BRPI0820628A2 - processo para separar e determinar a carga viral em uma amostra de pancreatina - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA SEPARAR E DETERMINAR A CARGA VIRAL EM UMA AMOSTRA DE PANCREATINA. A presente invenção refere-se a processos para separar uma carga viral de uma amostra de pancreatina, e para determinar quantitativamente a carga viral em uma amostra de pancreatina, com alta sensibilidade.

Description

" Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO

PARA SEPARAR E DETERMINAR A CARGA VIRAL EM UMA AMOSTRA DE PANCREATINA". A presente invenção refere-se a um processo para separar de forma substancialmente quantitativa a caga viral de um espécime de pan- creatina, e um processo para determinar quantitativamente a carga viral des- te espécime de pancreatina com alta sensibilidade. A pancreatina é uma mistura de vários constituintes fisiologica- mente ativos, conhecida há muito tempo, obtida a partir de glândulas pan- « 10 —creáticas de mamíferos. Os principais constituintes da pancreatina são en- ". x zimas digestivas, particularmente lipase pancreática, mas também amilases ' e proteases. Graças às suas propriedades terapêuticas valiosas e alto nível de segurança no uso, a pancreatina tem sido utilizada há muito tempo de forma altamente exitosa como uma preparação farmacêutica na terapia de reposição enzimática. A lipase pancreática é de grande valor neste caso, mas as amilases e proteases também realizam uma contribuição considerá- vel para os benefícios terapêuticos da pancreatina. A pancreatina para pro- pósitos terapêuticos é obtida usualmente a partir do gado ("pancreatina bo- vina") ou porcos ("pancreatina porcina"), sendo a pancreatina porcina do maior valor em termos de quantidade. Os métodos para a produção de pan- creatina para propósitos terapêuticos são em si conhecidos, por exemplo, através da publicação Nº EP 0 115023 A. Devido à natureza da pancreatina derivada de animais, as maté- rias-primas podem estar tipicamente acompanhadas de componentes bioló- gicos indesejados, tais como contaminantes bacterianos ou virais. Entretan- to, durante mais de 100 anos de comercialização de produtos farmacêuticos que contêm pancreatina, não foi relatado nenhum caso no qual os pacientes foram afetados por pancreatina contaminada com vírus. Contudo, as empre- sas produtoras de produtos farmacêuticos derivados de tecidos biológicos — e/ou fluidos corporais experimentam pressão crescente pelas entidades re- guladoras para aumentar o nível de segurança dos seus produtos reduzindo todos contaminantes até o menor nível possível, independentemente de se

. 2 ' qualquer contaminante em questão é considerado um patógeno humano ou não. Para a aplicação de pancreatina em produtos farmacológicos, é, por- tanto, desejável ter métodos analíticos confiáveis para detectar e quantificar tais contaminantes biológicos.

Até recentemente, nenhum método confiável tinha sido desen- volvido para detetctar ou separar quantitativamente contaminantes virais em uma amostra de pancreatina. Isto possivelmente deve-se ao fato de que os constituintes enzimaticamente ativos da pancreatina são incompatíveis com as linhagens de células usadas tipicamente para multiplicar vírus usando - 10 técnicas conhecidas pelos versados na área, tornando assim mais difícil ou mesmo impossível determinar a titulação viral em uma amostra de pancrea- Í tina.

Apenas recentemente, foi desenvolvido um método para permitir a separação e detecção da carga viral em uma amostra de pancreatina; vide — pedido de patente não publicado Nº POT/EP2007/054880. Entretanto, como a carga viral das preparações derivadas de animais, tais como a pancreati- na, é muito baixa, há uma necessidade contínua de se obter processos que têm alta sensibilidade para separar e determinar a carga viral em prepara- ções farmacêuticas, particularmente em preparações de pancreatina para usofarmacêutico.

Consequentemente, o objetivo da invenção foi fornecer um pro- cesso altamente sensível para separar de forma substancialmente quantita- tiva a carga viral de um espécime de pancreatina, e um processo para de- terminar quantitativamente a carga viral deste espécime de pancreatina.

Particularmente, foi um objetivo da invenção fornecer um processo para se- parar de forma substancialmente quantitativa uma carga viral infecciosa de um espécime de pancreatina, e um processo para determinar quantitativa- mente a carga viral infecciosa deste espécime de pancreatina.

Descobriu-se agora surpreendentemente que a carga viral, par- ticularmente a carga viral infecciosa, de um espécime de pancreatina pode ser determinada de forma substancialmente quantitativa com alta sensibili- dade caso a carga viral seja primeiramente separada do espécime de pan-

. 3 ' creatina em um processo de centrifugação em múltiplos estágios e a carga viral separada é então determinada quantitativamente usando métodos viro- lógicos em si conhecidos.

Uma publicação Nº JP 12856990 já descreveu um método para concentrar ou isolar vírus da hepatite por uma combinação inespecífica de centrifugação em baixa velocidade e ultracentrifugação.

Em uma primeira modalidade, a invenção refere-se a um pro- cesso para separar a carga viral de um espécime de pancreatina, compre- endendo as etapas processo: ” 10 a) produzir uma amostra líquida de pancreatina para teste, a- propriada para centrifugação, a partir do espécime de pancreatina, sem mu- ' dar a carga viral do mesmo ao fazê-lo, b) submeter pelo menos uma parte definida da amostra de pan- creatina para teste, obtida a partir do da etapa (a) do processo, a pelo me- nos uma centrifugação em baixa velocidade sob condições sob as quais os vírus com constantes de sedimentação > 120 S não formam ainda um péle- te, c) descartar qualquer depósito sólido que opcionalmente é gera- do na etapa (b) do processo durante a centrifugação em baixa velocidade, e reter um sobrenadante da amostra de pancreatina para teste, d) submeter pelo menos uma parte definida do sobrenadante da amostra de pancreatina para teste, obtido na etapa (c) do processo, a uma primeira ultracentriftugação em um meio com gradiente descontínuo, em que a duração da primeira ultracentrifugação e força centrífuga relativa para a primeira ultracentritugação são selecionadas de tal modo que a carga viral seja transportada quantitativamente para fora do sobrenadante da amostra de pancreatina em teste e para dentro de uma primeira fração-alvo situada acima ou na camada limítrofe entre o componente subjacente com gradiente de mais baixa concentração e o próximo componente subjacente com gradi- entede mais alta concentração, e separar quantitativamente a primeira fra- ção-alvo incluindo opcionalmente qualquer pélete presente depois da centri- fugação, que contém a carga viral do sobrenadante da amostra de pancrea-

' 4 ' tina em teste; e) submeter a primeira fração-alvo obtida na etapa (d) a uma segunda ultracentrifugação, por meio do que a dita segunda ultracentrifuga- ção é conduzida com uma força centrífuga relativa mais alta do que a força — centrífuga relativa da primeira ultracentritugação em um meio com gradiente do mesmo tipo usado na primeira ultracentrifugação, por meio do que o dito meio de gradiente é um meio de gradiente com concentração mais alta do que a concentração do componente de gradiente com concentração mais baixa na primeira fração-alvo, e - 10 f) obter uma segunda fração-alvo que contém a carga viral des- cartando os 75% superiores de líquido (vol/vol) ou mais da camada superior Í correspondente à primeira fração-alvo, e obter a fração mais baixa que cor- responde aos 25% mais baixos de líquido (vol/vol) ou menos da camada superior e a camada completa do meio com gradiente de concentração mais alta excluindo qualquer pélete opcionalmente presente depois da centrifuga- ção.

Em uma segunda modalidade, a invenção refere-se a um pro- cesso para determinar quantitativamente a carga viral do espécime de pan- creatina, particularmente a carga viral infecciosa do espécime de pancreati- —na.Por exemplo, na segunda modalidade, além do processo de acordo com a primeira modalidade, em uma etapa (g) do processo a ser conduzida de- pois da etapa (f) do processo, uma determinação quantitativa da carga viral do espécime de pancreatina é conduzida determinando a titulação da infec- ção do vírus na fração-alvo que contém a carga viral, permitindo determinar acarga viral infecciosa na amostra em teste.

A menos que diferentemente aqui especificado,, quaisquer ter- mos técnicos e científicos assinalados abaixo terão, em cada caso, o mes- mo significado que eles têm convencionalmente, e são entendidos pelos versados na técnica específica em questão. As faixas de temperaturas aqui citadas abaixo no formato de, por exemplo, "0—15ºC" denominam uma faixa de na faixa entre 0ºC e 15ºC estando os limites da faixa incluídos em cada caso. As faixas de tempo aqui citadas abaixo no formato de, por exemplo,

' 5 ' "30-120 minutos" denominam uma faixa de tempo entre 30 minutos e 120 minutos, estando os limites da faixa incluídos em cada caso. As faixas de tempo aqui citadas abaixo no formato de, por exemplo, "2-8 horas" denomi- nam uma faixa de tempo entre 2 horas e 8 horas, estando os limites da faixa incluídos em cada caso. As faixas de força centrífuga relativa aqui citadas abaixo no formato, de, por exemplo, "1.500-5.000 X g" denominam uma força centrífuga relativa na faixa entre 1.500 X g e 5.000 X g, estando os limites da faixa incluídos em cada caso. As faixas de volume aqui citadas abaixo no formato de, por exemplo, "10-15 mL" denominam uma faixa de - 10 volume entre 10 mililitros e 15 mililitros, estando os limites da faixa incluídos em cada caso. A medida das faixas de comprimentos aqui citadas abaixo no ' formato de, por exemplo, "80-100 mm" denomina uma medida de faixa de comprimento entre 80 milímetros e 100 milímetros, estando os limites da faixa incluídos em cada caso.

