BRPI0811501A2 - sistema de expressão para a produção de um ou mais polipeptídeo-alvo/polipeptídeos-alvo, uso do mesmo e método para a produção sem antibiótico de um polipeptídeo-alvo - Google Patents

Abstract

SISTEMA DE EXPRESSÃO PARA A PRODUÇÃO SEM ANTIBIÓTICO DE POLIPEPTÍDEOS. A presente invenção refere-se a um sistema de expressão para produção de um ou mais polipeptídeo-alvo/polipeptídeos-alvo compreendendo uma célula hospedeira em cujo genoma a sequência de DNA que codifica desidrogenase de glicerina-3-fosfato é inativado ou parcial ou completamente deletado e a qual é transformada por um elemento extracromossômico que compreende uma sequência de DNA que codifica o (s) polipeptídeo(s)-alvo e desidrogenase de glicerina-3-fosfato, pelo que não apenas o genoma da célula hospedeira, mas também o elemento extracromossômico, não trazem gene de resistência a antibiótico, bem como uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo com atividade de desidrogenase de glicerina-3-fosfato caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA é selecionada de a) sequências de DNA que compreendem uma sequência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1 b) sequências de DNA que compreendem uma sequência de nucleotídeo representada pelos nucleotídeos 1338 a 2375 de SEQ ID NO: 1, c) sequências de DNA que são codificadas pelo plasmídeo pTP01 com o mapa de plasmídeo de acordo com SEQ ID NO: 2, e) sequências de DNA que hibridizam, sob condições estringentes, a uma das sequências de DNA de acordo com a), b), c) ou d), f) sequências de DNA que estão relacionadas às sequências de DNA/nucleotídeo de acordo com a), b), c) ou d), f) sequências de DNA que são relacionadas às sequências de DNA/nucleotídeo de acordo com to a), b), c), d) ou e) em virtude da degenerância do código genético e g) fitas complementares às sequências de acordo com a) a f) e a proteína codificada pelas mesmas.

Description

R 187 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SISTEMA DE EXPRESSÃO PARA A PRODUÇÃO DE UM OU MAIS POLIPEPTÍDEO- " ALVO/POLIPEPTÍDEOS-ALVO, USO DO MESMO E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO SEM ANTIBIÓTICO DE UM POLIPEPTÍDEO-ALVO".

A presente invenção refere-se a um sistema de expressão mi- crobiana para a produção de polipeptídeos baseado no uso de DNA extra- cromossômico, pelo que nenhum gene marcador de antibiótico (genes cujas proteínas derivadas proporcionam à célula resistência a um antibiótico, tam- bém denominados genes de resistência a antibiótico, genes de resistência, marcador antibiótico ou marcador de seleção por antibiótico) para a seleção da células hospedeira, mas sequências de DNA que codificam glicerina-3- fosfato desidrogenase (também denominada reductase de di-hidroxiacetona fosfato NAD(P)H-dependente, glicerina-3-fosfato desidrogenase NAD(P)H- dependente, glicerina-3-fosfato desidrogenase (NADP), sintase de glicerina- 3Hfosfato, glicerina-3-fosfato desidrogenase Dbiossintética, L-glicerina-3- fosfato: oxidoreductase de NAD(P)) são usadas e, assim, a produção do polipeptídeo desejado, por exemplo, xilanase, não requer a adição de antibi- óticos. O sistema de expressão é sem genes de resistência a antibiótico. A invenção ainda se refere a uma sequência de DNA que codifica um —polipeptídeo com atividade de glicerina-3-fosfato desidrogenase, bem como um polipeptídeo com atividade de glicerina-3-fosfato desidrogenase.

Polipeptídeos e enzimas que são necessários em grandes quan- tidades são, hoje, obtidos principalmente através de fermentação de micro- organismos. Dois grupos de micro-organismos são aqui usados - i) tais mi- cro-organismos que as proteínas de interesse produzem naturalmente e ii) micro-organismos geneticamente modificados. Os métodos genéticos que são necessários para a modificação dos micro-organismos são conhecidos no estado da técnica há muito tempo. O princípio dos mesmos é que genes que codificam proteínas de interesse são inseridos nas células hospedeiras e transcritos, traduzidos, possivelmente modificados pós-traducionalmente e opcionalmente secretados pelas respectivas membranas no periplasma ou no meio adjacente pelas células hospedeiras. Os polipeptídeos de interesse

E: 2/37 podem, então, ser isolados das respectivas células ou dos sobrenadantes de Í cultura.

" Em métodos técnicos para a produção de polipeptídeos, primeiro as habilidades naturais dos micro-organismos usados para a produção são exploradas para síntese e, opcionalmente, para secreção das proteínas. Tais sistemas que são de custo eficaz na fermentação, mostram uma alta taxa de formação de produto e prometem uma duplicação, modificação, etc. corretas do polipeptídeo a ser produzidos são, basicamente selecionados como sis- temas para a produção de polipeptídeos. Os micro-organismos estabeleci- dos para isso são de origem eucariota tais como, por exemplo, fungos fila- mentosos (Aspergilla, Trichoderma, Penicilium) e levedos (por exemplo, Saccharomyces, Hansenula, Pichia) ou procariotas são usados tais como, por exemplo, E. coli, bacilli, lactobacilli, staphylococci, streptomycetes ou pseudomonades.

A adequabilidade de um método biotecnológico depende, decisi- vamente, do rendimento obtido do polipeptídeo. Esse rendimento não ape- nas é determinado pelo sistema de expressão usado, mas também pelo pro- cesso de fabricação usado, particularmente pelos parâmetros de fermenta- ção e o meio de cultura. Otimizando o sistema de expressão e o processo de fermentação, o potencial e rendimento obtenível podem ser claramente au- mentados.

Micro-organismos geneticamente modificados contêm a nova informação genética integrada no genoma, conforme frequentemente é o caso para fungos filamentosos ou levedos ou sobre elementos extracromos- —sômmicos tais como, por exemplo, plasmídeos que são frequentemente u- sados em procariotas ou também levedos. Os primeiros construtos, nos quais a nova informação genética é integrada no genoma do hospedeiro, também são muito estáveis sem pressão de seleção. A desvantagem desse método para procariotas é que apenas uma cópia do gene está presente no hospedeiro após a transformação e integração de outras cópias do mesmo gene para aumento da taxa de formação de produto através do efeito de ge- ne-dosagem é metodicamente muito complexa. Uma solução para essa a-

: 3/37 bordagem pode ser encontrada no EP 0 284 126 B1, o qual resolve o pro- à blema da múltipla integração estável de um gene fornecendo separadamen- -. te as cópias do gene exógeno a ser integrado no genoma da célula hospe- deira através de DNA cromossômico endógeno que é vital para a célula.

O pedido de patente DD 277467 A1 proporciona um método para a produção de enzimas extracelulares, o qual é baseado na integração estável, vantajo- samente múltipla, dos genes que codificam um polipeptídeo de interesse no cromossoma bacteriano.

A integração é aqui realizada através de recombi- nação através de faixas homólogas.

Um gene de eritromicina que está conti- do sobre o plasmídeo pelo qual os genes são inseridos na célula e inativa- dos no caso de uma integração com sucesso serve como um controle dos eventos de integração com sucesso.

O pedido WO 96/23073 A1 descreve um sistema baseado na transposição para a integração de várias cópias de um gene de interesse no —cromossoma bacteriano caracterizado pelo fato de que os genes marcado- res do vetor são deletados durante ou após a integração e, assim, as cepas obtidas são isentas de um gene marcador.

De acordo com esse documento, um marcador é necessário apenas durante a construção da respectiva cepa bacteriana.

Um sistema para aumento do número de cópias de determina- dos genes integrado em um cromossoma bacteriano é descrito no pedido WO 01/90393 A1. Se DNA extracromossômico é usado para a produção de um micro-organismo geneticamente modificado, o gene de interesse é transferi- do para um elemento de replicação autônoma, por exemplo, um plasmídeo, e epissomicamente mantido no organismo hospedeiro.

O efeito de gene- dosagem através do número usualmente alto de cópias de plasmídeo por célula influencia, vantajosamente, o rendimento do polipeptídeo que é codifi- cado pelo gene de interesse.

Desvantajoso é o fato de que uma pressão de seleção tem de ser mantida durante todo o tempo de cultura para manter os elementos extracromossômicos estáveis na célula.

Como uma regra, isso ocorre através da adição de antibióticos ao meio de cultura.

Uma vez que o

B 4/37 gene pelo qual o micro-organismo se torna resistente ao antibiótico está lo- calizado sobre o elemento extracromossômico, apenas as células que têm . tal elemento podem crescer.

O gene de interesse é mantido nas células em um alto número de cópias localizando-o sobre o mesmo plasmídeo, pelo que os hospedeiros se tornam resistentes ao antibiótico/antibióticos.

Usando an- tibióticos como pressão de seleção, perda do plasmídeo em virtude de insta- bilidade segregativa ou estrutural pode ser evitada (Bron e Luxen, 1985, Plasmid 14, 235-244). Dessa forma, plasmídeos maiores podem também ser mantidos estáveis na célula e a célula mantém a capacidade de produzir o —polipeptídeo desejado.

Geralmente, uma perda de DNA extracromossômico ocorre muito facilmente, em particular se é sobre DNA que é desconhecido desse organismo.

Conforme com plasmídeos que contêm bactérias natural- mente, a aplicação de pressão de seleção é também frequentemente razoá- vel, uma vez que os elementos extracromossômicos que ocorrem natural- mente estão frequentemente presentes apenas em um baixo número de có- pias; contudo, um alto número de cópias é necessário para uma taxa de produção comercialmente alta.

Esse alto número de cópias pode, contudo, usualmente ser mantido apenas através de uma pressão de seleção.

O uso de resistências a antibiótico como marcador de seleção tem sido considerado mais e mais criticamente em anos recentes.

Primeira- mente, o uso de antibióticos é caro, particularmente se a resistência é base- ada em uma enzima que degrada o antibiótico, de modo que o antibiótico deve ser fornecido durante todo o cultivo.

Em segundo, seu uso mundial, o qual também se estende a outros campos de engenharia e medicina, contri- —buiparaa disseminação de genes de resistência para outras cepas também patogênicas, o que poderia ter consequências negativas sobre o controle da doença.

Sistemas de seleção sem antibiótico também já foram desenvol- vidos na técnica anterior.

Por exemplo, a publicação de Herrero e outros (1990, J.

Bacteriol. 172, 6557-6567) descreve resistências a herbicidas e metais pesados como marcador de seleção.

Contudo, as mesmas preocu- pações contra antibióticos surgem contra o uso desses compostos.

. 5/37 Outro método aplicado para manter plasmídeos estáveis na célula é a complementação epissômica de cepas auxotrópicas. Nesse caso, L genes do genoma da cepa de produção que codificam funções metabólicas essenciais são removidos ou inativados. As cepas hospedeiras assim auxo- trópicas podem crescer apenas se a função metabólica é alternativamente reproduzida. O produto metabólico necessário pode, por exemplo, ser adi- cionado ao meio se a cepa é capaz de aceitar esse metabólito ou o gene que é desativado sobre o genoma do hospedeiro e que codifica a função essencial pode ser tornado epissomicamente disponível. Vantajosamente, isso ocorre sobre o plasmídeo que também traz o gene de interesse para a produção de um polipeptídeo. A patente EP 0 284 126 B1 lista os genes me- tabólicos leu, his, trp ou semelhante, particularmente aqueles das vias de síntese de aminoácido, como marcadores de seleção auxotrófica.

