BRPI0818236B1 - processo para recuperação do ácido chiquímico de um fluxo de processo aquoso compreendendo ainda glifosato - Google Patents

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BRPI0818236B1
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shikimic acid
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BRPI0818236-1A
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Sunder S. Rangachari
Todd C. Friedman
Greg Hartmann
John W. Hemminghaus
Keith A. Kretzmer
Nicholas J. Nissing
Robert B. Weisenfeld
Original Assignee
Monsanto Technology Llc
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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Abstract

processo para recuperação do ácido chiquímico de um fluxo de processo aquoso compreendendo ainda glifosato a presente invenção refere-se, de forma geral, a processos para produzir e recuperar ácidos ciclocarboxílicos, tais como ácido chiquímico e ácido quínico. em particular, a presente invenção é direcionada aos processos para produzir ácido chiquímico que compreendem contactar glifosato e um organismo que tenha o caminho biossintético aromático comum. a presente invenção também é direcionada à recuperação do produto do ácido chiquímico dos fluxos de processo aquoso utilizando técnicas de separação de membrana.

Description

PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO DO ÁCIDO CHIQUÍMICO DE UM FLUXO DE PROCESSO AQUOSO COMPREENDENDO AINDA GLIFOSATO CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se geralmente a processos para produzir e recuperar ácidos ciclitolcarboxícos, tais como ácido chiquí-mico e ácido quínico. Em particular, a presente invenção é direcionada a processos para produzir ácido chiquímico que incluem contactar gli-fosato e um organismo que tem o caminho biossintético aromático comum. A presente invenção também é direcionada a recuperação do produto de ácido chiquímico de correntes de processo aquosas utilizando técnicas de separação de membrana.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Ácido chiquímico (ácido tri-hidróxi-1-ciclo-hexeno-1-carboxílico; Chemical Abstracts Registry Number 138-59-0) é o compost precursor chave para a fabricação sintética de oseltamivir ester etílico de ácido ((3R, 4R, 5S)-4-(acetil-amino)-5-amino-3-(1-etilpropóxi)-1-ciclo-hexeno-1-carboxílico; Chemical Abstracts Registry Number 196618-13-0) (Rohloff et al., 1998; Federspiel et al., 1999). Oseltamivir, um inibidor oralmente ativo da essencial neuraminidase do virus da influenza, foi descoberto por cientistas em Gilead Sciences Inc. of Foster City, California (Kim et al., 1997; Kim et al. , 1998; Abrecht et al., 2004; Bischofberger et al., patente US 5,763,483; Lew et al., patente US 5,866,601; Bischofberger et al., patente US 5,952,375; Bischofberger et al., patente EP 0759917 Bl; Bischofberger et al., patente EP 0976734 Bl).
[003] Durante a replicação do virus da influenza novas partículas de vírus são ligadas a uma cadeia lateral de ácido siálico na proteína receptora de vírus. O mecanismo da neuraminidase viral é clivar este ácido siálico e liberar as recentemente replicadas partículas de vírus. Oseltamivir é um análogo de ácido siálico que inibe esta reação de clivagem ligando ao local ativo da neuraminidase. Estas células infectadas abortivamente são destruídas, parando a expansão do vírus dentro do hospedeiro. Oseltamivir tem potencial uso em pandemia de influenza, inclusive "influenza de ave", na forma do farmacêutico TAMI-FLU (De Clercq, 2002; Bradley, 2005; Farina e Brown, 2006) . O farmacêutico TAMIFLU é o sal de fosfato de oseltamivir (Chemical Abstracts Registry Number 204255-11-8; também conhecido como composto Roche Ro 64-0796/002 e composto Gilead Sciences GS- 410402). TAMIFLU foi primeiro comercializado por Roche em outubro de 1999 (Farina e Brown, 2006). Porém, a produção ampla da droga foi limitada pela disponibilidade baixa do material precursor de ácido chi-químico.
[004] O ácido chiquímico é uma substância química escassa e onerosa, sendo principal mente obtida das sementes de arbustos lenhosos, isto é o arbusto de erva-doce de estrela chinesa (lllicium ve-rum) nativa da China e o arbusto shikimi-no-ki (lllicium anisatum, antigamente chamado lllicium religiosum) de onde o ácido chiquímico conseguiu seu nome nativo do Japão (Haslam, 1974; Sadaka e Garcia, 1999; Payne e Edmonds, 2005). Mais ou menos 30 quilogramas de erva-doce de estrela ou shikimi-no-ki são exigidos para produzir um quilograma de ácido chiquímico (Farina e Brown, 2006) . Porém, esta fonte natural é limitada e insuficiente para satisfazer a demanda mundial por TAMIFLU (Bradley, 2005).
[005] 1,3 gramas de ácido chiquímico são exigidas para fabricar as 10 doses de TAMIFLU necessárias para tratar uma pessoa (Bradley, 2005). A produção de uma provisão de TAMIFLU suficiente para tratar 400 milhões de pessoas (uma estimativa conservadora da necessidade no caso de uma pandemia de influenza) exige 520.000 quilogramas de ácido chiquímico. A produção anual mundial de ácido chiquímico atualmente é de apenas mais ou menos 100.000 quilogramas. Outra estimativa da necessidade de TAMIFLU no caso de uma pandemia de influenza severa é de 30 bilhões de doses, exigindo 3,9 milhões de quilogramas de ácido chiquímico (Bradley, 2005).
[006] Várias abordagens para solucionar o problema de escassez de ácido chiquímico foram recentemente exploradas. Uma é a produção de ácido chiquímico por micro-organismos por um processo a base de fermentação (Farina e Brown, 2006). Processo a base de fermentação é descrito em Bogosian et al., Pedido de Patente Internacional PCT/US2008/060079, o conteúdo inteiro do qual é incorporado neste por referência para todos os propósitos relevantes e descritos abaixo como o "método de fermentação". Bogosian et al. inclui uma pesquisa de processos a base de fermentação, inclusive citação de muitas referências relacionadas, muitos dos quais são listados na seção “REFERÊNCIAS” em outro lugar neste. Outro método para produção de ácido chiquímico é baseado em novas rotas de síntese química para fosfato de oseltamivir que não utilizam produtos naturais escassos como compostos precursores, mas ao invés disso usam substâncias químicas econômicas e extensamente disponíveis (Fukuta et al., 2006; Yeung et al., 2006). As rotas químicas que foram desenvolvidas até hoje são funcionais apenas como sínteses em escala de bancada acadêmicas e não são processos industriais eficientes que poderiam competir com o atual processo de fabricação a base de ácido chiquímico para fosfato de oseltamivir (Farina e Brown, 2006). Ainda outros métodos utilizam plantas para produção de ácido chiquímico (como detalhado abaixo).
[007] Para entender os processos a base de fermentação e outros processos para produção de ácido chiquímico, seria útil brevemente rever o caminho biossintético para ácido chiquímico. Este cami-nho é conhecido tanto como o caminho biossintético aromático comum (Herrmann, 1983; Pittard, 1987; Pittard, 1996) porque ele leva a (entre outras coisas) aminoácidos aromáticos, quanto como o caminho para chiquimato (Haslam, 1974) depois do intermediário metabólico no caminho que foi identificado primeiro. Vários livros inteiros e artigos de revisão completos foram dedicados para este importante caminho metabólico (Haslam, 1974; Weiss e Edwards, 1980; Herrmann, 1983; Conn, 1986; Pittard, 1987; Haslam, 1993; Herrmann, 1995a; Herrmann, 1995b; Pittard, 1996; Herrmann e Weaver, 1999; Bongaerts et Al., 2001; Kramer et Al., 2003).
[008] O caminho biossintético aromático comum está presente em plantas, bactérias, fungos e outros micro-organismos eucarióticos. Uma pesquisa em bancos de dados on-line, especificamente PubMed e o National Center for Biotechnology Information (NCBI), indicou que além de plantas, bactérias e fungos o caminho está presente em Stramenopiles tais como algas marrons e diátomos, Alveolata (dentro do reino Protista), tais como parasitas ciliatos, dinoflagelatos e api-complexa, e vários Euglenozoa. O caminho biossintético aromático comum na bactéria Escherichia coli é mostrado na Fig. 1. O caminho biossintético aromático comum não é encontrado na maioria dos animais superiores, como nematodos, insetos e outros artrópodes, moluscos e vertebrados e outro cordatos inclusive peixes, anfíbios, répteis, pássaros e mamíferos. Foi estabelecido por outros que o caminho biossintético aromático comum está presente nos micro-organismos protozoários parasitários conhecidos como apicomplexa (Roberts et al., 1998; McConkey, 1999; Roberts et al., 2002). Também foi sugerido por outros que o caminho biossintético aromático comum pode estar presente em alguns animais superiores, especificamente em metazoa-nos basais dentre os invertebrados marinhos e de água doce conhecidos como cnidarianos (ou coelenterados), inclusive corais, anémonas do mar, águas-vivas e hidróides (Starcevic et al., 2008). É para ser entendido que declarações que o caminho biossintético aromático comum está presente em micro-organismos significam que o caminho ocorre em organismos microscópicos e organismos macroscópicos taxonomicamente relacionados dentro das categorias, algas, Archaea, bactérias, fungos e protozoários; isto inclui procarióticos, inclusive cia-nobactérias, como também organismos eucarióticos unicelulares.
[009] O fato que micro-organismos possuem o caminho biossintético aromático comum, e dependem dele para a biossíntese de muitos componentes celulares essenciais, e que mamíferos (inclusive humanos) carecem do caminho, faz das enzimas do caminho objetivos atraentes para novas classes de agentes terapêuticos antimicrobianos (Davies et al., 1994; Roberts et al., 1998). Quaisquer desses agentes terapêuticos que são baseados em ácido chiquímico aumentariam a demanda por ácido chiquímico. Realmente, ácido 6-fluorochiquímico foi considerado ser um composto antibacteriano eficaz (Davies et al., 1994; Bornemann et al., 1995) e composto antiparasítico (McConkey, 1999; Roberts et al., 2002). Ácido chiquímico também foi convertido em compostos que exibiram um efeito inibidor significante sobe a proliferação de célula, abrindo seu uso possível como agente quimiotera-pêutico anticâncer (Tan et al., 1999). Deste modo, ácido chiquímico poderia servir como um bloco de construção importante para uma ampla gama de classes importantes de fármacos, inclusive fármacos anti-virais, antibacterianas, antiparasíticas e anticâncer.
[0010] Como observado, outros métodos para produção de ácido chiquímico utilizam plantas. Em algumas plantas e tecidos de planta, tais como sementes, o ácido chiquímico naturalmente se acumula até níveis altos. A erva-doce de estrela chinesa e várias espécies de árvores sempre-viva são exemplos destes. O ácido chiquímico normalmente não se acumula até níveis que se pode detectar em, por exemplo, tecidos vegetativos de colheitas agronômicas importantes, tais como alfafa, soja, trigo, milho, beterraba, etc.
[0011] O ácido chiquímico é um ácido ciclitolcarboxílico, uma classe de compostos que também inclui ácido quínico. Ácido quínico (ácido 1,3,4,5-tetra-hidroxiciclo-hexano-l-carboxílico; Chemical Abstracts Registry Number 77-95-2) também é um material de partida para a síntese de várias moléculas biologicamente importantes, inclusive osel-tamivir. Ele é utilizado na síntese de FK-506, um agente imunossu-pressor útil em prevenir rejeição de transplante de órgão (Rao et al., 1991) e muitos produtos naturais que são caso ao contrário difíceis de obter, por exemplo, micosporina (White et al., 1989) e D-mio-inositol-1,4,5-trifosfato (Falck et al., 1989). Ácido quínico pode ser convertido em ácido chiquímico (Dangschat et al., 1938 & 1950; E Adachi et al., 2006) e também em éster metílico de ácido chiquímico (Cleophax et al., 1971 & 1973). Ácido quínico é encontrado em casca de cinchona, grãos de café e as folhas de certas plantas, e é feito sinteticamente por hidrólise de ácido clorogênico.
[0012] Glifosato é famoso como um herbicida altamente eficaz e comercial mente importante útil para combater a presença de uma ampla variedade de vegetação não desejada, inclusive ervas daninhas agrícolas (por exemplo, patentes US 3,799,758 e 4,405,531). Glifosato e seus vários sais são essencialmente não seletivos, significando isto que quando aplicados pós-aparecimento eles controlam uma ampla variedade de ervas daninhas anuais e perenes.
[0013] Glifosato é um herbicida móvel de xilema e floema. Uma vez absorvido pela folhagem tratada, o glifosato é mobilizado das folhas tratadas para outras partes da planta, como raízes ou folhas recentemente formadas. A mobilização das folhas tratadas finalmente será limitada por um efeito herbicida direto nas folhas tratadas. Quando o efeito herbicida é maior, a taxa e extensão de mobilização serão diminuídas. Este efeito sobre a mobilização é maior com concentração aumentada de tratamento por herbicida, ou quando as condições ambientais no tratamento são particularmente estressante, tal como sob condições de extremo seco, quente ou frio.
[0014] O modo de ação de glifosato é inibição do caminho biossin-tético aromático comum por inibição de enzima cloroplasto 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS). A inibição de EPSPS por glifosato é não reversível e as plantas tratadas são eventualmente "privadas" dos produtos finais essenciais do caminho biossintético aromático comum. Como isto afeta o novo crescimento em uma extensão maior do que partes existentes da planta, os sintomas de tratamento com glifosato parecem ser lentos para se desenvolver.
[0015] O ácido chiquímico é um produto natural que normalmente não acumula até níveis altos em plantas. Porém, quando plantas suscetíveis são tratadas com glifosato, elas acumulam ácido chiquímico (e também provavelmente acumulam quantias menores do ácido 5-fosfochiquímico intermediário metabólico instável) até níveis altos. É possível, então, usar este sistema para produzir quantidades grandes de ácido chiquímico em qualquer planta que é suscetível a glifosato, tanto em plantas que normalmente não acumulam ácido chiquímico quanto em plantas que naturalmente podem acumular ácido chiquímico até um certo nível. Adicionalmente, se este método é aplicado a um sistema de colheita agronômica normal incluindo, mas não limitado a, soja, alfafa, milho e trigo, ele pode ser usado para produzir ácido chiquímico até níveis em escala industrial e potencial mente poderia aliviar a limitação de ácido chiquímico na produção de produtos tais como o inibidor de neuraminidase TAMIFLU.
[0016] Recentemente, com a bioengenharia de colheitas resistentes a glifosato, tais como soja, milho, algodão, canola, alfafa e beterraba, o uso de glifosato aumentou. Quando glifosato é aplicado a plantas resistentes a glifosato, nenhum sintoma de dano visual ou bioquímico é detectado; entretanto, quaisquer plantas indesejáveis suscetíveis (como ervas daninhas) que podem estar presente são controladas. As colheitas são ainda colhidas na maneira convencional. Por exemplo, em soja ROUNDUP READY as vagens do feijão são colhidas e em algodão ROUNDUP READY os gorgulhos de algodão são colhidos. Não é típico colher a planta inteira em tais colheitas.
[0017] Pesquisa prévia identificou o acúmulo de ácido chiquímico em plantas como uma conseqüência de contactar uma planta suscetível com glifosato (vejam, por exemplo, Amrhein et al., 1980; Harring et al., 1998; Pline et al., 2002; Mueller et al., 2003; Buehring et al., 2007; E Henry et al., 2007). Anderson et Al. (2001) descreve um método para a determinação de ácido chiquímico em tecido de planta depois de exposição da planta a glifosato. A análise de ácido chiquímico do tecido de planta foi efetuada usando extração de água seguida por análise por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). A Publicação Internacional de Anderson WO 2008/027570 A2 descreve um método de isolar ácido chiquímico de uma planta (trigo) que foi tratada com glifosato para aumentar a quantidade de ácido chiquímico na planta.
[0018] Apesar do conhecimento de que ácido chiquímico está presente em plantas tratadas com glifosato, esforços significativos por outros para desenvolver novas fontes de ácido chiquímico falharam muito embora exista uma consciência significativa e uma necessidade há muito sentida por fontes melhoradas de ácido chiquímico, com base em preocupações altamente publicadas relativas a pandemia global de "influenza de ave" e outros vírus tipo influenza.
[0019] A pesquisa exemplificada neste mostrou que o tratamento de plantas suscetíveis com glifosato também pode resultar na acumulação de ácido quínico. Esta acumulação de ácido quínico fornece uma nova fonte de ácido quínico. É possível, então, tratar plantas suscetí-veis com glifosato para produzir ácido quínico em níveis de escala industrial. O resultante ácido quínico pode ser usado na produção de compostos químicos bioativos, tais como FK-506 e TAMIFLU. Alternativamente, o resultante ácido quínico pode ser usado para preparar ácido chiquímico que, por sua vez, pode ser usado na produção de produtos como TAMIFLU.
[0020] Um objeto da presente invenção é o desenvolvimento de processos para produção de ácido chiquímico e ácido quínico utilizando plantas. Outro objeto da presente invenção é o desenvolvimento dos processos para recuperação de ácido chiquímico, não importando a maneira de sua produção (por exemplo, pelo "método da planta" ou "método de fermentação" como detalhado em outro lugar neste).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0021] Brevemente, então, a presente invenção é direcionada a processos para recuperar ácido chiquímico.
[0022] Em várias modalidades, a presente invenção é direcionada a processos para recuperação de ácido chiquímico de um fluxo do processo aquoso incluindo ácido chiquímico e ainda incluindo glifosato. Em uma modalidade, o processo inclui introduzir o fluxo de processo aquoso em uma unidade de separação de membrana compreendendo pelo menos uma membrana de separação; contactar o fluxo de processo aquoso e pelo menos uma membrana de separação para formar um retentado e um permeado, onde o retentado compreende ácido chiquímico e glifosato; e separar o ácido chiquímico do glifosato no retentado para formar uma solução de produto aquoso compreendendo ácido chiquímico e esgotada de glifosato em relação ao retentado.
[0023] Em outra modalidade, o processo inclui introduzir o fluxo de processo aquoso em uma unidade de separação de membrana compreendendo pelo menos uma membrana de separação;
[0024] contactar o fluxo de processo aquoso e pelo menos uma membrana de separação para formar um retentado e um permeado, em que o permeado compreende ácido chiquímico e fenilalanina; e
[0025] separar o ácido chiquímico da fenilalanina no permeado para formar uma solução de produto aquoso compreendendo ácido chiquímico e esgotada de fenilalanina em relação ao permeado.
[0026] Em uma modalidade adicional, o processo inclui introduzir o fluxo do processo aquoso em uma unidade de separação de membrana incluindo pelo menos uma membrana de separação; e contactar o fluxo do processo aquoso e pelo menos uma membrana de separação para formar um retentado e um permeado.
[0027] Em várias outras modalidades, a presente invenção é direcionada a processos para recuperação de ácido chiquímico de um caldo de fermentação. Em uma modalidade, o processo inclui introduzir o caldo de fermentação em uma unidade de separação de membrana incluindo pelo menos uma membrana de separação; e contactar o caldo de fermentação e pelo menos uma membrana de separação para formar um retentado e um permeado.
[0028] A presente invenção é ainda direcionada a métodos para produzir ácido chiquímico. Em uma modalidade, o método inclui (a) selecionar uma pluralidade de células de planta incluindo o caminho biossintético aromático comum; (b) aplicar glifosato a pelo menos uma porção das células de planta; (c) colher as células de planta; e (d) extrair ácido chiquímico da colheita.
[0029] Em outra modalidade, o método inclui (a) selecionar uma pluralidade de organismos incluindo o caminho biossintético aromático comum; (b) colher os organismos; (c) aplicar glifosato a pelo menos uma porção da colheita; (d) efetuar um processo de extração na colheita; e (e) colher ácido chiquímico produzido pelo processo de extração.
[0030] Em uma modalidade adicional, o método inclui (a) aplicar glifosato a pelo menos uma porção de uma planta de soja; (b) colher pelo menos uma porção da planta de soja; (c) extrair ácido chiquímico da porção colhida da planta de soja.
[0031] Em ainda uma modalidade adicional, o método inclui (a) colher pelo menos uma porção de uma planta de soja; (b) aplicar glifosato a pelo menos uma porção da colheita; (c) efetuar um processo de extração em pelo menos uma porção da colheita tratada com glifosato; (d) colher ácido chiquímico produzido pelo processo de extração.
