BRPI0817985A2 - Dispositivo de mão de pcr - Google Patents

Abstract

microdispositivo pcr de mão. invenção sobre um microdispositivo pcr de mão incluindo um microchip pcr ltcc contendo um aquecedor, uma câmara de reação para carregar uma amostra. também inclui um controle de aquecedor para regular o aquecedor com base na entrada recebida de um sensor de temperatura, tem ainda um sistema óptico contendo uma fibra óptica para detectar um sinal de fluorescência da amostra e pelo menos uma interface de comunicação para interagir com os outro(s) dispositivo(s).

Description

S MICRODISPOSITIVO PCR DE MÃO

ÁREA DA INVENÇÃO Esta invenção se relaciona a um sistema PCR portátil en) tempo real com microchip PCR descartável de cerâmica co-sinterizada a baixas temperaturas (LTCC). A 5 invenção descreve ainda um métod.o para controlar e monitorar o micro-PCR e o aparelho envolvido para PCR.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Nos últimos cinco anos, a pesquisa e o desenvolvimento para sistemas de diagnóstico clínico com base em tecnologias de microl'aboratório ("lab-on-a-chip") 10 cresceram bastante. Tais sistemas são uma grande promessa para diagnósticos cIínicos. Eles consijmern material de amostra e reagentes somente em volumes muito pequenos. Pèquenos chips individuais podem ser baratos e descartáveis. O prazo entre a amostrager)n e o resultado tende a ser bastante curto. Os projetos mais , avançados de chip podeín realizar todas as funções analíticas - amostragem, pré- 15 tratamento de amostra; etapas de separação, diluição e mistura; reações químicas; « e detecção — em um único circuito microfluídico integrado. S istemas de microlaboratório pérmitem aos projetistas criar instrumentos de diagnósticos pequenos, portáteid, robusto, de baixo custo e uso fácil, que oferecem altos níveis de capacidade e vêrsatiÍidade. MicrofluÍdicos - fluidos que fluem em microcanais 20 possibilitam o projeto db dispositivos analíticos e formatos de ensaio que não funcionariam em mais larga escala.

As tecnologias de microlaboratórios permitem emular os procedimentos de laboratório que siriam !realjzados em uma amostra dentro de uma estrutura microfabricada. osi dispÒsitivos mais bem sucedidos foram aqueles que funcionam ?' 25 em amostras de fluidosj Um grande número de procedimentos de processamento

T Ç ,

L r O 2/28 químico, purificação e reação foram demonstrados nesses dispositivos. Algum grau de integração monolítica de processos químicos demonstrou produzir dispositivos

A que realizam um procediinento completo de mensuração química. Esses dispositivos se baseiam em prcicedimentos laboratoriais aceitos de análise e assim conseguem 5 acomodar matrizes de' amostras mais complexas do que sensor químico convencional.

Os recentes avanços em biologia molecular e celular foram produzidos, em grande parte, como resultado do desenvolvimento de técnicas analíticas rápidas e eficientes. Graças à miniàturização e multiplexação, técnicas como chip genético ou . 10 biochip permitem ' a caracterização de genomas completos em uma única configuração experimental. PCR (reação em cadeia da poIimerase) é um método de biologia molecular para amplificação in vivo de moléculas de ácido nuclear A técnica PCR está substituindo rapidamente outras técnicas demoradas e menos sensíveis ,, para identificação de espécies biológicas e patógenos em amostras forenses, , 15 ambientais, cIínicaS e 1Ádustriais. Entre as biotécnicas, PCR se tornou a etapa . analítica mais impÒdante nos laboratórios de ciências biológicas para um grande t número de diagnósticos Mo|ecu|ares e clínicos. Desenvolvimentos importantes feitos na tecnologia PCR, como PCR em tempo real, levaram a processos de reação rápida em comparação com métodos convencionais. Durante vários anos, a 20 tecnologia de micrcfabricação vem se expandindo para a miniaturização do sistema , de análise e reação tal como análise PCR com intenção de reduzir ainda mais o tempo de análise e Ô conSumo de reagentes.

Na maioria dos pcrs hóje disponíveis, não são possíveis mudanças instantâneas de temperatura em razão das capacidades de amostra, recipiente e calor do 25 ciclador, e como resultado têm-se maiores tempos de amplificação de 2 a 6 horas.

4.

;

i: H 3/28 Durante os período's em que a temperatura da amostra está em transição, ocorrem reações estranhas e indesejáveis que consomem reagentes importantes e criam compostos interferentes indesejados.

LTCC é usada na embalagem de dispositivos semicondutores. Este sistema permite 5 a integração da função elétrica e estrutural. A sequência de fabricação camada por camada no processo de fabricação LTCC permite a criação de estruturas tridimensionais corií elementos elétricos integrados com facilidade. Além disso, o r processamento é mais bÊírato em comparação com o de silício. Um chip é fabricado com substrato de cerâmica como LTCC (Cerâmica Co-sinterizada a Baixas 10 Temperaturas), o que permite a integração de elementos mecânicos e eletrônicos de forma fácil e barata.

O uso de uma platáforma de computação portátil como PDA dá ao sistema poder de computação suficiénte p'ara controlar os componentes eletrônicos e fornecer uma , interface de usuárió versitii, porém simples, para exibir os dados. lsso também torna ': 15 o sistema todo modular'e assim permite fácil upgrade com custo mínimo para o . usuário.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO O principal objetivo'as inúenção é desenvolver um microdispositivo PCR de mão.

Outro objetivo da i?resente invenção é ainda o de desenvolver um método para 20 monitorar o microdisposiÇvo PCR de mão. DECLARAÇÃO DA INVE'NÇÃO Assim, a invenção fornece um microdispositivo PCR de mão incluindo: um microchip PCR de LTCC incluindo um aquecedor, uma câmara de reação para carga de uma

P amostra, um controle de'aquecedor para regular o aquecedor com base na entrada 25 recebida de um seríSor de temperatura, um sistema de detecção óptica para detectar . f i r .. , 4/28 .

um sinal fluorescente da amostra e pelo menos uma interface de comunicação para interagir com outro(s) dispositivo(s); e também fornece um método para monitorar e controlar o microdispositivo PCR de mão, tal método incluindo os passos: estabelecimento de comunicação entre o microdispositivo PCR de mão e outro 5 dispositivo através'de uma interface de comunicação, iniciando um processo de ciclagem térmica com base em valores de perfil térmico recebidos do outro dispositivo para controlar um microchip PCR LTCC e envio de sinal óptico detectado por sistema óptico ao outro dispositivo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS ANEXOS 10 A invenção será descrita agora com referência aos desenhos anexos: A figura 1 mostra um es,quema de configuração do microdispositivo PCR LTCC de acordo com esta invençã'Ò.

A figura 2 mostra uma visão ortográfica de uma configuração do microchip PCR , LTCC.

15 A figura 3 mostra uma visão de corte transversal de uma configuração do microchip % PCR LTCC.

A figura 4 mostra uin desenho em camadas de uma configuração do microchip PCR LTCC.

A figura 5 mostra um modelo do desenho fabricado da câmara de reação do chip.

