BRPI0816816A2 - método para aumentar características relacionadas com o rendimento em plantas em relação às plantas de controle, plantas, partes das mesmas, ou células de planta, construção, uso de uma construção, método para a produção de plantas transgênicas, planta transgênica, partes colhíveis, produtos, e, uso de uma sequência de ácido nucleico - Google Patents

Abstract

método para aumentar características relacionadas com o rendimento em plantas em relação às plantas de controle, plantas, partes das mesmas, ou células de planta, construção, uso de uma construção, método para a produção de plantas transgênicas, planta transgênica, partes colhíveis, produtos, e, uso de uma sequência de ácido nucleico a presente invenção diz respeito no geral ao campo da biologia molecular e envolve um método para aumentar várias características relacionadas com o rendimento de planta pelo aumento da expressão em uma planta de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo grf, polipeptídeo equivalente a raa1, polipeptídeo syr, polipeptídeo arkl, e polipeptídeo ytp. a presente invenção também envolve plantas tendo expressão aumentada de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo grf, polipeptídeo equivalente a raa1, polipeptídeo syr, polipeptídeo arkl, e polipeptídeo ytp, plantas estas que têm características relacionadas com o rendimento aumentado em relação às plantas de controle. a invenção também fornece construções úteis nos métodos da invenção.

Description

MÉTODO PARA AUMENTAR € AR ACTERÍST1CAS RELACIONADAS COM O RENDIMENTO EM PLANT AS EM RELAÇÃO ÀS PLANTAS DE CONTROLE-, PLANTAS, PARTES DAS MESMAS, OU CÉLULAS DE PLANTA, CONSTRUÇÃO, USO DE UMA CONSTRUÇÃO, MÉTODO 5 PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGENIC AS, PLANTA

TRANSGÊN1CA, PARTES COLHÍVE1S. PRODUTOS, E, USO DE UMA SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLE.OT'

A presente invenção diz respeito no geral ao campo da biologia molecular e envolve um método para aumentar vários características 10 relacionadas com o rendimento de planta pelo aumento da expressão em uma planta de uma sequência de ácido nudéico que codifica um polipeptideo selecionado do grupo que consiste de: polipeptideo GRF, polipeptideo equivalente a RAA1, polipeptideo SYR, polipeptideo ARKL. e polipeptideo YTP, A presente invenção Também, envolve plantas tendo expressão 15 aumentada de uma sequência de ácido rmclèico que codifica um polipeptideo selecionado do grupo que consiste de: polipeptideo GRF, polipeptideo equivalente a RAAL polipeptideo SYR, polipeptideo ARKL, e polipeptideo YTP, plantas estas que têm características relacionadas com o rendimento aumentadas um relação às plantas de controle, a invenção também fornece20 construções úteis nos métodos da invenção, .A população mundial sempre crescente e a oferta diminuída de terra arável disponível para a agricultura estimulam a pesquisa voltada para o aumento da etkiênda da agricultura. Meios convencionais pata as melhoras de saíra e hortiedturai.s utilizam técnicas de geração seletiva para identificar D plantas lendo características desejáveis. Entretanto, tais técnicas de geração seletiva têm várias desvantagens, isto ê que estas técnicas são tipicamente intensivas em trabalho e resultam em plantas que frequentemente contêm componentes geneticos heterogêneos que nem sempre podem resultar no traço desejável que é passado adiante a partir das plantas precursoras. Avanços na biologia molecular têm permitido que a humanidade modifique o germoplasmo de animais e plantas. A engenharia genética de plantas acarreta necessariamente a isolação e manipulação de material genético (tipicamente na forma de DNA ou RN A) u a subsequente introdução deste material genético cm uma phmta. Tal tecnologia tem a capacidade para liberar saims ou plantas tendo vários traços econômicos, agronômicos ou horticulturais melhorados.

Urn traço de interesse econômico particular é o rendimento aumentado. O rendimento é normalmente definido como o produto mensurável de valor econômico de uma safra. Isto pode ser definido em termos de quantidade e/ou qualidade, O rendimento é diretamente dependente de vários fatores, por exemplo, do número e tamanho dos órgãos, arquitetura de planta (por exemplo, o número de ramificações), produção de semente, senescência de folha e mais. O desenvolvimento de raiz, captação de nutriente, tolerância ao estresse e vigor inicial também podem ser fatores importantes na determinação do rendimento. A otimização dos fatores mencionados acima portanto pode contribuir para aumentar o rendimento da safra.

O rendimento de semente e um traço particularmente importante, visto que as sementes de muitas plantas são importantes para a nutrição humana e animal. As safras tais como de milho, arroz, trigo, canola e soja responsáveis por mais da metade da ingestão calóríca humana total, seja através do consumo direto das próprias sementes ou através do consume de produtos de carne erigida sobre sementes processadas. Estas também são uma fonte de açúcares, óleos e muitos tipos de metabolites usados em processos industriais. As sementes contêm um embrião (a fonte de novos brotos e raízes) e um endosperma (a fonte de nutrientes para o crescimento do embrião durante a germinação e durarrte u crescimento inicial das mudas). O desenvolvimento de uma semente envolve muitos genes e requer a transferência de metabolites das raizes, folhas e hastes na semente em * desenvolvimento. O endosperms, em particular, assimila os precursores metalxihcos de carbmdratos, óleos e proteínas e os sintetizam em macromolecules de armazenagem para encher o grão.

A biomassa vegetal é produzida para safras de forragem, como alfalfa. silagem milho e feno, Muitos representantes para a produção foram usados em safras de grão, O principal entre estes são estimativas do tamanho da planta, O tamanha da planta pode ser medido em muitos modos dependendo das espécies e estágio desenvol ví mental, mas incluem peso seco 10 da planta total, peso seco acima do solo, peso fresco acima do solo, área de folha, volume de caule, altura da planta, diâmetro da roseta, comprimento da tolha, comprimento da raiz, massa da raiz, número de brotos e número de folhas. Muitas espécies mantém urna razão conservative entre o tamanho de partes diferentes da planta em um dado estágio desenvolvimental Estas 15 relações alométricas são usadas para extrapolar a partir de uma destas medidas de tamanho para outra (por exemplo, Tittonell eZ «/ 2005 Agric Ecosys & Environ 105: 213). O tamanho da planta em um estágio desenvolvimento! inicial tipicamente correlacionar-se-á corn o tamanho da planta mais tarde no desenvolvimento, Uma planta maior com uma áre de 20 folha maior pode tipicamente absorver mais luz e dióxido de carbono do que uma planta menor e portanto provavelmente ganhara u.m peso maior durante o mesmo oeríodo (Fasoula & Tolltmaar 2005 Mavdica 50: 39 h Isto está além da

................................................ ............................................................................................................_........................................................................................................................X...................................................................... : : : ...........................' ': : : continuação potencial das vantagens micro-ambientais ou genéricas que a planta, teve para alcançar o tamanho maior inicialmente. Existe um 25 componente genético forte para o tamanho e taxa de crescimento da. planta (por exemplo, fôr Steege eí o/ 2005 Plant Physiology 139: 1078),. e assim para uma faixa de tamanhos de planta de genótipos diversos sob uma condição ambiental é provável correlacíonar-se com o í amanho sob uma outra (Hitíalrnam ez £?Z 2003 1'heoretical Applied Genetics 107:079),. Deste modo urn ambiente padrão ê usado como um representante para os diversos e dinâmicos ambientes encontrados em locais e tempos diferentes pelas safras no campo.

Um outro traço importante para muitas safras é o vigor inicial. A melhora do vigor inicial é um objetivo importante de programas dc geração de arroz modernos em cultivares de arroz tanto temperados quanto tropicais. Raizes longas são importantes para a ancoragem no solo adequada em arroz semeado em água. Onde arroz é semeado diretamente em campos alagados e onde as plantas devem emergir rapidamente através da água, brotos mais longos estão associados com vigor. Onde a semeadura ern sulco é praticada, mesocólilos e coleoptiles mais longos são importam.es para a boa emergência das mudas. A capacidade para engendrar vigor inicial nas plantas seria de enorme importância na agricultura, Por exemplo, o vigor inicial deficiente tem sido uma limitação à introdução de híbridos de milho (2eo wofs L.) com base no germoplasmo do Cinturão do Milho no Atlântico Europeu.

índice de colheita, a razão de rendimento de semente para peso seco acima do solo, é relativamente estável sob muitas condições ambientais e assim uma correlação robusta entre o tamanho da planta e rendimento de grão pode ser frequentemente obtida (por exemplo, Rebetzke rí o/ 2002 Crop Science 42: 739). Estes processos são íntnnsicamente ligados porque a maioria da biomassa de grão é dependente da produtividade fotossmtética corrente ou armazenada pelas folhas e haste da planta (Gardener er nZ 1985 Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, pp 68-73). Portanto, selecionar quanto ao tamanho da planta, mesmo em estágios iniciais de desenvolvimento, foram usados como um indicador para futuro rendimento potencial (por exemplo, TittonelI et m 2005 Agríc Ecosys & Environ 105: 213). Quando do teste quanto ao impacto de diferenças genéticas sobre tolerância ao estresse, a capacidade para padronizar as propriedades do solo, temperatura, disponibilidade de água e nutriente e imensidade de luz é uma vantagem intrínseca de ambientes de estufa ou câmara de crescimento de planta comparadas com o campo. Entretanto. limitações artificiais sobre o rendimento devido à polinização deficiente devido à ausência de vento ou insetos, ou espaço insuficiente para o crescimento de raiz ou copa maduras, pode restríngir o uso destes ambientes controlados para i estar diferenças de rendimento. Portanto, medições de tamanho de planta em desenvolvimento inicial, sob condições padronizadas em uma câmara de crescimento ou estufa, são práticas padrão para fornecer indicação de vantagens de rendimento genético potencíah

Um outro traço de importância é aquele de tolerância ao estresse abiótico melhorada. O estresse abiótico é uma causa primária de perda de saíra no mundo todo, reduzindo os rendimentos médias para a maioria das plantas de safra principais em mais do que 50 % (Wang e/ n/,. Plant (2003) 2.18: 1-14). Os estresses abióticos podem ser causados pela seca, salinidade, extremos de temperatura, toxicidade química, excesso ou deficiência de nutrientes (macroelementos ou rnicroelementos), radiação e estresse oxidative. A capacidade para aumentar a tolerância da planta ao estresse abiótico seria de enorme vantagem econômica para os agricultores no mundo todo e permitiría o cultivo de safras durante as condições adversas e em territórios onde o cultivo de safras de outro modo não pode ser possível.

O rendimento de safra portanto pode ser aumentado pela otimização de um dos fatores mencionados acima.

Dependendo do uso final, a modificação de certos traços de rendimento pode ser favorecida em relação a outros. Por exemplo para aplicações tais como forragem ou produção de madeira ou recurso de biocombustíveL um aumento nas partes vegetative de uma planta pode ser desejável e para aplicações tais como produção de farinha, amido ou óleo, urn aumento nos parâmetros de semente pode ser particidarmeute desejável. Mesmo entre os parâmetros de semente, alguns podem ser favorecidos em relação a outros, dependendo da aplicação. Vários mecanismos podem contribuir para aumentar o rendimento de semente, quer que estejam na forma de tamanho de semente aumentado ou número de .semente aumentado.

Um método para aumentar as características relacionadas com o rendimento (rendimento de semente e/ou biomassa) em plantas pode ser através da modificação dos mecanismos de crescimento inerentes de um planta, tais como o ciclo celular ou vários caminhos de sinalização envolvidos no crescimento da planta ou em mecanismos de defesa.

Foi agora descoberto que várias características relacionadas com o rendimento podem ser aumentadas em plantas em relação às plantas de controle, pelo aumento da expressão em uma planta tie uma sequência de ámdo nudéíco que codifica um polipeptídeo do Fator Regulador do Crescimento (GRF). As características relacionadas com o rendimento aumentadas compreende um ou mais de: vigor inicial aumentado, biomassa acima do solo aumentada, rendimento de semente total aumentada por planta, taxa de enchimento de semente aumentada, índice de colheita aumentado e peso de mil sementes aumentado,

Foi agora descoberto que várias características de crescimento podem ser melhoradas em plantas pela modulação da expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um equivalente a RAAI (/Arquitetura de Raiz Associada 1) em. unia planta.

Foi agora descoberto que várias características de crescimento, em particular resistência ao estresse abiótlco aumentada, podem ser melhoradas em plantas pela modulação da expressão em uma planta de um ácido nuclesco que codifica urna proteína Reguladora do Rendimento de Semente (SYR).

Foi agora descoberto que várias características relacionadas com o rendimento podem ser melhoradas em plantas pela modulação da expressão em uma planta de uni ácido nucléico que codifica um polipeptídeo

A.RKL (Equí valente a A.RADIA) ern uma planta.

Foi agora descoberto que várias características relacionadas com o rendimento podem ser melhoradas em plantas pela modulação da expressão em unia planta de um ácido nucíéico que codifica uma YTP 5 (Proteína de Transmembrana de Rendimento) em uma planta.

FUNDAMENTOS.

As proteínas que ligam DNA são pretensas que compreendem qualquer um de muitos domínios de ligação de DNA e assim têm uma afinidade especifica ou geral para o DNA, As proteínas de ligação de DNA 10 incluem por exemplo fatores de transcrição que modulam o processo de transcrição, nucleases que clívam moléculas de DNA., e histonas que estão envolvidas no empacotamento de DNA no núcleo da célula.

Os fatores de transcrição são usnalmente definidos como proteínas que mostram afinidade de ligação de DNA específicas da .15 SEQuência e que são capazes de ativar e/ou reprimir a transcrição. O genorna de ..drodàdopçR f/wto codifica pelo menos 1533 reguladores transcricionais, responsabilizando-se por -5,9 % do seu número total estimado de genes (Riechmann e/ «/. (2000) Science 290: 2105-2109).. A Base de Dados de Fatores de Transcrição do Arroz (DRTF) é uma coleção de fatores 20 de transcrição conhecidos e prognosticados de Dryzo sorw L ssp. indica e Οπζίΐ wfvo £. xsp. mponròo, e correntemente contém 2.025 modelos de gene de fatores de transcrição putativos (TF) em W/co e 2.384 em. Rg.m.nma, distribuídos em 63 famílias (Gao et aL (2000)..Bioinformatlcs 2006, 22(10): 1286-7).

Uma destas lamilías è a família do Fator Regulador do

Crescimento (GRF) de fatores de transcrição, que é específico para plantas. Pelo menos nove polípeptídeos GRF foram idenlíficados em TroóíWopsA’ Om/ròw (Kim cr o/. (2003) Plant J 36i 94-104), e pelo menos doze em Oyze (Choi eZ ofi (2004) Plant Cell Physiol 45(7): 897-904). Os polipeptídeos GRF são caracterizados pela presença na sua metade de terminal N dc pelo menos dots domínios dtameníe conservados, nomeados depois que a maioria dos aminoácidos conservados dentro de cada domínio: (?) um domínio QLQ (acesso hiterPro 1PR0I4978, acesso PFAM PF08880). onde os aminoácidos mais conservados do domínio são Gln-Leu-G1n; e (íí) um domínio WRC (acesso In.ter.Pro ÍPRO14977, acesso PFAM PF08879), onde a maior parte dos aminoácidos conservados do domínio são Trp-Arg~ Cys. O domínio WRC contém ainda duas características estruturais distintivas, a saber, o domínio WRC é enriquecido em aminoácidos básicos Lys e Arg, e ainda compreende três resíduos Cys e um Mis em um espaçamento conservado (CX$CX^CX₂HX designado como o domínio Efetor de Transcrição (ET) (Ellerstrom e/ m. (2005) Plant Molec Biol 59: 663-681). O espaçamento conservado de resíduos de císteína e hislidina no domínio ET é recordativo das proteínas de dedo de zinco (ligação de zinco). Além disso, um sinal de localização nuclear (NI..S) è usualmente compreendido nas sequências de GRF do .polípeptídeo..

.A. interação de alguns polipeptídeos GRF com uma família pequena de coatívadores imnscricionais, fatores que interagem com GRF (GIFT a GIF3; também chamados de polípeptídeo de transloeação de sarcoma sinovial (SYT), SYTT a SYT3), foi demonstrado usando um ensaio de interação de híbrido duplo de levedura (Kim & Kende (2004) Proc Natl /lead Sei 101: 13374-13379).

O nome GRF também foi dado a um outro tipo de polipeptídeos, pertencentes à família 14-3-3 de polipeptídeos (de Vetten &. Feri (1994) Plant Physiol 106: 1593-1604), que são totalmente não relacionados com os polipeptídeos GRF úteis na realização dos métodos da invenção.

Plantas de íhu/àmn transgênicas transformadas com um polípeptídeo GRF do arroz (OsGRFT) sob o controle de um promotor

358 CaMV constitutivo viral demos.ntra.ram folhas enroladas, alongamento » severameníe reduzido da inflorescência primária, e expulsão demorada (van der Knapp et oL (2000) Plant Physiol 122: 695-704). As plantas transgênicas de ,4rxfofobprís r/mfforav transformadas com um de dois polipeplideos GRF de 5 .4>^fzd?d.fo/?.yd^: (A1GRF1 e A1GRF2) desenvolveram folhas e cotilêdones maiores, foram demoradas na expulsão, e foram parcialmente estéreis (devido à falta de pólen viávelj, comparadas com as plantas do tipo selvagem. (Kim et o/. (2003) Plant J 36: 94-104)..

No pedido de patente US US2006/004S240, um polipeptídeo

GRF de Jmófdo/zrís é identificado como SEQ ID NO: 33421. No pedido de patente US 2007/00.22493, um polipeptídeo GRF de ítów é identificado como SEQ ID NO: 1803 (também aqui aludido como G1438). As plantas de Arabidopsis transgênicas que super expressam G1438 usando o promotor 35$ CaMV apresentam folhas verdes escuras.

,15 Surpreendentemente, foi agora descoberto que aumentar a expressão de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF dá plantas tendo características relacionadas com o rendimento aumentadas em relação às plantas de controle.

De acordo com uma forma de realização, é fornecido um método para aumentar características relacionadas com o rendimento em plantas em relação às plantas de controle, que compreende aumentar a expressão de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF em uma planta. As características relacionadas com o rendimento aumentadas compreendem um ou mais de: vigor inicial aumentado, bíomassa aeima do solo aumentada, rendimento de semente total aumentado por planta, taxa de enchimento de semente aumentada, índice de colheita aumentado e peso de mil sementes aumentado.

Pouco é conhecido a cerca da biologia molecular da formação

d.e raiz em plantas monocotiledôneas» Até agora apenas uns poucos genes ι Ο foram identificados que afetam o desenvolvimento de raiz: os exemplos são o mutante rtl que forma pouca ou nenhuma copa c raizes de fixação (Jenkins, J. tiered, 21: 79-80, 1930), u mutante asrl, que demonstra raízes seminais defeituosas (De Miranda e/ o/„ Maize Genet. Coop. News Lett. 84: 18-19. 1980), as raízes nodais que carecem do mutante Ties (adventícias) (Metz er a?/,. Plant J, H): 845-857, 1996), o mutante siri e o mutante slr2 com raízes laterals encurtadas (Hochholdmger &t <A, Plant Physiol 125: 1529-1539, 2001), ou rum 1, que é afetado no inicio lateral na raiz primária mas também no início da formação da raiz seminal (Woll «/., Plant Physiol,, 139, 1255-1267, 20()5)., Liu er ο/, (Proteomics 6, 4300-4308, 2006) fizeram urna comparação proteomics enlre as raizes primárias de mudas do tipo selvagem e ruml e identificaram mais 12 genes que foram difereniemente regulados e que foram envolviudos na biossíntese de liguína, defesa, e no ciclo de citrato.

Um outro gene envolvido na formação de raiz em plantas monocotíledôneas é raal, primeiro isolado do arroz (Ge A <?/., Plant Physiol. .135, 1502-1513, 2004): o gene codifica uma proteína de 12,0 k.D tendo 58 % de homologia com o FPFl de (Fator IQue Promove o

Florescimento). No arroz, RAA1 foi expressado especificamente no meristema apical, a zona de alongamento de ponta de raiz, esteias da zona de ramificação, e a raiz lateral jovem. A superexpressão constitutiva aumentou o número de raízes adventicias, mas o crescimento de .raiz primária foi diminuído. .Além, disso, o teor de auxina endógena foi aumentado,. OsRAAl também foi induzido pela auxina; sugerindo que uma regufagem de retroalimentação positiva existe entre RAA1. e auxina no desenvolvimento da raiz do arroz (Ge Ά u/,, 2004). Além disso, as plantas que super expressam OsRAAl tiveram folhas mais longas e tlósculos estéreis (Ge er «/,, 2004), WO 2006/067219 divulga o uso de FPFl e proteins relacionadas para aumentar a produção de carboidratos em plantas, mas os iransgênicos que superexpressam FPFl não mostraram rendimento de semente aumentado e nenhum efeito sobre o crescimento de raiz foi relatado,

Surpreendentemente, foi agora descoberto que modular a expressão de um ácido nucléico que eodi üca um pollpeptídeo equivalente a R.AA1 dá plantas tendo traços realçados relacionados com o rendimento, em particular rendimento aumentado em relação às plantas de controle.

De acordo com uma forma de realização, é fornecido um método para melhorar características relacionadas com o rendimento de uma planta errs relação ás plantas de controle, que compreende modular a expressão de um ácido nucléico que codifica um pollpeptídeo equivalente a 10 RAA1 em uma planta. As características relacionadas com o rendimento melhoradas compreenderam altura aumentada, índice de broto/raiz, espessura de raiz. índice de verdura, número de flores por panículo e peso de mil sementes aumentados. As características relacionadas com o rendimento melhoradas foram observados sob condições de cultivo normais assirn como 15 sob condições de estresse.

O Regulador de Rendimento de Semente (SYR) é uma nova proteína que até agora não fui caracterizada. SYR mostra alguma homologia (em torno de 48 % de identidade da SEQuência ao nível dc DNA, em torno de 45 % ao nivel de proteína) com uma. proteína de chamada de

ARGOS (Hu er mN Plant Cell 15, 1951-1961,. 2603; US 2005/0108793 ). Hu rf aí. Postularam que ARGOS c uma proteína de função única, e é codificada por um único single. Os ftmótipos principais da super expressão de ARGOS em drnbíóbpsis são a biomassa folhosa aumentada e o florescimento retardado. Ao contrário, a super expressão de SYR em arroz primariamente aumenta o 25 rendimento de semente, ao passo que a biomassa foihosa e o tempo de florescimento obviamenie não são afetados..

Surpreendentemente, foi agora descoberto que modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica uma proteína Reguladora do Rendimento de Semente (daqui em diante chamada de SYR)

I 'ϊ dá plantas, que quando cultivadas sub condições de estresse abí ótico. teudo tolerância ao estresse abiótico realçada em relação às plantas de controle.

Portanto, a presente invenção fornece um método para realçar características relacionadas com o rendimento em plantas cultivadas sob 5 condições de estresse abiótieo, em relação às plantas de controle, que compreende. modular a expressão em uma planta de um ácido nudéico que codifica um polipeptideo SYR.

O polipeptideo ARKLs compreende um domínio de dedo de RING que se parece· com aquele encontrado na proteína ARKAD1A de 10 camundongo, uma E3 ubiquitina 1iga.se envolvida na sinalização Nodal durante a embríogênese (Mavrakis et u7. 2007; PLoS BioL 2007 Mar; 5(3): e67).

Λ ubiquitilação, um processo pelo qual uma proteína é modificada pela ligação covalente de ubiquitina é uma parte central e .1.5 essencial de vários processos celulares em eucariotas. Em plantas, os defeitos nesse caminho causa numerosas aberrações de desenvolvimento, resposta alterada aos estímulos externos e ciclo celular e padrões de crescimento modificados. As proteínas ubíquitinadas são alvejadas paia a degradação via um caminho dependente ou independerão de proteassoma 26S. A modificação 20 pela ubiquitina desempenha um papel na ativação de proteínas de sinalização, endocito.se, seleção, e modificação de histona.

O destino da proteína ubíquitinada é determinado pela natureza da ligação da ubiquitina. Ubiquitinas únicas ou múltiplas podem ser ligadas ao alvo (mono e poli ubíquitinação; o resíduo l.ys específico usado 25 para formar a cadeia da ubiquitina pode influenciar o destino final da proteína modificada, por exemplo se este é a degradação ou ativação.

A ligação de ubiquitina às proteínas ocorre em um processo de etapa múltipla envolvendo ires enzimas chamadas, El, E2, E3 (Glíkcman e Ciechanover (2000) Physiol Rev 82: 377-482). Imcialmente a ubiquína é ligada à proteína em uma maneira dependente de ATP que é depois transferido para um aceitador de cisterna na proteína E2 para formar um intermediário de ubiqmhna E2 que atua como um doador de ubiquitins para a proteína alvo em uma reação mediada pela ubiquitins ligase, também chamada de E3 ligase ou enzima E.1 Existem tipos múltiplos de E3 ligases. As E3 ligases do tipo RING são caracterizadas pela presença de um domínio de proteína conservado chamado de dedo de RING ou RING-ZnF (Novo Gene Realmente Interessante ~ Dedo de Zinco),

Os motivos de ligação de zinco são estruturas estáveis, e estes raramente sofrem mudanças conformacionaís na ligação ao seu alvo. A maioria das proteínas de ZnF contém protuberâneias equivalentes a dedo múltiplas que fazem contatos em tandem com as sua molécula alvo, frequentemente reconhecendo substratos prolongados. O dedo de RING é um domínio de hgação de Zinco especializado que presumivelmente funciona nas Interações de protema-proteína. O dedo de RING tem de 40 a 60 resíduos de comprimento e coorde.ua dois átomos de zinco. Este é distinto de outros dedos de zinco em que os oito resíduos de aminoácido de ligando metálico que coordenam o íon zinco caem em uma estrutura específica chamada de estrutura de suporte cruzado (Borden (2000). J Mol Biol 295: 1103-1112). O espaçamento das cisteínas/hístidinas que coordenam os ions Zinco em um tal domínio é C-x(2)-C-x.(9 a 39)-C-x(I a. 3>4I-x(2 a 3)-Cx(2)-C-x(4 a 48)0 x(2)-C. Os pares de ligando metálico um e três co-ordenam-se para ligar um íon de zinco, enquanto que os pares dois e quatro ligam o segundo, Existe duas variantes diferentes, o tipo C.3HC4 e um tipo C3H2C3, que estão claramente relacionadas a despeito do padrão de cisteína/híslídina diferente. O último tipo é algumas vezes aludido como 'dedo de RING412\ No último a coordenação do íon Zinco é mediada pelas 6 cisternas e 2 histidinas enquanto que no C3HC4 é mediada pelas 7 cisternas e uma histidma.

Na ..4mdà/cç.>sA /.íWm.nn existem pelo menos 477 domínios

RING putativos que compreendem proteínas. Alguns contêm domínios de dedo de RING múltiplos. Os domínios RING foram classificados em oito tipos com base no resíduo de ligando metálico presente e/ou o número de aminoâcidos entre eles (Stone N «/. 2005) Plant Phys. 137, 13-30. A classe de RING-112 é a classe maior em Com base na natureza dos domínios e a soa organização as proteínas de dedo de RING de /.fiwâÃço.dy foram classificadas ainda em 30 grupos, Grupo l ao Grupo 30. Os subgrupos dentro de alguns dos grupos também foram reconhecidos, por exemplo os subgrupos 2.1 e 2.2 do grupo 2 (Stone G oZ. 2005). O Grupo 1 foi aludido como o grupo da proteína de dedo de RING que carece dos domíniso anteríormente descritos. A análise da SEQuêncía desta proteína revelou regiões de similaridade entre umas poucas proteínas fora do domínio de RING, que foram chamadas de DARI a DAR3 (Domínio Associado com RING). DARI e DAR3 têm aproximadamente 40 aminoâcidos de comprimento e DAR2 120, DAR 1 foi relatado ocorrer apenas em proteínas de origem vegetal (Stone cf cd. 2005). A presença de domínios conservados comuns sugeriu uma função relacionada para as proteínas que compreendem os domínios.

Surpreendentemente, foi agora descoberto que modular a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ARKL dá plantas tendo características relacionadas com o rendimento realçadas em particular rendimento aumentado em relação às plantas de controle.

De acorde com uma forma de realização, é fornecido um método para melhorar ou realçar características relacionadas com o rendimento de uma planta em relação às plantas de controle, que compreende modular a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ARKL em uma planta.

Todas as células eucariótícas contêm sistemas elaborados de membranas internas que ativam vários compartimentos fechados por membrana dentro da célula. O sistema de endomembrana é a coleção de estruturas membtwosas envolvidas no transporte dentro da célula. 0s componentes principais do sistema de endomembrana são o reticule andapbsmático, os corpus de Golgi, vesículas, membrana celular e envelope 5 nuclear Os membros do sistema de endomembrana passam materiais através um do outro ou através do uso de vesículas. Uma característica universal de iodas as células è uma membrana limitadora externa chamada do membrana plaamátícm

As membranas são construídas a partir de lipídeos e proteínas. 10 A associação de proteínas com a membrana pode ser via u.ma ligação covalente, pela qual a proteína é ligada aos lipídeos da membrana., No caso das chamadas proteínas de transmembrana, as cadeias de polipeptideo da proteína realmente cruzam a bicamada lipídica. A associação com a membrana também pude ocorrer via associação da proteína, a chamada ,15 proteína periférica, pelas ligações não coval entes às porções protrubenuites de proteínas de membrana integral.

As proteínas de transmembrana (proteínas de TM) têm uma natureza anftfíHca com segmentos de TM hidrofóbicos (TMSs) e alças hidrofthcas. Em proteínas de transmembrane, a porção dentro da bicamada 20 Hpídica consiste primaríamente de amínoáddos hidrofóbicos. Estes são usualmente arranjados em uma hélice alfa de modo que os grupos polares earbôxi («OO) e amino (-NH) nas ligações de peptídeo podem interagir entre si ao invés de com seus arredores liidrofobícos. Estas porções do po.lipeptídeo que projeta da bicamada tendem a ter uma alta porcentagem de amínoácidos 25 hidroftlícos. .Além disso, aqueles que se projetam .no espaço extracelular são ü»ualmente glicosilados.

A. topologia de transmernbrana de u.ma proteína foi determinada com base na cristalografia de raio X expert mental, RMN, técnica de fusão de gene, método de acessibilidade à cisteína substituída, experimento de glicosilação ligado a Asp(’N) e outros métodos bioquímicos. Além disso, vários métodos foram desenvolvidos para determinar a esírutura e função de proteínas TM de suas sequências de aminoácido (Killer ei u/., 2001; Ikeda e/ oZ., 2002; Chen eí aL, 2002).

Λ análise dc similaridade da SEQuência de proteína entro proteínas tem se beneficiado dos desenvolvimentos no campo da genõmica. Vários domínios conservados entre duas ou mais proteínas para as quais nenhuma função fui designada pode ser realizada usando algoritmos específicos. Um tal domínio conservado é o chamado domínio DUF221 (Domínio de Função Desconhecida 221) como descrito em Pfam (Firm eí o/. Nucleic Acid Research (’2006) Database Issue 34; D247-D251). Este domínio é encontrado em uma família de proteínas de Lransmembrana hipotética, nenhuma das quais turn qualquer função conhecida, a região alinhada está em 538 resíduos no comprimento máximo. O domínio ocorre um várias proteínas de origem eucariótíca. A expressão de um gene de .drubíabpsZs, EDR4, que codifica uma proteína que compreende um DUF221 foi relatada ser expressada imediatamente no tratamento de desidratação (Kiyosue eru/; Plant Mol Biol. 1994 25(5): 791-8). Um mutante silenciado de yfmbàfopsuq gfslO, em um gene que codifica uma outra proteína contendo DUF221 do domínio foí relatada ter um fenótipo similar àquele dos mutante de seleção vacuolar (.Fuji tou/; 2007. Plant Cell. 2007. 19(2): 597-609).

Surpreendentemente, foi agora descoberto que modular a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptideo YTP dá plantas tendo características relacionadas com o rendimento realçadas em particular rendimento aumentado em relação às plantas de controle.

De acordo com uma forma de realização, é fornecido um método para realçar (melhorar) características relacionadas com o rendimento de uma planta em relação às plantas de controle, que compreende modular a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptideo YTP em uma planta.

dhfiniçôes

Polipepti deo(s)/pFQt ei na(s)

Os termos “pofipeptídeo'·¹ e “proteína” são usados inlerc^mbisvelmente aqui e refere-se a amnuxmidos em uma forma polimcrica de qualquer comprimento. ligados entre si pelas ligações de peptídeo.

.......nuçléiçpí^^......de.......ácido......nuçléjço/

Os termos “polinucleotídeoís)”, ^i;sequância(s) de ácido nucléico”, “sequência(s) de nucleolídeo’, “ácído(s) nucléicufeF, “molécula de ácido nucléico” são aqui usados intercambiavelmente e refere-se a nucleotídeos, ribonudeoudeos ou desoxiribonucleotídeos ou uma combinação de ambos, em uma forma não ramificada pofimérica de qualquer J 5 comprimento.

SanfeÓl áctoltrofe

A escolha de plantas de controle adequadas é uma parte da rotina de um cenário experimental e pode incluir plantas do tipo selvagem cunespondentes ou plantas correspondentes sem o gene <le interesse, A. planta 20 de controle é tipicamente da mesma espécie vegetal ou ainda da mesma variedade como a. planta a ser avaliada. .A planta de controle também pode ser uma nulizigota da planta a ser avaliada. Nulizigotos são indivíduos que perdem o transgene pela segregação. Uma “planta de controle* como aqui usada refere-se não apenas às plantas inteiras, mas também a partes de planta, 25 incluindo sementes e partes de semente.

“Homólogos” de uma proteína abrangem peptídeos, uligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas tendo substituições.

deleçôes e/ou inserções de aminoácido em relação á proteína não modificada em dúvida e tendo atividade biológica e funcional similares como a proteína não modificada a partir da qual elas são derivadas,

Uma deleçào refere-se à remoção de uni ou mais aminoácidos de uma: proteína.

n Uma inserção refere-se a um ou mais resíduos de aminoàcido que são introduzidos em um sitio pré determinado em uma proteína. As inserções podem compreender fusões de terminal N e/ou terminal C assim como inserções intra-sequência de amínoáeidas únicos ou múltiplos. No gerai, as inserções dentro da sequência de aminoàcido será menor do que as 10 fusões de terminal N ou C, da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos. Os exemplos de proteínas de fusão de terminal N ou C ou peptideos incluem o domínio de ligação ou domínio de ativação de um atívador transcricional como usado no sistema de híbrido duplo de levedura, proteínas de revestimento de fago, rótulo de (histidinal-d, rótulo de glutatíona S. 15 transferase, proteína A, proteína de ligação de maltose, diidrofoliato redutase, epítopo de Rótulo* 100. epítopo c-myc, epítopo FLAG^, lacZ, CM.P (peptídeo de ligação de eslmodulína), epítopo HA, epítopo de proteína C e epítopo vsv.

Urna substituição refere-se á substituição de aminoácidos da 20 proteína com outros aminoácidos tende propriedades similares (tais como hidrofobiddade, hidrofdicídade, antígenicidade, propensão para formar ou romper estruturas a-helieoidais ou estruturas de folha β similares). A.s substituições de aminoàcido são tipicamente, de resíduos unices, mas podem ser agrupados dependendo das restrições funcionais colocadas no 25 poHpeptideo; as mserçoes usual mente serão da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoàcido. As substituições de aminoàcido são preferivelmente substituições de aminoàcido conservativas. As tabelas de substituição conservatives são bem conhecidas na técnica (ver por exemplo Creighlon (1984) Proteínas. W. H, freeman and Company (Eds) e Tabela 1 abaixo).

Tabela k Exemplos <le substituições da ammoácido consçn-adas

Residue	Subsiítuíçõcs Conservative	Resíduo	SnbOiluiçòes ('<x:serv.»'ib as
Ala	Ser	Ltm	lie; VA
................	Lys	l,ys	A?g; G1h
Asn.	Gin.: His	Mel	Leu; He
Asp	Íli/::	fhe	Met; Leu: Tyr
Gin	Asa	Ser...........	liill çi'11111'iç
JóE................	Ser	Thr	Ser; Vai
Glu	Asp	Trp	IM................................................................
Ely	Pro	Tyr	Trp; Phe
........1	A.m; Gin	Vai	Ue; Leu
	Leu. Vai

As substituições, deleçoes e/ou Inserções de anünoácido podem ser facilmente fabricadas usando técnicas sintéticas de peptídeo bem conhecidas na técnica, tais como síntese de peptídeo de fase sólida e outras ou pela manipulação de DNA recombinante. Os métodos para a manipulação da SEQuêacias de DNA para produzir variantes de substituição. Inserção ou deleçao de um proteína são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as técnicas para fabricar mutações de substituição em sítios pré determinados no DNA são bem conhecidos por aquelas habilitados na técnica e incluem mutagênese M.H. mutagênese P? T7-Gen (USB. Cleveland, OH), Mutagênese Direcionada ao Sitio QuickChange (Stratagene, San Dlego, CA), mutagénese direcionada ao sítio mediada pela PCR ou outros protocolos de mutagênese direcionada ao sítio,

Myate ^Derivados' incluem peptídeos, obgopeptídeos, polipeptídeos que, comparadas com. a sequência de amínoácído da forma que ocorre naturalmente da proteína, tal como a proteína de interesse, podam compreender substituições de amínoáddos com resíduos de amínoàeido que não ocorrem naturalmente ou adições de resíduos de arninoácido que não ocorrem naturalmerUe·, “Derivados de uma proteína também abrangem pepíídeos, olígopeptídeos, poli peptídeos que compreendem resíduos de ammoáeido alterados que ocorrem naturalmente (gíicosilados, sedados, prendados, fosforilados. miristoilados, sulfatados etc.) ou alterados que não ocorrem natural mente comparados com a sequência de aminoácido de uma forma que ocorre natural men te do polipeptídeo. Ijm derivado também pode compreender um ou mais substituintes que não aminoácido ou adições comparadas com a sequência de aminoácido a partir da qual os mesmos são derivados, por exemplo uma molécula repórter ou outro ligando, covalente ou não covalentemente ligado à sequência de aminoácido, tal como uma molécula repórter que está ligada, para facilitar a sua detecção e resíduos de aminoácido que nau ocorrem naturalmente em relação à sequência de aminoácido de uma proteína que ocorre naturalmente,

Além disso, “derivados*' também incluem fusões da forma que ocorre naturalmente da proteína com pepíideos de rotulação tais como H..AG, H’186 ou tiorredoxina (para uma revisão de pepíideos de rotulação, ver Tcrpe, App1. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).

QrtólogofsyParálogofs}

Ortólogos e parálogos abrangem conceitos evolucionários usados para descrever as relações ancestrais de genes. Parálogos são genes dentro da mesma espécie que se originaram através da duplicação de um gene ancestral; orlólogos são genes de organismos diferentes que se originaram através da evolução de novas espécies e também são derivados de um gene ancestral comum.

Pqndnío

O termo “domínio'’ refere-se a um conjunto de aminoáeidos conservados em posições específicas junto com um alinhamento da SEQuêmuas de proteínas evoiucionariameníe relacionadas. Embora o.s aminuácidos em outras posições possam variar entre homólogos., os amínoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam ammoãcidos que são provavelmente essenciais em estrutura, estabilidade ou função de uma proteína. Identificado pelo seu alto grau de conservação nas sequências alinhadas de uma família de proteínas homólogas, eles podem ser usados como identificadores para determinar se algum polipeptídeo em duvida pertence a uma família de polipeptídeo anteriormente identificada. Muii v< ^.'Sequência de opnsensn/.Assitvitimi

Os termos “motivo* ou “sequência de consenso” ou 5 “assinatura” referem-se a uma região conservada curta na sequência de proteínas evolucionariarnente relacionadas. Os motivos são frequentemente partes altamente conservada de domínios, mas também podem incluir apenas parte do domínio ou estar localizadas foram dó domínio conservado (se todos os aminoácidos do motivo caem fora de um domínio definido).

Hibrklízaçãa

O termo “hibridizaçâo” como aqui definido é um processo em que sequências de nucleotídeo substancialmente homólogas complementares recoz.em-se entre si, O processe? de hibridizaçâo pode ocorrer totalmente em solução, isto é, ambos os ácidos nucléicos complementares estão em solução. .15 O processa de hibridizaçâo também pode ocorrer com uma das moléculas de ácido nucléico complementares imobilizadas a tuna matriz tal como pérolas magnéticas, pérolas de Sepharose ou qualquer outra resina. O processo de hibridizaçâo além disso pode ocorrer com uma. das moléculas de ácido nucléico complementares imobilizadas a um suporte sólida tais como uma 20 membrana, de nitrocelulose ou náilon ou imobilizados por exemplo pela fbtolitografia, por exemplo, a um suporte de vidro silício (o último conhecido como arranjos ou microarranjos da SEQuêncía de ácido nucléico ou como lascas da SEQuência de ácido nucléícu). De modo a permitir que a hibridizaçâo ocorra, as moléculas de ácido nucléico são no geral térmica ou 25 quimicamente desnaturadas para íúndir um filamento duplo em dois filamentos únicos e/ou para remover grampos de cabelo ou outras estruturas secundárias de moléculas de ácido nucléico de filamento único.

O termo “severidade” relère-se às condições sob as quais uma hibridizaçâo ocorre.. A severidade de hibridizaçâo é influenciada pelas condições tais como temperatura, concentração salina, concentração iomca e composição do tampão de hibridização. No gerai, condições de severidade baixa são selecionadas para serem de cerca de 30 C mais baixo do que o ponto de fusão térmica (T_fô) para a sequência específica em uma concentração 5 iônica e pH definidos. As condições de média severidade são quando a temperatura está 20* C abaixo da T_ra e condições de alta severidade são quando a temperatura está 10° C abaixo da T_n.. As condições de hibridização de severidade alta são tipicamente usadas para isolar sequências hibridizanles que têm similaridade da SEQuência alta com a sequência de ácido nucléico 10 alvo. Entretanto, as sequências de ácido nucléico podem desviar na sequência e ainda codificar um polipeptideo substancialmente idêntico, devido à degenerescêncla do código genético. Portanto as condições de hibridização de severidade média podem algumas vezes necessitar identificar tais moléculas de ácido nucléico.

.15 A Tm é a temperatura sob concentração iônica e pH definidos, na qual 50 % da sequência alvo hibridiza com unia sonda períeltamente emparelhada, A é dependente das condições de solução e da composição base e comprimento da sonda. Por exemplo., sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. A taxa máxima de 20 hibridização é obtida, a partir de cerca de 16* C até 32 C abaixo da T_w. A presença de càtions monovalentes na solução de hibridização reduz a repulsão cletrostàtica entre os dois filamentos da SEQuêncía de ácido nucléico promovendo deste modo a formação de híbrido; este efeito ê visivcl para as concentrações de sódio de até 0,4 M (para concentrações mais altas, este 25 efeito pude ser ignorado). A fonnamida reduz a temperatura de fusão de duplexes de DNAdONA e DNA-RNA com 0,6 a 0,7° C para cada porcentagem de fonnamida e a adição de 50 % de fonnamida permite que a hibridização seja realizada de 30 a 45 C, embora a taxa de hibridização será diminuída. Os desemparelhamentos de par de base reduzem a taxa de hibridização e a estabilidade térmica dos duplexes. Em média c para sondas grandes, a Tm diminui cem a de I^o C por% de desemparelhameuto de base. A Tm pode ser calculada usando as seguintes equações, dependendo dos tipos de híbrídos:

1) Híbridos de DNA-DNA (Memkoth e Wahl, Anal.

Bíochem., 138: 267-284, 1984):

Π ? f' - 0,61 x % de Formamida

2) Híbridos de DNA-RNA cm RN.A-RNA:

T₍b “ 79,8 -t 18,5 (logiiJ'NTf') 4- 0,58 ( %G/C^b) -r 11,8 ( %G/C^hR - 820/1.7

3) híbridos de oligo-DN A ou uligo~R.NA^d?

Para < '20 nudeotídeos: T_(!,™ 2 (L)

Para 20 a 35 nucleotídeos: Τ_γ<_; ·“ 22 *· 1,46(ζ) .IS ⁴ ou para outro cátiou monovalente, mas apenas preciso na faixa de 0,01 a.0,4NL ” apenas preciso para %GC na faixa de 30 % a 75 %.

L - comprimento do duplex em. pares de base.

oligo, oligonucleotideo; l,_n comprimento eficaz de 20 preparador ™ 2>'(n^í;1 de G/C) (n^§ de A/T).

A ligação não específica pode ser controlada usando qualquer uma de várias técnicas conhecidas tais como, por exemplo, bloqueio da membrana com soluções conteúdo proteína, adições de R.NA. DNA e SDS heterólogos ao tampão de hibridizaçào e tratamento com Rnase. Para as 25 sondas não homólogas, uma serie de híbridizações pode ser realizada variando-se um de (i) diminuir progressivamente a temperatura de recozimento (por exemplo de 68° C a 42 C) ou (il) diminuir progressivamente a concentração de formamida (por exemplo de 50 % a 0 %), O técnico habilitado está ciente de vários parâmetros que podem ser alterados durante a hibridização e que manterão ou mudarão as condições de severidade.

Além das condições de hibridização, a especificidade da hibridização tipicamente também depende da iimção das lavagens de pós 5 hibridização. Para remover o fundo que resulta da hibridização não específica, as amostras são lavadas com soluções salinas diluídas. Os fatores críticos de tais lavagens incluem a concentração iônica e temperatura da solução de lavagem final: quanto mais baixa a concentração salina e quanto mais alta a temperatura de lavagem» mais alta a severidade da lavagem. As condições de 10 lavagem são tipicamente realizadas na on abaixo da severidade de hibridização. Uma hibridização positiva dá um sinal que é pelo menos duas vezes daquele do fundo. No gera!, as condições severas adequadas para os ensaios de hibridização da SEQuência de ácido nucléico ou procedimentos de detecção da amplificação de gene são como apresentados acima. Condições 15 mais ou menos severas também podem ser selecionadas. O técnico habilitado esta ciente de vários parâmetros que podem ser alterados durante a lavagem e que manterá ou mudará as condições de severidade.

Por exemplo, as condições de hibridização de severidade alta típicas para híbridos de DNA. mais longos do que 50 nudeotídeos abrangem a 20 hibridização a 65° C em Ix SSC ou a42^a C em lx SSC e 50 % de formamida, seguida pela lavagem a 65° C em 0,3 x SSC. Os exemplos de condições de hibridização de severidade média para híbridos de DNA mais longos do que 50 nucleotídeos abrangem a hibridização a 50° C em 4x SSC ou a 40 C em 6x SSC e 50 % de formamida, seguido pela lavagem a 50 C em 2x SSC. O 25 comprimento do hibrídu é o comprimento previsto para o ácido nucléico hbridizanle. Quando moléculas de ácido nucléico da SEQuência conhecida são hibridizados, u cumprimento do híbrido pude ser determinado alinhandose as sequências e identificando as regiões conservadas aqui descritas. I* SSC é 0,15 M de NaCl c 15 mM de citrato de sódio; a solução de hibridização e as soluções de lavagem podem adidonalmente incluir Sx. reagents de Denhardt, 0,5 a 1,0 % de SDS, 100 pg/ml de D'NA de esperma de salmão desnaturado, fragmentado, 0,5 % de pirofosfato de sódio.

Para os propósitos de definir o nível de severidade, referência pode ser feita a Sambrook c/ mf (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3^a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nova Iorque ou a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &- Sons, ΝΛΕ (1989 e as atualizações anuais).

Variante de junção

O termo “variante de junção’' como aqui usado abrange variantes de uma sequência de ácido nucléieo em que introns e/ou exons selecionados foram excisados, substituídos, deslocados ou adicionados ou em que introns foram encurtados ou encompridado.s. Tais variantes serão aquelas em que a atividade biológica da proteína é substancialmente retida; isto pode .15 ser obtido retendo-se selelivamente segmentos funcionais da proteína. Tais variantes de junção podem ser encontradas na natureza ou podem ser sintéticas. Os métodos para prognosticar e isolar tais variantes de junção são bem conhecidas na técnica (ver por exemplo Foissac e Schíex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).

Variante Aléiica

A.Ielos ou variantes alélicas são formas alternativas de um dado gene, localizado na mesma posição cromossômica. As variantes alélicas abrangem Polimorfismos de Nudeotídco Unico (SN.Ps), assim como Polimorhsmos de Inserção/Deleção Pequenas (INDELs). O tamanho dos 25 INDELs é usuahnente menor do que 100 pares de base. SN Ps e INDELs formam o maior conjunto de variantes da SEQuência nas quais cepas polímórftcas ocorrem naturalmente da maioria dos organismos. Embaralhamento de gene/Evolução direcionada

O embaralhamento de gene ou evolução direcionada consistem de iterações de embaralhamento de DNA seguidas pel a triagem e/ou seleção apropriadas para gerar variantes da SEQuências de ácido nucléico ou porções destas que codificam proteínas tendo uma atividade biológica modi ficada (Castle m o/., (2004) Science 304(5674): 1151-4: Patentes US 5,811,238 e 5 6.395.547),

Elemento regulador/Sequencia de controle/Promotor

Os termos “elemento regulador”, sequência de controle” e “promotor” são todos aqui usados intercambíavelmente e devem ser interpretados em run contexto amplo para se referir à. sequência reguladora dc 10 ácidos nucléicos capazes de efetuar a expressão das sequências às quais eles estão ligados. O termo “promotor* tipicamente refere-se a uma sequência de controle da sequência de ácido nucléico localizada a montante do início transcricional de um gene e que está envolvido no reconhecimento e ligação da RNA polimerase e outras proteínas, direcionando deste modo a transcrição .15 de um ácido nucléico operavelmente ligado. Abrangido pelos termos anteriormente mencionados estão as sequências reguladoras transcricionais derivadas de um gene genômico euearíótieo clássico (Incluindo a caixa TATA que é requerida para o início de transcrição preciso, com ou sem uma sequência da caixa CCAAT) e reguladores de demento adicionais (isto é 20 sequências que ativam a montante, realçadores e silenciadores) que alteram a expressão de gene em resposta aos estímulos desenvolvimentais e/ou externos ou em uma maneira específica de tecido. Também incluídos dentro do termo está uma sequência reguladora transcridonal de um gene procariótíco clássico, caso este em que o mesmo pode incluir uma sequência de caixa -35 25 e/ou sequências reguladoras transcricionais da caixa -10. O termo “demento regulador” também abrange uma molécula ou derivado de fusão sintética que conferem, ativam ou aumentam a expressão de uma molécula da sequência de ácido nucléico ern uma célula, tecido ou órgão.