[0032] A presente invenção é adicionalmente direcionada a métodos para produzir ácido quínico. Em uma modalidade, o método inclui (a) selecionar uma pluralidade de células de planta incluindo o caminho biossintético aromático comum; (b) aplicar glifosato a pelo menos uma porção das células de planta; (c) colher as células de planta; e (d) extrair ácido quínico da colheita.
[0033] Em outra modalidade, o método inclui (a) aplicar glifosato a pelo menos uma porção de uma planta de soja; (b) colher pelo menos uma porção da planta de soja; (c) extrair ácido quínico da porção colhida da planta de soja.
[0034] A presente invenção é adicionalmente direcionada a métodos para produzir um inibidor de neuraminidase. Em uma modalidade, o método inclui (a) selecionar uma pluralidade de organismos incluindo o caminho biossintético aromático comum; (b) aplicar glifosato aos organismos; (c) colher os organismos; (d) extrair ácido chiquímico da colheita; (e) purificar o ácido chiquímico; e (f) converter o ácido chiquímico em um inibidor de neuraminidase.
[0035] Em outra modalidade, o método inclui (a) aplicar glifosato a pelo menos uma porção de uma planta de soja; (b) colher pelo menos uma porção da planta de soja; (c) extrair ácido chiquímico da porção colhida da planta de soja; (d) purificar o ácido chiquímico; e (e) conver-ter o ácido chiquímico em um inibidor de neuraminidase.
[0036] Outros objetos e características serão em parte aparentes e em parte assinalados em seguida.
DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS
[0037] Fig. 1: O caminho biossintético aromático comum, também conhecido como o caminho chiquimato. O primeiro passo é a conversão dos metabolites centrais fosfoenolpiruvato e eritrose-4-fosfato em 3-deóxi-D-arabino-heptulosonati-7-fosfato (DAHP). Mais três passos no caminho rendem ácido chiquímico que, por sua vez, é convertido em três passos adicionais a ácido corísmico. O ácido corísmico é um intermediário chave na biossíntese dos aminoácidos aromáticos tripto-fano, fenilalanina e tirosina, como também os outros compostos essenciais ácido para-hidroxibenzóico, ácido para-aminobenzóico, ácido 2,3-di-hidroxibenzóico e outros compostos tais como folato, ubiquino-na, menaquinona e enteroquelina. Em Escherichia coli, o primeiro passo no caminho biossintético aromático comum é executado por três enzimas sintase DAHP isofuncionais; estas três enzimas isofuncionais são codificadas pelos genes aroF, aroG e aroH. Semelhantemente, existem duas enzimas isofuncionais de chiquimato quinase codificadas pelos genes aroK e aroL As outras enzimas do caminho consistem em enzimas únicas e são codificadas por genes únicos: o gene aroB codifica 3-de-hidroquinato sintase, o gene aroD codifica 3-de-hidroquinato dehidratase, o gene aroE codifica chiquimato de-hidrogenase, o gene aroA codifica EPSP sintase e o gene aroC codifica corismato sintase.
[0038] Fig. 2 é um fluxograma esquemático de um processo para recuperar ácido chiquímico produzido pelo método de planta.
[0039] Fig. 3 é um fluxograma esquemático de um processo de múltiplos passos para recuperar ácido chiquímico produzido pelo método de planta.
[0040] Fig. 4 é um fluxograma esquemático de um processo para recuperar ácido chiquímico produzido pelo método de fermentação.
[0041] Fig. 5 mostra a acumulação de chiquimato em alfafa depois de tratamento com glifosato como descrito em Exemplo 1.
[0042] Fig. 6 mostra a acumulação de chiquimato em soja depois de tratamento com glifosato como descrito em Exemplo 2.
[0043] Fig. 7: como descrito no Exemplo 5, alterações na região promotora do gene pheA de E. coli conduzidas em pXT1457 e pXT1483. Duas regiões foram alteradas na região promotora. Uma mutação de promotor para cima foi introduzida na região -10 do promotor pheA, mudando o mesmo de TACTGTA para TATAATA. Também, uma deleção de 146 bp foi introduzida entre o promotor pheA e o local de ligação de ribossoma (RBS) do gene pheA, removendo a região atenuadora pheA incluindo o gene de peptídeo líder pheL Nucleo-tídeos sublinhados representam aqueles nucleotídeos que foram dele-tados. O local de restrição EcoRI foi colocado onde indicado, imediatamente antes da região promotora do gene pheA. SEQ ID NO: 4 é a sequência de nucleotídeo listada na Fig. 7, enquanto SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácido listado na Fig. 7.
[0044] Fig. 8 é um fluxograma ilustrando um sistema de avaliação de laboratório.
[0045] Caracteres de referência correspondentes indicam partes correspondentes ao longo dos desenhos.
DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[0046] SEQ ID NO: 1 Sequência de nucleotídeo do fragmento de restrição de EcoRI-BamHI sintético conduzido nos plasmídeos pXT1457e pXT1483.
[0047] SEQ ID NO: 2 Seqüência de dehidratase mutase-prefenato corismato E. coli resistente a feedback codificada nos plasmídeos pXT1457 e pXT1483.
[0048] SEQ ID NO: 3 Sequência de nucleotídeo do plasmídeo pΧΤ1483.
[0049] SEQ ID NO: 4 Sequência de nucleotídeo ilustrando as alterações na região de promotor do gene pheA de E. coli conduzidas nos plasmídeos pXT1457 e pXT1483.
[0050] SEQ ID NO: 5 Sequência de aminoácido codificada por uma porção do gene de peptídeo líder pheL deletado.
DEFINIÇÕES
[0051] As definições seguintes são fornecidas para facilitar aqueles versados na técnica entenderem completamente e apreciarem o âmbito da presente invenção. Como sugerido nas definições fornecidas abaixo, as definições fornecidas não se destinam a ser exclusivas, a menos que assim indicado. Ao invés disso, elas são definições preferidas fornecidas para focar o versado nas várias modalidades ilustrativas da invenção.
[0052] Como usado neste, o termo "ácido ciclitolcarboxílico" é limitado ao grupo de ácidos carboxílicos consistindo em ácido chiquímico e ácido quínico e se refere não só ao ácido livre, mas também a sais e ésteres dos mesmos, a menos que o contexto determine o contrário.
[0053] Como usado neste, o termo "ácido chiquímico" se refere não só ao ácido livre, mas também a sais e ésteres do mesmo, a menos que o contexto determine o contrário.
[0054] Como usado neste, o termo "ácido quínico" se refere não só ao ácido livre, mas também a sais e ésteres do mesmo, a menos que o contexto determine o contrário.
[0055] Como usado neste, o termo “derivado” quando se referindo a ácido chiquímico ou ácido quínico quer dizer, sem limitação, qualquer composto químico que é preparado do ácido livre inclusive sais e ésteres do mesmo e adicionalmente para ácido chiquímico o correspondente chiquimato-3-fosfato. Em particular, como usado neste, o termo "derivado de ácido chiquímico" se refere, sem limitação, a qual-quer composto químico que é preparado usando ácido chiquímico e/ou chiquimato-3-fosfato como reagentes de partida.
[0056] Como usado neste, o termo "planta suscetível" se refere a plantas que contêm o caminho biossintético aromático comum. Em plantas suscetíveis, tratamento com glifosato a níveis de pelo menos cerca de 20 g a.e./ha demonstrará dano significativo para a fisiologia da planta. As plantas suscetíveis podem incluir anuais ou perenes, gramas ou folhas largas, plantas que carregam sementes, grãos, legumes, incluindo tanto legumes de forragem como de grão, plantas lenhosas e árvores.
[0057] Como usado neste, o termo "planta resistente" se refere a plantas que toleram glifosato a níveis de menos que cerca de 3360 g a.e./ha. Os exemplos de plantas resistentes a glifosato incluem sojas e milho transgênico tais como, por exemplo, soja ROUNDUP milho ROUNDUP READY disponível de Monsanto Company.
[0058] Como usado neste, o termo "glifosato" se refere a uma N-(fosfonometil) glicina, um sal, éster ou outro derivado de N-(fosfonometil) glicina que é convertido em glifosato ou que caso contrário fornece ânion glifosato. A este respeito, é para ser notado que o termo "glifosato" quando usou neste é entendido como englobando N-(fosfonometil) glicina e tais derivados como também misturas dos mesmos, a menos que o contexto exija o contrário. Sais apropriados de N-(fosfonometil) glicina incluem formas mono-, di- ou tribásicas e incluem amônio orgânico, metal alcalino, metal alcalina terroso, amônio (por exemplo, mono-, di- ou triamônio) e sais sulfônio (por exemplo, mono-, di- ou trimetilsulfônio) de N-(fosfonometil) glicina . Os sais de amônio orgânico podem incluir sais de amônio alifáticos e aromáticos e podem incluir sais de amônio primário, secundário, terciário ou quaternário. Os exemplos representativos específicos de tais sais de amônio orgânico incluem isopropilamônio, N-propilamônio, etilamônio, dimetilamônio, 2-hidroxietilamônio (também chamado de monoetano-lamônio), sais etilenodiamina e hexametilenodiamina de N-(fosfonometil) glicina. Exemplos representativos específicos de sais de metal alcalino incluem sais de potássio e sódio de N-(fosfonometil) glicina.
[0059] Como usado neste, o processo de "colher" se refere a colher pelo menos uma porção de uma planta para uso adicional. Colheita pode incluir remover porções específicas de uma planta como, por exemplo, fruta, vagens, núcleos, sementes, folhas, talos, agulhas, galhos, ramos ou novo crescimento. Colheita pode também incluir colher plantas inteiras ou porções grandes de uma planta contendo uma variedade de tecidos de planta. No caso de culturas de célula de planta, colheita pode incluir ainda utilizar uma porção da cultura de célula ou a cultura de célula inteira. O material de planta colhido durante o processo de colher é chamado de "a colheita".
[0060] Como usado neste, o termo "planta unicelular" se refere a espécie fotossintética unicelular e formas unicelulares de criptomona-des, haptofitos, crisofitos, euglenóides, dinoflagelados, diatomos, algas vermelhas, algas marrons e algas verdes.
[0061] Como usado neste, o termo "planta multicelular" se refere a espécie fotossintética multicelular formas multicelulares (inclusive colônias e filamentos) de criptomonades, haptofitos, crisofitos, euglenóides, dinoflagelados, diatomos, algas vermelhas, algas marrons e algas verdes; briofitos (inclusive hepáticas, hornworts e musgos); plantas vasculares sem sementes (inclusive psilotofitos, licofitos, horsetails e samambaias); e plantas de semente (inclusive cicads, ginkgo, coníferas, gnetofitos e angiospermas). Plantas de semente incluem, por exemplo, vinhas coníferas, arbustos e árvores, e plantas de angios-perma monocotiledôneas e dicotiledôneas anuais, bienais e perenes, inclusive plantas de angiosperma não lenhosas, e plantas de angios-perma lenhosas inclusive vinhas decíduas e não decíduas, arbustos, e árvores.
[0062] Como usado neste, o termo “micro-organismo” de preferência se refere a organismos microscópicos e organismos macroscópicos taxonomicamente relacionados dentro das categorias alga, Ar-chaea, bactérias, fungos, Stramenopiles, Protista e apicomplexa, que contêm o caminho biossintético aromático comum, também conhecido como o caminho chiquimato. Esta definição inclui todos os procarióti-cos, inclusive cianobactérias e outras bactérias, como também todos os organismos eucarióticos unicelulares, inclusive Stramenopiles como algas marrons e diatomos, Alveolata (dentro do reino Protista) como parasitas ciliados, dinoflagelados e apicomplexa e vários Euglenozoa que contêm o caminho biossintético aromático comum.
[0063] Como usado neste, o termo "meio de cultura mínimo" de preferência se refere a um meio de cultura quimicamente definido. Em tal meio de cultura, os elementos químicos necessários para sustentar crescimento são fornecidos por sais inorgânicos como fosfatos, sulfatos e semelhantes. A fonte de carbono é definida, e é normalmente um açúcar como glicose, lactose, galactose e semelhantes, ou outros compostos como glicerol, lactato, acetato e semelhantes. Enquanto algum desses meios de cultura também use sais de fosfato como um tampão, outros tampões podem ser empregados como citrato, trietano-lamina e semelhantes.
[0064] Como usadas neste, os termos "desregular", "desregula-ção", "desregulado" e "desregulando" de preferência se referem a um aumento deliberado do fluxo de metabólitos por um caminho metabólico, alcançado incapacitando um ou mais dos mecanismos que normalmente funcionam para controlar tal fluxo de metabólitos. Esta des-regulação pode ser alcançada incapacitando quaisquer dos mecanismos que reprimem a expressão de qualquer dos genes que codificam quaisquer das enzimas que executam os passos do caminho metabólico (denominadas neste como "derepressar" ou "derepressão" ou "de-repressado" ou "derepressando"). Esta desregulação pode também ser alcançada tornando quaisquer das enzimas normalmente sujeitas a realimentação-inibição por um metabólito no caminho resistentes a tal realimentação-inibição. A desregulação pode também ser alcançada por qualquer combinação de mecanismos de derepressão e realimentação-inibição.
[0065] Como usadas neste, os termos "densidade óptica" e "OD" se referem a uma estimativa da concentração de células de um microorganismo suspensas em um meio de cultura. Tais estimativas de densidade óptica são feitas espectrofotometricamente e medem a diminuição na luz transmitida. A densidade óptica é dada por log10 (lo/l), onde lo é a intensidade da luz incidente e I é a intensidade da luz transmitida. Para um tipo dado de célula, a relação entre OD e concentração de célula é linear por uma grande faixa. Como usadas neste, medidas de densidade óptica foram feitas usando luz com um comprimento de onda de 550 nanômetros.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS
[0066] Descritos neste estão processos para produzir e recuperar ácidos ciclitolcarboxílicos como ácido chiquímico e ácido quínico. Várias modalidades da presente invenção incluem produzir ácido chiquímico contactando um organismo que sofre o caminho biossintético aromático comum com glifosato. Por exemplo, várias modalidades da presente invenção incluem contactar vários legumes (por exemplo, soja) com glifosato para realçar a produção de ácido chiquímico por inibição do caminho biossintético aromático comum. Várias outras modalidades da presente invenção são direcionadas a recuperação do produto de ácido chiquímico de fluxos de processo aquosos utilizando técnicas de separação de membrana. Os fluxos de processo aquoso incluem extratos aquosos de material de planta contactados com glifo-sato e caldos de fermentação aquosos produzidos contactando uma cultura de um micro-organismo capaz de produzir ácido chiquímico (por exemplo, Eschericia coli) com glifosato.
I. Produção de Ácido Ciclitolcarboxílico de Células de Planta (o "método da planta")
[0067] Geralmente, em certas modalidades, a presente invenção é direcionada a métodos e processos para produção de um ácido ciclitolcarboxílico (por exemplo, ácido chiquímico e ácido quínico) de material de planta. A preparação de ácido chiquímico desta maneira é geralmente denominada neste como o "método da planta". Várias modalidades do método da planta fornecem métodos para produzir o desejado ácido ciclitolcarboxílico em que o método inclui: (a) cultivar uma pluralidade de organismos como, por exemplo, material de planta; (b) expor pelo menos uma porção dos organismos a glifosato; (c) extrair ácido ciclitolcarboxílico dos organismos tratados; (d) recuperar e purificar o ácido ciclitolcarboxílico; e (e) converter o ácido ciclitolcarboxílico para um inibidor de neuraminidase como, por exemplo, fosfato de osel-tamivir. Também, como detalhado em outro lugar neste, conforme a presente invenção, ácido chiquímico pode eficazmente ser recuperado de soluções de processo aquosas incluindo um ácido ciclitolcarboxílico (por exemplo, ácido chiquímico) produzido e extraído de material de planta.
[0068] Modalidades alternativas da presente invenção fornecem métodos para selecionar uma pluralidade de organismos compreendendo o caminho biossintético aromático comum, aplicando glifosato aos organismos, colhendo material dos organismos cultivados, e extraindo o desejado ácido ciclitolcarboxílico da colheita.
[0069] Modalidades alternativas da presente invenção podem incluir propagar uma espécie predeterminada, colher material de uma cultura de célula, colher material de plantas multicelulares, ou colher material de plantas unicelulares.
[0070] Modalidades alternativas da presente invenção podem também incluir contactar ou aplicar glifosato ao organismo de modo que a quantidade depositada no organismo seja de pelo menos mais ou menos 0.00001 grama por grama de organismo. De mais preferência, a quantidade depositada é de pelo menos mais ou menos 0.0001 grama ou até pelo menos mais ou menos 0.001 grama de glifosato por grama de organismo. De preferência, a quantidade de glifosato depositada é menos do que mais ou menos 0.1 grama por grama de organismo.
[0071] Em algumas modalidades da presente invenção, a pluralidade de organismos (por exemplo, plantas suscetíveis) é dispersada através de pelo menos um hectare para facilitar produção em grande escala de ácido chiquímico. As modalidades alternativas podem incluir aplicação de pelo menos 10 gramas de glifosato por hectare (ha) de organismo cultivado. De mais preferência, modalidades alternativas podem incluir pelo menos mais ou menos 100 gramas de glifosato por hectare de organismo cultivado e menos do que mais ou menos 10000 gramas de glifosato por hectare de organismo cultivado. As modalidades da invenção incluindo níveis mais altos de aplicação de glifosato ainda serão eficazes, mas não são preferidas devido a custos excessivos.
[0072] A colheita dos organismos tratados com glifosato pode acontecer a qualquer hora depois do tratamento dos organismos suscetíveis com glifosato. Como o propósito dos métodos reivindicados é obter ácido chiquímico ou quínico dos organismos tratados, se a colheita acontecer depois do tratamento dos organismos suscetíveis tal colheita ocorre depois de um período de tempo suficiente para permitir acumulação de qualquer um de chiquímico ou quínico, mas antes de qualquer declínio possível na quantidade de um ou de outro. Deste modo, o ponto em que os organismos tratados são colhidos pode depender de vários fatores inclusive, por exemplo, o tipo de organismo, a concentração de glifosato aplicada ao organismo, o ponto de aplicação do glifosato ao organismo e as condições ambientais cercando o crescimento do organismo tratado, tanto antes como depois da aplicação do glifosato. Deste modo, em algumas modalidades da presente invenção em que a colheita do organismo acontece depois da aplicação de glifosato ao mesmo, a colheita dos organismos acontece menos do que mais ou menos 30 dias depois da aplicação de glifosato. De preferência, a colheita acontece dentro de mais ou menos 21 dias depois da aplicação de glifosato, de mais preferência dentro de mais ou menos 14 dias depois da aplicação de glifosato e ainda de mais preferência dentro de mais ou menos 7 dias depois da aplicação de glifosato, (isto é, entre aproximadamente 0 e mais ou menos 168 horas depois da aplicação de glifosato). Porém, em algumas modalidades, a colheita do organismo como, por exemplo, material de planta, pode preceder a aplicação de glifosato. Por exemplo, glifosato pode ser aplicado a material de planta removido da planta inteira desde que o material de planta mantenha pelo menos alguns processos metabólicos. O período para que o material de planta mantenha pelo menos alguns processos metabólicos pode depender de vários fatores inclusive, por exemplo, da espécie de material de planta colhido, da parte do material de planta colhido, da saúde do material de planta na hora de colher e das condições sob as quais o material de planta colhido é armazenado. Deste modo, uma vez colhido, o material de planta suscetível pode ser contactado com glifosato dentro de minutos, horas, dias depois de colher. Em uma modalidade, o material de planta colhido pode ser contactado com glifosato dentro mais ou menos 60 minutos da colheita. Em outra modalidade, o material de planta colhido pode ser contacta-do com glifosato dentro de mais ou menos 12 horas da colheita. Em outra modalidade, o material de planta colhido pode ser contactado com glifosato dentro de mais ou menos 24 horas da colheita. Em outra modalidade, o material de planta colhido pode ser contactado com glifosato dentro de mais ou menos 2 dias da colheita. Em outra modalidade, o material de planta colhido pode ser contactado com glifosato dentro de mais ou menos 5 dias da colheita. Em outra modalidade, o material de planta colhido pode ser contactado com glifosato dentro de mais ou menos 1 semana da colheita. Qualquer método descrito neste pode utilizar um passo de colher o organismo ou antes ou depois da aplicação de glifosato.
