BRPI0820042B1 - método de obtenção de uma planta de tabaco, ou célula ou parte desta, tendo níveis reduzidos de nornicotina, produto de tabaco, método para fabricar um produto de tabaco, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, polipetpídeo isolado e método de obtenção de uma planta, ou parte de planta desta, do gênero nicotiana - Google Patents

método de obtenção de uma planta de tabaco, ou célula ou parte desta, tendo níveis reduzidos de nornicotina, produto de tabaco, método para fabricar um produto de tabaco, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, polipetpídeo isolado e método de obtenção de uma planta, ou parte de planta desta, do gênero nicotiana Download PDF

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Abstract

método de obtenção de uma planta de tabaco, ou célula ou parte desta, tendo níveis reduzidos de nornicotina, produto de tabaco, método para fabricar um produto de tabaco, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, polipetpídeo isolado e método de obtenção de uma planta, ou parte de planta desta, do gênero nicotiana são disponibilizadas composições e métodos para reduzir o nível de nornicotina e n’-nitrosonornicotina (nnn) em plantas e partes de plantas nicotiana. as composições compreendem polinucleotídeos e polipeptídeos isolados para citocromos p450s que participem da conversão metabólica de nicotina a nornicotina nessas plantas. também são disponibilizados cassetes de expressão, vetores, plantas e partes de plantas compreendendo sequências inibidoras que tenham como alvo a expressão ou a função dos polipeptídeos do citocromo p450 descobertos. também são disponibilizados métodos para usar essas novas sequências para inibir a expressão ou a função dos polipeptídeos do citocromo p450 que participam dessa conversão metabólica. os métodos podem ser usados na fabricação de produtos de tabaco que possuam menores níveis de nornicotina e de seu metabólito carcinogênico, nnn, e, portanto, que possuam menor potencial carcinogênico para os indivíduos que consumam esses produtos de tabaco ou que estejam expostos a fumaça secundária derivada desses produtos.

Description

MÉTODO DE OBTENÇÃO DE UMA PLANTA DE TABACO, OU CÉLULA OU PARTE DESTA, TENDO NÍVEIS REDUZIDOS DE NORNICOTINA, PRODUTO DE TABACO, MÉTODO PARA FABRICAR UM PRODUTO DE TABACO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CASSETE DE EXPRESSÃO, POLIPETPÍDEO ISOLADO E MÉTODO DE OBTENÇÃO DE UMA PLANTA, OU PARTE DE PLANTA DESTA, DO GÊNERO NICOTIANA
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção se refere a composições e métodos para reduzir o nível de nornicotina e de seu metabólito, N'-nitrosonornicotina (NNN), em uma planta que pertença ao gênero Nícotíana, referindo-se particularmente a composições e métodos para inibir a expressão ou a função de um polipeptídeo de citocromo P450 que participe da conversão metabólica de nicotina a nornicotina.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Um alcalóide predominantemente encontrado em variedades de tabaco comercial é a nicotina, que representa normalmente entre 90% e 95% do conjunto total de alcalóides. A fração de alcalóides restante é composta principalmente por três outros alcalóides de piridina: nornicotina, anabasina e anatabina. A nornicotina é gerada diretamente a partir da nicotina mediante a N-demetilase da mesma. A nornicotina representa geralmente menos do que 5% do conjunto total de alcalóides de piridina. Porém, as plantas de tabaco que inicialmente produzem quantidades muito baixas de nornicotina podem engendrar progênies que metabolicamente convertem uma grande porcentagem de folhas de nicotina a nornicotina. Esse processo é denominado conversão. Nas plantas de tabaco
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2/112 geneticamente convertidas (isto é, conversoras), a grande maioria da produção de nornicotina ocorre durante a senescência e a cura de uma folha madura (Wernsman e Matzinger (1968) Tob. Sci. 12:226-228) . Os tabacos do tipo Burley são particularmente propensos à conversão genética, sendo que as taxas observadas em alguns cultivos chegam a até 20% por geração.
[0003] Durante a cura e o processamento da folha de tabaco, uma parte da nornicotina é metabolizada a NNN, uma nitrosamina específica do tabaco (TSNA) que é possivelmente carcinogênica em animais de laboratório (Hecht e Hoffmann (1990) Cancer Surveys 8:273-294; e Hoffmann et al. (1994) J. Toxicol. Environ. Health 41:1-52; Hecht (1998) Chem. Res. Toxicol. 11:559-603). Nos tabacos curados em estufa, as TSNAs se formam predominantemente mediante uma reação de alcalóides com quantidades ínfimas de óxidos de nitrogênio presentes em gases de combustão em sistemas de aquecimento com chama direta usados em galpões de cura tradicionais (Peele e Gentry (1999) Formation of tobacco-specific nitrosamines in flue-cured tobacco, CORESTA Meeting, Agro-Phyto Groups, Suzhou, China). Os gases de combustão, porém, podem ser eliminados quando os galpões de cura são equipados com permutadores de calor, o que elimina a mistura de gases de combustão com o ar da cura, reduzindo, portanto as TSNAs nos tabacos curados dessa forma (Boyette e Hamm (2001) Rec. Adv. Tob. Sci. 27:17-22.) . Pelo contrário, nos tabacos Burley curados ao ar livre, a formação de TSNA primeiramente ocorre mediante uma reação de alcalóides de tabaco com nitrito, um processo catalisado por micróbios presentes na folha (Bush et al. (2001) Rec. Adv. Tob. Sci.
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27:23-46) . Até o presente, as tentativas de reduzir as TSNAs mediante a modificação das condições de cura mantendo, ao mesmo tempo, padrões de qualidade aceitáveis, não foram frutíferas em tabacos curados ao ar livre.
[0004] Nas plantas de tabaco Burley, existe uma correlação positiva entre o conteúdo de nornicotina de uma folha e a quantidade de NNN que se acumula na folha curada (Bush et al. (2001) Rec. Adv. Tob. Sci, 27:23-46; e Shi et al. (2000) Tob. Chem. Res. Conf. 54:Abstract 27) . Porém, manter em mínimo os níveis de nornicotina nas plantas de tabaco Burley é dificultoso devido à conversão. Os cultivadores de plantas e os produtores de sementes são tradicionalmente os responsáveis por minimizar o número de plantas de tabaco Burley que acumulam altos níveis de nornicotina. Também é certo que a porcentagem de conversoras que crescem finalmente nos campos é reduzida devido a conversoras degeneradas durante a propagação dos estoques de sementes. Infelizmente, esse processo é caro, demorado e imperfeito.
[0005] Depois de que a planta se converte, a característica de nornicotina elevada é herdada como um único gene dominante (Griffith et al. (1955) Science 121:343-344; Burke e Jeffrey (1958) Tob. Sci. 2:139-141; e Man et al. (1964) Crop Sci. 4:349-353). A natureza desse gene, porém, é atualmente desconhecida. No cenário mais simples, o locus da conversora pode representar um gene não-funcional de nicotina Ndemetilase que recupera sua função em conversoras, possivelmente mediante a mobilização de um elemento transponível indutor de mutações. Alternativamente, o locus da conversora pode codificar uma proteína que inicia uma série de
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4/112 eventos que finalmente permitam que as conversoras metabolizem nicotina a nornicotina, o que significa que muitos genes podem estar envolvidos.
[0006] Independentemente de se existem um ou mais genes associados à conversão, o ou os genes que codificam polipeptídeos com atividade de nicotina demetilase desempenham um papel fundamental nesse processo. Embora a impossibilidade de purificar nicotina N-demetilase ativa a partir de extratos crus tenha impedido o isolamento e a identificação dessa enzima, existem evidências de que um membro da superfamília de monooxigenases do citocromo P450 poderia estar envolvido (Hao e Yeoman (1996) Phytochem. 41:477-482; Hao e Yeoman (1996) Phytochem. 42:325-329; Chelvarajan et al. (1993) J. Agric, Food Chem. 41:858-862; e Hao e Yeoman (1998) J. Planta Physiol. 152:420-426). Infelizmente, esses estudos não são conclusivos, já que os inibidores P450 clássicos, como o monóxido de carbono e a tetcilase, não são capazes de reduzir a atividade enzimática a taxas comparáveis com outras reações mediadas por P450 conhecidas (Chelvarajan et al. (1993) J. Agric. Food Chem. 41:858-862) .
[0007] Além disso, os citocromos P450 são proteínas ubíquas transmembrana que participam da metabolização de uma grande variedade de compostos (revisado por Schuler (1996) Crit. Rev. Plant Sci. 15:235-284; e Schuler e Werck-Reichhart (2003) Annu. Rev. Plant Biol. 54:629-667). Exemplos de reações bioquímicas mediadas pelos citocromos P450 incluem hidroxilações, demetilações e epoxidações. Nas plantas, as famílias genéticas do citocromo P450 são bastante numerosas. Por exemplo, um exame de sequência de genomas total revelou
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272 genes citocromo P450 previstos na Arabidopsis e pelo menos 455 genes citocromo P450 únicos no arroz (vide, por ex., Nelson et al. (2004) Plant Physiol. 135(2):756-772). Embora os citocromos P450 estejam implicados na conversão de nicotina a nornicotina, a identificação dos principais membros participantes dessa família de proteínas continua sendo um desafio.
[0008] Além de servir como um precursor para a NNN, estudos recentes sugerem que a nornicotina encontrada em produtos de tabaco traz consequências indesejáveis para a saúde. Por exemplo, Dickerson e Janda demostraram que a nornicotina causa uma glicosilação aberrante de proteínas dentro da célula (Dickerson e Janda (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:1508415088). De maneira similar, as concentrações de proteínas modificadas por nornicotina foram muito maiores no plasma de fumantes em relação ao de não-fumantes. Além disso, a nornicotina pode modificar de forma covalente drogas esteróides comumente receitadas como a prednisona, o que pode alterar tanto a eficácia como a toxidade dessas drogas.
[0009] Tendo em vista as dificuldades associadas à conversão, bem como os efeitos indesejados sobre a saúde provocados pela acumulação de nornicotina, métodos aprimorados para reduzir o conteúdo de nornicotina em variedades de tabaco, particularmente nas plantas de tabaco Burley, são, portanto, desejados. Esses métodos não só ajudariam a aliviar as pontenciais consequências negativas sobre a saúde da nornicotina em si, conforme descrito acima, mas também ajudariam a reduzir os níveis de NNN.
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RESUMO DA INVENÇÃO
[0010] São fornecidas composições e métodos para reduzir o conteúdo de nornicotina nas plantas que pertençam ao gênero Nícotíana. As composições incluem polinucleotídeos e polipeptídeos isolados de citocromo P450 que participem da conversão de nicotina a nornicotina nas plantas, particularmente em espécies Nícotíana. Os polinucleotídeos isolados incluem aqueles que compreendem uma sequência de ácidos nucléicos conforme apresentado nas SEQ N°:1, 3 ou 4, uma sequência de ácidos nucléicos que codifica um polipeptídeo conforme apresentado nas SEQ N°:2, 5-12, 14-24, e fragmentos e variações das mesmas. Os polipeptídeos isolados da invenção incluem aqueles que compreendem uma sequência de aminoácidos conforme apresentado nas SEQ N°:2, 5-12 ou 14-24, uma sequência de aminoácidos codificados pela sequência de ácidos nucléicos apresentada nas SEQ N°:1, 3 ou 4, além de fragmentos e variações das mesmas.
[0011] Em um primeiro aspecto, a presente invenção é resumida como polinucleotídeos que podem suprimir a expressão de uma nicotina demetilase envolvida na conversão metabólica de nicotina a nornicotina em uma planta, incluindo as nicotinas demetilases da presente invenção. A presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado com um promotor capaz de funcionar em uma célula vegetal operacionalmente vinculada a um sequência de ácidos nucléicos que compreende uma região de entre cerca de 100 ácidos nucléicos e cerca de 350 ácidos nucléicos de SEQ N°:1 obtida a partir de uma sequência selecionada dentre o grupo de ácidos nucléicos das posições 253, 353, 647, 733, 1050, 1397 e combinações dos
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7/112 mesmos. A presente invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de ácidos nucléicos que codifica uma nicotina demetilase de folha verde, sendo que a sequência de aminoácidos da nicotina demetilase codificada possui uma substituição em um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que contém resíduos 235, 449, 174, 410, 224, 72, 143 e 422, sendo que a numeração está de acordo com a SEQ N°:2. Também é fornecido um polinucleotídeo isolado que compreende um promotor capaz de funcionar em uma célula vegetal operacionalmente vinculada a um sequência de ácidos nucléicos compreendendo uma região de entre cerca de 100 ácidos nucléicos e cerca de 350 ácidos nucléicos de SEQ N°:4. É fornecido, ainda, um polinucleotídeo isolado que codifica uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ N°:2 com a mutação de um resíduo que difere dos outros polipeptídeos P450 a um resíduo conservado. Alternativamente, é fornecido um polinucleotídeo isolado que codifica uma sequência de aminoácidos conforme apresentado nas SEQ N°:2 com uma mutação na posição selecionada a partir do grupo que contém resíduos 85, 118, 216, 245 e 466, sendo que o resíduo em 85 não é uma isoleucina, o resíduo em 118 não é uma asparagina, o resíduo em 216 não é tirosina, o resíduo em 245 não é uma tirosina e o resíduo em 466 não é valina.
[0012] Em um segundo aspecto, a presente invenção é resumida como um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de SEQ N°:2 operacionalmente vinculada a um promotor que é funcional em uma célula vegetal. A presente invenção fornece um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo
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8/112 contendo uma sequência de ácidos nucléicos de SEQ N°:3, ou um fragmento de pelo menos 25 ácidos nucléicos contíguos da mesma, operacionalmente vinculados a um promotor que é funcional em uma célula vegetal. Também é fornecido um polinucleotídeo isolado que compreende pelo menos 25 nucleotídeos de uma sequência de ácidos nucléicos de SEQ N°:3. É fornecido, ainda, um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos selecionados a partir do grupo que contém as SEQ N°:2, 5-12 e 14-24. Em uma configuração do segundo aspecto, o polipeptídeo isolado comprende uma sequência de aminoácidos 99% idêntica à SEQ N°:2, que forma tal que ela seja capaz de converter nicotina a nornicotina em folhas verdes de tabaco.
[0013] Em um terceiro aspecto, a presente invenção é resumida como uma planta do gênero Nícotíana, ou uma parte dessa planta, compreendendo um cassete de expressão, o cassete que codifica a SEQ N°:2, um fragmento do mesmo ou um complemento de qualquer um dos dois. Também é fornecida uma planta Nícotíana transgênica com um menor nível de taxa de conversão de nicotina a nornicotina em folhas verdes, comparada a uma planta não-transgênica, sendo que a planta compreende um construto exógeno de ácidos nucléicos que contém um promotor capaz de funcionar em uma célula vegetal operacionalmente vinculada a um polinucleotídeo com uma primeira sequência de ácidos nucléicos compreendendo uma região de entre cerca de 100 ácidos nucléicos e cerca de 350 ácidos nucléicos de uma sequência de nicotina demetilase da folha verde do tabaco que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ N°:2 e uma segunda sequência de ácidos nucléicos capaz
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9/112 de formar um RNA de fita dupla com a primeira sequência. Também é fornecida uma planta Nícotíana transgênica com um menor nível de taxa de conversão de nicotina a nornicotina em folhas verdes, comparada a uma planta não-transgênica, sendo que a planta compreende um construto exógeno de ácidos nucléicos que contém um promotor capaz de funcionar em uma célula vegetal operacionalmente vinculada a um polinucleotídeo com uma primeira sequência de ácidos nucléicos compreendendo uma região de entre cerca de 100 ácidos nucléicos e cerca de 350 ácidos nucléicos de uma sequência de nicotina demetilase da folha verde do tabaco com a sequência de ácidos nucléicos da SEQ N°:3 e uma segunda sequência de ácidos nucléicos capaz de formar um RNA de fita dupla com a primeira sequência. É fornecida, ainda, uma planta Nícotíana transgênica com um menor nível de taxa de conversão de nicotina a nornicotina em folhas verdes, comparada a uma planta não-transgênica, sendo que a planta compreende um construto exógeno de ácidos nucléicos que contém um promotor capaz de funcionar em uma célula vegetal operacionalmente vinculada a um polinucleotídeo com uma primeira sequência de ácidos nucléicos compreendendo uma região de entre cerca de 100 ácidos nucléicos e cerca de 350 ácidos nucléicos de uma sequência de nicotina demetilase da folha verde do tabaco com a sequência de ácidos nucléicos da SEQ N°:4 e uma segunda sequência de ácidos nucléicos capaz de formar um RNA de fita dupla com a primeira sequência.
[0014] Em um quarto aspecto, a presente invenção é resumida como uma semente de uma planta Nícotíana transgênica com um menor nível de taxa de conversão de nicotina a nornicotina em folhas verdes, comparada a uma planta não-transgênica, sendo
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10/112 que a planta compreende um construto exógeno de ácidos nucléicos que contém um promotor heterólogo capaz de funcionar em uma célula vegetal operacionalmente vinculada a um polinucleotídeo com uma primeira sequência de ácidos nucléicos compreendendo uma região de entre cerca de 100 ácidos nucléicos e cerca de 350 ácidos nucléicos de uma sequência de nicotina demetilase da folha verde do tabaco com a sequência de aminoácidos da SEQ N°:4 e uma segunda sequência de ácidos nucléicos capaz de formar um RNA de fita dupla com a primeira sequência. Também é fornecido um cultivo de tecidos regeneráveis de células de tabaco compreendendo uma célula vegetal que contém um primeiro polinucleotídeo com um fragmento da sequência de ácidos nucléicos das SEQ N°:1, 3 ou 4 e um segundo polinucleotídeo capaz de formar um RNA de fita dupla com o primeiro.
[0015] Em um quinto aspecto, a presente invenção é resumida como um produto de tabaco compreendendo uma célula da planta Nícotíana transgênica com um menor nível de taxa de conversão de nicotina a nornicotina em folhas verdes, comparada a uma planta não-transgênica, sendo que a célula compreende um promotor heterólogo capaz de funcionar em uma célula vegetal operacionalmente vinculada a um polinucleotídeo com uma primeira sequência de ácidos nucléicos compreendendo uma região de entre cerca de 100 ácidos nucléicos e cerca de 350 ácidos nucléicos de uma sequência de nicotina demetilase da folha verde do tabaco com a sequência de ácidos nucléicos da SEQ N°:4 e um segundo polinucleotídeo capaz de formar um RNA de fita dupla com o primeiro. Também é fornecida uma célula de tabaco com um genoma alterado para inibir a expressão de pelo
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11/112 menos uma nicotina demetilase de folha verde, sendo que a célula é homozigota para uma mutação no gene que codifica a nicotina demetilase de folha verde. É fornecida, ainda, uma célula de tabaco que compreende um transgene contendo uma sequência de ácidos nucléicos de nicotina demetilase de folha verde que aborda um gene marcador selecionável, sendo que o gene marcador selecionável divide o gene de nicotina demetilase produzindo, assim, uma célula de tabaco na qual o gene endógeno da nicotina demetilase de folha verde está dividido. Alternativamente, é fornecida uma célula de tabaco que compreende um transgene contendo uma sequência de ácidos nucléicos de nicotina demetilase de folha verde que aborda um gene marcador selecionável, sendo que o gene marcador selecionável divide o gene de nicotina demetilase produzindo, assim, uma célula de tabaco na qual o gene endógeno da nicotina demetilase de folha verde está dividido.
[0016] Em um sexto aspecto, a presente invenção é resumida como um método para reduzir os níveis de nornicotina em uma parte de planta derivada de uma planta do gênero Nícotíana, sendo que o método compreende: a) inibir a expressão de uma nicotina demetilase, sendo que essa nicotina demetilase possui uma sequência de aminoácidos apresentada no grupo que contém as SEQ N°:2 e 5-12; e b) reduzir os níveis de nornicotina em uma parte de planta derivada de uma planta do gênero Nícotíana. Também é fornecido um método para reduzir os níveis de nornicotina em um produto de tabaco, sendo que o método compreende: a) cultivar uma planta de tabaco transgênica, sendo que essa planta possui uma parte de planta que contém um cassete de expressão compreendendo um promotor heterólogo e
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12/112 uma nicotina demetilase, sendo que essa nicotina demetilase possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que contém as SEQ N°:2 e 5-12; e b) preparar um produto de tabaco a partir dessa parte de planta de tabaco. É fornecido, ainda, um método para reduzir os níveis de nornicotina em um produto de tabaco, sendo que o método compreende: a) cultivar uma planta de tabaco transgênica, sendo que essa planta possui uma parte de planta que contém um anticorpo que vincula especificamente um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que contém as SEQ N°:2 e 5-12; e b) preparar um produto de tabaco a partir dessa parte de planta de tabaco. Alternativamente é fornecido um método para reduzir os níveis de nornicotina em um produto de tabaco, sendo que o método compreende: a) cultivar uma planta de tabaco transgênica, sendo que essa planta possui uma parte de planta que contém um fragmento de uma nicotina demetilase de folha verde operacionalmente vinculada a um promotor heterólogo e sendo que esse fragmento possui pelo menos 25 ácidos nucléicos contíguos de uma sequência de ácidos nucléicos que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que contém as SEQ N°:2 e 5-12; e b) preparar um produto de tabaco a partir dessa parte de planta de tabaco. Também é fornecido um método para reduzir os níveis de nornicotina em uma parte de planta derivada de uma planta do gênero Nícotíana, sendo que o método compreende: a) modificar o alelo CYP82E5v2 funcional para modificar alelos a um CYP82E5v2 não-funcional, sendo que a sequência de aminoácidos desse CYP82E5v2 não-funcional possui uma substituição em um resíduo de aminoácido em uma posição
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13/112 selecionada a partir do grupo que contém resíduos 235, 449, 174, 410, 224, 72, 143 e 422, sendo que a numeração está de acordo com a SEQ N°:2; e b) reduzir o nível de nornicotina em uma parte de planta derivada de uma planta do gênero Nícotíana. A presente invenção também fornece um método para reduzir o potencial carcinogênico de um produto de tabaco, sendo que o método compreende as etapas de preparar o produto de tabaco mediante: a) cultivar uma planta de tabaco transgênica, sendo que essa planta possui uma parte de planta que contém um fragmento de uma nicotina demetilase de folha verde operacionalmente vinculada a um promotor heterólogo e sendo que esse fragmento possui pelo menos 25 ácidos nucléicos contíguos de uma sequência de ácidos nucléicos que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que contém as SEQ N°:2 e 5-12; e b) preparar um produto de tabaco a partir dessa parte de planta de tabaco. Finalmente, a presente invenção fornece um método para reduzir a conversão de nicotina a nornicotina em uma planta Nícotíana, compreendendo: a) transformar uma planta Nícotíana com um construto de ácido nucléico compreendendo um promotor capaz de funcionar em uma célula vegetal operacionalmente vinculada a uma sequência de ácidos nucléicos que possua uma primeira sequência de ácidos nucléicos compreendendo uma região de entre 100 ácidos nucléicos e cerca de 350 ácidos nucléicos das SEQ N°:1, 3 ou 4, e uma segunda sequência de ácidos nucléicos que seja capaz de formar um RNA de fita dupla com a primeira sequência de ácidos nucléicos; e b) regenerar uma planta Nícotíana transgênica.
