BRPI0815543B1 - Processo in vitro para previsão da resposta de um paciente com câncer de pulmão de não pequenas células ao tratamento com erlotinib, e usos in vitro de um gene ptprf e de erlotinib - Google Patents

Abstract

MARCADOR DE PREVISÃO PARA TRATAMENTO COM INIBIDOR DE EGFR. A presente invenção fornece um biomarcador que é capaz de prever o benefício clínico do tratamento com inibidor de EGFR em pacientes com câncer.

Description

A presente invenção refere-se a um biomarcador que é capaz de prever o benefício clínico do tratamento com inibidor de EGFR em pacientes com câncer.

Várias malignidades humanas estão associadas à expressão aberrante ou à superexpressão do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). O EGF, fator de crescimento transformante-? (TGF-?) e vários outros ligantes se ligam ao EGFR, estimulando a autofosforilação do domínio de tirosina quinase intracelular do receptor. Uma variedade de vias intracelulares é subsequentemente ativada e estes eventos a jusante resultam na proliferação de células tumorais in vitro. Foi postulado que a simulação de células tumorais através do EGFR pode ser importante tanto para o crescimento de tumor quanto para a sobrevivência de tumor in vivo.

Dados clínicos iniciais com Tarceva®, um inibidor da EGFR tiro- sina quinase, indicam que o composto é seguro e geralmente bem tolerado em doses que fornecem a concentração eficiente buscada (que é determinada por dados pré-clínicos). Os testes clínicos em fases I e II em pacientes com doença avançada demonstraram que o Tarceva® possui atividade clínica promissora em uma faixa de tumores epiteliais. Na verdade, foi mostrado que o Tarceva® é capaz de induzir remissões parciais duráveis em pacientes tratados anteriormente com câncer de cabeça e pescoço e NSCLC (Câncer pulmonar sem ser de células pequenas) de uma ordem similar à quimioterapia de segunda linha estabelecida, mas com o benefício adicional de um melhor perfil de segurança que a quimioterapia e maior conveniência (comprimido em vez de administração intravenosa [i.v.]). Um teste controlado com placebo duplo cego aleatório completado recentemente (BR.21) mostrou que o agente Tarceva® isolado prolonga e aumenta significativamente a sobrevivência de pacientes com NSCLC para os quais a terapia padronizada para doença avançada falhou.

O Tarceva® (erlotinib) é uma molécula química pequena; é um inibidor da EGFR tirosina quinase (EGFR-TKI) seletivo potente ativo oralmente.

O câncer pulmonar é a causa principal de morte relacionada ao câncer na América do Norte e na Europa. Nos Estados Unidos, o número de mortes secundárias ao câncer pulmonar excede as mortes totais combinadas decorrentes da segunda (cólon), da terceira (mama) e da quarta (próstata) causas principais de mortes por câncer combinadas. Aproximadamente 75% até 80% de todos os cânceres pulmonares são NSCLC, com aproximadamente 40% dos pacientes apresentando doença avançada local e/ou que não pode ser removida cirurgicamente. Este grupo inclui tipicamente aqueles com doença volumosa nos estágios IIIA e IIIB, excluindo efusões pleurais malignas.

A incidência bruta de câncer pulmonar na União Europeia é de 52,5, a taxa de mortalidade de 48,7 casos/100000/ano. Entre os homens as taxas são de 79,3 e 78,3, entre as mulheres de 21,6 e 20,5, respectivamente. O NSCLC é responsável por 80% de todos os casos de câncer pulmonar. Aproximadamente 90% da mortalidade causada por câncer pulmonar entre os homens e 80% entre as mulheres, é atribuída ao fumo.

Nos EUA, de acordo com a American Cancer Society, durante 2004, havia aproximadamente 173.800 novos casos de câncer pulmonar (93.100 em homens e 80.700 em mulheres) e eram responsáveis por aproximadamente 13% de todos os cânceres novos. A maior parte dos pacientes morre como uma consequência de sua doença dentro de um período de dois anos do diagnóstico. Para muitos pacientes com NSCLC, o tratamento bem sucedido permanece evasivo. Os tumores avançados frequentemente não são suscetíveis à cirurgia e também podem ser resistentes a doses toleráveis de radioterapia e quimioterapia. Em testes aleatórios, as quimioterapias de combinação mais ativas atualmente atingiram taxas de resposta de aproximadamente 30% até 40% e uma taxa de sobrevivência de 1 ano entre 35% e 40%. Este é realmente um avanço em relação à taxa de sobrevivência em 1 ano de 10% observada com tratamento apenas de suporte.

Até recentemente as opções terapêuticas para pacientes reincidentes após a recaída eram limitadas a um melhor cuidado de suporte ou paliativo. Um teste recente que compara o docetaxel (Taxotere) com melhor cuidado de suporte mostrou que pacientes com NSCLC poderiam se beneficiar da quimioterapia de segunda linha após os regimes de primeira linha baseados em cisplatina terem falhado. Os pacientes de todas as idades e com condição de desempenho de ECOG de 0, 1 ou 2 demonstraram maior sobrevivência com docetaxel, que aqueles que tinham sido refratários ao tratamento baseado em platina anterior. Os pacientes que não se beneficiaram da terapia incluíam aqueles com perda de peso de 10%, altos níveis de lactato desidrogenase, envolvimento de vários órgãos ou envolvimento do fígado. Adicionalmente, o benefício da monoterapia com docetaxel não se estendia além do ajuste de segunda linha. Os pacientes que receberam o docetaxel como tratamento de terceira linha ou além não exibiram prolongamento da sobrevivência. O docetaxel como único agente se tornou uma terapia de segunda linha padronizada para NSCLC. Recentemente outro teste em fase III aleatório na terapia de segunda linha de NSCLC comparou o pemetrexed (Alimta®) com o docetaxel. O tratamento com pemetrexed resultou em uma eficácia clinicamente equivalente, mas com efeitos colaterais significativamente menores comparados com os do docetaxel.

