BRPI0820327A2 - moléculas e métodos para modulação de proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade 6 (lrp6) - Google Patents

Abstract

MOLÉCULAS E MÉTODOS PARA MODULAÇÃO DE PROTEÍNA RELACIONADA AO RECEPTOR DE LIPOPROTEÍNA DE BAIXA DENSIDADE 6 (LRP6). A invenção refere-se a moléculas de ligação à LRP6 agonistas ou antagonistas (por exemplo, anticorpos ou fragmentos Fab) e seu uso para facilitar ou inibir a sinalização à via Wnt, respectivamente. As referidas moléculas de ligação à LRP6 agonistas ou antagonistas podem ser usadas, por exemplo, para diagnosticar, aliviar os sintomas de, proteger contra e tratar distúrbios de sinalização ao Wnt associados a níveis anormalmente baixos ou anormalmente altos de sinalização à via Wnt, respectivamente. Exemplos não-limitativos de distúrbios os quais podem ser tratados associados à super-regulação anormal de sinalização ao Wnt é câncer (por exemplo, câncer de cólon). Exemplos não-limitativos de distúrbios os quais podem ser diagnosticados, protegidos contra e tratados incluem cânceres, distúrbios ósseos (por exemplo, osteoporose e osteoartrite), diabetes, doenças neurodegene- rativas, tal como mal de Alzheimer e distúrbios fibróticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS

E MÉTODOS PARA MODULAÇÃO DE PROTEÍNA RELACIONADA AO RECEPTOR DE LIPOPROTEÍNA DE BAIXA DENSIDADE 6 (LRP6)".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A família de genes Wnt codifica uma grande classe de proteinas secretadas relacionadas ao proto-oncogene Int1AWnt1 e drosófila sem asas ("Wg") (Drosophila wingless), um homólogo de Drosophila Wnt1 (Cadigan et al. (1997) Genes & Development 11: 3286-3305). Os Wnts são expressados em uma série de tecidos e órgãos e são necessários para muitos processos de desenvolvimento, incluindo segmentação em Drosophila; do endoderma em C. elegans; e estabelecimento da polaridade nos membros, diferencia- ção da crista neural, morfogênese dos rins, determinação de sexo e desen- volvimento cerebral em mamíferos (Parr, et al. (1994) Curr. Opinion Genetics . & Devel. 4: 523-528). A via de Wnt é um regulador mestre no desenvolvi- mento de animais, tanto durante a embriogênese como no organismo maduro ' (Eastman, et al. (1999) Curr. Opin. Cell Biol. 11: 233-240; Peifer, et al. (2000) Science 287: 1606-1609). Os sinais de Wnt são transduzidos pela família Frizzled ("FZ") de sete receptores de domínio transmembrana (Bhanot et a/. (1996) Nature 382: 225-230). Os receptores da superfície celular Frizzled (Fzd) desempe- nham um papel essencial na sinalização de Wnt canônica e não-canônica. Na via canônica, depois da ativação de Fzd e LRP5/6 (proteína relacionada a receptor de lipoproteína de baixa densidade 5 e 6) por proteínas de Wnt, é gerado um sinal que impede a fosforilação e degradação de B-catenina pelo “complexo de destruição de B-cat"”, permitindo a translocação e acúmulo estável de B-catenina no núcleo e, portanto, a transdução do sinal de Wnt. (Perrimon (1994) Cell 76: 781-784) (Miller, J.R. (2001) Genome Biology, 3(1):1-15). A via de sinalização de Wnt não-canônica é menos bem definida: há pelo menos duas vias de sinalização de Wnt não-canônicas que foram propostas, inclu- indoaviade polaridade celular planar (PCP), a via Wnt/Ca++, e uma via de extensão de convergência. A glicogênio sintase cinase 3 (GSK3, conhecida como shaggy em drosófila), o produto do gene supressor de tumor APC (polipose do cólon Í adenomatosa) (Gumbiner (1997) Curr. Biol. 7:R443-436), e a proteína- esqueleto Axin, são todos reguladores negativos da via de Wnt, e em con- junto formam o "complexo de destrução de B-cat". Na ausência de um ligan- tedeWnt estas proteinas formam um complexo e promovem a fosforilação e degradação de B-catenina, enquanto que a sinalização de Wnt inativa o complexo e impede a degradação de B-catenina. A B-catenina estabilizada se transloca para o núcleo como resultado, onde ela se liga a fatores de transcrição TCF (fator de células T) (conhecidos também como fator intensi- ficador-ligante linfoide 1 (LEF1)) e serve como um coativador da transcrição induzida por TCF/LEF (Bienz, et a/. (2000) Cell 103: 311-320; Polakis, et al.

(2000) Genes Dev 14: 1837-1851). A sinalização de Wnt ocorre por intermédio de mecanismos ca- . nônicos e não-canônicos. Na via canônica, depois da ativação de Fzd e L- RP5/6por proteinas de Wnt, B-catenina estabilizada se acumula no núcleo e leva à ativação de genes-alvo de TCF (como descrito acima) (Miller, J.R. (2001) Genome Biology; 3(1):1-15). A via de sinalização de Wnt não- canônica é menos bem-definida: pelo menos duas vias de sinalização de Wnt não-canônicas foram propostas, incluindo a via de polaridade celular planar(PCP)eaviaWntCat+.

A alta ativação da via de Wnt de forma aberrante, através da estabilização de B-catenina, desempenha um papel fundamental na tumori- gênese para muitos carcinomas colorretais. Estima-se que 80% dos carci- nomas colorretais (CRCs) abrigam mutações inativadoras no repressor tu- moral APC, o que permite a sinalização ininterrupta de Wnt. Além disso, há um conjunto de evidências que sugere que a ativação da via de Wnt pode estar envolvida em melanoma, e cânceres de mama, fígado, pulmão e estô- mago. Há uma conexão há muito reconhecida entre o desenvolvimento nor- mal de Wnts e câncer, uma conexão estabelecida ainda com a identificação do proto-oncocogene c-Myc como um alvo da sinalização de Wnt (He et al. (1998) Science 281:1509-3512).

Além disso, outros distúrbios associados a níveis patologicamen-

te altos ou baixos da sinalização de Wnt incluem, porém sem limitações, os- Í teoporose, osteoartrite, doença renal policística, diabetes, esquizofrenia, do- ença vascular, doença cardíaca, doenças proliferativas não-oncogênicas, e doenças neurodegenerativas tais como doença de Alzheimer. A regulação ascendente aberrante da sinalização de Wnt está associada a câncer, oste- ovartrite, e doença renal policística, enquanto que a regulação descendente aberrante da sinalização de Wnt foi ligada à osteoporose, obesidade, diabe- tes, distúrbios fibróticos, e doenças neuronais degenerativas. O atual paradigma para desenvolver terapias para distúrbios re- acionados à sinalização de Wnt, tais como câncer colorretal, baseia-se em assestar componentes da via de B-cat ou Wnt a jusante de B-cat. Estudos recentes, entretanto, sugerem que a sinalização autócrina de Wnt mediada pelo receptor de Wnt Frizzled e LRP5/6 pode desempenhar papéis importan- - tes na regulação do crescimento tumoral e sobrevida. Existe uma necessi- dade de se obter agentes e métodos que inibem ou potencializam a atividade Ú de transdução do sinal de Wnt modulando a ativação da via de Wnt ao longo de outras junções críticas, e desta forma, tratando, diagnosticando, preve- nindo e/ou melhorando os distúrbios relacionados à sinalização de Wnt.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a epitopos de moléculas ligantes de LRP6, e métodos para usar as moléculas. As moléculas ligantes de LRP6 interagem com LRP6 e são, desta forma, capazes de modular as funções de LRP6. As moléculas ligantes agonizantes ou antagonistas de LRP8 podem ser usadas para facilitar ou inibir a sinalização da via de Wnt, respectivamen- te; portanto, as moléculas ligantes agonizantes ou antagonistas de LRP6 podem ser usadas para, por exemplo, diagnosticar, melhorar os sintomas, proteger contra, e tratar distúrbios da sinalização de Wnt associados a níveis aberrantemente baixos ou aberrantemente altos da sinalização da via de Wnt, respectivamente. Um exemplo não-limitativo de um distúrbio associado àregulação ascendente aberrante de Wnt é câncer (por exemplo, câncer de mama, câncer de pulmão, e câncer de cólon). Os exemplos não-limitativos de distúrbios associados à regulação descendente aberrante da sinalização de Wnt são distúrbios relacionados a ossos distinguidos por baixa densidade mineral óssea (BMD) (por exemplo, osteoporose). Em vários aspectos, a invenção fornece moléculas ligantes de LRP6 que modulam (por exemplo, inibem ou promovem) uma ou mais fun- ções biológicasdeLRP6.Por exemplo, uma molécula ligante de LRP6 pode modular a fosforilação e subsequente degradação de B-catenina.

A título de outro exemplo, uma molécula ligante de LRP6 pode interferir com a capaci- dade de LRP6 de se ligar a membros integrais da via de Wnt, por exemplo, DKK1 (dickkopf 1), DKK2, DKK4, SOST1, SOSD1 (USAG1), sFRP (proteina solúvel relacionada a Fzd) 1-4, Wise (a versão murina de USAG1), ou ligan- tes de Wnt em si.

As moléculas ligantes de LRP6 incluem, por exemplo, anticorpos que se ligam a LRP6 (por exemplo, dentro de um domínio ou epitopo especi- - fico de LRP6, tal como a primeira ou terceira hélice do domínio extracelular de LRP6, ou domínios específicos dentro de qualquer hélice (por exemplo, uma repetição EGF, um modelo semelhante a YWTD, ou outros)), e polipep- tídeos que incluem partes ligantes de antígenos desses anticorpos.

As molé- culas ligantes de LRP6 incluem também moléculas nas quais a parte ligante não é derivada de um anticorpo, por exemplo, moléculas ligantes de LRP6 derivadas de polipeptídeos que têm uma dobra semelhante à imunoglobuli- na, e nas quais a parte ligante de antígeno é manipulada para se ligar a L- RPG através de randomização, seleção, e maturação de afinidade.

Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece uma molécula ligante de LRP6 que inclui uma parte ligante de antígeno de um anticorpo que se liga (por exemplo, se liga especificamente) a LRP6, onde a parte ligante de antígeno se liga a um epitopo dentro da "hélice 1" de LRP6 humana (SEQ ID NO:2; resíduos 20-326 de SEQ (ID NO:1) dentro ou se so- brepondo à um dos seguintes: (a) aminoácidos 286-324 de SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobreposto à seguinte sequência: NATNPC- GIDN GGCSHLCLMS PVKPFYQCAC PTGVKLLENG KTCK (SEQ ID NO:3)); (b) aminoácidos 66-69 de SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobreposto à seguinte sequência: YWSD); (c) aminoácidos 110-113 de SEQ

ID NO:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobreposto à seguinte sequência: ' YWTD); (d) aminoácidos 153-156 de SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobreposto à seguinte sequência: YWTD); (e) aminoácidos 197-200 de SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobreposto à seguinte sequência: 5 YWAD);e(f) aminoácidos 238-241 de SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo den- tro ou sobreposto à seguinte sequência: YWTD). Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula ligante de LRP6 que inclui uma parte ligante de antígeno de anticorpo que se liga (por exemplo, se liga especificamente) a LRP6, onde a parte ligante de antígeno seligaa um epitopo dentro da "hélice 1" de LRP6 humana (SEQ ID NO:2; resíduos 20-326 de SEQ ID NO:1) dentro ou sobreposto a um dos seguintes: (a) aminoácidos 20-65 de SEQ ID NO:1; (b) aminoácidos 70-109 de SEQ ID NO:1; (c) aminoácidos 114-152 de SEQ ID NO:1; (d) aminoácidos 157-196 - de SEQ ID NO:1; e (e) aminoácidos 201-237 de SEQ ID NO:1; e (f) aminoá- cidos242-326 de SEQ ID NO:1.

Ú Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece uma molécula ligante de LRP6 que inclui uma parte ligante de antígeno de um anticorpo que se liga (por exemplo, se liga especificamente) a LRP6, onde a parte ligante de antígeno se liga a um epitopo dentro da "hélice 3" da LRP6 humana (SEQ ID NO:4; resíduos 631-932 de SEQ ID NO:1) dentro ou so- breposto a um dos seguintes: (a) aminoácidos 889-929 de SEQ ID NO:1 (is- to é, um epitopo dentro ou sobreposto à seguinte sequência: GW NE- CASSNGHC SHLCLAVPVG GFVCGCPAHY SLNADNRTEC (SEQ ID NO:5)); (b) aminoácidos 677-680 de SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo dentro ou so- breposto à seguinte sequência: YWTD); (c) aminoácidos 720-723 de SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobreposto à seguinte sequência: YWAD); (d) aminoácidos 763-766 de SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobreposto à seguinte sequência: YWTE); (e) aminoácidos 806-809 de SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo dentro ou sobreposto à seguinte sequência: —YWTD);e(f) aminoácidos 846-849 de SEQ ID NO:1 (isto é, um epitopo den- tro ou sobreposto à seguinte sequência: YWTD).

Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula ligante de

“ * 6 LRP6 que inclui uma parte ligante de antigeno de um anticorpo que se liga : (por exemplo, se liga especificamente) a LRP6, onde a parte ligante de antí- geno se liga a um epitopo dentro da "hélice 3" de LRP6 humana (SEQ |D NO:4; resíduos 631-932 de SEQ ID NO:1) dentro ou sobreposto a um dos seguintes: (a) aminoácidos 631-676 de SEQ ID NO:1; (b) aminoácidos 681- 719 de SEQ ID NO:1; (c) aminoácidos 724-762 de SEQ ID NO:1; (d) amino- ácidos 767-805 de SEQ ID NO:1; (e) aminoácidos 810-845 de SEQ ID NO:1; e (f) aminoácidos 850-932 de SEQ ID NO:1. Em várias modalidades, a molécula ligante de LRP6 (por exem- plo, um anticorpo antagonista anti-LRP6) se liga dessa maneira a um epitopo dentro da LRP6 humana (por exemplo, à hélice 1, hélice 3 de LRP6 humana, ou a seus domínios ou modelos constituintes) de modo a impedir que certos ligantes de Wnt se liguem similarmente. A título de exemplo não-limitativo, - as moléculas ligantes de LRP6 que "antagonizam" a via de sinalização de Wntimpedem que ligantes de Wnt1 ou Wnt3a se liguem a LRP6. Por exem- : plo, a atividade de sinalização específica de Wnt3 e Wnt3a pode ser inibida mais eficazmente por uma molécula antagonista de LRP6 específica de Whnt3a. A título de outro exemplo não-limitativo, a atividade de sinalização específica de Wnt1, Wnt2, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, e Wnt10 pode ser mais efi- cazmente inibida por uma molécula ligante antagonista de LRP6 específica de Wnt1.

Em várias modalidades, a molécula ligante de LRP6 (por exem- plo, um anticorpo antagonista anti-LRP6) é capaz de se ligar a mais do que uma hélice de LRP6 (por exemplo, simultaneamente à hélice 1, hélice 3, ou seus domínios ou modelos constituintes)). Em alguns casos, a dita molécula ligante de LRP6 que se liga simultaneamente é capaz de impedir que certos ligantes de Wnt se liguem similarmente a LRP6. A título de exemplo não- limitativo, as ditas moléculas ligantes de LRP6 que se ligam simultaneamen- te são capazes de impedir que os ligantes de Wnt1 ou Wnt3a se liguem a LRP6.A título de exemplo não-limitativo, as ditas moléculas ligantes de L- RP6 que se ligam simultaneamente são capazes de inibir a atividade de si- nalização específica de Wnt3 e Wnt3a. A título de exemplo não-limitativo, as ditas moléculas ligantes de LRP6 que se ligam simultaneamente são capa- : zes de inibir a atividade de sinalização específica de Wnt1, Wnt2, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, e Wnt10. Em várias modalidades, a molécula ligante de LRP6 (por exem- plo, um anticorpo agonizante ou antagonista anti-LRP6) que se liga a um epitopo dentro da hélice 1, hélice 3 humana de LRP6, ou dentro de seus domínios ou modelos constituintes, caso estejam sujeitos à reação cruzada com a proteina LRP6 (ou parte dela) de um primata não-humano (por exem- plo, um macaco cinomolgo, ou um macaco reso). Em várias modalidades, a molécula ligante de LRP6 sofre reação cruzada com LRP6 de uma espécie roedora (por exemplo, LRP6 murina, LRP6 do rato). Em várias modalidades, a molécula ligante de LRP6 sofre reação cruzada com LRP5 humana.

Em várias modalidades, a molécula ligante de LRP6 (por exem- plo, um anticorpo antagonista anti-LRP6) é capaz de se ligar e modular (por exemplo, inibir) LRP6 fosforilada (fosfo-LRP6). Ú Em várias modalidades, a parte ligante de antígeno se liga a um epitopo linear.

Em várias modalidades, a parte ligante de antígeno se liga a um epitopo não-linear.

Em um exemplo, a parte ligante de antígeno se liga a um epitopo não-linear, incluindo ou consistindo em pelo menos uma parte de cada um dos seguintes epitopos lineares: (a) aminoácidos 286-324 de SEQ ID NO:1; (b) aminoácidos 66-69 de SEQ ID NO:1; (c) aminoácidos 110-113 de SEQ ID NO:1; (d) aminoácidos 153-156 de SEQ ID NO:1; (e) aminoáci- dos 197-200 de SEQ ID NO:1; e (f) aminoácidos 238-241 de SEQ ID NO:1. Em outro exemplo, a proteina ligante de antígeno se liga a um epitopo não- linear, incluindo ou consistindo em pelo menos uma parte de dois ou três entre os seguintes epitopos lineares: (a) aminoácidos 889-929 de SEQ |D NO:1; (b) aminoácidos 677-680 de SEQ ID NO:1; (c) aminoácidos 720-723 de SEQ ID NO:1; (d) aminoácidos 763-766 de SEQ ID NO:1; (e) aminoáci- —dos806-809de SEQ ID NO:1; e (f) aminoácidos 846-849 de SEQ ID NO:1. Em várias modalidades, a parte ligante de antígeno da molécula ligante de LRP6 se liga a LRP6 com uma constante de dissociação (Kp) i-

i 8 gual ou menor do que 1 nM, 0,5 nM, 0,25 nM, ou 0,1 nM.

' Em várias modalidades, a parte ligante de antígeno da molécula ligante de LRP6 se liga a LRP6 de um primata não-humano (por exemplo, macaco cinomolgo ou chimpanzé) com uma Kp igual ou menor do que 1 nM, O0,5nM 0,25nM,ou0,1nM.

Em várias modalidades, a parte ligante de antígeno se liga a LRP6 do camundongo com uma Kp igual ou menor do que 1 nM, 0,5 nM, 0,25 nM, ou 0,1 nM.

O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico (por exemplo, hu- —manizado) ou um anticorpo humano.

Em uma modalidade, a parte ligante de antígeno é uma parte ligante de antígeno de um anticorpo humano.

A parte ligante de antígeno pode ser uma parte ligante de antí- . geno de um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal. A molécula ligante de LRP6 inclui, por exemplo, um fragmento : Fab, um fragmento Fab', um framento F(ab”),, ou um fragmento Fv do anti- corpo. A molécula ligante de LRP6 inclui também, por exemplo, anticorpos completos, por exemplo, anticorpos IgG bivalentes. Em algumas modalida- des, um fragmento Fab ou outro monovalente que é capaz de antagonizar LRP6 pode ser convertido em um anticorpo bivalente completo, por exemplo, um anticorpo IgG bivalente, que é capaz de agonizar LRP6.

Em outras modalidades, a molécula ligante de LRP6 está conju- gada ou acoplada com um agente para aumentar a dita molécula ligante, Em alguns casos, a molécula ligante de LRP6 está conjugada com proteina(s) ligante(s) de albumina de soro humano (HSA). Em algumas modalidades, a molécula ligante de LRP6 é "peguilada" (por exemplo, usando a tecnologia patenteada, como descrito em qualquer uma das patentes US nº 5.840.526; US 5.874.541; US 6.005.079; e US 6.765.087 ("patentes de Hamers”), e na família das patentes que inclui a publicação PCT nº WOS7/49805). Em al- gumas modalidades, a molécula ligante de LRP6 é um fragmento Fab pegui- lado. Os exemplos não-limitativos de técnicas que podem ser empregadas para fabricar os ditos conjugados de moléculas ligantes de LRP6 podem ser

: E) encontrados nas famílias de patentes que incluem uma ou mais entre as se- ' guintes: patentes US nº 5.840.526; US 5.874.541; US 6.005.079; e US

6.765.087 ("as patentes de Hamers"); publicação PCT nº WO 97/49805; pa- tente europeia nº EP1517921B1; patente US nº 6.267.974; e publicação nº US2003-0175921. Em uma modalidade, a molécula ligante de LRP6 é um anticorpo humano. Em uma modalidade, a molécula ligante de LRP6 inclui um Fv de cadeia única.

Em uma modalidade, a molécula ligante de LRP6 inclui um dia- corpo (por exemplo, um diacorpo de cadeia única, ou um diacorpo que tem duas cadeias de polipeptídeo).

Em algumas modalidades, a parte ligante de antígeno do anti- . corpo é derivada a partir de um anticorpo entre um dos seguintes isótipos: 1gG1,1gG2, 1963 ou IgG4. Em algumas modalidades, a parte ligante de an- tígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo de um isótipo IgA ou IgE.