Na prática, o uso de tais auxotropias como marcadores de sele- ção tem sido muito difícil até o momento uma vez que, particularmente em meios de fermentação industriais, quase todas as substâncias necessárias, tais como aminoácidos e vitaminas, estão disponíveis em quantidades sufi- cientes e as respectivas células podem equilibrar a incapacidade de síntese de um determinado metabólito através de absorção desse metabólito do —meiode cultura.

Os meios de fermentação industrialMente usados contêm, usu- almente, componentes que são produtos residuais de outros, frequentemen- te processos fermentativos, por exemplo, resíduos de grão da produção de etanol (grão consumido de destilarias), resíduos de milho da produção de amido (pó de sabugo de milho ou licor de sabugo de milho) ou resíduos de batata da produção de batata (sedimento de batata). Esses componentes servem não apenas como fonte de carbono (C) ou fonte de nitrogênio (N), mas também são, frequentemente, ricos, por exemplo, em vitaminas ou ami- noácidos em virtude da fermentação microbiana que foi envolvida em sua recuperação. Os meios de fermentação industrialmMente usados são, conse- quentemente, muito complexos. Assim, é difícil, se não mesmo impossível, manter uma pressão de seleção nesses mesmos, mesmo se cepas auxotró-

: 6/37 picas são usadas. À Até o momento, as únicas exceções são auxotropias para a timi- - dina e D-alanina essenciais necessárias para Bacilli e micro-organismos gram-positivos, os quais estão presentes apenas em traços ou nem isso em meios de fermentação industriais e, assim, devem ser produzidos pelos mi- cro-organismos em si. Portanto, o pedido EP 0 251 579 A1 proporciona a Solução ao usar, como cepas hospedeiras, cepas que são deficientes com relação ao gene essencial para o metabolismo de nucleotídeo para a sintase de timidilato. Consequentemente, o gene pode ser tornado disponível quanto àsuafunção (thyA de Escherichia coli KI2) por meio de um vetor e cura do defeito gênico. A patente EP 0 185 512 B1 resolve o problema através da inserção do gene dal (racemase de D,L-alanina) no plasmídeo usando cepas hospedeiras dal-deficientes.

Uma outra solução para esse problema foi descrito no pedido WO 2004/078953. É descrito que os fatores essenciais envolvidos na secre- ção eram adequados para uma seleção. Um gene cuja proteina derivada está envolvido na translocação de proteina como um fator que é essencial para o respectivo gene, por exemplo, com relação a Bacillus, as proteinas SecA, SecY, SecE, b-SRP, FtsY ou PrsA, proporcionam a base para sele- ção. lsso significa que a falha de tal fator é letal e, assim, permite uma sele- ção antibiótico-similar dos micro-organismos recombinantes.

Acima de tudo deve ser estabelecido que, a despeito da experi- ência na produção de polipeptídeos através de métodos biotecnológicos du- rante anos, até o momento, não foi proporcionado um sistema praticável pe- loquala produção com um alto número de cópias do gene de interesse sem seleção através de substâncias caras ou ecologicamente questionáveis, tais como antibióticos, seja possível. Até o momento, as diferentes abordagens para a seleção através de marcadores auxotrópicos também resultou em resultados negligenciáveis em virtude do meio de cultura complexo usado na indústria (WO 2004/078953) ou sistemas que ainda contêm genes de resis- tência a antibiótico.

O uso de meios definidos compostos de componentes purífica-

.: 7137 dos (fontes de C e fontes de N puras, bem como vitaminas, aminoácidos e minerais) não é possível para a produção de polipeptídeos industrialmente . usados tais como, por exemplo, enzimas, na indústria alimentícia, indústria de ração ou indústria de detergente em virtude do alto custo dos mesmos.

Portanto, é o objetivo da presente invenção proporcionar um sis- tema de expressão para a produção de polipeptídeos pelos quais não há seleção através de substâncias caras e/ou poluentes e/ou não-saudáveis. Uma seleção não ocorre através de resistências a antibiótico, em particular. O sistema de expressão de acordo com a invenção é facilmente aplicável e universalmente adequado para expressão de quaisquer polipeptídeos-alvo. Além disso, o sistema de expressão de acordo com a invenção é adequado para o estabelecimento em quaisquer células hospedeiras. Além disso, o sistema de expressão de acordo com a invenção é também para permitir uma seleção em meios de cultura industrialmente usuais ou de custo eficaz.

O objetivo é resolvido por um sistema de expressão para a pro- dução de um ou mais polipeptídeo-alvo/polipeptídeos-alvo compreendendo uma célula hospedeira em cujo genoma a sequência de DNA que codifica glicerina-3-fosfato desidrogenase é inativado ou parcial ou completamente deletado e a qual é transformada por um elemento extracromossômico que compreende uma sequência de DNA que codifica o(s) polipeptídeo(s) alvo e glicerina-3-fosfato desidrogenase, pelo que não apenas o genoma da célula hospedeira, mas também o elemento extracromossômico, não trazem gene de resistência a antibiótico.

Surpreendentemente, descobriu-se que um gene de glicerina-3- fosfato desidrogenase que é proporcionado sobre um elemento extracro- mossômico pode ser usado nas respectivas células hospedeiras auxotrópi- cas para a seleção das células hospedeiras correspondentes. O elemento auxotrópico que traz o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase também traz o gene para o polipeptídeo de interesse a ser produzidos.

Portanto, o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase serve co- mo um marcador de seleção para estabilização do elemento extracromos- sômico nas células hospedeiras auxotrópicas. Essa estabilização do elemen-

: 8/37 to extracromossômico, o qual compreende uma sequência de DNA que codi- fica o(s) polipeptídeo(s) alvo e glicerina-3-fosfato desidrogenase, é baseada na complementação epissômica da célula hospedeira tornada auxotrópica. No genoma da cepa hospedeira, uma sequência de DNA que codifica glicerina-3-fosfato desidrogenase ou um respectivo gene é inativada. Esse gene codifica a enzima glicerina-3-fosfato desidrogenase (também denomina reductase de di-hidroxiacetona fosfato NAD(P)H-dependente; sintase de gli- cerina-3-fosfato, glicerina-3-fosfato desidrogenase biossintética; Morbidoni e outros, 1995, J. Bacteriol. 177 (2), 5899-5909; números EC 1.1.1.8, 1.1.1.94, aqui também, inter alia, glicerina-3-fosfato desidrogenase NAD(P)H- dependente, glicerina-3-fosfato desidrogenase (NADP), oxidoreductase de L- glicerina-3-fosfato: NAD(P)). A glicerina-3-fosfato desidrogenase catalisa a conversão de di-hidroxiacetona fosfato em sn-glicerina-3-fosfato sob a liga- ção de NAD(P)H. A sn-glicerina-3-fosfato em si é a substância inicial para a síntese de fosfolipídio da célula e, assim, metabólito central para a síntese de membrana celular. Dependendo do organismo, o gene para a glicerina-3- fosfato desidrogenase NAD(P)H-dependente é, inter alia, referido como gp- sA (também denominado gol, gly, glyc), gpd (gpd 1/2/3/A/A1/A2/h) ou dar1. Geralmente, ela é a enzima que catalisa a síntese de glicerina-3-fosfato sob condições fisiológicas e usualmente usa NAD(P)H como cofator. Uma enzi- ma que usa um cofator diferente, por exemplo, FAD, também seria concebi- vel. Dependendo da cepa hospedeira, o gene correspondente que codifica glicerina-3-fosfato desidrogenase ou genes de glicerina-3-fosfato desidroge- nase são inativados.

Deletando o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase no ge- noma da cepa hospedeira, essa cepa se torna auxotrópica para glicerina-3- fosfato (G3P); contudo, pode cresce se o meio de cultura é correspondentemente suplementado (com G3P ou glicerina) ou o gene correspondente é epissomicamente proporcionado. Inserindo o gene de —glicerina-3-fosfato desidrogenase no plasmídeo, o qual também traz a sequência de DNA para o polipeptídeo de interesse, o plasmídeo é mantido estável na célula hospedeira auxotrópica. Concorrentemente, os genes de

E 9/37 : resistência a antibiótico, os quais usualmente existem sobre plasmídeos, são eliminados.

Além disso, genes de resistência a antibiótico que estão - opcionalmente presentes no genoma de uma célula hospedeira são também eliminados.

A eliminação dos genes de resistência a antibiótico é realizada em uma maneira conhecida per se, por exemplo, do genoma através de recombinação homóloga (vide abaixo) ou do plasmídeo através de excição por meio de enzimas de restrição adequadas e subsequente ligação.

A respectiva sequência de DNA que codifica glicerina-3-fosfato desidrogenase é deletado no genoma da célula hospedeira do sistema de expressão de acordo com a invenção.

A deleção pode ser completa ou parcial.

Em qualquer caso, a deleção deve estar presente para o efeito de que o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase seja inativado.

A inativação desse gene na cepa hospedeira ocorre através de recombinação homóloga com uma cópia do gene inativado ou (parcialmente) deletado, por exemplo.

Como um resultado desse evento de recombinação, a cópia cromossomica do gene se torna inoperável.

Além disso, sistemas preferidos são caracterizados pelo fato de que a inativação do gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase sobre o vetor de complementação de cura é evitada, de preferência, em uma perda completa do gene ou seção gênica compreendida no respectivo locus cromossômico.

Uma recombinação e integração do vetor de complementação no genoma do hospedeiro, pelo quais a célula é epissomicamente fornecida com a função essencial, curariam a inativação novamente e, assim, compensando a pressão de seleção pela qual o plasmídeo é mantido estável na célula.

O gene realmente de interesse e a ser expresso poderia, desse modo, ser pedido através de subsequentes divisões celulares ou estaria presente apenas em uma ou poucas cópias sobre o cromossoma.

Isso é impedido através de uma deleção completa ou extensiva durante a etapa de inativação, a qual pode, teoricamente, também envolver seções de DNA que estão localizadas a montante ou a jusante.

Deve ser levado em conta que as regiões a montante ou a jusante do gene gpsA podem ter funções na cepa hospedeira que também são essenciais para o hospedeiro.

: 10/37 Para excluir uma recombinação homóloga entre o gene de glicerina-3-fosfato — desidrogenase proporcionado pelo — elemento - extracromossômico e um gene cromossômico opcionalmente presente, é necessário inativar o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase sobre o genoma do hospedeir não apenas através de uma mutação de ponto individual, mas removê-lo extensiva ou completamente.

A eliminação do gene do genoma do hospedeiro é, por exemplo, realizada através de recombinação homóloga por meio de um vetor de deleção compreendendo apenas uma parte inativa do gene ou, ainda melhor, apenas as regiões de flanqueamento do gene sem o gene em si, de modo que a cópia do gene sobre o genoma do hospedeiro é substituída pela cópia truncada presente sobre o vetor de deleção ou completamente deletado.

É essencial que nenhum gene marcador de antibiótico seja aqui deixado para trás.

A fim de eliminar o gene completamente do hospedeiro, é necessário isolar as regiões que flanqueiam o gene a montante e a jusante do genoma do hospedeiro e inserir essas regiões de flanqueamento sem o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase em si em um vetor de deleção.