20 A figura 6 mostra um sistema de detecção óptica bifurcado usando fibra óptica bifurcada.

A figura 7 mostra um diagrama de bloco do circuito que controla o aquecedor e o sensor de temperatúra. ' A figura 8 mostra a fusão' do fragmento de DNA de lambda-636 usando o aquecedorl 25 termistor integrado, controlado pela unidade de mão.

A Figura 9 mostra a amplificação PCR do fragmento de DNA de lambda-311 no chip, (a) Sinal de fluorescência de tempo real vindo do chip; (b) lmagem do gel confirmando o produto dá amplificação.

A figura 10 mostra uma imagem do gel da amplificação do PCR processado de 5 sangue processado e plasma para a unidade ribossômica 16S de Salmonella.

A figura 11 mostra uma imagem do gel da amplificação do PCR direto de sangue para a unidade riboSsômica 16S de Salmonella.

A figura 12 mostra'"uma imagem do gel da amplificação do PCR direto de plasma para a unidade ribossômha 16S de Salmonella.

!0 A figura 13 mostra a amplificação PCR do gene da Salmonella usando microchip, (a) Sinal de fluorescência de tempo real do chip; (b) Imagem do gel confirmando o produto da amplificação.

A figura 14 mostra'o tempo que se levou para amplificar o DNA Viral da Hepatite B , usando o chip LTCC. 15 A Figura 15 mostra um'a visão geral da aplicação do Assistente Digital Pessoal . (PDA) comunicando-se com a unidade de mão.

A figura 16 mostra uma curva de fusão obtida pelo uso de um chip LTCC para derivada do sinal de fluorescência para a fusão do DNA )\-311.

A figura 17 mostra"' um fluxograma do programa de ciclagem térmica que roda no 20 PDA. : A figura 18 mostra Ò sinài de fluorescência em tempo real do DNA HBV amplificado usando microchip. ' A figura 19 mostra um sistema de detecção óptica usando divisor de feixe.

A figura 20 mostra um sister1?a de detecção óptica híbrido.

25 DESCRIÇÃO DETÁLHAÒA DA INVENÇÃO "C 1 i 6/28 A presente invenção se relaciona a um microdispositivo PCR de mão incluindo: a) um microchip PCR LTCC incluindo um aquecedor, uma câmara de reação para carregar uma amostra, b) um controle de aquecedor para regular o aquecedor com base na entrada 5 recebida de um sensor de temperatura.

C) um sistema de detecção óptica para detectar um sinal de fluorescência da amostra, e d) pelo menos uma interface de comunicação para interagir com outro(s) dispositivo(s).

10 Em uma configuração dá presente invenção, pelo menos uma camada condutora é fornecida entre o aC(uecedor e a câmara de reação.

Em uma configuração da presente invenção a câmara de reação é cercada por anéis condutores.

. Em uma configuração da presente invenção os anéis condutores são conectados à 15 camada condutora por pilares. . Em uma configuração da presente invenção o condutor é feito de um material selecionado de um grupo incluindo ouro, prata, pIatina e paládio ou ligas destes.

Em uma conf guraçao d'a presente nvençao o sensor de temperatura é colocado fora do chip para medir sua temperatura.

20 Em uma configuração da presente invenção o sensor de temperatura está embutido em pelo menos uma camada do chip.

Em uma configuração àa presente invenção, o sensor de temperatura é um termistor.

Y Em uma configuração 'da presente invenção, o sensor de temperatura está 25 conectado como um braço de um circuito em ponte.

Em uma configuração da presente invenção, a saída do circuito em ponte é amplificada antes de ser alimentada ao controle de aquecedor para regular o aquecedor.

Em uma configuração da presente invenção o chip inclui uma tampa de vedação 5 transparente para cobrir a câmara de reação.

Em uma configuração da presente invenção o chip é descartável.

Em uma configuração da presente invenção, o sistema de detecção óptica é selecionado de um gruRo incluindo um sistema de detecção óptica de divisor de feixe, um sistema de divisão óptica hibrido e um sistema de divisão óptica bifurcado.

10 Em uma configuração dai presente invenção, o sistema óptico inclui uma fonte de luz e um fotodetector para detectar um sinal fluorescente da amostra.

Em uma configuração da presente invenção, um amplificador lock-in amplifica o sinal detectado.

Em uma configuração da presente invenção o sistema óptico bifurcado usa uma ' 15 fibra óptica bifurcadà com a fonte da Iuz colocada em uma extremidade bifurcada . (605a) e o fotodetector 'colocado na outra extremidade bifurcada (605a) da fibra óptica.

Em uma configuração da presente invenção a extremidade comum (605b) da fibra óptica bifurcada aponta para a amostra.

20 Em uma configuração da presente invenção o sistema hibrido de detecção óptica .?' , usa fibra óptica para direCionar a luz para a amostra.

Em uma configuração dà presente invenção o sistema híbrido de detecção óptica usa lentes para focar o facho emitido da amostra.

Em uma configuração da presente invenção a interface de comunicação é 25 selecionada de um 'grupo incluindo serial, USB, Bluetooth ou combinações destes.

T . \ )b

[ 8/28 Em uma configuração dá presente invenção o outro dispositivo coleta a temperatura do chip e o sinal amplificado do dispositivo de mão.

Em uma configuração da presente invenção, o outro dispositivo é selecionado de um grupo incluindo smart phone, PDA e dispositivo programável.

5 A presente invençãò também se relaciona a um método para monitorar e controlar o microdispositivo PCR de mão, tal método incluindo os passos: a) estabelecer umá comunicação entre o microdispositivo PCR de mão e outro dispositivo através de urria interface de comunicação, b) iniciar um processo de ciclagem térmica com base nos valores de perfil térmico 10 recebidos do outro dispositivo para controlar um microchip PCR LTCC, e C) enviar um sinal óPtico detectado pelo sistema óptico para o outro dispositivo.

Em uma configuraçào da presente invenção, enviar os valores de perfil térmico para o outro dispositivo jlor urh usuário através da interface de usuário.

. Em uma configuração da presente invenção, criar, modificar ou excluir os perfis 15 térmicos através da interface de usuário. . Em uma configuração da presente invenção o outro dispositivo fornece autenticação ' { do usuário.

Em uma configuraSão da presente invenção o outro dispositivo armazena uma diversidade de perfis térrhicos.

20 Em uma configuração da' presente invenção o perfil térmico fornece o valor de ponto de ajuste e número de ciclos.

Em uma configuração da presente invenção, manter o chip a uma temperatura e pelo tempo determinado pelo valor de ponto de ajuste. . Em uma configuraçâo da presente invenção, trazer a temperatura do microchip PCR :· 25 para a temperatura ambiénte interrompendo o processo de ciclagem térmica. í

Em uma configuração da presente invenção, manter a temperatura do microchip PCR constante quando o ciclo térmico estiver interrompido.

Em uma configuração dá presente invenção, comunicar-se com o outro dispositivo, usando a pilha de pêrfil de porta serial Bluetooth.

5 Em uma configuração dà presente invenção, representação dos dados térmicos e ópticos em uma unidade de display do outro dispositivo.