O processo de acordo com a invenção é apropriado para todos os tipos de pancreatina de origem animal e pode ser conduzido particular- mente em pancreatinas porcinas e pancreatinas bovinas comerciais con- vencionais. O processo é conduzido, de preferência, em espécimes de pan- creatina porcina.

O processo aqui descrito é geralmente apropriado para separar a carga viral de um espécime de pancreatina e para subsequentemente de- terminar quantitativamente a carga viral de um espécime de pancreatina. Particularmente, o processo é apropriado para separar e para determinar quantitativamente a carga viral de espécimes de pancreatina, no qual a car- ga viral compreende rotavírus A bovino, vírus da encefalomiocardite (= EMCV), circovírus porcino (= PCV), parvovírus porcino (= PPV), rotavírus À porcino, teschovirus porcino e/ou vírus da doença vesicular suína (= SVDV). Graças às suas propriedades muito similares, o vírus coxsackie humano B 5/1 pode ser usado como um modelo para verificar a adequabilidade do pro- — cesso de acordo com a invenção para separar e/ou determinar quantitativa- mente SVDV. Graças às suas propriedades muito similares, o rotavírus À bovino (por exemplo, cepa B 223) pode ser usado como um modelo para

: 6 ' verificar a adequabilidade do processo de acordo com a invenção para se- parar e/ou determinar quantitativamente o rotavírus A porcino. O processo aqui descrito é apropriado também para determinar a carga viral com vírus da hepatite E (= HEV) em espécime de pancreatina, separando a carga viral como descrito e subsequentemente usando outra análise que usa tecnologi- as conhecidas, por exemplo, reação de polimerase em cadeia (= "PCR") ou similares.

Na etapa a) do processo aqui descrito, uma amostra de pancre- atina líquida em teste, apropriada para centrifugação, é produzida a partir do . 10 espécime de pancreatina, sem, ao fazê-lo, mudar ou modificar a carga viral, particularmente a carga viral infecciosa do mesmo. Isto pode ser realizado, ' por exemplo, produzindo uma suspensão da amostra de pancreatina em teste a partir do espécime de pancreatina. Por exemplo, uma suspensão da amostra de pancreatina em teste é produzida combinando o espécime de —pancreatina com um meio de cultura de células, que é apropriado para a linhagem de células usada para cultivar a espécie de vírus a ser investigada, e com um ou mais antibióticos apropriados para este propósito. Em outra modalidade, a suspensão da amostra de pancreatina em teste é produzida combinando o espécime de pancreatina com uma solução salina, particu- larmente, uma solução salina tamponada com fosfato (= "PBS", pH 7,2). Ge- ralmente, todos antibióticos são apropriados para produzir a solução de an- tibiótico usada opcionalmente na etapa a) do processo. Como regra geral, são usados antibióticos de amplo espectro, ou misturas destes antibióticos de amplo espectro. Os antibióticos apropriados podem ser selecionados, por exemplo, no grupo que compreende antibióticos de beta-lactama, tais como penicilinas, cefalosporinas (incluindo oxacefemas e carbacefemas), carba- penemas e monobactamas; estreptomicina (incluindo sulfato de estreptomi- cina); neomicinas (incluindo neomicina A, neomicina B e paromomicina); canamicinas (incluindo canamicina, gentamicina, amicacina e tobramicina); — espectinomicina; tetraciclinas (incluindo tetraciclina, oxitetraciclina, doxicicli- na e minociclina); antibióticos macrolídeos (incluindo eritromicina, claritromi- cina, roxitromicina, azitromicina, josamicina e espiramicina); inibidores de

: girase (incluindo ácido nalidíxico, cinoxacina, ácido pipemídico, norfloxacina, pefloxacina, ciprofloxacina, ofloxacina e fleroxacina; antagonistas do ácido fólico (incluindo antibióticos de sulfonamidas, diamino-benzil-pirimidinas e combinações dos mesmos); cloranfenicol; lincosamidas; antibióticos glico- peptídeos (incluindo vancomicina e teicoplanina); fosfomicina; antibióticos polipeptídeos (incluindo polimixina B, colistina, bacitracina e tiroticina) e mu- pirocina. Os antibióticos preferidos são sulfato de estreptomicina e penicilina e misturas de sulfato de estreptomicina e penicilina, por exemplo, como um "coquetel" de antibióticos. O um ou mais antibióticos podem, por exemplo, - 10 ser usados em uma solução em um solvente apropriado para o um ou mais antibióticos em cada caso, isto é, como uma solução de antibióticos.

7 A suspensão da amostra de pancreatina em teste é produzida convencionalmente sob resfriamento até uma temperatura de 0-15ºC, por exemplo, até uma temperatura de 4—10ºC. Os constituintes para produzir a suspensão da amostra de pancreatina em teste são agitados convencional- mente sob resfriamento com gelo e durante pelo menos 30 minutos, por e- xemplo, 30-120 minutos, de preferência 45-90 minutos, particularmente 50 minutos ou 60 minutos. O propósito do resfriamento da suspensão da amos- tra de pancreatina em teste e do resfriamento em todas as outras etapas do processo é, em cada caso, evitar ou pelo menos reduzir substancialmente qualquer desativação indesejada da carga viral pelos constituintes enzimati- camente ativos do espécime de pancreatina.

Caso seja usado o meio de cultura de células para a preparação da suspensão da amostra de pancreatina em teste, o meio de cultura de células é, em cada caso, usado ao produzir a suspensão da amostra de pancreatina do teste na etapa a) do processo, é determinado por qual espé- cie de vírus vai ser separada e/ou determinada quantitativamente pelo pro- cesso de acordo com a invenção. A culturas de células permissivas nas quais a espécie de vírus investigada se possível inicia um efeito citopático (= CPE) são usadas para cultivar e detectar uma espécie de vírus específica. CPE é uma modificação de células infectadas com vírus, que é reconhecível por microscopia de luz. Caso uma espécie de vírus se multiplique na célula

' da cultura sem CPE, esta multiplicação pode ser em geral, contudo, identifi-

cada per se por métodos de detecção indireta.

Caso, por exemplo, o rotavírus A bovino vá ser separado e/ou determinado quantitativamente, podem ser usadas células renais fetais do macaco (= células MA-104), por exemplo, para cultura do mesmo.

Neste caso, o Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (= meio Dulbecco) é, por e- xemplo, apropriado como meio de cultura de células.

Caso EMCV vá ser separado e/ou determinado quantitativamente, podem ser usadas células renais porcinas (= células PK-15) ou células renais porcinas embrionárias (= - 10 células SPEV) para cultura do mesmo.

No caso de células PK-15, o Meio Essencial Mínimo (= MEM) conhecido é, por exemplo, apropriado como ' meio de cultura de células.

No caso de células SPEV, o meio Dulbecco é, por exemplo, apropriado como meio de cultura de células.

Caso, por exem- plo, PCV vá ser separado e/ou determinado quantitativamente, as células PK-15, por exemplo, podem ser usadas para cultura do mesmo.

Caso, por exemplo, PPV vá ser separado e/ou determinado quantitativamente, as célu- las renais porcinas (células SK-6), por exemplo, podem ser usadas para cul- tura do mesmo.

Neste caso, o meio Dulbecco é, por exemplo, apropriado como meio de cultura de células.

Caso, por exemplo, o rotavírus A porcino vá ser separado e/ou determinado quantitativamente, as células MA-104, por exemplo, podem ser usadas para cultura do mesmo.

Caso, por exemplo, o teschovírus porcino vá ser separado e/ou determinado quantitativamente, as células PK-15, por exemplo, podem ser usadas para cultura do mesmo.

Caso, por exemplo, SVDV vá ser separado e/ou determinado quantitativa- mente, as células SPEV, por exemplo, podem ser usadas para cultura do mesmo.

Os versados na técnica devem conhecer as linhagens de células apropriadas para cultivar a espécie de vírus específica e os meios de cultura de células apropriados correspondentes.

As espécies de vírus utilizáveis de acordo com a presente invenção e as linhagens de células correspondentes — podem ser obtidas em fornecedores apropriados, por exemplo na "American Type Culture Collection", Manassas, EUA (= ATCC), em "Deutsche Sam- mlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", Braunschweig, Ale-

: 9 ' manha (= DSMZ), "Friedrich-Lóffler-Institut", Federal Research Institute for Animal Health, Insel Riems, Alemanha (= FLI) ou na"Veterinary Service Divi- sion" do "Department of Agriculture and Rural Development", Belfast, Reino Unido (= DARD).