Então, a recombinação homóloga ocorre entre as sequências que flanqueiam o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase, pelo que o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase é completamente removido do genoma.

De acordo com a invenção, o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase deletado ou inativado sobre o cromossoma do hospedeiro é novamente tornado disponível! à célula sobre um elemento extracromossômico também trazendo uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo de interesse.

Não apenas o mesmo gene que foi deletado na respectiva célula hospedeira, mas também um gene correspondente que codifica glicerina-3-fosfato desidrogenase NAD(P)H-dependente, podem ser tornados disponíveis à célula hospedeira novamente.

Portanto, a invenção também se refere a um vetor para a complementação do genoma de uma célula hospedeira na qual a sequência de DNA que codifica glicerina-3-fosfato desidrogenase é deletada, compreendendo uma sequência de DNA que codifica o(s) polipeptídeo(s)

: 11/37 alvo e um cassete de expressão que compreende uma sequência de DNA que codifica glicerina-3-fosfato desidrogenase, pelo que o vetor não contém - genes de resistência a antibiótico. Assim, o vetor cura a inativação do DNA que codifca a glicerina-3-fosfato — desidrogenase ("vetor de complementação"), isto é, ele proporciona extracromossomicamente uma cópia do gene ativo que codifica glicerina-3-fosfato desidrogenase. Os termos "vetor" e "plasmídeo" são basicamente usados permutavelmente. Outros elementos extracromossômicos tais como, por exemplo, fagos, pagmídeos ou transposons, também podem servir como vetores.

Um plasmídeo que mantém um alto número de cópias na célula hospedeira é preferido como um vetor. É particularmente vantajoso se o plasmídeo é um plasmídeo que estabelece uma base (por exemplo, 10 a 30 plasmídeos por célula), de preferência em um número múltiplo de cópias (mais de 30 plasmídeos por célula). Quanto mais cópias do plasmídeo estão presentes, maior é o rendimento do produto de proteína desejado em virtude do efeito de gene-dosagem.

De acordo com a invenção, o vetor de complementação não contém quaisquer genes de resistência a antibiótico. Além disso, o vetor de complementação contém não apenas as sequências de interesse para a produção de polipeptídeo, mas também um cassete de expressão com o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase.

De preferência, a sequência deletada que codifica a glicerina-3- fosfato desidrogenase e está endogenamente presente nas células hospedeiras é aqui usada. Contudo, também é possível usar sequências de outros organismos que codificam uma enzima tendo a mesma função, de preferência de cepas relacionadas, se elas são capazes de curar o respectivo defeito e, desse modo, proporcionar um sistema que assegura uma alta produtividade da proteína de interesse sem pressão de seleção adicional. Uma perda desse DNA extracromossômico seria letal para a célula hospedeira auxotrópica se crescendo em meio minimo, de modo que tal célula é forçada a transmitir esse elemento extracromossômico para a geração seguinte em cada divisão celular. Há uma pressão de seleção

D 12/37 endógena no sistema de acordo com a invenção, na medida em que a cepa i recombinante cresça em um meio sem fornecimento de glicerina-3-fosfato - ou glicerina. Não é necessário adicionar um antibiótico para evitar a perda do vetor com o gene a ser expresso.

Os cassetes de expressão que podem ser usados para a introdução de uma sequência de DNA que codifica a atividade de uma glicerina-3-fosfato desidrogenase ou uma rede de leitura aberta de acordo com a invenção em uma célula hospedeira compreende, de preferência, uma região de início de transcrição que está ligada à rede de leitura aberta.

Tal cassete de expressão pode compreender uma variedade de sítios de clivagem por restrição para a inserção da rede de leitura aberta e/ou outro DNA, por exemplo, uma região de regulação de transcrição. O cassete de transcrição compreende, na direção 5'>3' da transcrição, uma região de iní- cio de transcrição e tradução, a sequência de DNA que codifica a atividade de glicerina-3-fosfato desidrogenase e uma região de término de transcrição e tradução que é funcional em uma célula microbiana. A região de término pode ser nativa com relação à região de início de transcrição, pode ser nati- va com relação à sequência de DNA de interesse ou pode ser derivada de qualquer outra fonte.

O termo "rede de leitura aberta" (ORF) se refere à sequência de aminoácido que é codificada entre os códons inicial e terminal de tradução de uma sequência de codificação. Os termos "códon inicial" e "códon termi- nal" se referem a uma unidade de três nucleotídeos adjacentes (códons) em uma sequência de codificação, os quais especificam o início e final de ca- deiada síntese de proteína (tradução de mRNA).

Com relação a um ácido nucleico, "ligação operável" se refere a um composto como parte da mesma molécula de ácido nucleico em uma posição e orientação adequadas ao início de transcrição do promotor. DNA em ligação operável a um promotor está localizado abaixo da regulação de início de transcrição do promotor. Sequências de codificação podem ser o- peravelmente ligadas à sequência regulatória, na orientação senso ou anti- senso. Com referência a polipeptídeos, ligação operável significa o compos-

. 13/37 to como parte do mesmo polipeptídeo, isto é, através de ligações de peptidi- la. - De acordo com a invenção, quaisquer promotores podem ser usados, na medida em que eles mantenham o sistema de acordo com a in- venção estável.

Em uma modalidade preferida, promotores fracos e constitu- tivos são usados.

Promotor usualmente se refere à sequência de nucleotí- deo a montante (5') com relação à sequência de codificação e controla a ex- pressão da sequência de codificação proporcionando o reconhecimento da RNA polimerase e outros fatores que são necessários para a transcrição correta.

O promotor usado de acordo com a invenção pode compreender um promotor mínimo, isto é, uma sequência de DNA curta a partir de uma caixa TATA e outras sequências que especificam o sítio de início de transcrição ao qual elementos regulatórios são presos para controlar a expressão.

Com o sistema de expressão de acordo com a invenção, o —polipeptídeo de interesse pode ser produzido com um rendimento se não maior, pelo menos o mesmo, sem a adição de antibiótico em qualquer ponto da produção e sem genes marcadores de antibiótico estarem presentes e sem antibióticos ou genes de resistência a antibiótico estarem presentes no produto de proteína.

Usando o sistema de expressão de acordo com a in- venção, os produtos podem, portanto, também ser usados naquelas aplica- ções nas quais a presença de genes marcadores de antibiótico completos ou parciais não são admissíveis ou desejados.

A invenção ainda se refere ao uso do sistema de expressão para a produção sem antibiótico do polipeptídeo-alvo.

O sistema de expressão é, desse modo, crescido em um meio que é isento de glicerina-3-fosfato ou compostos que proporcionam glicerina-3-fosfato.

Exemplos de tais meios são estabelecidos acima.

O crescimento do sistema de expressão é realiza- do de uma maneira conhecida per se.

O sistema de expressão de acordo com a invenção é adequado para quaisquer células hospedeiras.

O sistema de expressão de acordo com a invenção pode, em geral, ser usado para praticamente todas as células hospedeiras industriais que são importantes para produção fermentativa de h 14/37 : proteina. São exemplos organismos hospedeiros gram-positivos, por exem- ' plo, dos gêneros Staphylococcus, Corynebacterium ou Bacillus, particular- - mente das espécies Staphylococcus camosus, Corynebacterium glutami- cum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. brevis, B. globigii,B. megaterium, B. clausii ou B. lentus e, muito particularmente, deri- vados das cepas B. licheniformis ou B. amyloliquefaciens.

O uso de cepas de Bacillus como células hospedeiras é preferi- do. Particularmente preferido é o uso de Bacillus amyloliquefaciens. Em Ba- cillus amyloliquefaciens, o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase está presente como gpsA. Surpreendentemente, descobriu-se que o sistema de expressão de acordo com a invenção pode ser estabelecido em Bacillus am- yloliquefaciens sem uma redução do número de cópias do plasmídeo de produção comparado com o plasmídeo contendo marcador de antibiótico análogo (derivado de pUB110). Antes, foi possível obter uma alta produtivi- dade com uma cepa hospedeira de Bacillus amyloliquefaciens assim trans- formada (GpsA”), mesmo se comparado com a cepa hospedeira transforma- da pelo plasmídeo inicial com gene marcador de antibiótico (plK91 derivado de pUB110, vide EP 0 585 617 B1) (GpsA”).

Ainda, descobriu-se que o gene gpsA endógeno de Bacillus am- —yloliquefaciens pode ser melhor removido do genoma de Bacillus amylolique- faciens através do uso das sequências que flanqueiam esse gene. Além dis- so, é vantajoso se o gene gpsA endógeno como tal é proporcionado episso- micamente. O gene gpsA de Bacillus amyloliquefaciens, o qual era desco- nhecido até o momento, foi isolado para essa finalidade. Embora bancos de dados de sequência tais como, por exemplo, EMBL (European Bioinforma- tics Institute (EBI), Cambridge, Grã Bretanha; http://www.ebi.ac.uk) ou Gen- Bank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institu- tes of Health, Bethesda, MD, EUA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) contenham dados do gene gpsA, uma comparação do gene de acordo com a invenção com genes gpsA de outros organismos mostra apenas 76% de identidade, a nível de DNA, com o gene descrito para Bacillus subtilis ou 71% de identida- de com o gene de Bacillus licheniformis.

: 15/37 ; A enzima glicerina-3-fosfato desidrogenase proporciona, em Ba- cilli, sn-glicerina-3-fosfato (G3P), um metabólito essencial da síntese de . membrana celular. Morbidoni e outros (1995) descrevem que o teor de G3P na célula de Bacillus subtilis deve ser regulado muito finamente e que o equi- líbrio entre síntese e degradação de G3P na célula é muito critico. Experi- mentos por Freese e outros (1972, em: Halverson e outros (ed.) Spores V, 212-221) mostram que células de B. subtilis nas quais fosfato de glicerina se acumula em virtude de um defeito da desidrogenase de glicerina de fosfato (Gof) catabólica crescem pior do que células normais e que a esporulação é suprimida.

Geralmente, é desejável que o gene de interesse que codifica o polipeptídeo a ser produzido esteja presente na célula hospedeira em um número possivelmente alto de cópias para aumentar o rendimento através do efeito de gene-dosagem. Assim, em uma modalidade preferida, plasmí- deos que estão presentes na célula com várias cópias são usados tais co- mo, por exemplo, derivados de pUB110, o qual está presente com cerca de 50 cópias por célula (Gryczan e outros, 1978, J. Bacteriol. 134, 318-329). A introdução de tais cópias numerosas do gene gpsA a ser complementado poderia, contudo, perturbar o equilíbrio sensível entre a síntese e degrada- çcãodeG3P.

Surpreendentemente, agora descobriu-se que esses problemas descritos para Bacillus subtilis não ocorrem em Bacillus amyloliquefaciens sob as condições de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferida, o gene gpsA é, desse modo, colocado abaixo de um promotor fraco. Zyprian e Matzura(1986, DNA 5, 219-225) reportam que, no vetor pUB110, tal pro- motor está naturalmente presente. Se o gene gpsA é colocado sob a regula- ção desse promotor, o equilíbrio delicado entre síntese e degradação de G3P na célula é aparentemente mantido, a despeito do número aumentado de cópias do gene comparado com uma célula de Bacillus não modificada.