Um “promotor vegetar compreende elementos reguladores.

que medeiam a expressão de um segmento da SEQuencia codificador em célula vegetais. Consequentemente, um promotor vegetai não precisa ser de origem vegetal, mas pode originar-se de vírus ou microorganismos, por exemplo de vírus que atacam células vegetais. O “promotor vegetal”¹ 5 preferivelmente origina-se de uma célula vegetal, por exemplo da planta que e transformada com a sequência de ácido nucléico a ser expressada no processo da invenção e aqui descrita. Isto também se aplica a outros sinais reguladores “vegeteis’, tais como termi.nadores “vegetais”. Os promotores montante das sequências de nucleotídeo úteis nos métodos da presente invenção podem ser 10 modificados por uma ou mais substituições, inserções e/ou ddeções de nudeoiideo sem interferir com a funcionalidade ou atividade dos promotores, a matriz de leitura aberta (ORF) ou a região reguladora 3' tais como terminadores ou outras regiões reguladoras 3” que estão localizadas fora da ORF. É além disso possível que a atividade dos promotores seja aumentada .15 pela modificação da sua sequência ou que seja completamente recolocada pelos promotores mais ativos, mesmo promotores de organismos heterólogos. Para a expressão em plantas, a molécula da sequência de ácido nucléico, como descrita acima, deve ser operavelmenle ligada ao ou compreender u.m promotor adequado que expressa o gene no ponto certo no tempo e com o 20 padrão de expressão espacial requerido.

Para a identificação de promotores funcionalmente equivalentes, a força e/ou o padrão de expressão do promotor de um promotor candidato podem ser analisados por exemplo ligando-se operavehnente o promotor a um gene repórter e ensaiando o nível de expressão e padrão do 25 gene repórter eus vários tecidos da planta. Os genes repórter adequados bem conhecidos incluem por exemplo beta-glicuronidase ou beta-galactosidase. Λ atividade de promotor é ensaiada medindo-se a atividade enzimática da betaglicuronidase ou bela-galactosklase. A força e/ou o padrão de expressão do promotor podem ser depois comparados com aquele de um promotor de referência (tal como aquele usado nos métodos da presente invenção). Aítcmativamente, a força do promotor pode ser ensaiada quant i ficando-se os níveis de mRNA ou comparando-se os níveis de mRNA da sequência de ácido nucléico usada nos métodos da presente invenção, com o.s níveis de 5 mRNA de genes de manutenção tais como 18S rR.NA, usando métodos conhecidas na técnica, tais como Northern blotting com a análise densitometries. de autorradiogramas, PCR. em tempo real quantitativa ou RTPCR (Heid cr n/., 1996 Genome Methods 6: 986-994). No geral por ‘’promotor fraco” é intencionado um promotor que direciona a expressão de 10 uma sequência codifiesdora em um nível baixo, por '/nível baixo é intencionado em níveis de cerca de 1/10.000 transcritos a cerca de 1/100.000 transcritos, a cerca de 1/500.0000 transcritos por célula. Ao contrário, um '‘promotor forte’' direciona a expressão de uma sequência codifícadora em nível alto ou de cerca de l/l 0 transcritos a cerca de 1/100 transcritos a cerca 15 de 1/1000 transcritos per célula. No geral, por “promotor de força média” é intencionado um promotor que direcione a expressão de uma sequência, codííicadora em um nível que esteja em todos os casos abaixo daquele obtido sob o controle de um promotor de 358 CaMV.

Opera velmente ligada

O termo “operavelmente ligada” como aqui usado refere-se a uma ligação funcional entre a sequência promotora e o gene de interesse, tal que a sequência promotora seja capaz de iniciar a transcrição do gene de interesse.

Promotor Constitutivo

Um “promotor constitutivo” refere-se a um promotor que é franscricionalmente ativo durante a maior parte, mas não necessariamente todas, das fases de cultivo e desenvolvimento c sub a maior parte das condições ambientais, em pelo menos uma. cédula, tecido ou órgão. A Tabela 2a abaixo dá exemplos de promotores constitutivos.

lAuIaA; INampins dc promolorcs cunadlulívos

Irontu de Gene	Reroròaeia
Aehua 11MGB	MeBi roy ro ro, Plant Ceil, 2: 163-1:7 L 1999 WÜWWBBf......
GOS2	<k Palro e/ cá Pbro J Nnv;2(6);837-44s 1992, WO 200)65596
Ubiquitina	Christensen ro U, Plant Mot Biol. 18: 673-689. 1992
Cidafáhu da Arroz	Buchholz roa/, Plant Mol Biol. 25(5}: 837-43, 1994
Hlstona H3 du roilhu	Lepetit er «/, Mok Gen.. Genet. 231: '276-285. 1992
Bistona H.3 da alfaia	Wu el nk Flora. Met Biol, 11: 641-649, 1988
Avima 2	Afi«/dt Flam J. ϊϋ(ί); 107-121, Í.99Ü
Subtmidadc pequena de Rubiseu	US 4,962.028
OÍ.ÍS .leisner (1988) Proc Nad Aeroi Sci D8A 85ph 2553
SAD1	Jain at ul. Crop Science, 39 (6Ϊ 1999; 1696
S.A.Ü2	Jain «r «/., Crop Science, 39 ¢6), 1999: 1696
V-ATPa.se	W 0V14572
Proteínas de caixa G	WD94/12Ü1S
	Odell Nature, 313: 810-812, 1985
OMV 198	Nilsson erro., Physiol. Plant. 100:456-462, 1997
34SFMV	Sanger ro A., Plant. Mot Biot. 14, 1999; 433-443
nos	Shaw ro U. ¢1984} Nudeic Acids Res. 12(203:7831- ..... .......

Promotor Ubíquo

Um promotor ubíquo é ativo substancíalmente em. todos os tecidos ou células de um organismo.

Promotor desenvolvímentalmente regulado

Um promotor desenvolvimentalmente regulado é ativo durante certos estágios de desenvolvimento ou em partes da planta que sofrem mudanças desenvol vimentaí s.

Promotor indytíyel

Um promotor indutível tem início de transcrição induzido ou aumentado em resposta a um produto químico (para uma revisão ver Gatz 1997, Anna. Rev. Plant Physiol. Plant Mol Biol.. 48: 89-108), o estímulo ambiental ou físico pode ser “mdutível pelo estresse”, isto é ativado quando uma planta é exposta a várias condições de estresse ou um '‘mdutívcl por patógeno” íxtc é ativado quando uma planta é exposta à exposição aos vários patògenos.

Promotor específico de órgão/promotor especifico de ucido < Um promotor especifico de órgão ou específico de tecido é um que è capaz de preferencial mente iniciar a transcrição em certos órgãos ou tecidos, tats como as tolhas, raízes, tecido de semente etc. Por exemplo, um “promotor específico de raiz*’ é um promotor que é tfanscrieionaimente ativo predommantcmente em raízes de planta, substancialmente para a exclusão de qualquer outras partes de uma planta, embora ainda permita qualquer expressão mal vedada nestas outras partes de planta. Os promotores capazes de iniciar amiuoácido transcrição em certas células apenas são aludidos aqui 10 como “específicos de célula”.

Os exemplos de promotores específicos de raiz são listados na

Tabela 2b abaixo:

Tabela 2b: Exemplos de promotores.específicos. de raiz

Tdnte de Gene	Ríífétemia
RO 3 do Armz	Ãu U A (1993) Plant Mol Biol 27(2); 237-48
Transportador de fbsfam de Arabidnpsis FHT1	Kovama er αΖ., 2005
Transportador de fosfato de Medleago	Xiao ci <R.. 201)6
ArábUopA PyklO	Nitz r? oZ. (2001) Plant Sei 161(2); 337- 346
(Unes o\ps.i.-íilcos da raiz do Tabaco RB7, RD2, RD5. RH 12	Conkling er «Z. (1990) Plant Phys 93(3): ...............
Leeilna especifica de raiz da cevada	temer A- Raikhcl (1989) Plant Phys 91; 124-129
Proteína rica em hidrèxbpmlm espeertka de raiz	Keller & Lamb (1989) Genes & Dev 3: 1639-1646
Arabídopsis CDC27B/hobbit	Blilou <·ν aZ. (2(162) Gents &. Dev 16: 2366-2575

Um promotor específico de semente é transcricionalmente la ativo predominantemente em tecido de semente, mas não necessariamente de modo exclusivo em tecido de semente (em casos de expressão mal vedada). O promotor especifico de semente pode ser ativo durante o desenvolvimento da semente e/ou durante a germinação. Os exemplas de promotores específicos de semente sâo mostrados na Tabela 2c· abaixo. Outros exemplos de 20 promotores específicos de semente são dados em Qing Qu e Takaiwa (Plant

Biolechnob J. 2, 1 Π-125, 2004), divulgação esta que é incorporada aqui por referência como se totalmerHe apresentada.

tabela ?c, Exemplos de piomolorus espcctftcos de xrmate

Fonte do gene	Roferêada
genes específicos de semente	Simon er a/., Plant Mol Biol. 5: 19.1, 1985;
	Scofield er ο/.. J, Biol. Chcm. 252: 12202.. 1987;
	BaszczynsAi e/ rd.. Plant Moi Biol. 14: 633. 1990.
Àlbomína da castanha do Pará.	Pearson rv oZ., Plant Mol Biol. 18; 235-245, 1992.
Legumina	Ellis et rd.. Plant Mol Biol. 10: 203-214. 1988.
Glutelins (arroz)	Takaiwa Mol. Gen, Genet. 208: 15-22, 1986;
	Takaiwa er <F., FEBS l...eita, 221: 45-47, 1987.
Z.eíns	Matzke er al Plant Mol Biol, 14(3): 323-32 1990
NapA	Stalberg ei <F, Plant 199: 515-519. 1996.
Gluteiina 1 LMW e MM W do trigo	Mol Gen Genet 216: 81-90, 1989; NAR 17;
SP A do trigo	Albarn e/< Plant Cell, 9: 171484, 1997
«, β, y-gliadimes do triga	EMBOI3: 14(19-15, 1984
Promotor Itr 1 da cevada	Diaz e/ ci/. (1995) Mol Gen Genet 248(5).: S92-8
Bl, C, D, hordeina da cevada	i'beor Appl Gen 98: 1253-62, 1999; Plant J 4: 343-55. 1993; Mol Gen Genet 250: 75060, 1996
DOF da cevada	Mena er a/, The Plant Journal, 116( 1): 53-62, 1998
lillpi.,..........oi	EP99196056.7
Promotor sintético	Vicente-Carbaiosa et o(., Plant J. 13: 62.9640, 1998.
proiamma do arroz NR.P33	Wu er o/. Plant Cell Physiology 39(8) 885889. 1998
a-globulina do arroz Gib- 1	Wu cl ο/. Plant Cell Physiology 39(8) 885-
OSB1 do arroz	Sato er a/, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 8117-8122,1996
a-globníina do arroz REB/OHP-1	Nakasc ¢/ cw. Plant Mol Biol. 33: 513-522, 1997
ADP-gliocse pirofosio.ri.lase do	Irons Res 6: 157-68, 199?
Família dn gene ESR do rnílho	Plant .1 12:235-46, 1997
o-callri.ua do sorgo	DeRose ci n?.x Planta Mol. Biol 32; 1()29-35, .....
K.NOX	Postma-I-Iaarsma eZ c/, Plant Mol Bin). 39;

Oleosma da arroz	Wu« J. Hmdmm. 323; 3|6S 1998:
? )W\ma da pr.ma-l	Cummins cííA, Piam Mui Bml. Eè 873-8 “o, /02/ '.Λ:.....
PROOi 17, proteína ribossônüca 408 putativa do arroz	WMW .....
PR.OOÍ36, aíanína amínotransferase do anoz	úãupiAhcada.
PROqmq mmid<<r da rripMoa ÍTR.1 (cevada)	min publicado
PRQ0151, arroz WSH8	WO 2004/070039
PROOI 75, arroz RAB21	WO 2004707()039
PR0005	WO 2004/070039
PR00095	WO 2004/070039
c-ami lase (Amy3 2b)	Umaban efm, Plant Cell 4: 203 -211, 1992; Shriver e? <?Z, Proc Natl Acad Sei USA 88: 7266-7270, 1991
Gene equivalente à 13 catepsirra	Cejado rí ai. Plant Mol Biul 20: 049-836, ........ . ........ /)/)177
Cevada Ltp2	Külia cí a/.. Plant 4. 6: 849-60, 1994
Chi26	Leah G Plant 1 <h 379-89,1994
Maha B-Pem	Sdipger G «Z.. Genetics 149J 125-38,1998

Um promotor específico de tecido verde como definido aqui é um promotor que é transoricionalmente ativo predominantemente em tecido verde, substancialmente para a exclusão de qualquer uma das outras partes de um planta, embora ainda possibilite qualquer expressão mai vedada nestas omras panes de planta.

Os exemplos de promotores específicos de tecido verde que podem ser usados para realizar os métodos da invenção são mostrados ria Tabela 2d abaixo.

Tabela 2d: Exemplos de promotores específicos de tecido verde

Gene	Expressão	Referência
Ortofosfato dicinase do milho	Específica de folha	Fukavama aí u/.. 2001
Fosfoendpinrveiu uarlmxihse do milha	Específica de folha	Rausch aí u/., 2001
Fosfbeno Ipiru va to carbo x i 1 a?-e do arroz	Especifica de folha	:Uu'efgA,2ÕÕ3
Subunidade pequena de Rabisco do arroz	Espçcí&a de: Adha	Nwra cr <»/.. 2000
beta expansina EXBP9 do arroz	Específica de broto	W2»WW39
Seburàdade pequena de Rabisco do guandu	i 'rpecrnea de folha	iPsnfuiutt W G, 2003
R.BCS3A da enilha	Especifica de tolha

Um om.ro exemplo de um promotor específico de tecido é um promotor especifico de merístema, que é transerieionalmenic ativo predommantemente em tecido meristemâtíco, substancialmente para a exclusão de qualquer outra das partes de uma planta, enquanto ainda permite 5 qualquer expressão mal vedada nestas outras partes da planta. Os exemplos de promotores verdes específicos de meristema que podem ser usados para realizar os métodos da invenção são mostrados na Tabela 2e abaixo.

Tabela 2e: Exemplos <ie. promotores específicos pie .meristerpa

Fonte da geue	Parirão de expressão	Referência
OSl-ri do arroz	Meri sterna apical de broto, du estágio globular do embrião para o estágio de muda	Sato í ? «Z. 0996} Proc. Mali. Acad. Set USA, 93: Si 17'8122
Melak4iout.‘üiu do arroz	Especifica de medstema	BAW835.1
WAKi & WAK2	.Meristemas de broto e raiz apical e nas folhas e répai&s que se expandem	Wagner & Kdhom (200 Ϊ) Plant Cell 13(2): 303-318

Terminador

O termo ^{10 ii * * * 15 * * * * 20}terminador^,> abrange uma sequência de controle que é urna sequência de DNA no final de urna unidade transcricional que sinaliza o processamento 3’ e polladenilação de um transcrito primário e terminação de transcrição. O tenninador pode ser derivado do gene natural, de uma variedade de outros genes vegetais ou de T-DNA. O iermlnador a ser adicionado pode ser derivado, por exemplo, dos genes da nopalina síntase ou octopina sintase ou alternatívamente de um outro gene vegetal ou menos preferivelmente de qualquer outro gene eucariótico.

Modulação

O termo “modulação* significa em relação a expressão ou expressão de gene, um processo em que o nível de expressão é mudado pela dita expressão de gene em comparação com a planta, de controle, o uivei de expressão pode ser aumentado ou diminuído. A expressão original não modulada pode ser de qualquer tipo dc expressão de um RN A estrutural (VR NA. tRNA) ou mRNA com tradução subsequente, O termo “modular a atividade” deve significar qualquer mudança da expressão das sequências de ácido nucléíco da invenção ou proteínas codificadas, que leva ao rendimento aumentado e/ou crescimento aumentado das plantas.

Expressão

O termo “expressão” ou “expressão de gene” significa a transcrição de um gene específico ou genes específicos ou construção genética especifica. O termo “expressão” ou “expressão de gene” em particular significa a transcrição de um gene ou genes ou construção genética 10 em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com ou sem tradução subsequente do último em. uma proteína. O processo inclui a transcrição de DNA e processamento do produto de mRNA resultante.

Exi>rcssão.autpentada/superex.pressãn

Os termos “expressão aumentada” ou “superexpressao” como 15 aqui usados significam qualquer forma de expressão que seja adicional ao nível de expressão do tipo selvagem original.

Os métodos para aumentar a expressão de genes ou produtos de gene são bem documentados na térmica e incluem, por exemplo, a superexpressão direcionada pelos promotores apropriados, o uso de realces de 20 transcrição ou. realces de tradução. Os ácidos nucléicos isolados que servem como promotor ou dementes de realce podem ser introduzidos em uma posição apropriada (tipicamente a montante) de uma forma não heteróíoga de um polínucleotídeo de modo a supm-regular a expressão de um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de interesse. Por exemplo, promotores 25 endógenos podem ser alterados m vivo pela mutação» deleçào e/ou substituição (ver, Kmiec. US 5.565.350; Zarling d o/._x WO9322443) ou promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula vegetal na orientação e distância, apropriadas- de um gene da presente invenção de modo a controlar a expressão do sene.

Se a expressão do polipeptídeo é desejada, é no geral desejável íneluir uma região de poliadenilação na extremidade 3’ de uma região que codifica o polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes vegetais ou de T-DNA. A 5 sequência da extremidade 3' a ser adicionada pode ser derivada, por exemplo, dos genes da nopalína sintase ou nd.opina sintase ou altemativamente de urn nutro gene vegetal ou menos preferivelmente de qualquer outro gene eucari ótico.

Uma sequência de intron também, pode ser adicionada à região 10 5’ não traduzida (UTR) ou a sequência codificadora da sequência codifícadora parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que acumula no citossoL A inclusão de um intron encdxável na unidade de transcrição nas. construções de expressão tanto vegetal quanto animal tem sido mostrado aumentar expressão de gene tanto ao nível de mRNA quanto de .15 proteína até 1000 vezes (Buchman e Berg (1988) Mol.. Cell Biol. 8: 43954405; Callis H u/. (1987) Genes Dev 1: 1183-1200). Tal realce de intron da expressão de gene é tipicamente maior quando colocado próximo à extremidade 5' da unidade de transcrição. O uso dos introns do milho, os intron 1,2 e 6 de Add 1 -S, o intron Bronze-1 são conhecidos na técnica. Para 20 informação geral ver: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling and Walbot, Eds., Sumerer, N.Y. (1994),

Referência aqui a um gene “endógeno” não apenas refere-se ao gene em. dúvida, como encontrado em uma planta na sua forma nazund (isto é. 25 sem. que haja nenhuma intervenção humana), mas também refere-se àquele mesmo gene (ou um ácido nucléico/gex^e substancialmente homóloga) em uma forma isolada subsequentemente (re)introduzida em uma planta (um transgene). Por exemplo, uma planta transgêtüca contendo um tal íransgene pode encontrar uma redução substancial da expressão de transgene e/ou redução substancial da expressão do gene endógeno. O gene isolado pode ser isolado de um organismo ou pode ser sintético, por exemplo pela síntese químico.

Referenda aqui a “expressão diminuída” ou “redução ou eliminação substancial” de expressão é considerada significar uma diminuição na expressão endógena de gene e/ou níveis de polipeptideo e/ou atividade de polipeptideo em relação às plantas de controle. A redução ou eliminação substancial é em ordem crescente de preferência de pelo menos 10 %, 20 %, 10 30 %, 40 % ou 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %. 90 % ou 95 %, 96 97 %, %, 99 % ou mais de redução comparado com as plantas de controle.

Para a redução ou eliminação substancial de expressão de um gene endógeno em uma planta, um comprimento suficiente de nucleotídeos substancialmente contíguos de uma sequência de ácido nucléico é requerido. .15 De modo a realizar o silenciamento de gene, este pode ser tão pouco quanto 20, 19, 18, 17, 16, IS, 14, 13, 12, ll, 10 ou menos nucleotideos, altemativamente isto pode ser tanto quanto o gene inteiro (incluindo a 5 e/ou 3' UTR, em parte ou no todo). O trecho de nucleotideos substancialmente contíguos pode ser derivado do ácido nucléico que codifica a proteína de 20 interesse (gene alvo) ou de qualquer ácido nucléico capaz de codificar um ortólogo, parálogo ou. homólogo da proteína de interesse. Preferivelmente, o trecho de nucleotideos substancialmente contíguos é capaz de formar ligações de hidrogênio com o gene alvo (filamento de sentido ou de anti-sentido), mais preferivelmente, o trecho de nucleotideos substancialmente contíguos tem, em 25 ordem crescente de preferência. 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidade da SEQuénoia com o gene alvo (filamento de sentido ou de anti-senttdo). Uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptideo (funcional) nào è uma exigência para os vários métodos debatidos aqui para a redução ou eliminação substancial da expressão de um gene endógeno.

Esta redução uu eliminação substancial de expressão pode ser obtida usando ferramentas e técnicas de rotina. Um método para a redução ou eliminação substancial de expressão de gene endógeno c pelo süenciamento mediado pelo RNA usando uma repetição invertida de uma sequência de ácido nucléico ou uma parte desta (neste caso ura trecho de nucleotldeos subsíancialmente contíguos derivados do gene de interesse, ou de qualquer sequência de ácido nucléico capaz de codificar um ortólogo, parálogo ou homólogo da proteína de Interesse), preferivelmente capaz de formar uma estrutura de grampo de cabelo. Um outro exemplo de um método de silenciamenío de RNA envolve a introdução da S.EQuêncÍ.as de ácido nucléico ou partes destas (neste caso um trecho de nucleotídeos subsíancialmente contíguos derivados do gene de interesse, ou de qualquer sequência de ácido nucléico capaz de codificar um ortólogo, parálogo ou homólogo da proteína de interesse) em um orientação de sentido em uma planta. Üm outro exemplo de um método de silenciamento de RNA envolve o uso da SEQuências de ácido nucléico de anti-sentido. O silenciamenlo de gene também pode ser obtido pela mutagênese de inserção (por exemplo, inserção de T-DNA ou inserção de transposon) ou pelas estratégias como descritas, entre outros, por Angell e Baulcombe ((1999) Plant .1 20(3): 357-62), {Amplicon VIGS WO 98/3608'3), ou Baulcom.be (WO 99/15682). Outras métodos, tais como o uso de anticorpos direcionados a um pulipeptídeo endógeno para inibir a sua função em planta. ou interferência no caminho de sinalização em que um polipeptídeo está envolvido, será bem conhecido pelo técnico habilitado. microRNAs (rníRNAs) artificiais e/ou naturais podem ser usados para silenciar a expressão de gene e/ou tradução de mRNA. miR.NAs endógenos são RN As pequenos de filamento único tipicamente de 19 a 24 nucleotldeos de comprimento.

Esta redução ou eliminação substancial de expressão pude ser obtida usando ferramentas e técnicas de rotina. Ura método preferido para a redução ou eliminação substancial da expressão endógena de gene é pela introdução e expressão era uma planta de uma construção genética na qual o ácido nucleico (neste caso um trecho de nuc leotídcos substandaimeníe contíguos derivados do gene de interesso ou de qualquer ácido nuclèiea capaz de codificar um ortólogo, parálogo ou homologo de qualquer uma das proteínas de interesse) é clonado como uma repetição invertida (em parte ou completamente), separada por um espaçador (que não codifica DNA).

Em um tal método preferido, a expressão do gene endógena á reduzida ou substancialmente eliminada através do silenciamenlo mediado pelo RNA usando uma repetição invertida de um ácido nucleico ou uma parte deste (neste caso um trecho de nucleotídeos substanciaímentc contíguos derivados do gene dc interesse nu de qualquer ácido nucleico capaz de codificar um ortólogo, parálogo ou homologo da proteína de Interesse), preferivelmente capaz de formar uma estrutura de grampo de cabelo. A repetição invertida é donada em um vetor de expressão que compreenda SEQuências de controle. Uma sequência de ácido nucleico que não codifica DNA (um espanador, por exemplo um fragmento da região de ligação de matriz ( MAR), um intron, um polihgador, etc.) está localizada entre os dois ácidos nucléicos invertidos formando a repetição invertida. Depois da transcrição da repetição invertida, um RN A quimérico com uma estrutura auto-complementar é formada (parcial ou completa), Esta estrutura de RN A de filamento duplo é. aludida como o RN A grampo de cabelo (hpRNA). O hpRNA è processado pela planta em siRNAs que são Incorporadas em um complexo silenciador induzido pelo RNA (RISC), O RISC diva ainda os transcritas de mRNA, deste moda reduzindo substancialmente o numero de transcritos de m.RNA a serem traduzidos em polipeptideos. Para detalhes mais gerais ver por exemplo, Grierson er d. (1998) WO 98/53083: Waterhouse ef «/. ( .1999) WO 99/53050),

O desempenho dos métodos da invenção não contam com a introdução e expressão cm uma planta de uma construção genética na qual o ácido nucléico c danado como uma repetição invertida, mas qualquer um ou mais de vários métodos de “sílenciamento de gene” bem conhecidas pode ser usado para se obter os mesmas efeitos.

Um tal método para a redução da expressão endógena de gene é o silenciamento mediado pelo RNA da expressão de gene (infra-regulagem), O silenciamento neste caso é deflagrado em uma planta por uma sequência de RNA de filamento duplo (dsRNA) que é substanciahnente similar ao gene endógeno alvo, Este dsRNA é ainda processado pela planta em cerca de 20 a cerca de 26 nucleotídeos chamados RNAs interferentes curtos (siRNAs), Os siRNAs são incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) que cllva o transcrito de mRNA do gene alvo endógeno. reduzindo substancialmente deste modo o número de transcritos de mRNA a serem traduzidos em um polipeptídeo, Preferivelmente, a sequência de RNA de filamento duplo corresponde a um gene alvo.

Um outro exemplo de um método de silenciar RNA envolve a introdução das sequências de ácido nucléico ou partes destas (neste caso um trecho de nucleotídeos substancialmente contíguos derivadas do gene de interesse ou de qualquer ácido nucléico capaz de codificar um ortólogo, parálogo ou homólogo da proteína de interesse) utn uma orientação de sentido em uma planta. “Orientação de sentido” refere-se a uma sequência de DNA que é homólogo a um transcrito de mRNA desta. Introduzida em uma planta portanto seria pelo menos uma cópia da sequência do ácido nucléico. A sequência de ácido nucléico adicional reduzirá a expressão do gene endógeno, dando ongem a um fenômeno conhecido como co-supressâo. A redução da expressão de gene será mais pronimdada se várias cópias adicionais de uma sequência de ácido nucléico forem Introduzidas na planta, visto que existe uma correlação positiva entre níveis de transcrito altos e a deflagração da co40 suoressão.

............... X

Um oul.ro exemplo de um método de silenciar RNA envolve o uso da SEQuências dc âeido nucléico de anti-sentido. Uma sequência de ácído nucléico de “anti-sentido” compreende uma sequência de nucleotideo que é 5 complementar a uma sequência de ácido nucléico de “sentido” que codifica uma proteína, isto é complementar ao filamento codificador de uma molécula de cana de filamento duplo ou complementar a uma sequência transcrita de mRNA. A sequência de ácido nucléico de anti-sentido é preferivelmente complementar ao gene endógeno a ser silenciado. A complementaridade pode 10 ser localizada na “região codificadora” e/ou na “região não codífieadora” de um gene. O termo “região codificadora” refere-se a uma região da sequência de Hucleotídeo que compreende eódons que são traduzidos em resíduos de aminoácido. O termo “região não codificadora” refere-se às sequências de 5* e 3’ que flanqueiam a região codificadora que são transcritas mas nau .1:5 traduzidas em aminoácidos (também aludidas como regiões não traduzidas 5’ e 3').

As sequências de ácido nucléico de anti-sentido podem ser planejadas de acordo com as regras de emparelhamento de base de Watson e Crick. A sequência de ácido nucléico de anti-sentido pode ser complementar à 20 sequência de ácido nucléico inteira (neste caso um trecho de nucleotídeos substancialmente contíguos derivadas du gene· de interesse ou de qualquer ácido nucléico capaz de codificar um ortólogo, parálogo ou homólogo da proteína de interesse), mas também podem ser um oHgonudeolídeo que seja de anti -sentido a apenas urna parte da sequência de ácido nucléico (incluindo 25 a 5’ e 3’ UTR de mRNA). Por exemplo, a sequência de oligonucleotídeo de anti-sentido pode ser complementar à região que circunda o sítio de inicio de tradução de um transcrito de m.RNA que codifica urn polipeptideo. O comprimento de uma sequência de oligonncleotídeo de anti -sentido adequada é conhecida na técnica e pode começar de cerca de 50, 45,40, 35, 30, 25, 20, ou 10 nucleotídeos no comprimento oü menos. Uma sequência de ácido nucléico de anli-sentldo de acordo com a invenção pode ser construído usando a síntese química e reações dc ligação enzirnática usando métodos conhecidos na técnica. Por exempla, urna sequência dc ácido nucléico de anti5 sentido (por exemplo, uma sequência de oligonudectídeo de anti-sentido) pode ser quimicamente sintetizada usando nucleotideos que ocorrem naturalmente ou nucleotideos variadamente modificados planejados para aumentar a estabilidade biológica das moléculas ou aumentar a estabilidade física do duplex formado entre as sequências de ácido nucléico de anti-sentido 10 e de sentido, por exemplo, derivados de fosforotioato e nucleotideos substituídos corn acridina podem ser usados. Os exemplos de nudeotideos modificados que podem ser usadas para gerar as sequências de ácido nucléico de anti-sentido são bem conhecidos na técnica, as modificações de nucleotídeo conhecidas incluem metilação, ciclização e ’'cops' e substituição 15 de um ou mais dos nucleotideos que ocorrem aaturalmeaie com um análoga tal como inosina. Outras modificações de nucleotideos são bem conhecidas na técnica.

A sequência de ácido nucléico de antí-sentido pode ser biologicamente produzida usando um vetor de expressão em que unia 20 sequência de ácido nucléico fbi snbclonado em uma orientação de anti-sentido (isto é, o RN A transcrito a partir do ácido nucléico inserido será de uma orientação de anti-.sentido em relação a um ácido nucléico alvo de interesse). Preferivelmente, a produção da SEQuências de ácido nucléico de anti-sentido em plantas ocorre por melo de uma construção de ácido nucléico 25 estavelmente integrado que compreende um promotor, um oligonudeutídeo de anti-sentido operavelmente ligado e um termmador.

As moléculas de ácido nucléico usadas para o sikmciamenio nos métodos da invenção (se introduzidas em uma planta ou geradas m A7?u) hibridizam com ou se ligam aos transcritos dc mRNA e/ou DNA genômico que codifica urn polipeptídeo para inibir deste modo a expressão da proteína, por exemplo, pela inibição da transcrição e/ou tradução. A hibridização pode ser pela (x>mplenieníaridade de nucleotídeo convencional para formar um duplex estável, ou, por exemplo, no caso de uma .sequência de ácido nucléico 5 de anti-sentido que se liga aos duplexes de DNA, através de interações específicas na ranhura maior da hélice dupla. Sequências de ácido nucléico de anti-sentido podem ser Introduzidas em uma planta pela transformação ou injeção direta em um sítio de tecido especifico. Altemativamente, as sequências de ácido nucléico de anti-sentido podem ser modificadas para 10 células selecionadas alvo e depois sistemicamente administradas. Por exemplo, para a. administração sistêmica, as sequências de ácido nucléico de anti-sentido podem ser modificadas tal que elas especificamente se ligam aos receptores ou anügenos expressados em uma superfície de célula selecionada, por exemplo, pela ligação da sequência de ácido nucléico de antí-sentido aos j 5 peptídeos ou anticorpos que se ligam aos receptores de superfície de célula ou antigenos. As sequências de ácido nucléico de anti-sentido também podem ser .liberadas às células usando os vetores aqui descritos.

De acordo com um outro aspecto, a sequência de ácido nucléico de anti-sentido é uma sequência de ácido nucléico a-anomèrica,. Uma 20 sequência de ácido nucléico a-anoinéríca forma híbridos específicos de filamento duplo com RNA. complementar em que, ao contrário das unidades b usuais, os filamentos correm paralelos um ao outro {'Gaultier e?' o/. (1987) Nucl Ac Res 15; 6625-6641). A sequência de ácido nucléico de anti-sentido tarnbém pode compreender um 2-o-metilribonucleotídeo (Inoue eí <?/. (1987) 25 Nud Ac Res 15, 6131-6148) ou um análogo de RNA-DNA quimérico (Inoue aro/. (1987) FEBS Lett. 215,327-3301

A redução ou eliminação substancial de expressão endógena de gene também podem ser realizadas usando ríbozimas. As ríbozimas são moléculas de RN A catalíticas com atividade de ribonuclease que são capaz.es dc clivar uma sequência de ácido nucléico de filamento único, tal corno um mRNA, ao qual elas têm uma região complementar. Assim, as ribozimas (por exemplo, ribozimas cabeça de martelo (descrito em Haselhoff e Gerlach (1988) Nature 334, 585-391) podem ser usadas para clivar cataliticamente transcritos de mRNA que codificam um pollpeptídeo, reduzindo substancialmente deste modo o numero de transcritos de rnRNA a serem traduzidos em um pollpeptídeo. Uma rihozima tendo especificidade para uma sequência de ácido nucléico pode ser planejada (ver por exemplo: Cech e.r «/. Patente U.S. N- 4.987.071; e Cech ef o/. Patente U.S. Ν^δ 5J 16.742). Altemativamente, os transcritos de mRNA que correspondem a uma sequência de ácido nucléico podem ser usados para selecionar um RNA catalítico tendo uma atividade de ribonuclease específica a partir de uma reunião de moléculas de RNA (Bartel e Szustak: (1993) Science 261, 14111418), O uso de ribozimas para o silenciamento de gene em plantas é conhecido na técnica (por exemplo, .Atkins et o/. (1994) WO 94/00012; Lenne eí o'Z. (1995) WO 95/034(14; Lutziger er oi (2000) WQ 00/00619; Prinsen et raí (1997) WO 97/13865 e Scott W aL (1997) WO 97/38116).

O silenciamento de gene também pode ser obtido pela mutagênese de inserção (por exemplo, inserção de T-DNA ou inserção de transposon) ou pelas estratégias como descritas, entre outros, por Angell e Baulcombe ((1999) Plant J 29(3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083) ou Baulcom.be (WO 99/15682).

O silenciamento de gene também pode ocorrer se houver uma mutação em um gene endógeno e/ou uma mutação em um gene/ácido nucléico isolados subsequentemente introduzidos em uma planta, A redução ou eliminação substancial pode ser causada por um pollpeptídeo não funcional. Por exemplo, o pollpeptídeo pode ligar-se a várias proteínas inlluenciadoras; uma ou mais mutações e/ou truncagens podem portanto fornecer um pollpeptídeo que ainda é capaz de Ligar proteínas iníluenciadoras (tais como proteínas receptoras) mas que não pode exibir a sua função normal (tais como ligando de sinalização),

Um outro método para o silencíamenlo de gene é pelo alvejamento da SEQuências de ácido nucléico complementares à região reguladora do gene (por exemplo, o promotor e/ou realçador) para formar estruturas hebeoídaís triplas que impedem a transcrição do gene nas células alvo. Ver Heleno, C., Anticancer Drug Res. 6. 569-84, 1991; Helene er ο/., Ann.. N. Y.. Acad. Sei. 660, 27-36 1992: e Maher, L, J, Bioassays 14, 807-15,

1.992..

Outros métodos, lais como o uso de anticorpos direcionados a um pohpeptídeo endógeno para inibir a sua função em planta ou'interferência no caminho de sinalização em. que um polipeptídeo está envolvido, será bem conhecido para o técnico habilitado. Em. particular, pode ser considerado que moléculas sintéticas podem ser úteis para inibir a função biológica de um poHpeptídeo alvo ou para iute.rfe.rir' com o caminho de sinalização ©rn que o polipeptídeo alvo é envolvido.

Altemativarneme, um programa de triagem pode ser ajustado para Identificar em um população de planta variantes naturais de um gene, variantes estas que codificam polipeptldeos com atividade reduzida. Tais variantes naturais também podem ser usadas por exemplo, para realizar a recombiuaçãu homologa.

MicroRNAs (miRNAs) artificiais e/ou naturais podem ser usados para silenciar a expressão de gene e/ou tradução de mRNA. miRNAs endógenos são RN.A.s pequenos do filamento único tipicamente de 19 a 24 nuefeotídeos dc comprimento. Estes funcionam primariamente para regular a expressão de gene e/ ou tradução de mRNA. A maioria dos microRNAs (miRNAs) vegetais têm complementaridade perfeita ou quase perfeita com as suas sequências alvo. Entretanto, existem alvos natural» com até cinco dcsemparelhamentos. Estes são processados a partir de RNAs que nào mais φ

codificam com estruturas dobradas para Irás características pelas RNases especificas de filamento duplo da familia Dicer, No processamento, eles são incorporados no complexo de silenciamcnto induzido pelo RNA (RISC) pela ligação ao seu componente principal, uma proteína Argonauta. Mi.RNAs 5 servem corno os componentes de especificidade de RISC, visto que eles formam par de base aos ácidos nucléícos alvos, principal mente mRNAs, no citoplasma. Os eventos reguladores subsequentes incluem a divagem do mRNA alvo e a destruição e/ou inibição traducional, Os efeitos da superexpressão de miRNA são assim frequentemente refletidos em níveis de 10 mRNA diminuídos de genes alvo.

Os microRNAs artificiais (amiRNAs), que têm tipicamente 21 nucleotídeos no comprimento, podem ser geneticamente engendrados especificamente para regular negativamente a expressão de gene de genes únicos ou. múltiplos de interesse. Os determinantes da seleção de microRNA .15 vegetal alvo são bem conhecidos na. técnica. Os parâmetros empíricos para o reconhecimento alvo foram defmídos e podem ser usados para ajudar no planejamento d.e amiRNAs específicos, (Schwab e: n/., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). As ferramentas convenientes para o planejamento e geração de amiRNAs e seus precursores também estão disponíveis para o público 20 (Schwab uZ., Plant Cell IA 1121. -1133, 2006).

Para o desempenho ótimo, as técnicas de silenclarnento de gene usadas para reduzir a expressão em uma planta de um gene endógeno requer o uso da SEQuências d.e ácido nueléico de plantas monocotíledôneas para a transformação de plantas monocotiledôneas e de plantas dicotiledòneas 25 para a transformação de plantas dicotiledòneas. Preferivelmente, uma sequência de ácido nucléico de qualquer espécie vegetal dada é introduzida, em que a mesma espécie. Por exemplo, uma sequência de ácido nucléico de arroz é transformada em uma planta de arroz. Entretanto, não è uma exigência absoluta que a sequência de ácido nucléico a ser introduzida se origine da mesma espécie vegetal eomo a planta em que a mesma será introduzida. E suficiente que haja homologia substancial entre o gene alvo endógeno e o ácido nucléico a ser introduzido.

São descritos acima exemplos de vários métodos para a redução ou eliminação substancial de expressão em uma planta de um gene endógeno. Uma pessoa habilitada na técnica seria prontameme capaz de adaptar os métodos aníeriormente mencionados para o silencíamenlo de modo a obter redução da expressão de um gene endógeno em urna planta inteira ou em partes desta através do uso de um promotor apropriado, por exemplo.

Marcador selecionável (geue)/Gene repôner “Marcador selecionàver, “gene marcador selecionáver ou gene repórter incluem qualquer gene que confere um fenótipo em uma célula em que o mesmo é expressado para facilitar a identificação e/ou a seleção dc células que são transfectadas ou transformadas com. uma 15 construção de ácido nucléico da invenção, Estes genes marcadores possibilitam a identificação de uma transferência bem. sucedida das moléculas da sequência de ácido nucléico por intermédio de uma série de princípios diferentes. Os marcadores adequados podem, ser selecionados de marcadores que conferem resistência a antibiótico ou herbicida, que introduzem um novo 20 traço metabólico ou que possibilite a seleção visual. Os exemplos de marcadores de gene selecionáveis incluem genes que conferem resistência aos antibióticos (tais como optfl que fosforila neomicina e canamid.na ou hpt, que fosforila higromicina ou genes que conferem resistência, por exemplo, à bl eomícina, estreptomicina, tetracicl ina, cloranfemcol. amplcílina, gentamiema, geneticina (G418), espectinomicina ou blastícidma), aos herbicidas (por exemplo bar que fornece resistência a Basta'*; aroA ou gox que fornecem resistência contra glifosato ou os genes que conterem resistência, por exemplo, à imidazolino.na, fosftnotricma ou sulfoniluréia) ou genes que fornecem um traço metabólico (tais como manA que permite que as plantas usem manosecomo fonte de carbono única ou xilose isomerase para a utilização de xilnse ou marcadores antinutritivos tais como a resistência à 2desoxiglieose). .A. expressão de genes marcadores visuais resulta na formação de cor (por exemplo β-glicuronidase, GUS ou β~galactosidase com seus 8 substratos coloridos, por exemplo X-Gal)> lumiuescência (tal como o sistema de luciferinaAluciferase) ou fluorescência (Proteína Fluorescente Verde. GFP e derivados destes). Esta lista representa apenas um pequeno numero de marcadores possíveis. O trabalhador habilitado está familiarizado com. tais marcadores. Os marcadores diferentes são preferidos, dependendo do 10 organismo e do método de seleção.

E conhecido que na integração estável ou transitória de ácidos nucléicos em células vegetais, apenas uma minoria das células captam o DNA estranho e, se desejado, o integra no seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e da técnica de transfecção usada. Para identificar e •I5 selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (tal como um daqueles descritos acima) é usualmente introduzido nas células hospedeiras junto corn, o gene de interesse. Estes marcadores por exemplo podem ser usados em mu.tan.tes em que estes genes não são funcionais, por exemplo, pela deleção pelos métodos convencionais. Além disso, as 20 moléculas da sequência de ácido nucléico que codificam um marcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesmo vetor que compreende a sequência que codifica os polipeptideos da invenção ou usada nos métodos da invenção ou ainda em um vetor separado. As células que foram estavelmente transfectadas com o ácido nucléico introduzido 2.8 podem ser identificadas por exemplo pela seleção (por exemplo, células que tém integradas o marcador selecionável sobrevivem ao passo que as outras c él u 1 a s j n urre m).

Visto que os genes marcadores, particularmente os genes para a resistência aos antibióticos e herbicidas, não são mais requeridos ou são indesejados na célula hospedeira iransgêuica uma vez que as sequências de ácido nucléico foram introduzidas com êxito, o processo de acordo com a invenção para, a introdução das sequências de ácido nucléico vantajosamente utiliza técnicas que possibilitam a. remoção ou excisão destes genes marcadores. Um tal método é aquele que é conhecido como co-transformação. O método de eo-transformação utiliza dois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor que carrega a sequência de ácido nucléico de acordo com a invenção e um segundo que carrega oís) genet's) marcadores). Uma grande proporção de transformantes recebe ou, no caso de plantas, compreende (até 40 % ou mais dos transformantes), ambos os vetores. No caso de transformação com Agrobactérias, os transformantes usualmeníe recebem apenas uma parte do vetor, isto é a sequência flanqueada pelo T DNA, que usualmento representa o cassete de expressão. Os genes marcadores podem ser subsequentemente removidos da planta transformada pela realização de cruzamentos, Em um outro método, os genes marcadores integrados em um. transposon são usados para a transformação juntos com a sequência de ácido nucléico desejado (conheddo como a tecnologia Ac/Ds). Os transformantes podem ser cruzados com uma fonte de transposase ou os transformantes são transformados com uma construção da SEQuência de ácido nucléico que conferem expressão de uma transposase, transitoriamente ou estável, Em alguns casos (aprox. .10 %), o transposon pulam do genoma da célula hospedeira uma vez que a transformação tenha, ocorrido com êxito e é perdido. Em um outro numero de casos, o transposon pula para uma localização diferente. Nestes casos o gene marcador deve ser eliminado pela realização de cruzamentos. Em mícrobiologia, técnicas foram desenvolvidas que tomam possível ou facilitam, a detecção de tais eventos. Um outro método vantajoso conta com o que é conhecido como sistemas de recombi nação; cuja vantagem é que a eliminação pelo cruzamento pode ser dispensado. O sistema melhor conhecido deste tipo é aquele que é conhecido como o sistema Cre/lox. Cre) é uma recombinase que remove as sequências localizadas entre as sequências loxP. Se o gene marcador é integrado entre as sequências loxP, o mesmo ê removido uma vez que a trans formação tenha ocorrida com êxito, pela expressão da recombinase. Outros sistemas de recombinação são o sistema H1N/H.LX, FLP/FRT e REP/STB (Tribble cr u/., J. BioL Chem., 275, 2000; 22255-22267; Velmurugan ef m'., J, Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Uma integração específica de sítio no genuína vegetal das sequências de ácido nucléico de acordo corn a invenção é possível. Naturalmente, estes métodos também podem ser aplicados aos 10 microorganismos tais como levedura, fungos ou bactérias.

Transgênicosnransgene/Reçombinante

Para os propósitos da invenção, ^utransgênicos'\ *'transgene” ou

Aecombmante’’ significam com respeito, por exemplo, a uma sequência de ácido nuclétco, um cassete de expressão, construção de gene ou um vetor que -15 compreende a sequência de ácido nodéieo ou um organismo transformado com as sequências de ácido nadei co, cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção, todas estas construções foram realizadas pelos métodos recombina.nt.es em. que (a) as sequências de ácido nucléíeo que codificam as proteínas 20 úteis nos métodos da invenção, ou (b) sequência(s) de controle genético que é/são operavehnente ligad-aís) com a sequência de ácido nuclétco de acordo com a invenção, por exemplo um promotor, ou (c) a) e b) não são localizadas no seu ambiente genético natural ou foram modificadas pelos métodos recombinantes, sendo possível para a modificação tomar a forma, por exemplo, de uma substituição, adição, deleção, inversão ou Inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. O ambiente genético natural é entendido como significando o local genômico ou cromossômico natural na planta oripjnul ou a presença em uma biblioteca genòmica. Nu case de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácido nucléico é preferivelmente retido, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a sequência de ácido nucléico pelo menos em um lado e tem um comprimento da SEQuêncía de pelo menos 50 pares de base, preferivelmente pelo menos 500 pares de base, de modo especialmente preferível pelo menos 1000 pares de base, o mats preferivelmente pelo menos 5000 pares de base, Um cassete de expressão que ocorre naturalmente - por exemplo a combinação que ocorre naturalmente do promotor natural das sequências de ácido nucléico com a sequência de ácido nucléico correspondente que codifica um polipeptideo òtil nos métodos da presente invenção, como definidos acima - torna-se um cassete de expressão transgêníco quando este cassete de expressão é modificado pelos métodos não naturais, sintéticos (“artificiais”) tais como. por exemplo, tratamento mutagênico. Os métodos adequados são descritos, por exemplo, na. (..IS 5,565,350 ou WO 00/15815.

Uma planta transgêmea para os propósitos da invenção é assim entendido como significando, como acima, que os ácidos nucléicos usados no método da invenção não estão no seu local natural no genoma da dita planta, sendo possível para as sequências de ácido nucléico serem homóloga ou heterologamente expressadas. Entretanto, como mencionado, transgênicos também significam que, embora os ácidos nucléicos de acordo com a invenção ou usados no método da invenção estejam na sua posição natural no genoma de um planta, a sequência foí modificaria com respeito à sequência natural e/ou que as sequências reguladoras das sequências naturais foram modificadas. Transgêmcos ê preferivelmente entendido corno significando a expressão dos ácidos nucléicos de acordo com a invenção em um local não natural no genoma, isto é a expressão homóloga ou, preferivelmente, heleróloga das sequências de ácido nucléico ocorre. As planta transgênicas preferidas são aqui mencionadas.

Ihllisfonnaçao

Os termos “introdução” ou “transformação” como aqui aludidos abrangem a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independente do método usado para a transferência. O 5 tecido vegetal capaz de propagação clonal subsequente, seja pela organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com uma construção genética da presente invenção e «ma planta inteira regenerada desta. O tecido particular escolhido variará dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis e melhor adaptados para a espécie que é transformada. Os tecidos 10 alvos exemplares incluem discos de folha, pólen, embriões, cotilédoncs, hipocotilos, megagametòftlos, tecido de calo, tecido merlstemátieo existente (por exemplo, meristema apical, brotos axilares e meristemas de raiz) e tecido de meristema induzido (por exemplo, meristema de cotilédone e meristema de hipocoíilo). θ polinucleotídeo pude ser transitória ou estávelmente •15 introduzido em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemple, como um plasmídeo. Altemativamente, este pode ser integrado no genoma hospedeiro, A célula vegetal transformads resultante pode ser depois usada para regenerar uma planta transformada em uma maneira conhecida pelas pessoas habilitadas na técnica.

A transferência de genes estranhos no genoma de uma planta é chamada de transformação. A transformação de espécie de planta é agora uma técnica regularmente de rotina. Vantajosamente, qualquer um de vários métodos de transformação pode ser usado para introduzir o gene de interesse em uma célula ancestral adequada. Os métodos descritos para a transformação 25 e regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais ou células vegetais podem ser utilizados para a transformação transitória ou estável. Os métodos de transformação incluem o uso de lipossomas, eletroporação, produtos químicos que aumentam a captação de DNA livre, injeção do DNA diretamente na planta, bombardeamento de pistola de partícula, transformação usando virus ou pólen e microprojeção, Os métodos podem ser selecionados do método do cálcío/polietdeno glicol para protoplastos (Krens, F. A< ez &A, (1982) Nature 296, 72-74; Negrulíu l eZ u/. (1987) Plant Mol Biol 8: 363373); eletroporação de protoplasms (Shillito R. D. eZ αλ (1985) Bio/Tcchnol

3, I099-HÜ2); microínjeção em material vegetal (Crossway A ví a/,, (1986)

Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeamento de partícula revestida com DNA ou RNA (Klein T M eZ uA, (.1987) Nature 327: 70) infecção com vírus (não integratívo) e outros. Plantas transgênicas, incluindo plantas de safra íransgênioas, são preferivelmente produzidas por intermédio da transformação 10 mediada pela Agrobactéria. Um método de transformação vantajoso é a transformação em planta. Para esta finalidade, é possível, por exemplo, permitir que as agrobactérias atuem nas sementes da planta ou inocttlar o meristema. da planta, com agrobactérias. Isto tem se mostrada partieulannente útil de acordo com a invenção para permitir que uma suspensão de 15 agrobactérias transformadas atuem na planta intacta, ou pelo menos na flor primordial. Á planta é subsequentemente cultivada até que as sementes da planta tratado sejam obtidas (Clough e Bent, Plant j. (1998) 16, 735-743). Os métodos para a transformação mediada pela Agrobactéria de arroz incluem métodos bem conhecidos para a transformação de arroz, tal como aqueles 20 descritos em qualquer um dos seguintes: Pedido de patente europeu EP 1198985 Al, Aldemita e Hodges (Piam. 199: 612-617, 1996); Chan ez aL (Plant Mol Biol 22 (.3): 491 -506, 1993), Hiei eí nA (Plant .1 6 (2): 271-282, 1994), divulgações estas que são aqui incorporadas por referência como se totalmente apresentadas. No caso de transformação de milho, o método 25 preferido é como descrita em Ishida et «A (Naí. Bioteclmol 14(6): 745-50, 1996) ou Frame eí nd. (Plant Physiol 1.29(1): 13-22, 2002). divulgações estas que são aqui incorporadas por referência como se totalmente apresentadas. Os ditos métodos são descrita ainda por via de exemplo em B. Jenes ei «/., Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D< Kung e R. Wu, Academic Press (1993} 128-143 e ' m Petryk us A.nnu, Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 ? 1991) 205-225).

