BRPI0813724A2 - partículas similares a vírus da gripe (vlps) compreendendo hemaglutinina produzida no interior de uma planta - Google Patents

Abstract

PARTÍCULAS SIMILARES A VÍRUS DA GRIPE (VLPS) COMPREENDENDO HEMAGLUTININA PRODUZIDA NO INTERIOR DE UMA PLANTA A presente invenção refere-se a um método para sintetização de partículas similares a vírus da gripe (VLPs) no interior de uma planta, ou uma porção desta é proporcionado. O método envolve expressão de HA da gripe em plantas, e a purificação por cromatografia de exclusão de tamanho. A invenção é também direcionada a uma VLP compreendendo proteína de HA da gripe e lipídeos de planta. A invenção é também direcionada a um ácido nucleico que codifica HA da gripe, bem como vetores. As VLPS podem ser usadas para formularem vacinas da gripe, ou podem ser usadas para enriquecerem vacinas existentes.

Description

. Relatório Descritivo da Patente de lnvenção para "PARTÍCU- LAS SIMILARES A VÍRUS DA GRIPE (VLPS) COMPREENDENDO HE- MAGLUTININA PRODUZIDA NO JNTERIOR DE UMA PLANTA".

CAMPO DA INVENÇÃO 5 A presente invenção refere-se à produção de partículas similares a vÍrus. Mais especificamente, a presente invenção é direcionada a produ- ção de partículas similares a vÍrus compreendendo antlgenos de gripe.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A gripe é a causa condutora de morte em humanos devido a um 10 vÍrus respiratório. Os sintomas comuns incluem febre, garganta dolorida, falta de ar, e músculo dolorido, entre outros. Durante a estação da gripe, os vÍrus da gripe infectam 10-20% da população ao redor do mundo, conduzin- - do a 250-500.000 mortes anualmente. Os vÍrus da gripe são vÍrus envelopados que se originam da ! 15 membrana de plasma de células de mamífero infectadas. Eles são classifi- cados em tipos A, B, ou C, baseados nas nucleoproteínas e antígenos de proteína matriz presentes. Os vÍrus tipo A da gripe podem ser adicionalmen- te divididos em subtipos de acordo com a combinação de glicoproteínas de superfície de hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) apresentada. HA 20 governa a capacidade do vÍrus se ligar e penetrar a célula hospedeira. A NA remove resíduos de ácido siálico terminal de cadeias glicans na célula hos- pedeira e proteinas de superfície viral, que previne agregação viral e facilita a mobilidade do vÍrus. Atualmente, 16 subtipos de HA (H1-HI6) e 9 subtipos de NA (N1-N9) são reconhecidos. Cada vÍrus da gripe tipo A apresenta um 25 tipo de HA e um tipo de glicoproteína NA. Geralmente, cada subtipo exibe especificidade de espécies; por exemplo, todos os subtipos HA e NA são conhecidos por infectarem pássaros, enquanto alguns subtipos Hl, H2, H3, H5, H7, H9, HlO, Nl, N2, N3 e N7 mostraram infectar humanos (Horimoto 2006; Suzuki 2005). Os vírus da gripe compreendendo H5, H7 e H9 são 30 considerados as formas mais altamente patogênicas de vÍrus de gripe A, e são causam mais provavelmente futuras pandemias. As pandemias de gripe são usualmente causadas por vÍrus da

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L gripe altamente transmissíveis e virulentos, e podem conduzir a níveis ele- vados de doença e morte globalmente. A emergência de novos subtipos A de gripe resulta em 4 pandemias maiores no século 20. A gripe espanhola, causada pelo vÍrus H1N1, em 1918-1919, conduziu a mortes de cerca de 50 5 milhões de pessoas ao redor do mundo entre 1917 e 1920. Atualmente, o risco da emergência de um novo subtipo, ou da transmissão a humanos de um subtipo endêmico em animais, está sempre presente. De interesse parti- cular é uma forma altamente virulenta de gripe aviária (também denominada "gripe de pássaro"), deflagrações da qual foram reportadas em vários países 10 ao redor do mundo. Em muitos casos, esta gripe de pássaro pode resultar em taxas de mortalidade se aproximando de 1OO°/, dentro de 48 horas. A difusão do vÍrus da gripe aviária (H5N1), primeiro identificado em Hong Kong ~ em 1997, para outros países da Ásia e Europa, tinha sido postulada estar ligada aos modelos migratórios de pássaros selvagens. ~ 15 O método atual de combater a gripe em humanos é por vacina- ção anual. A vacina é usualmente uma combinação de várias cepas que são prognosticadas para serem cepas dominantes para a "estação de gripe" en- trante. O prognóstico é coordenado pela Organização Mundial de Saúde. Geralmente, o número de doses de vacina produzidas cada ano não é sufi- 20 ciente para vacinar a população mundial. Por exemplo, o Canadá e os Esta- dos Unidos obtiveram doses de vacina bastante para imunizar cerca de um terço de sua população, enquanto somente 17% da população da União Eu- ropéia puderam ser vacinada. É evidente que a produção mundial atual de vacina de gripe seria insuficiente em caso de uma pandemia de gripe no 25 mundo. Mesmo se a produção anual necessária possa um tanto ser encon- trada em um dado ano, as cepas dominantes mudam de ano para ano, des- se modo o estoque em tempos necessários baixos no ano não é prático. A produção econômica de grande escala de uma vacina de gripe efetiva é de interesse significante para o governo e a indústria privada. 30 Os estoques virais para uso nas vacinas são produzidos nos ovos fertilizados. As partlculas de vÍrus são coletadas, e para uma vacina viral inativada, rompidas por detergente para inativar. Vacinas atenuadas

. vivas são produzidas de vÍrus da gripe que foram adaptados para crescimen- to a baixa temperatura que significa que em temperatura corpórea normal, a vacina é atenuada.

Tal vacina é licenciada nos Estados Unidos da América para uso em individuos de 5 a 49 anos de idade.

Vacinas de vÍrus total inati- 5 vadas são tornadas inofensivas pela inativação com agentes químicos, e elas foram produzidas em ovos embriônicos ou cultura de célula de mamife- ro.

Todos estes tipos de vacina mostram algumas vantagens e desvanta- gens específicas.

Uma vantagem de vacinas derivadas de virus totais é o tipo de imunidade induzido por tais vacinas.

Em geral, vacinas divididas in- lO duzem uma forte resposta de anticorpo, enquanto vacinas produzidas de vÍrus totais induzem ambas uma resposta de anticorpo (humoral) e celular.

Mesmo embora uma resposta de anticorpo funcional seja um critério para

" licenciamento que se correlaciona com proteção induzida por uma vacina, existe evidência aumentada que uma resposta de célula T é também impor- - 15 tante na imunidade da gripe, isto pode também proporcionar melhor prote- ção na idade avançada.

De modo a induzir uma resposta imune celular, vacinas produzi- das de vÍrus totais foram desenvolvidas.

Devido à alta patogenicidade da cepa da gripe (por exemplo, H5N1), estas vacinas são produzidas em facili- 20 dade BL3+. Para cepas de gripe altamente patogênicas, tais como H5N1, alguns fabricantes modificaram a sequência de gene de hemaglutinina de modo a reduzir a patogenicidade da cepa da gripe e torná-la avirulenta e mais facilmente produzida em ovos embriônicos ou cultura de célula de ma- mifero.

Outros também usam cepas de gripe reclassificadas em que as se- 25 quências genéticas para as proteínas de hemaglutinina e neuraminidase são clonadas em uma cepa doadora de gripe patogênica de alta-baixa produção (A/PR/8/34; Quan F-S et al., 2007). Enquanto estes métodos podem produzir vacinas úteis, eles não proporcionam uma solução para a necessidade de produção de vacinas de alto volume, baixo custo e rápida na escala neces- 30 sária para satisfazer a necessidade global em um ano normal, e quase cer- tamente seria insuficiente no caso de pandemia.

Usando-se esta tecnologia genética reversa, pode-se também necessitar mudar a sequência genética da proteína HA para torná-la aviru- lenta.

Para cepas de gripe altamente patogênicas, a produção de vacinas de vÍrus total requer procedimentos de confinamento, ou as vacinas resultantes não se equiparam exatamente a sequência genética do vÍrus circulante.

No 5 caso de vacinas atenuadas vivas, existe ainda um risco que a vacina admi- nistrada pode recombinar com um vÍrus da gripe a partir do hospedeiro, con- duzindo a um novo vÍrus da gripe.

Enquanto este método mantém o epítope antigênico e modifica- ções pós-translacionais, existe um número de problemas para este método, incluindo o risco de contaminação devido ao uso de vÍrus total e rendimentos variáveis dependendo da cepa de vÍrus.

Níveis subótimos de proteção po- dem resultar de heterogeneidade genética no vÍrus devido a sua introdução nos ovos.

Outras desvantagens incluem planejamento para obtenção de o- vos, riscos de contaminação devido a químicos usados na purificação, e tempos longos de produção.

Também, pessoas hipersensíveis a proteínas de ovo não podem ser candidatas qualificadas para recebimento da vacina.

No caso de uma pandemia, a produção de vacina dividida é limi- tada pela necessidade de adaptar a cepa para crescimento em ovos e os rendimentos de produção variáveis alcançados.

Embora esta tecnologia tenha sido usada por anos para a pro- dução de vacinas sazonais, ela pode responder arduamente em uma estru- tura de tempo razoável a uma pandemia e a capacidade de manufaturamen- to ao redor do mundo é limitada.

Para evitar o uso de ovos, os vÍrus da gripe foram também pro- duzidos na cultura de célula de mamífero, por exemplo, em células MDCK ou PERC.6, ou similares.

Outra aproximação é genéticas reversas, em que os vÍrus são produzidos por transformação de célula com genes virais.

Estes métodos, contudo, também requerem o uso de vÍrus total, bem como elabo- ram métodos e ambientes de cultura especlficos.

Vários produtos recombinantes foram desenvolvidos como can- didatas de vacina de gripe recombinante.

Estas aproximações têm se focali- zado na expressão, produção, e purificação de proteínas tipo A HA e NA da gripe, incluindo expressão destas proteínas usando células de inseto infec- tadas de baculovírus (Crawford et al., 1999; Johansson, 1999), vetores vi- rais, e constructo de vacina de DNA (Olsen et al., 1997). Especlficos de uma infecção de vÍrus da gripe são bem conheci- 5 dos.

Brevemente, o ciclo infeccioso é iniciado pela fixação da proteína HA de superfície do vÍrion a um receptor celular contendo ácido siálico (glicoproteí- nas e glicolipídeos). A proteina NA media processamento do receptor de ácido siálico, e a penetração de vÍrus na célula depende da endocitose me- diada por receptor dependente de HA.

No limite acídico de endossomos in- lO ternalizados contendo um vÍrion da gripe, a proteína HA suporta mudanças conformacionais que conduzem a fusão de membranas viral e de célula e vÍrus sem revestimento e liberação de M2-mediado de proteínas Ml de ribo- nucleoproteinas associadas a ribonucleoproteínas (RNPS), que migram no núcleo de célula para sÍntese de RNA viral.

Anticorpos para proteínas HA previnem infecção de vÍrus por neutralização de infectividade de vÍrus, pelo que anticorpos para proteínas NA mediam seu efeito nas etapas anteriores de replicação viral.

Crawford et al. (1999) descrevem expressão de HA de gripe em células de inseto infectadas com baculovírus.

As proteínas expressas são descritas como sendo capazes de prevenir doença de gripe letal causada por subtipos de gripe H5 e H7. johansson et al. (1999) ensinam que proteí- nas HA e NA da gripe que expressam baculovírus induzem respostas imu- nes em animais superiores àqueles induzidos por uma vacina convencional. lmunogenicidade e eficácia de hemaglutinina expressa por baculovírus de vÍrus da gripe de equino foi comparada a um candidato de vacina de DNA homólogo (Olsen et al., 1997). CoIetivamente, estes dados demonstram que um alto grau de proteção contra desafio de vírus da gripe pode ser induzido com proteínas HA ou NA recombinantes, usando-se várias aproximações experimentais e em diferentes modelos de animal.

Desde que pesquisa anterior tem mostrado que as glicoproteí- nas de gripe superficial, HA e NA, são os alvos principais para indução de imunidade protetora contra vÍrus da gripe, e que Ml proporciona um alvo conservado para imunidade celular para gripe, uma nova vacina candidata pode incluir estes antigenos virais como uma partícula macromolecular de proteína, tais como partículas similares a vÍrus (VLPS). Os produtos de vaci- na, VLPs, oferecem a vantagem de serem mais imunogênicos do que antí- 5 genos de subunidade ou recombinante, e são capazes de estimularem am- bas resposta imune humoral e celular (Grgacic e Anderson, 2006). Adicio- nalmente, a partícula com estes antígenos da gripe pode revelar epítopes conformacionais que induzem neutralização de anticorpos a cepas múltiplas de vÍrus da gripe.

A produção de uma cepa de vÍrus da gripe não-infecciosa para proposta de vacina é um modo de evitar infecção inadvertente.

Alternativa- mente, partículas similares a vÍrus (VLPS) como substitutas para o vÍrus cul- tivado foram investigadas.

VLPs imitam a estrutura do capsid viral, mas ca- rece de um genoma, e, desse modo, não pode replicar ou proporcionar um meio para uma infecção secundária.

Vários estudos têm demonstrado que proteínas de vÍrus recom- binante autoagregadas em VLPS em cultura de célula usando plasmídeos de expressão de mamífero ou vetores de baculovírus (Gomez-Puertas et al., 1999; Neumann et al., 2000; Latham e Galarza, 2001). Gomez-Puertas et al. (1999) descrevem que a formação eficiente de VLP de gripe depende dos níveis de expressão de várias proteínas virais.

Neumann et al. (2000) esta- beleceram um sistema baseado em plasmídeo de expressão de mamlfero para geração de partículas similares a vÍrus da gripe infecciosas totalmente de cDNAS clonados.

Latham e Galarza (2001) reportaram a formação de VLPS de gripe em células de inseto infectadas com baculovlrus recombinan- te coexpressando genes HA, NA, Ml, e M2. Estes estudos demonstraram que proteínas de vÍrion da gripe podem se autoagregar sob coexpressão em células eucarióticas.

Gomez-Puertas et al.(2000) ensinam que, em adição a hemaglu- tinina (HA), a proteína matriz (Ml) do vÍrus da gripe é essencial para VLP que se origina de células de inseto.

Contudo, Chen et al. (2007) ensinam que Ml pode não ser requerido para formação de VLP, e observaram que liberação eficiente de Ml e VLPS requerem a presença de HA e atividade de sialidase provida pela NA.

A NA cliva os ácidos siálicos das glicoproteínas na superfície das células que produzem as VLPS, e liberando as VLPS no meio. 5 Quan et al 2007 ensinam que a vacina de VLP produzida em um sistema de expressão de baculovírus (célula de inseto) induz uma imunidade protetora contra algumas cepas de vÍrus da gripe (A/PR8/34 (H1N1)). As VLPS estudadas por Quan foram observadas para se originarem a partir da membrana de plasma, e foram consideradas serem do tamanho e morfologia corretos, similares àquelas obtidas em um sistema de mamífero (células de MDCK). Os vÍrus envelopados podem obter seu envelope de lipideo quando 'se originam' da célula infectada e obtêm a membrana a partir da membrana de plasma, ou daquela de uma organela interna.

As partículas de vÍrus da gripe e VLPS se originam a partir da membrana de plasma da hos- pedeira.

Em sistemas de célula de mamifero ou baculovírus, por exemplo, a gripe se origina a partir da membrana de plasma (Quan et al 2007). Somente uns poucos vÍrus envelopados são conhecidos por infectarem plantas (por exemplo, membros de Topovírus e Rhabdovírus). Dos vÍrus envelopados de planta conhecidos, eles são caracterizados por origem de membranas inter- nas da célula hospedeira, e não a partir da membrana de plasma.

Embora um número pequeno de VLPs recombinantes tenha sido produzido nos hos- pedeiros de planta, nenhuma foi derivada a partir da membrana de plasma, elevando a questão se VLPs derivadas de membrana de plasma, incluindo VLPS da gripe, podem ser produzidas em plantas.

As tecnologias de produção de VLP da gripe atuais assentam na coexpressão de proteínas virais múltiplas, e esta dependência representa um problema destas tecnologias, visto que no caso de uma pandemia e de epidemias anuais, o tempo de resposta é crucial para vacinação.

Um siste- ma de produção de VLP mais simples, assentando na expressão de somen- te uma proteína viral, é desejável para acelerar o desenvolvimento de vaci- na.

De modo a proteger a população mundial da gripe e prevenir futuras pandemias, os fabricantes de vacina necessitariam desenvolverem métodos rápidos e efetivos de produção de doses de vacina. O uso atual de ovos fertilizados para produzir vacinas é insuficiente, e envolve um processo 5 prolongado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É um objetivo da invenção proporcionar partículas similares a vírus da gripe (VLPs) aperfeiçoadas. De acordo com a presente invenção é proporcionado um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotideo que codifica um antígeno de um vírus envelopado operativamente ligado a uma região regu- latória ativa em uma planta. O antígeno pode ser uma hemaglutinina da gri- pe (HA). A presente invenção também proporciona um método de produ- ção de partículas similares a vÍrus da gripe (VLPS) em uma planta compre- endendo: a) introdução de um ácido nucleico que codifica um antígeno de um vÍrus envelopado, por exemplo, uma hemaglutinina da gripe (HA), opera- tivamente ligada a uma região regulatória ativa na planta, ou porção desta, e b) incubação da planta ou uma porção desta sob condições que permitem a expressão do nucleico, produzindo, desse modo, as VLPs. O método pode ainda compreender as etapas de coletar a planta e purificar ou separar as VLPs a partir do tecido da planta. A presente invenção inclui o método acima no qual, na etapa de introdução (etapa a), o ácido nucleico pode ser ou transientemente expresso na planta, ou estavelmente expresso na pIanta. Além disso, as VLPS podem ser purificadas usando-se cromatografia de exclusão de tamanho. A presente invenção também proporciona uma partícula similar a vÍrus (VLP) compreendendo uma proteína HA de vÍrus da gripe e um ou mais do que um lipídeo de planta. Também incluída na presente invenção está uma composição compreendendo uma dose efetiva de uma VLP compreendendo uma protel-

. na HA de vÍrus da gripe, um ou mais do que um lipídeo de planta, e um veí- culo farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção também contempla fragmentos ou porções de proteínas de HA que formam VLPS em uma planta. 5 A VLP pode compreender uma proteína de HA de um ou mais do que um subtipo, incluindo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, HlO, Hll, H12, H13, H14, H15 ou H16, ou fragmento ou porção desta.

Exemplos de subtipos compreendendo tais proteínas de HA incluem A/Nova Caledô- nia/20/99 (H1N1)A/lndonésia/5/2006 (H5N1), A/galinha/Nova York/1995, 10 Ngaivota de arenque/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, Npato silves- tre/MN/33/00, A/pato/Shanghai/1/2000, A/rabijunco do norte/TX/828189/02, A/Turquia/Ontário/6118/68(H8N4), A/shoveler/lrã/G54/03, A/galinha/Alemanha/N/1 949(H1ON7), Npato/lnglaterra/56(H11 N6), A/pato/A|berta/60/76(H12N5),NGaivota/Mary|and/704/77(H13N6), NPato 15 silvestre (mallard)/Gurjev/263/82, A/pato/Austrália/341/83 (H15N8), Ngaivota de cabeça preta/Suécia/5/99(H1 6N3), 8/Lee/40, C/Johannesburg/66, NPorto Rico/8/34 (H1N1), A/8risbane/59/2007 (H1N1), Nllhas Salomão 3/2006 (Hl Nl), A/8risbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006, A/Singapura/1/57 (H2N2), 20 A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1), AA Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)). Em um aspecto da invenção, a proteína de HA pode ser um sub- tipo Hl, H2, H3, H5, H6, H7 ou H9. Em um outro aspecto, a protelna de Hl 25 pode ser a partir de cepa de A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1), NPorto Ri- CO/8/34 (H1N1), A/8risbane/59/2007 (H1N1), ou Nllhas Salomão 3/2006 (H1N1). A proteina H3 pode também ser a partir de cepa de A/8risbane 10/2007 (H3N2) ou A/Wisconsin/67/2005 (H3N2). Em um aspecto adicional da invenção, a proteína H2 pode ser a partir da cepa de NSingapura/1/57 30 (H2N2). A proteína H5 pode ser a partir da cepa de A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1), ou A/lndonésia/5/2005. Em um aspecto da in- venção, a protelna H6 pode ser a partir da cepa de A/Cerceta/Hong

Kong/W312/97 (H6N1). A proteína H7 pode ser a partir da cepa de NEquino/Praga/56 (H7N7). Em um aspecto da invenção, a proteína H9 pode ser a partir da cepa de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). Em um outro aspecto da invenção, a proteína HA pode ser de um vÍrus da gripe que pode ser um 5 vÍrus tipo B, incluindo B/Malásia/2506/2004 ou B/Flórida/4/2006. Exemplos de sequências de aminoácido das proteínas HA de subtipos Hl, H2, H3, H5, H6, H7 ou H9 incluem SEQ ID NOs: 48-59. A proteína HA de vÍrus da gripe pode ser H5 da lndonésia.

A presente invenção também proporciona moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências que codificam uma proteína HA.

As moléculas de ácido nucleico podem compreender adicionalmente uma ou mais regiões regulatórias operativamente ligadas a sequência que codifica uma proteína HA.

As moléculas de ácido nucleico podem compreender uma sequência que codifica um Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, HlO, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16. Em um aspecto da invenção, a proteína HA codificada pela molécula de ácido nucleico pode ser um subtipo H1, H2, H3, H5, H6, H7 ou H9. A proteína Hl codificada pela molécula de ácido nucleico é de cepa de A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1), NPorto Rico/8/34 (H1N1), N8risbane/59/2007 (H1N1), ou A/llhas Salomão 3/2006 (H1N1). Em um as- pecto da invenção, a proteína H3 codificada pela molécula de ácido nucleico pode ser a partir da cepa de N8risbane 10/2007 (H3N2), ou A/Wisconsin/67/2005 (H3N2). Em um aspecto adicional da invenção, a pro- teína H2 codificada pela molécula de ácido nucleico pode ser a partir da ce- pa de A/Singapura/1/57 (H2N2). A protelna H5 codificada pela molécula de ácido nucleico pode também ser da cepa de A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1 ), ou A/lndonésia/5/2005. Em um aspecto da in- venção, a proteína H6 codificada pela molécula de ácido nucleico pode ser a partir da cepa A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1). A proteina H7 codifi- cada pela molécula de ácido nucleico pode também ser a partir da cepa de NEquino/Praga/56 (H7N7). Adicionalmente, a proteína H9 codificada pela molécula de ácido nucleico pode ser a partir da cepa de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). Exemplos de sequências de moléculas de ácido nu-

cleico que codificam tais proteínas HA de subtipos H1, H2, H3, H5, H6, H7 ou H9 incluem SEQ ID NOs: 36-47 e 60-73. A sequência de ácido nucleico pode codificar a proteína HA de vÍrus da gripe H5 lndonésia. 5 Regiões regulatórias que podem ser operativamente ligadas a uma sequência que codifica uma proteína HA incluem aquelas que são ope- rativas em uma célula de pIanta, uma célula de inseto ou uma célula.

Tais regiões regulatórias podem incluir uma região regulatória pIastocianina, uma região regulatória de Ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (Ru8is- 1O CO), clorofill proteína de ligação a/b (CAB), ST-LSI, uma região regulatória polihedrin, ou uma região regulatória gp64. Outras regiões regulatórias in- cluem uma 5' UTR, 3' UTR ou sequências terminadoras.

A região regulatória plastocianina pode ser uma região regulatória de alfafa piastocianina; as 5' UTR, 3'UTR ou sequências terminadoras podem ser sequências de alfafa.

Um método de indução de uma imunidade para uma infecção de ' vÍrus da gripe em um indivíduo, é também proporcionado, o método compre- endendo administrar a partícula similar a vÍrus compreendendo uma proteína HA de vÍrus da gripe, um ou mais do que um lipídeo de planta, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

A partícula similar a vÍrus pode ser administra- da a um ind ivíduo oralmente, intradermalmente, intranasalmente, intramus- cularmente, intraperitonealmente, intravenosamente, ou subcutaneamente.

A presente invenção também pertence a uma partícula similar a vÍrus (VLP) compreendendo uma ou mais do que uma proteína derivada de um vÍrus selecionado a partir do grupo consistindo em Gripe, Measles, Ebo- la, Marburg, e HIV, e um ou mais do que um lipideo derivado de uma célula de produção de hospedeiro de não-sialilatação.

A proteína de HlV pode ser p24, gp120 ou gp41; a proteína de vírus Ebola pode ser VP30 ou VP35; a proteina de vírus de Marburg pode ser Gp/SGP; a proteína do vÍrus Measles pode ser H-proteína ou F-protelna.

Adicionalmente a presente invenção se refere a uma partícula similar a vÍrus (VLP) compreendendo uma proteína HA de vÍrus da gripe e um ou mais do que um lipídeo de hospedeiro.

Por exemplo se o hospedeiro é inseto, então a partícula similar a vÍrus (VLP) pode compreender uma pro- teína HA de vÍrus da gripe e um ou mais do que um lipídeo de inseto, ou se o hospedeiro é uma levedura, então a partlcula similar a vÍrus (VLP) pode compreender uma proteína HA de vÍrus da gripe e um ou mais do que um 5 lipídeo de levedura.

A presente invenção também se refere a composições compre- endendo VLPS de duas ou mais cepas ou subtipos de gripe.

Os dois ou mais subtipos ou cepas podem ser selecionados a partir do grupo compreenden- do: A/New Caledônia/20/99 (Hl N1)A/lndonésia/5/2006 (H5N1), A/galinha/Nova York/l 995, Ngaivota de arenque/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/pato silvestre/MN/33/OO, A/pato/Shanghai/1/2000, Nrabijunco do norteLTX/8281 89/02, A/Turquia/Ontario/6118/68(H8N4), A/shoveler/lrã/G54/03, Ngalinha/Alemanha/N/1949(H10N7), A/pato/lnglaterra/56(H1 N6), A/pato/Alberta/60/76(H 12N5), A/Gaovota/Maryland/704/77(H 13N6), A/Pato silvestre/Gurjev/263/82, A/pato/Austrália/341/83 (Hl 5N8), Npato silvestres da cabeça pre- ta/Suécia/5/99(H16N3), 8/Lee/40, C/Johannesburg/66, NPorto Rico/8/34 (H1N1), A/8risbane/59/2007 (H1N1), A/llhas Salomão 3/2006 (H1N1), A/8risbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006, A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7) ou A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)). Os dois ou mais subtipos ou cepas de VLPS podem estar presentes em cerca de quantidades equivalentes; alternadamente um ou mais subtipos ou cepas podem ser a maioria das cepas ou subtipos representados.

A presente invenção pertence a um método para indução de i- munidade a infecção de virus da gripe em um animal ou organismo alvo compreendendo administrar uma dose efetiva de uma vacina compreenden- do uma ou mais do que uma VLP, a VLP produzida usando um hospedeiro de não-sialiatação, por exemplo, um hospedeiro de planta, um hospedeiro de inseto, ou um hospedeiro de levedura.

A vacina pode ser administrada oralmente, intradermalmente, intranasalmente, intramuscularmente, intrape-

. ritonealmente, intravenosamente, ou subcutaneamente.

O organismo alvo pode ser selecionado a partir do grupo compreendendo humanos, primatas, cavalos, porcos, pássaros (aves), aves de água, pássaros migratórios, co- dorn iz, pato, gansos, aves domésticas, galinha, camelo, canino, cães, felino, 5 gatos, tigre, leopardo, gato da algália, marta, marta de pedra, furões, animais domésticos, camundongos, ratos, foca, baleias, e similares.

A presente invenção proporciona um método para produção de VLPS contendo hemaglutinina (HA) de cepas de gripe diferentes em um hospedeiro adequado capaz de produzir uma VLP, por exemplo, uma planta, 10 inseto, ou levedura.

As VLPS que são produzidas nas plantas contêm lipí- deos de origem de pIanta, VLPS produzidas em células de inseto compreen- dem lipídeos a partir da membrana de plasma de células de inseto (geral- mente referidas como "lipídeos de inseto"), e VLPS produzidas na levedura compreendem lipídeos a partir da membrana de plasma de células de leve- 15 dura (geralmente referidas como "lipldeos de levedura"). A produção das VLPs em plantas apresenta várias vantagens sobre a produção destas partículas em cultura de célula de inseto.

Os lipí- deos de planta podem estimular células imunes específicas e aumentar a resposta imune induzida.

As membranas de planta são produzidas de lipí- 20 deos, fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE), e também contêm glicosfingolipídeos que são únicos para plantas e algumas bactérias e proto- zoários.

Esfingolipídeos são não-usuais em que eles não são PC ou PE simi- lares a ésteres de glicerol, mas preferivelmente consistem em um amino ál- cool de cadeia longa que forma uma ligação de amida a uma cadeia de áci- 25 do graxo contendo mais do que 18 carbonos.

PC e PE, bem como glicosfin- golipídeos, podem se ligar a moléculas de CDl expressas por células imu- nes de mamífero, tais como células dendríticas similares a células apresen- tando antlgeno (APCS) e macrófagos e outras células incluindo linfócitos B e T no timo e fígado (Tsuji m,. 2006). Além disso, em adição ao efeito adjuvan- 30 te potencial da presença de lipídeos de planta, a capacidade de N-glicans de planta de facilitar a captura de antígenos de glicoproteína por células apre- sentando antígeno (Saint-jore-Dupas, 2007), pode ser vantajosa da produ-

ção de VLPS em plantas. Sem desejar estar ligado pela teoria, é antecipado que VLPs produzidas de planta induzirão uma reação imune mais forte do que VLPS produzidas em outros sistemas de fabricação, e que a reação imune por es- 5 tas VLPS produzidas por pIanta serão mais fortes quando comparadas a re- ação imune induzida pelas vacinas de vÍrus totais vivas ou atenuadas. Contrário as vacinas produzidas de vÍrus totais, as VLPS propor- cionam a vantagem, visto que elas são não-infecciosas, contenção biológica restritiva não é, desse modo, uma emissão significante conforme seria ope- lO rando como um vÍrus infeccioso total, e não é requerido para produção. As VLPS produzidas de planta proporcionam uma vantagem adicional novamen- te por permitir que o sistema de expressão seja crescido em uma estufa ou campo, sendo, desse modo, significantemente mais econômico e adequado para escala. Adicionalmente, as plantas não compreendem as enzimas en- volvidas na sintetização e adição de resíduos de ácido siálico a proteínas. As VLPS podem ser produzidas na ausência de neuraminidase (NA), e não exis- te necessidade de coexpressar NA, ou tratar as células de produção ou ex- trato com sialidase (neuraminidase), para assegurar produção de VLP nas plantas. AS VLPS produzidas de acordo com a presente invenção não compreendem proteína Ml que é conhecida por ligar RNA. RNA é um con- taminante da preparação de VLP e é indesejado quando se obtém aprova- ção regulatória para o produto de VLP. Este sumário da invenção não descreve necessariamente todas as características da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Estas e outras características da invenção tornar-se-ão mais a- parentes a partir da seguinte descrição em que referência é feita aos dese- nhos em anexo, nos quais: A Figura 1A mostra uma sequência de um cassete de expressão baseado em alfafa plastocianina usada para a expressão de Hl de acordo com uma concretização da presente invenção (SEQ ID NO:8). O peptídeo de sinal de proteína disulfeto isomerase (PDl) é sublinhado.

Os locais de restri- ção Bglll (AGATCT) e Sacl (GAGCTC) usados para clonagem são mostra- dos em negrito.

A Figura 1B mostra um diagrama esquemático de domínios 5 funcionais de hemaglutinina da gripe.

Após clivagem de HAO, HAI e HA2, fragmentos permanecem ligados juntos por uma ponte de disulfeto.

A Figura 2A mostra uma representação de plasmideo 540 agre- gado para a expressão de HA subtipo Hl.

A Figura 2B mostra uma repre- sentação de plasmídeo 660 agregado para expressão de HA subtipo H5. A Figura 3 mostra uma cromatografia de exclusão de tamanho de extratos de proteína de folhas produzindo hemaglutinina H1 ou H5. A Fi- gura 3A mostra o perfil de eluição de Hl; Blue Dextran 2000 (triângulos) e proteínas (diamantes). A Figura 3B mostra imunodetecção (western blot; anti HI) de frações de eluição de Hl seguindo cromatografia de exclusão de ta- manho (S50OHR contas). A Figura 3C mostra o perfil de eluição de H5; Blue Dextran 2000 (triângulos) e protelnas (diamantes). A Figura 3D mostra imu- nodetecção (western blot; anti H5) de frações de eluição de H5 seguindo cromatografia de exclusão de tamanho (S50OHR contas). A Figura 4 mostra uma fotomicrografia microscópica de elétron de estruturas grandes de hemaglutinina H1 e H5 da fração de eluição 9 de uma coluna de exclusão de tamanho.

