BRPI0810959B1 - Proteína l1 do hpv11, polinucleotídeo, vetor, célula, composição, partícula do tipo vírus (vlp) hpv11, método para produzir uma proteína l1 do hpv, vacina para prevenção de condiloma acuminado ou de infecções por hpv e método para produzir uma vacina para prevenção de condiloma acuminado ou infecções por hpv - Google Patents
Proteína l1 do hpv11, polinucleotídeo, vetor, célula, composição, partícula do tipo vírus (vlp) hpv11, método para produzir uma proteína l1 do hpv, vacina para prevenção de condiloma acuminado ou de infecções por hpv e método para produzir uma vacina para prevenção de condiloma acuminado ou infecções por hpv Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0810959B1 BRPI0810959B1 BRPI0810959-1A BRPI0810959A BRPI0810959B1 BR PI0810959 B1 BRPI0810959 B1 BR PI0810959B1 BR PI0810959 A BRPI0810959 A BR PI0810959A BR PI0810959 B1 BRPI0810959 B1 BR PI0810959B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- protein
- hpv
- hpv11
- vaccine
- vlp
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 132
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 123
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 47
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 34
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 28
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 26
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 10
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 10
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 9
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 abstract description 3
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 49
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 101000936049 Vibrio cholerae serotype O1 (strain ATCC 39315 / El Tor Inaba N16961) Outer membrane lipoprotein Blc Proteins 0.000 description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 7
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229940031416 bivalent vaccine Drugs 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 3
- 229940031351 tetravalent vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 2
- 241000701828 Human papillomavirus type 11 Species 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLMKTBGFQGKQEV-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hexadecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO NLMKTBGFQGKQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124897 Gardasil Drugs 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000642125 Human papillomavirus 11 Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 1
- 101150027802 L2 gene Proteins 0.000 description 1
- WXJKFRMKJORORD-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Ala Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN WXJKFRMKJORORD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 101710157639 Minor capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JUJCUYWRJMFJJF-AVGNSLFASA-N Pro-Lys-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 JUJCUYWRJMFJJF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 description 1
- ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical class OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005448 Trichomonas Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010044620 Trichomoniasis Diseases 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000009329 sexual behaviour Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/12—Keratolytics, e.g. wart or anti-corn preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
proteína l1 do hpv11, polinucleotídeo, vetor, célula, composição, partícula semelhante ao vírus (vlp) hpv11, método para produzir uma proteína l1 do hpv, vacina para prevenção de condiloma acuminado ou de infecções por hpv, uso da proteína, método para prevenção de condiloma acuminado ou infecções por hpv e método para prevenção de condiloma acuminado ou infecções por hpv". a invenção refere-se a uma proteína l1 truncada do papilomavírus humano tipo l1, a uma partícula semelhante a vírus consistindo da proteína, a uma vacina compreendendo dita partícula semelhante a vírus e ao uso da vacina na prevenção de condiloma acuminado ou infecções por hpv.
Description
[001] A invenção refere-se a uma proteína L1 truncada do Papilomavírus Humano tipo 11, a uma partícula semelhante a vírus consistindo da proteína, a uma vacina compreendendo dita partícula semelhante a vírus, e ao uso da vacina na prevenção de condiloma acuminado e de infeção por HPV (especialmente HPV11).
[002] O papilomavírus humano, um vírus não-envelopado do ácido desoxirribonucléico (DNA), pertence ao gênero da família Papovaviridae. O genoma viral é um DNA circular de fita dupla, de aproximadamente 7,2-8kb de extensão, contendo 8 regiões de abertura de leitura (ORFs). O genoma pode ser dividido em três partes, em termos de função: (1) a região precoce (E), com aproximadamente 4,5kb de extensão, codificando 6 proteínas não-estruturais E1, E2, E4~E7, associadas com a replicação, transcrição e transformação do vírus; (2) a região tardia (L), com aproximadamente 2,5KB de extensão, codificando a proteína de capsídeo maior L1 e a proteína de capsídeo menor L2; (3) a região controladora longa (LCR), situada entre o final da região L e o terminal de iniciação da região E, com aproximadamente 800-900bp de extensão e compreendendo elementos reguladores para replicação e expressão de DNA, e não codifica proteínas. As partículas virais têm 45-55 nm de diâmetro, sendo que o nucleocapsídeo, consistindo de L1 e L2, exibe simetria icosaédrica e compreende 72 capsômeros.
[003] Atualmente, existem mais de 90 tipos diferentes de HPV, que causam principalmente doença papilar na pele e mucosa de seres humanos. Os tipos de HPV são divididos em três grupos, dependendo de sua relação com a tumorigênese: (1) grupo de baixo ou nenhum risco carcinogênico, contendo os tipos 6, 11, 39, 41, 42 e 43; 2). grupo de médio risco carcinogênico, contendo os tipos 31, 33, 35, 51 e 52; e (3) grupo de alto risco carcinogênico, contendo os tipos 16, 18, 45 e 56.
[004] A investigação epidemiológica revela que a infecção por HPV (tal como o HPV 6, 11) na mucosa anogenital é a terceira doença sexualmente transmissível mais comum, seguida de tricomoníase e clamídia. As alterações patológicas causadas por HPV dos tipos 6 e 11 respondem por cerca de 90% desses casos. Na América, a infecção por HPV do meato genital entre mulheres ocorre mais frequentemente na faixa etária de 15-25 anos, estando altamente relacionada com o comportamento sexual da pessoa infectada. Na China, a infecção por HPV entre mulheres ocorre o mais frequentemente na faixa etária de 20-29 anos, sendo a taxa de infecção de 1606.1/100.000. Mulheres com mais de 35 anos são as menos infectadas pelo HPV. Porém, já que a maioria de infecções por HPV são sub- clínicas, é difícil estimar com precisão a taxa de infecção. Segundo a estimativa do US CDC, o risco é de aproximadamente 10% durante toda a vida. Além disso, há poucos dados relacionados com infecção por HPV entre indivíduos do sexo masculino, devido à dificuldade encontrada na coleta de amostras e por ser menor a gravidade das consequências. Acredita-se que, atualmente, a taxa de infecção por HPV entre homens esteja bem próxima daquela entre as mulheres. Nos Estados Unidos, o condiloma acuminado é encontrado em 1% de homens adultos sexualmente ativos. O desenvolvimento, portanto, de uma vacina segura e eficiente contra o HPV 6 e 11 seria uma forma eficaz de prevenir doenças sexualmente transmissíveis.
[005] A proteína L1 do HPV, com um peso molecular de 55-60 kDa, é a proteína de capsídeo maior do papilomavírus humano e a proteína-alvo principal da vacina contra o HPV. A proteína L1 do HPV expressada em sistemas de expressão múltiplos diferentes podem formar partículas semelhantes a vírus (VLPs) que lembram morfologicamente as partículas HPV nativas, sem a assistência da proteína L2. A VLP, consistindo de 72 pentâmeros das proteínas L1, exibem simetria icosaédrica. Pelo fato de as VLPs reterem os epítopos nativos das partículas virais, elas são altamente imunogênicas e podem induzir à geração de anticorpos neutralizantes contra HPV homólogo (Kirnbauer, R.,F.Booy, et al. 1992 Proc. Natl.Acad Sci USA 89(24):12180-4). Além disso, as VLPs são seguras e não apresentam risco carcinogênico potencial, por não conterem DNA viral. Portanto, as vacinas VLP tornaram-se as principais candidatas à uma vacina contra o HPV.
[006] A solução para o desenvolvimento de uma vacina consiste em produzir eficientemente vacinas VLP de HPV em larga escala. Atualmente, os sistemas de expressão mais utilizados normalmente são os sistemas de expressão eucarióticos e procarióticos.
[007] Os sistemas eucarióticos geralmente utilizados compreendem poxvírus, baculovírus de inseto e vetores de leveduras. A proteína L1 do HPV expressada em sistemas eucarióticos mostra pouca diferença conformacional em relação àquela do vírus nativo, e podem se auto-montar em VLPs. Sendo assim, VLPs purificadas podem ser facilmente obtidas após centrifugação em gradiente de densidade,o que proporciona bastante conveniência ao trabalho de purificação. Porém, devido aos altos custos envolvidos com cultura e ao baixo nível de expressão, a produção industrial em larga escala é muito difícil. A vacina Gardasil® contra o HPV, lançada no mercado recentemente, é mais cara que as outras devido ao baixo nível de expressão e ao alto custo de produção do sistema de expressão Saccharomyces cerevisiae empregado em sua fabricação.
[008] A expressão da proteína L1 do HPV num sistema procariótico, tal como E.coli, foi anteriormente documentada. Banks, Matlashewski, et al., publicaram um documento relacionado com a expressão da L1 do HPV 16 empregando E.coli (Banks, L., G.Matlashewski, et al. (1987). J.Gen.Virol 68 (Pt 12): 3081-90. Porem, a maioria das proteínas L1 do HPV expressadas através de E.coli perdem sua conformação nativa e não podem induzir à geração de anticorpos protetores contra o HPV. Alternativamente, embora as VLPs do HPV possam ser obtidas a partir de proteínas incorretamente ligadas/moldadas através de etapas tais como purificação de corpos de inclusão e religação, é difícil aplicar esse método numa produção em larga escala, já que a maior parte da proteína se perde durante o processo de religação e o rendimento é baixo (Kelsall, S.R. e J.K.Kulski (1995). J Virol Methods 53(1):75- 90). Embora a proteína L1 do HPV possa ser expressada numa forma solúvel com uma correta conformação em E.coli e dissolvida nos sobrenadantes de lisado de E.coli, o nível de expressão é baixo. Além do mais, por haver um grande número e quantidade de proteínas impuras, torna-se difícil isolar delas as proteínas de interesse. Apesar do relato de que o nível de expressão da proteína L1 pode ser aumentado nos sobrenadantes por meio de expressão de fusão com GST e que a purificação da proteína de interesse é facilitada (Li, M., T.P.Cripe, et al (1997), J.Virol 71(4):2988-95), não se pode ainda aplicar esse método numa produção em larga escala, por serem necessárias enzimas de alto custo para clivar a proteína de fusão.
[009] Portanto, uma proteína L1 do HPV, capaz de induzir a geração de anticorpos protetores contra o HPV, e uma partícula semelhante a vírus compreendendo a mesma ainda são necessárias no estado da técnica, para se produzir vacinas para condiloma acuminado industrialmente em larga escala.