As sequências de ácido nucléico ou a construção a ser expressada é preferivelmente clonada em uni vetor, que c adequado para transformar /IgruZmteer/vn? /umqAmfens, por exemplo pfâin!9 (Bevan er αλ. Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). As agrobactérias transformadas por um tal vetor podem ser depois usadas na maneira conhecida para a transformação de plantas, tais como plantas usadas como um modelo, como dtefokfopurs (a .4rad>/>drg.ÀVÓ· está dentro do escopo da presente invenção não considerada como 10 urna planta de safra) ou plantas de safra i.ais como, por via de exemplo, plantas de tabaco, por exemplo pela imersão das folhas machucadas ou folhas picadas em uma solução agrobacteriana e depois cultivá-las em meios adequados. A transformação de plantas por meio da í'a??ie/b<'àí^?ns é descrita, por exemplo, por Hôfgen e Wi Umitzer em Nucl. Acid -15 Res. (1.988} 1.6, 9877 ou é conhecida òtíer c/áv de F. F. White, Vectors for

Gene Transfer in Higher Plants; em Transgenic Plant, Vol. I, Engineering and Utilization, eds. S, D. KungeR. Wu, Academic Press, 1993, pp. 1.5-38.

Alérn da transformação de células somáticas, que depois foram regeneradas cm plantas intactas, também é possível transformar as células de 20 me.ristemas de planta e em particular aquelas células que se desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametas transformados seguem o desenvolvimento da ( planta natural, dando origem às plantas transgênicas. Assim, por exemplo, sementes de JrabZdopSíS são tratadas com agrobactérias e as sementes são obtidas a partir das plantas em desenvolvimento das quais uma certa 25 proporção é transformada e assim transgênica [Feldman, K A e Marks M D (1987), Mol Gen Genet 208: 274-289; Feldmami K (1992). Em: C K.oncz, NH Chua e J Shell, eds, Methods in Aiabidopsis Research. Word Scientific, Singapura, pp. 274-289(. Métodos alternativos são fundamentados na remoção repetida das ínflorescências e incubação do sitio de excisão no centro da roseta com agrobactérías transformadas, por meio dos quais as sementes transformadas do mesmo modo podem ser obtidas em um ponto posterior no tempo (Chang (1994). Plant J< 5; 55l -558; Katavíc (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Ereretant.o, um método especialmente eficaz c o método da infiltração a vácuo com as suas modificações tais como o método da “imersão floral”. No caso de infiltração a vácuo de Arabidopsís, plantas intactas sob pressão reduzida são tratadas com uma suspensão agrobacíeriana (Bechthold. N (1993). C R Acad Sei Paris Life Sm, 316: 1194-1199^ enquanto que no caso do método de “imersão floral” o tecido floral em desenvolvimento é ligeiramente incubado com uma suspensão agrobacíeriana tratada com tensoativo [Clough, S J e Bem Λ F (1998) The Plant I 16, 7357431. Uma certa proporção de sementes transgênicas são colhidas em ambos os casos e estas sementes podem ser distinguidas das sementes não transgênicas pelo cultivo sob as condições seletivas descritas acima. Além disso, a transformação estável de plastídeos é vantajosa porque os plastídeos são herdados maternalmente e a maioria das safras reduzem ou eliminam o risco de fluxo de íraasgene através do pólen. A transformação do genoma de ctoroplasto é nu geral obtido por um processo que foi esquematicamente demonstrado cm Klaus a? 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-2291. Em. resumo as sequências a serem transformadas são olonadas junto com um gene marcador selecíonàvel entre sequências fianqueadoras homólogas ao genoma de cloroplasto. Estas sequências flanqueadoras homólogas direcionam a integração especifica de sítio no plastoma. Λ transformação plastídica foi descrita para muitas espécies de planta diferentes e uma vista geral é dada em Buck. (2001) Transgenics plastids in basic research and plum, biotechnology. J Mol Biol. 21 de setembro de 2001; 312. (3): 425-38 ou Malign. P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends .Biotechnol. 21, 20-28, Outros progressos bíotecnológicos foram recentemente relatados na forma de transfòrmantes plastid icos isentos de marcador, que podem ser produzidos por um gene marcador co-integrado transitório (Klaus et 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-2291

Rotulação de ativação de T-DNA

A rolulaçào de ativação de T-DNA (Hayashi eí aL Science (1992) 1350-1353). envolve a inserção de T-DNA, usualmente contendo um promotor (também pode ser um realçador de tradução ou um intron), na região genômíca do gene de interesse ou 10 kb a montante ou a jusante da região codificadora de um gene em uma configuração tal que o promotor direcione a expressão do gene alvejado. Tipicamente, a regulagem da expressão do gene alvejado pelo seu promotor natural é rompida e o gene ialha sob o controle do promotor recém introduzido. O promotor è tipicamente embutido em um T-DNA, Este T-DNA é aleatoriamente inserido no genoma vegetai por exempla, através da infecção pela Agrobactéria e leva à expressão modificada de genes próximos ao T-DNA inserido» As plantas transgênícas resultantes mostrara fenótipos dominantes devido à expressão modificadade series próximos ao nrcmotor introduzido.

K.‘· A X

TIUJNG

O termo “TILLING” é uma abreviação de “Lesões Locais Induzidas Alvejadas em Genomas” e refere-se a uma tecnologia de mulagênese útil para gerar e/ou identiticar ácidos nucléicos que codificam proteínas com expressão e/ou atividade modificadas. TILLING também possibilita a seleção de plantas que carregam tais variantes mutantes. Estas variantes mulantes podem exibir a expressão modificada, em força ou na localização ou no tempo (se as mutações afetam c promotor por exempla), Estas variantes mutantes podem exibir atividade mais alta do que aquela exibida pelo gene na sua forma natural. TILLING combina mutagênese de alta densidade com métodos de triagem de alto rendimento. As etapas tipicamente seguidas em TILLING são: (a) mulagênese EMS (Redei G P e

Koncz (...' (1992) Em Methods tn Arabidopsis Research, Koncz Chua N H, Schell J, eds. Singapura, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann ef m., (1.994) Em Meyerowitz E M, Somerville C R, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S pp 137-172; Lightner J e Caspar T (1998) Em J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) preparação e reunião de DN'A de indivíduos; (e) amplificação pela PCR de uma região de interesse; (d) desnaturação e recozimento para possibilitar a formação de heteroduplexes; (e) DHPLC, onde a presença de 10 um heteroduolex em uma reunião é detectada como um oico extra no : Λ' > 57 ' .

eromatograma; (Ϊ) identificação do indivíduo mutante; e (g) sequenciamento do produto de PCR mutante. Os métodos para TILLING são bem conhecidos na técnica (McCallum cr u/.> (2000) Nat Bíoíedmol 18: 455-457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

I - Recombinação Homologa

A recombinação homóloga permite a. introdução em um genoma de um. ácido nucléico selecionado em uma posição selecionada definida. A recombinação homóloga é uma tecnologia padrão usada rotineiramente nas ciências biológicas para organismos inferiores tais como 20 levedura ou o musgo FÃp5con?írre//o. Os métodos para a realização da recombinação homóloga em plantas forram descritos não apenas para as plantas modelo (OfTringa cr m^?. (1990) E.MBO J 9(1()): 3077-84) mas também para as plantas de safra, por exemplo arroz (Terada eí o/. (2002) Nat Biotech 20(H)): 1030-4; lida e Terada (2004) Curr Opi.n. Biotech 15(2): 132-8) e 25 métodos existem que são no geral aplicáveis independente do organismo alvo (Miller eíoó Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).

Rendimento

O termo “rendimento” no geral significa um resultado mensurável de valor econômico, fiplcamente relacionado a uma safra, a uma área e a um período de tempo específicos. As partes de planta individuais diretameníc contribuem para o rendimento com base no seu número, tamanho e/ou peso ou o rendimento real ê o rendimento por metro quadrado para uma safra e ano, que é determinada dividindo-se a produção total (inclui a 5 produção tanto colhida quanto estimada) por metros quadrados plantados. O termo “rendimento’ de uma planta pode estar relacionado à biomassa vegetativa (biomassa de raiz e/ou broto), aos órgãos reprodutivos e/ou aos propágulos (tais .como sementes) desta planta.

Vigor inicial “Vigor inicial” refere-se ao crescimento bem equilibrado saudável ativo especiaImente durante os estágios iniciais de crescimento da planta e pode resultar da aptidão da planta aumentada devido, por exemplo, às plantas sendo melhor adaptadas para o seu ambiente (isto é otimizando o uso dos recursos de energia e partiesonando entre broto e raiz). As plantas tended vigor inicial também mostram sobrevivência de muda aumentada e urn melhor estabelecimento da safra, que frequentemente resulta em campos altamente uni formes (com a safra, crescendo em uma maneira uniforme , isto é com a. maioria das plantas atingindo os vários estágios de desenvolvimento substencialmente ao mesmo tempo) e frequentemente rendimento melhor e mais alto. Portanto, o vigor inicial pode ser determinado medindo-se vários fatores, tais como peso de mil grãos, germinação percentual., emergência percentual, crescimento de muda, altura da muda, comprimento de raiz, biomassa de raiz e broto e muitos mais.

Aumento/Melbora/Rçalçc

Os termos “aumento”, “melhora” ou “realce” são intercambiáveis e devem significar no sentido da aplicação de pelo menos um rendimento e/ou crescimento de 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % ou 10 %, preferivelmente pelo menos 15 % ou 20 %, mais preferivelmente 25 %, 30 %, 35 % ou 40 % maior em comparação com as plantas de controle como aqui definido.

Rendimento dc semente

O rendimento de semente aumentado pode manifestar-se por si mesmo eomo um ou mais dos seguintes: a) um aumento na biomassa de 5 semente (peso de semente total) que pode estar em uma base de semente individual e/ou por planta e/ou por hectare ou are; b) número aumentado de flores por panículo; c) número aumentado de sementes (cheias); d) taxa, de enchimento de semente, aumentada (que é expressada como a razão entre o número de sememes cheias dividido pelo número total de sementes); e) índice 10 de colheita aumentado, que é expressado como uma razão do rendimento das partes colhiveis, tais como sementes, dividida pela biomassa total; e f) número aumentado de panículos primários g) peso de miJ sementes aumentado flKW), que è extrapolado do número de sementes cheias contadas e seu peso total. Um TKW aumentado pode resultar dc urn tamanho de 15 semente e/ou peso de semente aumentados e também pode resultar de um aumento no tamanho do embrião e/ou endosperms.

l.)m aumento no rendimento de semente também pode ser manifestado como um aumento no tamanho de semente e/ou volume de semente. Além disso, um aumento no rendimento de semente também pode 20 manifestar por si só como um aumento na área de semente e/ou comprimento de semente e/ou largura de semente e/ou perímetro de semente. O rendimento aumentado também pode resultar em arquitetura modificada ou pode ocorrer * por causa da arquitetura modificada.

índice de Verdor

O “índice de verdor” como aqui usado é calculado a partir de imagens digitais de plantas. Para cada pixel pertencente à planta objeto na imagem, a razão do valor verde versus o valor vermelho (no modelo RGB para a cor codificadnra) é calculado. O índice de verdor é expressado como a porcentagem de pixels para a qual a razão de verde para vermelho excede um limiar dado. Sob condições de crescimento normal, sob condições de crescimento em estresse salino e sob condições de crescimento na disponibilidade de nutriente reduzida, o índice de verdor de plantas é medido na ultima formação do imagem antes do florescimento. An contrária, sob condições de crescimento em estresse pela seca, o índice de verdor de plumas é medido.na .primeira formação de imagem depois da seca.

PLANTA

O termo ‘'planta'· como aqui usado abrange plantas inteiras, ancestrais e progêoie das plantas e parles de planta, incluindo sementes, brotos, hastes, folhas, raízes (incluindo tubérculos), flores e tecidos e órgãos, em que cada um dos anteriormente mencionados compreendem o gene/sequência de ácido nucléico de. interesse. O termo ‘'planta” também abrange células vegetais, culturas em suspensão, tecido de calo, embriões, regiões meristemáticas, gametófítos, esporófitos, polen e microesporos, mais uma vez em que cada um dos anteriormente mencionados compreendem o gene/sequência de ácido nucléico de interesse.

As plantas que são pardcularmenie úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superiamilia F/rhomfon'pm, em particular plantas monocotiledôneas e dicotUedoncas incluindo forragem ou legumes forrageiros, plantas ornamentais, safras alimentícias, árvores ou arbustos selecionados da lista que compreende Jeer ,ψ/ζ, .dcZíoú/m ,ψρ., /l/ie/umschao ...ψρ., χόχϊ/αηο. 4^/2^0^ ^grcA$T& sfôfont/mz 4/7'mzn >W·· spp., Amm&phfta orenarm, etwm, $/?/?., 4mam graveo/ens, Xrac/ns ,ψρ, ,4rfoearpn>' ,ψρ., .d'spvo'ogio· q$7cma/íg .4 mm .ψρ. (por exemplo, .wòvr. zhwto· /bòm, ..-L’nno fozoofim zh'e«tf/htoo var. su/ím?, .4 verm /pGrirto), dverrboo <.mr6'mbo/u\ ,ψ._: Bewír/cosa màme/u. f/er/ho/Zefio exce/seo, .Beto v«Zgz?m, Bmwra spp. (por exemplo, Bms\sâm nqoass Bmr.ç/czf oçoo .s.ro. (canola, colza, nabo]). Γαώέα /àrmmm, .mwoLç Cowzo mdíco..

Cazznató sut/eo, Capncgm spp., Carex efefe. Canoa papaya, CGensa macracarpa, Gw? spp., (.'arí/joseín fàídori». Casftwa .rpp.> (Hòa penZutaGxç C/cfor/wn eWZvia, CZonuwommn .qy.?., Càfra/Zas ZbmZos_; Cfrr^v spp,. (..ricos spp.. (ZqzZeo spp.< í.o/acaria eseaZen/a; Co/a spp., (Anm/wvix xp., 5 Crirzaw/ram saíàw, Corvân spp., CraZae^s spp., Cnxws xrnmrnp

CaourZúía spp., CeevOtZx xpp... Çyrzara spp., 2)®caj aarofa, ZAesmodrian spp, Z>/mcrtirpz/s /ο,οραα Cfoscurea spp., D/ospyros .spp.., EcAòzoeA/oa s/ip., &7aezs (por exemplo, E/aezs gu/oeemvs; £Zaen u/eZZôrc), E/samm? aoracaaa, £ria«?ta sp., ErZoõaíry^ fqpumca ZmoaZypms sp.. Eggrzria vnf/a?ra< 10 /^gqpjvitm spp., Eagw spp.. Fesfaca arunãmacea, Ficus earzca, Formae/Za $ρρ., Fragarfa spp., Gm&go fe/orio, G/yoZne spp. (por exemplo, GZir/ne war, Sq/a Zaspmfa ou Sq/o max), (./bs\vv₍m'í.ím AmwZwr /Ze/ZawiZmy xp/x (por exemplo, ZZeZftw/no· fmmmvh Hc?»eFo#«ZZ& fuhw, J/Zòíwaç xpp., /ZmvZewi spp. (por exemplo, Z'/onriwn vWgare), Zpomoea òaro/ar, JhgZew xpp.., l> Z.rtdmr ymfva /χ^ζ/ζ)·τ^?^ Wm cn/^^rZ.sx Áfonw iO'ftiSiZxyimzoi?, ZJZoW eZ/foearà, Lo/ws .ψρ„ £q$o tmmang&'/m Zwpô?«s ypp., £<<mw ^y/vmzcu ^Λ· ..... ^?·

Z.jXO>perwLW* sppt (por exemplo, Z.pcppc?^-s'fco.?? esc«/er?zum ZprcimemZ^^^ Zycopmkw?, Zpcqpcnyfeo»? pyr/^rwe), M&crozyZowa xpp., A/ufa'x ,ψρ., Λ/oZpfgZi/o e^rgóroza, Mamma awricam, Ma/?gZ/era άκ/fea, Λ/αηζΛαζ spp., 20 A/amVZzo-'o oq/?<7Zo_; ÀferZZcago χαπΤη; MeZ/Zoto =ψρ_ν Mem^a spp., M&’eam/i&s .nwmrip Momon&ea spp._} ..Wonts ragra, Afeo spp., Àtozàma .gnp.., 0/ca spp_v

OpwrtZa spp., QonZzz^mxs ^pp._? €h>za spp. (por exemplo, 0?yza wZva Oysa * Am/oZia), ZAm/cwm ím/zacewn, ./'WmZewt yZrgoiaor Ζόζνχ/ζΖοηϊ edWZs;

Z'Us’ZiOnm sa/xva, .Z^mhseZm? sp._?. ZWoseo spp., ZAPxxsWwfW οη\φΐ.ο.ν, 2:> J/ho/am arw^maeea, fVm.seo/m< χρρ, ZWt?w? pra/cwc, P/zoeaix spp.,

P/b'agz-.nire.? <:mxWh\ Ppysa/Zs spp., /¾¹^ .ψρ., PZsZiteZo eem Z%mw xpp., A>a spp., PopaZar <ψρ, /O-osopZy spp.. /'Vows spp,. Z'Wf?.o.n spp., Prm/ca gramZííí??, /feno' eommwM', 0rerc«5 xpp< Rap&am«> soz/y?.o'., Afeew? rZ?í7Zxt7'òm'<xo;ç ZZZZw spp., 7ZZi.inm· cow?>mms. /Gfein spp,, S'oixdwxon xpp.<

&Ζ£χ .ψ., ,ψ/Α, SeaaG ivrew/t·, Swo/fl .77?., SVnuprò Ayr. 5VAmma $/?/λ (.por exemplo. 5bZa/mm tómwm, fm/onum mappQmmm ou Fo/rmum /yarmemZerou), .«Sorgo ZucoZor, Spí/?«om 57?/?., Apigfum spp, /hqropv spp., /bma/r/norís «?í/ka 7z?eobrr?«m c^auo, Zro/o/mro ZnOím/e sp.,

JH/ZcoxecoZe η/κρακξ 7>'úróm?í .ψρ. (por exemplo* 7>núu<m aeó7/wm,

ZroAròwí r/roromz 7‘>rò.Umu targà&tw, Trft/c«« Ly6eu'«?.<7?₍\ FrRròmu moc/m. 7'rirrôm?? .çtfríww ou JF/rámm v«/g«re)_? ZrqpueoZum mmu.s, FmpaeoZ^w mq/W, Któò» spp., Kròíu «ψ/ζ, F/gm? spp... Ffo/α odbmíu, Fdrò xp/z, Zea mqys} Zòmnfu pp/&$7rá. Zró/pF— x/?/z_s entre outros.

θ DgmçloJe^JMda.da .invenção

Sun^recudentementc, foi agora descoberto que a expressão crescente em uma planta de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo G.RF dá plantas tendo características relacionadas com o rendimento aumentadas em relação às plantas de controle. De acordo com 15 uma primeira forma de realização, a presente invenção fornece um método para aumentar características relacionadas com o rendimento em plantas em relação âs plantas de controle, que compreende a expressão crescente em uma planta de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF.

Um. método preferido para aumentar a expressão de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF é pela introdução e expressão em uma planta de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF.

Qualquer referenda daqui por diante a uma “proteína útil nos 25 métodos d.a invenção” e considerada significar em uma forma de realização um polipeptídeo GRF como aqui definido. Qualquer referência daqui por diante a uma “sequência de ácido nucléico útil nos métodos da invenção” é considerada significar uma sequência de ácido nucléico capaz de codificar um tal polipeptídeo GRF. .A sequência de ácido nucléico a ser introduzida em uma planta Ce portanto útil na realização dos métodos da invenção) é aualquer sequência de ácido nucléico que codifica o tipo de polipeptídeo, que agora sera descrito, daqui por diante também chamado de “sequência de ácido nuclei co GRF” ou “eerie GRFv

X·.·?. .....

Um “polipeptídeo GRF' como aqui definido refere-se a qualquer polipeptídeo que compreende: (i) um domínio tendo pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %. 70 %, 75 %, 80 %, 85 %_s 90 %. 95 %. 98 %. 99 % ou mais de identidade da SEQuência de atninoáeido a um domínio QLQ como representado pela SEQ ID NO: 115; e (ii) um domínio tendo pelo menos 50 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %. 80 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade da SEQuência de aminoácido a um domínio W.R.C como representado pela SEQ ID NO: 116.

Alternativa ou adicionaImcntc, um “polipeptídeo GRF” como aqui definido refere-se a qualquer polipeptídeo que compreende: (i) um domínio QLQ com um acesso InterPro IPR014978 (acesso PFAM PF0888OK (ii) um domínio WRC com um acesso InterPro IPR014977 (acesso PFAM PF08879); e (ill) um domínio Efetor de 'Transcrição (ΈΤ) que comproende resíduos três Cys e um His em um espaçamento conservado (CX9CX10CX2H).

Alternativa ou adicionalmente, um “polipeptídeo GRF* como aqui definido refere-se a qualquer polipeptídeo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50 ·%, 55 %, 60 %, 65 70 %, 75 %, 89 %, 85 %„ 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade da SEQuêncía de aminoácido para o polipeptídeo 61RF conto representado pela SEQ ID NO: 2 ou a qualquer uma das sequências de polipeptídeo de tamanho natural dadas na Tabela A aqui contida.

Alternativa ou adicionalmente, um “polipeptídeo GRF interage com polípeptideos do fator que interage com GRF (GIF) (também chamado de pohpeptídeos de translocação de sarcoma sinovial (SYT)) em um ensaio de interação de híbrido duplo de levedura.

Surpreendentemente, foi agora descoberto que modular a expressão cm uma planta de um ácido nucléico que codifica um pollpeptídeo ^f equivalente a RAAI dá plantas tendo características relacionadas com o á rendimento realçadas em relação às plantas de controle. De acordo com uma primeira forma de realização, a presente invenção fornece urn método para realçar características relacionadas com o rendimento em plantas em relação às plantas de controle, que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um pollpeptídeo equivalente a RAAI.

Um método preferido para modular (preferivelmente, aumentar) a expressão tie um ácido nucléico que codifica um pollpeptídeo equivalente a RAAI è pela introdução e expressão em uma planta de um àcí.do nucléico que codifica um pollpeptídeo equivalente a RAAI.

Qualquer referenda daqui por diante a uma proteína útil nus 15 métodos da Invenção” é considerada significar em uma forma de realização um poiipepddeo equivalente a RAAI como aqui definido. Qualquer referência daqui por diante a um “ácido nucléico útil nos métodos da invenção” é considerada significar um ácido nucléico capaz de codificar um tal polipeptídeo equivalente a RAAI. O ácido nucléico a ser introduzido eni 20 uma planta (e portanto òtil na realização dos métodos da invenção) é qualquer ácido nucléico que codifica o tipo de proteína que agora será descrito, daqui por diante também chamado de “ácido nucléico equivalente s RAAI” ou gene equivalente a RAAI”.

Um “pollpeptídeo equivalente a RAAI” como aqui definido 25 refere-se a qualquer pollpeptídeo representado pela SEQ IT) NO: 121 e aos seus ortólogos e parálogos. As proteínas equivalentes a RAA l são polipeptideos pequenos (PM entre 10 e 21 kDA) e básicos (pl acima de 8.5). e usualmente têm zero ou um resíduo de Cys na sequência que alinha com a SEQ FD NO: 121 quando do uso de um programa de alinhamento de

Needleman.·· Wunsch padrão com ajustes de default.

Preferivelmente, o polípeptídeo equivalente a RAAl compreende dois ou mais dos scguirn.es motivos da SEQuéncia conservada; SEQ ID NO: 162, motivo I.: GVW(V/L)F

SEQ ID NO: 163, motivo 2: LGW(E/S)RY(Y5F)

SEQ ID NO: 164, motivo 3: (D/FJ)L(.L/l)S(lN/l..)P(R/K/GmXS/D)F SEQ ID NO: 165, motivo 4; (H/Y)(F/M)YD(V/I)VVK(ND')(R/P)

Altemativamente, o homólogo de uma proteína RAAl tem em ordem crescente de preferência pelo menos 30 %, 31 %» 32 %, 33 %. 34 36, 35 %, 36 %, 37 36, 38 36, 39 %, 40 %, 41 42 %. 43 %, 44 %, 45 %, 46 36,

34, 48 %, 49 %, 56 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %,

36, 60 %, 81 36, 62 %, 63 36, 64 34, 65 H, 66 36, 67 %, 68 34, 69 34, 70 36, %, 72 %, 73 %_? 74 %, 75 36, 76 %, 77 %, 78 %. 79 %, 80 36. 8! 36, 82 %,

84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 34, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %,

H, 96 %₅ 97 35, 98 % ou 99 36 de identidade da SEQuência global para o aminoácido representado pela SEQ ID NO; 121, contanto que a proteína homologa compreenda os motivos conservados 1 (a, 6, c ou d)„ 2 e 3, e o domínio rico em leucina como esboçado acima, A identidade da SEQucncia global é determinada usando um algoritmo de alinhamento global, tal como o algoritmo de Needleman Wunsch no programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accclrys), preferivelmente cem parâmetros de default.

Preferivelmente, a sequência de polípeptídeo que quando usada na construção de uma arvore filogenéttca, tal como aquela representada na Figura 8 (Ge cr r/Z., 2004), agrupa-se com o grupo de polipeptídeos equivalentes a. RAAl que compreendem a sequência de aminoácido representada pda SEQ ID NT): 121 ao invés de corn qualquer outro grupo.

Surpreendentemente, tòí agora descoberto que modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polípeptídeo SYR dá plantas, quando cultivadas sob condições de estresse abiòüco, tendo características relacionadas com o rendimento realçadas em relação às plantas de controle. De acordo com uma primeira, forma, de realização, a presente invenção fornece um método para realçar características relacionadas com o rendimento cm plantas cultivadas sob condições de estresse abi ótico, em 5 relação às plantas de controle, que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptideo SYR.

Um método preferido para modular (preferivelmente, aumentar) a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptideo SYR é pela introdução e expressão em uma planta de um ácido nucléico que 10 cedí fica um pol ípeptídeo S YR.

Qualquer referência daqui por diante a uma “proteína útil nos métodos da invenção é considerada significar em uma forms de realização um polipeptideo SYR como aqui definido. Qualquer referência daqui por diante a um “'ácido nucléico útil nos métodos da invenção é considerada 15 significar um ácido nucléico capaz de codificar um tal polipeptideo SY.R. O ácido nucléico a ser introduzido em uma planta (e portanto útil n.a realização dos métodos da invenção) é qualquer ácido nucléico que codifica o tipo de prot.ei.na que agora será descrito,, daqui por diante também chamado de “ácido nucléico SYR. ou “gene SYR.

21) o termo “proteína SYR ou homólogo desta* como aqui definido refere-se a um polipeptideo de cerca de 65 a cerca de 200 aminoàcidos, que compreende (í) um domínio rico em leucína que se parece com u.m zíper de leuci.ua. na metade do terminal C da proteína, domínio rico em leucína este que é (ii) precedido por um tripeptídeo com a sequência YFS 25 (motivo conservado 5a, SEQ ID NO: 173), ou YFT (motivo conservado 5b, SEQ ID NO: 174), ou YFG (motivo conservado 5c, SEQ ID NO: 175) ou Y.LG (motivo conservado 5d, SEQ ID NO: 176), e (üi) seguido por um motivo conservado 6 ( (V/Á/I) LAFMP (T/S) , SEQ ID NO: 177). Preferível mente, o motivo conservado 6 é (A/V) LAEMP (T/S), mais

UP preferívehnente, o motivo conservado è VLAFMPT. A '‘proteína SYR ou homólogo desta'* preferivelmente também tern um pepíidso de terminal C conservado terminando com o rnotivo conservado 7 (SYL ou PYL, SEQ ID NO: 178). O domínio rico em leucina da proteína SYR ou sen homólogo é de. cerca de 38 a 48 aminoácldos de comprimento, começando imediatamente por detrás do motivo conservado 5 e acabando ímediaiamente antes do motivo conservado 6, e compreende pelo menos 30 % de leucína. O domínio rico em Leu preferivelmente tem um motivo que se parece com o motivo de Zíper de Leucina (L-X^-L-X^L-X^-L, em que Xó é uma sequência de 6 ammoâcidos consecutivos), Um exemplo preferido de uma proteína SYR e representado pela SEQ ID NO: 169. um visão geral dos seus domínios é dada na Figura 11.

Mais preferivelmente, as proteínas SYR têm dois domínios de transmembrana, com a parte de terminal N e a parte de terminal C da proteína localizadas dentro e a parte entre os domínios de tmnsmembrana localizadas fora.

Altemativamente, o homólogo de uma proteína SYR tem em ordem crescente de preferência pelo menos 27 H, 28 %, 2.9 %, 30 31 %, %, 33 %_? 34 %, .35 %, 36 %, 37 %, .38 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, %, 45 46 %, 47 %, 48 %_s 49 %, 50 %, 51 S2 53 H. 54 %_? 55 %, %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 81 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, %, 69 %_s 70 71 34, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %_f 77 78 %, 79 34, %, 81 82 %> 83 %, 84 34, 85 34, 86 %, 87 34, 88 34, 89 %, 90 % 91 %_f

93 %, 94 %, 95 %, 96 %. 97 %_s 98 %, ou 99 % de identidade da

SEQuência global para o am.moáeidn representado pela SEQ ID ND: 169., contanto que a proteína homologa compreenda os motivos conservados 5(a, b, c ou. d). 6 e 7, e o domínio rico em leucina como esboçado acima. A identidade da SEQuência global é determinada usando um algoritmo de alinhamento global· tal como o algoritmo de Needleman Wunseh no programa GAP (GCG Wisconsin Package. Accelrys), preferivelmente com parâmetros de de fed 1. Comparada com a identidade da. SLQucncia global, a identidade da SRQuencia no geral será, mais alta quando apenas domínios conservados ou motivos são considerados.

Surpreendentemente, foi agora descoberto que modular a 5 expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ARKL dá plantas tendo características relacionadas com o rendimento realçadas em relação às plantas de controle. De acordo com uma primeira forma de realização, a presente invenção fornece um método para realçar características relacionadas com o rendimento em plantas em relação às 10 plantas de controle, que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um pollpeptídeo ARKL.

Um método preferido para modular (preferivelmente, aumentar) a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo A.RKL é pela introdução e expressão em uma planta de um ácido nucléico que 15 codifica um polipeptideo A.RKL.

Qualquer referenda daqui por diante a uma “proteína útil nos métodos da invenção* é considerada significar um pofipeptideo ARKL como aqui definido, Qualquer referência daqui por diante a um “ácido nucléico útil nos métodos da invenção é considerada significar um ácido nucléico capaz 2.0 de codificar um tal polipeptideo ARKL. O ácido nucléico a ser introduzido em unia planta (e portanto útil na realização dos métodos da invenção) é qualquer ácido nucléico que codifique o tipo de proteína que agora será descrito, daqui por diante também chamado de “ácido nucléico ARKI..” ou 'gene ARKLx

2.5 Um “pollpeptídeo A.RKL” como aqui definido refere-se a qualquer polipeptideo que compreende um domínio conservado do dedo de zinco do tipo RING e opdonalmente um domínio DARK O dedo de zinco do tipo RING encontrado no polipeptideo ARKL compreende um tipo de domínio de dedo de zinco C.3H2C3 canônico. O mesmo pode ser ainda classificado no tipo RING-112 dentro do grupo I como definido pur Stone a; u7. 2005..

Urna scqucnda de consenso que representa o domínio RING112 foi relatado como representado por CX(2)CX(9-39)CX(L3)HX(23)HX(2)CX(4-48)CX(2)C (SEQ ID NO: 400). O comprimento da alça variável nos polipeptídeos ARKL c tipicamente de 14 a 15 aminoácidos entre os ligandos metálicos 2 e 3 e de 10 aminoácidos entre os ligandos metálicos 6 e 7 (Fig; 1). Resíduos de aminoácido específicos outros que não aqueles implicados na coordenação direta de ions Zrf' sâo altamente conservados no domínio R1NG-.H2 dos polipeptídeos ARKL (Fig. I). A SEQ ID NO: 401 representa uma sequência de consenso conservada entre a maioria dos polipeptídeos ARKL.

Um polipeptideo ARKL preferido útil nos métodos da invenção refere-se a um polipeptideo que compreende um domínio RING de dedo de zinco Z1.U3H2C3, tal domínio sendo representado pela SEQ ID NO: 400 ou um polipeptideo tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50 %, 55 %, 60 %. 65 %, 70 %, 75 %, 80 8:8 %, 90 %, 95 % ou mais de identidade da SEQuência a um ou mais dos domínios ZÍC3H2C3 como representados da SEQ) ID NO; 306 até a SEQ ID NO: 35 L Mais preferivelmente o polipeptideo ARKL da invenção compreende um domínio ZÍOH2C3 como representado pela SEQ 1.D NO; 401.

Os polipeptídeos ARKL tipicamente compreendem um domínio adicional, chamado de DARI (Domínio Associado com RING), que foi previamente descrito ocorrer fora do domínio .RING em umas poucas proteínas RING de origem vegetal (Stone et m. 2005). O domínio DARI ê tipicamente encontrado no terminal N do domínio RING. Tipicamente os domínios DARI compreendem uma assinatura de aminoàcido conservada como representada pela SEQ ID NO: 399 (Motivo 8).

Um outro polipeptideo ARKL preferido út.íi nos métodos da invenção refere-se a um pohpeptídeo que compreende um domínio DAR1 tendo cm ordem crescente dc preferência pelo menos 50 %. 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %. 95 % on mais de identidade da SEQnência a urn ou mais dos domínios DAR1 como representados da SEQ ID NO: 352 até a SEQ ID NO: 398.. Ainda mais preferivelmente o polipeplideo ARKL da invenção compreende o Motivo 8 como representado pela SEQ ID NO: 399.

Os domínios do tipo RING de dedo de zinco e DAR! podem ser encontrados em bases de dados de proteína especializada em famílias de proteína, dummies e sítios funcionais tais como Pfam (Finn cr n/. Nucleic Acids Research (2()06) Database Issue 34: D247-D251) ou InterPro quo integra a assinatura de bases de dados de proteína: PR.OSITE, PRINTS. ProDom, Pfam, SMART, IIGRFAMs, PIRSF, SUPERFAMILY, Gene3D e PANTHER. (’Mulder ez of, 2007 Nucleic Acids Research, 2007. Vol., 35. Database issue .02244)228). Pfam compila uma coleção grande de alinhamentos da SEQuêncía múltipla e oculta modelos de Markov (HMM) que abrangem muitos domínios e famílias de proteínas comuns e é disponível através do Sanger Institute no Reino Unido. Emparelhamentos confiáveis como considerado na base de dados Pfam são aquelas sequências com contagens mais altas do que o limiar de corte deduzido. O o limiar de corte deduzido do domínio RJNG-H2 (Número de acesso Pfam: PF00097) no método Pfam HMM fs é 16,0 e no método Pfam HM.M Is é 15,2. Entretanto emparelhamentos potenciais, que compreendem domínios do domínio RINGH2 verdadeiro, podem cair ainda sob o corte deduzido. Preferivelmente um polipeptídeo ARKL útil nos métodos da invenção é uma proteína tendo um ou mais domínios na sua sequência que excede o corte deduzido da família de domínio da proteína Pfam PF000097, também conhecios como domínio da família Dedo de Zinco, tipo C3HC4 (dedo RING).

Alternatívamente, os domínios de dedo de zinco tipo RING e DAR1 um urn polipeptídeo podem ser identificados realizando-se. uma comparação da SEQuéncia com polipeptídeos conhecidos que compreendem um dos domínios de Dedo de zinco tipo RING c/ou DAR1 e estabelecendo-se a similaridade na região dos ditos domínios. As sequências podem ser alinhadas usando qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica tais como algoritmos Blast. A probabilidade para que o alinhamento ocorra com uma dada sequência é tomada como base para identificar polipeptídeos similares, Um parâmetro que é tipicamente usado para representar tal probabilidade é chamado de valor e. O valor E é uma medida da credibilidade da contagem S. /X contagem S é uma medida da similaridade da dúvida para a sequência mostrada. O valor e descreve quão frequente uma dada contagem S é esperada, ocorrer aleatoriamente, O corte do valor e pode ser tão alto quanto 1,0. O limiar típico para um valor confiável e de um saída de pesquisa BLAST usando um polipeptídeo ARKL como sequência duvida é mais baixo do que e-5(~10-5), I.e-10, I.e-15, Le20, l.e-25, 1 .e-50, Le-75, l.e-lOO, Le200, Le-300, Le-400, Le-500, Le-600, I.e-700 e l.e-800, Preferivelmente os polipeptídeos A.RK1... úteis nos métodos da invenção compreendem uma sequência tendo em ordem crescente de preferência um valor e mais baixo do que e-5(“'10-5), Le-10, l.e-15, l.e-20, .I.e-25, l.e-50, l.e-75, l.e-100, l.e200, l.e-300, Le-400, l.e-500. l.c-600, Le-700 e Le-800 em um alinhamento com um. dos domínios de Dedo de zinco tipo RING e/ou DAR1 como encontrado em. um polipeptídeo ARKL conhecido, tal como por exemplo SEQIDNO: 213.

Os exemplos dos polipeptídeos ARKL úteis nos métodos da. invenção são dados na Tabela A. Uma sequência que compreende os domínios RING-H2. e DAR1 como apresentadas nus polipeptídeos ARKL representativos da. Tabela A é dada da SEQ ID NO: 306 até a SEQ ID NO: 351 e da SEQ ID NO: 352 até a SEQ ID NO: 398, respectivamente. .As coordenadas de aminoáeido da posição dos domínios RING-H2 e DAR1 como presentes em uma seleção dos polipeptídeos ARKL da Tabela A são dadas no Exemplo 4.

Outros polipeptídeos ARKL preferidos úteis aos métodos da invenção são aqueles tendo em ordem crescente de preferência peto menos 50 %, 55 %, 60 65 %_s 70 M, 75 %, 80 %, 85 %. 90 76, 95 75, 96 %; 98 % ou mais de identidade da SEQucncia a qualquer um dos polipeptídeos dados na Tabela A.

Surpreendeniemente, foi agora descoberto que modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo YTP dá. plantas tendo características relacionadas com o rendimento realçadas 10 em relação às plantas de controle» De acordo com uma primeira forma de realização» a presente invenção fornece um método para realçar características relacionadas com o rendimento em plantas em relação ás plantas de controle, que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo YTP.

Um método preferido para modular (preferivelmente, aumentar) a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo YTP é pela introdução e expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo YTP.

Qualquer referência daqui por diante a uma “proteína dtil nos 20 métodos da invenção” é considerada significar em uma forma de realização um polipeptídeo YTP corno aqui definido. Qualquer referência daqui por diante a um “àc-ido nucléico útil nos métodos <ia invenção” é considerada significar um ácido nucléico capaz de codificar um tal polipeptídeo YTP. O ácido nucléico a ser introduzido ern uma planta (e portanto útil na realização 25 dos métodos da invenção) é qualquer ácido nucléico que codifique o tipo de proteína que agora será descrita, daqui por diante também chamado de “ácido nucléico YTP” ou Άene YTP”.

Um “polipeptídeo YTP” como aqui definido refere-se a um polipeptídeo que compreende pelo menos um domínio de transmembrana e

7'·) uma porção de pelo menos 50 atninoácidos contíguos de um domínio DUF22L Adicionalmente o polipeptídeo VTF pode compreender o Motivo 9 conto .representado pela SEQ ID NO:. 54.6,

As proteínas de transmembraua têm uma estrutura anfiíllíca. com segmentos hidrofóbicos que cruzam as membranas e alças hidrofilicas que podem estar localizadas no lado da membrana (ver a Figura 20). .As alças são os segmentos (regiões) de uma proteína localizada entre dois domínios TM, As alças de tamanho médio localizadas no lado de dentro da membrana são tipicamente mais negativamente carregados do que aquelas no lado de fora da membrana,

Um domínio de tramsmembrana iònna tuna estrutura, secundária (usualmente uma hélice alfa ou beta) tipicamente de 12 a 35 resíduos de aminoácido. As alças entre o.s domínios de transmembrana são tipicamente mais curtos do que 60 resíduos de aminoácido, embora regiões de comprimento globular também possam ocorrer. O número de domínios de transmembrana em um polipeptídeo YTP é variável, mas tipicamente entre 2 e 20.

O domínio de íransmembrana encontrado nos polipeptídeos YTP está preferivelmente entre 8 e 50 aminoácidos, mais preferivelmente 8, 12, 14, 16, 18, 2, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, ou 36 aminoácidos. Uma alça encontrada bos polipeptídeos YTP tem preferivelmente acima de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85,90, 100 resíduos de aminoácido.

Um polipeptídeo ΎΤΡ preferido útil nos métodos da invenção compreende em ordem crescente de preferência mais do que 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12 domínios de transmembrana.

Os domínios de transmembrana são proteínas alíamente hidrofóbicas ricas em aminoácidos não polares. A Tabela 3 mostra uma classificação dos aminoácidos de acordo com as propriedades de cadeia lateral.

Os amínoàcidos hidrofóbicos são indicados. () caráter hídrofòbíco de um peptídeo pode ser determinado pelos métodos bem conhecidos na técnica, como por exemplo relatado por Kyte e Doolittle (1982)1. MM. Biol, ,157; W5-132.

Os polípcptidcos V TP úteis nus métodos da invenção preferivelmente compreendam domínios de transmembrane tendo pelo menos 20 %, 30 %, 40 %. 30 %, 60 %, ou mais amínoácidos não pulares. A Tabela 3 dá a polaridade dos 20 aminoáeidos essenciais.

Tabela >: Ç.h^sificaç.ão..de utmnoáddos de acordo com as..propriedades..de cadeíajateral.

Aminoácklo

Acidez ou baskidade cadeiíKÍa cadela im-eral

Prolina ar ar

Olu o lar 'ar

Fenüalaràna Phe hctras Π leoa IPohmdMe i Ma

Arg .Asa

Asp

Árido

Aspártico

Cisteina

Ácido gltnâmico Ghnanúna

Gin

Sis'

G liei na holeueina Leucina

Metionina

Hm.idiua

Usi.ua Seríua

Troo nina

Tirosína Alanina

T?ipt(>fa?m

Valina alar oi ar

Tyr Ala Gly lie

Leu Met

Pm

Trp Vai' básico neutro ácido neutro ácido neutro básico básico neutro atro um>

•saro io polar he atro utu>

polar peutro •entro :eulr<>

índice de hidropatia

3.5 <7

4.5

T9

Sff

UM domínio de trausmembrana em uma proteína pode ser identificado usando várias técnicas bem conhecidas no ramo tal como cristalografia de raio X, RMN. técnicas de fusão de gene, métodos de acessibilidade de cisteína substituída, exerirnentos de giieosihção ligados em

Asp(N). Adicional ου altentalivamenie algoritmos de computador podem «cr usados para prognosticar domínios de transmembrana. Os exemplas de tais domínios foram descritos e são disponíveis nas instituições que fornecem serviços de bioinformática (Wilier ofo/, 200 L Bioínformatter 17.646), O uso de um tal algoritmo para prognosticar os domínios de tmnsmembmna em um polipeptídeo YTP é mostrado na seção de Exemplos aqui contida.

O domínio DUF22I refere-se a uma sequência de ammoáekio conservada encontrada em algumas proteínas de origem eucariódea. Os domínios DLJF221 são usualmente de 350 a 550 resíduos no comprimento. Os exemplos de domínios DUF221 compreendidos nos polipeptídeos YTP que se originam de .dmbn/qpsis ritm/onu e Gpuo sudmo são representados pela SEQ ID NO: 518 a SEQ ID NO: 543, Uma sequência de consenso que representa a sequência SEQ ID NO: 518 a SEQ ID NO: 543 é dada na SEQ ID NO: 544,

Um polipeptídeo YTP preferido da invenção compreende um minima de 50 aminoácídos contíguos de um domínio DUF22I tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 75 %, 80 %_f 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 H, 99 % ou 100 % de identidade da SEQutmcia com qualquer um dos domínios representados da SEQ ID NO: 518 até a SEQ ID NO: 544. A similaridade da SEQuência é preferivelmente estabelecida em um alinhamento local usando algoritmos bem conhecidos na técnica tais como Blast

Um polipeptídeo YTP pode ser facilmente identificado pela pesquisa em bases de dados especializadas contendo domínios de proteína conservados tais como Piam. (Finn e? of. Nucleic Acids Research (2006) Database Issue 34: D247-D25Í). As temamentas úteis na pesquisa de tais bases de dados são bem conhecidos na técnica, por exemplo INTERPRO (European Bíoínformatics Institute, UK) que possibilita pesquisar diversas bases de dados de domínio de proteína simultaneamente.

Um domínio DUF221 pode ser identificado pela comparação da SEQuènda cont polipeptidens conhecidos que compreendem um domínio DUF221 e estabelecendo-se a similaridade percentual na região do domínio DUF22L As sequências podem ser alinhadas usando qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica tais como algoritmos Blast (para 5 alinhamento local) ou BestFít (para alinhamento global). A probabilidade do alinhamento com uma dada sequência é tomada corno base para identificar polípeprideos similares. Um parâmetro que é tipicamente usado para representar tal probabilidade é chamado de valor e, O valor e è uma medida da credibilidade da contagem “ST “S” é mna medida da similaridade entre as 10 duas sequências alinhadas. O valor e descreve quão frequentemente uma dada contagem “S” é esperada ocorrer ao acaso. Q corte do valor e pode ser tão alto quanto l,(). O limiar típico para um acerto confiável (verdadeiro) mostrando homologia da SEQuência significants para a sequência dúvida e que resultam de uma pesquisa BLAST é mais baixo do que 1 .e-5, em alguns casos um 15 limiar ainda mais baixo é tomado, por exemplo .1 .e-ou ainda mais baixo.

Preferivelmente polipeptideos YTPs úteis nos métodos da invenção compreendem pelo menus 50 aminoãcidos contíguos de um domínio DUF221 tendo em ordem crescente de preferência um valor e mais baixo do que Le\ l.e'^s'^!, l.e'^s\ Ι.ο^'ζ Lé^w, Le’⁰. Le“'\ Le¹⁰°, .l.e’'·⁰, Le'”*, 20 l.e''^v··. Le^i Ι.ο'^ί>-\ i.e'^:V\ l.e'^, am um alinhamento local com um domínio DUF221 encontrado em um polipeptídeo YTP conhecido, tal como qualquer um dos polipeptideos da Tabela A.

Deve ser entendido que os ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo YTP de acordo com a invenção não é restrito às sequências de 25 origem natural. O ácido nucléico pode codificar urn polipeptídeo YIP planejado ‘We novo”.

Alternativa ou adicionalmente a proteína YTP tem em ordem crescente de preferência pelo menos 25 %, '26 %, .27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 36, 40 %, 41 %, 42 %, 43

ZU %, 44 45 46 47 %, 48 %, 49 %, 50 %. 51 %, 52 %, 55 %_s 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 93, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %. 77 %, 78 %_s 79 %, 80 96, 8.1 %, 82 %, 83 H, 84 %, 85 %, 86 %_f 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 H, on 99 % de identidade da SEQuência global para o aminoàcido representado pela SEQ ID NO: 409..

A identidade da SEIQuencia global è determinada usando um algoritmo de alinhamento global. tal como o algoritmo de Needleman Wunsch no programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), preferivelmente com parâmetros de default. Comparada com a identidade da SEQuência global, a identidade da SEQuêncía no geral será mais alta quando apenas domínios ou motivos conservados são considerados.

Preferivelmente, uma sequência de polipeptídeo YTP quando usada na construção de um árvore filogenética, tal como aquela representada na Figura 21. agrupa-se com o Grupo 1, que compreende a sequência de aminoàcido representada pela SEQ ID NO: 409 ao invés de com os polipeptideos YTP no Grupo 2.

Os termos domínio⁵' e “motivo* são definidos na seção de “definições'⁵ aqui contida. As bases de dados especializadas existem para a identificação de domínios, por exemplo, SMART (Schultz er al (1998) Proc. Natl. Acad.. Sei, USA 95, 5857-5864: Letunic at (2002) Nucleic Acids Res

30. 242-244), InterPro (Mulder er (2003) Nucl. Acids, Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretação. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Bnitlag D., Karp P., .Lathrop R., Searls D,, Eds., pp 53-61, A.AAl Press, Menlo Park: Hulo ez o/._x Nucl. Acids. Res. 32: DI 34-DI 37, (2004)), on Pfam (Bateman er mú, Nucleic Acids Research 30( 1): 276-280 (2002). Um conjunto de ferramentas paara a análise m s/lEm da SbQucndas de proteína é disponível nos servidor ExPASy proteomics (Swiss institute of Rioinformatícs (Gasteiger errv/., Ex PA Sy: the proteomics server for in~deplh protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788 (2003)).

A análise da sequência de poiipeptideo da SEQ I'D NO: 2 é apresentada abaixo nos Exemplos 2 a 4 aqui contidos. Por exemplo, um polipeptideo GRF como representado pela SEQ ID NO: 2 compreende um domínio QLQ com um acesso InterPro IPR014978 (acesso BEAM PE08880) e um domínio WRC com um acesso InterPro IPRO14977 (acesso PFA.M 10 PF08879) na base dc dados de domínio InterPro. Os domínios também podem ser identificados usando técnicas de rotina, tal corno pelo alinhamento da SEQuência. Um alinhamento do domínio QLQ dos polipeptideos da Tabela A aqui contida, é mostrada na Figura 2, e o alinhamento do domínio WRC dos polipeptideos da tabela A aqui contida, è mostrada na Hgura 3. faís 15 alinhamentos são úteis para identificar os aminoácidos mais conservados entre os polipeptideos GRF, tais como os resíduos de ammoácido QLQ e WRC.