Uma vez que o promotor é também constitutivo, glicerina-3-fosfato desidro- genase suficiente é proporcionada no ciclo celular de Bacillus em qualquer ponto de tempo. Além disso, esse sistema também resulta em uma manu-

. 16/37 y tenção estável do alto número de cópias na célula hospedeira gpsA-negativa se crescida em meio complexo. Isso permite a produção de polipeptídeos de . interesse, os quais também são codificados pelo vetor de complementação, em altas concentrações no meio de cultura usualmente utilizado pela indústria.

Conforme já afirmado, de acordo com a invenção, quaisquer promotores podem ser usados, na medida em que eles mantenham o siste- ma de acordo com a invenção estável. Promotores constitutivos fracos são particularmente preferidos tais como, por exemplo, o promotor antes men- cionado descrito para o plasmídeo pUB110 por Zyprian e Matzura (1986). O promotor ptsH de B. subtilis é também um promotor fraco e constitutivo ade- quado (Stulke e Hillen, 2000, Annu. Rev. Microbiol. 54, 849-80).

Conforme afirmado acima, no sistema de expressão de acordo com a invenção, o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase é inativado so- breo cromossoma do hospedeiro. A incapacidade de sintetizar glicerina-3- fosfato desidrogenase é equilibrada por um fornecimento epissômico do res- pectivo gene. Mutantes de Bacillus subtilis gposA-negativos já foram produzi- dos através de mutação clássica há muito tempo (Mindich, 1970, J. Mol. Biol. 49, 415-432). As mutações são alelos do gene gpsA (Morbidoni e outros, 1995), os quais provavelmente têm apenas mutações de ponto no gene gp- SA ou sua regulação.

Essas cepas (e esse método) não são utilizáveis para uma pro- dução de proteína industrial, uma vez que poderia haver remutação espon- tânea à forma ativa, bem como recombinação do gene gpsA intacto episso- —micamente fornecido com o gene cromossômico defectivo em virtude das longas regiões de homologia (conforme também Ostroff e outros, 1984, Mol. Gen. Genet. 193, 299-305). Khasanov e outros (1992, Mol. Gen. Genet. 234, 494-497) mostraram que já poderia haver uma recombinação homóloga no genoma em homologias de 70 bp em Bacillus. Em tal caso, as células hos- pedeiras poderiam se tornar prototrópicas novamente e não seriam mais dependentes do plasmídeo com o gene gpsA. Isso poderia levar a uma inte- gração mais fácil ou perda do plasmídeo, de modo que o polipeptídeo de

. 17/37 E interesse, o gene do qual também está presente sobre o plasmídeo, não po- deria mais ser produzido pela célula hospedeira ou apenas em pequenas . quantidades. O gene gpsA, bem como as regiões a montante e a jusante do gene, não são descritos para B. amyloliquefaciens, os bancos de dados (por exemplo, EMBL, GenBank, SubtiList (Moszer e outros, 1995, Microbiology 141, 261268 Moszeri 1998 FEBS Llett 430, 28-36, http://genolist.pasteur.fr./SubtilList/)) fornecem apenas dados sobre Bacillus subtilis e micro-organismos que são mais distantemente relacionados. A or- ganização do genoma de B. amyloliquefaciens não é conhecida. Genes que estão localizados sobre o cromossoma de B. subtilis em proximidade direta com o gene gpsA, isto é, que representam as regiões de flanqueamento ne- cessárias para a produção do hospedeiro auxotrópico podem estar presen- tes sobre o genoma de B. amyloliquefaciens em posições completamente diferentes ou podem mesmo estar faltando em geral. Também, deve ser le- vado em consideração que as regiões a montante e a jusante do gene gpsA podem codificar funções na cepa hospedeira que são essenciais para o hos- pedeiro. Para B. subtilis, genes com funções desconhecidas são descritos a montante e a jusante, enquanto que não há informação sobre genes adja- centes para B. amyloliquefaciens. Assim, é aconselhável manter completa- mente as regiões adjacentes ao gene gpsA para B. subtilis e também para B. amyloliquefaciens e outros Bacilli de modo a não destruir funções desco- nhecidas e, assim, complementáveis, do genoma. Uma deleção completa, mas possivelmente precisa do gene gpsA que não causa qualquer mutação ou desvioda rede de leitura nos possíveis genes adjacentes é, assim, aspi- rada de acordo com a invenção.

Uma recombinação homóloga para a remoção precisa de um gene cromossômico ou fragmentos gênicos obterá mais sucesso quanto mais longas as regiões homólogas são (conforme Hamilton e outros, 1989, Ju Bacteriol. 171 (9) 46174622). Descobriu-se que as regiões que flanquei- am o gene gpsà de B. amyloliquefaciens mostram apenas uma identidade de sequência de cerca de 84% para a região de cerca de 1,3 kbp a montante

: 18/37 e uma identidade de cerca de 69% para a região de cerca de 1,1 kbp a ju- Í sante das regiões correspondentes de B. subtilis - conforme descrito no ban- . co de dados SubtiList (Moszer e outros, 1995; 1998). A amplificação das re- giões de flanqueamento sobre o DNA cromossômico da cepa hospedeira B. amyloliquefaciens foi, assim, extremamente difícil, particularmente uma vez que possivelmente regiões homólogas longas para a construção do vetor de deleção tiveram de ser produzidas.

A deleção do gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase sobre o cromossoma do hospedeiro foi realizada, por exemplo, por meio de vetores de plasmídeo tendo uma origem de replicação que é sensível à temperatura ou não funciona em Bacilli e nos quais as possíveis regiõêês de DNA homó- logas (flanqueamento) do gene a ser deletado foram adicionalmente inseri- das (vetor de deleção). Uma inativação reversível, por exemplo, através de integração de um elemento genético móvel, por exemplo, um transposon, no genea ser inativado poderia, contudo, também ser concebível.

Métodos para a inativação de genes através de um vetor de de- leção são descritos na publicação de Vehmaanperã e outros (1991, J. Biote- chnol. 19, 221-240). A origem de replicação desse vetor de deleção é carac- terizada por sua dependência da temperatura. Assim, é possível selecionar uma transformação com sucesso em baixa temperatura primeiro e, então, exercer uma pressão de seleção para uma integração com sucesso através de aumento da temperatura. Então, a célula é curada pelo vetor compreen- dendo a cópia do gene endógeno, de modo que nenhuma cópia funcional do gene está mais presente sobre o cromossoma. Não restam quaisquer se- —quências de vetor, isto é, também, nenhum gene de resistência a antibiótico, na célula.

Portanto, a invenção se refere a uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo com atividade de glicerina-3-fosfato desidrogenase caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA é selecionada de a) se- —quênciasde DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo de acordo com 1, b) sequências de DNA que compreendem uma sequência de nucleo- tídeo representada pelos nucleotídeos 1338 a 2375 de SEQ ID NO: 1, c) se-

. 19/37 Eh quências de DNA que são codificadas pelo plasmídeo pTPO1 com o mapa de plasmídeo de acordo com a Figura 4 e depositado sob o número de de- - pósito DSM 18890, d) sequências de DNA que codificam a sequência de proteína de acordo com SEQ ID NO: 2, e) sequências de DNA que se hibri- dizam com uma das sequências de DNA de acordo com a), b), c) ou d) sob condições estringentes, f) sequências de DNA que são relacionadas às se- quências de DNA/nucleotídeo de acordo com a), b), c), d) ou e) em virtude da degenerância do código genético e g) fitas complementares às sequên- cias de acordo com a) a f), bem como um polipeptídeo com atividade de gli- cerina-3-fosfato desidrogenase selecionado de a) um polipeptídeo codificado pela parte de codificação da sequência de DNA acima, b) um polipeptídeo tendo uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 2 ou uma sequência deri- vada da mesma que é obtenível através de substituição, adição e/ou deleção de um mais aminoácidos da mesma, c) um polipeptídeo tendo uma sequên- cia que mostra pelo menos 77% de identidade aos aminoácidos 1 a 345 de SEQ ID NO: 2, d) um polipeptídeo que é codificado por uma sequência de ácido nucleico que se hibridiza, sob condições estringentes, com (i) os nu- cleotídeos 1338 a 2375 de SEQ ID NO: 1, (ii) uma sequência parcial de (i) de pelo menos 100 nucleotídeos ou (iii) uma fita complementar de (i) ou (ii), e) uma variante do polipeptideo com SEQ ID NO: 2 compreendendo uma subs- tituição, deleção e/ou inserção de um ou mais aminoácidos, f) variantes alé- licas das sequências de aminoácido a) a e). A invenção ainda se refere ao uso da sequência de DNA para a produção do sistema de expressão de acordo com a invenção.

Foi surpre- —endente descobrir que uma sequência de DNA derivada de B. amyloliquefa- ciens que codifica um polipeptídeo com atividade de glicerina-3-fosfato desi- drogenase é particularmente vantajosa na produção do sistema de expres- são de acordo com a invenção.

Com relação às sequências reivindicadas, o grau da identidade de sequência é, de preferência, analisado determinando o número de resí- duos da sequência mais curta envolvida na comparação e tendo uma contra- parte "correspondente" na outra sequência.

Para fins da presente invenção,

" 20/37 , a identidade é, de preferência, determinada de uma forma conhecida per se usando os algoritmos usuais. De acordo com a invenção, apenas os nucleo- - tídeos que codificam as proteínas maduras ou os aminoácidos das respecti- vas proteinas maduras são usados para uma comparação. De acordo com a invenção, contra-partes de sequência similares, de preferência idênticas, foram detectadas como sequências homólogas por meio de programas de computador conhecidos. Um exemplo de tal programa é o programa Clone Manager Suite, o qual compreende a parte de programa Align Plus e é dis- tribuído pela Scientific & Educational Software, Durham, NC, EUA. Uma comparação de duas ou mais sequências de DNA ou aminoácido, conforme definido acima é, desse modo, realizada sob a opção local alignment de a- cordo com o método FastScan — MaxScore ou de acordo com o método de Neeldeman-Wunsch, mantendo os valores-padrão. Para calcular a identida- de, a versão do programa "Clone Manager 7 Algin Plus 5" com as funções "Compare Two Sequences/Local/Fast Scan-Max Score/Compare sequences as DNA bases" ou, para aminoácidos, "Compare Two Sequences/Local/Fast Scan-Max Score/Compare sequences as Amino Acids" é especialmente u- sada de acordo com a invenção. Algoritmos disponíveis das seguintes fontes foram, desse modo, usados: Hirschberg (1975, Commun. Assoc. Comput. Mach.18,341-343); Myers e Miller (1988, CABIOS 4, 11-17); Chao e outros (1992, CABIOS 8, 481-487).

A invenção ainda se refere à adição e/ou deleção de moléculas dos polipeptídeos acima com atividade de glicerina-3-fosfato desidrogenase. Assim, um polipeptídeo modificado de acordo com a invenção com atividade de glicerina-3-fosfato desidrogenase pode ser obtido através da adição de outras sequências na extremidade N-terminal e/ou C-terminal ou na molécu- la, pelo que os polipeptídeos assim obtidos ainda mostram atividade de gli- cerina-3-fosfato desidrogenase ou devem ser capazes de complementar as cepas glicerina-3-fosfato desidrogenase-deficientes. Moléculas híbridas ten- do outras propriedades vantajosas podem, desse modo, ser produzidas.

