BRPI0819691A2

BRPI0819691A2 - Aparelho e método para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação

Info

Publication number: BRPI0819691A2
Application number: BRPI0819691-5A
Authority: BR
Inventors: John Corbett
Original assignee: Cobertt Research Pty Ltd.
Priority date: 2007-11-30
Filing date: 2008-11-27
Publication date: 2021-03-16
Also published as: SG10201402188TA; RU2487944C2; CA2697635C; US20100323923A1; CA2697635A1; CN101855365A; JP2011504727A; US9259736B2; WO2009067744A1; RU2010126536A; EP2227559B1; EP2227559A1; EP2227559A4

Abstract

aparelho e método para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação aparelho para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação, o aparelho incluindo uma fonte de radiação para expor o recipiente de radiação à radiação, aquecendo assim a mistura de reação, um sensor de temperatura para medir a temperatura indicativa de uma temperatura de mistura de reação e um controlador para controlar a fonte de radiação de acordo com a temperatura de mistura de reação para assim, seletivamente, aquecer a mistura de reação.

Description

“APARELHO E MÉTODO PARA CONTROLAR A TEMPERATURA DE

UMA MISTURA DE REAÇÃO MANTIDA DENTRO DE UM RECIPIENTE DE REAÇÃO” Campo da Invenção A presente invenção se refere a um aparelho e a um método ' para controlar a temperatura de uma mistura de reação e em particular a - dispositivos de ciclagem térmica para amplificação de ácido nucleico. Entretanto, será apreciado que a invenção não esteja limitada a esse campo particular de uso. Fundamentos da Invenção A referência nessa especificação a qualquer publicação anterior (ou informação derivada dela) ou a qualquer assunto que seja conhecido, não é e não deve ser considerado como um reconhecimento ou admissão ou qualquer forma de sugestão que a publicação anterior (ou informação derivada dela) ou matéria conhecida forma parte do conhecimento | geral comum no campo de tentativa ao qual essa especificação se refere. | PCR é uma técnica que envolve múltiplos ciclos e que resulta na amplificação exponencial de algumas seqiiências polinucleotídeos a cada | vez que um ciclo é completado. A técnica de PCR é bem conhecida e é | 20 descrita em muitos livros, incluindo: PCR: A practical Approach M.J. | MacPherson, et al., IRL Press (1991), PCR Protocols: A guide to Methods and Applications by Innis, et al., Academic Press (1990) e PCR Technology: Principals and Applications for DNA Amplification H. A. Erlich, Stockton Press (1989). PCR é descrito também em muitas patentes americanas, incluindo U.S. 4683 195; 4683 202; 4 800 159; 4 965 188; 4 889 818; 5 075 216; 5 079 352; 5 104 792; 5 023 171; 5 091 310; 5066 584. A técnica PCR envolve geralmente a etapa de desnaturar um polinucleotídeo seguido pela etapa de recozimento pelo menos de um par de oligonucleotídeos iniciadores para o polinucleotídeo desnaturado, i.e.,

hibridizando o iniciador para a matriz polinucleotídeos desnaturada. Depois da etapa de aquecimento, uma enzima com atividade polimerase catalisa a síntese de um novo fio de polinucleotídeo que incorpora o oligonucleotídeo iniciador e usa o polinucleotídeo original desnaturado como uma matriz de síntese, Essa série de etapas (desnaturação, aquecimento de iniciador e ' extensão de iniciador) constitui o ciclo PCR.

- Como os ciclos são repetidos, a quantia de polinucleotídeo sintetizado — aumenta — exponencialmente porque os polinucleotídeos sintetizados recentemente podem servir como matrizes para sínteses nos ciclos subsegientes. Iniciadores oligonucleotídeos são selecionados geralmente aos pares que podem amolecer os fios opostos de uma dada sequência de polinucleotídeo de fio duplo de forma que a região entre os dois lugares amolecidos seja amplificada.

A desnaturação do DNA acontece geralmente em torno de 90 a 95ºC, o aquecimento de um iniciador para o DNA desnaturado é executado geralmente em torno de 40 a 60ºC, e a etapa de aquecimento de extensão com uma polimerase é executada geralmente em torno de 70 a 75ºC. Portanto, | durante um ciclo PCR a temperatura da mistura de reação deve ser variada, e variada muitas vezes durante um experimento de ciclo múltiplo PCR.

A técnica PCR tem uma variedade ampla de aplicações biológicas, incluindo, por exemplo, análise de sequência de DNA, geração de prova, clonagem de sequências de ácido nucleico, metagênese dirigida, detecção de mutações genéticas, diagnoses de infecções virais, impressão digital molecular e o monitoramento de microorganismos contaminadores no —fluidobiológicoe em outras fontes.

Em adição ao PCR, outros procedimentos de amplificação “in vitro” incluindo reações em cadeia de ligase como verificado na Patente Americana US N. 4 988 617 para Landegren e Hood, são conhecidos e amplamente usados na técnica anterior. Mais geralmente ainda, vários métodos importantes conhecidos na técnica da biotecnologia, tal como seqienciamento e hibridização do ácido nucleico, dependem da troca da temperatura das soluções contendo moléculas de amostra de uma forma controlada.

Técnicas convencionais confiam no uso de poços ou tubos — individuais ciclados através de zonas de temperatura diferente.

Por exemplo, ] um número de “cicladores” térmicos usados para a amplificação e . sequenciamento do DNA são verificados na técnica anterior na qual um elemento de temperatura controlada ou “bloqueador” segura uma mistura de reação, e em que a temperatura do bloqueador é variada com o passar do tempo.

Uma vantagem desses dispositivos é que um número relativamente grande de amostras pode ser processado simultaneamente, e.g., 96 placas de poço são empregadas comumente.

Entretanto tais dispositivos sofrem várias desvantagens, caracterizadas pelo fato de que elas são relativamente lentas na | ciclagem das misturas de reação, elas têm energia relativamente intensa para | operar, o controle de temperatura é menor do que o ideal, e a detecção da | mistura de reação in situ é difícil. | Em um esforço para evitar várias dessas desvantagens, foram desenvolvidos outros cicladores térmicos nos quais uma pluralidade de recipientes para conter mistura(s) de reação são apoiados em um carrossel giratório giratoriamente montado dentro de uma câmara adaptada para ser aquecida e resfriada.

Por exemplo, veja a Patente Americana N. 7 081 226 para Wittwer et al.

Entretanto, esses dispositivos ainda sofrem várias desvantagens.

Por exemplo, o controle sobre a temperatura das misturas de reação é menor —doqueo ideal o controle sobre a taxa de aquecimento e resfriamento das misturas de reação é menor do que o ideal, e esses dispositivos têm relativamente uma energia pobre de eficiência.

Portanto, ainda existe uma necessidade de cicladores térmicos para PCR os quais fornecem controle de temperatura melhorado das misturas de reação, não são complexos para usar, e podem fornecer análise em tempo real da reação ocorrendo nos recipientes de amostra, e são eficientes em energia. A presente invenção tenta superar ou melhorar pelo menos —umadas desvantagens da técnica anterior acima mencionada, ou fornecer uma ' alternativa útil.. . Sumário da Invenção Em uma primeira abordagem ampla a presente invenção tenta prover um aparelho para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação, o aparelho incluindo: a) uma fonte de radiação para expor o recipiente de reação à | radiação, aquecendo assim a mistura de reação; b) um sensor de temperatura para medir a temperatura indicativa de uma temperatura de mistura de reação; c) um controlador para controlar a fonte de radiação de acordo com a temperatura da mistura de reação, para assim, seletivamente aquecer a mistura de reação.

Geralmente o aparelho inclui uma fonte de calor para aquecer uma câmara contendo o recipiente de reação.

Geralmente o controlador é para: a) aumentar a temperatura da mistura de reação pelo menos em parte usando a fonte de radiação; e b) manter a temperatura da mistura de reação pelo menos em parte usando a fonte de calor.

O aparelho inclui, geralmente, um equipamento de resfriamento para resfriar a mistura de reação.