Os métodos para o alinhamento da SEQuências para comparações são bem conhecidos na técnica, tais métodos incluem GAP, 20 BESTF.n. 131 AST, FASTA e TFASTA. GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar o alinhamento global (isto é, transpor as sequências completas) de duas sequências que maximizamente o número de emparelhamentos e minimiza o número de intervalo. O algoritmo BLAST (Altschul et o/. (1990) J Mol Blol 215: 40325 10) calcula a identidade da SEQuência percentual c realizo uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para realizar a análise BLAST é publicamente disponível através do National Centre for Biotechnology Information (NCBl). Homólogos podem ser iãctlmente identificados usando, por exemplo, o algoritmo de alinhamento da SEQuência múltipla CluslalW (versão 1.83). com os parâmetros de alinhamento aos pares de default, e um método de contagem em porcentagem. As porcentagens globais de similaridade e identidade também podem ser determinadas usando um dos métodos disponíveis no pacote de .software MatGAT (Campanella et n/., (2093) BMC Bioinformatics, 10: 29. MatGAT? uma aplicação que gera matrizes de similaridade/identidade usando sequências de proteína ou DNA). Edição manual menor pode ser realizada para otimizar o alinhamento entre motivos conservados, como estaria evidente a uma pessoa habilitada na técnica. Além disso, ao invés de usar sequências de tamanho natural para a identificação de homólogos, domínios específicos também podem ser usados. Os valores de identidade da SEQnêneia podem ser determinados na sequência de ácido nucléico ou sequência de pollpeptídeo inteiras ou nos domínios ou motivos conservados selecionados, usando os programas mencionados acima usando os narâmeíros de default.

................ X·....................

Para alinhamentos locais, o algoritmo de Smith-Waterman é particularmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1): 195-7).

Fora do domínio QLQ e do domínio WRC. os polipeptídeos GRF supsotamente têm identidade da SEQuência de aminoácido baixa. O Exemplo 3 aqui descreve na Tabela B a identidade percentual entre o pollpeptídeo GRF como representado pela SEQ ID NO: 2 e os polipeptídeos GRF Estados na Tabela A, que pode ser tão baixa quanto 15 % de identidade da SEQuência de aminoácido. A identidade percentual pode ser substancial mente aumentada se o cálculo da identidade é realizado entre o domínio QLQ SEQ ID NO: 2 (como representado pela SEQ ID NO: 115 compreendido na SEQ ID NO: 2; domínio QLQ dos polipeptídeos GR.F da Tabela A representado na Figura 2) e us domínios QLQ dos polipeptídeos úteis na realização da invenção. Similarmente, a identidade percentual pode ser substancia hnente aumentada se o cálculo da identidade è realizado entre o

7Q domínio WR.C SEQ ID NO: 2 (como representado pela SEQ ID NO: 116 compreendido na SEQ ID NO: 2; domínio WRC dos polipeptideos GRF da Tabela A representado na Figura 3) e os domínios WRC dos polipeptideos úteis na realização da invenção. Identidade percentual no domínio QLQ entre S as sequências de polipeptideo úteis na realização dos métodos da invenção varia entre 25 % e 99% de identidade de aminoácido. e identidade percentual no domínio WRC entre as sequências de polipeptideo úteis na realização dos métodos da invenção varia entre 60 % e 99 % de identidade de aminoácido. Como também pode ser observado na Figura .3, o domínio WRC é melhor 10 conservado entre os polipeptideos GRF diferentes do que o domínio QLQ, como mostrado na Figura 2.

A tarefa do prognóstico da localização subcelular da proteína é importante e bem estudada. Conhecer uma localização da. proteína ajuda a elucidar a sua função. Os métodos experintentais para a localização de 15 proteína variam de imunolocalização para, a rotulação de proteínas usando proteína fluorescente verde (GFP) ou beta-glícuronídase (GUS). Tais .métodos são precisos embora altamente dependente de mão de obra comparada com os métodos computacionais. Recentemente muito progresso tem sido feito no prognóstico computacional da localização de proteína a partir dos dados da 20 SEQuência. Juntameníe com os algoritmos bem conhecidos a uma pessoa habilitada na técnica estão disponíveis no ExPASy Proteomics ferramentas hospedadas pelo Swiss Institute for Bioinformatics, por exemplo, PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP_; MITOPROT, PATS, PTSI, SignalP e outros,

Além disso, os polipeptideos GRF úteis nos métodos da presente invenção (pelo menos na sua forma nativa) tipicamente, mas não necessariamente, têm atividade regulatória transcricional e capacidade para interagir com outras proteínas. Portanto, os polipeptideos GR.F com atividade rgulaíória transcricional reduzida, sem atividade regulatória tmnscrícionaL com capacidade de interação pmteína-proteína reduzida, ou sem nenhuma ' capacidade de interação de proteína-proteína, pode ser igualmente útil nos métodos da presente invenção. A atividade de ligação de DNA e as interações de protsma-proteína podem ser facilmente· determinadas õ? vzZro ou m vá vo usando técnicas bem conhecidas no ramo (por exemplo em Current. Protocols in Molecular Biology, Volumes 1 e 2, Ausubel et «À (1994), Current Protocols). Os polipeptídeos GRF são capazes de ativação tmnscrícional de genes repórter em células de levedura (Kim & Rende (2004) Proc Natl Acad Sci 1.01(36): 13.374-13.379). Os polipeptídeos GRF também são capazes de 10 interagir com polipeptídeos do fator que interage com G.R.F (GÍFI a GI.F3;

também chamados de polipeptídeos de translocação de sarcoma smovíal (SYT), SYTl a SYT3) m vivo em células de levedura, usando um ensaio de interação de proteína-proteína de híbrido duplo de levedura (Rim & K.ende, supra). Os ensaios de ligação m vRro também são usados para mostrar que. os

1.5 polipeptídeos GR.F e polipeptídeos GIF (também chamados de SYT) são parceiros interagentes (Kim & Rende» supra).

Λ presente invenção é ilustrada em uma forma de realização pela transformação de plantas com a sequência de ácido nucléico representada pela SEQ ID NO: L que codifica a sequência de polipeptídeo GRF da SEQ 20 ID NO: 2. Entretanto, o desempenho da invenção não é restrita a estas sequências; os métodos da invenção podem, ser vantajosamente realizados usando qualquer sequência de ácido nucléico que- codifica um polipeptídeo G.R..F como aqui definido,

A presente invenção é ilustrada em uma forma de realização 25 pela transformação de- plantas com a sequência de ácido nucléico representada pela SEQ ID NO: 1'20, que codifica a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 121. Entretanto. o desempenho da invenção não é restrita a estas sequências; os métodos da invenção podem ser vantajosamente realizados usando qualquer ácido nucléico codificador equivalent a RA.A1 ou polipeptideo equivalentes RAAI como aqui definidos.

Além disso, polipeptídeos equivalentes a RAAL quando expressados no arroz de acordo com os métodos da presente invenção como esboçado nos exemplos, dá plantas tendo características relacionadas com o 5 rendimento aumentadas, em partí colar índice de mix/broto aumentado, número aumentado de flores por panículo e Peso de Mil Grãos aumentado.

Os domínios de transmembrana são de cerca de 15 a 30 aminoácidos de comprimento e são usualmente compostos de resíduos hidrofóbicos que formam uma hélice alfa. Estes são usualmenic 0 prognosticados com base na hídrofobicidade (por exemplo Klein cr u/<, Biochim. Biophys. Acta 815, 468, 1985; ou Sonnhammer eí u/.. Em J, Glasgow, T, Littlejohn, F, Major, R> Lathrop, D. Sankoff, e C. Sensen, editores. Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for .Molecular Biology, páginas 175-182, Menlo Park, CA, 1998. 5 AAAI Press).

Os exemplos de proteínas que caem sob a definição de “polipeptideo SYR ou um homólogo deste são dados na Tabela /A da seção de exemplos e incluem sequências de várias plantas monocotiledôneas, tais como arroz (SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179 e SEQ ID NO: 180), milho .0 (SEQ ID NO: 181), trigo (SEQ ID NO: 182), cevada (SEQ ID NO: 183), cana de açúcar (SEQ ID NO: 1.84 e SEQ ID NO: 185), sorgo (SEQ I.D NO: 186); e de plantas díeotiledôneas tais como (SEQ ID NO: 187 e SEQ 1D

NO: 188), uva (SEQ ID NO: 189), cítricos (SEQ ID NO: 190) ou tomate (SEQ 1.D NO: 191. e SEQ I.D NO: 192). E considerado que o domínio rico em .5 Leu seja importante para a função da proteína, por este motivo as proteínas com o domínio rico em Leu mus sem os motivos conservados 5 ou 6 também podem ser úteis nos rnétodos da presente invenção; os exemplos de tais proteínas são dados nas SEQ ID NOs: 201 e 202,

Deve ser entendido que o termo “polipeptideo SYR ou um homólogo deste” nào deve ser limitado à sequência representada pela SEQ 1D

NO: 169 ou aos homólogos listados como SEQ ID NO: 179 a SEQ ID NO:

192, mas que qualquer polipeptídeo de cerca de 65 a cerca de 200 amíncácidos que atinge os critérios de compreender um domínio rico em .8 leucina como definido acima, precedido pelo motivo de tripepiídeu conservado 5 (a, b, c ou d) e seguido pelo motivo conservado 6 e preferivelmente também pelo motivo conservado 7; ou tendo pelo menos 38 % de identidade da SEQuência com a sequência da SEQ ID NO: 169, pode ser adequado para o uso nos métodos da invenção.

A. atividade de uma proteína SYR. ou homólogo desta pude ser ensaiada pela expressão da. proteína S YR ou homólogo desta sob o controle de ura promotor de GOS2 em Orw snAvo, que resulta em plantas com biomassa aumentada, c/ou rendimento de semente aumentado sem uma demora no tempo de florescimento quando cultivadas sob condições de deficiência de nitrogênio ou sob condições de estresse de seca, e comparada com as plantas do tipo selvagem correspondentes. Este aumento no rendimento de semente pode ser medido de diversos modos, por exemplo como um aumento do peso de semente total, número de sementes cheias» taxa de enchimento. Índice de colheita ou Peso de Mil Grãos.

A presente invenção é ilustrada em uma forma de realização pela transformação de plantas com a sequência de ácido nucléico representada pela SEQ TD NO: 168, que codifica a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 169. Entretanto, o desempenho da invenção não é restrita a estas sequências; os métodos da invenção podem ser vantajosamente realizados usando qualquer ácido nucléico que codifica SYR ou polipeptídeo SYR como aqui definidos.

A.lèm disso, os polípeptideos ARKL (pedo menos na .sua forma nativa) tipicamente têm atividade da ubiquitina ligase E3 de proteína. As ferramentas e técnicas para medir a atividade da ubiquitina ligase E3 de &

proteína são bem conhecidos na técnica (Patente US 6737244;

WO/2 001/075145; Miura m o/. (2005) Proc Nad Acad Set USA. 102(21): 7760-7765; Kawasaki ei o/. (2005) The Plant Journal 44, 258-270. Fim resumo a atividade da nbiqu.iti.na figase ,E3 de um. polípeptídeo AR.K.L pode 5 ser ensaiada incubando-se a proteína A.RK.L com uma das proteínas El e E2 e ubiquitina rotulada. As proteínas ubiquítinadas podem ser detectadas depois da eletroforese de SDS-RAGE e manchmaneto usando um anticorpo para o rótulo da ubiquitma. Os exemplos de proteínas El e E2 que podem ser úteis no ensaio sâo a El do Trigo e a proteína E2 AtUBCl de Rru/íum.

A ubiquitina rotulada com hístidtna e anticorpos para detectá-la sâo commercial mente disponíveis (Cal biochcm, San Diego. CA, USA).

Além disso, os polipeptídeos AKKL. quando expressados no arroz de acordo com os métodos da presente invenção como esboçado nos exemplos, dá plantas tendo características relacionadas com o rendimento 15 aumentadas, em particular Peso de Mil Grãos, rendimento de semente total, vigor iniciai e/ou índice'de colheita.

A presente invenção é ilustrada em uma forma de realização pela transformação de plantas com a sequência de ácido nucléico representada pela SEQ ID NO: 212. que codifica a sequência de polípeptídeo da SEQ ID 20 NO: 213. Entretanto, o desempenho da. invenção não é restrita a estas sequências; os métodos da invenção podem ser vantajosamente realizados usando qualquer ácido nucléico que codifica ARKL ou polípeptídeo ARKL como aqui definidos.

Além disso, os polipsptídeos YTP tipicamente têm atividade de realçar o rendimento de semente. Ferramentas e técnicas para medir a atividade de realçar (ou melhorar) o rendimento são bem conhecidos na técnica. Outros detalhes são fornecidas na seção de exemplos aqui contida.

Além disso, os polipeptídeos YTP, quando expressados e fenotipicameníe avaliados no arroz tie acordo com os métodos da presente invenção como esboçado nos Exemplos 10 a 15, dá plantas tendo características relacionadas corn o rendimento aumentadas, em particular um ou mais de peso de semente total. Peso de Mil Grãos, número de flores por panlculo, taxa de enchimento de semente e índice de colheita.

A presente invenção é ilustrada ern uma forma de realização pela transformação de plantas com a sequência de ácido nudéico representada pela SEQ 1D NO: 408, que codifica a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 409. Entretanto, o desempenho da invenção não é restrita a estas sequências; os métodos da invenção podem ser vantajosamenle realizados usando qualquer ácido nucléíco que codifica YTP ou polipeptídeo YTP como aqui definido.

Os exemplos das sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos da invenção são dados na Tabela A do Exemplo 1 aqui contida, especialmente as sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos selecionados do grupo que consiste de:

polipeptídeo GRF são dadas na Tabela Al, polipeptídeo equivalente a RAA1 são.dadas na Tabela .A2, polipeptídeo SYR são dadas na Tabela A3, polipeptídeo ARKL são dadas na Tabela A4, e polipeptídeo YTP são dadas na Tabela A5 respectivamente. Tais sequências de ácido nucleico são úteis na realização dos métodos da invenção. As sequências de polipeptídeo dadas na Tabela A do Exemplo I são sequências de exemplo de ortólogos e parálogos do polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRF, polipeptídeo equivalente a RAAl, polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARKL, e YTP representado pda SEQ ID NO: 2, 121, 169, 213 ou 409 respectivamente os termos “ortólogos' e “parálogos” sendo como aqui definidos. Outros ortólogos e parálogos podem ser facilmente identificados reafizando-se um chamado de pesquisa de blast recíproca. Tipicamente, isto envolve um primeiro BLAST envolvendo submenter a BLAST uma sequência dúvida (por exemplo usando qualquer uma das sequências listadas na Tabela A do Exemplo I) contra qualquer base de dados da SEQuêncU. íal como a base de dados NC.BI publicamente disponível. BLASTN ou TBLASTX (usando 5 valores de default nadrão) são no geral usadas quando comecando de urna sequência de nucleotídeo, e B.LASTP ou TBLASTN (usando valores de default padrão) quando começando de uma sequência de proteína. Os resultados de BLAST podem ser opcionalmente filtrados. Ás sequências de tamanho natural de cada um dos resultados filtrados ou resultados não 10 filtrados são depois retro submetidos ao BLAST (segundo BLAST) contra sequências do organismo a partir do qual a sequência dúvida ê derivada (onde a sequência dúvida é a SEQ ID NO: 1, 120, 168. 212 ou 408 respectivamente ou SEQ ID NO: 2, 121, 169, 213 ou 409 respectivamente o segundo BLAST portanto seria contra sequências de mo/íono). Os resultados do primeiro e segundo BLASTs são depois comparados. Um parálogo é identificado se ura acerto de alia classificação do primeiro blast, é da mesma espécie como da que a sequência dúvida é derivada. um retro BLAST depois idealmente resulta na sequência dúvida entre os acertos mais altos; um ortólogo é identificado se um acerto de alta classificação no primeiro BLAST 20 não é da. mesma espécie como da qual a sequência dúvida é derivada, e preferivelmente resulta no retro BLAST na sequência dúvida sendo entre os acertos mais altos.

O termo “Tabela A” usado neste relatório descritivo deve ser interpretado para especificar o conteúdo das Tabelas A I, A2, A3. A4 e/ou A5, 25 o termo Tabela AP usado neste relatório descritivo deve ser interpretado para especificar o conteúdo da Fabela Λ1. O termo “Tabela A2” usado neste relatório descritivo deve ser interpretado para especificar o conteúdo da Tabela A2. O termo “Tabela A3” usado neste relatório descritivo deve ser interpretado para especificar o conteúdo da Tabela A3. O termo “Tabela A.4” usado neste relatório descritivo deve ser interpretado para especificar o conteúdo da Tabela Ad, O termo “Tabefe A5 usado neste relatório de^eritiso deve ser interpretado para especificar u conteúdo da Tabela AS.

Em uma forma de realização preferida, o termo “Tabela A” significa Tabela AI. Em uma forma dc realização preferida, o termo Tabela

A” significa Tabela A2. Em uma forma de realização preferida, o termo Tabela A significa Tabela A3. Em uma forma de realização preferiría, o termo “Tabela A” significa Tabela A4. Etn uma forma de realização preferida, o termo “Tabela A” significa Tabela A5.

Acertos de alta classificação são aqueles tendo um valor E baixo. Quanto mais baixo o valor E. mais significante a contagem (ou em outras palavras mais baixa a chance que o accents desse encontrado ao acaso). A computação do valor E é bem conhecida na técnica. Além dos valeres E, comnparaçõcs também são pontuadas pela identidade percentual. A identidade percentual refere-se ao número de nucleotídeos (ou aminoácidos) idênticos entre as duas sequências de ácido nucléico (ou polipeptideo) comparadas em um comprimento particular, nu caso de famílias grandes, Clu.stalW pude ser usado, seguido por uma árvore de união de vizinhos, para ajudar a visualizar a formação de grupo dc genes relacionados e para identificar ortólogos e pzrálogos.

As variantes de ácido nucléico também podem ser úteis na prática dos métodos da invenção. Os exemplos de tais variantes incluem sequências de ácido nucléico que codificam homólogos e derivados de qualquer uma. das sequências de polipeptideo dadas na Tabula A do .Exemplo 2S 1. os Lermos “homólogo” e “derivado” sendo como aqui definidos. Também úteis nos métodos da invenção são as sequências de ácido nucléico que codificam homólogos e derivados de ortólogos ou parálogos de qualquer uma das sequências de polipeptideo dadas na Tabela A do Exemplo I. Homólogos e derivados úteis nos métodos da presente invenção têm substancial mente a mesma atividade biológica e funcional como a proteína não modificada da qual des são derivados.

Em uma forma de realização da invenção, mu derivado preferido útil nos métodos da invenção é urn poli.peptki.eo ARKL um residue* 5 de císteina na posiulào de ligando 5 (ver a Fig. 15) no domínio de dedo de RING coordinando um dos ions Zinco. Um outro derivado preferido útil nos métodos da. invenção é um pofipeptídeo ARKL tendo sete cisternas e uma histidina.(ZIC3HC4) como resíduos àeido nucléico nas posições de. ligação do íon zinco.

Outras variantes de ácido nucléico úteis na prática, dos métodos da invenção incluem porções das sequências de ácido nucléico que codificam polipeptideos selecionados do grupo que consiste de: polipeptideos GRF, polipeptideos equivalentes a RAAl, polipeptideos SYR, os polipepiídeos ARKL., e os polipeptideos YTP respect?vamente, as sequências de ácido nucléico que- híbridízam àa sequências de ácido nucléico que codificam polipeptideos selecionados do grupo que consiste de: polipeptideos GRF, polipeptideos equivalentes a RAAL polipeptideos SYR, os polipeptideos ARKL. e os polipeptideos YTP respectivamente, variantes de junção das sequências de ácido nucléico que codificam polipeptideos 20 selecionados do grupo que consiste de: polipeptideos GRF, polipeptideos equivalentes a RAAl, polipeptideos SYR, os polipeptideos ARKL, e os polipeptideos YTP respeuti vamente, as variantes alélicas das sequências de áddo nucléico que codificam os polipeptideos selecionados do grupo que consiste de: polipeptideos GRF, polipeptideos equivalentes a RAAL 25 polipeptideos SYR, os polipeptideos A.R.K.L, e os polipeptideos YTP respectivamente e variantes das sequências de ácido nucléico que codificam polipeptideos selecionados do grupo que consiste de: polipeptideos GRF. polipeptideos equivalenúrs a RAAl, polipeptideos SYR, os polipepiídeos ARKL, e os polipeptideos YTP respectivamente obtidos pelo embaralhamento dc genu. Os termos sequência que hibridiza, variante dc junção, variante alèiica e embaralhamento dc gene sao corno aqui descritos.

As sequencers dc ácido rmdcico que codificam polipeptideos selecionado do grupo que consiste det polipeptideos GRF, polipeptideos equivalentes a RAA1, polipeptideos SYR, os polipeptideos ARKL. e os polipeptideos YTP respectivamente não precisam ser sequências de ácido nucléico de tamanho natural, visto que o desempenho dos métodos da invenção não contam com u uso da SEíQucncias de ácido nucléico de tamanho natural. De acordo com. a presente invenção, é fornecido um método para aumentar características relacionadas com o rendimento, cm plantas, que compreende introduzir e expressar cm uma planta uma porção de qualquer uma das sequências de ácido nucléico dadas na Tabela A do Exemplo 1, ou uma porção de uma sequência de ácido nucléico que codifica um ortólogo, parálogo ou homólogo de qualquer uma das sequênciass de polipeptídeo dadas na Tabela A do Exemplo 1.

Uma porção de uma sequência de ácido nucléico pode ser preparada, por exemplo, fabricando-se uma ou mais deleçoes para a sequência de ácido nucléico. As porções podem ser usadas na forma isolada ou ela pode ser fundida a outras sequências codificadores (ou não codificadores) de modo, por exemplo, a produzir uma proteína que combine diversas atividades, Quando fundido a outras sequências codificadoras, o polipeptídeo resultante produzido na tradução pode ser maior do que aquele prognosticado para a. porção de proteína.

As porções úteis nos métodos da invenção, codificam em uma forma de realização um polipeptídeo GRF como aqui defmido, e têm substand.alme.nte a mesma atividade biológica como as sequências de polipeptídeo dadas na Tabela Al do Exemplo 1. Preferivelmente, a porção é uma porção de qualquer uma das sequêncíass de ácido nucléico dadas na Tabela A l do Exemplo 1. „ ou é uma porção de uma sequência de ácido nucléico que codifica um ortólugo ou parálogo de qualquer uma das sequências de polipeptideo dadas na labei a AI do Exemplo 1. Preferivelmente a porção tem, em ordem crescente de preferência, pelo menos 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 5 1150, H90 nucleotídeos consecutivos no comprimento, os nucleoudeos consecutivos sendo de qualquer uma das sequências de ácido nuclei co dadas na Tabela AI do Exemplo I, ou de uma sequência de ácido nucléico que codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das sequências de polipeptideo dadas na Tabela Al do Exemplo 1. Preferivelmente, a porção é 10 uma porção de uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de polipeptideo que compreende; (i) um domínio tendo pelo menos 50 %, 55 %> 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade da SEQuência de aminoácido a um domínio QLQ como representado pela SEQ ID NO: 115; e (li) um domínio tendo pelo menos 50 15 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 98 %, 99 % ou mais de identidade da SEQuênda de aminoácido a um domínio WRC como representado pela SEQ ID NO: 116. O mais preferivelmente a porção é uma porção da sequência de ácido nucléico da SEQ ID NO: I.

As porções úteis nos métodos da Invenção, codificam em uma 20 forma de realização um polipeptideo equivalente a RAAI como aqui definido.

e têm substancial men te a mesma atividade biológica como a sequência de amiuoâddos dada na 'Tabela. A2 do Exemplo L Preferivelmente, a porção é uma porção de qualquer um dos ácidos nucléicos dados na Tabela A2 do Exemplo 1, ou ê uma porção de um ácido nucléico que codifica um ortólogo 25 ou parálogo de qualquer um das sequências de aminoácido dadas na Tabela

A2 do Exemplo I. Preferivelmente a porção tem pelo menos 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, .1600, 1700, 1809, 1900, 2000, 2100, 2200 nudemídeus consecutivos no comprimento, os nucleotideos consecutivos sendo de qualquer uma das sequências de ácido nucléico dadas na Tabela A2 do Exemplo I. ou de um ácido nucléico que codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das- sequências de aminoácido dada na 'Fabela A2 do Exemplo

1. Mais preferível mente a porção ê uma porção do ácido nucléico da SEQ 1D NO: 120. Preferivelmente, a porção codifica um fragmento de uma sequência de aminoácido que, quando usada na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela representada na Figura 8. agrupa-se com os grupo de polipeptídeos equivalentes a RAAI que compreendem a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO? .121 ao invés de com qualquer outro grupo.

As porções díeis nus métodos da invenção, codificam ern uma forma de realização um. pollpeptídeo SYR como aqui definido, e têm substancialmente a mesma atividade biológica como as sequências de aminoácido dadas na Tabela A3 do Exemplo 1. Preferivelmente, a porção é uma porção de qualquer um dos ácidos nucléicos dados na Tabela A3 do Exemplo I, ou é uma porção de um ácido nucléico que codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das sequências de aminoácido dadas na Tabela A.3 do Exemplo 1. Preferi ve Imente s potçào tem pelo menos 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 nucleotideos consecutivos no comprimento, os nucleotideos consecutivos sendo de qualquer uma das sequêneiass de ácido nucléico dadas na Tabela A3 do Exemplo 1, ou de um ácido nucléico que codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das sequências de aminoácido dadas na Tabela A3 do Exemplo h Mais preferivelmente a porção e urna porção do ácido nucléico da SEQ IT) NO: 168. Preferivelmente, a porção codifica um pollpeptídeo de cerca de 65 a cerca tie 200 aminoácidos, que compreende um domínio rico em leucina como definido acima, precedido pelo motivo de tripeptídeo conservado 5 (a, b, c on d) e seguido pelo motivo conservado 6 e preferivelmente também pelo motivo conservado 7: nu lendo pelo menos 38 % de identidade da SEQuência com a sequência, da SEQ ID

NO: 169.

As porções úteis nos métodos da invenção, codificam cm uma forma de realização um polipeptídeo ARKL como aqui definido, e tèm substancial mente a mesma atividade biológica como as sequências de aminoácido dadas na Tabela A4 do Exemplo 1. Preferivelmente, a porção c uma porção de qualquer um dos ácidos nucléicos dados na Tabela A4 do Exemplo l, ou é uma porção dc um ácido nucléico que codifica um artóiogo ou parálogo de qualquer uma das sequências de aminoácido dadas na Tabela A4 do Exemplo L Preferivelmente a porção tem pelo menos 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, nucleotideos consecutivos no comprimento, os nucleotideos consecutivos sendo de qualquer uma das sequénciass de ácido nucléico dadas na Tabela A4 do Exemplo l, ou de um ácido nucléico que codifica um ortólogo ou paraiogo de qualquer uma das sequências de aminoácido dadas na Tabela A4 do Exemplo 1. Mais preferivelmente a porção é uma porção do ácido nucléico da SEQ ID NO: 212. Preferivelmente, a porção codifica um fragmento de uma sequência de aminoácido que, quando usado na construção de uma árvore fllogenética, tal como aquela representada .na Figura 17, agrupa-se .com. .o grupo do.s. polipeptídeos ARKL que compreende a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 213 ao invés de com. qualquer outro grupo tal como aquele representada pela sequência Mttsmu-Goliafh.

As porções úteis nos métodos da invenção, codificam em uma forma de realização um polipeptídeo YTP corno aqui definido, e têm substancialmente a mesma atividade biológica como as sequências de aminoácido dadas na Tabela A 5 do Exempla 1. Preferivelmente, a porção é uma porção de qualquer um dos ácidos nuclei cos dados na Tabela A5 do Exemplo I, ou é uma porção de um ácido nucléico que codifica um artóiogo ou parálago de qualquer uma das sequências de aminoácido dadas n.a Tabela A5 do Exemplo I. Preferivelmente a porção tem pelo menos 300, 400, 500,

550, 600. 650, 700, '750, 800. 850, 900, 950, 1000, 1500, 2090, 2500. 3060 nudcotídeos consecutivos no comprimento, os nucleotídeos consecutivos sendo de qualquer uma das sequências de ácido nucléico dadas na Tabela A5 do Exemplo 1. ou de um ácido nucléico que codifica um oríólogo ou parálogo de qualquer uma das sequências de aminoàcido dadas na 'Tabela ,A5 do Exemplo 1. O mais preferivelmente a porção é uma porção do ácido nucléico da SEQ ID NO: 408. Preferivelmente, a porção codifica um fragmento de uma sequência de aminoàcido que, quando usado na construção de uma árvore tilogenétíca, tal como aquela representada na Figura 21, agrupa-se com o Grupo 1, que compreende a sequência de aminoàcido representada pela SEQ ID NO: 409 ao invés de com os polipeptídeos YTP no Grupo 2.

Uma outra variante da SEQuéncia de ácido nucléico útil nos métodos da invenção é uma sequência de ácida nucléico capaz de hibridizar, sub condições de severidade, reduzida, preferível mente sob condições severas, com uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRF, polipeptídeo equivalente a RAA1, polipeptídeo SYR, polipeptídeo AR KL, e polipeptídeo YTP respectivamcnte como aqui definido, ou com uma porção como aqui definida.

De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar características relacionadas com o rendimento em plantas, que compreende introduzir e expressar em uma planta uma sequência de ácido nucléico capaz, de hibridizar a qualquer uma das sequências de ácido nucléico dadas na Tabela A do Exemplo I, ou que compreende introduzir e expressar em uma planta urna sequência de ácido uudéico capaz de hibridizar a uma sequência de ácido nucléico que codifica um ortólogo, parálogo ou homólogo de qualquer uma das sequências de ácido nucléico dadas na Tabela A do Exemoln l.

A

As sequências que hibridizam úteis nos métodos da invenção codiikam um polipeptideo selecionado do grupo que consiste de: polipeptideo GRF, polipeptideo equivalente a RAA1, polipeptideo SYR, polipeptideo ARK.L, e polipeptideo ΥΓΡ respectivamente como aqui definidos, e têm substancialmente a mesma atividade biológica cento as sequências de polipeptideo dadas na ’Fabela A do Exemplo E Preferivelmente, a sequência que híbridiza é capaz, de hibridizar a qualquer uma das sequências de ácido nucléico dadas na Tabela A do Exemplo L ou a uma porção de qualquer uma dessas sequências, uma porção sendo como definida acima, ou em que a sequência que hibridíza é capaz de hibridizar a uma sequência de ácido nudeíco que codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer urna das sequências de polipeptideo dadas na Tabela A. do Exemplo

Preferivelmente, em uma forma de realização a sequência que .híbridiza é capaz de hibridizar a uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de polipeptideo que compreende: (i) um domínio tendo pelo menos 50 %₅ 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98,99 % ou mais de identidade da SEQuência de amincácído a um domínio QLQ como representado pela SEQ ID NO'. 115; e (ii) um domínio tendo pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 35 ou mais de identidade da SEQnência de ammuácido a um domínio WRC como representado pela SEQ I.D NO: 116. O mais preferivelmente, a sequência que hibridíza é capaz de hibridizar a uma sequência de ácido nucléico como representada pda SEQ ID NO: 1 ou a uma porção desta.

Preferivelmente, em uma forma de realização a sequência que hibridíza é capaz de hibridizar a um áeido nucléico como representado pela SEQ ID NO: 120 ou. a uma porção desta..

Preferivelmente, a sequência que hibridíza codifica urn polipeptideo corn uma sequência de ammoàcido que, quando de tamanho natural e usado na construção de unia árvore filogenética, tal como aquela representada na Figura 8, agrupa-se com o grupo de poiijxtptídeos equivalentes a R.AA1 que compreendem a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO; 121 ao invés de com qualquer outro grupo, ’ Preferível mente, em uma forma de realização a sequência que hibridiza é capaz de hibridizar a um ácido nucléico como representado pela SEQ ID NO: 168 ou a uma porção destas.

Preferivelmente, a sequência que hibridiza codifica um polipeptídeo de cerca de 65 a cerca de 200 aminoãcidos, que compreende um domínio rico em leucina como definido acima, precedido pelo motivo de I0 tripcpüdcG conservado 5 (a, b, o ou d) e seguido pelo motivo conservado 6 e preferivelmente também pelo motivo conservado 7; ou tendo pelo menos 38 % de identidade da SEQuência com a sequência da SEQ ID NO: 169.

Preferivelmente, em uma forma, de realização a sequência que hibridiza é capaz de hibridizar a um ácido nucléico como representado pela 15 SEQ TD NO: 212 ou a uma porção destas.

Preferivelmente, a sequência, que hibridiza codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácido que, quando de tamanho natural e usado na construção de uma árvore íilogenétíca, tal corno aquela, representada na Figura 17, agrupa-se com o grupo dos polipeptideos AR KL 20 que compreendem a sequência de aminoácido representada pela SEQ Π.) NO: 213 ao invés de com qualquer nutro grupo tal como aquele representado pela sequência de Musmtn-Gofiath.

Preferivelmente, em uma forma de realização a sequência que hibridiza é capaz de hibridizar a um ácido nucléico como representado pela 25 SEQ Π) NO: 4(18 ou a uma porção destas.

Preferivelmente, a sequência que hibridiza codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácido que, quando de tamanho natural e usado na construção de uma árvore filogenétíca, tal como aquela como na Figura 21, agrupa-se com o Grupo L (.pie compreende a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 409 ao invés de com os polipeptideos YTP no Grupo 2.

Uma outra variante da SEQuência de ácido nucléico útil nos métodos da invenção è uma variante de junção que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRl^;\ polipeptídeo equivalente a RAA.L polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARKL, e polipeptídeo YTP respectivameute como aqui acima definido, ama variante de junção sendo como aqui definida.

De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar características relacionadas com o rendimento, que compreende introduzir e expressar em uma planta uma variante de junção de qualquer uma das sequências de ácido nucléico dadas na Tabela A do Exemplo 1, ou uma variante de junção de uma sequência de ácido nucléico que codifica um ortólogo, parálogo ou homólogo de qualquer uma das sequências de polipeptídeo dadas na Tabela A do Exemplo L

As variantes de junção preferidas são em uma forma de realização variantes de junção de uma sequência de ácido nucléico representada nela SEQ ID NO: L ou uma variante de iuncão de uma sequência de áoido nucléico que codifica um ortólogo ou parálogo da SEQ ID NO: 2. Preferivelmente, a variante de junção é uma variante de junção de uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de polipeptídeo que compreende: (i) um domínio tendo pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %_? 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade da SEQuência de aminoácido a um domínio QLQ como representado pda SEQ ID NO: 115; e (ii) um domínio tendo pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade da SEQuência de aminoácido a um domínio WRC como representado pela SEQ ID NO? 116.

As variantes de junção preferidas são em uma forma de realização variantes de junção de um ácido nucléico representado pela SEQ ID NO: 120, cm uma variante de junção de am ácido nucléico que codifica um _% . _f.. ....... _...... ...

ortôlogo ou parálogo da SEQ ID NO: 121. Preferível mente, a sequência de * aminuácido codificada pela variante de junção, quando usada na construção 5 de uma árvore filogenética, tal como aquela representada na Figura 8, agrupa se com o grupo de polipeptideos equivalentes a RAA1 que compreende a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 121 ao invés de com qualquer ouW grupo.

As variantes de junção preferidas são em uma forma de 10 realização variantes de junção de um ácido nucléico representado pela SEQ ID NO: 168, ou uma variante dc junção de um ácido nucléico que codifica um ortôlogo ou parálogo da SEQ ID NO: 169. Preferivelmente, a sequência de amínoácido codificada pela variante de junção ê um polipeptideo de cerca de 65 a cerca de 200 arnmoácidos, que compreende um domínio rico em leucina 15 como definido acima, precedido pelo motivo de tripeptídeo conservado 5 (a, b, c ou d) e seguido pelo motivo conservado 6 e preferivelmente também pelo rnotívo conservado 7; entendo pelo menos 38 % de identidade da SEQuência com. a sequência da SEQ II.) NO: 1.69.

As Variantes de junção preferidas são em uma forma de 20 realização variantes de junção de um ácido nucléico representado pela SEQ ID NO: 212, crí uma variante de junção de um ácido nucléico que codifica rnn ortôlogo ou parálogo da SEQ ID NO: 213. Preferivelmente, a sequência de amínoácido codificada pela variante de junção, quando usada na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela representada na Figura 17.

agrupa-se com o grupo dos polipeptideos ARK.L que compreende a sequência de aminoácido representada, pela SEQ ID NO: 213 ao invés de com qualquer outro grupo tai' como aquele representado pela sequência de Musmu-Golíath.

As variantes de junção preferidas são em uma forma de realização variantes de junção de um ácido nucléico representado pela SEQ ortólogo ou parálogo da SEQ ID NO: 409. Preferivelmente. a sequência de aminoácido codificada pela variante de junção, quando usada na construção de uma árvore filogenética, tal como aquela representada na Figura 21, agrupa-se com o Grupo I, que compreende a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 409 ao invés de com os polipeptideos YTP no Grupo 2.

Uma outra variante da sequência, de ácido nucléico útil na. realização dos métodos da invenção é uma variante alélica de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRF, polipeptídeo equivalente a RAAl, polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARKI.., e polipeptídeo YTP respecúvameníe como aqui acima definidos, uma variante alélica sendo como aqui definida.

De acordo oom a. presente invenção, é fornecido um método para, aumentar características relacionadas com o rendimento, que compreende introduzir e expressar em uma planta uma variante alélica de qualquer uma das sequências de ácido nucléico dadas na Tabela A do Exemplo 1. ou que compreende introduzir e expressar em uma planta uma variante alélica de uma sequência de ácido nucléico que codifica um ortólogo, parálogo ou homólogo de qualquer urna das sequências de polipeptídeo dadas na Tabela A do Exemplo l.

As variantes alélicas úteis em uma forma de realização da presente invenção têm substancialmente a mesma atividade biológica como o polipeptídeo GRF da SEQ ID NO: 3 e qualquer uma das sequências de polipeptídeo representadas na Tabela A do Exemplo 1. As variantes alélicas existem na natureza, e abrangidas dentro dos métodos da presente invenção é o uso destes aldos naturais. Preferivelmente, a variante alélica é uma variante alélica da SEQ ID NO: I ou uma variante alélica de tuna sequência de ácido nucléico que codifica um ortólogo ou parâlogo da SEQ 1D NO: 2.

Preferivelmente, a variante alélica é uma variante alélica de uma sequência de polipeptídeo que compreende: (i) um domínio tendo pelo menos 50 %, 55 %, 69 %< 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência de aminoácido a um domínio QLQ como 5 representado pela SEQ ID NO: 115; e (il) um domínio tendo pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %» 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência de aminoácido a um domínio WRC como representado pda SEQ ID NO: 116.

As variantes alélicas úteis em uma forma de realização da 10 presente invenção têm substancialmente a mesma atividade biológica como o polipeptídeo equivalente a ’RAA1 da SEQ ID NO: 121 e qualquer um dos ammoàcidos representados na Tabela A do Exemplo 1. As variantes alélicas existem na natureza, e abrangidas dentro dos métodos da presente invenção está o uso destes alelos naturais. Preferivelmente, a variante alélica é uma. 15 variante alélica da SEQ) ID NO: 120 ou uma. variante alélica de nm ácido nucléico que codifica um ortólogo ou parálogo da SEQ ID NO? 121. Preferivelmente, a sequência de aminoácido codificada pela variante alélica, quando usada na construção de urna árvore filogenética» tal como aquela representada na Figura 8, agrupa-sc com os polipcptídeos equivalentes a 20 RAAI que compreendem a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 121 ao invés de com qualquer outro grupo.

As variantes alélicas úteis em uma forma de realização da presente invenção têm substancialmente a mesma atividade biológica como o polipeptídeo SYR da SEQ ID NO: 1.69 e qualquer um dos aminoácidos 25 representados na Tabela A do Exemplo l. As variantes alélicas existem na natureza, e abrangidas dentro dos métodos da presente invenção está o uso destes alelos naturais. Preferivelmente, a variante alélica é uma variante alélica da SEQ ID NO: 168 ou uma variante alélica de um ácido nucléico que codífca um ortólogo ou parâlogo da SEQ ID NO: 169. Preferivelmente, a sequência de aminoácido codificada pela variante alélica é um polipeptídeo de cerca de 65 a cerca de 200 aminoácidos, que compreende um domínio rico em leucma como definido acima, precedido pedo motivo de Iripeptídeo conservado 5 (a, b, c ou d) e seguido pelo motivo conservado 6 e preferivelmente também pelo motivo conservado 7; ou tendo pelo menos 38 % de identidade de sequência com a sequência da. SEQ ID NO: 169,

As variantes alélicas úteis em uma forma de realização da presente invenção têm subslancialmente a mesma atividade biológica corno o polipeptídeo ARKL da SEQ ID NO: 213 e qualquer um dos aminoácidos 10 representados na Tabela A do Exemplo 1. As variantes alélicas existem na natureza* e abrangido dentro dos métodos da presente invenção está o uso destes alelos naturais. Preferivelmente, a variante alélica é uma variante alélica da SEQ ID NO; 212 ou. uma variante alélica de um ácido nucléíoo que codifica um ortólogo ou parálogo da SEQ ID ND: 213. Preferivelmente, a 15 sequência de aminoácido codificada pela variante alélica, quando usada na. construção de uma árvore filogenética, tal como aquela representada na Figura 17, agrupa-se com o grupo dos polipeptídeos ARKL que compreende a sequência de aminoácido representada pela SEQ ÍD NO: 213 ao invés de com qualquer outro grupo tal como aquele representado pela sequência de Musmu 20 Goliaüi.

As variantes alélicas úteis em uma forma de realização da presente invenção têm subslancialmente a mesma atividade biológica como o polipeptídeo YTP da SEQ ID NO: 409 e qualquer um dos aminoácidos representados na Tabela A do Exemplo L As variantes alélicas existem na 25 natureza, e abrangidos dentro dos métodos da presente invenção está o uso destes alelos naturais. Preferivelmente, a variante alélica é uma variante alélica da SEQ ID NO: 408 ou uma variante alélica de um ácido nuclêicu que codifica um ortólogo ou parálogo da SEQ ID NO: 409. Preferivelmente, a sequência de aminoácido codificada pela variante alélica, quando usada na

100 construção dc urna árvore filogenéiica, tal como aquela representada na Figura 21, agrupa-sc com o Grupo l, que compreende a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 409 ao invés de com os polipeptídeos YTP no Grupo 2,

O embaralhamento de gene ou a evolução direcionada também podem ser usados para get ar variantes das sequências de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GR.F, polipeptídeo equivalente a RAAE polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARK.L, e os polipeptídeos YTP respectivamente como definido 10 acima, o termo “embaralhamento de gene” sendo como aqui definido.

De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar características relacionadas com o rendimento, que compreende introduzir e expressar em uma planta uma variante de qualquer uma das sequências de ácido nucléico dadas na Tabela A do Exemplo E ou l5 que compreende introduzir e expressar em uma planta uma variante de uma sequência de ácido nucléico que codifica um ortólogo. parálogo ou homóloga de qualquer uma das sequências de polipeptídeo dadas na Tabela A do Exemplo k sequência de ácido nucléico variante esta variante que é obtida pelo embaralhamento de gene.

Preferivelmente em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico variante obtida oelo embaralhamento de eerie codifica uma ..... ....... ..... ·χ.«·· .....

sequência de polipeptídeo que. compreende: (Í) um domínio tendo pelo menos 50 %, 55 %, 60 %» 65 %, 70 %, 75 %. 80 %, 85 %_y 90 %, 95 %» 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência de aminoácído a um domínio QLQ como 25 representado pela SEQ ÍD NO: .115; e (il) uni domínio tendo pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência de amiucácido a um domínio W.RC -como representado pda SEQ ID NO: 1 '16.

Preferiveimenle cm uma forma de realização, a sequência de

10!

aminoácido codificada pelo ácido nucléico variante obtido pelo embaralhamento de gene, quando usado na construção dc uma árvore fifogenética tal como aquela representada na Figura 8, agrupa-se com o grupo de polípeptkieos equivalentes a RAA1 que compreende a sequência de aminoàcido representada pela SEQ ID NO: 121 ao invés de com qualquer outro grupo.

Preferivdmente cm uma forma de realização, a sequência de aminoácido codificada, pelo ácido nucléico variante obtida pelo embaralhamento de gene é um polipeptideo de cerca de 65 a cerca de 200 amtnoácidos, que compreende um domínio rico em Icucina. como definido acima, precedido pelo motivo de tripeptideo conservado 5 (a. h, c ou d) e seguido pelo motivo conservado 6 e preferivelmente também, pelo motivo conservado 7; ou tendo pelo menos 38 % de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 169.

Preferivelmente em uma forma de realização, a sequência de aminoácido codificada pelo ácido nucléico variante obtido pelo embaralhamento de gene, quando usado na construção de uma árvore filogenélica tal como aquela representada na Figura 17, agrupa-se com o grupo dos polipeptídeos ARKL que compreende a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 213 ao invés de com qualquer outro grupo tal como aquele representado pela sequência PF00097Musmu~Goliath.

.Preferivelmente em uma forma, de realização, a sequência de aminoácido codificada pelo ácido nucléico variante obtido pelo embaralhamento de gene, quando usado na construção de uma árvore filogenética tal como aquela representada na Figura 21, agrupa-se com o Grupo 1, que compreende a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 409 ao invés de com os polipeptídeos YTP no Grupo 2.

Além disso, as variantes da sequência de ácido nucléico também podem ser obtidos pela mutagênese direcionada ao sitio. Diversos

102 métodos sito disponível para se obter mutagénesc direcionada ao sítio, o mais comum sendo métodos com base em PCR (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Eds.).

As sequências de ácido nucléico que codificam polipeptídeos 5 GRF podem ser derivados de qualquer fonte natural ou artificial. A sequência de ácido nucléico pode ser modificada a partir da sua forma nativa em composição e/ou ambiente genômico através da manipulação humana deliberada. Preferivelmente a sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptideo GRF é de uma planta, mais preferivelmente de uma planta 10 dicoiiJedõnea, mais preferivelmente da família Bmtufcoeeae, mais preferivelmente a sequência de ácido nucléico é da hm/mnm

Os ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos equivalentes a RAA1 podem ser derivados de qualquer fonte natural ou artificial. O ácido nticléíco pode ser modificado a partir da sua forma nativa em composição 15 e/ou ambiente genômico através da manipulação humana deliberada. Preferivelmente o ácido nucléico que codifica o polipeptideo equivalente a RAA1 é de uma planta, mais preferivelmente de uma planta monocotíledônea, mats, preferivelmente da. família mais preferivelmente o ácido nucléico é de (?n-cu .mrívm

Os ácido nucléicos que codificam polipeptídeos SYR podem ser derivados de qualquer fonte natural ou artificial. () ácido nucléico pode ser modi ficado a partir da sua forma nat iva em composição e/ou ambiente genômico através da manipulação humana deliberada. .Preferivelmente o ácido nucléico que codifica o polipeptideo SYR é de uma planta, mais 25 preferivelmente de uma planta monocotiledônea, mais preferivelmente da familia mais preferivelmente o ácido nucléico é de (Mmc wívm

Os ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos ARKL podem ser derivados de qualquer fonte natural ou artificial. O ácido nucléico pode ser modificado a partir da sua fonna nativa em composição e/ou

Η) 3 ambiente genõmico através da manipulação humana deliberada. Preferivelmente o ácido nucléico que codifica o polípeptídeo ARKL é de uma pbnta, mais preferivelmente de um planta monccoliledônea, mais preferível mente da família /Yxmeoe, mais preferivelmente o ácido nucléico é 5 de 6)p}co .çtfhm.

Os ácidos nucléicos que codificam os polipcplidcos YTP também podem ser codificados por um polípeptídeo YTP planejado Ve wvo_s isto é, não derivado de uma fonte natural· O ácido nucléico pode ser modificada a partir da sua forma nativa em composição e/ou ambiente 10 genômico através da manipulação humana deliberada. Preferivelmente o ácido nucléico que codifica o polípeptídeo YTP é de uma planta, mais preferivelmente- de uma planta monocotíledônea, reais preferívelrnente da família ./Moecoc, mais preferivelmente o ácido nucléico é de se/rivo.

0 desempenho dos métodos da invenção dá em uma forma de realização plantas tendo características relacionadas com o rendimento realçadas. Em particular o desempenho dos métodos da invenção dá plantas tendo rendimento aumentado, especialmente rendimento de semente aumentado em relação às plantas de controle. Os termos “rendimentos” e 2.0 “‘rendimento de semente'⁵ sâo descritos em rnais detalhes na seção “definições” aqui contida.

O desempenho dos métodos da invenção dá em uma forma de realização plantas tendo resistência ao estresse abiótico aumentada (ou tolerância ao estresse abiótico, termos estes que são usados 25 intercambíavelmento), efetuada como camctc.risi.icas relacionadas com o rendimento realçadas comparada com as plantas de controle quando cultivadas sob estresse abiótico. Em particular, o desempenho dos métodos da invenção dá plantas tendo rendimento aumentado, especialmente rendimento de semente aumentado e biomassa aumentada em relação às plantas de controle. Os termos “rendimento” e “rendimento de semente são descritos em mais detalhes na seção “definições” aqui contida.

Referência aqui contida aos características relacionadas cora o rendimento realçadas é considerada significar um aumento na biomassa 5 (peso) de uma ou mais partos de uma planta, que podem incluir partes acima do solo (colhíve;) e/ou partes (colhiveis) abaixo do solo.

Em uma. forma de realização, tais partes colhíveis são sementes, e o desempenho dos métodos da invenção resulta em plantas tendo rendimento de semente aumentado em .relação ao rendimento de semente de 10 plantas de controle.

Em. uma .forma de realização tais partes colhíveis são raízes, ilores e/ou sementes, e o desempenho dos métodos da invenção resulta em plantas tendo biomassa e/ou. rendimento de semente aumentadas em relação ao rendimento de semente de plantas de controle.

Em uma forma de realização, tais partes colhíveis sao sementes, e o desempenho dos métodos da invenção resulta em plantas tendo rendimento, peso de semente total, taxa de enchimento de semente, número de flores (ou flósculos), índice de colheita, e Peso de Mil Grãos aumentados em relação às plantas de controle.

Tomando o milho como um exemplo, um aumento de rendimento pode ser manifestado como uns ou mais dos seguintes: aumento no número de plantas estabelecidas por hectare ou acre, um aumento no número de espigas por planta., um. aumento no número de fileiras, número de grãos por fileira, peso do grão. Peso de Mil Grãos, comprímento/diâmetro da 25 espiga, aumento na taxa de enchimento de semente (que é o número de sementes cheias divididas pelo número lotai de sementes e multiplicado por 100), entre outros. Tomando arroz como um exemplo, um aumento no rendimento pode manifestar-se por si só como um aumento em um ou mais dos seguintes: número de planlas por hectare ou acre, número du paníeulos

OS por planta, número de espigueta por paniculo, numero de flores (llósculos) por panícuto (que c expressado como uma razão do número de sementes cheias sobre o numero de panículos primários), aumento na taxa de enchimento de semente (que é o número de sementes cheias dividido pelo número total de sementes e multiplicado por 100), aumento no Peso de Mil Grãos, entre outros.