De acordo com a invenção, partes de sequência do polipeptídeo com atividade de glicerina-3-fosfato desidrogenase também podem ser dele-

: 21/37 , tadas mantendo a atividade de glicerina-3-fosfato desidrogenase.

A muta- ção, alongamento e redução podem ser realizadas de uma forma conhecida - per se de acordo com métodos conhecidos per se na técnica.

A produção de tais variantes é geralmente conhecida na técnica.

Por exemplo, variantes de sequência de aminoácido dos polipeptídeos po- dem ser produzidas através de mutação no DNA.

Métodos para a mutagê- nese e modificação de sequência de nucleotídeo são bem conhecidos no estado da técnica (conforme, por exemplo, Kunkel, 1985, Proc.

Natl.

Acad.

Sci, USA 82, 488-492, Kunkel e outros, 1987, Methods Enzymol. 154, 367- 382, Patente U.S.

Nº 4873192, Walker e Gaastra (ed.), 1983, Techniques in Molecular Biology, Mac Millan Publishing Company, New York). Referências sobre substituição de aminoácido adequada que não afeta a atividade bioló- gica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff e outros (1978, Atlas of Protein Sequence and Structure.

Natl.

Biomed.

Res. . Found., Washington D.C.). Substituições conservativas, tal como a substitui- ção de um aminoácido por outro tendo propriedades similares são preferi- das.

Essas substituições podem ser divididas em 2 grupos principais com 4 subgrupos juntos e uma substituição em cada subgrupo é referida como substituição conservativa a qual, de preferência, não afeta a atividade ou duplicação da proteína.

Alifático Não-polar Oo AN | polar e carregado a EA [aeréro [OO AEW Os termos "proteína", "peptídeo" e "polipeptídeo" são essencial- mente usados de modo permutável.

Um polipeptídeo ou enzima tendo ativi- dade de glicerina-3-fosfato desidrogenase é referida como uma enzima que catalisa a redução NAD(P)H-acoplada de di-hidroxiacetona fosfato em glice- rina-3-fosfato.

A atividade de glicerina-3-fosfato desidrogenase pode ser de- terminada usando qualquer método de teste conhecido per se no qual um

. 22/37 : desses substratos ou produtos é usado (Morbidoni e outros, 1995; Bergme- yer, 1970, Methoden der enzymatischen Analyse. Verlag Chemie, 426-227). . A invenção ainda se refere à sequências de DNA que codificam um polipeptídeo com atividade de glicerina-3-fosfato desidrogenase compre- endendo mutações, modificações ou variações da sequência de acordo com SEQ ID NO: 1. Além disso, a invenção também se refere à sequências que hibridizam, sob condições relaxadas ou estringentes, com as sequências acima. Condições estringentes são: hibridização a 65 ºC, 18 h em solução de sulfato de dextrano (GenescreenPlus, DuPont), então, lavagem dos filtros durante 30 min cada, primeiro com 6 x SSC, 2 x SSC, 2 x SSC, SDS a 0,1% e, então, com 0,2 x SSC a 65 ºC (métodos de detecção e transferência de membrana, Amersham).

Além disso, a invenção também se refere à sequências de DNA que são relacionadas às sequências acima de acordo com a invenção em virtude da degenerância do código genético, bem como variantes alélicas das mesmas. A degenerância do código genético pode resultar de degene- rância natural ou de um uso de códon especialmente selecionado. Variantes alélicas que ocorrem naturalmente podem ser identificadas usando técnicas bem conhecidas de biologia molecular tal como, por exemplo, a reação em cadeia de polimerase (PCR), técnicas de sequenciamento e técnicas de hi- bridização.

Uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser usado para ser deletado em quaisquer células hospedeiras e é subsequentemente tornada disponível novamente sobre o —plasmídeo que também traz o gene de interesse. Após a deleção/inativação do gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase, as células hospedeiras são caracterizadas pela falta da função essencial da glicerina-3-fosfato desidro- genase.

O tipo de construção de cepas hospedeiras auxotrópicas de a- —cordo com a invenção, conforme descrito aqui, torna possível usar uma cepa de micro-organismo auxotrópica produzida, o gene de glicerina-3-fosfato de- sidrogenase cromossômico da qual foi inativado, para novas transformações

: 23/37 E contínuas com vetores de complementação similarmente construídos os quais, a cada vez, proporcionam a mesma função curando o defeito gênico - mas trazem, cada um, diferentes genes para que outros polipeptídeos de interesse sejam produzidos. Assim, um sistema de produção muito prático e versatimente utilizável é proporcionado.

É a finalidade do sistema manter um elemento genético que é necessário para a produção de um polipeptídeo de interesse sem pressão de seleção por antibiótico estável durante mais ou muitas gerações e mantê- lo em um alto número de cópias na célula. Esse elemento é o plasmídeo que traznão apenas o gene de glicerina-3-fosfato desidrogenase, mas também o gene para o polipeptídeo a ser produzido.

A manutenção dessa pressão de seleção é de vantagem para o armazenamento das cepas de produção recombinantes. A estabilidade ine- rente do sistema, contudo, é suficiente para manter o alto número de cópias no processo de produção e, assim, assegurar alta produtividade.

Em consequência da alta estabilidade inerente, o sistema per- manece estável mesmo sem a aplicação de pressão de seleção, isto é, mesmo se crescido em meio industrial (o qual pode conter traços de gliceri- na) na cultura principal, o rendimento do polipeptídeo-alvo não diminui du- rante o tempo de cultivo, isto é, o vetor de complementação é mantido está- vel na célula.

De interesse particular são sistemas de expressão de acordo com a invenção que são dirigidos a determinados produtos produzidos atra- vés da cultura de micro-organismos, particularmente polipeptídeos ou prote- ínastais como, por exemplo, enzimas hidrolíticas ou oxidoreductases, parti- cularmente de preferência alfa-amilases, beta-amilases, amilases maltogêni- cas, CGTases, xilanases, alfa-galactosidases, beta-galactosidases, fosfo- lipases, fosfatases, fitases, endoglucanases, particularmente endo-beta-1,4- glucanases, endo-beta-1,3(4)-glucanases, endo-1,2-beta-glucanases e en- — do-1,3-alfa-glucanases, celulases, xilosidases, galactanases, particularmente arabinogalactan-endo-1,4-beta-galactosidases e arabinogalactan-endo-1,3- beta-galactosidases, enzimas de degradação de pectina, particularmente e 24/37 . pectinases, esterases de pectina, pectinilases, poligalacturonases, arabana- nases, rhamnogalacturonases, rhamnogalacturonanacetil esterases, rham- ' nogalacturonan-alfa-rhamnosidases, liases de pectato e alfa-galacturoni- dases, mananases, beta-manosidases, acetil esterases de manana, acetil esterases de xilana, outras xilanases, arabinoxilanases, enzimas proteolíti- cas, tais como proteases e peptidases, enzimas lipolíticas, tais como lipases, digalactosil-diglicero|l-esterases e cutinases e outras enzimas, tais como la- cases e transglutaminases.

Portanto, o uso de um sistema de acordo com a invenção em métodos industriais, principalmente para produção de proteína, é de impor- tância particular. Métodos para a produção de uma proteína através de culti- vo de células de uma cepa de micro-organismo são geralmente conhecidos no estado da técnica se o plasmídeo é baseado em uma pressão de sele- ção, porque ela pode ser estabelecida por antibióticos.

A invenção ainda se refere a um método para a produção de um polipeptídeo de interesse usando o sistema de expressão de acordo com a invenção.

Métodos de produção de proteína caracterizados pelo fato de que a proteina de interesse é secretada no meio adjacente são de importân- cia particular. O processamento do produto obtido é aqui significativamente aliviado. Contudo, também é possível uma alternativa de acordo com a in- venção para solubilizar as respectivas células que produzem a proteína sub- sequente à produção real e, assim, obter o produto.

É um aspecto particularmente vantajoso que uma série de micro- organismos relacionados seja obtida realizando sempre o mesmo tipo de inativação e cura mas fornecendo, sobre o vetor de cura, outro gene que codifica outro polipeptídeo de interesse de cada vez. Dessa forma, um sis- tema desenvolvido com sucesso pode ser transferido para inumeráveis ou- tros processos de fabricação.

Figuras As figuras em anexo explicam a invenção em mais detalhes. São mostrados na:

. 25/37 . Figura 1: sequência de DNA do gene gpsA com regiões de flan- queamento de Bacillus amyloliquefaciens; SEQ ID Nº 1 (em itálico: gene gp- - sA, itálico/negrito: RBS putativa, negrito: terminador putativo) Figura 2: sequência de aminoácido codificada pelo gene gpsA de acordocoma Figura 1, SEQIDNº2 Figura 3: alinhamento da sequência de DNA de acordo com a Figura 1 com outras regiões gpsA de Bacillus conhecidas (B. amyloliq.: Ba- cillus amyloliquefaciens RH 1330; B. subtilis: Bacillus subtilis 168; B. lichenif.: Bacillus licheniformis ATCC 14580).

Figura 4: mapa do plasmídeo pTPO1 com o gene gpsA deposita- do.

Figura 5: mapa de plasmídeo do plasmídeo de deleção (ALF: região localizada a montante do gene gpsA sobre o cromossoma de B. am- yYloliquefaciens RH 1330; ARF: região localizada a jusante do gene gpsA so- breo cromossoma de B. amyloliquefaciens RH 1330; ermC: o gene ermC codifica uma adenina-metilase que proporciona resistência contra eritromici- na).

Figura 6: mapa de plasmídeo do pIK91.

Figura 7: mapa de plasmídeo do vetor pTP15 usado para a ex- pressão do polipeptídeo.

O plasmídeo pTP01 da Figura 4 e a cepa RH 1626 foram depo- sitados no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultu- ren GmbH, Mascheroder — Weg 1B, 38124 Braunschweig; http://mvww.dsmz.de) em 22/12/2006 ou em 18/12/2006 sob os números DSM 18890 e DSM 18878. Bacillus amyloliquefaciens RH 1626, o qual foi deposi- tado sob o número DSM 18878, é uma cepa recipiente com uma deleção de gpsA e sem plasmídeo. O depósito DSM 18890 se refere a Bacillus subtilis RH 1632, o qual traz do plasmídeo pTPO01.

Os exemplos abaixo explicam a invenção em mais detalhes.

Exemplos Os trabalhos moleculares-biológicos foram realizados de acordo com métodos-padrão tais como, por exemplo, descrito no manual de Sam-

: 26/37 E brook e Russell (2001, Molecular cloning.

Cold Spring Harbour Laboratory Press). Os kits e enzimas usados foram aplicados de acordo com a especifi- . cação do respectivo fabricante.

Exemplo 1: Isolamento do gene gpsA de Bacillus amyloliquefaciens Para isolar o gene gpsA, DNA cromossômico de Bacillus amylo- liquefaciens (coleção de cepa AB Enzymes GmbH) foi preparado por meio do QIAGEN DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden) e o gene gpsA foi amplifica- do através de PCR.

Iniciadores que se hibridizam a montante e a jusante do gene gpsA foram aqui usados, de modo que o gene foi completamente am- plificado.