A molécula ligante de LRP6 (por exemplo, a molécula ligante de LRP6 que se liga a um epitopo dentro da primeira ou terceira hélice do do- mínio extracelular de LRP6, ou a domínios específicos dentro das ditas héli- ces(por exemplo, uma repetição EGF, ou um modelo semelhante a YWTD)) pode apresentar uma ou mais entre inúmeras atividades biológicas. Em vá- rias modalidades, a molécula ligante de LRP6 inibe a ligação de LRP6 a vá- rios membros da via de sinalização de Wnt (por exemplo, DKK1 (dickkopf 1), DKK2, DKKA4, SOST1, SOSD1 (USAG1), sFRP (proteína solúvel relacionada aFzd) 14, Wise, ou ligantes de Wnt em si). Por exemplo, a molécula ligante de LRPG6 inibe a ligação de membros da via de sinalização de Wnt em pelo menos 5%, 10%, 15%, 25%, ou 50%, em relação a um controle (por exem- plo, em relação à ligação na ausência da molécula ligante de LRP6).

Em uma modalidade, uma molécula ligante de LRP6 compete com membros da via de sinalização de Wnt (por exemplo, DKK1 (dickkopf 1), DKK2, DKK4, SOST1, SOSD1 (USAG1), sFRP (proteína solúvel relacio- nada a Fzd) 14, Wise, ou ligantes de Wnt em si) pela ligação a LRP6, mo-

| i 10 dulando desta forma a atividade biológica e consequências da sinalização da ' via de Wnt. A título de exemplo não-limitativo, uma molécula ligante de LRP6 antagonista pode inibir, atenuar ou impedir a ativação e sinalização da via de Whnt competindo com membros da via de Wnt pela ligação a LRP6. A título de outro exemplo, uma molécula ligante de LRP6 antagonista específica de Wnt1 pode impedir a ativação e sinalização da via de Wnt por qualquer um entre Wnt1, Wnt2, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b e Wnt10. A título de outro exemplo, uma molécula ligante de LRP6 antagonista (por exemplo, que se liga dentro da primeira hélice de LRP6) pode inibir, atenuar ou impedir a ativação e si- —nalização da via de Wnt pelos ligantes de Wise ou Wnt. A título de ainda ou- tro exemplo, uma molécula ligante de LRP6 antagonista (por exemplo, que se liga dentro da terceira hélice de LRP6) pode inibir, atenuar ou impedir a ativação e sinalização da via de Wnt, por exemplo, por DKK1, e ligantes de - Wnt tais como Wnt3 e Wnt3a.

Em algumas modalidades, uma molécula ligante de LRP6 é ca- Ú paz de ativar, intensificar ou perpetuar a via de sinalização de Wnt, ou sen- sibilizar células à sinalização de Wnt. A título de exemplo não-limitativo, as moléculas ligantes de LRP6 agonizantes são capazes de se ligar a LRP6 (por exemplo, à 3º hélice) engendrar a dissolução do complexo de destrui- ção de B-catenina, permitindo desta forma a estabilização de B-catenina, translocação para o núcleo, e engate de fatores de transcrição.

Em algumas modalidades, as moléculas ligantes de LRP6 ago- nizantes são capazes de ativar, intensificar ou perpetuar a via de sinalização de Wnt, ou sensibilizar células à sinalização de Wnt, oligomerizando LRP6.

Sabe-se que o requisito para ligantes de Wnt pode ser ab-rogado por agen- tes que permitem a formação de oligomerização de LRP6 (por exemplo, he- tero-oligômeros Fzd-LRP6), incluindo as moléculas ligantes de LRP6 da in- venção (Cong et a/. (2004) Development 131(20): 5103). Em algumas moda- lidades, as ditas moléculas ligantes de LRP6 são anticorpos IgG bivalentes, — como aquidescrito.

Em algumas modalidades, a molécula ligante de LRP6 modula atividades biológicas a jusante normalmente moduladas de uma maneira i ' n direta ou indireta por LRP6 (por exemplo, modulação da fosforilação e de- ' gradação de B-catenina). Por exemplo, uma molécula ligante de LRP6 anta- gonista permite a fosforilação e degradação de B-catenina em pelo menos uma maior de 5%, 10%, 15%, 25%, ou 50%, em relação a um controle (por exemplo, em relação à atividade na ausência da molécula ligante de LRP6 antagonista).

Em uma modalidade, uma molécula ligante de LRP6 antagonista específica permite a fosforilação e degradação de B-catenina em pelo menos uma margem maior de 5%, 10%, 15%, 25%, ou 50% em relação a um con- troleimpedindo a ativação e sinalização da via de Wnt por qualquer um entre Wnt1, Wnt2, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, e Wnt10. Em outra modalidade, uma molé- cula ligante de LRP6 antagonista específica de Wnt3a permite a fosforilação e degradação de B-catenina em uma margem maior de 5%, 10%, 15%, 25%, ou - 50%, em relação a um controle impedindo a ativação e sinalização da via de Wnt por Wnt3 ou Wnt3a. Em outra modalidade, uma molécula ligante de Ú LRP6 antagonista específica de Wnt1 permite a fosforilação e degradação de B-catenina em uma margem maior de 5%, 10%, 15%, 25%, ou 50% em relação a um controle impedindo Wise a ligação a LRP6. Em ainda outra modalidade, uma molécula ligante de LRP6 antagonista específica de Wnt3a permite a fosforilação e degradação de B-catenina em uma margem maior de pelo menos 5%, 10%, 15%, 25%, ou 50% em relação a um controle impedindo DKK1, ligantes de Wnt tais como Wnt3 e Wnt3a, etc. a ligação a LRP6.

Inversamente, por exemplo, uma molécula ligante de LRP6 ago- nizante estabiliza os níveis de B-catenina em uma margem maior de pelo menosa5%, 10%, 15%, 25%, ou 50% em relação a um controle (por exemplo, em relação à atividade na ausência da molécula ligante de LRP6 agonizante).

A invenção refere-se também a moléculas ligantes de LRP6 dife- rentes de anticorpos. Uma molécula ligante de LRP6 diferente de anticorpo inclui um domínio ligante de LRP6 que tem uma sequência de aminoácidos —derivadade uma dobra semelhante à imunoglobulina (Ig-semelhante) de um polipeptídeo diferente de anticorpo tal como um entre os seguintes: tenasci- na, N-caderina, E-caderina, ICAM, fibronectina, titina, receptor de GCSF,

receptor de citocinas, inibidor de glicosidase, cromoproteina antiobiótica, ' molécula de adesão na membrana com mielina PO, CD8, CD4, CD2, MHC classe |, receptor de antígeno de células T, CD1, C2 e domínios |-set de VCAM-1, domínio de imunoglobulina |-set de proteina C ligante de miosina, domínio de imunoglobulina |I-set de proteina H ligante de miosina, domínio imunoglobulina |-set de teloquina, NCAM, twitchina, neurogliana, receptor de hormônio do crescimento, receptor de eritropoietina, receptor de prolactina, receptor de interferon-gama, B-galactosidase/glicuronidase, B-glicuronidase, transglutaminase, receptor de antígeno de células T, superóxido dismutase, domínio do fator tecidual, citocromo F, proteína verde fluorescente, GroEL, ou taumatina. Em geral, a sequência de aminoácidos do domínio ligante de LRP6 é alterada,em relação à sequência de aminoácidos da dobra seme- lhante à imunoglobulina, de tal modo que o domínio ligante de LRP6 se ligue - especificamente a LRP6 (isto é, onde a dobra semelhante à imunoglobulina nãose liga especificamente a LRP6). Em várias modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio ligante de LRP6 é pelo menos 60% idêntica (por exemplo, pelo menos 65%, 75%, 80%, 85%, ou 90% idêntica) a uma sequência de aminoácidos de uma dobra semelhante à imunoglobulina de uma fibronectina, um receptor de ci- tocinas, ou uma caderina.

Em várias modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio ligante de LRP6 é pelo menos 60%, 65%, 75%, 80%, 85%, ou 90% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma dobra semelhante à imunoglobuli- na de um ou mais entre os seguintes: tenascina, N-caderina, E-caderina, ICAM, titina, receptor de GCSF, receptor de citocinas, inibidor de glicosida- se, cromoproteína antibiótica, molécula de adesão na membrana com mieli- na PO, CD8, CDA4, CD2, MHC classe |, receptor de antígeno de células T, CD1, C2 e domínios |-set de VCAM-1, domínio I|-set de imunoglobulina de proteina C ligante de miosina, domínio |-set de imunoglobulina da proteina H ligante de miosina, domínio |-set de imunoglobulina de teloquina, NCAM, twitchina, neurogliana, receptor do hormônio de crescimento, receptor de eritropoietina, receptor de prolactina, receptor de interferon-gama, B-galacto-

sidase/glicuronidase, B-glicuronidase, transglutaminase, receptor de antíge- ' no de células T, superóxido dismutase, domínio de fator tecidual, citocromo F, proteína verde fluorescente, GroEL, ou taumatina. Em várias modalidades, o domínio ligante de LRP6 se liga a LRP6 comuma kKçpigualoumenordo que 1 nM (por exemplo, 0,5 nM, 0,1 nM). Em algumas modalidades, a dobra semelhante à Ig é uma dobra semelhante à lg de uma fibronectina, por exemplo, uma dobra semelhante à Ig de fibronectina tipo Ill (por exemplo, uma dobra semelhante à lg do módu- lo 10 de fibronectina Ill).

A invenção fornece também peptídeos correspondentes a epito- pos antigênicos de LRP6. Em um aspecto, a invenção refere-se a um pepti- deo que consiste em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idên- tica a uma das seguintes sequências de aminoácidos: a primeira hélice de * LRP6 (SEQ ID NO:2); NATNPCGIDN GGCSHLCLMS PVKPFYQCAC PTGVKLLENG KTCK (SEQ ID NO:3); a terceira hélice de LRP6 (SEQ ID i NO:4); ou GW NECASSNGHC SHLCLAVPVG GFVCGCPAHY SLNADN- RTC (SEQ ID NO:5).

Em outro aspecto, a invenção fornece composições para eliciar anticorpos que se ligam especificamente a LRP6 quando a composição é administrada a um animal. As composições incluem, por exemplo, um dos seguintes peptídeos: a primeira hélice de LRP6 (SEQ ID NO:2); NATNPC- GIDN GGCSHLCLMS PVKPFYOCAC PTGVKLLENG KTCK (SEQ ID NO:3); a terceira hélice de LRP6 (SEQ ID NO:4); GW NECASSNGHC SHL- CLAVPVG GFVCGCPAHY SLNADNRTC (SEQ ID NO:5); um seu peptídeo com menos do que 5 mudanças de aminoácidos; ou um seu fragmento (por exemplo, fragmentos que contêm 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 aminoácidos). O peptídeo pode ser modificado para aumentar a antigenicidade, por exemplo, acoplando uma proteína veículo.

A invenção refere-se também a uma composição farmacêutica que incluiuma molécula ligante de LRP6 aqui descrita. A composição inclui, por exemplo, uma molécula ligante de LRP6 e um veículo farmaceuticamen- te aceitável.

A invenção refere-se também a métodos para usar as moléculas ' ligantes de LRP6 aqui descritas.

Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para inibir o crescimento de uma célula tumorosa. O método inclui colocar a célula can- cerosaem contato com com uma molécula ligante de LRP6 antagonista (por exemplo, uma molécula ligante de LRP6 que inclui uma parte ligante de an- tígeno de um anticorpo que se liga epecificamente a LRP6), estabilizando desta forma o complexo de destruição de B-catenina, engendrando a fosfori- lação e degradação de B-catenina, e impedindo a transdução do sinal da via deWntdentro da célula tumorosa.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para indu- zir apoptose em uma célula tumorosa. O método inclui colocar a célula tumo- rosa, ou o ambiente da célula hospedeira, em contato com uma molécula ligante de LRP6 antagonista (por exemplo, uma molécula ligante de LRP6 que incluiuma parte ligante de antígeno de um anticorpo que se liga especi- Ú ficamente a uma LRP6), estabilizando desta forma o complexo de destruição - de f-catenina, engendrando a fosforilação e degradação de B-catenina, e impedindo a transdução do sinal da via de Wnt dentro da célula tumorosa.

Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a um método para erodiro suporte estromal para tumores cancerosos. O método inclui colocar a célula tumorosa em contato com uma molécula ligante de LRP6 antagonis- ta (por exemplo, uma molécula ligante de LRP6, que inclui uma parte ligante de antígeno de um anticorpo que se liga especificamente a uma LRP6), ex- terminando desta forma os vasos sanguíneos (angiogênicos ou outros) e/ou outros componentes estruturais sobre os quais o tumor depende.

Nos casos acima, a molécula ligante de LRP6 antagonista pode ser administrada em uma quantidade eficaz para inibir o crescimento de uma célula tumorosa, ou para induzir apoptose em uma célula tumorosa, respec- tivamente. A razão de células cancerosas para células sadias do indivíduo pode ser reduzida em pelo menos 10%, em relação à dita razão antes da administração da composição (por exemplo, a razão de células cancerosas para células sadias é reduzida em pelo menos 25%, 30%, 50%, 60%, 75%,

OO 15 ou 100%). Em algumas modalidades, o indivíduo está recebendo também ' terapia com um agente quimioterápico.

Em um aspecto, as moléculas ligantes agonizantes ou antago- nistas de LRP6 da invenção podem ser usadas, por exemplo, para diagnos- ticar, melhorar os sintomas de, proteger contra e tratar distúrbios relaciona- dos aos ossos, como aqui definido.

Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para elevar a densidade mineral óssea em um indivíduo. O método inclui administrar uma molécula ligante de LRP6 agonizante (por exemplo, uma molécula ligante de LRP6 que inclui uma parte ligante de antígeno de um anticorpo que se liga especificamente a uma LRP6) a um indivíduo em uma quantidade eficaz pa- ra elevar a densidade mineral óssea. Em algumas modalidades, a dita molé- cula ligante de LRP6 agonizante interfere com episódios de ligação entre . LRP6 e esclerostina e é capaz de ativar, intensificar ou perpetuar a via de sinalização Wnt, ou sensibilizar células à sinalização de Wnt. A esclerostina é uma proteína codificada pelo gene SOST, e é um regulador negativo da via de sinalização de Wnt que está implicado em distúrbios relacionados aos ossos (a sinalização de Wnt é crítica para a formação óssea sob condições fisiológicas normais).

A título de exemplo não-limitativo, as moléculas ligantes de L- RP6 agonizantes são capazes de se ligar a LRP6 (por exemplo, à 3º hélice de LRP6) e engendrar a dissolução do complexo de destruição de B- catenina, permitindo desta forma a estabilização de B-catenina, translocação para o núcleo, e engate de fatores de transcrição, elevando desta forma a densidade mineral óssea no processo. A título de outro exemplo não- limitativo, as moléculas ligantes de LRP6 agonizantes são capazes de se ligar a LRP6 em um lugar diferente da 3º hélice. Nestes casos, os ditos anti- corpos agonistas de LRP6 são capazes de oligomerizar LRP6 de tal modo que a sinalização de Wnt seja ativada, intensificada ou perpetuada, ou que ascélulassejam sensibilizadas à sinalização de Wnt.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para baixar a densidade mineral óssea em um indivíduo. O método inclui administrar uma molécula ligante de LRP6 antagonista (por exemplo, uma molécula li- ' gante de LRP6 que inclui uma parte ligante de antígeno de um anticorpo que se liga especificamente a uma LRP6) a um indivíduo em uma quantidade eficaz para baixar a densidade mineral óssea.

Em algumas modalidades, a ditamolécula ligante de LRP6 antagonista mimetiza os efeitos de esclerosti- na, ela é desta forma capaz de regular negativamente a via de Wnt de uma maneira análoga.

Em algumas modalidades, as moléculas ligantes de LRP6 antago- nistas são específicas de Wnt1, e se ligam à primeira hélice de LRP6. Em al- gumas outras modalidades, as moléculas ligantes de LRP6 antagonistas são específicas de Wnt1, se ligam à primeira hélice de LRP6, e impedem que os ligantes Wnt1, Wnt6, e/ou Wnt7 interajam com LRP6 e iniciem a via de Wnt.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para me- lhorar ou prevenir sintomas de sindrome metabólica e/ou doença das arté- rias coronárias.

O método inclui administrar uma molécula ligante de LRP6 agonizante (por exemplo, uma molécula ligante de LRP6 que inclui uma par- te ligante de antigeno de um anticorpo que se liga especificamente a uma LRP6) a um indivíduo em uma quantidade eficaz para melhorar ou prevenir os sintomas de síndrome metabólica e/ou doença de artérias coronárias.

Em algumas modalidades, a dita molécula ligante de LRP6 agonizante é capaz de ativar, intensificar ou perpetuar a via de sinalização Wnt, ou sensibilizar células à sinalização de Wnt.

A título de exemplo não-limitativo, as ditas mo- léculas ligantes de LRP6 agonizantes são capazes de se ligar a LRP6 (por exemplo, à 3º hélice de LRP6), induzir a oligomerização de LRP6, e engen- draradissolução do complexo de destruição de B-catenina, permitindo desta forma a estabilização de B-catenina, translocação para o núcleo, e engate de fatores de transcrição, desta forma melhorando ou prevenindo os sintomas de síndrome metabólica e/ou doença de artérias coronárias no processo.

Em algumas modalidades, a composição é administrada por via intravenosa.

Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção serão enunciados nos desenhos anexos e na descrição abaixo.

Outras caracteris-

ticas, objetos, e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da descri- Ú ção e desenhos, e a partir das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS O depósito da patente ou pedido de patente contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias da publicação desta patente ou pedido de patente com desenho(s) colorido(s) serão fornecidas pela Reparti- ção mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.

A figura 1 é uma representação gráfica da identificação de Fabs antagonistas anti-LRP6 que preferencialmente inibem a sinalização de Wnt induzida por Wnt1, A figura 2 é uma representação gráfica de Fabs antagonistas anti-LRP6 que preferencialmente inibem a sinalização de Wnt induzida por Wnt3A.

A figura 3 é uma representação gráfica da indentificação de Fabs agonistas anti-LRP6. A figura 44 ilustra onde os mutantes truncados de LRP6 foram gerados, para o mapeamento do domínio de LRPG6. A figura 4B ilustra a aná- lise FACS dos mutantes truncados, sendo que cada gráfico corresponde a um mutante diferente. A fileira do topo, da esquerda para a direita, refere-se aocomprimento inteiro de LRP6, deleção | de LRP6, e deleção Il de LRP6. À fileira de baixo, da esquerda para a direita, refere-se à deleção Ill de LRP6, deleção | e Ill de LRP6. As células foram coradas com anticorpo anti-Flag. A figura 4C ilustra a análise FACS dos mutantes truncados, sendo que cada gráfico corresponde a um mutante diferente. O arranjo é igual àquele da figu- rad4B,eascélulasforam coradas com Fab005, Fab021, Fabo010, Fab00O4, Fab002, Fab026, Fab025, e um controle (Fab antilisossoma).

A figura 5 é uma representação gráfica da mudança na atividade quando inúmeros Fabs são convertidos em IgGs. A figura 5A ilustra a indu- ção por Wnt1, e a figura 5B ilustra a indução por Wnt3A.