É reconhecido há muito tempo que há uma necessidade de desenvolver métodos de tratamento de câncer individualizados. Com o desenvolvimento de tratamentos para câncer direcionados, há um interesse particular em metodologias que poderiam fornecer um perfil molecular do tumor alvo, (isto é, aquele que pode prever o benefício clínico). Já foi estabelecida uma prova de princípio para a obtenção do perfil de expressão gênica no câncer com a classificação molecular de tipos de tumores que não são evidentes com base nos testes morfológicos e imuno-histoquímicos atuais. Duas entidades de doença separadas foram identificadas com prognósticos diferentes partindo da única classificação atual de linfoma de células B difusas utilizando a obtenção do perfil de expressão gênica.

Portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer biomar- cadores de expressão que podem prever o benefício clínico do tratamento com inibidor de EGFR em pacientes com câncer.

Em um primeiro objetivo, a presente invenção fornece um método in vitro de previsão do benefício clínico de um paciente com câncer em resposta ao tratamento com um inibidor de EGFR que compreende as etapas: de determinação de um nível de expressão de um gene PTPRF em uma amostra de tumor de um paciente e de comparação do nível de expressão do gene PTPRF com um valor representativo de um nível de expressão do gene PTPRF em tumores de uma população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento, em que um nível de expressão maior do gene PTPRF na amostra de tumor do paciente é indicativo de um paciente que obterá benefício clínico partindo do tratamento.

A abreviação PTPRF significa a proteína tirosina fosfatase, do tipo receptor, F. A Seq. Id. N° 1 mostra a sequência de nucleotídeos da PTPRF humana, variação de transcrição 1 e a Seq. Id. N° 2 mostra a sequência de nucleotídeos da variante de transcrição PTPRF humana 2.

O termo "um valor representativo de um nível de expressão de PTPRF em tumores de uma população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento" refere-se a uma estimativa do nível médio de expressão do gene PTPRF em uma população de pacientes que não obtêm um benefício clínico partindo do tratamento. Benefício clínico foi definido como possuindo uma resposta objetiva ou uma estabilização da doença durante >12 semanas.

Em uma modalidade preferida adicional, o gene PTPRF exibe um nível de expressão entre 1,1 e 1,8, preferivelmente 1,1 e 1,6 ou mais vezes maior na amostra de tumor do paciente comparado a um valor representativo da população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento.

Em uma modalidade preferida adicional, o gene PTPRF exibe um nível de expressão entre 1,2 e 1,8 ou mais vezes maior na amostra de tumor do paciente comparado a um valor representativo da população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento.

Em uma modalidade preferida, o nível de expressão do gene marcador é determinado através da tecnologia de microarranjo ou outras tecnologias que avaliam os níveis de expressão de RNA como a RT-PCR quantitativa ou através de qualquer método que considera o nível de expressão da respectiva proteína, por exemplo, imuno-histoquímica (IHC). A construção e o uso de chips gênicos são bem-conhecidos na técnica, vide as Pa-tentes U.S. N— 5.202.231; 5.445.934; 5.525.464; 5.695.940; 5.744.305; 5.795.716 e 1 5.800.992. Vide também, Johnston, M. Curr. Biol. 8:R171-174 (1998); Iyer VR e outros, Science 283:83-87 (1999). Evidentemente, o nível de expressão gênica pode ser determinado através de outros métodos que são conhecidos por um versado na técnica tais como, por exemplo, northern blots, RT-PCR, PCR quantitativa em tempo real, extensão de iniciadores, proteção à RNase, obtenção do perfil de expressão de RNA.

O gene marcador da presente invenção pode ser combinado com outros biomarcadores em conjuntos de biomarcadores. Os conjuntos de biomarcadores podem ser construídos partindo de qualquer combinação de biomarcadores de previsão para realizar previsões em relação ao efeito do tratamento com inibidor de EGFR em pacientes com câncer. Os biomarcadores e os conjuntos de biomarcadores descritos aqui podem ser utilizados, por exemplo, para prever como os pacientes com câncer responderão à intervenção terapêutica com um inibidor de EGFR.

O termo "gene", como utilizado aqui, compreende variações do gene. O termo "variação" refere-se a sequências de ácidos nucleicos que são substancialmente similares às sequências de ácidos nucleicos fornecidas pelo número de acesso do GenBank. O termo "substancialmente similar" é bem entendido por um versado na técnica. Em particular, uma variação gênica pode ser um alelo que exibe alterações de nucleotídeos quando comparado à sequência de ácido nucleico do alelo mais prevalecente na população humana. Preferivelmente, tal sequência de ácido nucleico substancialmente similar possui uma similaridade de sequência com o alelo mais prevalecente de pelo menos 80%, preferivelmente de pelo menos 85%, mais preferivelmente de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95%. Entende-se também que o termo "variantes” se refere a variantes de união.

O inibidor de EGFR pode ser selecionado do grupo que consiste de gefitinib, erlotinib, PKI-166, EKB-569, GW2016, CI-1033 e um anticorpo anti-erbB tal como trastuzumab e cetuximab.

Em outra modalidade, o inibidor de EGFR é erlotinib.

Ainda em outra modalidade, o câncer é NSCLC.