Os iniciadores foram derivados das sequências das regiões de flanqueamento do gpsA determinadas através de sequenciamento no Exem- plo 2a). Os seguintes iniciadores foram usados para a amplificação: SEQ ID Nº 3: AL 1198 gctattaageegeegagcttcatta SEQ ID Nº 4: AR 180C taatcccatagcaccaagegeaaaceac O fragmento de DNA contendo 1591 bp foi completamente se- quenciado através do método de acordo com Sanger e outros (1977, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 74, 5463-5467). Os iniciadores de sequenciamento u- sados são listados na Tabela 1. Tabela 1: Iniciadores usados para o sequenciamento completo do gene gp- —sAde Bacillus amyloliquefaciens | a | arts | Tateccatageaccaagegenaaceão. | [Os Pamz | O teogentetatacanateos — | O gene gpsA tendo 1035 bp de comprimento e a glicerina-3- fosfato desidrogenase, assim, consistindo em 345 aminoácidos é represen- tado com as regiões de flanqueamento de DNA na Figura 1. Exemplo 2: Deleção do gene gpsA em Bacillus amyloliquefaciens A eliminação do gene gpsA sobre o cromossoma de B. amyloli- quefaciens foi realizada através de um vetor de deleção.

O procedimento é

. 27/37 ' baseado na descrição de Vehmaanperá e outros (1991). O plasmídeo PE194, o qual foi descrito na mesma publicação, foi selecionado como um - vetor para a deleção de gpsA.

É a vantagem desse vetor que ele não tem origem de replicação temperatura-dependente.

A 28ºC, o pE194 pode se reproduzir na célula, de modo que, nessa temperatura, ele pode primeiro ser selecionado para uma transformação com sucesso.

Subsequentemente, as células que contêm o vetor são incubadas a 46ºC.

Nessa temperatura, o ve- tor não se reproduz mais e uma pressão de seleção é exercida sobre a inte- gração do plasmídeo sobre uma das duas regiões homólogas (a montante e ajusante do pgsA) no cromossoma.

Uma outra recombinação homóloga so- bre a outra região homóloga (segunda), então, leva à deleção do gpsA.

Uma outra recombinação da primeira região homóloga também seria possível.

Aqui, o vetor se recombina do cromossoma novamente, de modo que o gene gpsA cromossômico seria mantido.

A eliminação do gene pgsA do genoma de Bacillus amylolique- faciens RH 1330 compreende as seguintes etapas: Etapa 1: Construção do vetor de deleção Isolamento das reaiões de flanqueamento de apsA de Bacillus amvlioliauefa-

: 28/37 i entre B. amyloliquefaciens e B. subtilis nessas regiões de não codificação, a amplificação das regiões de flanqueamento do gene gpsA através de PCR e provou ser difícil e teve de ser realizada sob condições muito suaves (baixa temperatura de anelamento, alta concentração de modelo). Os seguintes iniciadores foram usados para a amplificação por PCR da região localizada a montante do gene gpsA: SEQ ID Nº 8 ALF.Xba.fw aatgaaagcgtetagatigaaagg SEQ ID Nº 9: ALF.Kpn.bw catgtttgattggtacctttttatttte O produto de PCR (ALF, 1,4 kbp) foi inserido no plasmídeo p- CRO2.1-TOPOG (Invitrogen, Carlsbad, EUA). O plasmídeo resultante foi de- nominado pCC1. Os seguintes iniciadores foram usados para a amplificação por PCR das regiões localizadas a jusante do gene pgsA: SEQ ID Nº 10: ARF.Kpn.fw aagcgaaggtacccectettta SEQIDNº 11: ARF.

Xba.bw cctatttgaatatgacatctctagaaaattte O produto de PCR (ARF, 1,2 kbp) foi inserido no plasmídeo p- CRO2.1-TOPOO.

O produto resultante foi denominado pCC2. Incorporação das regiões de flanqueamento de pgsA de Bacillus amylolique- faciens no vetor pE 194 A região ALF foi isolada do plasmídeo pCC1 cortado com Kpn | e inserida no plasmídeo pCC2 cortado com a mesma enzima de restrição.

As regiões de flanqueamento do gpsA estão presentes "cabeça-para-cauda" no plasmídeo pCC3 resultante.

As regiões de flanqueamento do gpsA foram isoladas do plasmí- deo pCC3 através de restrição com Pst | e Sac | e construídas no vetor PE 194 cortado com as mesmas enzimas de restrição.

O plasmídeo de repli- cação temperatura-dependente pCC10 é um vetor de deleção.

Ele foi con- firmado através de análise de restrição e sequenciamento.

Etapa 2: Transformação de B. amyloliquefaciens com o vetor de deleção e —deleçãodo gene gpsA no cromossoma C. amyloliquefaciens RH 1330 foi transformado pelo vetor de deleção através de protoplastos de acordo com o método descrito por Chang

. 29/37 . e Cohen (1979, Mol. Gen. Genet. 168, 1111-115). Consequentemente, a deleção do gene gpsA foi realizada de é acordo com o método descrito por Vehnmaanperã e outros (1991). O vetor de deleção foi primeiro integrado no cromossoma sob pressão por antibiótico e pressão por temperatura através de recombinação homóloga de uma das regiões de flanqueamento do gene gpsA. Subsequentemente, as células sem pressão de seleção foram crescidas através de eritromicina, o que per- mitiu uma segunda recombinação entre as duas cópias da segunda região homóloga e levou à excisão do vetor de deleção trazendo o gpsA. O gene gpsA cromossomicamente codificado foi completamente removido do geno- ma de Bacillus dessa forma.

Finalmente, as células nas quais os eventos de recombinação desejados ocorreram foram isoladas examinando as células com relação à sua sensibilidade à eritromícina e sua auxotropia para glicerina através de crescimento sobre respectivas lâminas de ágar.

A cepa isolada de B. amyloliquefaciens RH 1330 A (gpsA) foi denominada RH 1626. A ausência do gene gpsA e a conservação das regi- ões de flanqueamento no cromossoma desse cepa, bem como a ausência de genes de resistência a antibiótico e outras sequências do pE194, foram confirmadas através de sequenciamento e Southern blot. Exemplo 3: Construção do sistema de expressão recombinante A construção do sistema de expressão recombinante compreen- deu as seguintes etapas: Etapa 1: Inserção do gene gpsA no derivado pUB110 através de xilanase de B.amyloliquefaciens O gene gpsA foi amplificado através de seu próprio sítio de liga- ção ribossômica (RBS) e seu próprio terminador de transcrição, começando a partir de DNA cromossômico de B. amyloliquefaciens. Os seguintes inicia- dores foram usados para essa finalidade: SEQ ID Nº 12: ABa Ale fw cgaatceggcacgcttatagattta SEQ ID Nº 13: ABa Sph bw cegteccateattgcatgcattatattte Os iniciadores foram construídos de modo que, a montante do

. 30/37

: RBS, um sítio de clivagem Ale | e, a jusante do terminador, um sítio Sph |, fossem inseridos no produto de PCR.

Subsequentemente, o fragmento de . PCR obtido pôde ser clonado, através desses sítios de clivagem inseridos, no vetor de expressão de xilanase plK91 (EPOS8S5617) por trás do promotor descrito por Zyprian e Matzura (1986) para puB110. O vetor plK91, um deri- vado de pUB110 (McKenzie e outros, 1986, Plasmid 15, 93-103; McKenzie e outros, 1987, Plasmid 17, 83-85), compreende o gene para a endo-f-1,4- xalanase (xy/) de Bacillus subtilis, re-classificado como Bacillus amylolique- faciens.

O plasmídeo pTP01 (representado na Figura 4) resultante da clona- gemtem um tamanho de 7267 bp e não apenas traz os genes gpsA e xyl, mas também um gene de resistência à canamicina e um gene de resistência à bleomicina.

A sequência do plasmídeo pTP01 resultante foi confirmada através de análise de restrição e sequenciamento.

Uma cepa de Bacillus subtilis (1h 247, BGSC; genótipo: sacU(H), rpsL) foi transformada através do pTPO1, pelo que células competentes (Bertram e Gassen, 1991, Gentech- nische Methoden.

Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Jena, New York) foram usadas para transformação.

A cepa resultante foi denominada RH 1632. A expressão de glicerina-3-fosfato desidrogenase ativa na cepa de Bacillus trazendo pTPO01 RH 1632 pôde ser verificada (contrário aos rela- tos anteriores na literatura através de um teste de atividade enzimática des- crito por Morbidoni e outros (1995) e Bergmeyer (1970). Nesse teste de ati- vidade, a alteração da concentração de NADH durante a conversão NADH- acoplada de di-hidroxiacetona fosfato em sn-glicerina-3-fosfato catalisada pela glicerina-3-fosfato desidrogenase é fotometricamente monitorada.

A diminuição na extinção a 340 nm é proporcional à diminuição na concentra- ção do substrato.

A cepa de Bacillus RH 1632 foi aqui crescida em um frasco de agitação sobre meio de caldo LB (peptona a 1%, extrato de levedo a 0,5%, NaCl a 1%, água corrente, ajuste do valor de pH para um pH de 7,2 antes da esterilização), as células foram coletadas através de centrifugação e solubilizadas por lisozima.

O lisato de células foi usado para o teste de ati- vidade de glicerina-3-fosfato desidrogenase.

Usando uma glicerina-3-fosfato desidrogenase análoga de músculo de coelho como padrão, pôde ser mos-

. 31/37 ' trado que a cepa de Bacillus trazendo plasmídeo RH 1632 tem uma ativida- de que está em torno de unidades g de massa celular umida maior comparado com B. subtilis 1h 247. Assim, o gene epissomicamente codifi- cado gpsA é também expresso no transformante adicional ao gene gpsA cromossomicamente codificado.

Para revisar a complementação da cepa de B. amyloliquefaciens GpsA' auxotrópica RH 1626 (Exemplo 2) através de pTPO01, a cepa RH 1626 foi transformada com o plasmídeo pTPO01 através de protoplastos (corres- pondendo a Chang e Cohen, 1979). A seleção dos transformantes foi reali- zada através de seleção com antibiótico sobre lâminas de ágar TYE, suple- mentadas com xilano e canamicina (peptona a 1%, extrato de levedo a 0,5%, NaCl a 0,8%, xilano a 1%, 10 g/l de canamicina). A complementação da cepa de B. amyloliquefaciens auxotrópica através de pTP01 foi verificada através do cultivo sobre meio mínimo (sal Spizizen (Anagnostopoulos e Spi- zizen, 1961, J.

Bacteriol. 81/5), 741-746) com glicose a 0,7% e glutamina a 0,4%, água purificada pelo Millipore Water System, valor de pH em um pH de 7,2 antes da esterilização) sem a adição de glicerina ou G3P.

Etapa 2: Deleção dos genes marcadores de antibiótico Os genes de resistência a antibiótico kan e ble foram removidos do plasmídeo pTPO1 (Exemplo 3, etapa 1) através de amplificação do plas- mídeo completo sem genes kan e ble através de PCR.

Iniciadores que inse- riram um sítio de clivagem Sac Il no produto de PCR em cada extremidade do produto de PCR foram usados para essa finalidade: SEQ ID Nº 14: pT ble kan Sac fw gctaaaatctattatticegcggttcagcaategg SEQIDNº15:pT kan ble Sac bw gtccattcactatcegegateccettttoag O produto de PCR foi cortado com Sac Il e o produto de restri- ção foi religado.