[0073] Modalidades alternativas da presente invenção incluem colher material de quaisquer plantas contendo o caminho biossintético aromático comum. As modalidades preferidas da presente invenção incluem espécie de planta incluindo protistas fotossintéticos (inclusive criptomonades, haptofitos, crisofitos, euglenóides, dinoflagelados, dia-tomos e espécie unicelular de algas) e plantas multicelulares inclusive espécie multicelular de algas, briofitos (inclusive hepáticas, hornworts e musgos), plantas vasculares sem semente (inclusive psilotofitos, li-cofitos, horsetails, e samambaias), e plantas com semente (inclusive cicads, ginkgo, coníferas, gnetofitos, e angiospermas). Modalidades preferidas adicionais incluem vinhas coníferas, arbustos e árvores, e plantas de angiosperma monocotiledôneas e dicotiledôneas anuais, bienais e perenes, inclusive plantas de angiosperma não lenhosas e plantas de angiosperma lenhosas inclusive vinhas decíduas e não decíduas, arbustos, e árvores. Uma espécie de planta preferida é legume incluindo tanto legumes de forragem como de grãos, incluindo, por exemplo, alfafa, trevo, ervilha, feijões, lentilhas, lupinus, mesquite, ca-rob e amendoim.
[0074] Exemplos específicos não limitantes de modalidades alter-nativas da invenção incluem alfafa (Medicago sativa), soja (Glycine max), milho (Zea pode), canola (Brassica napus), algodão (espécie do gênero Gossypium), beterraba (Beta vulgarius), trigo (Triticum aesti-vum), girassol (Helianthus annus), folha de veludo (Abutilon theophras-ti), grama de curral (Echinochloa crus-galli), ryegrass (a maioria das espécies no gênero Lolium), switchgrass (Panicum virgatum e outras espécies do gênero Panicum), árvores de bálsamo (Liquidambar styraciflua e outras espécies no gênero Liquidambar), Arbustos de erva-doce de estrela chinesa (lllicium verum) e shikimi-no-ki (lllicium anisatum, antigamente chamado lllicium religiosum, e outras espécies do gênero lllicium). Em várias modalidades preferidas, o material de planta é colhido de uma árvore conífera (por exemplo, pinheiro, espru-ce e árvores de abeto). Em vários outras modalidades preferidas, o material de planta é fornecido por soja.
[0075] Modalidades alternativas da presente invenção também incluem métodos em que colher o organismo não mata o organismo propriamente (isto é, colhendo só uma porção do organismo, o remanescente do organismo é capaz de viabilidade continuada e/ou produção possível de porções adicionais que são colhidas) ou uma maioria dos organismos cercando o mesmo. Por exemplo, quando colhendo plantas como, por exemplo, plantas perenes, pode ser desejável para as plantas sobreviver ao atual processo de colheita com a finalidade de habilitar futura colheita da mesma planta. Em algumas modalidades alternativas, a sobrevivência da planta pode ser realçada aplicando glifosato ao material de planta colhido (isto é, a porção de planta colhida) somente depois que o material for removido do remanescente da planta.
[0076] Modalidades alternativas da presente invenção incluem recuperar e isolar o desejado ácido ciclitolcarboxílico produzido por quaisquer dos métodos descritos neste.
[0077] Modalidades alternativas da presente invenção podem incluir modalidades em que a colheita contém menos do que mais ou menos 1000 µg de ácido quínico por grama de peso fresco de colheita. De preferência, a colheita inclui uma relação de peso de ácido chiquí-mico para ácido quínico antes de extração de pelo menos cerce de 10:1. Em algumas modalidades, o nível reduzido de ácido quínico pode permitir a extração mais eficiente e purificação do ácido chiquímico.
[0078] Modalidades alternativas da presente invenção incluem um método de produzir o desejado ácido ciclitolcarboxílico incluindo: (a) selecionar uma pluralidade de plantas suscetíveis incluindo o caminho biossintético aromático comum; (b) aplicar glifosato as plantas; (c) colher as plantas cultivadas; e (d) extrair o ácido ciclitolcarboxílico da colheita.
[0079] Modalidades alternativas da presente invenção incluem um método de produzir um inibidor de neuraminidase incluindo: (a) selecionar uma pluralidade de organismos incluindo o caminho biossintético aromático comum; (b) aplicar glifosato aos organismos; (c) colher os organismos; (d) extrair o ácido chiquímico da colheita; (e) recuperar o ácido chiquímico do extrato; e (f) converter o ácido chiquímico em um inibidor de neuraminidase.
[0080] De preferência, as modalidades da presente invenção adicional incluem cultivar os ditos organismos. De mais preferência, o método pode incluir propagar uma espécie predeterminada.
[0081] Em vários aspectos de modalidades da invenção, a seleção de uma pluralidade de organismos pode incluir identificar uma espécie particular com características benéficas como, por exemplo, uma taxa de crescimento rápido ou características de processo benéficas como, por exemplo, uma espécie particular de planta. Além disso, o processo de selecionar poder incluir organismos que já estão estabelecidos como, por exemplo, uma planta pré-existente.
[0082] Em vários aspectos de modalidades da invenção, a seleção de uma pluralidade de organismos pode incluir identificar uma espécie particular de células de planta com características de processo benéficas para usar em uma cultura de célula.
[0083] Em vários aspectos de modalidades da invenção, plantar um campo a ser cultivado pode incluir quaisquer técnicas conhecidas na técnica relacionadas a produção de plantas, inclusive o uso de fertilizantes, fungicidas, inseticidas, herbicidas e todos os outros pesticidas ou produtos usados na produção de colheitas agrícolas.
[0084] Modalidades da invenção podem incluir propagar qualquer uma de uma variedade larga de plantas suscetíveis incluindo o caminho biossintético aromático comum inclusive, mas não limitadas a plantas anuais como soja, milho e algodão; Plantas perenes como alfafa; e plantas lenhosas como arbustos e árvores inclusive, mas não limitadas a coníferas e espécie decíduas. Em modalidades da invenção relacionadas a extração de ácido chiquímico de árvores, de preferência as folhas ou agulhas, frutas ou nozes, e novos crescimentos são usados. Alternativamente, árvores novas inteiras podem ser usadas. Em algumas modalidades, pode ser preferível aplicar o glifosato precocemente na estação de crescimento quando existe alongamento ativo para maximizar o efeito do glifosato e o rendimento resultante de ácido chiquímico. Em algumas modalidades, porções da planta podem ser tratadas com glifosato e removidas sem matar a planta inteira. Em modalidades alternativas, porções da planta como as folhas ou agulhas podem ser removidas da planta antes da aplicação de glifosato.
[0085] Em vários aspectos de modalidades da invenção, expor plantas ou porções de plantas pode incluir meios típicos de aplicação de herbicida inclusive, mas não limitados a pulverização a pressão alta de um veículo, mochila ou equipamento de pulverização portátil e aplicação aérea.
[0086] Outras modalidades da invenção fornecem métodos de recuperar e isolar o ácido ciclitolcarboxílico depois de produzir o ácido ciclitolcarboxílico por quaisquer dos métodos conhecidos na técnica. De preferência, modalidades da presente invenção são usadas para colher e extrair volumes grandes de material para os propósitos tanto de eficiência como de abastecer a demanda mundial crescente por ácido chiquímico. De preferência, modalidades da presente invenção são usadas para extrair pelo menos mais ou menos 1 kg de ácido ciclitolcarboxílico de material de planta tratado com glifosato. De mais preferência, modalidades da presente invenção são usadas para extrair pelo menos mais ou menos 100 kg, de ainda mais preferência pelo menos mais ou menos 1000 kg de ácido ciclitolcarboxílico do material de planta tratado com glifosato.
[0087] Em vários aspectos de modalidades da invenção, as plantas são tratadas com glifosato por qualquer meio apropriado para produção em massa de plantas cultivadas, tal como pulverizando uma solução diluída. De preferência, a solução inclui pelo menos mais ou menos 420 g a.e. de glifosato e é aplicada a uma taxa de pelo menos mais ou menos 95 L/ha. O glifosato pode ser usado em qualquer concentração efetiva. Em modalidades preferidas da invenção as plantas são tratadas com glifosato a uma taxa de 20-4200 g a.e./ha. Em modalidades mais preferidas as plantas são tratadas com glifosato a uma taxa de 210-3360 g a.e./ha. Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção o glifosato é aplicado a uma taxa de 420-1680 g a.e./ha. Na modalidade mais preferida deste invenção o glifosato é aplicado a uma taxa de 840 g a. e./ha.
[0088] De preferência, a formulação de glifosato inclui componentes adicionais destinados a melhorar a eficiência e eficácia de aplicação. As formulações preferíveis de glifosato incluem a adição de uma quantidade suficiente de água para formar uma solução diluída de cer-ca de 0.5 g a.e./L - 5.0 g a.e./L de concentração. De preferência formulações de glifosato podem também incluir uma variedade de surfactan-tes, inclusive alcoxilatos de álcool, alcoxilatos de alquilfenol, alcoxilatos de amina graxos, etoxilados de triglicerídeo, sulfatos, sulfonatos, éster de fosfato, etoxilatos de amina quaternária, óxidos de amina, poliglico-sídeos de alquila e etoxilatos de eteramina. Os componentes adicionais que podem também ser incorporados na formulação de glifosato incluem tinturas, antiespumantes, solventes, densificadores e quelan-tes. No caso de plantas com níveis mais altos de cera epicuticular e/ou uma reduzida superfície planar, tais como, por exemplo, agulhas de pinheiro, um surfactante agressivo ou uma concentração mais alta de surfactante pode ser preferida. Alternativamente, para plantas lenhosas grandes o glifosato pode ser aplicado a um furo criado em um talo lenhoso como um tronco de árvore.
[0089] Em modalidades preferidas da invenção, o ácido ciclitolcar-boxílico é extraído do material de planta tratada usando quaisquer de vários métodos sabidos na técnica inclusive, mas não limitados a, extração congela descongela usando HCI, extração de solvente usando tridodecilamina, ou extração lipídica usando gás liquefeito de petróleo e etanol. A extração pode ser realizada de qualquer forma conhecida na técnica inclusive técnicas como são descritas no pedido de patente chinês 1830939A, Publicação de Pedido de Patente Internacional. WO 01/68891, WO 07/077570 e WO 02/06203, e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos 2007/0149805, 2004/0009242, 2002/0155177, 2002/0114853, 2007/0087424 e 2007/0161818.
[0090] Um exemplo de um método preferido para extrair ácido chi-químico de material de planta tratado conforme a presente invenção inclui congelar os talos e as folhas colhidos das plantas (por exemplo, em temperaturas de aproximadamente -80°C). Os talos e as folhas congelados são tipicamente moídos e a mistura de extrato de planta preparada por extração do material de planta moído usando uma solução de HCI aquosa (por exemplo, 0.25 N) em uma razão peso:peso (solução:material de planta) de cerca de 100:1. A solução contendo o material de planta pode ser agitada (por exemplo, em um liquidificador) para ajudar na liberação de conteúdo solúvel das células de planta. O material de planta é separado da mistura resultante usando aparato apropriado (por exemplo, uma centrífuga como uma centrífuga modelo Beckman Coulter Avanti J - 20I operada a 12.000 x g por 30 min a 4°C) remover escombros celulares. O resultante sobrenadante ou centrado resultante pode ser opcionalmente filtrado (por exemplo, usando uma Cápsula MAXICULTURE 0.2 µm ou um filtro de 0.45µm).
[0091] Em modalidades preferidas da invenção, pelo menos mais ou menos 1 kg do ácido ciclitolcarboxílico é extraído do material de planta tratado. Uma vez extraído, o ácido chiquímico pode ser incorporado em um fluxo de processo aquoso para recuperação de ácido chiquímico como detalhado em outro lugar neste.
II. Produção de Ácido Chiquímico de Culturas de Micro-organismo (o "método de fermentação")
[0092] Como detalhado em outro lugar neste, conforme a presente invenção, ácido chiquímico pode ser recuperado de soluções de processo incluindo ácido chiquímico produzido de culturas de microorganismo. A preparação de ácido chiquímico desta maneira é geralmente denominada neste como o "método de fermentação". Os métodos de fermentação apropriados são descritos em Bogosian et al., Pedido Internacional PCT/US2008/060079, o conteúdo inteiro do qual foi incorporado neste por referência.
[0093] Várias modalidades do método de fermentação fornecem métodos para produzir ácido chiquímico incluindo: a) fornecer uma cultura de micro-organismo; em que o micro-organismo é capaz de converter chiquimato-3-fosfato em ácido chiquímico; b) contactar o micro-organismo com glifosato; e c) converter o chiquimato-3-fosfato em ácido chiquímico. Em aspectos preferidos destas modalidades o microorganismo é Escherichia coli (E. coli). Em aspectos mais preferidos destas modalidades da invenção o micro-organismo é cepa E. coli LBB427. Em aspectos sempre mais preferidos destas modalidades da invenção o micro-organismo é cepa E. coli LBB427 transformada com plasmídeo pXT1457 ou com o plasmídeo pXT1483.
[0094] Em vários aspectos destas modalidades da invenção, a conversão de chiquimato-3-fosfato para ácido chiquímico pode ser realizada por qualquer mecanismo apropriado inclusive, mas não limitado a, métodos enzimáticos, métodos químicos, e/ou métodos físicos (exemplos incluem, mas não são limitados a, conversão de enzimática e aquecimento em um ambiente de baixo pH). Em aspectos preferidos desta modalidade da invenção, a conversão é por uma catálise enzimática. Em aspectos especialmente preferidos desta modalidade a conversão enzimática é realizada por uma fosfatase (por exemplo, uma fosfatase alcalina). Em todas as modalidades da invenção a conversão de chiquimato-3-fosfato pode acontecer ou intra-celularmente ou extra-celularmente. Além disso, a presente invenção prevê o passo de conversão acontecendo ou com ou sem o isolamento de chiquima-to-3-fosfato. Isto é, várias modalidades da invenção fornecem a produção de chiquimato-3-fosfato por quaisquer dos métodos descritos neste, purificação de chiquimato-3-fosfato e subsequente hidrólise de chi-quimato-3-fosfato para ácido chiquímico por qualquer método apropriado conhecido por aqueles versados na técnica.
[0095] Em outro aspecto destas modalidades da invenção, a conversão de chiquimato-3-fosfato para ácido chiquímico pode ser realizada por meio físico. Foi reportado que chiquimato-3-fosfato pode ser convertido em ácido chiquímico abaixando o pH e/ou levantando a temperatura das amostras de cultura em que os micro-organismos são crescidos. (Davis e Mingioli, 1953). Deste modo, em certas modalidades a conversão de chiquimato-3-fosfato para ácido chiquímico é realizada abaixando o pH do meio de cultura e/ou aumentando a temperatura do meio de cultura. Estes ajustes ao pH e/ou temperatura do meio de cultura são feitos depois do contato do micro-organismo no meio com glifosato, e antes da recuperação de ácido chiquímico do microorganismo ou meio. Geralmente, o pH do meio pode ser abaixado para abaixo do pH de crescimento da cultura de célula típica de cerca de 7, e de preferência abaixado para um pH de cerca de 1. Geralmente, a temperatura do meio pode ser levantada para uma temperatura maior que a temperatura de crescimento da cultura de célula típica de cerca de 37°C, e de preferência para uma temperatura de pelo menos mais ou menos 60°C.
[0096] Outras modalidades do método de fermentação incluem recuperar e/ou purificar ácido chiquímico depois de produzir o mesmo por quaisquer dos métodos de fermentação descritos neste.
[0097] Outras modalidades da presente invenção fornecem métodos de fermentação para produzir ácido chiquímico de microorganismos onde o método inclui: a) desregular um caminho biossinté-tico aromático comum do micro-organismo; b) contactar o microorganismo com glifosato; e c) converter o chiquimato-3-fosfato para ácido chiquímico. Em aspectos preferidos desta modalidade da invenção o micro-organismo é Escherichia coli (E. coli). Em aspectos mais preferidos destas modalidades da invenção o micro-organismo é cepa E. coli LBB427. Em aspectos ainda mais preferidos, o micro-organismo é cepa E. coli LBB427 transformada com o plasmídeo pXT1457 ou com o plasmídeo pXT1483. Em quaisquer dos aspectos destas modalidades da invenção o chiquimato-3-fosfato pode ser convertido em ácido chiquímico por qualquer método apropriado. De preferência, a conversão de chiquimato-3-fosfato para ácido chiquímico é por um mé-todo químico, físico e/ou enzimático. De preferência, o chiquimato-3-fosfato é convertido em ácido chiquímico por uma enzima fosfatase; de mais preferência por uma enzima fosfatase alcalina.
[0098] Alguns aspectos do método de fermentação incluem desre-gular a biossíntese de um ou mais compostos selecionados do grupo que consiste em triptofano, fenilalanina, tirosina, ácido chiquímico, chi-quimato-3-fosfato, 5-enolpiruvoilchiquimato-3-fosfato, ácido corísmico, ácido para-hidroxibenzóico, ácido para-aminobenzóico, ácido 2,3-di-hidroxibenzóico, folato, ubiquinona, menaquinona e enteroquelina. Em aspectos preferidos desta modalidade da invenção a desregulação é executada em uma bactéria, de preferência E. coli.
[0099] Em várias modalidades do método de fermentação, a biossíntese de fenilalanina é desregulada em um micro-organismo. Em aspectos preferidos desta modalidade o micro-organismo é Escherichia coli (E. coli). Em aspectos mais preferidos desta modalidade da invenção o micro-organismo é cepa E. coli LBB427. Em aspectos ainda mais preferidos desta modalidade da invenção o micro-organismo é cepa E. coli LBB427 transformada com plasmídeo pXT1457 ou com plasmídeo pXT1483.
[00100] Em vários aspectos do método de fermentação, o microorganismo é contactado com glifosato adicionando o mesmo ao meio de cultura. O glifosato pode ser usado em qualquer concentração eficaz. Em modalidades preferidas da invenção o glifosato é adicionado em uma concentração de 1 millimolar ou maior. Em modalidades mais preferidas o glifosato é adicionado em uma concentração de 10 millimolar ou maior. Em outras modalidades preferidas da invenção o glifosato é adicionado em uma concentração de mais ou menos 10 millimolar a mais ou menos 50 millimolar; de mais preferência, o glifosato é adicionado em uma concentração de mais ou menos 20 millimolar a mais ou menos 50 millimolar. Em uma modalidade especialmente pre-ferida da invenção o glifosato é adicionado em uma concentração de cerca de 20 millimolar.
[00101] Ácido chiquímico e/ou chiquimato-3-fosfato tipicamente são recuperados do meio de cultura ou do sobrenadante de cultura mais ou menos 5 horas depois da exposição do meio ou dos microorganismos no mesmo ao glifosato. O rendimento de ácido chiquímico e/ou chiquimato-3-fosfato pode ser aperfeiçoado em relação ao microorganismo particular utilizado encurtando ou prolongando o período de tempo entre exposição ao glifosato e recuperação de ácido chiquímico e/ou chiquimato-3-fosfato. A concnetração de ácido chiquímico e/ou chiquimato-3-fosfato no meio de cultura tende a aumentar por um período de tempo seguinte a exposição ao glifosato e, então, entra em platô. Ajustes ao período de tempo baseados no micro-organismo particular utilizado para aperfeiçoar a recuperação podem ser prontamente determinados por alguém versado na técnica.
[00102] Em aspectos preferidos destas modalidades da invenção o micro-organismo é crescido em um meio de cultura mínimo. O microorganismo pode ser crescido usando qualquer método apropriado conhecido daqueles versados na técnica. Em modalidades preferidas da invenção os micro-organismos são produzidos usando ou um frasco batedor ou um processo a base de fermentação (isto é, em um bior-reator controlado) em que o micro-organismo é crescido até uma densidade óptica (O.D.) maior do que dois (2); de preferência uma O. D. maior do que 10, maior do que 20, maior do que 50 ou maior do que 100.
[00103] Em qualquer aspecto da presente invenção a cultura baseada em fermentação pode ser usada para produzir ácido chiquímico a uma taxa maior que 1 grama/litro, de preferência maior que mais ou menos 20 gramas/litro; de mais preferência, maior que mais ou menos 40 gramas/litro; maior que 90 gramas/litro; ou maior que 100 gra-mas/litro.