As técnicas para a detecção e para a quantificação da expressão gênica dos genes descritos por esta invenção incluem, mas não estão limitadas a northern blots, RT-PCR, PCR quantitativa em tempo real, extensão de iniciadores, proteção à RNase, obtenção do perfil de expressão de RNA e técnicas relacionadas. Estas técnicas são bem-conhecidas pelos versados na técnica vide, por exemplo, Sambrook J e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2000).

As técnicas para a detecção da expressão de proteínas dos respectivos genes descritos por esta invenção incluem, mas não estão limitadas à imuno-histoquímica (IHC).

De acordo com a invenção, as células de uma amostra de tecido do paciente, por exemplo uma biópsia de tumor ou de câncer, podem ser analisadas para determinar o padrão de expressão de um ou mais biomar- cadores. O sucesso ou o fracasso de um tratamento para câncer pode ser determinado com base no padrão de expressão do biomarcador das células provenientes do tecido de teste (células de teste), por exemplo, biópsia de tumor ou -de câncer, como sendo relativamente similar ou diferente do padrão de expressão de um conjunto de controle do um ou mais biomarcado- res. No contexto desta invenção, foi observado que o gene da tabela 3 é regulado para mais, isto é, exibe um nível de expressão maior, em tumores de pacientes que obtiveram benefício clínico partindo do tratamento com inibidor de EGFR comparados a tumores de pacientes que não obtiveram benefício clínico partindo do tratamento com inibidor de EGFR. Assim, se as células de teste exibirem um perfil de expressão de biomarcador que correspon de aquele de um paciente que respondeu ao tratamento para câncer, é altamente provável ou previsto que o câncer ou o tumor do indivíduo responderá favoravelmente ao tratamento com o inibidor de EGFR. Em contraste, se as células de teste exibirem um padrão de expressão de biomarcador que corresponde aquele de um paciente que não respondeu ao tratamento para câncer, é altamente provável ou previsto que o câncer ou o tumor do indivíduo não responderá ao tratamento com o inibidor de EGFR.

O biomarcador da presente invenção, isto é, o gene listado na tabela 3, é uma primeira etapa em direção a uma terapia individualizada para pacientes com câncer, em particular, pacientes com NSCLC refratário. Esta terapia individualizada permitirá que os médicos que estão fazendo o tratamento selecionem o agente mais apropriado dos fármacos existentes para terapia para câncer, em particular, NSCLC. Os benefícios da terapia individualizada para cada paciente futuro são: as taxas de resposta/o número de pacientes que se beneficiam aumentarão e o risco de efeitos colaterais adversos causados pelo tratamento ineficiente será reduzido.

Em um objetivo adicional, a presente invenção fornece um método terapêutico de tratamento de um paciente com câncer identificado pelo método in vitro da presente invenção. O dito método terapêutico compreende a administração de um inibidor de EGFR ao paciente que foi selecionado para o tratamento baseado no padrão de expressão do gene de previsão da tabela 3. Um inibidor de EGFR preferido é erlotinib e um câncer preferido para ser tratado é NSCLC.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra o planejamento do estudo;

A Figura 2 mostra o esquema de processamento de amostras;

A Figura 3a mostra os níveis de expressão de PTPRF versus o resultado clínico para a obtenção de perfil com Genechip®;

A Figura 3b mostra os níveis de expressão de PTPRF versus o resultado clínico para qRT-PCR e

A Figura 3c mostra a correlação entre as medidas de Genechip® e qRT-PCR para o PTPRF.

Parte Experimental Base Lógica para o Estudo e Planejamento do Estudo

Recentemente foram descritas mutações dentro do gene EGFR no tecido de tumor de um subconjunto de pacientes com NSCLC e a associação destas mutações com sensibilidade ao erlotinib e ao gefitinib (Pao W, e outros 2004; Lynch e outros 2004; Paez e outros 2004). Para os pacientes combinados de dois estudos, o EGFR mutado foi observado em 13 de 14 pacientes que responderam ao gefitinib e em nenhum dos 11 pacientes tratados com gefitinib que não responderam. A prevalência relatada destas mutações era de 8% (2 de 25) em pacientes com NSCLC não selecionados. Estas mutações foram observadas mais frequentemente em adenocarcinomas (21%), em tumores de mulheres (20%) e em tumores de pacientes japoneses (26%). Estas mutações resultam na maior atividade in vitro de EGFR e na maior sensibilidade ao gefitinib. A relação das mutações com a doença estável prolongada ou com a duração de sobrevivência não foi avaliada de forma previdente.

Com base nas análises exploratórias provenientes do estudo BR.21, parecia improvável que a vantagem de sobrevivência observada fosse somente devido às mutações de EGFR, uma vez que uma vantagem de sobrevivência significativa é mantida mesmo quando pacientes com resposta objetiva são excluídos das análises (dados no arquivo). Outros mecanismos moleculares também têm que contribuir para o efeito.

Com base na suposição de que há alterações nos níveis de expressão gênica que podem prever uma resposta/benefício em relação ao tratamento com Tarceva®, foi utilizada uma análise de microarranjos para detectar estas alterações.

Isto requeria uma população de estudo claramente definida tratada com uma monoterapia de Tarceva® após o fracasso da terapia de 1â linha. Com base na experiência do estudo BR.21, a população beneficiada foi definida como possuindo resposta objetiva ou estabilização da doença durante 12 semanas. Os conjuntos de dados clínicos e de microarranjos foram analisados de acordo com um plano estatístico predefinido.

A aplicação desta técnica requer tecido congelado fresco (FFT). Portanto uma biópsia obrigatória tinha que ser realizada antes do início do tratamento. O material coletado foi congelado em nitrogênio líquido (N2).