[0010] A presente invenção consiste em prover uma proteína L1 de HPV do tipo 11, as partículas semelhantes a vírus (VLPs) compreendendo a mesma, e uma vacina compreendendo as VLPs.
[0011] Durante a pesquisa, descobriu-se por acaso que o sistema de expressão em E.coli pode produzir uma proteína L1 de HPV11 truncada que por sua vez pode induzir a geração de anticorpos neutralizantes contra o HPV11. Após a purificação, a proteína L1 de HPV11 truncada pode ser produzida com alto rendimento, com pelo menos 50% de pureza. O tratamento adicional da proteína L1 de HPV purificada pode produzir VLPs, que podem induzir a produção de anticorpos neutralizantes contra o HPV11. A invenção foi concluída com base no acima exposto.
[0012] Portanto, o primeiro aspecto da invenção refere-se a proteínas L1 do HPV11 com 3, 4, 5, ou 6 aminoácidos, truncada no terminal N, em comparação com uma proteína L1 do HPV11 tipo selvagem. Preferivelmente, a proteína truncada tem a sequência estabelecida nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3 ou 4, especialmente a sequência estabelecida na SEQ ID NO:1.
[0013] Um outro aspecto da invenção refere-se a um polinucleotídeo que codifica a proteína truncada de acordo com a invenção, e um vetor contendo o polinucleotídeo.
[0014] Um outro aspecto da invenção refere-se a uma célula compreendendo o vetor.
[0015] A invenção também refere-se a uma composição compreendendo a proteína truncada, o polinucleotídeo, o vetor ou a célula.
[0016] Um outro aspecto da invenção refere-se a uma VLP de HPV11, compreendendo ou consistindo de uma proteína L1 de HPV11 com 3, 4, 5, ou 6 aminoácidos, truncada no terminal N, tal como uma proteína L1 de HPV11 tendo uma sequência estabelecida nas SEQ ID NOs.: 1, 2, 3, ou 4.
[0017] Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para obter a proteína L1 do HPV11, compreendendo a expressão de uma fragmento gênico de proteína L1 de HPV11 truncada, num sistema de expressão em E.coli e a subsequente purificação da proteína a partir do sobrenadante de lisado.
[0018] Numa concretização preferida da invenção, um método para obter proteína L1 de HPV11 compreende: a) . expressar o fragmento gênico de proteína L1 de HPV11 truncada num sistema de expressão em E.coli; b) . romper a E.coli, que expressou a proteína L1 do HPV 11 truncada, numa solução salina a uma concentração de 100 mM a 600 mM, e isolar o sobrenadante; c) . reduzir a concentração salina do sobrenadante em b) de 100 mM para 0, inclusive, utilizando água ou uma solução de baixa concentração salina, e coletar um precipitado; d) . redissolver a precipitação em c) numa solução salina a uma concentração de 150 mM a 2500 mM, adicionando-lhe um redutor, e então isolar a solução resultante, sendo que a solução contém a proteína L1 do HPV11 truncada com uma pureza de pelo menos 50%.
[0019] Mais geralmente, a invenção também refere-se a um método para obter uma proteína L1 do HPV, tal como a proteína L1 do HPV11, de acordo com a invenção, compreendendo: a) . expressar o gene HPV L1 que codifica a proteína L1 do HPV num sistema de expressão em E.coli; b) . romper a E.coli, que expressou a proteína L1 do HPV, numa solução salina a uma concentração de 100mM a 600 mM, e isolar o sobrenadante; c) . reduzir a concentração salina do sobrenadante em b). de 100 mM para 0, inclusive, utilizando água ou uma solução de baixa concentração salina e coletar o precipitado; d) . redissolver a precipitação de c) numa solução salina a uma concentração de 150 mM a 2500 mM, adicionando-lhe um redutor, e então isolar a solução resultante, sendo que a solução contém a proteína L1 do HPV com uma pureza de pelo menos 50%.
[0020] A invenção também refere-se a uma vacina para a prevenção de condiloma acuminado ou infecção por HPV, compreendendo VLPs de proteínas L1 do HPV11, de acordo com a invenção. Preferivelmente, a vacina compreende ainda pelo menos uma VLP selecionada de VLPs de proteínas L1 de HPV18, 6, 16, 31, 33, 45, 52 e 58. Geralmente, a vacina contém ainda portadores ou excipientes úteis para vacina.
[0021] Preferivelmente, a vacina compreende VLPs de HPV6 e VLPs de HPV11, especialmente VLPs de HPV6, compreendendo ou consistindo de uma proteína que contém a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:7, e as VLPs de HPV11 compreendendo ou consistindo de uma proteína que possui uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:1. Mais preferivelmente, a vacina compreende ainda VLPs de HPV16 e VLPs de HPV18, especialmente as VLPs de HPV16 compreendendo ou consistindo de uma proteína que possui uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:8 e as VLPs de HPV18 compreendendo ou consistindo de uma proteína que possui uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:9.
[0022] Numa concretização especialmente preferida, a vacina compreende as VLPs de HPV6 compreendendo ou consistindo de uma proteína que possui uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:7, as VLPs de HPV11 compreendendo ou consistindo de uma proteína que possui uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:1, as VLPs de HPV16 compreendendo ou consistindo de uma proteína que possui uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:8 e as VLPS DE HPV18 compreendendo ou consistindo de uma proteína que possui uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:9.
[0023] A invenção refere-se ainda ao uso da proteína L1 do HPV11 ou as VLPs da mesma, na manufatura de uma vacina para a prevenção de condiloma acuminado ou de infecções por HPV.
[0024] A invenção refere-se ainda a um método para prevenir condiloma acuminado ou infecções por HPV, compreendendo administrar uma vacina que compreende uma quantidade preventivamente eficaz de proteína L1 do HPV11 a um humano ou animal necessitado da prevenção de condiloma acuminado ou de infecções por HPV.
[0025] A invenção envolve um método para obter VLPs da proteína L1 do HPV11, compreendendo: e) purificar adicionalmente a proteína L1 de HPV11 truncada com uma pureza de pelo menos 50%, submetendo-a à cromatografia; f) . remover o redutor da proteína L1 do HPV11 obtida em e).
[0026] A presente invenção envolve um método para preparar uma vacina para prevenir condiloma acuminado ou infecções por HPV, compreendendo misturar as VLPs acima e, opcionalmente, uma ou mais VLPs selecionadas do grupo consistindo de VLPs de HPV 6, 16, 18, 31, 33, 45, 52 e 58, com portadores ou excipientes úteis para vacinas.
[0027] De acordo com a invenção, o "sistema de expressão em E.coli" refere-se a um sistema de expressão consistindo de E.coli (cepas) e vetores, sendo que a E.coli (cepas) incluem, porém não se restringem a: GI698, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3) e BLR (DE3), que estão disponíveis no mercado.
[0028] De acordo com a invenção, o termo "vetores" refere-se às ferramentas portadoras de ácido nucléico que podem ter um polinucleotídeo codificando uma proteína nele inserida e que permite a expressão da proteína. O "vetor" pode ter o material genético transportado expressado numa célula hospedeira, através de transformação, transdução, e transfecção na célula hospedeira. Por exemplo, os "vetores incluem plasmídeos, fagos, cosmídeos e similares.
[0029] De acordo com a invenção, o termo "um fragmento gênico de uma proteína L1 de HPV11 truncada" refere-se aos ácidos nucléicos com o(s) nucleotídeo(s) codificando uma ou mais sequências de aminoácido deletadas no terminal 5 'ou 3 ' do gene L1 de HPV11 do tipo selvagem (cDNA). A sequência gênica de extensão completa do gene L1 de HPV11 do tipo selvagem pode ser encontrada, embora não se restrinja, às seguintes sequências NCBI: MI4119.1, AF335603.1 e AF335602.1.
[0030] O termo "proteína L1 de HPV11 truncada" refere-se à proteína com um ou mais aminoácidos deletados no terminal N- e/ou C- da proteína L1 de HPV11 do tipo selvagem. A sequência gênica de extensão completa da proteína L1 de HPV11 do tipo selvagem pode ser encontrada, embora não se restrinja, às seguintes sequências NCBI: M14119.1, AF335603.1 e AF335602.1.
[0031] De acordo com a invenção, o termo "portadores ou excipientes úteis para vacinas" refere-se a um ou mais reagentes, inclusive, porém não limitados a: reguladores de pH, surfactantes, adjuvantes, e intensificadores de potência iônica. Por exemplo, os reguladores de pH incluem, porém não se restringem a tampões fosfato; surfactantes incluem, porém não se restringem a surfactantes aniônicos, surfactantes catiônicos, surfactantes não-iônicos (por exemplo, porém não restritos a Tween 80); adjuvantes incluem, porém não se restringem a hidróxido de alumínio e adjuvante completo de Freund; e intensificadores de potência iônica incluem, porém não se restringem a NaCl.
[0032] De acordo com a invenção, o termo "cromatografia" inclui, porém não se restringe à cromatografia de troca iônica (ex: cromatografia de troca catiônica), cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia absorvente (ex: cromatografia em hidroxiapatita), cromatografia de filtração em gel (cromatografia por exclusão em gel) e cromatografia de afinidade.
[0033] De acordo com a invenção, as proteínas L1 de HPV11 truncadas, podem ser obtidas preferivelmente através das seguintes etapas: a) . romper a E.coli, que expressa a proteína L1 de HPV11 truncada, num tampão contendo concentração salina de 100-600 mM, preferivelmente de 200-500mM; b) . isolar o sobrenadante da solução rompida, e então reduzir a concentração salina do sobrenadante para 100 mM - 0M com água ou um tampão com baixa concentração salina (geralmente com uma concentração salina inferior àquela do tampão utilizada para o rompimento); c) . separar um precipitante do sobrenadante com uma concentração salina tão baixa quanto 100 mM-0; d) . redissolver o precipitante numa solução contendo um redutor e tendo uma concentração salina de 150-2000 mM, preferivelmente maior que 200mM; e) . isolar uma solução das proteínas L1 de HPV11 truncadas com uma pureza de pelo menos 50%, preferivelmente de pelo menos 70%, mais preferivelmente de pelo menos 80%.
[0034] De acordo com a invenção, no método para se obter a proteínas L1 de HPV11 truncadas, o termo "tampão" refere-se a uma solução que pode manter estável o valor de pH dentro de uma certa faixa, inclusive, porém não restrito a: tampões Tris, tampões fosfato, tampões HEPES e tampões MOPS.