A Figura 4A mostra uma ampliação de 50 000 vezes de uma VLP de Hl mostrando a presença de estruturas simila- res múltiplas (a barra representa 200 nm). A Figura 4B mostra uma amplia- ção de 150 000 vezes de uma VLP de H1 (a barra representa 100 nm). A Figura 4C mostra uma ampliação de 50 000 vezes de uma VLP de H5 mostrando a presença de estruturas similares múltiplas (a barra representa 50 nm). A Figura 5A mostra a sequência do fragmento Terminal-N de H1 (SEQ ID NO: 1). A Figura 5B mostra o fragmento Terminal-C de Hl (SEQ ID NO:2). A Figura 5C mostra a sequência completa que codifica HAO de Hl (SEQ ID NO:28). A Figura 6 mostra a sequência que codifica H5 flanqueado por

© um local Hindlll imediatamente a montante do ATG inicial, e um local Sacl imediatamente a jusante do códon de parada (TAA) (SEQ ID NO:3). A Figura 7A mostra a sequência do iniciador Plasto-443c (SEQ ID NO:4). A Figura 7B mostra a sequência de iniciador SpHA(lnd)-Plasto. 5 (SEQ ID NO:5). A Figura 7C mostra a sequência de iniciador Plasto- SpHA(lnd)- (SEQ ID NO:6)- A Figura 7D mostra a sequência de iniciador HA(lnd)-Sac.r (SEQ ID NO:7). A Figura 8A mostra a sequência de aminoácido da sequência de peptídeo HAI (SEQ ID NO:9). A Figura 8B mostra a sequência de amino- lO ácido da sequência de peptídeo HA5 (SEQ ID NO: 10). O peptídeo de sinal nativo é indicado em negrito.

A Figura 9 mostra a sequência de HA de gripe A subtipo H7 (SEQIDNO:11). A Figura IOA mostra a sequência de Gripe A HA, subtipo H2 15 (SEQ ID NO: 12). A Figura 108 mostra a sequência de Gripe A HA subtipo H3 (SEQ ID NO: 13). A Figura lOC mostra a sequência de Gripe A HA subti- po H4 (SEQ ID NO: 14). A Figura IOD mostra a sequência de Gripe A HA subtipo H5 (SEQ ID NO: 15). A Figura IOE mostra a sequência de Gripe A HA subtipo H6 (SEQ ID NO: 16). A Figura IOF mostra a sequência de Gripe 20 A HA subtipo H8 (SEQ ID NO: 17). A Figura IOG mostra a sequência de Gri- pe A HA subtipo H9 (SEQ ID NO: 18). A Figura IOH mostra a sequência de Gripe A HA subtipo HlO (SEQ ID NO: 19). A Figura 10l mostra a sequência de Gripe A HA subtipo H11 (SEQ ID NO:20). A Figura lOj mostra a sequên- cia de Gripe A HA subtipo H12 (SEQ ID NO:21). A Figura IOK mostra a se- 25 quência de Gripe A HA subtipo H13 (SEQ ID NO:22). A Figura IOL mostra a sequência de Gripe A HA subtipo H14 (SEQ ID NO:23). A Figura IOM mos- tra a sequência de Gripe A HA subtipo H15 (SEQ ID NO:24). A Figura ION mostra a sequência de Gripe A HA subtipo H16 (SEQ ID NO:25). A Figura 10O mostra a sequência de Gripe B HA (SEQ ID NO:26). A Figura lOP mos- 30 tra a sequência de Gripe C HA (SEQ ID NO:27). A Figura IOQ mostra a se- quência de iniciador Xmal-pPlas.c (SEQ ID NO: 29). A Figura IOR mostra a sequência de iniciador Sacl-ATG-pPlas.r (SEQ ID NO: 30). A Figura lOS

+ mostra a sequência de iniciador Sacl-PlasTer.c (SEQ ID NO: 31). A Figura IOT mostra a sequência de iniciador EcoRl-PlasTer.r (SEQ ID NO: 32). A Figura 11 mostra uma representação esquemática de várias constructo conforme aqui usadas.

O constructo 660 compreende a sequên- 5 cia de nucleotídeo para codificar a HA subtipo H5 operativamente ligada ao promotor de plastocianina (plasto) e terminador (Pter); o constructo 540 com- preende a sequência de nucleotídeo para codificar a HA subtipo Hl em com- binação com um peptldeo de sinal de alfafa proteína disulfeto isomerase (SP PDl), e é operativamente Iigada a um promotor de plastocianina (Plasto) e 10 terminador (Pter); o constructo 544 agregada para a expressão de HA subti- po Hl, a sequência de nucleotideo que codifica H1 é combinada com um peptídeo de sinal de alfafa proteína disulfeto isomerase (SP PDl) e um zip- per de leucina GCN4pll (no lugar da do domínio de transmembrana e calda citoplásmica de Hl) e operativamente ligada ao promotor de plastocianina 15 (Plasto) e terminador (Pter); e constructo 750 para a expressão de região de codificação de Ml de gripe A/PR/8/34 é combinada ao vÍrus etch de tabaco (TEV) 5'UTR, e operativamente ligada com o promotor duplo 35S e termina- dor Nos.

Figura 12 mostra imunodetecção de H5, usando anticorpos anti- 20 H5 (Vietnã), em extratos de proteína de folhas de N. benthamiana transfor- madas com constructo 660 (raia 3). H5 comercial de gripe A/Vietnã/1203/2004 foi usada como controle positivo de detecção (raia 1), e um extrato de proteína de folhas transformadas com um vetor vazio foi usa- do como controle negativo (raia 2). 25 A Figura 13 mostra caracterização de estruturas de hemaglutini- na por cromatografia de exclusão de tamanho.

O extrato de proteína de bio- massas separado produzindo H5, Hl, Hl solúvel, ou Hl e Ml, foi separado por filtração de gel em S-500 HR.

Hl comercial na forma de invólucros foi também fracionado (invólucro Hl). A Figura 13 A mostra frações de eluição 30 analisadas para teor de proteína relativo (Nível de Proteína Relativo — um perfil de eluição de proteína padrão de um fracionamento de biomassa é mostrado). O pico de eluição de Blue Dextran 2000 (padrão de referência 2

MDa) é indicado.

A Figura 13B mostra frações de eluição analisadas para a presença de hemaglutinina por imunoblotting com anticorpos anti-H5 (Viet- nã) (para H5). A Figura 13C mostra frações de eluição analisadas para anti- corpos antigripe A para Hl.

A Figura 13D mostra frações de eluição analisa- 5 das para anticorpos antigripe A para Hl solúvel.

AFigura 13E mostra frações de eluição analisadas para anticorpos antigripe A para invólucro de H1. A Figura 13F mostra frações de eluição analisadas para anticorpos antigripe A para H1+M1. A Figura 14 mostra concentração de estruturas H5 de gripe por 10 centrifugação de gradiente de sacarose e exame de microscopia de elétron de frações concentradas de hemaglutinina.

A Figura 14A mostra caracteriza- ção de frações de centrifugação de gradiente de densidade de sacarose.

Cada fração foi analisada para a presença de H5 por imunoblotting usando anticorpos anti-H5 (Vietnã) (painel superior), e para seu teor de protelna re- 15 lativo e capacidade de hemaglutinação (gráfico). A Figura 14B mostra exame de microscopia de elétron de transmissão de manchamento negativo de fra- ções reunidas 17, 18 e 19 de centrifugação de gradiente de sacarose.

A bar- ra representa 100 nm.

A Figura 15 mostra purificação de VLPS de gripe H5. A Figura 20 15A mostra a análise de Coomassie Blue manchado SDS-PAGE de teor de proteína nas etapas de clareamento - raia 1, extrato bruto; raia 2, extrato ajustado a pH 6; raia 3, extrato tratado com calor; raia 4, extrato filtrado-DE; as etapas de purificação de afinidade de fetuin: raia 5, carga; raia 6, lava- gem; raia 7, eluição (lOX concentrado). A Figura 15B mostra exame de mi- 25 croscopia de elétron de transmissão de manchamento negativo da amostra de H5 VLP purificada.

A barra representa 100 nm.

A Figura 15 C mostra H5 VLP isolada ampliada para mostrar detalhes da estrutura.

A Figura 15D mos- tra o produto de H5 VLP em um Coomassie-manchado de redução de SDS- PAGE (raia A) e Western blot (raia B) usando anticorpo poIiclonal de coelho 30 elevado contra HA de cepa A/Vietnã/1203/2004 (H5N1). A Figura 16 mostra uma sequência de nucleotídeo para vÍrus de Gripe A (A/Nova Caledônia/20/99(H1N1)) gene hemaglutinina (HA), CDS

A ^

IY

W completo. N° de Acesso no Banco de Gene AY289929 (SEQ ID NO: 33). A Figura 17 mostra uma sequência de nucleotídeo para Medica- go sativa mRNA para proteína disulfeto isomerase. N° de Acesso no Banco de Gene No. Zl 1499 (SEQ ID NO: 34). A Figura 18 mostra uma sequência 5 de nucleotídeo para vÍrus da Gripe A (NPorto R1co/8/34(H1N1)) segmento 7, sequência completa. N° de Acesso no Banco de Gene No. NC 002016.1 (SEQ ID NO: 35). A Figura 19 mostra localização de acúmulo de VLP por observa- ção de microscopia de elétron de transmissão de manchamento positivo de 10 tecido de produção de H5. CW: parede de célula, ch: cloroplasto, pm: mem- brana de plasma, VLP: partícula similar a vÍrus. A barra representa 100 nm. A Figura 20 mostra indução de respostas de soro de anticorpo 14 dias após impulso em camundongos Balb/c vacinados com gripe VLP de grupe H5 produzida por planta ou HÁ recombinante solúvel. A Figura 20(A) 15 respostas de anticorpo de camundongos imunizados através de injeção in- tramuscular. Figura 20(B) respostas de anticorpo de camundongos imuniza- dos através de administração intranasal. As respostas de anticorpo foram medidas contra vÍrus de H5N1 totais inativados (Nlndonésia/5/05). GMT: titulação media geométrica. Os valores são o GMT (|og2) de titulações de 20 ponto final recíprocas de cindo camundongos por grupo. As barras represen- tam desvio méd/o. * p< 0,05 comparado a HA solúvel recombinante. A Figura 21 mostra resposta de anticorpo de inibição de hema- glutinação (HAI) 14 dias após impulso em camundongos Balb/c vacinados com VLP H5 produzida de planta ou HA solúvel recombinante. A Figura 25 21(A) respostas de anticorpo de camundongos imunizados através de inje- ção intramuscular. A Figura 21(B) Respostas de anticorpo de camundongos imunizados através de administração intranasal. As respostas de anticorpo de HAI foram medidas usando-se vÍrus de H5N1 totais inativados (A/lndonésia/5/05). GMT: titulação média geométrica. Os valores são o GMT 30 (|og2) de titulações de ponto final reclprocas de cinco camundongos por gru- po. As barras representam desvio médio. * p< 0,05 e ** p" 0,01 comparado a HA solúvel recombinante.

+ m

< A Figura 22 mostra o efeito de adjuvante na imunogenicidade dos camundongos das VLPs nos camundongos.

A Figura 22(A) efeito de alume em camundongos imunizados através de injeção intramuscular.

Figu- ra 22(B) Efeito de Chitosan em camundongos imunizados através de admi- 5 nistração intranasal.

Respostas de anticorpo de HAI foram medidas usando- se vÍrus H5N1 totais inativados (A/lndonésia/5/05). GMT: titulação média geométrica.

Os valores são o GMT (log2) de titulações de ponto final recí- procas de cinco camundongos por grupo.

As barras representam desvio mé- dio. * p< 0,05 comparado ao HA solúvel recombinante correspondente. 10 A Figura 23 mostra resposta de anticorpo para administração de VLP.

Figura 23(A) isotipo de imunoglobulina anti-lndonésia/5/05 em camun- dongos vacinados com injeção intramuscular, 30 dias após impulso.

Os valo- res são o GMT (log2) de titulações de ponto final recíprocas de cinco camun- dongos por grupo.

ELIS A realizou usando vÍrus inativados totais como o 15 agente de revestimento.

As barras representam desvio médio. * p< 0.05, ** p< 0.001 comparado ao HA solúve! recombinante correspondente.

Figura 23(B) Titulações de anticorpo contra vÍrus inativados totais.

Todos os grupos são estatisticamente diferentes para controle negativo.

A Figura 24 mostra titulação de anticorpo contra vírus inativados 20 totais homólogos (Nlndonésia/5/05), 2 semanas após primeira dose (sema- na 2), 14 dias após impulso (semana 5) ou 30 dias após impulso (semana 7). GMT: titulação media geométrica.

Os valores são a GMT (Iog2) de titulações de ponto final reciprocas de cinco camundongos por grupo. * p< 0,05 com- parado a HA solúvel recombinante. 25 A Figura 25 mostra reatividade cruzada in vitro de anticorpos de soro. (A) titulações de anticorpo contra vÍrus inativados totais. (B) titulações de inibição de hemaglutinação contra vários vÍrus inativados totais.

Os valo- res são a GMT (]og2) de titulações de ponto final recíprocas de cinco camun- dongos por grupo.

As barras representam desvio médio.

Todos os grupos 30 são estatisticamente diferentes para controle negativo. * p< 0.05, ** p< 0.001 comparado a HA solúvel recombinante correspondente.

A Figura 26 mostra eficácia da VLP H5 produzida por planta. (A)

Taxa de sobrevivência de camundongos após desafio com 10 LD50 (4.09 x 10' CCID50) da cepa de gripe A/Turquia/582/06 (H5N1) (B) Peso corpóreo de camundongos imunizados após desafio.

Os valores são o peso corpóreo médio de camundongos sobreviventes. 5 A Figura 27 mostra Origem de VLPS de gripe derivadas de plan- ta. (A) Composição de lipídeo polar de VLPS de gripe purificada.

Os lipídeos continham em um equivalente de 40 µg de proteínas, foram extraldos de VLP conforme descrito, separados por HP-TLC, e comparados ao perfil de migração de lipídeos isolados de membrana de plasma de tabaco altamente purificada (PM). As abreviações de lipídeo são as seguintes: DGDG, Diga- |actosi|diaci|g|jcero|; gluCER, glucosil-ceramida; PA, ácido fosfático; PC, fos- fatidilcolina; PE, fosfatidiletanolam ina; PG, fosfatidilglicerol; Pl, fosfatidilinosi- tol; PS, fosfatidilserina; SG, Steril-glicoside- (B) Composição de lipldeo neu- tra de VLPS de gripe purificadas.

Os lipídeos contidos em um equivalente de 20 µg de proteínas foram extraídos de VLP conforme descrito, separados por HP-TLC e comparados a migração de sitosterol. (C) lmunodetecção da bomba de próton do marcador da membrana de plasma ATPase (PMA) em VLPS purificadas e PM altamente purificado de folhas de tabaco (PMl) e cé- lulas de tabaco B Y2 (PMbY2). Dezoito microgramas de proteína foram car- regados em cada raia.

A Figura 28 mostra a sequência de rotação de locais Dralll para Sacl de clone 774 - sequência de nucleotídeo de A/8risbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 36). A sequência de codificação é flanqueada por uma região regulatória de plastocianina, começando com um local de restrição Dralll na extremidade 5' e por um códon de parada e um local de Sacl na extremidade 3'. Os locais de restrição são sublinhados; ATG está em negrito e sublinhado.

A Figura 29 mostra a sequência de rotação dos locais Dralll para Sacl de clone 775 - sequência de nucleotídeo de Nllhas Salomão 3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 37). A sequência de codificação é flanqueada por uma região regulatória de plastocianina, começando com um Iocal de restrição Dralll na extremidade 5' e por um códon de parada e um local de Sacl na extremidade 3'. Os locais de restrição são sublinhados; ATG está em negrito e sublinhados.

A Figura 30 mostra a sequência de rotação de locais de Dralll para Sacl de clone 776 - sequência de nucleotídeo de A/8risbane 10/2007 5 (H1N1) (SEQ ID NO: 38). A sequência de codificação é flanqueada por uma região regulatória de plastocianina, começando com um local de restrição de Dralll na extremidade 5' e por um códon de parada e um local de Sacl na extremidade 3'. Os locais de restrição são sublinhados; ATG está em negrito e sublinhado.

Figura 31 mostra a sequência de rotação de locais Dralll para Sacl de clone 777 - sequência de nucleotídeo de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) (SEQ ID NO: 39). A sequência de codificação é flanqueada por uma região regulatória de plastocianina, começando com um local de restrição Dralll na extremidade 5' e por um códon de parada e um Iocal de Sacl na extremidade 3'. Os locais de restrição são sublinhados; ATG está em negrito e sublinhado.

A Figura 32 mostra a sequência de rotação de locais de Dralll para Sacl de clone 778 - sequência de nucleotldeo de B/Malásia/2506/2004 (SEQ ID NO: 40). A sequência de codificação é flanqueada por uma região regulatória plastocianina, começando com um local de restrição Dralll na ex- tremidade 5' e por um códon de parada e um local de Sacl na extremidade 3'. Os locais de restrição são sublinhados; ATG está em negrito e sublinha- do.

A Figura 33 mostra a sequência de rotação de locais de Dralll para Sacl de clone 779 - sequência de nucleotldeo de B/Flórida/4/2006 (SEQ ID NO: 41). A sequência de codificação é flanqueada por uma região regulatória plastocianina, começando com um local de restrição Dralll na ex- tremidade 5' e por um códon de parada e um local de Sacl na extremidade 3'. Os locais de restrição são sublinhados; ATG está em negrito e sublinha- do.

A Figura 34 mostra a sequência de rotação de locais de Dralll para Sacl de clone 780 - sequência de nucleotídeo de A/Singapura/1/57

(H2N2) (SEQ ID NO: 42). A sequência de codificação é flanqueada por uma região regulatória plastocianina, começando com um local de restrição na extremidade 5' e por um códon de parada e um local de Sacl na extremidade 3'. Os locais de restrição são sublinhados; ATG está em negrito e sublinha- 5 do.

A Figura 35 mostra a sequência de rotação de locais Dralll para Sacl de clone 781 - sequência de nucleotídeo de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 43). A sequência de codificação é flanqueada por uma região regulatória plastocianina, começando com um local de restrição Dralll na ex- lO tremidade 5' e por um códon de parada e um local de Sacl na extremidade 3'. Os locais de restrição são sublinhados; ATG está em negrito e sublinha- do.

A Figura 36 mostra a sequência de rotação de locais de Dralll para Sacl de clone 782 - sequência de nucieotideo de A/Vietnã/1194/2004 (H5N1) (SEQ ID NO: 44). A sequência de codificação é flanqueada por uma região regulatória, começando com um local de restrição na extremidade 5' e por um códon de parada e um local de Sacl na extremidade 3'. Os locais de restrição são sublinhados; ATG está em negrito e sublinhados.

A Figura 37 mostra a sequência de rotação de locais de Dralll para Sacl de clone 783 - sequência de nucleotídeo de AACerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (SEQ ID NO: 45). A sequência de codificação é fian- queada por uma região regulatória, começando com um local de restrição na extremidade 5' e por um códon de parada e um local de Sacl na extremidade 3'. Os locais de restrição são sublinhados; ATG está em negrito e sublinha- dos.

A Figura 38 mostra a sequência de rotação de locais de Dralll para Sacl de clone 784 - sequência de nucleotídeo de A/Equino/Praga/56 (H7N7) (SEQ ID NO: 46). A sequência de codificação é flanqueada por uma região regulatória, começando com um local de restrição na extremidade 5' e por um códon de parada e um Iocal de Sacl na extremidade 3'. Os locais de restrição são sublinhados; ATG está em negrito e sublinhados.

A Figura 39 mostra a sequência de rotação de locais de Dralll para Sacl de clone 785 - sequência de nucieotídeo de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (SEQ ID NO: 47). A sequência de codificação é flanqueada por uma região regulatória, começando com um local de restrição na extremidade 5' e por um códon de parada e um local de Sacl na extremidade 3'. Os locais de 5 restrição são sublinhados; ATG está em negrito e sublinhados. Figura 40A mostra a sequência de aminoácido(SEQ ID NO: 48) do polipeptídeo transladado de clone 774 (A/8risbane/59/2007 (H1N1)). A estrutura de leitura aberta do clone 774 começa com o ATG indicado na Fi- gura 28. A Figura 40B mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 49) 10 do polipeptídeo transladado de clone 775 (Nllhas Salomão 3/2006 (H1N1)). A estrutura de leitura aberta do clone 775 começa com o ATG indicado na Figura 29. " A Figura 41A mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 50) do polipeptídeo transladado do clone 776 (A/8risbane/10/2007 (H3N2))- 15 A estrutura de leitura aberta 776 começa com o ATG indicado na Figura 30. A Figura 41B mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 51) do poli- peptídeo transladado do clone 777 (A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)). A estrutu- ra de leitura aberta do clone 777 começa com o ATG indicado na Figura 31. A Figura 42A mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 20 52) do poIipeptldeo transladado do clone 778 (B/Malásia/2506/2004). A es- trutura de leitura aberta do clone 778 começa com o ATG indicado na Figura

32. A Figura 42B mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 53) do polipeptideo transladado do clone 779 (B/Flórida/4/2006). A estrutura de lei- tura aberta do clone 779 começa com o ATG indicado na Figura 33. 25 A Figura 43 A mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 54) do polipeptídeo transladado do clone 780 (A/Singapura/1/57 (H2N2)). A estrutura de leitura aberta do clone 780 começa com o ATG indicado na Fi- gura 34. A Figura 43B mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 55) do polipeptídeo transladado do clone 781 (A/Anhui/1/2005 (H5N1)). A estru- 30 tura de leitura aberta do clone 781 começa com o ATG indicado na Figura

35. A Figura 44A mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO:

56) do polipeptídeo transladado do clone 782 (A/Vietnã/1194/2004 (H5N1)). A estrutura de leitura aberta do clone 782 começa com o ATG indicado na Figura 36. A Figura 44B mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 57) do poIipeptideo transladado do clone 783 (NCerceta/Hong-kong/W312/97 5 (H6N1)). A estrutura de leitura aberta do clone 783 começa com o ATG indi- cado na Figura 37. A Figura 45A mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 58) do polipeptídeo transladado do clone 784 (A/Equino/Praga/56 (H7N7)). A estrutura de leitura aberta do clone 784 começa com o ATG indicado na Fi- lO gura 38. A Figura 45B mostra a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 59) do polipeptídeo transladado do clone 785 (A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)). A estrutura de leitura aberta do clone 785 começa com o ATG indicado na Fi- gura 39. A Figura 46 mostra imunodetecção (western blot) de frações de " 15 eluição de VLPs produzidas por planta, seguindo cromatografia de exclusão de tamanho.

Subtipos de hemaglutinina Hl, H2, H5, H6 e H9 são mostrados.

Hemaglutinina é detectada em frações 7-14, correspondendo à eluição de VLPS.

A Figura 47 mostra uma análise de "imunoblot" de expressão de 20 uma série de H1 hemaglutinina de cepas epidérmicas anuais.

Dez e vinte microgramas de extratos de proteina foram carregados nas raias 1 e 2, res- pectivamente.

A Figura 48 mostra uma análise de "imunoblot" de expressão de uma série de H5 hemaglutinina de cepas pandêmicas potenciais.

Dez e vinte 25 microgramas de extratos de proteína foram carregados nas raias 1 e 2, res- pectivamente.

A Figura 49 mostra um "imunoblot" de H5 de cepa A/lndonésia/5/2005 em extratos de proteina de folhas de Nicotiana tabacum, agroinfiltradas com AGL1/660. Duas plantas foram infiltradas e 10 e 20 µg 30 de proteína solúvel de cada planta foram carregados nas raias 1 e 2, respec- tivamente.

A Figura 50 mostra a reatividade cruzada in vitro de anticorpos de soro.

Titulações de inibição de hemaglutinação (Hl) em soro de furão, 14 dias (A) após 1" imunização e (B) após segundo impulso com VLP H5 da gripe produzida por planta.

As respostas de anticorpo de HAI foram medidas usando-se os seguintes vÍrus H5N1 totais inativados: A/peru/Turquia/1/05, 5 A/Vietnã/1194/04, A/Anhui/5/05 e a cepa homóloga A/lndonésia/5/05. Os valores são o GMT (|og2) de titulações de ponto final recíprocas de cinco fu- rões por grupo.

Faixa diagonal - Nlndonésia/6/06 (clade 2.1.3); verificada - A/peru/Turquia/1/05 (clade 2.2); barra branca - A/Vietnã/1194/04 (clade 1); barra negra A/Anhui/5/05. Respondedores são indicados.

As barras repre- lO sentam desvio médio.

A Figura 51 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de H5 de A/lndonésia/5/2005 (Construção # 660), alfafa plastocianina 3' UTR e se- quências terminadoras.

A Figura 52 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de Hl de A/Nava Caledô- nia/20/1999 (Constructo # 540), alfafa plastocianina 3' UTR e sequências terminadoras.

A Figura 53 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de Hl de A/8risbane/59/2007 (constructo #774), alfafa plastocianina 3' UTR e sequên- cias terminadoras.

A Figura 54 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de Hl de Nllhas Salo- mão/3/2006 (Hl Nl) (constructo #775), alfafa plastocianina 3' UTR e sequên- cias terminadoras.

A Figura 55 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5'

UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de H2 de A/Singapura/1/57 (H2N2) (constructo # 780), alfafa plastocianina 3' UTR e sequências termi- nadoras.

A Figura 56 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- 5 te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de H5 de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (constructo* 781), alfafa plastocianina 3' UTR e sequências termina- doras.

A Figura 57 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- lO te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de H5 de A/Vietnã/1194/2004 (H5N1) (constructo # 782), alfafa plastocianina 3' UTR e sequências terminadoras.

A Figura 58 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de H6 de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (constructo # 783), alfafa plastocianina 3' UTR e se- quências terminadoras.

A Figura 59 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de H9 de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (constructo # 785), alfafa plastocianina 3' UTR e se- quências terminadoras.

A Figura 60 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de H3 de A/8risbane/10/2007 (H3N2), alfafa plastocianina 3' UTR e sequências termi- nadoras.

A Figura 61 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de H3 de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), alfafa plastocianina 3' UTR e sequências ter-

minadoras. A Figura 62 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de H7 de 5 A/Equino/Praga/56 (H7N7), alfafa plastocianina 3' UTR e sequências termi- nadoras. A Figura 63 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de HA de B/Malásia/2506/2004, alfafa plastocianina 3' UTR e sequências terminado- ras. A Figura 64 mostra a sequência de ácido nucleico de um casse- te de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de HA de B/Flórida/4/2006, alfafa plastocianina 3' UTR e sequências terminadoras. A Figura 65 mostra uma sequência de aminoácido de consenso (SEQ ID NO: 74) para HA de A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1) (codificada por SEQ ID NO: 33), A/8risbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 48), Nllhas Salomão/3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 49) e SEQ ID NO: 9. Xl (posição 3) é A ou V; X2 (posição 52) é D ou N; X3 (posição 90) é K ou R; X4 (posição 99) é Kou T; X5 (posição 111)é You H; X6 (posição 145)é Vou T; X7(posição 154)é E ou K; X8 (posição 161)é Rou K; X9(posição 181)éVou A; XlO (posição 203) é D ou N; Xll (posição 2O5) é R ou K; X12 (posição 210) é T ou K; X13 (posição 225) é R ou K; X14 (posição 268) é W ou R; X15 (posi- ção 283) é T ou N; X16 (posição 290) é E ou K; X17 (posição 432) é I ou L; Xl8 (posição 489) é N ou D. A Figura 66 mostra sequência de aminoácido de Hl Nova Cale- dônia (AAP34324.1) codificada por SEQ ID NO: 33. A Figura 67 mostra a Sequência de aminoácido de H1 Porto Ri- co (NC _ 0409878.1) codificada por SEQ ID NO: 35

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção refere-se a produção de partículas similares à vÍrus.

Mais especificamente, a presente invenção é direcionada a produ- ção de partículas similares à vÍrus compreendendo antigenos da gripe.

A seguinte descrição é de uma concretização preferida.

A presente invenção proporciona um ácido nucleico compreen- 5 dendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um antígeno de um vÍrus envelopado, por exemplo, a hemaglutinina da gripe (HA), operativamente iigada a uma região regulatória ativa em uma planta.

Além disso, a presente invenção proporciona um método de produção de partículas similares a vírus (VLPS) em uma pIanta.

O método envolve introdução de um ácido nucleico que codifica um antígeno operati- vamente ligado a uma região regulatória ativa na planta, ou porção da plan- ta, e incubação da planta ou uma porção da planta sob condições que permi- tem a expressão do ácido nucleico, produzindo, desse modo, as VLPS.

As VLPS podem ser produzidas de vÍrus da gripe, contudo, VLPS podem também serem produzidas de outro vÍrus derivado da membrana de plasma incluindo, mas não limitado a, Measles, Ebola, Marburg, e HlV.

A invenção inclui VLPs de todos os tipos de vÍrus da gripe que possam infectar humanos, incluindo, por exemplo, mas não limitado a, o subtipo muito prevalecente A (H1N1) (por exemplo, A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1)), o subtipo Nlndonésia/5/05 (H5N1) (SEQ ID NO: 60) e o tipo B me- nos comum (por exemplo, SEQ ID NO:26, Figura 100), e tipo C (SEQ ID NO:27, Figura IOP), e para HAs obtidas de outros subtipos de gripe.

VLPS de outros subtipos de gripe são também incluídos na presente invenção, por exemplo, A/8risbane/59/2007 (Hl Nl; SEQ ID NO:48), Nllhas Saio- mão/3/2006 (H1N1; SEQ ID NO:49), A/Singapura/1/57 (H2N2; SEQ ID NO:54), A/Anhui/1/2005 (H5N1; SEQ ID NO:55), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1; SEQ ID NO:56), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1; SEQ ID NO:57), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2; SEQ ID NO:59), A/8risbane/10/2007 (H3N2; SEQ ID NO:50), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2; SEQ ID NO:51), A/Equino/Praga/56 (H7N7; SEQ ID NO:58), B/Malásia/2506/2004 (SEQ ID NO:52), ou B/Flórida/4/2006 (SEQ ID NO:53). A presente invenção também pertence a vÍrus da gripe que in-

fectam outros mamíferos ou animais hospedeiros, por exemplo, humanos, primatas, cavalos, porcos, pássaros, aves de água, pássaros migratórios, codorniz, pato, gansos, animais domésticos, galinha, camelo, canino, cães, felino, gatos, tigre, leopardo, gato da algália, marta, marta de pedra, furões, 5 animais domesticados, animais de fazenda, camundongos, ratos, foca, ba- leia, e similares.

Exemplos não-limitativos de outros antlgenos que podem ser expressos em vÍrus derivados de membrana de plasma incluem, a proteína de capsídeo de HlV - p24; gpl20, gp41 - protelnas envelopadas, as proteí- 1O nas estruturais VP30 e VP35; Gp/SGP (uma proteína de membrana integral glicosilatada) de Filovírus, por exemplo, Ebola ou Marburg, ou a proteína H, e proteína F de Paramyxovírus, por exemplo, Measles.

A invenção também inclui, mas não está limitada a, VLPs deri- vadas da gripe que obtêm um lipídeo envelope a partir da membrana de plasma da célula em que as proteínas de VLP são expressas.

Por exemplo, se a VLP é expressa em sistema baseado em pIanta, a VLP pode obter um lipldeo envelope a partir da membrana de plasma da célula.

Geralmente, o termo "lipldeo" se refere a moléculas que ocorrem naturalmente solúveis em gordura Qipofllicas). O termo é também usado mais especificamente para se referir a ácidos graxos e seus derivados (inclu- indo tri-, di-, e monoglicerídeos e fosfolipidios), bem como outros metabólitos ou esteróis contendo esterol solúvel em gordura.

Os fosfolipídios são um maior componente de todas as membranas biológicas, junto com glicolipí- deos, esteróis e proteínas.

Exemplos de fosfolipídios incluem fosfatidiletano- lamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, e similares.

Exem- plos de esteróis incluem zoosteróis (por exemplo, colesterol) e fitoesteróis.

Mais de 200 fitoesteróis foram identificados em várias espécies de planta, os mais comuns sendo campesterol, stigmasterol, ergosterol, brassicasterol, delta-7-stigmasterol, delta-7-avenasterol, daunosterol, sitosterol, 24- metilcolesterol, colesterol ou beta-sitosterol.

Como um dos versados na téc- nica compreenderia, a composição de lipídeo da membrana de plasma de uma célula pode variar com a cultura ou condições de crescimento da célula ou organismo do qual a célula é obtida.

As membranas de célula geralmente compreendem bicamadas de lipídeo, bem como proteínas para várias funções.

As concentrações loca- lizadas de lipídeos particulares podem ser encontradas na bicamada de lipi- 5 deo, referida como 'balsas de lipídeo'. Sem desejar estar ligado pela teoria, as balsas de lipídeo podem ter papéis significantes na endo e exocitose, en- trada ou egresso de virus ou outros agentes infecciosos, transdução de sinal inter-célula, interação com outros componentes estruturais da célula ou or- ganismo, tais como matrizes intracelular e extracelular.

Com referência ao vÍrus da gripe, o termo "hemaglutinina" ou "HA", conforme aqui usado, se refere a uma glicoproteína encontrada no exte- rior de partículas virais da gripe.