Uma segunda amostra de tumor foi coletada ao mesmo tempo e armazenada em parafina (embebida em parafina fixada com formalina, FF- PE). Esta amostra foi analisada em relação a alterações na via de sinalização de EGFR.

A capacidade de realizar biópsias tumorais através de broncos- copia era um pré-requisito para este estudo. A broncoscopia é um procedimento padronizado para confirmar o diagnóstico de câncer pulmonar. Embora seja geralmente segura, há um risco remanescente de complicações, por exemplo, sangramento.

Este estudo foi uma primeira etapa em direção a uma terapia individualizada para pacientes com NSCLC refratário. Esta terapia individualizada permitirá que os médicos que estão fazendo o tratamento selecionem o agente mais apropriado dos fármacos existentes para esta indicação.

Uma vez que a terapia individualizada esteja disponível, o benefício para cada paciente futuro será mais importante que o risco que os pacientes têm que correr no presente estudo: • as taxas de resposta/o número de pacientes que se beneficiam aumentarão, • o risco de efeitos colaterais adversos devido ao tratamento ineficiente será reduzido.

Base Lógica para Seleção de Dosagens

O Tarceva® foi fornecido oralmente uma vez ao dia em uma dose de 150 mg até a progressão da doença, toxicidades intoleráveis ou morte. A seleção desta dose se baseava nos parâmetros farmacocinéticos, assim como no perfil de segurança e capacidade de tolerância desta dose observada em testes nas Fases I, II e III em pacientes com câncer avançado pré- tratados fortemente. Os níveis de fármacos observados no plasma de pacientes com câncer que receberam a dose de 150 mg/dia estavam coerentemente acima da concentração média no plasma de 500 ng/mL direcionada para eficácia clínica. O BR.21 exibiu uma vantagem de sobrevivência com esta dose.

Objetivos do Estudo

O objetivo primário era a identificação de genes expressos de forma diferencial que podem prever o benefício (CR, PR ou SD ? 12 semanas) do tratamento com Tarceva®. A identificação de genes expressos de forma diferencial que podem prever "resposta" (CR, PR) ao tratamento com Tarceva® era um objetivo adicional importante.

Os objetivos secundários eram avaliar as alterações nas vias de sinalização de EGFR em relação ao benefício proveniente do tratamento.

Planejamento do Estudo

Visão Geral do Planejamento do Estudo e do Regime de Dosagem

Este era um estudo aberto em Fase II de identificação de marcadores que podem fazer uma previsão. O estudo foi realizado em aproximadamente 26 locais em aproximadamente 12 países. 264 pacientes com NSCLC avançado após o fracasso de pelo menos um regime de quimioterapia anterior foram registrados ao longo de um período de 12 meses. O Tarceva® oral contínuo foi fornecido em uma dose de 150 mg/dia. Reduções de doses foram permitidas com base na capacidade de tolerância à terapia com o fármaco. Parâmetros clínicos e laboratoriais foram analisados para avaliar o controle da doença e a toxicidade. O tratamento continuou até a progressão da doença, toxicidade inaceitável ou morte. O planejamento do estudo é representado na figura 1.

Amostras de tecido tumoral e de sangue foram obtidas para análises moleculares para a avaliação dos efeitos do Tarceva® e para a identificação de subgrupos de pacientes que se beneficiaram da terapia;

Avaliações dos Marcadores de Previsão

Biópsias do tumor foram realizadas dentro de um período de 2 semanas antes do início do tratamento. Foram coletadas duas amostras diferentes:

A primeira amostra era sempre congelada imediatamente em N2 líquido.

A segunda amostra era fixada em formalina e embebida em parafina.

O tecido congelado instantaneamente tinha a maior prioridade neste estudo.

A figura 2 mostra um esquema do processamento das amostras.

Análise de Microarranjos

As amostras congeladas instantaneamente foram utilizadas para microdissecação com captura a laser (LCM) de células tumorais para extrair o RNA do tumor e o RNA do tecido que circunda o tumor. O RNA foi analisado em chips de microarranjo Affymetrix (HG-U133A) para estabelecer o perfil de expressão gênica do tumor dos pacientes. O Controle de Qualidade dos chips do Affymetrix foi utilizado para selecionar as amostras de qualidade adequada para comparação estatística.

Análises de Biomarcadores Isolados em Tecido Embebido em Parafina Fixado com Formalina

A segunda biópsia de tumor, a amostra de FFPE, foi utilizada para realizar análises de mutação do DNA, de IHC e de ISH como descrito abaixo. Análises similares foram realizadas em tecidos coletados no diagnóstico inicial.

O estado de mutação do DNA dos genes que codificam EGFR e de outras moléculas envolvidas na via de sinalização de EGFR foi analisado através do sequenciamento do DNA. A amplificação gênica de EGFR e genes relacionados foi estudada por FISH.

As análises de expressão de proteínas incluíam análises imuno- histoquímicas [IHC] de EGFR e outras proteínas dentro da via de sinalização de EGFR.

Avaliações das Respostas

Os critérios de RECIST (Medida Unidimensional de Tumor) foram utilizados para avaliar a resposta. Estes critérios podem ser encontrados no link a seguir: http://www.eortc.be/recist/

Observar que:

Para ser determinado um estado de CR ou PR, alterações nas medidas de tumor têm que ser confirmadas através de avaliações repetidas com pelo menos 4 semanas de intervalo em qualquer momento durante o período de tratamento.

No caso de SD, as medidas de acompanhamento têm que ter satisfeito os critérios de SD pelo menos uma vez após a entrada no estudo em um intervalo mínimo de 6 semanas.

No caso de SD mantido, as medidas de acompanhamento têm que ter satisfeito os critérios de SD pelo menos uma vez após a entrada no estudo com duração de manutenção de pelo menos 12 semanas.