Geralmente, o mecanismo de resfriamento é para resfriar a mistura de reação a partir de uma temperatura elevada. Geralmente, o mecanismo de resfriamento supre o ar ambiente para uma câmara que contém o recipiente de reação. Geralmente, o mecanismo de resfriamento supre fluido refrigerado a uma câmara que contém o recipiente de reação. Geralmente o sensor de temperatura é um sensor 5 infravermelho. Geralmente o sensor de temperatura é um sensor óptico para . medir uma cor de um indicador dependente da temperatura na mistura de reação. Geralmente o sensor de temperatura mede a temperatura da mistura de reação.

Geralmente o sensor de temperatura sensoreia uma temperatura de recipiente de reação e em que o controlador é para determinar a temperatura da mistura de reação usando a temperatura do recipiente de reação.

Geralmente o sensor de temperatura sensoreia uma temperatura de câmara e em que o controlador é para determinar a temperatura da mistura de reação, usando a temperatura de câmara.

Geralmente a fonte de radiação gera radiação infravermelha. | Geralmente a fonte de radiação gera radiação óptica.

Geralmente o aparelho inclui uma câmara para receber os recipientes de reação em uso.

Geralmente o aparelho inclui um montador para receber um número de recipientes de reação, a fonte de reação e o montador sendo colocados de forma a permitir o aquecimento de um ou mais dos numerosos — recipientes de reação.

Geralmente o aparelho inclui um acionador para mover a montagem em relação à fonte de radiação.

Geralmente, o controlador é para controlar o acionador para assim, seletivamente, aquecer a mistura de reação nos respectivos recipientes,

dentre os numerosos recipientes de reação.

Geralmente a fonte de radiação expõe uma zona de aquecimento para radiação e em que o controlador controla o aquecimento da mistura de reação expondo seletivamente o recipiente de reação à zona de — aquecimento. Geralmente o controlador é um sistema de processamento. . Geralmente o controlador é para: a) aumentar a temperatura da mistura de reação para um primeiro valor de temperatura para desnaturar polinucleotídeos na mistura de reação; | b) diminuir a temperatura da mistura de reação para um segundo valor de temperatura para aquecer polinucleotídeos na mistura de reação; e, c) aumentar a temperatura da mistura de reação para um terceiro valor de temperatura para hibridizar os polinucleotídeos desnaturados. Geralmente o controlador é para: a) determinar a temperatura da mistura de reação usando sinais recebidos do sensor de temperatura; e b) controlar a fonte de radiação baseado na temperatura da mistura de reação a ser controlada. Geralmente o controlador é para: a) controlar a fonte de radiação para aumentar a temperatura da mistura de reação para o primeiro valor de temperatura.

b) controlar a fonte de calor para manter a temperatura da mistura de reação no primeiro valor de temperatura; c) controlar um mecanismo de resfriamento para assim diminuir e manter a temperatura da mistura de reação na segunda temperatura; e d) controlar a fonte de radiação para assim aumentar a temperatura da mistura de reação para o terceiro valor de temperatura; e e) controlar a fonte de calor para manter a temperatura da mistura de reação no terceiro valor de temperatura.

Geralmente a fonte de radiação é adaptada para gerar seletivamente uma zona de aquecimento predeterminada e em que o aparelho . inclua um orifício de suprimento de fluido refrigerante adaptado para gerar seletivamente uma zona de resfriamento predeterminada, em que a zona de aquecimento predeterminada e a zona de resfriamento predeterminada são — geradas substancialmente adjacentes aos orifícios de suprimento do aquecedor e refrigerador respectivamente, tal que a temperatura da mistura da reação seja controlável pela exposição seletiva do recipiente de reação à zona de aquecimento e/ou à zona de resfriamento.

Geralmente, o recipiente de reação é pelo menos parcialmente transmissivo à radiação.

Geralmente a radiação tem um comprimento de onda selecionado de acordo com pelo menos uma das propriedades do recipiente de reação e das propriedades da mistura de reação.

Em uma segunda forma de abordagem a presente invenção trata de fornecer um método para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação, o método incluindo, em um controlador, a) determinar uma temperatura de mistura de reação usando sinais recebidos de um sensor de temperatura; e b) controlar a fonte de radiação, a fonte de radiação sendo para expor o recipiente de radiação à radiação, aquecendo assim a mistura de reação; a fonte de radiação sendo controlada baseada na temperatura da mistura de reação, permitindo assim que a temperatura da mistura de reação seja controlada.

Em uma terceira forma de abordagem a presente invenção trata de fornecer um aparelho para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação, o aparelho incluindo: i) um aquecedor para gerar seletivamente uma zona de aquecimento predeterminada e um orifício de suprimento de resfriamento adaptada para gerar seletivamente uma zona de resfriamento predeterminada, - em que a zona de aquecimento predeterminada e a zona de resfriamento predeterminada são geradas substancialmente adjacentes ao aquecedor e o orifício de suprimento de resfriamento, respectivamente, tal que a temperatura da mistura de reação é controlável pela exposição seletiva do recipiente de reação à zona de aquecimento e/ou à zona de resfriamento.

Geralmente o aquecedor é um ou mais dos emissores de IV.

Geralmente o orifício de suprimento de refrigerante inclui uma pluralidade de aberturas dispostas adjacentes ao aquecedor e em que o refrigerante é o ar ambiente.

Geralmente uma pluralidade de recipientes de reação é provida em um arranjo.

Geralmente a temperatura da mistura de reação é controlável pela exposição seletiva do recipiente de reação para a zona de aquecimento ou para a zona de resfriamento, de acordo com um perfil térmico predeterminado.

Geralmente o perfil térmico predeterminado é adaptado para ampliação do ácido nucleico.

Geralmente a zona de aquecimento e a zona de resfriamento — são substancialmente coincidentes.

Em uma quarta forma de abordagem a presente invenção tenta fornecer um método para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação, o método incluindo as etapas de: i) fomecer um aquecedor adaptado para gerar seletivamente uma zona de aquecimento predeterminada; e ii) fornecer um orifício de suprimento de refrigerante adaptado para gerar seletivamente uma zona de resfriamento predeterminada; ij) em que a zona de aquecimento predeterminada e a zona de resfriamento predeterminada são geradas substancialmente adjacentes ao aquecedor e do orifício de suprimento de refrigerante, respectivamente; e - iv) controlar a temperatura da mistura de reação pela exposição seletiva do recipiente de reação à zona de aquecimento e/ou à zona de resfriamento.

Em uma quinta forma de abordagem a presente invenção tenta fornecer um método para controlar a temperatura de uma mistura de reação | mantida dentro de um recipiente de reação, o método incluindo as etapas de: i) Expor seletivamente o recipiente de reação a um a zona de aquecimento — predeterminada e/ou a uma zona de resfriamento ' —predeterminada, em que a zona de aquecimento predeterminada e a zona de resfriamento predeterminada são geradas substancialmente adjacentes a um aquecedor e a um orifício de suprimento de refrigerante, respectivamente.

Será apreciado que as formas de abordagem da presente invenção possam ser usadas individualmente ou em combinação, e devem ser usadas para controlar temperatura em uma faixa de aplicações diferentes, incluindo, mas não limitando a ampliações de ácido nucleico.

Breve Descrição dos Desenhos Será agora descrita uma configuração preferida da invenção, apenas a título de exemplo, com referência aos desenhos anexos, nos quais: Figura 1 é um diagrama esquemático de um aparelho para controlar a temperatura de uma mistura de reação: Figura 2 é um fluxograma de um exemplo de um processo para controlar a temperatura de uma mistura de reação usando o aparelho da Figura 1;

Figura 3 A é uma vista lateral esquemática de um segundo exemplo de aparelho para controlar a temperatura de uma mistura de reação; Figura 3 B é uma vista plana esquemática de parte do aparelho da Figura 3B; (acho que deveria ser 3 A) Figura 4 é um diagrama esquemático de um exemplo de um controlador.

- Figura 5 é uma vista de topo em perspectiva de um terceiro exemplo de aparelho para controlar a temperatura de uma mistura de reação, mostrando um carrossel giratório suportando uma pluralidade de recipientes —dereação posicionados sobre um aquecedor IV mostrado na Figura 1; Figura 6 é uma vista de topo em perspectiva de um carrossel giratório e de um aquecedor IV mostrado na Figura 1.