Na etapa b) do processo, a amostra de pancreatina para teste obtida na etapa a) do processo pode ser usada na sua totalidade, ou uma parte definida da amostra de pancreatina em teste, particularmente um vo- lume definido desta amostra de pancreatina em teste, pode ser usada. À amostra de pancreatina para teste, obtida na etapa (a) do processo é usada - 10 de preferência na sua totalidade.

Na etapa b) do processo, no caso de centrifugações em baixa " velocidade, podem ser estabelecidas condições sob as quais os vírus com constantes de sedimentação > 120 S, particularmente 2 120 S a 5.000 S, ainda não formam um pélete. Usualmente, os vírus com constantes de se- —dimentação 21208, particularmente vírus com constantes de sedimentação 2 120 S a 5.000 S, ainda não formam péletes quando as centrifugações em baixa velocidade são conduzidas com uma força centrífuga relativa, em ca- da caso, menor do que 15.000 x g, de preferência, em cada caso, 8.000

15.000 x g, particularmente, de preferência, em cada caso, 10.000-13.500 x g,porexemplo, em cada caso, 10.800 x 9. A duração de uma etapa de cen- trifugação em baixa velocidade equivale convencionalmente pelo menos 5 minutos, usualmente 5-60 minutos, particularmente 10-45 minutos, de pre- ferência 10-30 minutos, por exemplo, 15 minutos. Em uma modalidade pre- ferida da etapa b) do processo, as etapas de centrifugação em baixa veloci- — dade são conduzidas sob resfriamento até uma temperatura de 0-15ºC, por exemplo, até uma temperatura de 4—10ºC, de preferência em uma centrífu- ga refrigerada. O propósito das etapas de centrifugação em baixa velocidade na etapa b) do processo é principalmente remover da suspensão de pancreati- naos constituintes da pancreatina tais como partículas insolúveis, etc., que são rompedoras na separação e/ou determinação quantitativa da carga viral de um espécime de pancreatina, para obter um sobrenadante da amostra

: 10 ' de pancreatina para teste, que é apropriado para processamento adicional. Os depósitos sólidos obtidos opcionalmente nas etapas de centrifugação em baixa velocidade são, assim, geralmente descartados na etapa c) do pro- cesso, enquanto que o sobrenadante é usado para a próxima etapa d) do processo. As etapas de centrifugação em baixa velocidade com o subse- quente descarte de depósitos sólidos opcionalmente obtidos são convencio- nalmente repetidas até que não sejam mais observados depósitos sólidos. Usualmente, nenhuma outra repetição será necessária depois de 1-3 repeti- ções, particularmente depois de apenas uma repetição das etapas de centri- - 10 fugação em baixa velocidade com subsequente descarte de depósitos sóli- dos opcionalmente obtidos. Em uma modalidade da invenção, um depósito : sólido como obtido na etapa b) do processo pode ser um sedimento ou péle- te.

Em uma modalidade da invenção, o depósito obtido em etapas de centrifugação em baixa velocidade é lavado uma vez ou mais, por exem- plo 1-3 vezes, com um fluido de lavagem antes de ser descartado. Um fluido de lavagem apropriado é, por exemplo, o sobrenadante da amostra de pan- creatina em teste, obtido depois da centrifugação em baixa velocidade em si, que pode ser então usado na etapa d) do processo. Caso um fluido de lavagem diferente do sobrenadante da amostra de pancreatina do teste em si seja usado, o dito fluido de lavagem é combinado, depois que a lavagem do depósito se completar, com o sobrenadante da amostra de pancreatina em teste, e depois usado em uma etapa d) do processo. É particularmente vantajoso lavar o depósito da maneira assinalada acima antes de usar na etapad)do processo, caso a carga viral do espécime de pancreatina com- preenda EMCV.

Em uma modalidade específica, a invenção compreende tam- bém um sobrenadante da amostra de pancreatina em teste, que pode ser produzido de acordo com as etapas a)-c) do processo indicadas acima.

Um gradiente de sacarose descontínuo com duas fases é usado convencionalmente como o meio de gradiente descontínuo na etapa d) do processo. O meio com gradiente descontínuo compreende, de preferência,

. 111 ' um gradiente preparado a partir de uma solução de sacarose tamponada a 50% (peso/volume)em uma solução de sacarose tamponada a 20% (pe- so/volume). Tampões neutros (isto é, tempão com um valor de pH de cerca de 7) podem, por exemplo, ser usados como o tampão para as soluções de sacarose. Um tampão de PBS é, de preferência, usado. Meios com gradien- te estéreis são usualmente utilizados. Um gradiente de sacarose descontí- nuo com duas fases do tipo assinalado acima proporciona uma sedimenta- ção particularmente apropriada, e assim sendo, podem ser encontradas condições para os vírus. Os gradientes de sacarose descontínuos, particu- . 10 larmente um gradiente como descrito acima preparados a partir de uma so- lução de sacarose a 50% (peso/volume) opcionalmente tamponada e uma S solução de sacarose tamponada a 20% (peso/volume), e além disso, apre- sentam condições osmóticas apropriadas para não desativar qualquer carga viral opcionalmente presente. Uma ultracentrifugação de acordo com a eta- pad) do processo assegura, por exemplo, que a carga viral originária do espécime de pancreatina seja transferida de forma substancialmente quanti- tativa do sobrenadante da amostra de pancreatina em teste para dentro do meio com gradiente descontínuo. O termo "substancialmente quantitativa" significa neste caso que uma carga viral adicionada anteriormente a uma amostra do teste é tão inteiramente recuperada que a diferença de titulação na carga viral adicionada e naquela recuperada depois que a ultracentrifu- gação foi conduzida é igual ou menor do que uma meia metade de etapa do logaritmo decimal da titulação do vírus (= 0,5 log etapas). A primeira ultra- centrifugação de acordo com a etapa d) do processo assegura ainda que a carga viral seja transportada para dentro de uma primeira fração-alvo que é suficientemente distante da amostra de pancreatina em teste, para permitir a separação mecânica da mesma da amostra de pancreatina em teste, sem que seja possível qualquer nova mistura das fases rompedoras para que a separação ocorra.

A etapa d) do processo é conduzida convencionalmente introdu- zindo um volume do meio com gradiente de concentração mais alta dentro de um tubo de ultracentrífuga sobre o qual é acamado um volume do meio

' com gradiente com a próxima concentração mais baixa. Este processo é repetido tantas vezes quanto desejado para obter um meio com gradiente de múltiplas fases sendo que a camada final (topo) é um volume de amostra de pancreatina líquida em teste para centrifugação da qual a carga viral vai ser separada. No caso de um meio com gradiente de duas fases, o volume do meio com gradiente da próxima concentração mais baixa é então imedia- tamente sobreposto com um volume de uma amostra de pancreatina líquida do teste ou de uma suspensão da amostra de pancreatina em teste (volume da amostra de pancreatina para teste) que é apropriado para centrifugação.

. 10 —Nocaso de um meio com gradiente de duas fases, isto produz uma sequên- cia de fases no tubo da ultracentrifuga a partir do topo para baixo até uma : primeira camada que compreende o volume da amostra de pancreatina do teste (topo), depois o volume do meio com gradiente de concentração mais baixa (na metade; por exemplo, uma solução de sacarose tamponada a 20% (peso/volume)) e finalmente o volume do meio com gradiente de con- centração mais alta (fundo, cobrindo a base do tubo da ultracentrífuga; por exemplo, uma solução de sacarose a 50% (peso/volume)). Quando os vo- lumes individuais são sobrepostos, deve-se tomar cuidado para assegurar que não ocorra turbulência ou intermistura nas respectivas interfaces.

A primeira fração-alvo na etapa (d) do processo compreende tipicamente (i) uma parte do meio com gradiente de concentração mais bai- xa suficientemente longe e distante do volume da amostra de pancreatina do teste, e (ii) o volume completo do meio com gradiente da próxima con- centração mais alta. No caso de um meio com gradiente de duas fases, a fração-alvo compreende, por exemplo, uma parte do meio com gradiente da concentração mais baixa suficientemente longe e distante do volume da amostra de pancreatina do teste e o volume completo do meio com gradien- te de concentração mais alta que se estende para baixo na direção do fundo do tubo da ultracentrífuga opcionalmente junto com o pélete no fundo do ditotubo.

Quando se calcula a localização da primeira ou segunda fração fração-alvo que fica suficientemente distante do volume da amostra de pan-

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' creatina em teste, permitindo desta forma a separação subsequente, deve- se levar em consideração que os valores calculados para a posição das par- tículas (isto é, a posição das partículas virais separadas da amostra de pan- creatina) usualmente denotam os vértices de uma distribuição gaussiana.

Assim sendo, as partículas ficarão distribuídas acima e abaixo da sua posi- ção calculada.

É assim necessário quando se determina a distância deseja- da entre a fração-alvo e o volume da amostra de pancreatina em teste incluir uma margem adicional para levar em conta a distribuição gaussiana das localizações das partículas.