Os outros dispositivos (101) são aqueles capazes de interagir com o dispositivo de mão através de qualquer interface de comunicação padrão (107), como por , exemplo, com fio (porta 'serial RS232, USB) ou sem fio (Bluetooth implementando 10 um perfil de porta sérial),.'etc. Microchip PCR LTCC é ijm chip PCR feito de camadas LTCC. Este chip pode ser facilmente preso ou removido da unidade de mão.

O perfil térmico mostra a temperatura e o tempo que são os valores de ponto de ajuste, bem como 'a contagem de número de ciclos para concluir um processo de 15 ciclo térmico. ! . A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica descoberta para sintetizar múltiplas cópias de um Íragmento específico de DNA de um modelo. O processo PCR original se baseia na enzima de polimerase de DNA de calor estável de Thermus aquaticus (Taq), que pode sintetizar uma fita complementar a uma 20 determinada fita di DNA em uma mistura contendo quatro bases de DNA e dois fragmentos de DNÁ iniciador ladeando a sequência alvo. A mistura é aquecida para separar as fitas de DN'A de dupla hélice contendo a sequência alvo e depois resfriada para permitir a'os iniciadores que encontrem e se Iiguem às sequências complementares nas fitas separadas e que a polimerase Taq estenda os iniciadores 25 em novas fitas complementares. Ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento G.

{ \ : t : r,

L P } ,, 10/28 multiplicam o DNA alvo .exponencialmente, já que cada nova fita dupla se separa para tornar-se dois mode'los para síntese subsequente.

Um perfil de temperatura típico para a reação em cadeia da polimerase é como segue: 5 1. Desnaturação a 93°C por 15 a 30 segundos

2. Recozimento do lniciador a 55°C para 15 a 30 segundos

3. Extensão dos iniciadores a 72°C por 30 a 60 segundos Como exemplo, na priméira etapa, a solução é aquecida a 90-95°C de forma que o modelo de dupla fita se funde ("desnatura") para formar duas fitas individuais. No 10 próximo passo, ela é resfriada para 50-55°C de forma que pequenos fragmentos de DNA especialmentie sintetizados ("iniciadores") se unem à seção complementar apropriada do modelo ("recozimento"). Finalmente, a soIução é aquecida a 72°C quando uma enzirha esjseáfica ("dna polimerase") estende os iniciadores unindo . bases complementares ' da soIução. Assim, duas fitas duplas idênticas são 15 sintetizadas a partir de uma única fita dupla. . A etapa de extensão do iniciador tem que ser aumentada em aproximadamente , 60seg/kbase para gerar produtos mais longos do que algumas centenas de bases.

Os tempos acimaÍ são típicos para instrumentação; na verdade, as etapas de desnaturação e recozimènto acontecem quase instantaneamente, mas os Índices de 20 temperatura em instrumentos comerciais são menores do que 1°C/seg quando são usados blocos de metal ou água para equilíbrio térmico e são colocadas amostras nos tubos pIásticos de microcentrifugação.

Efetuando-se a microusinagem de câmaras PCR de baixa massa termicamente

P isoladas, é possÍveÍ produzir em massa um instrumento PCR mais específico e com 25 uso mais eficiente de enérgia. Além disso, as rápidas transições de uma temperatura para outra asseguram que a amostra permaneça um tempo minimo em temperaturas intermediárias indesejadas, de forma que o DNA amplificado venha a ter fidelidade e pureza idèais.

Cerâmica Co-sinterizada a Baixas Temperaturas (LTCC) é a versão moderna da 5 tecnologia de pehcula espessa que é usada na embalagem de componentes eletrônicos para a indústria automotiva, de defesa, aeroespacial e de telecomunicações. É um material vÍtreo de cerâmica com base em alumina que é quimicamente inerte, biocompatível, termicamente estável condução térmica ("600°C), com baixa 'condução térmica ("3\N/mk), boa força mecânica e 10 proporciona boa hèrmeticidade. É convencionalmente usada na embalagem de dispositivos eletrônicos íem nível de chip onde realizam funções estruturais e elétricas. Os presentes inventores reconheceram a adequação da LTCC para ser usada em aplicações de microchip PCR e, tanto quanto os inventores saibam, a . LTCC não foi usada antes para tal objetivo. Os substratos básicos na tecnologia 15 LTCC são, de preferência, camadas não queimadas (verdes) de material vÍtreo de h cerâmica com um' ag|bmerante polimérico. As características estruturais são formadas pelo corte/penção/perfuração dessas camadas e empilhamento de camadas múltiplas. O processo camada por camada possibilita a criação de componentes tridimensionais essenciais para MEMS (Microssistemas 20 Eletromecânicos). "Componentes tão pequenos quanto 50 mícrons podem ser prontamente fabricádos em LTCC. Circuitos elétricos são fabricados serigrafando-se uma pasta condutora é resistiva em cada camada. As múltiplas camadas são interconectadas pela puhção de vias e preenchimento das mesmas com a pasta condutora. Essas camadas são empilhadas, comprimida's e queimadas. A literatura 25 registra o processamento de pilhas de até 80 camadas. O material queimado é t Fí Zk denso e possui boa força' mecânica.

A Figura 1 mostra um )esquema de uma configuração do Microdispositivo PCR indicando vários componentes e suas funções. O dispositivo é composto de um microchip PCR LTCC descartável (103), que possui uma câmara de reação para 5 conter a amostra com um aquecedor embutido e um sensor de temperatura embutido para ciclágem térmica. O sensor de temperatura é um termistor. O sensor de temperatura também pode ser coIocado fora do chip em vez de embutido do lado

L de dentro. O sensor de'temperatura pode ser qualquer sensor capaz de medir a temperatura. O microchip PCR LTCC (103) faz interface com uma unidade eletrônica 10 de mão (109) incluindo o circuito de controle (102) com um controle de aquecedor e circuito condutor, o qual controla o aquecedor com base no valor do sensor de . temperatura. O válor d'o sensor de temperatura é alimentado no controle de aquecedor através de urh circuito de percepção de temperatura (107). O controle de

L

Í aquecedor ajusta a temperatura do chip e mantém a temperatura por um período 15 fornecido por um microcontrolador (106) como valores de ponto de ajuste. Todos os & componentes da unidade de mão (109) são energizados por um conjunto de bateria (108). ' ? O dispositivo de mâo (109) também contém um sistema óptico (104) para detecção de sinais de fiuorescênCia do microchip PCR (103). lsso inclui fonte de luz, um 20 circuito para controlar á fonte de luz, detector para perceber a luz emitida da amostra, um circuito para amplificação do sinal (da amostra). O dispositivo de mão (109) fará interface com outro dispositivo de processamento (101) como USB/BIuetooth para um smart phone/PDA ou qualquer dispositivo de processamento r para aquisição e cohtroie' de dados. í 25 As baterias podem ser aCesslveis, com uma porta fornecida para se recarregarem a partir de fontes externas. Por exemplo, as baterias poderiam ser de níquel-cádmio, Íon Iítio ou poIímero que possam fornecer corrente de pico acima de 1A.