Figura 7 é uma vista de topo em perspectiva de um exemplo de uma placa de base tendo o arranjo de aquecedor/refletor IV e as orifícios de resfriamento; Figura 8 é uma vista fechada de uma porção da Figura 7 mostrando um sensor de temperatura sem contato disposto adjacente ao aquecedor/refletor IV; Figura 9 mostra o aparelho como mostrado na Figura 7 —dispostoem um alojamento; Figura 10 é uma vista semelhante à Figura 8 e mostrando também os recipientes de reação; | Figura 11 é uma vista semelhante à Figura 5; e Figura 12 é um diagrama esquemático de um exemplo dos — componentes do aparelho para controlar a temperatura de uma mistura de reação. Configurações Preferidas da Invenção Agora, serão feitas referencias aos desenhos em que os numerais de referencia semelhantes se referem a partes semelhantes.

Um exemplo de aparelho para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação, será agora descrito com referencias à Figura 1. Nesse exemplo, o aparelho 100 inclui uma câmara 101 S — contendo uma fonte de radiação 110 para expor um recipiente de reação 121 à radiação, aquecendo assim uma mistura de reação 120 fornecida aqui.

A fonte . de radiação pode ser qualquer forma adequada de fonte de radiação, mas é geralmente na forma de um aquecedor infravermelho para gerar radiação infravermelha.

Entretanto, em outros exemplos, um ou mais lasers, diodo emissor de luz (LEDs), ou semelhante, podem ser usados para gerar radiação óptica ou infravermelha.

As radiações podem ser usadas para aquecer os recipientes de reações, os quais por sua vez aquecem a mistura de reação. | Alternativamente, a radiação pode aquecer um ou mais | componentes diretamente na mistura de reação, por exemplo, se os recipientes de reação estão pelo menos parcialmente transmissivos à radiação.

Nessa abordagem será apreciado que o comprimento da onda da radiação pode ser selecionado de acordo com pelo menos uma das propriedades do recipiente de reação e propriedades da mistura de reação.

Portanto, as propriedades do recipiente de reação, tal como a espessura e o material usados no recipiente, | — como também as propriedades de mistura de reação, tal como os constituintes da mistura, podem ser usados para selecionar um comprimento de onda de radiação de forma que pelo menos alguma radiação passe através do recipiente de reação e seja absorvida pela mistura de reação.

Será apreciado, entretanto, que, como uma alternativa as propriedades do recipiente de reação, e/ou as propriedades de mistura de reação possam ser selecionadas dependendo do comprimento da onda da radiação gerada pela fonte de radiação.

O recipiente de reação pode ser provido em um arranjo acoplado a um mecanismo acionador permitindo que múltiplos recipientes a serem movidos em relação à fonte de radiação, permitindo que os recipientes de reação a serem seletivamente e/ ou periodicamente expostos à radiação. Isso pode ser usado para ajudar a controlar o processo de reação, como também permitir misturas de reação a serem processadas simultaneamente.

Um sensor de temperatura 130 é posicionado na câmara 101 para medir uma temperatura indicativa de uma temperatura de mistura de , reação. A medição de temperatura pode ser executada de qualquer maneira adequada, incluindo o uso de um sensor infravermelho, tal como um sensor termo pilha. Alternativamente, a mistura de reação pode conter um indicador, tal como um corante ou outro colorante que tenha uma temperatura | dependente da cor, permitindo que a temperatura seja sentida usando-se um sensor óptico. Ainda que a temperatura da mistura de reação possa ser determinada diretamente, uma alternativa adicional é para detectar a | temperatura do recipiente de reação 121. A temperatura do ar dentro da câmara 101 poderia também ou alternativamente ser detectada, permitindo que a temperatura da mistura a ser liberada daí, por exemplo usando um | algoritmo adequado. Um controlador 140 é provido acoplado ao sensor de temperatura 130 e a fonte de radiação 110. Em uso o controlador 140 determina a temperatura de mistura de reação usando sinais recebidos do sensor de temperatura 130. O controlador 140 controla a fonte de radiação 110 baseada na temperatura de mistura de radiação, permitindo que a temperatura de mistura de reação seja controlada. Portanto, isso permite ao controlador 140 controlar a ciclagem térmica da mistura de reação, por — exemplo, para uso em um processo de amplificação de acido nucleico tal como PCR. O controlador 140 é, portanto, adaptado para monitorar sinais do sensor de temperatura 130, e controlar a fonte de radiação 110. Adequadamente, o controlador pode ser qualquer forma adequada de controlador, tal como um sistema de processamento adequadamente programado, FPGA (Field Programmable Gate Away) ou similar. Em um exemplo, uma fonte de calor adicional, tal como um aquecedor de transmissão 150, pode ser usado para aquecer a câmara 101 para ajudar a aumentar e/ou manter a temperatura de mistura de reação. O f aquecedor de transmissão 150 é geralmente controlado pelo controlador 140 . baseado na temperatura de mistura das reações de uma temperatura da câmera

101. Em um exemplo, o resfriamento pode ser provido também por um mecanismo de resfriamento 160. Isso pode usar o ar ambiente, ou um refrigerante, para resfriar diretamente tanto o recipiente de reação ou uma temperatura de câmera, para aumentar a taxa de qualquer resfriamento executado durante o processo de controle de temperatura.

Em um exemplo, o uso da fonte de radiação para expor os — recipientes de reação para assim aquecer o recipiente de reação ou mistura de reação diretamente evita a necessidade de aquecer a câmara inteira 101. Isso pode também reduzir a quantia de energia exigida para alcançar as temperaturas de mistura de reação usadas na execução de tais processos, reduzindo assim o total de exigências de energia dos aparelhos.

Em alguns exemplos, uma fonte de calor adicional, tal como um aquecedor de transmissão 150, pode ser usado para aquecer a câmera 101 para ajudar a manter a estabilidade de temperatura de reação exigida, permitindo ainda uma maior estabilidade de temperatura de mistura de reação a ser alcançada.

O uso de um mecanismo de resfriamento 160 pode ajudar também em reduzir adicionalmente o tempo do ciclo de temperatura.

Em um exemplo, a medição de temperatura pode também ser executada no recipiente de reação ou diretamente na mistura de reação. Isso provê uma maior exatidão na determinação da temperatura da mistura de reação que pode ocorrer, por exemplo, quando medindo a temperatura do ar na câmara.

Isso aumenta a exatidão com a qual a temperatura da mistura de reação pode ser controlada, a qual em troca ajuda a maximizar a efetividade do processo de amplificação, permitindo ainda a necessidade para — implementar computacionalmente caros algoritmos para derivar a temperatura | da mistura de reação da temperatura de ar da câmara. . Um exemplo do ciclo de controle da temperatura será descrito agora com referencia a Figura 2. Nesse exemplo, na etapa 200, o controlador 140 ativa a fonte de radiação 110, e monitora a temperatura da mistura de reação usando o sensor de temperatura 130. Na etapa 210 é determinado se a mistura da reação | alcançou uma primeira temperatura, geralmente em torno e 90º a 95ºC, e se | não, o processo continua até a etapa 200. | Uma vez que a primeira temperatura é alcançada na etapa 220, o controlador 140 controla o processo de aquecimento para manter a mistura de reação na primeira temperatura para um primeiro período de tempo exigido, tal como por 20-30 segundos, permitindo assim que ocorra a desnaturação do DNA.

Será apreciado que períodos de tempo mais longos possam ser usados para o primeiro ciclo de reações de PCR de início quente, tal como de 1-9 minutos.

O período de tempo pode ser pré-programado baseado na reação PCR sendo executada, ou pode ser detectado pela medição óptica de um indicador na mistura de reação.

A mistura de reação pode ser mantida usando-se qualquer técnica adequada.

Portanto, em um exemplo, o controlador 140 pode controlar a quantia de radiação gerada pela fonte de radiação 110. Adicional ou alternativamente, uma fonte de calor 150, tal como um aquecedor de transmissão, pode ser usado.

Uma vez que a etapa de desnaturação tenha sido completada, a temperatura da mistura da reação é resfriada para um segundo valor de temperatura, geralmente 40ºC a 60ºC.

O processo de resfriamento envolve ter o controlador 140 desativar a fonte de radiação 110 e/ou aquecedor de transmissão 150 na etapa 230, permitindo que a mistura de reação esfrie, com o controlador 140 monitorando a temperatura da mistura de reação usando o | S — sensor de temperatura 130. Um mecanismo de resfriamento 160 pode ser | usado também para acelerar o processo de resfriamento.