Avaliação da Sobrevivência

Uma verificação regular do estado a cada 3 meses foi realizada através da visita do paciente à clinica ou por telefone. Todas as mortes foram registradas. No final do estudo era necessária uma confirmação definitiva de sobrevivência para cada paciente.

Métodos Preparação de Amostras de RNA e Controle de Qualidade de Amostras de RNA

Todo o processamento de amostras de biópsia foi realizado por um laboratório de referência de patologia; amostras de tecidos congelados frescos foram enviadas dos locais de pesquisa para as instalações do Clinicai Sample Operations na Roche Basel e de lá para o laboratório de patologia para processamento adicional. A microdissecação por captura a laser foi utilizada para selecionar células tumorais do tecido circundante. Após a LCM, o RNA foi purificado do material tumoral enriquecido. O laboratório de patologia então realizou um número de etapas para a obtenção de uma estimativa da concentração e da qualidade do RNA.

As RNases são enzimas que degradam o RNA e são encontradas em qualquer lugar e assim todos os procedimentos em que o RNA será utilizado têm que ser rigorosamente controlados para minimizar a degradação do RNA. A maior parte das espécies de mRNA por si só possui meias- vidas particularmente curtas e assim são consideradas bastante instáveis. Portanto é importante realizar verificações da integridade do RNA e a quantificação antes de qualquer ensaio.

A concentração e o perfil de qualidade do RNA podem ser avaliados utilizando um instrumento da Agilent (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) chamado de um 2100 Bioanalyzer®. O software do instrumento gera um Número de Integridade do RNA (RIN), uma estimativa da quantificação (Schroeder, A. e outros, The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol, 2006. 7: p. 3) e calcula proporções ribossomais da amostra de RNA total. O RIN é determinado partindo do rastro eletroforético inteiro da amostra de RNA e inclui assim a presença e a ausência de produtos de degradação.

A qualidade do RNA foi analisada por um 2100 Bioanalyzer®. Somente as amostras com pelo menos um pico de rRNA acima do ruído de poli-l adicionado e com RNA suficiente foram selecionadas para análises adicionais na plataforma de Affymetrix. O RNA purificado foi enviado para o Roche Centre for Medical Genomics (RCMG; Basel, Suíça) para análise por microarranjo. 122 amostras de RNA foram recebidas do laboratório de pato-logia para processamento adicional.

Marcação Direcionada de amostras de RNA do tecido

A marcação direcionada foi realizada de acordo com o Two- Cycle Target Labeling Amplification Protocol da Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, Califórnia), seguindo as instruções do fabricante.

O método se baseia no procedimento de amplificação linear padronizado de Eberwine, mas utiliza dois ciclos deste procedimento para gerar cRNA suficiente para hibridização, mas utiliza dois ciclos deste procedimento para gerar cRNA marcado suficiente para hibridização a um microarranjo.

A entrada de RNA total utilizada na reação de marcação era de 10 ng para aquelas amostras em que mais de 10 ng de RNA estavam disponíveis; se estivesse disponível menos que essa quantidade ou se não houvesse dados de quantidade disponíveis (devido à concentração de RNA mui- to baixa), metade da amostra total era utilizada na reação. Os rendimentos provenientes das reações de marcação variavam de 20-180 μg de cRNA. Uma etapa de normalização foi introduzida no nível de hibridização em que 15 μg de cRNA eram utilizados para cada amostra.

O RNA de Referência Humana (Stratagene, Carlsbad, CA, USA) foi utilizado como uma amostra de controle no fluxo de trabalho com cada batelada de amostras. 10 ng deste RNA foram utilizados como entrada junto com as amostras de teste para verificar se os reagentes de marcação e de hibridização estavam funcionando como esperado.

Hibridizações em Microarranjos

Os microarranjos Affymetrix HG-U133A contêm mais de 22.000 conjuntos de sondas que se direcionam a aproximadamente 18.400 produtos da transcrição e variações que representam aproximadamente 14.500 genes bem-caracterizados.

A hibridização para todas as amostras foi realizada de acordo com as instruções do Affymetrix (Affymetrix Inc., Expression Analysis Technical Manual, 2004). Sucintamente, para cada amostra, 15 μg de cRNA marcado com biotina foram fragmentados na presença de cátions divalentes e calor e hibridizados durante a noite aos arranjos de oligonucleotídeos de ge- noma completo do Affymetrix HG-U133A. No dia seguinte, os arranjos foram corados com estreptavidina-ficoeritrina (Molecular Probes; Eugene, OR) de acordo com as instruções do fabricante. Os arranjos foram então verificados utilizando um GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix) e as intensidades de sinal foram calculadas automaticamente pelo GeneChip Operating Software (GCOS) Versão 1,4 (Affymetrix).

Análise Estatística

A análise dos dados do Affymetrix® consistia em cinco etapas principais.

A Etapa 1 consistia no controle de qualidade. A meta era identificar e excluir deste arranjo de análise dados com um perfil de qualidade a- baixo do padrão.

A Etapa 2 consistia no pré-processamento e na normalização. A meta era criar um "conjunto de dados de análise" normalizado e graduado, sensível à comparação interchips. Este compreendia a estimativa e a subtração do ruído de fundo, a compactação e a classificação das sondas.

A Etapa 3 consistia na exploração e na descrição. A meta era identificar a tendência potencial e as fontes de variabilidade. Consistia na aplicação de técnicas de análises descritivas multivariadas e univariadas para identificar covariedades que exerciam influência.