Protoplastos da cepa BGSC 61106 de B. subtilis (gol (= gp- SA) metC trpC2. Morbidoni e outros, 1995) foram transformados através do produto de ligação.

A cepa BGSC 61106 atuou como um hospedeiro inter- —mediário.

Uma transformação direta do produto de ligação na cepa transfor- mante de B. amyloliquefaciens GpsA' auxotrópica RH 1626 (Exemplo 2) não foi possível.

A seleção dos transformantes de Bacillus foi realizada sobre

" 32/37 . lâminas de ágar consistindo em sal Spizizen, glicose a 0,7% e glutamina a 0,2%. O plasmídeo de 5864 bp resultante foi confirmado através de mapea- . mento e sequenciamento e foi denominado pTP15 (Fig. 7). Etapa 3: Preparação de um sistema de expressão recombinante O isolamento do plasmídeo pTP15 de B. subtilis BGSC 61106 foi realizado através do QIAGEN Plasmid MiniprepKit.

A cepa de B. amylolique- faciens RH 1626 (AgpsA; Exemplo 2) foi transformada, através de protoplas- tos, através do plasmídeo pTP15. O sistema de vetor/hospedeiro resultante, o qual é sem a presença de genes de resistência a antibiótico e sem antibió- ticos no meio de cultura, foi registrado sob o número RH 1810 na coleção de cepas AB Enyzmes.

A complementação da cepa de B. amyloliquefaciens auxotrópica pelo pTP15 foi verificada através de cultivo sobre meio mínimo (sal Spizizen com glicose a 0,7% e glutamina a 0,4%, água purificada pelo Millipore Water System, valor de pH em um pH de 7,2 antes de esteriliza- ção). RH 1810 cresce sobre meio mínimo em oposição à RH 1626. A ausên- cia do gene gpsA sobre o DNA cromossômico de RH 1810 foi verificada a- través de PCR através do uso de iniciadores, as sequências dos quais são derivadas das regiões de flanqueamento do gene gpsA.

Os seguintes inicia- dores foram usados para a verificação: SEQIDNº16:A 313 gaaggtgtgacgtctacgagatgaa SEQ ID Nº 4: AR 180C taatcccatagcaccaagegeaaaceac Para examinar a expressão do gene xy/ de RH 1810, a atividade de xilanase foi determinada no sobrenadante de cultura.

A cepa de Bacillus no frasco de agitação foi crescida sobre diferentes meios em dois estágios.

Naprimeira etapa, o crescimento foi realizado sob pressão de seleção sobre meio mínimo (sal Spizizen com glicose a 0,7% e glutamina a 0,4%, água purificada pelo Millipore Water System, valor de pH em um pH de 7,2 antes da esterilização). Na segunda etapa, o meio complexo foi inoculado com 5% da primeira cultura.

O meio correspondia à seguinte composição: Glucidex 12a9%, póde sabugo de milho a 2%, (NH4)HPO, a 1,32%, MgSO, * 7 HO a 0,05%, CaCO; a 0,5%, água corrente, ajuste do valor de pH para um pH de 8,0 antes da esterilização.

Os sobrenadantes de cultura obtidos após 48 i 33/37 W horas de incubação foram usados para determinar a atividade de xilanase de acordo com o método abaixo. í Os fragmentos de xilano liberados pela clivagem enzimática de xilano foram fotometricamente determinados a 412 nm. 1 unidade se refere à quantidade de enzimas que libera o equivalente de 1 umol de xilose através de clivagem de xilano dentro de um minuto a 30 ºC sob condições-padrão. As diluições de enzima são preparadas com solução tampão de acetato de sódio a 0,04 M, pH de 4,5. O lote de reação para o valor principal consiste em 0,75 ml de uma solução de xilano de spelt de aveia a 0,5% em tampão de acetato de sódio a 0,04 M, pH de 4,5 e 0,25 ml de solução enzimática diluída correspondentemente. Com relação ao valor de placebo, 4 ml de uma solução de hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico a 0,5% (PAHBAH, company Janssen Chimica), Titriplex Il! a 0,465% (EDTA, companhia Merck) foram adicionados a NaOH a 0,5 M antes da adição da solução enzimática para cessarareação.

Após a incubação de 20 min a 30ºC, a reação enzimática no va- lor principal é cessada através da adição de 4 ml da mesma solução confor- me para o valor de placebo e o desenvolvimento da cor é obtido através de incubação a 75ºC durante 30 min. A avaliação é conduzida através de cali- —braçãocom uma curva de calibração na qual xilose é usada como padrão.

Com relação à determinação dupla das atividades de xilanase dos sobrenadantes de cultura de RH 1810, as atividades de 153,4 XyIHg' e 151,1 XyIH g” foram medidas. Assim, a produção de xilanase isenta de gene de resistência a antibiótico mostrou, no frasco de agitação, uma maior produ- tividade do que a produção com RH 6000 na qual canamicina foi usada co- mo pressão de seleção. Em comparação, a cepa de Bacillus recombinante RH 6000 (RH 1330::plK91) obteve, no frasco de agitação, uma atividade de xilanase de apenas 57,8 XyIH g (EP 0585617 B1). Exemplo 4: Determinação da estabilidade do sistema Para determinar a estabilidade genética do plasmídeo trazendo gpsA-xyl nas células de B. amyloliquefaciens GpsA”, a cepa RH 1810 obtida de acordo com o Exemplo 3 foi examinada em um experimento com frasco de agi-

. 34/37 . tação sem pressão de seleção em meio líquido.

Uma precultura de RH 1810 foi crescida sob pressão de seleção para essa finalidade, isto é, um meio no qual o B. amyloliquefaciens auxotrópico não pode crescer e no qual nem glicerina nem G3P nem edutos de glicerina ou G3P são acessíveis para a cepa de Bacillus foi usado.

O crescimento foi realizado em um frasco de agitação de Erlenmeyer de 150 ml! com 20 ml de meio a cada vez.

O meio da precultura consistia na se- guinte composição: sal Spizizen + Glucidex 12 a 7% — hidrolisato de caseína a 2% (valor de pH em um pH de 7,2). A primeira precultura foi incubada durante 16 h e, a partir da mesma, a segunda precultura foi inoculada com a mesma composição de meio.

Após 8 horas de incubação, a cultura principal foi inocu- lada a partir da mesma.

O crescimento sem pressão de seleção foi realizado em um frasco de agitação de Erlenmeyer de 1 | com 150 ml de meio com com- posição, cada: Glucidex 12 a 9%, pó de sabugo de milho a 2%, (NHs)-HPO, a 1,32%, MgSO, * 7 HO a 0,05%, CaCO; a 0,5%, água corrente, ajuste do pH paraum valor depH=;38,0 antes da esterilização.

Nesse meio, um crescimento da cepa de Bacillus GpsA' sem o plasmídeo de complementação pTP15 (E- xemplo 3: etapa 2) é possível.

Após 8 a 16 horas, a cultura foi, cada uma, supe- rinoculada a 5% em dois frascos de Erlenmeyer com meio fresco, pelo que um frasco foi usado para a superinoculação do frasco seguinte e, no outro dos fras- cos,a atividade de xilanase do sobrenadante de cultura foi determinada após 24 horas de incubação.

Ele foi cultivado durante cinco dias e noites; as culturas principais foram, desse modo, superinoculadas quatro vezes.

Após cada térmi- no de cultura, o número total de células por ml! de meio foi determinado como sendo capaz de controlar a estabilidade do plasmídeo pTP15 em RH 1810. O resultado é mostrado na Tabela 2. Tabela 2: Estabilidade de plasmídeo nos transformantes trazendo pTP15 de células de B. amyloliquefaciens GpsA RH 1626, verificada com base na ati- vidade de xilanase pelo número de geração de cultivo da cultura | culação da cultura ração va de xilanase principal [h] principal [%] Le a A E O 6a E

. 35/37 de cultivo da cultura | culação da cultura ração va de xilanase À principal [h] principal [%] EFE Aa q EA a aa mo | A AS as AA Conforme mostrado no resultado da Tabela 2, a atividade de xilanase sem pressão de seleção permanece estável durante o período de 5- vezes de uma fermentação normal.

Isso se torna evidente pela atividade re- lativa de xilanase para a primeira cultura sem pressão de seleção permane- cendo constante e mesmo ligeiramente aumentando um pouco.

Exemplo 5: Produção de xilanase através de fermentação em um bioreator com o sistema recombinante a) Precultura A cepa RH 1810 foi crescida sobre lâminas de seleção (sal Spi- zizen com glicose a 0,7%, glutamina a 0,4% ágar a 1%, água purificada a- través do Millipore Water System, valor de pH a 7,2 antes de esterilização). A incubação foi realizada a 37ºC durante pelo menos 32 h. 1º precultura: um frasco de Erlenmeyer de 1 | com defletores com 150 ml de meio foi inoculado com RH 1810 da lâmina de ágar.

A solu- ção nutriente tinha a seguinte composição: REA O Aee a A cultura foi incubada durante 16 horas a 37 ºC enquanto se agi- tava (150 rpm).

. 36/37 . 2º precultura: frascos de Erlenmeyer de 1 | com defletores foram enchidos com 150 ml da mesma composição e inoculados com 5% da pri- . meira precultura.

O cultivo foi realizado a 37ºC durante 8 horas. b) Bioreator Cultura principal: 20 | de uma solução nutriente de: O bioreator é inoculado com 5% da 2º precultura.

Condições de cultura: 37 ºC, ventilação de 0,5 vwvm, agitação com 450 rpm, 48 horas.

O caldo de cultura foi clarificado através de centrifugação e usado para a de- terminação de atividade de xilanase.

No sobrenadante de cultura, uma ativi- dadede xilanasede 166 XylH g” foi medida.

Cc) Experimento de assadura Uma massa foi preparada a partir de 100 partes em peso de fa- rinha de aveia, 2 partes em peso de sal, 3 partes em peso de levedo de pa- daria, 58 a 60 partes em peso de água e 40 a 50 ppm (baseado no peso da massa) de ácido ascórbico em uma batedeira de massa (fabricada pela Di- osna) durante 2 a 3 min no nível 1 e durante 3 a 4 min no maior nível, 11. Antes de início do processo de amassamento, as respectivas quantidades de enzimas foram adicionadas à água.

A temperatura da massa era de 25 ºC-28 ºC.

Após um repouso da massa de 10 min, a massa foi dividida em pedaços de massa de 350 g para produzir pão branco Alemão ("freigescho- benes WeiBbrof'). Após mais um repouso da massa de 20 min, os pedaços de 350 g foram moldados, refinados durante 70 min a 32 ºC e umidade rela- tiva de 80% e assados durante 32 min a 230 ºC.

Após eles terem esfriado, o volume dos pães foi medido por —meiode um instrumento TexVol BVM-L370 através de exploração a laser.

O valor médio para todas os quatro pães a partir de um pedaço de massa é

. 37/37 ' considerado na avaliação. Resultado dos experimentos de assadura " O sobrenadante de cultura de uma fermentação de RH 1810, a qual é realizada de acordo com as condições descritas nos Exemplos 5a) e b),foiusado para os experimentos de assadura. Pães que foram assados de acordo com o procedimento explicado com a enzima produzida de acordo com a invenção mostraram as seguintes propriedades: Tabela 3: Série de concentração com a xilanase assadura-ativa de RH 1810 produzida de acordo com a invenção comparado à xilanase produzida pela cepade Bacillus recombinante RH 6000 (EP 0585617 B1) O volume dos pães às quais a xilanase assadura-ativa de RH 6000 foi adicionada é de 100%.