A presente invenção fornece um método para aumentar características relacionadas com o rendimento de plantas em relação às plantas de controle, método este que compreende a expressão crescente em uma planta de uma sequência de ácido nuciéico que codifica um polípeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRF e polípeptídeo equivalente a RAA1 respectivamente como aqui definido.

A presente invenção fornece um .método para aumentar a resistência ao estresse abiótico de plantas, resultando em rendimento aumentado, especialmente rendimento de semente e/ou biomassa aumentada de plantas, em relação às plantas de controle, quando cultivadas sob condições de estresse abiótico, método este que compreende modular a expressão» preferivelmente expressão crescente, em uma planta de um ácido nuciéico que codifica um polipeptídeo SYR como aqui definido.

A presente invenção fornece um método para aumentar o rendimento, especialmente rendimento de semente dc plantas, em relação às plantas de controle, método este que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nuciéico que codifica um polípeptídeo ARKL como aqui definido,

A presente invenção fornece um método para aumentar o rendimento, especialmente rendimento de semente de plantas, em relação às plantas de controle, método este que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nuciéico que codifica um polípeptídeo YTP como aqui definido.

Visto que as plantas transgênicas de acordo com a presente invenção têm características relacionadas com o rendimento aumentadas, è provável que estas plantas exibam uma taxa de crescimento aumentada (durante pelo menos parle dc seu ciclo de vida), em relação à taxa de crescimento de plantas de· controle em um estágio correspondente em seu ciclo de vida.

Além da capacidade de rendimento aumentado, uma eficiência aumentada dc captação de nutriente também pode contribuir para o aumento no rendimento. E observado que as plantas de acordo com a presente invenção mostram, uma eficiência mais alia na captação de nutriente. A eficiência aumentada de captação de nutriente permite melhor crescimento da planta, quando a planta está sob estresse. Também é observado que as plantas transgênicas de acordo com a presente invenção lèm tolerância ao estresse de seca aumentada, permitindo que as plantas continuem a crescer sob condições que retardam ou inibem o crescimento de plantas de controle.

A. taxa de crescimento aumentada pode ser específica a uma ou mais partes de uma planta (incluindo sementes), ou pode ser substancialmente por toda a planta. As plantas tendo uma taxa de crescimento aumentada podem ter um ciclo de vida mais curto, O ciclo de vida de uma planta pode ser considerado significar o tempo necessário para crescer a partir de uma semente madura seca até o estágio onde a planta produziu sementes madures secas, similares ao material inicial. Este ciclo de vida pode ser influenciado por fatores tais como vigor inicial, taxa de crescimento, índice de verdura, tempo de florescimento e velocidade de maturação de semente. O aumento na taxa de crescimento pode ocorrer em um ou mais estágios no ciclo de vida de uma planta ou durante substaneialmente o ciclo de vida da planta Inteiro. A taxa de crescimento aumentada durante os estágios iniciais no ciclo de vida de uma planta pode refletir vigor aumentado (inicial). O aumento na taxa de crescimento pode alterar o ciclo de colheita, de uma planta permitindo que a.s

107 plantas sejam semeadas mais tarde e/ou colhidas mais cedo do que de outro modo seria possível (um efeito similar pode ser obttdo com tempo de Ihavsei morno mais cedo; florescimemo demorado ustudmente não è um iraço desejado em safras). Sc a taxa de crescimento é suüdeniemente aumentado, 5 pode permitir a semeadura adicional de sementes da mesma espécie de planta (por exemplo semeadura e colheita de plantas de arroz seguidas peta semeadura e colheita de mais plantas de arroz todas dentro de um periodo de crescimento convencional). Similarmente. se a taxa de crescimento é suficientemente aumentada, pode permitir a semeadura adicional de sementes 10 de espécies de plantas diferentes (por exemplo a semeadura e colheita de plantas de milho seguidas, por exemplo, pela semeadura e colheita opcional de soja., batata ou qualquer outra planta adequada). Os tempos adicionais de colheita do mesmo rizoma no caso de algumas plantas de safira também pode ser possível. Alterar o ciclo de colheita de urna planta pode levar s um 15 aumento na produção de biomassa anual por acre (devido a um aumento no número de vezes (digamos em um ano) que qualquer planta particular pode ser cultivada e colhida). Um aurnento xia taxa de crescimento lambem pode pe.rmh.ir o cultivo de plantas transgenicas em uma área geográfica mais ampla do que as suas contrapanes do tipo selvagem, visto que as limitações 20 territoriais para cultivar uma safra são frequentemente determinadas pelas condições ambientais adversas no tempo de plantar (estação iniciai) ou no tempo de colheita (estação tardia). Tais condições adversas podem ser evitadas se o ciclo de colheita é encurtado. A taxa de crescimento pode ser determinada pela derivação de vários parâmetros a partir de curvas de 25 crescimento, tais parâmetros podem ser: T-Mid (o tempo levado para as plantas atingirem 50 % de seu tamanho máximo) e T-90 (tempo levado para as plantas atingirem 90 % de seu tamanho máximo), entre outros.

De acordo com uma característica, preferida da presente invenção, o desempenho dos métodos da invenção dà plantas tendo uma taxa (OS de crescimento aumentada em relação às plantas de controle. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar a taxa de crescimento de plantas, método este que compreende a expressão crescente em uma planta de uma sequência de ácido nucléico que codifica um 5 polipeptideo GR.F ou um palipeptídoo equivalente a RAAl ou um polipeptideo YTP ou um polipeptideo .ARKL como aqui definidos.

De acordo com uma caracteística preferida da presente invenção, o desempenho dos métodos da invenção dá plantas tendo uma taxa de crescimento aumentada em relação às plantas de controle quando lí) cultivadas sob condições de estresse abiótico. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar a taxa dc crescimento de plantas sob condições de estresse abiótico, método este que compreende modular a expressão, preferivelmente a. expressão crescente, em uma planta de um doido nucléico que codifica um polipeptideo SYR corno 15 aqui definido.

Traços relacionados com o rendimento aumentados ocorrem se a planta está sob condições nào estressaníes ou se a planta é exposta aos vários estresses comparada com as plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. As plantas tipicamente respondem à exposição ao 20 estresse crescendo mais lentamente. Em condições de estresse severo, a planta pode mesmo parar de crescer cornpletamente. O estresse brando por outro lado è aqui definida como sendo qualquer estresse ao qual uma planta ê exposta que não resulta na planta cessando de crescer completamente sem a capacidade para retomar o crescimento. O estresse brando no sentido da 25 invenção leva a uma redução no crescimento das plantas estressadas de menos do que 40 %, 35 % ou 30 %, preferivelmente menos do que 25 20 % on 15 %, mais preferivelmente menos do que 14 %, 13 %, 12 %, 11 % ou 10 % ou menos em ornnparação com a planta de controle sob condições não estressantes. Devido aos avanços nas práticas agrícolas (irrigação, η μ)

Fertilização, tratamentos com pesticida) os estresses severos não são frequentemente encontrados em plantas de safra cultivadas. Como urna consequência, o crescimento comprometido induzido pelo estresse brando é frequentemente uma característica indesáveí para a agricultura. Os estresses 5 brandas são os estresses biótico e/on abíútíeo (ambientais) de todos os dias aos quais uma planta é exposta.

Os estresses abiõticos podem ser devido à seca ou água em excesso, estresse anaeróbico, estresse salino, toxicidade química, estresse oxidativo e temperaturas quentes, (fias ou congelantes. O estresse abiótico 10 pode ser um estresse osmotico causado par um estresse de água (particularmentc devido à seca), estresse salino, estresse oxidativo ou urn estresse iônico. Os estresses bióticos são tipicamente aqueles estresses causados pelos patógenos, tais como bactérias, vírus, fungos, nematoides, e insetos. O termo condições “não estressantes” como aqui usado são aquelas 15 condições ambientais que permitem o crescimento ótimo de plantas. As pessoas habilitadas na técnica estão cientes das condições de solo e condições climáticas normais para uma dada localidade.

Em particular, os métodos da presente invenção podem ser realizado sob condições não estressantes ou sob condições de seca branda 20 para dar plantas tendo rendimento aumentado em relação às plantas de controle. Como relatada em Wang eZ <vZ. (Planta (2003) 218: 1 -14), o estresse abiótico leva a uma série de mudanças marfológicas, fisiológicas, bioquímicas e moleculares que afetam adversamente o crescimento e a produtividade da planta. Seca, salinidade, temperaturas extremas e estresse 25 oxidativos são conhecidos serem i nterconectados e podem induzir o crescimento e dano celular através de mecanismos similares. Rabbani et o/. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) descrevem um grau particularmente alto de “conversa cruzada’* entre o estresse pela seca, e estresse de alta salinidade. Por exemplo, a seca e/ou a salinisação são manifestadas primaríamente como estresse osmòtico, resultando no rompimento da homeostase e distribuição de íon na célula. O estresse oxidative, que frequentemente acompanha temperatura alia ou baixa, estresse pela salinidade ou seca, pode causar a desnaluração de proteínas funcionais e estruturais. 5 Como uma consequência, estes estresses ambientais diversos frequentemente ativam os caminhos de sinalização de célula similares e respostas celulares, tais como a produção de proteínas de estresse, super-regulagem de antioxídantes, acúmulo de solutos compatíveis e parada de crescimento, O termo condições “não estressantes” como aqui usado são aquelas condições 0 ambientais que permitem o crescimento ótimo das plantas. As pessoas habilitadas na técnica estão cientes das condições de solo e condições climáticas normais para uma dada localização.

Um aumento no rendimento e/ou taxa de crescimento ocorre se a planta está sob condições não estressantes ou se a planta è exposta aos S vários stresses comparada com as plantes de controle.

As plantas tipicamente respondem, à exposição ao estresse crescendo mais lentamente. Em condições de estresse severo, a planta pode ainda oarar de crescer completamente. O estresse brando por outro lado ê aqui definido como sendo qualquer estresse ao qual uma planta é exposta que não ,0 resulta na planta cessando de crescer completaraeníe sem a capacidade para retomar o crescimento. Devido aos avanços nas práticas da agricultura (irrigação, fertilização, tratamentos com pesticida) estresses severos não são frequentemente encontrados nas plantas de safra cultivadas. Como mna consequência, o crescimento com prometido induzido pelo estresse brando ê frequentemente uma característica indesejável para a agricultura. Os estresses brandos são os estresses bióticcs e/ou abiótícos (ambienteis) de todos os dias aos quais uma planta c exposta. Os estresses abióticos podem ser devido à seca ou água em excesso, estresse anaeróbico, estresse salino, toxicidade química, estresse oxidativo e temperaturas quentes, frias ou cougelantes. O estresse abióticu pude ser um estresse nsmótíco causado por um estresse de àgua (particularmente devido à seea), estresse salino, estresse oxidativo nu um estresse iônico. Os estresses bíóticos sãn tipicamente aqueles estresses cansados pelos patógenos, tab como bactérias, vírus, fungos e insetos.

O desempenho dos métodos da invenção dã em uma forma do realização plantas cultivada?) sob condições nào estressantes ou sob condições de estresse brando tendo características relacionadas com o rendimento aumentadas, em relação ás plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar características relacionadas com o rendimento em plantas cultivadas sob condições não estressantes ou sob condições de estresse brando, método este que compreende a expressão crescente em uma planta de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polípeptideo GRF.

O desempenho dos métodos de acorda com a presente invenção resulta em plantas cultivadas sob condições de estresse abiôtico tendo características relacionadas com o rendimento aumentadas em relação às plantas de controle cultivadas sob condições de estresse comparáveis. Como relatada em Wang «/. (Planta (2003) 218: I ·14), o estresse abiôtico leva a uma série de mudanças morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e moleculares que afetam adversamente o crescimento e a produtividade da planta. A seca, salinidade, temperaturas extremas e estresse oxidativo são conhecidos serem ixrterconectados e podem induzir o crescimento e dano celulares através de mecanismos similares. Rabbani et o/. (Plant Physiol (2003) 133; 1755-1767) descreve um grau particularmente alto de ’‘conversa cruzada” entre o estresse pela seca e o estresse de alta salinidade. Por exemplo, a seca e/ou salinização são manifestadas primaríamente como estresse osmótico, resultando no rompimento da homeostase e distribução de ion na célula. O estresse oxidativo, que frequentemente acompanha as temperaturas altas ou baixas, estresse pela salinidade ou seca, pode causar a dcsnaturaeào das moteínas funcionais e estruturais. Corno uma conseouência, estes diversos estresses ambientais frequentemente ativam caminhos de sinalização de célula similares e respostas celulares, tais como a produção du proteínas de estresse, super-regulagem de anti-oxtdantes, acúmulo de solutos S compatíveis e parada de crescimento. Visto que diversas estresses ambientais ativam caminhos similares, a exemplificação da presente invenção com estresse pela seca não deve ser observado como uma limitação ao estresse pela seca, mas mais como uma triagem para indicar o envolví mento de polipeptideos GRF como definido acima, em aumentar características 10 relacionadas com o rendimento em relação às plantas de controle cultivadas em condições de estresse comparáveis, em estresses abióticos no geral.

O termo “estresse abiótico” conn:? aqui definido é considerado significar qualquer um ou mais de: estresse pela água (devido à seca ou agua em excesso), estresse anaeròbíco, estresse salino, estresse de temperatura 15 (devido às temperaturas quentes, frias ou congelantes), estresse de toxicidade química e estresse oxldativo. De acordo com um aspecto da invenção, o estresse abiótico é um estresse osmótieo, selecionado de estresse pela água, estresse safi.no, estresse oxldativo c estresse fônico. Preferivelmente, o estresse pela água c o estresse pela seca. O termo estresse salino não é restrito 20 ao sal comum (NaCl), mas pode ser qualquer estresse causado por um ou mais de: NaCI, KCI, IJC1, MgCb, CaCh, entre outros.

O desempenho dos métodos da invenção dá plantas tendo características relacionadas com o rendimento aumentadas, sob condições de estresse abiótico em relação às plantas de controle cultivadas em condições de 25 estresse comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar características relacionadas com o rendimento, em plantas cultivadas sob condições de estresse abiótico, método este que compreende a expressão crescente em uma planta de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF. Do acordo eom um aspecto da invenção, o estresse abiôtico é um estresse osmõtsco, selecionado de um ou mais dos seguintes: estresse pela água, estresse salino, estresse oxidativo e estresse iônieo.

Um outro exemplo de estresse ambiental abiôtico é a disponibilidade reduzida de um ou mais nutrientes que necessitam ser assimilados pelas plantas para crescer e desenvolver. Por causa da forte influência da eficiência de utilização de nutrição sobre o rendimento da plante e qualidade de produto, uma quantidade enorme de fertilizante e vertida nos campos para otimizar o crescimento e qualidade da planta. A produtividade de 10 plantas ordinariamente c limitada por três nutrientes primários, fósforo, potássio e nitrogênio, que é usualmente o elemento limitante de taxa no crescimento da planta destes três. Portanto o elemento nutricional principal requerido para o crescimento da planta é o nitrogênio (N). O mesmo c um constituinte de numerosos compostos importantes encontrados nas células 15 vivas, incluindo ammoâeidos, proteínas (enzimas), ácido nucléico*, e clorofila. 1.5 % a 2 % de matéria seca vegetal é nitrogênio e aproximadamente 16 % da proteína vegtal total. Assim, a disponibilidade de nitrogênio é um fator limitante principal para o crescimento e produção da planta de safra (Frink e? <.?/. (1909) Proc Natl Acad Sei USA 96(4): 1175·· 20 II80), e tem também um. maior impacto sobre o acúmulo de proteína e composição de aminoácido. Portanto, de enorme interesse são as plantas de safra com características relacionadas com o rendimento aumentadas, quando cultivadas sob condições limitantes de nitrogênio.

O desempenho dos métodos da invenção dà plantas cultivadas 25 sob condições de disponibilidade de nutriente reduzida, particuiannente sob condições de disponibilidade de nitrogênio reduzida, tendo características relacionadas com o rendimento aumentadas em relação às plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo corn a presente invenção, é fornecido um método para aumentar características relacionadas η 4 com ο rendimento em plantes cultivadas sob condições de disponibilidade de nutriente reduzida, preferivelmente disponibilidade de nitrogênio reduzida, método este que compreende a expressão crescente ern uma plante de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptideo GRf. Λ disponibilidade de nutriente reduzida poria resultar de uma deficiência ou excesso de nutrientes tais como nitrogênio. fi>sfatos e outros compostos contendo fósforo, potássio, cálcio, cádmio, magnésio, manganês, ferro e boro, entre outros. Preferivelmente, a disponibilidade de nutriente reduzida é a disponibilidade de nitrogênio reduzida.

O desempenho dos métodos da invenção dá em uma forma de realização plantas cultivadas sob condições nào estressantes ou sob condições de seca branda rendimento aumentado em relação às plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento em plantas cultivadas sob condições nâo estressantes ou sob condições de seca branda, método este que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptideo equivalente a R.AA .I.

O desempenho dos métodos da invenção dá em uma forma de realização plantas cultivadas sob condições de deficiência de nutnente, parficularmente sob condições de deficiência de nitrogênio, rendimento aumentado em relação às plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com. a presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento em plantas cultivadas sob condições de deficiência de nutriente, método este que compreende modular a expressão em tuna planta de um. ácido nucléico que codifica um polipeptideo equivalente a RAA l. A deficiência de nutriente pode resultar de uma falta de nutrientes tais como nitrogênio, fosfatas e outros compostos contando fósforo, potássio, cálcio, cádmio. magnésio, manganês, ferro e bo.ro, entre outros.

O desempenho dos métodos da invenção dá plantas cultivadas

IIS sob condições de estresse abiõtieo tais como condições de seca branda a severa rendimento aumcatado em relação ás plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento em plantas cultivadas sob 5 condições de estresse abiótieo tal como condições de seca branda a severa, método este que compreende a expressão crescente em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptideo SYR. O termo “condições de seca severa'* ou “estresse pda seca severo” como aqui usado são aquelas condições de sees que causam uma redução de rendimento de 50 % ou mais 10 nas plantas de controle, comparado corn o rendimento de plantas de controle cultivadas sob condições não estressant.es.

O desempenho dos métodos da invenção dá em uma forma de realização plantas cultivadas sob condições de deficiência de nutriente, particularmente sob condições de deficiência de nitrogênio, rendimento 15 aumentado em relação às plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento em plantas cultivadas sob condições de deficiência de nutriente, método este que compreende a expressão crescente em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo SYR. A 20 deficiência de nutriente pode resultar de uma falta de nutrientes tais como nitrogênio, fosfates e outros compostos contendo fósforo, potássio, cálcio, cádmio, magnésio, manganês, ferro e bom, entre outros.

O desempenha dos métodos da invenção dá plantas cultivadas sob condições não estressant.es ou sob condições de· seca branda rendimento 25 aumentado em relação às plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento em plantas cultivadas sob condições nâo estressantes ou sob condições de seca branda, método este que compreende modular a expressão em uma planta de urn ácido nucléico que codifica um pal i pept idco ARK 1..

O desempenho dos métodos da invenção dá em uma forma de realização plantas cultivadas sob condições de deficiência de nutriente, partie alarm ente sob condições dc deílcicnchi de nitrogênio, rendimento aumentado em relação ãs plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis.. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento em plantas cultivadas sob condições de deficiência de nutriente, método este que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ARKL. A deficiência de nutriente pode resultar de uma falta de nutrientes tais como nitrogênio, fbsfatos e outros compostos contendo fósforo, potássio, cálcio, câdmio, magnésio, manganês, fórro e boro, entre outros.

O desempenho dos métodos da invenção dá plantas culti vadas sob condições não estressantes ou sob condições de seca branda rendimento aumentado em relação às plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo cam. a preserve invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento em plantas cultivadas sob condições não estressantes ou sob condições de seca branda, método este que compreende modular a expressão em. uma planta de um ácido nucléico que codifica um pol ipeptídeo YTP.

O desempenho dos métodos da invenção dá plantas cultivadas sob condições de deficiência de nutriente,. partlcularmente sob condições de deficiência de nitrogênio, rendimento aumentado em relação às plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto» de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento em plantas cultivadas sob condições de deficiência de nutriente, método este que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo YTP. A deficiência de nutriente pode resultar de uma falta de nutrientes tais como nitrogênio, fòsiatos e outros compostos contendo fósforo, potássio, cálcio. cádmío, magnésio, manganês, fero e buro, entre outros.

A presente invenção abrange plantas ou partes destas (incluindo sementes) ou células destas obteníveis pelos metodus de acordo com a presente invenção. As plantas ou partes destas ou células destas compreendem um transgene de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRF, polipeptídeo equivalente a R.AA1, polípeptídeo SYR. polipeptídeo ARKL, e polipeptídeo YTP respectivamente como definido acima.

IO A invenção também fornece construções genéricas e vetores para facilitar a Introdução e/ou expressão aumentada cm plantas das sequências de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de:, polipeptídeo GRF, polipeptídeo equivalente a RAAl, polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARKL. e polipeptídeo YTP respectivamente.

As construções de gene podem ser inseridas em vetores, que podem ser comercialmente disponíveis, adequados para transformação em plantas e para a expressão do gene de interesse nas células transformadas. a invenção também fornece o uso de uma construção de gene como aqui definida nos métodos dá invenção.

Mais especificamente, a presente invenção fornece em uma forma de real ização uma construção que compreende:

(a) uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF' como definido acima:

(b) uma ou mais sequências de controle capazes de expressão crescente da sequência de ácido nucléico de (a); e opcionalmente (c) uma. sequência de terminação de transcrição.

Preferivelmente, a sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF c como definido acima. Os termos ^<4scquência de controle’* e ‘'sequência de terminação’* são como aqui definidos.

118

Preferivelmente, uma das sequências de controle de uma construção è nm promoror const iíuuvo íxoLulo de um genoma xcgctut l’m exemplo de um promotor constitutivo de planta é um promotor 'de (7( )82, preferivelmente um promotor do arroz de GOS2, mais preferivelmente um 5 promotor de GOS2 como representado pela SEQ 11.) NO: lt7.

Mais especificamente, a presente invenção fornece em uma forma de realização urna construção que compreende:

(d) um áddo nucléico que codifica um polipeptideo equivalente a R.AA1 como definido acima;

(e) uma ou mais sequências de controle capazes de direcionar a expressão da sequência de ácido nucléico de (a); e opcionalmente (í) uma sequência determinação de transcrição.

Preferivelmente, o ácido nucléico que codifica um polipeptideo equivalente- a RAA1 é como definido acima. O termo “sequência 15 de controle” e “sequência de terminação” são como aqui definidos.

Mais especificamente, a presente invenção fornece em uma forma de realização uma construção que compreende:

l. um ácido nucléico que codifica um polipeptideo SYR comí) defini do acima;

2. uma ou maís sequências de controle capazes de direcionar a expressão da sequência de ácido nucléico de (a); e opcionalmente

3. uma. sequência de terminação de transcrição.

Preferivelmente, o ácido nucléico que codifica um. polipeptideo SYR é como definido acima. O termo “sequência de controle” e 25 “sequência de terminação” são como aqui definidos.

Mais especificamente, a presente invenção fornece em uma forma dc realização uma construção que eomprccadm

l. um ácido nucléico que codifica um polipeptideo ARKL como definido acima;

110

2. uma ou mais sequências de controle capazes de direcionar a expre-s-Go da sequência de ácido nucleico de (a); e opcíonalmente

3. urna sequência de terminação de transcrição.

Preferi vel mente, o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ARKL é como definido acima. Os termos “sequência de controle” e “sequência de terminação” são como aqui definidos.

Mais específicamente, a presente invenção fornece em uma forma de realização uma construção que compreende:

L um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo YTP como definido acima;

2. uma ou mais sequências de controle capazes de direcionar a expressão da sequência de ácido nucleico de (a): e opcíonalmente

3. uma sequência de terminação de transcrição.

Preferivelmente, o ácido nucleico que codifica urn polipeptídeo YTP é como definido acima. Os termos “sequência de controle” c “sequcncia de terminação” sào como aqui defi.rudos.

As plantas são transformadas com um vetor que compreende qualquer uma das sequências de ácido nucleico descritas acima. O técnico habilitado está bem ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor de modo a transformar, selecionar e propagar com êxito células hospedeiras contendo a sequência de interesse. A sequência de interesse é operavelmente ligada a uma ou mais sequências du controle (pelo menos a um promotor).

Vantajosamente, qualquer tipo de promotor, seja natural ou sintético, pode ser usado para aumentar a expressão da sequência de ácido nuclèmo. Um promotor constitutivo é particulannente útil nos métodos, preferivelmente um promotor constitutivo isolado de um genoma vegetal. O promotor constitutivo de planta direciona a expressão de uma sequência codi.ficadora em um nível que está em iodos os casos abaixo daquele obtido ί 20 sob ο controle de um promotor viral do 35S CaMV,

Outros promotores específicos de órgão, por exemplo para a expressão preferida em folhas, hastes, tubérculos, meristemas. sementes (embrião e/ou eudospenna), são úteis na realização dos métodos da invenção.

Ver a seção “Definições” aqui contida para definições dos vários tipos de promotor.

Preferivelmente em urna forma de realização o promotor constitutivo também é um promotor ubíquo. Ver a seção “Definições'’ aqui contida para as definições dos vários tipos de promotor.

i 0 Deve estar claro que a aplicabilidade da presente invenção não é restrita, a uma sequência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo GRF. como representado pela. SEQ ID NO: 1, nem é a aplicabilidade da. invenção restrita à expressão de uma sequência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo GRF quando direcionada por um promotor constitutivo.

i5 Deve estar claro que a aplicabilidade da presente invenção não é restrita ao ácido nucléico que codifica o polipeptídeo equivalente a RAAI representado pela SEQ ID NO: 120, nem é a aplicabilidade da invenção restrita à expressão de um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo equivalente a RAAI quando direcionado por um promotor constitutivo.

O promotor constitutivo é preferivelmente um promotor de

GOS2, preferivelmente um promotor de GOS2 do arroz. Mais preferivelmente o promotor constitutivo é representado por uma sequência de ácido nucléico substancialmente similar à SEQ ID NO: 124, mais preferivelmente o promotor constitutivo é como representado pela SEQ ID 25 NO; 124 ou SEQ I'D NO: 211. De acordo com uma outra característica preferida da invenção, o promotor constitutivo é um promotor da Proteína de Mobilidade Rápida (11MGP), preferivelmente um promotor da HM.GP do arroz» mais preferivelmente de modo substancial similar á SEQ ID NO: 125. mais preferivelmente idêntica à SEQ ID NO: 125. Ver a Tabela '2 na seção “Def inições” aqui contida para mais exemplos de promotores constitutivos.

Deve <mtor clan? que a aplicabilidade da presente imençào nílo é restrita ao ácido nucléicn que codifica o polipeptideo SYR representado pela SEQ ID NO: 168, nem é a aplicabilidade da invenção resulta à expressão de um ácido mmléico que codifica o polipeptideo SYR quando direcionado por um promotor constitutivo,

O promotor constitutivo é preferivelmente um promotor de GOS2, preferivelmente um promotor de GOS2. do arroz. Mais preferivelmente o promotor constitutivo é representado por uma sequência de ácido nucléico substancial mente similar à SEQ ID NO: 172 ou SEQ ID NO: 211, mais preferivelmente o promotor constitutivo é como representado pela SEQ ID NO; 172 ou SEQ ID NO: 211. Ver a Tabela 2 na seção “Definições^ aqui contida para mais exemplos de promotores constitutivos úteis.

Deve estar claro que a aplicabilidade da presente invenção não é restrita ao ácido nucléico que codifica o polipeptídeo ARKL representado pela SEQ ID NO: 212, nem é a aplicabilidade da invenção restrita à expressão de um ácid.o nucléico que codifica o polipeptideo ARKL, quando direcionado por um promotor constitutivo, ou quando direcionado por um promotor específico de raiz.

O promotor constitutivo é preferivelmente um promotor de GOS2, preferivelmente um promotor de GOS2 do arroz. Mais preferivelmente o promotor constitutivo é representado por uma sequência de ácido nucléico substancialmente similar à SEQ ID NO: 406, mais preferivelmente o promotor constitutivo é como representado pela SEQ ID NO: 406 ou SEQ ID NO: 211. Ver a Tabela 2 na seção “Definições” aqui contida para mais exemplos de promotores constitutivos.

Deve estar claro que a aplicabilidade da presente invenção não é restrita ao ácido nucléico que codifica o polipeptideo YTP representado pela SEQ ID NO: I , nem c a aplicabilidade da invenção restrita à expressão de um ácido nudéico que codifica o polipeptídeo YTP quando direcionado por urn proí noter e onst i t u i i vo.

O promotor constitutivo é nreferivelmente um promotor de Λ:·.· .X ,·χ·

GQS2, preferivelmente um promotor de GOS2 do arroz. Mais preferivelmente o promotor constitutivo ê representado por uma sequência de ácido nucléico substaneialmente similar ã SEQ ID NO: 548, mais preferivelmente o promotor constitutivo è como representado pda. SEQ ID NO: 548 ou SEQ ID NO; 21 L Ver a Tabela 2 na seção “Definições'’ aqui contida para mais exemplos de promotores constitutivas.

lô Opcionalmente. uma ou mais sequências terminadoras podem ser usadas na construção introduzida em uma planta.. Os elementos reguladores iniciais podem incluir aumentadores transcricionais assim como tradueionais. Aqueles habilitados na técnica estarão dentes de sequências iermmadoras e aumentadoras que podem ser adequadas para o uso na 1S realização da invenção. Uma sequência de intron também pode ser adicionada à região não traduzida 5’ (UTR) ou na sequência codifieadora para aumentar a quantidade da mensagem madura que acumula no citosol, como descrito na seção definições. Outras sequências de controle (além do promotor, aumentador, silenciador, sequências de intron, regiões 3‘UTR e/ou 5'UTR) 2.0 podem, ser elementos de estabilização de proteína e/ou RNA. Tais sequências seriam conhecidas ou podem ser facilmente obtidas por uma pessoa habilitada ; na técnica,

Opcionalmente, uma ou mais sequências terminadoras podem ser usadas na construção introduzida em uma planta. Preferivelmente, a 25 construção compreende um cassete de expressão essencialmente similar ou idêntico à S.EQ ID NO: 166, que compreende o promotor de GOS2, o ácido nunlèieo que codifica o polipeptídeo equivalente a RAAl. Em uma forma dc realização alternativa, a construção compreende um cassete de expressão essencialmente similar ou idêntica à SEQ ID NO: 167, que compreende o promotor de HMGP, o ácídn nuciéico que codifica o polipeptídeo equivalente aRAA1.

Opcionalmente, uma nu mais sequências tmnmadoms podem ser usadas na construção introduzida em uma planta. Preferivelmente, a construção compreende um cassete dc expressão essenciahucute similar ou idêntico à SEQ ID NO: 407. que compreende o promotor de GOS2, o ácido nuciéico que codifica o polipeptídeo Orysa-ARKLl e a sequência terminadora de transcrição de T-zeína -t T-rubisco.

Opcionalmente, uma ou mais sequências termínadoras podem ser usadas na construção Introduzida em uma planta. Preferivelmente, a construçâo compreende um cassete de expressão essenciaImente similar ou idêntica à SEQ ID NO: 549, que compreen.de o promotor de GOS2, o ácido nuciéico que codifica o polipeptídeo YTP e a sequência terminadora de transcrição de T-zeína r T-rubisco.

Os elementos reguladores iniciais podem incluir realçadores transcrícionais assim como traducíonais. Aqueles habilitados na técnica estarão cientes de sequências terminadoras e realçadoras que podem ser adequadas para o uso na realização da invenção. Uma sequência de intron também pode ser adicionada à região 5' não traduzida (UTR) ou na sequência codificador» para aumentar a quantidade da mensagem madura que acumula no citosol, como descrito na seção de definições. Outras sequências de controle (além do promotor, realçador, silenciador, sequências de intron, regiões 3TJTR e/ou 5TJTR) podem ser proteína e/ou elementos estabilizadores de RNA. Tais sequências seriam conhecidas ou podem ser facilmente obtidas por uma pessoa habilitada na técnica.

As construções genéticas da invenção podem incluir ainda utna sequência dc origem de replicaçào que é requerida para a manutenção e/ou rcplicação em um tipo de célula específico. Um exemplo é quando uma construção genética é requerida ser mantida em uma célula bacteriana como um elemento genètíeu epissmnico (por exemplo, mukxmhi de pbsmideo ou cosmideo). As origens preferidas de rcplicação inchiem, mas não são limitadas a fl-on eccIEI.

Para a detecção da transferência bem sucedida das sequências de ácido nucléico como usadas nos métodos da invenção e/uu a seleção de plantas transgêmcas que compreendem estas sequências de ácido nucléico, é vantajoso usar genes marcadores (ou genes repórter). Portanto, a construção genética pode opcionalmente compreender um gene marcador seiccionâveh Os marcadores selecionáveis são descritos em mais detalhes na seção Definições* aqui contida.

Os genes marcadores podem ser removidos ou excisados da célula transgênica uma vez que elas não sejam mais necessárias. As técnicas para a remoção de marcador são conhecidas na técnica, as técnicas úteis são descritas acima na seção de definições.

E conhecido que na integração estável ou transitória das sequências de ácido nucléico em células vegetais, apenas uma minaria das células abosorve o DNA estranho e, se desejado, o integra dentro do seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e da técnica de transfecção usada. Para identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (tal como aqueles descritos acima) è usualmente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Estes marcadores por exemplo podem ser usados em mutantes nos quais estes genes não são funcionais, por exemplo, pela deleção pelos métodos convencionais. Além disso, as molecules dc sequência de ácido nucléico que codificam um marcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira nu mesmo vetor que compreende a sequência que codifica os polipeptídeos da invenção ou usado nos métodos da invenção, ou ainda em um vetor separado. As células que foram eslavelmcnte trans tecladas com a sequência de ácido nucléico introduzida podem ser identificadas por exemplo pela seleção (por exemplo, células que (êm integrado o marcador selecionável sobrevivem ao passo que as outras células morrem). Os genes marcadores podem ser tenuuídos ou exGsados da <èhda tmnsgemcu mnu vez que t'la> rdo são niao necessárias. As técnicas para a remoção de gene marcador são conhecidas no 5 ramo, as técnicas úteis são descritas acima na seção de definições.

A invenção também fornece um método para it produção de plantas transgênicas tendo características relacionadas com o rendimento aumentadas em relação às plantas de controle, que compreende a introdução e expressão em uma planta de qualquer sequência de ácido nucléico que 10 codifica um polípeptídeo selecionado do grupe que consiste de: polípeptídeo GR.F, polípeptídeo equivalente a RAA1, polípeptídeo SYR, polípeptídeo ARKL, e polípeptídeo YTP respectivamente como aqui acima definido.

Mais especiftcamente, a presente invenção fornece em uma forma de realização um método para a produção de plantas transgênicas tendo 15 características relacionadas com o rendimento aumentadas em relação às plantas d.e controle., método este que compreende:

íi) introduzir e expressar em uma planta, parte de planta, ou célula de planta uma sequência de ácido nucléico que codifica um polípeptídeo GR.F, sob o controle de promotor constitutivo de planta; c (íi) cultivar a célula de planta, parte de planta ou planta sob condições que promovam o crescimento e desenvolvimento da planta.

A sequência de ácido nucléico de (t) pode ser qualquer uma da sequências de ácido nucléico capaz de codificar um pdipepíideo GRF como aqui definido.

Mais especificamente, a presente invenção fornece em uma forma de realização um método para a produção de plantas transgênicas tendo características relacionadas com o rendimento realçadas aumentados, partieularmente bíomassa e/ou. rendimento de semente aumentados, método este que item preemie;

í) introduzir e expressar em uma planta ou célula de planta ura ácido nucléico que codifica o polipeptideo equivalente a RAAI; e

ÍÒ cultivar a célula de planta sob condições que promovam o crescimento e desenvolvimento da planta.

O ácido nucléico de (i) pode ser qualquer urn dos ácidos nudéicus capazes de codificar um polipeptideo equivalente a RAAl como aqui definido.

Mais especificameute, a. presente invenção fornece em uma forma de realização um método para a produção de plantas transgênicas tendo 10 características relacionadas com o rendimento realçadas aumentados, rendimento (semente) particularmente aumentado e/ou biomassa aumentada, método este que compreende:

(i) introduzir e expressar em uma planta ou célula de planta. um ácido nucléico que codifica o polipeptideo SYR; e (íi) cultivar a célula de planta sob condições que promovam o crescimento e desenvolvimento da planta.

O ácido nucléico de (i) pode ser qualquer um dos ácidos nuclétcos capazes de codificar um polipeptideo SYR. como aqui definido.

Mais especificamenle, a presente invenção fornece em uma 20 forma de realização um método para a produção de plantas tnmsgênicas tendo características relacionadas com o rendimento realçadas aumentados, parlíeularmente rendimento (semente) aumentado, método este que compreenda;

(i) introduzir e expressar em uma planta ou célula de planta um ácido nucléico que codifica o polipeptideo ARKL; e (?i) cultivar a célula de planta sob condições que promovam o crescimento e desenvolvimento da planta.

O ácido nucléico de (i) pode ser qualquer um dos ácidos nucléicos capazes dc codificar um polipeptideo ARKL como aqui definido.

Mais aspect ficamente, a presente invenção fornece cut uma forma de realização um método para a prndução de plantas transgcuicas tendo características relacionadas com o rendimento realçadas aumentados, particulannente rendimento (semente) aumentado, método este que compreende:

i) introduzir e expressar em uma. planta ou célula de planta, um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo YTP; s li) cultivar a célula de planta sob condições que promovam o crescimento e desenvolvimento da planta.

O ácido nucléico de (i) pode ser qualquer um dos ácidos nucléicos capazes de codificar um polipeptídeo YTP como aqui definido,

Λ sequência de ácido nucléico pode ser introduzida diretamente em uma célula de planta ou na. própria planta (incluindo a introdução em um tecido, órgão ou qualquer outra parte de uma planta). De 15 acordo com uma característica preferida da presente invenção, a sequência de ácido nucléico é preferivelmente introduzida em uma planta pela transformação. O termo “transformação*’ é descrito em mais detalhes na seção “Definições” aqui contida.

As células vegetais geneticamente modificadas podem ser 20 regenerarias via todos <ís métodos com que o trabalhador habilitado está familiarizado. Os métodos adequados podem ser encontrados nas publicações supracitadas por S. D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hõfgen e Willmitzer.

No geral depois da transformação, as células vegetais ou agrupamentos de célula são selecionadas quanto a presença de um ou mais 25 marcadores que são codificados pelos genes expressa ve is em planta cotransferidos com o gene de interesse, a seguir do que o material transformado é regenerado em uma planta integral, Para selecionar plantas transformadas, o material de planta obtido na transformação é, como uma. regra, submetido às condições selecionativas de modo que as plantas transformadas possam ser dhtinguidas das plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas na maneira descrita, acima podem ser plantadas e. depois dc um permeo de crescimento inicia.!, submetidas a uma seleção adequada pela pulverização. Lima outra possibilidade consiste em cultivar as sementes, se apropriado depois da esterilização, etn placas de àgar usando um agente de seleção adequado de. modo que apenas as sementes transformadas possam crescer em plantas. Ahemativarnente, as plantas transformadas são tríadas quanto a presença de um marcador selecionável tal como aqueles descritos acima.

A seguir da transferência de DNA e regeneração, as plantas putativamente transformadas também podem ser avaliadas, por exemplo usando a análise de Southern, quanto a presença do gene de interesse, numero de cópia e/ou organização genômica. Alternativa ou adicmnaímente, os nivets de expressão do DNA recém introduzido pode ser monitorado usando a análise de Northern e/ou Western, ambas as técnicas sendo bem conhecidas pelas pessoas lendo habilidade comum na técnica.

As plantas transformadas generadas podem ser propagadas por uma variedade de meios, tal como pela propagação clonal ou técnicas de procriação clássicas. Por exemplo, urna planta transformada da primeira geração (ou Tl) pode ser auio-polinizada e os transformantes de segunda generaçâo homozigotos (ou T2) selecionados, e as plantas T2 podem ser depois propagadas ainda através das técnicas de cruzamento clássicas. Os organismos transformados gerados podem tomar uma. variedade de formas. Por exemplo, elas podem ser quimeras de células transformadas e células não transformadas: tnmsibrmanl.es elonais (por exemplo, todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, em plantas, urn rizorna transformado cnxeríaclo a uma progênie nâo transformada).

A presente invenção claramente estende-se a qualquer célula de planta ou planta produzidas por qualquer um dos métodos aqui descritos, e

129 π nates αχ pnaen de plantes e sens propagules. A premente invenção estende-se ainda para abranger a progenic de πηκι cdula, teeid«>, orga»» nu plante integral primários transformados ou transfcctados que foram produzidos por qualquer um dos métodos supracitados, a única exigência sendn que a progênic exiba 5 a(s) mesma(s) caractenstica(s) genotipicaCs) e/ou fenoíipica(s) como aquelas produzidas pelo precursor nos métodos de acordo com a invenção.

A invenção também inclui células hospedeiras contendo uma sequência de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRF, polipeptídeo equivalente a 10 RAAI, polipeptídeo SYR. polipeptídeo A.RKL, e polipeptídeo YTP respectivamente como aqui acima definido, operavelmenle ligado a um promotor constitutivo de planta. As células hospedeiras preferidas de acordo com a invenção são células vegetais, As plantas hospedeiras para as sequências de ácido nucléico ou o vetor usado no método de acordo com a 15 invenção, o cassete de expressão ou construção ou vetor são, em principio, vantajosamente todas as plantas, que são capazes de sintetizar os pdipepüdeos usados no método da invenção.

Os métodos da invenção são vantajosamente aplicáveis a qualquer planta. As plantas que são particularmente úteis nos métodos da 20 Invenção incluem todas as plantas, que pertencem à superfamília Frrir&cnrune, em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo forragem ou legumes íbrrageiros, plantas ornamentais, safras alimentícias, árvores ou arbustos. De acordo com uma forma de realização preferida, da presente invenção, a plante é uma planta de safra. Os exemplos 25 de plantas de safra incluem soja, girassol, canola, alfaia, colza, algodão, tomate, batata e tabaco. Mais preferi ve,Imente, a plante é uma planta monoootiledônea. Os exemplos de plantas monocotiledõneas incluem cana de açúcar. Mais preferivelmente a planta é um cereal. Os exemplos de cereais incluem arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, trítícale, sorgo, «wer,

130 spe/p seaale, umÂom, /ç/g nulo e aveia.

A invenção também estende-se ainda às partes colhiveis de uma planta que compreende uma sequência de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo 5 GRF, polipeptídeo equivalente a RAAI, polipeptídeo S¥R, polipeptídeo .ARKL, e polipeptídeo YTP respectivamente (como aqui acima definido) operavelmente ligada a um promotor constitutivo de planta, tal como, mas não limitadas a sementes, folhas, frutos, flores, hastes, rizomas, tubérculos e bulbos. A invenção além disso diz respeito aos produtos derivados, 10 preferivelmente díretamente derivados, de uma parte oolhível de um tal planta, tal como pelotas secas ou pós. óleo, gordura e ácidos graxos, amido ou proteínas.

De acordo com uma característica preferida da invenção, a expressão modulada é a expressão aumentada. Os métodos para aumentar a 15 expressão de ácidos nucléicos ou genes, ou produtos de gene, são bem documentados na técnica e os exemplos sâu fornecidos na seção de definições.

Como acima mencionado, um método preferido para aumentar a expressão de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo 20 selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRF, polipeptídeo equivalente a RAAI, jxdipeptídeo SYR, polipeptídeo ARKL, e polipeptídeo YTP respecti.vam.en.te é pela introdução e expressão em uma planta de· uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRF, polipeptídeo equivalente a RAAI, 25 polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARKL., e polipeptídeo YTP respeetivamente; entretanto os efeitos de realizar o método, isto é, aumentar características relacionadas com o rendimento, também podem ser obtidos usando outra?* técnicas bem conhecidas, incluindo mas não limitadas a rotulação da ativação de T-ONA, TILLING, recombinação homóloga. Uma descrição destas

Hvmra·' e fornecida ua seção de delmkmm

Λ presente invenção também abrange em uma forma de realização o uso das sequências de ácido nucléico que codificam polipeptideos GRF como aqui descritos e o uso destes jxilipeptideos GRF no aumento de qualquer um dos traços supracitados relacionados com o rendimento em plantas, sob condições de cultivo normais, sob condições de cultivo de estresse abiótlco (preferivelmente condições de cultivo em estresse osmótico), e sob condições de disponibilidade de nutriente reduzida, preferivelmente sob condições de disponibilidade de nitrogênio reduzida.

A presente invenção também abrange em uma forma de realização o uso de ácidos nuclèicos que codificam polipepíideos equivalentes a RAA1 corno aqui descritos e uso destes polipepíideos equivalentes a RAAl no realce de qualquer um dos traços supracitados relacionados com o rendimento em plantas.

A presente invenção também abrange em uma forma de realização o uso de ácidos nuclèicos que codificam polipepíideos SYR corno aqui descritos e o uso destes polipepíideos SYR no realce de qualquer um dos traços supracitados relacionados com o rendimento em plantas quando cultivadas sub condições de estresse abióúco.

Á presente invenção também abrange em uma forma de realização o uso de ácidos nuclèicos que codificam os polipepíideos A.RKL como aqui descritas e a uso destes polipepíideos ARKL no realce de qualquer um dos traços supracitados relacionadas com o rendimento em plantas.

A presente invenção também abrange em uma forma de realização o uso de ácidos nuclèicos que codificam os polipepíideos YTP como aqui descritos e o uso destes polipeptideos YTP no realce de qualquer um dos traços supracitados relacionados com o rendimento em plantas.

A.s sequências de ácido nucléico que codificam um polipeptideo selecionado do grupo que consiste de: polipeptideo GRF.

132 polipeptideo equivalente a RAAI, pollpeptídeo SYR, polipepííden ARKL, c pollpeptídeo YTP respect ívamente, aqui descritos. ou os próprios polipeptídeos da invenção, podem eneonlrar uso em programas de procriação em que um marcador de DNA é identificado que pode ser geneticamente 5 ligado a um gane que codifica o pollpeptídeo GRF. Os genes/sequéncias de ácido nucléico, ou o polipeplídeo GRF, pollpeptídeo equivalente a RAAI, pollpeptídeo SYR, pollpeptídeo ARK.L, e polipeplídeo YTP respeclivamente, eles próprios podem ser usados pare definir um marcador molecular. Este DNA ou marcador de proteína podem ser usados em programas de procriaçào 10 para selecionar planta?) tendo características relacionadas com o .rendimento aumentadas, corno aqui acima definidos nos métodos da invenção.

As variantes alélicas de um gene/sequência de ácido nucléico que codifica um polipeplídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptideo GRF. polipeptideo equivalente a RAAI, pollpeptídeo SYR, 15 pollpeptídeo ARKL, e pollpeptídeo YTP respeclivamente também pode encontrar uso em programas de procríação assistida por marcador. Tais programas de cruzamento algumas vezes requerem a introdução de variação alélica pelo tratamento mutagênico da?) plantas, usando por exemplo a mutagenese EMS; altemativamente, o programa pode começar com uma 20 coleção das variantes alélicas da chamada origem “natural causada de modo nào intencional A identificação das variantes alélicas depois ocorre, por exemplo, pela PCR. Isto é seguido por uma etapa para a seleção de variantes alélicas superiores da sequência em dúvida c que dá earacterístleas relacionadas com o rendimento aumentadas. A seleção é tipicamente realizada 25 monitorando-se o desempenho de crescimento de plantas comendo variantes alélicas diferentes da sequência em dúvida. O desempenho de crescimento pode ser monitorado em uma estufa ou no campo. Outras etapa?) opcionais incluem cruzar plantas nas quais a variante aléfico superior foi identificada com uma outra planta. Isto pode ser usado, por exemplo, para fabricar n.ma combinação de características fenotípicas interessantes.

As sequências de: ácido nucléico que codificam polipeptídeo selecionado do grope que consiste de: polipeptídeo GRF. polipeptldcu equivalente a RA.A'1, polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARK.L, e polipeptídeo YTP respect ivamente também podem ser usadas como sondas para mapear genética e fiscamente os genes dos quais eles são uma parte, e como marcadores para traços ligados a aqueles genes. Tal informação pode ser útil na procriação de planta de modo a desenvolver linhagens com fenótípos desejados. Tal uso das sequências de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRF, polipeptídeo equivalente a RAA1, polipeptídeo SYR, polipeptídeo A.R.KL, e polipeptídeo YTP respeelivamente requer apenas uma sequência de ácido nucléico de pelo menos 15 nucleolideos no comprimento. A sequências de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRF, polipeptídeo equivalente a RAAI> polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARKL, e polipeptídeo YTP respectivamente podem ser usadas como marcadores de polimorfimo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), Southern blots (Sambrook J, Fritsch EF e Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de DMA genômico de planta digerido com restrição podem ser sondados com as sequências de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRF, polipeptídeo equivalente a RAAI, polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARKL., e polipeptídeo YTP respectivameute. Os padrões de formação de faixa resultantes podem ser depois submetidos às análises genéticas usando programas dc computador tais corno MapMaker (Lander e? o/. (1987) Genomics 1: 174-181) de modo a construir um mapa genético. Além disso, as sequências de ácido nucléico podem ser usadas para sondar Southern blots contendo DNAs genômicos tratados corn endonuclease de restrição de um conjunto de indivíduos que representam precursor e progênie de um cruzamento genético definido. A segregação dos pclimorfismos de DNA é mencionada e usada para calcular a posição da sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF no mapa genético previamente obtido usando esta população (Butstein e/ oZ. (1980) 5 Am. J. Hum. Genet. 32; 314-331).

A produção e o uso de sondas derivadas de gene vegetal para o u?>u no mapeamento genético é descrita em Bernatzky e Tanksley (1986) Plant Mot Biol. Reporter 4: 37-41. Numerosas publicações descrevem ο mapeamento genético de clones de cDNA específicos usando a metodologia 10 esboçada acima ou variações destas. Por exemplo, populações de iniemruzamenlos F2> populações retrocruzadas, populações aleatoriamente acasaladas, linhagens quae isogêníeas, e outros conjuntos de indivíduos podem ser usados para o mapeamento. Tais metodologias são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

As sondas de sequência de ácido nucléico também podem ser usarias para o mapeamento físico (isto é, colocação das sequências nus mapas físicos; ver Hoheisel e? nZ. Em: Non -mamma Kan Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, e referências citadas neste).

