10 tes e modificações evidentes para aquelas péssoas qualificadas na técnica são considerados estarem dentro do espírito, escopo e conceito, conforme definido pelas Reivindicações anexadas.
Todos os documentos ou partes de documentos, citados neste Pedido, incluindo, mas, sem limitação, Patentes, Pedidos de 15 Patentes, artigos, livros e tratados, ficam, por este meio, expressamente incorporados, por referência, na sua totalidade.

Claims (22)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1 - Composição de Vírus Vivo Atenuado, caracterizada pelo fato de que compreende:
    um ou mais vírus vivos atenuados;
    um ou mais copolímeros em bloco de poli(óxido de etileno) e poli(óxido de propileno) (EO-PO), em que os copolímeros em bloco EOPO incluem poloxâmero 407 (Pluronic® F127);
    um ou mais agentes proteicos, em que um ou mais agentes proteicos são uma ou mais albuminas selecionadas a partir do grupo que consiste em lactalbumina e albumina do soro; e um ou mais agentes de carboidrato, em que um ou mais agentes de carboidrato incluem trealose, em que a composição é capaz de reduzir a inativação de um ou mais vírus atenuados vivos.
  2. 2 - Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende:
    um ou mais flavivírus vivos atenuados;
    uma ou mais albuminas com uma concentração de 0,001% a 3,0% (p/v); e trealose tendo uma concentração de 5% a 50% (p/v), em que a composição é capaz de reduzir a inativação de uma ou mais de um ou mais vírus vivos atenuados.
  3. 3 - Composição, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os vírus atenuados vivos são selecionados do grupo que consiste em Flavivirus, Togavirus, Coronavirus, Rhabdovirus, Filovirus, Paramixovirus, Orthomixovirus, Buniavirus, Arenavirus, Retrovirus, Hepadnavirus, Herpesvirus, Famílias de Vírus da Varíola e combinações dos mesmos.
  4. 4 - Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que os vírus atenuados
    Petição 870190114554, de 08/11/2019, pág. 11/41
    2/4 vivos são Flavivírus.
  5. 5 - Composição , de acordo com qualquer uma das Reivindicações 2 a 4, caracterizada pelo fato de que um ou mais Flavivírus são vírus da dengue.
  6. 6 - Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a composição está na forma aquosa.
  7. 7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a composição é adaptada para ser parcial ou totalmente desidratada.
  8. 8 - Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais albuminas são albumina do soro derivada de uma espécie de vertebrado.
  9. 9 - Composição de Vírus Vivo Atenuado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o um ou mais copolímeros em bloco EO-PO é o poloxâmero 407, o um ou mais agentes proteicos é a albumina sérica e o um ou mais agentes carboidratos é a trealose.
  10. 10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a concentração de poloxâmero 407 (Pluronic F127®) é de 0,1 a 4% (p/v), em que a concentração de albumina sérica é de 0,001 a 3% (p/v) e a trealose concentração é de 5 a 50% (p/v).
  11. 11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais albuminas são selecionadas do grupo que consiste em albumina sérica bovina e albumina sérica humana.
  12. 12 - Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais albuminas são uma albumina recombinante.
    Petição 870190114554, de 08/11/2019, pág. 12/41
    3/4
  13. 13 - Método de Diminuição da Inativação de Virus Vivo Atenuado, caracterizado pelo fato de que compreende combinar um ou mais virus vivos atenuados com uma composição que compreende um ou mais copolímeros de blocos EO-PO, em que os copolímeros de blocos EO-PO incluem poloxâmero 407 (Pluronic® F127);
    um ou mais agentes protéicos, em que um ou mais agentes proteicos são uma ou mais albuminas selecionadas a partir do grupo que consiste em lactalbumina e albuminas do soro, e um ou mais agentes de carboidratos, em que um ou mais agentes de carboidratos incluem trealose, em que a composição é capaz de reduzir a inativação do vírus vivo atenuado.
  14. 14 - Método, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os vírus atenuados vivos são selecionados do grupo que consiste em Flavivirus, Togavirus, Coronavirus, Rhabdovirus, Filovirus, Paramixovirus, Orthomixovirus, Buniavirus, Arenavirus, Retrovirus, Hepadnavirus, Herpesvirus, Famílias de Virus da Varíola e combinações dos mesmos.
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que os vírus vivos atenuados são Flavivírus e os Flavivírus são vírus da dengue.
  16. 16. Método de diminuição da inativação de um vírus vivo atenuado, de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de desidratar ainda parcial ou totalmente a combinação.
  17. 17. Método de diminuição da inativação de um vírus vivo atenuado, de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de ainda reidratar parcial ou totalmente a composição antes da administração.
  18. 18 - Kit para diminuir a inativação de uma composição de vírus vivo atenuado, caracterizado pelo fato de que compreende:
    pelo menos um recipiente; e
    Petição 870190114554, de 08/11/2019, pág. 13/41
    4/4 uma composição de vírus vivo atenuado como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
  19. 19 - Uso de uma Composição de Vírus Vivo Atenuado, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é na preparação de composição de vírus a ser administrada a um sujeito para reduzir o início ou impedir uma condição de saúde.
  20. 20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é que a condição de saúde é selecionada a partir do grupo que consiste em infecção do Nilo Oeste, Febre de dengue, Encefalite japonesa, Doença da Floresta de Kyasanur, Encefalite do Vale de Murray, Encefalite de St. Louis, encefalite Tique-borne, febre amarela e Infecção do Vírus C da Hepatite.
  21. 21. Composição de flavivírus vivo atenuado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para reduzir o início ou impedir uma condição de saúde.
  22. 22. Composição de flavivírus atenuado, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a condição de saúde é selecionada a partir do grupo que consiste em infecção do Nilo Oeste, Febre de dengue, Encefalite japonesa, Doença da Floresta de Kyasanur, Encefalite do Vale de Murray, Encefalite de St. Louis, encefalite Tiqueborne, febre amarela e Infecção do Vírus C da Hepatite.
BRPI0809663A 2007-04-06 2008-04-04 composição de vírus vivo atenuado, usos da mesma, métodos de diminuição da inativação de vírus vivo atenuado, e kit para diminuir a inativação de uma composição de vírus vivo atenuado. BRPI0809663B8 (pt)

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