[00104] Em vários aspectos da invenção o micro-organismo pode ser algas, Archaea, bactérias, fungos ou protozoários; inclusive proca-riotes, cianobacterias e organismo eucariótico unicelular.
III. Recuperação de Ácido Cvclitolcarboxílico
[00105] Processos da presente invenção para recuperar um ácido ciclitolcarboxílico como ácido chiquímico geralmente incluem contactar um fluxo de processo aquoso incluindo ácido chiquímico e uma membrana de separação para formar um retentado e um permeado. O fluxo de processo aquoso inclui água e o extrato de material de planta produzido conforme o método de planta e/ou o meio de cultura ou sobre-nadante de cultura produzido conforme o método de fermentação. As composições do retentado e permeado dependem de uma variedade de fatores, inclusive a origem e composição do fluxo de processo inicialmente contactado com a membrana. Em várias modalidades, o ácido chiquímico recuperado como o produto está presente no retentado, ao passo que em várias outras modalidades o ácido chiquímico recuperado está presente no permeado. O retentado ou peemeado incluindo o ácido chiquímico pode ser ainda tratado por uma variedade de métodos inclusive, por exemplo, métodos de concentração e troca iônica (como detalhados em outro lugar neste) para recuperar um produto de ácido chiquímico da pureza desejada. É para ser entendido que a referência a presença de um ácido ciclitolcarboxílico particular como ácido chiquímico dentro de um fluxo particular (por exemplo, retentado ou permeado) não indica a ausência de ácido chiquímico em outros fluxos de processo. Porém, como detalhado em outro lugar neste, o fluxo do qual o produto de ácido chiquímico é recuperado é frequentemente selecionado devido a outras características além da concentração ou proporção de ácido chiquímico inclusive, por exemplo, a presença de outros componentes, as proporções relativas destes componentes e do ácido chiquímico, e a facilidade com que o ácido chiquímico pode ser separado destes outros componentes.
[00106] Vários métodos convencionais para recuperação de ácido chiquímico utilizam solventes orgânicos. Geralmente conforme a presente invenção e como descrito acima, o fluxo de processo aquoso inclui um extrato de planta aquoso ou meio de cultura de célula ou so-brenadante preparado na ausência de solventes orgânicos. Desse modo, a presente invenção fornece um processo de separação e recuperação para ácido chiquímico que evita as questões de custo, descarte e separação associados com solventes orgânicos. Além disso, desta maneira, o processo da presente invenção pode ser prontamente utilizado com relação a qualquer fluxo aquoso contendo ácido chiquímico. Mais particularmente, muito da discussão neste enfoca fluxos de processo aquosos contendo ácido chiquímico produzido conforme o método de planta e métodos de fermentação detalhados neste, mas igualmente é para ser entendido que os processos e métodos da presente invenção são apropriados para tratamento de qualquer fluxo de processo aquoso contendo ácido chiquímico, não importando a fonte.
[00107] Geralmente, conforme a presente invenção, qualquer uma de uma variedade de técnicas de separação de membrana bem conhecidas na técnica pode ser utilizada, por exemplo, ultrafiltração, mi-crofiltração, nanofiltração e osmose reversa. Porém, em várias modalidades preferidas, o processo da presente invenção utiliza nanofiltração. Membranas de separação de nanofiltração apropriadas são tipicamente construídas de polímeros orgânicos como poliamidas aromáticas reticuladas na forma de um ou mais compósitos de filme finos. Geralmente, membranas de nanofiltração apropriadas exibem um Corte de Peso Molecular (MWCO) de mais ou menos 150 daltons a mais ou menos 1000 daltons e, tipicamente, de cerca de 250 daltons. Além do tamanho de componentes de fluxo de processo ou constituintes, a separação por membranas de nanofiltração apropriadas também tipicamente inclui um componente baseado na carga da membrana, que depende, pelo menos em parte, do pH do fluxo de processo contactado com a membrana. O pH do fluxo de processo também tipicamente impacta o grau de dissociação de componentes acídicos do fluxo de processo. Deste modo, como detalhado em outro lugar neste, o pH do fluxo de processo impacta a separação dos componentes do fluxo de processo. O ajuste do pH do fluxo de processo ser adequadamente conduzido conforme métodos sabidos para uma pessoa qualificada na técnica por uma adição de um reagente apropriado acídico ou básico antes de contactar a membrana de separação.
[00108] Exemplos de membranas de nanofiltração apropriadas incluem, por exemplo, e sem limitação, membranas série D, H e K fabricadas por GE Water & Processo Technologies, Inc., uma subsidiária de GE Infrastructure (Minnetonka, MN), membranas SelRO disponíveis de Koch Membrane Systems (Wilmington, MA) e membranas NF disponível de Filmtec Corporation, uma subsidiária de Dow Chemical Company (Midland, Ml). Exemplos específicos de membranas de nanofiltração apropriadas incluem, por exemplo, e sem limitação, as membranas DK, DL, HK, HL e KH fabricadas por GE Water & Process Technologies, Inc., as membranas NF (por exemplo, NF 40, NF 40HF, NF 50, NF 70 e NF 270) disponível de FilmTec Corporation, membrana MPS-34 disponível de Koch Membrane Systems (Wilmington, MA), membrana SU disponível de Toray (Japão) e as membranas NTR (por exemplo, NTR 7450 e NTR 7250) disponíveis de Nitto Electric (Japão).
[00109] Além de ácido chiquímico e glifosato, o fluxo de processo a ser tratado pode incluir um ou sais mais inorgânicos. Estes sais podem estar presentes como resultado de utilizar um sal de glifosato no método para produtor ácido chiquímico (isto é, pelo método de planta ou método de fermentação) e pode também ser nativo para plantas usa-das para produzir ácido chiquímico. Estes sais geralmente incluem cloreto de potássio, cloreto de amônio, hidróxido de amônio, sulfato de sódio, sulfato de potássio e combinações dos mesmos. Foi observado que as proporções relativas de ácido chiquímico e sais no fluxo de processo impactam se o ácido chiquímico de produto tende a acumular no retentado ou permeado produzido mediante contato com a membrana de separação (por exemplo, nanofiltração). Por exemplo, em várias modalidades, foi geralmente observado que como a proporção relativa de ácido chiquímico para sais inorgânicos diminui, a proporção de ácido chiquímico no retentado aumenta. Inversamente, igualmente foi geralmente observado que como a proporção relativa de ácido chiquímico para sais inorgânicos aumenta, a proporção de ácido chiquímico no permeado aumenta.
[00110] Não importando como o ácido chiquímico no fluxo de processo aquoso é produzido (isto é, pelo método de planta ou método de fermentação) o fluxo de processo a ser tratado ainda inclui glifosato. Como com sais inorgânicos, a proporção de glifosato no fluxo de processo e, mais particularmente, a proporção relativa de ácido chiquímico e glifosato no fluxo de processo impacta se o produto desejado ácido chiquímico tende a acumular no retentado ou permeado. Por exemplo, em várias modalidades, foi geralmente observado que como a proporção relativa de ácido chiquímico para glifosato aumenta, a proporção de ácido chiquímico no retentado aumenta. Inversamente, igualmente foi geralmente observado que como a proporção relativa de ácido chiquímico para glifosato diminui (por exemplo, para próximo de conteúdo equivalente de ácido chiquímico e glifosato, por peso), a proporção de ácido chiquímico no permeado aumenta.
[00111] Membranas de nanofiltração apropriadas tipicamente exibem características de rejeição seguintes com respeito a ácido chiquímico, sais inorgânicos e glifosato, como determinado de dados composicionais para o fluxo de processo inicial e retentado e permeado resultantes. Estes dados composicionais podem ser determinados por métodos sabidos na técnica inclusive, por exemplo, análise por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e espectrometria de massa. Uma característica de rejeição pode ser definida como a diferença entre a relação de concentração de permeado (Cp) de um componente e a média da concentração do fluxo de processo (Cs) e concentração no retentado (Cr) do componente: 1-Cp/((Cs + Cr)/2). Membranas de nanofiltração apropriadas geralmente exibem uma característica de rejeição com respeito a ácido chiquímico de mais ou menos 40% a mais ou menos 100%, tipicamente de mais ou menos 60% a mais ou menos 80% e, mais tipicamente, de cerca de 70%. Com respeito a sais inorgânicos, membranas de nanofiltração apropriadas geralmente exibem uma característica de rejeição de mais ou menos 20% a mais ou menos 80%, tipicamente de mais ou menos 40% a mais ou menos 60% e, mais tipicamente, de cerca de 50%. A característica de rejeição a glifosato de membranas de nanofiltração apropriadas é geralmente de mais ou menos 75% a mais ou menos 100%, tipicamente de mais ou menos 90% a mais ou menos 98% e, mais tipicamente, mais ou menos 95%.
[00112] Além dos componentes do fluxo de processo do qual o ácido chiquímico é recuperado (e suas proporções relativas), o pH do fluxo de processo contactado com a membrana de separação também impacta se o produto desejado ácido chiquímico está presente ou acumula no retentado ou permeado. Por exemplo, foi observado que o contato de um fluxo de processo tendo um pH de cerca de 4 com uma membrana de separação de nanofiltração como descrita neste, geralmente fornece um permeado contendo produto ácido chiquímico. Inversamente, fluxos de processo mais acídicos e mais básicos tendo um pH de menos de cerca de 4 (por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 3.5) ou maior que mais ou menos 4 (por exemplo, de mais ou menos 4.5 para sobre 7) foram observados como fornecendo um retenta-do contendo produto ácido chiquímico. Sem estar preso a uma teoria particular, acredita-se que este efeito de pH na retenção de ácido chiquímico é devido, pelo menos em parte, ao efeito do pH do fluxo de processo na carga de superfície da membrana e ao grau de dissociação de componentes do fluxo de processo, inclusive dissociação de ácido chiquímico.
[00113] Em várias modalidades em que ácido chiquímico é recuperado de um fluxo de processo aquoso incluindo meio de cultura ou so-brenadante de cultura produzido pelo método de fermentação, o fluxo de processo tipicamente inclui uma ou mais outras impurezas além de glifosato e sais inorgânicos. Por exemplo, o fluxo de processo aquoso tipicamente contém fenilalanina produzida durante a fermentação. Como detalhado em outro lugar neste, naquelas modalidades em que o ácido chiquímico é fornecido pelo método de fermentação, o produto desejado ácido chiquímico está tipicamente presente no permeado. A característica de rejeição da membrana de separação com respeito a fenilalanina é tipicamente mais alta que a característica de rejeição para ácido chiquímico. Por exemplo, a característica de rejeição a fenilalanina de membranas de nanofiltração apropriadas é geralmente de mais ou menos 70% a mais ou menos 100%, tipicamente de mais ou menos 85% a mais ou menos 95% e, mais tipicamente, mais ou menos 90%. Porém, junto com ácido chiquímico, o permeado tipicamente igualmente incluirá um pouco de fenilalanina. Conforme a presente invenção foi descoberto que controlando o pH do fluxo de processo aquoso contactado com a membrana de separação fornece retenção seletiva vantajosa pela membrana de fenilalanina sobre o produto desejado ácido chiquímico. Por exemplo, foi observado que um fluxo de processo aquoso tendo um pH de cerca de 4 e incluindo fenilalanina fornece transmissão relativa vantajosa de ácido chiquímico sobre feni-lalanina. Mais particularmente, foi observado que contactando um fluxo de processo aquoso em tais níveis de pH e uma membrana de separação minimiza a relação da característica de rejeição de ácido chiquímico para a característica de rejeição de fenilalanina. Mais particularmente, conforme várias modalidades preferidas, esta relação é de preferência menos que mais ou menos 0.90, de mais preferência menos que mais ou menos 0.80 e, ainda, de mais preferência mais ou menos 0.70.
Método de Planta
[00114] Em várias modalidades em que ácido chiquímico é recuperado de um fluxo de processo aquoso incluindo o extrato de material de planta produzido pelo método de planta, um retentado incluindo produto ácido chiquímico desejado é fornecido por um fluxo de processo exibindo uma ou mais das características seguintes. Em várias tais modalidades, o fluxo de processo tem um pH de mais ou menos 2 a mais ou menos 7, de mais ou menos 3.5 a mais ou menos 5.5, ou mais ou menos 5. Geralmente conforme estas modalidades o fluxo de processo contém ácido chiquímico em uma concentração de mais ou menos 0.05 a mais ou menos 1.2 % em peso e tipicamente de mais ou menos 0.05 a mais ou menos 1 % em peso. Ainda conforme estas modalidades, o fluxo de processo contém glifosato a uma concentração de mais ou menos 0.02 a mais ou menos 1 % em peso, de mais ou menos 0.02 a mais ou menos 0.5 % em peso, ou de mais ou menos 0.03 a mais ou menos 0.25 % em peso. Ainda conforme tais modalidades, a concentração de sais inorgânicos é tipicamente de mais ou menos 0.1 a mais ou menos 1.5 % em peso, e mais tipicamente de mais ou menos 0.5 a mais ou menos % em peso.
[00115] Ainda conforme estas modalidades, a relação de peso de ácido chiquímico para sais inorgânicos é tipicamente menos que mais ou menos 1, mais tipicamente menos que mais ou menos 0.5 e, ainda mais tipicamente, menos que mais ou menos 0.25. A relação de peso de ácido chiquímico para glifosato é tipicamente pelo menos mais ou menos 5, mais tipicamente pelo menos mais ou menos 10 e, ainda mais tipicamente, pelo menos mais ou menos 20 (por exemplo, de mais ou menos 20 a mais ou menos 30).
[00116] Ainda conforme tais modalidades, a relação da característica de rejeição a ácido chiquímico da membrana para a sua característica de rejeição a glifosato é geralmente de mais ou menos 0.60 a mais ou menos 0.90, e tipicamente de mais ou menos 0.70 a mais ou menos 0.80. Ainda conforme estas modalidades, a relação da característica de rejeição a ácido chiquímico da membrana para sua característica de rejeição a sais inorgânicos é geralmente de mais ou menos 1.0 a mais ou menos 2.5, e tipicamente de mais ou menos 1.6 a mais ou menos 2.0.
[00117] Devido à concentração tipicamente relativamente baixa de ácido chiquímico no fluxo de processo aquoso e as características de rejeição da membrana com respeito a ácido chiquímico, uma porção significativa do ácido chiquímico inicial está presente no retentado enquanto o permeado inclui uma proporção relativamente baixa de ácido chiquímico. As características de rejeição da membrana para glifosato fornecem um retentado que igualmente inclui uma fração significativa do conteúdo inicial de glifosato. Porém, como detalhado em outro lugar neste, produto ácido chiquímico pode ser recuperado do retentado separando o glifosato e ácido chiquímico por métodos sabidos na técnica inclusive, por exemplo, troca de íons.
[00118] Ainda conforme estas modalidades de método de planta, a concentração de ácido chiquímico no retentado é geralmente de mais ou menos 0.05 ra mais ou menos 1.5 % em peso, e tipicamente de mais ou menos 0.25 a mais ou menos 1 % em peso. A concentração de glifosato no retentado é geralmente de mais ou menos 0.002 a mais ou menos 0.025 % em peso, e tipicamente de mais ou menos 0.01 a mais ou menos 0.025 % em peso. Ainda conforme estas modalidades, as a concentração de sais inorgânicos no retentado é geralmente de mais ou menos 0.6 a mais ou menos 1.2 % em peso, e tipicamente de mais ou menos 0.8 a mais ou menos 1 % em peso. O pH do retentado é geralmente de mais ou menos 2 a mais ou menos 7, e tipicamente de mais ou menos 3.5 a mais ou menos 5.5.
[00119] Adicionalmente ou alternativamente, ainda conforme estas modalidades, a concentração de ácido chiquímico no permeado é geralmente de mais ou menos 0.025 a mais ou menos 1 % em peso, e tipicamente de mais ou menos 0.25 a mais ou menos 0.75 % em peso. A concentração de glifosato no permeado nestas modalidades é geralmente de mais ou menos 0.002 a mais ou menos 0.025 % em peso, e tipicamente de mais ou menos 0.01 a mais ou menos 0.025 % em peso. Ainda conforme estas modalidades, a concentração de sais inorgânicos no permeado é geralmente de mais ou menos 0.1 a mais ou menos 0.3 % em peso.
Método de fermentação
[00120] Em várias modalidades em que ácido chiquímico é recuperado de um fluxo de processo aquoso incluindo o meio de cultura ou sobrenadante do meio de cultura produzido pelo método de fermentação, um permeado incluindo o produto ácido chiquímico desejado é fornecido por um fluxo do processo exibindo um ou mais das características seguintes. Em várias tais modalidades, o fluxo do processo tem um pH de mais ou menos 2 a mais ou menos 7, de mais ou menos 3.5 a mais ou menos 4.5, ou mais ou menos 4. Geralmente conforme estas modalidades, o fluxo do processo contém ácido chiquímico em uma concentração de cerca de 0.4 a mais ou menos 5 % em peso, e tipicamente de mais ou menos 0.5 a mais ou menos 2.5 % em peso. Ainda conforme estas modalidades, o fluxo de processo tipicamente contém glifosato em uma concentração de mais ou menos 0.2 a mais ou menos 0.5 % em peso, e mais tipicamente de mais ou menos 0.3 a mais ou menos 0.4 % em peso (por exemplo, mais ou menos 0.35 % em peso). A concentração de sais inorgânicos no fluxo de processo nestas modalidades é tipicamente de mais ou menos 0.1 a mais ou menos 1 % em peso, e mais tipicamente de mais ou menos 0.4 a mais ou menos 0.8 % em peso (por exemplo, mais ou menos 0.6 % em peso). Também conforme estas modalidades, o fluxo de processo tipicamente contém fenilalanina em uma concentração de mais ou menos 0.5 a mais ou menos 4 % em peso, e mais tipicamente de mais ou menos 1 a mais ou menos 3 % em peso.
[00121] Ainda conforme estas modalidades, a relação de peso de ácido chiquímico para sais inorgânicos é tipicamente pelo menos mais ou menos 0.5, mais tipicamente pelo menos mais ou menos 1 e, ainda mais tipicamente, pelo menos mais ou menos 1.5. A relação de peso de ácido chiquímico para glifosato é tipicamente de mais ou menos 1 a mais ou menos 5, mais tipicamente de mais ou menos 2 a mais ou menos 4 e, ainda mais tipicamente, mais ou menos 3. Ainda conforme estas modalidades, a relação de peso de ácido chiquímico para fenilalanina é geralmente de mais ou menos 0.1 a mais ou menos 10, ou de mais ou menos 1 a mais ou menos 5. Em várias outras modalidades, a relação de peso de ácido chiquímico para fenilalanina é de mais ou menos 0.5 a mais ou menos 1.5, ou de mais ou menos 0.8 a mais ou menos 1.2. Como notado acima conforme modalidades em que o fluxo do processo aquoso é fornecido pelo método de fermentação, retenção seletiva vantajosa de fenilalanina pela membrana através da passagem de ácido chiquímico foi observado em níveis de pH de cerca de 4.
[00122] Ainda conforme tais modalidades, a relação da característi-ca de rejeição a ácido chiquímico da membrana para sua característica de rejeição a glifosato é geralmente de mais ou menos 0.6 a mais ou menos 0.9, e tipicamente de mais ou menos 0.6 a mais ou menos 0.8 ou de mais ou menos 0.6 a mais ou menos 0.7. A relação da característica de rejeição a ácido chiquímico da membrana para sua característica de rejeição de sal inorgânico é geralmente de mais ou menos 1.25 a mais ou menos 2, e tipicamente de mais ou menos 1.4 a mais ou menos 1.8. Ainda conforme tais modalidades, a relação da característica de rejeição a ácido chiquímico da membrana para sua característica de rejeição a fenilalanina é geralmente de mais ou menos 0.1 a mais ou menos 1, e tipicamente de mais ou menos 0.7 a mais ou menos 0.9 ou de mais ou menos 0.7 a mais ou menos 0.8.