[0017] Em um sétimo aspecto aspecto, a presente invenção é
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14/112 resumida como um método para identificar uma sequência de nicotina demetilase de folha verde, compreendendo: a) obter uma sequência de ácidos nucléicos que possua pelo menos 200 ácidos nucléicos com identidade de sequência com a SEQ N°:1; e b) identificar uma sequência de códons que codifique um códon de parada na posição 422 do polipeptídeo codificado, sendo que a numeração está de acordo com a SEQ N°:2. Também é fornecido um método para identificar uma sequência de nicotina demetilase de folha verde, compreendendo: a) obter uma sequência de ácidos nucléicos que possua pelo menos 200 ácidos nucléicos com identidade de sequência com a SEQ N°:1; e b) identificar uma sequência de códons que codifique um códon que não seja uma prolina na posição 449 do polipeptídeo codificado, sendo que a numeração está de acordo com a SEQ N°: 2. É fornecido, ainda, um método para identificar uma planta de tabaco com baixos níveis de nornicotina, sendo que o método compreende: a) obter uma amostra de DNA a partir de uma planta de tabaco de interesse; e b) identificar nessa amostra a presença de uma mutação na SEQ N°:1. A presente invenção também fornece um método para reduzir o nível de nornicotina em uma parte de planta derivada de uma planta do gênero Nícotíana, sendo que o método compreende: a) inibir a expressão de uma nicotina demetilase CYP82E4v2 e uma nicotina demetilase CYP82E5v2; e b) reduzir o nível de nornicotina em uma parte de planta derivada de uma planta do gênero Nícotíana. Também é incluído material de planta de tabaco que
compreende um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos da
SEQ N°:13 trazendo uma mutação em uma posição selecionada a
partir do grupo que contém resíduos 458, 364, 329 e
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combinações dos mesmos. É incluído, ainda, um material de
planta de tabaco que compreende um CYP82E4v2 trazendo uma
mutação em uma posição selecionada a partir do grupo que
contém resíduos 458, 364, 329 e combinações dos mesmos, sendo
que a numeração corresponde à da SEQ N°:13. É incluído, finalmente, material de planta de tabaco que compreende um CYP82E4v2 trazendo uma mutação no resíduo 376, sendo que o resíduo não é valina e a numeração dos resíduos corresponde à SEQ N°:13.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0018] A FIG. 1A-C mostra o alinhamento de uma sequência de aminoácidos de membros da família de genes CYP82E2 que passaram por ensaios para detectar a atividade da nicotina demetilase em leveduras e/ou plantas transgênicas. As sequências em itálico e sublinhadas são positivas para a atividade da nicotina demetilase (CYP82E4v2 e CYP82E5v2); as sequências tituladas em cor preta não puderam mostrar atividade em um ensaio. Os resíduos que diferem entre os membros estão em cor cinza. Na FIG.1, CYP82E4v2 é apresentado na SEQ N°:13; CYP82E4v6 é apresentado na SEQ N°:26; CYP82E4v12 é apresentado na SEQ N°:27; 58-166 é apresentado na SEQ N°:28; CYP82E3 é apresentado na SEQ N°:29; CYP82E2v1 é apresentado na SEQ N°:30; CYP82E2v2 é apresentado na SEQ N°:31; e CYP82E5v2 é apresentado na SEQ N°:2.
DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
[0019] A SEQ N°:1 apresenta uma sequência de ácidos nucléicos de uma região codificadora do CYP82E5v2.
[0020] A SEQ N°:2 apresenta uma sequência de aminoácidos de um CYP82E5v2.
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[0021] A SEQ N°:3 apresenta uma sequência de ácidos nucléicos de um íntron do CYP82E5v2.
[0022] A SEQ N°:4 apresenta uma sequência de ácidos nucléicos de um CYP82E5v2 genômico.
[0023] A SEQ N°:5 apresenta uma sequência de aminoácidos de
um CYP82E5v2 P235S.
[0024] A SEQ N°:6 apresenta uma sequência de aminoácidos de
um CYP82E5v2 P449L.
[0025] A SEQ N°:7 apresenta uma sequência de aminoácidos de
um CYP82E5v2 S174L.
[0026] A SEQ N°:8 apresenta uma sequência de aminoácidos de
um CYP82E5v2 A410V.
[0027] A SEQ N°:9 apresenta uma sequência de aminoácidos de
um CYP82E5v2 M224I.
[0028] A SEQ N°:10 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E5v2 P72L.
[0029] A SEQ N°:11 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E5v2 L143F.
[0030] A SEQ N°:12 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E5v2 W422Stop.
[0031] A SEQ N°:13 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v2.
[0032] A SEQ N°:14 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v2 P458S.
[0033] A SEQ N°:15 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v2 K364N.
[0034] A SEQ N°:16 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v2 P38L.
[0035] A SEQ N°:17 apresenta uma sequência de aminoácidos
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de um CYP82E4v2 E201K.
[0036] A SEQ N° :18 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v2 R169Q.
[0037] A SEQ N° :19 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v2 G459R.
[0038] A SEQ N°:20 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v2 E296K.
[0039] A SEQ N°:21 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v2 T427I.
[0040] A SEQ N°:22 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v2 W329Stop.
[0041] A SEQ N°:23 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v2 V376M.
[0042] A SEQ N°:24 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v2 D171N.
[0043] A SEQ N°:25 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4 .
[0044] A SEQ N°:26 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v6.
[0045] A SEQ N°:27 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E4v12
[0046] A SEQ N°:28 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um 58-166.
[0047] A SEQ N°:29 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E3.
[0048] A SEQ N°:30 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E2v1.
[0049] A SEQ N°:31 apresenta uma sequência de aminoácidos
de um CYP82E2v2.
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[0050] A SEQ N°:32 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer dianteiro para exon 1 do CYP82E4v2 •
[0051] A SEQ N°:33 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer reverso para exon 1 do CYP82E4v2.
[0052] A SEQ N°:34 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer dianteiro para exon 2 do CYP82E4v2 •
[0053] A SEQ N°:35 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer reverso para exon 2 do CYP82E4v2.
[0054] A SEQ N°:36 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer dianteiro para exon 1 do CYP82E5v2 •
[0055] A SEQ N°:37 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer reverso para exon 1 do CYP82E5v2.
[0056] A SEQ N°:38 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer dianteiro para exon 2 do CYP82E5v2 •
[0057] A SEQ N°:39 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer reverso para exon 2 do CYP82E5v2.
[0058] A SEQ N°:40 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer E5Gen_F1.
[0059] A SEQ N°:41 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer E5Gen_R1.
[0060] A SEQ N°:42 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer E5Gen_F2.
[0061] A SEQ N°:43 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer E5Gen_R2.
[0062] A SEQ N°:44 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer E4Rt_F.
[0063] A SEQ N°:45 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer E4Rt_R.
[0064] A SEQ N°:46 apresenta uma sequência de ácidos
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nucléicos de um primer E5Rt_F.
[0065] A SEQ N°:47 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer E5Rt_R.
[0066] A SEQ N°:48 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer G3PDH_F.
[0067] A SEQ N°:49 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de um primer G3PDH_R.
[0068] A SEQ N°:50 apresenta uma sequência de ácidos
nucléicos de uma região codificadora do CYP82E4v2 e da proteína codificada (isto é, a SEQ N°:13).
DEFINIÇÕES
[0069] A presente invenção inclui composições e métodos para inibir a expressão ou a função de polipeptídeos de nicotina demetilase que participam da conversão metabólica de nicotina a nornicotina em uma planta, particularmente nas plantas do gênero Nícotíana, incluindo plantas de tabaco de diversas variedades comerciais.
[0070] Conforme aqui utilizado, inibir, inibição e inibidor são definidos como qualquer método conhecido na especialidade ou aqui descrito que diminua a expressão ou a função de um produto genético de interesse (isto é, o produto genético alvo).
[0071] Inibir pode ser usado no contexto de uma comparação entre duas plantas, por exemplo, uma planta geneticamente alterada contra uma planta de tipo selvagem. A comparação pode ser entre plantas, uma das quais carece de uma sequência de DNA capaz de reduzir o agente. A inibição da expressão ou da função de um produto genético alvo também pode ser usada no contexto de uma comparação entre células,
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20/112 organelas, órgãos, tecidos ou partes de planta pertencentes à mesma planta ou a plantas diferentes, incluindo comparações entre os estágios de desenvolvimento ou de tempos da mesma planta ou parte de planta ou, ainda, entre diferentes plantas ou partes de plantas.
[0072] Inibir pode significar qualquer decremento relativo da função ou da produção de um produto genético de interesse, até a eliminação completa da função ou produção desse produto genético, inclusive. Quando os níveis de um agente são comparados, essa comparação é preferentemente realizada entre organismos com antecedentes genéticos similares. Preferentemente, um antecedente genético similar é um antecedente no qual os organismos que estão sendo comparados dividem 50% ou mais, mais preferentemente 75% ou mais, e, ainda mais preferentemente 90% ou mais de identidade de sequência do material genético nuclear. Um antecedente genético similar é um antecedente no qual os organismos que estão sendo comparados são plantas, sendo que as plantas são isogênicas exceto para qualquer material genético originalmente introduzido usando técnicas de transformação de plantas ou uma mutação gerada por intervenção humana. A medição do nível ou quantidade de um agente pode ser realizada por qualquer método adequado, exemplos não-exaustivos dos quais incluem, mas não se limitam a, comparação de níveis de transcrição de mRNA, níveis de proteína ou peptídeos, e/ou fenótipo, especialmente a conversão de nicotina a nornicotina. Conforme aqui utilizado, as transcrições de mRNA podem incluir transcrições de mRNA processadas e não-processadas, sendo que os polipeptídeos ou peptídeos podem incluir polipeptídeos ou
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21/112 peptídeos com ou sem qualquer modificação translacional.
[0073] Conforme aqui utilizado, “célula hospedeira” significa uma célula que compreende uma sequência heteróloga de ácidos nucléicos da invenção. Embora a sequência de ácidos nucléicos da invenção, além de fragmentos e variantes da mesma, possa ser introduzida em qualquer célula de interesse, as células vegetais são de interesse particular, mais especificamente as células das espécies de plantas Nícotíana, por exemplo, a espécie da planta de tabaco e variedades descritas mais adiante.
[0074] Conforme aqui utilizado, variante” significa uma sequência consideravelmente similar. Uma variante pode possuir uma função diferente ou uma função consideravelmente similar como um polipeptídeo de tipo selvagem de interesse. Para uma nicotina demetilase, uma função consideravelmente similar possui pelo menos 99%, 98%, 97%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 60%, 50%, 25% ou 15% da função enzimática de tipo selvagem de converter nicotina a nornicotina sob as mesmas condições ou em
uma linha semi-isogênica. Um CYP82E5v2 de tipo selvagem é a
SEQ N°:2. Um CYP82E4v2 de tipo selvagem é a SEQ N°:13.
Conforme aqui utilizado, um polinucleotídeo variante” ou
polipeptídeo variante” significa um ácido nucléico ou uma sequência de aminoácidos que não é de tipo selvagem.
[0075] Uma variante pode possuir uma adição, eliminação ou
substituição; duas ou menos adições, eliminações ou
substituições; três ou menos adições, eliminações ou
substituições; quatro ou menos adições, eliminações ou
substituições; ou cinco ou menos adições, eliminações ou
substituições. Uma mutação inclui adições, eliminações e
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22/112 substituições. Essas eliminações ou adições podem ser no Cterminal, no N-terminal ou tanto no C- como no N-terminal. Polipeptídeos de fusão ou polipeptídeos com epítopo etiquetado também formam parte da presente invenção. As mutações de nucleotídeo silenciosas não modificam o aminoácido codificado em uma dada posição. As substituições de aminoácidos podem ser conservadoras. Uma substituição conservadora é uma modificação no aminoácido, sendo que essa modificação é a um aminoácido pertencente à mesma família de aminoácidos do que o aminoácido original. A família é definida pela cadeia lateral de cada aminoácido. Uma família de aminoácidos pode possuir cadeias laterais básicas, ácidas, polares ou não-polares descarregadas. Vide, Alberts et al., (1994) Molecular biology of the cell (3a ed., pgs 56-57, Garland Publishing Inc., New York, New York), incorporada aqui como referência como se fossem apresentadas em caráter íntegro. A eliminação, substituição ou adição pode ser ao aminoácido de outro membro da família CYP82E na mesma posição. Vide, FIG. 1A-C. Conforme aqui utilizado, um fragmento significa uma parte de um polinucleotídeo ou uma parte de um polipeptídeo e, portanto, proteínas codificadas pelos mesmos.
[0076] Conforme aqui utilizado, parte de planta inclui células vegetais, protoplastos de plantas, cultivos de tecidos de células vegetais a partir dos quais uma planta inteira pode ser regenerada, caules de plantas, terrões e células vegetais que estão intactas nas plantas ou partes de plantas como embriões, pólen, anteras, óvulos, sementes, folhas, flores, talos, galhos, frutas, raízes, pontas de raízes, entre outros. Progênie, variantes e mutantes das plantas regeneradas também
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23/112 formam parte do escopo da presente invenção, contanto que compreendam os polinucleotídeos apresentados na invenção. Conforme aqui utilizado, “material de planta de tabaco” significa qualquer porção de uma parte de planta ou qualquer combinação de partes de planta.
[0077] Conforme aqui utilizado, “operacionalmente vinculado” significa um vínculo funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, um vínculo operacional entre um polinucleotídeo de interesse e uma sequência reguladora (isto é, um promotor) é um vínculo funcional que possibilita a expressão do polinucleotídeo de interesse. Elementos operacionalmente vinculados podem ser contíguos ou nãocontíguos. Quando se referem à fusão de duas regiões codificadoras de proteína, “operacionalmente vinculado” pretende significar que as regiões codificadoras estão no mesmo marco de leitura.
[0078] Conforme aqui utilizado, “heterólogo” significa uma sequência que se origina a partir de uma espécie diferente, ou, caso pertençam à mesma espécie, que seja consideravelmente modificada de sua forma nativa em sua composição e/ou locus genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operacionalmente vinculado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente da espécie que deu origem ao polinucleotídeo, ou, caso sejam da mesma espécie ou de uma espécie análoga, um ou ambos são consideravelmente modificados de sua forma original e/ou locus genômico, ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo operacionalmente vinculado. Além disso, conforme aqui utilizado, “gene quimérico” significa uma sequência
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24/112 codificadora operacionalmente vinculada a uma região de início de transcrição que é heteróloga à sequência codificadora. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Polinucleotídeos e polipeptídeos de nicotina demetilase, além de variantes e fragmentos dos mesmos
[0079] As composições da presente invenção incluem polipeptídeos de citocromo P450. Os polipeptídeos de citocromo P450 podem apresentar atividade de nicotina demetilase. Esses polinucleotídeos e polipeptídeos de nicotina demetilase participam da conversão metabólica de nicotina a nornicotina nas plantas, incluindo variedades comerciais de plantas de tabaco. Também estão incluídas variantes dessas nicotinas demetilases. Em particular, as composições da invenção incluem polipeptídeos isolados que compreendem sequências de aminoácidos ilustrada nas SEQ N°:2 e 5-24, polinucleotídeos isolados que compreendem a sequência de ácidos nucléicos ilustrada nas SEQ N°:1, 3 e 4, bem como os polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos das SEQ N°:2 e 5-24. Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para inibir a expressão de polipeptídeos de nicotina demetilase ou de variantes dos mesmos que estejam envolvidas na conversão metabólica de nicotina a nornicotina nas plantas, particularmente nas plantas de tabaco. Alguns dos polinucleotídeos da invenção possuem mutações que inibem a atividade de nicotina demetilase da nicotina demetilase de tipo selvagem. A inibição de polipeptídeos da presente invenção é eficaz em reduzir os níveis de nornicotina em linhas de tabaco onde a conversão genética ocorre em menos do
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25/112 que 30%, 50%, 70% e 90% da população, como os tabacos curados em estufa. A inibição de polipeptídeos da presente invenção é eficaz em reduzir os níveis de nornicotina em populações de tabaco onde a conversão genética ocorre em pelo menos 90%, 80%, 70%, 60% e 50% da população vegetal. Uma população preferentemente contém mais do que cerca de 25, 50, 100, 500,
1.000, 5.000 ou 25.000 plantas sendo que, mais
preferentemente, pelo menos cerca de 10%, 25%, 50%, 75%, 95%
ou 100% das plantas compreendem um polipeptídeo da presente
invenção.
[0080] A presente invenção fornece, ainda, cassetes de
expressão compreendendo todos ou uma parte dos
polinucleotídeos que possuem uma sequência de ácidos nucléicos apresentada nas SEQ N°:1, 3 ou 4, e os polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos que possuem uma sequência de aminoácidos de SEQ N°: 2 e 5-24, um complemento ou fragmento da mesma, ou uma sequência que possua identidade de sequência considerável às SEQ N°:1, 3 ou 4, ou os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que possuem uma sequência de aminoácidos das SEQ N°:2 e 5-24, ou um complemento ou fragmento da mesma, operacionalmente vinculada a um promotor heterólogo que é funcional em uma célula vegetal para ser usada na expressão de uma transcrição de RNA inibitório que interfere com expressão (isto é, transcrição e/ou tradução) de polipeptídeos de nicotina demetilase. Em algumas configurações, os cassetes de expressão compreendem uma sequência de nucleotídeos apresentada nas SEQ N°:1, 3 ou 4, um complemento ou fragmento da mesma, ou uma sequência que possua identidade de sequência considerável às SEQ N°:1, 3 ou
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4, ou um complemento ou fragmento da mesma. A introdução desses cassetes de expressão em uma planta Nícotíana de interesse; particularmente em uma planta de tabaco de variedades normalmente conhecidas como variedades de estufa ou brilhantes, variedades Burley, variedades escuras e variedades orientais ou turcas; provoca a produção de plantas de tabaco com quantidades reduzidas de nornicotina e NNN. Os materiais de folha e talo dessas plantas transgênicas podem ser usados para fabricar uma variedade de produtos de tabaco com níveis reduzidos de nornicotina, e uma concomitante redução do NNN.
[0081] Os polinucleotídeos de nicotina demetilase e os polipeptídeos codificados da presente invenção incluem um novo gene P450 do citocromo, denominado gene nicotina demetilase CYP82E5v2, o qual é identificado de uma nova maneira como parte da conversão metabólica de nicotina a nornicotina nas plantas de tabaco. A supressão da expressão dos polipeptídeos codificados nas plantas transgênicas de tabaco provoca uma redução significativa da acumulação de nornicotina nas folhas verdes dessas plantas transgênicas. Ao não estar vinculado a uma teoria, o papel metabólico desses polipeptídeos pode ser direto, isto é, catalisando diretamente a reação de Ndemetilação, ou indireto, isto é, na forma de fabricação de um produto que leva à sobre-regulação da atividade de nicotina demetilase da folha. Independentemente do mecanismo, qualquer forma mediante a qual a expressão e/ou função dos polipeptídeos da presente invenção sejam alvo de inibição ou mutagênese dirigida em uma planta Nícotíana será eficaz em níveis reduzidos de nornicotina e NNN, nas folhas e talos dessas plantas.
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[0082] A invenção abrange polinucleotídeos isolados ou consideravelmente purificados ou composições de polipeptídeo da presente invenção. Um polinucleotídeo ou polipeptídeo isolado ou purificado, ou uma porção biologicamente ativa do mesmo, está consideravelmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou proteína, conforme encontrado em seu ambiente de ocorrência natural. Portanto, o polinucleotídeo ou polipeptídeo isolado ou purificado está consideravelmente livre de outro material celular ou meio de cultura ao ser produzido por técnicas recombinantes, ou consideravelmente livre de precursores químicos ou de outros químicos ao ser quimicamente sintetizado. Idealmente, um polinucleotídeo isolado está livre de sequências (idealmente sequências codificadoras de proteína) que naturalmente abordam o polinucleotídeo (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do polinucleotídeo) no DNA genômico do organismo do qual o polinucleotídeo deriva. Por exemplo, em várias configurações, o polinucleotídeo isolado pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequência de nucleotídeos que abordam naturalmente o polinucleotídeo no DNA genômico da célula da qual o polinucleotídeo deriva. Um polipeptídeo que está consideravelmente livre de material celular inclui preparações com menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (por peso seco) de proteína contaminante. Quando o polipeptídeo da invenção ou a porção biologicamente ativa do mesmo é produzido de forma recombinante, o meio de cultura ótimo representa menos do que cerca de 30% 20%, 10%, 5% ou 1% (por peso seco)
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28/112 dos precursores químicos ou dos químicos que não possuem uma proteína de interesse.