A figura 6 é uma demonstração gráfica da capacidade de molé- culas ligantes anti-LRP6 inibirem LRP6 fosforilada (fosfo-LRP6). A figura 6A ilustra a inibição de fosfo-LRP6 em células PA-1 (teratocarcinoma ovariano),

e a figura 6B ilustra a inibição de fosfo-LRP6 em células NCI-H929 (mieloma múltiplo).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece moléculas que se ligam a LRP6 (proteína relacionada ao receptor de lipoproteina de baixa densidade 6) ("moléculas ligantes de LRP6"), particularmente anticorpos humanos e par- tes deles que se ligam à LRP6 humana e modulam suas funções. Os epito- pos de LRP6 e agentes que se ligam a estes epitopos também são aqui for- necidos. A sequência de comprimento inteiro de LRP6 humana (hLRP6) pode ser encontrada no Número de Acesso do Genbank? Gl:148727288, gb| NP 002327, e está indicada na Tabela | como SEQ ID NO: 1. Uma sequên- cia do MRNA que codifica hLRP6 pode ser encontrada no Número de Aces- . so Gl: 148727287, NM 002336. Tabelal Sequência de Aminoácidos de LRP6 Humana 1 MGAVLRSLLIA CSEFCVLLRAA PLLLUYANRRD LRLVDATNGK ENATIVVGGL EDAAAVDFVE 61 SEGLIYWSDV SEBAIKRTEF NKTESVONVV VSGLLSPDGL ACDWNLGEKLY WTDSETNRIE 121 VSWNLDGSLRK VLFHOELDOP RAIALDPSSG EMYWTDWGEV PKIERAGMDG SSREIIINSE 181 IYWPNGLTLD YERQKLYWAD AKLNFIHKSN LDGINRDAVW KGSLPHPFAL TLFEDILYRT 241 DWSTHSILAC NKYTGZGLRE IRSDIFSPMD IHAFSQORQP NATNPCGIDN GGCSHLCLMS 301 PVKPEYQCAC PTGVKLLENG KTCKDGATEL LLLARRTDLR RISLDTEDFT DIVLOLEDIR 361 HAIAIDYDPV EGYIYWTDDE VRAIRRSFID GSGSQFVVTA QIAHPDGIAV DWVARNLYWT 421 DTGTDRIEVI RLNGTMRKIL ISEDLZEPRA IVLDPMVGYM YKTIWGEIPK IERAALDGSD 481 RVVLVNWTSLG WPNGLALDYD EGXIYWGDAK TDKIEVMNTD GTGRRVLVED KIFHIFGFIL 541 LGDYVYWTDW QORRSIERVHK RSAEREVITD QLPDLMGLKA TNVHRVIGSN PCAEENGGCS 601 HLCLYRPQGL RCACEIGFEL ISDMKTCIVP EAFLLESRRA DIRRISLETN NNNVAIPLTG 661 VKEASALDED VIDNRIYUTD ISLKTISRAF MNGSALEHVV EFGLDYPEGM AVOWLGKKLY 721 WADTGTNRIE VSKLDGOERO VLVWKDLDSP RALALDPAEG FMYWTENGGK PKIDRAAMDG 781 SERTTLVENV GRANGLTIDY AKRRLYWTDL DTNLIESSNM LGLNREVIAD DLPHFFGLTO 841 TODYIYWTDR SRRSIERANK TSGQONRTIIO GHLDYVMDIL VFHSSROSCW NECASSNGHC 901 SHLCLAVEVG GFVCÇGCPAHY SLNADNRTCS APTTILLESQ KSALINRMVID EQOSPDIILP SEl IHSLENVRAI DYDPLDKQLY WIDSRONMIR KAQEDGSQOGF TVVVSSVPSQ NLEIQPYDLS 10921 IDIYSRYIYN TCEATNVINV TRLDGRSVGV VLKGEQDRPR AVVVNPEKGY MYEFTNLOERS 1081 PKIERAALDG TEREVLFFSG LSKPIALALD SRLGKLFHAD SDLRRIESSD LSGANRIVLE 1141 DSNILOPVGL TVFENHLYWI DKOOOMIEKI DMTGREGRTK VOARIAQLSD IHAVKELNLO 1201 EXYROHPCAQD NGGCSHICEV KGIGTTRCSC PMHLVLLODE LSCGEPPTCS POQFTCETGE 1261 IDCIPVANWRC DGETECEDHS DELNCPVCSE SQFOCASÇOC IDGALRCNGD ANCODKSDEK 1321 NCEVLCLIDO FRCANGQCIG KHKKCDANVD CSDKSDELDC YFTEEPAPOA TNTVGSVIGV 1381 IVTIFVSGTV YEICORMLCP RMKEGDGETMT NDYVVHGPAS VPLGYVPHPS SLSGSLPGMS 1441 REGKSMISSLS IMGGSSGPPY DRARHVTGASS SSSSSTKGTY EPAILNPPPS PATERSHYTM 1501 EFGYSSNSPS THRSYSYRPY SYRHFAPPTT PCSTDVCDSD YAPSREMTSV ATAKGYTSDL 1561 NYDSEPVPEP PTPRSQVLSA EENYESCPES PYTERSYSHH LYPPPPSPCT DSS (SEQ ID NO:1) As localizações dos domínios dentro da sequência da proteína LRP6 humana (SEQ ID NO:1) são as seguintes: o peptídeo sinalizador pode ser encontrado a partir dos resíduos de aminoácidos 1-19 de SEQ ID NO:1; ' os quatro domínios de hélice do tipo B YWTD (tirosina, triptofano, treonina, e ácido aspártico), cada um dos quais formando uma estrutura de hélice com seis folhas B (Springer (1998) J.

Mol.

Biol.; 283:837; Jeon et al. (2001) Nat Struct Biol. 22:1172), podem ser encontrados nos aminoácidos 20-326 de SEQ ID NO:1; aminoácidos 327-630 de SEQ ID NO:1; aminoácidos 631-932 de SEQ ID NO:1; e aminoácidos 933-1246 de SEQ ID NO:1. LRP6 humana é Nglicosilada em N42, N81, N281, N433, N486, N692, N859, N865, N926, e N1039. A sequência de aminoácidos de LRP6 do camundongo tem o nú- mero de acesso GenBank Gl: 148727327, NP 032540. A sequência The Dros- phila Arrow é encontrada no número de acesso Gl: 24653390, NP 524737,e a sequência Xenopus de LRP6 é encontrada no número de acesso GI: - 10280605, AAG15429. LRP6 humana foi identificada por sua homologia a LRP5, que foi isolada originalmente através de sua homologia a LDLR (re- ceptor de lipoproteína de baixa densidade). Arrow/LRP5/LRP6 são proteinas transmembrana de passagem única tipo | com 1.678, 1.615 e 1613 resíduos de aminoácidos, respectivamente.

LRP5 e LRP6 compartilham 73% e 64% de identidade em domínios extracelulares e intracelulares, respectivamente, enquanto que Arrow está igualmente relacionada (40% idêntica) a LRP5 e LRP6. Realmente, LRP6 substitui Arrow durante a sinalização de Wg em células de Drosophila cultivadas (Schweizer et al. (2003) BMC Cell Biol. 4, 4), e Arrow constitutivamente ativada ativa a sinalização de Wnt/B-catenina em células de mamíferos e embriões de Xenopus (Tamai et al. (2004) Natu- red4o7:530). Definições Como aqui utilizado, o termo "distúrbios relacioandos à sinaliza- ção de Wnt" significa doenças e condições associadas à sinalização aber- rante de Wnt, incluindo, porém sem limitações, cânceres (por exemplo, car- cinomas colorretais (CRCs), melanoma, câncer de mama, fígado, pulmão, e estômago; outras doenças proliferativas não-oncogênicas, tais como distúr- bios proliferativos da pele (por exemplo, psoríase, dermatite); osteoporose;

osteoartrite; distúrbios fibróticos; esquizofrenia; doença vascular; doença ' cardíaca; crescimento capilar aberrante ou dificuldade no crescimento de cabelo; cicatrização de feridas; necessidades regenerativas (fígado, pulmão, membro); e doenças neurodegenerativas tais como doença de Alzheimer. À regulação ascendente da sinalização de Wnt está associada ao câncer, os- teoartrite, e doença renal policística, enquanto que a desregulação descen- dente aberrante da sinalização de Wnt foi ligada à osteoporose, obesidade, diabetes, e doenças neuronais degenerativas.

Como aqui utilizado, o termo "cânceres relacionados à sinaliza- ção de Wnt" inclui, porém sem limitações, carcinomas colorretais (CRCs), melanoma, câncer de mama, fígado, pulmão, e estômago. O termo "câncer relacionado a Wnt,"como aqui utilizado, inclui também meduloblastoma ma- ligno, e outros tumores neuroectodérmicos malignos primários do CNS, rab- . domiossarcoma, câncer de pulmão, tumores derivados do intestino, incluin- do, porém sem limitações, câncer do esôfago, estômago, pâncreas, e do i sistema de ductos biliares; cânceres de próstata e bexiga; câncer de cólon; leucemias e outros cânceres do sangue (por exemplo, Leucemia Linfocítica Crônica (LLC), Leucemia Mieloide Aguda (LMA), Leucemia Linfocítica Aguda (LLA), Leucemia Mieloide Crônica (LMC), e Síndromes Mielodisplásicas (SMD)); e linfomas (por exemplo, linfoma de Hodgkin e linfoma não- Hodgkin).

Como aqui utilizado, o termo "modular" indica a capacidade de controlar ou influenciar direta ou indiretamente, e a título de exemplos não- limitativos, pode alternativamente significar inibir ou estimular, agonizar ou antagonizar, obstruir ou promover, e fortalecer ou enfraquecer.

Como aqui utilizado, "antagonizar" indica a capacidade de inibir ou deter, por exemplo, a uma via de sinalização de Wnt. A título exemplifica- tivo, uma molécula ligante de LRP6 antagonista da invenção pode impedir a transdução do sinal por intermédio da via de sinalização de Wnt, por exem- plo, interferindo com a capacidade de LRP6 se ligar a membros da via Wnt (por exemplo, DKK1 (dickkopf 1), DKK2, DKK4, SOST1, SOSD1 (USAG1), SFRP (proteína relacionada a Fzd solúvel) 1-4, Wise, ou ligantes de Wnt), e desta forma promover a fosforilação de degradação de B-catenina.

' Como aqui utilizado, "agonizar" indica a capacidade de engen- drar, promover, intensificar, ou facilitar, por exemplo, uma via de sinalização tal como Wnt. A título exemplificativo, uma molécula ligante de LRP6 agoni- zanteda invenção pode promover ou intensificar a transdução de sinal por intermédio da via de sinalização de Wnt, por exemplo, facilitando a capaci- dade de LRPG6 se ligar a membros da via Wnt (por exemplo, DKK1 (dickkopf 1), DKK2, DKK4, SOST1, SOSD1 (USAG1), sFRP (proteína relacionada a Fzd solúvel) 1-4, Wise, ou ligantes de Wnt), e desta forma impedir a fosfori- lação e degradação de B-catenina (permitindo desta forma que B-catenina atinja o núcleo celular e se ligue a fatores de transcrição).

Como aqui utilizado, o termo "distúrbio relacionado aos ossos" inclui distúrbios nos quais a densidade mineral óssea (DMO) está anormal- mente e/ou patologicamente alta em relação a indivíduos sadios, e distúrbios nosquais a densidade mineral óssea (DMO) está anormalmente e/ou pato- i logicamente baixa em relação a indivíduos sadios. Os distúrbios caracteriza- dos por DMO alta incluem, porém sem limitações, esclerosteose, doença de Van Buchem, distúrbios de supercrescimento ósseo, e síndrome de Simp- son-Golabi-Behmel (SGBS). Os distúrbios caracterizados por DMO baixa eloufragilidade óssea incluem, porém sem limitações, osteoporose primária e secundária, osteopenia, osteomalacia, síndrome de osteroporose- pseudoglioma (OPPG), osteogênese imperfeita (OI), necrose avascular (os- teonecrose), fraturas e cicatrização de implantes (implantes dentários e im- plantes de quadril), e perda óssea em virtude de outros distúrbios (por e- xemplo, associados à infecção por HIV, cânceres, ou artrite). Outros "distúr- bios relacionados aos ossos" incluem, porém sem limitações, artrite reuma- toide, osteoartrite, fratura, artrite, e a formação e/ou presença de lesões os- teolíticas.

Como aqui utilizado, o termo "distúrbios fibróticos" significa qual- quer distúrbio fibrótico em seres humanos, caracterizado por proliferação excessiva de fibroblastos ou miofibroblastos e produção de matriz de tecido conjuntivo, incluindo colágeno, fibronectina e glicosaminoglicanos (GAG). Os ditos distúrbios incluem, porém sem limitações: formação de queloides cutã- : neos; esclerose sistêmica progressiva (PSS); cirrose hepática; fibrose pul- monar idiopática e farmacologicamente induzida; doença crônica de enxerto versus hospedeiro; escleroderma (local e sistêmica); doença de Peyronie; estenose uretral pós-cistoscópica; adesões internas pós-cirúrgicas; fibrose retroperitoneal idiopática e farmacologicamente induzida; e mielofibrose.

Como aqui utilizado, o termo "distúrbios fibróticos" inclui tam- bém, porém sem limitações, distúrbios fibróticos pulmonares (por exemplo, fibrose induzida por radiação, e fibrose associada à asma, COPD, e sarcoi- dose); distúrbios fibróticos hepáticos (por exemplo, fibrose alcoólica, associ- ada à hepatite C, e biliar primária, bem como esteatose não-alcoólica, colan- gite esclerosante, e fibrose resultante de esquistossomíase); distúrbios fibró- ticos renais (por exemplo, nefropatia diabética, glomeruloesclerose de lúpus, : síndrome de Alport, e rejeição crônica a enxertos renais); distúrbios fibróticos cardiovasculares (por exemplo, cicatrização pós-infarto do miocárdio, hiper- Ú trofia cardiaca, re-estenose arterial, e aterosclerose); distúrbios fibróticos da pele (por exemplo, cicatrização hipertrófica, cicatrização de queimaduras, e dermatopatia fibrosante nefrogênica); distúrbios fibróticos oculares (por e- xemplo, vitreorretinopatia e fibrose retro-orbital).

Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de uma molécula ligan- te de LRP6 da invenção pode resultar em um decréscimo na gravidade de sintomas de doenças (por exemplo, um decréscimo em sintomas de distúr- bios associados à sinalização aberrantemente alta de Wnt (por exemplo, um decréscimo no número, taxa de crescimento, ou malignidade de células tu- —morosas), ou em sintomas de distúrbios associados à sinalização aberran- temente baixa de Wnt (por exemplo, aumento em níveis de LDL e triglicerí- deos)), um aumento na frequência e duração de períodos isentos de sinto- mas da doença, ou uma prevenção do enfraquecimento ou incapacitação em virtude do padecimento.

O termo "indivíduo" pretende incluir organismos, por exemplo, eucariotos, que estão sofrendo ou afligidos com uma doença, distúrbio ou condição associada à sinalização aberrante de Wnt. Os exemplos de indiví-

i 23 duos incluem mamíferos, por exemplo, seres humanos, cães, vacas, cava- ' los, porcos, ovelhas, cabras, gatos, camundongos, coelhos, ratos, e animais não-humanos transgênicos.

Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano, por exemplo, um ser humano que está sofrendo, está em risco de sofrer, ou é potencialmente capaz de sofrer de câncer (por exemplo, câncer de cólon) e outras doenças proliferativas, osteoporose, e esquizofrenia, e outras doenças ou condições aqui descritas (por exemplo, um distúrbio rela- cionado à sinalização de Wnt). O termo "anticorpo", como aqui utilizado, refere-se a um anticor- pointacto ou um seu fragmento ligante de antígeno (isto é, "parte ligante de antígeno") ou cadeia única (isto é, cadeia leve ou pesada). Um anticorpo intacto é uma glicoproteina que compreende pelo menos duas cadeias pe- sadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto.

Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (a- — quiabreviada como V;) e uma região constante da cadeia pesada.

A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (aqui a- breviada como V,) e uma região constante da cadeia leve.

A região constan- te da cadeia leve compreende um domínio, C1. As regiões V, e V, podem ser subdivididas ainda em regiões de hipervariabilidade, denominadas regi- ões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de arcabouço (framework) (FR). Cada Vy e Vi, é constituída de três CDRs e quatro FRs arranjadas a partir do terminal amino até o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, C- DRI1,FR2, CDR2,FR3,CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesa- das e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno.

As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglo- bulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sis- tema imunológico (por exemplo, células efetoras) e do primeiro componente (Clag)dosistema de complementos clássico.

O termo "parte ligante de antígeno" de um anticorpo, como aqui utilizado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo intacto, que retém a capacidade de se ligar especificamente a um dado antígeno (por ' exemplo, hLRP6). As funções ligantes de antígeno de um anticorpo podem ser realizadas por fragmentos de um anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos ligantes englobados dentro do termo "parte ligante de antígeno" deum anticorpo incluem um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios Vi, Vu, Ci e CH1; um fragmento F(ab)>, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab (geralmente um de uma ca- deia pesada e um de uma cadeia leve) ligados por uma ponte dissulfeto na região de articulação; um fragmento Fd que consiste nos domínios Vy e CH1;um fragmento Fv que consiste nos domínios V, e Vy de uma única ra- mificação de um anticorpo; um fragmento de um anticorpo de um único do- mínio (dAb) (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), que consiste em um domínio Vu; e uma região determinante de complementaridade isolada (C- DR).

Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, V. e Vu, | sejam codificados por dois genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante peptídico artificial que os habilita a serem produzidos como uma única cadeia de proteína na qual o par de regi- ões V. e Vu forma moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); vide, por exemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; e Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única incluem uma ou mais "partes ligantes de antígeno" de um anti- corpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas conven- cionais conhecidas pelos versados nessas técnicas, e os fragmentos são triados quanto à utilidade da mesma maneira que os são anticorpos intactos. As partes ligantes de antígeno também podem ser incorporadas em anticorpos de domínio único, maxicorpos, minicorpos, intracorpos, dia- corpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv (vide, por exemplo, Hollin- ger e Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). As partes li- gantesde antígenos de anticorpos podem ser enxertadas dentro de esquele- tos (scaffolds) baseados em polipeptídeos tais como Fibronectina tipo III (Fn3) (vide patente US nº 6.703.199, que descreve monocorpos de polipep-

tídeos de fibronectina).

' As partes ligantes de antígenos podem ser incorporadas em mo- léculas de cadeia única que compreendem um par de segmentos Fv tandem (Vr-CH1-V4-CH1), os quais, em conjunto com polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões ligantes de antígenos (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062; e patente nº US 5.641.870).

O termo "anticorpo de camelídeo", como aqui utilizado, refere-se a um ou mais fragmentos de uma proteína de anticorpo intacto obtidos a par- tir de membros da família de camelos e dromedários (Camelus bactrianus e Calelus dromaderius), incluindo membros do Novo Mundo tal como a espé- cie de lhamas (Lama paccos, Lama glama e Lama vicugna). Uma região do anticorpo de camelídeo, que é o único domínio variável pequeno identificado como Vux,pode ser obtida por manipulação genética para produzir uma pro- teina pequena que tem alta afinidade por um alvo, resultando em uma prote- iínade baixo peso molecular derivada do anticorpo, conhecida como "nano- corpo de camelideo". Vide Pat. U.S. Nº 5.759,808; veja também Stilemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez- Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62; and Lauwereys. et al., 1998 EMBOJ 17:3512-3520.

Uma "molécula de ligação à LRP6 isolada", conforme usado a- qui, refere-se a uma molécula de ligação que é substancialmente isenta de moléculas tendo especificidades antigênicas por outros antígenos que não LRP6 (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente à hL- RP6é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a outros antigenos que não hlLRP6). Uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à hLRP6 pode, entretanto, ter reatividade cruzada a outros antígenos, tais como moléculas de LRP6 de outras espécies. Uma molécula de ligação é "purificada" se ela é substancialmente isenta de mate- rialcelular, O termo "composição de anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, refere-se a um preparado de moléculas de anticorpo de composição o 26 molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal mostra especifi- ' cidade e afinidade de ligação únicas por um epitopo em particular.

O termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, se destina a incluir anticorpos tendo regiões viáveis nas quais as regiões de arcabouço e CDR são ambas derivadas de sequências de origem humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada de tais sequências humanas, por exemplo, sequências de linhagem germinativa humana ou versões com mutação de sequências de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir re- síduos de aminoácido não codificados por sequências humanas (por exem- plo, mutações introduzidas por meio de mutagênese aleatória ou sítio- específica in vitro ou por meio de mutação somática in vivo). Entretanto, o termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, não se destina a incluir . anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, tenham sido en- xertadas sobre sequências de arcabouço humanas.

O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a um anticor- po mostrando uma especificidade de ligação única que tem regiões variáveis nas quais as regiões de arcabouço e CDR são ambas derivadas de sequên- ciashumanas. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal humano é pro- duzido por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não- humano transgênico (por exemplo, um camundongo transgênico tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve) fundido a uma célula imortalizada.

O termo "anticorpo humano recombinante", conforme usado a- qui, inclui qualquer anticorpo humano que é preparado, expresso, criado ou isolado por meios recombinantes, tal como um anticorpo isolado de um ani- mal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômi- Co para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a par- tirdos mesmos; um anticorpo isolado de uma célula hospedeira transforma- da para expressar o anticorpo humano, por exemplo, a partir de um transfec- toma; um anticorpo isolado de uma biblioteca combinatorial de anticorpo humano recombinante; e um anticorpo preparado, expresso, criado ou isola- , do através de qualquer outro meio que envolve splicing de toda ou uma por- ção de uma sequência de gene de imunoglobulina humana à outra sequên- cia de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nasquaisas regiões de arcabouço e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em determinadas modali- dades, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser sub- metidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para se- quências de Ig humana é usado, mutagênese somática in vivo) e, assim, as sequências de aminoácido das regiões Vy e V, dos anticorpos recombinan- tes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas à sequências Vu e V. de linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linhagem germinativa de anticorpo humano em um ser humano.

Conforme usado aqui, "isotipo" refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgM, IgE, IgG, tal como I9gG1 ou IgG4) que é codificada pelo gene de região constante de cadeia pesada.

As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "anticor- po específico para um antígeno" são usadas permutavelmente aqui com o termo"um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

Conforme usado aqui, uma molécula de ligação à LRP6 (por e- xemplo, um anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo) que "se liga especificamente a uma LRP6" se destina a referir-se a uma molécula de ligação à LRP6 que se liga à LRP6 com uma Ko de 1 x 107 M ou menos.

Uma molécula de ligação à LRP6 (por exemplo, um anticorpo) que "reage cruzadamente com um antígeno" se destina a referir-se a uma molécula de ligação à LRP6 que se liga a um antígeno com uma Kp de 1 x 10º M ou me- nos. Uma molécula de ligação à LRP6 (por exemplo, um anticorpo) que "não reage cruzadamente" com um determinado antigeno se destina a referir-se a uma molécula de ligação à LRP6 que não se liga detectavelmente a um de- terminado antígeno, ou se liga com uma Kp de 1 x 10º M ou mais. Em de- terminadas modalidades, tais moléculas de ligação que não reagem cruza-

damente com o antígeno exibem ligação essencialmente indetectável contra ' essas proteinas em ensaios de ligação padrões.