HA é uma membrana homotrimérica tipo I gli- coproteína, geralmente compreendendo um peptídeo de sinal, um domínio de HAI, e um domlnio de HA2 compreendendo um local de âncora de rotação de membrana no C-terminal e uma pequena calda citoplásmica (Figura IB). As sequências de nucleotldeo que codificam HA são bem co- nhecidas e são disponíveis - vide, por exemplo, o 81oDefence Public Health base (VÍrus da gripe; vide URL: biohealthbase.orçj) ou Nationa! Center for Biotechnology lnformation (vide URL: ncbi.nlm.nih.çjov), ambos dos quais são aqui incorporados por referência.

O termo "homotrímero" ou "homotrimérico" indica que um oligô- mero é formado por três moléculas de proteína de HA.

Sem desejar estar Iigado pela teoria, a proteína HA é sintetizada como proteína precursora mo- nomérica (HAO) de cerca de 75 kDa, que se junta na superfície em uma pro- teína trimérica aiongada.

Antes da trimerização ocorrer, a proteina precurso- ra é clivada em um local de clivagem de ativação conservada (também refe- rido como peptldeo de fusão) em 2 cadeias de polipeptídeo, HAI e HA2 (compreendendo a região de transmembrana), ligada por uma ligação de disulfeto.

O segmento de HAI pode ser 328 aminoácidos de comprimento, e o segmento de HA2 pode ser 221 aminoácidos de comprimento.

Embora esta clivagem possa ser importante para infectividade do vÍrus, ela pode não ser essencial para a trimerização da proteína.

A in-

serção de HA dentro da membrana do retícuio endoplasmático (ER) da célu- la hospedeira, clivagem de peptídeo de sinal e glicosilação de protelna são eventos co-translacionais.

O re-dobramento correto de HA requer glicosila- ção da proteína e formação de 6 ligações de disulfeto de intra-cadeia.

O trí- 5 mero de HA se junta dentro do complexo cis- e trans-Golgi, o domínio de transmembrana desempenhando um papel no processo de trimerização.

As estruturas de cristal de proteínas de HA tratadas com bromelain, que care- cem do domínio de transmembrana, têm mostrado uma estrutura altamente conservada contra cepas da gripe.

Estabeleceu-se que HA suporta maiores mudanças conformacionais durante o processo de infecção, que requer que o precursor HAO seja clivado nas cadeias de 2 polipeptldeos HAI e HA2. A proteína de HA pode ser processada (isto é, compreende domínios de HAI e HA2), ou pode ser não-processada (isto é, compreende o domínio de HAO). A presente invenção pertence ao uso de uma proteína de HA compreendendo o dominio de transmembrana e inclui domínios de HAI e HA2, por exemplo, a protelna de HA pode ser HAO, ou HA processada com- " preendendo HAI e HA2. A proteína de HA pode ser usada na produção ou formação de VLPS usando uma planta, ou sistema de expressão de célula de planta.

A HA da presente invenção pode ser obtida de qualquer subtipo.

Por exemplo, a HA pode ser de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, HlO, H11, H12, H13, H14, H15, ou H16. A HA recombinante da presente invenção pode também compreender uma sequência de aminoácido basea- da na sequência de qualquer hemaglutinina conhecida na técnica- vide, por exemplo, o 81oDefence Public Health base (Gripe Vírus; vide URL: biohealthbase.orq) ou National Center for Biotechnology lnformation (vide URL: ncbi.nlm.nih.qov). Além disso, a HA pode ser baseada na sequência de uma hemaglutinina que é isolada de um ou mais vÍrus da gripe emergente ou recentemente identificado.

A presente invenção também inclui VLPS que compreendem HAS obtidas de um ou mais do que um subtipo de gripe.

Por exemplo, VLPS pode compreender um ou mais do que uma HA do subtipo H1 (codificado por SEQ ID NO:28), H2 (codificado por SEQ ID NO: 12), H3 (codificado por SEQ ID NO: 13), H4 (codificado por SEQ ID NO: 14), H5 (codificado por SEQ ID NO: 15), H6 (codificado por SEQ ID NO: 16), H7 (codificado por SEQ ID NO: 11), H8 (codificado por SEQ ID NO: 17), H9 (codificado por 5 SEQ ID NO: 18), HlO (codificado por SEQ ID NO: 19), Hll (codificado por SEQ ID NO:20), H12 (codificado por SEQ ID NO:21), H13 (codificado por SEQ ID NO:27), H14 (codificado por SEQ ID NO:23), H15 (codificado por SEQ ID NO:24), H16 (codificado por SEQ ID NO:25), ou uma combinação destes.

Uma ou mais que uma HA dos um ou mais do que um subtipo de gripe pode ser coexpresso dentro de uma planta ou célula de inseto para assegurar que a síntese das uma ou mais do que uma HA resulta na forma- ção de VLPs compreendendo uma combinação de HAS obtidas de um ou mais do que um subtipo de gripe.

A seleção da combinação de HAS pode ser determinada pelo uso pretendido da vacina preparada a partir da VLP.

Por exemplo uma vacina para uso na inoculação de pássaros pode compreender qualquer combinação de subtipos de HA, enquanto VLPS úteis para inocula- ção de humanos pode compreender subtipos de um ou mais do que um dos subtipos Hl, H2, H3, H5, H7, H9, HlO, Nl, N2, N3 e N7. Contudo, outras combinações de subtipo de HA podem ser preparadas dependendo do uso do material usado na inoculação.

Portanto, a presente invenção é direcionada a uma VLP com- preendendo um ou mais do que um subtipo de HA.

A presente invenção também proporciona ácidos nucleicos que codificam hemaglutininas que formam VLPS quando expressas em plantas.

As proteínas de HA da gripe exibem uma faixa de similaridades e diferenças com relação a peso molecular, ponto isoelétrico, tamanho, complemento de glican e similares.

As propriedades físico-quÍmicas das vá- rias hemaglutininas podem ser úteis para permitir diferenciação entre as HAS expressas em uma planta, célula de inseto ou sistema de Ievedura, e podem ser de uso particular quando mais do que uma HA é coexpressa em um sis- tema simples.

Exemplos de tais propriedades físico-quimicas são proporcio- nadas na Tabela 1.

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A presente invenção também inclui sequências de nucleotídeo SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO: 11, que codifica HA de H1, H5 ou H7, respectivamente, uma sequência de nucleotídeo que hibridiza sob con- dições de hibridização estringentes para SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:3; SEQ 5 ID NO: 11, ou uma sequência de nucleotídeo que hibridiza sob condições de hibridização estringentes para um complemento de SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:l, no qual a sequência de nucleotídeo codifica uma proteí- na de hemaglutinina que quando expressa forma uma VLP, e que a VLP in- duz a produção de um anticorpo quando administrado a um indivlduo.

Por 10 exemplo, a expressão da sequência de nucleotídeo dentro de uma célula de planta forma uma VLP, e a VLP pode ser usada para produzir um anticorpo que é capaz de se ligar a HA, incluindo HA, HAO, HAI, ou HA2 maturas de " um ou mais tipos de gripe ou subtipos.

A VLP, quando administrada a um indivlduo, induz uma resposta imune. 15 A hibridização sob condições de hibridização estringentes é co- nhecida na técnica (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Bio- logy, Ausubel et al., eds. 1995 e suplementos; Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sam- brook e Russell, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3" edição 2001; 20 cada um do qual sendo aqui incorporado por referência). Um exemplo de uma tais condições de hibridização estringentes pode ser cerca de 16-20 horas de hibridização em 4 X SSC a 65°C, seguido por lavagem em 0,1 X SSC a 65°C por uma hora, ou 2 lavagens em 0,1 X SSC a 65"C cada para 20 ou 30 minutos. 25 Alternativamente, uma condição de hibridização estringente e- xemplar pode ser durante a noite (16-20 horas) em 50% de formamida, 4 X SSC a 42°C, seguido por lavagem em 0,1 X SSC a 65°C por uma hora, ou 2 lavagens em 0,1 X SSC a 65°C cada para 20 ou 30 minutos, ou durante a noite (16-20 horas), ou hibridização em tampão de fosfato aquoso Church 30 (7% de SDS; 0,5M de tampão de NaP04 pH 7,2; 10 mM de EDTA) a 65°C, com 2 lavagens ou a 50°C em 0,1 X de SSC, 0,1% de SDS por20 ou 30 mi- nutos cada, ou 2 Iavagens a 65"C em 2 X de SSC, O,1°/o de SDS por 20 ou

30 minutos cada.

Adicionalmente, a presente invenção inclui sequências de nucle- otídeo que são caracterizadas como tendo cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre estas, 5 identidade de sequência, ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeo que codifica HA de Hl (SEQ ID NO:28), H5 (SEQ ID NO:3) ou H7 (SEQ ID NO: 11), no qual a sequência de nucleotídeo codifica uma prote- Ína de hemaglutinina que quando expressa forma uma VLP, e que a VLP induz a produção de um anticorpo.

Por exemplo, a expressão da sequência de nucleotideo dentro de uma célula de planta forma uma VLP, e a VLP po- de ser usada para produzir um anticorpo que é capaz de se ligar a HA, inclu- indo HA, HAO, HAI, ou HA2 matura.

A VLP, quando administrada a um indi- vÍduo, induz uma resposta imune.

Similarmente, a presente invenção inclui HAS associadas com os seguintes subtipos Hl (codificado por SEQ ID NO:28), "H2 (codificado por SEQ ID NO: 12), H3 (codificado por SEQ ID NO: 13), H4 (codificado por SEQ ID NO: 14), H5 (codificado por SEQ ID NO: 15), H6 (codificado por SEQ ID NO: 16), H7 (codificado por SEQ ID NO:11), H8 (codificado por SEQ ID NO:17), H9 (codificado por SEQ ID NO:18), HlO (codificado por SEQ ID NO: 19), H11 (codificado por SEQ ID NO:20), H12 (codificado por SEQ ID NO:21), H13 (codificado por SEQ ID NO:27), H14 (codificado por SEQ ID NO:23), H15 (codificado por SEQ ID NO:24), H16 (codificado por SEQ ID NO:25); vide Figuras IOA a lOP), e sequências de nucleotideo que são ca- racterizadas como tendo de cerca de 70 a 1OO°/o ou qualquer quantidade entre estas, 80 a 100% ou qualquer quantidade entre estas, 90-100% ou qualquer quantidade entre estas, ou 95-100% ou qualquer quantidade entre estas, identidade de sequência com Hl (SEQ ID NO:28), H2 (SEQ ID NO: 12), H3 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 11), H8 (SEQ ID NO: 17), H9 (SEQ ID NO: 18), HlO (SEQ ID NO: 19), H11 (SEQ ID NO:20), H12 (SEQ ID NO:21), H13 (SEQ ID NO:27), H14 (SEQ ID NO:23), H15 (SEQ ID NO:24), H16 (SEQ ID NO:25), no qual a sequência de nucleotídeo codifica uma proteína de hemaglutinina que quando expressa forma uma VLP, e que a VLP induz a produção de um anticorpo.

Por exemplo, expressão da sequência de nucleo- tídeo dentro de uma célula de planta forma uma VLP, e a VLP pode ser usa- da para produzir um anticorpo que é capaz de se ligar a HA, incluindo HA, 5 HAO, HAI, ou HA2 matura.

A VLP, quando administrada a um indivíduo, induz uma resposta imune.

Uma "resposta imune" geralmente se refere a uma resposta do sistema imune adaptativo.

O sistema imune adaptativo geralmente compre- ende uma resposta humoral, e uma resposta mediada por célula.

A resposta humoral é o aspecto de imunidade que é mediada por anticorpos secreta- dos, produzidos nas células da linhagem de linfócito B (célula B). Anticorpos secretados se ligam a antigenos nas superfícies de micróbios de invasão (tais como vÍrus ou bactéria), que os sinalizam para destruição.

A imunidade humoral é usada geralmente para se referir a produção de anticorpo e os processos que o acompanha, bem como as funções efetuadoras de anticor- pos, incluindo ativação de célula de Th2 e produção de citoquina, geração de célula de memória, promoção de opsonin de fagocitose, eliminação de patogenia, e similares.

Os termos "modular" ou "modulação" ou similares se referem a um aumento ou diminuição em uma resposta particular ou parâ- metro, conforme determinado por qualquer de vários ensaios geralmente conhecidos ou usados, alguns dos quais são exemplificados aqui.

Uma resposta mediada por célula é uma resposta imune que não envolve anticorpos, mas preferivelmente envolve a ativação de macró- fagos, células matadoras naturais (NK), linfócitos T citotóxicos específicos de antígeno, e a liberação de várias citoquinas em resposta a um antígeno.

A imunidade mediada por célula é usada geralmente para se referir a alguma ativação de célula Th, ativação de célula Tc e respostas mediadas por célula T.

A imunidade mediada por célula é de importância particular na resposta de infecções virais.

Por exemplo, a indução de linfócitos T positivos CD8 específicos de antígeno pode ser medida usando-se um ensaio ELISPOT; a estimulação de Iinfócitos T positivos CD4 pode ser medida usando-se um ensaio de proli-

feração.

Titulações de anticorpo de antigripe podem ser quantificadas usan- do-se um ensaio ELISA; isotipos de anticorpos específicos de antígeno e reativos cruzados podem ser também medidos usando-se anticorpos anti- isotipo (por exemplo, anti -lgG, lgA, lgE ou lgM). Os métodos e técnicas para 5 realização de tais ensaios são bem conhecidos na técnica.

Uma inibição de ensaio de hemaglutinação (Hl, ou HAI) pode também ser usada para demonstrar a eficácia de anticorpos induzida por uma vacina, ou composição de vacina pode inibir a aglutinação de células de sangue vermelhas (RBC) por HA recombinante.

As titulações de anticorpo inibitórias de hemaglutinação de amostras de soro podem ser avaliadas por microtitulação de HAI (Aymard et al 1973). Eritrócitos de qualquer de várias espécies podem ser usados - por exemplo, cavalo, peru, galinha, ou simila- res.

Este ensaio dá informação indireta no conjunto do trlmer de HA na su- perfície da VLP, confirmando a apresentação correta de locais antigênicos em HAS.

A reatividade cruzada de titulações de HAI pode também ser usada para demonstrar a eficácia de uma resposta imune a outras cepas de vírus relacionadas ao subtipo de vacina.

Por exemplo, o soro de um indiví- duo imunizado com uma composição de vacina de uma primeira cepa (por exemplo, VLPS of A/lndonésia 5/05) pode ser usado em um ensaio de HAI com uma segunda cepa de vÍrus total, ou partículas de vÍrus (por exemplo, A/Vietnã/1194/2004), e a titulação de HAI determinada.

A presença de citoquina ou níveis podem também ser quantifi- cados.

Por exemplo, uma resposta de célula auxiliadora T (Th1/Th2) será caracterizada pela medição de células de secreção lFN-y e IL-4 usando-se ELISA (por exemplo, kits BD Biosciences OptEIA). Células mononucleares de sangue periféricas (PBMC) ou esplenócitos obtidos de um indivlduo po- dem ser cultivadas, e o sobrenadante analisado.

Os linfócitos T podem tam- bém ser quantificados por contagem de célula ativada por fluorescência (FACS), usando-se etiquetas fluorescentes especificas marcadoras e méto- dos conforme são conhecidos na técnica.

Um ensaio de microneutralização pode também ser conduzido para caracterizar uma resposta imune em um individuo, vide, por exemplo, os métodos de Rowe et al., 1973. As titulações de neutralização de vÍrus podem ser obtidas de vário modos, incluindo: 1) enumeração de placas de lysis (ensaio de placa), seguindo fixação/coloração de cristal violeta de célu- 5 las; 2) observação microscópica de lysis de célula na cultura; 3) detecção de ELISA e espectrofotométrica de proteína de vÍrus de NP (se correlaciona com infecção de vÍrus de células hospedeiras). A identidade de sequência ou similaridade de sequência podem ser determinadas usando-se um programa de comparação de sequência de nucleotideo, tal como provido dentro de DNASIS (por exemplo, usando, mas não limitado a, os seguintes parâmetros: penalidade GAP 5, # de diagonais superiores 5, penalidade de GAP fixada 10, k-tupla 2, folga de flutuação 10, e tamanho de janela 5). Contudo, outros métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, por exemplo, os algoritmos de Smith & Waterman (1981, Adv.

Appl.

Math. 2:482), Needleman & Wunsch (J.

Mol.

Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc.

Nat'l.

Acad.

Sci.

USA 85:2444), e por implementações computadorizadas destes algoritmos (por exemplo, GAP, BESTFIT, FASTA, e BLAST)., ou por alinhamento ma- nual e inspeção visual.

O termo "domínio de hemaglutinina" se refere a um peptídeo compreendendo ou o domínio de HAO, ou os domínios de HAI e HA2. O domínio de hemaglutinina não inclui o peptideo de sinal, domínio de trans- membrana, ou a calda citoplásmica encontrada na proteína que ocorre natu- ralmente.

O termo "partícula similar a vÍrus" (VLP), ou "partículas similares à vÍrus" ou "VLPs" se referem a estruturas que se auto-montam e compre- endem proteínas estruturais, tais como proteína de HA da gripe.

As VLPS são geralmente morfologicamente e antigenicamente similares a virions pro- duzidos em uma infecção, mas carecem de informação genética suficiente para replicar e, desse modo, são não-infecciosas.

Em alguns exemplos, VLPS podem compreender uma espécie de proteína simples, ou mais do que uma espécie de proteína.

Para VLPs compreendendo mais do que uma es- pécie de proteina, a espécie de proteína pode ser a partir da mesma espécie de vÍrus, ou pode compreender uma proteina de uma espécie diferente, gê- nero, subfamília ou família de vÍrus (conforme designado pela nomenclatura 5 ICTV). Em outros exemplos, uma ou mais das espécies de proteína compre- endendo uma VLP podem ser modificadas a partir da sequência que ocorre naturalmente.

As VLPS podem ser produzidas em células hospedeiras ade- quadas incluindo planta e células hospedeiras de inseto.

Seguindo extração a partir da célula hospedeira e após isolamento e purificação adicional sob condições adequadas, as VLPS podem ser purificadas como estruturas in- tactas.

As VLPS produzidas de protelnas derivadas da gripe, de acordo com a presente invenção não compreendem proteína Ml.

A proteína Ml é conhecida por Iigar RNA (Wakefield e Brownlee, 1989) que é um contami- nante da preparação de VLP.

A presença de RNA é indesejável quando se obtém aprovação regulatória para o produto de VLP, portanto, a preparação de VLP que carece de RNA pode ser vantajosa.

As VLPS da presente invenção podem ser produzidas em uma célula hospedeira que é caracterizada por carência da capacidade de sialilar proteinas, por exemplo, carecendo de sialidase, tal como uma célula de planta, uma célula de inseto, fungo, e outros organismos incluindo esponja, celenterado, annelida, artoropoda, mollusca, nematelminto, trochelmintos, platelmintos, chaetognatha, tentaculate, chlamydia, spirochetes, bactéria gram-positiva, cianobactéria, archaebacteria, conforme identificados em gly- coforum (vide, por exemplo, o URL: q|Ycoforum.qr.ip/science/word/evolution/ES-A03E.htm|). As VLPS produzidas conforme descrito aqui não compreendem tipicamente neuraminidase (NA). Contudo, NA pode ser coexpressa com HA deve VLPs compreendendo HA e NA serem desejados.

Uma VLP produzida em uma planta de acordo com alguns as- pectos da invenção pode ser complexada com Iipídeos derivados de planta.

A VLP pode compreender um peptldeo de HAO, HAI ou HA2. Os lipídeos derivados de planta podem ser na forma de uma bicamada de lipídeo, e po- de adicionalmente compreender um envelope circundando a VLP.

Os lipí- deos derivados de pIanta podem compreender componentes de lipídeo da membrana de plasma da planta onde a VLP é produzida, incluindo, mas não 5 limitado a, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), glicosfingolipk deos, fitosteróis ou uma combinação destes.

Um lipídeo derivado de pIanta pode alternadamente ser referido como um 'lipídeo de planta'. Exemplos de fitosteróis são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, estigmasterol, sitosterol, 24-meti|co]estero| e colesterol - vide, por exemplo, Mongrand et al., 2004. As VLPs podem ser avaliadas para estrutura e tamanho por, por exemplo, ensaio de hemaglutinação, microscopia de elétron, ou por croma- tografia de exclusão de tamanho.

Para cromatografia de exclusão de tamanho, proteínas solúveis totais podem ser extraidas de tecido de planta por amostra de homogenei- zação (Polytron) de material de planta triturado congelado em tampão de extração, e material insolúvel removido por centrifugação.

A precipitação com PEG pode também ser de beneficio.

A proteína solúvel é quantificada, e o extrato passado através de uma coluna Sephacryí®. Blue Dextran 2000 pode ser usado como um padrão de calibração.

Seguindo cromatografia, frações podem ser adicionalmente analisadas por "imunoblot" para determi- nar o complemento da proteína da fração.

Sem desejar estar ligado pela teoria, a capacidade de HA se li- gar a RBC de animais diferentes é acionada pela afinidade de HA para áci- dos siálicos ot2,3 ou a2,3 e a presença destes ácidos siálicos na superfície de RBC.

HA equino e de aves de eritrócitos aglutinados de vÍrus da gripe de todas as vários espécies, incluindo perus, galinhas, patos, porquinhos da Índia, humanos, ovelha, cavalos e vacas; pelo que HAs de humano se Iiga- rão a eritrócitos de perus, galinhas, patos, porquinhos da Índia, humanos e ovelha (vide também lto T. et al., 1997, Virology, vol 227, p493-499; e Medei- ros R et al., 2001, Virology, vol 289 p.74-85). Exemplos da reatividade da espécie de HAs de cepas de gripe diferentes são mostrados nas Tabelas 2A e 2B.

Tabela 2A: Espécies de RBC liçjado por HAS de cepas de çjripe sazonais selecionadas.

Sazonall Cepa No Origem Cavalo Peru Hl A/8risbane/59/2007 (Hl Nl) 774 Humano + ++ A/llhas Salomão/3/2006 775 Humano + ++ (H1N1) H3 A/8risbane/1 0/2007 (H3N2) 776 Humano + ++ I A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) L 777 I Humano j + I ++ B B/Malásia/2506/2004 778 Humano + ++ B/FIórida/4/2006 779 Humano + ++ Tabela 2B: Espécies de RBC liqado por HAS de cepas de çjripe pandêmicas 5 selecionadas . Pandemia Cepa No Origem Cavalo Peru H2 A/Singapura/1/57 (H2N2) 780 Humano + ++ H5 A/Anhui/1/2005 (H5N1) 781 Hu-Av ++ + A/Vietnã/1194/2004 (H5N1) 782 Hu-Av ++ + H6 i A/Cerceta/Hong I 783 I Ave l ++ I + , Kong/W312/97 (H6N1) H7 i A/Equino/Praga/56 (H7N7) i 784 i Equino ! ++ I ++ H9 I A/Hong Kong/1073/99 I 785 I Humano I ++ i + (H9N2) Conforme aqui usado, uma "proteína" se refere geralmente a uma haste de aminoácidos ligada por uma ligação de peptídeo, que pode ser ligada em estrutura secundária, terciária ou quaternária para alcançar uma morfologia particular. Alternadamente, os termos polipeptídeo, peptldeo ou 10 fragmentos de peptldeo podem ser usados em um contexto similar.

Um fragmento ou porção de uma proteína, proteína de fusão ou polipeptídeo incluem um peptídeo ou polipeptídeo compreendendo um sub- conjunto do complemento de aminoácido de uma proteina ou polipeptídeo particular, provido que o fragmento pode formar uma VLP quando expresso.

15 O fragmento pode, por exemplo, compreender uma região antigênica, uma região de indução de resposta de estresse, ou uma região compreendendo um domínio funcional da proteína ou polipeptídeo.

O fragmento pode tam- bém compreender uma região ou domínio para proteínas da mesma família geral, ou o fragmento pode incluir sequência de aminoácido suficiente para identificar especificamente a proteína de comprimento total da qual ela é de- 5 rivada.

Por exemplo, um fragmento ou porção pode compreender de cerca de 6Õ°/o a cerca de 1OO°/o do comprimento do comprimento total da proteína, ou qualquer quantidade entre estas, provido que o fragmento pode formar uma VLP quando expressa.

Por exemplo, de cerca de 60% a cerca 10 de 1OO°/o, de cerca de 7Q°/o a cerca de 1OO°/o, de cerca de 80% a cerca de 100%, de cerca de 9Õ°/o a cerca de 1OO°/o, de cerca de 95% a cerca de 1O0°/o do comprimento do comprimento total da proteína, ou qualquer quantidade

- entre estas.

Alternadamente, um fragmento ou porção pode ser de cerca de 150 a cerca de 500 aminoácidos, ou qualquer quantidade entre estas, de- " 15 pendendo da HA, e provido que o fragmento pode formar uma VLP quando expressa.

Por exemplo, um fragmento pode ser de 150 a cerca de 500 ami- noácidos, ou qualquer quantidade ente estas, de cerca de 200 a cerca de 500 aminoácidos, ou qualquer quantidade entre estas, de cerca de 250 a cerca de 500 aminoácidos, ou qualquer quantidade entre estas, de cerca de 20 300 a cerca de 500 ou qualquer quantidade entre estas, de cerca de 350 a cerca de 500 aminoácidos, ou qualquer quantidade entre estas, de cerca de 400 a cerca de 500 ou qualquer quantidade entre estas, de cerca de 450 a cerca de 500 ou qualquer quantidade entre estas, dependendo da HA, e provido que o fragmento pode formar uma VLP quando expresso.

Por exem- 25 plo, cerca de 5, 10, 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos, ou qualquer quantidade entre estas, podem ser removidos do terminal C, o terminal N ambos os ter- minais N e C de uma proteína de HA, provido que o fragmento pode formar uma VLP quando expresso.

A numeração de aminoácidos em qualquer dada sequência é 30 relativa a sequência particular, contudo um técnico pode determinar pronta- mente a 'equivalência' de um aminoácido particular em uma sequência ba- seada na estrutura e/ou sequência.

Por exemplo, se 6 aminoácidos Termi-

nais-N foram removidos quando da construção de um clone para cristalogra- fia, isto mudaria a identidade numérica específica do aminoácido (por exem- plo, relativo ao comprimento total da proteína), mas não alteraria a posição relativa do aminoácido na estrutura. 5 As comparações de uma sequência ou sequências podem ser feitas usando-se um algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990. J.

Mol Biol 215:403-410). Uma pesquisa BLAST permite comparação de uma sequência de questão com uma sequência específica ou grupo de sequências, ou com uma biblioteca maior ou base de dados (por exemplo, GenBank ou GenPept) 10 de sequências, e não identifica somente sequências que exibem 100% de identidade, mas também aquelas com graus menores de identidade.

Se- quências de ácido nucleico ou aminoácido podem ser comparadas usando-

- se um algoritmo BLAST.

Além disso, a identidade entre duas ou mais se- quências pode ser determinada pelo alinhamento das sequências juntas e 15 determinando a °/) de identidade entre as sequências.

O alinhamento pode ser efetuado usando-se o Algoritmo BLAST, (por exemplo, conforme dispo- nível através de Gen8ank; URL: ncbi.nlm.nih.qov/cqi-bin/BLAST/ usando-se parâmetros de falta: Programa: blastn; Database: nr; Expect 10; filtro: falta; Alinhamento: par; Códigos genéticos de Questão: Padrão(1)), ou BLAST2 20 através de EMBL URL: embl-heidelberg.de/Services/ index.html usando pa- râmetros de falta: Matrix BLOSUM62; Filtro: falta, echofiltro: Expect: 10, cor- te: faita; Trançado: ambos; Descrições: 50, Alinhamentos: 50; ou FASTA, usando parâmetros de falta), ou por comparação manualmente das sequên- cias e calculando a °/0 de identidade. 25 A presente invenção descreve, mas não é limitada a, a clona- gem de um ácido nucleico que codifica HA em um vetor de expressão de planta, e a produção de VLPS de gripe a partir da planta, adequadas para produção de vacina.

Exemplos de tais ácido nucleicos incluem, por exemplo, mas não estão limitados a, um vÍrus da gripe A/Nova Caledônia/20/99 30 (H1N1) HA (por exemplo, SEQ ID NO: 61), um subtipo de HA de A/lndonésia/5/05 (H5N1) (por exemplo SEQ ID NO: 60), A/8risbane/59/2007 (H1N1) (por exemplo SEQ ID NO: 36, 48,62), A/llhas Salomão/3/2006

(H1N1) (por exemplo SEQ ID NO: 37, 49, 63), NSingapura/1/57 (H2N2) (por exemplo SEQ ID NO: 42, 54, 64), A/Anhui/1/2005 (H5N1) (por exemplo SEQ ID NO: 43, 55, 65), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1) (por exemplo SEQ ID NO: 44, 56, 66), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (por exemplo SEQ ID 5 NO: 45, 57, 67), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (por exemplo SEQ ID NO: 47, 59, 68), A/8risbane/10/2007 (H3N2) (por exemplo SEQ ID NO: 38, 50, 69), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) (por exemplo SEQ ID NO: 39, 51, 70), A/Equino/Praga/56 (H7N7) (por exemplo SEQ ID NO: 46, 58, 71), B/Malásia/2506/2004 (por exemplo SEQ ID NO: 40, 52, 72), 8/Fk5rida/4/2006 10 (por exemplo SEQ ID NO: 41, 53, 73). O clone correspondente ou números de constructo para estas cepas é provido na Tabela 1. Sequências de ácido nucleico que correspondem a SEQ ID NOS: 36-47 compreendem um plasto- " cianina a montante e operativamente ligada à sequência de codificação da HA para cada dos tipos ou subtipos, conforme ilustrado nas Figuras 28-39. - 15 As sequências de ácido nucleico que correspondem a SEQ ID NO: 60-73 compreendem um cassete de expressão de HA compreendendo promotor de alfafa plastocianina e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de uma HA, alfafa plastocianina 3' UTR e sequências terminadoras, confor- me ilustrado nas Figuras 51-64. 20 As VLPS podem também serem usadas para produzir reagentes compreendidos de proteínas estruturais de gripe recombinantes que se auto- montam nas estruturas de proteína macromolecular funcional e imunogênica homotípica, incluindo partículas de gripe subviral e VLP de gripe, em células hospedeiros transformadas, por exemplo, células de planta ou células de 25 inseto.

Portanto, a invenção proporciona VLPS, e um método para pro- dução de VLPS virais em um sistema de expressão de planta, a partir da ex- pressão de uma proteína envelope simples.

As VLPs podem ser VLPs da gripe, ou VLPS produzidas de outros vÍrus derivados de membrana de plas- 30 ma incluindo, mas não limitado a, Measles, Ebola, Marburg, e HlV.

Proteínas de outros vÍrus envelopados, por exemplo, mas não limitadas a, Filoviridae (por exemplo, vÍrus Ebola, vÍrus Marburg, ou simila-

res), Paramixoviridae (por exemplo, vÍrus Measles, vÍrus Mumps, vÍrus sinci- tial Respiratório, pneumovírus, ou similares), Retroviridae (por exemplo, VÍ- rus-l da lmunodeficiência Humana, VÍrus-2 da lmunodeficiência Humana, VÍrus-l da Leucemia de Célula T, ou similares), Flaviviridae (por exemplo, 5 Encefalite de West Nile, vírus da Dengue, vÍrus da Hepatite C, vÍrus da febre amarela, ou similares), Bunyaviridae (por exemplo, Hantavlrus ou similares), Coronaviridae (por exemplo, coronavírus, SARS, ou similares), conforme seriam conhecidos àqueles técnicos no assunto, podem também serem usa- dos.

Exemplos não-limitativos de antígenos que podem ser expressos em vÍrus derivados de membrana de plasma incluem a proteína de capsídeo de HlV - p24; HlV glicoproteínas gp120 ou gp41, proteínas Filovírus incluindo VP30 ou VP35 de Ebolavírus ou Gp/SGP de vÍrus Marburg ou a proteína H ou proteína F do Measles paramyxovírus.

Por exemplo, P24 de HlV (por e- xemplo, Gen8ank referência gi: 19172948) é a proteína obtida por transla- ção e clivagem da sequência gag do do vÍrus HlV (por exemplo, GenBank referência gi:9629357); gp 120 e gp41 de HlV são glicoproteínas obtidas por translação e clivagem da proteína gp160 (por exemplo, Gen8ank referência gi:9629363), codificado por env do genoma de v/rus HlV.

VP30 de Ebolaví- rus (GenPept Referência gi: 55770813) é a proteína obtida por translação da sequência vp30 do genoma Ebolavírus (por exemplo, GenBank Referência gi:55770807); VP35 de Ebolavírus (GenPept Referência gi:55770809) é a proteína obtida por translação da sequência vp35 do genoma Ebolavírus.

Gp/SGP de vÍrus de Marburg (GenPept Referência gi: 296965) é a proteína obtida por translação da (sequência) do genoma de vÍrus de Marburg (Gen- Bank Referência gi: 158539108). H proteína (GenPept Referência gi: 9626951) é a proteína da sequência H do genoma de vÍrus de Measles (Gen8ank Referência gi: 9626945); proteína F (GenPept referência gi: 9626950) é a proteína da sequência F do genoma de vÍrus de Measles.