[0083] Fragmentos dos polinucleotídeos e polipeptídeos codificados aqui divulgados também formam parte da presente invenção. Fragmentos de um polinucleotídeo podem codificar fragmentos de polipeptídeos que retenham a atividade biológica do polipeptídeo nativo e, portanto, estão envolvidos na conversão metabólica de nicotina a nornicotina em uma planta. Alternativamente, fragmentos de um polinucleotídeo que são úteis como sondas de hibridização ou primers PCR usando os métodos descritos abaixo geralmente não codificam fragmentos de polipeptídeos que retêm atividade biológica. Além disso, fragmentos dos polinucleotídeos divulgados incluem aqueles que podem ser montados dentro de construtos recombinantes para serem usados no silenciamento de genes com qualquer método conhecido na especialidade, incluindo, mas não se limitando a, supressão/co-supressão senso, supressão anti-senso, interferência de RNA de fita dupla (dsRNA), interferência de RNA grampo e interferência de RNA grampo contendo íntrons, interferência mediada por amplicon, ribozimas e pequeno RNA ou micro RNA interferente, conforme descrito na especialidade e abaixo. Portanto, fragmentos de um polinucleotídeo poder
variar de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50
nucleotídeos, cerca de 7 0 nucleotídeos, cerca de 100
nucleotídeos, cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 200
nucleotídeos, 250 nucleotídeos , 300 nucleotídeos e até o
polinucleotídeo de extensão completa que codifica os
polipeptídeos da invenção, dependendo do resultado desejado.
Por exemplo, os fragmentos de um polinucleotídeo podem ter
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29/112 entre 100 e cerca de 350 nucleotídeos, entre 100 e cerca de
325 nucleotídeos, entre 100 e cerca de 300 nucleotídeos, entre
cerca de 125 e cerca de 300 nucleotídeos , entre cerca de 125 e
cerca de 275 nucleotídeos de extensão, entre cerca de 200 a
cerca de 320 nucleotídeos contíguos, entre cerca de 200 e
cerca de 420 nucleotídeos contíguos de extensão, entre cerca
de 250 e cerca de 450 nucleotídeos contíguos de extensão. Alternativamente, o fragmento pode ter entre cerca de 300 e cerca de 450 nucleotídeos contíguos de extensão.
[0084] Um fragmento de um polinucleotídeo de nicotina demetilase da presente invenção que codifica uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção irá codificar pelo menos 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo de nicotina demetilase de extensão completa da invenção (por ex., 517 aminoácidos para as SEQ N°:2 e 5), ou irá codificar pelo menos 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150 ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo de citocromo P450 de extensão parcial da invenção (por ex., 422 para a SEQ N°:12). Preferentemente, o fragmento compreende até o resíduo 330 do aminoácido do polipeptídeo codificado. Uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo de nicotina demetilase pode ser preparada isolando uma parte de um dos polinucleotídeos de citocromo P450 da presente invenção, expressando a porção codificada do polipeptídeo de citocromo P450 (por ex., pela expressão recombinante in vitro), e avaliando a atividade da porção codificada do polipeptídeo de
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30/112 citocromo P450, isto é, a capacidade de realizar a conversão de nicotina a nornicotina mediante ensaios conhecidos na especialidade e provistos abaixo.
[0085] Os polinucleotídeos que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos de citocromo P450 da presente invenção compreendem pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650 ou 1700 ácidos nucléicos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presentes em um polinucleotídeo de citocromo P450 de extensão completa, conforme aqui descrito (por ex., 1554 para a SEQ N°:1; ou 2608 para a SEQ N°:4). Os polinucleotídeos que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos de citocromo P450 da presente invenção compreendem fragmentos de cerca de 20 a cerca de 1700
ácidos nucléicos contíguos, de cerca de 50 a cerca de 1600
ácidos nucléicos contíguos, de cerca de 75 a cerca de 1500
ácidos nucléicos contíguos, de cerca de 100 a cerca de 1400
ácidos nucléicos, de cerca de 150 a cerca de 1300 ácidos
nucléicos contíguos, de cerca de 150 a cerca de 1200 ácidos
nucléicos contíguos, de cerca de 175 a cerca de 1100 ácidos
nucléicos contíguos, de cerca de 200 a cerca de 1000 ácidos
nucléicos contíguos, de cerca de 225 a cerca de 900 ácidos
nucléicos contíguos, de cerca de 500 a cerca de 1600 ácidos
nucléicos contíguos, de cerca de 775 a cerca de 1700 ácidos
nucléicos contíguos, de cerca de 1000 a cerca de 1700 ácidos
nucléicos contíguos, ou de cerca de 300 a cerca de 800 ácidos
nucléicos contíguos de um polinucleotídeo de citocromo P450, conforme aqui descrito. Por exemplo, o fragmento de
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31/112 polinucleotídeo pode compreender uma sequência de polinucleotídeos contendo uma sequência de ácidos nucléicos do polinucleotídeo próximo à posição 700 a próximo à posição 1250 de uma sequência codificante de citocromo P450, próximo à posição 700 a próximo à posição 1250 de uma sequência genômica de citocromo P450, próximo à posição 10 a próximo à posição 900 de uma sequência de íntrons de citocromo P450, ou próximo à posição 100 a próximo à posição 800 de uma sequência de íntrons de citocromo P450.
[0086] Variantes dos polinucleotídeos e polipeptídeos codificados descritos também formam, portanto, parte da presente invenção. As variantes de ocorrência natural incluem aquelas variantes que compartilham identidade de sequência considerável com os polinucleotídeos e polipeptídeos de citocromo P450 aqui descritos. As variantes de ocorrência natural podem compartilhar identidade funcional considerável com os polinucleotídeos de citocromo P450 aqui descritos. As composições e métodos da invenção podem ser usados para alterar a expressão ou função de qualquer citocromo P450 de ocorrência natural que compartilhe identidade de sequência considerável com os polipeptídeos de citocromo P450. Esses citocromos P450 podem possuir a atividade relevante do citocromo P450, isto é, a participação na conversão metabólica de nicotina a nornicotina nas plantas, ou não. Essas variantes podem ser resultantes de, por ex., polimorfismo genético ou de manipulação humana como ocorre com o cultivo e a seleção. As variantes biologicamente ativas de uma proteína de citocromo P450 da invenção, como variantes do polipeptídeo apresentado nas SEQ N°:2 e 5-24, possuem pelo menos cerca de 40%, 45%,
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50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos para a proteína de tipo selvagem, conforme determinado pelos programas e parâmetros de alinhamento de sequências descritos neste documento, podendo ser caracterizadas por uma participação funcional na conversão metabólica de nicotina a nornicotina nas plantas ou pela ausência da mesma. Uma variante biologicamente ativa de um polipeptídeo da invenção pode diferir por apenas 1 a 15 resíduos de aminoácido, apenas 10, apenas 9, apenas 8, apenas 7, apenas 6, apenas 5, apenas 4, apenas 3, apenas 2 ou apenas 1 resíduo de aminoácido do polipeptídeo de tipo selvagem. Uma variante biologicamente inativa de uma proteína da invenção pode diferir desse polipeptídeo por apenas 1 a 15 resíduos de aminoácido, apenas 10, apenas 9, apenas 8, apenas 7, apenas 6, apenas 5, apenas 4, apenas 3, apenas 2 ou apenas 1 resíduo de aminoácido.
[0087] As variantes dos polinucleotídeos da presente invenção incluem aqueles polinucleotídeos de ocorrência natural que codificam um polipeptídeo de nicotina demetilase que participa da conversão metabólica de nicotina a nornicotina nas plantas. Essas variantes de polinucleotídeo podem compreender uma eliminação e/ou uma adição de um ou mais nucleotídeos em uma ou mais localizações dentro do polinucleotídeo nativo aqui descrito e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em uma ou mais localizações no polinucleotídeo nativo. Devido a degeneração do código genético, variantes conservadoras para polinucleotídeos incluem aquelas sequências que codificam a sequência de
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33/112 aminoácidos de um dos polipeptídeos de citocromo P450 da invenção. Variantes de ocorrência natural como essas podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular conhecidas, como, por ex., com reação em cadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridização conforme indicadas na especialidade e aqui descritas. Os polinucleotídeos variantes também incluem polinucleotídeos derivados sinteticamente, como aqueles gerados, por ex., usando mutagênese dirigida, mas que ainda compartilham identidade de sequência considerável com as sequências de ocorrência natural aqui apresentadas, podendo, portanto, serem usadas nos métodos da invenção para inibir a expressão ou função de uma nicotina demetilase que participe da conversão metabólica de nicotina a nornicotina, incluindo os polipeptídeos de nicotina demetilase apresentados nas SEQ N°:2, 5, 7-11, 13, 16-21 e 23-24. Geralmente, variantes de um polinucleotídeo particular da invenção, por ex., a sequência de polinucleotídeos de SEQ N°:3 ou a sequência de polinucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ N°:2 e 5-24, possuem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com aquele polinucleotídeo particular, conforme determinado pelos programas e parâmetros de alinhamento de sequências descritos neste documento.
[0088] As variantes de um polinucleotídeo em particular da presente invenção (também denominado polinucleotídeo de referência) também podem ser avaliadas mediante a comparação da identidade de sequência porcentual entre o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência e o polipeptídeo
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34/112 codificado por uma variante do polinucleotídeo. A identidade de sequência porcentual entre dois polipeptídeos quaisquer pode ser calculada usando programas e parâmetros de alinhamento de sequências descritos neste documento. Quando qualquer par de polinucleotídeos da invenção é avaliado mediante a comparação da identidade de sequência porcentual compartilhada pelos dois polipeptídeos que eles codificam, a identidade de sequência porcentual entre os dois polipeptídeos codificados é pelo menos de cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência. Uma variante de um polipeptídeo da presente invenção pode incluir um polipeptídeo com uma serina na posição 458, uma asparagina na posição 364 do polipeptídeo de citocromo P450, um códon de parada na posição 329 do citocromo P450 ou qualquer combinação dos mesmos, sendo que a numeração corresponde à SEQ N°:13.
[0089] Além disso, os polinucleotídeos da invenção podem ser usados para isolar as correspondentes sequências de citocromo P450 de outros organismos, particularmente de outras plantas, ainda mais particularmente de outros membros do gênero Nícotíana. A PCR, a hibridização e outros métodos similares podem ser usados para identificar essas sequências com base na homologia de sua sequência com respeito às sequências aqui apresentadas. Sequências isoladas com base em sua identidade de sequência com respeito às sequências de nucleotídeos aqui apresentadas ou a variantes e fragmentos das mesmas formam parte da presente invenção. Essas sequências incluem sequências que são ortólogos das sequências descritas.
[0090] Conforme aqui utilizado, ortólogos significam
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35/112 genes derivados de um gene ancestral que se encontram em diferentes espécies com resultado da especiação. Os genes encontrados em diferentes espécies são considerados ortólogos quando suas sequências de nucleotídeos e/ou suas sequências de proteínas codificadas compartilham pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência. As funções dos ortólogos costumam estar altamente conservadas entre as espécies. Portanto, os polinucleotídeo isolados que codificam um polipeptídeo de nicotina demetilase que participa da conversão metabólica de nicotina a nornicotina e que hibridiza sob condições estringentes as sequências de citocromo P450 aqui descritas, ou variantes e fragmentos da mesma, formam parte da presente invenção. Essas sequências podem ser usadas nos métodos da presente invenção para inibir a expressão de polipeptídeos de nicotina demetilase que participam da conversão metabólica de nicotina a nornicotina nas plantas.
[0091] Usando PCR, os primers de oligonucleotídeo podem ser criados para serem usados em reações de PCR para amplificar as correspondentes sequências de DNA a partir de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse. Os métodos para criar primers PCR e para a clonagem PCR são geralmente conhecidos na especialidade e são descritos em Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual (2d ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Innis et al., eds. (1990) PCR protocolos: a guide to methods and applications (Academic Press, New York); Innis e Gelfand, eds.
(1995) PCR estratégias (Academic Press, New York); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR methods manual (Academic Press, New
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York) . Métodos conhecidos de PCR incluem, mas não se limitam a, métodos que usam primers pareados, primers aninhados, primers específicos únicos, primers degenerados, primers específicos de genes, primers específicos de vetor, primers com erro parcial de pareamento, entre outros.
[0092] As técnicas de hibridização requerem o uso de todo ou parte de um polinucleotídeo conhecido como uma sonda que seletivamente hibridiza outros polinucleotídeos correspondentes presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonado ou fragmentos de cDNA (isto é, genômico ou bibliotecas cDNA) a partir de um organismo selecionado.
[0093] A hibridização pode ser realizada sob condições estringentes. Conforme aqui utilizado, “condições estringentes” ou condições estringentes de hibridização” significam condições sob as quais uma sonda hibridiza sua sequência alvo a um grau claramente maior do que a outras sequências (por ex., pelo menos duas vezes mais do que a de fundo). As condições estringentes dependem da sequência e são diferentes em circunstâncias diferentes. Ao controlar a estringência da hibridização e/ou as condições de lavagem, as sequências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum grau de erro de pareamento de sequências, de forma tal que os níveis mais baixos de semelhança sejam detectados (sondagem heteróloga) . Geralmente, uma sonda possui menos do que cerca de 1000 ácidos nucléicos de extensão, idealmente menos do que 500 ácidos nucléicos de extensão.
[0094] Normalmente, as condições estringentes são aquelas
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37/112 nas quais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M de íon de Na, normalmente cerca de 0,01 a 1,0 M de íon de Na concentração (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C. As condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores como a formamida. Condições de baixa estringência que podem ser usadas como exemplo incluem a hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida,
1 M NaCl, 1% SDS (sulfato dodecil de sódio) a 37°C e uma
lavagem em 1X a 2X SSC (20X SSC = 3. 0 M NaCl/0.3 M citrato de
tri-sódio) de 50 a 55 °C. Condições de estringência moderada
que podem ser usadas como exemplo incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1.0 M NaCl, 1% SDS a 37°C e uma lavagem em 0.5X a 1X SSC de 55 a 60°C. Condições de alta estringência que podem ser usadas como exemplo incluem hibridização em 50% de formamida, 1 M NaCl, 1% SDS a 37°C e uma lavagem em 0.1X SSC de 60 a 65°C. Opcionalmente, os tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração da hibridização é geralmente inferior a cerca de 24 horas, geralmente cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração da lavagem será de pelo menos um período suficiente para alcançar o equilíbrio.
[0095] Preferentemente, as condições de estringência incluem a hibridização em uma solução contendo 5X SSC, 0.5% de SDS, 5X Denhardt's, 0,45 ug/ul poli A RNA, 0,45 ug/ul de DNA de timus de bezerro e 50% de formamida a 42°C, e pelo menos uma lavagem pós-hibridização em uma solução compreendendo cerca de 0.01X SSC a cerca de l X SSC. A duração da hibridização é de cerca de 14 a cerca de 16 horas.
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[0096] A especificidade é normalmente a função das lavagens pós-hibridização, sendo que os fatores críticos são a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% forma) - 500/L; sendo que M é a molaridade dos cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, % forma é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é a extensão do híbrido em pares de base. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza uma sonda perfeitamente pareada. A Tm é reduzida a cerca de l°C para cada l% de erro de pareamento; portanto, a Tm, a hibridização e/ou as condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar sequências da identidade desejada. Por exemplo, caso sequências com >90% de identidade sejam buscadas, a Tm pode ser reduzida a 10°C. Geralmente, as condições estringentes são selecionadas para estar cerca de 5°C abaixo do ponto de derretimento térmico (Tm) para a sequência específica e seu complemento a uma força iônica e pH definidos. Porém; condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4°C abaixo do ponto de derretimento térmico (Tm); condições estringentes moderadas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C abaixo do ponto de derretimento térmico (Tm); condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C abaixo do ponto de derretimento térmico (Tm) . Usando a equação, a hibridização e
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39/112 as composições de lavagem, além da Tm desejada, indivíduos com conhecimento médio da matéria poderão entender as variações na estringência das soluções de hibridização e/ou de lavagem que são inerentemente descritas. Caso o grau desejado de erro de pareamento resulte em uma Tm inferior a 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é ideal diminuir a concentração SSC de forma tal que uma temperatura mais alta possa ser usada. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucléicos se encontra em Tijssen (1993) Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York); e Ausubel et al., eds. (1995) Current protocolos in molecular biology, Capítulo 2 (Greene Publishing e Wiley-Interscience, New York). Vide também, Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
[0097] As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou de outros oligonucleotídeos, podendo ser etiquetadas com um grupo detectável como o 32P, ou com qualquer outro marcador deletável. Por exemplo, as sondas para hibridização podem ser feitas etiquetando oligonucleotídeos sintéticos com base nos
polinucleotídeos de sequências de citocromo P450 da presente
invenção. Os métodos para a preparação de sondas de
hibridização e para a construção de cDNA e de bibliotecas
genômicas são geralmente conhecidos na especialidade e são descritos em Sambrook et al., supra.
[0098] Por exemplo, os polinucleotídeos de citocromo P430 aqui descritos, bem como uma ou mais porções do mesmo, podem
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40/112 ser usados como sondas capazes de hibridizar especificamente os correspondentes polinucleotídeos de citocromo P450 e RNA mensageiros. Para realizar uma hibridização específica sob uma variedade de condições, essas sondas incluem sequências que são únicas entre as sequências de polinucleotídeo de citocromo P450 ou única para uma das sequências de polinucleotídeo de citocromo P450, incluindo regiões superiores 5' para a sequência de codificação e regiões inferiores 3' para a sequência de codificação e região de íntron, possuindo idealmente pelo menos cerca de 10 nucleotídeos contíguos de extensão, mais idealmente pelo menos cerca de 20 ácidos nucléicos contíguos de extensão, mais idealmente pelo menos cerca de 50 ácidos nucléicos contíguos de extensão, mais idealmente pelo menos cerca de 75 ácidos nucléicos contíguos de extensão, e mais idealmente pelo menos cerca de 100 ácidos nucléicos contíguos de extensão. Essas sondas podem ser usadas para amplificar os correspondentes polinucleotídeos de citocromo P450. Essa técnica pode ser usada para isolar sequências de codificação adicionais ou mutações de uma planta desejada ou como um ensaio diagnóstico para determinar a presença de sequências de codificação em uma planta. As técnicas de hibridização incluem identificação por hibridização de bibliotecas de DNA em placa (placas ou colônias; vide, por ex., Sambrook et al., supra.)
[0099] Conforme aqui utilizado, com respeito aos relacionamentos de sequência entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos, o termo “sequência de referência” significa uma sequência definida usada como base para a comparação de sequências. Uma sequência de referência
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41/112 pode ser um subconjunto ou uma determinada sequência completa; por exemplo, como um segmento de um cDNA ou sequência genética de extensão completa, ou o cDNA ou sequência genética completos.
[0100] Conforme aqui utilizado, “janela de comparação” representa um segmento contíguo e especificado de uma sequência de polinucleotídeos, sendo que a sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode conter adições ou eliminações (isto é, intervalos) se comparada com a sequência de referência (que não contém adições ou eliminações) para um perfeito alinhamento dos dois polinucleotídeos. Geralmente, a janela de comparação possui pelo menos 20 ácidos nucléicos contíguos de extensão, podendo opcionalmente possuir 30, 40, 50 ou 100 ácidos nucléicos contíguos ou mais. Os especialistas na matéria entendem que a fim de evitar uma alta similariadade com respeito a uma sequência de referência devido à inclusão de intervalos na sequência de polinucleotídeos, uma penalidade por intervalos é normalmente introduzida e substraída do número de pareamentos.
[0101] Os métodos de alinhamento para comparação de sequências são bem conhecidos na especialidade. Portanto, a determinação da porcentagem de identidade de sequência existente entre duas sequências quaisquer pode ser realizada utilizando um algoritmo matemático. Exemplos não exaustivos desses algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; o método de alinhamento de busca local de Pearson
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42/112 e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.
[0102] Os programas BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se baseiam no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) supra. As buscas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, extensão de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína da invenção. As buscas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, extensão de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma proteína ou polipeptídeo da invenção. Para obter alinhamentos com intervalos para propósitos de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSIBLAST (in BLAST 2.0) pode ser utilizado para realizar uma busca iterada que detecta relacionamentos distantes entre moléculas. Vide Altschul et al. (1997) supra. Ao utilizar BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetros predefinidos dos respectivos programas (por ex., BLASTN for sequências de nucleotídeos, BLASTX para proteínas) podem ser usados (Vide www.ncbi.nlna.nih.gov). O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.
[0103] Os valores de identidade ou semelhança de sequência aqui fornecidos foram calculados usando algoritmos BLASTX (Altschul et al. (1997) supra), Clustal W (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) e GAP (pacote de
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43/112 software do University of Wisconsin Genetic Computing Group) com parâmetros predefinidos. A presente invenção também abrange o uso de qualquer programa equivalente para análise e comparação de sequências de ácidos nucléicos e proteínas. Por “programa equivalente” entende-se qualquer programa de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento com pareamento de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos idênticos e uma identidade de sequência porcentual idêntica ao serem comparados com os correspondentes alinhamentos gerados por BLASTX, Clustal W ou GAP.
[0104] Devido à discussão adiante sobre variantes de sequências de nucleotídeos e polipeptídeos que formam parte da presente invenção, “identidade de sequência” ou “identidade” no contexto de duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeo se refere aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados para uma correspondência máxima sobre uma determinada janela de comparação. Quando a porcentagem de identidade de sequência é usada com referência a proteínas deve-se reconhecer que as posições dos resíduos que não são idênticos diferem normalmente por substituições de aminoácidos conservadoras, sendo que os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por ex., carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não modificam as propriedades funcionais da molécula. Quando as sequências diferem em substituições conservadoras, a identidade de sequência porcentual pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. As sequências que
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44/112 diferem por essas substituições conservadoras possuem “semelhança de sequência” ou “semelhança”. Os meios para realizar esse ajuste são bem conhecidos pelos especialistas. Normalmente, é preciso pontuar uma substituição conservadora como um erro de pareamento parcial em vez de total, aumentando, assim, a identidade de sequência porcentual. Portanto, por exemplo, caso um aminoácido idêntico receba uma pontuação de 1 e uma substituição não-conservadora receba uma pontuação de zero, a substituição conservadora recebe uma pontuação entre zero e 1. A pontuação de substituições conservadoras é calculada, por ex., conforme implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics; Mountain View, CA).