Na etapa 240 é . determinado se a mistura de reação alcançou a segunda temperatura, e se o processo de resfriamento continua na etapa 230. | Uma vez que a segunda temperatura é alcançada na etapa 250, o controlador 140 controla a fonte de radiação 110 para manter a mistura de | radiação na segunda temperatura por um segundo período de tempo exigido, | geralmente 20-40 segundos, permitindo assim o aquecimento do DNA para ocorrer um iniciador.

Novamente a mistura de reação pode ser mantida na temperatura exigida usando qualquer técnica adequada, e o período de tempo | 15 — pode ser pré-programado ou detectado. | Seguindo isso, a temperatura da mistura de reação é aquecida | | para um terceiro valor de temperatura tendo o controlador 140 ativado a fonte de radiação 110, e monitora a temperatura da mistura de reação usando o | sensor de temperatura 130 na etapa 260. Na etapa 270 é determinado se a | 20 mistura de reação alcançou a terceira temperatura, geralmente em torno de | 7O0ºC a 75ºC, e se não o processo de aquecimento continua na etapa 260. Uma vez que a terceira temperatura é alcançada, na etapa 280, o controlador 140 mantém a mistura de reação na terceira temperatura por um terceiro período de tempo executando assim o alongamento do DNA.

O terceiro período de — tempo dependerá dos fatores tais como a polimerase do DNA usada e ode ser novamente detectado ou pré-programado.

Será apreciado que isso é um exemplo de um simples ciclo, e que na prática, numerosos ciclos e etapas de manutenção final e opcional seriam usadas para executar um PCR ou outro processo de amplificação.

Um exemplo de aparelho para controlar temperatura de um processo de reação será descrito agora com referencia à Figura 3.

Nesse exemplo, o aparelho 300 inclui um corpo 310 e uma | cobertura 312, definindo uma câmara 311. A câmara 311 inclui uma —montagem 320, para receber um carrossel 321. O carrossel 321 inclui : numerosas aberturas 322 para receber recipientes de reação 323, contendo a . mistura de reação.

A montagem 320 é acoplada ao eixo 330, o qual é montado rotativamente em um mancal 331. Um motor acionador 332 é acoplado ao eixo 331, por exemplo, por uma correia acionadora 324, permitindo que o carrossel 321 seja girado dentro da câmara 311. É provida uma parede 313 que se estende pela câmara 311 para separar o motor acionador 332 e o mancal 331 do carrossel 321. A parede 313 inclui geralmente uma abertura que tem uma malha 314 permitindo que o ar flua através da malha 314.

A câmara 311 inclui uma fonte de radiação na forma de um aquecedor IV 340 montado geralmente na parede 313. Em um exemplo, o aquecedor 340 inclui um depósito 341 e um condutor 342. Em uso, uma corrente que passa através do condutor 342 causa aquecimento do condutor 342, o qual em troca gera radiação infravermelha que é emitida a partir da — superfície do condutor 342. O depósito em seguida reflete a radiação de forma que a radiação se encontra no recipiente de radiação 323.

Nesse exemplo, um sensor óptico 350 é provido também montado na parede 313, para sentir o status da reação baseado na cor de um indicador na mistura da reação. O sensor óptico 350 pode incluir uma fonte de iluminação, tal como um laser, e um detector óptico correspondente para detectar a iluminação refletida.

Como mostrado na Figura 3B, devido ao posicionamento do sensor óptico, em um exemplo, o aquecedor IV 330 pode se estender em torno apenas de parte do perímetro do carrossel 321, permitindo que a linha de visão seja mantida entre o sensor óptico 330 para se estender em torno de todo o perímetro do carrossel 321.

Tendo o aquecedor 330 se estendido apenas parcialmente em torno do perímetro do carrossel 321 pode acarretar algumas vantagens. Por — exemplo, isso provê aquecimento sobre apenas uma porção do perímetro do carrossel 321 permite aos recipientes de reação serem aquecidos por apenas . parte da rotação do carrossel 321, o que pode ajudar na estabilização da temperatura. Entretanto, em outros exemplos, mais aquecimento pode ser conseguido usando-se um aquecedor que se estende em torno de todo o carrossel 321.

Em um exemplo, o sensor óptico 350 atua como um sensor de temperatura detectando a cor do agente indicador sensitivo de temperatura na mistura de reação. Uma temperatura dependente do indicador pode alternativamente ser incorporada no recipiente de reação, por exemplo, 15º usando-se um material dependente de temperatura aplicado aí. Ou atualmente ' incorporado ao material de recipiente de reação. Será apreciado que, usando- se o sensor óptico, a mistura de reação ou a temperatura do recipiente de reação evite a necessidade de um sensor adicional. Isso reduz a complexidade e o custo geral do aparelho.

Alternativamente, um sensor de temperatura adicional pode ser provido, por exemplo, como mostrado em 360. Isso pode ser na forma de um sensor IV, em cujo caso o sensor IV é posicionado para detectar a temperatura da câmara de reação ou diretamente da mistura, o que pode reduzir a efetividade do controle de temperatura.

A câmara 311 inclui uma ventoinha 371 para permitir que o ar ambiente de fora entre na câmara 311 para ser circulado através da câmara

311. Em um exemplo, uma fonte de calor 372 também pode ser provida para aquecer o ar ambiente antes da entrada do ar na câmara, para assim prover aquecimento convectivo da câmara de reação.

Será apreciado que o aparelho irá geralmente incluir um controlador, um exemplo do qual será descrito agora com referencia à Figura

4. Nesse exemplo, o controlador 400 inclui um processador 410, uma memória 411, um dispositivo de entrada e saída 412, tal que como um teclado e mostrador, e uma interface 413, acoplados juntos, via um orifício | . 414. A interface 413 pode ser provida para permitir ao controlador 400 ser acoplado a qualquer um ou mais aquecedor 330 o acionador 332, os sensores 350, 360, a ventoinha 371 e a fonte de calor 372. A interface pode incluir também uma interface externa usada para fazer conexão com os dispositivos periféricos externos, tais como um scanner de código de barras, um sistema de computador, ou similar. Adequadamente será apreciado que o controlador 400 possa ser formado a partir de qualquer sistema de processamento adequado, FPGA, ou similar.

Em uso, o processador 410 geralmente executa instruções, tais como instruções do software armazenadas na memória 411, para determinar um processo cíclico térmico a ser executado. Isso pode ser conseguido acessando os perfis térmicos pré- estabelecidos armazenados na memória 411 e/ou através do uso de comandos de entrada supridos através do dispositivo de entrada.

O processador 410 gera em seguida sinais de controle para controlar a operação do aquecedor 330, o acionador 332, e opcionalmente a ventoinha 371 ou a fonte de calor 372, para iniciar um processo de ciclagem térmico. Durante esse processo, o processador 410 recebe sinais de um ou — mais sensores 350, 360, e usa isso para determinar a temperatura da mistura de reação, geralmente usando informação armazenada na memória 411 para interpretar os sinais. O processador 410 pode também determinar um status de reação, por exemplo, usando sinais determinados a partir do sensor óptico

350.

O processador 410 usa a temperatura de mistura de reação e opcionalmente o status de reação como feedback para controlar a operação do aquecedor 330, do acionador 332, e opcionalmente da ventoinha 371 ou da fonte de calor 372, permitindo assim que um processo de ciclagem térmico —sejaimplementado substancialmente como descrito acima em relação à Figura

2.

- Um aparelho de exemplo adicional será descrito agora com referência às Figuras 5 a 12, as quais mostram aparelho 1 para controlar a temperatura de uma mistura de reação para amplificação de ácido nucleico.