[0035] De acordo com a invenção, o rompimento da célula hospedeira procariótica pode ser obtido através de métodos que incluem, mas que não se restringem a um ou mais de rompimento com homogenizador, tratamento ultrassônico, trituração, extrusão sob alta pressão, e tratamento com lisozima.
[0036] De acordo com a invenção, no método para se obter as proteínas L1 de HPV11 truncadas, os sais utilizados incluem, porém não se restringem a um ou mais sais neutros, especialmente sal alcalino metálico, sais de amônio, cloridratos, sulfatos, bicarbonatos, sais de fosfato ou hidrogenosulfatos, especialmente NaCl, KCl, NH4Cl (NH4)2SO4. NaCl é preferido. O redutor utilizado inclui, porém não se restringe a DTT e 2-mercaptoetanol, numa quantidade que inclui, porém não se restringe a 10-100mM.
[0037] De acordo com a invenção, as VLPs da proteína L1 de HPV11 truncada podem ser produzidas através das seguintes etapas: purificar adicionalmente a proteína L1 de HPV truncada, com uma pureza de pelo menos 50% submetendo-a à cromatografia, obtendo assim uma solução de proteína L1 de HPV11 truncada; e remover o redutor da solução de proteína L1 de HPV11 purificada, e desta forma obter as VLPs da proteína L1 de HPV11 truncada. Métodos para remover o redutor incluem, porém não se restringem a técnicas conhecidas no estado da técnica, tais como diálise, ultrafiltração e cromatografia.
[0038] De acordo com a invenção, a proteína L1 de HPV truncada preferivelmente possui a sequência estabelecida em SEQ ID NO:1.
[0039] De acordo com a invenção, a vacina pode ser administrada numa forma aceitável ao paciente, inclusive, porém não restrita à administração oral e injeção, preferivelmente injeção.
[0040] De acordo com a invenção, a vacina é preferivelmente utilizada numa dose unitária. Cada dose unitária contém de 5- 80μ g de VLP de L1 de HPV11 truncada, preferivelmente 20-40μ g.
[0041] Atualmente, os sistemas de expressão úteis para o preparo de VLPs de HPV incluem sistemas de expressão eucarióticos e procarióticos.
[0042] As proteínas L1 de HPV expressas em sistemas de expressão eucarióticos retém sua conformação nativa e podem formar VLPs por si próprias. Na maioria dos casos, VLP com conformação correta pode ser obtida através de purificação simples. Entretanto, os sistemas de expressão eucarióticos, tais como os sistemas de expressão em baculovírus e leveduras são de difícil aplicação em produção industrial em larga escala devido aos baixos níveis de expressão e aos altos custos envolvidos.
[0043] Sistemas de expressão procarióticos, tais como os sistemas de expressão em E.coli apresentam as vantagens de altos níveis de expressão a um custo mais baixo. Porém, quando expressada num sistema procariótico, a proteína L1 de HPV geralmente perde sua conformação nativa e é expressada numa forma de corpos de inclusão no precipitante. A renaturação da proteína a partir de corpos de inclusão ainda representa um problema em todo o mundo. Devido à dificuldade e ineficiência da renaturação, esse método limita-se à pesquisa em pequena escala a nível laboratorial, não podendo ser aplicada em larga escala para se obter VLP com uma conformação correta a partir de corpos de inclusão. Embora a proteína L1 do HPV possa existir em sua conformação nativa no sobrenadante de lisado de E.coli, seus níveis de expressão são baixos. Além disso, é muito difícil purificar a proteína L1 do HPV das numerosas proteínas solúveis no sobrenadante de lisado de E.coli. Geralmente, a purificação é concluída através de meios tais como expressão em fusão e cromatografia por afinidade, métodos não viáveis para processos em escala industrial, devido ao alto custo das enzimas neles empregadas.
[0044] Na presente invenção, a proteína L1 de HPV11 N- truncada, é expressada num sistema de expressão em E.coli, e é seletivamente precipitada do sobrenadante de lisado de E.coli sob condições brandas. A proteína L1 do HPV11 é então redissolvida num tampão salino para melhorar significativamente sua pureza, enquanto ao mesmo tempo mantém sua conformação nativa. A proteína de interesse redissolvida pode ser imediatamente submetida à cromatografia de troca iônica ou cromatografia por interação hidrofóbica para se obter a proteína pura. A proteína L1 de HPV11 truncada e purificada, obtida nessas etapas, podem se auto-montar em VLPs com boa imunogenicidade e com a capacidade de induzir anticorpos neutralizantes de alta titulação contra o HPV11, que é uma boa vacina para a prevenção de infecção por HPV11 em humanos.
[0045] Além disso, a proteína L1 do HPV11 truncada utilizada na presente invenção, com a antigenicidade e capacidade de auto-montagem de partícula da proteína L1 de HPV11 de extensão completa mantidas, é facilmente expressada num sistema de expressão em E.coli, podendo ser purificada de forma econômica sem utilizar enzimas caras. Além disso, pelo fato de a proteína de interesse não ser submetida aos procedimentos intensivos de desnaturação e renaturação durante a purificação, o método pode ser aplicado industrialmente em larga escala devido ao baixo custo.
[0046] A invenção ficará mais compreensível, mediante a descrição detalhada e os desenhos a seguir. Todas as referências públicas são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
[0047] A Figura 1 mostra o resultado de SDS-PAGE da proteína HPV11N4C-L1 durante as etapas a)-d) do método de acordo com a invenção. Faixa 1: sobrenadante de lisado; Faixa 2: proteína HPV11N4C-L1 precipitada através de fluxo tangencial; Faixa 3: proteína HPV11N4C-L1 numa solução de resuspensão. O resultado mostra que a pureza da HPV11N4C-L1 atingiu cerca de 70% após as etapas de precipitação e redissolução;
[0048] A Figura 2 mostra o resultado de SDS-PAGE da proteína HPV11N4C-L1 que foi obtida na etapa d) e que foi adicionalmente purificada de acordo com a etapa e). Faixa 1: HPV11N4C-L1 purificada de acordo com a etapa e), 10μ L; Faixa 2: HPV11N4C-L1 purificada de acordo com a etapa e), 20μ L. O resultado mostra que HPV11N4C-L1 purificada de acordo com a etapa e) atingiu uma pureza de cerca de 98%;
[0049] A Figura 3 mostra a fotografia de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de VLPs de HPV11N4C-L1 obtidas na etapa f), num aumento de 50.000x. Observou-se grande quantidade de VLPs num raio de cerca de 25 nm em campo visual, sendo que o tamanho de partícula era consistente com o tamanho teórico e as partículas homogêneas;
[0050] A Figura 4 mostra o resultado de medição de difusão de luz dinâmica das VLPs de HPV11N4C-L1 obtidas na etapa f). O resultado mostra que a VLP de HPV11N4C-L1 tinha um raio hidrodinâmico de 27,19 nm e uma taxa de montagem de partícula de 96,7%;
[0051] A Figura 5 mostra títulos de anticorpos neutralizantes em soro em diferentes estágios após vacinação de coelho com VLPs de HPV11N4C-L1. As datas de vacinação são indicadas com setas. O título de anticorpos neutralizantes atingiu um nível de pico de 105, 1-2 meses após reforço ("booster");
[0052] A Figura 6 mostra os títulos de anticorpos neutralizantes contra HPV6 e HPV11 em soro em datas diferentes após vacinação de camundongos com a vacina bivalente contra HPV6/11 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada na semana 0 e 2. Os títulos de anticorpos neutralizantes contra HPV6 e HPV11 aumentaram rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 104-105;
[0053] A Figura 7 mostra os títulos de anticorpos neutralizantes contra HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18 em soro em datas diferentes após vacinação de camundongos com a vacina quadrivalente contra HPV6/11/16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada nas semanas 0 e 2; Os títulos dos anticorpos neutralizantes contra HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18 aumentaram rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 105-106;