A Etapa 4 consistia na modelagem e no teste. A meta era identificar uma lista de marcadores candidatos com base na avaliação estatística da diferença no nível médio de expressão entre pacientes com "benefício clínico" e "sem benefício clínico". Consistia no ajuste de um modelo estatístico adequado para cada conjunto de sondas e na derivação de uma medida de significância estatística.

A Etapa 5 consistia em uma análise de força. A meta era gerar uma lista qualificada de marcadores candidatos que não dependem fortemente dos métodos de pré-processamento e das suposições estatísticas. Consistia na repetição da análise com abordagens metodológicas diferentes e no cruzamento da lista de candidatos.

Todas as análises foram realizadas utilizando o pacote de programas R.

Etapa 1: Controle de Qualidade

A avaliação da qualidade dos dados se baseava na verificação de vários parâmetros. Estes incluíam os parâmetros de qualidade do Affyme- trix GeneChip®, em particular: Fator de Escala, Porcentagem da Solicitação Presente e Média de Fundo. Esta etapa também incluía inspeção visual de imagens virtuais de chips para a detecção de problemas de hibridização localizados e comparação de cada chip com um chip intermediário virtual para a detecção de qualquer desvio do comportamento mediano. A análise de correlação interchips também foi realizada para detectar amostras discrepantes. Em adição, medidas auxiliares da qualidade do RNA obtidas partindo da análise de amostras de RNA com o Agilent Bioanalyzer® 2100 foram levadas em consideração.

Com base nestes parâmetros, os dados provenientes de 20 arranjos foram excluídos da análise. Assim os dados provenientes de um total de 102 arranjos representando 102 pacientes foram incluídos na análise. A descrição clínica deste conjunto de 102 amostras é relatada na tabela 1.

Tabela 1: Descrição de características clínicas de pacientes incluídos na a- nálise

Etapa 2: Pré-processamento de dados e normalização

O algoritmo rma (Irizarry, R.A. e outros, Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data. Nucl. Acids Res., 2003. 31(4): p. e15) foi utiliza- do para o pré-processamento e para a normalização. O algoritmo mas5 (AFFYMETRIX, GeneChip® Expression: Data Analysis Fundamentals. 2004, AFFYMETRIX) foi utilizado para fazer a detecção das solicitações em relação aos conjuntos de sondas individuais. Os conjuntos de sondas chamados de "ausentes" ou "marginais" em todas as amostras foram removidos da a- nálise adicional; 5930 conjuntos de sondas foram removidos da análise com base neste critério. O conjunto de dados de análise consistia, portanto, em uma matriz com 16353 (de 22283) conjuntos de sondas medidos em 102 pacientes.

Etapa 3: Descrição e Exploração dos Dados

A análise exploratória descritiva foi realizada para identificar tendências potenciais e fontes principais de variabilidade. Foi verificado um conjunto de covariedades com um impacto potencial sobre os perfis de expressão gênica. Este compreendia tanto variáveis técnicas quanto clínicas. As covariedades técnicas incluíam: data do processamento de RNA (posteriormente referida como batelada), RIN (como uma medida de qualida- de/integridade do RNA), Operador e Centro de coleta de amostras. As covariedades clínicas incluíam: Tipo de histologia, condição de fumante, grau de tumor, escore de desempenho (Oken, M.M. e outros, Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group. Am J Clin Oncol, 1982. 5(6): p. 649-55), dados demográficos, condição de capacidade de resposta e condição de benefício clínico.

As ferramentas de análises incluíam ANOVA univariado e análise de componentes principais. Para cada uma destas covariedades, o ANOVA univariado foi aplicado independentemente a cada conjunto de sondas.

Um efeito significativo da variável de batelada foi identificado. Na prática, a variável de batelada capturava diferenças entre as datas de processamento de amostras e o lote de chips do Affymetrix. Após a verificação de que a variável de batelada era quase independente das variáveis de interesse, o efeito da batelada foi corrigido utilizando o método descrito em Johnson, W.E., C. Li e A. Rabinovic, Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostat, 2007. 8(1): p. 118- 127.

O conjunto de dados normalizados após a correção dos efeitos de batelada servia como o conjunto de dados de análise nas análises subsequentes.

A histologia e o RIN eram duas variáveis adicionais importantes 5 destacadas pela análise descritiva.

Etapa 4: Modelagem e Teste dos Dados

Um modelo linear foi ajustado independentemente a cada conjunto de sondas. As variáveis incluídas no modelo são relatadas na tabela 2. Os parâmetros do modelo foram estimados pela técnica de probabilidade 10 máxima. O parâmetro correspondente à variável de "Benefício Clínico" (X1) foi utilizado para avaliar a diferença no nível de expressão entre o grupo de pacientes com benefício clínico e o grupo sem benefício clínico.

Tabela 2: Descrição das variáveis incluídas no modelo linear.

Para cada conjunto de sondas i, o objetivo do teste estatístico era rejeitar a hipótese de que os níveis médios de expressão em pacientes com benefício clínico e em pacientes sem benefício clínico eram equivalentes, levando em consideração as outras covariáveis de ajuste listadas na tabela 2. Formalmente, a hipótese nula de igualdade foi testada contra uma alternativa bilateral. Sob a hipótese nula, a distribuição da estatística t para este teste segue uma distribuição de t de Student com 92 graus de liberdade. Os valores de p correspondentes são relatados na tabela 3.

A escolha do modelo linear foi motivada por duas razões. Em primeiro lugar, a modelagem linear é uma abordagem versátil, bem- caracterizada e robusta que permite o ajuste de variáveis confusas quando é estimado o efeito da variável de interesse. Em segundo lugar, fornecido o tamanho da amostra de 102 e a normalização e o escalonamento do conjunto de dados, a hipótese de distribuição normal era razoável e justificada.