A carga viral é transportada convencionalmente - 10 paradentrode uma fração-alvo que está suficientemente distante do volume da amostra de pancreatina em teste para separação subsequente caso par- Ú tículas com uma constante de sedimentação > 120 S, particulamente > 120 S a 5.000 S, tenham migrado do volume da amostra de pancreatina em tes- te em pelo menos 10 mm, por exemplo, pelo menos 15 mm, pelo menos 20 mm, pelo menos 25 mm ou pelo menos 30 mm, para dentro do meio com gradiente de concentração mais baixa devido à ultracentrifugação.

No caso de um meio com gradiente de duas fases descrito anteriormente, o meio com gradiente de concentração mais baixa e a solução de sacarose tampo- nada a 20% (peso/volume). Em uma variante da etapa de ultracentrifuga- ção, substancialmente todas as partículas com uma constante de sedimen- tação 2 120 S, particularmente 2 120 S a 5.000 S, atravessaram completa- mente o meio com gradiente de concentração mais baixa e são concentra- das na camada limítrofe ao meio com gradiente de próxima concentração mais alta (isto é, sobre um "colchão de sacarose"). Os versados na técnica conhecem as maneiras apropriadas para calcular e implementar as condi- ções correspondentes para a ultracentrifugação.

As condições apropriadas para a ultracentrifugação podem ser determinadas baseadas nas caracterís- ticas do vírus ou dos vírus a serem separados da amostra de pancreatina (por exemplo, densidade e constante de sedimentação), quando aplicável, — presumindo simplificações conhecidas per se (vide, por exemplo, Lebowitz et al., "Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial re-

view"; Protein Science 11:2067-2079 (2002)).

. 14 ' Desde que a primeira ultracentrifugação seja conduzida usando razões volumétricas convencionais e no meio com gradiente descontínuo, de preferência no gradiente de sacarose descontínuo com duas fases, a carga viral é transportada convencionalmente para dentro de uma primeira fração-alvo apropriada para separação subsequente pela segunda ultracen- trifugação, caso a primeira ultracentriftugação seja conduzida por um período com duração de pelo menos 1 hora, usualmente pelo menos 4 horas, tal como pelo menos 9 horas, por exemplo uma duração de 9-20 horas, parti- cularmente uma duração de 12-18 horas. Uma força centrífuga relativa a- . 10 —propriada para a primeira ultracentrifugação aqui descrita é pelo menos

50.000 X g e/ou abaixo de 150.000 X g. Em uma modalidade da primeira Ú etapa de ultracentrifugação, a dita etapa é conduzida por um período com uma duração de 12-18 horas com uma força centrífuga relativa de 50.000

150.000 X g em razões volumétricas convencionais para conduzir a ultra- centrifugação em um gradiente preparado a partir de uma solução de saca- rose tamponada a 50% (peso/volume) e uma solução de sacarose tampo- nada a 20% (peso/volume). Em outra modalidade da primeira etapa de ul- tracentrifugação, a dita etapa é conduzida por um período com uma duração de 15-17 horas com uma força centrífuga relativa de 70.000—120.000 X g em razões volumétricas convencionais para conduzir a ultracentrifugação em um gradiente preparado a partir de uma solução de sacarose tamponada a 50% (peso/volume) e uma solução de sacarose tamponada a 20% (pe- so/volume). As razões volumétricas convencionais para conduzir a ultracen- trifugação são obtidas, por exemplo, caso sejam usados tubos convencio- nais de ultracentrifugação. Os tubos convencionais de ultracentrifugação são neste caso, por exemplo, considerados aqueles com um volume de 10- 50 mL, particularmente 25-50 mL. Desde que um tubo de ultracentrifugação seja usado na etapa d) do processo, o volume do meio com gradiente de concentração mais alta (por exemplo, uma solução de sacarose tamponada a 50% (peso/volume)) pode equivaler, por exemplo, a 2 mL, o volume do meio com gradiente da próxima concentração mais baixa (por exemplo, uma solução de sacarose tamponada a 20% (peso/volume)) pode equivaler, por

: 15 ' exemplo, a 14 mL e o volume da amostra de pancreatina para teste pode equivaler, por exemplo, a 17 mL.

A segunda ultracentrifugação é conduzida na etapa e) usando a primeira fração-alvo obtida na etapa d) e colocando a dita primeira fração- —alvosobre um colchão de meio com gradiente. O dito colchão de meio com gradiente é constituído, por exemplo, do meio com gradiente do mesmo tipo usado na primeira ultracentrifugação, com o que o dito meio de gradiente é um meio com gradiente de concentração mais alta do que a concentração do componente com gradiente de concentração mais baixa da primeira fra- - 10 —ção-alvo. Por exemplo, caso a primeira ultracentrifugação seja uma centrifu- gação com gradiente descontínuo, usando o sistema descrito acima de uma Ú solução de sacarose tamponada a 20% (peso/volume) e uma solução de sacarose tamponada a 50% (peso/volume), a primeira fração-alvo resultante é um sistema que contém uma solução de sacarose tamponada com uma concentração mais alta do que 20% (peso/volume) e abaixo de 50% (pe- so/volume). Neste caso, o colchão de sacarose pode ser uma solução de sacarose tamponada a 50% (peso/volume). A primeira fração-alvo usada na etapa d) usualmente compreende também qualquer pélete opcionalmente presente depois da primeira centrifugação.

A segunda ultracentrifugação é conduzida por um período com duração de pelo menos 1 hora, usualmente pelo menos 2 horas, por exem- plo, uma duração de 2-8 horas, particularmente uma duração de 3-6 horas. Uma força centrífuga relativa para a segunda ultracentrifugação aqui descri- ta é de pelo menos 100.000 X 9, por exemplo, acima de 150.000 X g, tal como 150.000-350.000 X g. Em uma modalidade da segunda etapa de ul- tracentrifugação, a dita etapa é conduzida por um período com uma duração de 3-6 horas com uma força centrífuga relativa de 200.000—-350.000 X gem razões volumétricas convencionais para conduzir a ultracentrifugação. Em outra modalidade da segunda etapa de ultracentrifugação, a dita etapa é conduzida por um período com duração de 4,5-5,5 horas com uma força centrífuga relativa de 250.000-300.000 X g em razões volumétricas conven- cionais para conduzir a ultracentrifugação. As razões volumétricas conven-

: 16 ' cionais para conduzir a ultracentrifugação são obtidas, por exemplo, caso sejam usados tubos convencionais de ultracentrifugação.

Os tubos conven- cionais de ultracentrifugação são neste caso, por exemplo, aqueles com um volume de 10-15 mL, particularmente 12-13 mL; um raio interno de 6-8 mm, particularmente de 7 mm; e uma altura de 80-100 mm, particularmente de 85-95 mm.

Desde que um tubo convencional de ultracentrifugação seja usado na etapa d) do processo, o volume do colchão de gradiente (por e- xemplo, uma solução de sacarose tamponada a 50% (peso/volume) pode equivaler, por exemplo, a 0,5 mL, e o volume da primeira fração-alvo pode . 10 equivaler, por exemplo, a 10 mL.

A presente invenção permite a detecção até um limite de detec- Ú ção de uma unidade infecciosa por grama de espécime de pancreatina usa- do como matéria-prima.

Em uma variante preferida das modalidades das etapas d) e e) do processo, independentemente das condições selecionadas de outra for- ma, a ultracentrifugação é conduzida sob resfriamento até uma temperatura de 0-15ºC, de preferência até uma temperatura de 4—10ºC.

As centrífugas refrigeradas convencionais que podem ser usa- das nesta etapa do processo são conhecidas pelos versados na técnica.

Uma ultracentrífuga convencional existente no mercado é usada convencio- nalmente nas etapas d) e e) do processo, tal como a ultracentrífuga refrige- rável com um rotor de balde oscilante, por exemplo, uma ultracentrífuga da Sorvall? com um rotor de balde oscilante modelo "TH-641". A descrição feita acima das etapas de centrifugação em baixa velocidade e etapas de ultracentrifugação, de acordo com a invenção, pode ter sua escala aumentada ou diminuída em qualquer grau desejado pelos versados na técnica, particularmente com o auxílio de outras informações técnicas assinaladas na descrição da presente invenção.

Nas etapas d) e f) do processo, a primeira ou segunda fração- alvo que contém a carga viral é separada quantitativamente em cada caso do sobrenadante da amostra de pancreatina do teste e da primeira fração- alvo.

A separação ocorre usualmente colocando uma marca no tubo da ul-

: 17 Ú tracentrífuga na altura do limite determinado anteriormente da fração-alvo.

O volume inteiro acima deste limite é então separado do volume remanescen- te, por exemplo, sendo aspirado.

A aspiração pode ocorrer, por exemplo, com uma bomba peristáltica convencional, cujas tubulações e capilares fo- ram antes esterilizados convenientemente.

Uma vazão de bombeamento é, por exemplo, uma vazão de 2 mL/minuto.

Durante a aspiração, deve-se to- mar cuidado para assegurar que o capilar da bomba peristáltica fique sem- pre localizado na borda superior do líquido.

A fração-alvo remanescente no tubo da ultracentrífuga pode ser então removida do tubo da ultracentrífuga . 10 deuma maneira conhecida per se com uma pipeta com um único canal con- vencional, de preferência com um bico estéril.