[0054] A Figura 8 mostra os resultados de SDS-PAGE das proteínas HPV11N3C-L1, HPV11N5C-L1 e HPV11N6C-L1 separadamente tendo 3, 5, e 6 aminoácidos, truncadas no terminal N da proteína L1 do HPV11 (as sequências de aminoácido das mesmas sendo estabelecidas na SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente) durante as etapas a)-e) do método, de acordo com a invenção. Faixa 1: Marcador de Peso Molecular; Faixa 2: HPV11N3C-L1 purificada de acordo com a etapa a)-e), 10μ L; Faixa 3: HPV11N5C-L1 purificada de acordo com a etapa a)-e), 10μ L; Faixa 4: HPV11N6C-L1 purificada de acordo com a etapa a)-e), 10μ L. O resultado mostra que a pureza das proteínas HPV11N3C-L1, HPV11N5C-L1 e HPV11N6C-L1 com 3, 5, e 6 aminoácidos truncadas no terminal N da proteína L1 de HPV11 respectivamente, atingiu cerca de 95% após as etapas a)-e);
[0055] A Figura 9 mostra fotografias de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de VLPs de proteínas HPV11N3C-L1, HPV11N5C-L1 e HPV11N6C-L1 separadamente tendo 3, 5 e 6 aminoácidos truncadas no terminal N da proteína L1 de HPV11 obtidas após as etapas a)-f), num aumento de 50.000x. Fotografias de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de VLPs de HPV11N3C-L1 obtidas após as etapas a)-f). 2. Fotografias de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de VLPs de HPV11N5C-L1 obtidas após as etapas a)-f). 3. Fotografias de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de VLPs de HPV11N6C-L1 obtidas após as etapas a)-f). Os resultados mostram que uma grande quantidade de VLPs num raio de cerca de 25 nm em campo visual, sendo que o tamanho de partícula era consistente com o tamanho teórico e as partículas homogêneas; e
[0056] A Figura 10 mostra o resultado de medição de difusão de luz dinâmica das VLPs de proteínas HPV11N3C-L1, HPV11N5C- L1 e HPV11N6C-L1 separadamente tendo 3, 5 e 6 aminoácidos truncados no terminal N da proteína L1 de HPV11 obtida após as etapas a)-f). 1. Resultado de medição de difusão de luz dinâmica das VLPs de HPV11N3C-L1 obtidas após as etapas a).f). 2. Resultado de medição de difusão de luz dinâmica de VLPs de HPV11N5C-L1 obtidas após as etapas a)-f). 3. Resultado de medição de difusão de luz dinâmica de VLPs de HPV11N6C-L1 obtidas após as etapas a)-f). O resultado mostra que as VLPs de HPV11N3C-L1, HPV11N5C-L1 e HPV11N6C-L1 tinham um raio dinâmico de cerca de 25 nm e uma DAYVKRTNIF taxa de montagem de partícula SEQUÊNCIAS SEQ ID NO:1 1 superior a 80%. MSDSTVYVPP PNPVSKVVAT YHASSSRLLA VGHPYYSIKK VNKTVVPKVS 61 GYQYRVFKVV LPDPNKFALP DSSLFDPTTQ RLVWACTGLE VGRGQPLGVG VSGHPLLNKY 121 DDVENSGGYG GNPGQDNRVN VGMDYKQTQL CMVGCAPPLG EHWGKGTQCS NTSVQNGDCP 181 PLELITSVIQ DGDMVDTGFG AMNFADLQTN KSDVPLDICG TVCKYPDYLQ MAADPYGDRL 241 FFYLRKEQMF ARHFFNRAGT VGEPVPDDLL VKGGNNRSSV ASSIYVHTPS GSLVSSEAQL 301 FNKPYWLQKA QGHNNGICWG NHLFVTVVDT TRSTNMTLCA SVSKSATYTN SDYKEYMRHV 361 EEFDLQFIFQ LCSITLSAEV MAYIHTMNPS VLEDWNFGLS PPPNGTLEDT YRYVQSQAIT 421 CQKPTPEKEK QDPYKDMSFW EVNLKEKFSS ELDQFPLGRK FLLQSGYRGR TSARTGIKRP 481 AVSKPSTAPK RKRTKTKK SEQ ID NO:2 1 MPSDSTVYVP PPNPVSKVVA TDAYVKRTNI FYHASSSRLL AVGHPYYSIK KVNKTVVPKV 61 SGYQYRVFKV VLPDPNKFAL PDSSLFDPTT QRLVWACTGL EVGRGQPLGV GVSGHPLLNK 121 YDDVENSGGY GGNPGQDNRV NVGMDYKQTQ LCMVGCAPPL GEHWGKGTQC SNTSVQNGDC 181 PPLELITSVI QDGDMVDTGF GAMNFADLQT NKSDVPLDIC GTVCKYPDYL QMAADPYGDR 241 LFFYLRKEQM FARHFFNRAG TVGEPVPDDL LVKGGNNRSS VASSIYVHTP SGSLVSSEAQ 301 LFNKPYWLQK AQGHNNGICW GNHLFVTVVD TTRSTNMTLC ASVSKSATYT NSDYKEYMRH 361 VEEFDLQFIF QLCSITLSAE VMAYIHTMNP SVLEDWNFGL SPPPNGTLED TYRYVQSQAI 421 TCQKPTPEKE KQDPYKDMSF WEVNLKEKFS SELDQFPLGR KFLLQSGYRG RTSARTGIKR 481 PAVSKPSTAP KRKRTKTKK SEQ ID NO:3 1 MDSTVYVPPP NPVSKVVATD AYVKRTNIFY HASSSRLLAV GHPYYSIKKV NKTVVPKVSG 61 YQYRVFKVVL PDPNKFALPD SSLFDPTTQR LVWACTGLEV GRGQPLGVGV SGHPLLNKYD 121 DVENSGGYGG NPGQDNRVNV GMDYKQTQLC MVGCAPPLGE HWGKGTQCSN TSVQNGDCPP 181 LELITSVIQD GDMVDTGFGA MNFADLQTNK SDVPLDICGT VCKYPDYLQM AADPYGDRLF 241 FYLRKEQMFA RHFFNRAGTV GEPVPDDLLV KGGNNRSSVA SSIYVHTPSG SLVSSEAQLF 301 NKPYWLQKAQ GHNNGICWGN HLFVTVVDTT RSTNMTLCAS VSKSATYTNS DYKEYMRHVE 361 EFDLQFIFQL CSITLSAEVM AYIHTMNPSV LEDWNFGLSP PPNGTLEDTY RYVQSQAITC 421 QKPTPEKEKQ DPYKDMSFWE VNLKEKFSSE LDQFPLGRKF LLQSGYRGRT SARTGIKRPA 481 VSKPSTAPKR KRTKTKK SEQ ID NO:4 1 MSTVYVPPPN PVSKVVATDA YVKRTNIFYH ASSSRLLAVG HPYYSIKKVN KTVVPKVSGY 61 QYRVFKVVLP DPNKFALPDS SLFDPTTQRL VWACTGLEVG RGQPLGVGVS GHPLLNKYDD 121 VENSGGYGGN PGQDNRVNVG MDYKQTQLCM VGCAPPLGEH WGKGTQCSNT SVQNGDCPPL 181 ELITSVIQDG DMVDTGFGAM NFADLQTNKS DVPLDICGTV CKYPDYLQMA ADPYGDRLFF 241 YLRKEQMFAR HFFNRAGTVG EPVPDDLLVK GGNNRSSVAS SIYVHTPSGS LVSSEAQLFN 301 KPYWLQKAQG HNNGICWGNH LFVTVVDTTR STNMTLCASV SKSATYTNSD YKEYMRHVEE 361 FDLQFIFQLC SITLSAEVMA YIHTMNPSVL EDWNFGLSPP PNGTLEDTYR YVQSQAITCQ 421 KPTPEKEKQD PYKDMSFWEV NLKEKFSSEL DQFPLGRKFL LQSGYRGRTS ARTGIKRPAV 481 SKPSTAPKRK RTKTKK SEQ ID NO:5 1 ATGTGGCGGC CTAGCGACAG CACAGTATAT GTGCCTCCTC CCAACCCTGT ATCCAAGGTT 61 GTTGCCACGG ATGCGTATGT TAAACGCACC AACATATTTT ATCACGCCAG CAGTTCTAGA 121 CTCCTTGCTG TGGGACATCC ATATTACTCT ATCAAAAAAG TTAACAAAAC AGTTGTACCA 181 AAGGTGTCTG GATATCAATA TAGAGTGTTT AAGGTAGTGT TGCCAGATCC TAACAAGTTT 241 GCATTACCTG ATTCATCTCT GTTTGACCCC ACTACACAGC GTTTAGTATG GGCGTGCACA 301 GGGTTGGAGG TAGGCAGGGG TCAACCTTTA GGCGTTGGTG TTAGTGGGCA TCCATTGCTA 361 AACAAATATG ATGATGTAGA AAATAGTGGT GGGTATGGTG GTAATCCTGG TCAGGATAAT 421 AGGGTTAATG TAGGTATGGA TTATAAACAA ACCCAGCTAT GTATGGTGGG CTGTGCTCCA 481 CCGTTAGGTG AACATTGGGG TAAGGGTACA CAATGTTCAA ATACCTCTGT ACAAAATGGT 541 GACTGCCCCC CGTTGGAACT TATTACCAGT GTTATACAGG ATGGGGACAT GGTTGATACA 601 GGCTTTGGTG CTATGAATTT TGCAGACTTA CAAACCAATA AATCGGATGT TCCCCTTGAT 661 ATTTGTGGAA CTGTCTGCAA ATATCCTGAT TATTTGCAAA TGGCAGCAGA CCCTTATGGT 721 GATAGGTTGT TTTTTTATTT GCGAAAGGAA CAAATGTTTG CTAGACACTT TTTTAATAGG 781 GCCGGTACTG TGGGGGAACC TGTGCCTGAT GACCTGTTGG TAAAAGGGGG TAATAATAGA 841 TCATCTGTAG CTAGTAGTAT TTATGTACAT ACACCTAGTG GCTCATTGGT GTCTTCAGAG 901 GCTCAATTAT TTAATAAACC ATATTGGCTT CAAAAGGCTC AGGGACATAA CAATGGTATT 961 TGCTGGGGAA ACCACTTGTT TGTTACTGTG GTAGATACCA CACGCAGTAC AAATATGACA 1021 CTATGTGCAT CTGTGTCTAA ATCTGCTACA TACACTAATT CAGATTATAA GGAATACATG 1081 CGCCATGTGG AAGAGTTTGA TTTACAGTTT ATTTTTCAAT TGTGTAGCAT TACATTATCT 1141 GCAGAAGTCA TGGCCTATAT ACACACAATG AATCCTTCTG TTTTGGAGGA CTGGAACTTT 1201 GGTTTATCGC CTCCACCAAA TGGTACACTG GAGGATACTT ATAGATATGT ACAGTCACAG 1261 GCCATTACCT GTCAGAAACC CACACCCGAA AAAGAAAAAC AGGACCCCTA TAAGGATATG 1321 AGTTTTTGGG AGGTTAACTT AAAAGAAAAG TTTTCTTATG AATTAGATCA GTTTCCCCTT 1381 GGACGTAAGT TTTTATTGCA AAGTGGATAT CGAGGACGGA CGTCTGCTCG TACAGGTATA 1441 AAGCGCCCAG CTGTGTCTAA GCCCTCTACA GCCCCCAAAC GAAAACGTAC CAAAACCAGA 1501 AAGTAA SEQ ID NO:6 1 ATGAGCGACA GCACAGTATA TGTGCCTCCT CCCAACCCTG TATCCAAGGT TGTTGCCACG 61 GATGCGTATG TTAAACGCAC CAACATATTT TATCACGCCA GCAGTTCTAG ACTCCTTGCT 121 GTGGGACATC CATATTACTC TATCAAAAAA GTTAACAAAA CAGTTGTACC AAAGGTGTCT 181 GGATATCAAT ATAGAGTGTT TAAGGTAGTG TTGCCAGATC CTAACAAGTT TGCATTACCT 241 GATTCATCTC TGTTTGACCC CACTACACAG CGTTTAGTAT GGGCGTGCAC AGGGTTGGAG 301 GTAGGCAGGG GTCAACCTTT AGGCGTTGGT GTTAGTGGGC ATCCATTGCT AAACAAATAT 361 GATGATGTAG AAAATAGTGG TGGGTATGGT GGTAATCCTG GTCAGGATAA TAGGGTTAAT 421 GTAGGTATGG ATTATAAACA AACCCAGCTA TGTATGGTGG GCTGTGCTCC ACCGTTAGGT 481 GAACATTGGG GTAAGGGTAC ACAATGTTCA AATACCTCTG TACAAAATGG TGACTGCCCC 541 CCGTTGGAAC TTATTACCAG TGTTATACAG GATGGGGACA TGGTTGATAC AGGCTTTGGT 601 GCTATGAATT TTGCAGACTT ACAAACCAAT AAATCGGATG TTCCCCTTGA TATTTGTGGA 661 ACTGTCTGCA AATATCCTGA TTATTTGCAA ATGGCAGCAG ACCCTTATGG TGATAGGTTG 721 TTTTTTTATT TGCGAAAGGA ACAAATGTTT GCTAGACACT TTTTTAATAG GGCCGGTACT 781 GTGGGGGAAC CTGTGCCTGA TGACCTGTTG GTAAAAGGGG GTAATAATAG ATCATCTGTA 841 GCTAGTAGTA TTTATGTACA TACACCTAGT GGCTCATTGG TGTCTTCAGA GGCTCAATTA 901 TTTAATAAAC CATATTGGCT TCAAAAGGCT CAGGGACATA ACAATGGTAT TTGCTGGGGA 961 AACCACTTGT TTGTTACTGT GGTAGATACC ACACGCAGTA CAAATATGAC ACTATGTGCA 1021 TCTGTGTCTA AATCTGCTAC ATACACTAAT TCAGATTATA AGGAATACAT GCGCCATGTG 1081 GAAGAGTTTG ATTTACAGTT TATTTTTCAA TTGTGTAGCA TTACATTATC TGCAGAAGTC 1141 ATGGCCTATA TACACACAAT GAATCCTTCT GTTTTGGAGG ACTGGAACTT TGGTTTATCG 1201 CCTCCACCAA ATGGTACACT GGAGGATACT TATAGATATG TACAGTCACA GGCCATTACC 1261 TGTCAGAAAC CCACACCCGA AAAAGAAAAA CAGGACCCCT ATAAGGATAT GAGTTTTTGG 1321 GAGGTTAACT TAAAAGAAAA GTTTTCTTAT GAATTAGATC AGTTTCCCCT TGGACGTAAG 1381 TTTTTATTGC AAAGTGGATA TCGAGGACGG ACGTCTGCTC GTACAGGTAT AAAGCGCCCA 1441 GCTGTGTCTA AGCCCTCTAC AGCCCCCAAA CGAAAACGTA CCAAAACCAG AAAGTAA
[0057] A descrição é também ilustrada em combinação com os Exemplos, não se restringindo, porém, a eles. Exemplo 1 : Expressão da Proteína L1 de HPV11 Truncada (SEQ ID NO:1)
[0058] Preparação de Fragmentos Gênicos de HPV11 L1 como padrão ("template") PCR.