[00123] A concentração tipicamente mais alta de ácido chiquímico no fluxo do processo aquoso como comparada a fluxos do processo incluindo o extrato de material de planta produzido pelo método de planta geralmente fornece um permeado contendo uma proporção maior (base de massa) de ácido chiquímico. Consequentemente, o permeado inclui uma proporção apropriada de ácido chiquímico para fornecer o produto desejado ácido chiquímico. Devido às características de rejeição da membrana para glifosato (por exemplo, mais ou menos 95%), o retentado inclui uma fração significativa do conteúdo inicial de glifosato. Desse modo, conforme estas modalidades, contactando um fluxo do processo aquoso tendo as características notadas geralmente fornece separação significativa de produto desejado ácido chiquímico e glifosato no permeado. Como detalhado em outro lugar neste, produto ácido chiquímico presente no permeado pode ser recuperado separando fenilalanina e ácido chiquímico por métodos sabidos na técnica inclusive, por exemplo, troca de íons.
[00124] Ainda conforme estas modalidades de método de fermentação, a concentração de ácido chiquímico no retentado é geralmente de mais ou menos 0.4 a mais ou menos 6 % em peso, e tipicamente de mais ou menos 2 a mais ou menos 4 % em peso. A concentração de glifosato no retentado é geralmente de mais ou menos 0.3 a mais ou menos 0.5 % em peso. Ainda conforme estas modalidades, a concentração de fenilalanina no retentado é geralmente de mais ou menos 0.5 a mais ou menos 5 % em peso, e tipicamente de mais ou menos 1.5 a mais ou menos 3 % em peso. A concentração de sais inorgânicos no retentado é geralmente de mais ou menos 0.5 a mais ou menos 1 % em peso.
[00125] Adicionalmente ou alternativamente, a concentração de ácido chiquímico no permeado é geralmente de mais ou menos 0.25 a mais ou menos 3.5 % em peso, e tipicamente de mais ou menos 1 a mais ou menos 2.5 % em peso. Ainda conforme estas modalidades, a concentração de glifosato no permeado é geralmente de mais ou menos 0.25 a mais ou menos 0.4 % em peso. A concentração de fenilalanina no permeado é geralmente de mais ou menos 0.4 a mais ou menos 3.6 % em peso, e tipicamente de mais ou menos 1 a mais ou menos 2.5 % em peso. A concentração de sais inorgânicos no permeado é geralmente de mais ou menos 0.2 a mais ou menos 0.5 % em peso. O pH do permeado é geralmente de mais ou menos 2 a mais ou menos 7, e tipicamente de mais ou menos 3.5 a mais ou menos 4.5, ou mais ou menos 4.
[00126] Conforme estas e várias outras modalidades detalhadas em outro lugar neste, o contato do fluxo de processo e da membrana seletiva geralmente fornece um permeado esgotado de ácido chiquímico em relação ao fluxo de processo aquoso. A este respeito, é para ser entendido que a referência a um permeado "esgotado" em ácido chiquímico em comparação com o fluxo de processo não necessariamente indica que o permeado inclui ácido chiquímico em uma concentração reduzida em comparação com o fluxo do processo. Como notado acima, as características de rejeição de membranas apropriadas com respeito a ácido chiquímico são geralmente constantes (por exemplo, mais ou menos 70%). Deste modo, em uma base de massa absoluta de ácido chiquímico, o contato de uma membrana apropriada com um fluxo de processo incluindo uma massa predefinida de ácido chiquímico, não importando a composição precisa do fluxo (por exemplo, concentração de ácido chiquímico), tipicamente resultará em rejeição de uma proporção relativamente constante de ácido chiquímico. Deste modo, a referência ao esgotamento do permeado com respeito a ácido chiquímico indica uma massa mais baixa de ácido chiquímico no permeado em comparação com o processo inicial Consequentemente, em várias modalidades preferidas (por exemplo, em que o ácido chiquímico é recuperado de fluxos de processo aquosos produzidos pelo método de planta), um retentado é fornecido que é enriquecido em ácido chiquímico em relação ao permeado. Em vários outras modalidades preferidas (por exemplo, em que o ácido chiquímico é produzido pelo método de fermentação), um permeado enriquecido em ácido chiquímico em relação ao retentado é fornecido.
[00127] Várias modalidades preferidas da presente invenção incluem diluição antes de e/ou diafiltração do fluxo de processo aquoso durante o contato do fluxo de processo e da membrana seletivos. Diafiltração é uma técnica famosa em que um fluxo líquido (tipicamente, mas não limitado a, água desmineralizada) é adicionado a um fluxo de alimentação introduzido em uma unidade de separação de membrana para diluir a alimentação entrante. Esta diluição permite geração de permeado adicional a uma pressão estabelecida devido a uma redução da pressão osmótica do fluxo de alimentação. Como permeado adicional é gerado, a transmissão de componentes pela membrana de nanofiltração para a qual a membrana demonstra uma rejeição baixa, também aumenta. Desta maneira, a diafiltração pode ser de preferên-cia empregada para ajudar na recuperação e purificação de um fluxo de processo aquoso contendo ácido chiquímico aproveitando-se das características variáveis de rejeição a soluto demonstradas por membranas de nanofiltração apropriadas.
[00128] Por exemplo, quando a concentração de ácido chiquímico no fluxo do processo é comparável com aquela de glifosato e mais alta que a concentração de sais inorgânicos (por exemplo, um fluxo de processo fornecido pelo método de fermentação), diafiltração pode ser empregada para aumentar a quantidade de ácido chiquímico que é transmitida pela membrana de nanofiltração, devido à transmissão de água adicional pela membrana. Nesta modalidade, como notado acima, o fluxo de permeado conteria o produto desejado ácido chiquímico. Além disso, conforme estas e várias outras modalidades em que o ácido chiquímico é produzido pelo método de fermentação (por exemplo, aquelas em que diafiltração não é utilizada), um permeado é fornecido que é enriquecido em ácido chiquímico em relação ao retenta-do.
[00129] Por via de exemplo adicional, quando a concentração de ácido chiquímico no fluxo de processo contendo ácido chiquímico é mais baixa do que a concentração de sais inorgânicos e significativamente maior do que a concentração de glifosato (por exemplo, um fluxo do processo fornecido pelo método de planta), diafiltração pode ser empregada para aumentar a passagem de sais inorgânicos pela membrana de nanofiltração, devido à transmissão de água adicional pela membrana e a característica de rejeição relativamente baixa da membrana com respeito aos sais inorgânicos. Nesta modalidade, como notado acima, o fluxo de retentado incluiria o produto desejado ácido chiquímico e seria enriquecido em ácido chiquímico em relação ao permeado.
A. Recuperação de ácido chiquímico produzido pela planta Método
[00130] A figura 2 representa uma modalidade de um processo de recuperação e isolamento de ácido chiquímico a partir de um fluxo de processo de solução aquosa contendo um extrato de material de planta preparado pelo método da planta conforme detalhado aqui. Como mostrado, um fluxo de processo de solução aquosa 1 e fluxo de diafil-tração/diluição opcional é introduzido em uma unidade de separação de membrana 9 contendo uma membrana de separação adequada. Embora mostrado na figura 2, a diluição do fluxo de processo (ou seja, diafiltração) não é necessária para o funcionamento do processo descrito aqui. Embora não seja necessário, um extrato vegetal pode ser concentrado antes do tratamento para a recuperação e isolamento de ácido chiquímico.
[00131] Também não é mostrado na figura 2 um fluxo de reagente de ajuste do pH opcional para ajustar o pH do fluxo de processo aquoso introduzido na unidade de separação por membranas.
[00132] Conforme detalhado aqui, as plantas tratadas pelo contato com o glifosato podem ser colhidas e tratadas para extração de ácido chiquímico através de métodos que geralmente incluem submeter o material vegetal (por exemplo, raízes, caules e folhas) para uma operação de lavagem seguida por extração de ácido chiquímico por métodos conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, congelar e descongelar a extração com ácido clorídrico e extração de solvente usando tridodecilamina. Preferencialmente, o extrato vegetal é preparado na ausência de solventes orgânicos. Antes da operação de separação por membranas, o extrato aquoso vegetal pode ser submetido a uma operação de separação para remoção de material vegetal e produz um sobrenadante que compreende ácido chiquímico (por exemplo, fluxo de processo aquoso é mostrado na Fig.. 2). Estas etapas de processamento não são mostradas na fig. 2, mas o aparelho adequado e as condições podem ser facilmente selecionadas por uma pessoa versada na técnica e, em geral e, mais particularmente, tendo em vista a descrição do método de planta
[00133] Como mostrado na figura 2, ao entrar em contato o fluxo do processo aquoso e uma membrana de separação dentro da unidade de separação de membranas 9 forma o retentado 13 e um permeado 17. Conforme detalhado aqui, o permeado 17 é geralmente reduzido em ácido chiquímico em relação ao fluxo do processo aquoso e retentado, mas inclui uma fração substancial de sais inorgânicos, e é retirado do processo como um fluxo de resíduos. No entanto, como aqui descrito, o permeado contém algum ácido chiquímico. Assim, de acordo com diversas modalidades, permeado 17 pode ser submetido a outras operações de separação de membrana (por exemplo, reciclado) para fins de recuperação de ácido chiquímico. Deve-se entender que todo esse tratamento, em geral, seria realizado em conformidade com a discussão aqui. Por exemplo, o permeado pode ser tratado em outra unidade de separação de membrana, conforme descrito abaixo, com referência à figura 3.
[00134] Nanofiltração é um processo de separação impulsionada por pressão impulsionado pela diferença entre a pressão de operação e a pressão osmótica da solução na alimentação ou lado retentado da membrana. A pressão de funcionamento na unidade de separação por membranas 9 variará dependendo do tipo de membrana utilizada, como a pressão osmótica é dependente do nível de transmissão de solutos através da membrana. As pressões de funcionamento adequadas na unidade de separação por membranas 9 (e outras unidades de separação da membrana utilizado em conformidade com a presente invenção) são atingidas pela passagem do fluxo de processo aquoso através de uma ou mais bombas (não mostrado) a montante da unidade de separação por membranas, por exemplo, uma bomba de re-forço de combinação e arranjo de bomba de alta pressão.
[00135] Normalmente, a pressão de operação utilizada nas operações de nanofiltração é inferior a cerca de 4500 kPa absoluto e, de preferência, a partir de 2000 a cerca de 4000 kPa absoluto. Conforme ilustrado no Exemplo 12 abaixo, um fluxo de permeado de cerca de 2 litros/minuoe/m2 de superfície de membrana pode ser alcançado quando o tratamento de uma solução contendo ácido chiquímico a uma pressão operacional de cerca de 3500 kPa absoluto.
[00136] A fim de manter ou aumentar a eficiência de separação de membrana e fluxo de permeado, as membranas devem ser limpas periodicamente, de modo a remover os contaminantes da superfície da membrana. A limpeza adequada inclui operações de limpeza no local (CIP) em que a superfície da membrana é exposta a uma solução de limpeza quando instalada com a unidade de separação por membranas 9. Os sistemas preferidos monitoram a concentração do componente do retentado e/ou permeado e/ou fluxo de permeado para determinar se a limpeza é necessária.
[00137] Os protocolos de limpeza e soluções de limpeza variará dependendo do tipo de membrana de separação empregada e estão geralmente disponíveis a partir do fabricante da membrana. As soluções de limpeza adequadas podem incluir, por exemplo, soluções de soda cáustica ou alcalinas. Para não danificar as membranas e desnecessariamente encurtar a vida útil da membrana, a operação CIP é preferencialmente realizada utilizando uma solução de pH padrão em condições de pressão e temperatura conhecidas por aqueles versados na técnica. Em algumas aplicações, pode ser vantajoso realizar uma operação de limpeza nas novas membranas de separação antes de usar na operação de separação por membranas, a fim de melhorar o desempenho da membrana.
[00138] Mais uma vez, com referência à figura 2, o retentado 13 ge-ralmente compreende ácido chiquímico, glifosato, e várias outras impurezas, incluindo, por exemplo, vários sais inorgânicos e íons (por exemplo, íons de fosfato, íons sulfato, íons de potássio, íons de cloreto e íons de amónio). Estas impurezas podem ser fornecidas através de métodos para a produção de ácido chiquímico entrando em contato com uma planta e glifosato e/ou pode ser nativo das plantas tratadas para preparar ácido chiquímico. Como mostrado na figura 2, o retenta-do 13 é transferido para um vaso de concentração 21 em que o reten-tado é tratado para remover a água e formar um retentado concentrado 25 e fluxo de resíduos aquosos 29. Por exemplo, a água pode ser removida do retentado 13 para fornecer retentado concentrado 25 por aquecimento para evaporar uma parte do teor de água retido. Acredita-se que a remoção de água do retentado facilita a recuperação a jusante do produto de ácido chiquímico desejado. Aquecimento do retentado para remoção de água pode ser facilmente alcançado por meio de métodos convencionais conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, a troca de calor indireta com um fluxo adequado, por exemplo, (fluido, um fluido de transferência de calor apropriado, tais como vapor). O aquecimento do retentado também pode ser adequadamente realizado por aquecimento direto.
[00139] Mais uma vez, com referência à figura 2, o retentado concentrado 25 é introduzido em uma coluna de troca iônica ou unidade 33 contendo um leito de resina de troca iônica. A resina de troca iônica é selecionada para se adequar a adsorção seletiva de glifosato. A configuração exata da unidade de troca iônica e a composição da resina de troca iônica não é estritamente importante e pode ser escolhida de acordo com os métodos convencionais, utilizando aparelhos e resinas conhecidas na técnica. Por exemplo, Patente US No. 5.087.740 de Smith, todo o conteúdo do que foi incorporado para referência para todos os fins, descreve um método para a separação de glifosato de um fluxo aquoso usando uma fraca resina de troca iônica básica. As resinas de trocas iônicas adequadas incluem aqueles geralmente conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, entre outros, resinas de troca iônica fraca básica vendidas por: Rohm & Haas Co. (Philadelphia, Pa.) sob a marca Amberlite tal como AMBERLITE IRA- 93, AM-BERLITE IRA- 94, AMBERLITE IRA- 68 e AMBERLITE IRA-35; Diamond Shamrock Corp. (Dallas, Tex.) sob a sua marca DUOLITE A-392 e Sybron Chemicals, Inc. (Birmingham, NJ) sob a sua marca lonac como IONAC 305, 365 e IONAC IONAC 380. Outras resinas de troca iônica comercial mente disponíveis podem ser facilmente selecionadas por uma pessoa versada na técnica.
[00140] Como mostrado na figura 2, ao passar o retentado concentrado 25 através da unidade de troca iônica 33 fornece um fluxo de resíduos 37 (sobre a regeneração), compreendendo o glifosato e uma solução aquosa do produto 41 que compreende o ácido chiquímico desejado e empobrecido em glifosato em relação ao retentado concentrado em virtude da remoção do glifosato por troca iônica. Acredita-se atualmente que a separação do ácido de chiquímico e glifosato por meio de troca iônica representada na figura 2 fornece quase completa separação do ácido de chiquímico e glifosato e uma solução aquosa do produto 41 que não contém mais do que vestígios de glifosato.
[00141] Geralmente, de acordo com o processo mostrado na figura 2, o retentado concentrado 25 é passado através da resina de troca iônica, mais glifosato ácido é seletivamente adsorvido pela resina, embora menos ácido chiquímico geralmente passe pela resina. A separação de troca iônica continuará até que a passagem ou avanço de glifosato através da unidade de troca iônica seja detectado, a ponto de que a resina seja lavada e regenerada para produzir fluxo de resíduos 37, em conformidade com os métodos convencionais conhecidos na técnica, incluindo aparelhos adequados e fluxos de processo (não mostra-do na figura 2).
[00142] A preparação de fluxo de resíduos 37 que compreende geralmente incluir a adsorção seletiva e retenção de glifosato pela resina e, geralmente, inclui ainda a lavagem da resina pelo contato com um líquido aquoso adequado de lavagem para remover o glifosato da resina para o fluxo de resíduos, e regenerar a resina. O fluxo de resíduos 37 pode ser tratado para recuperar glifosato para uso em diversas aplicações, incluindo, por exemplo, o método da planta detalhada aqui.
[00143] Mais uma vez, com referência à figura 2, a solução aquosa do produto desejado 41 compreendendo ácido chiquímico do produto é transferida para um outro vaso de concentração 49 para reduzir o teor de água da solução do produto, como descrito acima para fornecer um fluxo de resíduos aquosos 53 e um produto ácido chiquímico 57. De preferência, o produto do ácido chiquímico tem um teor de umidade máximo de cerca de 20% em peso, mais de preferência, não mais que cerca de 15% em peso e, mais ainda, de preferência, não mais que cerca de 10% em peso.
[00144] A figura 2 também mostra fluxo de ajuste de pH 45 que é introduzido na unidade de troca iônica para fornecer condições dentro do leito da resina de troca iônica que é apropriada para a adsorção seletiva e retenção de glifosato e passagem de ácido chiquímico passante. Por exemplo, para promover condições adequadas para a retenção do glifosato, um ácido relativamente forte, como o ácido clorídrico pode ser introduzido para reduzir e/ou manter o pH do fluxo de processo abaixo de aproximadamente 2 (por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 2). Em diversas modalidades alternativas, a recuperação de ácido chiquímico pode incluir adsorção seletiva e retenção de ácido chiquímico em uma unidade de troca iônica contendo um leito de resina de troca iônica selecionado para tal fim. Geralmente, de acordo com tais modalidades, o pH do retentado em contato com a resina é maior (por exemplo, cerca de 4) para promover a retenção do ácido chiquímico pela resina de troca iônica.
[00145] A recuperação do ácido chiquímico retido pela resina de troca iônica compreende a regeneração da resina de troca iônica para remover o ácido chiquímico.
Operação de múltipla passagem
[00146] A figura 3 representa uma modalidade de um processo de separação de membrana de múltipla passsagem para recuperação e isolamento de ácido chiquímico a partir de um fluxo de processo de solução aquosa contendo um extrato de material de planta preparado pelo método da planta conforme detalhado aqui. Como mostrado na figura 3, o efluente do extrato vegetal 201 é introduzido em um tanque de armazenamento de extrato vegetal 205. A alimentação do extrato vegetal 209 é removida do tanque de armazenamento 205 e misturada com fluxo de diluição 213 para formar fluxo de processo aquoso 217. O fluxo de processo aquoso 217 é transferido para a primeira unidade de separação de membrana 221 e em contato com uma primeira membrana de separação para formar um primeiro retentado 225 e um primeiro permeato 229. Como mostrado, primeiro retentado 225 retorna ao tanque de armazenamento 205. De acordo com a discussão anterior, o primeiro retentado 225 compreende o ácido chiquímico 225. Assim, a introdução do primeiro retentado 225 no tanque de armazenamento enriquece o teor de ácido chiquímico do extrato vegetal contido no tanque de armazenamento. Ainda em conformidade com a discussão anterior, um primeiro permeado 229 compreende igualmente algum ácido schiquímico. Assim, o tratamento posterior do primeiro permeato 229 (conforme detalhado a seguir), permite a recuperação de ácido chiquímico adicional que não foi recuperado no primeiro retentado 225.
[00147] O primeiro permeato 229 é introduzido em uma segunda unidade de separação de membrana 233 e entra em contato com uma segunda membrana de separação de nanofiltração para formar um segundo retentado 237 e o segundo permeado 241. O segundo reten-tado 237 retorna ao tanque de armazenamento 205 e o segundo permeado é transferido para uma terceira unidade de separação de membrana 245 e entra em contato com uma terceira membrana de separação de nanofiltração. Como mostrado na figura 3, os efluentes da terceira unidade de separação de membrana 245 são o terceiro retentado 249 e fluxo de resíduos 253. O terceiro retentado 249 retorna ao tanque de armazenamento 205. A figura 3 apresenta o permeado da terceira unidade de separação de membrana com um fluxo de resíduos. É preciso entender que os processos de separação de membrana de múltipla passagem praticados em conformidade com a presente invenção não se limitam a utilização de três unidades de separação de membrana. Assim, o fluxo 253 poderia ser tratado em uma unidade de separação de membrana para a recuperação de ácido chiquímico adicional. Opcionalmente (como mostrado por linhas tracejadas 261 e 265 na fig. 3), é preciso entender que os retentados, além de serem transferidos ao tanque de armazenamento 205, podem ser reciclados para fluxos de alimentação a montante. Por exemplo, o terceiro retentado 249 pode ser introduzido junto com primeiro permeato 229 em uma segunda unidade de separação de membrana 233, como mostrado pela linha tracejada 261. Da mesma forma, o segundo retentado 237 pode ser introduzido junto com o fluxo 217 em uma primeira unidade de separação de membrana 221, como mostrado pela linha tracejada 265. É ainda deve-se entender que uma porção do retentado pode ser introduzida no tanque de armazenamento 205 e uma porção do retentado pode ser reciclada para um fluxo de alimentação a montante, como descrito acima.