Contudo, outras proteínas revestidas podem ser usadas dentro dos métodos da presente invenção conforme é conhecido por um versado na técnica.

A invenção, portanto, proporciona uma molécula de ácido nucle-

ico compreendendo uma sequência que codifica HlV-p24, HlV-gpl20, HlV- gp41, EbolavÍrus-VP30, Ebolavírus-VP35, vÍrus de Marburg Gp/SGP, proteí- na de vÍrus de Measles H ou proteína F.

A molécula de ácido nucleico pode ser operativamente ligada a uma região regulatória ativa em um inseto, leve- 5 dura ou célula de planta, ou em um tecido de planta particular.

A presente invenção adicionalmente proporciona a clonagem de um ácido nucleico que codifica uma HA, por exemplo, mas não limitado a, vÍrus da gripe humana A/lndonésia/5/05 HA (H5N1) em uma pIanta ou vetor de expressão de inseto (por exemplo, vetor de expressão de baculovírus) e 10 produção de candidatos de vacina da gripe ou reagentes compreendidos de proteínas estruturais de gripe recombinante que se automontam em estrutu- ras de proteína macromolecular homotípica imunogênicas, incluindo partícu-

· las de gripe subviral e VLP da gripe, em células de planta transformadas ou células de inseto transformadas. . 15 O ácido nucleico que codifica a HA de subtipos de gripe, por e- xemplo, mas não limitado a, A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1), subtipo A/lndonésia/5/05 (H5N1), A/8risbane/59/2007 (H1N1), Nllhas Salo- mão/3/2006 (H1N1), A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong 20 Kong/1073/99 (H9N2), A/8risbane/1 0/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equino/Praga/56 (H7N7), B/Malásia/2506/2004, B/FIórida/4/2006 pode ser expresso, por exemplo, usando-se um Sistema de Expressão de Baculovírus em uma linha de célula apropriada, por exemplo, células Spo- dopterafrugiperda (por exemplo, linha de célula Sf-9; ATCC PTA-4047). Ou- 25 tras linhas de inseto podem também serem usadas.

O ácido nucleico que codifica a HA pode, alternadamente, ser expresso em uma célula de planta, ou em uma planta.

O ácido nucleico que codifica HA pode ser sintetizado por transcrição reversa e reação cie cadeia de polimerase (PCR) usando HA RNA.

Como um exemplo, o RNA pode ser 30 isolado de vÍrus da gripe humana A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1) ou vÍrus da gripe humana A/lndonésia/5/05 (H5N1), ou outros vÍrus da gripe, por e- xemplo, A/8risbane/59/2007 (H1N1), A/llhas Salomão/3/2006 (Hl NI),

A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equino/Praga/56 (H7N7), B/Malásia/2506/2004, 8/Flórida/4/2006, ou de 5 células infectadas com um vírus da gripe.

Para transcrição reversa e PCR, iniciadores de oligonucleotÍdeo específicos para HA RNA, por exemplo, mas não limitados a, sequências de vÍrus HA da gripe humana A/Nova Caledô- nia/20/99 (H1N1) ou sequências de HAO de vÍrus da gripe humana A/lndonésia/5/05 (H5N1), ou sequências HA de subtipos de gripe 10 A/8risbane/59/2007 (H1N1), Nllhas Salomão/3/2006 (H1N1), A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99

- (H9N2), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equino/Praga/56 (H7N7), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006 podem 15 ser usados.

Adicionalmente, um ácido nucleico que codifica HA pode ser quimicamente sintetizado usando-se métodos conforme conhecidos por um versado na técnica.

As cópias de cDNA resultantes destes genes podem ser clona- das em um vetor de expressão adequado conforme requerido pelo sistema 20 de expressão de hospedeiro.

Exemplos de vetores de expressão apropria- dos para plantas são descritos abaixo, alternativamente, vetor de expressão de baculovírus, por exemplo, pFast8acl (lnVitrogen), resultando em pIasmí- deos baseados em pFast8acl, usando-se métodos conhecidos, e informação provida pelas instruções do fabricante pode ser usada. 25 A presente invenção é adicionalmente direcionada a uma cons- trução de gene compreendendo um ácido nucleico que codifica HA, confor- me descrito acima, operativamente ligado a um elemento regulatório que é operativo em uma planta.

Exemplos de elementos regulatórios operativos em uma célula de planta e que podem ser usados de acordo com a presente 30 invenção incluem, mas não estão limitados a, região regulatória de plastoci- anina (US 7.125.978; que é aqui incorporada por referência), ou uma região regulatória de Ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (Ru8isCO; US

4.962.028; que é incorporada aqui por referência), proteína de ligação de clorofila a/b (CAB; Leutwiler et al; 1986; que é incorporado aqui por referên- cia), ST-LSI (associado com o complexo emitido de oxigênio de fotosistema ll e descrito por Stockhaus et al. 1987,1989; que é aqui incorporado por refe- 5 rência). Um exemplo de uma região regulatória de pIastocianina é uma se- quência compreendendo nucleotídeos 10-85 de SEQ ID NO: 36, ou uma re- · gião similar de qualquer uma de SEQ ID NOS: de 37 a 47. Se a construção é expressa em uma célula de inseto, exemplos de elementos regulatórios operativos em uma célula de inseto incluem, mas 10 não estão limitados a, o promotor de poliedrina (Possee e Howard 1987. Nu- cleic Acids Research 15:10233-10248), o promotor gp64 (Kogan et al., 1995. J Virology 69:1452-1461) e similares.

. Portanto, um aspecto da invenção proporciona um ácido nuclei- co compreendendo uma região regulatória e uma sequência que codifica 15 uma HÁ da gripe. A região regulatória pode ser um elemento regulatório de plastocianina , e a HA da gripe pode ser selecionada a partir do grupo de cepas da gripe ou subtipos, compreendendo A/Nova Caledônia/20/99 (Hl Nl), subtipo A/lndonésia/5/05 (H5N1), A/8risbane/59/2007 (H1N1), A/llhas Salomão/3/2006 (Hl Nl), A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 20 (H5N1), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), A/8risbane/1 0/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equino/Praga/56 (H7N7), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006. Sequências de ácido nucleico com- preendendo um elemento regulatório de plastocianina e uma HA da gripe 25 são exemplificadas aqui por SEQ ID NOS: de 36 a 47. É conhecido que podem existir diferenças de sequência na se- quência de hemaglutinina das sequências de aminoácidos da gripe, ou os ácidos nucleicos que as codificam, quando vÍrus da gripe é cultivado em o- vos, ou células de mamífero, (por exemplo, células de MDCK), ou quando 30 isolado de um indivíduo infectado. Exemplos não-limitativos de tais diferen- ças são ilustradas aqui, incluindo Exemplo 18. Além disso, como um versado na técnica compreenderá, variação adicional pode ser observada dentro da hemaglutinina da gripe obtida de novas cepas a medida que mutações adi- cionais continuam a ocorrer.

Devido a variabilidade de sequência conhecida entre hemaglutininas da gripe conhecidas, a presente invenção inclui VLPS que podem ser produzidas usando-se qualquer hemaglutinina de gripe pro- 5 vida que quando expressa em um hospedeiro conforme descrito aqui, a he- maglutinina da gripe forma uma VLP.

Os alinhamentos de sequência e sequências de consenso po- dem ser determinados usando-se qualquer de vários pacotes de software conhecidos na técnica, por exemplo, MULTALIN (F.

CORPET, 1988, Nucl. 10 Acids Res., 16 (22), 10881-10890), ou sequências podem ser alinhadas ma- nualmente e similaridades e diferenças entre as sequências determinadas.

A estrutura de hemaglutininas é bem estudada e as estruturas

· são conhecidas por serem altamente conservadas.

Quando estruturas de hemaglutinina são superimpostas, um alto grau de conseNação estrutural é . 15 observado (rmsd <2A). Esta conservação estrutural é observada mesmo embora a sequência de aminoácido possa variar em algumas posições (vide, por exemplo, Skehel e Wiley, 2000 Ann Rev Biochem 69:531-69; Vaccaro et al 2005). As regiões de hemaglutininas são também bem conservadas, por exemplo: 20 · Domlnios estruturais: a poliproteína HAO é clivada para propor- cionar HA madura.

HA é um homotrlmero com cada monômero compreen- dendo um domlnio de ligação de receptor (HAI) e um domínio de ancora- mento de membrana (HA2) ligado por uma Iigação de disulfeto simples; os 20 resíduos de terminaI-N da subunidade HA2 podem também ser referidos 25 como o domínio de fusão de HA ou sequência.

Uma região de 'cauda' (inter- na à membrana envelope) está também presente.

Cada hemaglutinina com- preende estas regiões ou domínios.

As regiões individuais ou domínios são tipicamente conservados em comprimento.

Todas as hemaglutininas contêm o mesmo número e posição de 30 pontes de dissulfeto intra- e intermolecular.

A qualidade e posição na se- quência de aminoácido das cisteínas que participam na rede de fonte de dis- sulfeto são conservadas entre as HAS.

Exemplos de estruturas ilustrando as pontes de dissulfeto características intra- e intermolecular e outros aminoá- cidos conservados e suas posições relativas são descritos em, por exemplo, Gamblin et al. 2004 (Science 303:1838-1842). Estruturas exemplares e se- quências incluem 1 RVZ, IRVX, IRVT, 1 RVO, IRUY, 1RU7, disponíveis a 5 partir do Banco de Dados de Proteína (URL: www.rcsb.orq). · Cauda citoplasmática — a njaioria de hemaglutininas compre- ende 3 cisteínas em posições conservadas.

Uma ou mais destas cisteínas podem ser plamitoiladas como uma modificação pós-translacional.

A variação de aminoácido é tolerada em hemaglutininas de vÍrus da gripe.

Esta variação proporciona poucas cepas que são continuamente identificadas.

A infectividade entre as novas cepas pode variar.

Contudo, a formação de trímero de hemaglutinina, que subsequentemente formam VLPS é mantida.

A presente invenção, portanto, proporciona uma sequência de aminoácido de hemaglutinina, ou a ácido nucleico que codifica uma sequên- cia de aminoácido de hemaglutinina, que forma VLPS em uma planta, e inclui sequências conhecidas e sequências variantes que podem se desenvolver.

A Figura 65 ilustra um exemplo de tal variação conhecida.

Esta figura mostra uma sequência de aminoácido de consenso (SEQ ID NO: 74) para HA das seguintes cepas de H1N1: A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1) (codificado por SEQ ID NO: 33), A/8risbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 48), A/llhas Salomão/3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 49) e SEQ ID NO: 9. Xl (posição 3) é A ou V; X2 (posição 52) é D ou N; X3 (posição 90) é K ou R; X4 (posição 99) é K ou T; X5 (posição 111) é Y ou H; X6 (posição 145) é V ou T; X7 (posição 154) é E ou K; X8 (posição 161)é Rou K;X9(posição 181)éVou A;X1O(posição 203)é D ou N; Xll (posição 2O5) é R ou K; X12 (posição 210) é T ou K; X13 (posição 225) é R ou K; X14 (posição 268) é W ou R; X15 (posição 283) é T ou N; X16 (posi- ção 290) é E ou K; X17 (posição 432) é I ou L; Xl8 (posição 489) é N ou D.

Como outro exemplo de tal variação, um alinhamento de se- quência e sequência de consenso para HA of A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1) (codificado por SEQ ID NO: 33), A/8risbane/59/2007 (H1N1) (SEQ

ID NO: 48), A/llhas Salomão/3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 49), A/Porto Ri- co/8/34 (H1N1) e SEQ ID NO: 9 é mostrado abaixo na Tabela 3.

Tabela 3: Alinhamento de sequência e sequência de consenso para HA de cepas de H1N1 selecionadas SEQ ÍD NO. Sequência 1 50 75 MKAKLLVLLC tftatyadti cigymnnst dtvdtvlbkn vrvmsvNIíb 9 MKAKLLVLLA TrrÀTY=í cígyhannst dtvdtvlekn vT\rmsvNLib 48 VLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN L 49 L"L,WW tftatyadti cigyhannst d vrmsvNLL 7 6 + - « . k 4 0 0 k * Consenso mkxkllvlle tf tatyadti çjgyhannst dtvdtvlekn vEvth&vn1l 51 IQQ 75 EDSHNGKLCL LKGIÀPLQLG NCSVAGWILG NPLISK ESWSYlVETP 9 EDSKNGKL-CL LKGIAPLQLG NCSVAGWILG "NPECELLISK ESWSYIVETP 48 ENSHNGKLCL t0KGtAPlALG NCSVAGWILG NPECELLISK ESWSYIVEKP 49 EDSHNGKLCL LKGTAPLQLG NCSVAGWILG NPECELLISR ESWSYIVEKP 7 € m . « g è . ^ bm * Consenso emmgklcl lkgLap-lqlg ncsvawijg npecelíís W éÉwsyive .p 101 150 75 NPENGTCYPG YPAMÍBELRE QLSSVSSFER FEIFFKESSW FNHTVTGVSA 9 NPENGTCYPG YFAIJYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSW PMTVTGVSA 4B NPENGTCYPG HFAUY6ELRB QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVTGVSA 49 NPENLPCYPG HFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSW pNHTTmvsA 76 .,,.++.,., Consenso npengtcypg xf&dYeelre qlB$vs8EBr fei£pkessw pnhExtgvse 151 200 75 scsEmKssF YRNLLYU,TGK NGLYPNLSKS YVNNKEKEVL VLhGVHHPFN 9 SCSSF YRNLLRTGK NGL¥FNLSKS YVNNKEKEVL vLi9ppN 48 SCSKNGBSSF YRNLLTK NGLYPNLSKS YANNKEKEVL VLWGVHHPPN 49 SCSKNGBSSF ¥KNLLWL,TGK NCLYPNLSKS YANNKEKWL VLWGUKHPPN 76 ......,.., Consenso scshnqxssf yxnlLwltgk nglygnlsks j'xnnkekevl viwgvhhppn 2U1 250 75 IGNQRALYXT =yvsvvss HYSRRFTPEI AKRFKVRDQE GRINYYWTLL 9 IGNQRALYHT FNAYVSVVSS HYSRRFTPEI AKRPKVKDQE GRINYYWTLL 48 IGDQKALYRT =YVSVVSS HYSRKÊTPEI AKRPKVRDQE GRÊNYYWTLL 49 FGtlQR^LYHK ENÃYVSVV$S RYSRKFTPEI AKRPKVRDQE GRFNYYWTLL 76 a&b4*..©. . ,....T SII PSGPLKAEIA QRLEWFAGK Consenso igxqxalyhx enayvsvvss hysrxftpe! akrPkm#qe gRi.#yywt1Z 251 300 7 5 EPGMUIFEA IAPWYA PALSRGFGSG fTTSNAPMDE C!»XCQTPQG 9 BPGDTIIFEA N(MLIAFWYA FALSRGFGSG IITsNApmE CDAXÇQT'PQG 48 EFGWIIF_A NMLIAP.RTA FALqSRGFGSG IINSNAFMDK CDAKCQTPQG 49 HGDTTIFEA NGNLIAPRYA FAV'RGFGSG ÍINM CDÀKCQTPQG 76 NTDLEVL= . . .LKTRPIL SPLT'KG7 LGF vmjTvpsER GLQRRRFVQN Consenso #pgdt!itEa ngnLiapxya £ aL5"rGf'g6g !itsnaPm#x çaakcqtpQg 301 350 75 ÀINSSLPFQN VHPVTIGECP KYVRSAKLRM VT.GLRNTPS IQSRGLFGAI 9 AINSSLPFQN VHPVTIGECP KYVRSAKLRM vT.gLRNrps IQSRCLFGAI 48 AINSSLPFQN VHWTIGECP KYVRSAKLRM VT.GLRNIPS IQSRGLFGAI 49 AINSSLPFQN VHFVTÍGECP KYVRSAKLRM VT.GLRNIPS IQSRGLFGAI

76 alng. . . . .N GDPNNMDKAV KLYRKLKREI TFHGAKEISL SYSAGÀLASC Consenso AíNsglpLqN vhPvzigecp K!níRgaxlrm vtxGlrâ ips :ÍqSrG1£gai 351 400 75 AgFI£ggmN M\/DGhYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAÍN GITNKVNSVI 9 agfieggwtg MVDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GfTNKVNSVF 48 ageiwgwtg Wygyhh qneqgsgyaa dqkstqnaw GTTNKVNSVI 49 agei WYGYHH qneqgsgyaa DQKSTQNAIN grm 76 MGLIYNRM.G A=EVAFGL vcatceqiad SQHRSKRQEN TTTNPLIRHE Consenso aG£1WHtG mVdgwygkhh *leqgggyAa dQkstqnain giTNkvnsv·i 401 450 75 EKMNTQFTAV GKEFNKLERR MENLNKKVDD G'FLDIYJTYNA ELLVLLENER 9 EKMNTQFTAV GKEFNKLERR 'KENLNKKVDD GFLDIWTYNA ELLVLLENER

4.8 EXXNTQFTAV GKEFNKLKRR MENLNKKVDD GFIDIYTTYNA ELLVLÍLENER 49 EKMNTQFTAV GKEFNKLERR MENLNKKVDD GF'IDÍWI'YNA ELLVLL9NER 76 A .KAM6QMAGS SBQAARAMÊV A. . . . . . . .S QARQMVQÀMR Consenso ã%tqtTav gKéf#k$er":r mu1nkkv#d g£xà£wty'na fllv$l#neR G5L 500 75 TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL KNNAKEIGNG CFEFYHKCNN ECMESVKNGT 9 TLDNVK NLYEKVKSQL KNNAKEIGNG CF~KKCNN E·~GT 48 TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL KNNAKEIGNG CFEFYKKCND ECMESVKNGT 49 TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL KNNAXEIGNG cFEFYtüccND E=SVXNGT 76 TIGTHPSSSA GLKNDLLENL QÀYQKmgvQ mRFK. . . . . . . . - . . . . . . Consenso TldfHàSwvk ntjy#kvks#L kkèigng cfêFyhkcnx ecmesvkngt 501 550 75 YDYPKYSEES KGNRBKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS LVLLVSLGAI 9 YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQY 'AIYSTVASS LVLLVSLGAI 48 YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLES'MGVYQI LAIYSTVASS LNLLVSLGAI 49 YDYPKYSEES KLNREKI KLESMGVYQI LArYsTvAss LVLLVSLGAL 7 6 4 r . 6 e . . .t b 4 · . V K Y * V P ·9 q P e . F r 7 B « T * Consenso ydypkys klnrekiàw klesi. 1aiWt'vaE$ lvlivs1.gai 551 566 75 SFWNCSNGSL QCRICI 9 sF~sNgm QCRLCI 48 SFWMCSNGSL QCRICI 49 SFWNCSNGSL QCRICI 7 6 b 4 . B .&^. k . M . »Ç . . » Consenso &fwmc8ngsl qcríci A sequência de consenso indica no caso superior letras de ami- noácidos comuns a tais sequências em uma posição designada; as letras do caso inferior indicam aminoácidos comuns a pelo menos metade, ou uma 5 maioria das sequências; o símbolo ! é qualquer um de l ou V; o sÍmbolo $ é qua|querumdeLouM;osÍmbo|o°6équa|querumdeFouY;osÍmbo|o#é qualquer um de N, D, Q, E,B ou Z; o sÍmbolo "." é nenhum aminoácido (por exemplo, uma anulação); X na posição 3 é qualquer um de A ou V; X na po- sição52équa|querumdeEouN;Xnaposição90éKouR;Xnaposição 99éTouK;Xnaposição1WéqualquerumdeYouH;Xnaposição145é qua|querumdeVouT;Xnaposição157éKouE;Xnaposição162éRou K;Xnaposição182éVouA;Xnaposição203éNouD;Xnaposição205 éRouK;Xnaposição210éTouK;Xnaposição225éKouY;Xnaposi- ção 333 é H ou uma anulação; X na posição 433 é I ou L; X na posição 49) é

N ou D.

Como outro exemplo de tal variação, um alinhamento de se- quência e sequência de consenso para HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 55), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1) e A/lndonésia/5/2006 (H5N1) (SEQ ID NO: 10) é mostrado abaixo na Tabela 4. Tabela 4: Alinhamento de sequência e sequência de consenso para HA de cepas de H1N1 selecionadas SEQ ID NO.

Sequência

1 5Q 10 WKXT VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE 56 ~IVLLFAT VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTTMEKNV T'VTHAQDM 55 MEKTVIiLLAt VSLVKSDQIC IGYHANNSTB QVDTIMBKNV TvTHMDrLÈE Consenso kexivlliaí vslvksdqic igyhannste qvdtimeknv tvtraqdile

5i 100 IO KTHNGKLCDL DGVKPÍALRD CSVÀCWL= ~DEFINVP EWSYIVEKAN 56 KTKNGKLCDL DGVKPLILKD CSUA~LGN FMCDEFINVP EWSYIVEKAN 55 KT¢DL DGVKPLIL'RD CSVAGWLLGN ~DEFINVP EWSYFVEKAN Consenso ktangklcd.l dgvkplilrd csvamllgn fmcdefinvp ms

10l 15Q 10 ypndlcypgs najYEEu{KL lsrinkfeki qílrksswsd heassgvssa 56 PVNDLCYPGD PNDYEEL,KHL LSRINHFEKI QKIPKSSWSS KEASLGVSSA 55 PANDLCYPGN FNDYEELKKL LSRINKFEKI QÍrpKssHsD HEASSGVSSA Consenso pxndlcypgx ¥ndyeblkhl LsRINHp.ux QllPkSSWSd HEASGCNSSA

151 200 IQ ÇPYLGSPSFF RNVVWLIKKN STXPT1KKSY mmv ZMCIHHPNDA 56 CPYQGKSSFÊ' RNVVWLIKKN STYPTIKRSY NNTNQEDLLV ~IHHFNDA 55 CPYQGTPSFF RNVVWLIKKN NTYPTIKRSY NNTNQOLLI LWGIHHSNDA Consenso CPYqGxpSFF RNv\jTmIKKN sTYFTIKrSY nntnqedll! ly©ihhpnda

201 250 ID AEQTRLYQNP TTYISIGTST INQRLVPKIA TRSKVNGQSG RM9FFWTLLK 56 AEQTKLYQNP TTTIsvgFsr LNQRLVPRIA TRSKVNGQSG RbSEFFWTÍLK 55 AEQTKLYQNP TTYISVGTST WQRLVPKIA TRSKVNGQSG RMDFFwrILK Consenso AEQTkLY'QNp ttyis ÈgTsi' LNQRLVpkIA trskvngqsg RM#FFwrrLK

251 300 io PNDAINFESN GNFIAPEYAY KÍVKKGDSA1 MKSELEYGNC NTKC*ÈMGA 56 FNDAINFESN GNFIAPEYA'Z KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTFMGA 55 FNDAINFESN GNFIAPEYAY KFVKKGDBM VKSEVEY= NTKçQTpIm Consenso PNljAíNFESN gnftapeyay K"IVKKGDSa1 msElEywc NTKCQTPmGA

301 350 10 INSSMPF'HNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLÀ TGLRNSPQRE SRRKKRGWG 56 lNSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLANSPQRE RRRKKRGLPG 55 INssxpFmI HPLTIGECPK YVKSNKLVLA mLRNspLiRE RRRK.

RGLFG

Consenso inssmpfhnk hpltigefpk YvKSNrLVLA TGLRNSPqRE rRRKkRGLFG

35.1 400 io A"AGFIEGGW QGMVDGWYGY WSNEQGSGY AADKESTQKA INVTNKVNS 56 AIÀGFIEGGW QGMVDGWYGY KHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS 55 AIÀGFIEGGW GY = AADKEsmKA IDGVTNKVNS Conse nso AIAGFIEGGW QGXVDGWYGY KHSNEQGSGY AADKÊ$TQKA r 401 450 10 ITDKKNTQFE AvgREFlu¶jLE RRÍENLNKKM =FLDVWTY N 56 IIDKMNTQFE AVGREFNNLE RRIKM EDGFLIJVWTY NAEUÂ 55 IIDKMNTQFE AVGREFNNLE RRI.ENLNKKM EDGFLWWTY Nmw Consenso i idkmntqfe avgrefnnle rrienlnkkm == naellvlmen 451 500 1Ü ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG NGCFEFYKKC DNBCMESÍRN 56 ERTLDFKDSN VKNLYDKVRL QLRDNAXELG NgcFEFYHKé DNECMESVRN 55 ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG NGCFEYYHKC DNECMESVRN Consenso ertldfkdsn vknlydkvrl qlrdnakelg ngcfefyhkc dnecmes irn SOI 550 10 GTYNYPQYSE KREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA SSLALAIM 55 GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESTGIY QFLSIYSTVA SSLALAIMVA 55 GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QíLsIYsTvA SSLALAIMVÃ Consenso gtyvypqyse earlkreeis gvKLEsIgtY qi'lsiystva ssLALtAIMvÀ 551 568 lO GLSLYMCSNG SLQCRICI 56 gLsumc8Ng slqcrici .55 GL"NG SLQCRICI Consenso glsl9mcsng sLQcRIct A sequência de consenso indica no caso superior letras de ami- noácidos comuns a todas as sequências em uma posição designada; as le- tras do caso inferior indicam aminoácidos comuns a pelo menos metade, ou 5 uma maioria das sequências; o sÍmbolo ! é qualquer um de I ou V; o simbolo $équa|querumdeLouM;osÍmbo|o°/)équa|querumdeFouY;osÍmbo|o #é qualquerum de N, D, Q, E,B ou Z; X na posição 102 é qualquerde T,V ouA;Xna posição 11OéqualquerdeS, Dou N;Xna posição 156 équal- querdeS,kouT. Os alinhamentos ilustrados e descritos acima e sequências de consenso são exemplos não-limitativos de variantes em sequências de ami- noácido de hemaglutinina que podem ser usadas em várias concretizações da invenção para a produção das VLPS em uma planta. Um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido pode ser facilmente determinado, visto que os códons para cada aminoácido são conhecidos na técnica. A provisão de uma sequência de aminoácido, portanto, ensina a degenerar sequências de ácido nucleico que a codifica. A presente invenção, portanto, proporciona uma sequência de ácido nucleico que codifica uma hemaglutinina daquelas cepas da gripe e subtipos aqui descritos (por exemplo, A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1)A/lndonésia/5/2006 (H5N1), A/galinha/Nova York/1995, A/pato silvestre de arenque/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, Npato silvestre do hemisfério norte/MN/33/00, 5 A/pato/Shanghai/1/2000, A/rabijunco do norte/TX/828189/02, NPeru/Ontario/6118/68(H8N4), A/shoveler/lrã/G54/03, Ngalinha/Alemanha/N/1949(H1ON7), A/pato/lnglaterra/56(H11 N6), A/pato/Alberta/60/76(H12N5),NPato silvestre /Maryland/704/77(H13N6), A/Pato silvestre do hemisfério norte/Gurjev/263/82, A/pato/Austrália/341/83 10 (H15N8), A/pato silvestre da cabeça preta/Suécia/5/99(H16N3), 8/Lee/40, C/Johannesburg/66, NPorto Rico/8/34 (Hl Nl), A/8risbane/59/2007 (HI Nl), A/llhas Salomão 3/2006 (H1N1), A/8risbane 10/2007 (H3N2),

. A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006, A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnã/1194/2004 " 15 (H5N1), A/Cerceta/Hong-kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong-kong/1073/99 (H9N2)), bem como sequências degeneradas que co- dificam as hemaglutininas acima.

Adicionalmente, uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico pode ser facilmente determinada, como o códon ou có- 20 dons para cada aminoácido são conhecidos.

A provisão de um ácido nuclei- co, portanto, ensina uma sequência de aminoácido codificado por ele.

A in- venção, portanto, proporciona sequências de aminoácido da hemaglutinina daquelas cepas da gripe e subtipos aqui descritos (por exemplo A/Nova Ca- ledôn ia/20/99 (H1N1 )Nlndonésia/5/2006 (H5N1), A/galinha/Nova York/1995, 25 Npato silvestre de arenque/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, Npato silvestre do hemisfério norte/MN/33/00, A/pato/Shanghai/1/2000, A/rabijunco do norte/TX/828189/02, A/Peru/Ontario/6118/68(H8N4), A/shoveler/lrã/G54/03, Nga|jnha/A|emanha/N/1949(H10N7), Npato/lnglaterra/56(HHN6), A/pato/Alberta/60/76(H 12N5), A/Pato silvestre 30 /Maryland/704/77(HI3N6), NPato silvestre do hemisfério nor- te/Gurjev/263/82, A/pato/Austrália/341/83 (H15N8), Npato silvestre do pes- coço preto/Suécia/5/99(H16N3), 8/Lee/40, C/Johannesburg/66, A/Porto Ri-

CO/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/llhas Salomão 3/2006 (H1N1), A/8risbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006, A/Singapura/1/57 (H2N2), NAnhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong- 5 kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong-kong/1073/99 (H9N2)). Nas plantas, as VLPS da gripe se originam a partir da membrana de plasma (vide Exemplo 5, e Figura 19); portanto, a composição de lipídeo das VLPS refletem sua origem.

As VLPS produzidas de acordo com a pre- lO sente invenção compreendem HA de um ou mais que um do tipo ou subtipo de gripe, complexados com lipídeos derivados de planta.

Os lipídeos de planta podem estimular células imunes específicas e aumentam a resposta

- imune induzida.

As membranas de planta são produzidas de lipídeos, fosfa- tidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE), e também contêm glicosfingoli- 15 pÍdeos, saponins, e fitosteróis.

Adicionalmente, baisas de lipídeo são tam- bém encontradas nas membranas de plasma de planta —estes microdomí- nios são enriquecidos em esfingolipídeos e esteróis.

Em plantas, uma varie- dade de fitosteróis é conhecida por ocorrer, incluindo estigmasterol, sitoste- rol, 24-metilcolesterol e colesterol (Mongrand et al., 2004). 20 PC e PE, bem como glicosfingolipÍdeos, podem se ligar a molé- culas de CDl expressas por células imunes mamíferas tais como células dendríticas similares a células apresentando antígeno (APCs) e macrófagos, e outras células incluindo linfócitos B e T no timo e flgado (Tsuji m,. 2006). Moléculas de CDl são estruturalmente similares a moléculas complexas de 25 maior histocompatibilidade (MHC) de classe I, e seu papel é apresentar antí- genos de glicolipídeo para células de NKT (Natural Killer T cells). Após ati- vação, as células NKT ativam células imunes inatas tais como células NK e células dendríticas, e também ativam anticorpo similar a células imunes a- daptativas que produzem células B e células T. 30 Uma variedade de ditosteróis pode ser encontrada em uma membrana de plasma - o complemento específico pode variar dependendo das espécies, condições de crescimento, fontes de nutrientes ou estado de patogenia, para denominar uns poucos fatores.

Geralmente, beta-sitosterol é o fitosterol mais abundante.

Os fitosteróis presentes em uma VLP da gripe complexada com uma bicamada de lipídeo, tal como envelope derivado de membrana de 5 plasma, pode proporcionar uma composição de vacina vantajosa.

Sem dese- jar estar ligado pela teoria, as VLPS produzidas de planta complexadas com uma bicamada de lipídeo, tal como envelope derivado de membrana de plas- ma, pode induzir uma reação imune mais forte do que as VLPS produzidas em outros sistemas de expressão, e podem ser similares à reação imune 10 induzida por vacinas de vÍrus totais vivos ou atenuados.

Portanto, em algumas concretizações, a invenção proporciona uma VLP complexada com uma bicamada de lipídeo derivada de planta.

Em

· algumas concretizações, a bicamada de Iipldeo derivada de planta pode compreender o envelope da VLP, 15 A VLP produzida dentro de uma pIanta pode induzir uma HA compreendendo N-glicans específicas de planta.

Portanto, esta invenção também proporciona uma VLP compreendendo HA tendo N-glicans específi- cas de planta.

Além disso, modificação de N-glican em plantas é conhecida 20 (vide, por exemplo, U.S. 60/944.344; que é aqui incorporada por referência) e HA tendo N-glicans modificadas podem ser produzidas.

HA compreenden- do um modelo de glicosilação modificado, por exemplo, com N-glicans fuco- silatadas reduzidas, xilosilatadas, ou ambos, fucosilatadas e xilosilatadas podem ser obtidas, ou HA tendo um modelo de glicosilação modificado po- 25 dem ser obtidas, no qual a protelna carece de fucosilação, xilosilação, ou ambos, e compreendem galatosilação aumentada.

Além disso, modulação de modificações pós-translacional, por exemplo, a adição de galactose ter- minal, pode resultar em uma redução de fucosilação e xilosilação da HA ex- pressa quando comparada a HA de expressão de planta tipo selvagem. 30 Por exemplo, que não é para ser considerado limitante, a sÍntese de HA tendo um modelo de glicosilação modificado pode ser alcançada por coexpressão da proteína de interesse junto com uma sequência de nucleotí-

deo que codifica beta-l .4 galactosiltransferase (GalT), por exemplo, mas não limitado a mamífero GalT, ou GalT humano contudo GalT de outras fontes podem também ser usados.

O domínio catalítico de GalT pode também ser fundido a um domínio de CTS (isto é, a cauda citoplásmica, domínio de 5 transmembrana, região de haste) de N-acetilglucosaminil transferase (GNTI), para produzir uma enzima híbrida de GNTl-GalT, e a enzima híbrida pode ser coexpressa com HA.