Um carrossel giratório 2 é provido para suportar vários recipientes de reação 3 para manter uma pluralidade de misturas de reação (não mostrado). Os recipientes de reação 3 são formados de preferência de materiais plásticos e são adaptados para um equilíbrio térmico relativamente rápido e para permitir a detecção da mistura de reação. Os recipientes de —reação3 podem ser carregados com qualquer mistura de reação, entretanto, nas configurações aqui consideradas as misturas de reação são para a amplificação do ácido nucleico e o aparelho de ciclagem térmica | é configurado — adequadamente, ie, a rotina de ciclagem térmica á | particularmente adaptada para amplificação do ácido nucleico, de acordo com umbperfildeciclagem térmica predeterminada como discutido abaixo. | Pelo menos um aquecedor 4 é provido para suprir calor aos recipientes de reação 3, e pelo menos um orifício de suprimento de resfriamento 5 é provida para suprir refrigerante aos recipientes de reação 3. O aquecedor 4 e o orifício de suprimento de refrigerante 5 são adaptados para — gerar seletivamente uma zona de aquecimento predeterminada e uma zona de resfriamento predeterminada, respectivamente. Essas zonas são geradas substancialmente adjacentes ao aquecedor 4 e o orifício de suprimento de refrigerante 5 respectivamente, tal que a temperatura da mistura de reação é controlável pela exposição seletiva dos recipientes de reação 3 à zona de aquecimento e/ou à zona de resfriamento. As “zonas predeterminadas” que são geradas podem ser definidas como uma área ou região relativamente confinada ou limitada em espaço, as quais são aquecidas / resfriadas. Portanto a introdução dos recipientes de reação 3 nas zonas, ou a exposição dos S — recipientes de reação 3 às zonas, aquece/esfria os recipientes de reação 3, de preferência aquecer /esfriar a câmara inteira (não mostrado) na qual o . aparelho 1 está alojado.

O aparelho 1 é capaz de ciclar mais rapidamente as misturas de reação, comparado com dispositivos da técnica anterior, reduzindo assim o tempo exigido para executar amplificações. Além do mais, não apenas os tempos de ciclos podem ser reduzidos como também o grau de controle sobre a temperatura de reação pode melhorar se comparada a dispositivos da técnica anterior, uma vez que apenas a mistura de reação é aquecida e resfriada. Isso é adicionalmente melhorado detectando a temperatura atual da mistura de 15º reação em tempo real e fornecendo um feedback para um loop de controle para controlar a quantidade de calor provido pelo aquecedor 4 e a quantidade de refrigerante suprido aos recipientes de reação pelos orifícios de suprimento de refrigerante 5. Melhorias adicionais são contempladas pela medição do curso atual da reação ocorrendo nos recipientes de reação 3, e usando o curso — dareação como um sinal de controle para controlar a quantidade de calor e a | quantidade de refrigerante suprido ao recipiente de reação 3.

| O aquecedor 4 é de preferência na forma de um aquecedor sem contato. Tal como um aquecedor/emissor de infravermelho (IV) 6, o qual está localizado convenientemente no fundo da câmara, alojando o carrossel | giratório2e perto dos recipientes de reação que giram 3. O aquecedor IV 6 é de preferência um tubo de aço inoxidável com um diâmetro externo de aproximadamente 2 mm e um diâmetro interno de 1.5 mm. O aquecedor IV 6 deveria ser adaptado para suprir calor aos recipientes de reação 3 tal que essencialmente uma zona localizada sobre o recipiente de reação 3 seja aquecida. Um refletor parabólico 7 é preferivelmente provido. O refletor 7 é adaptado para focar substancialmente o calor provido pelo aquecedor IV 6 sobre os recipientes de reação 3.

O orifício de suprimento de refrigerante 5 pode ser uma — abertura anular disposta adjacente à placa refletora 7. Entretanto, em outros exemplos, o orifício de suprimento de refrigerante inclui uma pluralidade de . aberturas espaçadas circunferencialmente 8 colocadas adjacentes à placa refletora 7. As aberturas de suprimento de refrigerante 8 são adaptadas de preferência, para encontrar o refrigerante diretamente sobre os recipientes de —reação3. Dessa maneira uma zona localizada de resfriamento é localizada sobre os recipientes de reação 3. De preferência o refrigerante é o ar ambiente, entretanto, o ar ambiente deve ser pré- resfriado.

A temperatura dos recipientes de reação 3 pode ser medida/sentida durante um experimento de ciclagem térmico, de preferência 15" com um detector termo pilha 9. A temperatura medida dos recipientes de reação pode ser enviada de volta a um painel para um loop de controle, tal como um Proporcional Integral Derivativo (PID) — controlador do tipo codificado em um micro processador de controle 10, o qual pode ajustar a | quantidade de calor ou a quantidade de refrigerante suprida aos recipientes de reação3. Será apreciado que não apenas a temperatura dos recipientes de reação 3 possa ser medida/sentida durante um experimento de ciclagem térmica, mas o progresso das reações que ocorrem nos recipientes de reação 3 | pode também ser monitorado. O monitoramento pode ser por qualquer meio, entretanto, um exemplo preferido é com o uso de uma prova fluorescente a —qualéincluídana mistura da reação.

O monitoramento é de preferência feito por meio de uma fonte de luz 11, filtro 12, tubo fotomultiplicador 13. Os resultados do progresso da reação podem ser arquivados pelo micro processador de controle 10. Será apreciado que o progresso das reações que ocorre nos recipientes de reações 3 pode ser usado como sinal de controle para aumentar ou diminuir a temperatura dos recipientes de reação para aumentar ou reduzir a extensão das reações que ocorrem nos recipientes de reação 3. Numerosas características adicionais para uso nos exemplos —acimaoucom os exemplos acima serão descritas agora. ] Em um exemplo, a temperatura da mistura de reação é - controlável de acordo com um perfil térmico predeterminado. Isso permite que a mistura de reação seja usada para amplificação de ácido nucleico e que o perfil térmico predeterminado seja adaptado para amplificação de ácido —nucleico. O perfil térmico pode ser pré-armazenado no controlador ou na | memória, e pode ser selecionado a partir de numerosos perfis através de comandos apropriados providos por um dispositivo de entrada. Alternativamente, o perfil pode ser imputado manualmente usando-se o dispositivo de entrada.

Em um exemplo, uma pluralidade de recipientes de reação é provida em um arranjo, tal como um carrossel giratório. Cada recipiente de reação deve conter a mesma ou diferentes misturas de reação, permitindo que ' uma pluralidade de misturas de reação seja processada simultaneamente.

O aquecedor é geralmente um ou mais emissores IV, e o orifício de suprimento de refrigerante inclui uma pluralidade de aberturas dispostas adjacentes ao(s) emissor(es) IV. Em um exemplo o aquecedor é um emissor IV suprindo energia IV que é absorvida pelo recipiente de reação e por seu conteúdo, levando-os a aquecer. Em tais exemplos, a zona de aquecimento e a zona de resfriamento são substancialmente coincidentes.

Em um exemplo, a “zona predeterminada” é alcançada pelo suprimento de calor a uma área ou região relativamente confinada ou limitada em espaço. Isso está em contraste com dispositivos da técnica anterior que aquece / resfria a câmara inteira dentro da qual os recipientes de reação estão localizados. Através do foco ou concentração de calor/esfriamento dentro de uma zona localizada predeterminada em um espaço ambiente dentro do qual o recipiente de reação pode ser introduzido/exposto aquecendo assim e/ou resfriando o recipiente de reação e seus conteúdos.

Em algumas configurações, apenas a ponta do recipiente de reação é aquecida/esfriada — introduzindo-se apenas a ponta do recipiente de reação nas zonas, e em outras configurações, a metade inferior do recipiente de reação pode ser : aquecida/esfriada.

Entretanto, será apreciado que os dispositivos de aquecimento, na forma de um aquecedor/emissor IV, e os meios de resfriamento, na forma de um orifício de suprimento de refrigerante, possam ser adaptados para aquecer/ resfriar todo o recipiente de reação sem aquecer/esfriar substancialmente toda a câmara alojando os recipientes de reação.

Certo grau, algum aquecimento/esfriamento da câmara pode resultar per se.

Entretanto, a técnica minimiza qualquer “perda” de aquecimento/esfriamento da câmara afetando termicamente apenas o ambiente localizado circundando os recipientes de reação.

Numerosas vantagens podem ser alcançadas aquecendo e resfriando a mistura de reação, ou os recipientes de reação, ou uma porção do | mesmo, como em oposição à câmara inteira alojando os recipientes de reação, | 20 — como é comum em muitos dispositivos da técnica anterior.