Conforme usado aqui, o termo "alta afinidade", quando de refe- rência a um anticorpo de IgG, indica que o anticorpo tem uma K5 de 10º M oumenos por um antígeno-alvo.

Uma sequência de nucleotídeo é dita como sendo "otimizada" se ela foi alterada para codificar uma sequência de aminoácido usando códons que são preferidos na célula ou organismo produtor, geralmente uma célula eucariota, por exemplo, uma célula de um levedo, tal como Píchia, uma célula de inseto, uma célula de mamífero, tal como célula de Ovário de Hâmster Chinês (CHO) ou uma célula humana. A sequência de nucleotídeo otimizada é manipulada para codificar uma sequência de aminoácido idêntica ou quase idêntica à sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotí- - deo padrão original, a qual também é conhecida como a sequência "paren- tal, i Vários aspectos da invenção são descritos em maiores detalhes ' nas subseções a seguir. Ensaios padrões para avaliar a capacidade de moléculas de se ligar à LRP6 de várias espécies e epitopos particulares de LRP6 são conhe- cidosno campo incluíndo, por exemplo, ELISAs e Western blots. Determina- ção se uma molécula de ligação à LRP6 se liga a um epitopo específico de LRP6 pode empregar um ensaio de competição por epitopo peptídico. Por exemplo, uma molécula de ligação à LRP6 é incubada com um peptídeo cor- respondendo a um epitopo de LRPG6 de interesse em concentrações de satu- ração do peptídeo. A molécula de ligação à LRP6 pré-incubada é testada quanto à ligação à LRP6 imobilizada, por exemplo, através de análise Biaco- reº. Inibição de ligação à LRP6 por meio de pré-incubação com o peptideo indica que a molécula de ligação à LRP6 se liga ao epitopo peptídico (veja, por exemplo, Pub. de Pat. U.S. 20070072797). A cinética de ligação também pode ser avaliada por meio de ensaios padrões conhecidos no campo, tal como através de análise Biacoreº ou ligação aparente através de análise por FACS. Ensaios para avaliar os efeitos de moléculas de ligação à LRP6 sobre

O 29 as propriedades funcionais de LRP6 são descritos em maiores detalhes a- ] baixo.

Consequentemente, uma molécula de ligação à LRP6 que "ini- be" uma ou mais dessas propriedades funcionais da LRP6 (por exemplo, atividades bioquímica, celular, fisiológica ou outras biológicas ou semelhan- te), conforme determinado de acordo com metodologias conhecidas no campo e descritas aqui, será entendida como produzindo uma diminuição estatisticamente significativa na propriedade funcional em particular com re- lação àquela observada na ausência da molécula de ligação (por exemplo, quando uma molécula de controle de especificidade irrelevante está presen- te). Uma molécula de ligação à LRP6 que inibe a atividade de LRP6 obtém tal diminuição estatisticamente significativa em pelo menos 5% do parâmetro medido. Em determinadas modalidades, um anticorpo de antagonização ou - outra molécula de ligação à LRP6 pode produzir uma diminuição na proprie- dade funcional selecionada de pelo menos 10%, 20%, 30% ou 50% compa- rado ao controle.

Em algumas modalidades, a inibição de LRP6 é determinada medindo-se os níveis de proteínas ou estabilidade de proteína na via de si- nalização Wnt (por exemplo, Wnt, Wise, DKK1, DKK2, DKK4, SOST1, SOSD1 (USAG1), sFRP (proteina Fzd-relacionada solúvel) 1-4, Axina ou B- catenina). Em outras modalidades, alterações biológicas, fisiológicas e/ou morfológicas indicam que a molécula de ligação à LRP6 inibe a LRP6, por exemplo, para inibir o crescimento de uma célula tumoral ou induzir a apop- tose em uma célula tumoral; ou diminuir a densidade mineral óssea.

Em contraste, uma molécula de ligação à LRP6 que agoniza ou promove a atividade de LRP6 efetua um aumento estatisticamente significa- tivo em pelo menos 5% do parâmetro medido. Em determinadas modalida- des, um anticorpo agonista ou outras molécula de ligação à LRP6 pode pro- duzir um aumento na propriedade funcional selecionada de pelo menos 10%, 20%, 30% ou 50% comparado com o controle.

Em algumas modalidades, inibição de LRP6 é determinada me- dindo-se os níveis de expressão ou estabilidade de mensagens de MRNA a

: jusante ou proteínas na via de sinalização Wnt (por exemplo, Axina, Axina2, ' B-catenina, VEGF, cMyc, ciclina D1, SNAIL). Em outras modalidades, altera- ções biológicas, fisiológicas e/ou morfológicas indicam que a molécula de ligação à LRP6 inibe a sinalização ao Wnt, por exemplo, densidade mineral óssea ou secreção de insulina menor do que o normal.

Anticorpos Os anticorpos anti-LRP6 descritos aqui incluem anticorpos mo- noclonais humanos. Em algumas modalidades, porções de ligação a antige- no de anticorpos que se ligam à LRP6 (por exemplo, cadeias V4y e V1) são "misturados e combinados” para criar outras moléculas antiligação à LRP6. A ligação de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada usando os ensaios de ligação antes mencionados (por exemplo, FACS, ELI- SAs). Quando de seleção de uma sequência Vy para misturar e combinar com - uma sequência V, em particular, tipicamente, é selecionada uma Vy que é estruturalmente similar à V, que ela substitui no emparelhamento com essa W.. Da mesma forma, uma sequência de cadeia pesada de comprimento 7 total de um emparelhamento de cadeia pesada de comprimento total/cadeia leve de comprimento total particular é, em geral, substituída por uma se- quência de cadeia pesada de comprimento total estruturalmente similar. Da mesma forma, uma sequência V, de um emparelhamento Vx4/V, particular deverá ser substituida por uma sequência V, estruturalmente similar. Da mesma forma, uma sequência de cadeia leve de comprimento total de um emparelhamento de cadeia pesada de comprimento total/cadeia leve de comprimento total particular deverá ser substituída por uma sequência de cadeialevede comprimento total estruturalmente similar. A identificação de similaridade estrutural, nesse contexto, é um processo bem-conhecido no campo.

Em outros aspectos, a invenção proporciona anticorpos que compreendem as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e cadeia leve de um ou mais anticorpos de ligação à LRP6, em várias combinações. Dado que cada um desses anticorpos pode se ligar à LRP6 e que a especificidade de ligação a antígeno é conferida primariamente pelas regiões CDR1, CDR2

- e CDR3, as sequências CDR1, 2 e 3 de V, e as sequências CDR1, 2 e 3 de ' V, podem ser "misturadas e combinadas" (isto é, CDR de diferentes anticor- pos podem ser misturadas e combinadas). A ligação à LRP6 de tais anticor- pos "misturados e combinados" pode ser testada usando os ensaios de liga- S ção descritos aqui (por exemplo, ELISAs). Quando sequências de CDR de Vu são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de V, particular deverá ser substituída por (uma) sequên- cia(s) de CDR estruturalmente similar(es). Da mesma forma, quando se- quências de CDR de V, são misturadas e combinadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ouCDR3 de uma sequência V, particular deverá ser substituída por (uma) sequência(s) de CDR estruturalmente similar(es). A identificação de similaridade estrutural, nesse contexto, é um processo bem-conhecido no campo.

Conforme usado aqui, um anticorpo humano compreende regi- ões variáveis de cadeias pesada ou leve ou cadeias pesada ou leve de i comprimento total que são "o produto de" ou "derivadas de" uma sequência " de linhagem germinativa em particular se as regiões variáveis ou cadeias de comprimento total do anticorpo são obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana como a fonte das sequên- cias Em um de tais sistemas, um anticorpo humano é produzido em um ca- mundongo transgênico trazendo genes de imunoglobulina humana.

O ca- mundongo transgênico é imunizado com o antígeno de interesse (por exem- plo, um epitopo de hLPR6 descrito aqui). Alternativamente, um anticorpo humano é identificado fornecendo uma biblioteca de gene de imunoglobulina humana visualizada sobre um fago e realizando triagem da biblioteca com o antígeno de interesse (por exemplo, hLPR6 ou um epitopo de hlLPR6 descri-

to aqui). Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana pode ser identificado como tal comparando a sequência de aminoácido do anti- corpo humano com as sequências de aminoácido de imunoglobulinas de linhagem germinativa humana e selecionando a sequência de imunoglobuli-

O 32 . na de linhagem germinativa humana que tem a sequência mais próxima (isto ' é, maior identidade %) da sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é “o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglo- bulina de linhagem germinativa humana em particular pode conter diferenças de aminoácido quando comparado com a sequência de linhagem germinati- va codificada em virtude, por exemplo, de mutações somáticas que ocorrem naturalmente ou mutações sítio-dirigidas artificiais. Entretanto, um anticorpo humano selecionado tem, tipicamente, uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácido codificada por um ge- ne de imunoglobulina de linhagem germinativa humana e contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado com as sequências de aminoácido de imunoglobulina de linhagem germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências de linha- gem germinativa de murino). Em determinados casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou pelo menos 95% ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico, quanto à sequência de amino- ' ácido, à sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa.

A identidade percentual entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, iden- tidade % = f de posições idênticas/f total de posições x 100), levando-se em conta o número de gaps e o comprimento de cada gap que precisa ser intro- duzida para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de se- quências e determinação de identidade percentual entre duas sequências são determinadas usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (1988 Com- Put. Appl. Biosci., 4: 11-17), o qual foi incorporado ao programa ALIGN (ver- são 2.0), usando uma matriz PAM120, uma penalidade por extensão de gap de 12 e uma penalidade por gap de 4. Tipicamente, uma Vy ou V, de um anticorpo humano derivado de uma sequência de linhagem germinativa humana particular mostrará não mais do que 10 diferenças de aminoácido a partir da sequência de aminoá- cido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa huma-

- na. Em determinados casos, a V, ou V, do anticorpo humano pode mostrar ' não mais do que ou mesmo não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferença de ami- noácido a partir da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imu- noglobulina de linhagem germinativa humana.

Anticorpos de camelideo Proteínas de anticorpo obtidas de membros da família dos ca- melos e dromedários (Camelus bactrianus e Calelus dromaderíus), incluindo membros do Novo Mundo, tais como espécies lhama (Lama paccos, Lama glama e Lama vicugna), foram caracterizadas com relação ao tamanho, complexidade estrutural e antigenicidade para seres humanos. Determina- dos anticorpos de IgG encontrados na natureza nessa família de mamíferos carecem de cadeias leves e, assim, são estruturalmente distintos da estrutu- ra quaternária com quatro cadeias tendo duas cadeias pesadas e duas leves - típica para anticorpos de outros animais. Veja WO 94/04678. Uma região do anticorpo de camelideo que é o pequeno domínio Ú variável único identificado como Vu pode ser obtida por meio de engenharia genética a fim de proporcionar uma pequena proteína tendo alta afinidade por um alvo, resultando em uma proteína derivada de anticorpo de baixo peso molecular conhecida como um "nanocorpo de camelídeo". Veja Pat. U.S. Nº5.759.808; veja também Stilemans et a/., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al!., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62; e Lauwereys. ef al., 1998 EMBO J. 17: 3512-3520. Bibli- otecas manipuladas de anticorpos e fragmentos de anticorpo de camelideo estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Ablynx, Ghent, Bélgica. Conforme com outros anticorpos de origem não-humana, uma sequência de aminoácido de um anticorpo de camelideo pode ser alterada recombinante- mente a fim de obter uma sequência que se assemelha mais intimamente a uma sequência humana, isto é, nanocorpo pode ser "humanizado". Assim, a baixa antigenicidade natural de anticorpos de camelideos para seres huma- nos pode ser adicionalmente reduzida.

O nanocorpo de camelideo tem um peso molecular de aproxi-

- madamente um décimo daquele de uma molécula de IgG humana e a prote- ina tem um diâmetro físico de apenas uns poucos nanômetros.

Uma conse- quência do pequeno tamanho é a capacidade dos anticorpos de camelideo de se ligar a sítios antigênicos que são funcionalmente invisíveis para prote- ínasde anticorpo maiores, isto é, nanocorpos de camelídeo são úteis como reagentes para detectar antígenos que, de outro modo, são críticos usando técnicas imunológicas clássicas e como possíveis agentes terapêuticos.

As- sim, outra consequência do pequeno tamanho é que um nanocorpo de ca- melíideo pode inibir, como um resultado de ligação a um sítio específico em uma ranhura ou agrupamento estreito de uma proteína-alvo e, consequen- temente, pode servir em uma capacidade que se assemelha mais intima- mente à função de um fármaco de baixo peso molecular do que aquela de um anticorpo clássico. - O baixo peso molecular e tamanho compacto ainda resultam no fato de os nanocorpos de camelideo serem extremamente termoestáveis, estáveis a pHs extremos e digestão proteolitica e serem pobremente antigê- ' nicos.

Outra consequência é que nanocorpos de camelideo se movem pron- : tamente do sistema circulatório para os tecidos e mesmo através da barreira sangue-cérebro e podem tratar distúrbios que afetam o tecido nervoso.

Na- —nocorpos podem ainda facilitar o transporte de fármaco através da barreira sangue-cérebro.

Veja Pub. de Pat.

U.S.

Nº 20040161738 publicada em 19 de agosto de 2004. Essas características, combinadas com a baixa antigeni- cidade em seres humanos, indicam grande potencial terapêutico.

Ainda, es- sas moléculas podem ser totalmente expressas em células procariotas, tal comoe. coli

Consequentemente, uma característica da presente invenção é um anticorpo de camelídeo ou nanocorpo de camelídeo tendo alta afinidade pela LRP6. Em determinadas modalidades aqui, o anticorpo ou nanocorpo de camelídeo é naturalmente produzido no animal camelídeo, isto é, é pro- duzido pelo camelideo após imunização com LRP6 ou um fragmento peptí- dico da mesma, usando técnicas descritas aqui para outros anticorpos.

Al- ternativamente, o nanocorpo de camelídeo anti-LRP6 é manipulado, isto é,

* produzido por meio de seleção, por exemplo, a partir de uma biblioteca de Ú fago mostrando proteínas de nanocorpo de camelideo com mutações apro- priadas usando procedimentos de panning com LRP6 ou um epitopo de L- RP6 descrito aqui como um alvo.

Nanocorpos manipulados podem ser ainda personalizados através de engenharia genética para aumentar a meia-vida em um indivíduo recipiente de 45 minutos para duas semanas.

Diacorpos Diacorpos são moléculas bivalentes, biespecíficas nas quais os domínios V; e V, são expressos sobre uma única cadeia polipeptídica, conectados por meio de um ligante que é muito curto para permitir empare- lhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia.

Os domínios Vy e V, se emparelham com domínios complementares de outra cadeia, desse modo, criando dois sítios de ligação a antígeno (veja, por exemplo, Holliger et al., 1993 Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90: 6444-6448; Poljak et a/., 1994 Structure 2: 1121-1123). Diacorpos podem ser produzidos mediante expres- Ú são de duas cadeias polipeptídicas com a estrutura Vua-Vieg € Vus-Via (con- figuração V4-Vi) ou Via-VHs E Vie-VnHa (configuração Vi-V4) dentro da mes- ma célula.

A maioria deles pode ser expressa na forma solúvel em bactérias.

Diacorpos com uma única cadeia (scDb) são produzidos conec- tando as cadeias polipeptídicas que formam dois diacorpos com um ligante de aproximadamente 15 resíduos de aminoácido (veja Holliger e Winter, 1997 Cancer Immunol.

Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immu- notechnology, 2(1): 21-36). scDb podem ser expressos em bactérias na for- ma monomérica ativa, solúvel (veja Holliger e Winter, 1997 Cancer Immunol.

Immunother., 45(34): 128-30; Wu et a/., 1996 Immunotechnology, 2(1): 21- 36; Pluckthun e Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7): 617-21). Um diacorpo pode ser fundido à Fc para gerar um "di-diacorpo”" (veja Lu et a/., 2004 J.

Biol.

Chem., 279(4): 2856-65). — Anticorpos manipulados e modificados Um anticorpo da invenção pode ser preparado usando um anti- corpo tendo uma ou mais sequências de V, e/ou V. como material de inicia-

OO 36 - ção para manipular um anticorpo modificado, anticorpo modificado o qual ' pode ter propriedades alteradas com relação ao anticorpo de iniciação. Um anticorpo pode ser manipulado por meio de modificação de um ou mais resí- duos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, V4 e/ou V1), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de arcabouço. Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode ser manipulado por meio de modificação de resíduos dentro da(s) região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função(ões) efetuadora(s) do anticorpo.

Um tipo de manipulação da região variável que pode ser realiza- do é enxertagem de CDR. Anticorpos interagem com antígenos-alvo predo- minantemente por meio de resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis CDRs de cadeias pesada e leve. Por essa razão, as sequências de aminoácido dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que sequências fora de CDRs. Em virtude do fato de as sequências de CDR serem responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos que ocorrem naturalmente específicos construindo vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo que ocorre natu- ralmente específico enxertadas sobre sequências de arcabouço de um anti- corpo diferente com propriedades diferentes (veja, por exemplo, Riechmann et al., 1998 Nature 332: 323-327; Jones ef al., 1986 Nature 321: 522-525; Queen et a!., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033; Pat. U.S. Nº 5.225.539 e Pats. U.S. Nº 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370).

Sequências de arcabouço podem ser obtidas a partir de bancos de dados de DNA públicos ou referências publicadas que incluem sequên- Cias gênicas de anticorpo de linhagem germinativa. Por exemplo, sequências de DNA de linhagem germinativa para genes de região variável de cadeias pesada e leve humanas podem ser encontradas no banco de dados de se- quência de linhagem germinativa humana "VBase" (disponível na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat et a/., 1991 Se- quences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Depart-

oO 37 s ment of Health and Human Services, Publicação NIH Nº 91-3242; Tomlinson ' et al., 1992 J. Mol. Biol. 227: 776-798; e Cox et al., 1994 Eur. J. Immunol. 24: 827-836; os conteúdos de cada um dos quais são expressamente incorpora- dos aqui por referência. As sequências de CDR1, 2 e 3 de V4y e as sequências de CDR1, 2 e 3 de V, podem ser enxertadas sobre regiões de arcabouço que têm a sequência idêntica conforme aquela encontrada no gene de imunoglobulina de linhagem germinativa do qual a sequência de arcabouço é derivada ou as sequências de CDR podem ser enxertadas sobre regiões de arcabouço que contêm uma ou mais mutações quando comparado com as sequências de linhagem germinativa. Por exemplo, descobriu-se que, em determinados ca- sos, é benéfico realizar mutação em resíduos dentro das regiões de arca- bouço para manter ou intensificar a capacidade de ligação a antígeno do . anticorpo (veja, por exemplo, Pats. U.S. Nº 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e6.180.370).

CDRs também podem ser enxertadas em regiões de arcabouço de outros polipeptídeos que não domínios de imunoglobulina. Bases apro- priadas formam uma rede conformacionalmente estável que mostra os resi- duos enxertados de modo que eles formem uma superfície localizada e se liguem ao alvo de interesse (por exemplo, LRP6). Por exemplo, CDRs po- dem ser enxertadas sobre uma base na qual as regiões de arcabouço são baseadas em fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostaína, citocromo b, dedo de zinco CP1, PST1, espiral enrolada, LACI-D1, domínio Z ou ten- dramisat (veja, por exemplo, Nygren e Uhlen, 1997 Current Opinion in Struc- tural Biology, 7, 463469).

Outro tipo de modificação de região disponível é modificação de resíduos de aminoácido dentro das regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de Vu e/ou V, para, desse modo, aprimorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse, conhecida como "matu- ração por afinidade”. Mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito sobre a ligação do anticorpo ou outra propriedade funcional de interesse pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo, conforme descrito aqui. Modificações ' conservativas podem ser introduzidas. As mutações podem ser substitui- ções, adições ou deleções de aminoácido. Além disso, tipicamente, não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDRsão alterados.

Os anticorpos manipulados da invenção incluem aqueles nos quais modificações foram feitas em residuos de arcabouço dentro da Vn e/ou V,, por exemplo, para aprimorar as propriedades do anticorpo. Tipica- mente, tais modificações de arcabouço são feitas para diminuir a imunogeni- cidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é realizar "retromutação" de um ou mais resíduos de arcabouço à sequência de linhagem germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de arcabouço que diferem da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem seridentificados comparando as sequências de arcabouço do anticorpo com as sequências de linhagem germinativa das quais o anticorpo é derivado. Para retornar as sequências de região de arcabouço à sua configuração de : linhagem germinativa, as mutações somáticas podem sofrer "retromutação" para a sequência de linhagem germinativa, por exemplo, mediante mutagê- nese síitio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR. Tais anticorpos com "retromutação" também se destinam a ser abrangidos pela invenção.

Outro tipo de modificação de arcabouço envolve mutação de um ou mais resíduos dentro da região de arcabouço ou mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR para remover epitopos de células T para, desse modo, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Essa abordagem é tam- bém referida como "deimunização" e é descrita em maiores detalhes na Pub. de Pat. U.S. Nº 20030153043 por Carr ef al.

Além de ou alternativamente às modificações feitas dentro das regiões de arcabouço ou CDR, anticorpos da invenção podem ser manipula- dos para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como meia-vida no soro, fixação de complemento, ligação ao receptor de Fc e/ou citotoxicidade

. celular antigeno-dependente.