[00148] Ao combinar o primeiro retentado 225, o segundo retentado 237 e o terceiro retentado 249 retornados ao tanque de armazenamento, fornece o enriquecimento do extrato da planta em relação ao teor de ácido chiquímico. Por outro lado, o contato do extrato da planta e a membrana de separação remove as impurezas (por exemplo, sais inorgânicos). Assim, a introdução de um ou mais retentados no tanque de armazenamento normalmente fornece uma redução no teor de impureza do extrato vegetal aqui contido. Como mostrado na figura 3, um fluxo de produto enriquecido com ácido chiquímico 257 é removido do tanque de armazenamento 205. Este fluxo de produto pode ser tratado em conformidade com a discussão sobre a recuperação do ácido chiquímico do produto, incluindo, por exemplo, a concentração da solução do produto e separação de glifosato por troca iônica.
B. Recuperação de ácido chiquímico produzido a partir do Método de fermentação
[00149] A figura 4 representa uma modalidade de um método de recuperação e isolamento de ácido chiquímico a partir de um fluxo de processo de solução aquosa contendo um meio de cultura de célula ou sobrenadante de cultura de célula preparado pelo método de fermentação conforme detalhado aqui. Como mostrado, um fluxo de processo de solução aquosa 101 e fluxo de diafiltração/diluição 105 são introduzidos em uma unidade de separação de membrana 109 contendo uma membrana de separação adequada. Como mencionado acima, em conexão com o processo descrito na figura 2, diafiltração, quando utilizada, é geralmente realizada em conformidade com os métodos convencionais conhecidos na técnica, mas não é obrigatória. Da mesma forma, um fluxo de reagente de ajuste do pH opcional para ajustar o pH do fluxo de processo aquoso pode ser introduzido no fluxo de processo aquoso a montante da unidade de separação por membranas.
[00150] O fluxo de processo aquoso 101 geralmente compreende, ou seja, sob a forma de um meio de cultura celular (caldo de fermenta-ção) produzido pelo método de fermentação detalhado aqui. O caldo de fermentação contendo ácido chiquímico pode ser submetido a uma operação de separação (por exemplo, centrifugação) e o sobrenadante resultante ou centrado pode ser filtrado para remover os restos celulares. Embora não seja necessário, um caldo de fermentação pode ser diluído com a adição de um diluente aquoso (por exemplo, água deio-nizada), ou concentrado antes do tratamento para a recuperação e isolamento de ácido chiquímico.
[00151] Como mostrado na figura 4, entrar em contato com o fluxo de processo aquoso 101 e a membrana de separação dentro da unidade de separação de membranas 109 forma um retentado 113 e permeado 117. O retentado 113 geralmente compreende glifosato e diversos sais inorgânicos e seus íons (por exemplo, íons de fosfato, íons de sulfato, íons de potássio, íons de cloreto, e íons de amônio), e pode ser tratado e o glifosato recuperado para uso em, por exemplo, o método de fermentação detalhado aqui. O retentado 113 inclui também algum ácido chiquímico e, portanto, pode ser submetido ao tratamento posterior em um processo de separação por membranas de múltipla passagem para o isolamento de ácido chiquímico.
[00152] O permeato 117 geralmente compreende ácido chiquímico, fenilalanina, e várias outras impurezas (por exemplo, potássio e sais de sódio de fosfatos, sulfatos e cloretos). Como mostrado na figura 4, permeado 117 é transferido para um vaso de concentração 121 para formar um permeado concentrado 125 e um fluxo de resíduos aquosos 129. A remoção de água de permeado 117 para formar permeado concentrado 125 pode ser facilmente realizada em conformidade com os métodos conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, como descrito acima em relação à figura 2.
[00153] O permeado concentrado 125 é introduzido na coluna de troca iônica ou unidade 133 que contém um leito de resina de troca iônica selecionado para ser adequado para a adsorção seletiva e retenção de fenilalanina. As resinas de troca iônica adequadas incluem aqueles geralmente conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, as descritas acima. Geralmente, de acordo com o processo mostrado na figura 4, o permeado concentrado 125 é passado através da resina de troca iônica, mais fenilalanina ácida é seletivamente adsorvida pela resina, embora menos ácido chiquímico geralmente passe pela resina. A passagem do permeado concentrado 125 através da coluna de troca iônica continua até o avanço de fenilalanina seja detectado, em que a resina é lavada e regenerada para produzir fluxo de resíduos 137.
[00154] Como mostrado na figura 4, ao passar o permeado concentrado 125 atavés da unidade de troca iônica 133 fornece uma solução aquosa do produto 141 desejado compreendendo o ácido chiquímico do produto e empobrecido em fenilalanina em relação ao permeado 117 e permeado concentrado 125. Para proporcionar condições vantajosas para a separação de fenilalanina e ácido chiquímico, o ajuste do pH dentro da unidade de troca de íons 133 é fornecido pelo fluxo de ajuste de pH 145. Para promover condições adequadas para a retenção de fenilalanina, um ácido relativamente forte, como o ácido clorídrico pode ser introduzido para reduzir e/ou manter o pH do fluxo de processo abaixo cerca de 2 (por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 2). O fluxo de resíduos 137 que inclui fenilalanina é geralmente fornecida por lavagem da resina de troca iônica com um líquido aquoso adequado de lavagem. Além da fenilalanina, o fluxo de resíduos em geral, compreende uma ou mais impurezas, incluindo, por exemplo, vários sais como cloreto de potássio e impurezas alcalinas como o hidróxido de amônio.
[00155] Mais uma vez, com referência à figura 2, a solução aquosa do produto desejado 141 compreendendo ácido chiquímico do produto é transferida para um outro vaso de concentração 149 para remover água da solução do produto 141, como descrito acima para fornecer um fluxo de resíduos aquosos 153 e um produto ácido chiquímico 157. De preferência, o produto do ácido chiquímico 157 tem um teor de umidade máximo de cerca de 20% em peso, mais de preferência, não mais que cerca de 15% em peso e, mais ainda, de preferência, não mais que cerca de 10% em peso.
[00156] Embora a descrição anterior incide sobre a produção, recuperação e isolamento de ácido chiquímico, deve-se entender que a metodologia e as técnicas aqui divulgadas podem ser facilmente adap-tadaa por aqueles versados na técnica para recuperação e isolamento de outros ácidos, como ácidos ciclitolcarboxílicos tal como ácido quí-nico.
[00157] Além disso, de acordo com a presente invenção, diversas outras modalidades são direcionadas aos métodos para a síntese de um composto químico, seja in vitro ou in vivo, onde um ácido ciclitol-carboxílico (por exemplo, ácido chiquímico ou ácido quínico) produzidos e/ou recuperados por qualquer um dos métodos e processos detalhados aqui é usado como reagente na síntese. Em aspectos preferidos da modalidade da invenção, o composto é bioativo e tem a atividade como um agente anti-microbiano e/ou um agente inibidor da proliferação celular (incluindo mas não limitado a uma propriedade bioati-va selecionada do grupo consistindo em: atividade anti-viral, atividade anti-bacteriana, atividade anti-parasitária ou atividade anti-câncer). Em aspectos preferidos da modalidade da invenção o composto tem propriedades anti-bacterianas e/ou anti-virais. Em algumas modalidades preferidas, a invenção fornece um método para a produção de um inibidor da neuraminidase. Em outros aspectos desta modalidade da invenção o composto sintetizado é ácido 6 - fluorchiquímico ou oseltami-vir ou fosfato de oseltamivir preparado por qualquer método apropriado conhecido por aqueles versados na técnica.
[00158] Em especial, os inibidores da neuraminidase incluindo osel-tamivir podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica, incluindo as descritas no International Patent Application Publicação Nº s WO 07/080321, WO 07/074091, e Patente US Nos. 5763483, 5866601; 5,982675; 6593314; 6057459, 6111132, 6204398, 6225341, 6376674, 6518438, 7074431, 6939986 e 6437171.
[00159] A síntese química de oseltamivir de ácido chiquímico está ainda descrito na literatura científica. Ver, por exemplo Rohloff et al. (1998) e Federspiel et al. (1999), entre outros. Em modalidades preferidas da invenção, o método produz, pelo menos, aproximadamente 1 Kg de oseltamivir.
[00160] Após descrever a invenção em detalhes, ficará evidente que as modificações e as variações são possíveis, sem se afastar do âmbito de aplicação da invenção definida nas reivindicações anexas.
Exemplos
[00161] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Será apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguintes representam as técnicas descobertas pelos Requerentes para funcionar bem na prática da invenção e, portanto, podem ser consideradas como modos de preferência para a sua prática. No entanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da divulgação instantânea, também considerar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas, e ainda a obtenção de resultados semelhantes, ou similares, sem se afastar do âmbito de aplicação da invenção. Assim, os exemplos são exemplares único e não devem ser interpretados no sentido de limitar a invenção de alguma forma. Na medida do necessário para permitir e descrever a invenção atual, todas as referências citadas estão aqui incorporadas para referência.
Método de planta Exemplo 1: Aplicação, colheita e extração de ácido chiquímico da Alfafa:
[00162] Alfafa foi criada em uma estufa em vasos de 10,16 cm (4 polegadas) e tratadas com glifosato na fase inicial vegetativa. Cerca de 8 plantas por vaso foram tratadas na fase de crescimento V4. As plantas foram tratadas com Roundup WEATHERMAX em um pulverizador de pista, com 0, 100, 200, 400 e 800 ae g/ha e voltaram para a estufa. Todos os tratamentos foram repetidos 5 vezes. As folhas foram colhidas em cinco momentos: imediatamente após a pulverização (tӨ), e em 1, 2, 3 e 4 dias pós o tratamento. Após a colheita, as folhas foram congeladas em gelo seco, pesadas e, em seguida, armazenadas a -80°C até a extração e análise.
[00163] Para a colheita t0, as folhas foram colhidas imediatamente após o tratamento. Para a colheita de 1, 2, 3 e 4 dias, as plantas foram lavadas com água de uma mangueira de pulverização e, em seguida, secas antes da colheita. Esse procedimento permitiu a medição da concentração de ácido chiquímico, bem como uma estimativa da concentração de tratamento de glifosato (tӨ) e a quantidade de glifosato absorvido e retido nas folhas tratadas (1, 2, 3 e 4 dias após o tratamento).
Extração de ácido chiquímico:
[00164] O tecido foliar foi congelado em terra em gelo seco para um pó congelado. As amostras foliares T0 interias foram extraídas diretamente em seus tubos de amostra de 50 mL em 20 mL de 0,25 N de HCI usando um Polytron. Os tubos de 50 mL foram centrifugados a 9.500 rpm e 2 mL do sobrenadante foi filtrado por um filtro de 0,45 micron. Para a análise de ácido chiquímico, 100 µL do filtrado foram usados. As amostras de 1, 2, 3 e 4 dias foram subamostradas, pela transferência de cerca de 100 mg de pó congelado em tubos de 1,8 mL tarada Sarstedt e pela adição de 900 µL de 0,25 N de HCI. Um chip de aço inoxidável foi adicionado em cada amostra e os tubos foram extraídos por agitação em um agitador de tinta Harbill por 3 minutos. Os tubos foram centrifugados a 14.000 rpm e 100 µL do sobrenadante foi utilizado para análise de ácido chiquímico.
Análise de extrato:
[00165] Para a análise, todas as amostras do extrato foram diluídas 1:10 pela adição de 100 µL do sobrenadante ou filtrado da amostra a 900 μL de 0,1% de ácido fórmico em um frasco de amostrador automático HPLC. Um padrão interno (100mL, 238 mg/mL de glifosato de N-metil) foi adicionado a cada uma das amostras diluídas. Todos os padrões de calibração foram preparados de maneira semelhante.
[00166] A análise do extrato foi realizada utilizando a detecção HPLC/MS e HPLC/UV (210 nm). Dois ou dez μL de volumes dos extratos diluídos foram injetados em um sistema Waters ZMD HPLC/MS equipado com uma coluna ODS2 4,6 mm x 250 mm Spherisorb Waters ® de 5 microns (P/N PSS831915). O ácido chiquímico também foi analisado em um sistema separado Agilent 1100 HPLC equipado com uma coluna ODS2 4,6 mm x 250 mm Spherisorb Waters ® de cinco microns (P/N PSS831915) usando um detector de arranjo de diodos.
[00167] Os resultados são mostrados na fig. 5. Como tem sido claramente demonstrado, o ácido chiquímico acumula significativamente elevados níveis de alfafa ao longo do tempo após o tratamento com glifosato. Além disso, a taxa de acúmulo de ácido chiquímico está relacionada à taxa de glifosato aplicado.
[00168] O ácido chiquímico produzido e extraído pelo método acima é purificado e o produto final é usado como matéria-prima na produção de um inibidor da neuraminidase usando métodos conhecidos na técnica.
Exemplo 2: Aplicação, colheita e extração de ácido chiquímico da soja:
[00169] As plantas da soja foram criadas em uma estufa em vasos de 4 polegadas e tratadas com glifosato na fase inicial vegetativa. Cerca de 1 planta por vaso foi tratada na fase de crescimento V2. As plantas foram tratadas com Roundup WEATHERMAX em um pulverizador de pista, com 0, 100, 200, 400 e 800 ae g/ha e voltaram para a estufa. Todos os tratamentos foram repetidos 5 vezes. As folhas foram colhidas em cinco momentos: imediatamente após a pulverização (tӨ), e em 1, 2, 3 e 4 dias pós o tratamento. Após a colheita, as folhas foram congeladas em gelo seco, pesadas e, em seguida, armazenadas a -80°C até a extração e análise.
[00170] Para a colheita t0, as folhas foram colhidas imediatamente após o tratamento. Para a colheita de 1, 2, 3 e 4 dias, as plantas foram lavadas com água de uma mangueira de pulverização e, em seguida, secas antes da colheita. Esse procedimento permitiu a medição da concentração de ácido chiquímico, bem como uma estimativa da concentração de tratamento de glifosato (tӨ) e a quantidade de glifosato absorvido e retido nas folhas tratadas (1, 2, 3 e 4 dias após o tratamento).
Extração de ácido chiquímico:
[00171] O tecido foliar foi congelad em terra em gelo seco para um pó congelado. As amostras foliares T0 inteiras foram extraídas diretamente em seus tubos de amostra de 50 mL em 20 mL de 0,25 N de HCI usando um Polytron. Os tubos de 50 mL foram centrifugados a 9.500 rpm e 2 mL do sobrenadante foi filtrado por um filtro de 0,45 micron. Para a análise de ácido chiquímico, 100 µL do filtrado foram usados. As amostras de 1, 2, 3 e 4 dias foram subamostradas, pela transferência de cerca de 100 mg de pó congelado em tubos de 1,8 mL tarada Sarstedt e pela adição de 900 µL de 0,25 N de HCI. Um chip de aço inoxidável foi adicionado em cada amostra e os tubos foram extraídos por agitação em um agitador de tinta Harbill por 3 minutos. Os tubos foram centrifugados a 14.000 rpm e 100 µL do sobrenadante foi utilizado para análise de ácido chiquímico.
Análise de extrato:
[00172] Para a análise, todas as amostras do extrato foram diluídas 1:10 pela adição de 100 µL do sobrenadante ou filtrado da amostra a 900 μL de 0,1% de ácido fórmico em um frasco de amostrador automático HPLC. Um padrão interno (100mL, 238 mg/mL de glifosato de N-metil) foi adicionado a cada uma das amostras diluídas. Todos os padrões de calibração foram preparados de maneira semelhante.
[00173] A análise do extrato foi realizada utilizando a detecção HPLC/MS e HPLC/UV (210 nm). Dois ou dez μL de volumes dos extratos diluídos foram injetados em um sistema Waters ZMD HPLC/MS equipado com uma coluna ODS2 4,6 mm x 250 mm Spherisorb Waters ® de 5 microns (P/N PSS831915). O ácido chiquímico também foi analisado em um sistema separado Agilent 1100 HPLC equipado com uma coluna ODS2 4,6 mm x 250 mm Spherisorb Waters ® de cinco microns (P/N PSS831915) usando um detector de arranjo de diodos.
[00174] Os resultados deste experimento são mostrados na fig. 6. Como tem sido claramente demonstrado, o ácido chiquímico acumula significativamente elevados níveis de soja ao longo do tempo após o tratamento com glifosato. Além disso, a taxa de acúmulo de ácido chiquímico está relacionada à taxa de glifosato aplicado.
Exemplo 3: Rendimento de ácido chiquímico de diversas espécies de plantas
[00175] As espécies vegetais, incluindo soja, alfafa, trigo, azevém, azevém perene, girassol, e beterraba foram avaliadas para determinar o rendimento de ácido chiquímico resultante do tratamento com o herbicida Roundup.
[00176] As plantas foram tratadas com Roundup WEATHERMAX em um pulverizador de pista, com 800 ae g/ha e voltaram para a estufa. Todos os tratamentos foram repetidos 5 vezes. As folhas foram co-Ihidas em três dias após o tratamento. Após a colheita, as folhas foram congeladas em gelo seco, pesadas e, em seguida, armazenadas a -80°C até a extração e análise.
Extração de ácido chiquímico:
[00177] O tecido foliar foi congelado em terra em gelo seco para um pó congelado. O pó congelado foi armazenado em tubos de amostra para posterior subamostragem e extração. Aproximadamente 100 mg de pó congelado foram pesados em tubos de 1,8 mL tarada Sarstedt e extraídos em 900 µL de 0,25 N HCI. Um chip de aço inoxidável foi adicionado em cada amostra e os tubos foram extraídos por agitação em um agitador de tinta Harbill por 3 minutos. Os tubos foram centrifugados a 14.000 rpm e o sobrenadante foi utilizado para análise de HPLC.
Análise de extrato:
[00178] Para a análise, todas as amostras do extrato foram diluídas 1:10 pela remoção de 100 μL do sobrenadante ou filtrado da amostra a 900 μL de 0,1% de ácido fórmico em um frasco de amostrador automático HPLC. Um padrão interno (100mL, 238 mg/mL de glifosato de N-metil) foi adicionado a cada uma das amostras diluídas. Todos os padrões de calibração foram preparados de maneira semelhante.
[00179] A análise do extrato foi realizada utilizando a detecção HPLC/MS e HPLC/UV (210 nm). Dois ou dez µL de volumes dos extratos diluídos foram injetados em um sistema Waters ZMD HPLC/MS equipado com uma coluna ODS2 4,6 mm x 250 mm Spherisorb Waters ® de 5 microns (P/N PSS831915). O ácido chiquímico também foi analisado em um sistema separado Agilent 1100 HPLC equipado com uma coluna ODS2 4,6 mm x 250 mm Spherisorb Waters ® de cinco microns (P/N PSS831915) usando um detector de arranjo de diodos. Os resultados deste experimento são apresentados na Tabela 1 abaixo:
Tabela 1. Acúmulo de ácido chiquímico (mg/g MF) em folhas de plan-tas pulverizadas com ROUNDUP WEATHERMAX, colhidas três dias após o tratamento.
Figure img0001
EXEMPLO 4: Rendimento de Ácido Quínico a partir de Várias Espécies de Plantas
[00180] Durante o mesmo experimento descrito no Exemplo 3, as espécies de plantas incluindo soja, alfafa, trigo, azevém, azevém perene, girassol e beterraba foram também avaliadas para determinar o rendimento do ácido quínico. A análise do ácido quínico foi realizada em amostras de extratos de plantas contendo o ácido chiquímico, por meio da metodologia analítica utilizada para a determinação de ácido chiquímico. Os resultados deste experimento são apresentados na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: O acúmulo de ácido quínico (mg/g FW) em folhas de plantas pulverizadas com ROUNDUP WEATHERMAX (sal de potássio), colhidas três dias após um tratamento.