Em. urna outra forma de realização, as sondas de sequência de ácido nucléico podem ser usadas no mapeamento da híbridização pela fluorescência direta srrn (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149 154). Embora métodos correntes de mapeamento FISH favoreçam o uso de clones grandes (diversos kb a. diversas centenas de kb; ver Laan f.rt uà (1995) 25 Genome Res. 5: I3-20), melhoras na sensibilidade podem permitir o desempenho do mapeamento FISH usando sondas mais curtas.

Uma variedade de mèíodos com base na amplificação da sequência de ácido nucléico para os mapeamentos genético e físico pode ser realizada usando as sequências de. ácido nucléico. Os exemplos incluem amplificação especifica dc aiclo (Kazazian (19891 A Lab. Clin. Med 1.1: 9596), polimrfismos dc fragmentos amplificados pela PCR (CAPS; Sheffield eZ al (PAR) Genomic 16: ligação especificado aiclo (l.andegren r?

iiL (1986) Science 241: 1077-1080). reaç-ôcs dc extensão de nudeotideo (Sokolov (1990.1 Nudetc Acid Sequence Res. 18: 3671), Radiations Hybrid Mapping (Walter A a/. (1997) Nat. Genet. 7: 22--28) e Happy Mapping (Dear e Conk (1989) Nucleic Acid Sequence Res. 17: 6795-6807). Para estes métodos, a sequência de ama sequência de ácido nucléico é usada para planejar e produzir pares dc inidador para o uso na reação de amplificação ou em reações de extensão de inidador. O planejamento de tais iniciadores é bem conhecido por aqueles habilitados na técnica. Em métodos que utilizam mapeamento genético com base na PCR. pode ser necessário identificar diferenças de sequência de DNA entre os precursores do cruzamento de mapeamento na região que corresponde à presente .sequência de ácido nucléico. Isto, entretanto, no geral não é necessário para os métodos de mapeamento.

Os métodos de acordo corn a presente invenção resultam em uma forma de realização em plantas tendo características relacionadas com o rendimento aumentadas, como aqui anteriormente descritos. Estes traços também podem ser combinados com outros traços economicamente vantajosos, tais como outros traços que aumentam o rendimento, tolerância aos estresses abíoticos e bióticos, tolerância aos herbicidas, inseticidas, traços que modificam várias características arquiteturais e/ou características bioquímicas e/ou fisiológicas.

Os métodos de acordo com a presente invenção resultam em tuna forma dc realização em plantas tendo características relacionadas com o rendimento realçadas, como aqui anteriormente descritos. Estes traços também podem ser combinados com outros traços economicamente vantajosos, tais como outros traços que realçam o rendimento, tolerância a outros estresses abiotieos e biòticos. nacos que umdincam vari caracteríslícas arquiteturais e/ou características bioquímicas e/ou fisiológicas.

Gs métodos para o empílhamento de geme errs plumas transgênicas são bem conhecidos na técnica (ver por exemplo. uma revisão pur Halpin (2005) Plant Biotech J (3): Μ1-155. O empilhamemo de gene pode se processar pelas etapas interativas, onde dois ou mais transgenes podem ser sequencíabnentc introduzidos em uma planta pelo cruzamento de uma planta contendo um transgene corn indivíduos que abrigam outros transgenes ou. alternativamente, pela re-transfòrmaçío (ou supertransformação) de uma planta contendo um transgene com novos genes. Uma limitação do procedimento iterative é que os transgenes não são ligados e serão localizados em locais aleatórios diferentes no genorna vegetal. A consequência é que os dois .locais podem segregar-se separadamente em gerações subsequentes, que tem consequências para os programas de procriacão.

Altemativarnente, o empilhaniento de gene pode ocorrer via co-transformação, que è mais rápido e pode ser usado em uma faixa integrai de técnicas de transformação. Quando do uso de transformação por Tgroòacrermn? por exemplo, os transgenes (pelo menos dois) podem estar presentes cm várias conformações:

(i) as sequências codi:fica.doras são fundidas para formar um único polipeptídeo quando iraduizidu e colocado sob o controle de um (mico promotor;

(ii) as sequências codificadoras sâo sequencialmente colocadas a jusante de um único promotor, separadas pelos sinais de ácido nucléico que influenciam a síntese de mRNA. (.sítios de entrada de ribossoma interno IRES, sinais de 2<A, etc.), ou síntese de polipeptídeo (poliproteinas separadas pelos sítios de substrato de protease, etc,);

(iii) as sequências codificadoras são índependentemente direcionadas pelos promotores separados. υ .as combi nações de pmmotorsequência codiíicadora estão localizadas dentro do mesmo T-DNA;

(iv) as sequências codificadoras são índependeniemente direcionadas pelos promotores separados, c as combi nações dc promotorsequência codificadota estão localizadas em T-DNAs diferentes no mesmo plasmídeo;

(v) as sequências codificadoras são independentemente direcionadas pelos promotores separados, e as combinações de promotorsequência eodificadora estão localizadas em T-DNAs diferentes nos plasmideos diferentes hhospedados na mesma ou em cepas de separadas.

Em uma outra .forma de realização, a presente invenção fornece um método para aumentai' características relacionadas com o rendimento em plantas em relação às plantas de controle, que compreende a expressão crescente em uma planta de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF e modular a expressão na mesma planta de uma sequência de ácido nucléico que codifica um segundo polipeptídeo.

Surpreendentemente, foi agora descoberto que a expressão crescente em uma planta de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF dá plantas tendo características relacionadas com o rendimento aumentadas em relação às plantas de controle. De acordo <mm. uma primeira forma de realização, a presente invenção fornece um método para aumentar características relacionadas com o rendimento em plantas em relação às plantas de controle, que compreende a expressão crescente em uma planta de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF.

Em uma forma de realização a invenção diz respeito á matéria objeto resumida como segue;

l. Um método para aumentar características relacionadas com o rendimento em plantas em relação às plantas de coníroie. que compreende a expressão crescente em uma planta dc uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo do Fator Regulador do Crescimento (GRF). polipeptídeo GRF este que compreende; (i) um domínio tendo pelo .menos 50 %, 55 35, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 30 36, 85 %, 90 %, 95 %_? 98 %. 99 % ou mais de identidade de sequência de aminoácido a um domínio QLQ como representado pela SEQ ID NO: 115; e (ü) um domínio tendo pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência de ammoácído a um domínio WRC como IO representado pela SEQ ID NO? El6, e opcíonalmente selecionar quanto as plantas tendo características relacionadas corn o rendimento aumentadas.

2. Método de acordo com o item 1, em que o dito polipeptídeo GRF compreende: (i) um domínio QLQ com um acesso InterPro IPRO .14978 (acesso PFAM PF08880); (li) um domínio WRC corn um acesso InterPro

IPRO 14977 (acessa PFAM PF08879); e (líi) um domínio Efetor de Transcrição (ET) que compreende três resíduos Cys e um Hís em um espaçamento conservado (C.X9C.X 10CX2I1).

3. Método de acordo com os itens 1 ou 2, em que o dito polipeptídeo GRF tem em ordem crescente de preferência pelo menos 50 %,

55 %, 6() %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 H, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência de aminoácido para o polipeptídeo Ci.RF como representado pela SEQ ID NO: 2 ou a qualquer uma das sequências depolipeptídeo dadas na Tabela A aqui contida.

4. Método de acorda com qualquer item precedente, em que a 25 dita sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo GRF é representado por qualquer uma das sequências de ácido nucleico SEQ ID NOs dadas na Tabela A ou uma porção destas, ou uma sequência capaz dc híbridlzar com qualquer uma das sequências de ácido nucléíco das SEQ ID NOs dadas na 'Fabela A.

139

5. Método de acordo com qualquer item precedente» em que a dita sequência de áoido nucléico codifica um ortólogo ou paráíogo de qualquer uma das sequências de polipeptídeo SEQ ID NOs dadas na Tabela A.

6. Método de acordo com qualquer item precedente, em que a dite. expressão aumentada è efetuada por qualquer urna ou mais de? rotulação da ativação de T-DNÁ, TILLING, ou recotnbinação homóloga.

7. Método de acordo com qualquer item precedente, em que a dita expressão aumentada é efetuada pels introdução e expressão cm uma plante de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF.

8. Método de acordo com qualquer item precedente, em que o dito traço relacionado com o rendimento ai.iment.ado é um ou mais de; (i) vigor inicial aumentado; (ii) biomassa acima do solo aumentada; (iii) rendimento de semente total aumentado por planta; (iv) taxa de enchimento de semente aumentada; (v) índice de colheita aumentado; ou (vi) peso de mil sementes aumentado (TKW).

9. Método de acordo com qualquer item precedente, em que a dite sequência de ácido nucléico é operavelmente ligada a um promotor constitutivo, preferivelmente a um promotor constitutivo de planta, mais preferivelmente a um promotor de GOS2, mais preferivelmente a um promotor de GOS2 do arroz como representado pela SEQ ID NO: 117.

10. Método de acordo com qualquer hem precedente, em que a dita sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF é de origem vegetei, preferivelmente de uma planta dicotiledônea, mais preferivelmente da. família Rnrssfeoceue. mais preferivelmente de /107 6 idqpx ó I .òo /in «o.

IL Plantas, partes destes (incluindo sementes), ou células vegetais obteníveis por um método de acordo com qualquer item precedente.

cm que a ditei phmtu, parte ou cchíla desía compreende um transgene de ácido nudéko isolado que codifica urn pclipepiídec GRF operavchnenie ligado a um promotor constitutivo de planta.

12. Construção que compreende?

1. Uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF como definido em qualquer um dos itens de i a 5:

2. uma ou mais sequências de controle capazes dc direcionar a expressão da sequência de ácido nucléico de (a); e opcionalmente

3. um sequência de terminação de transcrição.

13. Construção de acorria com o item 12, em que a dita sequência de controle é urn promotor constitutivo de planta, preferivelmente um promotor de GOS2, mais preferivelmente um promotor de GOS2 como representado pela SEQ ID NO: 1)7.

14. Uso de uma construção de acordo com os itens 12 ou 13

1S em um método para fabricar plantas tendo características relacionadas com o rendimento aumentadas em relação às plantas de controle, características relacionadas com o rendimento aumentadas estes que são um ou mais de: (i) vigor inicial aumentado; (ii) biomassa acima do solo aumentada; (iii) rendimento de semente totul aumentado por planta; (ív) taxa de enchimento 20 de semente aumentada; (v) índice de colheita aumentado; ou (vi) peso de mil sementes aumentado (TKW).

15. Planta, parte de planta ou célula de planta transformadas com uma construção de acordo com o item 1. 2 ou 1.3.

16. Método para a produção de plantas transgênicas tendo 25 características relacionadas com o rendimento aumentadas em relação às plantas de controle, que compreende:

(i) introduzir e expressar cm uma planta, parte de planta, ou célula de planta, uma sequência de ácido nucléico que codifica urn polipeptideo GRF como definido em qualquer um do?? itens de 1 a 5, sob o

141 controle de promotor constitutivo de planta; e (il) cultivar a célula de planta, parte de planta, ou planta sob condições que promovam o crescimento e desenvolvimento da planta.

17. Planta transaênica tendo características relacionadas corn o rendimento aumentadas em relação às plantas de controle, que resultam da expressão aumentada de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptideo GRF como definido em qualquer um dos itens de 1 a 5, opera ve Imente ligada a um promotor constitutivo de planta, ou uma célula de planta transgêmea ou parte de planta trattsgenica derivada, da dita planta transgàtica.

18. .Planta transgâmea de acordo com os itens 11, 1.5 ou 17, em que a dita planta é uma planta de safra ou uma monocotiledônea ou um cereal, tal como arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, tritícale, sorgo e aveia, ou uma célula de planta transgênica derivada, da dita planta transgêmea.

19. Partes colhíveis que compreendem uma sequência de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptideo GRF' de uma planta de acordo com o item 18, em que as ditas partes colhíveis são preferivelmente sementes.

20. Produtos derivados de uma planta de acordo com o item 18 e/ou de partes colhiveis de uma planta de acordo com o item 19.

21.. Uso de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptideo GRF como definido em qualquer um dos itens de I a 5 no aumento de características relacionadas com o rendimento, que compreende um ou mais de: (i) vigor inicial aumentado; (ii) biomassa acima do solo aumentada; (iii) rendimento de semente total aumentado por planta; (iv) taxa de enchimento de semente aumentada; (v) índice de colheita aumentado; ou (ví) peso de mil sementes aumentado (TKW).

Em uma forma de realização a invenção diz respeito à matéria objeto resumida como segue:

22. Um método para realçar características relacionadas com o rendimento em plantas em relação ás plantas de controle, que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptideo equivalente a RAAI, em que o díio polipeptideo equivalente a RAAI compreende dois ou mais dois seguintes motivos:

(i) motivo 1: GVW(V/L)F (SEQ ID NO: 162), (ü) motivo 2: LGW(E/S)RY(Y/F) (SEQ ID NO: 163), (iü) motivo 3: (I>dI)l..(L/I)S(IA</L)P(OGTJm)(S/D)F (SEQ ID NO: 164), (iv) motivo 4; (HAQÍF_;%1)YD(V/l)VVK(Nn'WP) (SEQ ID NO: 165),

23. Método de acordo com o item 22, em que o dito polipeptideo equivalente a RA.A1 além disso tem um PM. entre 10 e 2.1 KDa e um pi acima de 8,5.

24. Método de acordo com os itens 22 cm 23, em que a dita expressão modulada é efetuada pela introdução e expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptideo equivalente a RAAI.

25. Método de acordo com qualquer item precedente, em que o dito ácido nucléico que codifica um polipeptideo equivalente a RAAI codifica qualquer um das proteínas listadas na Tabela A ou é uma porção de um tal ácido nucléico., ou um ácido nucléico capaz de hibridizar com um tal ácido nucléico,

26. Método de acordo com qualquer item precedente, em que a dita sequência de ácido nucléico cod.ifi.ua um. ortólogo ou. parálogo de qualquer urna das proteínas dadas na Tabela A.

27. Método de acordo com qualquer item precedente, em que as ditas uaracterísticas relacionadas com o rendimento realçadas compreendem rendimento aumentado, preferivelmente biomassa aumentada e/ou rendimento de semente aumentado em relação ás plantas de controle.

28. Método de acordo com qualquer um dos itens de 22 a 27,

143 cm que as ditas características relacionadas com o rendimento realçadas são obtidos sob condições não estressantes.

29. Método de acordo cora qualquer um dos itens de 22 a 27, em que as ditas características relacionadas com c rendimento realçadas são obtidos sob condições de deficiência de nitrogênio.

30. Método de acordo com qualquer um dos itens ds 24 a 29, em que o dito ácido nucléico é operavelmente ligado a um promotor COnStitUtivO;

3L Método de acordo com o item 30, em que o dito promotor 10 constitutivo é um promotor de GOS2 ou um promotor de HMGP, preferivelmente urn promotor de GOS2 ou promotor de HMGP do arroz.

32. Método de acordo com qualquer item precedente, em que o dito ácido nucléico que codifica um polípeptídeo de RAAl é de origem vegetal, preferivelmente de uma planta dicotiledõnea, mais preferivelmente da família /Moucoe, mais preferivelmente do gênero Oryzí?, mais preferivelmente de On w sorivo.

33. Planta ou parte desta, incluindo sementes, obteníveis por um método de acordo com qualquer item precedente, em que a dita planta ou parte desta compreende um ácido nucléico recombínante que codifica um polípeptídeo equivalente a RAA1.

34. Construção que compreende:

(i) ácido nucléico que codifica um polípeptídeo equivalente a RAAl;

(n) uma ou mais sequências de controle capazes de direcionar 25 a expressão da sequência de ácido nucléico de (a); e opcionalmente (iii) uma sequência de terminação de transcrição.

35. Construção de acordo com o item 34, em que uma das ditas sequências de controle ê um promotor constitutivo.

36. Construção de acordo com o item 35, em que o dito

144 promotor eonstkimvo é u.m promotor de GOS2 ou um promotor de H.M.GP, preferivelmente um promotor de GGS2 ou um promotor de HMGP do arroz.

37. Uso de uma construção de acordo com qualquer um dos itens de 34 a 36 em um método para fabricar plantas tendo rendimento aumentado, particularmente biornassa aumentada e/ou rendimento de semente aumentado em relação às plantas de controle.

38. Planta, parte de planta ou célula de planta transformadas com uma construção de acordo com. qualquer um dos itens de 34 a 36.

39. Método para a produção de um planta transgênica tendo rendimento aumentado, particularmente biomassa aumentada e/ou rendimento de semente aumentado em relação às plantas de controle, que compreende:

(i ) introduzir e expressar em uma planta urn ácido nucléico que codifica um polipeptídeo equivalente a RAA1; e (ii) cultivar a célula tie planta sob condições que promovam o 15 crescimento e desenvolvimento da nlanta.

.....

40. Planta transgènica tendo rendimento aumentado, particularmente biomassa aumentada e/ou rendimento de semente aumentado, em relação às plantas de controle, que resultam da expressão modulada de urn ácido nucléico que codifica, um polipeptídeo equivalente a RAA1, ou uma.

célula de planta transgéntea deri vada da dita planta tnmsgérnca.

4L Planta transgénica de acordo corn os itens 33, 38 ou 39, ou uma célula de planta transgénica derivada desta, em que a dita planta é uma planta de safra ou. uma monocotlledônea ou um cereal, tal como arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, tríticale, sorgo e aveia.

42. Partes colhí veis de uma planta de acordo com o item 41, em que as ditas partes colhlveis são preferivelmente bio.ma.ssa de raiz e/ou sementes.

43. Produtos derivados de uma nlanta de acordo com o item 41 e/ou de partes colhlveis de uma planta de acordo com o 42.

a

44. Uso de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo equivalente a RAA1 no aumento do rendimento, panicuíannente no aumento do rendimento de semente e/ou biomassa de raiz em plantas, em relação às plantas de controle.

Em uma forma de realização a Invenção diz respeito à matéria objeto resumida como segue:

45. Um método para aumentar a resistência ao estresse abíóúco em plantas em relação às plantas de controle, que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo SYR, polipeptídeo SYR este que compreende um domínio rico em leucina, precedido pelo motivo de tripeptídeo conservado 5 (uma das SEQ ID NO: 173, 174. 175 ou 176)) e seguido pelo motivo conservado 6 (SEQ ID NO: 177). cm que a dita resistência ao estresse abí ótico aumentada é eficiência de captação de nutriente aumentada e/ou tolerância ao estresse de 15 seca aumentada, em relação âs plantas de- controle.

46. Método de acordo com o item 45, em que o dito polipeptídeo SYR tem, em ordem crescente de preferência, pelo menos 27 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %_s 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais de identidade de sequência corn o polipeptídeo SYR representado pela SEQ ID NO: 1.69.

47. Método de acordo com os itens 45 ou 46, em que o dito ácido nucléico que codifica um polipeptídeo SYRé representado por qualquer um dos ácidos nucléicos das SEQ II> NOs dadas na Tabela A ou uma porção destas, ou uma sequência capaz de hibrídizar com qualquer um dos ácidos nucléicos das SEQ ID NOs dadas na Tabela A.

48. Método de acordo com qualquer um dos itens de 45 a 47, em que a dita sequência de ácido nucléico codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das SEQ ID NOs dadas na. Tabela A.

49. Método de acordo com qualquer item precedente, em que a

14b dita proteína SYR além disso compreende o motivo conservado 7 (SEQ ID NO: 178).

50. Método de acordo com qualquer item precedente, em que a dita captação de nutriente eficiência resulta era rendimento de semente aumentado e/ou biomassa aumentada.

51. Método do item 50, em que o dito rendimento de semente aumentado compreende pelo menos peso total aumentado de sementes, Peso de Mil Grãos e/ou número de sementes cheias aumentado.

52. Método do item 50, em que a dita biomassa aumentada é biomassa de broto aumentada e/ou biomassa de raiz aumentada.

53. Método de acordo com qualquer item precedente, em que a dita eficiência de captação de nutriente aumentada ocorre sob condições de seca branda.

54. Método de acordo com qualquer item precedente, em que a dita tolerância ao estresse de seca aumentada resulta em rendimento de semente aumentado.

55. Método do item 54, em que o dito rendimento de semente aumentado compreende pelo menos o peso total de sementes, taxa de enchimento e/ou índice de colheita aumentados.

56. Método de acordo com qualqtter item precedente, em que a dita expressão modulada é efetuada pela introdução e expressão em uma planta de um ácido nuciéico que codifica um polipeptídeo SYR.

57. Método de acordo com o item 56, em que o dito ácido nuciéico é operavelmente ligado a um promotor constitutivo, preferivelmente a um. promotor de GOS2.

58. .Método de acordo com qualquer item precedente, em que o dito ácido nuciéico que codifica um polipeptídeo SYR. é de origem vegetal, preferivelmente de uma planta monocoiiledônea, mais preferivelmente, da família ZGrmenm mais preferivelmente do gênero Ortoo, mais preferivelmente

147 de Omm 5'<ϊίή·^!ό\

59. Uso de uma construção em um método para fabricar plantas tendo resistência ao estresse abiótico aumentada, a dita construção compreendendo x

(a) o ácido nucléico que codifica um polipeptideo SYR como definido em qualquer um dos itens de 45 a 49:

(b) uma ou mais sequências de controle capazes de direcionar a expressão da sequência de ácido nucléico de (a); e opcíonalmente (c) uma sequência de terminação de transcrição, e em que uma das ditas sequências de controle é um promotor constitutivo, preferivelmente um promotor de GOS2 e em que a dita resistência ao estresse abiótico aumentada é a eficiência de captação de nutriente aumentada e/ou tolerância ao estresse de seca aumentada, em relação às plantas de controle.

60. Uso de um ácido nucléico que codifica um polipeptideo

SYR em um método nara aumentar a resistência ao estresse abiótico em .i.' plantas em relação às plantas de controle, em que a dita resistência ao estresse abiótico aumentada é a eficiência de captação de nutriente aumentada e/ou a tolerância ao estresse de seca aumentada, em. relação às plantas de controle.

.20 61. Uso de acordo com o item 60, em que a dita eficiência de captação de nutriente aumentada resulta, em rendimento de semente aumentado e/ou biomassa aumentada.

62. Uso de acordo com o item 60, em que a dita tolerância ao estresse de seca aumentada resulta em rendimento de semente aumentado.

.2.5 Em uma forma de realização a invenção diz respeito à matéria objeto resumida como segue:

63. Um método para, realçar características relacionadas com o rendimento em plantas em relação às plantas de controle, que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um

148 polipeptídeo ARK L.

64. Método de acordo com o item 63, em que o dito polipeptídeo A.RKL compreende um ou mais dos seguintes domínios:

(i) Um domínio Z1'U'.1H2C3 como representado pela SEQ 1D NO: 400 ou um domínio tendo em ordem, crescente de preferência pelo menos 50 %, 55 %. 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %. 90 %, 95 % ou mais de identidade de sequência a um ou mais dos domínios ZÍC3H2C3 como representado pela SEQ ID NO: 95 à SEQ ID NO. 351; e (ii) Um domínio DA.R1 tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %. 95 % ou mais de identidade de sequência a um ou mais dos domínios PtamB2828 como representado pela SEQ ID NO: 352 à SEQ ID NO. 398.

65. Método de acordo com o item 63 e 64, em que o dito polipeptídeo ARKL compreende um ou mais dos seguintes:

(í) Um domínio ZfC3H2C3 como representado pela SEQ ID NQ: 401:

(ii) Um Motivo 8 como representado pela SEQ) ID NO: 399;

66. Método de acordo com o item 6.3 a 65, ern que a dita expressão modulada é efetuada, pela introdução e expressão em. uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ARKL.

67. Método de acordo com qualquer item precedente, em que o dito ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ARK.L codifica qualquer uma das proteínas listadas na Tabela A ou é uma porção de um ial ácido nucléico, ou um ácido nucléico capaz de hibridizar com u.m tal ácido nucléico.

68. Método de acordo com qualquer item precedente, em que a. dita sequência de ácido nucléico codifica, um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das proteínas dadas na Tabela A,

69. Método de acordo com qualquer item precedente, em que as ditas características relacionadas com o rendimento realçadas !49 compreendem rendimento aumentado, preferivelmente rendimento de semente aumentado em relação às plantas de controfe·.

70. Método de acordo com o item precedente, em que as ditas características relacionadas com o rendimento realçadas são obtidos sob condições não estressames.

71. Método de acordo com. o item precedente, em que as ditas características relacionadas com o rendimento realçadas sâo obtidos sob condições de estresse pela seca.

72. Método de acordo corn qualquer item precedente, em que o 10 dito ácido nucléico é operavelmente ligado a um promotor constitutivo, preferivelmente a um. promotor de GGS2_? mais preferivelmente a um promotor de GOS2 do atroz.

73. Método de acordo com qualquer item, precedente, em que o dito ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ARKL é de origem vegetal, preferivelmente de uma planta monocottledônea, mais preferivelmente da família Eouceac, mais preferivelmente do gênero mais preferivelmente de Onzn sort vo.

74. Planta ou parte desta, incluindo sementes, obteníveis por um método de acordo com qualquer item precedente, em que a dita planta ou parte desta compreende um ácido nucléico recombinante que codifica um pol ipeptídeo ARKL.

75. Construção que compreende:

(i) ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ARKL como definido nos itens 63 a 65;

(li) uma ou mais sequências de controle capaz de direcionar a expressão da sequência de ácido nucléico de (a); e opcionalmente (ni) uma sequência de terminação de transcrição.

76.. Construção de acordo com o item 75, em que uma das ditas sequências de controle é um promotor constitutivo, preferivelmente mn promotor de GOS2, mais preferivelmente um promotor de GOS2 do arroz.

77. Uso de uma construção de acordo com os itens 75 ou 76 em um método para fabricar plantas tendo características relacionadas com o rendimento realçadas preferivelmente rendimento aumentado, mais preferivelmente rendimento de semente aumentado em relação às plan tas de controle.

78. Planta, pane de planta ou célula. de planta transformadas com uma construção de acordo com os itens 75 ou 76,

79. Método para a produção de uma planta transgênica. tendo 10 rendimento aumentado, narticularmente rendimento de semente aumentado em relação às plantas de controle, que compreende:

(i) introduzir e expressar em urna planta urn ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ARKL como definido nos itens de 63 a 65; e (ii) cultivar a célula de planta sob condições que promovam o 15 cresci mento e desenvolvimento da planta.

80. Planta transgênica tendo rendimento aumentado, panicularmente rendimento de semente aumentado, em relação às plantas de controle, que resultam da expressão aumentada de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ARKL como definido nos itens de 6.3 a 65, ou um célula de planta transgênica derivada da dita planta transgênica.

8L Planta transgênica de acordo com. o item 74, 78 ou 80, ou uma célula de planta transgênica derivada deste, em que a dita, planta é uma planta de safra ou uma monocotiledônea ou um cereal, tal como atroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, iriticale, sorgo e aveia.

82. Partes colhí veis de uma planta de acordo eom o item 81, em que as ditas partes colhíveis são preferivelmente biomassa de raiz e/ou sementes.

83. Produtos derivados de uma planta de acorde eom o item 81 e/ou de partes colhíveis de uma planta de acordo com o item 82.

84. Uso de um ácido nucléico que codifica um polipeptideo ARKL. nue realça características relacionadas co?n o rendimento

£.. ':.x preIAtívUmente rendimento aumentado, mais preferivelmente rendimento de semente aumentado em relação ás plantas de controle.

Em uma forma de realização a invenção diz respeito à matéria objeto resumida como segue:

85. Um método para melhorar características relacionadas com o rendimento em plantas em relação às plantas de controle, que compreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucléico que codifica um polipeptideo YTP que compreende (i) pelo menos um domínio de transmembrana e (ii) pelo menos uma porção de um domínio DUF221

86. Método de acordo com o item 85, em que a dita porção tem em ordem crescente de preferência, pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % de identidade de sequência qualquer um dos domínios .representados pela SEQ ID NO: 518 à SEQ ID NO: 544.

87. Método de acordo corn os itens 85 ou 86, em que o dito ácido nucléico codifica um polipeptideo YTP tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, '75 %, 80 %, 85 H, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com qualquer um dos puhpeptídeos da. Tabela A,

88. Método de acordo com qualquer item precedente, em que o dito polipeptideo YTP compreende ainda o Motivo 9 (SEQ ID NO: 545).

89. Método de acordo com qualquer item precedente, em que a dita expressão modulada é efetuada pela introdução e expressão em uma planta de um áeido nucléico que codifica um polipeptideo YTP.

90. Método de acordo com qualquer item precedente, em que o dito ácido nucléico que codifica um polipeptideo YTP codifica qualquer uma das proteínas listadas na Tabela A ou é urna porção de um tal ácido nucléico, ou um ácido nucléico capaz de hibridizar com um tal ácido nucléico.

91. Método de acordo com qualquer Item precedente, em que a dita sequência de ácido nucléico codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das proteínas dadas na Tabela A. ou c uma porção de um tal ácido nucléico, ou um ácído nucléico capaz de hibridizar com um tal ácido nucléico.

92. Método de acordo com qualquer item precedente, em que as ditas características relacionadas com o rendimento realçadas compreendem rendimento aumentado, preferivelmente rendimento de semente aumentado em relação às plantas de controle.

93. Método de acordo com qualquer um dos itens de 85 a 92, em que as ditas características relacionadas com o rendimento realçadas são obtidos sob condições não estressantes.

94. Método de acordo com qualquer um dos itens de 89 a 93, em que o dito ácido nucléico é operavelmenle ligado a um promotor constitutivo, preferivelmente a um promotor de GOS2, mais preferivelmente a um promotor de GOS2 do arroz.

95. Método de acordo com qualquer item precedente, em que o dito ácido nucléico que codifica um polipeptídeo YTP é de origem vegetal, preferivelmente de uma planta dicotiledônea, mais preferivelmente da família Poitoono, mais preferivelmente do gênero mais preferivelmente de Orrçu .nrtovm

96. Planta ou parte desta, incluindo sementes, obteníveis por 25 um método de acordo com qualquer item precedente, em que a dll.a planta ou parte desta compreende um ácido nucléico recombinante que codifica um polipeptídeo YTP.

97. Construção que compreende'.

(Í) ácido nucléico que codifica um polipeptídeo YTP como definido nos itens de 85 a 88 (ü) uma ou mais sequências do controle capazes de direcionar a expressão da sequência de ácido nucléico de (a): e opcional mente (in) uma sequência de terminação de transcrição.

98. Construção de acordo com o item 97, em que uma das ditas sequências de controle é um promotor constitutivo, preferivelmente um promotor de GOS2, mais preferivelmente um promotor de GOS2 do arroz.

99. Uso de uma construção de acordo com os itens 97 ou 98 em um método para fabricar plantas tendo rendimento aumentado, particularmente rendimento de semente aumentado em relação às plantas de cent role.

100. Planta, pane de planta ou célula da planta transformadas com uma construção de acordo com os itens 97 ou 98.

101. Método para a produção de uma planta transgênica tendo rendimento aumentado, partíeularmente rendimento de semente aumentado em relação às plantas de controle, que compreende:

(1) introduzir e expressar em uma planta, um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ΥΓΡ como definido nos itens de 85 a. 88; e (ii) cultivar a célula de planta sob condições que promovam o crescimento e desenvolvimento da planta.

102. Planta transgênica tendo rendimento aumentado, partí.cula.rmente rendimento de semente aumentado, em relação às plantas de controle, que resultam da expressão modulada de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de YTP como definido nos itens de 85 a 88 ou uma célula de planta transgêmca derivada da dita planta transgênica.

103. Planta transgênica de acordo com os itens 96, 100 ou 102, ou uma célula, de planta transgênica derivada desta, em que a dita planta é rema, planta de· safra ou uma monocotiledônea ou um cereal, tal como arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, tritica'le, sorgo e aveia.

154

K)4, Parles colhíveis de uma planta de acordo com o item 103, em que as ditas partes colhiveis são preferivelmente biomass de broto e/ou sementes.

105. Produtos derivados de urna planta de acordo com o item 103 e/ou tin partes colhíveis de uma planta de acordo com 104.

106. Uso de um ácido nuciéico que codifica um polípeptídeo YTP no aumento do rendimento, particulanuente no aumento do rendimento de semente e/ou biomassa de broto era plantas, em relação às plantas de controle·.

A presente invenção agora será descrita com referencia às seguintes figuras em que:

A Figura I representa um desenho de um polipeptídeo GRF como representado pela SEQ ID NO: 2, que compreende as seguintes características: (i) um domínio QLQ com um acesso IntefPro 1PR014978 (acesso PF AM PF0S880): (ii) um domínio WRC com um acesso Int.erP.m IPR014977 (acesso PFAM’ PF08K79); e (i.i.i) um domínio Efetor de Transcrição (ET) que compreende três resíduos Cys e um H.is em um espaçamento conservado (CX^CX_$OCX'T1)> localizado no domínio WRC.

A. Figura 2 mostra um alinhamento de sequência múltipla AlignX (a partir do Vetor ΝΓΠ 10.3, Invítrogen Corporation) do domínio QLQ dosof polipeptídeos GRF da Fabela A (como representado pela SEQ ID NO; 115 para a SEQ ID NO: 2). Os resíduos de aminoácido QLQ conservados estão localizados no topo do alinhamento múltiplo. Dois outros resíduos muito conservados (em caixas eem preto) são E (Glu) e P (Pro).

A Figura 3 mostra um alinhamento de sequencia múltipla AlignX (a partir do Vetor NTI 10,3. Invítrogen Corporation) do domínio WRC dos polipeptídeos GRF da Tabela A (como representado pela SEQ ID NO: 116 para a SEQ ID NO: 2). Os resíduos de anúnoácido WRC conservados estão em negrito na sequência de consenso. t)s três resíduos Cys e um His em um espaçamento conservado (CX₉CXioCX₂.H), designado como o domínio Efetor de Transcrição (ET), estão em caixas verucamente através do alinhamento, e também identificado no fundo do alinhamento. D sinal de localização nuclear putative (NLS) compreendido no domínio WRC, é duplamente sublinhado.

A Figura 4 mostra o vetor binário para a expressão aumentada em Orgm Mfíva de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptideo GRF sob o controle de um promotor de GOS2 (pGOS2) do arroz,

A Figura 5 detalha exemplos das sequências úteis na realização dos métodos de acordo com apresente invenção.

A Fig. 6 representa a sequência de uma proteína equivalente a RAAI do arroz (SEQ ID NO: 121) com as sequências de assinaturas conservadas indicadas em. negrito sublinhado.

A Fig.. 7 mostra um alinhamento múltiplo de várias proteínas equivalentes a .RAAI. NP-001046787 corresponde a QOE1D7, NP001052368 corresponde a QOJEF5, AAR97604 corresponde a Q6RIBO, NP001042631 corresponde a Q9LGE3, NP-001045304 corresponde a Q8LR63, NP-974763 corresponde a Q9LXB5, NP-197868 corresponde a 023624, NP194866 corresponde a Q5QOB3, NP-001060595 corresponde a Q8H475.

A Fig. 8 mostra uma árvore filogenética de polipeptídeos equivalentes a RAAI (Ge et u/._s 2004). OsRAAl corresponde à SEQ ID NO: 121.

A Fig. 9 representa o vetor binário para a expressão aumentada em. (.)?qeo szr/ívu de um RAAl-likeque codifica àcído nucléico sob o controle de um arroz promotor de GOS2 (pGOS2).

A Fig. 10 detalha exemplos das sequências úteis na realização dos métodos de acordo com a presente invenção.

156

Λ Fig. 11 dá um visão geral cios motivos conservados presentes na SEQ ID NO: l69. O domínio rico em leucina está sublinhado, os motivos conservados 5, 6 e 7 são indicados em negrito e a sequência em itálicos representa o sitio de N-glicosilaçâo putatívo com o sítio dc: 5 fosforilação da cinase C de proteína putativo.

A Fig. 12 mostra um alinhamento múltiplo de várias proteínas SYR. Os asteriscos indicam resíduos de aminoácido idênticos, os dois pontos representam substituições aliamente conservadas e. os pontos representam substituições menos conservadas. Com a informação da Figura 11, os vários 10 domínios e motivos conservados na SEQ ID NO: 171 podem ser facilmente identificados nas outras proteínas SYR.

A Fig. 13 mostra o vetor binário pGOS2::SYR para a transformação e expressão em Onmi sariw de um ácido nucléico SYR de Oncu smmu sob o controle de um promotor de GOS2 do arroz.

A Fig. 14 detalha exemplos das sequências úteis na realização dos métodos dc acordo com a presente invenção, ou úteis na isolaçãu de tais sequências. As sequências podem resultar de montagens de EST publicas, com sequenciamento de menor qualidade. Como uma consequência, umas poucas substituições de ácido nucléico podem ser esperadas. As UTRs tanto 20 5' quanto '.Γ também podem ser usadas para a realização dos métodos da invenção. A SEQ ID NO: 193 representa a sequência de proteína ARGOS (acesso do GenBank AY305869).

A Fig. 15 representa a sequência de aminoáctdo da SEQ ID NO: 213, Os domínios conservados pfamB2828 e Z1Ü3E12C3 (pfam00097) 25 são salientados em. negrito e caracteres sublinhados respectivamente. O Motivo 8 altamente conservado é indicado por uma linha pontilhada sublinhada. Os resíduos dc aminoâeido mais altamente conservados nos polipeptídeos ARKL estão em caixas. As posições de ligando metálico de amino conservados (números) e pares de aminoâeido que coordenam zinco (ΖγΓ ) são ilustrados,

A Fig.. 16 representa um alinhamento múltiplo de. polipeptídeos ARKL selecionados. Os resíduos de aminoácido ahamente conservados são indicados na sequência de consenso. Como mostrado na Figura, a sequência do terminal C dos polipeptídeos ARKL è mais altamente conservada do que a do terminal N.

A .Fig. 17 mostra uma árvore fdogenética dos polipeptídeos ARKL com base em um alinhamento do domínio de dedo de RING (pfam00097) compreendido nos polipeptídeos ARKL como representados pelas SEQ ID NOs: 306 a 314, 31.6 a 3.18, 322, 323, 402 (a SEQ ID NO: 402 compreende o domínio pfam00097 (dedo de zinco RING) presente no polipeptideo Abadia. de AAa amsmdur e a SEQ ID Ní.): 403 representa o domínio pfam()0097 como presente no polipeptideo Goliath de Αίαν

As abreviações usadas: Os: Dpyrm sa/ív# (Orysa); Hv: J/mAwn va/gvmc (Horvu); Gm: G/àâm mar (Giyma); Zm: Zeu mmu (Zeama); Musmu: À-fe

A Fig, 18 representa o vetor binário para a expressão aumentada de ácido nucléico de OS-A.R.K.L1 como representado pela SEQ ID NO: 212 sob o controle de um promotor de GOS2 do arroz (pGOS2).

A Ftg. '19 detalha exemplos das sequências úteis na realização dos métodos de acordo com a presente invenção.

A Fig. 20 representa a sequência de YTP1 (SEQ ID NO: 409). Os dominions de tr&nsmmnbrana estão em caixas. Uma parte de um domínio DU.F22I de 124 resíduos de aminoácido é salientada em negrito. O motivo 8 é sublinhado.. Os resíduos invariáveis no Motivo 8 são indicados com um tipo de letra de tamanhoo maior. A primeira e terceira alças são prognosticadas estar localizadas ao lado de fora da membrana; a segunda alça dentro.

A Fig. 21 mostra a árvore filogenética de uma selecção dos polipept ídeos YTP.

158

A Fig. 22 representa alinhamento multi pio de pofipeptideos YTP selecionados. Uma sequência de consenso como represented» pela SEQ ID NO: 544 é dada. Os resíduos de aminoàcido conservados são indicados na sequência de consenso; os brancos representem as regiões de baixa 5 conservação.

A Fig. 23 representa o vetor binário para a expressão aumentada em Onoa snúTu de um ácido nucléico que codifica YTPl sob o controle de um promotor de GOS2 do arroz (pGOS2).

Λ Fig. 24 detalha exemplos da sequências úteis na realização I0 dos métodos de acordo com a presente invenção.

Exemplos

A presente invenção agora será descrita coin referência aos seguintes exemplas, que são apenas por via de ilustração. Os exemplos que seguem não são intencionados a definir completemente ou de outro modo 15 limitar o escopo da invenção.

Manipulação de DNA: a menos que de outro modo estabelecido, as técnicas de DNA são recombinantes realizadas de acordo com os protocolos padrão descritos em (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3³ Edição Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, .2() nova Iorque) ou nos Volumes .1 e 2 de Ausubel ei at (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Os materials e métodos padrão para o trabalho molecular em planta sac descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R. D. D. Croy, publicado pda BIOS Scientific. Publication Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications (UK).

Exemplo I: Identificação das sequências relacionadas com a sequência de ácido nucléico usada nos métodos da invenção

As sequências (cDN A de tamanho natural. ESTs ou genômico) relacionadas com a sequência de ácido nucléico usadas nos métodos da presente invenção foram identificadas entre aquelas mantidas no Entrez

159

Nucleotides database no National Center for Biotechnology Information (NCBl.) usando as ferramentas de pesquisa de sequência de base de dados, tais como a Basie Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul er oZ. (1990) J. Mot Bld. 215: 403-410; e Altschul er d. (19(/7) Nucleic Adds Res. 25: 33895 3402). O programa é usado para encontrar regiões de similaridade· locai entre as .sequências pela comparação da sequência de ácido nucléico ou sequências de polipeptídeo com as bases de dados de sequência e calculando-se a significância estatística de emparelhamentos. Por exemplo, o polipeptídeo codificado pela sequência de ácido nucléico da presente invenção foi usado .10 para o algoritmo TBLASTN, com ajustes de default e o filtro para ignorar sequências de baixa complexidade set qrit A saída da análise foi visualizada pela comparação aos pares, e classificada de acordo com a contagem de probabilidade (valor E), onde a contagem reflete a probabilidade de que um alinhamento particular ocorre ao acaso (quanto mais baixo o valor ,E_f mais 15 significants o acerto). Além dos valores E, comparações foram também classificadas pela identidade percentual. A identidade percentual refere-se ao número de nucleotídeos idênticas (ou aminoácidos) entre as duas sequências de ácido nucléico (nu polipeptídeo) comparadas em um comprimento particular. Em alguns casos, os parâmetros de default podem ser ajustados 20 para modificar a severidade da pesquisa. Por exemplo o valor E pode ser aumentado para mostrar emparelhamentos menos severos. Deste modo, emparelhamentos curtos quase exatos podem ser identificados.

A. Fabela A fornece uma lista das sequências de ácido nucléico relacionadas com a sequência de ácido nucléico usada nos métodos da 25 nresente invenção.

Tabela Al: Exemplos de sequências de polipeptídeo GRF, e sequências de ácido... nucléico... codi ficadoras;

UOMk	O;·igSSBJSí5	AGírsísísmea SEQ !O NO:	sr.<) às rio	Acesso r>.a Hase de Dados
Araíh.GRr..AOm59ma	.mzSoÇj.vTí		X,	Ancmxe i
		3	4

160

NOME	O$y.i.:nst-K> F<-.aiír	Àcãlo oucJêko W in HO:.	IMÍij>Sp6de«í WiiWí	AcSSB 70 is.:.'·?.:;' ’.:;: Í3aík>s
Afaih..GRP\ ,A?;’G32840.1	. íEsísiwa	FRFyyysrsS···........a	<!	:BO2WA0 ........
ArathJj&E Α£Ο364<Κ;.ί	í&áiiísm.....	F-	7fs' ......	: Α κ2036·400,1
Amh..GRP..At2G454iJ0. 1	íBBB	yR;........ .................... ................	to	Ai2(MM80.(
Arash GRP .0052910.1	.....	IB........................................................	12	AUGSZTÍO.Í
Arath. ..GRP...AX4G24} 50. i	,<OíiF&A^.¥SÍ í.Wàwja	S3	ii	At4G24 í 50. >
Ara*b...GRF..At4G37740.}	ί Ζί<·.!;ίϋ.';ΪΛ	Ϊ3	16	: ÀÍ4W740J
Arsth..GRP ..Al 5G53666. 1	Oüià-iíja	Í7	; ÍS	AGG53BO.1
Aqufe. GRP	..ΌΒΒ ^Wíósiá· ,y ..Sí«;í<í’yG pnspesciro?	................................................	SO	õrMOBi.í I)R:M6?16J.
Bim_GRF	.^ÍÍsYÍÍÍY-? ?5<íTW , .	,:M	*ÍB ............Hr........... •.\λ·	CN73OS! 7.Í d ES92S527
píWá..Ú;RF	V?ií£<W	w..... .....	B	ΛΚ ?.B:U·· {
l.yces..ORF	<:\\'<V3íí:í'	25	B	-IBBBlt:'............................................5
Me&rGRF	Àfej&a^íi Ííííafüíft/fí	4< ·*	B	AC144645S7
Meshr ORF iiU	Mxfeaye ;?«>;< «ftsAv	29	W	Açmsw
Orysa GP.F Òsü2r472SR2	{>>£ SfSÍÍV*'		....................	Os02p3?2SQ.2
Orysa ORF 0053690.1		33	íB-f .......	Os02s5’3690J
Orsva GR? QsíMèMSCÍU	Onsss ss&víj:	35	36	i>XOg51976.}
« a7á<s GRF OsOr-JBIO 1	ÍF-y;?:·; ss.’i ív<5	37	38	cmWrò.í
()ry^.GRF.Os«)4^H&0.i	Onsíi ísrMj·	39	40	0$04g;i}}90.í
Orysa GRP ÇkOBOBttU	OopRíSíiÉVÍÍ.	a	O	OBSBSíB}
OjysaJiRF .òs Μ g‘OB.O	ÓF·'.·;;:·;		sByssSyy;;;;:::::·	Gsl 1505030.1
OtysaGRP Osh.g2^} }	ÍAyse íü.fív>->	4.5	B	O$} 2g J
O^m GRF OsS3R4?N<n	i.'-.'X'C „'.*y.w<í	......................	0:0........ .........	stWWBÍBÍ5;77y:
Psyáa ORF sà 054479 iü B N	íiFysíüysíÉws		B	NMJXBS42O.1
Ojysa ORF jy Π5460325 r-:s N MtóÉJ......		:3I	52	NMJRÍ10662BJ
Orysa GRF «1 UBS W Μ N M BÍB61S.6J		53	IB	NM ...OOi-%6126 1
Fopir GRP. JG.tWT. XIV.. >9	.Ró^sÇsyy	ygl........................................ s'	56	WWWiA
Fs;pR· GR.F Jí;S síxííT Π. 1 ό0	ί/·<·:·ί?>·ί<Ζ-·>ό·&·5·	|l;' ........B	1S27:“:	kí.>c&Rji.}07i>
Rapts OFJd.stíM.Blΐ		59	60	RI..W:J.10}.í:
	7'V^W' <í«í A >><«.'.'·	6Í	62	Rí sO'B.iO
	FFyjíííos tesisiAsSadí;	63	B
Fop·!· .GRP...H ./walf JG.74Í	Çq&íi&Kí ?>>?»i*.í<.<í -Rs	65	66	B..sBBÍWi
: WB9 W<0G<YS J3'M	RyoWsíí	if....................................	63	.............
J4„WO:»W	/’í^sí/síy RWAY&hS·	B	6	B.?W 501.20
Rapt? GRF id y.B XH1.769	íOwÇ&Rfey	71	?2	BbB.X ^-769
Ik-pU. GRF.kl..stair xrv. 174	Fr.y-iRas úypjaAsíííPã·	73	B	k-L.wiR..XlVJ74
PÇpVàSRFJçÍ.Sí&iÉ NIV.M	A.y-vAs.s ^sssíítRiWf	Fffs....................:||............	76	hbwbíBbí.............................

161

NOME	O;/.?»:>&»<> Fb-Ríí	A<Kb> s-í;, F'K'v SEQ 1.0 NO:	;MipçpÍ&fen BQIORO	Ac-íkasí >;a ÁW ;b·' lisáàs
	: íV>&íí:W ίΒίκΑΜΝ	7?	S: ........	MwWAAMSO
»opu-„GRFjU;;WT 2S-3OO	í?íg?síR®	oè ........	: st*	........
^pA^WM^scsÃ. jMs	íF»,»is/Rí·:	A	>	ScqwaífJ.àB
5::-::-:1 fíRI’..........	: 54ΝΉΑίη çí^íí.'N<?í’>W	....................................................	Sps.......................................	CAGA 837 J cOón CA12EU£ i
Vim GRF	FV.';.Í v.'gS:;	85	S?.>	A.M46RG35
X®í.w-;í GRFÍÓ í’í s 46008494 sb EF515849.1	.<<<;;	8?	88	EFÍOSAGJ
Zeayns GRFO «j 146008515 gb EP.5I5850.1	Aà ??;.:;>«			efssOj
ZeiBRS GRFÍ2 «j 1W5M gb	Z«« ??;«><	Ai		EF5L-585LI
	Zs?a :·?>·χκ:	B	w	EF5Í58S23
/ti'a.BJi GRF· 4 p D6B8560 j-;h BAisfeyi	A>.Ag».«.«	ΐΒκΚ.......................	sOi:.....	EFASSS? i
Zeasna GRFi sy s46OV8UO sb E F5íSS-W.j	ZgíSiWJS’	v	98	EEO5AVJ
Zwim GRF2 gi vrgGOOSS gb E FUSjÜÀ.i	'^í3<íííàiYS:	99	UXí	EF5 OA1G
ZíAm DR.F3 g: SBNCNE gb E F5I584?..!		im	sFa:	EF515842 A
Zam GRF4 gi 146808393 gb E F5D843J		m	104	EHÍ5A.U
/®S!ia;< GRF5 gi s 460084 S 3 gb L F5158443		Hí5	Os..........'	EF5Í5844.1
Zemat GRF6 gj 146008429 &b £ F5D&453	A 4 w$ ®	slBi ::::: :s’	iw	EF5Í5845.À
ZtSiJXlíl <MF'V s.: U<4K)84-0 £gs £ ..^.1.58463	.&?ίϊ TNOq-A...........	s>A:............................................	s|lÍ|....................................	EF5 Ü846 1
IWm Gm jjj Í«W61 ;;b E jieAlfilfilí·'........ .......ιΐιίΐιι		m	02	EFSiSMT.j
Ze&m GKF9 gy 1 Wjg475 gb E HDSA.Í	Z: ':3 ·>«Ε>:3	irBr:...........síssáas		..wOo........................