A HA pode também ser coexpressa junto com uma sequência de nucleotídeo que codifica N-acetilglucosaminiltrasnferase lll (GnT-lll), por exemplo, mas não limitado a mamífero GnT-III ou GnT-lll hu- IO mano, GnT-III de outras fontes podem também ser usados.

Adicionalmente, uma enzima híbrida de GNTl-GnT-lll, compreendendo a CTS de GNTI fundi- da a GnT-lll pode também ser usada. " Portanto, a presente invenção também inclui VLP'S compreen- dendo HA tendo N-glicans modificadas. 15 Sem desejar estar ligado pela teoria, a presença de N-glicans de planta em HA pode estimular a resposta imune peia promoção da ligação de HA por células que apresentam estímulo.

O estímulo da resposta imune u- sando N-glican de planta foi proposto por Saint-jore-Dupas et al. (2007). A- Iém disso, a conformação da VLP pode ser vantajosa para a apresentação 20 do antígeno, e aumenta o efeito adjuvante da VLP quando complexada com uma camada de lipídeo derivada de planta.

Por "região regulatória" "elemento regulatório" ou "promotor" é significativo uma porção de ácido nucleico tipicamente, mas não sempre, a montante da região de codificação de protelna de um gene, que pode ser 25 compreendida de DNA ou RNA, ou ambos DNA e RNA.

Quando uma região regulatória é ativa, e em associação operativa, ou operativamente ligada, com um gene de interesse, isto pode resultar na expressão do gene de inte- resse.

Um elemento regulatório pode ser capaz de mediar especificidade de órgão, ou controlar a ativação de gene desenvolvente ou temporal.

Uma "re- 30 gião regulatória" inclui elementos de promotor, elementos promotores de núcleo exibindo uma atividade promotora basal, elementos que são induzí- veis em resposta a um estimulo externo, elementos que mediam atividade de promotor, tais como elementos regulatórios negativos ou intensificadores transcricionais.

A "região regulatória", conforme aqui usada, também inclui elementos que são ativos seguindo transcrição, por exemplo, elementos re- gulatórios que modulam expressão de gene, tais como intensificadores 5 translacionais e transcricionais, repressores translacionais e transcricionais, sequências de ativação a montante, e determinantes de instabilidade de mRNA.

Vários destes últimos elementos podem estar localizados proximais à região de codificação.

No contexto desta descrição, o termo "elemento regulatório" ou 10 "região regulatória" tipicamente refere-se a uma sequência de DNA, usual- mente, mas não sempre, a montante (5') a sequência de codificação de um gene estrutural, que controla a expressão da região de codificação pela pro- ' visão do reconhecimento de RNA polimerase e/ou outros fatores requeridos para transcrição para começar um local particular.

Contudo, é para ser com- 15 preendido que outras sequências de nucleotldeo, localizadas dentro de in- trons, ou 3' da sequência, podem também contribuir para a regulação de ex- pressão de uma região de codificação de interesse.

Um exemplo de um e- lemento regulatório que proporciona o reconhecimento de RNA polimerase ou outros fatores transcricionais para assegurar iniciação em um local parti- 20 cular é um elemento promotor.

Muitos, mas não todos, elementos promoto- res eucarióticos, contêm um caixa de TATA, uma sequência de ácido nuclei- co conseNada compreendida de pares de base de nucleotídeo adenosina e timidina usualmente situados aproximadamente 25 pares bases a montante de um local de partida transcricional.

Um elemento promotor compreende 25 um elemento promotor basal, responsável pela iniciação de transcrição, bem como outros elementos regulatórios (conforme listado acima) que modificam a expressão de expressão.

Existem várias regiões regulatórias, incluindo aquelas que são desenvolvimentalmente reguladas, induzíveis ou constitutivas.

Uma região 30 regulatória que é regulada de maneira desenvolvida, ou controla a expres- são diferencial de um gene sob seu controle, é ativada dentro de certos ór- gãos ou tecidos de um órgão em tempos específicos durante o desenvolvi-

mento daquele órgão ou tecido. Contudo, algumas regiões regulatórias que são desenvolvente reguladas podem preferencialmente ser ativas dentro de certos órgãos ou tecidos em estágios desenvolventes diferentes, elas podem também ser ativas em uma maneira desenvolvimentalmente regulada, ou em 5 um nível basal em outros órgãos ou tecidos dentro de uma planta também. Exemplos de regiões regulatórias específicas de tecido, por exemplo, vide uma região regulatória específica, incluem promotor napin, e o promotor cru- ciferin (Rask et al., 1998, J. Planta Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Planta Cell 14: 125-130). Um exemplo de um promotor específico de 10 folha inclui o promotor plastocianina (Figura lb ou SEQ ID NO:23); US

7.125.978, que é aqui incorporada por referência). Uma região regulatória induzivel é uma que é capaz de ativar . diretamente ou indiretamente transcrição de uma ou mais sequências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor, as 15 sequências de DNA ou genes não serão transcritas. Tipicamente o fator de proteina que se liga especificamente a uma região regulatória induzível para . ativar transcrição pode estar presente em uma forma inativa, que então é diretamente ou indiretamente convertida à forma ativa pelo indutor. Contudo, o fator de proteína pode também estar ausente. O indutor pode ser um agen- 20 te quimico, tais como proteina, metabólito, regulador de crescimento, herbi- cida ou composto fenólico, ou um estresse fisiológico imposto diretamente por calor, frio, sal, ou elementos tóxicos, ou indiretamente através da ação de uma patogenia ou agente de doença tal como um vírus. Uma célula de planta contendo uma região regulatória induzível pode ser exposta a um in- 25 dutor por aplicação externamente do indutor à célula ou planta, tais como métodos de pulverização, irrigação, aquecimento ou similar. Elementos regu- latórios induzlveis podem ser derivados de ou planta ou genes de não-planta (por exemplo, Gatz, C. e Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; que é incorporado por referência). Exempios de promotores induzíveis po- 30 tenciais incluem, mas não estão Iimitados a, promotor induzível de tetracicli- na (Gatz, C.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; que é incorporado por referência), promotor induzível de esteróide (Aoyama, T. e

Chua, N.H.,1997, Plant j. 2, 397-404; que é incorporado por referência), e promotor induzível de etanol (Salter, M.G., et al., 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al., 1998, Nature Biotech. 16, 177-180, que são incorporados por referência), genes de IB6 e CKll induziveis de citokinin 5 (Brandstatter, I. e Kieber, JJ.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985; que são incorporados por referência), e o ele- mento induzível de auxin, DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963- 1971; que é incorporado por referência). Uma região regulatória constitutiva direciona a expressão de um 10 gene através de todas as várias partes de uma pIanta e continuamente atra- vés de todo o desenvolvimento da planta.

Exemplos de elementos regulató- rios constitutivos conhecidos incluem promotores associados com o

- transcrito CaMV 35S. (Odell et ai., 1985, Nature, 313: 810-812), a actina 1 de arroz (Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), actina 2 (An et al., " 15 1996, P/ant j., 10: 107-121), ou tms 2 (U.S. 5.428.147, que é aqui incorpora-

da por referência), e genes de triosefosfato isomerase 1 (Xu et. al., 1994,

. Plant Physiol. 106: 459-467), o gene ubiquitin 1 de milho (Cornejo et al., 1993, Plant MoI.

Biol. 29: 637-646), o Arabidopsis ubiquitin 1 e 6 genes (HOI- torf et al., 1995, Plant Mol.

Biol. 29: 637-646), e o fator de iniciação transla- 20 cional de tabaco 4A (Mandel et al., 1995 Plant Mol.

Biol. 29: 995-1004). O termo "constitutivo", conforme aqui usado, não indica necessariamente que um gene sob controle da região regulatória constitutiva é expresso no mes- mo nível em todos os tipos de célula, mas que o gene é expresso em uma faixa ampla de tipos de célula mesmo embora variação em abundância seja 25 frequentemente observada.

Por "operativamente ligado" é significativo que as sequências particulares, por exemplo, um elemento regulatório e uma região de codifica- ção de interesse, interajam ou diretamente ou indiretamente para efetuar uma função pretendida, tal como mediação ou modulação de expressão de 30 gene.

A interação de sequências operativamente ligadas pode, por exemplo, ser mediada por proteínas que interagem com as sequências operativamen- te ligadas.

A uma ou mais sequências de nucleotídeo da presente invenção podem ser expressas em qualquer hospedeiro de planta adequado que é transformado pela sequência de nucleotídeo, ou construções, ou vetores da presente invenção.

Exemplos de hospedeiros adequados incluem, mas não 5 estão limitados a, colheitas agriculturais incluindo alfafa, canola, Brassica spp., milho, Nicotiana spp., alfafa, batata, ginsém, ervilha, aveia, arroz, so ja, trigo, cevada, girassol, algodão, e similares.

A uma ou mais construções genéticas quiméricas da presente invenção podem adicionalmente compreender uma região 3' não- lO transladada.

Uma região 3' não-transladada refere-se àquela porção de um gene compreendendo um segmento de DNA que contém um sinal de polia- denilação e quaisquer outros sinais regulatórios capazes de efetuar proces-

" samento de mRNA ou expressão de gene.

O sinal de poliadenilação é usu- almente caracterizado por efetuação da adição de rastros de ácido poliade- 15 nílico para a extremidade 3' do precursor de mRNA.

Os sinais de poliadeni- . lação são comumente reconhecidos pela presença de homologia para a for-

- ma canônica 5' AATAAA-3', embora variações são sejam incomuns.

Uma ou mais das construções genéticas quiméricas da presente invenção podem também incluir adicionalmente intensificadores, ou intensificadores de trans- 20 lação ou de transcrição, conforme podem ser requeridos.

Estas regiões de intensificador são bem conhecidas àqueles versados na técnica, e podem incluir o códon de iniciação ATG e sequências adjacentes.

O códon de inici- ação deve estar em fase com a estrutura de leitura da sequência de codifi- cação para assegurar translação da sequência total. 25 Exemplos não-limitativos de regiões 3' adequadas são as regi- ões 3' transcritas não-transladadas contendo um sinal de poliadenilação de tumor Agrobacterium induzindo genes de plasmídeo (Ti), tais como nopalina sintase (gene Nos) e genes de planta, tais como genes de armazenagem de soja, um gene de subunidade pequena da ribulose-l, 5-bisfosfato carboxila- 30 se (sSRUBISCO; US 4.962.028; que é incorporada aqui por referência), o promotor usado na regulação de expressão de pIastocianina (Pwee e Gray 1993; que é aqui incorporado por referência). Um exemplo de um promotor de plastocianina é descrito em US 7.125.978 (que é aqui incorporada por referência). Conforme descrito aqui, promotores compreendendo sequências intensificadoras com eficiência demonstrada em expressão de folha verifica- 5 ram-se serem efetivos em expressão transiente.

Sem desejar estar ligado pela teoria, a fixação de elementos regulatórios a montante de um gene fo- tossintético por fixação à matriz nuclear pode mediar forte expressão.

Por exemplo, até -784 do local de partida de translação do gene de plastocianina da ervilha podem ser usados para mediar forte expressão de gene relator. 10 Para auxiliar na identificação de células de planta transformadas, as construções desta invenção podem ser adicionalmente manipuladas para incluir marcadores selecionáveis de planta.

Marcadores selecionáveis úteis

- incluem enzimas que proporcionam resistência a quimicos tal como um anti- biótico, por exemplo, gentamicina, higromicina, kanamicina, ou herbicidas, 15 tais como fosfinotricina, glifosato, clorosulfuron, e similares.

Similarmente,

" enzimas proporcionando produção de um composto identificável por mudan-

. ça de cor tal como GUS (beta-glucuronidase), ou luminescência, tal como luciferase ou GFP, podem ser usados.

Também considerada parte desta invenção são plantas transgê- 20 nicas, células de planta ou sementes contendo a construção de gene quimé- rico da presente invenção.

Métodos de regeneração de plantas totais de cé- lulas de planta são também conhecidos na técnica.

Em geral, células de planta transformadas são cultivadas em um meio apropriado, que pode con- ter agentes seletivos, tais como antibióticos, onde marcadores selecionáveis 25 são usados para facilitar identificação de células de planta transformadas.

Uma vez que o calo se forma, formação de broto pode ser encorajada pelo emprego dos hormônios de planta apropriados de acordo com métodos co- nhecidos, e os brotos são transferidos para meio de enraizamento para re- generação de pIantas.

As plantas podem então ser usadas para estabelecer 30 gerações repetitivas, ou de sementes, ou usando técnicas de propagação vegetativas.

As plantas transgênicas podem também ser geradas sem uso de culturas de tecido.

Também considerada parte desta invenção são pIantas transgê- nicas, células de árvores, levedura, bactéria, fungos, inseto e animal conten- do a construção de gene quimérico compreendendo um ácido nucleico que codifica HAO recombinante para produção de VLP, de acordo com a presen- 5 te invenção.

Os elementos regulatórios da presente invenção podem também ser combinados com região de codificação de interesse para expressão den- tro de uma faixa de organismos hospedeiros que são responsáveis pela transformação, ou expressão transiente.

Tais organismos incluem, mas não 10 estão limitados a, plantas, ambas monocots e dicots, por exemplo, mas não limitadas a, milho, plantas de cereal, trigo, cevada, aveia, Nicotiana spp, Brasslca spp, feijão-soja, feião, ervilha, alfafa, batata, tomate, ginsém, e A-

- rabidopsis.

Métodos para transformação estável e regeneração destes or- - 15 ganismos são estabelecidos na técnica e conhecidos a um versado na técni- " ca.

O método de obtenção de pIantas transformadas e regeneradas não é crítico para a presente invenção.

Por "transformação" é significativo a transferência específica es- tável de informação genética (sequência de nucleotídeo) que é manifestada 20 genotipicamente, fenotipicamente, ou ambas.

A transferência interespecífica de informação genética de uma construção quimérica para um hospedeiro pode ser herdada, e a transferência de informação genética considerada estável, ou a transferência pode ser transiente, e a transferência de informa- ção genética não é hereditária. 25 Pelo termo "material de planta", é significativo qualquer material derivado de uma planta.

A matéria de planta pode compreender uma planta total, tecido, células, ou qualquer fração dos mesmos.

Adicionalmente, a ma- téria de planta pode compreender componentes de planta intracelular, com- ponentes de planta extracelular, extratos liquidos ou sóIidos de plantas, ou 30 uma combinação dos mesmos.

Adicionalmente, o material de pianta pode compreender plantas, células de planta, tecido, um extrato líquido, ou uma combinação dos mesmos, de folhas de planta, caules, fruto, raízes, ou uma combinação dos mesmos. A matéria de planta pode compreender uma plan- ta ou porção da mesma que não tenha sido individualizada para quaisquer etapas de processamento. Contudo, é também contemplado que o material de pIanta possa ser individualizado para etapas de processamento mínimas 5 conforme definido abaixo, ou processamento mais rigoroso, incluindo purifi- cação de protelna parcial ou substancial usando técnicas comumente co- nhecidas dentro da técnica incluindo, mas não limitada a, cromatografia, ele- troforese e similares. Pelo termo "processamento mínimo" é significativo matéria de 10 planta, por exemplo, uma planta ou porção da mesma compreendendo uma proteina de interesse que é parcialmente purificada para produzir um extrato de planta, homogenato, homogenato de fração de planta, ou similares (isto é, minimamente processada). Purificação parcial pode compreender, mas

A não é limitado a, rompimento das estruturas celulares da planta criando, 15 desse modo, uma composição compreendendo componentes de planta so- - iúveis, e componentes de planta insolúveis que podem ser separados, por exemplo, mas não limitado a, por centrifugação, filtração, ou uma combina- ção das mesmas. Neste particular, proteínas secretadas dentro do espaço extracelular de folha ou outros tecidos podem ser prontamente obtidas u- 20 sando-se vácuo ou extração centrífuga, ou tecidos podem ser extraídos sob pressão por passagem através de rolos ou moagem ou similares para es- premer ou liberar a proteina livre de dentro do espaço extracelular. Proces- samento mínimo pode também envolver preparação de extratos brutos de proteínas solúveis, visto que estas preparações teriam contaminação razoá- 25 vel de produtos de planta secundários. Adicionalmente, processamento mí- nimo envolve extração aquosa de uma proteina solúvel de folhas, seguido por precipitação com qualquer sal adequado. Outros métodos podem incluir maceração de grande escala e extração de suco de modo a permitir o uso direto do extrato. 30 O material de planta, na forma de material de planta ou tecido pode ser oralmente distribuído a um individuo. A matéria de planta pode ser administrada como parte de um suplemento dietético, junto com outros ali-

mentos, ou encapsulados.

A matéria de planta ou tecido pode também ser concentrada para aperfeiçoar ou aumentar palatabilidade, ou provido com outros materiais, ingredientes, ou excipientes farmacêuticos, conforme re- querido. 5 Exemplos de um indivíduo ou organismo alvo que as VLPS da presente invenção podem ser administradas incluem, mas não estão limita- dos a, seres humanos, primatas, pássaros, aves de água, pássaros migrató- rios, codorniz, pato, gansos, animais domésticos, galinha, sulno, ovelha, e- quino, cavalo, camelo, canino, cães, felino, gatos, tigre, leopardo, gato da 10 algália, marta, marta da pedra, furões, animais domésticos, animais de fa- zenda, coelhos, camundongos, ratos, porquinhos da Índia, ou outros roedo- res, foca, baleia, e similares.

Tais organismos alvos são exemplares, e não

- são para serem considerados limitantes às aplicações e aos usos da presen- te invenção. 15 É contemplado que uma planta compreendendo a proteína de

- interesse, ou que expressa a VLP compreendendo a proteína de interesse, pode ser administrada a um indivíduo ou organismo-alvo, em uma variedade de modos, dependendo da necessidade e da situação.

Por exemplo, a prote- Ína de interesse obtida a partir da planta pode ser extraída antes de seu uso 20 na forma ou crua, parcialmente purificada, ou purificada.

Se a proteína é pa- ra ser purificada, então ela pode ser produzida em quaisquer plantas comes- tíveis ou não-comestiveis.

Além disso, se a proteína é oralmente administra- da, o tecido de planta pode ser coletado e alimentado diretamente ao indiví- duo, ou o tecido coletado pode ser secado antes da alimentação, ou um a- 25 nimal pode ser permitido pastar na planta com nenhuma coleta anterior ocor- rendo.

É também considerado dentro do escopo desta invenção os tecidos de planta coletados a serem providos como um suplemento de alimentação dentro da alimentação do animal.

Se o tecido de planta está sendo alimenta- do a um animal com pouco ou nenhum processamento adicional, é preferido 30 que o tecido de planta sendo administrado seja comestível.

Silenciamento de gene pós-transcricional (PTGS) pode ser en- volvido na expressão de limitação de transgenes em plantas, e coexpressão de um supressor de silenciamento a partir do vÍrus da batata Y (HcPro) pode ser usado para contra-agir a degradação específica de transgene mRNAs (Brigneti et al., 1998). Supressores alternados de silenciamento são bem- conhecidos na técnica e podem ser usados conforme descrito aqui (Chiba et 5 al., 2006, Virology 346:7-14; que é aqui incorporado por referência), por e- xemplo, mas não limitado a, TEV -pVHC-Pro (Tobacco etch vÍrus-pl/HC-Pro), BYV -p21, pl9 de vÍrus de evolução fechada de tomate (TBSV pl9), proteína de capsídeo de vÍrus de ruga de tomate (TCV -CP), 2b de VÍrus de mosaico de pepino; CMV-2b), p25 de vÍrus da batata X (PVX-p25), p11 de VÍrus da 10 batata M (PVM-pl 1), pi 1 de VÍrus da batata S (PVS-pl 1), p16 vÍrus de es- pécie de mirtilo, (BSCV -pl6), p23 de vÍrus de Citrus tristexa (CTV-p23), p24 de vÍrus-2 associado a folha de videira, (GLRaV-2 p24), plO de VÍrus A de videira, (GVA-plO), p14 de Vírus B de videira (GVB-p14), plO de Vírus laten- te de Heracleum (HLV-pIO), ou pl6 de VÍrus latente comum de Garlic(GCLV- . 15 pl6). Portanto, um supressor se silenciamento, por exemplo, mas não limita-

- do a, HcPro, TEV -pVHC-Pro, BYV-p21, TBSV pl9, TCV-CP, CMV-2b, PVX- p25, PVM-pll, PVS-pl 1, BScV-pl6, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV- plO, GCLV-pl6 ou GVA-plO, podem ser coexpressos junto com a sequência de ácido nucleico que codifica a protelna de interesse para assegurar adi- 20 cionalmente altos níveis de produção de proteína dentro de uma planta.

Além disso, VLPS podem ser produzidas que compreendem uma combinação de subtipos HA.

Por exemplo, VLPs podem compreender um ou mais do que uma HA a partir do subtipo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, HlO, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, ou uma combinação das mesmas.

A 25 seleção da combinação de HAS pode ser determinada pelo uso pretendido da vacina preparada a partir da VLP.

Por exemplo, uma vacina para uso na inoculação de pássaros pode compreender qualquer combinação de subtipo de HA, enquanto as VLPs úteis para inoculação de humanos pode compre- ender subtipos de um ou mais do que um dos subtipos Hl, H2, H3, H5. Con- 30 tudo, outras combinações de subtipo HA podem ser preparadas dependendo do uso da VLP.

De modo a produzir VLPS compreendendo combinações de subtipos de HA, o subtipo de HA desejado pode ser coexpresso dentro da mesma célula, por exemplo, uma célula de planta.

Além disso, VLPS produzidas conforme aqui descrito não com- preendem neuraminidase (NA). Contudo, NA pode ser coexpressa com HA com VLPS compreendendo HA e NA podem ser desejadas. 5 Portanto, a presente invenção adicionalmente inclui um vetor adequado compreendendo a construção quimérica adequada para uso com sistemas de expressão ou estável ou transiente.

A informação genética pode ser também provida dentro de uma ou mais do que uma construção.

Por e- xemplo, uma sequência de nucleotideo que codifica uma proteína de inte- IO resse pode ser introduzida em uma construção, e uma segunda sequência de nucleotídeo que codifica uma proteina que modifica glicosilação da prote- Ína de interesse pode ser introduzida usando-se uma construção separada.

Estas sequências de nucleotideos podem então ser coexpressas dentro de uma planta.

Contudo, uma construção compreendendo uma sequência de 15 nucleotídeo que codifica ambas a proteína de interesse e a proteína que " modifica perfil de glicosilação da proteína de interesse pode também ser u- sado.

Neste caso a sequência de nucleotídeo compreenderia uma primeira sequência compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de interesse operativamente Iigada a um promotor ou re- 20 gião regulatória, e uma segunda sequência compreende uma segunda se- quência de ácido nucleico que codifica a proteína que modifica o perfil de glicosilação da protelna de interesse, a segunda sequência operativamente ligada a um promotor ou região regulatória.

Por "coexpresso" é significativo que duas ou mais do que duas 25 sequências de nucleotídeos são expressas a cerca do mesmo tempo dentro da pIanta, e dentro do mesmo tecido da planta.

Contudo, as sequências de nucleotídeo não necessitam ser expressas exatamente ao mesmo tempo.

Preferivelmente, as duas ou mais sequências de nucleotídeo são expressas em uma maneira tal que os produtos codificados têm uma chance de intera- 30 girem.

Por exemplo, a proteína que modifica glicosilação da proteína de inte- resse pode ser expressa antes do ou durante o periodo quando a proteína de interesse é expressa de modo que modificação da glicosilação da protei-

na de interesse ocorre.

Duas ou mais do que duas sequências de nucleotí- deo podem ser coexpressas usando-se um sistema de expressão transiente, onde as duas ou mais sequências são introduzidas dentro da planta a cerca do mesmo tempo sob condições que ambas sequências são expressas.

Al- 5 ternativamente, uma planta de plataforma compreendendo uma das sequên- cias de nucleotídeo, por exemplo, a sequência que codifica a proteína que modifica o perfil de glicosilação da proteína de interesse, pode ser transfor- mada, ou transientemente, ou em uma maneira estável, com uma sequência adicional que codifica a proteína de interesse.

Neste caso, a sequência que 10 codifica a proteína que modifica o perfil de glicosilação da proteína de inte- resse pode ser expressa dentro do tecido desejado, durante um estágio de- sejado de desenvolvimento, ou sua expressão pode ser induzida usando-se um promotor induzível, e a sequência adicional que codifica a proteína de . interesse pode ser expressa sob condições similares e no mesmo tecido, 15 para assegurar que as sequências de nucleotídeo sejam coexpressas.

As construções da presente invenção podem ser introduzidas

, em células de planta usando os Ti plasmldeos, Ri plasmídeos, vetores de vÍrus de planta, transformação de DNA direta, microinjeção, eletroporação, etc.. Para revisões de tais técnicas, vide, por exemplo, Weissbach e Weiss- 20 bach, Métodos for P/ant Mo/ecu/ar Bio/ogy, Academy Press, Nova York Vlll, pp. 421-463 (1988); Geierson e Corey, P/ant Mo/ecu/ar Bio/ogy, 2d Ed. (1988); e Miki e lyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. ln P/ant Me- tabo/ism, 2d Ed.

DT.

Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Ad- dison Wesly, Langmans Ltd.

London, pp. 561-579 (1997). Outros métodos 25 incluem entendimento de DNA direto, o uso de lipossomos, eletroporação, por exemplo, usando protoplastos, microinjeção, microprojéteis ou "whis- kers", e infiltração de vácuo.

Vide, por exemplo, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol.

Gen.

Genet. 228: 104-112, 1991), Guer- che et al. (PIanta Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor.

Appl 30 Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), De8lock et al., Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Métodos for Plant Mole-

cular Biology (Weissbach e Weissbach, eds., Academic Press lnc., 1988), Métodos in Plant Molecular Biology (Schuler e Zielinski, eds., Academic Press lnc., 1989), Liu e Lomonossoff (J.

Virol Meth, 105:343-348, 2002,), Patentes dos Estados Unidos N°s 4.945.050; 5.036.006; e 5.100.792, pedido 5 de patente dos Estados Unidos N°s de Série 08/438.666, depositado em 10 de maio de 1995, e 07/951.715, depositado em 25 de setembro de 1992, (todas das quais são aqui incorporadas por referência). Métodos de expressão transiente podem ser usados para ex- pressar as construções da presente invenção (vide, Liu e Lomonossoff, 10 2002, Journal of Virological Métodos, 105:343-348; que é aqui incorporado por referência). Alternativamente, um método de expressão transiente base- ado em vácuo, conforme descrito por Kapila et al. 1997 (aqui incorporado por referência) pode ser usado.

Estes métodos podem incluir, por exemplo, mas não estão limitados a, um método de Agroinoculação ou Agroinfiltração, . 15 contudo, outros métodos transientes podem também ser usados conforme - notado acima.

Com ou Agroinoculação ou Agroinfiltração, uma mistura de

. Agrobacter/a compreendendo o ácido nucleico desejado entra nos espaços intercelulares de um tecido, por exemplo, as folhas, porção aérea da planta (incluindo caule, folhas e flor), outra porção da planta (caule, raiz, flor), ou a 20 planta total.

Após cruzamento da epiderme, o Agrobacter/um infecta e trans- fere cópias de t-DNA nas células.

O t-DNA é epissomalmente transcrito e o mRNA transladado, conduzindo a produção da proteína de interesse em cé- lulas infectadas; contudo, a passagem de t-DNA dentro do núcleo é transien- te. 25 Se a sequência de nucleotídeo de interesse codifica um produto que é diretamente ou indiretamente tóxico para a planta, então pelo uso do método da presente invenção, tal toxicidade pode ser reduzida através de toda a planta por expressão seletivamente da sequência de interesse de nu- cleotídeo dentro de um tecido desejado ou em um estágio desejado de de- 30 senvolvimento de planta.

Em adição, o período limitado de expressão resul- tante da expressão transiente pode reduzir o efeito quando se produz um produto tóxico na planta.

Um promotor induzível, um promotor especlfico de tecido, ou um promotor específico de célula, podem ser usados para direcio- nar seletivamente expressão da sequência de interesse. As VLPS de HA recombinantes da presente invenção podem ser usadas em conjunto com as vacinas da gripe existentes, para suplementar 5 as vacinas, torná-las mais eficazes, e para reduzir as dosagens de adminis- tração necessárias. Conforme seria conhecido por um versado na técnica, a vacina pode ser direcionada contra um ou mais do que um vírus da gripe. Exemplos de vacinas adequadas incluem, mas não estão limitados a, aque- las comercialmente disponiveis de Sanofi-Pasteur, ID Biomedical, Merial, 10 Sinovac,Chiron, Roche, Medlmmune, GlaxoSmithKline, Novartis, Sanofi- Aventis, Serono, Shire Pharmaceuticals, e similares. Se desejado, as VLPs da presente invenção podem ser mistura- - das com um adjuvante adequado conforme seria conhecido um versado na técnica. Além disso, a VLP pode ser usada em uma composição de vacina 15 compreendendo uma dose efetiva da VLP para o tratamento de um orga- . nismo alvo, conforme descrito acima. Além disso, a VLP produzida de acor- . do com a presente invenção pode ser combinada com VLPS obtidas usando proteínas de gripe diferentes, por exemplo, neuraminidase (NA). Portanto, a presente invenção proporciona um método para in- 20 dução de imunidade a infecção de vÍrus da gripe em um animal ou organis- mo alvo compreendendo administrar uma dose efetiva de uma vacina com- preendendo um ou mais do que uma VLP. A vacina pode ser administrada oralmente, intradermalmente, intranasalmente, intramuscularmente, intrape- ritonealmente, intravenosamente, ou subcutaneamente. A administração de 25 VLPS produzidas de acordo com a presente invenção é descrita no Exemplo

6. A administração de uma H5 VLP produzida de planta resulta em uma res- posta significantemente mais alta quando comparada a administração de HA solúvel (vide Figuras 21A e 21B). Conforme mostrado nas Figuras 26A e 26B, um indivíduo admi- 30 nistrado com A/lndonésia/5/05 H5 VLPs proporciona proteção cruzada a um desafio com gripe A/Peru/582/06 (H5N1; "Peru H5N1"). A administração de lndonésia H5 VLPs antes do desafio não resulta em qualquer perda de mas-

sa de corpo.

Contudo, em indivíduo não administrado com H5VLPS, mas desafiado com Turkey H5N1, exibe perda significante de massa de corpo, e vários indivíduos morrem.

Estes dados, portanto, demonstram que VLPS da gripe produzi- , 5 das de planta compreendendo a proteina viral de H5 hemaglutinina induz uma resposta imune cspeclfica para cepas da gripe patogênicas, e que par- tículas similares a virus podem se originar a partir de uma membrana de plasma de planta.

Portanto, a presente invenção proporciona uma composição 10 compreendendo uma dose efetiva de uma VLP compreendendo uma proteí- na de HA de vÍrus da gripe, um ou mais do que um lipídeo de planta, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

A proteína HA de vÍrus da gripe

- pode ser H5 Indonésia/5/2006. Também é proporcionado um método de in- dução de imunidade para uma infecção de vÍrus da gripe em um indivíduo.

O - 15 método compreendendo administrar a partícula similar a vÍrus compreen- " dendo uma proteína HA de vÍrus da gripe, um ou mais lipldeo de planta, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

A partícula similar a vírus pode ser administrada a um indivíduo oralmente, intradermalmente, intrana- salmente, intramuscularmente, intraperitonealmente, intravenosamente, ou 20 subcutaneamente.

Composições de acordo com várias concretizações da invenção podem compreender VLPS de duas ou mais cepas da gripe ou subtipos. "Duas ou mais" refere-se a duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10 ou mais cepas ou subtipos.

As cepas ou subtipos representadas podem ser 25 de um subtipo simples (por exemplo, toda H1N1, ou toda H5N1), ou podem ser uma combinação de subtipos.

Subtipo e cepas exemplares incluem, mas não estão limitados a, aqueles aqui descritos (por exemplo, A/Nova Caledô- nia/20/99 (H1N1)A/lndonésia/5/2006 (H5N1), A/galinha/Nova York/1995, A/pato silvestre /DE/677/88 (H2 N8), A/Texas/32/2003, A/pato silvestre do 30 hemisfério norte/MN/33/00, A/pato/Shanghai/1/2000, A/rabijunco do nor- te/TX/828189/02, A/Peru/Ontario/6118/68(H8N4), A/shoveler/lrã/G54/03, A/galinha/Alemanha/N/1949(H10N7), A/pato/lnglaterra/56(H11 N6),

A/pato/Alberta/60/76(H12N5), A/Pato silvestre /Maryland/704/77(H13N6), NPato silvestre do hemisfério norte/Gurjev/263/82, A/pato/Austrália/341/83 (H15N8), Npato silvestre de cabeça preta/Suécia/5/99(H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburg/66, A/Porto Rico/8/34 (H1N1), N8risbane/59/2007 (H1N1), 5 A/llhas Salomão 3/2006 (H1N1), A/8risbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006, NSingapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnã/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong-kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong-kong/1073/99 (H9N2)). 10 A escolha de combinação de cepas e subtipos pode depender da área geográfica dos indivíduos provavelmente para serem expostos a gripe, proximidade de espécies de animal a uma população humana a ser

- imunizada (por exemplo, espécies de ave aquática, animais agrícolas tal como suino, etc.) e as cepas que eles conduzem, são expostas a ou são >

15 provavelmente para serem expostos a prognósticos de subtipos antigênicos . dentro de subtipos ou cepas, ou combinações destes fatores.