Figure img0002
Figure img0003
[00181] O Método da Fermentação
EXEMPLO 5: Construção de um plasmídeo derivado de pBR322 expressando um gene PHEA não regulado que codifica uma enzima co-rismato mutase-prefenato desidratase que é resistente à inibição por feedback fenilalanina.
[00182] Um gene pheA com três alterações na seqüência de nucle-otídeos foi preparado por síntese de DNA como um fragmento de restrição EcoRI-BamHI (SEQ ID NO: 1). A técnica de síntese de DNA é conhecida na técnica (Khudyakov e Fields 2003).
[00183] As três alterações foram:
  • 1. Uma mutação no promotor na região-10 do promotor pheA, mudando o mesmo para TACTGTA TATAATA (Fig. 7)
  • 2. Uma deleção de 146 pb entre o promotor pheA e o local de ligação de ribossomo (RBS) do gene pheA, removendo a região atenuadora do pheA incluindo o gene de peptídeo líder pheL (Fig. 7)
  • 3. Uma deleção 6 bp de códons abrangendo 304-305-306 do gene pheA, alterando a sequência de aminoácidos da corismato mutase-prefenato desidratase codificada a partir de Ala-303, Thr-304, Gly-305, Gin-306, Gln-307 Ala-GIn-Lys (SEQ ID NO: 2). A sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 1) é alterada a partir de GCG-ACC-GGG-CAA-CAA para GCG-AAA-CAA, a deleção 6 pb é dos nucleotídeos C-CC-GGG sublinhados.
[00184] Todas estas três alterações na sequência de nucleotídeos do gene pheA são conhecidas na técnica (Nelms et al., 1992; Fothe-ringham e Nelms, patente dos Estados Unidos 5.120.837; Fotherin-gham e Nelms, patente européia EP 0 418 840 BL). A mudança de TACTGTA para TATAATA (SEQ ID NO: 4) na região promotora do gene pheA (Fig. 7) aumenta a atividade deste promotor. A remoção da região atenuadora de pheA incluindo o gene de peptídeo líder Phel (Fig. 7) leva a expressão constitutiva do gene pheA, e não mais estão sujeitos a um mecanismo de atenuação da repressão por fenilalanina (Pittard, 1996). As mudanças na sequência de aminoácidos de coris-mato mutase-prefenato desidratase alteradas (SEQ ID NO: 2) resultam na enzima sendo resistente à inibição de feedback por fenilalanina.
[00185] Este fragmento de restrição sintético EcoRI-BamHI, carregando o gene alterado pheA, foi inserido no vetor de clonagem padrão pBR322 (Bolívar et al, 1977; Pouwels et al., 1985; Balbas et al., 1986; Balbas et al., 1988) para produzir um plasmídeo pXT1457. As técnicas de manipulação de moléculas de DNA, incluindo a divagem de moléculas de DNA com enzimas de restrição e ligação de fragmentos de restrição do DNA, são conhecidas na técnica (Sambrook e Russell, 2001; Ausubel et al., 2005). Embora o plasmídeo pBR322 codifique resistência a ampicilina e tetraciclina, a inserção de um fragmento de DNA entre os sítios EcoRI e BamHI do pBR322 rompe o gene de resistência a tetraciclina, e assim pXT1457 codifica resistência apenas a ampicilina.
[00186] Para confirmar que o plasmídeo novo estava funcionando como esperado, a cepa LBB427 de hospedeiro de E. coli K-12 do tipo selvagem foi transformada com o plasmídeo pXT1457. Técnicas para transformar bactérias, incluindo cepas de E. coli, são conhecidas na técnica (Sambrook e Russell, 2001; Ausubel et al., 2005). Os níveis de produção de ácido chiquímico e fenilalanina desta cepa foram comparados aos da cepa LBB427 de hospedeiro não transformado. As cepas foram cultivadas em 50 ml de meio de cultura de mínimo de Vogel-Bonner (Vogel e Bonner, 1956), consistindo de por sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgS04-7H20) a 298 miligramas por litro, fosfato de potássio dibásico anidro (K2HPO4) com 14,93 gramas por litro, fosfato de sódio e amônio tetrahidratado (NaNH4HPO4-4H2O) com 5,22 gramas por litro, ácido cítrico anidro (na forma de ácido livre) com 2,73 gramas por litro, e glicose em 2,00 gramas por litro. O pH do meio de cultura foi de 7,0. Para a cepa LBB427 transformada com o plasmídeo pXT1457, a ampicilina foi incluída no meio de cultura a 100 miligramas por litro. As culturas foram crescidas em frascos, em um agitador de incubador operando a 300 rpm e 37 graus Celsius. Ao fim de 24 horas após a inoculação, as células foram peletizadas por centrifugação, e os sobrenadantes de cultura foram analisados por cromatografia líquida de alta de pressão (HPLC) para ensaio de ácido chiquímico e teor de fenilalanina. Para as amostras a serem analisadas, o ácido fosfórico foi adicionado a uma concentração final de 6 milimolar. As amostras foram injetadas em uma coluna de C-18 Bondapak Altec 5 micron de 0,5 centímetro por 200 centímetros, e o eluato foi escaneado de 190 a 300 nanômetros.
[00187] Nestas condições de crescimento, apesar da cepa LBB427 do hospedeiro não transformado não ter produzido níveis detectáveis de fenilalanina no sobrenadante da cultura, a cepa LBB427 do hospedeiro transformada com o plasmídeo pXT1457 produziu fenilalanina no sobrenadante da cultura, em níveis de cerca de 400 mg de fenilalanina por unidade densidade óptica (DO) por de litro.
[00188] Nestas condições de crescimento, a cepa LBB427 do hospedeiro não transformado não produziu níveis detectáveis de ácido chiquímico no sobrenadante da cultura. A cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1457 produziu ácido chiquímico no sobrenadante da cultura, em níveis de cerca de 3 miligramas de ácido chiquímico por unidade de OD por litro.
[00189] Estes resultados confirmaram que a presença do gene pheA alterado no plasmídeo pXT1457 derivado de pBR322 transformado na cepa LBB427 de hospedeiro estava levando a uma desregu-lação do percurso biossintético aromático comum na cepa.
EXEMPLO 6: Construção de um plasmídeo derivado de pSC1OI que expressa um gene pheA não regulado que codifica uma enzima prefe-nato desidratase-corismato mutase que é resistente à inibição de feedback por fenilalanina
[00190] Os plasmídeos derivados de pBR322, tal como o pXT1457 descrito no Exemplo 5, existe em uma célula hospedeira de E. coli em um número de cópias (o número de moléculas de plasmídeo por célula) de cerca de 30; esta determinação do número de cópias é descrita em Bogosian et al., Publicação Internacional No. WO 2007/035323 Al, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Para investigar o efeito do gene pheA alterado quando presentes em um vetor do plasmídeo de número de cópia inferior, um vetor de clonagem derivado de pSCIOI foi construído. O plasmídeo pSCIOI tem um número de cópias de cerca de 15 (Hasunuma e Sekiguchi, 1977), que é intermediário entre o dos plasmídeos número de cópia inferior e dos plasmídeos de número de cópia superior tal como o pBR322 (Armstrong et al., 1984).
[00191] O plasmídeo de partida foi o vetor de clonagem pXT995. O pXT995 de plasmídeo e sua construção estão descrito em Bogosian et al., Publicação Internacional No. WO 2007/035323, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade. O plasmídeo pXT995 é essencialmente o plasmídeo pBR322, com a única diferença de que a origem de derivado de pBR322 de replicação no pXT995 é flanqueada por arranjos de sítios de restrição convenientes. Em uma extremidade da origem de replicação, o arranjo de sítios de restrição inclui um sítio para a enzima Nsil de restrição, e na outra extremidade da origem de replicação, o conjunto de sítios de restrição inclui um sítio para a enzima de restrição SACL. Assim, a origem de replicação no plasmídeo pXT995 pode ser exercida pela digestão do plasmídeo com as enzimas Nsil e Sacl, e substituído com um fragmento de restrição Nsil-SACL carregando uma origem diferente da replicação.
[00192] A origem de replicação do plasmídeo pSCIOI foi amplificada pela reação em cadeia da polimerase como um fragmento de restrição Nsil-SACL, e inserida no plasmídeo pXT995. A técnica de amplificação de segmentos de DNA pela reação em cadeia da polimerase é conhecida na técnica (Sambrook e Russell, 2001; Ausubel et al., 2005). Esta inserção substituiu o fragmento Nsil-SACL no pXT995 (que levou a origem de derivado de pBR322 de replicação), com a origem de derivado de pSCIOI de replicação. O plasmídio resultante foi designado pXT1405. O plasmídeo pXT1405 é, portanto, composta do esqueleto do pBR322, incluindo os genes que codificam resistência à ampicilina e tetraciclina, mas com uma origem de replicação a partir de pSCIOI.
[00193] Este fragmento de restrição EcoRI-BamHI de pXT1457 (descrito no Exemplo 5), que carrega o gene pheA alterado, foi inserido neste novo vetor de clonagem pXT1405 para produzir o plasmídeo pXT1483 (SEQ ID NO: 3). Embora o plasmídeo pXT1405 codifique resistência a ampicilina e tetraciclina, a inserção de um fragmento de DNA entre os sítios EcoRI e BamHI de pXT1405 rompe o gene de resistência a tetraciclina, e assim o pXT1483 codifica resistência apenas à ampicilina.
EXEMPLO 7: Tratamento de cepas com glifosato
[00194] Umas cepa LBB427 de hospedeiro não transformado e a cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1457 foram cultivadas em 50 ml do meio de cultura de mínimo de Vogel-Bonner descrito no Exemplo 5. Para a cepa LBB427 transformada com o plasmídeo pXT1457, a ampicilina foi incluída no meio de cultura a 100 miligramas por litro. As culturas foram cultivadas em frascos, em um gene pheA operando a 300 rpm e 37 graus Celsius. De 2,5 horas após a inoculação, N-(fosfonometil) glicina foi adicionado a uma concentração de 3,38 gramas por litro (20 milimolar). Crescimento das culturas foi quase completamente inibido por esse nível de glifosato. Ao fim de 24 horas após a inoculação (ou seja, 21,5 horas após a adição de N-(fosfonometil) glicina), as células foram peletizadas por centrifugação, e os sobrenadantes de cultura foram analisados quanto ao teor de ácido chiquímico utilizando o ensaio de HPLC descrito no Exemplo 5. Os sobrenadantes da cultura da cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1457 também foram analisadas quanto ao teor de fenilalanina.
[00195] Sob estas condições de tratamento com glifosato, a cepa LBB427 de hospedeiro de acolhimento não transformado não produziu níveis detectáveis de ácido chiquímico no sobrenadante da cultura.
[00196] De acordo com essas mesmas condições de tratamento com glifosato, a cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1457 também não apresentou níveis detectáveis de ácido chiquímico no sobrenadante da cultura. Esta linhagem produziu fenilalanina no sobrenadante da cultura, mas somente em níveis de cerca de 50 miligramas de fenilalanina por unidade OD por litro.
[00197] Estes resultados indicam que a inibição da enzima EPSP sintase pelo glifosato inibiu o crescimento de ambas as cepas transformadas e não transformadas, e reduziu a biossíntese de fenilalanina pela cepa LBB427 transformada com o plasmídeo pXT1457. O fato de ambas as cepas transformadas e não transformadas não produzirem níveis detectáveis de ácido chiquímico indicou que a inibição da enzima EPSP sintase pelo glifosato estava fazendo com que chiquimato-3-fosfato se acumulasse em vez de ácido chiquímico.
EXEMPLO 8: Crescimento de cepas em condições limitantes de fosfato
[00198] Um meio de cultura de fosfato de limitação foi desenvolvido pelo depositante, contendo sulfato de magnésio anidro (MgS04) a 192 mg/L, cloreto de amônio (NH4CI) com 5,35 gramas por litro, cloreto de potássio (KCI) a 3,73 gramas por litro, cloreto de sódio (NaCI) com 1,17 gramas por litro de trietanolamina (um composto tampão) com 22,3 gramas por litro, e glicose a 1,5 gramas por litro. O pH do meio de cultura foi de 7,0. Este meio de cultura não contém qualquer fonte de fosfato. Este meio de cultura foi designado meio de cultura PF (mantido para o meio de cultura sem fosfato). No entanto, um meio limitante de fosfato pode ser formulado para ser utilizado na invenção de tal forma que, embora não seja livre de fosfato, o mesmo contenha quantidades mínimas de fósforo (isto é, seja substancialmente livre de fosfato). Tal meio criará a condições limitantes de fosfato que resultam em um rendimento de ácido chiquímico nos micro-organismos cultivados que é comparável ao rendimento alcançado quando se utiliza um meio livre de fosfato, e que é maior que o rendimento alcançado ao usar um meio típico contendo fosfato, tal como o meio de cultura mínimo de Vogel-Bonner divulgado no Exemplo 5. Geralmente, um meio de limitação de fosfato deve conter fosfato em níveis de não mais que cerca de 1 milimolar, e de preferência em níveis de não mais que cerca de 100 micromolar.
[00199] Para o pré-cultivo das cepas, as fontes de fosfato foram fornecidas a este meio de cultura na forma de casamino ácidos a 2,2 gramas por litro e extrato de levedura em 300 miligramas por litro. Este meio de cultura foi designado o meio de cultura PF-CAA/YE (mantido para o meio de cultura PF mais casamino ácidos e extrato de levedura).
[00200] A cepa de hospedeiro LBB427 não transformado e a cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1457 foram cultivadas inicialmente em 50 ml de meio de cultura PF-CAA/YE. Para a cepa LBB427 transformadas com o plasmídeo pXT1457, a ampicilina foi incluída no meio de cultura a 100 miligramas por litro. As culturas foram cultivadas por 2,5 horas em frascos, em um agitador de incubadora operando a 300 rpm e 37 graus Celsius. As células nessas cultu-ras foram peletizadas por centrifugação e ressuspendidas no mesmo volume do meio de cultura PF. Para a cepa LBB427 transformada com o plasmídeo pXT1457, a ampicilina foi incluída no meio de cultura a 100 miligramas por litro. Ao retornar para o agitador de incubadora, as linhagens apresentaram pouco crescimento adicional, confirmando que elas foram limitadas por fosfato. A pequena quantidade de crescimento adicional que foi observada foi provavelmente devido à transição de pequenas quantidades de fosfato, provavelmente sob a forma de reservas de fosfato no interior das próprias células. Ao fim de 24 horas após a inoculação, as células foram peletizadas por centrifugação, e os sobrenadantes de cultura foram analisados quanto ao teor de ácido chiquímico utilizando o ensaio de HPLC descrito no Exemplo 5. Os sobrenadantes de cultura da cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1457 também foram analisados quanto ao teor de fenilalanina.
[00201] Nestas condições limitantes de fosfato, as cepas de hospedeiros LBB427 não transformados não produziram níveis detectáveis de ácido chiquímico no sobrenadante da cultura. Nestas mesmas condições de limitação de fosfato, as cepas de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1457 também não apresentaram níveis detectáveis de ácido chiquímico no sobrenadante da cultura. Esta linhagem produziu fenilalanina no sobrenadante da cultura, em níveis de cerca de 500 miligramas de fenilalanina por unidade OD por litro.
[00202] Estes resultados indicam que a limitação de fosfato em cepas transformadas ou não transformadas não leva à produção de ácido chiquímico.
EXEMPLO 9: Crescimento de cepas em condições limitantes de fosfato, combinado com o tratamento com glifosato
[00203] As cepas de hospedeiro LBB427 não transformado e as cepas de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1457 ou com o plasmídeo pΧΤ1483 foram cultivadas inicialmente em 50 ml de meio de cultura PF-CAA/YE descrita no Exemplo 8. Para as cepas de LBB427 transformadas com o plasmídeo pXT1457 ou com o plasmídeo pXT1483, a ampicilina foi incluída no meio de cultura a 100 miligramas por litro. As culturas foram cultivadas por 2,5 horas em frascos, em um agitador de incubadora operando a 300 rpm e 37 graus Celsius. As células nessas culturas foram peletizadas por centrifugação e ressuspendidas no mesmo volume do meio de cultura PF descrito no Exemplo 8. Para as amostras de LBB427 transformadas com o plasmídeo pXT1457 ou com o plasmídeo pXT1483, a ampicilina foi incluída no meio de cultura a 100 miligramas por litro. Para essas culturas ressuspensas, N-(Fosfonometil) glicina foi adicionado a uma concentração de 3,38 gramas por litro (20 milimolar). Ao retornar para o agitador deb incubadora, as linhagens apresentaram pouco crescimento adicional. Ao fim de 24 horas após a inoculação (ou seja, 21,5 horas após a adição de N-(Fosfonometil) glicina), as células foram peletizadas por centrifugação, e os sobrenadantes de cultura foram analisados quanto ao teor de ácido chiquímico utilizando o ensaio de HPLC descrito no Exemplo 5.
[00204] Sob estas condições de tratamento com glifosato e limitação de fosfato, a cepa de hospedeiro LBB427 não transformado produziu ácido chiquímico no sobrenadante da cultura em níveis de cerca de 200 miligramas de ácido chiquímico por unidade OD por litro. A cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1457 produziu ácido chiquímico no sobrenadante da cultura em níveis de cerca de 250 miligramas de ácido chiquímico por unidade OD por litro. A cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1483 produziu ácido chiquímico no sobrenadante da cultura em níveis de cerca de 400 miligramas de ácido chiquímico por unidade OD por litro.
[00205] É possível que nem todo o chiquimato-3-fosfato acumulado nessas células tenha sido convertido em ácido chiquímico e excretado no meio de cultura. Como mencionado acima, foi relatado que chiqui-mato-3-fosfato pode ser convertido em ácido chiquímico, pela diminuição do pH e/ou elevação da temperatura de amostras de cultura (Davis e Mingioli 1953). Uma amostra da cultura de cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1483 (tomada até 24 horas após a inoculação), incluindo as células, foi ajustada para pH 1,0 com ácido sulfúrico e aquecida a 60 graus Celsius por 15 minutos. As células foram peletizadas por centrifugação, e o sobrenadante da cultura foi analisado para teor de ácido chiquímico utilizando o ensaio de HPLC descrito no Exemplo 5. O nível de ácido chiquímico encontrado foi cerca de 600 miligramas por unidade OD por litro.
[00206] Estes resultados indicaram que, com a cepa de hospedeiro LBB427 não transformado, a inibição da enzima EPSP sintase pelo glifosato, combinado com a indução da enzima fosfatase alcalina pela limitação de fosfato, fez a cepa produzir e excretar no meio de cultura quantidades substanciais de ácido chiquímico.
[00207] Estes resultados demonstraram ainda que com a cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1457 ou com o plasmídeo pXT1483, a combinação de desregulação do percurso biossintética aromático comum, a inibição do glifosato da enzima EPSP sintase, e a indução da enzima fosfatase alcalina por limitação de fosfato, fez a cepa produzir e excretar no meio de cultura quantidades ainda maiores de ácido chiquímico. Ácidos chiquímicos adicionais poderão ser recuperados a partir dessas células, diminuindo o pH e elevando a temperatura das amostras de cultura.
[00208] Ainda que não se deseje limitar pela teoria, a maior produção de ácido chiquímico obtidos com a cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1483, em comparação com a cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1457, é possivelmente devido ao número de cópias de plasmídeo pXT1483 inferior. A carga metabólica das células para manter plasmídeos de multicópia é significante (Bentley et al., 1990), e poderia afetar a capacidade da célula para produzir compostos como o ácido chiquímico.
EXEMPLO 10: Produção de ácido chiquímico de uma cultura de fermentação de alta densidade
[00209] A cepa de hospedeiro LBB427 transformado com o plasmídeo pXT1483 pode ser cultivada a altas densidades ópticas em uma cultura de fermentação limitada por fosfato. As fermentações são conduzidas em um meio mínimo quimicamente definido contendo 5,9 gramas de sulfato de amônio anidro ((NH4)2SO4), 1,8 gramas de fosfato de potássio dibásico anidro (K2HPO4), 1,0 gramas de fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4-H2O), 550 miligramas de sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgSO4- 7H2O), 27 miligramas de cloreto férrico hexa-hidratado (FeCI3-6H2O), 0,5 miligramas de sulfato de zinco hepta-hidratado (ZnSO4-7H2O), 0,9 miligramas de cloreto de cobalto hexa-hidratado (CoCI2-6H2O), 0,9 mg de molibdato de sódio di-hidratado (Na2MoO4-2H2O), 1,1 mg de sulfato cúprico penta-hidratado (CUSO4-5H2O), 0,3 miligramas de ácido bórico (H3BO3), e 0,7 miligramas de sulfato de manganês mono-hidratado (MnSO4-H2O) por litro de água. O fermentador é mantido a 37 graus Celsius. O pH é mantido em 7,0 pela adição controlada de hidróxido de amônio (NH4OH) concentrado (cerca de 29%). A glicose é alimentada a uma taxa controlada a partir de uma solução estoque a 50% para manter a concentração de glicose de 0,2%.