[0059] O gene de extensão completa HPV11 L1 foi sintetizado por Shanghai Boya Bio Co. O fragmento gênico sintetizado tinha uma extensão completa de 1506 bp e uma sequência de SEQ ID NO:5. Com base no fragmento gênico sintético de extensão completa HPV11 L1, a proteína L1 de HPV11 truncada, de acordo com a invenção, foi preparada como padrão.
[0060] Construção de Vetor de Expressão Não de Fusão de gene de L1 de HPV11 truncada.
[0061] O fragmento gênico de extensão completa de L1 de HPV11 sintetizado na etapa anterior foi utilizado como padrão na reação PCR seguinte. O primer à frente ("forward primer") era o 11N4F: 5’-CAT ATG AGC GAC AGC ACA GTA TAT GTG-3’ (SEQ ID NO: 10), em cujo terminal 5' o sítio NdeI de endonuclease de restrição foi introduzido. A sequência do sítio de NdeI era CAT ATG, onde ATG era o códon de iniciação no sistema de E.coli. O primer reverso ("reverse primer") era 6CR: 5’-GTC GAC TTA CTT TCT GGT TTT GGT ACG TTT-3’ (SEQ ID NO: 11), em cujo terminal 5' o sítio Sa1I de endonuclease de restrição foi introduzido. A amplificação foi realizada num termociclador para PCR Biometra T3 utilizando os seguintes parâmetros:
[0062] Os fragmentos de DNA, com cerca de 1,5kb de comprimento, foram obtidos após amplificação. Os produtos de PCR foram ligados ao vetor pMD 18-T (Takara Biosciences). Após digestão com NdeI/Sa1I, foi identificada a obtenção de colônias positivas, onde o gene de L1 de HPV11 truncada havia sido inserido, designadas como pMD 18-T-HPV11N4C-L1.
[0063] A sequência nucleotídica de interesse, que foi inserida no plasmídeo pMD 18-T-HPV11N4C-L1, foi determinada como SEQ ID NO:6 por Shanghai Boya Bio Co. mediante o uso de iniciadores ("primers") M13+/-. A SEQ ID NO:6 codifica a sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID NO:1 que corresponde a uma proteína L1 de HPV11 com 4 aminoácidos truncados em seu terminal N e nenhum aminoácido truncado em seu terminal C, sendo designada como HPV11N4C-L1.
[0064] Os fragmentos gênicos HPV11N4C-L1 truncados foram obtidos através de digestão NdeI/Sa1I de plasmídeo pMD 18-T- HPV11N4C-L1. Os fragmentos foram ligados ao Vetor de Expressão Não de Fusão pTO-T7 (Luox Wenxin et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16:53-57). As colônias foram identificadas com digestão de NdeI/Sa1I. As colônias positivas contendo o inserto do fragmento gênico L1 foram marcadas como pTO-T7-HPV11N4C-L1. 1μ L de plasmídeo pTO-T7- HPV11N4C-L1 (0,15 mg/ml) foi utilizado para transformar 40μ L de E.coli ER2566 competente (New England Labs) preparado através do método de cloreto de cálcio, e então revestido sobre meio LB sólido contendo canamicina (a uma concentração final de 25mg/mL, a mesma abaixo citada). As placas foram incubadas a 37oC por cerca de 10-12h até que colônias únicas pudessem ser claramente observadas. As colônias foram transferidas para um tubo contendo 4ml de meio LB líquido contendo canamicina. As culturas foram incubadas num incubador de agitação a 220 rpm por 10 horas a 37oC, e então 1ml de solução bacteriana foi liofilizada e armazenada a - 70oC. Expressão de HPV11N4C-L1 em larga escala
[0065] E.coli transformada com pTO-T7-HPV11N4C-L1 foi coletada da cepa liofilizada a -70oC e diluída com um pouco de água estéril, e então incubada em 50ml de meio LB contendo canamicina a 200 rpm e 37oC por 8 horas. Então, as culturas foram transferidas para dez frascos (cultura de 5ml por frasco), cada qual contendo 500 ml de meio LB, e foram incubadas num incubador de agitação da noite para o dia a 200 rpm e 30oC. As culturas foram as culturas de partida.
[0066] Meio LB: Peptona :10 g Extrato de levedura : 5 g NaCl : : 10 g
[0067] Os componentes acima foram dissolvidos em 1L de água deionizada; a solução resultante teve seu pH ajustado em 7,2 mediante adição de NaOH, esterilizada a 121oC por 30 minutos, e resfriada até 50oC.
[0068] Um fermentador de 50L da Shanghai Baoxing Biological Ltd. foi utilizado em incubação de larga escala. O eletrodo de pH foi calibrado. 30L de meio LB foram preparados e transferidos para o fermentador, esterilizados in situ a 121oC por 30 minutos. O eletrodo de oxigênio dissolvido foi calibrado, sendo o valor determinado como 0 antes da introdução de ar após esterilização e como 100% antes da vacinação após introdução de ar, durante agitação a 100 rpm no início.
[0069] Preparação da alimentação: 20g de peptona e 10g de extrato de levedura foram dissolvidos em 100 ml de água deionizada para o preparo de uma mistura de peptona e de extrato de levedura (30%) e 50g de glicose foram dissolvidos em 100 ml de água deionizada para o preparo de uma solução de glicose (50%). As duas misturas foram esterilizadas a 121oC por 20 minutos.
[0070] No segundo dia, as culturas de partida nos dez frascos (para um total de 5L) foram transferidas para o fermentador. A 37oC e a um pH de 7,0,. O O2 dissolvido foi mantido a >40% regulando-se a taxa de agitação ou o suprimento de ar manualmente.
[0071] Alimentação de fluxo: 50% glicose, e 30% mistura de peptona e extrato de levedura foram misturados a uma relação de massa de 2:1.
[0072] As taxas de fluxo foram as seguintes: 25 mL/min foi definido como 100%. 1h : 5% 2h : 10% 3h : 20% 4h : 40% 5h até o final : 60%
[0073] Quando OD600nm atingiu cerca de 10, a temperatura da cultura foi reduzida para 25oC e 4g de IPTG foram adicionados para iniciar a cultura de indução de 4 horas. A fermentação foi interrompida quando OD600nm atingiu cerca de 60. A cultura foi então centrifugada para se obter cepas alvo expressando a proteína HPV11N4C-L1 (cerca 2,7 kg). Exemplo 2: Preparação de HPV11N4C-L1 com uma pureza de cerca de 70%
[0074] 1g de cepas foram resuspensas em 10 ml de tampão de lise (20mM tampão tris pH 7,2, 300mM NaCl). As cepas foram rompidas através de passagem por um homogenizador APV (Invensys Group) cinco vezes a uma pressão de 600 bar. O homogenado foi centrifugado a 30.000g (13,500 rpm num rotor JA-14) por 15 min. O sobrenadante foi submetido a SDS-PAGE num gel a 10%. Neste estágio, HPV11N4C-L1 tinha uma pureza de cerca de 10%. O sobrenadante foi dialisado através de um Filtro de Fluxo Tangencial Centrasette 5 (Pall Co.), operando a uma pressão de 0,5 psi, uma taxa de fluxo de 500ml/min, e uma taxa de fluxo tangencial de 200 ml/min, onde o peso molecular de retenção era de 30kDa, o dialisado um tampão fosfato 10mM pH 6,0, e um volume de diálise três vezes tão grande quanto o volume do sobrenadante. Após diálise completa, a mistura foi centrifugada a 12.000g (9500 rpm num rotor JA-10 (centrífuga de alta velocidade Beckman J25)) por 20 minutos, e a precipitação coletada. A precipitação foi resuspensa em 10mM tampão fosfato pH 8,0 contendo 10 mM DTT e 300mM NaCl, sendo que o volume do tampão era 1/10 vezes tão grande quanto o volume do sobrenadante. A mistura foi agitada por 30 minutos e centrifugada a 30.000g (13.500 rpm num rotor JA-14 (centrífuga de alta velocidade Beckman J25)) por 20 minutos. O sobrenadante passa por uma membrana de filtro de 0,22μ m. A amostra foi adicionalmente submetida à cromatografia de troca catiônica. 30μ L de 6x tampão de carga foram adicionados a 150μ L do sobrenadante filtrado, e a solução resultante foi misturada. Após aquecimento em banho- maria a 80oC por 10 minutos, uma amostra de 10μ L foi submetida a SDS-PAGE num gel a 10% a 120V por 120 minutos. As bandas eletroforéticas foram coradas com azul brilhante de Coomassie. O resultado é mostrado na Fig. 1. De acordo com a análise de SDS-PAGE, a proteína HPV11N4C-L1 foi purificada e enriquecida após as etapas de precipitação e redissolução, com a pureza aumentada para cerca de 70%. Exemplo 3: Purificação de HPV11N4C-L1 através de Cromatografia Cromatografia de Troca Catiônica de HPV11N4C-L1
[0075] Equipamento: sistema de cromatografia líquida preparatória AKTA Explorer 100 (GE Healthcare, ou seja, a antiga Amershan Pharmacia Co).