Além disso, um anticorpo da invenção pode ' ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser presas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosila- ção, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anti- corpo.

Em uma modalidade, a região de dobradiça de CH1 é modifica- da de modo que o número de resíduos de cisteina na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído.

Essa abordagem é ainda descrita na Pat.

U.S.

Nº 5.677.425 por Bodmer ef al.

O número de re- síduos de cisteína na região de dobradiça de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias pesada e leve ou aumentar ou diminu- ir a estabilidade do anticorpo.

Em outra modalidade, a região de dobradiça de Fc de um anti- - corpo sofre mutação para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo.

Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na região de interface de domínio CH2-CH3 do fragmento de Fc-dobradiça, de modo que o anticorpo tem ligação deficiente à proteína A Estafilocócica (SpA) com relação à ligação à SpA do domínio de Fc-dobradiça nativo.

Essa abordagem é descrita em maiores detalhes na Pat.

U.S.

Nº 6.165.745 por Wardetal Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica.

Várias abordagens são possíveis.

Por exemplo, a Pat.

U.S.

Nº 6.277.375 descreve as seguintes mutações em uma IgG que aumentam sua meia-vida in vivo: T252L, T2548S, T256F.

Alternativamente, paraaumentara meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CL ou CH1 para conter um epitopo de ligação a receptor de salva- mento tomado de dois loops de um domínio CH2 de uma região Fc de uma 1gG, conforme descrito nas Pat.

U.S.

Nº 5.869.046 e 6.121.022 por Presta et al.

Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada substituin- do pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetuadoras do anticorpo.

Por exemplo, um

E ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido ' diferente, de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada por um |li- gante efetuador, mas retenha a capacidade de ligação a antígeno do anti- corpo parental. O ligante efetuador do qual a afinidade é alterada pode ser, porexemplo, um receptor de Fc ou o componente C1 de complemento. Essa abordagem é descrita em maiores detalhes nas Pats, U.S. Nº 5.624.821 e

5.648.260, ambas por Winter et al. Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um resíduo de aminoá- cido diferente, de modo que o anticorpo tenha ligação alterada a C1q e/ou citotoxicidade complemento-dependente (CDC) reduzida ou eliminada. Essa abordagem é descrita em maiores detalhes na Pat. U.S. Nº 6.194.551 por Idusogie et al. : Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácido são alterados para, desse modo, alterar a capacidade do anticorpo de se fixar ao complemento. Essa abordagem é descrita ainda no WO 94/29351 por Bod- mer et al. . Em ainda outra modalidade, a região Fc é modificada para au- mentar a capacidade do anticorpo de mediar a citotoxicidade celular anticor- po-dependente (ADCC) e/ou aumentar a afinidade do anticorpo por um re- ceptor Fcy por meio de modificação de um ou mais aminoácidos. Essa abor- dagem é ainda descrita no WO 00/42072 por Presta. Além disso, os sítios de ligação sobre a IgG1 humana para FeyRl, FeyRIl, FeyRIIl e FoeRn foram ma- peados e variantes com ligação aprimorada foram descritas (veja Shields, RL etal, 2001 J. Biol. Chem. 276: 6591-6604). Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (isto é, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por e- xemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo por um antígeno. Tais modi- ficações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, alterando um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, podem ser feitas uma ou mais substituições de aminoácido que resultam em

* eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de arcabouço da região va- ' riável para, desse modo, elíminar a glicosilação nesse sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Tal abordagem é descrita em maiores detalhes nas Pats. US. Nº 5.714.350 e 6,350.861 por Coeta.

Adicional ou alternativamente, pode ser feito um anticorpo que tem um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac de bissecção aumentadas. Foi demonstrado que tais pa- drões de glicosilação alterados aumentam a capacidade de ADCC dos anti- corpos. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exem- plo, expressando o anticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. Células com uma maquinaria de glicosilação alterada foram descritas no campo e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais expressar os anticorpos recombinantes da invenção para, desse modo, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, o EP ' 1.176.195 por Hang et al. descreve uma linhagem de célula com um gene . FUT8 funcionalmente rompido, o qual codifica uma fucosil transferase, de modo que anticorpos expressos em tal linhagem de célula exibem hipofucosilação. A Pub. PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma linha- gem de célula CHO variante, células Lecl3, com capacidade reduzida de fixar fucose a carboidratos Asn(297)-ligados, também resultando em hipofu- cosilação de anticorpos expressos nessa célula hospedeira (veja também Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). O documento WO 99/54342 por Umana ef al. descreve linhagens de célula manipuladas para expressar glicosil transferases de modificação de glicoproteína (por e- xemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferase 11! (GnTIII)), de modo que os anticorpos expressos nas linhagens de célula manipuladas exibem estru- turas GlcNac de bissecção aumentadas, o que resulta em atividade de —ADCC aumentada dos anticorpos (veja também Umana et a/., 1999 Nat. Bio- tech. 17: 176-180).

Outra modificação dos anticorpos aqui que é considerada pela

” invenção é peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado, por exemplo, para : aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para pe- guilar um anticorpo, o anticorpo ou fragmento do mesmo, tipicamente, é rea- gido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster ou derivado de aldeído reativo de PEG, sob condições nas quais uma ou mais porções PEG se tor- nam presas ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. A peguilação pode ser realizada por meio de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Conforme usado aqui, o termo "polietileno glicol" se destina a a- branger qualquer uma das formas de PEG que tenham sido usadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcóxi- ou arilóxi- polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em determinadas modalida- des, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para peguilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Veja, por exemplo, EP 0 154 316 por Nishimura i et al. e EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

" Além disso, peguitação pode ser obtida em qualquer parte de um polipeptideo de ligação à LRP6 da invenção através da introdução de um aminoácido não natural. Determinados aminoácidos não naturais podem ser introduzidos através da tecnologia descrita em Deiters et al, J Am Chem Soc 125: 11782-11783, 2003; Wang e Schultz, Science 301: 964-967, 2003; Wang et a/., Science 292: 498-500, 2001; Zhang et al., Science 303: 371- 373, 2004 ou na Patente US Nº 7.083.970. Resumidamente, alguns desses sistemas de expressão envolvem mutagênese sítio-dirigida para introduzir um códon não senso, tal como uma TAG âmbar, no quadro de leitura aberta que codifica um polipeptídeo da invenção. Tais vetores de expressão são, então, introduzidos em um hospedeiro que pode utilizar um tRNA específico para o códon não senso introduzido e carregados com o aminoácido não natural de escolha. Aminoácidos não naturais particulares que são benéficos parafinsde conjugação de porções aos polipeptídeos da invenção incluem aqueles com cadeias laterais acetileno e azido. Os polipeptídeos contendo esses novos aminoácidos podem, então, ser peguilados nesses sítios esco-

- ” lhidos na proteína. i Métodos de manipulação de anticorpo Conforme discutido acima, anticorpos anti-LRP6 podem ser usa- dos para criar novos anticorpos anti-LRP6 por meio de modificação das se- quênciasde cadeia pesada e/ou cadeia leve de comprimento total, sequên- cias de Vy e/ou Vi ou a(s) região(ões) constante(s) presa(s) à(s) mesma(s). Por exemplo, uma ou mais regiões CDR dos anticorpos podem ser combi- nadas recombinantemente com regiões de arcabouço conhecidas e/ou ou- tras CDRs para criar novos anticorpos anti-LRP6 recombinantemente mani- pulados. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na seção anterior. O material de iniciação para o método de manipulação é uma ou mais das sequências de Vy e/ou V, ou uma ou mais regiões CDR das mes- mas. Para criar o anticorpo manipulado, não é necessário preparar realmen- te (isto é, expressar como uma proteína) um anticorpo tendo uma ou mais das sequências de V, e/ou V. ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Antes, a informação contida na(s) sequência(s) é usada como o material de 7 iniciação para criar (uma) sequência(s) de "segunda geração" derivada(s) da(s) sequência(s) original(is) e, então, a(s) sequência(s) de "segunda gera- ção" é(são) preparada(s) e expressa(s) como uma proteína.

Técnicas de biologia molecular padrões podem ser usadas para preparar e expressar a sequência de anticorpo alterada. O anticorpo codifi- cado pela(s) sequência(s) de anticorpo alterada(s) é um que retém uma, al- gumas ou todas as propriedades funcionais do anticorpo anti-LRP6 do qual ele é derivado, propriedades funcionais as quais incluem, mas não estão limitadas a, ligação específica à LRP6, interferência com a capacidade da LRP6 de se ligar a membros da via Wnt (por exemplo, os ligantes DKK1 (dickkopf 1), DKK2, DKK4, SOST1, SOSD1 (USAG1), sFRP (proteína Fzd- relacionada solúvel) 1-4, Wise ou Wnt) e modulação de fosforilação e degra- dação de B-catenina. As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas usando ensaios padrões disponíveis no campo e/ou descritos aqui (por exemplo, ELISAs).

Em determinadas modalidades dos métodos de manipulação de

% anticorpos da invenção, mutações podem ser introduzidas aleatória ou sele- : tivamente ao longo de toda ou parte de uma sequência de codificação de anticorpo anti-LRP6 e os anticorpos anti-LRP6 modificados resultantes po- dem sofrer triagem com relação à atividade de ligação e/ou outras proprie- dades funcionais (por exemplo, ligação específica à LRP6, interferência com a capacidade da LRP6 de se ligar a membros da via Wnt (por exemplo, os ligantes DKK1 (dickkopf 1), DKK2, DKK4, SOST1, SOSD1 (USAG1), sFRP (proteína Fzd-relacionada solúvel) 1-4, Wise ou Wnt) e modulação de fosfori- lação e degradação de B-catenina), conforme descrito aqui.

Métodos muta- cionais foram descritos no campo.

Por exemplo, a Publicação PCT WO 02/092780 por Short descreve métodos para criação e triagem de mutações de anticorpo usando mutagênese por saturação, montagem de ligação sinté- tica ou uma combinação dos mesmos.

Alternativamente, o WO 03/074679 . por Lazar ef al. descreve métodos de uso de abordagens de triagem compu- tacional para otimizar as propriedades físico-químicas de anticorpos. i Moléculas de ligação à LRP6 de não-anticorpo A invenção proporciona ainda moléculas de ligação à LRP6 que exibem propriedades funcionais de anticorpos, mas derivam suas porções de arcabouço e de ligação a antígeno de outros polipeptídeos (por exemplo, outros polipeptídeos que não aqueles codificados por genes de anticorpo ou gerados através da recombinação de genes de anticorpo in vivo). Os domi- nios de ligação a antígeno (por exemplo, domínios de ligação à LRP6) des- sas moléculas de ligação são gerados por meio de um processo de evolução dirigida.

Veja Pat.

U.S.

Nº 7.115.396. Moléculas que têm uma dobra global similar àquela de um domínio variável de um anticorpo (uma "dobra" seme- lhante à imunoglobulina) são proteinas de base apropriadas.

Proteínas de base adequadas para derivatização de moléculas de ligação a antígeno in- cluem fibronectina ou um dímero de fibronectina, tenascina, N-caderina, E- caderina, ICAM, titina, GCSF-receptor, receptor de citocina, inibidor de glico- sidase, cromoproteína antibiótica, molécula de adesão à membrana de mie- lina PO, CD8, CD4, CD2, MHC da classe |, receptor de antígeno de célula T, domínios CD1, C2 e I-set de VCAM-1, domínio I-set de imunoglobulina de

. proteina C de ligação à miosina, domínio |-set de imunoglobulina de proteína H de ligação à miosina, dominio l-set de imunoglobulina de teloquina, NCAM, twitchina, neurogliana, receptor de hormônio de crescimento, recep- tor de eritropoietina, receptor de prolactina, receptor de interferon-gama, B- galactosidase/glucuronidase, B-glucuronidase, transglutaminase, receptor antigênico de célula T, dismutase de superóxido, domínio de fator tecidual, citocromo F, proteína fluorescente verde, GroEL e taumatina.

O domínio de ligação a antigeno (por exemplo, a dobra seme- lhante à imunoglobulina) da molécula de ligação de não-anticorpo pode ter uma massa molecular de menos de 10 kD ou mais de 7,5 kD (por exemplo, uma massa molecular entre 7,5-10 kD). A proteína usada para derivar o do- mMínio de ligação a antígeno é uma proteina de mamífero que ocorre natu- ralmente (por exemplo, uma proteina humana) e o domínio de ligação a an- tígeno inclui até 50% (por exemplo, até 34%, 25%, 20% ou 15%) de aminoá- cidos com mutação quando comparado com a dobra semelhante à imuno- globulina da proteína da qual ele é derivado.

O domínio tendo a dobra seme- lhante à imunoglobulina geralmente consiste em 50-150 aminoácidos (por exemplo, 40-60 aminoácidos). Para gerar as moléculas de ligação de não-anticorpo, uma biblio- teca de clones é criada na qual sequências em regiões da proteina de base que formam superfícies de ligação a antígeno (por exemplo, regiões análo- gas, quanto à posição e estrutura, às CDRs de uma dobra de imunoglobulina de domínio variável de anticorpo) são randomizadas.

Clones da biblioteca são testados quanto à ligação específica ao antígeno de interesse (por e- xemplo, hLPR6)e outras funções (por exemplo, inibição de atividade biológi- ca de LRP6). Clones selecionados podem ser usados como a base para randomização e seleção adicionais para produzir derivados de maior afini- dade pelo antígeno.

Um exemplo de um protocolo de seleção é descrito na Pat.

U.S.

Nº 6.207.446. Moléculas de ligação de alta afinidade são geradas, por exem- plo, usando o décimo módulo de fibronectina II! ("º*Fn3) como a base.

Uma biblioteca é construída para cada um dos três loops semelhantes à CDR de

- "ºEN3 nos resíduos 23-29, 52-55 e 78-87. Para construir cada biblioteca, segmentos de DNA que codificam a sequência que sobrepõe cada região semelhante à CDR são randomizados por meio de síntese de oligonucleoti- deo. Técnicas para a produção de bibliotecas de *ºFn3 selecionáveis são descritasnasPats. U.S. Nº 6.818.418 e 7.115.396; Roberts e Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 12297; Pat. U.S. Nº 6.261.804; Pat. U.S. Nº

6.258.558; e Szostak et al. WO98/31700. Moléculas de ligação de não-anticorpo podem ser produzidas como dímeros ou multimeros a fim de aumentar a avidez pelo antígeno-alvo. Por exemplo, o domínio de ligação a antígeno é expresso como uma fusão com uma região constante (Fc) de um anticorpo que forma dímeros de Fc- Fc. Veja, por exemplo, Pat. U.S. Nº 7.115.396. Moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos da invenção Outro aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucle- ico que codificam as moléculas de ligação à LRP6 da invenção. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisato de célula " ou podem ser ácidos nucleicos em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substanci- almente puro" quando purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares ou proteinas, por meio de técnicas padrões, incluindo tratamento alcalino/SDS, união com CsCl, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem-conhecidas no campo. Veja F. Ausubel ef a/., ed. 1987 Current Proto- cols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter sequências intrônicas. Em uma modalidade, o ácido nu- cleico é uma molécula de cDNA. O ácido nucleico pode estar presente em um vetor, tal como um vetor de exibição de fago ou em um vetor de plasmí- deo recombinante. Ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos usando técni- cas padrões de biologia molecular. Para anticorpos expressos por hibrido- mas (por exemplo, hibridomas preparados a partir de camundongos trans-

- gênicos trazendo genes de imunoglobulina humana, conforme descrito ainda abaixo), cDNAs que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo feito pelo hibridoma podem ser obtidos mediante amplificação padrão por PCR ou técnicas de clonagem de DNA. Para anticorpos obtidos a partir de uma bibli- otecade genes de imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de exibi- ção de fago), o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser recuperado de vários clones de fago que são membros da biblioteca.

Uma vez que fragmentos de DNA que codificam os segmentos Vu e V, são obtidos, esses fragmentos de DNA podem ser ainda manipula- dos por meio de técnicas de DNA recombinante padrões, por exemplo, para converter os genes de região variável a genes de cadeia de anticorpo de comprimento total, a genes de fragmento Fab ou a um gene de scFv. Nes- sas manipulações, um fragmento de DNA que codifica Vx ou V, é operati- - vamente ligado à outra molécula de DNA ou a um fragmento que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo "operativamente ligado", conforme usado nesse contexto, se destina a significar que os dois fragmentos de DNA são unidos de uma . maneira funcional, por exemplo, de modo que as sequências de aminoácido codificadas pelos dois fragmentos de DNA permaneçam in-frame ou de mo- doquea proteína seja expressa sob o controle de um promotor desejado.

O DNA isolado que codifica a região V, pode ser convertido a um gene de cadeia pesada de comprimento total por meio de ligação opera- tiva do DNA que codifica V, à outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes de região constante de cadeia pesada humana são conhecidas no campo (veja, por exemplo, Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunologi- cal Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH Nº 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo essas regi- ões podem ser obtidos por meio de amplificação padrão por PCR. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, 19G3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. Para um gene de cadeia pesada de frag- mento Fab, o DNA que codifica V, pode ser operativamente ligado à outra

- molécula de DNA que codifica apenas a região constante CH1 de cadeia pesada.

O DNA isolado que codifica a região V, pode ser convertido a um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como a um gene de ca- deialevede Fab) por meio de ligação operativa do DNA que codifica V, à outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL.

As sequências de genes de região constante de cadeia leve humana são conhecidas no campo (veja, por exemplo, Kabat ef a/., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S.

Department of Health and Human Services, Publicação NIH Nº 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo essas regiões podem ser obtidos por meio de amplificação pa- drão por PCR.

A região constante de cadeia leve pode ser uma região cons- tante kappa ou lambda.

Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA que codifi- camVWV.'eW são operativamente ligados a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácido (Gly4 - Ser)s, de modo que as sequências de Vy e V. possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões V, e Vy unidas por meio do ligante flexível (veja, por exemplo, Bird ef al., 1988 Science 242: 423-426; Huston et a/., 1988 Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 85: 5879-5883; Mc- Cafferty et al., 1990 Nature 348: 552-554). Geração de anticorpo monoclonal Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos por meio de uma variedade de técnicas, incluindo a metodologia convencional de an- ticorpo monocional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somáti- ca padrão de Kohler e Milstein (1975 Nature, 256: 495) ou usando métodos de visualização de biblioteca, tal como exibição de fago.

Um sistema animal para preparo de hibridomas é o sistema de murino.

A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bem- estabelecido.

Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de es- plenócitos imunizados para fusão são conhecidos no campo.

Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fu-

- são são também conhecidos.

Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados baseado na sequência de um anticorpo monoclonal de murino preparado conforme descrito acima. DNA que codifica as imuno- —globulinasde cadeias pesada e leve pode ser obtido do hibridoma de murino de interesse e manipulado para conter sequências de imunoglobulina que não são de murino (por exemplo, humanas) usando técnicas padrões de biologia mole- cular. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis de murino podem ser ligadas a regiões constantes humanas usando méto- dos conhecidos no campo (veja, por exemplo, Pat. U.S. Nº 4.816.567 para Cabilly et al). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR de muri- no podem ser inseridas em um arcabouço humano usando métodos conhe- cidos no campo. Veja, por exemplo, Pat. U.S. Nº 5.225.539 e Pats. U.S. Nº - 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370.

Em uma determinada modalidade, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais huma- nos dirigidos contra a LRP6 podem ser gerados usando camundongos ' transgênicos ou transcromossômicos trazendo partes do sistema imune hu- mano ao invés do sistema de camundongo. Esses camundongos transgêni- cos e transcromossômicos incluem camundongos referidos aqui como ca- mundongos HuUMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletiva- mente referidos aqui como "camundongos com lg humana", O camundongo HUMAbº (Medarex, Inc.) contém mini Joci de i- munoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina de ca- deiapesada(uney)levexnão-rearranjadas, junto com mutações objetivadas que inativam os /oci de cadeia 4 e x endógenos (veja, por exemplo, Lonberg et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859). Consequentemente, os camundon- gos exibem expressão reduzida de IGM ou x de camundongo e, em resposta à imunização, os transgenes de cadeias pesada e leve humanas sofrem tro- cade classee mutação somática para gerar IgGx monoclonal humana de alta afinidade (Lonberg, N. ef a/., 1994 supra; revisto em Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. e Huszar,

OO 50 * D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 e Harding, F. e Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 536-546). O Preparo e uso de camundongos HuUMAb e as modificações genômicas trazidas por tais camundongos são ainda des- critos em Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. etal, 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon ef al, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4: 117- 123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et a/., 1994 J. Immu- nol. 152: 2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; e Fishwild, D. ef a!, 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851, os conteúdos de todos os quais são aqui especificamente incorporados por referência na in- tegra. Veja ainda Pats. U.S. Nº 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425;

5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas para Lonberg e Kay; Pat. U.S. Nº 5.545.807 para Surani et al.; Pubs. POT - Nº WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Pub. PCT Nº WO Ú 01/14424 para Korman et al.

" Em outra modalidade, anticorpos humanos da invenção podem ser produzidos usando um camundongo que traz sequências de imunoglobu- lina humana sobre transgenes e transcromossomos, tal como um camun- dongo que traz um transgene de cadeia pesada humana e um transcromos- somo de cadeia leve humana. Tais camundongos, referidos aqui como "ca- mundongos KM", são descritos em detalhes no WO 02/43478.