Por exemplo, a técnica pode fornecer tempos de aquecimento e/ou de resfriamento os quais | são geralmente mais rápidos do que os dispositivos da técnica anterior os | quais aquecem a câmara inteira.

Certamente, é vantajoso estar apto a ciclar mais rapidamente as misturas de reação, reduzindo assim o tempo exigido — paraexecutar amplificações.

Adicionalmente, o aquecimento e/ou resfriamento das misturas de reação podem aumentar mais diretamente o grau de controle sobre a temperatura de reação pode melhorar comparado com dispositivos da técnica anterior, uma vez que apenas a mistura de reação ou recipiente de reação é | aquecido e resfriado. Adicionalmente, a temperatura atual da mistura de reação ou recipiente de reação pode ser detectada rapidamente fornecendo feedback para o loop de controle. Isso contrasta com dispositivos da técnica anterior na qual se usa inundar a câmara com fluido de aquecimento ou resfriamento e não usar a temperatura atual da mistura de reação como um elemento de feedback.

: O aparelho pode prover então controle fino de temperatura das misturas de reação que estão sendo cicladas termicamente nos recipientes de reação. Isso constitui avanço significativo sobre os dispositivos da técnica anterior os quais podem apenas relativamente controlar a temperatura de reação em curso sobre tempos de ciclagem comparativos uma vez que geralmente tais dispositivos da técnica anterior são efetivamente de “loop aberto” onde o ar ou bloqueio de temperatura é apenas controlado; a temperatura atual da mistura de reação não é usada como elemento de feedback no loop do controle térmico.

| Além do mais, melhoramentos na eficiência de energia podem | ser realizados uma vez que haja perda mínima de calor e de fluido refrigerante. Também, dispositivos de aquecimento e resfriamento menores podem ser usados, comparados com os dispositivos da técnica anterior uma vez que a câmara inteira não precisa ser aquecida e resfriada, significando custo reduzido para fabricação do instrumento.

Muitas outras vantagens podem também ser alcançadas. Por exemplo, a câmara alojando o carrossel giratório pode usar muito pouco ou nenhum isolamento, uma vez que há uma perda mínima de calor/ refrigerante, —euma ventoinha para circulação de fluido pode ser evitado para circular o ar aquecido/esfriado em torno dos recipientes de reação e ao longo da câmara, se os orifícios de resfriamento são usados.

O aparelho é particularmente direcionado para cicladores térmicos para amplificação de ácido nucleico, em que os recipientes de reação são suportados por um carrossel circular rotativo montado dentro de uma câmara.

Cicladores térmicos particularmente preferidos para uso com o aparelho a família de cicladores Rotor-Gene TM fabricados e distribuídos por Corbett Life Sciences Pty Limited (WWW .corbettifscience.com). Outros — dispositivos semelhantes são verificados na Publicação Internacional PCT N.

WO 92/20778 e WO 98/49340. Entretanto, será apreciado que outros - cicladores térmicos disponíveis comercialmente podem ser modificados para operar como descrito acima.

A rotação dos recipientes de reação pode prover numerosas — vantagens.

Por exemplo, uma das vantagens principais repousa em estar apto para monitorar o curso da reação de amplificação in situ.

Uma vez que o carrossel giratório é geralmente circular, preferivelmente o aquecedor e o orifício de suprimento de refrigerante são também circulares tal que os recipientes de reação experimentem um calor constante ou um resfriamento constante durante a rotação.

Nesse caso, a rotação do carrossel significa que não há necessidade de posicionar os recipientes de reação sobre um aquecimento particular/zona de resfriamento para aquecer/ resfriar recipientes.

Em alguns exemplos, o orifício de suprimento de refrigerante pode estar radialmente para dentro ou radialmente para fora do aquecedor. | Será apreciado também que o aquecedor (ou orifício de suprimento de refrigerante) pudesse ser um ou mais setores de um círculo tal que os recipientes de reação experimentem aquecimento intermitente (ou resfriamento) à medida que são girados.

Entretanto, em configurações — alternativas o aquecedor e o orifício de suprimento de refrigerante podem ser setores de um círculo os quais são alternados para definir zonas de aquecimento/esfriamento alternadas.

Em um exemplo, um aquecedor sem-contato pode ser usado para levar aquecimento à mistura de reação.

Por exemplo, uma fonte de aquecimento adequada é um emissor de microondas, ou em configurações preferidas, um aquecedor (IV) infravermelho. No caso de um aquecedor infravermelho, o aquecedor é, de preferência, capaz de liberar pelo menos 100 Watts. Em um exemplo, um aquecedor IV preferido é um tubo de aço — inoxidável com um diâmetro externo aproximadamente de 2 mm e um diâmetro interno de 1.5Smm. Alternativamente, o aquecedor IV é um elemento : Ni-Cromo enrolado em uma configuração em espiral sobre um tubo.

O aquecedor IV pode ser localizado no fundo de uma câmara alojando o carrossel giratório e bem próximo aos recipientes de reação —giratórios. Em um exemplo o aquecedor IV está subjacente aos recipientes de reação tal que os recipientes de reação se estendem sobre o aquecedor IV em uso. Entretanto, em exemplos alternativos, será apreciado que o aquecedor IV estiver posicionado radialmente para fora (ou para dentro), a partir dos recipientes de rotação e adaptado para direcionar a energia IV radialmente — para dentro (ou para fora) em direção aos recipientes de reação suportados pelo carrossel giratório.

Com relação à configuração atual o aquecedor pode ser adaptado para suprir calor aos recipientes de reação ou à mistura de reação de forma que apenas uma zona localizada sobre o recipiente de reação seja aquecida. Em um exemplo, o tubo de aço inoxidável é montado sobre isolantes de cerâmica que são afixados a uma placa refletora, a configuração sendo tal que o aquecedor IV gerado pelo aquecedor seja direcionado primeiramente para os recipientes de reação.

Em outros exemplos, a placa refletora é adaptada para focar — substancialmente o calor provido pelo aquecedor IV sobre o recipiente de | reação. Em tais exemplos, a placa refletora é curvada em seção transversal, e de preferência parabólica em seção transversal. Embora o uso da placa | refletora seja preferido, será apreciado que a placa refletora não seja essencial. Em um exemplo, o orifício de suprimento de refrigerante é uma abertura anular adjacente ao arranjo de placa refletora/aquecedor IV.

Entretanto, em outros exemplos, o orifício de suprimento do refrigerante inclui uma pluralidade de aberturas espaçadas circunferencialmente e dispostas adjacentes ao arranjo de placa refletora / aquecedor IV.

Os orifícios — de suprimento de refrigerante podem ser adaptados para levar o refrigerante diretamente sobre os recipientes de reação.

Dessa maneira, uma zona - predeterminada de refrigerante é estabelecida sobre o recipiente de reação.

Em um exemplo, o refrigerante é o ar ambiente.

Entretanto, o refrigerante pode ser qualquer tipo de fluido, como é bem sabido na técnica.

Em um aspecto relacionado, o refrigerante é o ar ambiente que for pré- congelado.

Será apreciado que o ar possa ser congelado por qualquer meio, | por exemplo, fluindo o ar passado pelo lado-frio de um bloco Peltier antes de | levar o ar resfriado sobre os recipientes de reação.

Entretanto, em alguns | exemplos preferidos, o refrigerante é resfriado por expansão adiabática, como | 15 é bem conhecido na técnica.

Por exemplo, o orifício de suprimento de refrigerante toma a forma de um ou mais bocais injetores.

Recipientes de reação de exemplo são adaptados para um equilíbrio térmico relativamente rápido e para permitir por detecção da mistura de reação, e devem ser formados por vidro ou por material plástico.

Em um exemplo, os recipientes de reação são similares aos tubos Eppendorf"M.

Os | | recipientes de reação podem ser carregados com qualquer mistura de reação, entretanto, nas configurações aqui contempladas, as misturas de reação são para amplificação do ácido nucleico e termo cicladores configurados adequadamente, | i.e., rotina de ciclagem térmica é particularmente adaptada para a simplificação do —ácidonucleico como discutido acima.

Em um exemplo, o recipiente de reação é pelo menos parcialmente transmissivo à radiação de forma que a mistura de radiação está pelo menos parcialmente exposta à radiação, assim sofrendo aquecimento direto.