O dispositivo de mão também inclui pelo menos uma interface de comunicação (107) para se comunicar com os demais dispositivos (101). A interface de comunicação 5 (107) pode ser com fio (porta serial RS232, USB) ou sem fio (Bluetooth implementando um perfil de porta serial). Tipicamente, o perfil de porta serial é usado para comunicação em razão de sua velocidade e facilidade de implementação. A 'interface transfere dados e instruções entre o outro dispositivo (101) e o microcont-roladór (106). r 10 Os outros dispositivos (101) aqui são aqueles capazes de controlar e monitorar o dispositivo de mão. Pofexemplo, o outro dispositivo poderia ser um PDA, smart phone, computador, microcontrolador ou qualquer dispositivo de processamento capaz de se comunicar com o dispositivo de mão. O outro dispositivo também fornece uma interfa'ce de· usuário para entrada e visualização de dados pelo usuário.

15 O outro dispositivo'âqui referido tem capacidade de rodar o software relevante para b comunicar-se, controlar é monitorar o dispositivo de mão (109).

Um microcontrolador (1Ó6) controla os componentes eletrônicos no dispositivo de mão (109) e se comunica com o outro dispositivo (101) através de uma interface. O microcontrolador possui um conversor analógico-digital, digital-analógico para 20 interagir com o cirCuito analógico, isto é, o circuito de controle (102), circuito de percepção de temÓeratúra (107) e circuito óptico (105). O microcontrolador (106) coleta os valores dê poRlo de ajuste do outro dispositivo e fornece-os ao circuito de t controle (102). O microcontrolador também fornece a temperatura captada pelo circuito de percepção de temperatura (107) e os dados ópticos fornecidos pelo 25 circuito óptico (105) ao outro dispositivo. Os dados ópticos são o sinal detectado € ? ·4 " .i pelo sistema óptico (105). A figura 2 mostra uma í/isão ortográfica de uma configuração do microchip PCR indicando a câmara de' reação (201) ou poço. A figura indica a montagem do aquecedor (201) e um termistor sensor de temperatura (203) dentro do microchip PCR LTCC. Também são indicadas as linhas condutoras do aquecedor (205) e as Iinhas condutoras do termistor (204). Essas Iinhas condutoras irão ajudar a fornecer conexão ao aquecedor e o termistor embutidos no chip com sistema de circuito r.

externo.

Faz-se referência à Figúra 3, que mostra uma visão de corte transversal de uma configuração do microchip PCR LTCC em que (206a & 206b) indicam as almofadas de contato para o aquecedor (202) e (207a & 207b) indicam a almofada de contato para o termistor (203). ' Faz-se referência 'à Figura 4, que mostra um projeto por camadas de uma configuração de microchip PCR LTCC em que o chip é composto de 12 camadas de fitas LTCC. Há duas camadas de base (401), três camadas intermediárias contendo a camada de aquecedor (402), uma camada condutora (403) e uma camada contendo o termistor (404), enquanto (405) forma a camada de interface para a câmara de reação (201). As camadas de câmara de reação (406) consistem de seis camadas, como rncstrada Também é fornecida uma camada condutora (403) entre as camadas de aquecedor e termistor. Também são indicadas a linhas condutora do aquecedor (205) e as linhas condutoras do termistor (204). A figura mostra que as linhas condutoras (204) são colocadas em ambos os lados da camada de termistor (404). O desenho-, do aquecedor pode ser de qualquer feitio, como "escada", "serpentina", "linha", "placa", etc., com o tamanho variando de 0,2mm x 3mm a 2mm x 2mm. O tamanho"e o feitio do aquecedor podem ser selecionados com base nos r j 4 15/28 requisitos. Os requisitos podem depender do tamanho da câmara de reação ou da amostra que está sendo testada ou o material sendo usado como camada condutora.

O chip LTCC tem um volume de poço de 1 a 25 µ1. O aquecedor se baseia no j 5 elemento resistivo de película espessa que é utilizado em pacotes LTCC convencionais. O sisterria de termistor com alumina é usado para fabricação de sensores de temperatura embutidos. O TCR medido do chip foi entre 1 e 2 C)/°C. O chip foi fabricado em sistema verde DuPont 951. A camada de termistor pode ser colocada em qualquer parte no chip ou um sensor de temperatura pode ser colocado !0 fora do chip em vez'·do termistor dentro do chip.

Após determinar a uniformidade do perfil de temperatura dentro do chip, foram realizadas reações PCR' nesses chips. Fragmentos de DNA de Lambda, DNA de Salmonella e DNA de Hepatite B foram amplificado com sucesso usando esses chips. A Figura 5 mostra o microchip em 3 visões dimensionais, mostrando suas 15 diversas conexões com c) aquecedor, anéis condutores, termistor e anéis condutores . (502). Também móstra 'pilares (501) que estão conectando os anéis condutores (502) à placa condutora (403) O aquecedor embutido 'é feito de pasta resistiva como a série CF da DuPont, compatível com LTCC. Pode ser usado qualquer sistema de fita de cerâmica verde, 20 como DuPont 95, ESL (série 4 lXXX), Ferro (sistema A6) ou Haraeus. O citado sensor de temperatura èmbutido é um termistor fabricado usando uma pasta de resistência de termiStor de PTC (Coeficiente de Temperatura Positivo) (por exemplo: 509X D, ESL 2612 de','ESL Electroscience) para substrato de alumina. NTC: Coeficiente de Temperatura negativo de pasta de resistência como NTC 4993 da 25 EMCA Remex também pode ser usado.

¥ i ..

A tampa de vedação transparente (comprimento de onda de 300 a 1OOOnm) é para prevenir a evaporação da amostra da citada câmara de reação e é feita de material polímero.

Sistema de detecção óptica (104, 105) 5 O sistema de detecção óptica (fluorescência) inclui uma fonte de iluminação, tipicamente um LED, filtros para seleção de luz de comprimento de onda apropriado, componentes ópticos para levar e coletar luz da amostra e um sensor de luz (fotodiodo, tubo fotõmultiplicador, fototransistor, sensor de imagem, etc.). Também inclui um sistema de circuitos (105) para conduzir a fonte de luz, para detectar sinal do sensor de luz. Em aplicações portáteis, é preferível usar fotodiodo, fototransistor ou sensor de imagens em razão de seu baixo consumo de energia (<1miliW). A detecção em tempo real dos produtos PCR utiliza técnica de fluorescência, em que um corante fotossensível (fluorocromo como SYBR Verde) presente na mistura PCR absorve Iuz de um deterrhinado comprimento de onda e emite a um comprimento de onda maior (470nm & 5ZOnm para SYBR Verde). Tipicamente, a intensidade da luz do emissor aumenta ou diminui com o progresso bem sucedido do PCR.

A monitoração da mudança na intensidade emitida proporciona a capacidade de detecção em temp'o real do dispositivo PCR. O acoplamento e coleta de luz da amostra PCR podevn ser obtidos de diversas formas. Os seguintes métodos podem ser utilizados no sistema:i / · Sistema de detecçãó óptica usando fibra óptica bifurcada (605) (plástico multimodo, fibra de sÍiiCa ou feixes de fibras) Uma dás extremidades bifurcadas (605a) é para incidência de luz do LED (601) na amostra e a outra extremidade para a luz incidente em úm fotodetector (602). A extremidade comum (605b) direciona a luz na amostra. O lnétodo utiliza elementos ópticos para acoplar a luz de e para a

, fibra além dos filtros para seletividade de comprimento de onda.