Exemplos de

. combinações usadas nos anos passados são disponlveis (vide URL: who.int/csr/doença/gripe/vacina recomendações l/en). Algumas ou todas destas cepas podem ser empregadas nas 20 combinações mostradas, ou em outras combinações, na produção de uma composição de vacina.

Mais particularmente, combinações exemplares podem incluir VLPS de duas ou mais cepas ou subtipos selecionados a partir do grupo compreendendo: A/8risbane/59/2007 (H1N1), um vÍrus similar a 25 A/8risbane/59/2007 (H1N1), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), um vírus similar a A/8risbane/10/2007 (H3N2), B/Flórida/4/2006 ou um vÍrus similar a B/Flórida/4/2006. Outra combinação exemplar pode incluir VLPS de duas ou mais cepas ou subtipos selecionados a partir do grupo compreendendo 30 A/lndonésia/5/2005, um vÍrus similar a Nlndonésia/5/2005, A/Vietnã/1194/2004, um vÍrus similar a A/Vietnã/1194/2004, A/Anhui/1/05, um vÍrus similar a A/Anhui/l/05, A/ganso/Guiyang/337/2006, vÍrus similar a

Nganso/Guiyang/337/2006, A/galinha/Shanxi/2/2006, ou um vÍrus similar a Ngalinha/Shanxi/2/2006. Outra combinação exemplar pode incluir VLPs de A/Galinha/ltália/13474/99 (H7 tipo) ou cepas de gripe de A/Galinha/8ritish Columbia/04 (H7N3). 5 Outra combinação exemplar pode incluir VLPS de NGalinha/Hong-kong/G9/97 ou NHong-kong/1073/99. Outra combinação exemplar pode compreender VLPS de Ajllhas Salomão/3/2006. Outra com- binação exemplar pode compreender VLPs de A/8risbane/10/2007. Outra combinação exemplar pode compreender VLPS de A/Wisconsin/67/2005. 10 Outra combinação exemplar pode compreender VLPS das cepas ou subtipos 8/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006 ou B/8risbane/3/2007. As duas ou mais VLPs podem ser expressas individualmente, e

- as VLPS purificadas ou semipurificadas subsequentemente combinadas.

Al- ternadamente, as VLPS podem ser coexpressas no mesmo hospedeiro, por 15 exemplo, uma planta.

As VLPS podem ser combinadas ou produzidas em uma proporção desejada, por exemplo, cerca de proporções equivalentes,

. ou podem ser combinadas de tal maneira que um subtipo ou cepa compre- ende a maioria das VLPS na composição.

Portanto, a invenção proporciona composições compreendendo 20 VLPS de duas ou mais cepas ou subtipos.

VLPS de vírus envelopados geralmente adquirem seu envelope a partir da membrana que elas originam.

As membranas de plasma de plan- ta têm um complemento de fitosterol que pode ter efeitos imunoestimulató- rios.

Para investigar esta possibilidade, VLPS H5 produzidas de planta foram 25 administradas em animais na presença ou ausência de um adjuvante, e a HAI (resposta de anticorpo de inibição de hemaglutinação) determinada (Fi- guras 22A, 22B). Na ausência de VLPs H5 produzidas de pIanta adicionadas de adjuvante demonstra uma HAI significante, indicativa de uma resposta imune sistêmica para administração do antígeno.

Além disso, os perfis de 30 isotipo de anticorpo de VLPS administradas na presença ou ausência de ad- juvante são similares (Figura 23 A). A Tabela 5 Iista sequências providas em várias concretizações da invenção.

Tabela 5: Descrição de sequência para identificadores de sequência.

SEQ ID No Descrição da Sequência Na Revelação 1 Terminal-N Hl fragmento I Figura 5 a 2 Terminal-C Hl fragmento i Figura 5b 3 H5 sequência de codificação I Figura 6 4 iniciador Plato-443c Figura 7a 5 iniciador SpHA(lnd)-Plasto.r Figura 7b iniciador Plasto-SpHA(lnd).c.

Figura 7c 7 iniciador HA(lnd)-Sac.r Figura 7d 8 Sequência do cassete de expressão —.,.— Figura 1 baseado em alfafa plastocianina usa- do para a expressão de Hl 9 HAI sequência de peptídeo (A/Nova Figura 8a Caledônia/20/99) 10 HA5 sequência de peptídeo Figura 8b (A/lndonésia/5/2006) 11 Gripe A Subtipo H7 sequência de co- Figura 9 dificação (A/galinha/Nova York/l 995) 12 Gripe A Subtipo H2 sequência de co- Figura lOa dificação (A/pato silvestre de aren- que/DE/677/88 (H2N8)) 13 Gripe A Subtipo H3 sequência de co- Figura lOb dificação (A/Texas/32/2003) 14 Gripe A Subtipo H4 sequência de co- Figura lOc dificação (Npato silvestre do hemisfé- rio norte/MN/33/00) 15 Gripe A Subtipo H5 sequência de co- Figura lOd dificação (A/pato/Shanghai/1/2000) 16 Gripe A Subtipo H6 sequência de co- Figura lOe dificação (Nrabijunco do nor- te/TX/828189/02) 17 Gripe A Subtipo H8 sequência de co- Figura lOf dificação (A/Peru/Ontario/6118/68(H8N4)) 18 Gripe A Subtipo H9 sequência de co- Figura lOg dificação (A/shoveler/lrã/G54/03)

SEQIDNO I Descrição da Sequência Na Revelação 19 I Gripe A Subtipo HlO sequência de Figura lOh codificação |(A/ga|inha/A|emanha/N/1949(HiON 7)) 20 I Gripe A Subtipo Hll sequência de co- Figura lOi dificação (A/pato/lnglaterra/56(H11N6)) 21 jgripe a Subtipo Hl2 sequência de co- Figura loj dificação (A/pato/Alberta/60/76(H 12N5)) 22 I Gripe A Subtipo Hl3 sequência de co- Figura lOk dificação (NPato silvestre /Maryland/704/77(H13N6) ) 23 i Gripe A Subtipo H14 sequência de Figura 101 I codificação (NPato silvestre do he- misfério norte/Gurjev/263/82) 24 I Gripe A Subtipo Hl5 sequência de co- Figura lOm l dificação (A/pato/Austrália/341/83 (h15n8)) 25 I Gripe A Subtipo H16 sequência de co- Figura 1On l dificação (A/pato silvestre de cabeça preta/Suécia/5/99(H16N3)) 26 I Gripe B HA sequência de codificação Figura 10o (8/Lee/40) 27 I Gripe C HA sequência de codificação Figura lOp (C/Johannesburg/66) 28 i Completa HAO Hl sequência Figura 5c 29 I lniciador Xmal-pPlas.c Figura lOq 30 I lniciador Sacl-ATG-pplas.r Figura lOr 31 lniciador Sacl-PlasTer.c Figura lOs 32 lniciador EcoRI-PlasTer.r Figura lOt 33 I A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1) Figura 16 Gen8ank Accession No.

AY289929 34 M.

Sativa proteina disulfide isomerase Figura 17 Gen8ank Accession No.

Z11499 35 I N.Porto Rico/8/34 (H1N1) Gen8ank Figura 18 Accession No.

NC _002016.1

SEQIDNO I Descrição da Sequência I Na Revelação 36 I CIone 774: DNA de Dralll a Sacl com- I Figura 28 preendendo região regulatória de ) plastocianina operativamente ligada a I isequência que codifica HA de 59/2007j (H1N1) 37 i Clone 775: DNA de Dralll a Sacl com- I Figura 29 preendendo região regulatória de I plastocianina operativamente ligada a I I sequência que codifica HA de Nllhas I Salomão 3/2006 (H1N1) 38 | Clone 776: DNA de Dralll a Sacl com- I Figura 30 preendendo região regulatória de ) plastocianina operativamente ligada a I sequência que codifica HA de A/8risbane 10/2007 (H3N2) 39 I Clone 777: DNA de Dralll a Sacl com- I Figura 31 preendendo região regulatória de ) plastocianina operativamente ligada a I sequência que codifica HA de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) 40 I Clone 778: DNA de Dralll a Sacl com- I Figura 32 preendendo região regulatória de ) plastocianina operativamente ligada a I sequência que codifica HA de B/Malásia/2506/2004 41 Clone 779: DNA de Dralll a Sacl com- Figura 33 preendendo região regulatória de I plastocianina operativamente ligada a I sequência que codifica HA de B/Flórida/4/2006 42 Clone 780: DNA de Dralll a Sacl com- Figura 34 preendendo região regulatória de i plastocianina operativamente ligada a I sequência que codifica HA de A/Singapura/1/57 (H2N2)

SEQIDNO I Descrição da Sequência Na Revelação 43 I Clone 781: DNA de Dralll a Sacl com- Figura 35 preendendo região regulatória de i plastocianina operativamente ligada a sequência que codifica HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) 44 | Clone 782: DNA de Dralll aSacl com- Figura 36 preendendo região regulatória de I plastocianina operativamente ligada a sequência que codifica HA de A/Vietnã/1194/2004 (H5N1) 45 I Clone 783: DNA de Dralll a Sacl com- Figura 37 preendendo região regulatória de ) plastocianina operativamente ligada a l sequência que codifica HA de A Cer- »

ceta/Hong-kong/W312/97 (H6N1) 46 I CIone 784: DNA de Dralll a Sacl com- Figura 38 preendendo região regulatória de i plastocianina operativamente ligada a sequência que codifica HA de A/Equino/Praga/56 (H7N7) 47 i Clone 785: DNA de Dralll a Sacl com- Figura 39 preendendo região regulatória de I plastocianina operativamente ligada a sequência que codifica HA de A/Hong-kong/107 3/99 (H9N2) 48 I Clone 74 Sequência de aminoácido Figura 40A I de HA A/8risbane/59/2007 (H1N1) 49 I Clone 775 HA sequência de aminoá- Figura 40B ! cido Nllhas Salomão 3/2006 (H1N1) 50 I Clone 776 HA sequência de aminoá- Figura 41A cido N8risbane 10/2007 (H3N2) 51 I Clone 777 HA sequência de aminoá- Figura 4 IB l cido A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) 52 I Clone 778 HA sequência de aminoá- Figura 42A cido B/Malásia/2506/2004 53 Clone 779 HA sequência de aminoá- Figura 42B cido B/Flórida/4/2006

SEQIDNO I Descrição da Sequência Na Revelação 54 l Clone 780 HA sequência de aminoá- Figura 43A cido /Singapura/1/57 (H2N2) 55 I Clone 781 HA sequência de aminoá- Figura 43 B cido A/Anhui/1/2005 (H5N1) 56 i Clone 782 HA sequência de aminoá- Figura 44A cido A/Vietnã/1194/2004 (H5N1) 57 | CIone 783 HA sequência de aminoá- Figura 44B l cido A/Cerceta/Hong-kong/W312/97 (H6N1) 58 l Clone 784 HA sequência de aminoá- Figura 45A cido A/Equino/Praga/56 (H7N7) 59 : Clone 785 HA sequência de aminoá- Figura 45B l cido A/Hong-kong/1073/99 (H9N2) 60 I HA cassete de expressão compreen- Figura 51 l dendo promotor de alfafa plastociani- jna e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de H5 de I A/lndonésia/5/2005 (Construção # | 660), alfafa plastocianina 3' UTR e sequências terminadoras —'--·--- 61 I HA cassete de expressão compreen- Figura 52 dendo promotor de alfafa plastociani- | na e 5' UTR, hemaglutinina sequência i de codificação of Hl de A/Nova Cale- l dônia/20/1999 (Construção # 540) , I alfafa plastocianina 3' UTR e sequên- cias terminadoras 62 HA cassete de expressão compreen- Figura 53 l dendo promotor de alfafa plastociani- jna e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de Hl de N8risbane/59/2007 (construção l #774), alfafa plastocianina 3' UTR e sequências terminadoras

SEQIDNO I Descrição da Sequência I Na Revelação 63 l HA cassete de expressão compreen- : Figura 54 l dendo promotor de alfafa plastociani- i |na e 5' UTR, sequência de codificaçãoj I de hemaglutinina de Hl de Nllhas I I Salomão/3/2006 (Hl Nl) (construção ) l #775), alfafa plastocianina 3' UTR e i sequências terminadoras 64 HA cassete de expressão compreen- Figura 55 I dendo promotor de alfafa plastociani- I |na e 5' UTR, sequência de codificaçãoj de hemaglutinina de H2 de i A/Singapura/1/57 (H2N2) (construção I I # 780), alfafa plastocianina 3' UTR e I sequências terminadoras 65 HA cassete de expressão compreen- Figura 56 I dendo promotor de alfafa plastociani- I |na e 5' UTR, sequência de codificaçãoj de hemaglutinina de H5 de I A/Anhui/1/2005 (H5N1) (Construção* i I 781), alfafa plastocianina 3' UTR e I sequências terminadoras —·' 66 l HA cassete de expressão compreen- I Figura 57 I dendo promotor de alfafa plastociani- I |na e 5' UTR, sequência de codificaçãoj de hemaglutinina de H5 de ) A/Vietnã/1194/2004 (H5N1) (Constru- I ção # 782), alfafa plastocianina 3' UTR e sequências terminadoras 67 HA cassete de expressão compreen- Figura 58 i dendo promotor de alfafa plastociani- I jna e 5' UTR, sequência de codificaçãoj de hemaglutinina de H6 de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 I (H6N1) (Construção # 783), alfafa I I plastocianina 3' UTR e sequências I terminadoras

SEQIDNo : Descrição da Sequência I Na Revelação 68 | HA cassete de expressão compreen- I Figura 59 : dendo promotor de alfafa plastociani- i |na e 5' UTR, sequência de codificação| I de hemaglutinina de H9 de A/Hong I I Kong/1073/99 (H9N2) (Construção I ) #785), alfafa plastocianina 3' UTR e i terminador de sequências 69 HA cassete de expressão compreen- Figura 60 ) dendo promotor de alfafa plastociani- I |na e 5' UTR, sequência de codificaçãoj de hemaglutinina de H3 de l A/8risbane/10/2007 (H3N2), alfafa | I plastocianina 3' UTR e sequências I terminadoras 70 HA cassete de expressão compreen- Figura 61 I dendo promotor de alfafa plastociani- I |na e 5' UTR, sequência de codificaçãoj de hemaglutinina de H3 de I A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), alfafa | I plastocianina 3' UTR e sequências I terminadoras 71 HA cassete de expressão compreen- Figura 62 I dendo promotor de alfafa plastociani- I jna e 5' UTR, sequência de codificaçãoj de hemaglutinina de H7 de NEquino/Praga/56 (H7N7), alfafa l plastocianina 3' UTR e sequências I terminadoras 72 HA cassete de expressão compreen- Figura 63 - I dendo promotor de alfafa plastociani- I prognóstico |na e 5' UTR, sequência de codificaçãoj de hemaglutinina de HA de I B/Malásia/250672004, alfafa pIastoci- i janina 3' UTR e sequências terminado-j ras

SEQIDNO ) Descrição da Sequência | Na Revelação 73 i HA cassete de expressão compreen- I Figura 64 I dendo promotor de alfafa plastociani- I |na e 5' UTR, sequência de codificaçãoj de hemaglutinina de HA de I B/FIórida/4/2006, alfafa plastocianina | I 3' UTR e sequências terminadoras | 74 jconsenso de seq id no: 49,48, 33 e| Figura 65 9 75 Sequência de aminoácido de Hl Nova Figura 67 I Caledônia (AAP34324.1) codificada I porSEQ ID NO: 33 76 Sequência de aminoácido de Hl Porto Figura 68 : Rico (NC _ 0409878.1) codificada por i SEQ ID NO: 35 A invenção será agora descrita em detalhes por meio de refe- rência somente aos seguintes exemplos não-limitativos. Métodos e Materiais

1. Conjunto de cassetes de expressão " 5 Todas as manipulações foram feitas usando os protocolos de biologia molecular gerais de Sambrook e Russell (2001; que é aqui incorpo- rado por referência). A primeira etapa de clonagem consiste na montagem de um plasmídeo receptor contendo elementos regulatórios a montante e a jusante do gene de alfafa pIastocianina. O promotor de plastocianina e 10 5'UTR sequências foram amplificados de DNA genômico de alfafa usando iniciadores de oligonucleotÍdeo Xmal-pPlas.c (SEQ ID NO: 29; Figura IOQ) e Sacl-ATG-pPlas.r (SEQ ID NO: 30; Figura IOR). O produto de amplificação resultante foi digerido com Xmal e Sacl e ligado em pCAMBIA2300 (Cambia, Canberra, Austrália), previamente digerido com as mesmas enzimas, para 15 criar pCAMBIApromo PIasto. Similarmente, as 3'UTR sequências e termina- dor do gene de plastocianina foram amplificados de DNA genômico de alfafa usando os seguintes iniciadores: Sacl-Plas7er.c (SEQ ID NO: 31; Figura lOS) e EcoRl-PlasTer.r (SEQ ID NO: 32; Figura IOT), e o produto foi digeri- do com Sacl e EcoRI antes de ser inserido nos mesmos locais de pCAMBI- 20 ApromoPlasto para criar pCAMBIAPlasto.

A estrutura de leitura aberta do H1 gene de cepa de Gripe A/Nova Caledônia/20/99 (Hl Nl) foi sintetizada em dois fragmentos (Planta Biotechnology lnstitute, National Research Council, Saskatoon, Canada). Um primeiro fragmento sintetizado corresponde a sequência de codificação Hl 5 tipo selvagem (Gen8ank ace. No. AY289929; SEQ ID NO: 33; Figura 16) carecendo de sequência de codificação de peptideo de sinal na 5' extremi- dade e a sequência de codificação de dominio de transmembrana na 3'extremidade. Um local de restrição Bglll foi adicionado na 5' extremidade da sequência de codificação e um local dual Sacl/Stul foi adicionado imedia- lO tamente a jusante do códon de parada na 3' extremidade de terminal do fragmento, para produzir SEQ ID NO: 1 (Figura 5A). Um segundo fragmento que codifica a extremidade de terminal C da Hl proteína (compreendendo - um domínio de transmembrana e cauda citoplásmica) a partir do local Kpnl para o códon de parada, e flanqueada em 3' por locais de restrição Sacl e 15 Stul foi também sintetizada (SEQ ID NO. 2; Figura 5B). O primeiro Hl fragmento foi digerido com Bglll e Sacl e clonado nos mesmos locais de um vetor binário (pCAMBIAPlasto) contendo o promo- tor de plastocianina e 5'UTR fundido ao peptídeo de sina! de gene de alfafa proteína dissulfeto isomerase (PDl) (nucleotídeos 32-103; Accession No. 20 Z11499; SEQ ID NO: 34; Figura 17) resultando em um gene quimérico PDl- Hl a jusante dos elementos regulatórios de plastocianina. A sequência do cassete baseado em plastocianina contendo o peptideo de sinal PDl é apre- sentada na Figura 1 (SEQ ID NO:8). O pIasmídeo resultante contém região de codificação Hl fundida ao peptídeo de sinal PDl e flanqueada pelos ele- 25 mentos regulatórios de plastocianina. A adição da região de codificação de extremidade de terminal C (que codifica o domínio de transmembrana e a cauda citoplásmica) foi obtida por inserção do fragmento sintetizado (SEQ ID NO: 2; Figura 5B) previamente digerida com Kpnl e Sacl, no plasmideo de expressão H1. O plasmídeo resultante, denominado 540, é apresentado na 30 Figura 11 (também vide Figura 2A).

2. Conjunto de cassete de expressão de H5 Um fragmento que codifica hemaglutinina de cepa de Gripe

A/lndonésia/5/05 (H5N1; Ace.

No.

LANLISDN125873) foi sintetizado por E- poch Biolabs (Sugar Land, TX, USA). O fragmento produzido, contendo a região de codificação completa de H5 incluindo o peptídeo de sinal nativo flanqueado por um local Hindlll imediatamente a montante do ATG inicial, e 5 um local Sacl imediatamente a jusante do códon de parada (TAA), é apre- sentado em SEQ ID NO: 3 (Figura 6). A região de codificação H5 foi clonada em um cassete de expressão baseado em pIastocianina pelo método de li- gação baseado em PCR apresentado em Darveau et al. (1995). Brevemen- te, uma primeira amplificação de PCR foi obtida usando iniciadores PIato- lO 443C (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) e SpHA(lnd)-Plasto.r (SEQ ID NO:5; Figura 7B) e pCAMBIA promoPlasto como gabarito.

Em paralelo, uma segunda amplificação foi realizada com iniciadores Plasto-SpHA(lnd).c (SEQ ID NO:

- 6; Figura 7C) e HA(lnd)-Sac.r (SEQ ID NO:7; Figura 7D) com fragmento de codificação de H5 como gabarito.

A amplificação obtida de ambas reações 15 foram misturadas e a mistura serviu como gabarito para uma terceira reação (reação de agrupamento) usando Plato-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) e HA(lnd)-Sac.r (SEQ ID NO: 7; Figura 7D) como iniciadores.

O fragmento re- . sultante foi digerido com BamHl (no promotor de plastocianina) e Sacl (na 3'extremidade do fragmento) e clonado em pCAMBIAPlasto previamente 20 digerido com as mesmas enzimas.

O plasmídeo resultante, denominado 660, é apresentado na figura 2B (também vide Figura 11). O cassete que codifica a forma solúvel de Hl foi preparado por substituição da região que codifica o domínio de transmembrana e a cauda citoplásmica no 540 por um fragmento que codifica o zipper de leucina zip- 25 per GCN4 p11 variante (Harbury et al., 1993, Science 1993; 262: 1401- 1407). Este fragmento foi sintetizado com flanqueamento de locais de Kpnl e Sacl para facilitar clonagem.

O plasmídeo resultante desta substituição foi denominado 544 e o cassete de expressão é ilustrado na figura 11. Uma fusão entre o vÍrus etch de tabaco (TEV)5'UTR e a estrutu- 30 ra de leitura aberta do gene da Gripe A/PR/8/34 MI (Ace. # NC _002016) foi sintetizada com um flanqueamento de local Sacl adicionado a jusante do códon de parada.

O fragmento foi digerido com Swal (no TEV 5'UTR) e Sacl,

e clonado em um cassete de expressão baseado em 2X35S/TEV em um plasmídeo binário pCAMBIA. O plasmídeo resultante perfura a região de co- dificação Ml sob o controle de um promotor 2X35S/TEV e 5'UTR e o termi- nador NOS (construção 750; figura 11). 5 Uma construção HcPro (35HcPro) foi preparada conforme des- crito em Hamilton et al. (2002). Todos os clones foram sequenciados para confirmar a integridade das construções. Os plasmldeos foram usados para transformar Agrobacteium tumefaciens (AGLI; ATCC, Manassas, VA 20108, USA) por eletroporação 10 (Mattanovich et al., 1989). A integridade de todos as cepas A. tumefaciens foi confirmada por mapeamento de restrição.

3. Preparação de biomassa de planta, inoculum, aqroinfiltração, e coleta P/antas de Nicotiana benthamiana ou Nicotiana tabacum foram ^ crescidas de sementes em superfícies planas preenchidas com um substrato 15 de musgo de turfa comercial. As plantas foram permitidas crescerem na es- tufa sob um fotoperíodo 16/8 e um regime de temperatura de 25°C dia/20°C noite. Três semanas após semeadura, as plantinhas individuais foram cap- . tadas, transplantadas em potes e deixadas crescerem na estufa por três se- manas adicionais sob as mesmas condições ambientais. Antes da transfor- 20 mação, mudas apicais e axilares foram removidas em vários momentos con- forme indicado abaixo, ou por aperto das mudas a partir da planta, ou por tratamento químico da planta. Agrobacteria transfectada com construções 660, 540, 544, 750 ou 35SHcPro foram crescidas em um meio YEB suplementado com ácido 2- 25 [N-morfolino]etanosulfônico a 10 mM (MES), acetosiringone a 20 µM, 50 µg/ml de kanamicina e 25 µg/ml de carbenicillin p H 5,6 até eles alcançarem um OD600 entre 0,6 e 1,6. Suspensões de Agrobacterium foram centrifuga- das antes de uso e ressuspensas em meio de infiltração (MgC|2 a 10 mM e MES a 10 mM pH 5,6). lnfiltração em seringa foi realizada conforme descrito 30 por Liu e Lomonossoff (2002, Journal of Viro/ogica/ Métodos, 105:343-348). Para infiltração de vácuo, suspensões de A. tumefaciens foram centrifuga- das, ressuspensas no meio de infiltração e armazenadas durante a noite a

4°C. No dia de infiltração, as bateladas de cultura foram diluldas em 2,5 vo- lumes de cultura e permitidas aquecer antes de uso. As plantas totais de N. benthamiana ou N. tabacum foram coIocadas de cabeça para baixo na sus- pensão bacterial em um tanque de aço inoxidável hermético a ar sob um 5 vácuo de 2,67 kPa a 5,14 kPa (20-40 Torr) por 2 min. Em seguida a infiltra- ção de seringa ou vácuo, as plantas foram retornadas para a estufa por 4 a 5 dias de período de incubação até coleta.

4. Amostraqem de folha e extração de proteina total Em seguida à incubação, a parte aérea das plantas foi coletada, 10 congelada a -80°C, trituradas em peças. As proteínas solúveis totais foram extraldas por homogeneização (Polytron) cada amostra de material triturado congelado de material de planta em 3 volumes de frio 50 mM de Tris pH 7,4, . NaCl a 0,15 M, e fluoreto de fenilmetanossulfonila a 1 mM. Após homoge- neização, as pastas fluidas foram centrifugadas a 20.000 g por 20 min a 4'C 15 e estes extratos brutos clareados (sobrenadante) mantidos para análise. O teor de proteína total de extratos brutos cIareados foi determinado por ensaio

V de Bradford (81o-Rad, Hercules, CA) usando albumina de soro bovino como o padrão de referência.

5. Cromatoqrafia de exclusão de tamanho de extrato de proteína 20 Gotas de alta resolução de colunas de cromatografia de exclu- são de tamanho (SEC) de 32 ml Sephacryl" S-500 (S-500 HR : GE Health- care, Uppsala, Suécia, Cat. No- 17-0613-10) foram acondicionadas e equili- bradas tampão de equilibrio/eluição (Tris a 50 mM pH8, NaCl a 150 mM). Um mililitro e meio de extrato de proteína bruto foi carregado na coluna, se- 25 guido por uma etapa de eluição com 45 ml de tampão de equihbrio/eluição. A eluição foi coletada em frações de 1,5 ml de teor relativo de protelna de frações eluídas foi monitorado por mistura de 10 µL da fração com 200 µL de reagente de corante de proteína 81o-Rad diluído (81o-Rad, Hercules, CA). A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de NaOH 0,2 N, seguido por 10 30 volumes de coluna de Tris a 50 mM pH8, NaCl a 150 mM, 20% de etanol. Cada separação foi seguida por uma calibração da coluna com Blue Dextran 2000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, USA). Os perfis de eluição de Blue Dextran 2000 e proteínas solúveis hospedeiras foram com- parados entre cada separação para assegurar uniformidade dos perfis de 1 eluição entre as colunas usadas.

6. Análise de Proteína e "lmunoblottinq" 5 As concentrações da proteina foram determinadas pelo ensaio de proteína BCA (Pierce Biochemicals, Rockport IL). As proteínas foram se- paradas por SDS-PAGE sob condições de redução e manchadas com Coo- massie Blue. Os géis manchados foram escaneados e análise de densitome- tria realizada usando-se lmagej Software (NIH). 10 As protelnas de fração de eluição de SEC foram precipitadas com acetona (Bollag et al., 1996), ressuspensas em 1/5 voIume em tampão de equihbrio/eluição e separadas por SDS-PAGE sob condições de redução . e eletrotransferidas em membranas de poIivinileno difluoreto (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para imunodetecção. Antes de 15 imunoblotting, as membranas foram bloqueadas com 5°/, de leite escumado " e 0,1°/o de Tween-20 em solução salina Tris-tamponada (TBS-T) por 16-18 V horas a 4°C. "lmunobiotting" foi realizado por incubação com um anticorpo adequado (Tabela 6), em 2 µg/ml em 2% de leite escumado em TBS-Tween 20 20 0,1%. Os anticorpos secundários usados para detecção de quimilumines- cência foram conforme indicado na Tabela 4, diluidos conforme indicado em 2°/, de leite escumado em TBS-Tween 20 0,1 °/). Complexos imunorreativos foram detectados por quimiluminescência usando luminol como o substrato (Roche Diagnostics Corporation). Conjugação de peroxidase-enzima de rá- 25 bano de anticorpo lgG humano foi efetuada pelo uso do kit de conjugação EZ-Link Plus® Peroxidase Ativada (Pierce, Rockford, IL).

Tabela 6: Condições de eletroforese, anticorpos, e diluições para "imunoblot- tinq" de proteínas expressas.

HA Cepa de Condição Anticorpo Diluição Anticorpo Diluição Subtipo gripe de eletro- primário secundá- forese rio Hl A/8risban Redução Fll10-150 4 µg/ml Cabra 1:100 e/59/2007 antica- (H1N1) mumdon- go (JIR 115-035- 146) Hl Nllhas Redução NIBSC 1:2000 Coelho 1:100 Salo- 07/104 anti- mão/3/20 ovelha 06 (JIR 313- (H1N1) 035-045) Hl A/Nova Redução FII10-150 4 Ug/ml Cabra 1:100 Caledô- antica- nia/20/99 mundon- ' (H1N1) go (JIR 115-035- 146) H2 NSingap Não- NIBSC 1:1000 Coelho 1:100 ura/1/57 redução 00/440 anti- (H2N2) ovelha (JIR 313- 035-045) H5 Nlndonés Redução ITC IT- 1:4000 Cabra 1:100 ia/5/2005 003-005V anti- (H5N1) Coelho (JIR111- 035-144) H5 A/Anhui/1 Redução NIBSC 1:750 Coelho 1:100 /2005 07/338 anti- (H5N1) ovelha (JIR 313- 035-045)

HA Cepa de Condição Anticorpo Diluição Anticorpo Diluição Subtipo gripe de eletro- primário secundá- forese rio H5 A/Vietnã/ Não- itc rr-003- 1:2000 Cabra 1:100 1194/200 redução 005 anti- 4 (H5N1) Coelho (JIR111- 035-144) H6 A/Cerceta Non- BEINR 1:500 Coelho 1:100 /Hong redução 663 anti- Kong/W3 ovelha 12/97 (JIR 313- (H6N1) 035-045) H9 A/Hong Redução NIBSC 1:1000 Coelho 1:10 000 Kong/107 07/146 anti- 3/99 ovelha (H9N2) (JIR 313- 035-045) Fll: Fitzgerald lndustries lnternational, Concord, MA, USA; NISBIC: National lnstitute for Biological Standards e Control; jIR: Jackson lmmunoResearch, West Grove, PA, USA; BEINR: Biodefense e emerging infections research resources 5 repository; ITC: lmmune Technology Corporation, Woodside, NY, USA; Ensaio de hemaglutinação para H5 foi baseado em um método descrito por Nayak. e Reichl (2004). Brevemente, diluições duplas em série das amostras de teste (100 µL) foram feitas em placas de microtitulação de 96 cavidades de fundo em V contendo 100 µL de PBS, deixando 100 µL de amostras diluídas por cavidade.

Cem microlitros de uma suspensão de célu- las de sangue vermelhas de peru 0,25% (Bio Link lnc., Syracuse, NY) foram adicionados a cada cavidade, e as placas foram incubadas por 2 horas à temperatura ambiente.

A recíproca da diluição mais alta mostrando hemaglu- tinação completa registrada como atividade de HA.

Em paralelo, um padrão de HA recombinante (A/Vietnã/l 203/2004 H5N1) (Protein Science Corporati- on, Meriden, CT) foi diluído em PBS e operado como um controle em cada placa.