[0105] Conforme aqui utilizado, “porcentagem de identidade de sequência” significa o valor determinado ao comparar duas sequências perfeitamente alinhadas sobre a janela de comparação, sendo que a porção da sequência de polinucleotídeos da janela de comparação pode conter adições ou eliminações (isto é, intevalos) quando comparada à sequência de referência (que não contém adições ou eliminações) para um perfeito alinhamento das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucléico ou o resíduo de aminoácido idêntico ocorrem em ambas as sequências para obter o número de posições pareadas, dividindo o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para obter a porcentagem de identidade de sequência.
[0106] Portanto, as sequências de polinucleotídeos de citocromo P450 e de polipeptídeos podem ser identificadas
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45/112 usando as sequências aqui fornecidas. Esses métodos incluem obter um polinucleotídeo ou uma sequência de polipeptídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de polinucleotídeos das SEQ N°:1, 3 ou 4 ou um complemento ou fragmento da mesma, ou uma sequência de polipeptídeos das SEQ N°:2 ou 5-24. Uma configuração preferida inclui um polipeptídeo correspondente à SEQ N°:13 que possui uma serina na posição 458 ou uma asparagina na posição 364 do polipeptídeo de citocromo P450, ou um códon de parada na posição 329 do citocromo P450, ou uma combinação dos mesmos, sendo que a numeração corresponde à SEQ N°:13.
Cassetes de expressão para serem usados nos métodos da invenção
[0107] As composições da presente invenção incluem, ainda, cassetes de expressão compreendendo sequências inibitórias capazes de inibir a expressão ou a função de um polipeptídeo de nicotina demetilase que participa da conversão de nicotina a nornicotina em uma planta ou parte de planta Nícotíana, sendo que as sequências inibitórias estão operacionalmente vinculadas a um promotor que é funcional em uma célula vegetal. Dessa forma, os cassetes de expressão compreendendo todas ou partes das sequências apresentadas nas SEQ N°:1, 3 ou 4 ou que codificam as SEQ N°:2 ou 5-24, um complemento ou fragmento das mesmas, ou sequências que compartilhem uma considerável identidade de sequência com respeito a essas sequências, ou um complemento ou fragmento do mesmo, operacionalmente vinculado a um promotor que é funcional em uma célula vegetal são construídos para serem usados nos métodos de silenciamento genético da presente invenção
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46/112 descrita abaixo. Essas sequências são denominadas “sequências inibitórias ou sequências inibitórias de polinucleotídeos, já que são capazes de serem expressas como uma molécula de RNA que inibe a expressão (isto é, a transcrição e/ou tradução) do polipeptídeo de citocromo P450 alvo, por exemplo, o polipeptídeo apresentado na SEQ N°:2 ou 5-24 e variantes do mesmo, sendo que as variantes de polipeptídeos possuem uma considerável identidade de sequência em relação aos polipeptídeo de citocromo P450 descritos. Essas variantes podem ou não participar da conversão metabólica de nicotina a nornicotina em uma planta. Essas sequências também incluem sequências de fragmentos do polinucleotídeo ou polipeptídeo de citocromo P450 alvo. Por exemplo, uma sequência de fragmento pode incluir qualquer parte da sequência de citocromo P450, incluindo sequência de codificação e de não-codificação (por ex., sequências 5' UTR, íntron e 3' UTR), podendo incluir fragmentos entre 100 e cerca de 350 ácidos nucléicos, entre cerca de 125 e cerca de 300 ácidos nucléicos, ou entre cerca de 125 e cerca de 275 ácidos nucléicos. Preferentemente, um fragmento de nicotina demetilase pode possuir entre cerca de 20 e cerca de 420, cerca de 30 e cerca de 420, entre cerca de 40 e cerca de 320, entre cerca de 50 e cerca de 200, entre cerca de 50 e cerca de 400, entre cerca de 50 e cerca de 420, entre cerca de 60 e cerca de 320, cerca de 70 e cerca de 220, entre cerca de 100 e cerca de 200, entre cerca de 100 e cerca de 320, entre cerca de 150 e cerca de 200, entre cerca de 150 e cerca de 220, entre cerca de 150 e cerca de 400, entre cerca de 200 e cerca de 300 ou entre cerca de 300 e cerca de 400 ácidos nucléicos contíguos. Alternativamente, um fragmento de
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47/112 um citocromo P450 pode possuir cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 220, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 320, ou cerca de 350 ácidos nucléicos contíguos de extensão. Alternativamente, um fragmento de citocromo P450 pode ter sua extensão reduzida a cerca de 20, cerca de 40, cerca de 60, cerca de 80, cerca de 100, cerca de 120, cerca de
140, cerca de 160, cerca de 180, cerca de 200, cerca de 220, cerca de 240, cerca de 260, cerca de 280, cerca de 290, cerca de 300, cerca de 320, cerca de 340, cerca de 360, cerca de 380, cerca de 400 ácidos nucléicos contíguos em comparação com a extensão completa. Para todos esses fragmentos de citocromo P450, o truncamento ou eliminação pode começar na extremidade 5', começar na extremidade 3' ou ser interna a um citocromo
P450 ou um íntron de citocromo P450. Para um fragmento de
íntron de citocromo P450, a sequência inteira de um íntron de
citocromo P450 pode ser a SEQ N° :3.
[0108] Além disso, um fragmento de um polinucleotídeo ou
polipeptídeo de citocromo P450 pode conter nucleotídeos contíguos de cerca de 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90% do gene completo. Dito de outra maneira, um fragmento de um polinucleotídeo ou polipeptídeo de citocromo P450 pode conter entre cerca de 5% a cerca de 80%, entre cerca de 10% a cerca de 70%, entre cerca de 10% a cerca de 60%, entre cerca de 10% a cerca de 50%, entre cerca de 25% a cerca de 60%, entre cerca de 25% a cerca de 50%, entre cerca de 40% a cerca de 60%, entre cerca de 40% a cerca de 80%, entre cerca de 50% a cerca de 90% da extensão de um citocromo P450 inteiro.
[0109] Os cassetes de expressão da presente invenção incluem aqueles que abrangem domínios adicionais que modulam o
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48/112 nível de expressão, o tempo de desenvolvimento da expressão ou o tipo de tecido no qual a expressão ocorre (por ex., Patente da Austrália N° AU-A-77751/94 e Patente dos EUA N° 5.466.785 e 5.635.618) . Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucléicos da presente invenção podem ser combinados com promotores induzíveis, constitutivos, induzidos por patógenos ou por feridas, regulados ambientalmente ou por desenvolvimento, preferidos pela célula ou tecido, ou com outros promotores para a expressão nas plantas.
[0110] Os promotores induzidos por químicos podem ser usados para inibir a expressão de um citocromo P450 que participa da conversão metabólica de nicotina a nornicotina em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Os promotores induzidos por químicos são conhecidos na especialidade e incluem, mas não se limitam a, o promotor PR-la do tabaco, ativado por ácido salicílico. Outros promotores induzidos por químicos de interesse incluem promotores responsivos esteróides (vide, por ex. , o promotor induzido por glicocorticóide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425; e McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257) e os promotores induzidos por tetraciclina (vide, por ex., Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229237; e Patente dos EUA N° 5.814.618 e 5.789.156), cada um dos quais se incorpora aqui como referência como se fossem apresentados em caráter íntegro.
[0111] Os promotores constitutivos incluem, por ex., o promotor principal do promotor Rsyn7 e promotores constitutivos externos descritos na Patente dos EUA N°
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6.072.050; o promotor principal CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632; e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:27232730); promotor ALS (Patente dos EUA N° 5.659.026), entre outros. Outros promotores constitutivos incluem, por ex., aqueles descritos nas Patentes dos EUA N° 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611.
[0112] Os promotores preferidos por tecidos podem ser utilizados para ter como alvo a expressão de uma sequência inibitória de polinucleotídeos da presente invenção dentro de um tecido vegetal em particular. Os promotores preferidos por tecidos incluem aqueles descritos em Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet.
254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol.
112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol.
112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138;
Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20) :95869590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505.
[0113] São de particular interesse os promotores preferidos por folhas que possibilitam a expressão predominantemente em tecidos de folhas. Vide, por ex., Yamamoto et al. (1997) Plant
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J. 12(2):255-265,· Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:35767; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778, Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138, Baszczynski et al. (1988) Nucl. Acid Res. 16:4732; Mitra et al. (1994) Plant Molecular Biology 26:35-93; Kayaya et al. (1995) Molecular and General Genetics 248:668-674; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590. Regulado por senescência et al. (1998) Plant Physiol. 116:329-335); SAG 13 (Gan e Amasino (1997) Plant Physiol. 113:313-319; SAG 15 (Gan (1995) “Molecular Characterization and Genetic Manipulation of Plant Senescência”, Tese de Ph.D., Universidade de Wisconsin, Madison); SEN1 (Oh et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:739-754; promotor de um gene específico de senescência para a expressão de IPT (Gan e Amasino 91995) Science 270:1986-1988); entre outros (vide, por ex., Or et al. (1999) Plant Cell 11:10731080; e McCabe et al. (2001) Plant Physiol. 127:505-516).
[0114] Os cassetes de expressão da presente invenção podem incluir sequências líderes 5' que podem agir melhorando a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na especialidade e incluem, mas não se limitam a, líderes picornavírus, por ex., líder EMCV (Encefalomiocardite na região não-codificadora 5'; Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acid. Sci. USA 86:6126-6130); líderes potyvírus, por ex., líder TEV (Vírus “etch” do tabaco; Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), líder MDMV (Vírus do mosaico anão do milho; Virology 154:9-20) e proteína vinculante de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP; Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido da proteína coberta de
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51/112 mRNA do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4; Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV; Gallie et al. (1989) em Molecular biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); e líder do vírus mosqueado clorótico do milho (MCMV; Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385) . Vide também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Outros métodos conhecidos para melhorar a tradução também podem ser utilizados.
Métodos para inibir a expressão ou a função de uma nicotina demetilase
[0115] São disponibilizados métodos para reduzir a concentração, o conteúdo e/ou a atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção em uma planta ou parte de planta Nicotiana, particularmente no tecido da folha. Muitos métodos podem ser usados, isoladamente ou combinados, para reduzir ou eliminar a atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção, mais particularmente, a nicotina demetilase CYP82E5v2. Além disso, combinações de métodos podem ser usadas para reduzir ou eliminar a atividade de dois ou mais polipeptídeos de citocromo P450 diferentes, particularmente as nicotina demetilases CYP82E5v2 e CYP82E4v2. Preferentemente, a CYP82E5v2 é um polipeptídeo com pelo menos uma mutação de aminoácidos na SEQ N°:2 que afeta negativamente a conversão em folhas verdes e a CYP82E4v2 possui a sequência apresentada na SEQ N°:13 com pelo menos uma mutação de aminoácidos que afeta negativamente a conversão em folhas senescentes.
[0116] De acordo com a presente invenção, a expressão de um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção é inibida
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52/112 se o nível de proteínas do polipeptídeo de citocromo P450 for estatisticamente menor do que o nível de proteínas do mesmo polipeptídeo de citocromo P450 em uma planta que não tenha sido geneticamente modificada ou mutagenizada para inibir a expressão desse polipeptídeo de citocromo P450, sendo que essas plantas foram cultivadas e colhidas usando o mesmo protocolo. Em configurações particulares da invenção, o nível de proteínas do polipeptídeo de citocromo P450 em uma planta modificada de acordo com a invenção é de menos do que 95%, menos do que 90%, menos do que 80%, menos do que 70%, menos do que 60%, menos do que 50%, menos do que 40%, menos do que 30%, menos do que 20%, menos do que 10%, ou menos do que 5% do nível de proteínas do mesmo polipeptídeo de citocromo P450 em uma planta que não seja um mutante ou que não tenha sido geneticamente modificada para inibir a expressão desse polipeptídeo de citocromo P450 e que tenha sido cultivada e colhida usando os mesmos protocolos. O nível de expressão do polipeptídeo de citocromo P450 pode ser medido diretamente, por exemplo, testando o nível da transcrição do citocromo P450 ou do polipeptídeo de citocromo P450 expressado na planta ou parte de planta Nícotíana, ou indiretamente, por ex., medindo a conversão de nicotina a nornicotina na planta ou parte de planta Nícotíana. Os métodos para monitorar o nível de expressão de um polipeptídeo são conhecidos na especialidade e incluem, mas não se limitam a, análise Northern blot e ensaios de diferenciação de RNA. Os métodos para determinar a atividade dos polipeptídeos de citocromo P450 alvo na transformação de nicotina a nornicotina são conhecidos na especialidade e descritos abaixo, incluindo, mas não se
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53/112 limitando a, análise alcalóide usando cromatografia a gás.
[0117] Em alguns casos, a atividade de um ou mais polipeptídeos de citocromo P450 é reduzida ou eliminada transformando uma planta ou parte de planta com um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que inibe a atividade de um ou mais polipeptídeos de citocromo P450 da presente invenção. Diversos enfoques foram usados para combinar transgenes ou mutações em uma planta, incluindo cruzamento sexual, retransformação, cotransformação e o uso de transgenes vinculados. Um transgene quimérico com sequências genéticas parciais vinculadas pode ser usado para suprimir numerosos genes vegetais endógenos de forma coordenada. Os construtos modelados em poliproteínas virais podem ser usados para introduzir simultaneamente vários genes codificadores em células vegetais. Para uma revisão, vide Halpin et al. , Plant Mol. Biol. 47:295-310 (2001) . Uma planta que possua uma mutação na CYP82E4v2 que iniba a atividade de nicotina demetilase em folhas senescentes pode ser cruzada com uma planta que possua uma mutação na CYP83E5v2 capaz de inibir nicotina demetilase em folhas verdes para produzir uma planta com níveis de conversão menores do que cerca de 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6% ou 0,7%. Alternativamente, uma planta que possua uma ou mais mutações na CYP82E4v2 nas posições 458, 364, 38, 201, 169, 459, 296,
427, 329, 376 ou 171 pode ser cruzada com uma planta que
possua uma ou mais mutações na CYP83E5v2 na s posições 235,
449, 174, 410, 224, 72 ou 143 para produzir uma planta com
níveis de conversão menores do que cerca 0, 2%, 0,3%, 0 ,4%,
0,5%, 0,6% ou 0,7% . Em outra alternativa, uma planta que
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54/112 possua uma ou mais mutações na CYP82E4v2 nas posições 458, 364 ou 329 pode ser cruzada com uma planta que possua uma ou mais mutações na CYP83E5v2 nas posições 235, 449, 174, 410, 224, 72 ou 143 para produzir uma planta com níveis de conversão menores do que cerca 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6% ou 0,7%. Um nível de conversão de nicotina a nornicotina particularmente preferido pode estar entre 0,05% e 0,4%, entre 0,1 e 0,6%, entre 0,1% e 0,3%, entre 0,1% e 0,5%, entre 0,1% e 0,4%, entre 0,1% e 0,7%, ou entre 0,1% e 1,0%. Qualquer mutação de um polinucleotídeo da presente invenção que provoque um truncamento do polipeptídeo CYP83E4v2 ou CYP83E5v2 diante de um motivo conservado de ligação heme irá inibir a enzima e poderá ser usado em um dos cruzamentos acima descritos. Os domínios das proteínas de citocromo P450 são conhecidos na especialidade. Vide, por ex., Xu et al. (2007) Physiologia Plantarum 129:307-319, incorporada aqui como referência como se fossem apresentadas em caráter íntegro. Ao cruzar plantas que possuem um gene CYP82E4v2 não-funcional ou inibido, um gene CYP82E5v2 não-funcional ou inibido, ou genes CYP82E4v2 e CYP82E5v2 não-funcionais ou inibidos, os níveis de nornicotina podem ser reduzidos em uma planta de tabaco.
[0118] A atividade de um polipeptídeo de nicotina demetilase ao transformar nicotina em nornicotina em uma planta ou parte de planta Nicotiana é inibida de acordo com a presente invenção caso essa atividade de conversão seja estatisticamente inferior à atividade de conversão do mesmo polipeptídeo de citocromo P450 em uma planta ou parte de planta Nicotiana que não tenha sido geneticamente modificada para inibir a atividade de conversão desse polipeptídeo de
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55/112 citocromo P450 e que tenha sido cultivada e colhida usando os mesmos protocolos. Em configurações particulares, a atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 ao transformar nicotina em nornicotina em uma planta ou parte de planta Nícotíana modificada de acordo com a invenção é inibida caso a atividade represente menos do que 95%, menos do que 90%, menos do que 80% menos do que 70%, menos do que 60%, menos do que 50%, menos do que 40%, menos do que 30%, menos do que 20% menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 2% ou menos do que 1% da atividade de conversão do mesmo polipeptídeo de citocromo P450 em uma planta Nícotíana que não tenha sido geneticamente modificada para inibir a expressão desse polipeptídeo de nicotina demetilase e que tenha sido cultivada e colhida usando os mesmos protocolos. A atividade de um polipeptídeo de nicotina demetilase ao transformar nicotina em nornicotina em uma planta ou parte de planta Nícotíana é eliminada de acordo com a invenção quando não é possível detectá-la mediante métodos de ensaio conhecidos na especialidade ou aqui descritos. Métodos para determinar a atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 ao transformar nicotina em nornicotina em uma Nícotíana usando cromatografia a gás são descritos nos exemplos abaixo.
[0119] Em configurações específicas, um polinucleotídeo inibitório de citocromo P450 ou uma mutação de nicotina demetilase aqui descritos são introduzidos em uma planta ou parte de planta Nícotíana. Consequentemente, a planta ou parte de planta Nícotíana na qual tenham sido introduzidos os polinucleotídeo de inibição da presente invenção é selecionada mediante métodos conhecidos pelos especialistas, incluindo,
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56/112 mas não se limitando a, análise Southern blot, sequenciamento de DNA, análise de PCR ou análise fenotípica. Uma sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos da presente invenção inclui uma sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos de extensão completa, uma sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos truncada, fragmentos de sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos, variantes de sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos, sequências de nucleotídeos com orientação senso, sequências de nucleotídeos com orientação anti-senso, o complemento de uma sequência de nucleotídeos com orientação senso ou anti-senso, regiões invertidas de sequências de nucleotídeos, grampos de sequências de nucleotídeos, sequências de nucleotídeos de fita dupla, sequências de nucleotídeos de fita simples, combinações das mesmas, entre outros. Uma planta ou parte de planta alterada ou modificada pelos métodos anteriores cresce sujeita a condições de formação de plantas por um tempo suficiente para modular a concentração e/ou a atividade dos polipeptídeos da presente invenção na planta. As condições de formação das plantas são bem conhecidas na especialidade e explicadas brevemente neste documento.
[0120] Uma planta de tabaco transformada que contém uma sequência inibitória de polinucleotídeos de nicotina demetilase aqui descrita possui um nível de conversão de nicotina a nornicotina. Em configurações particulares, a conversão de nicotina a nornicotina em uma planta ou parte de planta de tabaco transformada de acordo com a invenção é menos do que 95%, menos do que 90%, menos do que 80% menos do que 70%, menos do que 60%, menos do que 50%, menos do que 40%,
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57/112 menos do que 30%, menos do que 20%, menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 2% ou menos do que 1% da conversão em uma planta de tabaco que não tenha sido geneticamente modificada para inibir a expressão desse polipeptídeo de nicotina demetilase e que tenha sido cultivada e colhida usando os mesmos protocolos. Em alguns casos, a planta de tabaco transformada é uma planta conversora de tabaco. Alternativamente, a planta de tabaco transformada é uma planta não conversora de tabaco. Alternativamente, a planta de tabaco transformada possui uma taxa de conversão menor do que a taxa observada em plantas de tabaco não-conversoras comerciais.
[0121] O nível e/ou a atividade do polipeptídeo podem ser modulados utilizando um polinucleotídeo que não seja capaz de dirigir, em uma planta transformada, a expressão de uma proteína ou de um RNA. Por exemplo, os polinucleotídeos da invenção podem ser usados para projetar construtos de polinucleotídeos que podem ser utilizados em métodos para alterar ou mutar uma sequência de nucleotídeos genômica em um organismo. Esses construtos de polinucleotídeos incluem, mas não se limitam a, vetores RNA:DNA, vetores mutacionais RNA:DNA, vetores de reparação RNA:DNA, oligonucleotídeos duplex mistos, oligonucleotídeos e oligonucleobases recombinogênicas RNA:DNA auto-complementares. Esses construtos de nucleotídeos, bem como seus métodos de uso, são conhecidos na especialidade. Vide, Patente dos EUA N° 5.565.350; 5.731.181; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972 e 5.871.984; cada uma das quais é incorporada aqui como referência como se fossem apresentadas em caráter íntegro. Vide também, Publicação de Pedido Internacional de Patente N° WO 98/149350,
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WO 99/107865 e WO 99/125921; e Beetham et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8774-8778; cada uma das quais é incorporada aqui como referência como se fossem apresentadas em caráter íntegro.
[0122] Os métodos da presente invenção não dependem da incorporação de todo o polinucleotídeo inibitório de nicotina demetilase dentro do genoma, apenas de que a planta ou parte de planta Nicotiana relacionada seja alterada como resultado da introdução desse polinucleotídeo inibitório na célula. Dessa forma, o genoma pode ser alterado após a introdução do polinucleotídeo inibitório de nicotina demetilase na célula. Por exemplo, o polinucleotídeo inibitório, ou qualquer parte do mesmo, pode ser incorporado ao genoma da planta. Alterações ao genoma incluem, mas não se limitam a, adições, eliminações e substituições de nucleotídeos no genoma. Embora os métodos da presente invenção não dependam de adições, eliminações e substituições de um número determinado de nucleotídeos, é reconhecido que essas adições, eliminações e/ou substituições compreendem pelo menos um nucleotídeo.
[0123] Além disso, é possível reduzir o nível e/ou a atividade de uma sequência de nicotina demetilase elicitando os efeitos da sequência somente durante certos estágios de desenvolvimento e desativar o efeito em outros estágios nos quais a expressão não for mais desejável. O controle da expressão da nicotina demetilase pode ser obtido mediante o uso de promotores induzíveis ou preferidos pelos tecidos. Alternativamente, o gene pode ser invertido ou eliminado usando recombinases, transposons ou sistemas de recombinação sítio-específicos, os quais também poderiam ativar ou
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59/112 desativar a expressão da sequência de citocromo P450.