· Um sistema de detecção óptica divisor de feixe usando divisores de feixe, lentes e filtros para focar a Iuz para a amostra e detecção. Figura 19 · Um sistema híbrido de detecção óptica utilizando fibra óptica para iluminação e 5 detecção direta usa'ndo lénte de foco, filtro e detector. Figura 20 A figura 6 mostra uma configuração do sistema óptico que é a preferida para um dispositivo PCR de acordo com a presente invenção. A figura mostra a configuração com a fibra óptica bifurcada (605) incluindo uma fonte de excitação de um LED (601) em uma extremidade da extremidade bifurcada (605a) e a fluorescência detectada 10 por um fotodetector (602-) em outra extremidade bifurcada (605a). O LED (601) e o fotodetector (602) S'ão aCoplados à extremidade bifurcada (605a) da fibra óptica e a extremidade comum (60'5b) virado para dentro da câmara de reação (201) do chip LTCC (200). A figura tarhbém mostra um filtro (604a) acoplado ao LED (601) e um filtro (604b) acoplado ao fotodetector (602) pelos acopladores (603a & 603b) 15 respectivamente. . O sinal de salda do detector (602) é amplificado (in loco no tubo fotomultiplicador, fotodiodo de avala'nche) usando um circuito amplificador (701) como na figura 7 antes de ser envia'do pàra o controlador de aquecedor. Um exemplo do circuito amplificador é um circuito de malha de captura de fase (PLL) (amplificador lock-in).

20 Nesse circuito a iluminação é pulsado a uma frequência predefinida (tipicamente na faixa entre 10 Hz a 500 KHz). O circuito de processamento de sinal de saída (sinal de fluorescência) trava 'na mesma frequência e gera uma corrente direta (DC) proporcional que é amplificada, convertida a uma voItagem, amplificada mais ainda e enviada ao microcontroi&or (106). O circuito intensifica a relação sinal/ruído do sinal 25 e elimina o ruído relacionado a frequência do sinal. O circuito lock-in se baseia no modulador/demodulador baianceado (como AD 630 JN da Analog Devices).

A figura 7 mostra um diagrama de bloco do circuito que controla o aquecedor e o termistor em que o terrhistor no microchip PCR LTCC (200) age como um dos braços no circuito em ponte (706). Mesmo quando o sensor de temperatura está 5 colocado fora do chip ele pode ser conectado a um dos braços do circuito em ponte.

A saída amplificada de ponte vinda do amplificador de ponte (701) é alimentada como entrada no controlador PID (703) onde é digitalizada, e o algoritmo PID fornece uma salda digital controlada. A saída é novamente convertida de voltar para a voItagem analógica e'isso conduz o aquecedor usando um transistor de força 10 presente no condutor do aquecedor (704).

O circuito analógico implementado para o controle de aquecedor (703) utiliza P, Pl, PD ou PID (Derivada Proporcional lntegral) ou pode ser um simples controle liga/desliga com base na saída do termistor. O sensor de temperatura é parte do circuito que detect"fí a 'mudança na temperatura. Nesta figura um exemplo de 15 termistor é considerado 3ara o sensor de temperatura em que é feito parte de um . circuito em ponte de Wheatstone (706). Uma mudança na resistência do termistor em razão de aquecimento ou resfriamento resulta em voltagem de saída finita do circuito. Essa voltagem se relaciona à temperatura do poço no chip LTCC. A voltagem medida é usa'da para determinar se o aquecedor deve ser ligado ou ., 20 desligado. O aquecedor ê fornecido com uma energia pré-ajustada determinada pela i temperatura máxima a sêr atingida no poço (no chip LTCC). Para levar em conta a variação de resistência do a aquecedor e termistor (-20°/o para chip otimizado), um circuito de autocalibração foi desenvolvido e está sendo implementado na unidade

P de mão. O circuito' compensa as mudanças nas resistências usando um termistor 25 comercial (PTlOO) èxposto ao ambiente. .&

P i

Ç

"r :" P é 19/28 O circuito de controle do aquecedor é gerenciado por um microcontrolador. O microcontrolador é programado para rodar o perfil térmico desejado através da interface de comunicação. O programa controla o circuito de controle do aquecedor (102) para rodar o perfil desejado do chip LTCC. Foi testada uma interface Bluetooth 5 para controlar o rnibrocohtrolador usando software rodando em PDA (iPaq rodando WindowsCE). O desenvolvimento de software para comunicação Bluetooth e desenvolvimento de GUl (lnterface Gráfica de Usuário) está sendo implementado no dispositivo de mão (109). O método de controlar o aquecedor e ler o valor do sensor de temperatura mostrado aqui é somente um exemplo. Este não deve ser 10 considerado o únici modò de lidar com o controlador ou uma limitação. Outro meio e método de controià o aquecedor e ler o valor do termistor é aplicável ao caso ora divulgado. Z O outro dispositivo permite aos usuários criar perfis térmicos para o PCR através de uma GUI (Interface Gráfica de Usuário). Os perfis térmicos são transferidos ao 15 microcontrolador através da interface de comunicação (107). O perfil térmico inclui

B valores de ponto de ajusi'te (temperatura e tempo) e número de ciclos. Os dados de sensor de tempeíàtura' e dados de detecção óptica do microcontrolador são enviados ao outro dispofitivo e nele exibidos. O computador também irá avaliar os dados e exibir o resultado da reação. O computador portátil roda um sistema 20 operacional como Windows CE/Mobile, Palm OS, Symbian ou Linux. Ainda em outra configuração é possÍvel que somente os valores de ponto de ajuste sejam enviados ao e o número de ciclos são monitorados pelo outro dispositivo. O microcontrolador atinge os valores de ponto de ajuste enviados de um perfil térmico pelo outro dispositivo.

25 Tipicamente, o produto PCR é analisado usando eletroforese em gel. Nessa técnica,

20/28 l fragmentos de DNA após PCR são separados em um campo elétrico e observados por tingimento com corante fluorescente. Um esquema mais adequado é usar um corante fluorescentê que se ligue especificamente a um DNA de fita dupla para monitorar a reação contihuamente (PCR em tempo real). Um exemplo de tal corante 5 é SYBR VERDE que é excitado por luz azul de 490nm e emite luz verde de 520nm quando ligado ao DNA. A intensidade da fluorescência é proporcional à quantidade de DNA produto dé dupla fita formado durante PCR e dessa forma aumenta com o número de ciclos. ' Um exemplo abaixÓ'explica diferentes possibilidades que podem ser obtidas usando 10 o dispositivo de mão (10"9) com o outro dispositivo. O outro dispositivo considerado neste exemplo é um PDAJSmartphone.