Ainda outros sistemas de animal transgênico alternativos ex- pressando genes de imunoglobulina humana estão disponíveis no campo e podem ser usados para produzir anticorpos anti-LRP6 da invenção. Por exem- plo, um sistema transgênico alternativo referido como Xenomouse* (Abgenix, Inc.) pode ser usado. Tais camundongos são descritos, por exemplo, nas Pats. U.S. Nº 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 para Kucherlapati et al.

Além disso, sistemas de animal transcromossômico alternativos expressando genes de imunoglobulina humana estão disponíveis no campo e podem ser usados para produzir anticorpos anti-LRP6 da invenção. Por

- exemplo, camundongos trazendo tanto um transcromossomo de cadeia pe- sada humana como um transcromossomo de cadeia leve humana, referidos como "camundongos TC", podem ser usados; tais camundongos são descri- tos em Tomizuka et a/., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727. Além disso, vacas trazendo transcromossomos de cadeias pesada e leve huma- nas foram descritas no campo (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20: 889-894) e podem ser usadas para produzir anticorpos anti-LRP6 da in- venção. Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem também ser preparados usando métodos de exibição de fago para triagem de biblio- tecas de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de exibição de fago para isolamento de anticorpos humanos são estabelecidos no campo. Veja, por exemplo, Pats. U.S. Nº 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 para Ladner et al.; Pats. U.S. Nº 5.427.908 e 5.580.717 para Dower et a/.; Pats, US. Nº” 5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty et al; e Pats. U.S. Nº

5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 para Griffiths et a/. Bibliotecas podem sofrer triagem quanto à ligação à LRP6 de comprimento total ou um epitopo de LRP6 em particular. Anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados usando camundongos SCID nos quais células imunes hu- manas tenham sido reconstituídas, de modo que uma resposta de anticorpo humano possa ser gerada quando de imunização. Tais camundongos são descritos, por exemplo, nas Pats. U.S. Nº 5.476.996 e 5.698.767 para Wil- son et al. Geração de anticorpos monoclonais humanos em camundongos com lg hu- mana A LRP6 humana recombinante purificada expressa em células procariotas (por exemplo, E. coli) ou células eucariotas (por exemplo, células de mamífero, por exemplo, células HEK293) podem ser usadas como o antí- geno.A proteína pode ser conjugada a um veículo, tal como hemocianina do caramujo Megathura crenulata (KLH). Anticorpos monoclonais à LRP6 totalmente humanos são prepa-

. rados usando os gêneros HCo7, HCo12 e HCo17 de camundongos transgê- nicos HuMab e o gênero KM de camundongos transcromossômicos transgê- nicos, cada um dos quais expressa genes de anticorpo humano. Em cada um desses gêneros de camundongo, o gene de cadeia leve kappa de ca- mundongo endógeno pode ser homozigoticamente rompido conforme descri- to em Chen ef al., 1993 EMBO J. 12: 811-820 e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno pode ser homozigoticamente rompido conforme descrito no Exemplo 1 do WO 01109187. Cada um desses gêneros de ca- mundongo traz um transgene de cadeia leve kappa humana, KCo5, confor- me descrito em Fishwild et a/., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851. O gênero HCo7 traz o transgene de cadeia pesada humana conforme descrito nas Pats. U.S. Nº 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807. O gênero HCo12 traz o transgene de cadeia pesada humana conforme descrito no Exemplo 2 do - WO 01/09187, O gênero HCo17 traz o transgene de cadeia pesada humana

15. HCoil7. O gênero KM contém o transceromossomo SC20, conforme descrito Ú no WO 02/43478, Para gerar anticorpos monoclonais à LRP6 totalmente humanos, ' camundongos HuMab e camundongos KM são imunizados com LRP6 re- combinante purificada, um fragmento de LRP6 ou um conjugado da mesma (por exemplo, LRP6-KLH) como antígeno. Esquemas gerais de imunização para camundongos HuMab são descritos em Lonberg, N. et a/., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et a/., 1996 Nature Biotechnology 14: 845- 851 e WO 98/24884. Os camundongos têm 16 semanas de idade quando da primeira infusão de antígeno. Um preparado recombinante purificado (5-50 ug)doantígenoé usado para imunizar os camundongos HuMab e camun- dongos KM na cavidade peritoneal, subcutaneamente (Sc) ou mediante inje- ção na pata. Camundongos transgênicos são imunizados duas vezes com antígeno em adjuvante completo de Freund ou adjuvante Ribi na cavidade peritoneal (IP), subcutaneamente (Sc) ou na pata (FP), seguido por imuniza- ção IP, Sc ou FP 3-21 dias (até um total de 11 imunizações) com o antígeno em adjuvante incompleto de Freund ou Ribíi. A resposta imune é monitorada

- através de coletas de sangue retro-orbital. O plasma sofre triagem através de ELISA e camundongos com titulações suficientes de imunoglobulina hu- mana anti-LRP6 são usados para fusões. Os camundongos recebem um reforço intravenosamente com antígeno 3 e 2 dias antes de sacrifício e re- moção do baço. Tipicamente, 10-35 fusões para cada antígeno são realiza- das. Várias dúzias de camundongos são imunizados para cada antígeno. Um total de 82 camundongos dos gêneros de camundongo HCo7, HCo12, HCo17 e KM são imunizados com LRP6.

Para selecionar camundongos HuMab ou KM que produzem an- ticorpos que se ligam à LRP6, soro de camundongos imunizados pode ser testado através de ELISA, conforme descrito por Fishwild, D. et a/., 1996. Resumidamente, lâminas de microtitulação são revestidas com LRP6 re- combinante purificada a 1-2 ugiml em PBS, 50 uli/cavidade incubadas a 4 ºC - durante a noite, então, bloqueadas com 200 ul/cavidade de soro de galinha a5%em PBS/Tween (0,05%). Diluições de plasma de camundongos imuni- zados com LRPG6 são adicionadas a cada cavidade e incubadas durante 1-2 horas em temperatura ambiente. As lâminas são lavadas com PBS/Tween e, então, incubadas com um anticorpo policlonal de cabra anti-Fc de 19G hu- mana conjugado com peroxidase de rábano (HRP) durante 1 hora em tem- peratura ambiente, Após lavagem, as lâminas são reveladas com substrato ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 ma/ml) e analisadas através de um espectrofo- tômetro em uma OD de 415-495. Esplenócitos de camundongos que desen- volveram as maiores titulações de anticorpos anti-LRP6 são usados para fusões. As fusões são realizadas e sobrenadantes de hibridoma são testa- dosquanto à atividade anti-LRP6 por meio de ELISA. Os esplenócitos de camundongo, isolados dos camundongos HuMab e KM, são fundidos com PEG a uma linhagem de célula de mieloma de camundongo baseado em protocolos padrões. Os hibridomas resultantes, então, sofrem triagem quanto à produção de anticorpos antígeno específicos. Suspensões de células únicas de linfócitos esplênicos de ca- mundongos imunizados são fundidas a um quarto do número de células de mieloma de camundongo não secretórias SP2/0 (ATCC, CRL 1581) com

- PEG a 50% (Sigma). As células são colocadas a aproximadamente 1 x 105 células/cavidade em lâminas de microtitulação de fundo plano, seguido por incubação de cerca de duas semanas em meio seletivo contendo soro bovi- no fetal a 10%, meio condicionado com P388D 1 à 10% (ATCC, CRL TIB- 63), Origen” a 3-5% (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com alto teor de glicose, L-glutamina e piruvato de sódio) mais HEPES a 5 mM, 2- mercaptoetanol a 0,055 mM, 50 ug/ml! de gentamicina e 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Após 1-2 semanas, as células são cultivadas em meio no qual o HAT é substituído por HT.

Células individuais, então, sofrem triagem por meiode ELISA por anticorpos monoclonais de IgG humana anti-LRP6. Uma vez que crescimento extensivo de hibridoma tenha ocorrido, o meio é moni- torado usualmente após 10-14 dias.

Os hibridomas que secretam anticorpo são recolocados em lâmina, sofrem triagem novamente e, se ainda positivos para IgG humana, anticorpos monoclonais anti-LRP6 são subclonados pelo menos duas vezes por meio de diluição limitativa.

Os subclones estáveis são, então, cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo " em meio de cultura tecidual para caracterização adicional. ' Geração de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monocionais humanos da invenção, esplenócitos e/ou células de nódulo linfático de ca- mundongos imunizados podem ser isoladas e fundidas a uma linhagem de célula imortalizada apropriada, tal como uma linhagem de célula de mieloma de camundongo.

Os hibridomas resultantes podem ser fundidos a um sexto do número de células de mieloma de camundongo não secretórias P3X63- Ag8.653(ATCC, CRL 1580) com PEG a 50%. As células são colocadas a aproximadamente 2 x 14º em lâminas de microtitulação de fundo plano, se- guido por uma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo Soro de clone fetal a 20%, meio condicionado "653" a 18%, Origen? a 5% (IGEN), L-glutamina a 4 mM, piruvato de sódio a 1 mM, HEPES a 5 mM, 2 mercaptoetanol a 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 ug/ml de es- treptomicina, 50 ug/ml de gentamicina e 1X HAT (Sigma; o HAT é adiciona- do 24 horas após a fusão). Após aproximadamente duas semanas, as célu-

- las podem ser cultivadas em meio no qual o HAT é substituído por HT. Célu- las individuais podem, então, sofrer triagem por meio de ELISA para antícor- pos monoclonais humanos de IgG e lg. Uma vez que crescimento extensivo de hibridoma ocorre, o meio pode ser observado usualmente após 10-14 dias. Os hibridomas que secretam anticorpo podem ser recolocados em lã- mina, sofrer triagem novamente e, se ainda positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes mediante diluição limitativa. Os subclones estáveis podem, então, ser culti- vados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura tecidual para caracterização.

Para purificar anticorpos monocionais humanos, hibridomas se- lecionados podem ser crescidos em frascos para centrífuga de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser fil- trados e concentrados antes de cromatografia por afinidade com proteína A- Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser verificada por meio de eletroforese em gel e cromatografia de líquido de alto desempe- ' nho a fim de assegurar a pureza. A solução tampão pode ser trocada para PBS e a concentração pode ser determinada pela OD>s8o5 usando um coefici- ente de extinção de 1,43. Os anticorpos monocionais podem ser transforma- dosemalíquotase armazenados a -80 ºC. Geração de transfectomas que produzem anticorpos monoclonais Anticorpos da invenção podem também ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção gênica, con- forme é bem-conhecido no campo (por exemplo, Morrison, 1985 Science 229: 1202).

Por exemplo, para expressar os anticorpos ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, DNAs que codificam cadeias pesada e leve parciais ou de comprimento total podem ser obtidos por meio de técnicas padrões de biológica molecular (por exemplo, amplificação por PCR ou clonagem de cCDNA usando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão de modo que os genes

- sejam operativamente ligados a sequências de controle transcricional e tra- ducional.

Nesse contexto, o termo "operativamente ligados" se destina a sig- nificar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor, de modo que se- quências de controle transcricional e traducional dentro do vetor sirvam à sua função pretendida de regulação de transcrição e tradução do gene de anticorpo.

O vetor de expressão e sequências de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada.

O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vetores distintos ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão.

Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão através de métodos padrões (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares sobre o fragmento do gene de anticorpo e vetor ou ligação à extremidade cega se nenhum sítio . de restrição está presente). As regiões variáveis de cadeias pesada e leve dos anticorpos descritos aqui podem ser usadas para criar genes de anticor- po de comprimento total de qualquer isotipo de anticorpo através de inserção ' das mesmas em vetores de expressão que já codificam regiões constantes : de cadeia pesada e constantes de cadeia leve do isotipo desejado, de modo que o segmento V,, seja operativamente ligado ao(s) segmento(s) CH dentro dovetoreo segmento V, seja operativamente ligado ao segmento CL dentro do vetor.

Adicional ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinalizador que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira.

O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de expressão, de modo que o peptídeo sinalizador seja ligado ín-frame ao amino término do gene de cadeia de anticorpo.

O peptí- deo sinalizador pode ser um peptídeo sinalizador de imunoglobulina ou um peptídeo sinalizador heterólogo (isto é, um peptideo sinalizador de uma pro-

teina de não-imunoglobulina). Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expres- são recombinantes da invenção trazem sequências regulatórias que contro- lam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedei- ra.

O termo "sequência regulatória" se destina a incluir promotores, intensífi-

- cadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia de anticorpo. Tais sequências regulatórias são descritas, por exem- plo, em Goeddel (Gene Expression Technology. 1990 Methods in Enzymo- logy185, Academic Press, San Diego, CA). Será apreciado por aqueles ver- sados no campo que o design do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências regulatórias, pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína de- sejado, etc. Sequências regulatórias para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que dirigem altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Simiano 40 (SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polioma.

- Alternativamente, sequências regulatórias não virais podem ser usadas, tal como o promotor de ubiquitina ou promotor de P-globina. Ainda outros ele- i mentos regulatórios compostos de sequências de diferentes fontes, tal como " o sistema promotor SRa, o qual contém sequências do promotor precoce de : SV40 e a repetição terminal longa do vírus de leucemia de célula T humana do tipo 1 (Takebe et a/., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 4686-472).

Além dos genes de cadeia de anticorpo e sequências regulató- rias, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem trazer se- quências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do ve- tor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita seleção de células hospedeiras nas quais o vetor tenha sido introduzido (veja, por e- xemplo, Pats. U.S. Nº 4.399.216; 4.634.665; e 5.179.017, todas por Axel et al.). Por exemplo, tipicamente, o gene marcador selecionável confere resis- tência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, sobre uma célula hospedeira na qual o vetor tenha sido introduzido. Genes marcadores —selecionáveis incluem o gene de reductase de di-hidrofolato (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr- com seleção/amplificação por metotrexato) e o gene neo (para seleção por G418).

- Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de expressão que codifica(m) as cadeias pesada e leve é(são) transferido(s) para uma célula hospedeira por meio de técnicas padrões.

As várias formas do termo "transfecção" se destinam a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariota ou eucariota, por exemplo, eletroporação, pre- cipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrana e seme- lhantes.

Teoricamente, é possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procariotas ou eucariotas.

Expressão de anticorpos em células eucariotas, em particular células hospedeiras de mamífero, é discuti- da porque é mais provável que tais células eucariotas e, em particular, célu- las de mamífero, sejam montadas e secretem um anticorpo imunologicamen- te ativo e apropriadamente duplicado.

Foi reportado que expressão procario- - ta de genes de anticorpo é ineficaz para produção de altos rendimentos de anticorpo ativo (Boss e Wood, 1985 Immunology Today 6: 12-13). Ú Células hospedeiras de mamífero para expressão de anticorpos recombinantes da invenção incluem células de Ovário de Hâmster Chinês : (células CHO) (incluindo células CHO dhfr-, descritas por Urlaub e Chasin, 1980 Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 77: 4216-4220) usadas com um marcador —selecionável DHFR, por exemplo, conforme descrito em Kaufman e Sharp, 1982 Mol.

Biol. 159: 601-621, células de mieloma NSO, células COS e célu- las SP2. Em particular, para uso com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão é o sistema de expressão do gene GS mostrado no WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando vetores de expressão re- combinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos através de cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permi- tir expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são crescidas.

Anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos padrões de pu-

rificação de proteína.

- Moléculas biespecíficas Em outro aspecto, a presente invenção se caracteriza por molé- culas biespecíficas compreendendo uma molécula de ligação à LRP6 (por exemplo, um anticorpo anti-LRP6 ou um fragmento do mesmo) da invenção.

Uma molécula de ligaçãoàLRP6 da invenção pode ser derivatizada ou liga- da à outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) a fim de gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação ou mo- léculas-alvo diferentes. A molécula de ligação à LRP6 da invenção pode, na verdade, ser derivatizada ou ligada a mais de uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois sítios de ligação e/ou moléculas-alvo diferentes; tais moléculas multiespecíficas tam- bém se destinam a ser abrangidas pelo termo "molécula biespecífica", con- - forme usado aqui. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por meio de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou " de outro modo) a uma ou mais de outras moléculas de ligação, tais como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, de modo que uma molécula biespecífica resulte.

Consequentemente, a presente invenção inclui moléculas bies- pecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de liga- ção por um epitopo de LRP6 e uma segunda especificidade de ligação por um segundo epitopo-alvo, sobre a LRP6 ou outro alvo de proteína. À guisa de exemplo não-limitativo, uma molécula biespecífica da invenção é capaz deligaçãoao propulsor 1 e propulsor 3 de LRP6.

Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem, como uma especificidade de ligação, pelo menos um anti- corpo ou um fragmento de anticorpo do mesmo incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')., Fv ou um Fv com uma única cadeia. O anticorpo pode também ser um dímero de cadeia pesada ou cadeia leve ou qualquer frag- mento mínimo do mesmo, tal como um Fv ou um construto com uma única cadeia, conforme descrito em Ladner et a/. Pat. U.S. Nº 4.946.778, os conte-

- údos da qual são expressamente incorporados por referência.

As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas através de conjugação das especificidades de ligação constituintes usando métodos conhecidos no campo. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e, então, conjugada uma à outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento e ligação cruzada pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de ligação cruzada incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-ticacetato (SATA), ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) e 4-(N-maleimido- metil)ciclo-hexano-1-carboxilato de sulfo-succinimídila (sulfo-SMCC) (veja, por exemplo, Karpovsky et a/., 1984 J. Exp. Med. 160; 1686; Liu et a/., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Outros métodos incluem aqueles des- critos em Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. Nº 78, 118-132; Brennan et al. 1985 Science 229: 81-83) e Glennie ef al., 1987 J. Immunol. 139: 2367- 2375). Agentes de conjugação são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis da Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles po- dem ser conjugados através de ligação por sulfidrila das regiões de dobradi- ça C-terminais das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particular, a região de dobradiça é modificada para conter um número impar de resíduos de sulfidrila, por exemplo, um, antes de conjugação.

Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Esse método é particularmente útil onde a molécula biespecífica é uma proteína de fusão de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab”), ou ligante x Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula com uma única cadeia compreendendo um anticorpo com uma única cadeia e um de- terminante de ligação ou uma molécula biespecífica com uma única cadeia compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas po- dem compreender pelo menos duas moléculas com uma única cadeia. Mé-

- todos para preparo de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, nas Pats. U.S. Nº 5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513;

5.476.786; 5.013.653; 5.258.498; e 5.482.858. A ligação das moléculas biespecíficas a seus alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, por meio de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio (REA), análise por FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento) ou ensaio Western blot. Cada um desses ensaios detecta, em geral, a presença de complexos de proteína- anticorpo de interesse particular empregando um reagente rotulado (por e- xemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Ensaios funcionais As características funcionais de moléculas de ligação à LRP6 podem ser testadas in vitro ou in vivo. Por exemplo, moléculas de ligação podem ser testadas quanto à capacidade de interferir com a capacidade da LRP6 de se ligar a membros da via Wnt (por exemplo, os ligantes DKK1 (dickkopf 1), DKK2, DKK4, SOST1, SOSD1 (USAG1), sFRP (proteína Fzd- " relacionada solúvel) 1-4, Wise ou Wnt) ou modular processos biológicos tais como fosforilação e degradação de B-catenina, crescimento de célula tumo- ral, apoptose, regulação de densidade mineral óssea e secreção de insulina. A ligação de LRP6 a membros da via Wnt (por exemplo, os li- gantes DKK1 (dickkopf 1), DKK2, DKK4, SOST1, SOSD1 (USAG1), sFRP (proteína Fzd-relacionada solúvel) 14, Wise ou Wnt) pode ser detectada usando Biacore” mediante imobilização dos referidos membros da via Wnt a um suporte sólido e detecção de ligação de LRP6 solúvel aos mesmos. Al- ternativamente, LRP6 pode ser imobilizada e a ligação da mesma a um membro da via Wnt pode ser detectada. A ligação LRP86/membros da via Wnt pode também ser analisada através de ELISA (por exemplo, detectando a ligação de LRP6 a membros da via Wnt imobilizados) ou por meio de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET). Para rea- lizar FRET, a ligação de LRP6 fluoróforo-rotulada a membros da via Wnt em solução pode ser detectada (veja, por exemplo, Pat. U.S. Nº 5.631.169). A ligação de LRP6 a membros da via Wnt (por exemplo, os li-

- gantes DKK1 (dickkopf 1), DKK2, DKK4, SOST1, SOSD1 (USAG1), sSFERP (proteína Fzd-relacionada solúvel) 14, Wise ou Wnt) pode também ser de- tectada via métodos de "ligação em líquido", isto é, medindo a afinidade em um ambiente líquido ao invés de em um ambiente imobilizado. Os referidos métodos são oferecidos, por exemplo, pela BioVeris (agora Roche).

A ligação de LRP6 aos referidos membros da via Wnt pode ser detectada por meio de coimunoprecipitação (Lagace et a/., 2006 J. Clin. Inv. 116(11): 2995-3005). Para examinar a ligação LRP6-membros da via Wnt dessa maneira, células HepG2 são cultivadas em meio privado de esterol durante 18 horas. LRP6 purificada é adicionada ao meio na presença de clo- roquina a 0,1 mM e as células são incubadas durante uma hora. As células são submetidas à lise em detergente suave (digitonina a 1% em peso/vol). LRP6 ou um membro da via Wnt é imunoprecipitado dos lisatos celulares, separado mediante SDS-PAGE e imunocorado para detectar a presença do referido membro da via Wnt ou LRP6 coimunoprecipitada, respectivamente (Lagace et a/., 2006 J. Clin. Inv. 116(11): 2995-3005). Esses ensaios podem ser conduzidos com uma forma mutante de LRP6 que se liga a um membro : da via Wnt com uma maior avidez (Lagace et a/., 2006, supra).