[0076] Meios cromatográficos: SP Sepharose 4 Fluxo Rápido
[0077] Volume da coluna : 5,5cm x 20 cm
[0078] Tampão: 20 mM tampão fosfato pH 8,0, 10mM DTT
[0079] 20 mM tampão fosfato pH 8,0, 10mM DTT, 2M NaCl
[0080] Taxa de fluxo : 25 mL/min
[0081] Comprimento de onda do detector : 280 nm
[0082] Amostra : 3L, cerca de 70% solução HPV11N4C-L1
[0083] Protocolo de eluição: eluir proteínas indesejadas com 200 mN NaCl, eluir a proteína de interesse com 800 mM NaCl, coletar 500 mM eluato de NaCl e finalmente obter cerca de 700 mL de amostra de HPV11N4C-L1 purificada.
[0084] Purificação de HPV11N4C-L1 através de Cromatografia CTH-II
[0085] Equipamento: sistema de cromatografia líquida preparatória AKTA Explorer 100 (GE Healthcare, ou seja, a antiga Amershan Pharmacia Co).
[0086] Meios cromatográficos: CTH-II (Bio-Rad)
[0087] Volume da coluna : 5,5cm x 20 cm
[0088] Tampão: 10 mM tampão fosfato pH 7,0, 10mM DTT,
[0089] 0,5M NaCl
[0090] Taxa de fluxo : 20 mL/min
[0091] Comprimento de onda do detector : 280 nm
[0092] Amostra : 500 mN eluato de NaCl de SP Sepharose 4 Fluxo Rápido
[0093] Protocolo de eluição: coletar diretamente a passagem contendo a proteína de interesse.
[0094] A passagem que contém HPV11N4C-L1 foi coletada e cerca de 300mL de HPV11N4C-L1 purificada foram obtidos. 30μ L 6x tampão de carga foram adicionados a 150μ L de amostra de HPV11N4C-L1 purificada de acordo com o método do Exemplo, e então a solução resultante foi totalmente misturada. Após aquecer a solução em banho maria a 80oC por 10 minutos, uma amostra de 10oC por 10 minutos, uma amostra de 10μ L foi submetida a SDS-PAGE em 10% gel, a 120V por 120 minutos. As bandas eletroforéticas foram coradas com azul brilhante de Coomassie. O resultado é mostrado na Figura 2. A concentração da proteína de interesse foi de cerca de 0,3mg/ml e a pureza superior a 98% de acordo com SDS-PAGE. Exemplo 4: Montagem de VLPs de HPV11N4C-L1
[0095] Equipamento: Filtro de fluxo tangencial Centrasette 5 (Pall Co.), retenção MW 30 kDa.
[0096] Amostra: 300 mL de HPV11N4C-L1 obtida no Exemplo 3.
[0097] Concentração da amostra: a amostra foi concentrada até 800 ml com a taxa de fluxo tangencial do sistema ajustada em 50mL/min.
[0098] Renaturação da Amostra: O tampão da amostra foi completamente trocado por 10L de tampão de renaturação (20mM PB pH 6,0, 2mM CaCl2, 2mM MgCl2, 0,5M NaCl, 0,003% Tween-80). Durante a operação do Filtro de Fluxo Tangencial a pressão ficou em 0,5 psi e a taxa de fluxo tangencial em 10ml/min. Finalizada a troca, o tampão da amostra foi substituído por tampão de armazenamento (20L PBS: 20mM PB pH 6,5, 0,5M NaCl). O volume de troca foi de 20L. A pressão de operação foi de 0,5psi e a taxa de fluxo tangencial foi de 25mL/min. Quando a troca de líquido foi concluída, a amostra foi assepticamente filtrada com um filtro Pall (0,20 μ m). As VLPs de HPV11N4C-L1 foram obtidas e armazenadas a 4oC para uso posterior. Exemplo 5: Determinação de morfologia de VLPs de HPV11N4C-L1 Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) de VLPs de HPV11N4C-L1
[0099] O equipamento era um Microscópio Eletrônico de Transmissão JEOL 100kV (aumentado em 100,000x). As VLPs de HPV11N4C-L1 foram negativamente coradas com ácido fosfotúngstico a 2% pH 7,0, e fixado sobre grade de cobre. Os resultados constam da Figura 3. Pode-se observar que as VLPs obtidas no Exemplo 4 tinham um raio de aproximadamente 25nm, eram homogêneas e tinham forma oca. Medição de VLPs de HPV11N4C-L1 com difusão de luz dinâmica
[00100] O instrumento de dispersão de luz dinâmica DynaPro MS/X (incluindo um controlador de temperatura) (US Protein Solutions Co.) foi usado nas medições por difusão de luz. O algoritmo de regulação foi usado nas medições. A amostra utilizada foi a obtida no Exemplo 4. A amostra foi passada por uma membrana de filtro 0,22 μ m antes da medição. Os resultados são mostrados na Fig. 4. O resultado mostra que as VLPs de HPV11N4C-L1 tinham um raio hidrodinâmico de 27,19nm e uma taxa de montagem de partícula de 96,7%. Estabelecimento de Ensaio de Neutralização de Pseudovírion para HPV11
[00101] O HPV dificilmente pode ser cultivado in vitro, e o hospedeiro do HPV apresenta forte especificidade. Sendo assim, o HPV dificilmente pode ser propagado em outros hospedeiros que não humanos. Ou seja, não há um modelo animal apropriado para o HPV. Portanto, para avaliar rapidamente a produtividade imune da vacina contra o HPV, surge a necessidade de se estabelecer um modelo eficiente para ensaios de neutralização in vitro.
[00102] Modelo de Infecção de Pseudovírion in Vitro: De acordo com a característica de que a VLP de HPV pode empacotar ácidos nucléicos de forma não específica, o pseudovírion do HPV foi formado expressando-se a proteína L1 e L2 do HPV em células e empacotando-se o DNA viral do epissomo ou introduzindo os plasmídeos repórteres heterologamente. Métodos incluem os sistemas de expressão baseados em vírus recombinantes e cotransfecção de multiplasmídeos (vide Yeager, M.D., Aste-Amezaga, M. et al(2000) Virology (278) 570-7).
[00103] A invenção utiliza cotransfecção de um sistema multiplasmídeo. Alguns aperfeiçoamentos foram feitos conforme a seguir descrito. Um método otimizado de transfecção de fosfato de cálcio foi estabelecido para a linhagem celular 293FT, com uma eficiência de transfecção superior a 90%, o que facilita a produção em larga escala. O plasmídeo de expressão códon-otimizado resultante da proteína estrutural do HPV poderia expressar eficientemente gene L1 e L2 de HPV em linhagens celulares de mamíferos, facilitando a montagem eficiente de pseudovírion. Construção de Pseudovírion de HPV
[00104] P11L1h, p11L2h e pN31-EGFP (doados pelo Professor John T.Schiller de NIH) contém genes para HPV11L1, HPV11L2 e GFP, respectivamente. Esses plasmídeos foram purificados utilizando centrifugação em gradiente de densidade CsC1 conforme descrito em "The Molecular Cloning Experiment Guide" (3a.edição). O procedimento de purificação é descrito a seguir: . Os plasmídeos foram utilizados para transformar E.coli DH5α; . Colônias únicas foram transferidas para um meio de cultura LB de 500 mL e incubadas num frasco de agitação a 37oC por 16h; . O meio de cultura foi centrifugado em 9.000g por 5 min e os corantes coletados; . As substâncias a seguir foram sucessivamente adicionadas às bactérias em cada 1000 mL de LB: 40mL solução I (50mM glicose, 25mM Tris-Cl pH 8,0, 10mM EDTA pH 8,0) e 2ml de 1μ g/μ L RNase A), 40 mL solução II (0,2M NaOH, 1% SDS) e 48ml solução III (60,0 mL acetato potássio 5M, 11,5mL ácido acético e 28,5 mL água deionizada). . Após ser mantida em gelo por 10 minutos, a mistura foi centrifugada em 15.000g por 20 minutos a 4oC; . O sobrenadante foi misturado com 0,6 volumes de álcool isopropílico, e então centrifugado novamente a 15.000g por 30 minutos a 4oC; . O sobrenadante foi decantado como resíduo e a precipitação lavada com etanol a 70%; . A precipitação foi dissolvida em TE e o teor de DNA determinado; . CsCI foi dissolvido na solução de DNA (1g DNA por 1,01g CsCl) e então 100μ L de 10mg/ml de solução EB foram também dissolvidos naquela solução; . A mistura foi centrifugada utilizando uma centrífuga Beckman NVT65 a 62.000 rpm por 10 horas a 20oC; . A seção circular de DNA foi coletada utilizando um injetor cabeça de pino; . EB foi extraído quatro vezes com volume equivalente de álcool isoamílico repetidamente; . Três volumes de água deionizada e oito volumes de etanol seco foram adicionados a um volume de solução de DNA, e então a mistura foi centrifugada a 20000g por 30 minutos a 4oC; . A precipitação de DNA foi coletada e lavada com etanol a 75% e então dissolvida em 1mL TE; . A concentração da solução de DNA foi determinada, e então a solução armazenada em pequenas embalagens a -20oC.