Entretanto, alternativamente, o recipiente de reação pode absorver a radiação e ser aquecido, com o aquecimento sendo conduzido para a mistura de reação aí contida.

Em um exemplo, a temperatura do recipiente de reação é medida/sentida durante um experimento de ciclagem térmica. O dispositivo S — de medira temperatura pode tomar qualquer forma, como é bem sabido na técnica, entretanto dispositivos preferidos para sentir a temperatura são os ' sensores sem-contato. Por exemplo, detectores termo pilha e tecnologias | similares. Pelo uso de recipientes de reação adequados que são adaptados para | um rápido equilíbrio térmico, a mistura de reação mantida no recipiente de — reação está na mesma temperatura da superfície do recipiente de reação. Nenhum equilíbrio térmico é, portanto, exigido, uma vez que o ponto estabelecido é alcançado. Também, o tempo de equilíbrio térmico não é mais dependente da área de superfície para proporção de volume dos recipientes de reação. Como o IV é | focado na mistura de reação a taxa de aquecimento é proporcional à força liberada | para o aquecedor de IV e não dependente da geometria do tubo como em outros sistemas de ciclagem térmicos de condução (bloco) e convenção (ar).

Em um exemplo a mistura de reação é sentida diretamente, por exemplos e o recipiente de reação é transmissivo à radiação usada na medição, como pode ocorrer quando detectar oticamente a cor de um indicador na mistura de reação.

Será apreciado que ao aquecer ou resfriar a mistura de reação apenas localmente, até 95ºC pelo menos uma porção da mistura de reação irá evaporar e condensar nas porções frias do recipiente de reação que não foi exporto à radiação IV. Para superar isso, o rotor é girado em alta velocidade — durante o ciclo de resfriamento para girar para baixo qualquer mistura de reação que deva ser evaporada durante a etapa de aquecimento. Outra maneira de superar esse fenômeno é cobrir a mistura de reação com óleo ou cera para agirem como uma barreira contra a evaporação.

Será apreciado que o aquecedor suprindo calor para o recipiente de reação e o orifício de suprimento suprindo refrigerante para o recipiente de reação deve ser operado sequencialmente ou simultaneamente, como é bem sabido na técnica. Por exemplo, ao ser operado sequencialmente, o controle de temperatura pode ser considerado como controle “liga/desliga”, e quando operado simultaneamente o controle de temperatura pode ser ] considerado para ser de controle “proporcional”. No ultimo caso, um - controlador do tipo (PID) Proporcional-Integral-Derivativo pode ser usado para controlar a temperatura do recipiente de reação.

Em um exemplo, um método para controlar uma temperatura da | 10 mistura de reação inclui as etapas de: prover um aquecedor adaptado para gerar seletivamente uma zona de aquecimento pré-determinada; e prover um orifício de suprimento de refrigerante adaptado para gerar seletivamente uma zona de resfriamento predeterminada; em que a zona de aquecimento predeterminada e a zona de resfriamento predeterminada são geradas substancialmente adjacentes ao — aquecedor e ao orifício de suprimento de refrigerante; e controlar a temperatura da mistura de reação por exposição seletiva do recipiente de reação para a zona de aquecimento e/ou para a zona de resfriamento.

Em tais exemplos, isso pode ser usado para permitir que o recipiente de reação seja aquecido/esfriado sem aquecer/esfriar a câmara inteira alojando os recipientes de reação, tal como é típico nos dispositivos da técnica anterior. Isso reduz a quantia de energia exigida para aquecer e resfriar a mistura de reação, e pode reduzir também o tempo de aquecimento, como descrito anteriormente.

Sem que o contexto exija claramente que seja feito de outra —maneira, ou onde não seja indicado de outra maneira, a palavra “inclui”, “incluindo” e similares são para ser consideradas em um sentido de incluir, mas de não limitar.

Outros exemplos além dos operacionais, ou onde seja indicado de outra maneira, todos os números expressando quantidades de ingredientes ou condições de reação usadas em que devem ser entendidas como modificadas em todos os exemplos pelo termo “aproximadamente”. Embora as faixas numéricas e parâmetros estabelecidos adiante na larga extensão da invenção sejam aproximações, os valores —numéricos estabelecidos nos exemplos específicos são reportados tão precisamente quanto possível. Qualquer valor numérico, entretanto, contém, - inerentemente, alguns erros resultando necessariamente dos desvios padrão encontrados em suas respectivas medições de testes. A terminologia usada aqui, em que é propósito descrever exemplos particulares do aparelho para controlar temperaturas de misturas de reação não pretende ser limitativa. Se não definida de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como | comumente entendido por uma pessoa com conhecimento na técnica. À recitação de uma faixa numérica usando pontos finais inclui todos os números assumidos dentro da faixa (e.g., 1 a 5 incluí 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4,5, etc. ) | Os termos “preferível” e “preferivelmente” podem conter alguns benefícios, sob certas circunstancias. Entretanto, outras configurações podem também ser preferidas sob a mesma ou outras circunstancias. Alem do mais, a recitação de uma ou mais configurações preferidas, não implica em que outras configurações não sejam úteis, e não pretende excluir outras configurações do escopo da invenção.

Características de diferentes exemplos podem ser usadas em conjunção ou de forma permutável, e os exemplos descritos têm apenas o propósito de exemplificar.

Embora a invenção tenha sido descrita com referencia a exemplos específicos, será apreciado por aqueles que são especializados na técnica que a invenção pode ser incorporada de muitas outras formas. Em particular, características de qualquer um dos vários exemplos descritos podem ser providas em combinação com qualquer dos outros exemplos descritos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Aparelho para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação, caracterizado pelo fato de que inclui: a) uma fonte de radiação para expor o recipiente de reação à ' radiação durante o aquecimento da mistura de reação; - b) um sensor de temperatura para medir uma temperatura indicativa de uma temperatura de mistura de reação; e c) um controlador para controlar a fonte de radiação de acordo coma temperatura de mistura de reação para assim, seletivamente, aquecer a mistura de reação.

2. Aparelho de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aparelho inclui uma fonte de calor para aquecer uma câmara contendo o recipiente de reação.

3. Aparelho de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o controlador é para: a) aumentar a temperatura da mistura de reação pelo menos em parte, usando a fonte de radiação; e b) manter a temperatura da mistura de reação, pelo menos em —parteusando a fonte de calor.

4. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o aparelho inclui um mecanismo de resfriamento para resfriar a mistura da reação.

5. Aparelho de acordo com a reivindicação 4, caracterizado — pelo fato de que o mecanismo de resfriamento é para resfriar a mistura de reação a partir de uma temperatura elevada.

6. Aparelho de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o mecanismo de resfriamento supre ar ambiente para uma câmara contendo o recipiente de reação.

7. Aparelho de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o mecanismo de resfriamento supre fluido refrigerado para uma câmara contendo o recipiente de reação.

8. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações dela7, caracterizado pelo fato de que o sensor de temperatura é um sensor " infravermelho. -

9. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o sensor de temperatura é um sensor óptico para medir uma cor de uma temperatura dependente do indicador na mistura de reação.

10. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o sensor de temperatura sensoreia a temperatura da mistura da reação.

11. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações delao9, caracterizado pelo fato de que o sensor de temperatura sensoreia uma temperatura de recipiente de reação e em que o controlador é para determinar a temperatura da mistura da reação usando a temperatura do recipiente de reação.

12. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações delao, caracterizado pelo fato de que o sensor de temperatura sensoreia uma temperatura de câmara e em que o controlador é para determinar a temperatura da mistura de reação usando a temperatura da câmara.

13. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a fonte de radiação gera radiação infravermelha.

14. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a fonte de radiação gera radiação óptica.

15. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações

; de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o aparelho inclui uma câmara para receber os recipientes de reação em uso.

16. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o aparelho inclui uma montagem para receber numerosos recipientes de reação, a fonte de radiação e a ã montagem sendo arranjada de forma a permitir o aquecimento de um ou mais . dos numerosos recipientes de reação. |

17. Aparelho de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que inclui um acionador para mover a montagem em relação à —fontede radiação.

18. Aparelho de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o controlador é para controlar o acionador para assim, seletivamente, aquecer a mistura de reação nos respectivos recipientes dos numerosos recipientes de reação.

19. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a fonte de radiação expõe uma zona de aquecimento à radiação e em que o controlador controla o aquecimento da mistura da reação expondo seletivamente o recipiente de reação à zona de aquecimento.

20. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19 caracterizado pelo fato de que o controlador é um sistema de processamento.

21. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20 caracterizado pelo fato de que o controlador é para: a) aumentar a temperatura da mistura de reação para um primeiro valor de temperatura para desnaturar polinucleotídeos na mistura de reação; b) diminuir a temperatura da mistura de reação para um segundo valor de temperatura para recozer polinucleotídeos na mistura de reação; e c) aumentar a temperatura da mistura de reação para um terceiro valor de temperatura para hibridizar os polinucleotídeos desnaturados.

22. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações ' de 1 a 21 caracterizado pelo fato de que o controlador é para: ' a) determinar a temperatura da mistura da reação usando sinais recebidos do sensor de temperatura; e b) controlar a fonte de radiação de calor baseada na temperatura da mistura de reação a ser controlada.

23. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22 caracterizado pelo fato de que o controlador é para: a) controlar a fonte de radiação para aumentar a temperatura da mistura de reação para o primeiro valor de temperatura; b) controlar a fonte de calor para manter a temperatura de mistura de reação no primeiro valor de temperatura; c) controlar um mecanismo de resfriamento para assim diminuir e manter a temperatura da mistura de reação em uma segunda temperatura; e d) controlar a fonte de radiação para assim aumentar a temperatura da mistura de reação para o terceiro valor de temperatura; e e) controlar a fonte de calor para manter a temperatura da mistura de reação no terceiro valor de temperatura.

24. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações —dela23 caracterizado pelo fato de que a fonte de radiação é adaptada para gerar seletivamente uma zona de aquecimento predeterminada e em que o aparelho inclui um orifício de suprimento de refrigerante adaptado para gerar seletivamente uma zona, em que a zona de aquecimento predeterminada e a zona de resfriamento predeterminada são geradas substancialmente adjacentes | | ao aquecedor e o orifício de suprimento de refrigerante, respectivamente, tal que a temperatura da mistura de reação seja controlável por exposição seletiva do recipiente de reação à zona de aquecimento e/ou à zona de resfriamento.

25. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 —dela24 caracterizado pelo fato de que o recipiente de reação é pelo menos ' parcialmente transmissivo da radiação.

. 26. Aparelho de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a radiação tem um comprimento de onda selecionado de acordo com pelo menos uma das propriedades do recipiente de reação e das — propriedades da mistura de reação.

27. Método para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação, caracterizado pelo fato de que inclui, em um controlador, a) determinar uma temperatura da mistura de reação usando sinais recebidos de um sensor de temperatura; e b) controlar uma fonte de radiação, a fonte de radiação sendo por exposição do recipiente de reação à radiação aquecendo assim a mistura de reação; a fonte de radiação sendo controlada baseada na temperatura de mistura de reação, permitindo que a temperatura de mistura de reação seja controlada.

28. Aparelho para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação, caracterizado pelo fato de que inclui: um aquecedor adaptado para gerar seletivamente uma zona de — aquecimento predeterminada e um orifício de suprimento de refrigerante adaptado para gerar seletivamente uma zona de resfriamento predeterminada, em que a zona de aquecimento predeterminada e a zona de resfriamento predeterminada são geradas substancialmente adjacentes ao aquecedor e ao orifício de suprimento de refrigerante respectivamente, tal que a temperatura da mistura de reação seja controlável por exposição seletiva do recipiente de reação à zona de aquecimento e/ou zona de resfriamento.

29. Aparelho de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o aquecedor é um ou mais emissores de IV.

30. Aparelho de acordo com a reivindicação 28 ou ' reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o orifício de suprimento do | . refrigerante inclui uma pluralidade de aberturas dispostas adjacentes ao | aquecedor e em que o refrigerante é o ar ambiente. |

31. Aparelho de acordo com qualquer reivindicação de 28 a | 10 30, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de recipientes de reação é provida em um arranjo.

32. Aparelho de acordo com qualquer reivindicação de 28 a 31, caracterizado pelo fato de que a temperatura da mistura de reação é controlável pela exposição seletiva do recipiente de reação à zona de aquecimento ou à zona de resfriamento de acordo com um perfil térmico predeterminado.

33. Aparelho de acordo com a reivindicação 32 caracterizado pelo fato de que o perfil térmico predeterminado é adaptado para amplificação de ácido nucleico.

34. Aparelho de acordo com qualquer das reivindicações 28 a 33, caracterizado pelo fato de que a zona de aquecimento e à zona de resfriamento são substancialmente coincidentes.

35. Método para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação, caracterizado pelo fato de —queincluias etapas de: i) fornecer um aquecedor adaptado para gerar seletivamente uma zona de aquecimento predeterminada; e ii) fornecer um orifício de suprimento de refrigerante adaptado para gerar seletivamente uma zona de resfriamento predeterminada;

ili) em que a zona de aquecimento predeterminada e a zona de resfriamento predeterminada são geradas substancialmente adjacentes ao aquecedor e ao orifício de suprimento de refrigerante, respectivamente; e iv) controlar a temperatura da mistura de reação pela exposição seletiva do recipiente de reação à zona de aquecimento e/ou à zona Í de resfriamento.

.

36. Método para controlar a temperatura de uma mistura de reação mantida dentro de um recipiente de reação, caracterizado pelo fato de que inclui as etapas de: i) expor seletivamente o recipiente de reação a uma zona de aquecimento — predeterminada e/ou a uma zona de resfriamento predeterminada, em que a zona de aquecimento predeterminada e a zona de resfriamento predeterminada são geradas substancialmente adjacentes a um aquecedor e a um orifício de suprimento de refrigerante, respectivamente.

| 3 h

E Fig. 1

Ativar fonte de radiação e 200 monitorar a temperatura a mistura de reação. 7 NÃO Primera, 210 temperatus > alcançada? Manter a primeira temperatura para o 220 primeiro período detempo Desativar aquecimento e permitir que a 230 mistura de reação esfrie NÃO inda” temperaturs 240 alcançad:s

SIM Manter a segunda temperatura para d 250 segundo período de tempo Ativar fonte de radiação e monitorar 260 a temperatura da mistura de reação temperatura 270 valcançada?

SIM Manter terceira temperatura para o terceiro período 280 De tempo Fig. 2 oo ” 221 312 O

LON 310 : LO COD | - 340 R FAS | 1 200 ar BR EL ces EN Lo A EEE [o ar [= 1] | Fig. 3A | GA AO TES : 341 CATARRDASS No pr O nO o 322 TA ON s28 /// Fig. 3B eae ==. 400 414 s Fig. 4

| | | ! ( | AEAS ão

FARO BASS e O a NS à P FR NX. ERA AE x VARA À DAT BR N No: Dá: x. S “) is & 1h FISNA Er Ee AAA RB ÉS SEA = já E Ss FASES T VS i EA | E NA ÍA o he o” u Qd ”

I// = O) // D/ E : DIE É HS NAS - Es <

VN RES É 0) BES 4) O, o) OS [O TS Õ Es S / ES ) o WAS

À DO BI

À MD Ia

ZA v , a OA SS IL AR : q TZ ANN E | LAO & SAMPA d ; O) 7 E V É p í 2 5 Ro alle > 2% j à WE = AD Ses

Aa —— ////fo É k le | fo Hillho

No ke | :

E L RR XY - JF

WE NA [PE ( =) [== REA) .

RCA E VIAS, |

RE

EAV = AP a) /

E PV Do EN ão PB Z NO p AA a & HHTO co o E js) A N SESI. o) À ds VS FR j SF " fee 15 S Esc MS 1/7 CE" MS N/ us ) ABANAAREASEO , Ja

NOS 2

, o : a 236 & vão Ss e 8 o oFE 2 Nao 2% ce Ur o o o 8 8E r 3o > <c2 nm. o = 2

ES = e E) E o 2O | 2 5

E N E e - A bo - 2 88 > xr = 5 u & z o o os ê = ês 3ã = n o o 8 Es o ss cê "o E ses ss o v o8ê £õa 8 s go | 2 => £ Fr os

UE o = ” o 2 38 à às

TES 3

LL O