Moléculas de ligação à LRP6 podem ser testadas quanto à ca- pacidadede aumentar ou diminuir os níveis de membros da via Wnt dentro das referidas células. Por exemplo, células são cultivadas em meio privado de esterol (DMEM suplementado com 100 U/ml de penicilina, 100 yg/ml de sulfato de estreptomícina e 1 g/l de glicose, soro deficiente em lipoproteína de bezerro recém-nascido (NCLPDS) a 5% (vol/ívol), compactina de sódio a 10uUMe mevalonato de sódio a 50 uM) durante 18 horas para induzir à ex- pressão de um membro da via Wnt. LRP6 purificada (5 pg/ml) é adicionada ao meio. Os níveis de membros da via Wnt em células coletadas a 0, 0,5, 1, 2 e 4 horas após a adição de LRP6 são determinados (Lagace et a/., 2006 J. Clin. Inv. 116(11): 2995-3005). Os níveis de membros da via Wnt podem ser determinados por meio de citometria de fluxo, FRET, imunoblotting ou outros meios.

Moléculas de ligação à LRP6 podem ser testadas quanto à ca-

. pacidade de aumentar ou diminuir a fosforilação de LRP6 induzida por Wnt e estabilização de expressão de B-catenina, gene repórter ou gene-alvo.

A ligação de LRP6 a membros da via Wnt pode ser detectada mediante produção de preparados de membrana celular contendo LRP6 e testada quanto à capacidade de se ligar aos referidos preparados compara- do com preparados de membrana celular não contendo LRP6 ou por meio de análise por PCR de células com LRP6 endógena com células com LRP6 superexpressa.

Abs anti-LRP6 podem ser testados com relação à sua capacida- dedeinibiro crescimento de tumores Wnt-dependentes em camundongos. Por exemplo, inibição de crescimento de tumor de tumores WNT1-MMTV por Abs anti-LRP6. Inibição de crescimento de tumor dentro de modelos de xe- noenxerto de tumor (por exemplo, modelos de xenoenxerto SCID, modelos de xenoenxerto ortotópico, etc.) é outro ambiente no qual Abs anti-LRP6 po- dem ser testados quanto à sua capacidade de inibir o crescimento de tumo- res Wnt-dependentes.

Abs anti-LRP6 podem ser testados quanto à sua capacidade de inibir o crescimento de tumores Wnt-dependentes in vitro, tal como inibição de formação de colônia em ágar macio.

Composições farmacêuticas Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma com- posição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo uma ou uma combinação de moléculas que se ligam à LRP6 (por exemplo, anticorpos monoclonais ou porção(ões) de ligação a antígeno dos mesmos) da presen- te invenção, formuladas junto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir uma ou uma combinação (por exemplo, du- as ou mais diferentes) moléculas de ligação. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos ou agentes que se ligam a diferentes epitopos sobre o antígeno-alvo ou que têm atividades complementares.

Composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia combinada, isto é, combinadas com outros agen-

' ' 64 - tes. Por exemplo, para terapia de câncer, a terapia combinada pode incluir um anticorpo anti-LRP6 (por exemplo, um anticorpo de antagonização de LRP6) combinado com pelo menos um outro agente quimioterapêutico. Da mesma forma, para terapia de diabetes, a terapia combinada pode incluir um anticorpo anti-LRP6 (por exemplo, um anticorpo de antagonização de LRP6) combinado com pelo menos um outro intensificador de secreção de insulina, tal como netaglinidas ou repaglinidas. Da mesma forma, para terapia de os- teoporose, a terapia combinada pode incluir um anticorpo anti-LRP6 (por exemplo, um anticorpo de antagonização de LRP6) combinado com pelo menos um outro agente capaz de aumentar a densidade óssea, tal como cálcio, vitamina D ou bisfosfonatos. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia combinada são descritos em maiores detalhes abaixo na seção sobre usos dos agentes da invenção.

Conforme usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e para retardo de absorção e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. O veículo deverá ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcu- tânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, através de injeção ouinfusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto. Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitá- vel"refere-sea um sal que retém a atividade biológica desejada do compos- to parental e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (veja, por exemplo, Berge, S.M. et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxi- cos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e semelhantes, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos mono- e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos fenila-

- substituídos, ácidos hidróxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Sais de adição de base incluem aque- les derivados de metais alcalinoterrosos, tais como sódio, potássio, magné- Sio, cálcio e semelhantes, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N N-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.

Uma composição farmacêutica da invenção também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissul- fito de sódio, suífito de sódio e semelhantes; antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (VHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol e semelhantes; e agentes de quelação de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes.

Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que " podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção inclu- : em água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e semelhantes) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais co- mo óleo de olivae ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, mediante o uso de mate- riais de revestimento, tal como lecitina, mantendo o tamanho de partícula adequado no caso de dispersões e usando tensoativos.

Essas composições podem também conter adjuvantes, tais co- Mo conservantes, agentes de umedecimento, agentes de emulsificação e agentes de dispersão. Prevenção da presença de micro-organismos pode ser assegurada por meio de procedimentos de esterilização, supra e medi- ante a inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exem- plo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e semelhantes. Também — pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e semelhantes nas composições. Além disso, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser obtida por meio de inclusão de agen-

- tes os quais retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dis- persões aquosas estéreis e pós estéreis para o preparo extemporâneo de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido no campo. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, uso dos mesmos nas composições farmacêuticas da invenção é considerado. Compostos ativos suplementares também podem serincorporados nas composições.

Composições terapêuticas devem, tipicamente, ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. À composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra . estrutura ordenada adequada para uma alta concentração de fármaco. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol " líquido e semelhantes) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apro- priada pode ser mantida, por exemplo, mediante o uso de um revestimento, tal como lecitina, mantendo o tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e usando tensoativos. Em muitos casos, pode-se incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições in- jetáveis pode ser obtida incluindo, na composição, um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme re- querido, seguido por microfiltração para esterilização. Em geral, dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para o preparo de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparo são secagem a vácuo e

= secagem-congelamento (liofilização) que proporcionam um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução previamente filtrada-estéril do mesmo.

A quantidade de ingrediente ativo a qual pode ser combinada comum material veículo para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do indivíduo que está sendo tratado e do modo de administra- ção em particular.

A quantidade de ingrediente ativo a qual pode ser combi- nada com um material veículo para produzir uma única forma de dosagem será, em geral, aquela quantidade da composição a qual produz um efeito terapêutico.

Geralmente, de cem porcento, essa quantidade oscilará de cer- ca de 0,01 porcento a cerca de noventa e nove porcento de ingrediente ati- vo, de cerca de 0,1 porcento a cerca de 70 porcento ou de cerca de 1 por- cento a cerca de 30 porcento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a respos- ta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, 7 um único bolo pode ser administrado, várias doses divididas podem ser ad- : ministradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica.

É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de uni- dade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosa- gem.

Forma de unidade de dosagem, conforme usado aqui, refere-se a uni- dades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade prede- terminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido.

A especifi- cação para as formas de unidade de dosagem da invenção é orientada por e diretamente dependente das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico que se deseja obter em particular e das limitações ineren- tesno campo de composição, tal como composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Para administração do anticorpo, as faixas de dosagem oscilam

. de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e, mais usualmente, 0,01 a 5 mg/kg do pe- so corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplificativo requer administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou mesmo a cada três a 6 meses. Regimes de dosagem para a molécula de ligação à LRP6 da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou3 mg/kg de peso corporal por meio de administração intravenosa, com o anticorpo sendo fornecido usando um dos seguintes esquemas de dosagem: a cada quatro semanas para seis dosagens, então, a cada três meses; a cada três semanas; 3 mg/kg de peso corporal uma vez, seguido por 1 mg/kg - de peso corporal a cada três semanas.

Em alguns métodos, duas ou mais moléculas de ligação (por exemplo, anticorpos monoclonais) com diferentes especificidades de ligação " são administradas simultaneamente, caso no qual a dosagem de cada anti- : corpo administrado cai dentro das faixas indicadas. A molécula de ligação à LRP6 é usualmente administrada em múltiplas ocasiões. Intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Os intervalos podem também ser irregulares, conforme indicado mediante medição dos níveis sanguíneos de uma molécula de ligação à LRP6 no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para obter uma concentração de molécula de ligação à LRP6 no plasma de cercade1-1000 pg/ml e, em alguns métodos, cerca de 25-300 pg/ml. Alternativamente, uma molécula de ligação à LRP6 pode ser administrada como uma formulação com liberação sustentada, caso no qual administração menos frequente é requerida. A dosagem e frequência vari- am, dependendo da meia-vida da molécula de ligação à LRP6 no paciente. Em geral, anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguido por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não-humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar, dependendo se o

. tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma do- sagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente não frequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento durante o resto de suas vidas. Em aplicações terapêu- ticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é requerida até que progressão da doença seja reduzida ou terminada ou até que o paciente mostre alívio parcial ou completo dos sintomas. Após o que, pode ser administrado ao paciente um regime profilático. Os níveis reais de dosagem dos ingredientes ativos nas compo- sições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo a qual é eficaz para obter a res- posta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de admi- nistração em particular, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, inclu- indoa atividade das composições particulares da presente invenção empre- gadas ou do éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o momento de administração, a taxa de excreção do composto que está sendo : empregado em particular, a duração do tratamento, outros fármacos, com- postos e/ou materiais usados em combinação com as composições empre- gadas em particular, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente que está sendo tratado e fatores semelhantes bem-conhecidos no campo médico.

Uma composição da presente invenção pode ser administrada por meio de uma ou mais vias de administração usando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos no campo. Conforme será apreciado por aqueles versados, a via e/ou modo de administração variarão, dependendo dos resultados desejados. Vias de administração para moléculas de ligação à LRP6 da invenção incluem as vias de administração intravenosa, intra- muscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras pa- renterais, por exemplo, através de injeção ou infusão. A frase "administração parenteral", conforme usado aqui, significa outros modos de administração que não administração enteral e tópica, usualmente por meio de injeção e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra- arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, in- traperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcap- sular, subaracnoide, intraespínhal, epidural e intraesternal.

Ss Alternativamente, uma molécula de ligação à LRP6 da invenção pode ser administrada por meio de uma via não parenteral, tal como a via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente.

Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação com liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de distribuição microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, bio- compatíveis podem ser usados, tais como acetato de etileno vinila, poliani- dridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Mui- tos métodos para o preparo de tais formulações são patenteados ou geral- mente conhecidos por aqueles versados no campo. Veja, por exemplo, Sus- tained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., : Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Composições terapêuticas podem ser administradas com dispo- sitivos médicos conhecidos no campo. Por exemplo, em uma modalidade, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos mostrados nas Pats. U.S. Nº 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413;

4.941.880; 4.790.824 ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem- conhecidos úteis na presente invenção incluem: Pat. U.S. Nº 4.487.603, a qual mostra uma bomba de microinfusão implantável para distribuição de medicamento em uma taxa controlada; Pat. U.S. Nº 4.486.194, a qual mos- tra um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; Pat. U.S. Nº 4.447.233, a qual mostra uma bomba de infusão de medicamento para distribuição de medicamento em uma taxa de infusão precisa; Pat. U.S. Nº 4.447.224, a qual mostra um aparelho de infusão im- plantável de fluxo variável para distribuição contínua de fármaco; Pat. U.S.

Nº 4.439.196, a qual mostra um sistema de distribuição de fármaco osmótico tendo compartimentos com múltiplas câmaras; e Pat.

U.S.

Nº 4.475.196, a qual mostra um sistema de distribuição de fármaco osmótico.

Essas patentes são incorporadas aqui por referência.

Muitos outros de tais implantes, sistemas dedistribuiçãoe módulos são conhecidos por aqueles versados no campo.

Em determinadas modalidades, as moléculas de ligação à LRP6 da invenção podem ser formuladas para assegurar distribuição apropriada in vivo.

Por exemplo, a barreira sangue-cérebro (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos.

Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção atravessam a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas.

Para métodos de fabricação de lipossomas veja, por exemplo, Pats.

U.S.

Nº 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os liposso- mas podem compreender uma ou mais porções as quais são seletivamente transportadas para células ou órgãos específicos, assim, intensificando a distribuição do fármaco objetivado veja, por exemplo, V.V.

Ranade, 1989 J.

Cline Pharmacol. 29: 685). Porções de objetivação exemplificativas incluem folato ou biotina (veja, por exemplo, Pat.

U.S. 5.416.016 para Low et al.); manosídeos (Umezawa et al., 1988 Biochem.

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Commun. 153: 1038); anticorpos (P.G.

Bloeman et a/., 1995 FEBS Lett. 357: 140; M.

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Laukkanen, 1994 FEBS Lett. 346: 123; J.J.

Killion; 1.J.

Fidler, 1994 Immunomethods 4: 273. Usos e métodos da invenção As moléculas de ligação à LRP6 descritas aqui têm utilidades terapêuticas e diagnósticas in vitro e in vivo.

Por exemplo, essas moléculas podem ser administradas a células em cultura, por exemplo, in vitro ou in vivo ou em um indivíduo, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir ou diag- nosticar uma variedade de distúrbios.

Moléculas de ligação à LRP6 são par- ticularmente adequadas para tratamento de pacientes humanos que estão sofrendo de "distúrbios relacionados à sinalização ao Wnt", significando a- quelas doenças e condições associadas à sinalização anormal ao Wnt.

Su-

“ per-regulação anormal de sinalização ao Wnt está associada ao câncer, os- teoartrite e doença renal policística, condições as quais serão particularmen- te passíveis de tratamento por meio da administração de moléculas de liga- ção à LRP antagonistas.

Inversamente, sub-regulação anormal de sinaliza- çãoaoWntfoirelacionada à osteoporose, obesidade, diabetes e doenças neuronais degenerativas, condições as quais seriam particularmente passí- veis de tratamento por meio da administração de moléculas de ligação à LRP agonistas.

Em uma modalidade, moléculas de ligação à LRP6 antagonistas podem ser usadas para diagnosticar, aliviar os sintomas de, proteger contra e tratar distúrbios de sinalização ao Wnt associados a níveis anormalmente altos de via Wnt mediante ligação de um modo Wnt1-específico, ao primeiro propulsor de LRP6. Em uma modalidade, moléculas de ligação à LRP6 an- tagonistas podem ser usadas para diagnosticar, aliviar os sintomas de, pro- teger contra e tratar distúrbios de sinalização ao Wnt associados a níveis anormalmente altos de via Wnt mediante ligação de um modo Wnt3a- específico, ao terceiro propulsor de LRP6. Em uma modalidade, moléculas : de ligação à LRP6 agonistas podem ser usadas para diagnosticar, aliviar os sintomas de, proteger contra e tratar distúrbios de sinalização ao Wnt asso- ciadosa níveis anormalmente baixos de via Wnt mediante ligação ao tercei- ro propulsor de LRP6. "Cânceres relacionados à sinalização ao Wnt" os quais são pas- Síveis de tratamento através da administração das moléculas de ligação à LRP6 da invenção incluem, mas não estão limitados a, cânceres de cólon (por exemplo, carcinomas colorretais (CRCs)), melanoma, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer gástrico, meduloblastoma ma- ligno e outros tumores neuroectodérmicos malignos primários do CNS, rab- domiossarcoma, tumores derivados do sistema digestivo (incluindo, mas não limitado a, câncer do esôfago, estômago, pâncreas e sistema de duto biliar) ecânceres de próstata e bexiga.

De um modo relacionado, as moléculas de ligação à LRP6 anta- gonistas da invenção são capazes de inibição do crescimento de uma célula

- tumoral ou de indução de apoptose em ou inibição de angiogênese de uma célula tumoral. À guisa de exemplo, uma célula tumoral pode ser contatada com uma molécula de ligação à LRP6 antagonista (por exemplo, uma molé- cula de ligação à LRP6 incluindo uma porção de ligação à antígeno de um anticorpo que se liga especificamente a uma LRP6), desse modo, prevenin- do a transdução de sinal da via Wnt dentro da célula tumoral mediante esta- bilização do complexo de destruição de B-catenina e impedindo a fosforila- ção e degradação de B-catenina.

As moléculas de ligação à LRP6 descritas aqui são particular- mente adequadas para o tratamento de pacientes humanos que estão so- frendo de distúrbios relacionados ao osso, tal como no caso de fraturas, dis- túrbios nos quais a densidade mineral óssea (BMD) é anormal! e/ou patologi- camente alta com relação a indivíduos saudáveis e distúrbios nos quais a densidade mineral óssea (BMD) é anormal e/ou patologicamente baixa com relação a indivíduos saudáveis.

Distúrbios caracterizados por alta BMD, os quais serão passíveis ' de tratamento via a administração de moléculas antiligação à LRP6 antago- nistas incluem, mas não estão limitados a, esclerosteose, doença de Van Buchem, distúrbios de supercrescimento ósseo e síndrome de Simpson- Golabi-Behmel (SGBS). À guisa de exemplo, as referidas moléculas de liga- ção à LRP6 antagonistas (por exemplo, uma molécula de ligação à LRP6 incluindo uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo que se liga es- pecificamente a uma LRP6) serão administradas a um indivíduo em uma quantidade eficaz para diminuir a densidade mineral óssea.

Distúrbios caracterizados por baixa BMD e/ou fragilidade óssea, os quais seriam passíveis de tratamento via a administração de moléculas antiligação à LRP6 agonistas incluem, mas não estão limitados a, osteopo- rose primária e secundária, osteopenia, osteomalácia, síndrome de osteopo- rose-pseudoglioma (OPPG), osteogênese imperfecta (OI), necrose avascular (osteonecrose), fraturas e cicatrização de implantes (implantes dentais e im- plantes de quadril) e perda óssea em virtude de outros distúrbios (por exem- plo, associados à infecção pelo HIV, cânceres ou artrite). Os referidos anti-

. corpos agonistas de LRP6 são capazes de ativar, intensificar ou perpetuar a via de sinalização ao Wnt ou sensibilizar células à sinalização ao Wnt.

Os referidos anticorpos agonistas de LRP6 podem se ligar à LRP6 (por exem- plo, ao 3º propulsor de LRP6) e impedir a dissolução do complexo de destru- ição de B-catenina, desse modo, permitindo estabilização de B-catenina, translocação para o núcleo e encaixe com fatores de transcrição e, desse modo, elevando a densidade mineral óssea no processo.

Em algumas modalidades, as referidas moléculas de ligação à LRP6 agonistas são capazes de ativar, intensificar ou perpetuar a via de si- —nalização ao Wnt ou sensibilizar células à sinalização ao Wnt mediante oli- gomerização de LRP6., Sabe que o requisito de ligantes de Wnt pode ser eliminado por agentes os quais permitem a formação de oligomerização de LRP6 (por exemplo, hetero-oligômeros de Fzd-LRP6), incluindo as molécu- las de ligação à LRP6 da invenção (Cong et al. (2004) Development 131(20): 5103). Em algumas modalidades, as referidas moléculas de ligação à LRP6 i são anticorpos de IgG divalentes, conforme descrito aqui.

Outros "distúrbios relacionados ao osso" passíveis de tratamento : via a administração de moléculas de ligação à LRP6 incluem, mas não estão limitados a, artrite reumatoide, osteoartrite, artrite e a formação e/ou presen- cade lesões osteolíticas.

Em uma modalidade, moléculas de ligação à LRP6 antagonistas podem ser usadas para diagnosticar, aliviar os sintomas de, proteger contra e tratar distúrbios relacionados ao osso caracterizados por BMD anormal- mente alta mediante ligação, de um modo Wnt1-específico, ao primeiro pro- pulsordeLRP6. Em outra modalidade, moléculas de ligação à LRP6 anta- gonistas podem ser usadas para diagnosticar, aliviar os sintomas de, prote- ger contra e tratar distúrbios relacionados ao osso caracterizados por BMD anormalmente alta mediante ligação, de um modo Wnt3a-específico, ao ter- ceiro propulsor de LRP6. Em uma modalidade, moléculas de ligação à LRP6 agonistas podem ser usadas para diagnosticar, aliviar os sintomas de, pro- teger contra e tratar distúrbios relacionados ao osso caracterizados por BMD anormalmente baixa mediante ligação ao terceiro propulsor de LRP6.

- As moléculas de ligação à LRP6 descritas aqui são particular- mente adequadas para tratamento de pacientes humanos que estão sofren- do de diabetes, obesidade ou outros distúrbios relacionados ao metabolis- mo, por exemplo, aqueles caracterizados por taxas anormais e/ou patologi- camente baixas de sinalização ao Wnt com relação a indivíduos saudáveis. Os referidos distúrbios são passíveis de tratamento via a administração de moléculas antiligação à LRP6 agonistas as quais são capazes, por exemplo, de intensificar a secreção de insulina quando de ligação a seus alvos (Fujino et al. (2003) PNAS 100: 229). À guisa de exemplo, as referidas moléculas de ligação à LRP6 agonistas (por exemplo, uma molécula de ligação à LRP6 incluindo uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo que se liga especi- ficamente a uma LRP6) seriam administradas a um indivíduo em uma quanti- dade eficaz para intensificar a secreção de insulina, de modo que uma condi- ção diabética no referido indivíduo seja prevenida, aliviada ou remediada. Em uma modalidade, moléculas de ligação à LRP6 agonistas podem ser usadas para diagnosticar, aliviar os sintomas de, proteger contra e tratar diabetes, obesidade ou outros distúrbios relacionados ao metabolis- mo (por exemplo, aqueles caracterizados por taxas anormais e/ou patologi- camente baixas de sinalização ao Wnt com relação a indivíduos saudáveis) mediante ligação ao terceiro propulsor de LRP6.