A aplicação PDNSmartphone em questão roda em uma pIataforma Windows móvel

5. Ela usa pilha dé perfil de porta serial (SPP) móvel Bluetooth para se comunicar com a unidade de mão. A unidade de mão inclui um módulo Bluetooth, o qual faz . 15 interface com o microcontro|ador através da porta UART (Recepção e transmissão . universal assíncrona) pãa a comunicação de dados. A principal funcionalidade da aplicação é controlar e monitorar o processo de ciclagem'térmica da unidade de mão através de vários perfis térmicos armazenados. Ela também tem funcionalidades tais como controle de-'acesSo de dois níveis; exibição de dados, criação de perfis 20 térmicos, etc. A figüra 15 ilustra o método de comunicação entre a aplicação e a

V unidade de mão. '" ' Aplicação PDA O programa de aplicação PDA aceita os dados de entrada, o que inclui valores de ponto de ajuste (temperatura e tempo) e o número de ciclos. Os valores de ponto de 25 ajuste são transferiàos pára a unidade de mão através de uma conexão Bluetooth e !' «

G

P t 21/28 aguarda a resposta da únidade de mão. Ao atingir o valor de ponto de ajuste, a unidade de mão comunica-o ao PDA, o qual envia o próximo grupo de instruções (figura 17). O PDA também recebe dados da unidade de mão (temperatura e dados ópticos) e os exibe. Para comunicar e executar as instruções enviadas pelo PDA, a 5 unidade de mão possui um microcontrolador com um programa embutido que permite ao Bluetooth efetuar comunicação e controle dos circuitos analógicos. Além disso, o programa "no rriicrocontroiador continuamente envia temperatura e dados ópticos ao PDA. A aplicação PDA possui 4 módulos:

1. Controle de acesso 10 2. GUl

3. Processamento é comijnicação de dados Controle de Acessd '

1. Este módulo perÒite áos usuários efetuar login na aplicação.

2. Ele possui uma tela de login com Nome de usuário & Senha.

15 3. Existem dois níveis de controle de acesso % a. Administrador b. Usuário

4. O administrador tem os, seguintes poderes: a. Criar usuários e PastaS de usuários 20 b. Criar perfis térmicos c. Conectar-se a/Mudar dispositivo de mão (109)

5. Uma vez que os usuários tenham entrado no sistema com seus Nomes de Usuário & Senhas, eles têm poderes para executar a aplicação, visualizar e armazenar os dadog pertinentes à sua sessão 25 GUl k 22/28

1. O módulo GUI (Interface Gráfica de Usuário) fornece telas para: a. Administradores digitarem diferentes Pontos de Ajuste (Temperatura & Tempo) e criar/excluir/modificar perfis térmicos.

b. Criar/excluir Usuá'rios e pastas de usuários.

5 c. Mudança de dispositivo de mão.

i. A aplicação usa a pilha Bluetooth para detectar dispositivos Bluetooth no âmbito. Após a detecção, ela exibe todos os dispositivos disponíveis no âmbito. O Administrador irá selecionar o dispositivo de mão e a aplicação solicita a pilha Bluetooth que irá Se juntar ao dispositivo de mão (109). Após a junção ele irá 10 armazenar a informàção do dispositivo juntado para uso futuro.

d. Iniciar, parar, reiniciar è interromper a aplicação.

e. Uma janela de log, que mostra os dados transmitidos e recebidos pela aplicação.

2. O módulo GUl possui uma tela para exibir os dados térmicos e ópticos coletados da unidade de mãoi 15 Módulo de Processàmento de Dados b O módulo de processamento de dados possui a seguinte funcionalidade:

1. Conversão de dados !

2. Algoritmo de comunicação.

Conversão de dados: 20 1. Os dados são coletados de um perfil térmico selecionado pelo usuário.

2. Este é um típico i)erfi| térmico: Ponto de ajuste inicíal : Ponto de Ajuste 1 Ponto de Ajuste 2 25 Ponto de Ajuste 3 l Z , í: "

] 23/28 [Número de ciclos] , ' Ponto de ajuste final. '

3. Como os valores de Ponto de Ajuste contêm Temperatura e Tempo, os valores de temperatura são então convertidos para valores de voItagem usando a fórmula: 5 V= (t-x)/y Onde V é a voltagein, t é a temperatura e x & y são constantes predefinidas.

4. Os valores de voltagem assim obtidos serão convertidos para valores hexadecimais (base 16) de 10 bits usando a fórmula: (V lV sup pIy) * 1023 onde V é a voltagem.

10 5. Os valores de tempo (em segundos) são convertidos para valor hexadecimal (hex).

6. Os dados térmi'cos coletados da unidade de mão serão convertidos de valor hexadecimal para vòltagem para exibição usando a fórmula: . (Hex/1023) * V "pp'y ': 15 7. A voltagem é novamerite convertida para temperatura: > t=V*y+x

8. Os dados ópticos coletados serão convertidos para voltagem e serão diretamente enviados para exibi'ção. ' Comunicação de Dádos:' 20 O módulo de comunicação de dados conversa com a pilha Bluetooth móvel Windows. Os seguintes protocolos são seguidos durante a comunicação.

lnício: O botão de iniciar fornecido pelo programa de aplicação dá início ao processo de ciclagem térmica. A aplicação soIicita que a pilha Bluetooth estabeleça uma conexão 25 de porta serial sem'-fio com a unidade de mão. Após receber a confirmação, o PDA

Q 4 24/28 começa a se comunicar com a unidade de mão.

O comando Parar/Pausa/Continuar Parar irá parar a ciclagem térmica e indicar à unidade de mão que reduza a temperatura para temperatura ambiente - este processo não pode ser :reiniciado. A Pausa irá manter a temperatura do chip à 5 temperatura atual. lsso pode ser revogado pelo comando continuar O uso de uma plataforma de computação portátil como PDA dá ao sistema poder de computação suficiente para controlar os componentes eletrônicos e fornecer uma interface de usuário versátil, porém simples, para exibir os dados. lsso também torna o sistema todo modular e assim permite fácil upgrade com custo mínimo para o 10 usuário. · .

A invenção fornece ud dispositivo PCR de mão comercializável para aplicação específica de diagnóstico. O programa que roda no outro dispositivo fornece um sistema PCR de mão completo com detecção em tempo real e controle de software.

Reduzindo-se a massa térmica e os indices melhorados de . 15 aquecimento/resfriamento usando o dispositivo, o tempo que se leva de 2 a 3 horas . para concluir uma rèação de 30 a 40 ciclos, mesmo para um volume moderado de amostra de 5-25 µ1, foi Íeduzido para menos de 30 minutos. A figura 14 mostra o tempo que se Ievou para amplificar o DNA Viral da Hepatite B usando o chip LTCC da invenção. O PCR foi rodado por 45 ciclos e conseguiu obter amplificação em 45 20 minutos indicado como (1) na Figura 14. Além disso, a amplificação também foi observada quando'o PCR foi rodado por 45 ciclos em 20 minutos (2) e 15 minutos (3). A duração convincio'nai de HBV (45 ciclos) seria de cerca de 2 horas.