[0124] De acordo com a presente invenção, mudanças nos níveis, proporções, atividade ou distribuição de polipeptídeos de citocromo P450 da presente invenção, bem como mudanças no fenótipo da planta ou parte de planta Nícotíana, particularmente a acumulação reduzida de nornicotina e de seu metabólito carcinogênico, NNN, podem ser medidas comparando uma planta ou parte de planta de interesse com uma planta ou parte de planta de controle, sendo que a planta ou parte de planta de interesse e a planta ou parte de planta de controle foram cultivadas e/ou colhidas usando os mesmos protocolos. Conforme aqui utilizado, uma planta ou parte de planta de interesse é aquela na qual uma alteração genética, como uma transformação, tenha afetado o polipeptídeo de nicotina demetilase de interesse, ou ainda aquela planta ou parte de planta Nícotíana que descende de uma planta ou parte de planta Nícotíana assim alterada e que contém a alteração. Uma planta ou parte de planta de controle oferece um ponto de referência para medir mudanças no fenótipo da planta ou parte de planta de interesse. A medição de mudanças no fenótipo pode ser feita em qualquer momento em uma planta ou parte de planta, inclusive durante o desenvolvimento, senescência ou após a cura da planta. Em outras configurações, a medição das mudanças no fenótipo pode ser feita nas plantas que crescem em quaisquer condições, inclusive naquelas plantas cultivadas em câmaras de crescimento, estufas ou em um campo. Em uma configuração, as mudanças no fenótipo podem ser medidas determinando a taxa de conversão de nicotina a nornicotina. Em uma configuração preferida, a conversão pode ser medida
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60/112 dividindo a porcentagem de nornicotina (como uma porcentagem do peso total do tecido) pela soma da porcentagem de nicotina e nornicotina (como porcentagens do peso total do tecido) e multiplicando por 100.
[0125] De acordo com a presente invenção, uma planta ou parte de planta de controle pode conter uma planta ou parte de planta Nícotíana de tipo selvagem, isto é, com o mesmo genótipo que o material de início para a alteração genética que resultou na planta ou parte de planta de interesse. Uma planta ou parte de planta de controle também pode compreender uma planta ou parte de planta Nícotíana com o mesmo genótipo que o material de início mas que tenha sido transformada com um construto nulo (isto é, com um construto que não possua efeitos conhecidos sobre a característica de interesse, como um construto que compreenda um gene marcador selecionável). Alternativamente, uma planta ou parte de planta de controle pode compreender uma planta ou parte de planta Nícotíana que seja um segregante não-transformado entre a progênie de uma planta ou parte de planta de interesse, ou de uma planta ou parte de planta Nícotíana geneticamente idêntica à planta ou parte de planta de interesse, mas que não esteja exposta a condições ou estímulos que possam induzir a supressão do gene de nicotina demetilase de interesse. Finalmente, uma planta ou parte de planta de controle pode compreender a planta ou parte de planta de interesse em si sob condições nas quais a sequência inibitória de nicotina demetilase não seja expressa. Em todos os casos, a planta ou parte de planta de interesse e a planta ou parte de planta de controle são cultivadas e colhidas usando os mesmos protocolos.
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[0126] Conforme descrito neste documento, os métodos são disponibilizados para reduzir ou eliminar a atividade e/ou concentração de um polipeptídeo de nicotina demetilase da presente invenção ao introduzir em uma planta ou parte de planta Nícotíana uma sequência inibitória de polinucleotídeos de nicotina demetilase capaz de inibir a expressão ou a função de um polipeptídeo de nicotina demetilase que participe da conversão metabólica de nicotina a nornicotina. Em alguns casos, a sequência inibitória pode ser introduzida por transformação da planta ou parte de planta como uma célula vegetal com um cassete de expressão que expresse um polinucleotídeo que iniba a expressão do polipeptídeo de nicotina demetilase. O polinucleotídeo pode inibir a expressão de um polipeptídeo de nicotina demetilase diretamente, evitando a tradução do RNA mensageiro de polipeptídeo de nicotina demetilase, ou indiretamente, codificando um polipeptídeo que iniba a transcrição ou tradução de um gene de polipeptídeo de nicotina demetilase que codifique um polipeptídeo de nicotina demetilase. Os métodos para inibir ou eliminar a expressão de um produto genético em uma planta são amplamente conhecidos na especialidade, sendo que quaisquer métodos similares podem ser usados na presente invenção para inibir a expressão de polipeptídeos de nicotina demetilase.
[0127] Em outras configurações, a atividade de um polipeptídeo de nicotina demetilase da presente invenção pode ser reduzida ou eliminada rompendo o gene que codifica o polipeptídeo de nicotina demetilase. A invenção inclui plantas mutagenizadas que carregam mutações nos genes de citocromo P450, sendo que as mutações reduzem a expressão do gene de
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62/112 nicotina demetilase ou inibem a atividade de um polipeptídeo de nicotina demetilase codificado da presente invenção.
[0128] Para obter as plantas desejadas, uma planta ou parte de planta Nícotíana pode ser transformada com um cassete de expressão capaz de expressar um polinucleotídeo que iniba a expressão de uma sequência de nicotina demetilase. Esses métodos podem incluir o uso de supressão ou co-supressão senso, supressão anti-senso, interferência de RNA de fita dupla (dsRNA), interferência de RNA grampo e interferência de RNA grampo contendo íntrons, interferência mediada por amplicons, ribozimas, além de pequenos RNAs ou micro RNAs interferentes.
[0129] Para a co-supressão, um cassete de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA correspondente a todo ou a partes do RNA mensageiro que codifica um polipeptídeo de citocromo P450 de interesse (por exemplo, um polipeptídeo de citocromo P450 compreendendo a sequência apresentada nas SEQ N°:2 ou 5-24 ou uma sequência que possua uma identidade de sequência considerável com as SEQ N°:2 ou 524) na orientação senso. A superexpressão de uma molécula de RNA pode provocar uma expressão reduzida do gene nativo. Várias linhas de plantas transformadas com o cassete de expressão de co-supressão são posteriormente triadas para identificar aquelas que exibam a maior inibição de expressão de polipeptídeo de nicotina demetilase.
[0130] O polinucleotídeo usado para a co-supressão pode corresponder a toda ou parte da sequência que codifica um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção, toda ou parte da região 5' e/ou 3' não-traduzida de uma transcrição de
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63/112 polipeptídeo de citocromo P450, toda ou parte tanto da sequência de codificação como das regiões não-traduzidas de uma transcrição codificam um polipeptídeo de citocromo P450. Em algumas configurações nas quais o polinucleotídeo compreende toda ou parte da região de codificação para um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção, o cassete de expressão pode ser projetado para eliminar o códon de início do polinucleotídeo, de forma que nenhum produto do polipeptídeo possa ser transcrito.
[0131] A co-supressão pode ser usada para inibir a expressão dos genes da planta para produzir plantas com níveis indetectáveis para os polipeptídeos codificados por esses genes ou também podem ser usados para inibir a expressão de diversas proteínas na mesma planta (por ex., Broin et al. (2002) Plant cell 14:1417-1432; e Patente dos EUA N° 5.942.657). Métodos para usar a co-supressão para inibir a expressão de genes endógenos nas plantas são descritos em Flavell et al. (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:3490-3496; Jorgensen et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973; Johansen e Carrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938; Brain et al. (2002) Plant cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Yu et al. (2003) Phytochemistry 63:753-763; e Patente dos EUA N° 5.034.323; 5.283.184 e
5.942.657; cada uma das quais é incorporada aqui como referência como se fossem apresentadas em caráter íntegro. A eficiência da co-supressão pode ser elevada ao incluir uma região poly-dT no cassete de expressão a uma posição de 3' com relação à sequência senso e 5' do sinal de poliadenilação. Vide, Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2002/0048814,
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64/112 incorporada aqui como referência como se fosse apresentada em caráter íntegro. Normalmente, essa sequência de nucleotídeos possui uma identidade de sequência considerável com a sequência da transcrição do gene endógeno, preferentemente superior a cerca de 65% de identidade de sequência, idealmente superior a cerca de 95% identidade de sequência, idealmente superior a cerca de 99% identidade de sequência (por ex., Patente dos EUA N° 5.283.184 e 5.034.323; incorporada aqui como referência como se fossem apresentadas em caráter íntegro).
[0132] A inibição da expressão do polipeptídeo de citocromo
P450 da presente invenção também pode ser obtida via supressão anti-senso. Para a supressão anti-senso, o cassete de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA complementar a todo ou parte de um RNA mensageiro que codifica o polipeptídeo de citocromo P450. A sobre-expressão da molécula de RNA anti-senso pode causar uma expressão reduzida do gene nativo. De forma similar, diversas linhas de plantas transformadas com um cassete de expressão de supressão antisenso passam por uma triagem para identificar aqueles que mostram a maior inibição de expressão do polipeptídeo de nicotina demetilase.
[0133] O polinucleotídeo para ser usado em uma supressão anti-senso pode corresponder a todo ou a uma parte do complemento da sequência que codifica o polipeptídeo de citocromo P450, a todo ou a uma parte do complemento da região não traduzida 5' e/ou 3' da transcrição do polipeptídeo de citocromo P450, ou a todo ou a uma parte do complemento tanto da sequência de codificação e das regiões não traduzidas de
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65/112 uma transcrição que codifica o polipeptídeo de citocromo P450. Além disso, o polinucleotídeo anti-senso pode ser totalmente complementar à sequência alvo (isto é, 100% idêntico ao complemento da sequência alvo) ou parcialmente complementar à sequência alvo (isto é, menos do que 100% idêntico ao complemento da sequência alvo).
[0134] A supressão anti-senso também pode ser usada para inibir a expressão de várias proteínas na mesma planta (por ex., Patente dos EUA N° 5.942.657) . Além disso, porções dos nucleotídeos anti-senso podem ser usadas para interromper a expressão do gene alvo. Geralmente, podem ser usadas sequências de pelo menos 50 ácidos nucléicos, 100, 200, 300, 400, 450, 500, 550 ácidos nucléicos, ou mais. Métodos para utilizar a supressão anti-senso para inibir a expressão de genes endógenos nas plantas são descritos, por ex., em Liu et al. (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743; e Patente dos EUA N° 5.759.829 e 5.942.657; cada uma das quais é incorporada aqui como referência como se fossem apresentadas em caráter íntegro. A eficiência da supressão anti-senso pode ser aumentada mediante a inclusão de uma região poli-dT no cassete de expressão em uma posição localizada a 3' da sequência antisenso e a 5' do sinal de poliadenilação. Vide Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2002/0048814, incorporada aqui como referência como se fosse apresentada em caráter íntegro.
[0135] Para a interferência dsRNA, uma molécula de RNA senso como a acima descrita para a co-supressão e molécula de RNA anti-senso que seja total ou parcialmente complementar à molécula de RNA senso são expressadas na mesma célula, causando a inibição da expressão do correspondente RNA
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66/112 mensageiro endógeno. A expressão das moléculas senso e antisenso podem ser obtidas projetando um cassete de expressão que compreenda tanto uma sequência senso como uma sequência antisenso para a sequência alvo de citocromo P450. Alternativamente, diferentes cassetes de expressão podem ser usados para as sequências senso e anti-senso. Diversas linhas de plantas transformadas com o cassete de expressão ou os cassetes de expressão da interferência dsRNA passam, então, por uma triagem para identificar linhas de plantas que mostrem a maior inibição de expressão do polipeptídeo de citocromo P450 alvo. Métodos para usar interferência dsRNA para inibir a expressão de genes de planta endógenos são descritos em Waterhouse et al. (1998) Pros. Natl. Acad. Sci. USA 95:1393913964; Liu et al. (2002) Plana Physiol. 129:1732'-1743; e Publicação de Pedido Internacional de Patente N° WO 99/149024, WO 99/153050, WO 99/16163 l e WO 00/149035; cada um dos quais é incorporada aqui como referência como se fossem apresentados em caráter íntegro.
[0136] Os cassetes de expressão amplicon compreendem uma sequência de planta derivada de vírus que contém todo ou parte de um gene alvo, mas geralmente não todos os genes do vírus nativo. As sequências virais presentes no produto da transcrição do cassete de expressão permitem que o produto da transcrição dirija sua própria replicação. As transcrições produzidas pelo amplicon podem ser tanto senso como anti-senso com relação à sequência alvo (isto é, o RNA mensageiro para um polipeptídeo de citocromo P450 que participa da conversão metabólica de nicotina a nornicotina). Métodos para utilizar amplicons para inibir a expressão de genes de planta endógenos
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67/112 são descritos, por ex., em Angell e Baulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684; Angell e Baulcombe (1999) Plant J. 20:357-362; e Patente dos EUA N° 6.646.805, cada um dos quais é incorporado aqui como referência como se fossem apresentados em caráter íntegro.
[0137] Em alguns casos, o polinucleotídeo expressado pelo cassete de expressão da invenção é um RNA catalítico ou possui atividade de ribozima específica para o RNA mensageiro de um polipeptídeo de citocromo P450 aqui descrito. Portanto, o polinucleotídeo causa a degradação do RNA mensageiro endógeno, causando uma expressão reduzida do polipeptídeo de citocromo P450. Este método é descrito, por exemplo, em Patente dos EUA N° 4.987.071, incorporada aqui como referência como se fosse apresentada em caráter íntegro.
[0138] Em outros casos, a inibição da expressão de um ou mais polipeptídeos de nicotina demetilase pode ser obtida mediante interferência de RNA pela expressão de um gene que codifica um micro RNA (miRNA). Os miRNAs são agentes reguladores que contém cerca de vinte e dois ribonucleotídeos. Os miRNA são altamente eficientes para inibir a expressão de genes endógenos. Vide, por ex. , Javier et al. (2003) Natureza 425:257-263, incorporada aqui como referência como se fosse apresentada em caráter íntegro.
[0139] Para a interferência miRNA, o cassete de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA que é modelada em um gene miRNA endógeno. O gene miRNA codifica um RNA que forma uma estrutura de grampo contendo uma sequência de 22 nucleotídeos que é complementar a outro gene endógeno (sequência alvo). Para a supressão da expressão do
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68/112 polipeptídeo de nicotina demetilase, a sequência de 22 nucleotídeos é selecionada a partir de uma sequência de transcrição do polipeptídeo de citocromo P450 e contém 22 nucleotídeos que codificam essa sequência de polipeptídeo de citocromo P450 em uma orientação senso e 21 nucleotídeos de uma sequência anti-senso correspondente que é complementar à sequência senso. As moléculas de miRNA são altamente eficientes para inibir a expressão de genes endógenos, sendo que a interferência de RNA que elas induzem é herdada por gerações posteriores de plantas.
[0140] Alternativamente, a inibição da expressão de um ou mais polipeptídeos de citocromo P450 pode ser obtida pela interferência de RNA grampos (hpRNA) ou pela interferência de RNA grampos contendo íntrons (ihpRNA). Esses métodos são altamente eficientes para inibir a expressão de genes endógenos. Vide, Waterhouse e Helliwell (20013) Nat. Rev. Genet. 4:29-38 e as referências ali citadas.
[0141] O cassete de expressão para a interferência de hpRNA também pode ser projetado de forma tal que a sequência senso e a sequência anti-senso não correspondam a um RNA endógeno nesta configuração, sendo que as sequências senso e anti-senso abordam uma sequência loop que compreende uma sequência de nucleotídeos correspondente a todo ou parte do RNA mensageiro endógeno do gene alvo. Portanto, é a região de loop que determina a especificidade da interferência RNA. Vide, por ex., Publicação de Pedido Internacional de Patente N° WO 02/00904, incorporada aqui como referência como se fosse apresentada em caráter íntegro.
[0142] O Silenciamento Transcricional de Genes (TGS) pode
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69/112 ser obtido mediante o uso de construtos hpRNA, sendo que a repetição invertida do grampo compartilha identidade de sequência com a região promotora de um gene a ser silenciado. O processamento do hpRNA em RNAs curtos que podem interagir com a região promotora homóloga pode acarretar degradação ou metilação para provocar o silenciamento (Aufsatz et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99:16499-16506; e Mette et al. (2000) EMBO J. 19:5194-5201).
[0143] Em alguns casos, o polinucleotídeo codifica um anticorpo que se vincula a pelo menos um polipeptídeo de citocromo P450, reduzindo a atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção. Em outra configuração, a vinculação de um anticorpo provoca uma maior rotação do anticorpo-complexo de polipeptídeo de citocromo P450 mediante mecanismos de controle de qualidade celular. A expressão de anticorpos em parte de plantas e a inibição de caminhos molecular pela expressão e vinculação de anticorpos a proteínas em parte de plantas são bem conhecidos na especialidade. Vide, por ex., Conrad e Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21:35-36, incorporada aqui como referência como se fosse apresentada em caráter íntegro.
[0144] A atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção pode ser reduzida ou eliminada mediante a interrupção do gene que codifica o polipeptídeo de citocromo P450. O gene que codifica o polipeptídeo de citocromo P450 pode ser interrompido por qualquer método conhecido na especialidade, por ex., por transposon tagging ou pela mutagenização de plantas usando mutagênese aleatória ou dirigida e selecionando plantas que possuam uma atividade
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70/112 reduzida de nicotina demetilase ou mutações no CYP82E4v2 ou no CYP82E5v2.
[0145] O transposon tagging pode ser usado para reduzir ou eliminar a atividade de um ou mais polipeptídeos de citocromo P450 da presente invenção. O transposon tagging compreende inserir um transposon dentro de um gene de citocromo P450 endógeno para reduzir ou eliminar a expressão do polipeptídeo de citocromo P450.
[0146] Métodos para o transposon tagging de genes específicos nas plantas são bem conhecidos na especialidade. Vide, por ex., Maes et a1. (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96; Dharmapuri e Sonti (1999) FEMS Micerobiol. Lett. 179:53-59; Meissner et al. (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat et al.
(2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:9496; e Fitzmaurice et al. (1999) Genetics 153:1919-1928) .
[0147] Métodos adicionais para diminuir ou eliminar a expressão de genes endógenos nas plantas também são conhecidos na especialidade e podem ser aplicados de forma similar à invenção instantânea. Esses métodos incluem outras formas de mutagênese, usando compostos mutagênicos ou carcinogênicos, incluindo mutagênese induzida por etil metanossulfonato, mutagênese de eliminação, além de mutagênese de eliminação rápida de neutrons usada em um senso de genética inversa (com PCR) para identificar linhas de plantas nas quais o gene endógeno foi eliminaod. Para exemplos desses métodos vide, Ohshima et al. (1998) Virology 213:472-481; Okubara et al.
(1994) Genetics 137:867-874; e Quesada et al. (2000) Genetics 154:421-4315; cada um dos quais é incorporado aqui como
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71/112 referência como se fossem apresentados em caráter íntegro. Além disso, um método rápido e automatizável para realizar a triagem de mutações induzidas quimicamente, TILLING (Lesões Locais Induzidas por Alvos em Genomas), usando HPLC desnaturalizane ou digestão de endonuclease seletiva de produtos da PCR selecionados também é aplicável à invenção instantânea. Vide, McCallum et al. (2000) Nat. Bíotechnol. 18:455-457, aqui incorporada como referência.
[0148] As mutações que provocam um impacto na expressão genética ou que interferem na função da proteína de citocromo P450 codificada podem ser determinadas usando métodos amplamente conhecidos na especialidade. As mutações insercionais em exons de genes geralmente originam mutantes nulos. As mutações em resíduos conservados podem ser particularmente eficazes para inibir a função metabólica da proteína codificada. Os resíduos conservados dos polipeptídeos de citocromo P450 de plantas adequados para mutagênese com o objetivo de eliminar a atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 em transformar nicotina a nornicotina em uma planta ou parte de planta Nícotíana foram descritos. Os resíduos conservados dos polipeptídeos de citocromo P450 de plantas são ilustrados na FIG. 1A-C, sendo que os resíduos que diferem dos outros polipeptídeos P450 estão indicados em cor cinza. O resíduo conservado é aquele que não esá indicado em cor conza em cada posição. Esses mutantes podem ser isolados de acordo com procedimentos conhecidos.
[0149] Os mutantes dominantes podem ser usados para provocar o silenciamento de RNA devido à inversão genética e à recombinação de locus genéticos duplicados. Vide, por ex.,
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Kusaba et al. (2003) Plant Cell 15:1455-1467.
[0150] Embora um número de sequências sejam reconhecidas na prática da invenção, em particular as sequências que codificam as SEQ N°:2 e 13 possuem um uso particular. Embora a intenção não seja vincular-se a qualquer mecanismo particular de ação, os inventores acreditavam que essas sequências codificam a nicotina demetilase que catalisa a N-demetilação oxidativa de nicotina a nornicotina. Portanto, os métodos para inibir especificamente essas sequências de codificação e não outras sequências P450 podem ser benéficos para a planta recombinante. Isto é, estratégias que provocariam a inibição da função genética desse locus em particular podem terminar sendo superior àquelas que inibem a família genética inteira. As enzimas P450 participam de vários mecanismos na planta e sua inibição pode terminar sendo deletéria ou prejudicial para o crescimento e desenvolvimento da planta, podendo ainda ter um impacto negativo em fatores como as possibilidades da planta de defender-se contra doenças. De forma similar, devido a que as enzimas P450 da planta Nicotiana foram implicadas em metabólitos vegetais como fenilpropanóides, alcalóides, terpenóidse, lipídeos, glicosidas cianogênicas, glucosinolatos, além de um hóspede de outras entidades químicas, a interrupção da atividade P450 pode alterar os componentes relacionados ao sabor, à textura ou a outras propriedades do tabaco que poderiam criar um impacto na utilidade comercial da planta. Portanto, o uso dos métodos acima apresentados para inibir a expressão de forma tal a ter como alvo específico a sequência que codifica as SEQ N°:2 ou 13 pode ser preferido, incluindo estratégias mutacionais
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73/112 dirigidas, como a quimeraplastia. Vide, por ex., Stewart et al. (2000) Biotechniques 24:838-843; e Graham et al. (2002) Biochim Biophys Acta 1587:1-6; cada uma das quais é incorporada aqui como referência como se fossem apresentadas em caráter íntegro. Em algumas configurações, os métodos acima apresentados são usados para inibir a expressão de forma tal a
ter como alvo específico a SEQ N°: 1 (que codifica a SEQ N°:2 ),
a SEQ N° : 50 (que codifica a SEQ N°:13), ou ambas as
sequênc ias.