Quando moléculas de ligação à LRP6 são administradas junto com outro agente, os dois podem ser administrados sequencialmente em qualquer ordem ou simultaneamente. Em algumas modalidades, uma molé- cula de ligação à LRP6 é administrada a um indivíduo que também está re- cebendo terapia com um segundo agente. O referido segundo agente pode ser um agente quimioterapêutico, no caso de cânceres; um intensificador da secreção de insulina, tal como nateglinidas ou repaglinidas, no caso de dia- betes ou outros distúrbios metabólicos; e agentes capazes de aumentar a densidade óssea, tais como cálcio, vitamina D ou bisfosfonatos, no caso de distúrbios relacionados ao osso. Um regime de terapia combinada pode ser aditivo ou ele pode produzir resultados sinergísticos (por exemplo, aumentos na densidade mineral óssea ou na secreção de insulina ou na apoptose de

- células cancerígenas maior do que o esperado para o uso combinado dos dois agentes).

Em uma modalidade, as moléculas de ligação da invenção po- dem ser usadas para detectar níveis de LRP6. Isso pode ser obtido, por e- xemplo, mediante contato de uma amostra (tal como uma amostra in vitro) e uma amostra de controle com a molécula de ligação à LRP6 sob condições que permitem a formação de um complexo entre a molécula de ligação e a LRP$6. Quaisquer complexos formados entre a molécula e LRP6 são detecta- dos e comparados na amostra e no controle. Por exemplo, métodos padrões de detecção, bem-conhecidos no campo, tais como ensaios ELISA e de citometria de fluxo, podem ser realizados usando as composições da invenção.

Consequentemente, em um aspecto, a invenção ainda propor- ciona métodos para detecção da presença de LRP6 (por exemplo, hLPR6) em uma amostra ou medição da quantidade de LRP6 compreendendo con- tatoda amostra e uma amostra de controle com uma molécula de ligação à LRP6 (por exemplo, um anticorpo) da invenção, sob condições que permi- " tem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e a LRPG6. A formação de um complexo é, então, detectada, onde uma diferença na formação de complexo entre a amostra comparada com a amostra de controle é indicativa da presença de LRP6 na amostra.

Também dentro do escopo da invenção são kits consistindo nas composições da invenção e instruções para uso. O kit pode ainda conter pelo menos um reagente adicional ou um ou mais anticorpos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo tendo uma atividade complementar a qualseligaa um epitopo sobre o antígeno-alvo distinto do primeiro anticor- po). Kits incluem, tipicamente, um rótulo indicando o uso pretendido dos con- teúdos do kit. O termo rótulo inclui qualquer material escrito ou impresso for- necido sobre ou com o Kit ou o qual, de outro modo, acompanha o kit.

A invenção tendo sido totalmente descrita é ainda ilustrada por —meiodos exemplos e reivindicações a seguir, os quais são ilustrativos e não se destinam a ser limitativos. Aqueles versados no campo reconhecerão ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentação de

T7 - rotina, numerosos equivalentes aos procedimentos específicos descritos a- qui. Tais equivalentes estão dentro do escopo da presente invenção e rei- vindicações. Os conteúdos de todas as referências, incluindo patentes emiti- das ou pedidos de patente publicados, citados por todo o presente pedido, são aquiincorporados por referência.

EXEMPLOS Exemplo 1: Identificação de anticorpos antagonistas anti-LRP6 Wnt- específicos Descobriu-se que Fabs antagonísticos anti-LRP6 inibem prefe- rencialmente a sinalização ao Wnt Wnt1- ou Wnt3a-induzida. Células 293T foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos de expressão de Wnt1 ou Wnt3a junto com os repórteres SuperTopflash e SV40-Renilla. A propor- ção de sinal de luciferase entre células tratadas com Fabs à LRP6 e células tratadas com Fab de controle antilisossoma (FabControl) foi plotada e repre- sentapelo menos nas figuras 1 e 2.

Proteínas da via de sinalização ao Wnt que são capazes de si- ' nalização canônica ao Wnt podem ser divididas em duas classes vis-à-vis as moléculas de ligação à LRP6 da invenção. Wnt3 e Wnt3a são bloqueados por Abs antagonísticos de LRP6 Wnt3a-específicos. Outras proteinas de Wnt(Wnt1,2,6,7A,7B, 9, 10A, 10B) foram bloqueadas por meio de Abs antagonísticos de LRP6 Wnt1-específicos.

Experimentos foram realizados através de transfecção transitória de células 293T com diferentes construtos de Wnt e Frizzled junto com Su- perTopflash e SV40-Renilla e tratamento com um painel de Fabs antagoníis- ticos deLRP6.A proporção de sinal de luciferase entre as células tratadas com Fabs à LRP6 e células tratadas com Fab de controle antilisossoma (FabControl) é mostrada na Tabela ll:

mm o e . S Elas Ra as as a RES E Ni vo à SS Ss o Ss a +) 9) A MS AS = < 9 e| e e 2 E RS SA APRE RES E NS) 2) S2/s| 5S| os Ss gt Ss =| Ps 7 7-2 4 o

ERA S e) SR | 9) e 2 = + m o e

SEER E NS | o Ss | S o o Ss z Fr or 9 o asa S2 < o e

PESE SENESENENRNENES E NI S| 6) o) | | ml | S z F|)2jopa| || =| -|2 Sl el el e RR

ER PERNININIRNF - = 4/6 SR sas &s o E) e el =) e FR Eis: se" = PA o = CARS ENESESEIEIE) 3 Ss e - =|] =ls e el el x se 2 E ssa eloa N| NA e o o e e xs ss ss an —/ | 8/ 2) 8) 8 / o = = 8 s < ol + elo oleo 3; mm els =| =| Ss es ojolojo mn 2 as 2 2/ 2) 2 < |. | we) Hr ul uu ul ul

7o Exemplo 2: Identificação de anticorpos anti-LRP6 Wnt-específicos Fabs anti-LRP6 agonísticos foram identificados.

Células 293T- STF foram tratadas com anticorpos indicados (1 ug/ml) e meio condicionado com Wnt3a a 0% ou 5% durante a noite e a atividade de luciferase foi medi- da A proporção de sinal de luciferase entre células tratadas com Fabs à L- RP6 e células tratadas com Fab de controle antilisossoma (FabControl) na concentração indicada de Wnt3a foi plotada, conforme observado pelo me- nos na figura 3. Exemplo 3: Mapeamento de domínio de LRP6 e determinação epitópica Conforme observado pelo menos na figura 4, mapeamento de domínio de mutantes com deleção de LRP6 usando o ensaio FACS revela que anticorpos antagonísticos de LRP6 Wnt1-específicos se ligam ao pro- pulsor 1 e anticorpos antagonisticos à LRP6 Wn3a-específicos e anticorpos agonísticos à LRP6 se ligam a propulsor 3. Células 293T foram transitoria- mente transfectadas com construtos de expressão de LRP6 mutantes ou do tipo silvestre Flag-rotulados N-terminalmente junto com MESD.

As células 7 foram coradas com anticorpo anti-Flag (figura 4B) e Fabs indicados (figura : 4C) e analisadas por meio de FACS.

As curvas em vermelho representam dois anticorpos agonísticos de LRP6 (Fab025 e Fab026). As curvas em púr- pura representam dois anticorpos antagonísticos de LRP6 Wnt1-específicos (Fab010 e Fab021). As curvas em azul escuro representam dois anticorpos antagonísticos de LRP6 Wnt3a-específicos (Fab002 e Fab004), A curva em azul claro representa um anticorpo antagonístico de LRP6 que inibe a sinali- zação induzida por Wnt3a e Wnt1 (Fab005). A Tabela Il! mostra a capacida- de de ligação relativa entre os Fabs anti-LRP6 e mutantes de LRP6 com truncamento (esses dados na tabela correspondem às fotografias de análise por FACS mostradas nas figuras 4A-4C). "—" indica nenhuma atividade e "+" indica atividade (mais símbolos para mais atividade).

. TABELA Ill Antagonista Antagonista | Antagonista | parcial de Agonista de Wnt1 de Wnt3a | Wnt3a, Wnt1 ee TIO total ++ +++ +++ +++ leresseim | ae [o de | e [uresdem Po as Ps | [uresder fe | o] a [a | leres demam o Ds Conforme descrito por todo o pedido e representado pelo menos nas figuras 44-4C, aqueles Fabs capazes de ligação ao propulsor 1 de LRP6 funcionam com especificidade por Wnt1 (dentre os mesmos, os Fabs Wnt1- específicos Fab010 e Fabo21), enquanto que aqueles Fabs que se ligam ao . propulsor 3 de LRP6 funcionam com especificidade por Wnt3a (dentre os mesmos, os Fabs Wnt3a-específicos Fab002 e Fab004). Conforme demons- : trado aqui, a atividade de sinalização Wnt3- e Wnt3a-específica pode ser mais eficazmente inibida por uma molécula de ligação à LRP6 antagonista Whnt3a-específica; e a atividade de sinalização Wnt1-, Wnt2-, Wnt6-, Wnt7a-, Wnt7b- e Wnt10-específica pode ser mais eficazmente inibida por uma mo- lécula de ligação à LRP6 antagonista Wnt1-específica.

Não se acredita que moléculas de ligação à LRP6 agonistas (por exemplo, Fab025 e Fab026) sejam Wnt-específicas e se ligam ao 3º propulsor de LRP6 (isto é, elas per- dem a capacidade de ligação à LRP6 apenas quando o propulsor 3 é dele- tado (representado em LRP6 del |l!)). Exemplo 4: Oligomerização de LRPG6 intensifica a sinalização ao Wnt Conforme descrito na figura 5, anticorpos antagonísticos de L- RP6 mostram atividade agonística quando convertidos em IgG.

Células 293T foram transfectadas com Wnt1 ou Wnt3a junto com o repórter SuperTopflash e tratadas com anticorpos à LRP6. A atividade de luciferase foi normalizada contra o controle antilisozima (FabControl). Uma vez convertidos em IgG,

- anticorpos antagonísticos Wnt1-específicos mostram atividade agonística em um ensaio de Wnt3a, enquanto que anticorpos antagonísticos Wnt3a- específicos mostram atividade agonística no ensaio de Wnt1. Essas obser- vações são consistentes com a observação de que Wnt1 e Wnt3a se ligam a diferentes regiões de LRP6 para sinalização e que oligomerização de LRP6 intensifica a sinalização ao Wnt.

Por exemplo, IgGs antagonísticas Wnt1- específicas inibem a sinalização ao Wnt1 mediante bloqueio da interação física entre Wnt1 e LRP6. Anticorpos Wnt1-específicos, entretanto, não blo- queiam a interação Wnt3a-LRP6 e, antes, induzem à oligomerização de L- RP6.lsso leva a uma resposta intensificada ao ligante Wnt3a.

Esses dados sugerem que a oligomerização de LRP6 endógena aumenta a sinalização ao Wnt.

Exemplo 5: Inibição de fosforilação de LRP6 e acúmulo de B-Catenina livre Células PA-1 são células de teratocarcinoma ovariano.

Essas foram tratadas durante seis horas por meio de estimulação com uma combi- nação de Fab004, Fab004 e Fab012. As amostras de fosfo-LRP6 (pLRP6) e ' LRP6 foram preparadas usando uma lise de célula inteira em tampão Triton- : X.

As amostras de B-Catenina IB foram preparadas por meio de fraciona- mento celular mediante múltiplos ciclos de congelamento/descongelamento emsolução hipotônica.

Células NCI-H929 são células de mieloma múltiplo. 4 x 10º celu- las foram usadas.

Essas foram pré-incubadas com proteína durante 30 mi- nutos, seguido por estimulação de quatro horas com Wnt3a (meio condicio- nado a 50%). Fracionamento celular foi realizado por meio de múltiplos ci- closdecongelamento/descongelamento em solução hipotônica e a fração de membrana ressuspensa em tampão Triton-X.

Claims (38)

- REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ligação ao polipeptídeo 6 de proteína relacionada ao receptor de lipoproteina de baixa densidade (low-density-lipoprotein re- ceptor-related protein - LRP6) compreendendo uma porção de ligação a an- tígenode um anticorpo que se liga especificamente à LRP6, em que a por- ção de ligação a antígeno se liga a um epitopo de LRP6 humana (SEQ ID NO: 1) dentro ou em sobreposição a um dos seguintes: (a) aminoácidos 20-326 de SEQ ID NO: 1; (b) aminoácidos 286-324 de SEQ ID NO: 1; (c) aminoácidos 631-932 de SEQ ID NO: 1; ou (d) aminoácidos 889-929 de SEQ ID NO: 1.

2. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com a reivindicação 1, compreendendo uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo que se liga especificamente à LRP6, em que a porção de ligação a antígeno se liga aum epitopo de LRP6 humana (SEQ ID NO: 1) dentro ou em sobreposição a um dos seguintes: ' (a) aminoácidos 20-326 de SEQ ID NO: 1; ou ' (b) aminoácidos 286-324 de SEQ ID NO: 1.

3. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com a reivindicação 2, compreendendo uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo que se liga especificamente à LRP6, em que a porção de ligação a antígeno se liga a um epitopo de LRP6 humana (SEQ ID NO: 1) dentro ou em sobreposição : a um dos seguintes: * (a) aminoácidos 70-109 de SEQ ID NO: 1; ' 25 (b) aminoácidos 114-152 de SEQ ID NO: 1; : (c) aminoácidos 157-196 de SEQ ID NO: 1; : (d) aminoácidos 201-237 de SEQ ID NO: 1; ou (e) aminoácidos 242-326 de SEQ ID NO: 1.

'

4. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com a reivindicação 1, compreendendo uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo que se liga especificamente à LRP6, em que a porção de ligação a antígeno se liga a um epitopo de LRP6 humana (SEQ ID NO: 1) dentro ou em sobreposição

- a um dos seguintes: (a) aminoácidos 631-932 de SEQ ID NO: 1; ou (b) aminoácidos 889-929 de SEQ ID NO: 1.

5. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com a reivindicação 4, compreendendo uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo que se liga especificamente à LRP6, em que a porção de ligação a antígeno se liga a um epitopo de LRP6 humana (SEQ ID NO: 1) dentro ou em sobreposição a um dos seguintes: (a) aminoácidos 889-929 de SEQ ID NO: 1; (b) aminoácidos 677-680 de SEQ ID NO: 1; (c) aminoácidos 720-723 de SEQ ID NO: 1; (d) aminoácidos 763-766 de SEQ ID NO: 1; (e) aminoácidos 806-809 de SEQ ID NO: 1; ou (f) aminoácidos 846-849 de SEQ ID NO: 1.

6. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a porção de ligação a antígeno é capaz de ago- " nismo da via de sinalização Wnt. .

7. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a porção de ligação a antígeno é capaz de anta- gonismo da via de sinalização Wnt.

8. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das , reivindicações 1, 4 e 5, em que a porção de ligação a antigeno inibe prefe- rencialmente uma ou mais atividades de sinalização Wnt3- ou Wnt3a- específicas. ' 25

9. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das - reivindicações 1, 4 e 5, em que a porção de ligação a antigeno é capaz de . antagonismo de uma ou mais atividades de sinalização Wnt1-, Wnt2-, Wnt6-, Wnt7a-, Wnt7b- ou Wnt10-específicas. '

10. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, em que a porção de ligação a antígeno reage cruza- damente com uma LRP6 de um primata não-humano.

11. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma

. das reivindicações 1-9, em que a porção de ligação a antígeno reage cruza- damente com uma LRP6 de uma espécie de roedor.

12. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a porção de ligação a antígeno rea- gecruzadamente com LRP5 humana.

13. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a porção de ligação a antígeno se liga a um epitopo linear.

14. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-12, em que a porção de ligação a antígeno se liga a um anticorpo não-linear.

15. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a molécula de ligação à LRP6 com- preende um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab'), ou Fv doanticorpo.

16. Molécula de ligação à LRP6 antagonista de acordo com ' qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a porção de ligação a antigeno é capaz de ligação a e inibição de LRPS6 fosforilada (fosfo-LRP6). Ú

17. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a porção de ligação a antígeno se liga à LRP6 com uma Kp igual a ou menor do que 1 nM. .

18. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a porção de ligação a antígeno é & uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo humano. i 25

19. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma - das reivindicações precedentes em que o anticorpo é um anticorpo humani- zado.

20. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a porção de ligação a antígeno é uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo monocional.

21. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a porção de ligação a antígeno é

- uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo policlonal.

22. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a molécula de ligação à LRP6 é um anticorpo quimérico.

23. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a porção de ligação a antígeno é derivada de um anticorpo de um dos seguintes isotipos: I9G1, IgG2, IgG3 ou 19G4.

24. Molécula de ligação à LRP6 antagonista de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a molécula de ligação a antígeno inibe a ligação de LRP6 a um ligante de LRP6.

25. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a molécula de ligação à LRP6 inibe a ligação de LRP6 a um ou mais dos seguintes membros da via de sinaliza- ção Wnt os ligantes dickkopf 1 (DKK1), DKK2, DKK4, SOST1, SOSD1 (U- SAG1), sFRP (proteina Fzd-relacionada solúvel) 1-4, Wise ou Wnt. "

26. Composição farmacêutica compreendendo a molécula de ligação à LRP6 como definida em qualquer uma das reivindicações prece- dentes.

27. Método de tratamento de distúrbios Wnt-relacionados, o refe- rido método compreendendo administração da molécula de ligação à LRP6 ' de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes ou uma com- posição farmacêutica compreendendo a mesma a um indivíduo que está : sofrendo de ou está afetado pelo referido distúrbio Wnt-relacionado. i 25

28. Método de tratamento de câncer, o referido método compre- . endendo administração de uma molécula de ligação à LRP6 antagonista de - acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes ou uma composi- ção farmacêutica compreendendo a mesma a um indivíduo que está sofren- ' do de ou está afetado por câncer.

29. Método de tratamento de osteoartrite, o referido método compreendendo administração de uma molécula de ligação à LRP6 antago- nista como definida em qualquer uma das reivindicações precedentes ou

' , . uma composição farmacêutica compreendendo a mesma a um indivíduo que está sofrendo de ou está afetado por osteoartrite.

30. Método de tratamento de obesidade ou diabetes, o referido método compreendendo administração de uma molécula de ligação à LRP6 5 agonista como definida em qualquer uma das reivindicações precedentes ou uma composição farmacêutica compreendendo a mesma a um indivíduo que está sofrendo de ou está afetado por diabetes ou obesidade.

31. Método de tratamento de uma doença neurodegenerativa, o referido método compreendendo administração de uma molécula de ligação àLRP6 agonista como definida em qualquer uma das reivindicações prece- dentes ou uma composição farmacêutica compreendendo a mesma a um indivíduo que está sofrendo de ou está afetado pela doença neurodegenera- tiva.

32. Método de tratamento de um distúrbio fibrótico, o referido método compreendendo administração de uma molécula de ligação à LRP6 agonista como definida em qualquer uma das reivindicações precedentes ou f uma composição farmacêutica compreendendo a mesma a um indivíduo que está sofrendo de ou está afetado pelo distúrbio fibrótico. Ú

33. Método de tratamento de osteoporose, o referido método compreendendo administração de uma molécula de ligação à LRP6 agonista como definida em qualquer uma das reivindicações precedentes ou uma ' composição farmacêutica compreendendo a mesma a um indivíduo que está sofrendo de ou está afetado por osteoporose.

'

34. Molécula de ligação ao polipeptídeo 6 de proteína relaciona- da ao receptor de lipoproteina de baixa densidade (low-density-lipoprotein . receptor-related protein - LRP6) a qual é capaz de ligação a um epitopo de LRP6 humana (SEQ ID NO: 1) dentro ou em sobreposição a um dos seguintes: (a) aminoácidos 20-326 of SEQ ID NO: 1; ' (b) aminoácidos 286-324 of SEQ ID NO: 1; (c) aminoácidos 631-932 of SEQ ID NO: 1; ou (d) aminoácidos 889-929 of SEQ ID NO: 1.

35. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com a reivindicação

« 7 6 34, a qual é capaz de agonismo da via de sinalização Wnt.

36. Molécula de ligação à LRP6 de acordo com a reivindicação 34, a qual é capaz de antagonismo da via de sinalização Wnt.

37. Composição farmacêutica compreendendo a molécula de ligação àLRP6 como definida em qualquer uma das reivindicações 34-36.

38. Método de tratamento de distúrbios Wnt-relacionados, o refe- rido método compreendendo administração da molécula de ligação à LRP6 como definida em qualquer uma das reivindicações 34-36 ou uma composi- ção farmacêutica compreendendo a mesma a um indivíduo que está sofren- dode ou está afetado pelo referido distúrbio Wnt-relacionado.