A miniaturização permité leituras precisas com menores tamanhos de amostra e consumo de menores vo'lumes dos caros reagentes. As pequenas massas térmicas 25 dos Microssistemas e os pequenos tamanhos de amostra permitem uma ciclagem ,

b P 25/28 térmica de baixa energia, aumentando a velocidade de muitos processos, tai como replicação de DNA atravês de micro PCR. Além disso, os processos químicos que dependem da química de superfície são bastante melhorados pelas relações superfície/volume aumentadas que são disponíveis na microescala. As vantagens 5 dos microfluídicos levaram à demanda pelo desenvolvimento de microssistemas integrados para análise química.

O microchip traduzido em um dispositivo de mão (109) dessa forma remove a máquina PCR de um sÓfisticado laboratório, assim aumentando o alcance dessa técnica bastante poderosa, seja para diagnóstico cIínico, teste de alimento, testes de 10 sangue em bancos de sangue ou várias outras áreas de aplicação.

Os instrumentos PCR èxistentes, com múltiplas câmaras de reação, fornecem múltiplos Iocais de 'experimento de DNA todos rodando o mesmo protocolo térmico, de forma que não"são èficientes em relação ao tempo. Surge a necessidade de reduzir o tempo de reaçãÔ e volume de tomada de amostra. . 15 O PCR instantâneo, se projetado no futuro, poderia ter uma gama de dispositivos . com resposta térmica bastante rápida e alto isolamento dos chips PCR adjacentes . réações de forma eficaz e independente com diferentes para rodar múltipbs protocolos térmicosEe míhima diafonia.

A análise ou quantÍiicaçáo dos produtos PCR é realizada pela integração prática de 20 um sistema de detecção de fluorescência em tempo real. Este sistema também poderia ser integrado a sistemas de quantificação e sensores para detectar doenças como Hepatite B (Figura 12), AIDS, tuberculose, etc. Outros mercados incluem monitoramento de aliméntos, análise de DNA, ciência forense e monitoramento b ambiental.

25 A figura 8 mostra um deGenho comparativo da fusão do fragmento de DNA )\-636 no

< i b 26/28 chip usando o aquecedor e termistor integrados.

A figura 9 mostra o aumento no sinal de fluorescência associado à amplificação do DNA À-311. O perfil térmico foi controlado pela unidade de mão e a reação foi realizada em um chip @istura da reação de 3µ1 e óleo de 6µ1). A fluorescência foi 5 monitorada usando um amplificador lock-in convencional.

A invenção também fornece um sistema diagnóstico. O procedimento adotado para desenvolver o sistema diagnóstico foi o de inicialmente padronizar os protocolos térmicos para alguns 'problemas e funcionalizá-los no chip. Os iniciadores .

designados para o' DNA ribossômico 16S amplificaram o fragmento de E. coli e 10 Salmonella em - 300 - 4joo bp enquanto os iniciadores para o gene stn amplificaram o fragmento de Salmonella typhi em - 200 bp. Os produtos obtidos foram confirmados por detecção de fluorescência verde SYBR bem como eletroforese em gel de agarose. As figuras 9 e 13 mostram a figura gel do DNA À-311 amplificado e o . gene de Salmonella usahdo microchip. 15 Perfil térmico para ámplificação de DNA À-311:

W Desnaturação: 94°C (90S) 94°C (30S) - 50°C (30S) - 72°C (45S) Extensão: 72°C (120S) Perfil térmico para amplificação do gene da Salmonella: 20 Desnaturação: 94°C (90s) 94°C (30S) - 55°C (30S) -'72°C (30S) Extensão: 72°C (30OS) ! PCR com sangue e plasma processado O sangue ou plasma foi tratado com um agente de precipitação que pode precipitar 25 as principais substâncias inibidoras de PCR dessas amostras. O sobrenadante claro ,.. . < 9 l 0 27/28 foi usado como modelo. Usando este protocolo, foram obtidas amplificações para fragmentos de -200 bp de Salmonella typhi (figura 10). Na figura 10, a imagem de eletroforese em gel mostra

1. reação de controle, 5 2. Produto PCR — sangue sem processamento,

3. Produto PCR — sangue com processamento

4. Produto PCR - pIasma processado Tampão para PCR direto,de sangue Um tampão exclusivo foi formulado para PCR direto com amostras de sangue ou 10 plasma. Usando este sistema de tampão exclusivo, foi obtida amplificação de PCR direto com sangue e plasma. Com este sistema de tampão, foi obtida amplificação de até 5O°/q para sangue e 4Õ°/o para plasma (ver Figuras 11 e 12) usando o chip LTCC da invenção. Na figura 11, a imagem de eletroforese em gel mostra

P

1. Produto de PCR - 20% de sangue, 15 2. Produto de PCR - 30% de sangue, k

3. Produto de PCR - 40% de sangue,

4. Produto de PCR - 5Õ°/o de sangue, e na figura 12, a imàgem'de eletroforese em gel mostra,

1. Produto PCR - 20% de plasma, 20 2. Produto PCR - 3O°/j de plasma,

3. Produto PCR - 40% de plasma,

4. Produto PCR - 50% de plasma,

5. reação de controle ' O tanipão exclusivo inclui sal de tampão, um cIoreto ou sulfato contendo Íon l 25 bivalente, um detergente'não-iônico, um estabilizador e um álcool de açúcar.

,.

, g i 28/28 A figura 16 mostra uma curva de fusão do chip LTCC para derivada do sinal de fluorescência para a fusão do DNA À-311. A figura também fornece uma r comparação entre êgta invenção (161) e o dispositivo PCR convencional (162). Pico maior: valor do pico/largu'ra (eixo X) @ meio valor de pico = 1,2/43 5 Pico menor: valor do pico/largura (eixo x) @ meio valor de pico = 0,7/63 Uma relação maior indica um pico maior. Também no gráfico, o eixo y é a derivada (inclinação da curva de fusão), inclinação maior indica maior fusão.

A Figura 19 mostra a deScrição de uma configuração do sistema óptico com divisor

S de feixe que podería ser adotada no dispositivo de mão. O sistema de detecção de 10 fluorescência inclui uma fonte de luz LED (193), lente (196) para focar a Iuz, um filtro de passagem de banda (195) para selecionar um comprimento de onda específico da luz, um divisor de feixe (191), uma lente (198) para focar o facho incidente e o sinal da amostra carregado no chip (200), um filtro de passagem de banda (194) para selecionar o comprimento de onda específico da luz, lente de foco (197) e um . 15 fotodetector (1 92). "- A Figura 20 mostra a àescrição de uma configuração do sistema óptico híbrido incorporando fibra óptica e lentes. Este sistema de detecção de fluorescência inclui uma fonte de luz LED não mostrada na figura, com filtro de passagem de banda para selecionar um comprimento de onda de luz específico acoplado a uma fibra 20 óptica (213). A fibra óptica direciona a luz para a amostra. Opcionalmente, uma lente adequada pode ser usada para focalizar a Iuz que sai da fibra óptica para a amostra.