[00105] p11L1h, p11L2h e pN31-EGFP purificados cotransfectaram células 293FT (Invitrogen) cultivadas numa placa de cultura de células de 10cm através do método de fosfato de cálcio. O método de fosfato de cálcio foi descrito como segue. 40μ g de p11L1h, 40μ g de p11L2h e 40 μ g de pN31- EGFP foram adicionados separadamente à mistura de 1mL de solução HEPES (125μ L 1M HEPES/50 mL água deionizada, a um pH de 7,3 e 4oC) e 1 mL de solução CaCl2 0,5M. Após mistura, 2mL 2X solução HeBS (0,28M NaCl (16,36), 0,05M HEPES (11,9g), 1,5mM Na2HPO4 (0,213g), dissolvidos em 1000mL de água deionizada a um pH de 6,96 e -70oC) foram adicionados gota a gota. Após repousar à temperatura ambiente por 1 minuto, a mistura foi adicionada à placa de cultura de células de 10cm onde as células 293FT foram cultivadas. O meio de cultura original foi substituído por 10ml de meio completo (Invitrogen Co.) 6 horas depois. 48 horas após transfecção, o meio foi decantado e as células lavadas duas vezes com PBS. Então, as células foram coletadas e contadas. Cada 108 células foram suspensas em 1ml de solução citolítica (0,25% Brij58, 9,5mM MgCl2). Após lise, o lisado de células foi centrifugado a 5.000g por 10 minutos e o sobrenadante coletado. A solução de pseudovírion foi obtida após adição de 5M NaCl ao sobrenadante até uma concentração final de 850mM, e então armazenada em pequenas embalagens a -20oC.
[00106] Células 293FT (Invitrogen) foram espalhadas sobre uma placa de cultura de células de 96 cavidades (1,5X104células/cavidade). O ensaio de neutralização foi conduzido cinco horas depois. As amostras de soro foram serialmente diluídas com DMEM 10% meio a meio. Amostras diluídas de 50μ L foram separadamente misturadas com soluções de 50μ L de Pseudovírion diluídas com DMEM 10% (moi=0,1). Após incubar a 4oC por 1 hora, a mistura foi adicionada à placa de cultura de células de 96 cavidades tendo nela espalhadas as células 293FT. A mistura foi então incubada por 72 horas a 37oC. Títulos de neutralização de amostras foram avaliados observando-se a fluorescência. A porcentagem de infecção de células em cada cavidade foi verificada através de citometria de fluxo (EPICS CL, American Beckman Coulter Co.). Os títulos exatos de anticorpos monoclonais ou de anticorpos policlonais foram calculados. A porcentagem de infecção foi a porcentagem de células na região positiva menos as células não infectadas na região positiva.
[00107] Porcentagem de controle de infecção =(1 - porcentagem de infecção de célula na amostra/porcentagem de infecção de célula negativa) x 100%.
[00108] O título de neutralização foi definido como o múltiplo mais alto de diluição pelo qual a porcentagem de controle de infecção estava logo acima de 50%. Os anticorpos monoclonais e policlonais eram considerados providos de capacidade neutralizante se sua porcentagem de controle de infecção estivesse acima de 50% após diluições de 50x. Medição da proteção imune de animais vacinados com VLPs de HPV11
[00109] Coelhas (nível geral) com 6-8 semanas de vida, foram adquiridas da Disease Prevention and Control Center da província de Guangxy, onde foram criadas. VLPs de HPV11N4C-L1 preparadas no Exemplo 4 foram misturadas com igual quantidade de Adjuvante de Freund completo para a primeira imunização. Para o reforço, VLPs de HPV11N4C-L1 foram misturadas com Adjuvante de Freund incompleto. As coelhas foram imunizadas através de injeção muscular, com 100μ g por coelha para a primeira imunização, e com 50μ g por coelha para o reforço, separadamente nas semanas 4,10. Após a imunização, foi coletado sangue da veia externa semanalmente e o soro separado e armazenado para detecção.
[00110] Os títulos de neutralização dos anti-soros foram avaliados utilizando um ensaio de modelo celular de neutralização baseado em peseudovírion. Conforme mostra a Fig. 5, a vacina produzida misturando-se VLPs de HPV11N4C-L1 no Exemplo 4, poderia induzir anticorpos neutralizantes com um alto título em animais e ser utilizada como vacina eficaz na prevenção de infecções por HPV. Medição da Proteção Imune de Macacos Rhesus vacinados com Vacina Bivalente contra HPV6/11
[00111] Foram utilizados quatro camundongos SPF BALB-c, com 4-5 semanas de vida. VLPs de HPV6N5C-L1 e VLPs de HPV11N4C- L1, que foram preparadas de acordo com o método similar ao dos Exemplos 1-4, foram misturadas a uma relação de 1:2 (em peso), sendo que suas concentrações finais foram de 40μ g/mL e 80 μ g/mL, respectivamente. A vacina foi misturada com igual quantidade de adjuvante de Freund completo para a primeira imunização, e misturada com igual quantidade de adjuvante de Freund incompleto para o reforço.
[00112] Os camundongos foram imunizados através de injeção muscular. A quantidade para a primeira imunização foi de 10μ g HPV6N5C-L1 e 20μ g HPV11N4C-L1 por camundongo. O reforço foi administrado a cada duas semanas. A quantidade de reforço foi de 20μ g HPV6N5C-L1 e 40μ g de HPV11N4C-L1 por camundongo.
[00113] Após a imunização, sangue da veia externa foi coletado semanalmente, e o soro separado. Os títulos de anticorpos neutralizantes contra HPV6 e HPV11 em camundongos imunizados foram separadamente determinados de acordo com o método do Exemplo 5.
[00114] Os resultados são mostrados na Fig. 6, indicando que a vacina bivalente contra HPV6/11, preparada misturando-se VLPs de HPV6N5C-L1 e HPV11N4C-L1 preparadas de acordo com o método descritos nos Exemplos 1-4, tinham boa imunogenicidade, podiam induzir anticorpos neutralizantes com alto título contra HPV6 e HPV11 em animais, e ser usadas como vacina eficaz na prevenção de infecção por HPV6/HPV11 (além dos adjuvantes de Freund utilizados nos experimentos, a vacina pode ser preparada misturando-se as duas VLPs de HPV16N5C-L1 e HPV11N4C-L1 com adjuvantes de hidróxido de alumínio ou de fosfato de alumínio disponíveis no mercado, ou auto-preparados).
[00115] A Sequência de Aminoácido de L1 de HPV6N5C-L1 é mostrada na SEQ ID NO:7 como segue:
Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys Arg 485 490 495 Medição de proteção imune de camundongos vacinados com Vacina Quadrivalente contra HPV6/11/16/18
[00116] Foram utilizados quatro camundongos SPF BALB-c, de 45 semanas de vida. VLPs de HPV6N5C-L1, de HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 e HPV18N65C-L1, preparadas de acordo com o método similar ao dos Exemplos 1-4, foram misturadas a uma relação de 1:2:2:1 (em peso), sendo que suas concentrações finais foram de 40μ g/mL e 80 μ g/mL, 80μ g/mL e 40μ g/mL, respectivamente. A vacina foi misturada com igual quantidade de adjuvante de Freund completo para a primeira imunização, e misturada com igual quantidade de adjuvante de Freund incompleto para o reforço.
[00117] Os camundongos foram imunizados através de injeção muscular. A quantidade para a primeira imunização foi de 10μ g HPV6N5C-L1, 10μ g HPV18N65C-L1, 20μ g HPV11N4C-L1 e 20μ g HPV16N30C-L1 por camundongo.O reforço foi administrado a cada duas semanas. A quantidade de reforço foi de 20μ g HPV6N5C-L1, 20μ g HPV18N65C-L1, 40μ g HPV11N4C-L1 e 40μ g HPV16N30C-L1 por camundongo.
[00118] Após a imunização, sangue da veia externa foi coletado semanalmente, e o soro separado. Os títulos de anticorpos neutralizantes contra HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18 em camundongos imunizados foram separadamente determinados de acordo com o método do Exemplo 5.
[00119] Os resultados são mostrados na Fig. 7, indicando que a vacina quadrivalente contra HPV6/11/16/18, preparada misturando-se VLPs de HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 e HPV18N65C-L1 preparadas de acordo com o método descritos nos Exemplos 1-4, tinham boa imunogenicidade, podiam induzir anticorpos neutralizantes com alto título contra HPV6, HPV11, HPV 16 e HPV 18 em animais, e que podiam ser usadas como vacina eficaz na prevenção de infecção por HPV6/HPV11/HPV16/HPV18 (além dos adjuvantes de Freund utilizados nos experimentos, a vacina pode ser preparada misturando-se as quatro VLPs de HPV16N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 e HPV18N65C-L1 com adjuvantes de hidróxido de alumínio ou de fosfato de alumínio disponíveis no mercado, ou auto-preparados).
[00120] A Sequência de Aminoácido de L1 de HPV616N30C-L1 é mostrada na SEQ ID NO:8 como segue:
[00121] A Sequência de Aminoácido de L1 de HPV18N65C-L1 é mostrada na SEQ ID NO:9 como segue:
[00122] A Sequência de Aminoácido L1 de VLP de HPV6N5C-L1 é mostrada na SEQ ID NO:7 conforme descrita acima. Exemplo 6:
[00123] As proteínas L1 de HPV11 truncadas estabelecidas na SEQ ID NOS.: 2, 3 e 4 foram preparadas de acordo com as técnicas utilizadas nos exemplos 1-5. Todas essas proteínas truncadas puderam ser purificadas até um nível superior a 98% e montadas em VLPs com um raio de cerca de 25 nm. Os resultados são mostrados nas Figuras 8, 9 e 10.
Claims (13)
1. Proteína L1 do HPV11 truncada, caracterizada pelo fato de a referida proteína compreender 4, 3, 5, ou 6 aminoácidos truncados em seu terminal-N, e sendo que a proteína compreende uma sequência representada na SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4.
2. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de compreender a SEQ ID NO:6, e suas sequências degeneradas, que codificam a sequência de aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 1.
3. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 2.
4. Célula, caracterizada pelo fato de compreender o vetor, conforme definido na reivindicação 3, sendo que a referida célula é E.COLI.
5. Composição, caracterizada pelo fato de compreender a proteína, conforme definida na reivindicação 1.
6. Partícula do tipo vírus (VLP) HPV11, caracterizada pelo fato de compreender ou consistir da proteína, conforme definida na reivindicação 1.