Para cada conjunto de sondas, a hipótese de homogeneidade de variância foi avaliada utilizando testes de Fligner-Killeen baseados nos resíduos do modelo. A análise consistia em 3 etapas: 1. Teste de cada uma das variáveis categóricas em relação à homogeneidade de variância residual 2. Observação da variável V com o valor de p mínimo 3. Se o valor de p mínimo for menor que 0,001, reajustar o modelo que permite o nível diferente de variáveis V para obter uma variância diferente.

Etapa 5: Força

A meta da análise de força era reduzir o risco de que os resultados da análise pudessem ser provenientes de artefatos e um resultado das etapas de pré-processamento ou hipóteses que sustentam a análise estatística. Foram considerados os três aspectos a seguir: a) inclusão ou exclusão de alguns chips extras na etapa de controle de qualidade; b) algoritmo de pré-processamento e normalização; c) hipóteses estatísticas e abordagem de teste.

A lista de marcadores candidatos foi definida como o subconjunto de genes coerentemente declarados como significativos com ajustes de análises diferentes. As opções de análises aplicadas diferentes eram as seguintes: a) Um subconjunto adicional de 8 chips foi identificado com base em critérios de controle de qualidade mais rigorosos. Um "conjunto de dados reduzi- do" foi definido através da exclusão destes 8 chips. b) MAS5 foi identificado como uma alternativa para rma para o pré- processamento e para a normalização. MAS5 utiliza métodos diferentes para estimativa de fundo, sumarização de sondas e normalização. c) Dois testes estatísticos adicionais foram empregados. a. Um teste de Wilcoxon para a diferença entre benefício clínico e nenhum benefício e b. um teste de proporção de probabilidade (LRT) que testa o modelo de regressão logística em que o benefício clínico foi tomado como a variável de resposta e a expressão gênica como covariável. Estes dois testes adicionais se baseiam em um conjunto diferente de hipóteses estatísticas de suporte. Para cada conjunto de sondas, o LRT era realizado após um Qui-quadrado com 1 grau de liberdade.

Em resumo, dois conjuntos de amostras (o conjunto de dados "completo" e o conjunto de dados "reduzido") e 2 algoritmos de pré- processamento (mas5 e rma) foram considerados; isto resultou em quatro conjuntos de dados de análises diferentes. Para cada um destes quatro conjuntos de dados, três testes estatísticos diferentes foram aplicados. Portanto, para cada conjunto de sondas, foram calculados três valores de p. Em cada conjunto de dados de análise, um critério composto foi aplicado para identificar a lista de genes regulados de forma diferencial. Este critério composto foi definido como: o valor de p máximo é menor que 0,05 e o valor de p mínimo é menor que 0,001. A análise de força utilizando o critério 1 para a identificação de genes marcadores forneceu PTPRF como um marcador de previsão para o tratamento com inibidor de EGFR.

Tabela 3: Marcador Gênico para Benefício Clínico com Base na Análise de Força após a Aplicação do Critério Composto.

A coluna 1 é o identificador do Affymetrix do conjunto de sondas. A coluna 2 é o número de acesso do GenBank da sequência gênica correspondente. A coluna 3 é o nome do gene oficial correspondente. A coluna 4 é a alteração média de multiplicações ajustada correspondente no nível de expressão entre paciente com benefício clínico e sem benefício clínico, que é estimada partindo do modelo linear. A coluna 5 é o valor de p para o teste da diferença no nível de expressão entre pacientes com benefício clínico e sem benefício clínico que é derivado do modelo linear. A coluna 6 é o intervalo de confiança de 95% para a alteração de multiplicações média ajustada no nível de 5 expressão.

Análise Estatística Adicional

Para o marcador candidato selecionado PTPRF, foram realizadas as análises adicionais a seguir em um ambiente validado por estatísticos independentes: • Regressão de Cox Univariada para PFS (Sobrevivência sem progres são) partindo da Análise Primária de Affymetrix, • Regressão Logística Univariada para Benefício Clínico partindo da Análise Primária de Affymetrix e • Regressão de Cox Univariada para Sobrevivência partindo da Análise 15 Primária de Affymetrix

Os resultados destas análises são apresentados abaixo. Estes são coerentes com os resultados da análise primária e confirmam a escolha do marcador selecionado.

Resultados: Regressão de Cox Univariada para PFS (Sobrevivência sem progressão) partindo da Análise Primária de Affymetrix:

Resultados: Regressão de Cox Univariada para Benefício Clínico partindo da Análise Primária de Affymetrix:

Resultados: Regressão de Cox Univariada para Sobrevivência partindo da Análise Primária de Affymetrix:

qRT-PCR

O cDNA foi sintetizado utilizando SuperScript® III First-strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR (Invitrogen, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante, mas sem a inclusão de um produto da digestão da RNase H.

A PCR quantitativa foi realizada utilizando Ensaios de Expressão Gênica com TaqMan® em um Sistema de Detecção de Sequências ABI PRISM® 7900HT de acordo com as recomendações do fabricante (Applied Biosystems, CA, USA). Todos os ensaios foram realizados em triplicatas.

Os iniciadores e as sondas utilizados cruzavam os limites dos éxons ou estavam dentro da sequência de interesse da sonda do Affymetrix Genechip®. Dois genes de manutenção ("house-keeping") foram incluídos como controles endógenos: beta-2-microglobulina (B2M-, Ensaio Hs99999907_m1) e hipoxantinafosforribosil transferase (HPRT; Ensaio Hs99999909_m1).