[00210] Na presença de excesso de fosfato, tais culturas de fermentação podem ser cultivadas em densidade óptica com excesso de 50 ou até mais. Neste meio de cultura de fermentação limitado por fosfato, o início da inanição de fosfato é evidente quando o crescimento da cultura para em densidades ópticas menores. A adição de uma pequena quantidade adicional de fosfato, alimentado a partir de uma solução estoque de 85% de ácido fosfórico (H3PO4), permitiria o crescimento da cepa em uma maior densidade óptica. Quando a cultura atinge uma densidade óptica de cerca de 20-40, e a inanição de fosfato foi iniciada, N-(fosfonometil) glicina é adicionada a uma concentração final de 3,38 gramas por litro (20 milimolar).
[00211] Doze horas depois da adição de N-(fosfonometil)-glicina, as amostras das culturas de fermentação são levadas para a análise dos níveis de ácido chiquímico. As amostras, incluindo as células, são ajustadas para pH 1,0 com ácido sulfúrico e aquecidas a 60 graus Celsius por 15 minutos. As células são peletizadas por centrifugação, e os sobrenadantes de cultura são analisados quanto ao teor de ácido chiquímico utilizando o ensaio de HPLC descrita no Exemplo 5.
[00212] Em uma densidade óptica de 40, o ácido chiquímico é produzido no sobrenadante da cultura em níveis de cerca de 24 gramas de ácido chiquímico por litro.
EXEMPLO 11: Recuperação e isolamento/purificação de ácido chiquímico do meio de cultura
[00213] O ácido chiquímico foi recuperado do meio de cultura da cepa de hospedeiro LBB427 não transformado e a cepa de hospedeiro LBB427 transformada com o plasmídeo pXT1457 ou com o plasmídeo pXT1483, cultivadas sob condições limitantes de fosfato e tratadas com N-(fosfonometil) glicina, como descrito no Exemplo 9.
[00214] As células nas culturas foram peletizadas por centrifugação. Os sobrenadantes da cultura foram passados por um filtro de 0,2 mi-crômetro, colocadas em um frasco, e maior parte da água foi deixada evaporar. Isto levou à formação de cristais em frascos. Os sobrenadantes da cultura restantes foram descartados, e os cristais foram re-dissolvidos em 10 ml de água destilada. As soluções foram colocadas em um tubo de ensaio, e a maior parte da água foi deixada evaporar. Isto levou à formação de cristais no interior dos tubos de ensaio. Os sobrenadantes foram descartados, e os cristais foram dissolvidos em 5 ml de água destilada. As soluções resultantes foram submetidas à análise utilizando o ensaio de HPLC descrito no Exemplo 5, e todos os ensaios determinaram a presença de ácido chiquímico, com uma pureza superior a 99%.
Recuperação de ácido chiquímico Sistema de avaliação do laboratório
[00215] O seguinte descreve um sistema de avaliação de laboratório para soluções aquosas de processo compreendendo o ácido chiquímico, sais inorgânicos monovalentes e o glifosato fornecidos pelo método de fermentação e método da plantação.
[00216] Para o isolamento do ácido chiquímico preparado pelo método de fermentação, um caldo de fermentação foi centrifugado para remover os restos celulares, seguido por filtração através de um coxim de Celite e um filtro de 0,2 µm. Para o isolamento do ácido chiquímico preparado pelo método da plantação, a solução utilizada foi preparada a partir de plantas de soja que foram cultivadas em estufa de plantas por 21 dias para aproximadamente as fases V2 e V3, depois do que as plantas foram pulverizadas com ROUNDUP WEATHERMAX a 800 g/ha e colhidas três dias depois. Os caules e folhas das plantas foram congelados em gelo seco e armazenados a -800°C por aproximadamente 14 dias até o processamento. A extração da planta foi realizada pela moagem dos caules e folhas em forma de pó e contatando o pó com solução aquosa de HCI 0,1N. A solução resultante da extração vegetal foi isolada a partir do pó por centrifugação seguida de filtração através de um filtro de 0,2 µm. Um coxim de Celite não foi utilizado para processar o extrato da planta.
[00217] As experiências separação de membrana em laboratório foram realizadas utilizando uma configuração mostrada esquematicamente na fig. 8, que permitiu o processamento da solução de ácido chiquímico resultante da rota de fermentação e da solução de ácido chiquímico resultante da rota de extração vegetal. O sistema de avaliação laboratorial incluiu um recipiente de alimentação 401 de solução de ácido chiquímico, duas bombas 402 e 409, uma unidade de separação de membrana 422, e vários equipamentos de controle de processos, incluindo válvulas, indicadores de pressão e controladores de temperatura.
[00218] A primeira bomba 402 foi uma pequena bomba centrífuga que foi usada como uma bomba de reforço. A bomba de reforço 402 serviu a dois propósitos. Primeiramente, a bomba de reforço proporcionou uma corrente de alimentação de ácido chiquímico pressurizada 406 para bomba de alta pressão 409. A bomba de reforço também reciclou uma porção 404 da alimentação de solução de ácido chiquímico que foi removida do recipiente 401 de volta para o recipiente de alimentação. Isto proporcionou a mistura dos conteúdos do recipiente de alimentação 401. O recipiente de alimentação 401 também foi equipado com uma jaqueta externa (não mostrado) que foi usada para manter o conteúdo do recipiente de alimentação a uma dada temperatura inicial.
[00219] A corrente de alimentação de solução de ácido chiquímico pressurizada 406 da bomba de reforço 402 foi pressurizada adicionalmente pela bomba de deslocamento positivo de alta pressão 409 (bomba de diafragma Wanner), que foi capaz de gerar um fluxo de corrente de alimentação de aproximadamente 3,8 litros/min a 6996 kPa. Um acionador de velocidade variável foi instalado no acionador da bomba para permitir o controle da taxa de fluxo de alimentação. A bomba de alta pressão 409 foi usada para enviar uma corrente de alimentação de solução de ácido chiquímico altamente pressurizada 413 na unidade de separação de membrana 422.
[00220] Membranas em escala de bancada em espiral foram testadas no sistema de avaliação laboratorial. A pressão de operação era controlada por uma válvula de borboleta 430 posicionada na saída do que retentado 428 foi retirada da unidade de separação de membrana 422. As pressões de operação variaram de cerca de 1.732 a cerca de 4482 kPa absoluto, enquanto as temperaturas de funcionamento alvo variaram de cerca de 15°C a cerca de 30°C.
[00221] Em todos os experimentos de separação de membrana de laboratório, o retentado 428 foi reciclado para alimentar vaso 401 depois que saiu do alojamento da unidade de separação por membranas 422 no fluxo de reciclagem retentado 450. O retentado passou através de um medidor de fluxo 435 que forneceram para a monitorização da taxá de fluxo retentado. O permeato 441 que sai o alojamento da unidade de separação por membranas 422 também foi aprovado através de um medidor de fluxo 436 que para o monitoramento da taxa de fluxo do permeado.
[00222] O permeado 441 poderia ser desviado para um fluxo de resíduos 443 ou reciclado para alimentar o vaso 401 em fluxo de reciclo de permeado 446, dependendo do tipo de experimento realizado. Durante um experimento de “reciclo”, o retentado e permeado foram reciclados para alimentar cada vaso 401, juntamente com o retentado do permeato para fornecer uma composição de alimentação do licor-mãe durante todo o experimento. Este tipo de experimento foi usado para gerar dados sobre a estabilidade do fluxo de membrana e as características de rejeição. Durante um experimento “concentração de lote", o permeado seria desviado para os resíduos, embora o retentado foi reciclado para o vaso de alimentação 401. Este tipo de experimento permitiu a avaliação do fluxo da membrana e as características de rejeição, e a concentração de componentes, tais como o ácido chiquími-co, sais inorgânicos, e glifosato, na alimentação da solução de ácido chiquímico foi aumentanda.
[00223] A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e espec-trometria de massa foram utilizadas para analisar os fluxos de processos associados com as experiências de separação por membranas. A espectrometria de massa foi utilizada para quantificar as concentrações de ácido chiquímico e N-(fosfonometil) glicina. A coluna HPLC de troca ânionica ASIL Dionex usando uma solução de 10 mM KOH aquoso como fase móvel foi utilizada para quantificar as concentrações de íons inorgânicos monovalentes e polivalentes que incluem, entre outros, cloreto, sulfato, amônio, potássio e ânions de fosfato.
[00224] Um indicador de desempenho conhecido como rejeição de solutos foi calculado para cada um dos componentes da solução de alimentação de ácido chiquímico usando dados da análise de HPLC e espectrometria de massa. A rejeição de solutos foi definida como a diferença entre uma e a razão da concentração de permeado (PB) para um componente para a média do fluxo de processo (Cs) e a concentração do retentado (Cr): 1-Cp/ ((Cs + Cr) /2)..
EXEMPLO 12 - Contato com o ácido chiquímico com uma membrana de nanofiltração para avaliar as características de rejeição da membrana em função do pH
[00225] Este exemplo ilustra experimentos realizados utilizando membranas de nanofiltração em espiral para avaliar o impacto do pH sobre as características de rejeição da membrana para os componentes da solução de alimentação de ácido chiquímico.
[00226] O desempenho de uma membrna de poliamida de nanofiltração com base de película fina com um corte nominal de peso molecular (MWCO) de 250 daltons disponível a partir de GE Osmonics foi avaliado como pH da solução de alimentação de ácido chiquímico variaram de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 5,0 pela adição de hidróxido de amônio. A solução de alimentação de ácido chiquímico foi mantida em cerca de 3,8 litros por minuto, a temperatura de funcionamento foi mantida em cerca de 18°C, e a pressão de operação foi mantida em cerca de 3448 kPa. A concentração de ácido chiquímico na solução de alimentação de ácido chiquímico foi de aproximadamente 1,0% em peso. Cinco condições foram avaliadas em um experimento de modo de reciclagem usando Laboratory Evaluation System acima descrito como o pH foi progressivamente aumentado de 3,1 a 5,0 em incrementos de aproximadamente 0,5 unidades de pH. As amostras foram coletadas em cada situação uma vez que o processo se estabilizou durante trinta minutos. Os resultados são apresentados na Tabela 3.
Tabela 3: Testes experimentais para avaliar o impacto do pH na purificação da solução de ácido chiquímico por contato com uma membrana de nanofiltração de GE Osmonic no Laboratory Evaluation System
Figure img0004
[00227] Como mostrado na Tabela 3, o ácido chiquímico pode ser mais eficientemente separado de glifosato e fenilalanina em um pH de aproximadamente 4,0. Além disso, parece que o ácido chiquímico pode ser mais eficiente separado dos íons monovalentes inorgânicos conforme o pH é aumentado. Embora os dados deste exemplo sejam gerados a partir de um experimento, utilizando uma solução de ácido chiquímico derivado da rota de fermentação, que acredita-se atualmente que o desempenho da membrana é igualmente afetado pelo pH, quando entra em contato com uma solução de ácido chiquímico fornecida pela rota de extração vegetal.
EXEMPLO 13 - Purificação da solução de ácido chiquímico com base na rota de extração vegetal por entrar em contato com um fluxo de solução de alimentação do ácido chiquímico com uma membrana de na-nofiltração
[00228] Este exemplo ilustra experimentos realizados utilizando membranas de nanofiltração em espiral para a purificação de uma solução de ácido chiquímico que foi gerado pelo método da planta.
[00229] Uma membrana de poliamida de nanofiltração com base de película fina com um corte nominal de peso molecular (MWCO) de 250 daltons disponível a partir GE Osmonics foi utilizada no modo de concentração de lotes para purificar uma solução de ácido chiquímico que foi gerado a partir da rota de plantas. A solução de alimentação de ácido chiquímico foi mantida em cerca de 3,8 litros por minuto, a temperatura de funcionamento variou de cerca de 17°C a cerca de 22°C, a pressão de funcionamento foi mantida em cerca de 3448 kPa, e a solução de alimentação de ácido chiquímico foi ajustada e mantida em torno 4,0. A concentração de ácido chiquímico na solução de alimentação de ácido chiquímico no início do experimento foi de aproximadamente 0,1% por peso. Foram coletadas amostras conforme o permeado adicional foi gerado e removido do sistema. Os resultados são apresentados na Tabela 4.
Tabela 4: Purificação da solução de ácido chiquímico da rota de extração vegetal pelo contato com uma membrana de nanofiltração de GE Osmonic no Laboratory Evaluation System
Figure img0005
[00230] Como pode ser visto na Tabela 4, uma solução de ácido chiquímico resultante da rota de extração vegetal pode ser purificada utilizando membranas de nanofiltração para eliminar suficientemente pequenos íons monovalentes inorgânicos e, assim, purificar a solução de ácido chiquímico, que pode então ser transformado em mais uma unidade de operação, tais como a evaporação, para concentrar o ácido chiquímico.
[00231] Todas as composições e/ou métodos e/ou processos e/ou aparelhos divulgados e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da descrição instantânea. Embora as composições e os métodos da presente invenção sejam descritos em termos de modalidades preferidas, ficará evidente para aqueles versados na técnica que as variações podem ser aplicadas para as composições e/ou métodos e/ou aparelhos e/ou processos e nas etapas ou na seqüência das etapas dos métodos descritos aqui, sem se afastar do conceito e âmbito de aplicação da invenção. Mais especificamente, ficará evidente que certos agentes que são quimicamente e/ou fisiologicamente relacionados podem ser substituídos por agentes descritos aqui, enquanto os resultados iguais ou semelhantes serão alcançados. Todas as substituições semelhantes e modificações aparentes para aqueles versados na técnica são consideradas no âmbito e conceito de invenção. Na medida do necessário para permitir e descrever a invenção atual, todas as referências citadas estão aqui incorporadas para referência.
REFERÊNCIAS
[00232] As seguintes referências até o grau em que elas forneçam detalhes exemplares de procedimento ou outros suplementares aqueles estabelecidos neste são especificamente incorporadas neste para referência.
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[00233] Quando introduzindo elementos da presente invenção ou das modalidades preferidas da mesma os artigos "uns", "uns", "os" e "disse" são planejados para significar que existem um ou mais dos elementos. As condições "incluindo", "inclusive" e "ter" são planejados para ser inclusive e significar que pode haver elementos adicionais diferente dos elementos listados.
[00234] Devido ao acima de, será visto que os vários objetos da invenção são alcançados e outros resultados vantajosos atingidos.
[00235] Como várias mudanças podiam ser feitas nas acima de sem partir do âmbito da invenção, é planejado que todos importam contido na descrição acima e mostrada no acompanhar desenhos devem ser interpretados como ilustrativa e não em sensação de um limitar.

Claims (20)

  1. Processo para recuperação de ácido chiquímico de um fluxo de processo aquoso compreendendo ainda glifosato, caracterizado pelo fato de que o processo compreende:
    introduzir o fluxo de processo aquoso em uma unidade de separação de membrana compreendendo pelo menos uma membrana de separação selecionada a partir do grupo consistindo em ultrafiltra-ção, microfiltração, nanofiltração, ou osmose reversa; e
    contactar o fluxo de processo aquoso e a pelo menos uma membrana de separação para formar um retentado e um permeado.
  2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma membrana de separação é seletiva para produzir um retentado enriquecido em ácido chiquímico em relação ao permeado.
  3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma membrana de separação é seletiva para produzir um retentado enriquecido em glifosato em relação ao permeado.
  4. Processo, de acordo com qualquer a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o retentado compreende ácido chiquímico e glifosato e o processo compreende ainda separar ácido chiquímico de glifosato no retentado.
  5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que separar o ácido chiquímico de glifosato no retentado forma uma solução de produto aquoso compreendendo ácido chiquímico e esgotada de glifosato em relação ao retentado.
  6. Processo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que tal separação compreende introduzir o retentado em pelo menos uma zona de troca iônica e contactar o retentado com uma resina de troca iônica nele contida e seletiva para a remoção de glifosato de lá para formar uma solução de produto aquoso compreendendo ácido chiquímico e esgotada de glifosato relativo ao reten-tado.
  7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda diluir o fluxo de processo aquoso durante o contato com pelo menos uma membrana de separação, de tal modo que a unidade de separação de membrana funciona como a unidade de separação de membrana de diafiltração.
  8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que a unidade de separação de membrana compreende uma pluralidade de membranas de separação, a pluralidade de membranas compreendendo uma primeira membrana de separação e uma segunda membrana de separação, em que o processo compreende ainda:
    • (a) introduzir o retentado da primeira membrana de separação no fluxo de processo aquoso;
    • (b) contactar o permeado da primeira membrana de separação com a segunda membrana de separação para formar um segundo retentado e um segundo permeado, em que o segundo retentado é enriquecido em ácido chiquímico com relação ao segundo permeado; e
    • (c) introduzir o segundo retentado no fluxo de processo aquoso.
  9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de membranas de separação compreende ainda uma terceira membrana de separação, em que o processo compreende ainda:
    • (d) contactar o segundo permeado com a terceira membrana de separação para formar um terceiro retentado e um terceiro per-meado, em que o terceiro retentado é enriquecido em ácido chiquímico com relação ao terceiro permeado; e
    • (e) introduzir o terceiro retentado no fluxo de processo aquoso.
  10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das etapas (a) a (e) são conduzidas de forma substancialmente contínua.
  11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma membrana de separação é seletiva para produzir um permeado enriquecido em ácido chiquímico relativo ao retentado.
  12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma membrana de separação é seletiva para produzir um permeado esgotado de ácido glifosato relativo ao retentado.
  13. Processo, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o fluxo de processo aquoso compreende um caldo de fermentação preparado por um processo compreendendo:
    • a) fornecer uma cultura de micro-organismos, em que o micro-organismo é capaz de sintetizar shikimato-3-fosfato; e
    • b) contactar o micro-organismo com glifosato.
  14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que o permeado compreende ácido chiquímico e fenilalanina e o processo compreende ainda separar o ácido chiquímico da fenilalanina no permeado.
  15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que separar o ácido chiquímico de fenilalanina no permeado forma uma solução de produto aquoso compreendendo ácido chiquímico e esgotada de fenilalanina em relação ao permeado.
  16. Processo, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que tal separação compreende introduzir o permeado em pelo menos uma zona de troca iônica e contactar o permeado com uma resina de troca iônica contida nele e seletiva para a remoção de fenilalanina de lá para formar uma solução de produto aquoso compreendendo ácido chiquímico e esgotada de fenilalanina em relação ao permeado.
  17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda diluir o fluxo de processo aquoso durante o contato com pelo menos uma membrana de separação, de tal modo que a unidade de separação de membrana funciona como a unidade de separação de membrana de diafiltração.
  18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado pelo fato de que a unidade de separação de membrana compreende uma pluralidade de membranas de separação, a pluralidade de membranas compreendendo uma primeira membrana de separação e uma segunda membrana de separação, em que o processo compreende ainda:
    • (a) introduzir o permeado da primeira membrana de separação no fluxo de processo aquoso;
    • (b) contactar o retentado da primeira membrana de separação com a segunda membrana de separação para formar um segundo retentado e um segundo permeado, em que o segundo permeado é enriquecido em ácido chiquímico com relação ao segundo retentado; e
    • (c) introduzir o segundo permeado no fluxo de processo aquoso.
  19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de membranas de separação compreende ainda uma terceira membrana de separação, em que o processo compreende ainda:
    • (d) contactar o segundo retentado com a terceira membrana de separação para formar um terceiro retentado e um terceiro permeado, em que o terceiro permeado é enriquecido em ácido chiquími-co com relação ao terceiro permeado; e
    • (e) introduzir o terceiro permeado no fluxo de processo aquoso.
  20. Processo, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das etapas (a) a (e) são conduzidas de forma substancialmente contínua..
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