Qualquer sedimento possi- : velmente ainda existente remanescente no tubo da ultracentífuga pode ser removido na mesma hora, por exemplo, sendo repetidamente arrastado pa- ra cima e colocado novamente em suspensão com a pipeta de canal único.

Em uma modalidade, a invenção fornece também uma segunda fração-alvo isolada que pode ser produzida de acordo com as etapas a)-f) do processo.

Caso um processo para determinar quantitativamente a carga viral do espécime de pancreatina vá ser conduzido, uma etapa g) do proces- soé realizada depois da etapa f) do processo.

Na etapa g) do processo, a carga viral do espécime de pancreatina é determinada quantitativamente determinando a titulação da infecção do vírus na fração-alvo que contém a carga viral.

A determinação quantitativa da titulação da infecção do vírus na fração-alvo pode prosseguir neste caso de acordo com os processos de e- laboração conhecidos per se em virologia, por exemplo, de acordo com o princípio conhecido de determinação da titulção de infecção do vírus (= VITD). A segunda fração-alvo pode, por exemplo, ser diluída em uma proporção apropriada com um meio de cultura de células ou solução salina apropriada, por exemplo, PBS, para obter uma amostra de teste para de- terminação do vírus.

Os meios de cultura de células apropriados são aque- les assinalados acima como sendo utilizáveis, em cada caso, em função da

. 18 ' espécie de vírus investigada. Em uma modalidade da invenção, para impedir os acertos falso-positivos para a infecção do vírus, a fração-alvo diluída ou não-diluída pode ser filtrada através de um microfiltro antes que a determi- nação quantitativa da carga viral seja conduzida na etapa g) do processo.

Uma diluição apropriada pode, por exemplo, ser conseguida di- luindo a fração-alvo com o meio de cultura de células ou com a solução sali- na até o volume original do sobrenadante da amostra de pancreatina do tes- te usado na etapa d) do processo. Depois, em uma primeira etapa, uma sé- rie de diluições das amostras do teste para determinação do vírus pode ser . 10 primeiramente produzida de uma maneira conhecida per se, por exemplo, em etapas de diluição de 1:2, 1:5 ou 1:10 ou também em combinações des- ' tas etapas de diluição, para conduzir uma VITD quantitativa. Depois, em uma segunda etapa, uma suspensão de células apropriada pode ser inocu- lada de uma maneira conhecida per se com as amostras do teste para de- terminação do vírus de diferentes concentrações a partir da série de dilui- ções, após o que uma camada de células é deixada se formar sobre as a- mostras do teste para determinação do vírus de diferentes concentrações.

Para impedir acertos falso-positivos para a infecção do vírus que podem ser causados pela presença de micróbios tais como bactérias ou micoplasmas inertes, é então usualmente conveniente filtrar as amostras do teste para determinação do vírus antes de inoculá-las sobre as células detectoras. Pa- ra esta finalidade, uma amostra do teste para determinação do vírus ou uma amostra do teste diluída para determinação do vírus pode ser filtrada atra- vés de um filtro com tamanho de poro apropriado, tal como um microfiltro, por exemplo um microfiltrto com um tamanho de poro (isto é, diâmetro de poro) entre 0,1 e 10 um (limites da faixa incluídos; = microfiltração), de pre- ferência entre 0,1 e 0,45 um, usualmente um microfiltro com um tamanho de poro (isto é, diâmetro de poro) de 0,1 um. O filtrado pode ser então usado como uma amostra de teste para investigações adicionais. Depois, em uma terceira etapa, as amostras para teste inoculadas são lidas quanto ao seu grau de infecção dependendo da maneira na qual sua infecção está indica- da. Quando, por exemplo, a CPE pode ser usada como um indicador de in-

: 19 , fecção de uma camada celular, a CPE é lida da maneira conhecida per se depois de aproximadamente 4-7 dias. A titulação (diluição no ponto final) das amostras em teste para determinação do vírus neste caso permite a determinação quantitativa da dose de infecção originalmente presente. A titulação é realizada convencionalmente por diluição por um fator de 10, isto é, baseado no logaritmo decimal. Na prática, a dose de infecção de 50% (= Dlso) é calculada usualmente. No caso de múltiplos lotes paralelos, o valor de Dlso identificado então corresponde àquele da diluição mais alta (recípro- ca) da amostra em teste para determinação do vírus na qual uma CPE é . 10 detectável em exatamente metade dos lotes. Os resultados podem ser além disso opcionalmente corrigidos por computador ou interpolados de uma ma- ] neira conhecida per se. Os métodos mais comumente usados para calcular a titulação de vírus são aqueles de acordo com Spearman e Kârber (vide C. Spearman, Br. J. Psychol. 2 (1908) 227-242 e G. Kârber, Arch. Exp. Path. — Pharmak. 162 (1931) 480-483; vide também Bundesanzeiger [Federal gazet- : te] Nº 84, 4 de maio de 1994) ou de acordo com Reed e Muench (vide Reed, : L.J., Muench, H. Am. J. Hyg. 27 (1938) 493-497). Outros indicadores de uma infecção da camada celular também podem ser usados, por exemplo, indução de antígeno do vírus ou indução de placas. Os versados na técnica conhecem estes métodos e suas aplica- ções no presente caso, por exemplo, obtidos em livros de texto de virologia, tais como "Medizinische Virologie" por H.W. Doerr e W.H. Gerlich, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1º edição 2002 ou em cada caso sua edição mais recente.

O método de acordo com a presente invenção é particularmente útil para analisar grandes quantidades de espécimes de pancreatina como matéria-prima. Usar grandes quantidades de matéria-prima usualmente per- mite determinar a carga viral com uma sensibilidade mais alta, a saber, para determinar unidades infecciosas mais baixas por grama. Assim sendo, o —método de acordo com a presente invenção é particularmente útil para ma- térias-primas de pelo menos 5 g, por exemplo, de 8 9, 10 g ou 12 g.

EXEMPLOS

. 20 , Todas tarefas mencionadas nos exemplos que se seguem foram conduzidas sob condições estéreis sobre uma bancada esterilizada. Os pro- cedimentos convencionais em laboratórios de virologia, por exemplo, proce- dimentos de segurança devem ser observados. Os seguintes materiais, inter alia foram usados:

1. Solução de antibióticos, 1,0 g de sulfato de estreptomicina e 1,2 g de penicilina são usados em 20 mL de água bidestilada e filtrados a- través de um filtro de 0,2 um. Os filtrados são então divididos em alíquotas de 1 mL e opcionalmente estocados a —20ºC até o uso; . 10 2. Meio de Dulbecco, meio de cultura de células para células SK 6, células SPEV e células MA 104; ' 3. Pipeta de canal único, com bicos estéreis;

4. FCS, soro fetal vitelínico (por exemplo, da Bio Whittaker; = soro).

5. Frascos para cultura de tecidos, estéreis, área da base dos frascos em cada caso 25, 75 ou 175 cm?;

6. MEM, meio de cultura de células para células PK-15 com 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e piruvato a 1 mM;

7. Placas para microtitulação, estéreis com 96 poços e tampa;

8. Suspensão de PAN , suspensão de pancreatina a 10%; 8,0 g de pancreatina porcina (a menos que diferentemente assinalado) pesados sob condições estéreis dentro de um bécher, combinados com 8 mL de so- lução de antibióticos e (a menos que diferentemente assinalado) 64,0 mL do meio de cultura de células específico correspondente ou PBS e (a menos que diferentemente assinalado) em suspensão dentro de 60 minutos em um —banhode gelo sob agitação;

9. Tampão de Pardee, tampão de dióxido de carbono de Pardee;

10. PBS, solução "salina tamponada com fosfato" estéril (pH 7,2);

11. Pipetas, estéreis;

12. Bicos de pipeta, estéreis em bandejas estéreis;

13. Bolsas de plástico, impermeáveis a CO? com fecho ("Anae- rocult*", da Merck);

14. Conjugado de anticorpo policlonal anti-PPV com isotiociana-

] to de fluoresceína (= FITC), da NatuTec GmbH;

15. Tubos, estéreis, 15 e 50 mL;

16. Solução de sacarose, 20%, tamponada com PBS, estéril; a concentração é ajustada de uma maneira conhecida per se com o auxílio de umrefratômetro convencional;

17. Soluções de sacarose, 50%, estéril tamponada com PBS; a concentração é ajustada de uma maneira conhecida per se com o auxílio de um refratômetro convencional;

18. Tubos com topo de rosca, estéreis; . 10 19. Solução de tripsina, "Trypl. Expressº", da INVITROGEN;

20. Bomba peristáltica, da "ismaTec", vazão de bombeamento : de até 5,8 ml/minuto;

21. Ultracentrífuga refrigerada, "Sorvalf? Pro 80" com rotor "TH-641 |

22. Tubos de ultracentrífuga, estéreis, capacidade 11 mL, di- mensões9x90mm

23. Blocos de diluição, 96 poços, cada um de 1,0 mL;

24. Células MA-104: fornecidas por FLI;

25. Células PK-15: fornecidas por DARD;

26. Células SK-6: fornecidas por FLI;

27. Células CSPEV: fornecidas por FLI;

28. Suspensões de células das células SK 6, SPEV e PK-15 a serem testadas com 200.000 células/mL em meio de cultura de células com 10% de FCS;

29. Microtubos Falcon estéreis, capacidade 15 mL.

Exemplo 1: investigação do efeito nocivo de pancreatina sobre várias linha- gens de células Com o propósito de detectar vírus em amostras do material do teste usando culturas de células, o efeito nocivo do espécime de pancreati- na a ser investigado sobre as células deve ser determinado para ser possí- vel eliminar resultados falso-negativos quando se avalia as CPEs. Como assinalado abaixo, as investigações para determinar o efeito nocivo de uma suspensão da amostra de pancreatina em teste foram consequentemente

' conduzidas em várias linhagens de células.