[0151] As composições da invenção podem ser usadas em
métodos de tr iagem para identificar plantas não-conversoras a
serem usadas em programas de cultivo. Dessa forma, as
sequências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas para realizar a triagem de germoplasmas nativos para plantas nãoconversoras que possuam uma mutação estável em um ou mais genes P450 aqui identificados. Essas plantas não-conversoras identificadas pelos métodos da invenção podem ser usadas para desenvolver linhas de cultivo.
[0152] Além das sequências de nucleotídeos que codificam sequências de codificação P450, as composições da invenção incluem uma sequência de íntrons na sequência CYP82E5v2 que pode ser usada em métodos de triagem. Embora a intenção não seja vincular-se a qualquer mecanismo particular de ação, o(s) gene(s) CYP82E5v2 podem representar o(s) único(s) membro(s) da família de citocromos P450 que participa(m) da conversão metabólica de nicotina a nornicotina (e, conforme afirmado previamente, existe uma boa probabilidade de que os cDNAs CYP82E5v2 sejam originados a partir de apenas um único locus genético) em folhas verdes do tabaco. Para certas aplicações,
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74/112 seria útil possuir uma forma de diferenciar diagnosticamente esse membro específico da família genética do citocromo P450 do resto das sequências intimamente relacionadas a essa família. Por exemplo, é possível que dentro do germoplasma de tabaco naturalmente existente (ou em populações mutagenizadas) existam aquisições nas quais esse gene seja naturalmente disfuncional, podendo, portanto, ser útil como um recurso permanentemente não-conversor. Esses genes disfuncionais podem incluir aqueles que codificam os polipeptídeos apresentados nas SEQ N°:6 e 12. Um método para realizar um ensaio específico para esses genótipos (por ex., mutantes de eliminação, reordenamentos, entre outros) poderiam servir como uma ferramenta poderosa. A presente invenção inclui primers projetados para amplificar especificamente o exon 1 e o exon 2 do CYP82E5v2 ou do CYP82E4v2, sendo que um dos dois pares de primers corresponde ao íntron entre os exons. Exemplos de primers úteis para amplificar os exons do CYP82E4v2 incluem a SEQ N°:32 com as SEQ N°:33-35. Exemplos de primers úteis para amplificar os exons do CYP82E5v2 incluem a SEQ N°:36 com a 37 e a SEQ N°:38 com a 39. Esses mesmos primers podem ser usados para a análise de sequência dos produtos.
[0153] Quando qualquer cDNA correspondente a um membro da família CYP82E2 é usado como uma sonda de hibridização em um ensaio Southern blotting do genoma do tabaco no DNA, um padrão complexo é observado. Essa reação é esperada, já que existem vários membros intimamente relacionados nessa família genética. Devido a que as regiões de íntron dos genes são normalmente menos conservadas do que os exons, a previsão é de que o uso de uma sonda específica de íntrons reduziria essa
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75/112 complexidade e facilitaria a distinção do(s) gene(s) correspondente(s) ao gene CYP82E4v2 ou ao gene CYP82E5v2 em relação aos outros membros da família. O uso de uma sonda específica de íntrons CYP82E4v2 ou CYP82E5v2, e/ou os primers PCR usados para gerar produtos representam ferramentas poderosas em ensaios para determinar se quaisquer plantas de tabaco de ocorrência natural, ou mutagenizadas, possuem eliminações ou reordenamentos que podem produzir o gene
inativo. Essa planta pode então ser usada em programas de
cultivo para criar linhas de tabaco que sejam incapazes de
realizar a conversão.
Plantas e partes de plantas transformadas e produtos com
nornicotina e conteúdo de NNN reduzidos
[0154] Os polinucleotídeos de citocromo P450 da invenção, além de variantes e fragmentos dos mesmos, podem ser usados nos métodos da presente invenção para inibir os citocromos P450 que participam da conversão metabólica de nicotina a nornicotina em uma planta. Dessa forma, as sequências inibitórias que têm como alvo a expressão ou a função de um polipeptídeo de citocromo P450 aqui descritos são introduzidas em uma planta ou célula vegetal de interesse. Os cassetes de expressão aqui descritos podem ser introduzidos em uma planta de interesse, por exemplo, uma planta Nícotíana, conforme indicado aqui abaixo, usando quaisquer métodos de transformação adequados conhecidos na especialidade, inclusive os aqui descritos.
[0155] Os métodos da invenção não dependem de um método em particular para introduzir uma sequência em uma planta ou parte de planta, somente de que a sequência desejada tenha
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76/112 acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta ou parte de planta. Métodos para introduzir sequências de polinucleotídeos em plantas são conhecidos na especialidade e incluem, mas não se limitam a, métodos estáveis de transformação, métodos transientes de transformação e métodos de transformação mediados por vírus.
[0156] Os protocolos de transformação, bem como os protocolos para introduzir sequências heterólogas de polinucleotídeos em plantas, variam dependendo do tipo de planta ou de célula vegetal que constitui o alvo da transformação. Métodos adequados para introduzir polinucleotídeos nas células vegetais da presente invenção incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Shillito et al. (1987) Meth. Enzymol. 153:313-336; e Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad Sci. USA 83:5602-56116), transformação mediada por Agrobacterium (Patente dos EUA N° 5.104.310, 5.149.645, 5.177.010, 5.231.019, 5.463.174, 5.464.763, 5.469.976, 4.762.785, 5.004.863, 5.159.135, 5.563.055 e 5.981.840), transferência genética direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 1:2717-2722) e aceleração balística de partículas (Patente dos EUA N° 4.945.050, 5.141.131, 5.886.244, 5.879.918 e 5.932.782; Tomes et al. (1995) in Plant cell, tissue, and organ culture fundamental methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926) . Vide também, Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol.
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27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); De Wet et al. (1985) em The experimental manipulation of ovule tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York.); pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet, 84:560-566 (transformação mediada por whisker); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporação); cada um dos quais é incorporado aqui como referência como se fossem apresentados em caráter íntegro.
[0157] Qualquer tecido vegetal que possa ser subsequentemente propagado usando métodos de clonagem, seja por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com um construto recombinante compreendendo uma sequência inibitória de citocromo P450, por exemplo, um cassete de expressão da presente invenção. Conforme aqui utilizado, organogênese representa um processo pelo qual mudas e raízes são desenvolvidas seqüencialmente a partir centros meristemáticos. Conforme aqui utilizado, embriogênese representa um processo pelo qual mudas e raízes são desenvolvidas conjuntamente de forma concertada (não sequencial), seja a partir de células somáticas ou gametas. Exemplos de tecidos adequados para vários protocolos de transformação aqui descritos incluem, mas não se limitam a, tecido de calos, tecido meristemático existente (por ex., meristemas apicais, gemas axilares e ineristemas de raízes) e tecido de meristema induzido (por ex., meristema de cotilédones e meristema hipocotil), hipocotis, cotilédones, discos de folhas, pólen, embriões, entre outros.
[0158] Conforme aqui utilizado, transformação estável
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78/112 significa que o construto de nucleotídeos de interesse introduzido em uma planta se integra ao genoma da planta, podendo ser herdado por sua progênie. Da mesma forma, “transformação transiente” significa que uma sequência é introduzida na planta, a qual só é expressa temporariamente ou só está presente de forma transiente na planta.
[0159] As sequências inibitórias da invenção podem ser provistas a uma planta usando uma variedade de métodos de transformação transientes. As sequências inibitórias da invenção podem ser transformadas de forma transiente na planta usando técnicas conhecidas da especialidade. Essas técnicas incluem sistemas de vetores virais e a precipitação do polinucleotídeo de uma forma que impede liberações posteriores do DNA. Portanto, a transcrição a partir do DNA vinculado à partícula pode ocorrer, mas a frequência com que ele é liberado para se tornar integrado ao genoma é enormemente reduzida. Esses métodos incluem o uso de partículas cobertas com polietienlimina (PEI; Sigma 4P3143).
[0160] Alternativamente, a sequência inibitória da invenção pode ser introduzida nas plantas colocando-as em contato com um vírus ou com ácidos nucléicos virais. Geralmente, esses métodos requerem incorporar um cassete de expressão da invenção com uma molécula viral de DNA ou RNA. Os promotores para serem usados nos cassetes de expressão da invenção também incluem os promotores utilizados para a transcrição por RNA polimerases virais. Métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada na mesma, envolvendo moléculas virais de DNA ou RNA, são conhecidos na especialidade. Vide, por ex., Patente dos EUA N° 5.889.191;
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5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931; e Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221; cada um dos quais é incorporado aqui como referência como se fossem apresentados em caráter íntegro.
[0161] As células transformadas podem ser cultivadas em plantas Nícotíana de acordo com métodos convencionais. Vide, por ex., Vasil e Hildebrandt (1965) Science 150:889; Negaard e Hoffman (1989) Biotechniques 7(8):808-812. Essas plantas podem então ser cultivadas, e polinizadas com a mesma linha transformada ou com linhas diferentes, sendo que a progênie resultante possui expressão da característica fenotípica desejada identificada, isto é, expressão reduzida de uma ou mais nicotina demetilases que participam da conversão metabólica de nicotina a nornicotina e, portanto, do conteúdo reduzido de nornicotina, e um concomitante conteúdo reduzido de seu metabólito nitrosamina, NNN, na planta, particularmente nos tecidos das folhas. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão das características fenotípicas desejadas seja mantida estável e que seja herdada, e que as sementes sejam colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido alcançada. Dessa forma, a presente invenção oferece uma semente transformada (também denominada “semente transgênica”) com um polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado ao seu genoma.
[0162] As composições e métodos da invenção podem ser usadas para reduzir o conteúdo de nornicotina, particularmente nas folhas e talos, de qualquer planta do gênero Nicotiana incluindo, mas não se limitando, às seguintes espécies:
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acuminata, affinis, alata, attenuate, bigelovii, clevelandii,
excelsior, forgetiana, glauca, glutinosa, langsdorffii,
longiflora, obtusifolia, palmeri, paniculata, plumbaginifolia, qudrivalvis, repanda, rustica, suaveolens, sylvestris, tabacum, tomentosa, trigonophylla e x sanderae. A presente invenção também compreende a transformação de quaisquer variedades de uma planta do gênero Nicotiana, incluindo, mas não se limitando a, Nicotiana acuminata multiflora, Nicotiana alata grandiflora, Nicotiana bigelovii quadrivalvis, Nicotiana
bigelovii wallacei, Nicotiana obtusifolia obtusifolia,
Nicotiana obtusifolia plameri, Nicotiana quadrivalvis
bigelovii, Nicotiana quadrivalvis quadrivalvis, Nicotiana
quadrivalvis wallacei e Nicotiana trigonophylla palmeri, bem como as variedades comumente conhecidas como variedades de estufa ou brilhantes, variedades Burley, variedades escuras e variedades orientais ou turcas.
[0163] As plantas transgênicas do gênero Nicotiana, conforme aqui descritas, são adequadas para as técnicas convencionais de cultivo e colheita, como cultivo em solo adubado ou sem adubo, com ensacamento das flores ou sem ensacamento, ou corte do topo ou sem corte do topo. As folhas e os talos colhidos podem ser usados em qualquer produto de tabaco tradicional incluindo, mas não se limitando a, tabaco para cachimbos, charutos e cigarros, além de tabaco mastigável em qualquer uma de suas formas, incluindo tabaco em folha, tabaco em pedaços ou tabaco cortado.
[0164] Portanto, a presente invenção disponibiliza uma planta Nicotiana, particularmente tecidos das folhas dessa planta, compreendendo um cassete de expressão da invenção e
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81/112 uma quantidade reduzida de nornicotina e N'nitrosonornicotina. Conforme aqui utilizado, “uma quantidade reduzida” ou um nível reduzido” significam uma quantidade de nornicotina e/ou de NNN em uma planta tratada ou transgênica do gênero Nícotíana ou em uma parte de planta ou produto de tabaco da mesma que é menos do que se encontraria em uma planta do gênero Nícotíana ou em uma parte de planta ou produto de tabaco da mesma variedade de tabaco, processado (isto é, cultivado e colhido) da mesma maneira, que não tenha sido tratado ou que não tenha sido transformado em transgênico para nornicotina e/ou NNN reduzidas. A quantidade de nornicotina pode ser reduzida a cerca de 10% a mais do que cerca de 90%, incluindo mais do que cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70% e cerca de 80%. A conversão de nicotina a nornicotina pode ser menos do que 0,3%, menos do que 0,5%, menos do que 0,7%, entre 0,1% e 0,5%, entre 0,1% e 0,4%, entre 0,1% e 0,7% ou entre 0,1% e 1,0% nas plantas, partes de plantas e produtos da presente invenção, e mais especificamente nas plantas e partes de plantas com mutações no CYP82E4v2 e no CYP825v2.
[0165] Conforme aqui utilizado, produtos de tabaco” se refere a, mas não se limita a, materiais para fumar (por ex. , qualquer cigarro, incluindo cigarrilhas, cigarros de filtro recuado não-ventilados ou ventilados, charutos, cachimbos), produtos sem fumaça (por ex., rapé, tabaco mastigável, insertos biodegradáveis (por ex., goma de mascar, pastilhas, adesivos dispersantes)) . Vide, por ex., Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2005/0019448, incorporada aqui como referência como se fosse apresentada em caráter íntegro. O
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82/112 termo “produtos de tabaco” também se refere a misturas que podem ser feitas combinando tabaco convencional com diferentes quantidades do tabaco de baixa nornicotina e/ou do tabaco NNN aqui descrito. “Produtos de tabaco” também se refere a plantas ou partes de plantas do gênero Nicotiana, conforme descrito acima, que sejam tabacos curados.
[0166] Os produtos de tabaco aqui descritos reduzem o potencial carcinogênico da fumaça do tabaco que é inalada diretamente com o consumo de um produto de tabaco como charutos, cigarros ou cachimbos ou inalada como fumaça secundária (isto é, por um indivíduo que inala a fumaça do tabaco gerada por um indivíduo que esteja consumindo um produto de tabaco como charutos, cigarros ou cachimbos). O tabaco curado aqui descrito pode ser usado para preparar um produto de tabaco, particularmente um que sofra transformações químicas devido ao calor, compreendendo uma quantidade reduzida de nornicotina e/ou de NNN na linha de fumaça que é inalada diretamente ou inalada como fumaça secundária. Da mesma forma, os produtos de tabaco da invenção podem ser úteis na preparação de produtos de tabaco sem fumaça como tabaco mastigável, rapé, entre outros.
[0167] Os produtos de tabaco derivados das plantas transgênicas de tabaco da presente invenção, portanto, podem ser usados em métodos para reduzir o potencial carcinogênico desses produtos de tabaco, reduzindo a exposição dos humanos à nitrosamina e ao NNN carcinogênicos, particularmente no caso de indivíduos que são usuários desses produtos de tabaco. Os seguintes exemplos são provistos a modo de ilustração e não como uma forma de limitação.
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EXPERIMENTAL
[0168] Os seguintes materiais e protocolos são utilizados nos experimentos descritos abaixo.
Materiais vegetais
[0169] Todos os materiais vegetais foram obtidos do Dr. Earl Wernsman, Departmento de Ciências de Cultivo, Universidade Estadual de North Carolina (Raleigh, NC) . As sementes N. tomentosíformís e N. sylvestrís foram obtidas da coleção de germoplasmas de Nícotíana administrada pela Universidade Estadual de North Carolina. As plantas forma cultivaas em câmaras de cultivo por dois meses, período após o qual foram transferidas a uma estufa. As linhas Burley DH 98325-5 (não-conversora) e DH 98-325-6 (conversora) representam linhas quase isogênicas, isto é, recuperadas da mesma planta haplóide materna. O SC58 é uma variedade de tabaco curado em estufa, cujos indivíduos não-conversores são denominados SC58 (ctct) . O SC58 (CtCt) é uma linha conversora estável quase isogênica que foi originada através da introgressão do único locus conversor dominante (Cr) encontrado nas espécies progenitoras do tabaco N. tomentosíformís em SC58 (Mann et al.
(1964) Crop Scí., 4:349-353) . Após oito retrocruzamentos adicionais ao SC58, a linha SC58(CtCt) quase isogênica foi criada e foi posteriormente mantida via autofertilização.
[0170] Todas as plantas foram mantidas em câmaras de cultivo ou estufas usando vasos de cultivo e fertilizante comuns. As plantas foram mantidas em um ciclo claro/escuro de 14/10, regadas uma vez por dia conforme a necessidade e fertilizadas com fertilizador Peters Professional® All Purpose
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Planta Food (20-20-20; Spectrum Brands Inc.; Madison, WI) uma vez por semana. Para facilitar a senescência, algumas folhas verdes foram arrancadas e tratadas embebendo cada folha por 30 segundos em uma solução 0,2% de etefon. As folhas foram curadas em sacolas de plástico com condições de escuro até que se tornassem amarelas.
[0171] Para a mutagênese de etil metano sulfonato (EMS), dois gramos de semente da linha conversora forte de tabaco Burley DH98-325-6 foram esterilizados à superfície em 50% de água sanitária por 12 minutos e enxaguados 6 vezes em dH2O estéril. Alíquotas de aproximadamente 80 mg foram colocadas em frascos com tampa de rosca e embebidos em 1 ml de dH2O por 12 horas. O dH2O foi decantado e a semente foi incubada em 1 ml de EMS 0,5% (Sigma; St. Louis, MO) e agitada suavemente em um Nutator® Mixer (TCS Scientific Corp.; New Hope, PA) à temperatura ambiente por 12 horas no escuro. Após remover a solução EMS, as sementes tratadas foram lavadas oito vezes em volumes de 1 ml de dH2O com agitação suave por 5 minutos. Após a lavagem final, as sementes foram recolhidas em um funil Buchner para um enxágue final e posteriormente foram deixadas secar em papel filtro antes de plantá-las no solo. Foram cultivadas mudas em bandejas flutuantes comuns por cerca de 7 semanas, sendo posteriormente transplantadas a um campo. As plantas cultivadas em campos foram reservadas para que se auto-polinizassem, sendo de 5 a 10 cápsulas (contendo sementes da geração M1) por planta foram coletadas e catalogadas, correspondendo a aproximadamente 4000 indivíduos M0 independentes.
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Isolamento do cDNA NtabCYP82E5v2
[0172] O RNA total foi extraído de folhas verdes e senescentes do tabaco DH98-325-6 usando TRIzol® (Invitrogen; Carlsbad, CA), seguindo o protocolo do fabricante. O DNA genômico foi removido tratando os extratos com o kit TURBO DNA-.free™ Dnase (Ambion; Austin, TX) , seguindo o protocolo do fabricante. A síntese de cDNA foi realizada com o kit StrataScript™ First-Strand (Stratagene; Cedar Creek, TX) usando primers oligo dT e 3 Dg do RNA total livre e DNase. cDNAs NtabCYP82E5v2 de extensão completa foram amplificadas usando os primers E5Orf_F dianteiro e E5Orf_R traseiro, 10 ng de folha de tabaco da biblioteca cDNA como modelo e mistura de enzimas de PCR Long Range™ (GeneChoice, Inc.; Frederick, MD), seguindo o protocolo do fabricante. A informação da sequência de DNA dos primers é listada na listagem de sequências e acima. As condições da PCR foram as seguintes: 3 minutos de denaturação inicial a 95°C, seguida por 33 ciclos de denaturação a 94°C por 30 segundos, têmpera a 60°C, por 30 segundos e extensão a 68 °C por 90 segundos, seguida por uma incubação a 68 °C por 7 minutos. Os produtos da PCR foram clonado em um vetor de clonagem pGEM®-T Easy (Promega Corp.; Madison, WI) e sequenciados de acordo com o método dideoxi usando oligonucleotídeos sintéticos como primers (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 74: 5463-5467) .
Isolamento dos fragmentos CYP82E5 genômicos
[0173] O DNA genômico foi isolado das folhas verdes do tabaco N. tomentosiformis e DH98-325-6 usando um procedimento de extração baseado em cetiltrimetil amônio bromida, de acordo
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86/112 com as instruções do kit NucleoSpin® Plant (BD Bioscience Clontech; Palo Alto, CA).
[0174] Os fragmentos genômicos dos CYP82E5 ortólogos foram amplificados em duas reações de PCR consecutivas, usando primers aninhados. A primeira mistura de PCR continha 0,5 DM cada um dos primers E5Gen_F1 dianteiro (SEQ N°:40) e E5Gen_R1 traseiro (SEQ N°:41), 200 DM de cada dNTP, 20 ng de modelo de DNA genômico e 2 U de polimerase Platinum® Taq (Invitrogen) . A amplificação por PCR foi realizada sob as seguintes condições: 90°C por 3 minutos; 30 ciclos de denaturação a 94°C por 30 segundos, têmpera a 57°C por 30 segundos e extensão a 68°C por 2,2 minutos, seguida de uma extensão final a 68°C por 5 minutos. A composição e as condições do segundo PCR foram as mesmas descritas para a primeira amplificação, exceto que os primers E5Gen_F2 (SEQ N°:42) e E5Gen_R2 (SEQ N°:43) foram adicionados e 1 Dl de uma amostra diluída 50 vezes do primeiro produto da PCR foi usada como modelo. Os produtos purificados da PCR final foram ligados ao vetor de clonagem pGEM-T-Easy e submetidos a sequenciamento de DNA.
Expressão do cDNA NtabCYP82E5v2 em levedura
[0175] Para facilitar a expressão do cDNA NtabCYP82E5v2 em levedura, um quadro de leitura aberta do gene foi inserido na parte inferior do promotor GAL10-CYC1 induzível por galactose e reprensado com glicose do vetor de expressão YeDP60 da levedura (Cullin e Pompon 1988). O plasmídeo recombinante foi introduzido em uma corrente de levedura WAT11 usando o método de transformação baseado em lítio-acetato descrito por Gietz et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:1425-1425. O cultivo da levedura, a indução da expressão genética mediada por
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87/112 galactose e o isolamento das frações microssomais foram realizadas de acordo com o protocolo de Pompon et al. (1996) Methods Enzymol. 272:51-64.