7. Método para produzir uma proteína L1 do HPV, tal como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: a) ) expressar um gene L1 do HPV que codifica a proteína L1 do HPV em um sistema de expressão de E.COLI; b) ) romper a E.COLI, que expressou a proteína L1 do HPV, em uma solução com uma concentração salina de 100 mM a 600 mM, e isolar o sobrenadante; c) diminuir a concentração salina do sobrenadante de (b) de 100 mM para 0, inclusive, pelo uso de água ou uma solução de baixa concentração salina, e coletar um precipitado; d) redissolver a precipitação de (c) em uma solução com uma concentração salina de 150 mM a 2500 mM, adicionar um redutor a esse precipitado, e então isolar a solução resultante, sendo que a solução contém a proteína L1 do HPV com uma pureza de pelo menos 50%.
8. Vacina para prevenção de condiloma acuminado ou de infecções por HPV, caracterizada pelo fato de compreender: a VLP do HPV11, conforme definida na reivindicação 6, e portadores ou excipientes úteis para vacinas.
9. Vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender ainda pelo menos uma das VLPs de HPV selecionada do grupo consistindo das VLPs de HPV do tipo 6, 16, 31, 33, 45, 52, e 58.
10. Vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de a referida vacina compreender ainda uma VLP de HPV6 compreendendo uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:7.
11. Vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de a referida vacina compreender ainda uma VLP de HPV16 compreendendo uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID Nos: 8, e uma VLP de HPV18 compreendendo uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 9.
12. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender ainda: e) purificar, adicionalmente, a proteína L1 do HPV11, conforme definida na reivindicação 1, com uma pureza de pelo menos 50% através de cromatografia; e f) remover o redutor da proteína L1 do HPV11 obtido na etapa (e).
13. Método para produzir uma vacina para prevenção de condiloma acuminado ou de infecções por HPV, caracterizado pelo fato de compreender misturar a VLP, conforme definida na reivindicação 6, e opcionalmente, uma ou mais VLPs selecionadas do grupo consistindo de VLPs de HPV dos tipos 6, 16, 18, 31, 33, 45, 52 e 58, com portadores ou excipientes úteis para vacinas.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200710105763.2 | 2007-05-29 | ||
| CN200710105763 | 2007-05-29 | ||
| PCT/CN2008/001049 WO2008145020A1 (fr) | 2007-05-29 | 2008-05-29 | Protéine l1 tronquée du papillomavirus 11 humain |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0810959A2 BRPI0810959A2 (pt) | 2015-07-21 |
| BRPI0810959B1 true BRPI0810959B1 (pt) | 2021-06-29 |
Family
ID=40074566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0810959-1A BRPI0810959B1 (pt) | 2007-05-29 | 2008-05-29 | Proteína l1 do hpv11, polinucleotídeo, vetor, célula, composição, partícula do tipo vírus (vlp) hpv11, método para produzir uma proteína l1 do hpv, vacina para prevenção de condiloma acuminado ou de infecções por hpv e método para produzir uma vacina para prevenção de condiloma acuminado ou infecções por hpv |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9533035B2 (pt) |
| EP (3) | EP2907821B1 (pt) |
| CN (1) | CN101343314B (pt) |
| BR (1) | BRPI0810959B1 (pt) |
| DK (3) | DK2154148T3 (pt) |
| WO (1) | WO2008145020A1 (pt) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9364529B2 (en) | 2007-04-29 | 2016-06-14 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 18 |
| US9428555B2 (en) * | 2007-04-29 | 2016-08-30 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | Truncated L1 protein of Human Papillomavirus type 16 |
| BRPI0810951B8 (pt) * | 2007-05-29 | 2021-05-25 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Entpr Co Ltd | proteína l1 do hpv6, polinucleotídeo, vetor, célula, partícula semelhante ao vírus (vlp) hpv6, método para produzir a proteína hpv6 l1 truncada, vacina para prevenção de condiloma acuminado ou de infecções por hpv, uso da proteína hpv6 l1 truncada, método para prevenção de condiloma acuminado ou infecções por hpv, método para obter uma vlp de uma proteína l1 do hpv6 e método para produzir uma vacina para a prevenção de condiloma acuminado ou de infecções por hpv |
| EP2589604B1 (en) * | 2010-07-02 | 2016-10-05 | Xiamen University | Truncated l1 protein of human papillomavirus type 52 |
| CN102229660B (zh) | 2011-05-25 | 2015-04-22 | 厦门大学 | 截短的人乳头瘤病毒33型l1蛋白 |
| KR101559622B1 (ko) | 2012-07-30 | 2015-10-13 | 중앙대학교 산학협력단 | 인유두종바이러스 바이러스 유사입자의 고효율 정제방법 |
| CN105177025B (zh) * | 2013-12-03 | 2022-11-01 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 18型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法 |
| US10513541B2 (en) * | 2015-12-04 | 2019-12-24 | Xiamen University | Mutant of L1 protein of human papillomavirus type 11 |
| CN106831960B (zh) * | 2015-12-04 | 2019-11-05 | 厦门大学 | 一种人乳头瘤病毒6型l1蛋白的突变体 |
| WO2021013069A1 (zh) * | 2019-07-19 | 2021-01-28 | 神州细胞工程有限公司 | 嵌合的人乳头瘤病毒11型l1蛋白 |
| CN114539363B (zh) * | 2020-11-26 | 2023-12-01 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种c端改造的人乳头瘤病毒11型l1蛋白及其用途 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69434383T2 (de) | 1993-03-09 | 2005-11-24 | The University Of Rochester | Herstellung von menschlichem papillomavirus hüllprotein und virus-ähnlichen teilchen |
| US20020193565A1 (en) * | 1998-03-27 | 2002-12-19 | Stanley Margaret Anne | Antigen preparation and use |
| AU3730600A (en) * | 1999-03-18 | 2000-10-04 | Xiaojiang Chen | Compositions preparations and uses of human papillomavirus l1 protein |
| AP2004003021A0 (en) | 2001-08-31 | 2004-06-30 | Univ Cape Town | Vectors, constructs and transgenic plants for HPV-11 and HPV-16 L1 capsid protein. |
| GB0206359D0 (en) | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
| WO2003093437A2 (en) | 2002-05-02 | 2003-11-13 | University Of Rochester | Production of papillomavirus vaccines in plants |
| CN1293093C (zh) | 2002-08-30 | 2007-01-03 | 马润林 | 乳头瘤病毒衣壳蛋白的原核制备和应用 |
| CN1683010A (zh) | 2005-02-06 | 2005-10-19 | 哈尔滨医科大学 | 人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合蛋白抗原及构建方法 |
| CN101153280B (zh) * | 2006-09-29 | 2015-08-19 | 厦门大学 | 从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 |
-
2008
- 2008-05-29 DK DK08757380.4T patent/DK2154148T3/en active
- 2008-05-29 US US12/601,983 patent/US9533035B2/en active Active
- 2008-05-29 EP EP15160399.0A patent/EP2907821B1/en active Active
- 2008-05-29 EP EP15160363.6A patent/EP2910566B1/en active Active
- 2008-05-29 DK DK15160363.6T patent/DK2910566T5/en active
- 2008-05-29 BR BRPI0810959-1A patent/BRPI0810959B1/pt active IP Right Grant
- 2008-05-29 DK DK15160399.0T patent/DK2907821T3/en active
- 2008-05-29 EP EP08757380.4A patent/EP2154148B1/en active Active
- 2008-05-29 WO PCT/CN2008/001049 patent/WO2008145020A1/zh not_active Ceased
- 2008-05-29 CN CN200810111389.1A patent/CN101343314B/zh active Active
-
2016
- 2016-11-14 US US15/350,264 patent/US9943586B2/en active Active
-
2018
- 2018-03-19 US US15/924,511 patent/US10537629B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008145020A1 (fr) | 2008-12-04 |
| EP2154148A4 (en) | 2011-01-05 |
| US20170065708A1 (en) | 2017-03-09 |
| DK2907821T3 (en) | 2017-04-10 |
| US9943586B2 (en) | 2018-04-17 |
| EP2910566A1 (en) | 2015-08-26 |
| HK1208473A1 (en) | 2016-03-04 |
| EP2907821B1 (en) | 2016-12-28 |
| US9533035B2 (en) | 2017-01-03 |
| US20100291141A1 (en) | 2010-11-18 |
| DK2910566T3 (en) | 2016-10-24 |
| EP2907821A1 (en) | 2015-08-19 |
| EP2154148B1 (en) | 2016-06-22 |
| CN101343314A (zh) | 2009-01-14 |
| CN101343314B (zh) | 2015-11-25 |
| HK1124344A1 (zh) | 2009-07-10 |
| DK2154148T3 (en) | 2016-09-19 |
| BRPI0810959A2 (pt) | 2015-07-21 |
| US10537629B2 (en) | 2020-01-21 |
| EP2910566B1 (en) | 2016-07-13 |
| US20180207257A1 (en) | 2018-07-26 |
| DK2910566T5 (en) | 2016-11-07 |
| EP2154148A1 (en) | 2010-02-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10537629B2 (en) | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 11 | |
| US9745351B2 (en) | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 6 | |
| US9428555B2 (en) | Truncated L1 protein of Human Papillomavirus type 16 | |
| US9364529B2 (en) | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 18 | |
| BR112013000996B1 (pt) | Proteína l1 hpv58 truncada, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, partícula do tipo viral hpv58, composição, composição farmacêutica ou vacina, método para obter uma proteína l1 hpv58 truncada, método para preparar a partícula do tipo viral hpv58, método para preparar uma vacina, e uso da proteína l1 hpv58 truncada | |
| HK1208473B (en) | A truncated l1 protein of human papillomavirus 11 | |
| BRPI0815818B1 (pt) | Proteína li truncada do papiloma vírus humano tipo 18 | |
| HK1124343B (en) | Truncated human papillomavirus type 6 l1 proteins | |
| HK1133892B (en) | Truncated human papillomavirus type 18 l1 proteins | |
| HK1124344B (en) | Truncated human papillomavirus type 11 l1 proteins | |
| BR112013030150B1 (pt) | Proteína l1 hpv33 truncada, ácido nucléico, vetor, célula hospedeira, partícula do tipo viral hpv33, composição, composição farmacêutica ou vacina, método para obter uma proteína l1 hpv33 truncada, método para preparar a partícula do tipo viral hpv33, método para preparar uma vacina e uso da proteína l1 hpv33 truncada | |
| HK1205147B (en) | Truncated l1 proteins of human papillomavirus type 45 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] |
Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS. |
|
| B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: XIAMEN UNIVERSITY E OUTRO (CN) ; XIAMEN INNOVAX BI |
|
| B07E | Notice of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] | ||
| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B06A | Notification to applicant to reply to the report for non-patentability or inadequacy of the application [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 29/05/2008, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, , QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO. |