São usadas lentes (212) 'para caluniar o facho emitido da amostra carregada no chip (200). Um filtro de passagem de banda (214) é usado para selecionar comprimento de onda específico da luz emitida e lente de foco (212) para focá-la em um 25 fotodetector. ' , , í

Claims (32)

REIVINDICAÇÕES

1. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, CARACTERIZADO por incluir: a) um microchip PCR de LTCC (cerâmica co-sinterizada a baixa temperatura) incluindo um aquecedor, uma câmara de reação para carga de uma amostra, 5 b) um controle de aquecedor para regulá-lo com base na entrada recebida de um sensor de temperatura, c) um sistema de detecção óptica para detectar um sinal fluorescente da amostra e d) pelo menos uma interface de comunicação para interagir com outro(s) dispositivo(s).

10 2. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ser fornecida pelo menos uma camada condutora entre o aquecedor e a câmara de reação.

3. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pela câmara de reação ser cercada por anéis condutores.

15 4. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com as reivindicações 2 e 3, CARACTERIZADO pelos anéis condutores estarem conectados à camada condutora por pilares.

5. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com as reivindicações 2, 3 e 4, CARACTERIZADO pelo condutor ser feito de um material selecionado de um grupo 20 incluindo ouro, prata, platina e paládio ou ligas destes.

6. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo sensor de temperatura ser colocado fora do chip para medir a temperatura do chip.

7. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 1, 25 CARACTERIZADO pelo sensor de temperatura estar embutido em pelo menos uma camada do chip.

8. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo sensor de temperatura ser um termistor.

9. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 1, 5 CARACTERIZADO pelo sensor de temperatura estar conectado como um braço de um circuito em ponte.

10. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com as reivindicações 1 e 9, CARACTERIZADO pela saída do circuito em ponte ser amplificada antes de ser alimentada para o controle do aquecedor para regular o aquecedor.

10 11. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo chip incluir uma tampa para cobrir a câmara de reação.

12. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo chip ser descartável.

13. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 1, 15 CARACTERIZADO pelo sistema de detecção óptica ser selecionado de um grupo incluindo um sistema de detecção óptica de divisor de feixe, um sistema de divisão óptica híbrido e um sistema de divisão óptica bifurcado.

14. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo sistema óptico incluir uma fonte de luz e um fotodetector 20 para detectar um sinal fluorescente da amostra.

15. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO por um amplificador lock-in amplifica o sinal detectado.

16. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com as reivindicações 13 e 14, CARACTERIZADO pelo sistema óptico bifurcado usar uma fibra óptica bifurcada 25 com a fonte da luz colocada em uma extremidade bifurcada (605a) e o fotodetector colocado na outra extremidade bifurcada (605a) da fibra óptica.

17. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com as reivindicações 1 e 16, CARACTERIZADO pela extremidade comum (605b) da fibra óptica bifurcada apontar para a amostra.

5 18. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com as reivindicações 1 e 13, CARACTERIZADO pelo sistema de detecção óptica híbrido usar fibra óptica para dirigir a luz para a amostra.

19. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com as reivindicações 1 e 13, CARACTERIZADO pelo sistema de detecção óptica híbrido usar lente para focalizar 10 o feixe emitido da amostra.

20. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pela interface de comunicação ser selecionada de um grupo incluindo serial, USB, Bluetooth ou combinações destes.

21. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com as reivindicações 1 e 15, 15 CARACTERIZADO pelo outro dispositivo colher a temperatura do chip e o sinal amplificado do dispositivo de mão.

22. DISPOSITIVO DE MÃO DE PCR, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo outro dispositivo ser selecionado de um grupo incluindo smart phone, PDA e dispositivo programável.

20 23. MÉTODO PARA MONITORAR E CONTROLAR O MICRODISPOSITIVO PCR DE MÃO, 1, CARACTERIZADO por tal método incluir os passos: a. estabelecer uma comunicação entre o microdispositivo PCR de mão e outro dispositivo através de uma interface de comunicação, b. iniciar um processo de ciclo térmico com base nos valores de perfil térmico 25 recebidos do outro dispositivo para controlar um microchip PCR de LTCC, e c. enviar um sinal óptico detectado pelo sistema óptico para o outro dispositivo.

24. MÉTODO PARA MONITORAR E CONTROLAR O MICRODISPOSITIVO PCR DE MÃO, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO por alimentar 5 os valores de perfil térmico no outro dispositivo por um usuário através de uma interface.

25. MÉTODO PARA MONITORAR E CONTROLAR O MICRODISPOSITIVO PCR DE MÃO, de acordo com as reivindicações 23 e 24, CARACTERIZADO por criar, modificar ou excluir os perfis térmicos através da interface de usuário.

10 26. MÉTODO PARA MONITORAR E CONTROLAR O MICRODISPOSITIVO PCR DE MÃO, de acordo com as reivindicações 23 e 25, CARACTERIZADO pelo outro dispositivo fornecer autenticação do usuário.

27. MÉTODO PARA MONITORAR E CONTROLAR O MICRODISPOSITIVO PCR DE MÃO, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo outro 15 dispositivo armazenar uma diversidade de perfis térmicos.

28. MÉTODO PARA MONITORAR E CONTROLAR O MICRODISPOSITIVO PCR DE MÃO, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo perfil térmico fornecer valor de ponto de fixação e número de ciclos.

29. MÉTODO PARA MONITORAR E CONTROLAR O MICRODISPOSITIVO 20 PCR DE MÃO, de acordo com as reivindicações 23 e 28, CARACTERIZADO por manter o chip a uma temperatura por um tempo determinado pelo valor do ponto de fixação.

30. MÉTODO PARA MONITORAR E CONTROLAR O MICRODISPOSITIVO PCR DE MÃO, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO por trazer a 25 temperatura do microchip PCR à temperatura ambiente interrompendo o processo de ciclo térmico.

31. MÉTODO PARA MONITORAR E CONTROLAR O MICRODISPOSITIVO PCR DE MÃO, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO por manter a temperatura do microchip PCR constante quando o ciclo térmico é interrompido.

5

32. MÉTODO PARA MONITORAR E CONTROLAR O MICRODISPOSITIVO PCR DE MÃO, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO por comunicar com outro dispositivo usando a pilha de perfil de porta serial Bluetooth móvel.

33. MÉTODO PARA MONITORAR E CONTROLAR O MICRODISPOSITIVO 10 PCR DE MÃO, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO por representar os dados térmicos e ópticos em uma unidade monitora do outro dispositivo.

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C $ b 13/16 lnlcio pon os de àjlj$3 e iniod Ponto de ajuste Í,2,3 " " .,N° de Ciclos PontÓ de ajuste final · , /Obtj ") / - )pontod.aju? \ N' de çiclos _> ) Enviar tempo de ponto de ajuste inicial ( Subrotina T )

I cp" / Ler valor do sensor Enviar ponto / de tem,peratura de ajuste 1 '- L- <P' ' '7 ' Saída do sensor ' ~ de temperatIjra = ponto de ajuste >-j Enviar ponto , á de ajuste 2 I ' Espera J _ (tempo em segundos)' | de ajuste 3 U// Enviar ponto i lncrementar Ciclo Àiuai :le . Ciclo atuaí"E'N° de ciclo > l Enviar ponto de ajuste final < T? £>-~b · Figura 17 : '

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