Análise cinético do metabolismo da nicotina mediada por NtabCYP82E5
[0176] Os ensaios de metabolismo da nicotina foram realizados em uma mistura de reação contendo 0,75 mM de NADPH, 2,5 DM de [pirrolidina-2-14C] nicotina (Moravek Biochemicals; Brea, CA) e 90 Dg de microssomos de levedura em um volume final de 150 Dl Pi de solução tampão, pH 7,1. As concentrações de nicotina foram ajustadas mediante a adição de nicotina não radio-etiquetadas às concentrações finais que variam entre 0,7 e 13 DM. As preparações microssômicas isoladas da levedura contendo um vetor vazio foram usadas como controle negativo. As misturas da reação foram incubadas a 25°C por 7 minutos, sendo que a reação foi interrompida com 50 Dl de acetona. Após a centrifugação a 16.000 x g por 3 minutos, 50 Dl da amostra foi colocada em uma placa de silício Whatman K6F de 250 Dm. As placas foram desenvolvidas em um sistema solvente de clorofórmio:metanol:amônia (60:10:1). A nicotina e sua derivada nornicotina foram quantificadas medindo a abundância relativa de seus traços radioativos com um scanner de imagens Bioscan Sistema 400. Os valores Km e vmax foram calculados associando a equação Michaelis-Menten a medições de demetilação de nicotina a diferentes concentrações de substratos usando o programa gráfico SigmaPlot® 10.0 (Systat Software, Inc.; San Jose, CA).
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Análise PCR quantitativa em tempo real da expressão do CYP82E4v2 e do CYP82E5v2
[0177] A expressão do N. tomentosiformis e dos ortólogos de tabaco do CYP82E4v2 e do CYP82E5v2 foram analisadas mediante análise PCR quantitativa em tempo real (qrt-PCR) específica de alelos, usando fluorescência química SYBR® Green I (Morrison et al. (1998) Biotechniques 24: 954-962). O RNA total foi extraído das folhas verdes e curadas de plantas de 3 meses de idade usando os métodos já descritos aqui para o isolamento de cDNA NtabCYP82E5v2. As transcrições CYP82E4v2 e CYP82E5v2 foram amplificadas usando os primers E4Rt_F (SEQ N°:44) e E5Rt_F (SEQ N°:46) dianteiros em conjunto com os primers E4Rt_R (SEQ N°:45) e E5Rt_R traseiros (SEQ N°:47), respectivamente. A mistura de qrt-PCR continha 1x iQTM SYBR® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories) 0,5 DM de cada primer e 0,5 Dg de cDNA. As medições da transcrição foram obtidas usando curvas padrão geradas por amplificação de quantidades conhecidas do DNA alvo e um fragmento de 220 bp do gene gliceraldeído-3fosfato deidrogenase (G3PDH) , amplificado com os primers G3PDH_F (SEQ N°:48) e G3PDH_R (SEQ N°:49), para oferecer um padrão interno para as medições de cDNA. As amplificações de DNA foram realizadas usando o sistema PCR em tempo real (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA) sob as seguintes condições: 95°C por 2 minutos; 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 57°C por 30 segundos, 72°C por 50 segundos, seguido por uma extensão final a 72°C por 5 minutos. As sequências de DNA dos amplicons gerados por qrt-PCR foram verificadas clonando os produtos da PCR e sequenciando 20 clones selecionados aleatoriamente.
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Análise de plantas transgênicas
[0178] Os construtos de silenciamento de genes baseados em RNAi são montados em uma versão do vetor de clonagem pKYL80 (Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11) que é construído para conter um fragmento de 151 bp do íntron do gene FAD3 da soja entre os sítios de restrição Xhol e Sacl do polilinker (pKYLX80I). Para criar um construto no qual o íntron FAD3 seja abordado por um fragmento senso e anti-senso do CYP82E5v2, uma região de íntrons de 400 bp é clonada entre os sítios de restrição HindIII - Xhol e Sacl - Xbal do pKYLX801 em sua orientação senso e anti-senso, respectivamente. O fragmento HindIII - Xbal resultante que contém o braço senso CYP8E5v2, o íntron FAD3 e o braço anti-senso CYP82E5v2 é subclonado no vetor de expressão binário vegetal pKYLX71 (Maiti et al.
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6110-6114) entre o promotor 35S CaMV e um finalizador de uma pequena subunidade rubisco.
[0179] Os construtos de sobreexpressão são criados mediante a substituição de 3-glucuronidase ORF do vetor de expressão binário vegetal pBI121 (Clontech) com as regiões de codificação de extensão completa do CYP82E5v2, de variantes do CYP82E5v2 ou de cDNAs variantes do CYP82E4v2. Isso coloca o tabaco P450 sob o controle transcricional do promotor 35S CaMV. Os construtos baseados em pBI121 e pKYLX71 são transformados em cadeia Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 e introduzidos em cultivos de tabaco Petite Havana e DH98-325-6 (conversora), respectivamente, usando protocolos estabelecidos (Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231).
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Análise Northern Blot
[0180] Os RNAs celulares totais são isolados das folhas de tabaco usando o método TRIZOL®, conforme descrito pelo fabricante (Invitrogen). De cinco a dez microgramos de RNA são fracionados em um gel de agarose 1,2% preparado em solução tampão TBE. A imobilização do RNA, a etiquetagem da sonda e a detecção do sinal são realizados usando a etiquetagem de ácidos nucléicos DIG e kits de detecção, de acordo com as instruções do fabricante (Roche). Alternativamente, as sondas são sintetizadas usando 32P-dCTP de acordo com protocolos que acompanham o kit Random Primed DNA Labeling (Roche).
Isolamento do DNA de plantas mutagenizadas por EMS
[0181] O DNA genômico foi isolado do material de folhas jovens de uma única planta M1 cultivada em estufa para cada conjunto de sementes M1 independentes. Frascos com tampa d rosca de 1,5 ml foram usados para coletar um único disco de folha de cada planta e as amostras foram armazenadas a -80oC até que fossem processadas. O tecido da folha foi depositado no fundo do frasco por centrifugação, sendo que os tubos foram preparados com uma quantidade rala de nitrogênio líquido para facilitar a moenda usando bastões de plástico. O DNA genômico foi isolado do material de moenda adicionando 320 Dl de solução tampão de extração (200mM Tris-Cl, pH 7.5, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS) . As amostras foram vortexadas por 20 segundos e deixadas à temperatura ambiente por 5 minutos, seguido por uma incubação a 37oC por 3 minutos. O material lisado foi centrifugado 10 minutos e o sobrenadante foi transferido a um tubo fresco. Adicionou-se 50 Dl de solução de precipitação de proteínas (Qiagen), sendo que as amostras
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91/112 foram rapidamente vortexadas, colocadas em gelo por 5 minutos, seguido por uma centrifugação de 4 minutos a 16.000 x g. A precipitação de ácidos nucléicos foi alcançada adicionando um volume de 0,7 de isopropanol ao sobrenadante, seguido por centrifugação por 7 minutos a 12.000 x g. Após uma lavagem de 70% etanol, o pellet foi resuspenso em 50 Dl TE.
Preparação do modelo para o sequenciamento
[0182] Tanto o CYP82E4v2 como o CYP82E5v2 contêm dois exons separados por um grande íntron (1001 bp e 1054 bp, respectivamente). Os primers da PCR são projetados especificamente para amplificar o exon 1 e o exon 2 de cada gene. Devido à alta homologia de sequência compartilhada entre os cDNAs dos membros da família genética CYP82E2, dois pares de primers correspondem à sequência de íntrons de modo tal a obter produtos de amplificação específicos do gene desejado (devido ao fato de que as sequências de íntrons dessa família genética não estão tão conservadas como as sequências exom). Os primers exon específicos de 1 para CYP82E4v2 são 5'TGGAATTATGCCCATCCTACA-3' (dianteiro) (SEQ N°:32) e 5'CATTAGTGGTTGCACCTGAGG-3' (traseiro) (SEQ N°:33). Os primers exon específicos de 2 para CYP82E4v2 são 5'GATGAGATGTGTGCATACTTG-3' (dianteiro) (SEQ N°: 34) e 5'CCAAATTAGAAAAACTCGTACTG-3' (traseiro) (SEQ N°:35). Para CYP82E5v2, os primers específicos para amplificar exons 1 são 5'-ATTGTAGGACTAGTAACCCTTACAC-3' (dianteiro) (SEQ N°:36) e 5'GAGGCACAAAGAATTCTCATC-3' (traseiro) (SEQ N°:37); e para o exon 2 CYP82E5v2, os primers 5'-GAGTAGAGGGATTGTTTCCG-3' (dianteiro) (SEQ N°:38) e 5'-GTACAATCAAGATAAAACATCTAAGG-3' (traseiro) (SEQ N°:39) são usados. As reações de PCR foram realizadas em
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92/112 placas microtiter de 96 poços usando 1 Dl de modelo em um volume de reação de 25 Dl contendo 10 pmoles cada primer, 200 DM dNTP, 1,5 mM MgCl e 1,4 unidades de Taq DNA polimerase de alta fidelidade (Roche). A amplificação de DNA das sequências CYP82E4v2foi realizada usando 3 minutos iniciais de denaturação a 94oC, seguido por 30 ciclos de denaturação a 94oC por 30 segundos, têmpera de primer a 55oC por 30 segundos, além de extensão a 72oC por 1,5 minutos, seguido por 7 minutos finais a 72oC de extensão. As condições de amplificação para fragmentos do gene CYP82E5v2 foram as mesmas, exceto que a temperatura de têmpera foi de 53oC. Os produtos da reação PCR foram purificados usando unidades de filtro Millipore's Montage PCRD96. A eletroforese em gel de agarose foi usada para estimar a quantidade e a qualidade dos produtos limpos da PCR antes do sequenciamento.
Análise de sequência
[0183] Os produtos da PCR foram submetidos a um sequenciamento de ciclo usando Applied Biosystems Big Dye Versão 3.1 em reações de sequenciamento com formato de 96 poços, de de acordo com as instruções do fabricante. Os primers usados para o sequenciamento (3,2 pmoles por reação) são os seguintes: 5'-TGGAATTATGCCCATCCTACA-3' (SEQ N°:32) e 5'-CCTATAAAAAGGAAGTTGCCG-3' (SEQ N°:44) (primers dianteiros e traseiros para o exon 1 do CYP82E4v2) ; 5'GATGAGATGTGTGCATACTTG-3' (SEQ N°:34) e 5'CCAAATTAGAAAAACTCGTACTG-3' (SEQ N°:35) (primers dianteiros e traseiros para o exon 2 do CYP82E4v2) ; 5'ATTGTAGGACTAGTAACCCTTACAC-3' (SEQ N°:36) e 5'CTCATCTTTTTTCCATTTATCATTC-3' (SEQ N°:45) (primers dianteiros e
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93/112 traseiros para o exon 1 do CYP82E5v2) ; e 5'CAAGGTTCGGCAGATAGTG-3' (SEQ N°:46) e 5'GTACAATCAAGATAAAACATCTAAGG-3' (SEQ N°:39) (primers dianteiros e traseiros para o exon 2 do CYP82E5v2) . As reações de sequenciamento foram limpas usando placas de 96 poços
EdgeBioSistemas e analisadas usando sequências capilares de
alto rendimento Applied Biosistemas 3700 ou 3730. As
sequências foram alinhadas usando o algoritmo Clustal W
conforme representado no pacote do programa Vetor NTI
(Invitrogen). As mutações putativas são verificadas repetindo
a análise de sequência em plantas irmãs M1 culivada s a partir
do lote de sementes cognatas Mo.
Análise alcalóide
[0184] As análises alcalóides são realizadas por cromatografia a gás, conforme descrito anteriormente. Em resumo, as análises alcalóides são realizadas arrancando folhas de tabaco e embebendo-as em uma solução de 1% etefon, logo, realizando a cura por ar em uma câmara de cultivo de 7 a 10 dias. As folhas curadas são secas a 50°C por dois dias e moídas em um pó fino. Uma determinação quantitativa do conteúdo de nicotina, nornicotina, anatabina e anabasina foi realizada usando um Perkin Elmer Autosistema XL de cromatografia a gás de acordo com o “Protocolo LC” estabelecido na Universidade de Kentucky (disponível online no site da Universidade de Kentucky), aqui incorporado como referência.
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EXEMPLO 1: ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DO CYP82E5V2
Conversão da nicotina em N. tomentosiformis e vários genótipos do tabaco
[0185] Para avaliar a composição alcalóide das plantas de tipo selvagem, concentrações de nicotina e nornicotina foram determinadas nas folhas verdes e nas folhas curadas do N. tomentosíformís e vários genótipos do tabaco usando cromatografia a gás. Em N. tomentosíformís, a nornicotina aparece como o alcalóide predominante tanto nas folhas verdes como nas folhas curadas (Tabela 1). Os cultivos DH-98-325-6 do conversor Burley e os cultivos SC58C do conversor curado em estufa contêm baixos níveis de nornicotina (cerca de 3%) nas folhas verdes, mas uma grande porcentagem (cerca de 95 e 25%, respectivamente) de conteúdo de nicotina é metabolizado em nornicotina uma vez que as folhas entram em senescência (vide Tabela 1). Os níveis de nornicotina são baixos tanto nas folhas verdes como nas folhas curadas dos cultivos nãoconversores Burley e curado em estufa DH98-325-5 e SC58NC, respectivamente, embora a conversão de nicotina aumente ligeiramente após a cura.
Tabela 1. Análise alcalóide de folhas verdes e curadas do N.
tomentosiformis e vários genótipos do tabaco.
Q, % Nicotinaa a, % Nornicotinaa a, % Conversãob
Planta Fenótipo Verde Curadac Verde Curadac Verde Curada
N. GLC 0.003d 0.007 0.188 0.299 98.4 97.7
tomentosiformis (0.0002)e (0.001) (0.022) (0.031) (2.4) (2.1)
DH98-325-5 NC 1.243 1.332 0.032 0.040 2.6 3.0
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(0.334) (0.321) (0.006) (0.008) (0.2) (0.3)
DH98-325-6 SLC 1.113 0.082 0.041 1.416 3.5 94.4
(0.095) (0.019) (0.004) (0.187) (0.1) (1.6)
SC58NC NC 1.422 1.487 0.032 0.039 2.2 2.5
(0.127) (0.089) (0.004) (0.001) (0.07) (0.1)
SC58C SLC 1.171 0.501 0.029 0.164 2.4 24.7
aPorcentagem do peso seco da folha.
b[% nornicotina (% nicotina + % nornicotina)-1] X 100.
cFolhas tratadas com 0,2 % de etefon e curadas até que se tornem amarelas.
dSignifica sobre o conteúdo alcalóide de três plantas, exceto a SC58C, par a qual uma planta foi usada devido à baixa frequência de conversão.
eValores em parêntese representam o erro padrão da média. Abreviaturas: GLC: conversor da folha verde; NC: nãoconversor; SLC: conversor da folha senescente.
Isolamento do cDNA NtabCYP82E5v2 do tabaco
[0186] Para identificar genes putativos de nicotina demetilase do tabaco, uma estratégia de amplificação genética baseada em PCR foi usada, sendo que os primers são complementares aos terminais 5' e 3' da região codificadora NtabCYP82E3. A estrutura do primer foi baseada na observação de que todos os membros da intimamente relacionada subfamília genética CYP82E2 exibem um alto grau de identidade de sequência de DNA nas regiões imediatamente seguintes ao sinal de iniciação ATG e precedentes ao códon de parada TAA (Siminszky et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102:
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14919-14924), disponibilizando sítios alvo de primers bem conservados para a amplificação de membros adicionais da família. Uma PCR usando primers específicos do CYP82E3 e temperaturas de têmpera permissivas foi realizada para amplificar genes putativos de nicotina demetilase de uma biblioteca de cDNA de folha verde de tabaco. A análise de sequência de DNA de 20 clones selecionados aleatoriamente gerados a partir dos produtos da PCR produziram 19 sequências de cDNA NtabCYP82E3 e uma cDNA sendo que a sequência de DNA é diferente de todos os membros funcionalmente caracterizados da subfamília genética CYP82E2 (Siminszky et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102: 14919-14924) . Uma busca de homologia contra o banco de dados GenBank usando o algoritmo BLAST revela que o clone que representa a sequência de DNA única compartilha 99,7% de identidade prevista do nucleotídeo e 99,2% do aminoácido com o tabaco CYP82E5v1 cDNA de função desconhecida. De acordo com as pautas do comitê de nomenclatura P450, o cDNA foi chamado de NtabCYP82E5v2. A sequência de aminoácidos prevista do NtabCYP82E5v2 é 89,2, 91,9 e 91,3% idêntica àquelas dos NtabCYP82E2, NtabCYP82E3 e NtabCYP82E4v2, respectivamente.
NtabCYP82E5v2 codifica uma nicotina demetilase funcional
[0187] Para determinar se o NtabCYP82E5v2 codifica a atividade de nicotina demetilase, o cDNA N.tabCYP82E5 é expressado na cepa de levedura WAT11. A cepa WAT11 foi projetada para proporcionar uma expressão transgênica de alta eficiência e um ótimo ambiente redox para reações mediadas por P450 expressando o gene redutase P450 Arabidopsis, ATR1, sob o controle transcricional de um promotor induzido por galactose
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97/112 (Pompon et al. (1996) Methods Enzymol. 272: 51-64). Os fragmentos microssômicos isolados da levedura que expressa NtabCYP82E5v2 ativamente catalisa a N-demetilação da nicotina. Os valores Km e vmax para a reação de nicotina demetilase mediada por NtabCYP82E5v2 são 5,6 ± 1,4 DM e 0,7 ± 0,02 nmol min-1 mg-1 de proteína (média ± erro padrão), respectivamente. Contrariamente, nenhuma atividade de nicotina demetilase é evidente quando os microssomos isolados da levedura transformada com um plasmídeo vazio são adicionados ao ensaio catalítico.
NtabCYP82E5v2 se deriva do progenitor N. tomentosiformis
[0188] Como o genoma alotetraplóide do tabaco consiste em dois componentes genéticos, o genoma S doado pela N. sylvestris e o genoma T derivado da N. tomentosiformis, não se sabe qual das duas espécies progenitoras contribuíram com o NtabCYP82E5v2 do tabaco. Para essa finalidade, os primers específicos de CYP82E5 foram projetados para amplificar um fragmento genômico dos genes CYP82E5 do tabaco e do progenitor doador de NtabCYP82E5v2. As amplificações de PCR produzem um produto de 2243 bp distinto quanto o DNA genômico isolado do tabaco ou o N. tomentosiformis é usado como modelo, mas os amplicons não são detectados quando o DNA genômico do N. sylvestris é amplificado, indicando que o NtabCYP82E5v2 se derivou do N. tomentosiformis. Uma análise de sequência de DNA revela que os fragmentos genômicos do NtabCYP82E5v2 e do NtomCYP82E5 contêm um íntron de 1054 bp abordado por uma região codificadora 604 bp 5' e 585 bp 3' e diferem a 15 posições das quais nove e seis estão localizadas dentro da região codificadora e do íntron, respectivamente.
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[0189] Além disso, as regiões de codificação de dez clones genômicos isolados do tabaco selecionados aleatoriamente compartilham 100% de identidade de nucleotídeos com o NtabCYP82E5v2 cDNA, indicando que o NtabCYP82E5v2 é a única variante do CYP82E5 localizada no DH98-325-6.
NtabCYP82E5v2 é expressado a baixos níveis nas folhas verdes e amarelas
[0190] Para investigar o papel catalítico do CYP82E5 in planta, o perfil transcricional do CYP82E5v2 nas folhas verdes e senescentes do conversor (DH98-325-6) e do não-conversor (DH98-325-5) Burley, do conversor e do não-conversor do tabaco curado em estufa (SC58) e do N. tomentosiformis foi determinado usando análise PCR quantitativa em tempo real (qrt) .
Tabela 2. Quantificação absoluta dos cDNA CYP82E4v2 e CYP82E5v2 derivados das folhas verdes e curadas do N. tomentosiformis e diferentes tipos de genótipos mediante a análise de reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real.
CYP82E4v2 CYP82E5v2
Amostra Verde Curado Verde Curado
Pg
N. tomentosiformis
0.35c 17.94e 1.73d 0.18c
(0.16) (2.57) (0.72) (0.09)
DH98-325-5
0.0004a 0.007b 0.08c 0.26c
(0.0001) (0.003) (0.01) (0.17)
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DH98-325-6
0.004b 26.09e 0.137c 0.311c
(0.001) (3.50) (0.003) (0.109)
SC58NC 0.0006a 0.005b 0.070c 0.067c
(0.0001) (0.003) (0.012) (0.005)
SC58C 0.0006a 1.81d 0.11c 0.083c
[0191] *As médias são para 1 folha de 3 plantas independentes, 3 medições de cDNA por amostra (n = 9), exceto o SC58C, no qual apenas uma planta foi usada (n = 3).
[0192] *Números seguidos por diferentes letras são significativamente diferentes de acordo com o LSD protegido de Fisher (0.05) .
[0193] Baixos níveis de NtabCYP82E5v2 se expressam nas folhas verdes ou amarelas de todos os cultivos de tabaco (vide Tabela 2). A expressão do NtabCYP82E5v2 aumentou significativamente nas folhas curadas em comparação com as folhas verdes dos cultivos Burley conversor e não-conversor, mas permaneceram sem modificação no tabaco curado por estufa. Nas folhas verdes do N. tomentosiformis, a expressão do NtomCYP82E5 foi maior do que no tabaco, mas nenhuma diferença foi percebida nas folhas curadas por estufa das duas espécies (Tabela 2) . Para comparar os níveis de expressão do CYP82E5v2 com os do CYP82E4v2, um gene de nicotina demetilase previamente caracterizado cuja transcrição demonstrou ser altamente super regulada em folhas senescentes de N. tomentosiformis e de conversores de tabaco (Gavilano et al.