7. Ultracentrifuqação de qradiente de sacarose Um mililitro de frações 9, 10 e 11 eluiu a partir de cromatografia de filtração de gel em biomassa contendo H5 foram reunidas, carregadas em 5 um gradiente de densidade de sacarose descontinua de 20-60% (p/v), e centrifugadas 17,5 horas a 125 000 g (4°C). O gradiente foi fracionado em 19 3-ml de frações começando da parte superior, e dializado para remover sacarose antes da análise imunoló- gica e ensaios de hemaglutinação. 10 8. Miscroscopia de elétron Frações de eluição de SEC a serem observadas por microscopia de elétron (EM) foram primeiro concentradas usando-se 30 MWCO de uni- dades de ultrafiltração (Millipore, Billerica, MA, USA). As frações concentra- das foram fixadas em PBS pH 7,4 contendo 2°/, de glutaraldeído por 24 ho- 15 ras a 4°C. Uma vez fixadas, as amostras foram adsorvidas em grades de níquel de malha 200 revestidas com Formvar (Canemco, Lakefield, Canada) por 2 min, e as grades foram lavadas duas vezes com água deionizada an- . tes de serem manchadas em 1°/, de ácido fosfotungstênico. A observação foi realizada sob transmissão de microscopia de elétron em ampliações varian- 20 do de 1O.OOOX a 150.0OOX (para imagens nas Figuras 4A e 4B). Alternadamente, cem microlitros das amostras a serem exami- nadas foram colocadas em um tubo de centrifugação Airfuge (Beckman lns- truments, Palo Alto, CA, USA). Uma grade foi colocada no fundo do tubo que foi então centrifugado 5 min a 120 000 g. A grade foi removida, brandamente 25 secada, e colocada em uma gota de 3°/0 de ácido fosfotungstênico a pH 6 para manchamento. As grades foram examinadas em um microscópio de elétron de transmissão Hitachi 7100 (TEM) (para imagens nas Figuras 14B, 15Be 15C). Para imagens na Figura 19, blocos de Folha de aproximadamen- 30 te 1 mm3 foram fixados em PBS contendo 2,5% de glutaraldeído e lavados em PBS contendo 3°/, de sacarose antes de uma etapa de pós-fixação em 1,33% de tetróxido de ósmio. Amostras fixadas foram embutidas em resina

Spurr e camadas ultradelgadas foram assentadas em uma grade. As amos- tras foram positivamente manchadas com 5°/0 de uranil acetato e 0,2% de citrato de chumbo antes da observação. As grades foram examinadas em um microscópio de elétron de transmissão Hitachi 7100 (TEM). 5 9. Análise de lipídeo de membrana de plasma Membranas de plasma (PM) foram obtidas de folhas de tabaco e células BY2 cultivadas após fracionamento de célula de acordo com Mon- grand et al. por divisão de um sistema de duas fases de polímero aquoso com polietileno glicol 3350/dextran T- 500 (6,6% cada). Todas as etapas 10 foram realizadas a 4 °C. os lipídeos foram extraldos e purificados de frações diferentes de acordo com Bligh e Dyer. Lipídeos polares e neutros foram se- parados por HP-TLC monodimensional usando os sistemas de solvente des- critos em Lefebvre et al. Os lipldeos de frações de PM foram detectados após mancha- 15 mento com acetato de cobre conforme descrito por Macala et al. Os lipídeos foram identificados por comparação de seu tempo de migração com aqueles

V de padrões (todos os padrões foram obtidos de Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA, exceto para SG que foi obtido de Matreya, Pleasant Gap, PA, U'SA).

10. Purificação de H5 VLP 20 660 folhas infiltradas congeladas de N. benthamiana foram ho- mogeneizadas em 1,5 volumes de 50 mM de Tris pH 8, NaCl 150 mM e 0,04% de sódio meta-bisulfeto usando um misturador comercial. O extrato resultante foi suplementado com 1 mM de PMSF e ajustado a pH 6 com áci- do acético 1 M antes de ser aquecido a 42°C por 5 min. Terra diatomácea 25 (DE) foi adicionada ao extrato tratado com calor para adsorver os contami- nantes precipitados pela alteração do pH e tratamento de calor, e a pasta fluida foi filtrada através de um filtro de papel Whatman. O extrato clareado resultante foi centrifugado a 10.000 x g por 10 minuto à temperatura ambien- te para remover DE residual, passado através de 20 filtros 0.8/0.2 urn Acro- 30 pack e carregado em uma coIuna de afinidade de fetuin-agarose (Sigma- Aldrich, St-Louis, MO, USA). Em seguida a etapa de lavagem em 400 mM de NaCl, 25 mM de Tris pH 6, proteínas ligadas foram eluídas com 1,5 M NaCl,

50 mM de MES pH 6. A VLP eluída foi suplementada com Tween-80 a uma concentração final de 0,0005% (v/v). A VLP foi concentrada em uma mem- brana de 100 kDa MWCO Amicon, centrifugada a 10.000 x g por 30 minutos a 4°C e ressuspensa em PBS pH 7,4 com O,O1°/o de Tween-80 e 0,01% de 5 timerosal. As VLPS suspensas foram filtradas-esterilizadas antes de uso.

11. Estudos de animal Camundonqos Estudos na resposta imune a administração de VLP de Gripe foram realizados com camundongos BALB/C fêmeas de 6-8 semanas de i- lO dade (Charles River Laboratories). Setenta camundongos foram aleatoria- mente divididos em quatorze grupos de cinco animais. Todos os grupos fo- ram usados para imunização intramuscular e seis grupos foram usados para testar rota intranasal de administração. Todos os grupos foram imunizados em um regimento de duas doses, a imunização de impulso sendo feita 3 15 semanas em seguida a primeira imunização. Para administração intramuscular em pernas de corça, camun-

F dongos não-anestesiados foram imunizados com a vacina VLP H5 produzida de planta (0,1, 1, 5 ou 12 corte), ou um antígeno (HA) de hemaglutinina de controle. O HA de controle compreende hemaglutinina solúvel recombinante 20 produzida baseada na cepa A/lndonésia/5/05 H5N1 e purificado de 293 cul- turas de célula (lmmune Technology Corp., Nova York, USA) (usada a 5 µg por injeção a menos que de outro modo indicado)- Controle de tampão foi PBS. Estes antigeno consiste de aminoácidos 18-530 da proteína de HA, e tem uma His-etiqueta e um local de clivagem modificado. A microscopia de 25 elétron confirmou que este produto comercial não está na forma de VLPS. Para medir o efeito de adjuvante, dois grupos de animais foram imunizados com 5 µg de vacina de VLP H5 produzida por planta mais um volume Alhidrogel 2% (alume, Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY, US) ou com 5 µg de hemaglutinina recombinante purificada 30 de 293 culturas de célula mais 1 volume de alume. Setenta camundongos foram aleatoriamente divididos em quatorze grupos de cinco animais. Oito grupos foram usados para imunização intramuscular e seis grupos foram usados para testar rota intranasal de administração.

Todos os grupos foram imunizados de acordo com um regime de impulso, a imunização de impulso realizada 3 semanas em seguida a primeira imunização.

Para administração intramuscular em pernas de corça, camun- 5 dongos não-anestesiados foram imunizados com a VLP H5 produzida de planta (0,1, 1, 5 ou 12 µg), ou o antígeno de hemaglutinina de controle (HA) (5 µg) ou PBS.

Todas as preparações de antígeno foram misturadas com Alhidrogel 1°/0 (alume, Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY, US) em uma proporção de volume de 1:1 antes das imunizações.

Para 10 medir o efeito de adjuvante, dois grupos de animais foram imunizados com ou 5 vacina de VLP H5 produzida de pIanta de corte ou com 5 µg de antíge- no de HA de controle sem qualquer adjuvante.

Para administração intranasal, camundongos foram brevemente anestesiados por inalação de isoflurano usando uma câmara de indução au- 15 tomática.

Eles foram em seguida imunizados por adição de 4 µ1 de go- " ta/nostril com a vacina de VLP produzida de planta (0,1 ou 1 µg), ou com y antigeno de HA de controle (1 µg) ou com PBS.

Todas as preparações de antígeno foram misturadas com chitosan glutamato 1°/0 (Protosan, Novama- trixl FMC BioPolymer, Norway) antes das imunizações.

Os camundongos em 20 seguida respiraram nas soluções.

Para verificar o efeito de adjuvante com a rota intranasal de administração, dois grupos de animais foram imunizados com 1 µg de vacina de VLP H5 produzida de plantas ou com 1 µg de antíge- no HA de controle.

Furões 25 Dez grupos de 5 furões (macho, 18-24 semanas de idade, mas- sa de aproximadamente 1 kg) foram usados.

O tratamento para cada grupo é conforme descrito na Tabela 7. O adjuvante usado foi Alhidrogel (alume) (Superfos Biosector, Denmark) 2% (final=l%). A composição de vacina foi VLPS de A/lndonésia/5/05 (H5N1) associadas a membrana produzidas con- 30 forme descrito.

O controle de vacina (controle positivo) foi um recombinante de H5 ligado a membrana glicosilatado de cepa de lndonésia produzida u- sando-se adenovirus em 293 culturas de célula por lmmune Technology

Corporation (ITC). Tabela 7. Grupos de tratamento Grupo n Produto injetado aos a- Rota de admi- I Adjuvante nimais nistração 1 5 PBS (controle negativo) i.m.* 2 I 5 I Vacina-planta, 1 µg i.m. ~ 3 I 5 i Vacina-planta, 1 µg i.m.

Alume 4 i 5 i Vacina-planta, 5 µg i.m. m

5 i 5 I Vacina-planta, 5 µg— i.m.

Alume 6 I 5 : Vacina-planta, 7.5 µg i.m. ~ 7 i 5 I Vacina-planta, 15 µg i.m. 8 I 5 ) Vacina-planta, 15 µg i.m.

Alume 9 I 5 i Vacina-planta, 30 µg i.m. 10 I 5 I Vacina-controle, 5 µg i.m. i.m.: intramuscular Os furões foram avaliados para saúde total e aparência (peso " 5 corpóreo, temperatura retal, postura, pele, modelos de movimento, respira-

. ção, excremento) regularmente durante o estudo.

Os animais foram imuni- zados por injeção intramuscular (0,5-1,0 de volume total) em quadríceps no dia 0, 14 e 28; para protocolos incorporando adjuvante, a composição de vacina foi combinada com Alhidrogel imediatamente antes da imunização em 10 uma proporção de volume de 1:1). As amostras de soro foram obtidas no dia 0 antes da imunização, e no dia 21 e 35. Os animais foram sacrificados (a- nemia/perfuração cardiaca) nos dias 40-45, e, os baços foram coletados e necropsia realizada.

As titulações de anticorpo antigripe podem ser quantificadas em 15 ensaios ELISA usando-se vÍrus H5N1 homólogos ou heterólogos inativados.

As titulações de anticorpo inibitórias de hemaglutinação de a- mostras de soro (pré-imune, dia 21 e dia 35) foram avaliadas por HAI de mi- crotitulação conforme descrito (Aymard et al 1973). Brevemente, os soros foram pré-tratados com enzima de destruição de receptor, inativados com 20 calor e misturados com uma suspensão de eritrócitos (células de sangue vermelhas lavadas-RBC). RBC lavado de cavalo (iO°/j) de Lampire são re-

comendados e considerando-se que o ensaio pode variar dependendo da fonte do RBC (cavalo-dependente), RBCS lavados de 10 cavalos foram tes- tados para selecionar a batelada mais sensível.

Alternadamente, RBC de peru pode ser usado.

A titulação de anticorpo foi expressa como a recíproca 5 da diluição mais alta que inibe completamente hemaglutinação.

Titulações de HAI reativa cruzada: As titulações de HAI de fu- rões imunizados com uma vacina para a A/lndonésia/5/05 (clade 2.1) foram medidas usando-se cepas inativadas de H5N1 da gripe de outra subclade ou clade tal como a clade 1 Vietnã cepas A/Vietnã/l 203/2004 e 10 A/Vietnã/1194/2004 ou a A/Anhui/O1/2005 (subclade 2.3) ou a A/peru/Turkey/1/05 (subclade 2.2). Todas as análises foram realizadas nas amostras individuais.

Análise de dados: Análise estatística (ANOVA) será realizada em todos os dados para estabelecer se diferenças entre grupos são estatis- 15 ticamente significantes.

Desenho experimental para desafio letal (camundonqos) Cento e vinte e oito camundongos foram aleatoriamente dividi- . dos em dezesseis grupos de oito animais, um grupo sendo não-imunizado então desafiado (controle negativo). Todos os grupos foram imunizados via 20 administração intramuscular em um regime de duas doses, a segunda imu- nização sendo feita duas semanas em seguida a primeira imunização.

Para administração intramuscular em pernas de cervo, camun- dongos não-anestesiados foram imunizados com a H5 VLP produzida de planta (1, 5 ou 15 µg), ou 15 µg de antígeno de controle HA ou PBS.

Todas 25 as preparações de antígeno foram misturadas com um volume de Alhidrogel 1°/0 antes das imunizações (alume, Accurate Chemical & Scientific Corpora- tion, Westbury, NY, US). Durante o período de imunização, os camundongos foram pesa- dos uma vez em uma semana e observados e monitorados para reações 30 Iocais no local de injeção.

Vinte e dois dias em seguida a segunda imunização, os camun- dongos anestesiados foram desafiados intranasalmente (i-n.) em um labora-

tório contendo BL4 (P4-Jean Merieux-lNSERM, Lyon, France) com 4,09 x 106 50% dose infectiva de cultura de célula (CCID50) de vÍrus da Gripe A/Turkey/582/06 (gentilmente fornecido por Dr.

Bruno Lina, Lyon University, Lyon, France). Em seguida ao desafio, os camundongos foram observados 5 para todos os sintomas clínicos e pesados diariamente, sobre um perlodo de quatorze dias.

Os camundongos com sintomas de infecção severos e perda de peso de >25% foram eutanizados após anestesia.

Coleta de sançjue, lavaqens de pulmão e nasal e coleta de baço Coleta de sangue de veia safenosa foi realizada quatorze dias 10 após a primeira imunização e quatorze dias após segunda imunização no animal não-anestesiado.

O soro foi coletado por centrifugação a 8000 g por 10 min.

Quatro semanas após segunda imunização, os camundongos foram anestesiados com gás CO2 e imediatamente após terminação, punção 15 cardíaca foi usada para coletar sangue.

Após sangria final, um cateter foi inserido na traquéia nos pulmões e um ml de solução de coquetel de inibidor de PBS-protease frio foi posto em uma seringa lcc fixada ao cateter e injeta- . do nos pulmões e, em seguida, removido para análise.

Este procedimento de lavagem foi realizado duas vezes.

As lavagens do pulmão foram centrifu- 20 gadas para remover fragmentos celulares.

Para lavagens nasais, um cateter foi inserido na área nasal e 0,5 ml da solução de coquetel de inibidor de PBS-protease foi puxado através do cateter nas passagens nasais e, então, coletada.

As lavagens nasais foram centrifugadas para remover fragmentos celulares.

A coleta de baço foi realizada em camundongos imunizados in- 25 tramuscularmente com 5 µg de vacina produzida de pIanta com adjuvante, ou 5 µg de antígeno de H5 recombinante com adjuvante, bem como em ca- mundongos imunizados intranasalmente com 1 µg de cavina produzida de planta com adjuvante, ou 1 µg de antigeno de H5 recombinante com adju- vante.

Os baços coIetados foram colocados em RPMI suplementado com 30 gentamycin e misturado em um tubo cônico de 50 ml com êmbolo de uma seringa de 10 ml.

Os baços misturados foram enxaguados 2 vezes e centri- fugados a 2000 rpm por 5 min e ressuspensos em tampão de Iisação de

ACK por 5 min à temperatura ambiente.

Os esplenócitos foram lavados em PBS-gentamycin, ressuspensos em 5°/0 de RPMI e contados.

Os esplenóci- tos foram usados para ensaio de proliferação.

Titulações de anticorpo 5 As titulações de anticorpo de antigripe de soro foram medidas nos 14 dias após a primeira imunização, bem como 14 e 28 dias após a se- gunda imunização.

A titulação foi determinada por ensaio imunosorvente ligada por enzima (ELISA) usando o vÍrus inativo A/lndonésia/5/05 como o antígeno de revestimento.

As titulações de ponto terminal foram expressas 10 como o valor recíproco da diluição mais alta que alcançou um valor OD de pelo menos 0,1 mais alto do que aquele de amostras de controle negativo.

Para determinação da classe de anticorpo (lgGl, lgG2a, lgG2b, lgG3, lgM), as titulações foram avaliadas por ELISA conforme anteriormente descrito. 15 Titulações de inibição de hemaqlutinação (Hl) As titulações de inibição de hemaglutinação (Hl) de soro foram medidas nos 14 e 28 dias após a segunda imunização conforme anterior- . mente descrito (WHO 2002; Kendal 1982). Preparações de vÍrus inativadas de cepas A/lndonésia/5/05 ou A/Vietnã/1203/2004 foram usadas para testar 20 amostras de soro de camundongo para atividade de H1. Os soros foram pré- tratados com enzima ll de destruição de receptor (RDE ll) (Denka Seiken Co., Tokyo, Japão) preparados de Vibrio cho/erae (Kendal 1982). Os ensaios de H1 foram realizados com 0,5% de células de sangue vermelhas de peru.

As titulações de anticorpo de Hl foram definidas como a recíproca da dilui- 25 ção mais alta causando inibição completa de aglutinação.

Exemplos Exemplo 1: Expressão transiente de vÍrus da qripe A/lndonésia/5/05 (H5N1)hemaqlutinina por aqroinfiltração em plantas N. benthamiana A capacidade do sistema de expressão transiente para produzir 30 hemaglutinina da Gripe foi determinada através da expressão do subtipo H5 de cepa A/lndonésia/5/05 (H5N1). Conforma apresentado na Figura 11, a sequência de codificação de gene de hemaglutinina (Ace.

N° EF541394),

com seu peptldeo de sinal nativo e domínio de transmembrana, foi primeiro montado no cassete de expressão de plastocianina - promotor, 5'UTR, 3'UTR e sequências de terminação de transcrição a partir o gene de alfafa plastocianina - e o cassete montado (660) foi inserido em um plasmídeo bi- 5 nário de pCAMBIA. O plasmídeo foi, em seguida, transfectado em Agrobac- terium (AGLI), criando a cepa recombinante AGL1/660, que foi usada para expressão transiente. P/antas de N. benthamiana foram infiltradas com AGL1/660, e as folhas foram coletadas após um periodo de incubação de seis dias. Para 10 determinar se H5 se acumulou nas folhas agroinfiltradas, a proteína foi pri- meiro extralda de tecido de folha infiltrado e analisada por Western blotting usando anticorpos policlonais anti-H5 (Vietnã). Uma faixa única de aproxi- madamente 72 kDa foi detectada em extratos (Figura 12), correspondendo ao tamanho para a forma não-clivada de HAO de hemaglutinina da gripe. O 15 H5 comercial usou como controle positivo (A/Vietnã/1203/2004; Protein Sci- " ence Corp., Meriden, CT, USA) foi detectado como duas faixas de aproxi-

P madamente 48 e 28 kDa, correspondendo ao peso molecular de fragmentos de HAI e HA2, respectivamente. lsto demonstra que expressão de H5 em folhas infiltradas resulta no acúmulo do produto de translação não-clivado. 20 A formação de trímero de HA ativos foi demonstrada pela capa- cidade de extratos de proteína brutos de foihas transformadas por AGLI/660 para aglutinar células de sangue vermelhas de peru (dados não-mostrados). Exemplo 2: Caracterização de estruturas contendo hemaqlutinina em extra- tos de planta usando cromatoçjrafia de exclusão de tamanho 25 O conjunto de hemaglutinina produzido por planta da gripe em estruturas de alto peso molecular foi avaliado por filtração de gel. Extratos de proteína brutos de plantas infiltradas com AGLI/660 (1,5 ml) foram fraciona- dos por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em colunas de Se- phacryi® S-500 HR (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, U- 30 SA). Frações de eluição foram ensaiadas por seu teor de proteina total e para abundância de HA usando-se imunodetecção com anticorpos anti-HÁ (Figura 13A). Conforme mostrado na Figura 13A, eluição de Blue Dextran (2

MDa) em pico anterior em fração 10 enquanto a massa de proteínas hospe- deiras foi retida na coluna e eluida entre frações 14 e 22. Quando proteínas de 200 µL de cada fração de eluição de SEC foram concentradas (5 vezes) por precipitação de acetona e analisadas por Western blotting (Figura 15A, 5 H5), hemaglutinina (H5) foi principalmente encontrada em frações 9 a 14 (Figura 13B). Sem desejar estar ligado pela teoria, isto sugere que a protei- na HA tinha, ou montado em uma superestrutura grande, ou que tinha fixado a uma estrutura de peso molecular alto.

Um segundo cassete de expressão foi montado com a sequên- lO cia de ácido nucleico de Hl de A/Nova Caiedônia/20/99 (H1N1) (SEQ ID NO: 33; Figura 16; Gen8ank Accession No.

AY289929) para produzir cons- trução 540 (Figura 11). Uma construção de gene quimérico foi designada de modo a produzir uma forma trimérica solúvel de Hl em que o peptideo de sinal originado de um gene de proteína de planta disulfeto isomerase, e o 15 domínio de transmembrana de Hl foi substituído pela variante pll do zipper " de leucina GCN4, um peptídeo mostrado para automontar em trímero (Har- bury et al., 1993) (cassete 544, figura 11). Embora carecendo de domínio de transmembrana, esta forma trimérica solúvel foi capaz de hemaglutinação (dados não-mostrados). 20 Extratos de proteina de plantas infiltradas com AGL1/540 ou AGL1/544 foram fracionados por SEC e a presença de frações eluídas de Hl foi examinada por Western blotting com anticorpos A antigripe (Fitzge- rald, Concord, MA, USA). Em folhas infiltradas de AGLI/540, Hl se acumulou principalmente como uma estrutura de peso molecular muito alta, com o pico 25 inclinado para as estruturas de tamanho menores (Hl; Figura 13C). Em fo- lhas infiitradas de AGLI/544, a forma solúvel de Hl se acumulou como tríme- ro isolados conforme demonstrado pelo modelo de eluição de filtração de gel que fica paralelo ao perfil de eluição de proteína hospedeira (Hl solúvel; Fi- gura 13D). Em comparação, invólucros de H1 (Proteína Science Corp., Me- 30 riden, CT, USA), consistindo em micelas de 5-6 trimero de hemaglutinina eluidos em frações 12 a 16 (Figura 13E), mais cedo do que a forma soIúvel de H1 (Figura 13D) e mais tarde do que a Hl nativa (Figura 13C).

Para avaliar o impacto de coexpressão de Ml em conjunto de hemaglutinina em estrutura, um cassete de expressão de Ml foi montado usando-se ácido nucleico correspondente a sequência de codificação do A/PR/8/34 (H1N1) Ml (SEQ ID NO: 35; Figura 18; Gen8ank Accession N° 5 NC 002016). A construção foi denominada 750 e é apresentada na Figura

11. Para a coexpressão de Ml e Hl, suspensões de AGL1/540 e AGL1/750 foram misturadas em volume igual antes da infiltração. A co-infiltração de suspensões múltiplas de Agrobacterium permite coexpressão de transgene múltiplo. A análise de Western blot de frações de SEC de eluição mostra que a coexpressão de Ml não modifica o perfil de eluição das estruturas de H1, mas resultou em uma diminuição em acúmulo de H1 nas folhas agroinfiltra- das (vide Figura 13F). Exemplo 3: lsolamento de estruturas de H5 por centrifuqação em qradiente de sacarose e observação sob microscopia de elétron A observação de estrutura de hemaglutinina sob microscopia de elétron (EM) requereu uma concentração e nível de pureza mais alto do que aquele obtido de SEC em extratos de proteina de folha crua. Para permitir observação de EM de estruturas de H5, um extrato de proteína de folha crua foi primeiro concentrado por precipitação de PEG (20% PEG), seguido por ressuspensão em volumes 1/10 de tampão de extração. O extrato de proteí- na concentrado foi fracionado por filtração de gel de S-500 HR e frações de eluição 9, 10, e 11 (correspondendo ao volume de vazio da coluna) foram reunidas e adicionalmente isoladas de proteínas hospedeiras por ultracentri- fugação em um gradiente de densidade de sacarose 20-60°6. O gradiente de sacarose foi fracionado começando do topo, e as frações foram dialisadas e concentradas em uma unidade de filtro centrífuga 100 NMWL antes da aná- lise. Conforme mostrado nos Western blots e resultados de hemaglutinação (Figura 14A), H5 se acumulou principalmente em frações 16 a 19 que conti- nham = 6O°/, sacarose, pelo que muitas das proteínas hospedeiras de picos em fração 13. As frações 17, 18, e 19 foram reunidas, manchadas negativa- mente, e observadas sob Exame de EM. da amostra que demonstrou clara- mente a presença de estruturas esféricas perfuradas variando em tamanho de 80 a 300 cursos que se equiparam as características morfológicas de VLPS da Gripe (Figura 14B). Exemplo 4: Purificação de VLPS H5 da Gripe de biomassa de planta Em adição a um teor abundante de proteínas solúveis, extratos 5 de folha de planta contêm uma mistura complexa de açúcares solúveis, áci- dos nucleicos e lipideos.

O extrato bruto foi clareado por uma alteração de pH e tratamento de calor, seguido por filtração em terra diatomácea (vide seção de Material e método para uma descrição detalhada do método de clareamento). A Figura 15A (raias 1-4) apresenta um teor de proteína com- lO parando gel manchado de Coomassie Blue nas várias etapas de cIareamen- to.

Uma comparação de teor de proteína no extrato bruto (raia 1) e no extra- to clareado (raia 4) revelam a capacidade das etapas de clareamento de re- duzir o teor de proteína global e remover muito do contaminante maior visí- vel em 50 kDa em extratos de folha crua.

A faixa de 50 kDa corresponde a 15 subunidade grande Ru8isCO, representando até 3Õ°/o de proteinas de folha totais.

As H5 VLPS da gripe foram purificadas destes extratos clareados . por cromatografia de afinidade em uma coluna de fetuin.

Uma comparação da fração de carga (Figura 15A, raia 5) com o fluxo através (Figura 15A, raia 20 6) e as VLPS eluídas (Figura 15A, raia 7) demonstram a especificidade da coluna de afinidade de fetuin para H5 VLPs de Gripe em extrato de planta clareado.

O procedimento de purificação resultou em mais de 75% de pu- reza em H5, conforme determinado por densitometria no gel de Coomassie 25 Blue manchado SDS-PAGE (Figura 15A, raia 7). De modo a avaliar a quali- dade estrutural do produto purificado, a H5 purificada foi concentrada em uma unidade de filtro centrífuga de 100 NMWL (Iimite de peso nominal mole- cular) e examinada sob EM após manchamento negativo.

A Figura 15B mos- tra um setor representativo mostrando a presença de VLPS profusas.

Um 30 exame mais próximo confirmou a presença de picos nas VLPS (figura 15C). Conforme mostrado na Figura 15D, H5 VLPS foram purificadas para aproximadamente 89% de pureza de extrato de folha clareado por cro-

matografia de afinidade em uma coluna de fetuin, baseado na densidade do Coomassie Blue manchado H5 hemaglutinina e na determinação do teor de proteína total pelo método de BCA. A bioatividade de HA VLPS foi confirmada por sua capacidade 5 de aglutinar células de sangue vermelhas de peru (dados não-mostrados). A Figura 20B também confirma a identidade da VLP purificada visualizada por Western blotting e imunodetecção com um soro policlonal de anti-H5 (A/Vietnã/1203/2004). Uma faixa única de aproximadamente 72 kDa é detectada e corresponde em tamanho a forma de HAO não-clivada de he- lO maglutinina da gripe. A Figura 15C mostra a estrutura de VLP da vacina com os picos de hemaglutinina cobrindo sua estrutura. As VLPS foram formuladas para imunização de camundongos por filtração através de um filtro de 0,22 µm; teor de endotoxin foi medido durante um kit de detecção de endotoxin LAL (Limulus Amebocyte Lysate) 15 (Lonza, Walkserville, MS, USA). A vacina filtrada contenha 105,8 ±11,6% EU/ml (unidades de endotoxin/ml).

+ Exemplo 5: Localização de VLPS de Gripe em plantas Para localizar as VLPs e confirmar sua origem de membrana de plasma, seções de folhas delgadas de plantas de produção de H5 foram fi- 20 xadas e examinadas sob TEM após manchamento positivo. A observação de células de folha indica a presença de VLPS em cavidades extracelulares formadas pela invaginação da membrana de plasma (Figura 19). A forma e posição das VLPS observadas demonstram que apesar da aposição de suas membranas de plasmas na parede de célula, as células de planta têm a 25 plasticidade requerida para produzir VLPS da Gripe derivadas de sua mem- brana de plasma e a acumula no espaço apoplástico. Exemplo 6: Análise de lipídeo de membrana de plasma Adicionalmente a confirmação da composição e origem das VLPS da Gripe de pIanta foram obtidas de análise do teor de lipídeo. Os lipí- 30 deos foram extraídos de VLPS purificadas e sua composição foi comparada àquela de membranas de pIasma de tabaco altamente purificadas por cro- matografia de camada delgada de desempenho (HP-TLC). Os modelos de migração de lipídeos polares e neutros de VLPS e controle de membranas de plasma foram similares.

As VLPS purificadas continham os fosfolipídeos maiores (fosfatidilcolina e fosfatidilefhanolamina) e esfingolipídios (glucosil- ceramida) encontrados na membrana de pIasma (Figura 27A), e ambas con- 5 tinham esteróis livres como os lipídeos neutros somente (Figura 27B). Con- tudo, a imunodetecção de um marcador de proteína de membrana de plas- ma (ATPase) em extratos de VLP purificados mostrou que a bicamada de lipídeo de VLP não contém uma das maiores proteínas associadas com membranas de plasma de planta, sugerindo que proteínas hospedeiras po- lO dem ter sido excluídas das membranas durante o processo de origem das VLPs a partir das células de planta (Figura 27C). Exemplo 7: lmunoqenicidade das H5 VLPS e efeito de rota de administração Os camundongos foram administrados com H5 VLPs produzidas por planta por injeção intramuscular, ou intranasal (inalação). 0,1 a 12 µg de 15 VLPs foram injetados intramuscularmente nos camundongos, com alume . como um adjuvante, de acordo com os métodos descritos.

As titulações de anticorpo de pico foram observadas com a quantidade de antígeno mais bai- . xa, em uma grandeza similar àquela de 5 µg de hemaglutinina solúvel re- combinante (HA) (Figura 20A). 20 0,1 a 1 µg de H5 VLPS produzidas de planta foram administra- dos intranasalmente com um adjuvante chitosan provido para uma resposta de anticorpo maior do que aquela do HA solúvel recombinante com um adju- vante de alume (Figura 20B). Para ambas as rotas de administração, e sobre uma faixa de 25 quantidades de antígeno, soroconversão foi observada em todos os camun- dongos testados.

O antígeno solúvel de H5 recombinante conferiu baixas ("1/40) ou razoáveis (1"1/10 para o H5 recombinante não-adjuvante) titula- ções de H1. Exemplo 8: Titulação de anticorpo de inibição de hemaqlutinação (HAI) H5 30 VLP As Figura 21 A, B ilustram a resposta de anticorpo de inibição de hemaglutinação (HAI) 14 dias em seguida a um "impulso" com H5 VLP pro-

duzida de planta, ou HA solúvel recombinante. A dose mais baixa de antíge- no (0,1 µg) quando administrada intramuscularmente produziu uma resposta de HAI superior para uma administração maior do que 10 vezes (5 µg) de HÁ solúvel recombinante. As doses aumentadas de H5 VLP proporcionaram 5 um aumento modesto em HAI sobre a dose mais baixa. A resposta de HAI em seguida a administração intranasal foi significantemente aumentada em camundongos administrados com H5 VLPS produzidas de planta (1,0 ou 0,1 µg) comparado aquelas administradas com 1 µg de HA solúvel recombinante, que foi similar ao controle negativo. Todos 10 os camundongos imunizados por injeção intramuscular de H5 VLPS (de 0,1 a 12 µg) tinham titulações de HAI mais altas do que camundongos imunizados com o antlgeno de HA de controle (Figura 4a - agora 21 A). Para a mesma dose de 5 µg, VLPS induziram titulações de HAI 20 vezes mais altas do que a dose correspondente do antígeno de controle de HA. As VLPS 15 também induziram titulações de HAI significantemente mais altas do que o antígeno de HA de controle quando distribuído através da rota intranasal (Figura 21b). Para uma dada dose de H5 VLP, os níveis de titulações de HAI

H foram mais baixos em camundongos imunizados intranasalmente do que para camundongos imunizados intramuscularmente; 1 µg de VLP induziu 20 uma titulação de HAI média de 210 quando administrada i.m. enquanto a mesma dose induziu uma titulação de HAI media de 34 administrada i.n.. Quando administradas intramuscularmente, todas as doses de VLPS induziram alto nível de anticorpos capazes de Iigação homóloga aos vÍrus inativados totais (Figuras 20b e 24). Nenhuma diferença significante foi 25 encontrada entre a vacina de VLP produzida de planta e o antígeno de HA de controle (exceto o grupo de VLP de 12 µg 14 dias após impulso), confor- me ambas preparações de antígeno induzem alta ligação de titulações de anticorpo contra a cepa homóloga. Contudo, quando administradas intrana- salmente, as VLPS induziram ligação mais alta de titulações de anticorpo do 30 que o antígeno de HA de controie (Figura 20b). Quando misturada com Chi- tosan, a imunização com um micrograma de VLP induziu uma titulação mé- dia recíproca Ab de 5 500, 8,6 vezes mais alta do que o nlvel encontrado em camundongos imunizados com 1 µg do antígeno de HA de controle (titulação Ab média recíproca de 920). A imunogenicidade das VLPS da Gripe derivadas de planta foi então investigada através de um estudo de variação de dose em camundon- 5 gos. Os grupos de cinco camundongos B ALB/C foram imunizados intramus- cularmente duas vezes em intervalos de 3 semanas com 0,1 µg a 12 µg de HA contendo VLPS de Gripe A/lndonésia/5/05 (H5N1) formulada em alume (proporção 1:1). As titulações de inibição de hemaglutinação (Hl), usando antígeno de vÍrus inativados totais (A/lndonésia/5/05 (H5N1)), foram medi- lO das no soro coletado 14 dias após a segunda imunização. A imunização com doses de VLP mais baixa do que 0,1 µg induziu a produção de anticorpos que inibiram vÍrus e eritrócitos de aglutinação em altas diluições (Figura 21 A). lmunização paralela de camundongos com 5 µg de antígeno de H5 de controle com adjuvante de não-VLP alume (também de A/lndonésia/5/05) 15 induziu uma resposta de Hl que foi 2-3 logs mais baixa do que aquela al- " cançada com a dose de VLP mais baixa.