Todas as corridas incluíam uma amostra de calibração (RNA to- tai MVP® de pulmão de ser humano adulto; Stratagene, CA, USA) e uma curva padrão. O RNA total de Referência Humano Universal (Stratagene, CA, USA) foi utilizado como molde para curvas padrão de PTPRF. Todas as amostras foram medidas em triplicatas.

A quantificação relativa foi realizada utilizando o método de - 5 ΔCt.

Resultados

Como relatado anteriormente, os perfis de expressão gênica do Affymetrix Genechip® foram determinados para 102 pacientes incluídos neste estudo. Entre estes pacientes, os resultados da qRT-PCR foram obtidos para 75 (tabela 4). As características demográficas e clínicas dos pacientes com resultados de qRT-PCR eram similares àquelas da população inteira (n=264) e dos pacientes com perfis de expressão gênica de Genechip® disponíveis.

Tabela 4: Características de linha de base: pacientes com análises de qRT- 15 PCR (n=75)

Dos 75 pacientes com resultados de qRT-PCR, 4 (5%) tinham resposta parcial (PR), 23 (31%) tinham SD, 39 (52%) tinham PD e 9 (12%) não puderam ser avaliados. Estes resultados eram muito similares aos observados na população de estudo inteira (n=264).

A Figura 3 mostra os níveis relativos de mRNA para PTPRF em pacientes individuais, que são avaliados através da obtenção de perfis com Affymetrix Genechip® e qRT-PCR. A Figura 3a mostra níveis de expressão versus o resultado clínico para a obtenção de perfis com Genechip® e a Figura 3b mostra níveis de expressão para qRT-PCR.

Havia uma boa relação entre as medidas com Genechip® e com qRT-PCR do produto da transcrição de PTPRF (Figura 3c; p de Pearson = 0,76, p<0,01). Como observado com a obtenção de perfis com Genechip®, os níveis de mRNA de PTPRF avaliados utilizando qRT-PCR pareciam se correlacionar com a resposta ao erlotinib, com níveis mais altos sendo observados em indivíduos capazes de responder comparados com indivíduos incapazes de responder.

Discussão

Através da análise das amostras de tecido com a tecnologia de microarranjo de oligonucleotídeos em alta densidade e da aplicação da modelagem estatística aos dados, foi possível identificar os genes cujos níveis de expressão podem ser capazes de prever pacientes que obtêm um benefício clínico partindo do tratamento com erlotinib.

Foi aplicado um critério composto (definido anteriormente). Este resultou no PTPRF como um marcador capaz de previsão para o tratamento com inibidor de EGFR.

O gene PTPRF, localizado no cromossomo 1p34, codifica um membro proteico da família das proteínas tirosina fosfatases (PTP). Este possui uma região extracelular, uma única região transmembrana e dois domínios catalíticos intracitoplasmáticos em tandem e representa assim uma PTP do tipo receptora. A região extracelular contém três domínios similares à lg e nove domínios não similares à Ig, similares aqueles de molécula de adesão de células neurais.

Neste estudo, foi observado que o PTPRF era relativamente regulado para mais em pacientes que obtinham um benefício clínico partindo do tratamento com erlotinib. Esta descoberta pode ser interpretada no contexto de relatos publicados demonstrando a função potencial deste gene em mecanismos importantes diferentes de tumorigênese.

Em primeiro lugar, foi claramente estabelecido que o EGFR é um substrato do PTPRF. Em uma investigação detalhada, a interação entre EGFR e PTPRF foi adicionalmente caracterizada e mostrada como sendo complexa e fortemente controlada. Estas observações levaram os presentes inventores a postular que o PTPRF desempenha uma função importante e direta no controle da sinalização a jusante do receptor de EGFR. Em outra linha de evidência, foi observado que o PTPRF tem uma atividade supressora de tumor, atuando através de um efeito inibidor sobre a migração de células e possivelmente da indução da apoptose. O mecanismo através do qual o PTPRF controla o processo de migração celular foi adicionalmente obtido. Dois estudos mostraram que esta proteína funciona através de uma interação complexa com o complexo de E-caderina, mediada por uma regulação direta da atividade de beta-catenina.

A interação direta com o EGFR e uma atividade supressora de tumor bem-caracterizada são duas características proeminentes que tornam o PTPRF um marcador particularmente convincente de resposta ao erlotinib.

Claims (6)

1. Processo in vitro para previsão da resposta de um paciente com câncer de pulmão de não pequenas células (NSCLC) ao tratamento com erlotinib, caracterizado pelo fato de que compreende: a determinação de um nível de expressão de um gene PTPRF em uma amostra de tumor de um paciente e a comparação do nível de expressão do gene PTPRF a um valor representativo de um nível de expressão do gene PTPRF em tumores de uma população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento, em que um nível maior de expressão do gene PTPRF na amostra de tumor do paciente é indicativo de um paciente que obterá benefício clínico partindo do tratamento, em que o benefício clínico foi definido como tendo uma resposta objetiva ou estabilização da doença por 12 semanas ou mais.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão é determinado através da tecnologia de microarranjo.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o gene PTPRF exibe um nível de expressão entre 1,1 e 1,8, preferivelmente entre 1,1 e 1,6 ou mais vezes maior na amostra de tumor do paciente comparado com o valor representativo de um nível de expressão do gene PTPRF em tumores de uma população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o gene PTPRF exibe um nível de expressão entre 1,2 e 1,8 ou mais vezes maior na amostra de tumor do paciente comparado com um valor representativo da população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento.

5. Uso in vitro de um gene PTPRF, caracterizado pelo fato de que é para prever a resposta de um paciente com NSCLC ao tratamento com erlotinib.

6. Uso de erlotinib, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de um paciente com NSCLC identificado através de um processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.