Porções de 0,5 mL de uma suspensão de PAN produzida acima foram separadas para testar o efeito nocivo e designadas "amostras para teste da suspensão de pancreatina".

Centrifugação em baixa velocidade: a suspensão remanescente de PAN foi centriftugada por 15 minutos a 10.000 rpm (10.800 X g) e 4ºC em uma centrífuga refrigerada convencional (Biofugeº 22R Heraeus SEPATE- CHº com rotor em ângulo fixo Nº 3745). O sobrenadante depois da centrifu- gação em baixa velocidade foi então centrifugado por mais 15 minutos a . 10 10.000 rpm e 4ºC, e designado "sobrenadante depois da centrifugação em baixa velocidade", usado para titulação do vírus e ultracentriftugação. Os ' dois sedimentos obtidos em cada caso depois da centrifugação em baixa velocidade foram combinados (em conjunto 1 mL), recolocados em suspen- são em 9 mL do meio de cultura de células respectivo e designado "sedi- mento" ou pélete.

A primeira ultracentrifugação: o "sobrenadante depois da centri- fugação em baixa velocidade", da amostra em teste foi submetido a uma primeira ultracentriftugação em uma ultracentrífuga. Para esta finalidade, 2 mL da solução de sacarose a 50% (peso/volume) foram introduzidos por meiode uma pipeta dentro do número de tubos da ultracentrífuga necessá- rios para conduzir o teste. Com o tubo da ultracentrífuga mantido em um ângulo oblíquo, 14 mL da solução de sacarose a 20% foram cuidadosamen- te colocados sobre o topo da camada de sacarose a 50%, ficando uma ca- mada divisora discernível entre as duas soluções. Uma camada de 17 mL —do'"sobrenadante depois da centrifugação em baixa velocidade" da amostra em teste retirada como assinalado acima foi então colocada novamente com cuidado e evitando turbulência e intermisturando, em cima da solução de sacarose a 20% (peso/volume). Os tubos da ultracentrífuga são então sus- pendidos no rotor da ultracentrífuga. Para esta finalidade, os dois tubos da ultracentrífuga em lados opostos do rotor foram, em cada caso, contraba- lançados com PBS, inseridos nos suportes correspondentes e vedados hermeticamente com a tampa associada. Depois que os suportes foram in-

: 23 ' seridos no rotor, as amostras em teste foram centrifugadas por 16 horas a 10ºC e 22.000 rpm (87.000 X g). Depois da ultracentrifugação, os tubos da ultracentrífuga foram removidos dos suportes para cima da bancada estéril e marcados em uma altura de 5 cm, medida a partir do fundo do tubo da ultra- centrífuga. Usando uma bomba peristáltica, cuja tubulação e capilares ti- nham sido previamente esterilizados, o líquido acima da marca foi aspirado do tubo da ultracentrífuga em uma vazão de bombeamento de 2 mL/minuto, com os capilares sempre localizados no borda superior do líquido. Esta pri- meira fração obtida desta maneira foi designada "fração superior depois da . 10 primeira ultracentrifugação". A "fração inferior depois da primeira ultracentri- fugação" (1,5 mL) remanescente no tubo de ultracentrífuga foi, em cada ca- ' so, removida do tubo da ultracentrífuga com o auxílio de uma pipeta de ca- nal único. Qualquer sedimento possivelmente remanescente no fundo do tubo da ultracentrífuga foi sendo recolocado em suspensão sendo repetida- mente arrastado para cima com a pipeta de canal único e similarmente re- movido. A "fração inferior depois da primeira ultracentrifugação" foi combi- nada no caso de todos os tubos e usada diretamente na segunda ultracentri- fugação. Até processamento adicional, as frações resultantes foram estoca- das a 4ºC ou, no caso de estocagem prolongada a -20ºC.

A segunda centrifugação foi conduzida em tubos de 11 mL por 5 horas a 4ºC e 272.000 X g. Um colchão de meio com gradiente de solução da sacarose a 50% (peso/volume) foi introduzido nos tubos primeiramente (0,5 mL). Depois, 5 mL da primeira fração-alvo foram acamados em cima do colchão com gradiente e a ultracentrifugação foi realizada como indicado.

—Depoisde descartar a fração superior, um volume de 1,5 mL foi removido do fundo de cada tubo excluindo o pélete.

As amostras em teste "amostra em teste da suspensão de pan- creatina", "sobrenadante depois da centrifugação em baixa velocidade", "sedimento" (depois da centrifugação em baixa velocidade), "fração superior depois da primeira ultracentriftugação" e "camada inferior depois da primeira ultracentrifugação" (depois de ser recomposta até 5,0 mL), bem como a "fração superior depois da segunda ultracentrifugação" e a "fração inferior

. 24 " depois da segunda ultracentrifugação" foram então testadas quanto ao seu efeito nocivo com relação a várias linhagens de células.

Para esta finalida- de, várias séries de diluições das amostras em teste a serem testadas fo- ram, em cada caso, produzidas.

Todas as amostras em teste a serem testa- —dasforam diluídas adicionalmente em um fator de 2 a partir de uma diluição 1:5 com o respectivo meio de cultura de células apropriado.

Em placas de microtitulação, foram adicionadas a porções de 100 ul de suspensão de células que compreendem células PK-15, SPEV ou SK 6 por poço em 8 pa- ralelas, 100 ul das diluções das amostras em teste produzidas para, em ca- . 10 dacaso,100 yL de suspensão de células recém-produzida.

Quando as célu- las MA 104 foram testadas, foram usadas placas de microtitulação com uma ' camada de células que tinha 24 horas de idade.

Para esta finalidade, o meio de cultura de células foi, em cada caso, removido dos poços e substituído por 100 ul de meio de cultura fresco sem soro, de modo a gerar diluições finaisdas amostras em teste de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 etc.

Como con- trole, 100 ul de meio de cultura de células foram introduzidos em oito poços de cada placa de microtitulação em vez de 100 uL das séries de diluições.

Pares de placas junto com um tubo contendo 4 mL de tampão de Pardee e papel de filtro foram colocados em bolsas impermeáveis ao ar e vedados hermeticamente com um grampo de selagem.

As placas foram então incu- badas a 36:+1ºC por até 7 dias.

Durante o período de incubação, as placas foram inspecionadas diariamente com um microscópio quanto ao grau de CPE, isto é, quanto à lise celular e/ou degeneração das células e a ausência da formação de uma camada celular como resultado do efeito nocivo da —pancreatina.

A avaliação final foi conduzida depois de sete dias.

A titulação foi repetida se a degeneração celular já tivesse ocorrido nos controles sobre a leitura final.

Os resultados de testar as diferentes amostras em teste quanto ao seu efeito nocivo sobre várias linhagens de células não revelou qualquer efeito nocivo da "fração inferior depois da segunda ultracentrifugação" deri- vado a partir da pancreatina sobre várias linhagens de células.

Os resultados demonstraram que, na "fração inferior depois da

. 25 ] primeira ultracentrifugação" e a "fração inferior depois da segunda ultracen- trifugação", que tinham sido submetidas à primeira ou às primeira e segunda etapas de ultracentriftugação de acordo com a invenção, respectivamente, e nas quais a carga viral foi concentrada, há uma redução considerável no efeito nocivo sobre as linhagens de células investigadas em comparação com todas as outras amostras em teste investigadas. Exemplo 2: Teste de diferentes cargas de pancreatina na carga viral O procedimento de ultracentritugação em duas etapas de acor- do com a presente invenção, como descrito acima, foi aplicado para isolar . 10 vírus de suspensões com diferentes cargas de pancreatina em pó. A sepa- ração dos vírus da pancreatina foi o pré-requisito para a detecção de baixas ' cargas de vírus por titulação em linhagens de células suscetíveis: - 8 g da substância farmacológica foram misturados com 8 ml! da solução de antibióticos (1,0 g de sulfato de estreptomicina e 1,2 g Penicilina Gpor20 mL de PBS estéril) e 64 mL de PBS, e agitados em um banho de gelo por 60 minutos - a suspensão resultante foi centrifugada a 4ºC por 15 minutos a

10.800 X g - o sobrenadante depois da primeira centrifugação foi centrifu- gado novamente a 4ºC por 15 minutos a 10.800 X q O sobrenadante resultante depois da centrifugação em baixa velocidade foi usado para uma primeira ultracentrifugação. A primeira ultra- centrifugação foi realizada com um gradiente de sacarose descontínuo (qua- tro tubos de centrifugação com 2 mL de sacarose a 50% (peso/volume) e 14 —mLde sacarose a 20% (peso/volume) cobertos com 17 mL de sobrenadante depois da centrifugação em baixa velocidade). Esta técnica permite a sepa- ração de partículas de vírus da principal parte da suspensão de pancreatina em condições correspondentes. Os vírus das misturas de vírus/suspensão de pancreatina se tornam concentrados em uma camada limítrofe entre a sacarose a 50% (peso/volume) e 20% (peso/volume) em condições apropri- adas de centrifugação. Os componentes solúveis da pancreatina permane- cem depois da centrifugação no sobrenadante acima da camada de vírus. À

' fração de vírus é separada das camadas de pancreatina por sucção fracio- nada do gradiente de sacarose.