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100/112 (2007) J. Biol. Chem. 282: 249-256), a acumulação da transcrição do CYP82E4v2 foi comparada nos mesmos extratos usados para quantificar o mRNA CYP82E5v2. A transcrição do NtabCYP82E5v2 é significantemente maior do que aquela do NtabCYP82E4v2 nas folhas verdes de todos os cultivos de tabaco, no N. tomentosíformís e nas folhas curadas de plantas não-conversoras de tabaco. Porém, a tendência é revertida nas folhas curadas de conversor do tabaco e no N. tomentosíformís
(Tabela 2 ) . Dos dois genes de nicotina demetilase
caracterizados, portanto, CYP82E4v2 é o fator dominante na
produção de nornicotina induzida por senescência em N.
tomentosíformís e tabaco . Além disso , a atividade de
NtabCYP82E5v2 é o principal determinante da conversão de nicotina nas folhas verdes do tabaco.
EXEMPLO 2: IDENTIDADE DE SEQUÊNCIA EM MEMBROS DA FAMÍLIA GENÉTICA DO CITOCROMO P450
[0194] Embora o CYP82E5v2 e o CYP82E4v2 sejam ambos nicotina demetilases, possuem menos homologia de sequência entre um e outro do que o CYP82E5v2 em relação ao CYP82E3, por exemplo.
[0195] Tabela 3. Identidade de sequência de aminoácidos compartilhada entre a enzima de nicotina demetilase CYP82E4v2 e outras proteínas CYP82E2 que passaram por um ensaio para detectar atividade de nicotina demetilase. O CYP82E5v2 e o CYP82E4v2 são as únicas proteínas representadas que possuem atividade de nicotina demetilase.
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CYP82E 4v6 CYP82E4 v12 58- 166 CYP82 E3 CYP82E 2v1 CYP82 E2v2 CYP82E 5v2
CYP82E4v 2 SEQ N° : 13 9 9.6% 99.4% 94.8% 94.2% 92.6% 92.6% 91.1%
[0196] Tabela 4. Identidade de sequência de aminoácidos compartilhada entre a enzima de nicotina demetilase CYP82E4v2 e outras proteínas CYP82E2. O CYP82E5v2 e o CYP82E4v2 são as únicas proteínas representadas que possuem atividade de nicotina demetilase.
CYP82E4 v2 CYP82 E3 CYP82E 2
CYP82E5v 91.1% 91.9% 91.3%
2
SEQ N°:2
[0197] Tabela 5. Perfis de expressão para membros da família genética CYP82E2 que passaram por um ensaio para detectar atividade de nicotina demetilase. O CYP82E5v2 e o CYP82E4v2 são as únicas proteínas representadas que receberam positivo para a atividade de nicotina demetilase.
CYP82E4v2 CYP82E4v6 CYP82E4v12 58-166 CYP82E3 CYP82E2v1 CYP82E2v2 CYP82E5v2
Extrema- Baixa na Não Extrema- Baixa Extrema- Não Baixa
mente folha Reportado mente tanto mente Reportado na
baixa na verde; baixa na baixa na folha
folha Alta tanto folha folha verde;
verde; na folha na folha verde verde; Muito
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Extrema senescente verde como Extremamente baixa
mente induzida como na alta na na
alta por na folha folha folha folha
na folha etileno senescente induzid folha de
senescente induzida por senescente senescên-
induzida por etileno induzida cia
por etileno por Induzida
etileno etileno por
etileno;
EXEMPLO 3: MUTAÇÕES EM CYP82E4V2 E CYP82E5V2
Obtenção de variantes derivadas de EMS do CYP82E4v2
[0198] Para facilitar a introdução de mutações aleatórias no genoma do tabaco, milhares de sementes da forte conversora Burley linha DH98-325-6 foram tratados com a mutagênese química etil metano sulfonato (EMS). Aproximadamente 4000 plantas mutagenizadas (generação M0) foram cultivadas no campo e permitiu-se que se auto-polenizassem. Várias cápsulas de cada planta individual foram combinadas para criar populações de sementes M1 discretas, cada uma correspondente a uma M0 planta individual. Os DNA genômicos foram isolados do tecido de folha jovem de uma única planta M1 cultivada em estufa a partir de cada conjunto de sementes M1. Para identificar plantas que estejam realizando mutações no gene CYP82E4v2, primers específicos foram projetados para amplificar independentemente cada um dos dois exons do gene. A informação da sequência de DNA foi obtida usando análise de sequência de alto rendimento de 96 poços dos produtos de amplificação. A análise completa das plantas individuais envolveram 4 reações de sequenciamento com 96 poços: sequenciamento dianteiro e
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103/112 traseiro do produto de amplificação exon 1, e sequenciamento dianteiro e traseiro do PCR exon 2.
[0199] As mutações foram identificadas realizando um alinhamento multi-sequencial de todas as 96 sequências para uma corrida dada e procurando desvios na sequência de tipo selvagem. Qualquer mutação que tenha ocorrido em uma planta M0 paternal poderia parecer que estivesse segregando na proporção 1:2:1 na geração M1 para o mutante versus os alelos de tipo selvagem. As plantas M1 que são homozigotas para uma mutação induzida por EMS são rapidamente reconhecidos como polimorfismos que se desviam da sequência de tipo selvagem, verificada em ambas direções. As plantas M1 que são heterozigotas por uma mutação no CYP82E4v2 deveriam ter um mutante e alelos de tipo selvagem, cada um representando 50% da amplificação do produto.
[0200] Após o sequenciamento, se esperaria que a localização da mutação fosse anotada como um N, já que a leitura de fluorescências nesse sítio seria uma mistura de duas bases alternativas. A aparência de um “N na mesma localização de nucleotídeo usando os primers complementares, combinado com a inspeção visual dos correspondentes cromatogramos distingue as plantas que são realmente heterozigotas para uma mutação no CYP82E4v2, e diferencia esses heterozigotos verdadeiros das anomalias de sequência artifactual.
Mutações no CYP82E4v2
[0201] A análise de sequências de alto rendimento de 672 plantas M1 independentes resultou na identificação de onze indivíduos que possuem pontos de mutação com o gene CYP82E4v2
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104/112 (vide Tabela 6) . Seis das onze plantas identificadas como carregadoras de mutações CYP82E4v2 são homozigotas para os alelos mutantes (vide Tabela 6) . Todas as onze as mutações resultaram em mudanças na sequência de aminoácidos prevista da proteína codificada.
Tabela 6. Linhas M1 de plantas DH98-325-6 tratadas com EMS que possuam mutações no gene CYP82E4v2
Linha da Mutação de Modificação Zigozidade do
planta nucleotídeos de alelo mutante
* aminoácidos
* *
DH98-325-6 C1372T P458S Homozigoto
#101
DH98-325-6 G1092T K364N Homozigoto
#121
DH98-325-6 C113T P38L Homozigoto
#164
DH98-325-6 G601A E201K Heterozigoto
#321
DH98-325-6 G50 6A R169Q Heterozigoto
#377
DH98-325-6 G1375A G459R Heterozigoto
#569
DH98-325-6 G8 8 6A E296K Heterozigoto
#506
DH98-325-6 C1280T T427I Heterozigoto
#453
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DH98-325-6 #775 G986A W329Stop Homozigoto
DH98-325-6 #610 G1126A V37 6M Homozigoto
DH98-325-6 #761 G511A D171N Homozigoto
[0202] *A localização do nucleotídeo é em referência ao códon de início ATG do cDNA CYP82E4v2 (vide SEQ N°:50). O nucleotídeo à esquerda do número representa o resíduo de tipo selvagem, enquanto o nucleotídeo da direita indica o resíduo do mutante (por ex. C1372T significa que o resíduo C normalmente localizado na posição 1372 foi mutado a um resíduo T).
[0203] ** A localização do aminoácido é em referência ao inibidor metionina do polipeptídeo CYP82E4v2 (vide SEQ N°:13). O aminoácido à esquerda do número representa o resíduo de tipo selvagem, enquanto o aminoácido da direita indica o resíduo produzido pelo alelo mutante (por ex. P458S significa que o resíduo de prolina normalmente localizado na posição 458 da sequência de proteína foi modificado a uma Serina). Stop indica a introdução de um códon de parada prematuro.
[0204] A Planta n° 775 possui uma mutação no códon 329 que modifica um códon triptofano (TGG) em um códon de parada prematuro (TAG). Essa mutação produz a proteína codificada completamente não-funcional já que o domínio essencial vinculado a heme e outras regiões altamente conservadas da enzima estão localizadas na parte inferior do códon 329. Outras plantas que contêm mutações que afetam motivos
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106/112 altamente conservados compartilhados pela grande maioria das enzimas P450 incluem: planta n° 101 (na qual um resíduo conservado Pro imediatamente adjacente ao Cis aminoácido vinculado a heme é modificado a um Ser); planta n° 164 (resíduo Pro dentro da região altamente conservada de dobradiça rica em Pro da proteína modificada a um Leu); e planta n° 569 (resíduo Gly que é parte do motivo muito altamente conservado e vinculado a heme modificado a um Arg). Análise alcalóide das variantes do CYP82E4v2
[0205] Uma análise alcalóide foi realizada nas folhas curadas de indivíduos variantes para avaliar o efeito da mutação na conversão metabólica de nicotina a nornicotina. Conforme ilustrado na Tabela 7, três indivíduos (n° 101, n° 121 e n° 775) exibem taxas de conversão similares a plantas de controle não-conversoras cultivadas a partir de lotes de sementes que passaram por uma triagem para eliminar os indivíduos conversores (plantas TN90 LC) . As enzimas variantes CYP82E4v2 produzidas nessas plantas são completamente (ou quase completamente) não-funcionais. Duas plantas (n° 164 e n° 761) exibem uma alta taxa de conversão e não possuem efeito detrimental na atividade da enzima. Esse resultado para a planta n°164 é surpreendente porque contém uma mutação de Pro a Leu dentro de um dos resíduos que definem o motivo altamente conservado de dobradiça rico em Pro. A modificação de Val a Met no resíduo 376 inibe parcialmente a função da enzima como a planta mutante homozigota (n° 610) exibe um fenótipo de conversão intermediário (41.5%).
Tabela 7. Conteúdo alcalóide como porcentagem do peso seco de plantas homozigotas M1 para mutações no gene CYP82E4v2
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107/112
Planta Nicot ina Nornicot ina Anabasi na Anatabi na %Conversão *
DH98-325-6 2.17 0.0376 0.00514 0.0384 1.7%
#101
DH98-325-6 2.5 0.0333 0.00557 0.043 1.3%
#121
DH98-325-6 0.216 0.84 0.00499 0.0532 79.5%
#164
DH98-325-6 0.214 0.152 0.00429 0.0121 41.5%
#610
DH98-325-6 0.214 0.999 0.00429 0.0426 82.4%
#761
DH98-325-6 0.505 0.0159 0.00417 0.0136 3.1%
#775
SC58 CtCt 0.206 0.565 0.00412 0.0197 73.3%
(Controle)'
TN90 LC 3.11 0.0647 0.00901 0.0487 2.0%
(Controle)
TN90 LC 2.46 0.0521 0.00846 0.0417 2.1%
(Controle)
*[% nornicotina / (% nicotina + % nornicotina)] X 100
[0206] 'Uma planta conversora de genótipo SC58 curada em estufa é usada como um controle conversor forte; duas plantas de genótipo TN90 selecionadas a partir de lotes analisados para identificar conversores baixos (LC) são usadas como controles não-conversores.
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[0207] A substituição do resíduo Lys na posição 364 por um Asn da planta n°121 dentro dessa planta não ocorre em nenhum motivo conservado entre as enzimas P450, nem dentro de nenhuma região prevista por Xu et al. (Physiologia Plantarum 129: 307319, 2007) para ser um sítio de reconhecimento de substrato. Um alinhamento BLAST contra sequências de proteínas depositadas no GenBank revela várias P450s que possuem um resíduo Asn na posição análoga (por ex. o gene CYP82A1 da ervilha -número de aquisição Q43068) . O gene variante CYP82E4v2 na planta n° 121 está completamente inativo. Outra anomalia com a planta n° 121 se refere à natureza das mutações induzidas por EMS. Sabe-se que o EMS induz mutações mediante a alquilação de resíduos G, resultando em mutações de transição G a A ou C a T (Anderson, Methods Cell Biol. 48:31-58, 1995). Muito raramente a EMS provoca mutação de transversão de G to T como aquela encontrada na planta n° 121 (vide Tabela 3). Todas as outras mutações descritas tanto para os genes CYP82E4v2 como para os genes CYP82E5v2 são as mutações de transição G a A ou C a T esperadas.
Mutações no CYP82E5v2
[0208] Uma estratégia similar de sequenciamento de alto rendimento foi usada para identificar mutações no CYP82E5v2, o outro gene confirmado de nicotina N-demetilase que é encontrado no genoma do tabaco. Uma triagem de 768 plantas M1 revelou que 11 indivíduos possuem mutações no CYP82E5v2 (vide Tabela 8). Três plantas (n° 744, n° 561 e n° 340) contêm substituições de nucleotídeos silenciosas que não alteraram a sequência de proteínas prevista. Das oito mutações que geram mudanças na sequência de proteínas, duas são de particular
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109/112 interesse. A planta n° 1013 contém uma mutação que poderia provocar um produto truncado capaz de deixar o produto completamente não-funcional. A mutação de G a A na posição 1266 modifica o códon Trp (TGG) em um códon de parada (TGA) prematuro. As proteínas CYP82E5v2 previstas produzidas a partir desse quadro de leitura truncado carece dos 96 aminoácidos finais da enzima, uma região que inclui o domínio vinculado a heme essencial. Sem ser limitada pelo mecanismo, essa proteína truncada é provavelmente incapaz de catalisar a eliminação oxidativa do grupo de nicotina N' metil para formar nornicotina. Independentemente do mecanismo, a planta n° 1013 possui um alelo não-funcional. A planta n° 680 possui uma mutação que modifica um resíduo Pro na posição 449 a um Leu. Esse Pro é bem conservado nas plantas P450 e fica imediatamente adjacente ao motivo F-x-x-G-x-R-x-C-x-G que define a região vinculada a heme. A mutação encontrada na planta n° 680 possui um impacto negativo na função da enzima.
Tabela 8. Linhas M1 de plantas DH98-325-6 tratadas com EMS que possuam mutações no gene CYP82E5v2
Linha da planta Mutação de nucleotídeos * Modificação de aminoácidos * * Zigozidade do alelo mutante
DH98-325-6 #198 C703T P235S Heterozigoto
DH98-325-6 #680 C1346T P449L Homozigoto
DH98-325-6 G558A Nenhuma Homozigoto
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#744
DH98-325-6 #163 C521T S174L Heterozigoto
DH98-325-6 #561 G1458A Nenhuma Heterozigoto
DH98-325-6 #154 C1229T A410V Heterozigoto
DH98-325-6 #340 G1248A Nenhuma Heterozigoto
DH98-325-6 #780 G672A M224I Heterozigoto
DH98-325-6 #799 C215T P72L Heterozigoto
DH98-325-6 #540 C427T L143F Heterozigoto
DH98-325-6 #1013 G1266A W422Stop Homozigoto
[0209] *A localização do nucleotídeo é em referência ao códon de início ATG do cDNA CYP82E5v2 (vide SEQ N°:1). O nucleotídeo à esquerda do número representa o resíduo de tipo selvagem, enquanto o nucleotídeo da direita indica o resíduo
do mutante (por ex. C703T significa que o resíduo C
normalmente localizado na posição 703 foi mutado a um resíduo
T) .
[0210] ** A localização do aminoácido é em referência ao inibidor metionina do polipeptídeo CYP82E5v2 (vide SEQ N°:2). O aminoácido à esquerda do número representa o resíduo de tipo selvagem, enquanto o aminoácido da direita indica o resíduo
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111/112 produzido pelo alelo mutante (por ex. P235S significa que o resíduo de Prolina normalmente localizado na posição 235 da sequência de proteína foi modificado a uma Serina). Stop indica a introdução de um códon de parada prematuro. Nenhuma indica mutações que resultaram em substituições silenciosas que não alteraram a sequência de aminoácidos prevista.
Plantas com mutações no CYP82E4v2 e CYP82E5v2
[0211] Linhas de plantas de tabaco são geradas e mostram uniformidade e estabilidade dentro dos limites da influência meio-ambiental para reduzir a conversão de nicotina a nornicotina a níveis de cerca de 0,5% quando uma planta com uma mutação que inibe a atividade da nicotina demetilase do CYP82E4v2 é cruzada com uma planta que possua uma mutação que inibe a atividade da nicotina demetilase do CYP82E5v2.
[0212] Um cruzamento ilustrativo seria entre uma planta mutante CYP82E4v2 (da Tabela 9) e uma planta mutante CYP82E5v2 (da Tabela 9).
Tabela 9. Cruzamento ilustrativos de plantas DH98-325-6 que possuam mutações nos genes CYP82E5v2 e CYP82E4v2
CYP82E5v2 CYP82E4v2
DH98-325-6 DH98-325-6
#198 #101
DH98-325-6 DH98-325-6
#680 #121
DH98-325-6 DH98-325-6
#163 #775
DH98-325-6 #154
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DH98-325-6 #780
DH98-325-6 #799
DH98-325-6 #540
DH98-325-6 #1013
[0213] Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados na especificação são indicações do nível dos especialistas na matéria à qual esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patentes estão aqui incorporados como referência da mesma forma que se cada uma das publicações ou pedidos de patentes fossem especificamente e individualmente indicados para serem incorporados como referência.
[0214] Embora a invenção anterior tenha sido descrita em algum detalhe a modo de ilustração e exemplo com o objetivo de esclarecer o entendimento, é natural que certas mudanças e modificações possam ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (16)

1. Método de obtenção de uma planta de tabaco, ou célula ou parte desta, tendo níveis reduzidos de nornicotina, em que a referida planta de tabaco, ou célula ou parte desta, é do gênero Nícotíana e o referido método é caracterizado por compreender:
a) modificar o alelo CYP82E5v2 funcional de uma célula vegetal de tabaco para modificar alelos a um CYP82E5v2 não-funcional tendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 12, sendo que o gene que codifica o referido CYP82E5v2 compreende uma mutação do nucleotídeo G para A no nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 1266 da SEQ ID NO: 1;
b) cultivar a referida célula vegetal de tabaco sob condições de crescimento de célula vegetal; e
c) regenerar uma planta de tabaco, ou célula ou parte desta, a partir da referida célula vegetal de tabaco.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por essa modificação compreender mutagênese sítio-dirigida.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta de tabaco, ou célula ou parte desta, compreende um gene codificando a nicotina demetilase senescência-induzida que compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 50 com uma mutação em nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em C1372T, G1092T e G986A.
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4. Método de obtenção de uma planta de tabaco, ou célula ou parte desta, tendo níveis reduzidos de nornicotina, em que o referido método é caracterizado por compreender:
a) alterar o genoma de uma célula vegetal de tabaco para ser homozigota para uma mutação no códon 329 da SEQ ID NO: 50, sendo que a célula vegetal de tabaco compreende uma nicotina demetilase senescência-induzida tendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 22;
b) cultivar a referida célula vegetal de tabaco sob condições de crescimento; e
c) regenerar uma planta de tabaco, ou célula ou parte desta, a partir da referida célula vegetal de tabaco.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida planta de tabaco, ou célula ou parte desta, compreende um gene codificando a nicotina demetilase de folha verde que compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 com uma mutação de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em G1266A e C1346T.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de obter um material de planta de tabaco a partir da referida planta de tabaco, ou célula ou parte desta.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de preparar um produto de tabaco a partir do referido material de planta de tabaco.
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8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido produto de tabaco é um produto de tabaco sem fumaça tais como rapé ou tabaco mastigável ou o referido produto de tabaco é um charuto, cigarro, tabaco para cachimbo, cigarrilha, cigarros de filtro recuado não-ventilados ou ventilados, adesivos dispersantes, goma de mascar ou pastilhas.
9. Produto de tabaco caracterizado por ser preparado a partir de um material de planta de tabaco obtido a partir da planta de tabaco, ou célula ou parte desta, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o referido produto de tabaco é um cigarro de filtro recuado não-ventilado ou ventilado, adesivo dispersante, goma de mascar ou pastilhas.
10. Método para fabricar um produto de tabaco, caracterizado por compreender preparar o referido produto de tabaco a partir da planta de tabaco, ou célula ou parte desta, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou a partir de um material de planta de tabaco obtido a partir da planta de tabaco, ou célula ou parte desta, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido produto de tabaco é um produto de tabaco sem fumaça tais como rapé ou tabaco mastigável ou o referido produto de tabaco é um charuto, cigarro, tabaco para cachimbo, cigarrilha, cigarros de filtro recuado não-ventilados ou ventilados, adesivos dispersantes, goma de mascar ou pastilhas.
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12. Polinucleotídeo isolado caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos compreendendo a SEQ ID NO: 4 e adicionalmente compreendendo uma mutação selecionada do grupo que consiste em C703T, C1346T, C521T, C1229T, G672A, C215T, C427T e G1266A, ou um complemento da mesma.
13.
Cassete de expressão caracterizado por compreender um promotor que é funcional operacionalmente ligado a uma conforme definida na reivindicação em uma célula vegetal sequência de nucleotídeos 12.
14. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 13 caracterizado pelo fato de que o referido promotor é selecionado do grupo que consiste em um promotor induzível, constitutivo, induzido por patógeno ou ferimento, regulado ambientalmente ou de acordo com o desenvolvimento, ou específico para célula ou para tecido.
15. Polipetpídeo isolado caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 a 12 ou 14 a 24, em que o referido polipeptídeo é capaz de converter nicotina a nornicotina em folhas verdes de tabaco.
16. Método de obtenção de uma planta, ou parte de planta desta, do gênero Nícotíana, caracterizado por compreender:
a) transformar uma célula vegetal com o referido cassete de expressão conforme definido na reivindicação 13;
b) cultivar a referida célula vegetal transformada sob condições de crescimento de célula vegetal; e
Petição 870200025333, de 21/02/2020, pág. 125/133
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c) regenerar uma planta a partir da referida célula vegetal cultivada, em que a referida planta, ou parte de planta desta, compreende o referido cassete de expressão.
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