Tabela Á2: Exemplos de polipeptideos equivalentes a RAAI:

Ponte Vegetal	Àcído oueíéico SEQ 10 NÓ	Proteína SEQ ID NO
Q9LGE3	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO; 121
Q8H475	SEQ IO NO: 126	SEQIDNO; 127
A3BNA1	SEQ 1.0 NO: U8	SEQ ID NO: 129
023624	SEQ JD NO: HO	SEQ ID NQ: 131
Q8LR63	SEOIDNO: 02	SEQIDNO: 133
	SEQ ID NO: 134	SEQIDNO: 135
Q5QOB3	SEQ 10 NO: 136	SEQIDNÜ: 137
lOiRiãsiií®	SEQ WiÓrOÍ i.	SEQIDNO: 139
À2WN1.8	SEQ ID NG: 146	SEQIDNO; 141
024340	SEQ IO NO: 142	SEQIDNO: 143
A2X4J6	SEQ ID NO: 144	AEQ®NOí MS.................
06010?	SEQ ID NO; 146	SEQIDNO: 147
: 0495 P	SEQ ID NO; 148	SEQIDNO: 149
A2XRE0	SEQ ID NG; ISO	SEQIDNO: 131
Q6Rffi6	SEQ IO NO; 152	SEQIDNO: 153
Q9I.XB6	SEQ O NO: 154	SEQIDNO: 155
Q0.IEF5	SEQ ID NO; 156	SEQIDNO: 157
NP1050091	SEQ ID NO; 158	SEQIDNO: 159
A5BZJ2	SEQ 1D NO: 169	SEQIDNO: 161

Além das sequências de ácido nucléico publicarnente disponíveis, disponíveis na NCBI, as bases de dados de sequência patenteeadas também são pesquisadas seguindo o mesmo procedimento como aqui descrito acima.

A Tabela A3 fornece uma lista de sequências de ácido nucléico e proleina relacionadas com a sequência de ácido nucléico como representada pela SEQ ID NO: 168 e a sequência de proteína representada pela SEQ ID NO: 169.

Tabela A3: Sequências de ácido nucléico relacionadas com a sequência de 10 ácido nucléico (SEQ ID NO: 168) úteis aos métodos da presente invenção, e os polipeptkleos deduzidos corresponderdes.

UOns.		:SBQ iONO:	SBQ m NO.	mWésU cte ; aSÍXSí? fSi Wsií <ii' l ásáíss	.................... SRuáçâs
OsSO.		w	__________.....________________ 04		Tamanho naCinsi »a ^írrPÍ
n<® S¥R híkwVogo 5	(Λ>.·,<. .Ííifí lii	179		Tassiaiho ftanim;
nee S\ R h	.$<ÍÍÍVXÍ	USO	Ι?ΟΧ03ΙΒ	Tamanho salumi
	ii\i Wjé :	m			p«a í J
	WísStóS :S.ís.	Í83	..................*....... * i|ir *..... ......................;
tus*e> S\ R ht«rn'U'sX'		Bli		ÍCBS71444	}
<.ane SYR t-yr-ókjRti 1	WrrNuw	UM.........:;	2í>4	p: A. i 65717	pamiU
iliS.aí'· » SYR fensófeg» 2		tó............	:>S	p.?A24W(e :|írI:I
s<»'q!to-í) svx					Tamanh» {:sSsnd
ÁlSYR hof»àk>g» ;		t§7	1O.......	Qmjhsss	TsmdR> íssosal
	áéògwa		ws	ÍWJW3S 1	mwal
grapRSVR: hwàÉgç	ifei-sW	:iid ........ J	m		Tmsifò nsJKfsl
(Was S¥E áèsnSpgís	ÇÍ8>W RsCísiíUíR	o		kwwu	}>·$!>: isl
ferem Od hwWgíf	ÇrawW	55H	w	ί ΛΟ745ΟΪ 4...... ....................	ratáíitifeçs Tás&WSi nawt
’ot-míu SYR homOí.·^ ,L........	/iliíijíttiiH WWOjísRSi		m	mo O53?i> j.....................................
i............. S	,-tmRO'WsU ϊAiRi'i;		309		:Ts.<wds> W-VfeÇ

163

Tabela.....Λ4:.....Exeniplos.....de...ácidos.....nocléicos A.RKL e os polipeptídeo respeçti vamenle codi ficados.

Deseriç&>*	Fome vegetal	Aeido nvclGco SEQ ID NO	Proteína SEQ 1.0 NO;
Orvss ARKIJ	(Tn-ztf àwriva	212	<2?|;· '
Gn-xa ARKL2	Ons:<? 5<?nva		........
Orna ARKL3	Uns:; ÁUO®	216	21?
Chyss A.RKL4		218	219
Orysa ARKL5	t>V’£? À'£tò'W	220
Órysa A.RKL6		???
Orysa ARKL.?	(Aysa <?«£.’><·:<	224	225
Orysa ARKL 8			22?
Osyas ARK1.9	s.íi.àií	228	229
Zeama .ARKL 1	Zeu	230	231
Zeama ARKL2	Zm WM		233
Horvs ARKIJ	v/dgüre	234	238
Horvu A.RKL2	2/5^?«,'?’ pídgare	236
Horvu ARKL3		.238......	J39
Lyces ARKLI	Lxopm’«.‘um esndew.vw!	s2||si:S;;	24 i
Lyces ARKL. 2	Zycepemcum <ssc«Ze?f/«?w	?42
Ly^yARKO	lAropcrrirstf» c.scíeLyf&m	244	245
Criyma ARKIJ	G/ycihe /ws»	246	247
Glyma ARKL2	CíZycííse	248	249
Zínel ARKLI	Zàeriíí eZe^ím	250	......
Latja ARKL l	Zx>ra< /íWííMvs	252	253
Arath ARKL l	ArêAízGpsÀs	234	255
Arath ARK.L2	.AmàKG/w/.? ti&iii&sw	286	257
Àraih ARKL3	.4 rcri* ίίΑγ«is Ps?/	258
Aradi ARKL4	.ò\<íáMefí.\sí5 ?WLs«í?	w	261
AraÜs ARK.LS	4raèà/e/?.w.ç	262	263
Arath- A.RKL6		264	265
Arath ARKL?	4m&díjp$Zç jJ?íííL»?í.'	266	t2i7y:t;5sis.......
Arsth ARKL8	4r£?íGíL/..;,¥K PW/íWí:.*	268	269
Anrth ARKL9	AríyôMLpu/J í/w&skí)	2?0	?2IK;..... ...... .......:........
Arath A.RK.L10		272	1211·'.....iliiiiliiillll
Araih ARKIJ 1	.AmGLájp.sía d&díri&cf	274	;275i;::::;5i;i;:i
Araíh ARKIJ 2	zAidáe?«	276	277
IMptr ARKLI	/MpiíZ sw ϊΖΚΚχ'ίΎ.φίϊ	278	279
Poptr ARKL?	fràíWirçAs	280	?2ii.....
Poptr ARK.L3	Pqpa/uv p-à/j?X£»-pí3	O:	' 283
PopR ARKL4		284	I2Í1Jí3151 1
PoptT ARKL-5	PfspfiZuç	286	28?
Foplr ARK.L6	RpphZíi'? írif.73f>e«rpa	288	289
Popir ARKL?	P<V>í-í/?íy mxAxvíjw	290	291
Pfjptr ARKL8		292	293
P&ptr ARKL9		294	<1655?....................:..........................
Pcsptr ARKIJ 0		296	297
Mcdé ARKIJ	AMc/scqg.o a.«?íCía.í.ès	298	299
MedaARKI.2	ί>'ί.'«ί'£ϊη.'Ν	300	301
Meda A.R.KL3	A/edKí·..’^	302	3B
Meda ARKL4	A/e.4/c«^y írw??£’«raZ«	304

164

- *Orysa: Oryza mmí; Zeama: Zen mops; Horvu: /ibrríewm vn/gnre; Lyces; oeWe«tam; Glynia: G/femn max; Zineb Z/Twwt e/egm® Lotja: ΛοΖ?ζν/ίψο«/α«·; Arath: Araêá./qp® Poptr: Po/Wus nàrráucar^; Medtr: ADif/cugo fnmouitotò.

A Tabela A5 fornece uma lista das sequências de ácido nucléico relacionadas com a sequência de ácido nucléico usada nos métodos da presente invenção.

Tabela	AS: Exemplos de áoidusj'Hiofeiçpsto.IMdÍpeotiderrs.¥TP;
Úòs-	fciOíBO Pwudôr: ÍXV: f >	Otj?.wmBo Fonte	ÁowJo nodòUo àWHPW	P'Oii'St'.: M \' H> NO
	¥U?i.PASCYAL ?	í¥'y:::í «.>?;«>	w	w
vas	0s0h0534900{?6g		Ws	4ÍÍ
ytfu	:ÕUnp9SW:(70t}	íto-SsS AsíSUj		4Í3
YU’4	0&ft3ga?374(jQ(792}	i..òy;r:·} s<«.·><.'	U4	: 415
yuo	Ο®§66?3860{7??·	<>)<;;· .?a;Á'O	Ws	4J7
¥TP6 ·	wasga?sOT:íWj	Ogsií ííffiiw	w	•09
ww		............................................................	426	421
Y1TS	On5gi)5fW7í» ;766)	OésSíí .s«íí$-a	422	423
ΪΠΟ	oangíHsoíonrnn	safei	424	425
	OsWS?‘>}OÜ ;W)	<>.9··:.' .v;.!írv;.i	42?;	427
Wí		<.6','.$.':J ;wí: >«	42S	429
¥002.	(W3):	O}SsS . :.'í p o	426	431
yipb	ATUO 0090(762}	:áí--íS6fefcspju í&aaiws	432	433
YÍPÍ4	AI ion990 (375)		434	íBé
Υ'ΠΊ5	ojow	,4;?sA4á?«;.>sís :.ό«:!Α;.':>.ί	43-6	<13?
YTP 16		.ό<¥ «¥<%;.? àwíOíí&s	β	439
	Α.Ή 062326 069)	J ΐ'ίΑκΛΪΒϊΑ íWsUsíí	440	44 í
vrrri	ATI 0^450(70}	Uuí&w	442	443
rra! 9	ABUOUto Ü96.S	.>,<;?>:;/. ígí¥A>Ki
	AT3G2ͻ2$ (756)		946	44?
YT?O	AtW45BW)		446	44'7
YYP?.;?	At«WMW)	.AAsSítopYss WSi&síí	4 30	wr
ΥΉ'··.?.3	ΑΤ4Ο»Η.Ι41) (772)	t&áOso:	452-	453
Y.iKM	ΑΓΚΗ^ΟΓ·^!	.4>y«Y«:-.yAC :iU8SSW	w®	435
YIP25	AHG22i2í; (771)	Xíú6sfeSís: j&U&íKS·	456	45?
ΥΓΡ36	AT4G$5870<an)	T&ssiiW	456	459
Y »V27	AOCL26hlp^csOAq'skaU Ó4gW	XfSi2gg?aspi:e?e4	460	<br
YTP26	U }7S McdUsswfHO	.waessg}? ί® κίΐίχϊ&ο	462.	463
VOOS	?eq2l269_Med^ft (790;		564 -	465

165

Nósig			AePasÁlúÁ SEQ ÍO NO	ÒWfèis StlQ m?m
Ϋ'ΡΡ$0	m .242? Age od	XSAwge íí>sgs:wp	ads
VCk	pl ;; ?23Apdfepp i'4>S: j:		(rs	469
YTP<2	pgsAfoiXPSapat}		470	ai:........................................
nui	(2¾)	: r&APL (Us psUepg	laBc s ............r	........
¥WM	ppsíAT rçC26 O?S)	ZípdppfAAíWYV:	4t4	747547 517
VTP35		^í^s/ííg^jç^iísé^w	476	ί|57ΐ<7|444|44ΐ
yh%	tW)	pqgwr 5 ”;?í		l:4gÇss^4i:||is-i
YFP37	).25710724)	ZpWsU ;í'5'Ã.$Lí'<s.'p«	«iO	4SI
ΥΓΡ38	k.l..sc3.Pjn<)S{í í7trç		4SU	483
/mipPí	L4 Jt.2(í'?S (fi7l
YTP4i)		fl>í'«iC.;· 5’	4V>	487
γπ’η		/:íK.'í<;:.S5 AAÁWV	448	489
¥ΓΡ42			4>?(!	4m
ΥΤΡ43	kmcU? ΥΠΙ.Ρ48 (?U)	>égsAS &'!<	422	493
:w<	Pl..se<. XL9> >4$)	p<g«í&Ç (Ap<Yí®W	«4	49S
VTP45	ÍÕ#jQ$0ÍÍ)	.?'>.:f»í.íSS.y ίί'ίί?ΚΚ'οφ<<	496	4607777'
yw	PÇsestf X.iV. 1(06(846?	iPípLSc ii'pfewVP	498	499
VTP47	Uiài..rA.9)U6J565í575}		:Sd	50;
YfoR	YàWsãOOsà:
ΥΤΗθ	VOL VOX >59 19	; ’<.:)',·<ίΛ· jjjjjgsU	504	50.4
VTPSQ	dtisjríj-Í749ÍÕ(í)29)	çppíííAtPsgs<> '«ifíCíAíí.:	506	5Q7
VTP5Í	chimyU94?74 (H»>		sfo	w
V!?V	«ί .ΝΡ>Μ55?.;..>91)	.ggssA	$10	4|É;)............................
YTP 51	>92939.1.. (87;)		latcssiiiisgririsi	:' 50
	f<.NP..984S9i).l...(875;	X&wwYwn.ο·;., ·;·«%'.·?	$14	51 $
YÍPS5	r<XP.452<m.i.. (967)	sa mGmpYpr ííÈfVxPw	GArr :	4:55707 ........

Em alguns casos, as sequências relacionadas foram por tentativa montadas e publicamente divulgadas pelas instituições de pesquisa, tais como The Institute for Genomic Research (T.IGR). A base de dados Eukaryotic Gene Orfoologs (EGO) pode ser usada para identificar tais 5 sequências relacionadas, pela pesquisa de palavra chave ou pelo uso do algoritmo BLAST com a sequência de ácido nucléico ou sequência de polipeptídeo de interesse. Em outros casos, bases de dados de sequência de ácido nucléico especiais foram criadas para organismos particulares, tais como pdo Joint Genome Institute, por exemplo para pqp/rrr e êAuvxmoccnv 10 towv.

166

..Exemplo 2:.

a) Alinhainento de scquênoias de polipeptideo GRF

Q alinhamento de sequência múltipla de todas as sequências de polipeptideo GRF na 'Fabela A foi realizado usando o algoritmo AligriX (a partir do Vetor NT1 10.· 3, Invítrogen Corporation). Os resultados do alinhamento para o domínio QLQ de polipeptideos GRF da Tabela A (como representado pela SEQ ID NO: 115 para a SEQ ID NO: 2) são mostrados na Figura 2 do presente pedido. Os resíduos de amínoacido QLQ conservados estão localizados no topo do alinhamento múltiplo. Dois outros residues 10 muito conservados (nas caixas em preto) são E (Glu) e P (Pro). Os resultados do alinhamento para o domínio WRC dos polipeptideos GRF da Tabela A (como representado pela SEQ ID NO: 116 para a SEQ ID NO: 2) são mostrados na Figura 3 do presente pedido. Os resíduos dc amínoacido de WRC conservados estão em negrito na sequência da consenso. Os três 15 resíduos Cys e um His em urn espaçamento conservado (CX^CXhXDGH), designados como o domínio Efetor de Transcrição (ET), estão em caixas verticalmente através do alinhamento, e também identificados no fundo do alinhamento.

b) Alinhamento de polipeptideos equivalentes à sequência RAA1

() alinhamento das sequências de polipeptideo foi realizado usando o programa AlignX para o Vetor NTI (Invitrogen) que c fundamentado no algoritmo Clustal W popular de alinhamento progressivo (Thompson M o/. (1997) Nucleic· Adds Res 25: 4876-4882: Chenna er m. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497-3500). Os valores de Default sac para a 25 penalidade aberta no intervalo de .10, para a penalidade de de extensão de intervalo de 0.1 e a matrix de peso selecionada é Blosum 62 (se polipeptideos são alinhados). A edição manual menor foi feita para otimizar ainda mais o alinhamento. A conservação de sequência entre os polipeptideos equivalentes a RAA1 é essencialmente por toda a sequência inteira com a exceção de uma região rica em Gly c/ou Ser na metade de terminal N da proteína. Os polipeptideos equivalentes a RAAI são alinhados na Figura 7.

c) Alinhamento de sequências de polipeptídeo SYR

O AlignX ( Vetor NTI, Invitrogen) está fundamentado no algoritmo Clustal popular de alinhamento progressivo (Thompson et aí (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876-4882; Chenna e? αΖ. (2003), Nucleic Acids Res 31: 3497-3500). Uma árvore filogenética pode ser construída usando um algoritmo de formação de grupo que une vizinhos. Os valores de default são para a penalidade aberta no intervalo de 10, para a penalidade de 10 extensão de intervalo de 0,1 e a matriz de peso selecionada é Blosum 62. (se polipeptideos são alinhados).

O resultado do alinhamento de sequência múltipla usando polipeptideos relevantes na identificação daqueles úteis na realização dos métodos da invenção é mostrada na Figura 12. A repetição rica em leucma e 15 os motivos conservados podem ser facilmente discriminados nas várias scq u ênc ms.

d) Alinhamento de sequências de polipeptídeo ARKL

O alinhamento das sequências de polipeptídeo foi realizado usando o programa AlignX a partir do Vetor Ν .Π (Invitrogen) que está 20 fundamentado no algoritmo Clustal W popular de alinhamento progressivo (Thompson er a/. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876-4882; Chenna et α/. (2003).. Nucleic Acids Res 31: 3497-3500). Os valores de default values são para a penalidade aberta no intervalo de 10, para a penalidade de extensão de intervalo de 0,1 e a. matrix de peso selecionada é .Blosum. 6.2 (se polipeptideos 2S são alinhados). Edição manual menor pode ser feita para otimizar ainda mais o alinhamento. A conservação de sequência entre os polipeptideos .ARKL está essencial mento no terminal C junto com o domínio DAR.l e R.I.NG-H2 dos polipeptideos, o domínio de terminal N usualmente sendo mais variável no comprimento e composição de. sequência. Os polipeptideos .A.RKL são alinhados na Figura 16.

Uma árvore fikigenética dos polipeptideos AKKI, (Figura 17) foi construída usando urn algoritmo de formação de grupo que une vizinhos como fornecido no programa AlignX a partir do Vetor NTI (Invitrogen).

e) Alinhamento de sequências de polipeptídeo YTP

O alinhamento das sequências de polipeptídeo foi realizado usando o programa AlignX a partir do Vetor ΝΤΪ (Invitrogen) que está fundamentado no algoritmo Clustal W popular de alinhamento progressivo (Thompson <rt u/> (1997) Nucleic Adds Res 2$: 4876-4882: Che-nna at n/. (20()3). Nucleic Adds Res 31: 3497-3500), Os valores de default são para a penalidade aberta no intervalo de 10, para a penalidade de extensão de intervalo de 0,1 e a matriz de peso selecionada è Blosurn 62 (se polipeptideos são alinhados). A edição manual menor pode ser feita para otimizar ainda mais o alinhamento. A conservação de sequência entre os polipeptideos YTP é mais alta no terminal (.1 da proteína dos polipeptideos ao longo do domínio .DU.F22L O domínio de terminal N é usualmente mais variável em comprimento e composição de sequência. Os polipeptideos YTP são alinhados na Figura 22. Os resíduos de aminoácido altamente conservados são indicados na sequência de consenso (ver a Fig. 22).

Uma árvore filogenétíca dos polipeptideos YTP (Figura 21) foi construída usando um algoritmo de formação de grupo que une vizinhos como fornecido no programa AlignX a partir do Vetor NTI (Invitrogen). Como mostrada na Figura. 21, <> Grupo 1 compreende polipeptideos YTP que formam grupos com a SEQ ID NO: 409 (YTP1 na Figura 21).

Exemplo 3: Cálculo da identidade percentual global entre as sequências de polipeptídeo útejs na realização dos métodos da invenção

As porcentagens globais de similaridade e identidade entre sequências de polipeptídeo de tamanho natural úteis na realização dos métodos da invenção foram determinadas usando um dos métodos disponíveis

169 na técnica, o software MatGAT (Ferramenta de Alinhamento Global de Matriz) (BMC Bioinfonnatics. .2003 4: 29. MatGAT: a application that generates similarity/idenlity matrices usindo protein or DNA sequences. Campanella J J, Bitincka. I.., Smalley J; software hospedado pela Ledion Bitincka). O software MatGAT gera matrixes de similaridade/identidade para sequências de DNA ou proteína sem necessitar de prêmlinhamenío dos dados. O programa realiza uma. série de alinhamentos aos pares usando o algoritmo de alinhamento global de Myers e Miller (com uma penalidade de abertura de intervalo de 1.2, e uma penalidade de extensão de intervalo de 2), calcula similaridade e identidade usando por exemplo Blosum 62 (para polípeptídeos), e depois coloca os resultados em uma matriz de distância. A similaridade de sequência é mostrada na metade de fimdo da linha divisória e

a. identidade de sequência é mostrada na metade de topo da linha divisória diagonal

Os parâmetros usados na comparação foram:

Matriz de contagem: Blosumól

Primeiro intervalo: 12

Intervalo de extensão: 2

Os resultados da análise de software são .mostrados na Tabela B quanto a. similaridade e .identidade globais em relação ao tamanho natural das sequências de polipeptídeo (excluindo as sequências de polipeptídeo parciais).

.173

A identidade percentual entre as sequências de polipeptideo de tamanho natural úteis na realização dos métodos da invenção pode ser tão baixa quanto 15 % de identidade de aminoácido comparada com a SEQ 1D NO: 2.

A identidade percentual pode ser substancialmente aumentada se o cálculo da identidade for realizado entre o domínio QLQ SEQ ID NO: 2 (como representado pela SEQ ID NO: 115 compreendido na SEQ I'D NO: 2; domínio QLQ do polipeptídeos GRF da Fabela A representado na Figura 2) e os domínios QLQ dos polipeptídeos úteis na realização da invenção.

Similarmente, a identidade percentual pode ser substancialmente aumentada se o cálculo da identidade for realizado entre c domínio WRC SEQ ID NO: 2 (como representado pela SEQ ID NO: 116 compreendido na SEQ ID NO: 2; domínio WRC dos polipeptídeos GRF da Tabela. A representado na Figura 3) e os domínios WRC dos polipeptídeos úteis na realização da invenção. A identidade percentual em relação ao domínio QLQ entre as sequências dc polipeptideo úteis na realização dos métodos da invenção varia entre 25 % e 99 % de identidade de aminoácido, e identidade percentual em relação ao domínio WRC entre as sequências de polipeptideo úteis na realização dos métodos da invenção varia, entre 60 % e 99 % de identidade de aminoácido.

Como também pode ser observado na Figura 3, o domínio W.R.C é melhor conservado do que o domínio QLQ entre os polipeptídeos GRF diferentes, como mostrado na Figura 2.

As porcentagens na identidade de aminoácido entre os domínios QLQ, e a identidade percentual entre os domínios WRC são 25 signiíkantemente mais altas do que a identidade de aminoácido percentual calculada entre as sequências de polipeptideo GRF de tamanho natural.

Os resultados da análise de software relacionada com o polipeptideo equivalente a RAAI são mostrados na Tabela B2 para a similaridade e identidade globais em relação ao tamanho natural das sequências de polipeptídeo. A similaridade peercentual ê dada acima da diagonal e a identidade percentual é dada abaixo da diagonal (face em negrito),

A identidade percentual entre o polipeptídeo equivalente as .sequências de RAAI úteis na realização dos métodos da invenção pode ser tão baixa quanto 31 % de identidade de aminoácido comparada com a. S.EQ ID NO: 121, deixando Q9LX.B6 (SEQ ID NO: 155) fora de consideração.

5$

í 3S&

MS te e-s

W; pr: %fjS r o

aOiO sr> ΐΦ i 'if $ *“’ W«i «Λ í *Λ v>I «s íf>

sn so sn s I »n í £' I w | <3\

O:

O;

oi

WWI (Λ j *Λ!

Jpj rç

I tel χ»λ ™ ψ-'ί '30 'X> | £>Q rç | sm ί rçl rçi _w | r-i T te; cte í O | m ΛΑ: SM i iru^ir-pn j^ísrq «N ’Λ i»i S\ W · W>

.F»i: :·...·>

S i «<<

<3 d

$5\ ,_t

W-ts-J -r: V< i

Γ-X it*' - w\ i Oft s η» <M · rx: M I «η S o

«3 Έ s <u <3

JO t: C' ÍI m jr^!s Jr;< \0 r : I pr;

^T > sJC'; a ^; «--w í f>4 < «>. í. **~5 ί Ci > ''S-v <U <Λ· <501 STS ’ f*>: I OÍ; w | «Λ< Sas 5 *a {**► I «: sass fcsaft I e«i:i ass ¢3 i-s »« íXíSsiS?· n>

vfj

X«*\X s“ : f*31 <*3 s <d I fM <*ϊ s **3 I e*à J <*» j <*j

« m

o yo^ ; y>X ; ym·' ; w! t | $*·.$ < atk ; j«k ! Jàfc A jM. Í .Mfe

-cf : <X·: >~í s s νΊ >>'> · V;: VS ! & s '3' in i i i scr · w 11'' f'i >/~.: d ί *3': 'sf S O i Γ-3 'd '<': 'O · IT); -4'! d' « frj ......... ' <s, _s

Ι~~· Γ'· Λ; 'S'! SOS

O'! X& --4^5<5M 5^0 inhs> <*« •’Γ,νη s??s|r

S8 <53 rZ a®»?

w;

«3 d £X: <··.χ : o I _ .......«q â&tsfc làsi W) 4«^;; 5» : *Μ· Í .........J :i Js s ^6e«et x»e*<q; 5 ^;i ,x«*^ J;

‘a '^'^! ~ ' ~¹ “ ^! “' “^: ’ *“ ’ “ d :

>'<i.3 :

d ί

179

180

182

Λ Tabela Β5-2 mostra a SEQ ID NO: que correspondíe com as sequências usadas na Tabela B5~L

Ta^Ia B5-2:. dpnunioO^UE22L

I Descrição| SEQ IP NO | | YNI3J3UF22I1 530] j YTP 16JDUF221 l 533j

ΓYTP5^

I YTP 12 DUF221 | 529j

YTP6 DUF22I | 523I ________ΥΓΡ18 DUF221 |_______ 525| j YTPD.DUF221 |528

I 1yTP1OUF2?.1 j536

I YTP21JXJF221j538

I VtpTdÜF22Í Γ520

I xipyj>yf±N |532 j________YTP9 DBF221 J _526 ;LZ3^£1SslZ1ZIZj1IZ

Z YTP4J31.T22Í I ~52T [ xiPLÍlyièl 1 ΣΙΪ1ΖΖ

Exemplo 4: Identificação de domínios compreendidos nas sequências de polin.^íd.(?o üte|s naieaji^açàp dos niétodps_dajnyengã0

A base de dados Recurso Integrado de Famílias de Proteína, Domínios e Sítios (InterPro) é uma interface Integrada para as bases de dados de assinatura habitualmente usadas para as pesquisas eom base em texto e sequência. A base tie. dados InterPro combina estas bases de dados, que usam metodologias diferentes e graus variáveis de in formação biológica em torno das proteínas bem caracterizadas para derivar assinaturas de proteína. As bases de dados colaboradoras incluem SW1SS-PROT. PROSITE, TrEMBL.

PRINTS, ProDom e Piam, Smart e TIGR.FAMs. A Interpro é abrigada no European Bioi π formaties Institute no Reino Unido.

Os resultados da varedura na InterP.ro da sequência tie polipeptídeo corno representada pela SEQ ID NO: 2 são apresentados na I a be fa (...

T^beh, Cfç Resultados de yqitxdluaJa lnterPrp da sequência de jKdjpepüdeo corno representada pela SEQ ID NO: 2

184

Número e nome dc aeesso InterPix*	Nome da base de dados integrada	Xumer* de aeesst» da base de dados integrada	Nome de acesso da nasc de dados integrada
ÍPRO14977 domínio WRC	ΗΆΜ	Pl'08879	WRC
JFRO14978 domínio QLQ	PFAM	piomí)	QLQ

Os resultados da varredura da InterPro da. sequência de polipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 213 são apresentados na

Tabela CL

Tabela „C2~1:.....Resultados de varredura da lnl.er.Pro (números de acesso principais) da sequência de polipeptídeo como representada pela SEQ TD NO:

213.

Dúvida	\ι.ι?:ΛΙ.· é.í híX» O<! >	afisSSSO SSÍSTpPCS		&sd<à	Acesso na LhsL íCíEs	Ê&eàtósO $? .'>£« laneis dü v i< Lí.	·:················ξ Wiábd
OrnaÁRW	.............................	U«k' «svc. fip« a.íNU Óg«	ÇoUD·	íkee.U?	O3DSA:	sncto	i.sme
t^yss- ARK11		Uedís Us? tipu R.u;s?.	ÍÍM5U SiiWt		SM001S4	.............	miL· SSÍ D
Orysa- ARK1.1	1 ” ScUíws.	r............................................................................: r sriACtoN.oao CO M .A MOW1UOWO nr inuo ?.4	HMM	faath«r	HWW-	ucxn	OU'·
Oro:a· ARC Lí	IPKÍ«Í?H4}	í>·»:;» ík* àsca. nW tãííg:	HMM Cíw	rtans	PW!*»·	nscsv	-Oí>
ürv<a·. ARW	ÚAioA aixs&o IPR	O*7L:k:::::s.....rr:.....	HMM Písns	RSw	PF382S	26$-;·%

XabeM.ÇY2,. Dpuunios RING e PARI nos polipeptídeos ARKL (~ Proteína de Referência

IXoínío	Proteína de Referência	SEQ ID NO:
ZK3NC4 Orysa aRKLÍ	Orysa AR.K1.1	306
ZÍC3HC4 Orysa ARKL3	Orysa... ARK L3	307
ZKDIKM Grysa ARK1..4	Orysa ARK.L4	308
ZÍOHC4 Orysa ARKLS	Ory§a ARKL5	309
ZC3HC4 Oysa A.R.KL6	Orysa ARKI..6	340
ZIORC4 Orysa ARKL7	Orysa.ARK.L7	3D
ZÍOHC4 Orysa A.RKL8	Orysa ARKL.8	3Ϊ2
ZÍOHC4 Oryss ARK.L9	Oryaa ARK1..9	”3111........'::1.......'.....

185

DonOrno	PíOtónnB de Referenda	SEQ ID NO:
ZOHC4 Zcama ÃRKLÍ	Zeama ARKLl	314
ZÍC3HC4 Zearna ARKL2	Zeaina ARKL2	315
ZÍC3HC4 Horvu ARKLl	Hnrvy ARKL1	316
ZfC3HC4 Hems ARKI..2	IRrví- ARK.L2	317
Z1C3HC4 Korea A.RK.L3	Horvu A.RKL.3	318
Zft3RC4..Lyces.ÃRKLi	Lyees ARKLl	319
ZÍC3HC4 Lvces ÂRK.L2	Lyces ARKL.2	326
Z5C3LIC4 Lyces ÃRKL3	Lyees ARKL3	321
ZOHC4 Glyma ARKLl	Glynia ARKL!	.........
ZÍC3HC4 Glyma ARKL2	Glyma ARK.L2	323
Z6C3HC4 Zmeí ARKLl	Zínel ARKLl	324
ZfC3HC4 Loàa ARKLl	Lertja ARKLl	325.........
ZfC3HC4 Ãrath ÁRKÍ..Í	Araih A RK L l	326
ZÃL3É1C4. Arath..ARKL2	Ãratb ARKL2	327
ZÍÜ3HC4 Arnih ÁRKÍ.3	Ànuh ARKL3	;1|Ι22.2'...........2.7.....771
ZtO3HC4 Ãrath ÃRKL4	Arath ARKI..4	329
ZÍOHC4 Ãrath ÁRKL5	Amh ARKL5	339
ZÍO3HC4 Ãraih ÃRK.L6	Á.rath ARKL6	1331777 7117.. 111.. 7172
ZÍU.3 HC4 Ãralh ARKL?	Araíh ARK.L7	332
ZfC3ÍÍC4 Ãraih ÃRKLB	Ardhu»LB	333
ZÍOHC4 Arath ARK1.9	Ami„ARÍL9	334
Zf€3HC4 Ãraih ÃRKLIO	Arath ARKL4 9	31
ZIU3HC4 Ârath ÃRKLÍi	Àraíh ARKLH	336
ZtO3HC4 Ãrath ARKLi2	Arath ARK.IJ2	337
ZÍC3OC4 IMpU ARKLl	Popfcr ARKLl	73387777777777777777777;
ZR3HC4 Pnpir ÃRKL2	Pepír ARKL2	339
ZR53ÓC4 Popt.r AR.KL3	Poptr ARKL3	346 7
ZÍC3ÚC4 Pnplr ÃRKÍ.4	PopíLAlWW
Z5C3HC4 Poptr ÃRKL5	Poptr ARKLS	342
ZfÕ3HC4 Poplr ARKL6	Poptr ARKL6	343
ZÍOHC4 Foptr ARKL?	Poptr ÂR.KI..7
ZÍO3H.C4 Poptr ARKL8	Poptr ARKL8	345
ZÍOHC4 Popn- ARK.L9	Poptr ARKL9	346
ZÍO3I IC4 J>optrJVRKL ΐ ü	P«ptr/RK.LÍO	347
ZOHC4>1Mn ARKLl	Medtr ARKM	.30
ZÍO3HO4 Medir ARKL2	Medir ARKI..2	349
ZÍC3HC4 Mçdtt ARKL3	Medir ARKL3	7336177771111177171117;
ZR.'3HC4 Medir ÀRK.L.4	Medir AR.KL4	351
PÍM2828 Orysa ÃRKLÍ	Orysa ARKL l	352
PfòmRZO Ürysa ARK.L2	Orysa ARKL2	353
PfAn.B2ÜÃ Õry&a ÃRKÍ.3	Orysa ARKL3	354
PfeniB2828 Õrysa ÃRKL4	Orysa ARKL4	355
HamB2O Orysa ÃRKL5	Orysa ARKI..5	356
PBmB2828 Orysa ARKL6	Orysa ARK L6	357
PfamB282^.Òrysa..ÃRKL?	Orvsa ARKL?	358
PfemBRO Orysa ARK1A	Orysa ARKL8	359
PtamB2O Orysa ARKL9	Orvsa ARKL9 x<;.... aw. ..... ;	366

186

Don·! saio	Proteína dc B.efcréncia	SEQ ID NO;
PfamB2828 Zroroa ARKLI	Zearnà ARKL1	361
PíámB2828 Zeama ÃRKL2	Zeams ARK L2	362
PlãmB2828 Umvu ARKLI	Horvu ARKL 1	363
PíamB2828 Hervu ARKL2	Horvu.ARKL2	364
PfamB2$28 Harvu ÂRKI.3	Hurvu AR.KI.3
P(amB2828 Í ÃRKU	Lyccs ARKL 1	366
Pfan.rB28.28 Lyees ARKL2	Lyces ARKL'2	367
PftmB2828 Lycss ÃRK.L3	J^vcíçARKIJ	36.8
PfamB2828 Glyrua ARKLI	OIyms ARKLI	369
PíamB2828 Glyma ARKL2	Glyma ARKL2	370
PfonB2828 Zínd ARKLI	Zinel ARKLI	371
PRmB2828 l.otja ARKLI	Lotja ARKLI	372
PfenB2828 Arath ARKLI	Arath ARK.L I	237317 lK:l
PfamB2828 Aratb ARKI..2	Arath ARKL2	374
P&mB2828 Arath ARKL3	Anàh ARK I.3	>77
PfamB2828 Ãrath ARKL4	Arath ARKI..4	376
PfemB2828 Araíh ARKLS	Anòh ARK.LS
PfámB2828 Anüb .ARKÍ.6	Arath ARK1.6	378
PiãmB2828 Araíh ÃRKL7	Arath ARKL 7	379
PfenB2828 Aratb. A.RK.L8	Arath ARKL8	380
PíàraB2828 Araíh ARKL9	Arath ARK.L9	381 .......
PfamB2828 Ârath ARKL 10	Axath ARKL 10	382
PíamB2828 Arath ARKL11	Amth ARKL 11	383
PtaB2828 Arath ARKL 12	.Arath ARKL 12	384
PíamB2828 itoptr ARKLI	Poptr ARKLI	385
Píans B2828 Papír ARKI..2	Puptr ARKL2	386
PlàmB2828 Puptx ÃRKI..3	Poptr ARK13
PfasnB2828 Poptr ARKL4	Poptr ARKL4	.388
PtamR2828 Poptr A.RK.L5	Poptr A.RK1.5	389
PfenB2828 Pupir ARKL6	Poptr ARK.L6	I3lil|;;i:772
P0uaB2828 PopV ARKL?	Poptr ARK.L7	illL:::::::::::::
ΡΙΜΏ828 Poptr ARKL8	Poptr AR.KL8	392
PIWB2828 Poptr A.RKL9	Poptr ARK.L9	lllllillllgllliligi;
PíamB2828 Pcptg ARK Llò	Poptr ARRUO	71lf7:||||;||f;||;|:;;:
PfamB282S Medtr ÃRKLI	Medtx ARKLI	1393717:7177:7:117717:::
PíãmB2828 Medir ARKL2	Medú ARKL2
PMnB2828 Medtr ARK13	Medtr ARK.L3	iliç::::;:::;:::®:::.............i:®::
PfmnB2828J4edtr~ARKU	Medir ARKI.4	398

Os resultados da pesquisa Piam da sequência de polipeptideo como representada pela SEQ ID NO: 409 são apresentadas na Tabela 0-1 (Emparelhamemos confiáveis) e Tabeh C2 (Emparelhameutos a PfannBk Tabela C3-1: EmparelhamerUos çonfiáyeis de uma pesquisa Pfam usando a .SEO..ID...NO; 409 como sequência dúvida. Os emparelhamentos confiáveis têm um mais alto do que o limiar, deduzido para 0 domínio específico cm Piam. DÜF221 é um domínio Píbm-A com 0 número de acesso PF027M.

Domínio	Início	Fim	Bits	Valor e	Almhanieiao	Mode*
DVF22 l	305	411	44 J ü	23C-I2	Align	&

Tabela C3-2: Emparelhamentos orno Fiam-B

Domínio	Inicio	Fim	Alinhamento
Pmm-Bò332	i	HO	Align
Pfam-B-4698	144	233	Align
Ptam-B-131006	234	304	Align

Exemplo 5; Porgnóstico da localização subcelular.....das......sequênçjas_.de fíoH:

ideo úteis na realização dos métodos da invenção

Os métodos experimentais para a localização fie proteína variam de imunolocalízação para o alvejamento de proteínas usando a proteína fluorescente verde (GFP) ou beta-gficuron.ídase (GUS). Por exemplo.

um polipeptideo GRF fundido a um gene do reporter de GUS foi usado para transformar transitoriamente células da epiderme de cebola (van der Knapp ef «/. (2000) Plant Phys 122: 095-704). O núcleo foi identificado como o compartimento subcelular do polipeptideo GRF. Tais métodos para identificar a compartimcntalízação subcelular de polipeptídeos GRF são bem conhecidos na técnica.

Um sinal de localização nuclear prognosticado (NLS) foi encontrado pelo alinhamento de sequência múltipla, seguido pela inspeção ocular, no domínio W.RC (GRRTDGK.KWRC) do pollpeptídeo GRF da Tabela A. Um NLS é uma ou mais sequências curtas de lisinas ou arglninas posiúvamente carregadas.

O prognóstico computacional de localização de proteína a partir dos dados de sequência foi realizado. Entre os algoritmos bem conhecidos por uma pessoa, habilitada, na técnica estão disponíveis nas ferramentas ExPASv Proteomics hospedadas pelo Swiss Institute for Bioinformaties, por exemplo, PSort, Target?, ChloroP, LocTree, Predator, LipoP, MITOPR.OT. PATS, PTSL Signal? e outros.

188

LOCtree é um algoritmo que pode prognosticar a localização subcelular e a propensão da ligação de DNA de proteínas que não de membrana em eucariotas assim como procariotas não vegetais c vegetais. LOCtree classifica proteínas animais eucaríóticas em uma de cinco classes subcelalares, enquanto que as proteínas vegetais são classificadas em uma de seis classes e as proteínas procarióticas são classificadas em uma de três classes. A Tabela D abaixo mostra a saída de LOCtree usando a informação de sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO; 2. Prognósticos de alta confiabilidade têm valore de índice de confiabilidade maiores do que 5.

Tabela D Entrada de LOCtree.....usandora.....informação de sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 2.

localização Prognosticada	índice de confiablidade	.......................... ProgrGsticn de localização irrtermcdiària($aída de SVMs diferentes na árvore hierárquica)	índice Of.· confiabilidade
Ligação de DNA	6	Não secretado. Nuclear, ligação de DNA	8. (>., 9

O compartimento subcelular prognosticado do polipeptídeo

GRF como representado pela SEQ ID NO: 2 usando o algoritmo LOCTree é o núcleo.

Exemplo 6: Ensaio relacionado com as sequências de poHpeptídep. úteis na realização dos métodosdainvenção

Os polipeptídeos GRF úteis nos métodos da presente invenção (pelo menos na sua forma nativa) tipicamente, mas não necessariamente, têm atividade regulatória transcricional e capacidade para interagir com outras proteínas, A atividade de ligação de DNA e interações de proteína-proteína podem ser facilmente determinadas m vúro ou m vivo usando técnicas bem conhecidas no ramo (por exemplo em Current. Protocols in Molecular Biology, Volumes I e 2, Ausubel et nA (1994), Current Protocols). Os polipeptideos G.R.F são capazes de ativação transcriciorral de genes repórter em células de levedura (Kím Ken.de (2004) Proc Natl Acad Sei 101(36):

189

13374-0379). Os polipeptideos ORF também são capazes de interagir com polipeptideos du fator que interage com GRF (G1F1 a GIFj; tamuém chamado de SYTI a SYT.3) ú? vivo em células de levedura, usando um ensaio de interação de proteína-proteína de híbrido duplo de levedura (Kim & n Kende, supra). Os ensaios de ligação m vrtro também são usados para mostrar que os polipeptideos GRF e G1F (também chamado de SYF) são parcemos de interação (Kim & Kende, supra). Os experimentos descritos nesta publicação são úteis na caracterização de polipeptideos GRF, e são bem conhecidos na f

técnica.

Exemplo 7: Prognóstico de topologia da sequências de polipeptídeo. útehLna realização,dos métodos da invenção

O TargetP LI prognostica a localização subcelular de proteínas eucarióticas. A designação de localização está fundamentada na presença prognosticada de qualquer uma. das pré-sequêndas de terminal Nr _t 15 peptídeo de trânsito de cloroplasto (cTF), peptídeo de alvejamento mitocondrial (mTP) ou peptídeo de sinal de caminho secretor (SP). As contagens nas quais o prognóstico final está funda.ment.ado não são realmente probabilidades, e elas não sao necessariamente adicionadas a uma. Entretanto, a localização com a contagem mais alta é a mais provável de acordo com 20 TargetP, e as relações entre as contagens (a classe de confiabilidade) pode ser uma indicação de quão certo o prognóstico é. A classe de confiabilidade (RC) varia de 1 a 5, onde 1 indica o prognóstico mais forte. TargetP é mantido no servidor da Technical University oí Denmark.

Para as sequências prognosticadas conter uma pré-sequência 25 de terminal N um sitio de divagem potencial também pode ser prognosticado.

Vários parâmetros foram selecionados, tais como grupo de organismo (não vegetalplanta ou vegetal), conjuntos de cortes (nennum, conjtmtoo pré-deünido de cortes, ou conjunto especificado pelo usuário de cortes), e o cálculo de prognóstico de sítios de divagem (sim ou não).

190

Os resultados da análise de TargetP 1.1 da sequência de polipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 121 são apresentados na Tabela E1. O grupo de organismo ‘'vegeta?' foi selecionado, nenhum corrte definido, e o coprimento prognosticado do pepüdeo de trânsito requerido. A localização subcehdar da. sequência de polipeptídeo como representada pela. SEQ ID NO: 121 é provável estar no citoplasma, no pepíideo de trânsito (Signal?) ou sinal de localização nuclear (PredictNLS) é prognosticada.

Tabela...El;.....Análise...de. TargetP......1..,.1.....da sequènda <ie polipeptídeoçppm representada pela SEQ ID NO: 121 <Amprimentó (A A)1109 iFcptídeo de trânsito cloraplásticap,09S peptídeu de trânsito mitocoadnalb jPeptídeo de sínal do caminho secrelm ...|W5 potro alvcjamento sufelularp.450

Localização Prognosticada passe de confiabilidadep jCcinpriniento da peptídeo de trânsitok feraanosfcado * 10 Muitas outros algoritmos podem ser usados para realizar tais anal ises, incluindo:

X : :

♦ ChloroP 1.1 hospedado no servidor da Technical University of Denmark;

* Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor versão 1.2 hospedado no servidor do Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Austrália;

• PENCE Proleome Analyst PA-GOSUB 2,5 hosaedado no servidor da University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canadá;

• TM.HMM, hospedado no servidor da Technical University of 20 Denmark

Os resultados da análise de Target? 1,1 da sequência de polipeptídeo como representada pela SEQ ID NO: 169 são apresentados na Tabela E2. O grupo de organismo “vegetaD foi selecionado, nenhum corte defmido, e o comprimento prognosticado do peptideo de trânsito requerido. A

191 localízação subcelular da sequência de polipeptideo como representada pela

SEQ ID NO: 169 pode ser a. mitocôndria; entretanto deve ser mencionado que a classe de confiabilidade é 5 (isto é. a classe de confiabilidade mais baixa).

Tabela E2:.....Análise de TargetPLI da sequência de polipeptideo como representada pela SEQ 1.D NO; 169

Ctemprímenío (AA)
Peptídeo de trânsito cloroplâsüco	0J125
Peptfdeo de trânsito miuxmndrud	.......
peptídeo de sinal do caminho xecretor	0,009
Outro aiveiamento subedukr	0,416
Localização Prognosticada	Mitocôiidãa
classe de confiabilidade	1I5II7;!:::';.....

Dois domínios de transmembrana são identificadas pelo programa 'ΓΜΗΜΜ. hospedado ao servidor do Center for Biological Sequence Análise, Technical University of Denmark. A probabilidade de que o terminal N esteja localizado dentro ά 0,997. Mais detalhes sobre a orientação são dadas na Tabela F:

Tabela F: Resultados de TMHMM.2J)

OrieniacM	Resíduo começa - fim
dentro	1	42
TMhéHce	43	65
fora	66
rfMhêfice	7S	92
dentro	93	105

Muitos outros algoritmos podem ser usados para realizar tais análises, induindo:

ChloroP 1,1 hospedado no servidor da Technical University of

Denmark.;

Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor versão L2 hospedada no servidor do Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane. Australia;

PENCE Proteome Analyst PA-CX)SUB 2.5 hospedado no servidor da University of .Alberta, Edmonton, Alberta, Canadá;

Exemplo 8: Ensaio funcional para os polipeptideos ARKL

192

O enxsaio de ubiquitmação é realizado esssncialmente como descrito pur Stone e/ <7/. 2005. A proteína ARKL rotulada corn GS I. e incubaria a 30° C e pH 7,5 com levedura EL E2 purifcada em UBUC8, e ubiqukína (Sigma). A reação é ínterompida e analisada pela eletrofbresc de 5 SDS-PAGE seguida pela western blotting, usando anticorpos de ubiquitins.

Experimentos de quelaçao de zinco são feitos incubando-se proteína GST-A.RKJL ligadas a pérolas tratadas com TPEN com ZnCK Exemplo 9: Prognóstico de topologia de transmembrane das sequências do polipeptideo úteis na realização dos métodos da invenção o algoritmo TMHNTM V 2.0 (Krogh A «7. 2001 J Mol Bíol,

305, 567-580) foi usado para prognosticar hélices de transmembrane na SEQ ID NO: 409.

Como mostrado abaixo existem 4 hélices de transmembrane prognosticadas. A posição dos resíduos de aminoácido para as hélices 15 também é indicada. .As alças entre as hélices de transmembrane são prognosticadas estar localizadas dentro da membrane para as alças entre os resíduos 28-85 e 172-373 e fora para a alça entre, os resíduos 109-151.

# Número de Sequência de TMHs prognosticado: 4 íí Número de Sequência Exp de AAs cem TMHs: 89,26923 # Número de Sequência Exp. primeiros 60 AAs: 22,14249 # Sequência Total prob de N-em: 0,04519

Sequência de sinal de terminal N da sequência POSSIBLE MçÀLEútó

SequênciaTMHΜ M2.0	fora	1	4
SequêncíaTM HMM'2,0	TMheHx	5
Seq uê nc i aTMH Μ M2.0	dentro	28	85
SeqaênciaTM HMM2.0	TMhelix	86	108
SequêndaTMHMM2.0	fera	109	151
Sequê»eàaTMHMM2.0	TMhelix	152	171
Seq?rínriaTMl 1Μ M2.0	dentro	172	373
Sequência'rMHMM2..O	TMhelix	374	396
Sequência TMH Μ M2.0	fera	397	428

Exemplo 10:

1$ 3

a) Clonagem da sequência de ácido nucléico como representada pela SEQ IP NO:..l.

A menos quee de outro modo estabelecido, as técnicas de DNA recombinantes são realizadas de acordo com os protocolos padrão 5 descritos em (Sambrook. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3^;i Edição Cold Spring .Harbor Laboratory Press, CSH, Nova Iorque) ou nos Volumes 1 e 2 de Ausubel er a/. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Os materials e métodos padrão para o trabalho molecular vegetal são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) 10 por R. D. D. Croy, publicado pela BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications (UK).