R Para ambas as rotas de administração, e sobre uma faixa de quantidades de antígeno, a resposta de HAI é superior em camundongos administrados com VLPS. 20 Exemplo 9: Efeito de adjuvante na imunoqenicidade de H5 VLPs As H5 VLPS produzidas de planta têm uma origem de membrana de plasma (Figura 19, Exemplo 5). Sem desejar estar Iigado pela teoria, vÍ- rus envelopados ou VLPs de vÍrus envelopados geralmente adquirem seu envelope a partir da membrana eles originam. As membranas de plasma de 25 planta têm um complemento de fitosterol que é raramente, se sempre encon- trado em células de animal, e vários destes esteróis foram demonstrados exibirem efe itos imunoestimulatórios. As H5 VLPS produzidas de planta foram administradas intramus- cularmente (Figura 22A) ou intranasalmente (Figura 22B) a camundongos na 30 presença ou ausência de um adjuvante, e a HAI (resposta de anticorpo de inibição de hemaglutinação) determinada. VLPS, na presença ou ausência de um adjuvante adicionado (alume ou chitosan, como nestes exemplos) em qualquer sistema de administração demonstrou uma inibição de HAI hema- glutinina significantemente maior do que HA solúvel recombinante.

Mesmo na ausência de um adjuvante adicionado (isto é, alume ou chitosan), as H5 VLPS produzidas de planta demonstram uma HAI significante, indicativa de 5 uma resposta imune sistêmica a administração do antigeno.

O alume aumentou o nivel médio de titulações de HAI por um fator de 5 para administração intramuscular de VLP (Figura 22a), e por um fator de 3,7 para o antígeno de HA de controle.

Quando administradas i.m., 5 µg de VLPs induziram uma titulação de HAI média 12 vezes mais alta do 10 que a dose de antígeno correspondente de HA de controle.

Chitosan não impulsiona o nível de HAI médio do antigeno de HA de controle (Figura 22b), enquanto aumenta o nível de HAI médio de camundongos imunizados com 1 µg de VLP administrado i.n. por um fator de 5 vezes.

Exemplo 10: lsotipos de anticorpo 15 Camundongos administrados com H5 VLPS produzidas de plan- ta ou HA solúvel recombinante na presença ou ausência de alume como um adjuvante adicionado demonstrou uma variedade de isotipos de imunoglobu- . lina (Figura 23 A). Na presença de um adjuvante adicionado, os perfis de isotipo de 20 anticorpo de VLPS e da HA são similares, com IgGl sendo o isotipo dominan- te.

Quando VLPS ou HA são administradas sem um adjuvante adicionado, a resposta de IgGl é reduzida, mas permanece a resposta de isotipo dominan- te para VLPS, com lgM, lgG2a, lgG28 e lgG3 mantendo titulações similares como na presença de um adjuvante adicionado.

Titulações de lgGl, lgG2a, e 25 IgG2b são marcadamente reduzidas quando HA é administrada sem um ad- juvante adicionado.

Estes dados, portanto, demonstram que as VLPS produzidas de pIanta não requerem um adjuvante adicionado para induzir uma resposta de anticorpo em um hospedeiro. 30 As titulações de anticorpo contra cepas de vÍrus da gripe inativa- das totais (A/lndonésia/5/05; A/Vietnã/1203/04)1 em camundongos adminis- trados com VLPS produzidas de planta ou HA solúvel recombinante intra-

muscularmente na presença de um antlgeno adicionado são ilustradas na Figura 23B. Nenhuma diferença significante é observada nas titulações de anticorpo para estas cepas da gripe em camundongos administrados com 1 µgou5µgdeVLPsou5µgdeHAsolúvel. 5 Exemplo 11: Reatividade cruzada de anticorpos de soro induzidos pe/a vaci- na de H5 VLP A reatividade cruzada de anticorpos de soro induzidos por H5 VLP foi avaliada contra vÍrus da gripe inativados totais de cepas diferentes. Todas as doses de VLP (de 0,1 a 12 µg), bem como 5 µg de antígeno de HA 10 de controle induziram alta ligação de titulações de anticorpo contra uma cla- de de cepa 1 (A/Vietnã/1194/04), a cepa homóloga A/lndonésia/5/05 de cla- de 2.1, e uma cepa de clade 2.2 A/peru/Turkey/1/05 (Figura 25A). Contudo, somente a VLP produzida de pIanta induziu titulação de HAI contra a cepa de A/peru/1"urkey/1/05 (Figura 25b). As titulações de 15 HAI para a A/lndonésia/5/05 foram altas para VLPS. Exemplo 12: Proteção cruzada conferida por imunização com H5 VLP pro-

W duzida de planta Os camundongos que anteriormente tinham sido administrados com um regime de duas doses de VLPs de A/lndonésia/5/05 H5 VLPS con- 20 forme descrito, foram subsequentemente desafiados intranasalmente com vÍrus de infecção da Gripe ATurkey/582/06 (H5N1) ("Turkey H5N1"), e observados. A dose administrada, por animal, foi 10 LD50 (4,09 X 10' CClD50). Por 7 dias pós-desafio, somente 37,5% dos camundongos admi- 25 nistrados com o controle de vacina de PBS tinha sobrevivido exposto a Tur- key H5N1 (Figura 26A). 1OO°/o dos animais administrados com o antígeno de controle (HA) ou 1, 5 ou 15 µg de VLPS de lndonésia H5 sobreviveram até 17 dias pós-desafio, quando o experimento foi terminado. A massa corpórea dos camundongos foi também monitorada 30 durante o experimento, e a massa média dos camundongos sobreviventes plotadas (Figura 26B). Os camundongos administrados com 1, 5 ou 15 µg das VLPS da lndonésia H5 antes do desafio não perderam qualquer massa apreciável durante o curso do experimento, e, em particular, camundongos administrados com 5 µg das VLPS pareceram terem ganhado massa signifi- cante. Os camundongos de controle negativo (nenhum desafio de Turkey H5N1) não ganharam ou perderam apreciavelmente massa corpóreas. Os 5 camundongos de controle positive (não administrados com VLPs, mas desa- fiados com Turkey H5N1) exibiram perda significante de massa corpórea durante o curso do experimento, e três destes camundongos morreram. Co- mo massa corpórea é uma media de todos os camundongos no grupo, re- moção dos camundongos 'mais doentes' (os 3 que morreram) pode conduzir 10 a um aumento total aparente na massa, contudo nota-se que a massa corpó- rea média do grupo de controle positivo está ainda significantemente abaixo daquela dos grupos negativos ou tratados com VLP. Estes dados, portanto, demonstram que VLPS da Gripe produzi- das de planta compreendendo a proteína viral H5 hemaglutinina induzem 15 uma resposta imune específica para cepas da gripe patogênicas, e que par- tículas similares à vÍrus podem se originar de uma membrana de plasma de planta.

V Estes dados, portanto, demonstram que as plantas são capazes de produzirem partículas similares a vÍrus da gripe, e também pela primeira 20 vez, que partículas similares à vÍrus podem se originar de uma membrana de plasma de planta. Adicionalmente, usando-se a tecnologia de expressão transiente atual, um primeiro lote de antlgeno foi produzido somente 16 dias após a sequência da HÁ-alvo ser obtida. Sob os rendimentos atuais para H5 VLPS, 25 e em uma dose exemplar de 5 µg por indivíduo, cada kg de folha infiltrada pode produzir -20.000 doses de vacina. Esta combinação única de simplici- dade de plataforma aumenta a capacidade e proporciona imunogenicidade ponderosa para, eritre outras concretizações, uma nova resposta de método no contexto de uma pandemia. 30 Exemplo 13: Caracterização de estruturas contendo hemaqlutinina em extra- tos de planta usando cromatoqrafia de exclusão de tamanho O conjunto de hemaglutinina da gripe produzida por planta de subtipos diferentes em estruturas de alto peso molecular foi avaliado por fil- tração de gel.

Extratos brutos ou concentrados de proteína de plantas infil- tradas de AGL1/660-, AGL1/540-, AGL1/783-, AGL1/780- e AGLI/785 (1,5 ml) foram fracionados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em 5 colunas de Sephacryl® S-500 HR (GE Healthcare Bio-Science Corp., Pisca- taway, NJ, USA). Conforme mostrado na Figura 46, Blue Dextran (2 MDa) com eluição de pico anterior na fração 10. Quando as proteinas de 200 µL de cada fração de eluição de SEC foram concentradas (5 vezes) por precipi- tação de acetona e analisadas por Western blotting (Figura 46), as hemaglu- lO tininas foram principalmente encontradas em frações 7 a 14, e são indicati- vas da incorporação de HA em VLPs.

Sem desejar estar ligado pela teoria, isto sugere que a proteína de HA tinha ou montado em uma superestrutura grande ou que ela tinha fixado a uma estrutura de alto peso molecular, indi- ferente do subtipo produzido. 15 Exemplo 14: Expressão transiente de hemaqlutinina do vÍrus da qripe sazo- nal por aqroinfiltração em plantas N. benthamiana A capacidade do sistema de expressão transiente produzir he- . maglutinina da gripe sazonal foi determinada através da expressão do subti- po Hl de cepas de A/8risbane/59/2007 (H1N1) (plasmideo N° 774), A/Nova 20 Caledônia/20/1999 (H1N1) (plasmídeo N° 540) e A/llhas Salomão/3/2006 (H1N1) (plasmídeo N° 775). As sequências de codificação de gene hemaglu- tinina foram primeiro montadas no cassete de expressão de plastocianina - promotor, 5'UTR, 3'UTR e sequências de terminação de transcrição a partir do gene de alfafa plastocianina - e os cassetes montados foram inseridos 25 em um plasmídeo binário de pCAMBIA.

Os pIasmídeos foram então trans- fectados em Agrobacterium (AGLI), produzindo cepas de Agrobacterium AGLI/774, AGLI/540 e AGL1/775, respectivamente.

Plantas de N. benthamiana foram infiltradas com AGL1/774, AGL1/540 e AGL1/775, e as folhas foram coletadas após um período de seis 30 dias.

Para determinar se H1 se acumulou nas folhas agroinfiltradas, a prote- ina foi primeiro extraída de tecido de folha infiltrado e analisada por Western blotting usando anticorpos anti-H1. Uma faixa única de aproximadamente 72 kDa foi detectada em extratos (Figura 47), correspondendo em tamanho a forma de HAO não-clivada de hemaglutinina da gripe. lsto demonstra que expressão de cepas epidêmicas anuais diferentes de hemaglutinina em fo- lhas infiltradas resulta no acúmulo do produto de translação não-clivado. 5 Exemplo 15: Expressão transiente de hemaglutinina de vÍrus da qripe pan- dêmico potencial por aqroinfiltração em plantas de N. benthamiana A capacidade do sistema de expressão transiente para produzir hemaglutinina da gripe potencial foi determinada através da expressão do subtipo H5 de cepas de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (plasmídeo N° 781), 10 A/lndonésia/5/2005 (H5N1) (plasmídeo N° 660) e A/Vietnã/1194/2004 (H5N1) (plasmideo #782). As sequências de codificação de gene de hema- glutinina foram primeiro montadas no cassete de expressão de pIastocianina - promotor, 5'UTR, 3'UTR e sequências de terminação de transcrição a partir do gene de alfafa plastocianina - e os cassetes montados foram inseridos 15 em um plasmídeo binário de pCAMBIA. Os plasmídeos foram então trans- " fectados em Agrobacterium (AGLI ).

V Plantas de N. benthamiana foram infiltradas com AGL1/781, AGL1/660 e AGL1/782, e as folhas foram coletadas após um período de seis dias. Para determinar se H5 se acumulou nas folhas agroinfiltradas, a prote- 20 Ína foi primeiro extraída de tecido de folha infiltrado e analisado por Western blotting usando anticorpos anti-H5. Uma faixa única de aproximadamente 72 kDa foi detectada nos extratos (Figura 48), correspondendo em tamanho a forma de HAO não-clivada de hemaglutinina da gripe. lsto demonstra que expressão de cepas pandêmicas potenciais diferentes de hemaglutinina em 25 folhas infiltradas resulta no acúmulo do produto de translação não-clivado. Exemplo 16: Expressão transiente de H5 por açjroinfiltração em plantas de N. tabacum A capacidade do sistema de expressão transiente para produzir hemaglutinina da Gripe em folhas de Nicotiana tabacum foi analisada atra- 30 vés da expressão do subtipo H5 de cepa de A/lndonésia/5/2005 (H5N1) (plasmídeo N° 660). As sequências de gene de hemaglutinina foram primeiro montadas no cassete de expressão de plastocianina - promotor, 5'UTR,

3'UTR e sequências de terminação de transcrição a partir do gene de alfafa plastocianina gene - e os cassetes montados foram inseridos em plasmídeo binário de pCAMBIA.

Os plasmídeos foram então transfectados em Agrobac- terium (AGLI). 5 PIantas de N. tabacum foram infiltradas com AGL1/660 e as fo- lhas foram coIetadas após um perlodo de seis dias.

Para determinar se H5 se acumulou nas folhas agroinfiltradas, a proteína foi primeiro extraída de tecido de folha infiltrado e analisado por Western blotting usando anticorpos anti-H5. Uma faixa única de aproximadamente 72 kDa foi detectada nos ex- lO tratos (Figura 49), correspondendo em tamanho a forma de HAO não-clivada de hemaglutinina da gripe. lsto demonstra que expressão de hemaglutinina em folhas de N. tabacum infiltradas resulta no acúmulo do produto de trans- lação não-clivado.

Exemplo 17: lmunoqenicidade de vacina de H5N1 VLP produzida por planta 15 de A/lndonésia/5/05 (H5N1) em furões Um estudo de escala de dose em furões foi realizado para avali-

4 ar a imunogenicidade de VLPS derivadas de planta.

Reatividade cmzada in vitro de anticorpo de soro que induz a vacina de H5 VLP em 3 doses (1,5 e 15 µg) foi avaliada por inibição de hemaglutinação de três outras cepas de 20 H5N1 - A/peru/Peru/1/05 (cIade 2.2), A/Vietnã/1194/04 (clade 1) e A/Anhui/5/05 (todos os vÍrus totais inativados), usando soro tomado 14 dias após a primeira dose de vacina (Figura 50A), e 14 dias após a segunda dose (Figura 50 B). Para todas as 3 concentrações de dose, reatividade cruzada é observada. 25 Exemplo 17: Análise dos resultados da imunoçjenicidade de acordo com o critério de CHMP.

O Comitê EMEA'S para Produtos Medicinais para Uso Humano (CHMP) (http://.emea.europa.eu/htms/general/contacts/CHMP/CHMP.html) ajus- 30 ta três critérios (aplicados em seguida a segunda dose) para eficácia de va- cina: 1 —Número de soroconversão ou aumento significante nas titulações de H1 (4 vezes) "40%; 2 - Aumento geométrico médio de pelo menos 2,5; 3 -

proporção de indivíduos que alcançam uma titulação de Hl de 1/40 deve ser pelo menos 7Õ°/o.

A análise destes critérios no modelo de furão é mos- trada nas Tabelas 8-11. (*) é indicativo de encontrar ou exceder os critérios de CHMP.

Um resumo de análise de imunogenicidade cruzada em relação 5 aos critérios de CHMP para licenciamento é mostrado na Tabela 12. Os animais foram avaliados diariamente para peso corpóreo, temperatura e condição total.

Nenhum sinal de doença ou desconforto foi registrado durante o estudo.

O peso corpóreo e temperatura estavam dentro de faixas normais durante o estudo.

A vacina foi segura e tolerada pelos a- lO nimais do estudo.

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Tabela 12: Resumo de análise de imunoqenicidade cruzada em relação a critério de CHMP para licenciamento.

Cepa Critério Grupo de estudo Com ad- 5µg com 15 µg com juvante adjuvante adjuvante

A/peru/Turkey/1/ °/, 4-vezes aumento na titu- 8Oq/o* 100°6 * 80O/j*

05 (clade 2.2 lação de Hl aumento de 10.6* 20.8* 7, 7* média geométrica °/, de 1OO°/o * 1OO°/, * 1OO°/o * tituiação de Hl de 1/40 A/Anhui/1/05 °/) 4-vezes aumento na titu- 1OC)°/o* I 100%* j 6O°/, * (clade 2.3) lação de Hl aumento de 11.8* ) 14.4* i 3* média geométrica °/) de 1OO°/o * I 8Õ°/o * I 8O°/,* titulação de Hl de 1/40 A/Vietnã/1194/0 °/) 4-vezes aumento na titu- 60% 80%* 60% 4 (clade 1) lação de H1 aumento de 2.3 i 7.1* i 1.78 média geométrica °/) de 0°/0 i 80% * I 2Õ°/o titulação de H1 de 1/40

Exemplo 18: Seleção de sequências de nucleotídeo de hamaqlutinins As sequências de nucleotldeo da HA foram recuperadas de uma 5 base de dados de sequência de Gripe (vide URL: flu.lanl.qov), ou a fonte NCBI de vÍrus da gripe (vide URL: ncbi.n.m.hih.gov/genomes/FLU/FLU.html). Para várias das sequências de ácido nucleico de HA, entradas múltiplas são listadas nas bases de dados (Tabela 13). Alguma variação é associada prin- cipalmente com o sistema de cultura (Origem - MDCK, ovo, desconhecida, viral RNA/isolado clínico); por exemplo, o local de glicosilação na posição 194 (numeração de proteína matura) da HA está ausente quando vÍrus da gripe tipo B é expresso em fluido alantóico de ovos (vide também Chen et al., 2008). Para algumas sequências, domínios podem estar carecendo (por exemplo, clones incompletos, artefatos de sequenciamento, etc.). A sequên- cia de hemaglutinina pode ser dividida em 5 domínios: peptídeo de sinal (SP), HAI, HA2, transmembrana (DTm) e cauda citoplásmica.

Os domínios de uma primeira sequência podem ser combinados com um domínio de uma segunda sequência existente, por exemplo, o peptídeo de sinal de uma pri- meira sequência de cepa pode ser combinado com o restante da sequência de codificação de hemaglutinina de uma segunda cepa para proporcionar uma sequência de codificação completa.

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Y, N - Sim, Não, respectivamente SP - presença e sequência àe peptídeo de sinal Y/N HAI - dominio de HAI completo Y/N HA2 - domínio de HA2 completo Y/N 5 DTm - domínio de transmembrana completo Y/N Cepa: Hl de Nllhas Salomão/3/2006 Oito sequências de aminoácido foram comparadas, e variações identificadas. (Tabela 14). Posição 171 exibiu uma variação de glicina (G) ou arginina (R) em algumas sequências. 10 Tabela 14: A/llhas Salomão/3/2006 variação de aminoácido r"_' ' '"_ Aminoácido #* MDCK Ovo 212 K T 241 Q R 542 L R Numeração a partir do começo M

- Cepa: H1 de A/8risbane/59/2007 . Posição 203 exibiu uma variação de ácido aspártico (D), isoleu- . cina (I) ou asparagina (N). 15 Cepa: H3from AJ8risbane/10/2007 Variações de sequência foram observadas nas 5 posições (Ta- bela 15). Na posição 215, uma anulação é observada em duas sequências amostradas.

Tabela 15: H3 de N8risbane/10/2007 variação de aminoácido Origem 202, 210, 215, 235 242* ISDN274893 Ovo VL-YI ISDN273759 Ovo GPASl EU199248 Ovo GPASI d

EU199366 Ovo GPASI ISDN273757 Ovo VL-SS a

ISDN257043 Ovo GPASl EU199250 MDCK GLASI ISDN375357 T Ovo ISDN260430 I Ovo I GPASl

Origem 202, 210, 215, 235 242* ISDN256751 Ovo GPASl ISDN257648 MDCK GLASI * Numeração a partir do começo M Cepa: H3 para A/Wisconsin/67/2005 Variações de sequência nesta cepa foram observadas nas 4 po- sições (Tabela 16). 5 Tabela 16: H3 de A/Wisconsin/67/2005 variação de aminoácido Origem 138, 156, 186, 196 ISDN138724 Desconhecida AHGH DQ865947 Desconhecida SHVY EF473424 Desconhecida AHGH ISDN138723 Ovo SQVY ISDN131464 Desconhecida AHGH EF473455 Ovo AHGH "'·— * Numeração a partir da proteína matura r Cepa: de B/Malásia/2506/2004

E Variação em duas posições é observada (Tabela 17). Posição 120 não é um local de glicosilação; posição 210 é envolvida na glicosilação; 10 esta glicosilação é abolida em seguida a cultura em ovos. Tabela 17: Hemaqlutinina de B/Malásia/2506/2004 variação de aminoácido Aminoácido # : MDCK Egg 120 K N 210 T A * Numeração a partir da parte intermediária de SP Cepa: hemaqlutinina de B/Flórida/4/2006; ISDN261649 Variações observadas incluem variação de sequência de amino- " 15 ácido na posição 211, dependendo do sistema de cultura. Asparatina (N) é encontrada em sequências isoladas de células de MDCK, enquanto ácido

W glutâmico (D) é encontrado em sequência isolada de ovos. A posição 211 é um local de glicosilação, e é abolida em seguida a cultura em ovos. Cepa: H2 de A/Sinqapura/'1/1957 20 Variações de sequência foram observadas nas 6 posições (Ta-

bela 18). Tabela 18: H2 de variação de aminoácido de A/Sinqapura/1/1957 Origem Aminoácido No. 166 168 199\236 238 358 L20410 Viral RNA KETLSV Ll1142 Desconhecida EGKLSI AB296074 Desconhecida KGTQGV Consenso KGTQ/LGV I A/Japan/305/1957 i

1 Numeração a partir da proteína matura Cepas: H5 de AJVietnã/1194/2004 e H5from A/Anhui/1/2005 5 Não existem variações observadas na sequência de aminoácido sob alinhamento das sequências primárias de qualquer destas cepas H5. Cepa: H6 de A/Cerceta/Honçj Konq/W312/1 997 Somente uma entrada foi disponível para cepa (AF250179). Cepa: H7 para A/Equino/Praçja/56 " 10 Um total de 2 entradas de sequências foram encontradas nas

- bases de dados.

A entrada AB298877 foi excluída, visto que ela é um "reas- sortant" laboratorial.

Cepa: H9 de A/Honçj Konçj/1073/1999; AJ404626 Um total de 2 entradas de sequências foram encontradas nas 15 bases de dados.

Somente uma foi completa.

Todas as citações são, desse modo, incorporadas por referên- cia.

A presente invenção foi descrita com relação a uma ou mais concretizações.

Contudo, será aparente aos técnicos no assunto que um 20 número de variações e modificações pode ser feita sem fugir do escopo da invenção as definida nas reivindicações.

Listaqem de Referências: Aymard, H.

M, M. T.

Coleman, W.

R.

Dowdle, W.

G.

Laver, G.

C.

Schild, and R.

G.

Webster. 1973. lnfluenza virus neuraminidase-inhibition 25 test procedures.

Bull.

W.H.O. 48: 199-202 Bollag, D.M., Rozycki, M.D., and Edelstein, S.J. (1996) Protein methods (2"'edition). Wiley-Liss, Nova York, USA. Bligh, FOR EXAMPLE, & Dyer, W.J. Can. J. Med. Sci. 37, 911- 917 (1959). Chen, B.J., Leser, G.P., Morita, E., and Lamb R.A. (2007) lnflu- 5 enza Virus hemaglutinina e neuraminidase, but not the matrix protein, are required for assembly e budding of plasmid derived virus like particles. J. Vi- rol. 81,7111-7123. Chen Z, Aspelund A, Jin H. 2008 Stabilizing the glycosylation pattern of lnfluenza B hemaglutinina following adaptation to growth in eggs. 10 Vacinne vol 26 p 361-371 Crawford, j., Wilkinson, B., Vosnesensky, A., Smith, G., Garcia, M., Stone, H., and Perdue, M. L. (1999). Baculovírus-derived hemaglutinina vaccine protect against lethal Influenza infections by avian H5 and H7 subty- pes. Vaccine 17,2265-2274. 15 Darveau, A., Pelletier, A. & Perreault, J. PCR-mediated synthesis of chimeric molecules. Métodos Neurosc. 26, 77-85 (1995). Grgacic EVL, Anderson DA. Partucles similar to lnfluenza: pass- - port to immune recognition. Métodos 2006; 40: 60-65. Gillim-Ross, L., and Subbarao, K. (2006) Emerging respiratory 20 viruses: chanllenges and vaccine strategies. Clin. Microbioi. Rev. 19, 614-

636. Gomez-Puertas, P., Mena, I., Castillo, M., Vivo, A., Perez- Pastrana, E. and Portela, A. (1 999) Efficient formation of lnfluenza virus-like particles: dependence on the expressão level of viral proteins. J. Gen. Virol. 25 80,1635-1645. Gomez-Puertas, P., Albo, C, Perez-Pastrana, E., Vivo, A., and Portela, A. (2000) lnfluenza Virus protein is the major driving force in virus budding. J Virol. 74, 11538-11547. Hamilton, A., Voinnet, O., Chappell, L. & Baulcombe, D. Two 30 classes of short interfering RNA in RNA silencing. EMBO J. 21, 4671 -4679 (2002). Hôfgen, R. & Willmitzer, L. Storage of competent cells for Agro-

bacterium transformation. Acid nuc/e/co Res. 16, 9877 (1988). Harbury PB, Zhang T, Kim PS, Alber T. (1993) A switch between two-, three-, e four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science; 262: 1401-1407) 5 Horimoto T., Kawaoka Y. Strategies for developing vaccinas aga- inst h5Nl Influenza a viruses. Trends in Mol. Med. 2006; 12(11):506-514. Huang Z, Elkin G, Maloney BJ, Beuhner N, Arntzen CJ, Thana- vala Y, Mason HS. VÍrus-like particle expression and assembly in plants: he- patitis B and Norwalk viruses. Vaccine. 2005 Mar 7;23(15):1851-8. 10 Johansson, B. E. (1999). lmmunization with lnfluenza A virus hemaglutinina and neuraminidase produced in recombinant baculovirus re- sults in a balanced and broadened immune response superior to conventio- nal vaccine. Vaccine 17, 2073-2080. Latham, T., and Galarza, J. M. (2001). Formation of wild-type 15 and chimeric lnfluenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins J. Virol. 75,61 54- 6165. Lefebvre, B. et al. P/ant Physiol. 144, 402-418 (2007). - Leutwiler LS et al 1986. Nucleic Acid Sresearch 14910):4051-64 Liu, L & Lomonossoff, G.P. Agroinfection as a rapid method for 20 propagating Cowpea mosaic virus-based constructs. J. Virol. Métodos 105, 343-348 (2002). Macala, L.J., Yo, R.K. & Ando, S.JLip/deoRes. 24, 1243-1250 (1983) Mattanovich, D., Ruker, F., da Camara Machado, A., Laimer, M, 25 Regner, F., Steinkellner, H., Himmler, G., and Katinger, H. (1989) Efficient transformation of Agrobacterium spp. By electroporation. Nucl. Ac. Res. 17,

6747. Mena, I., Vivo, A., Perez, E., and Portela, A. (1996) Rescue of synthetic chloramphenicol acetyltransferase RNA into Influenza virus-like 30 particles obtained from recombinant plasmids. J. Virol. 70, 5016-5024. Mongrand S, Morel J, Laroche j, Claverol S, Carde JP, Hart- mann MA et al.. Lipide rafts in higher plant cells. The Journal of Biologica!

Chemistry 2004; 279(35): 36277-36286. Neumann, G., Watanabe, T., and Kawaoka, Y. (2000) Plasmid- driven formation of virus-like particles. J. Virol. 74, 547-551. Nayak DP, Reichl U. (2004) Neuraminidase activity assays for 5 monitoring MDCK cell culture derived lnfluenza virus. J Virol Métodos 122(1):9-15. Olsen, C. W., McGregor, M. W., Dybdahl-Sissoko, N., Schram, B. R., Nelson, K. M., Lunn, D., Macklin, M. D., and Swain, W. F. (1997). lm- munogenicity and efficacy of baculovirus- expressed and DNA-based equine 10 influenza virus hemaglutinina vaccinas in mice. Vaccina 15, 1149-1156. Quan FS, Huang C, Compans RW, Kang SM. Virus-like particle vaccine induces protective immunity against homologous and heterologous strains of lnfluenza virus. journal of Virology 2007; 81(7): 3514-3524. Rowe, T. et al. 1999. Detection of antibody to avian lnfluenza a 15 (h5Nl) virus in human serum by using a cmbiation of serologic assays. J. Clin Microbiol 37(4):937-43 Saint-jore-Dupas C et al. 2007. From plant to pharma

W with glycosylation in the toolbox. Trends in Biotechnology 25(7) :317-23 Sambrook J, and Russell DW. Molecular cloning: a Iaboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 20 2001.

Stockhaus J et al 1987. Analysis of cis-active sequences invol- ved in the Ieaf-specific expression of a potato gene in transgenic plants. Pro- ceedings of the National Academy of Sciences U.S.S. 84(22):7943-7947. 25 Stockhaus J et al 1989. ldentification of enhancer elements in the upstream region of the nuclear photosynthetic gene ST-LSI. Planta Cell. 1(8):805-13. Suzuki, Y. (2005) Sialobiology of Influenza. Molecular mecha- nism of host range variation of lnfluenza virus. Biol. Pharm. Bull 28, 399-408. 30 Tsuji m., Cell. Mol. Life Sci., 63 (2006); 1889-1898 Wakefield L., G.G. Brownlee Nuc Acid Res. 17 (1989); 8569-

8580.

Kendal, AP, Pereira MS, Skehel j.

Concepts and procedures for laboratory-based Influenza surveillance.

Atlanta:CDC; 1 982. p.Bl 7-B35. WHO.

Manual on animal lnfluenza diagnosis and surveillance.

Department of communicable disease surveillance e response.

World Health 5 Organisation GIobal lnfluenza Program. 2002. Skehel JJ and Wildy DC Ann Rev Biochem 2000 69:531-69 Vaccaro L et al 2005. Biophysical J. 88:25-36. Gamblin, S.J., Haire, L.F., Russell, R.J., Stevens, D.J., Xiao, B., Ha, Y., Vasisht, N., Steinhauer, D.A., Daniels, R.S., Elliot, A., Wiley, D.C., Skehel, J.J. (2004) The structure and receptor binding properties of the 1918 hemaglutinina lnfluenza.

Science 303: 1838-1 842

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotí- deo que codifica uma hemaglutinina da gripe (HA) operativamente ligada a uma região regulatória ativa em uma planta. 5 2. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, no qual a hemaglutinina da gripe é selecionada a partir do grupo consistindo em Hl, H

2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, HlO, H11, H12, H13, H14,H15, e H16.

3. Método de produção de partículas similares a vÍrus da gripe (VLPS) em uma planta compreendendo: 10 a) introdução do ácido nucleico como definida na reivindicação 1 na planta, ou porção desta, e b) incubação da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo, desse modo, as VLPS.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, no qual na etapa de 15 introdução (etapa a), o ácido nucleico é transientemente expresso na pIanta.

-

5. Método de acordo com a reivindicação 3, no qual na etapa de introdução (etapa a), o ácido nucleico é estavelmente expresso na planta. .

6. Método de acordo com a reivindicação 3, compreendendo a- dicionalmente a etapa de 20 C) coleta do hospedeiro e purificação das VLPS.

7. Partícula similar a vÍrus (VLP) compreendendo uma proteína HA de vÍrus da gripe e uma ou mais do que um Iipídeo derivado de uma pIanta.

8. Particula similar a vÍrus (VLP) de acordo com a reivindicação 25 7, no qual a proteína HA da gripe é H5 lndonésia.

9. Composição compreendendo uma dose efetiva da VLP como definido na reivindicação 7, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

10. Método de indução de imunidade a uma infecção de virus da gripe em um indivíduo, compreendendo administrar a partícula similar a vÍrus 30 como definido na reivindicação 7.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, no qual a partlcu- la similar a vÍrus é administrada a um indivíduo oralmente, intradermalmente,

Ç) intranasalmente, intramuscularmente, intraperitonealmente, intravenosamen- te, ou subcutaneamente.

12. Particula similar a vÍrus (VLP) compreendendo um vÍrus da gripe HA suportando N-glicans especificas de planta, ou N-glicans modifica- 5 das.

13. Composição compreendendo uma dose efetiva da VLP de acordo com a reivindicação 12, e um transportador farmaceuticamente acei- tável.

14. Método de indução de imunidade a uma infecção de vÍrus da gripe em um indivíduo, compreendendo administrar a composição de acordo com a reivindicação 13.

15. Método de acordo com a reivindicação 11, no qual a compo- sição é administrada a um indivíduo oralmente, intradermalmente, intrana- salmente, intramuscularmente, intraperitonealmente, intravenosamente, ou subcutaneamente.