A fração viral resultante foi ultracentrifugada novamente para concentração adicional de vírus sobre um colchão de saca- rose a 50% (peso/volume). A primeira centrifugação foi conduzida em quatro tubos de 36 mL por 16 horas a 4ºC e 87.000 X g.

Depois da centrifugação, um volume de 5 mL foi removido do fundo de cada tubo.

A segunda centrifugação foi subsequentemente conduzida em dois tubos de 11 mL por 5 horas a 4ºC e 272.000 X g.

Um volume de 1,5 mL - 10 foi removido do fundo de cada tubo.

Isto resultou em um concentrado de vírus de 3 mL que foi obtido a partir de 8 g de pancreatina em pó.

As amos- ' tras foram estocadas a -20ºC.

Ensaios de Infecciosidade O ensaio de infecciosidade baseia-se na suposição que uma baixa carga de vírus de uma amostra pode ser tornada visível por três pas- sagens consecutivas da amostra através de linhagens de células suscetí- veis.

Os vírus contidos podem infectar novas células e se tornar amplifica- dos durante estas passagens, levando a uma titulação aumentada do vírus.

Em combinação com a técnica de plaqueamento de grandes volumes, é possível detectar mesmo um único vírus infeccioso com um baixo grau de amplificação de 10 (10 vírus por 1 vírus infeccioso dentro de 6 dias de incu- bação) durante três passagens através de células pela formação de cerca de 1.000 placas sobre uma película de células depois da terceira passagem.

As frações virais extraídas das amostras de pancreatina foram, portanto, aplicadas às três passagens consecutivas sobre células SK 6 para detecção de parvovírus porcinos infecciosos. 1º Passagem - (tmL de fração de vírus = 2,66 g de pancreatina) A terceira parte de cada concentrado de vírus individual (1 mL de 3 mL) foi inoculada em um frasco de cultura de tecidos de 75 cm?, con- tendo 30 mL de meio de cultura de células com 5% de FCS e uma película de células subconfluente com 24 h de idade de células SK 6. Os frascos de cultura de células foram incubados a 37 + 1ºC por 6 dias.

. 27 : A formação de efeitos citopáticos (placas) foi verificada durante a incubação e ao final do tempo de incubação com o auxílio de um micros- cópio inverso. A passagem foi terminada com a criação de um lisado de ví- rus/células por dois ciclos de congelamento/descongelamento do conteúdo total do frasco de cultura de tecidos. O lisado de células vírus foi aplicado a uma centrifugação em baixa velocidade (2.800 x g por 15 minutos) para cri- ar um sobrenadante isento de células. Este sobrenadante depois da centri- fugação em baixa velocidade (30 mL por lote) foi filtrado através de um filtro com tamanho de poro de 0,1 um como uma etapa de segurança para redu- - 10 zZiruma possível contaminação do lisado com micoplasmas. 2º Passagem Ú Um frasco de cultura de tecidos de 75 cm? contendo 22,5 mL de meio de cultura de células com 5% de FCS e uma película de células com 24 h de idade de células SK 6 foi preparado para a segunda passagem de —cadalote. 7,5 mL do sobrenadante da cultura de células da primeira passa- gem (= 25%) foram adicionados. Os frascos foram incubados por 6 dias a 37+1ºC e verificados quanto aos efeitos citopáticos com um auxílio de um microscópio inverso. O lisado de cultura de vírus/células (30 ml por lote) foi obtido como descrito para a primeira passagem. 3º Passagem Um frasco de cultura de tecidos de 75 cm? foi preparado para cada lote, como descrito acima. 7,5 mL do lisado da cultura do vírus/células da passagem 2 (= 25%) e 22,5 mL do meio de cultura de células com 5% de FCS foram adicionados por frasco. Os frascos foram incubados por 6 dias a 37+1ºC e inspecionados quanto aos efeitos citopáticos com o auxílio de um microscópio inverso. O lisado da cultura de de vírus/células (30 mL por lote) foi prepa- rado como descrito para as passagens 1 e 2.

4. Detecção de parvovírus porcino (PPV) por imunocoloração com anticorpos anti-PPV conjugados com FITC Placas de microtitulação com 96 poços e uma película de célu-

las com 24 horas de idade de células SK 6 foram preparadas. 30 cavidades foram infectadas com 100 ul de cada um dos lisados de cultura de ví- rus/células da passagem 3 (= 10%) e incubadas a 37+1ºC por 24 horas. Depois da incubação, o sobrenadante da cultura de células foi removido das células, e a película de células foi fixada por uma mistura ge- lada de 80% de acetona e 20% de metanol. 100 ul. de solução de anticorpo anti-PPV conjugado com FITC por cavidade foram adicionados e as placas foram incubadas por 45 minutos a 37+1ºC. Depois de remover a solução de anticorpo, a película de células foi lavada 3 vezes com PBS e coberta com - 10 glicerina a 15% em PBS. A detecção de células infectadas por parvovírus foi conduzida com o auxílio de um microscópio inverso em luz UV.

í Em paralelo com as amostras de pancreatina, parvovírus porci- no NADL-2 com titulação conhecida foi titulado nas mesmas placas de mi- crotitulação como controle positivo.

Todos os itens do teste foram passados em células SK 6 em paralelo com os controles positivos como descrito. Desta forma, foi possível comparar a formação de placas/efeitos citopáticos típicos para Parvovirus porcino entre as amostras de pancreatina e os controles positivos.

Os resultados da cultura estão indicados na tabela 1. Tabela 1: Resultados da passagem dos itens do teste em células SK 6 em frascos de cultura de tecidos Número Passagem de frações virais de amostras de pancreatina em do Lote de | frascos de cultura de células com células SK 6 com inspeção pancreati- quanto aos efeitos citopáticos na em pó 0436 nenhuma CPE | Nenhuma CPE detec- Nenhuma CPE detectada tada típica detectada, mas ligeira dege- neração de células 6 dias depois da infecção 0437 nenhuma CPE | Placas únicas em pelí- | 30% da película de detectada cula celular 4 dias de- | células com placas pois da infecção, mas 6 dias depois da CPE não-confluente 6 infecção dias depois da infecção do Lote de | frascos de cultura de células com células SK 6 com inspeção pancreati- quanto aos efeitos citopáticos | detectada ção, 80% da película de | infecção, formação células com placas, de placas visíveis; CPE confluente 6 dias | CPE confluente 4 depois da infecção dias depois da in- fecção Na primeira passagem dos três itens do teste, nenhuma CPE foi detectada 6 dias depois da infecção.

Nenhuma CPE era detectável durante três passagens da amos- x tra 0436. Apenas na terceira passagem da amostra 0436 uma ligeira dege- neração que era, entretanto, idêntica aos efeitos citopáticos observados das amostras 0437 e 0438 foi encontrada.

s Placas únicas na película celular foram observadas durante a segunda passagem da amostra 0437 quatro dias depois da infecção. 6 dias depois da infecção aproximadamente 20% da película de células no frasco apresentaram CPE. Depois da terceira passagem da amostra, cerca de 30% da película de células apresentaram efeitos citopáticos/placas.

Placas únicas foram observadas 3 dias depois da infecção du- rante a segunda passagem da amostra 0438. No curso de outra passagem a formação de placas continuou e levou à CPE quase confluente.

Na terceira passagem uma clara CPE foi detectada 2 dias de- pois da infecção. A incubação foi encerrada 4 dias depois da infecção com uma CPE confluente.

Depois da terceira passagem em frascos de cultura de tecidos, o lisado da cultura de vírus/células da terceira passagem foi transferido para placas de microtitulação com película de células SK 6: 30 vezes 100 uL por lote dentro de 30 poços em duas paralelas. Um controle positivo de Parvovirus porcino NADL-?2 foi titulado nas mesmas placas.

As placas foram incubadas a 37+1ºC, a primeira placa para ob- servar efeitos citopáticos, e a segunda placa para detecção de Parvovirus

' porcino por imunocoloração.

A primeira placa foi incubada por 6 dias. Ao final da incubação, as amostras 0437 e 0438 apresentavam o mesmo efeito citopático que o PPV do controle positivo.

' 5 NADL-2. A amostra 0436 não apresentou qualquer CPE.