O cDNA de ίΛα/ζαπα que codifica a sequência de polipeptídeo GRF como representada pela SEQ ID NO: 2 foi amplificada pela PCR usando como padrão um banco de cDNA de sintetizado a partir do mRNA extraído de tecidos vegetais misturados. Os seguintes inicíadores, que incluem os sítios AttB para a recombinação Gateway, foram usado para a amplificação pela PCR.:

.1) Prm 10010 (SEQ ID NO: 118, sentido);

5¹ -GGGG ACA AGITTGT ACA AA A. A AGC AGGCTTA A A CA A TG A T

GAGTCTAAGTGGAAGTAG-3’

2) Prm 10011 (SEQ ID NO: 119, reverso, complementar): 5’-GGCK3ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGCTCTACTTAA ITÀGCTACCAGAV

A PCR. foi realizada usando Hifi Taq DNA polimera.se em 25 condições padrão, Um. fragmento de PCR do comprimento esperado (incluindo sidos attB) foi amplificado e purificado usando também métodos padrão. A primeira, etapa do procedimento Gateway, a reação BP, foi depois realizada, durante o que o fragmento de PCR recombinado m vfvo com o plasrnídeo pDONR20l para produzir, de acordo com a terminologia de

194

Gateway, um “done de entrada’c O plasmídeo pDONR201 foi adquirido da Jnvitrngen, cornu parte da tecnologia Gateway®).

bl .ÇfoPêMUP. sequência de ácido nucléico quo codifica os polipeptideos equivalentes aJRAAl usadps nos métodos da invenção

A sequência de ácido nudéico usada nos métodos da invenção foi amplificada, pela PCR usando como padrão unia biblioteca de cDNA de mudas de Orpro .rortro feita de encomenda (em pC.M.V Sport 6.0; Invítrogen, Paisley, UK), A PCR. foi realizada usando Hifi Taq DNA poümerase em condições padrão, usando 200 ng de padrão em uma mistura de PCR de 50 μΐ. Os iniciadores usados furam prm09129 (SEQ ID NO: 122; sentido, codon de partida em negrito):

5’ ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggettaaacaatgtcaggggtttgggtg 3' e prm09988 (SEQ ID NO: 123: reverso, complementar):

’ ggggaccaetttgtacaagaaa.gct.gggttgtcgcataggt.caa.tltagg 3', que incluem os sítios AttB para a recombínação de Gateway, O fragmento de PCR. amplificado foí purificado usando também métodos padrão. A primeira etapa do procedimento Gateway, a reação BP, foi depois realizada., durante a qual o fragmento de PCR recombina m võm com o plasmídeo pD0NR2Ol para produzir, de acordo com a terminologia Gateway, um “clone de entrada', equivalente apRAAl. O plasmídeo pIXJNR.201 foi adquirido da Invitrogen, como parte da tecnologia Gateway**.

c) Clonagem de gene da sequência.....de ácido nucléico que codifica os polipcptíêeus SYR

Manipulação de DNA: a menus que de nutro modo estabelecido, as técnicas de DNA recumbmanie são realizadas de acordo com protocolos padrão descritos em (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3“ Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nova Iorque) on nos Volumes I e 2 de Ausubel &t at (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Os materiais e métodos

198 padrão para o trabalho molecular vegetal sSo descritos cm Plant Molecular Biology Labfax. (1993) por R. D. D. Croy, publicado pela BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications (UK).

O gene SYR de Orvzo ,ναπνο foi amplificado pda PCR usando 5 como padrão uma biblioteca de cDNA de mudas de Oryzo μ/jvo (Invitrogen, .Paisley, UK). Depois da transcrição reversa do RNA extraído das mudas, os cDNAs foram clonados em. pCMV Sport 6.0. o tamanho médio do inserio do banco foi de 1,5 kb e o número original de clones foi da ordem de 1,59 x 10 ’ cfu. O título original foi determinado ser 9,6 x. l(P cfu/m.1 depois da primeira.

amplificação de 6 x IO¹¹ ctit/ml. Depois da extração de plasmídco, 200 ng de padrão foram usados em uma mistura de PCR de 50 ul. Os miei adores prm08.l70 (SEQ 1.D NO: 170; sentido, codon de partida em negrito, sitio AtíBI em. itálicos:

5’ggggacuv7grRgPac^omma\gCiaggem'.mu’Ci7atggaaggtgt.aggt.gctagg-3') e 15 prm08171 (SEQ I'D NO: 171; reverso, complementar, sitio AttB2 em itálicos:

S^gçgggocc^còúfgòacucígrru^gctgggtcaaaaacaaaaataaattcccc-S’), que incluem os shios AttB para a recombinação Gateway, foram usados para a amplificação pela PCR.

A PCR foi realizada usando Ilifi Taq DNA po.lí.merase em. 20 condições padrão. Um fragmento de PCR. do tamanho correto foi amplificado e purificado usando também, métodos padrão,. A primeira etapa do procedimento Gateway, a reação BP, foi depois realizada, durante o que· o fragmento de. PCR recombina m vivo com o pla&mideo pDONR20I para produzir, de acordo com a terminologia Gateway, um clone de entrada”, 25 pSYR» O plastnídeo pDONR201 foi adquirido da Invitrogen, como parte da tecnologia Gateway^.

de ácido nucléico que codifica os polipeptídeos ARK.L usados nos métodos da invenção

A sequência de ácido nucléico usado nos métodos da invenção

196 foi amplificado pela PCR usando como padrão uma biblioteca de cDNA de mudas e paníctdas de Cbmuc wòw feitas de encomenda (em pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley; UK). A PCR tbi realizada usando .Hifi Taq DNA polimerase em condições padrão, usando 200 ng de padrão em uma mistura de PCR de 50 μΐ. Os iniciadores usados foram prm()4873 (SEQ ID NO: 404; sentido, codon de partida em negrito): 5''\^gggacaagtiigtacaa.aaaagcaggettaaaoaatggai.galcscatgggaaga-<r e prm04874 (SEQ TD NO: 405; reverso, complementar): 5^!~ggggaccac.tttgt.acaagaa;agctgg_;gttttggtltctga.ag.aagcacc~3, que incluem os sítios AttB para a recombinaçao Gateway. O fragmento de PCR amplificado foi purificado usando também métodos padrão. A primeira etapa do procedimento Gateway, a reação BP, foi depois realizada, durante o que o fragmento de PCR recombina m vivo com o plasmídeo pDONR.201 para produzir, de acordo com a terminologia Gateway, um clone de entrada'’, pARKL. O plasmídeo pDONR201 foi adquirido da Invitrogen, como parte da tecnologia Gateway^.

e) Clonagem do ácido nucléico que codifica os polipeptideos YTP usados nos métodos da, invenção

A sequência de ácido nucléico usada nos métodos da invenção foi amplificada pela PCR usando como padrão uma biblioteca de cDNA de muda de Orvsa su/óví feita de encomenda (em pCMV Sport 6.4); Invitrogen, Paisley, UK). A PCR foi realizada usando Hifi Taq DNA. polimera.se em condições padrão, usando 200 ng de padrão em uma mistura de PCR de 50 pi. Os iniciadores usados foram (SEQ ID NO: 546; sentido, codon de partida em negrito.):

5••ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggacaccgcgtcgt-3 e (SEQ ID NO: 547; reverso, complementar):

’ •“ggggaccactt.tgt.aeaagaaag(:tgggtcagcacttgcattagatggat-3 ’, que incluem os sítios AttB para a recombinaçao Gateway. O

197 amplificado fragmento de PCR foi purificado usando também métodos padrão. A primeira etapa do procedimento Gateway, a reação BP, foi depois realizada, durante o que o fragmento de PCR recambias m vivo com o plasmídeo pD()NR201 para produzir, de acordo cota a terminologia Gateway;

um “clone de entrada*, pENTR-YTP L O plasmideo pDONRIOl foi adquirido da Invitrogeu, como parte da. tecnologia Gateway®.

Exemplo 1 b

a) Cqnstração de yeUK de expressão usando a sequência de ácido nucléico como representado pela SEQ ÍD NO: 1

O clone de entrada que compreende a SEQ ID NO: 1 foi subsequentemente usado em uma reação de LR com um vetor de destinação usado para a transformação de Orm-o soma?. Este vetor conteve como elementos funcionais dentro das bordas de T-DNA: um marcador vegetal selecionável; unt cassete de expressão de marcador triável; e um cassete 5 Gateway intencionado para a reeombinação de LR m vivo com a sequência de ácido nucléico de interesse já clonado no done de entrada. Um promotor do arroz de G0S2 (SEQ ID NO: 117) para a expressão constitutiva fbi localizado a montante deste cassete Gateway.

Depois da etapa de reeombinação de LR, o vetor de expressão 0 pGOS2::GRF resultante (Figura 4) foi transformada na. cepa de

Agrobacterium I..BA4Ô44 de acordo com cs métodos bem conhecidos na técnica.

b) Construção de vetor de expressão usando a sequência d.e ácido nucléico

SjyQ..LD.NO:.120

0 clone de entrada que compreende a SEQ ID NO: 1.20 foi depois usado em. uma reação LR com um vetor de destínação usado para a transformação de Orrau xrmvm Este vetor conteve como elementos funcionais dentro das bordas de T-DNA: um marcador selectonável. de planta; um cassete de expressão de marcador triável; e um cassete Gateway intencionado

198 para a recombinação de LR m vivo com a sequência de ácido nucléico de interesse já danada no done de entrada» Um promotor de GOS2 do arroz (SEQ ID NO: 124) para a expressão constitutiva foi localizada a montante deste cassete Gateway. Em uma forma de realização alternativa, um promotor 5 de HMOP do arroz (SEQ ID NO: 125) para a expressão constitutiva foi localizada a montante do cassete Gateway.

Depois da etapa de recombinação LR, o vetor de expressão pG0S2::Eqtüva.lente a RAA1 resultante (Figura 9), ou pHMGP::EquivaIente a RAA 1, foi transformado na cepa de JnrodcGermoí LBA4044 de acordo com 10 métodos bem conhecidos na técnica.

c) Construção de vetor de expressão usando a sequência de ácido nucléico que codifica os polipeptídeos SYR

O clone de entrada pSYR foi subsequentemente usado em uma reação LR com um vetor de destí nação usado para a transformação de On car 15 swòzn Este vetor contém como elementos fimclonais dentro das bordas· de ΓΟΝΑ: um marcador selecionável de planta; um cassete de expressão de marcador triável: e um cassete Gateway intencionado para a recombinação de LR óí v/vn com a sequência de interesse já danada no clone de entrada. Um promotor de GOS2 do arroz (SEQ ID NO: 211) para a expressão constitutiva 20 foi localtzao a montante deste cassete Gateway. Uma construção de vetor similar foi preparada, mas com o promotor de proteína de grupo de aha mobilidade (HMGP, SEQ ID NO: 200 ou SEQ ID NO: 210) ao invés do promotor GOS.

Depois da etapa de recombinaçâo LR, os vetares de expressão 25 resultantees, pGOS2;:SYR (com o promotor de GOS2) e pHMGP::SYR (com o promotor de HMGP), ambos para a expressão de SYR constitutiva (Figura

1.3) foram tornsfonuados na cepa de Agrobacterium LBA4044 e subsequentemente nas plantas de Onzu .wPfvm

d) Construção de vetor de expressão usando a sequência de ácido nucléico

199 .ç.ÊBq representada.j^Ja SEQ11‘XNO12]2

O clone de entrada que compreende a SEQ ID NO: 212 foi depois usado em uma reação de LR. com um vetor de destmação usado para a transformação de Onw srforeç Este vetor conteve como elementos funcionais dentro das bordas de T-DNA: um marcador selecionável <íe planta; um cassete de expressão de marcador triâvel; e um cassete Gateway intencionado para a recombínação de LR. òt Ww com a sequência de ácido nucléico de interesse já danada no done de entrada. Um promotor de G0S2 do arroz (SEQ 1.D NO: 406) para a expressão especifica de raiz foi localizado a 10 montante deste cassete Gateway.

Depois da etapa de recombinação de 'LR, o vetor de expressão pGOSStcARKL resultante (Figura 18) foi transformado na cepa de LBA4044 de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

como representada pda SEQ ID NO: 408

O clone de entrada que compreende a. SEQ ID NOt 408 foi depois usado eem uma reação de LR com um vetor de destmação usado para a transformação de Orreo .umvm Este vetor conteve como elementos funcionais dentro das bordas de T-DNA: um marcador selecionàvel de planta; um 20 cassete de expressão de marcador triável; e um cassete Gateway intencionado para a recombinação LR m vivo com a sequência de ácido nucléico de interesse já clonada no clone de entrada. Um promotor de GOS2 do arroz (SEQ ID NO: 548) para a expressão específica de raiz foi localizado a montante deste cassete Gateway;

Depois da etapa de recombinação de LR, o vetor de expressão pGOS2::YTPI resultante (.Figura 23) foi trans formado na cepa de Anrobacterium LBA4044 de acordo com os métodos bem conhecidos na

V ...... ....... ...............

técnica.

200 .Tousforinaçãu .de .Arroz

A contendo o vetor de expressão foi usado para transformar plante de Oraczr szmte. Sementes secas maduras do arroz j^otèíü culthar AQ^onzwu foram descascadas. A esterilização foi realizada incubando-se por um minuto em etanol a 70 %, seguido por 30 minutos em HgCh a 0,2 %. seguido por uma lavagem de 6 vezes por 15 minutos com água destilada estérib As sementes eateries foram depois germinadas em um meio contendo 2,4~D (meio de indução de calo). Depois da Incubação no escuro por quatro semanas, os calos embriog-emeos, derivados do escutelo foram excisados e propagados no mesmo meio. Depois de duas semanas, os calos foram multiplicados ou propagados pela subculture. no mesmo meio por mais 2 semanas. Os pedaços de calo smbriogênicos foram sub-cultivados em meio fresco 3 dias antes do co-cultivo (para reforçar a atividade de divisão celular).

A cepa de ./Igrobnefórfnm LBA4404 contendo cada vetor de expressão individual, foi usada independentemente para o co-cukivo. A /Igrobuerteum foí inoculada em meio AB com os antibióticos apropriados e cultivados por 3 dias a 28^c C. As bactérias foram depois coletadas e colocadas em suspensão em meio de co-cultivo líquido a uma densidade (OD^) de 20 cerca de 1. A suspensão foi depois transferida a uma placa de petri e os calos imersos na suspensão por 15 minutos. Os tecidos de calo foram depois manchados a seco em um papel de filtro e transferidos para meio solidificado, de co-cultivo e incubados por 3 dias no escuro a 25^<? C, Os calos co-cultivados foram cultivados em meio contendo 2,4-D por 4 semanas no escuro a 28° C 25 na presença de um agente de seleção. Durante este período, ilhas de calo resistentes quee crescem rapidamente desenvolveram-se. Depois da transferência deste material para um mcei.o de regeneração e incubação na luz, o potencial embriogênico foi liberado e os brotos desenvolveram-se nas quatro a cinco semanas seguintes. Os brotos foram excisados do calo e

201 incubados por 2 a 3 semanas em um meio contendo auxina do qual foram transferidos para o solo. Os brotos endurecidos foram cultivados sob aha umidade e dias curtos em uma estufa.

Aproximadamente 35 transformantes do arroz 1'0 independentes foram gerados para cada construção. Os transformantes primários foram transferidos de uma câmara de cultura de tecido para urna estufa. Depois de uma análise de PCR. quantitativa para verificar o número de cópia do ínserto de T-DNA, apenas as plantas transgênicas de cópia única que exibem tolerância ao agente de seleção foram mantidas para a colheita da 0 semente Tl. As sementes foram depois colhidas três a cinco meses depois do transplante. O método produziu transformantes de local único a uma taxa de mais de 50 % (Aldemite e Hodges 1996, Chan ut&Z. 1993, Hieiet nd. 1994). Exemplo 13: Procedimento de Avaliaáo Fenotipica

13.1- 1 Projeto de avaliação geral

Aproximadamente 35 transform antes do arroz TO independentes furant gerados. Os transformantes primários foram transferidos a partir de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa para cultivo e colheita de semente TI. Seis eventos, dos quais a progênníe Tl segregou 3:1 quanto a presença/ausência do transgene, foram retidos, Para cada um destes 0 eventos, aproximadamente .1.0 mudas Tl contendo o transgene (hetero- e humo-zigotos) e aproximadamente 10 mudas Tl que carecem do transgene (nulizigotos) foram selecionadas pelo monitoramento visual da expressão do marcador. As plantas transgenicas e os nulizigotos correspondentes foram cultivados lado a lado em posições aleatórias. As condições da estufa foram de dias curtos (12 horas de luz), 28° C na luz e 22⁰ C no escuro, e uma umidade relativa de 70 %.

13.1- 2 Projeto de .Avaliação. para plantas transformadas com S¥R_;. snb o çontrole do..promotor .G.QS2,.dp arrançou do pron^

Aproximadamente 15 a 20 transformantes do arroz T0

202 independentes foram gerados. Os transfonnantes primários foram transferidos de uma câmara de cuhura de tecido para uma estufe para, cultivo e colheita de semente Tl. Oito eventos, dos quais a progênie TI segregou 3:1 quanto a presença/ausência do transgene, foram retidos, Para cada um destes eventos, 5 aproximadamente 10 mudas Tl contendo o transgene (hetero- e homozigotos) e aproximadamente 10 mudas Tl que carecem do transgene (nulizigotos) foram selecionadas pelo monitoramento visual da expressão do marcador. As plantas Ti selecionadas foram transferidas para uma estufe. Cada planta recebeu um rótulo de código de barras único para liga de modo 10 não ambíguo as dados fenotípicos com a planta, correspondente. As plantas Tl selecionadas foram cultivadas em solo em vasos de diâmetro de 10 cm sob os seguintes ajustes ambientais: fotoperíodo ™ 11,5 h, intensidade da luz do dia 30.000 lux ou mais, temperatura, diurna ™ 28° C ou mais alta, temperatura noturna ™ 22* C umidade relativa ··- 60 a 70 %.

Projeu> Geral

A partir do estágio de semeadura até o estágio de maturidade as plantas foram passadas diversas vezes através de uma cabina de formação de imaggem digital. Em cada ponto de tempo imagens digitais (2048 x 1536 pixels, 16 milhões de cores) foram tiradas de cada planta de pelo menos 6 20 ângulos diferentes.

Quatro eventos Tl foram ainda avaliados na geração T2 seguindo o mesmo procedimento de avaliação como para a geração TI mas com mais indivíduos por evento, A partir do estágio de semeadura ate o estágjo de maturidade as plantas foram passadas diversas vezes através de 25 uma cabina de formação de imagem digital. Em cada ponto tie tempo imagens digitais (2048 x 1536 pixéis, 16 milhões de cores) foram tiradas de cada planta de pelo menos 6 ângulos diferentes.

13.2 Análise est^ístíçaçteste F

Um ANOVA de dois íators (análise de variantes) foi usado .203 conic am modelo estatístico para a avaliação global de características fenctipicas de pl anta, Um teste F fol realizado em todas os parâmetros medidos de todas as plantas de todos os eventos transformados com o gene da presente invenção, O teste F foi realizado para checar quanto a mn efeito do 5 gene em relação a todos os eventos de transformação e para verificar quanto a nm efeito global do gene, também conhecido como um efeito de gene global· O limiar de significância para um efeito de gene global verdadeiro foi ajustado a um nível de probabilidade de 5 % para o teste F. Um valor de teste F significance salienta a um efeito de gene, significando que não é apenas a 10 mera., presença ou posição do gene que está causando as diferenças no fonótipo,

Porque dois experimentos com eventos de sobreposição foram realizados, uma análise combinada foi realizada. Isto é útil para checar a compatibilidade dos efeitos em relação aos dois experimentos, e se este for o 15 caso, acumular evidência de ambos os experimentos de modo a aumentar a confiança na conclusão, O método usado foi um método de modelo misto que leva em conta a estrutura de nível múltiplo dos dados (isto é, experimento evento ·· segregates). Os valores P foram obtidos comparando-se o teste da razão de probabilidade com as dislrubuições de qui quadrado,

Porque dois experimentos com eventos sobrepostas foram realizados, uma análise combinada foi realizada. Isto é útil para, checar a compatibilidade dos efeitos em relação aos dois experimentos, e se este for o case, acumular evidência de ambos os experimentos de modo a aumentar a confiança na concl usão, O método usado foi um método de modelo duplo que 25 leva em conta a estrutura de nível múltiplo dos dados (isto é, experimento evento - segregantes). Os valores P foram obtidos comparando-se o teste da razão de probabilidade com as distribuições de qui quadrado.

1.3.3 Parâmetros medidos

Medida de parâmetro relacionado com a biomassa (método

204 geral)

A partir da estágio de semeadura até o estágio de maturidade as plantas foram passadas diversas vezes através de uma cabina de formação de imagem digital. Hm cada ponto de tempo imagens digitais (2043 x 1536 ptxéis, 16 milhões de cores) foram tiradas de. cada planta de pelo menos 6 ângulos diferentes.

A área acima do sola da planta (ου biomassa fblhosa) foi determinada contando-se o número total tie pixels nas imagens digitais da parte de plantas acima do solo discriminada do fundo. Este valor foi calct.tla.do em média para as imagens tiradas no mesmo ponto de tempo dos ângulos diferentes e foi convertido a. um valor de superfície física expressado em mm quadrado pela caltbração. Os experimentos mostram que a área de planta acima do solo medida deste modo correlaciona-se com a biomassa de parte de plantas acima do solo.. A área acima do solo è a área medida n ponto de tempo no qual a planta atingiu a sua. biomassa folhosa máxima. O vigor inicial é a área, acima do solo de planta (mudas) três semanas após a germinação. O aumento na biomassa de raiz é expressada como um aumento na biomassa de raiz total (medida como biomassa máxima de raizes observadas durante o período de vida de ama planta); ou como um aumento no indice de raiz/broto (medido como a razão entre a massa de raiz e a massa de broto no período de crescimento ativo de raiz e broto).

O vigor inicial foi determinado contando-se o número total de pixels de partes de planta acima do solo discriminadas do fundo. Este valor foí calculado em média para as imagens tiradas no mesmo ponto de tempo de ângulos diferentes e foi convertido a um valor de superfície física expressado em mm quadrado pela calibração. Os resultados descritos abaixa são para plantas três semanas após a germinação.

Medidas de parâmetro relacionado com semente (método geral)

Os paniculos primários maduros foram colhidos, contados, ensacados, rotulados com código de barras e depois secados por três dias em uma estufa a 37^w C Os paniculos foram depois debulhados e todas as sementes foram coletadas e coutadas. As cascas cheias foram separadas das vazias usando um dispositivo soprador de ar. A.s cascas vazias foram descartadas e a fração remanescente foí mais uma vez contada. As cascas cheias foram pesadas em uma balança analítica. O número de sementes cheias foi determinado contando-se o número de cascas cheias que permaneceram depois da etapa de separação. O peso de semente total por planta foi medido pesando-se todas as cascas cheias colhidas de uma planta. O número de semente total por planta foi medido contando-se o número de cascas colhidas de uma. planta. O Peso de Mil Grãos (TKW) é extrapolado do número de sementes cheias contadas e seu. peso total O índice de colheita (Hl) na presente invenção é definido como a razão entre o peso de semente total por planta e a área acima do solo (mnr), multiplicada por um fator de 10''. O número total de flores por panículo como definido na presente invenção é a razão entre o número total, de sementes e o número de panículos primários maduros. A taxa de enchimento de semente eomo definida na presente invenção é a proporção (expressada como urn (VO) do número de semente cheias em relação ao número total de sementes (ou fiósculos).

Triagem da eficiência no uso de nitrogênio (para plantas transformadas com SYR)

As plantas de arroz de sementes T2 foram cultivadas em solo dc vaso sob condições normais exceto quanto a solução de nutriente. Os vasos foram regados do transplante ate a maturação com uma solução de nutriente específica contendo teor de nitrogênio N (N) reduzido, usuahnente entre 7 a 8 vezes menos. O rasto do cultivo (maturação da planta, colheita de semente) foi o mesmo como para as plantas não cultivadas sob estresse abíòttco. Os parâmetros de cultivo e rendimento são registrados como detalhado para o

2U6 eulnvn sob condições normais.

Triagem de estresse pela seca (para plantas transformadas com SYR) zãs plantas de atroz de Tl, T2 on outras gerações foram cultivadas em solo de vaso sob condições normais até que se aproximassem do estágio de formação de cabeça. Estas foram depois transferidas a uma seção “seca” onde a irrigação foi retida. Sondas de umidade foram inseridas em vasos aleatoriamente escolhidos para monitorar o teor de água do solo (SWC). Quando SWC foi abaixo de certos limiares, as plantas foram automaticamente regadas continuamente até que um nível normal fosse mais uma vez atingido. As plantas foram depois re-transferidas mais uma. vez às condições normais. O resto do cultivo (maturação de planta, colheita de semente) foi a mesma como para plantas não cultivadas sob condições de estresse abiótico. Os parâmetros de cultivo e rendimento foram registrados como detalhado para o cultivo sob condições normais. As condições de· seca aplicadas foram 'condições de seca severas” como definido acima.

Exeniplo H:.....Resultados da avaliação fenotípica das plantas de arroz transgemcas que expressam a sequência de ácido nuciéico que codifica um uolipeptidco GRF como representado pela SEQ1D NO: 2

Os resultados da. avaliação de plantas de arroz transgênieas que expressam a sequência de ácido nuciéico que codifica um polipeptídeo GRF como representado pela SEQ II.) NO: 2, sub o controle do promotor de GOS2 para, a expressão constitutiva, e cultivadas sob condições de cultivo normais, são apresentadas abaixo.

Houve um aumento significaste no vigor inicial, na biomassa acima do solo, no rendimento de semente total por planta, na taxa ele enchimento de semente, no índice de colheita, e no Peso de Mil Grãos FTKW) das plantas transgênieas comparadas com os nulizigotos correspondentes (controles), como mostrado na Tabela G.

Tabela G; Resultados da avaliação de plantas de.. arp5T...tmisgênieas.jiue expressam a sequência de ácido nuclei eu que codifica um polipeptídeo GRF^? como representado pela SEO ID NO: 2, sob o controle do promotor de GOS2 para a expressão consliluliya.

.....Vb)......................................... <	Aumento % Médio Global em 6 Eventos na geração TI
Biomassa acima do solo	2%
Vigor 1 ui dal	13%
Remlimenío de semente total por planta	12%
Taxa de enchimento de semente	.5 %
índice de colheita	11 %
TKW	U H

E.x.empln...l5;.

a) Resultados da avaliação ténotípiea das plantas de arroz transgênicas que expressam, sequências de.ácido nucléico que codificam outros polipeptideos GRF

As plantas de arroz tnmsgêmcas foram geradas, índependentemente de expressar as sequências de ácido nucléico que codificam, outros polipeptideos GRF, como mostrado na Tabela H abaixo, sob o controle do promotor de GOS2 para a expressão constitutiva.

Houve um aumento no Peso de Mil Grãos (TK.W) das sementes de plantas transgênicas comparadas com os nulizígotos correspondentes (controles), para as três construções. Este aumento foi menos pronunciado do que para as sementes de plantas transgênicas que expressam a sequência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo GRF como representado pela SEQ ID NO: 2.

Tabela Hr Outro ácido nucléico GRF e sequências de polipeptídeo testadas em plantas de arroz, transgênico, sob o controle do prumofpr .de GOS2 para a expressão constituí! va.

Ipollpepudeo GRF l testado	Ácido nucléico SEQID NO	Polipeptídeo SEQ ID ND
ÍAT4G37740	SEQ 10 NO: 15	SEQ ID NO: 16
ÍÁ'Í'2G364{D	SEQ ID NO: 7	SEQ ID NO: 8
kT2G22W	SEQ ID NU: 5	SEQ ID NO: 6

b) Resultados da avaliação fenotípica das plantas transgêniças.que expressam

208 uni ácido nucléico equivalente a RAM

Os resultados da avaliação de plantas de arroz transgênicos que expressam um ácido nucléico equivalente a RAA1 sob o controle de um promotor constitutivo (seja GOS2 ou HMGP) sob condições não estressantes foram como segue: um aumento de pelo menos 2 % foi observado para o Peso de Mil Grãos e um aumento de mais do que 5 % foi observado quanto a pelo menos um dos seguintes parâmetros: índice de raiz/broto, biomassa de raiz total, flores por p&niculo.. Também sob condições de disponibilidade de nitrogênio reduzida, um aumento foi observado em um ou mais dei biomassa de raiz, altura, e índice de verdura.

cl)_______Medida_______de parâmetros........relací onados com___o rendimento para transibrm.anles pGOS2iiSYR cultivados sob condições de deficiência de nmnente.1

Na análise das sementes como descrita acima, os inventores descobriram que as plantas transformadas num a construção dc gene pGOS2::SYR e cultivadas sob estresse de deficiência de nutriente, ti.vve.ram um rendimento de semente mais alto, expressado como número de sementes cheias (aumento de mais do que 5 %), peso total de sementes (aumento de mais do que 5 H) e TKW (aumento de mais do que 2,5 %), comparadas com as plantas que carecem do transgene SYR. Também .foi observado um aumento na biomassa de bruto (mais do que 5 %) e biomassa de raiz (diversas linhagens maiores do que 5 %).

c2) medida de parâmetros relacionados com o rendimento para transformastes pGOS2::SYR cultivados sob çondiçõesdeestresse severo pela, seca:

Na análise das sementes como descrita acima, os inventores descobriram que as plantas transformadas com a construção de gene pGGS.2::SYR e cultivadas sob estresse severo pela seca, tiveram um rendimento de semente mais alto, expressado como peso total de sementes (aumento de mais do que 5 %), taxa de enchimento (aumento de mais do que

209

S %) e índice de colheita (aumento de mals do que 5 %), comparada com as plantas que carecem do transgene S YR.,

d) Resultados da avaliação fenodpica das plauús transgêníças que expressaat o ácido nucléico Orysa-ARKLl

Os resultados da avaliação de plantas do arroz transgênicas que expressam o ácido nucléico Orysa-ARKLl sob condições não estressantes são apresentadas abaixo, Um aumento de pelo menos 5 % foi observado quanto o vigor de emergência (vigor inicial), rendimento de semente total, número de sementes cheias. Peso de Mil Grãos e índice de colheita, e de 3 % para o Peso de Mil Grãos, Tabela L Resultados da avaliação fenotipica.

ITraçü pí> de aumento emi j plantas transgênícasAxm&ole i

I (sob condições não estressantes I iRendimeain de (IIi (semente total_ p| iNúmernof 8í

Sementes |i te&d. t1 g_, .............................

IVigor inicial (11| y ndice de colheita___6 i

As plantas de arroz transgênicas que expressam o ácido nucléico Orysa-ARKLI foram tarubém avaliadas sob condições de estresse pela seca como descrito acima. Os mesmos parâmetros (aumento no rendimento de semente, número de sementes cheias, vigor inicial e índice de colheita) também foram aumentadas em plantas transgêmoas versus a planta de controle correspondente, embora, a um grau mais baixo, íD..E^5yJfãd9ã..da..ayaljaçap...fenotíglcadas jdantas:.omtsggnic^ que exjjressani um áçido nucléico YTP1

Os resultados da avaliação de plantas de arroz transgênicas que expressam um ácido nucléico YTP1 sob condições não estressaut.es sao apresentados abaixo, Um aumento de pelo menos 5 % foi observado para o rendimento de semente total, taxa de enchimento de semente, número de

210 floras por pamculo, índice de colheita, e 2 % para o Peso de Mil üraos.

Os resultados da avaliação de plantas de arroz iransgenicas quo expressam um ácido nucléico YTP1 sob condições não estressantes são apresentados aqui abaixe. Um aumento foi observado para o peso de semente total, número de sementes cheias, taxa de enchimento, índice de colheita e peso de mil grãos (Tabela J)>

Melai Resulh^

Traço relacionado com o rendimento	% de aumenta nas plantas transgémcas earn respeito às de controle
Pesa de semente total	10
Taxa de enchimento de	...... ...............................................
.semente	.......................................................................................
Piores por pamom.o
índice de colheita	B::...... ......... .....-
Peso de Mil Grâo$	3....................................................................................................

Exemplo 16: Exemplosde transformação de outras safras

Transformação de milho

A transformação de milho (zfou mqvs) é realizada com uma modificação do método descrito por Ishida, erm^f. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50, Λ transformação é dependente de genótipe no milho e apenas genõtipos específicos são passíveis de transformação e regeneração. A linhagem congênita A188 (University of Minnesota) ou híbridos com A188 como um precursor são boas fontes de material doador para a transformação, mas outro genôtípos também podem ser usados com êxito. As espigas são colhidas da planta de milho aproximadamente 11 dias depois da polinização (DAF) quando o comprimento do embrião imaturo é de cerca de I a 1,2 mm. os embriões imaturos são co-eultivados com .tumç/rmmns contendo o vetor de expressão, e as plantas transgênicas são recuperadas através da organogênese. Os embriões excisados são cultivados no meio de indução de calo, depois no meio de regeneração de milho, contendo o agente de seleção (por exemplo imidazohnona mas váríos marcadores de seleção podem ser usados). As placas de Petri são incubadas na luz a 25° C por 2 a 3 semanas, ou até que os brotos se desenvolvam. Os brotos verdes são

211 transferidos de cada embrião para oo meio de enraizamento de milho e incubados a 25* C por 2 a 3 semanas, até que as raizes se desenvolvam. Os brotos enraizados são transplantados pata o solo na estufa. As sementes TI são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma única cópia do inserto de 'Γ-DNA.

Tl4lDfof0iação de 'Frigo

A transformação de trigo é realizada com o método descrito por Ishida cr a/. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. O cultivar ./kxWmrn (disponível da CIMM.YT, Mexico) é habitualmente usado na transformação.

Embriões imaturos são co--eultivados com .dgroèncíerõxm contendo o vetor de expressão, e plantas transgêmcas são recuperadas através da organogênese. Depois da incubação com os embriões são cultivados ín vitro em meio de indução de caio, depois meio de regeneração, contendo o agente de seleção (por exemplo itnidazolinona mas vários 15 marcadores de seleção podem ser usados). As placas de Petri são incubadas na luz a 25* C por 2 a 3 semanas, ou até que os brotos se desenvolvam. Os brotos verdes são transferidos de cada embrião para o meio de enraizamento e incubados a 25° C por 2 a 3 semanas, até que as raizes se desenvolvam. Os brotos enraizados são transplantados para o solo na estufa. .As sementes TI 20 são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância, ao agente de seleção e que contém uma única cópia do inserto de T~DNA<

Transformação da soja

A soja é transformada de acordo com uma modificação do método descrito na patente US 5.164.310 da Texas A&M. Diversas 25 variedades de soja comerciais são passíveis de transformação por este método. O cultivar Jack (disponível da Illinois Seed Foundation) é habitualmente usado para a transformação. As sementes de soja são esterilizadas para a serneadura õ? virro. O hlpocotilo, o radiculo e utn cotllédone sâo excisados das mudas jovens dc sete dias de idade. (.) epicótilo e o cotilédone remanescente são anida cultivados para desenvolver nodes axilares. Estes nados axilares são excisados e incubados com zfgro&ac/erw/n rumeAmmus contendo o vetor de expressão. Depois do tratamento de cocultivo, os explantes são lavados e transferidos para meia de seleção. Os brotos regenerados são excisados e colocados cm meio de alongamento de broto. Vrotos não maiores do que 1 cm são colocados em meto de enraizamento até que as raízes se desenvolvam. Os brotos enraizados são transplantados para o solo na estufa. As sementes Tl são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contenha uma única cópia do inserto de T-DNA.

Transformação do Colza/Canola

Os pecíolos cotiledonários e hipocotíios de mudas jovens de 5 a 6 dias de idade são usados como explantes para a cultura de tecido e transformados de acordo com Babic et ah (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). O cultivar comercial Westar (Agriculture Canada) é a variedade padrão usada para a transformação, mas outras variedades também podem ser usadas. As sementes de canola sao esterilizadas na superfície para a semeadura ??? virirn. Os explantes de pecíolo cotiledonário com o cotilédone ligado são excisados das mudas in viúm, e maculados eom (contendo o vetor de expressão) pela imersão da extremidade de corte do explante do pecíolo na suspensão bacte.ria.na. Os explantes são depois cultivados por .2 dias em meio MSBA.P-3 contendo 3 mg/l de BAP, 3 % de sacarose, 0,7 % de Phytagar a 23° C, 16 horas de luz. Depois de dois dias de co-cultivo eom os explantes de pecíolo são transferidos para o meio MSBA.P-3 contendo 3 mg/1 de BAP, cefotaxíma, carbenicilina, ou timentina (300 mg/1) por 7 dias, e depois cultivadas em meio MSBAP-3 com cefotaxima, carbenicilina, ou timentina e agente de seleção até a regeneração de broto. Quando os brotos tem de 5 a 10 mm no comprimento, eles são cortados e transferidos para meio de alongamento (MSBAP-0,5, contenda 0,5 mg/1 de BAP). Os brotos de cerca de 2 cm no comprimento são transferidos para o meio de enraizamento (MSG) para a indução de raiz. Os brotos enraizados são transplantados para o solo na esto fit As sementes TI são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contém, uma única cópia do inserto de T5 DNA.

Ίransfonnação de Alfaia

Um clone de regeneração de alfaia. (.Afedrcqgo sufivo) é trans formado usando o método de (McKersie et o/., 1999 Plant Physiol 119: 839-847). A regeneração e transformação de alfaia é dependente de genótipo 10 e portanto uma planta de reiteração é requerida. Os métodos para se obter plantas de regeneração foram descritos. Por exemplo, estas podem ser selecionadas do cultivar .Rmçge/umAv'' (.Agriculture Canada) ou qualquer outra variedade de alfaia comercial como descrito por Brown DCW e A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4:. 111-112). Ah.emativamen.ie, a 15 variedade RA3 (University of Wisconsin) foi selecionada para o uso em.

cultura, de tecido (Walker er o/., 1978 Am .1 Bat 65: 654-659), Os ex.plan.ies de pecíolo são co-cuhivados com uma cultura durante a noite de v4groZ>«c?er?'?w

C58C1 pM.P90 (McKersie era/., 1999 Plant Physiol 119: 839847) ou LBA4404 contendo o vetor de expressão. Os explantes são co20 cultivados por 3 dias no escuro em meio de indução SH contendo 288 mgzL de Pro, 53 mg/L de tioprolin.a, 4,35 g/L de K.7SO4, e 100 pm de acetoseringinona. Os expkmtes são lavados em meio de Murashige-Skoog na metade da concentração (Murashige e Skoog. 1962) e piaqueados no mesmo meio de indução de SH sem acetosermginona mas com um agente de seleção adequado e antibiótico adequado para inibir o crescimento de

Depois de diversas semanas, embriões somáticos são transferidos para meio de desenvolvimento BOÍ2Y que não conteve nenhum dos reguladores de crescimento, nenhuum. dos antibióticos, e 50 g/L de sacarose. Qs embriões somáticos são subsequentemente germinados em meio de Murashi.ge-Skoog

214 na metade da concentração. As mudas enraizadas foram transplantadas em vasos e cultivados em uma estufa. As sementes Ή são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contém uma única copiado ínsertodeT-DNA.

Tmnsfqrmação.de.algpdap

A transformação de algodão Ahtrfw Z.) é realizada usando zfgrobocterno?? mme/hcLms, em explantes de hipocotilos. Os cultivares comerciais tais como Coker 130 ou Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) sào variedades padrão usadas para a transformação, mas outras 10 variedades também podem ser usadas. As sementes são esterilizadas na superfície e germinadas no escuro. Os expUntes de hipoeoiilo sâo cortados das mudas germinadas até comprimentos de cerca de 1 a 1,5 centímetro. O explante de hipocotilo é submerso em inôculo de mmq/ücxw contendo o vetor de expressão, por 5 minutos depois de co-cultivados por 15 cerca de 48 horas em MS * 1,3 mg/l de KNOj t 2 % de glicose a 24^c C, no escuro. Os explam.es são transferidos ao mesmo meio contendo marcadores bacterianos e de planta selecionáveis apropriados (renovado diversas vezes), até que os calos embríogênicos são observados. Os calos são separados e subeultivados até que embriões somáticos aparecem. As pkmtinhas derivadas 20 dos embriões somáticos são maduros no meio de enraizamento até que as raízes se desenvolvam. Os brotos enraizados sâo transplantados para o solo de vaso na estufa. As sementes TI são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contém uma única cópia do inserto de TDNA.

Exemplo .17: Exemplos de triagens de estresse abiótico

Triagem de Sena

As plantas de um número selecionado de eventos são cultivadas em solo de vaso sob condições normais até que elas se aproximem do estágio do cabeçalho. Eles sao depois transferidos a uma seção “seca’” onde a irrigação é contida. As sondas de umidade são inseridas em vasos aleatoriamente escolhidos para monitorar o teor de água do solo (SWC). Quando SWC vai abaixo de certos limiares, as plantas são automaticamente regadas continuamente até que um nível normal seja novamente atingido. As 5 plantas são depois re-transferidas para condições normais. O resto do cultivo (maturação de planta, colheita de semente) é o mesmo corno para plantas não cultivadas sob condições de estresse abiótico. Os parâmetros de cultivo e rendimento são. registrados como detailhado para o cultivo sob as condições normais,

Triagem de estresse salmo

As plantas são cultivadas em um substrato fabricado de fibras de coco e argex (razão de 3 para. 1 )< Uma solução de nutriente normal é usada durante as primeiras duas semanas depois de transplantar as plantínhas na estufa. Depois das primeiras duas semanas, 25 mM de sal (NaCl) são 15 adicionados à solução nutriente, até que as plantas fossem colhidas. Os parâmetros de cultivo e rendimento sâo registrados como detalhado para o cultivo sob condições normais.

Triagem de disponibilidade de nutriente (nitrogênio) reduzida

Flautas de seis eventos (sementes T2) são cultivadas em solo de vaso sob condições normais exceto quanto a solução .nutriente. Os vasos são regados do transplante até a. maturação com uma solução nutriente específica contendo teor de nitrogênio N reduzido (N), usualmente entre 7 a. 8 vezes menos, O resto do cultivo (maturação de planta, colheita de semente) é a mesma como para plantas não cultivadas sob estresse abiótico. Os parâmetros de cultivo e rendimento são registrados como detalhado para o cultivo sob condições normais.

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para aumentar caractervstleas rehiexwdas com o rendimento em plantas em relação às plantas de controle, camcterizado pelo fato de que compreende modular a expressão em uma planta de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptideo selecionado do grupo que consista de:

   polipeptideo do Fator Regulador do Crescimento (GRF), polipeptideo equivalente a RA A1, polipeptideo SYR polipeptideo ARKL· e

   polipeptideo YTP e opeionalmentc selecionar quanto a plantas tendo características relacionadas com o rendimento aumentado.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação L osrecierizadp pelo fato de. que;

   ~ o dito polipeptideo GRF compreende:

   (Í) um domínio tendo pelo menos 50 %. 55 %, 60 %, 65 %₅ 70 %, 75 %, 80 %, 85 H, 90 36, 95 %. 98 %, 99 % ou mais de identidade da sequência de aniinoáddo a um domínio QLQ como representado pela SEQ ID NO: 115; e (ü) um domínio tendo pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %_s 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade da sequência, de ammuácido a um domínio WRC como representado pela SEQ ID NO: 116,

   - o dito polipeptideo equivalente a RAAI compreende dois ou mais dois seguintes motivos:

   (iii) motivo 1: GV W(V/L)F (SEQ ID NO: 162), (iv) motivo 2: LG W(E/S)RY(Y/F) (SEQ ID NO: 163), (v) motive 3: (D/>I)L(L/1)S(1N/T)P(R/KÁ\XS/D)F (SEQ ID

   NO: 164), (vi) motive 4: (I1/Y)(F/M)YD(V/I)VVK(N/T)(R^) (SEQ ID

   NO: 165),

   - o dito polipeptídeo SYR compreende um dominie rice cm leucina, precedido pelo motivo 1 de tripeptídeo conservado (uma da SEQ ID NO: 173,174, 175 ou 176) e seguido pelo motivo 2 conservado (SEQ ID NO; 177),

   - o díto polipeptídeo ARKI,· compreende um ou mais dos seguintes domínios:

   (vii) um domínio ZÍC3H2C3 como representado pela SEQ ID NO? 400 ou um domínio tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %_s 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais de identidade da sequência a um ou mais dos domínios ZÍC31I2C3 como representado pela SEQ ID NO? 306 até a SEQ ID NO. 351: e (víu) um domínio DA.R.1 tendo em ordem crescente de preferência pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais de identidade da sequência a um ou mais dos domínios PfamB2828 como representado pela SEQ ID NO? 35 até a SEQ ID NO: 398, · e .......... ..................

   - o dito polipeptídeo YTP compreende fix) pelo menos um domínio de traosmernbrana e (x) pelo menus uma porção de um domínio DUF221 e opcionalmente selecionar quanto a plantas tendo características relacionadas com o rendimento aumentado,
3. 3, Método de acordo com a. reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo GRF compreendo: (i) um domínio QLQ com um acesso InterPro IPR014978 (acesso PF AM PF08880); (ii) um domínio WRC com um acesso InterPro IPR014977 (acesso PFAM FF08879); e (íií) um domínio Efetor de Transcrição (E I) que compreende três resíduos Cys e um Mis em um espaçamento conservado (CX9CX10CX2ML
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1. camctenzado pelo fato de que o dito polipeptideo GRF tern cm ordem crescente de preferência pelo menos 50 %_? 55 %, 60 %, 65 %, 70 %₅ 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade da sequência de aminoácido com o polipeptideo GRF como representado pela SEQ ID NO: 2 ou a qualquer uma das sequências de polipeptideo dadas na Tabela A aqui contida.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptideo GRF é representada por qualquer uma das sequências de ácido nucléico SEQ ID NOs dadas na Tabela A ou uma porção destas, ou uma sequência capaz de hibridizar com por qualquer uma das sequências de ácido nucléico SEQ ID NOs dadas na Tabela A.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo feto de que a dita sequência de ácido nucléico codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das sequências de polipeptideo SEQ ID NOs dadas na Tabela A.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a dita expressão aumentada é efetuada por qualquer uma ou mais de: rotulação da ativação de T-DNA, TILLING, ou recombínação homóloga.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo lato de que a dita, expressão aumentada, é efetuada pela introdução e expressão em uma planta dc uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptideo GRF.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que. a dita característica relacionada com o rendimento aumentada é um ou mais de: (i) vigor inicial aumentado:

   (ii) biomassa acima do solo aumentada: (hi) rendimento de semente total aumentado por planta: (iv) taxa dc enchimento de semente aumentada: (v) índice de colheita aumentado; ou (vi) peso de mil sementes aumentado (TKW).

   5 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de ácido nucléico é operavelmcnte ligada a um promotor constitutivo, preferivelmente a um promotor constitutivo de planta, mais preferivelmente a um promotor de GOS2. mais preferivelmente a um promotor de GOS2 do arroz como 10 representado pela SEQ ID NO: 117.

   IL Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo lato de que a dita sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GRF è de origem vegetal, preferivelmente de uma planta dicotlledônea, rnais preferivelmente da família Broxvfeocene, mais 15 preferivelmente da .drufimopsís nWmw.

   12. Plantas, partes das mesmas (incluindo sementes), ou células de planta obteníveis por um método conto definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, as ditas plantas, partes ou células das mesmas caracterizadas pelo fato de que compreendem um transgeae de ácido nucléico 20 isolado rate codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo do Fator Regulador tio Crescimento (GRF ),

   - polipeptídeo equivalente a. RAAI, polipeptídeo SY.R.

   polipeptídeo A.RKL.

   polipeptídeo YTP operavelmente ligado a um promotor constitutivo de planta,

   1.3. Construção, caracterizada pelo fato de que compreende:

   (a) Uma sequência, de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeptídeo GRF, polipeptídeo equivalente a RAAl, polipeptídeo SYR, polipeptídeo A.R.KL, e polipeptídeo YTP de acordo corn qualquer uma das reivindicações de I a 6;

   (b) uma ou mais sequências de controle capazes de direcionar

   S a expressão da sequência de ácido nucléico de (a); e opcionalmente (c) uma sequência de terminação de transcrição,

   14, Construção de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a dita sequência de controle ê um promotor constitutivo de planta, preferivelmente um promotor de GOS2, mais
10. 10 preferivelmente mu promotor de GOS2 como representado pela SEQ ID NO:

    H7.

    15, Uso de uma construção como definida nas reivindicações
11. 13 ou
12. 14. çaraçteri^do pelo fato de ser em um método para fabricar plantas tendo características relacionadas com o rendimento aumentado em relação às
13. 15 plantas de controle, características relacionadas com o rendimento aumentado estas que são uma ou mais de: (i) vigor inicial aumentado; (u) bíomassa aumentada, preferivelmente biomassa acima do solo aumentada; (in) rendimento de semente total aumentado por planta; (iv) taxa de enchimento de semente aumentada; (v) índice de colheita aumentado; (vi) peso de rn.il 20 sementes aumentado (TKW), (vii) resistência ao estresse abiótieo aumentada, preferivelmente tolerância ao estresse de seca aumentada, ou (viii) eficiência de captação de nutriente aumentada,
14. 16. Plante, parle de plante, ou célula de planta, caracterizada pelo fato de que é transformada com unia construção como definida na

    25 reivindicação 13 ou. 14,
15. 17. Método para. a. produção de plantas transgênicas tendo características relacionadas com o rendimento aumentado em relação às plantas de controle, caracterizado pelo fato de que compreende:

    (i) introduzir e expressar em uma planta, parte de planta, ou célula de planta, uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptideo selecionado do grujxi que consiste de: polipeptideo GRF, polipeptideo equivalente a RA.AJ, polipeptideo SYR, polipeptideo ARKL, e YT.P de acordo com qualquer uma das reivindicações de l a 6, sob o controle 5 de promotor constitutivo de planta; e (ii) cultivar a célula de planta, parte de planta, ou planta sob condições que promovam o crescimento e desenvolvimento da planta.
16. 18. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de que tem características relacionadas com o rendimento aumentado em relação às

    10 plantas de controle, que resultam da expressão aumentada de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptideo selecionado do grupo que consiste de: polipeptideo GRF. polipeptideo equivalente a RAAl, polipeptideo SYR, polipeptideo ARKL, e polipeptideo YT.P de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, operavelmente ligados a um 15 promotor constitutivo de planta, ou uma célula d.e planta transgênica ou parte de planta transgênica derivada da dita planta transgênica.
17. 19. Planta transgênica de acordo com as reivindicações 12, 16 ou 18, caracterizada pelo fato de que a dita planta é uma planta de safra ou uma monocotiledônea ou um cereal, tal como arroz, milho, trigo, cevada,
18. 20 painço, centeio, triticale, sorgo e aveia, ou uma célula de planta transgênica derivada da dita planta transgênica.

    20. Partes co.lhíveis, caracterizadas pelo fato de que compreendem unia sequência de ácido nucléico Isolada que codifica um polipeptideo selecionado do grupo que consiste de: polipeptideo GRF,

    25 polipeptideo equivalente a RAAI, polipeptideo SYR, polipeptideo ARKL, e polipeptideo YTP de uma planta de acordo com a reivindicação 18, em que as ditas partes colhíveis são preferivelmente sementes.
19. 21. Produtos, caracterizados pelo fato de que são derivados de uma planta como definida na reivindicação 18 e/ou de partes colhíveis de u.ma planta como definida na reivindicação 20,
20. 22, l.Jso de uma sequência de ácido nucléico que codifica urn polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: polipeplídco GRF. polipeptídeo equivalente a RAAL polipeptideo SYR, polípepiideo A.RKL, e polipeptídeo YTP como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, çaracterizado pelo tato de ser em características relacionadas com o rendimento crescentes, que compreendem um ou mais de: (i) vigor inicial aumentado; (ü) biomassa acima do solo aumentada; (iii) rendimento de semente total aumentado por planta: (iv) taxa de enchimento de semente aumentada; (v) mdice de colheita aumentado: ou (vi) peso de mil .sementes aumentado (1KW), (vü) resistência ao estresse abíótico aumentada, preferivelmente to.lera.nda a.o estresse de seca aumentada, ou (vin) eficiência de captação de nutriente aumentada.