EEE RES

Claims (7)

- 173 ' REIVINDICAÇÕES

1. Sistema de expressão para a produção de um ou mais " polipeptídeo-alvo/polipeptídeos-alvo, caracterizado pelo fato de que compre- ende uma célula hospedeira em cujo genoma a sequência de DNA que codi- fica glicerina-3-fosfato desidrogenase é inativada ou parcial ou completa- mente deletada, em que a deleção provoca a inativação da glicerina-3- fosfato desidrogenase, e a qual é transformada por um elemento extracromossômico que compreende uma sequência de DNA que codifica o(s) polipeptídeo(s)-alvo e glicerina-3-fosfato desidrogenase, pelo que não apenas o genoma da célula hospedeira, mas também o elemento extracromossômico, não trazem um gene de resistência a antibiótico.

2. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que o elemento extracromossômico é um plasmídeo, um fago, fagemídeo ou um transposon.

3. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o elemento extracromossômico compreende uma sequência de DNA que corresponde à sequência de DNA que codifica a glicerina-3-fosfato desidrogenase endógena da célula hospedeira, uma se- quência de DNA que codifica uma glicerina-3-fosfato desidrogenase relacio- —nadaou uma glicerina-3-fosfato desidrogenase estranha.

4. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA que codifica glicerina-3-fosfato desidrogenase está sob o controle de um promo- tor fraco.

5. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 4, ca- racterizado pelo fato de que o promotor fraco é o promotor localizado a mon- tante do gene gpsA do plasmídeo pUB110 na Figura 7.

6. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 4, ca- racterizado pelo fato de que o promotor fraco é o promotor ptsH de B. subti- is

7. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA que r 213 . codifica a glicerina-3-fosfato desidrogenase endógena é essencialmente de- letada precisamente e sem mutação ou desvio da rede de leitura nas regiões f adjacentes.

8. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a7, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é deri- vada de uma célula bacteriana Gram-positiva.

9. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 8, ca- racterizado pelo fato de que a célula hospedeira é derivada de uma célula do gênero Staphylococcus, Corynebacterium ou Bacillus.

10. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 9, ca- racterizado pelo fato de que a célula hospedeira é derivada de B. amyloli- quefaciens, particularmente B. amyloliquefaciens RH 1626 depositado sob o número de depósito DSM 18878.

11. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é deri- vada de uma célula bacteriana Gram-negativa.

12. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o peptídeo-alvo é selecio- nado de enzimas hidrolíticas, enzimas de degradação de pectina, enzimas proteolíticas ou enzimas lipolíticas.

13. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA que codifica glicerina-3-fosfato desidrogenase é selecionada de: a) uma sequência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1, b) uma sequência de DNA que codifica uma sequência de prote- ína de acordo com SEQ ID NO: 2, c) uma sequência de DNA que se hibridiza, sob condições es- tringentes, a uma sequência de acordo com a) ou b) ou d) uma sequência de DNA que é relacionada às sequências de — acordo com a), b) ou c) em virtude da degenerância do código genético ou e) fitas complementares às sequências a) a d).

14. Método para a produção sem antibiótico de um polipeptídeo-

: 3/3 : " alvo, caracterizado pelo fato de que um sistema de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, é crescido sob condições para a , expressão do polipeptídeo-alvo e, assim, o polipeptídeo-alvo expresso é iso- lado.

15. Uso de um sistema de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é para a pro- dução sem antibiótico de um polipeptídeo-alvo.

FIG. 1 l aagggtacta tgggtaaace tgtegtagee attgteggaa gaccgaatgt 51 ggogaaaatce acaatcttta accggattgc Gggtgaaaga atttcaatag 101 tagaagatac ceceggagtg acgegggace ggatatacag ttceggeggaa 151 toggctgaatt atgattttaa ccetgattgat acgggeggaa ttgatatcgo 201 agacgagceg tttcetgacac agatcegeca gcaggetgaa atcgecatag 251 acgaggctga tgtgatcate tttatggtga acggcegega aggtgtgacg 301 tetgeggatg aagaagtogc aaaaatactg tacceggacga aaaaaccogt 351 Ccgtattagce gttaataaat tagataatac Ccgaaatgaga gegaacattt 401 atgactttta tgegetegge tttggagaac Ccgtatcegat ttcggggaca 451 cacggtttag gattgggaga tttgctegat gettgtgcog agcattttaa 501 aaacattceg Gagacgaagt acagtgatga tgtegttcaa ttctgcctaa 551 teggecegece gaatgtegga aaatceatece ttgtcaatgec gatgctegge - 601 gaagageggg ttatcgtgag caacgtagce ggaacgacta gagacgctot 651 ggatacggeg ttcacttaca atcagcagga atttgtaatc gttgacacgg 701 Cgggaatgag aaaaaagagt aaagtatatg aaacaacaga aaaatacagt P 751 gtgctgeggg cgttaaaage cattgacege tcagacgteg teggegttgt 801 gctgaatgca gaagaaggca tcettgagea Ggacaagegg atcegceeggat 851 acgccecatga agcegggaaa gceegtegtea ttategtaaa caaatgggat 901 gcegttgata aggacgageg cacgatgaaa gaatttgaac agaatattcg 2951 ggagcattte caatttcteg attatgegce ggtgctattt atgteggcac 1001 tgacgacaaa g9cggattceat acactceatge ctgcgattat taaagegagt 1051 gaaaaccact cteteegegt gcagacaaat atcttaaato atgtcatcat 1101 ggatgceggte gccatgaate cgactecegac gcacaacgge tecegtetga 1151 asatttatta tgcgactcaa gtegetagatta agcegecegag cttegttott 1201 tttgtcaacg atceggaact gatgcatttt tcttatgaac getttttaga 1251 aaaccgaatec Ccgggacgett teggattrga aggtacgcca attaaaatat 1301 ttgcaagage aagaaaataa aaaggtgtga tacagagatg aaaasaagtog 1351 caatgcttgg agegggaage tggggeactg cactttettt agtgctoget 1401 gataacggac atcaagtcat gatgtoaggga cacegtgceg aattga tega 1451 teaaatcaac gaactgcatg aaaacaaaga ttacctgeeg gIgGtgtggage 1501 tatcaagtte tatcateggg acagcegatt taagegagge tttaaaagga 1551 gcetgacttca tcattgtgage agtaccegaca aaagecatte gggaagtgot 1601 gaaaaaggct ctgcegtaca tecegaaaca ategattttt gtteatgtca 1651 gcaagggaat tgagceggat tegetteteeo gcatttcaga attaatggag 1703 gaggagctgo ctgaggagta cagaaaagac ategtegtge tttcagggcec 1751 gagccacget gaggaagteg gattaagaca Cccegacgact gttacatcat 1801 cttcaaaaas tatcaagoct gcagaagegg ttcaggattt attcatgaac 1851 cagcatttce gegtetatac aaatccegat atgateggta ttgaaatagg = 1901 Jggagegtta aaaaatatca tegetcttgo agcggggatt acagacogat 1951 —tggga tacgg agataatgca aaageggoct taateaceeg aggtcettgce- 2001 gaaategecca gacteggcac aaagataggge ggaaateege teacetttte 2051 Ccggectgace ggegtaggeg atttaatcgt gacgtgtaca agegtteatt f 2101 cccgaaactg gegegecegge aacctgcteg gcazaggata taagrtggaa 2151 gcetgtccetog ataagatggg gatggttgtt gaaggcgtge ggacgacgaa 2201 agctgegtat cagectgtcte aaaaatatca Igtgaaaatg cegatcacag

IEL LE O h 2/17 FIG. 1 ( Continuação )

2251 aagegettea ccaagtatta tttaatggge agaaggtaga aactgcegta 2301 gaatccttaa tggccagagt gaaaacccat gagatggaag acttggtcaa 2351 cacattegaa aaccgggtga agtga caata acatgccgtc agcatattet 2401 gaagtgacga aagtacaaaa cgcagaacte teceggetgaa atecgettaaa 2451 acatttgctg atttaggcag aagaggatgc agacgtacge atctacgcat 2501 actatagcat cgaagtccaa gagagtgtat ctcagacgta caggtgaata 2551 tagtcaactt gactgaagca aagtececet ctttgettoa gtttttttat

Ei 2601 tttttcaata gatggaaaac ctgttgatct tttcaacatt tgtatattaa 2651 aatgaaatat aacgcttaca atgatgggac ggggggeacg aacgtgagtg 2701 tggcattgat gaaaatgtog tttgcgettg gtgctatagg attaatgttt

2 2751 gttogcggteg cetetattta tgtcagcagg tacaaagtga aaaacaaact 2801 gataaaagca geggtttett cactegetta tgcctgcatg greatetegg 2851 gattgatcgt gttaatggtc gttttcageg ggcctateaa tgaataaage 2901 caaaaggggg Ccgcggaatgc ataagttaaa aatggcegtc ataacggcaa 2951 tggeggtgct tetgetgrog ggctgtctgt accctgaagc aaaaaaaact 3001 gaaaataaag tatcttacaa acatcagctt cagcaggtge aagcggcagt 3051 ggatgaattt aaaaaggega acggeggact tetgcegatt Ccagacaaaag 3101 atatgaaaac accgctctat caaaaatatc cgatagattt taageggete 3151 gegecceagat acatecgagga geegecggee teagettata aaageggago 3201 aatgtaccaa tacgtgcttg tegatgtaga aaataagceg acegteaage 3251 tggtegatet ccaaatggeg gaagcaatee gegacatgaa gcetgegtgte 3301 aaaatgtatc aggaaaageca tacatatecct cectatgagg acgetgttte 3351 aaaagggoctg ttcactttaa ataaaaaaaa gecteggeatg aaagactete 3401 cttcagtcaa aagtceggtt tcaggeacgt ctetgceget tttaategge 3451 getgacggag aaatctatgec cgactatege gtegateteg ceegetgeet 3501 gaaggaaaac aaaaagaaaa tcaaaccggg ggcggaaatt caggatattt 3551 tatggaaaga gactcettte gtcceggect ttteagteac atacacegta 3601 aatgaaaaac aggaaccegt ttttttagaa agtcaaacga aacaggaato 3651 aaccttttte cecgegeatac aaatagggag aaaggttttt ttgattttga 3701 tagaaaagac tgcct ks 3/17 Fig. 2

1 MKKVAMLGAG SWGTALSLVL ADNGHQVMMW GHRAELIDOI 41 NELHENKDYL PGVELSSSII GTADLSEALK GADFIIVAVP 81 TKAIREVLKK ALPYIPKQOSI FVHVSKGIEP DSLLRISELM 121 EEELPEEYRK DIVVLSGPSH AEEVGLRHPT TVTSSSKNIK 161 AAEAVQDLFM NOHFRVYTNP DMIGVEIGGA LKNIIALAAG " 201 ITDGLGYGDN AKAALITRGL AETIARLGTKM GGNPLTFSGL . 241 TGVGDLIVTC TSVHSRNWRA GNLLGKGYKL EAVLDKMGMV 281 VEGVRTTKAA YOLSQKYQVK MPITEALHQV LFNGQOKVETA

321 VESLMARVKT HEMEDLVNTF ENRVK

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