O sobrenadante da cultura da segunda placa de microtitulação foi removido 24 horas depois de iniciar a incubação. O curto tempo de incu- bação deveria reduzir a capacidade de detecção de células com infecções secundárias por parvovírus que foram liberados a partir das células com in- - 10 fecção primária. A película celular foi fixada e corada com anticorpo anti- . PPV conjugado com FITC e verificada quanto a células infectadas com o $ auxílio de um microscópio inverso em luz UV. Isto corresponde a uma titula- . ção de placa e fornece a possibilidade de detectar a titulação do vírus do | lisado da terceira passagem.

' 15 Os seguintes resultados foram obtidos: Nenhuma das 30 cavidades que foram infectadas com o lisado de vírus isento de células da terceira passagem da amostra 0436 continha células fluorescentes distintas.

Além dos 3 mL (= 10%) testados, outros 30 X 100 uL do lisado devírusisento de células foram transferidos para dentro da placa de microti- tulação com película de células SK 6, incubados por 24 horas a 37+1ºC, fi- xados e corados com anticorpo anti-PPV. Células não-infectadas foram en- contradas nestas 30 cavidades adicionais.

Este resultado correlaciona-se com os resultados de passar a amostra 0436 em frascos de cultura de tecidos e depois da terceira passa- gem em placas de microtitulação para detecção de efeitos citopáticos.

No caso das amostras 0437 e 0438 todas 30 cavidades que fo- ram coradas com anticorpo anti-PCV continham células fluorescentes distin- tas, tal como o controle positivo PPV NADL-2.

Como demonstrado acima, o processo de acordo com a presen- te invenção permite identificar uma unidade infecciosa por 1 g de pancreati- na, e assim sendo, fornece um processo altamente sensível para separar de i 1 31

Ú determinar a carga viral de um espécime de pancreatina.

Além disso, em contraste com os processos baseados em métodos de biologia molecular, tais como a detecção de moléculas de ácidos nucleicos, baseados em mé- : todos de amplificação, tal como PCR, o processo de acordo com a presente invenção permite determinar unidades infecciosas.

É, portanto, possível di- ferenciar entre carga viral infecciosa e não-infecciosa ou carga viral total de-

terminada por técnicas de biologia molecular.

Em outra modalidade, as passagens e a detecção podem ser realizadas na forma de etapas (como descrito acima) ou em uma aborda- - 10 gem paralela.

O termo "abordagem paralela" significa que, enquanto uma & passagem é realizada a carga viral da passagem anterior já pode ser deter- ». minada.

Usando esta abordagem, um resultado pode ser obtido a partir de todas passagens e se o resultado obtido a partir da primeira passagem é atingido até um ponto no tempo anterior àquele usando a abordagem na ' 15 forma de etapas.

Isto poderia ser de importância, por exemplo, para aumen- tar a eficiência temporal e/ou por exemplo para a segurança de qualidade em processos de fabricação, pois a respectiva amostra ou produto pode ser liberado em um ponto mais cedo no tempo.

Claims (11)

' REIVINDICAÇÕES

1. Processo para separar uma carga viral de um espécime de pancreatina, compreendendo as etapas de: a) produzir uma amostra líquida de pancreatina para teste, a- propriada para centrifugação, a partir do espécime de pancreatina, sem mu- dar carga viral do mesmo ao fazê-lo, b) submeter pelo menos uma parte definida da amostra de pan- creatina para teste, obtida a partir do da etapa a) do processo, a pelo menos uma centrifugação em baixa velocidade sob condições sob as quais os vírus & 10 com constantes de sedimentação 2 120 S não formam ainda um pélete, : c) descartar qualquer depósito sólido que opcionalmente é gera- í do na etapa b) do processo durante a centrifugação em baixa velocidade, e reter um sobrenadante da amostra de pancreatina para teste, d) submeter pelo menos uma parte definida do sobrenadante da amostra de pancreatina para teste, obtido na etapa (c) do processo, a uma primeira ultracentrifugação em um meio com gradiente descontínuo, em que a duração da primeira ultracentrifugação e força centrífuga relativa para a primeira ultracentrifugação são selecionadas de tal modo que a carga viral seja transportada quantitativamente para fora do sobrenadante da amostra de pancreatina em teste e para dentro de uma primeira fração-alvo situada acima ou na camada limítrofe entre o componente subjacente com gradiente de mais baixa concentração e o próximo componente subjacente com gradi- ente de mais alta concentração, e separar quantitativamente a primeira fra- ção-alvo incluindo opcionalmente qualquer pélete presente depois da centri- —fugação, que contém a carga viral do sobrenadante da amostra de pancrea- tina em teste; e) submeter a primeira fração-alvo obtida na etapa d) a uma se- gunda ultracentrifugação, por meio do que a dita segunda ultracentrifugação é conduzida com uma força centrífuga relativa mais alta do que a força cen- trífuga relativa da primeira ultracentritugação em um meio com gradiente do mesmo tipo usado na primeira ultracentritugação, por meio do que o dito meio de gradiente é um meio de gradiente com concentração mais alta do

. 2 ] que a concentração do componente de gradiente com concentração mais baixa na primeira fração-alvo, e f) obter uma segunda fração-alvo que contém a carga viral des- cartando os 75% superiores de líquido (vol/vol) ou mais da camada superior correspondente à primeira fração-alvo, e obter a fração mais baixa que cor- responde aos 25% mais baixos de líquido (vol/vol) ou menos da camada superior e a camada completa do meio com gradiente de concentração mais alta excluindo qualquer pélete opcionalmente presente depois da centrifuga- ção. ” 10 2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, no qual adicio- , nalmente em uma etapa (9) do processo depois da etapa f) é conduzida Í uma determinação quantitativa da carga viral do espécime de pancreatina, determinando a titulação da infecção do vírus na segunda fração-alvo que contém a carga viral.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, no qual a segun- da fração-alvo diluída ou não-diluída é filtrada através de um microfiltro an- tes de conduzir a determinação quantitativa da carga viral.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, no qual na etapa a) do processo a amostra de pancreatina em teste é produzida como uma suspensão da amostra de pancreatina para teste, combinando o espécime de pancreatina com um meio de cultura de células que é apropriado para a linhagem de células usada para cultivar o tipo de vírus a ser investigado ou com uma solução salina e com um ou mais antibióticos.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, no qual pelo me- nosuma etapa entre as etapas a) e f) é conduzida sob resfriamento até uma temperatura de 0-15ºC.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, no qual as centri- fugações em baixa velocidade na etapa b) do processo são, em cada caso, conduzidas com uma força centrífuga relativa menor do que 15.000 X 9.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, no qual as centri- fugações em baixa velocidade na etapa b) do processo são, em cada caso, conduzidas com uma força centrífuga relativa de 8.000—-15.000 X g.

: 3 ' 8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, no qual as centri- fugações em baixa velocidade na etapa b) do processo são conduzidas por um período com duração de pelo menos 5 minutos.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, no qual a primeira ultracentrifugação na etapa d) do processo é conduzida por um período com duração de pelo menos 9 horas.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, onde na primei- ra ultracentrifugação na etapa d) do processo a força centrífuga relativa é abaixo de 150.000 X 9.

. 10

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, no qual a se- ' gunda ultracentrifugação na etapa e) do processo é conduzida por um perí- 7 odo com duração de pelo menos 2 horas.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, onde na se- gunda ultracentrifugação na etapa e) do processo a força centrífuga relativa é acimade 150.000 X 9.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 1, no qual o meio com gradiente descontínuo introduzido na etapa (d) do processo é um gra- diente de sacarose descontínuo com duas fases.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, no qual o meio com gradiente descontínuo é um gradiente que compreende uma solução de sacarose tamponada a 50% (peso/volume) e uma solução de sacarose tamponada a 20% (peso/volume).

15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, no qual o meio com gradiente de concentração mais alta na etapa e) do processo é um meio com gradiente de solução de sacarose tamponada a 50% (pe- so/volume).

16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, no qual o espé- cime de pancreatina é um espécime de pancreatina porcina.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 1, no qual a carga viral da amostra de pancreatina para teste compreende rotavírus A bovino, vírus da encefalomiocardite, circovírus porcino, parvovírus porcino, rotavírus A porcino, teschovirus porcino, vírus da hepatite E porcino e/ou vírus da do-

' ença vesicular suína.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o espécime de pancreatina usado como matéria-prima compreende pelo menos 5 g de pancreatina.

19. Segunda fração-alvo isolada, obtenível pelo processo como definido na reivindicação 1.

20. Segunda fração-alvo isolada, de acordo com a reivindicação 19, em que na etapa a) do processo da reivindicação 1 a amostra de pan- creatina para teste é produzida como uma suspensão da amostra de pan- . 10 creatina para teste, combinando o espécime de pancreatina com um meio , de cultura de células apropriado para a linhagem de células usada para cul- 7 tivar o tipo de vírus a ser investigado ou com uma solução salina e com um ou mais antibióticos.

21. Segunda fração-alvo isolada, de acordo com a reivindicação 20,naquala solução salina é uma solução salina tamponada com fosfato.