BRPI0821962A2 - composições e métodos usados durante um tratamento anti-hiv - Google Patents

Abstract

composições e métodos usados durante um tratamento anti-hvi a invenção refere-se a uma composição comportando um tratamento anti-hiv e um tratamento dos efeitos secundários deste tratamento anti-hiv em um paciente infectado pelo hiv. a presente invenção encontra, por exemplo, uma aplicação muito útil no tratamento dos efeitos secundários gerados por determinados tratamentos anti-hiv, por exemplo, o envelhecimento precoce, a lipodistrofia que podem ser gerados pelos inibidores de protease ou pelos inibidores da transcriptase reversa . a composição da presente invenção compreende pelo menos um inibidor da hidróximetilglutarilcoenzima a (hmg-coa) redutase, pelo menos um inibidor da farnesil-pirofosfato sintase, e pelo menos um agente anti- hiv. um dos processos de tratamento de um paciente infectado pelo hiv compreende em qualquer ordem as etapas seguintes: (i) administração de uma mistura compreendendo pelo menos um inibidor de hidróximetilglutaril-coenzima a (hmg-coa) redutase e pelo menos um inibidor de farnesil- pirofosfato sintase e (ii) administração de um agente anti- hiv, em que, as administrações são concomitantes, sucessivas ou alternativas.

Description

' COMPOSIÇÕES E MÉTODOS USADOS DURANTE UM TRATAMENTO ANTI-HVI Pedidos relacionados

O presente pedido é relativo ao pedido de patente francês FR N° 08/50019 depositado em 3 de janeiro de 2008.

É igualmente relativo ao pedido de patente francês FR N° 06/06097 depositado em 5 de julho de 2006 e seu pedido PCT correspondente apresentado em 5 de julho de 2007 tendo por título Medicament destine au traitement des maladies avec persistance et/ou accumulation de protéines prénylées. 0 10 conteúdo inteiro de cada um destes pedidos referenciados acima é incorporado aqui por referência.

Descrição

Domínio técnico

A invenção refere-se a uma composição anti-HIV e aos processos de tratamento de um paciente infectado pelo HIV.

A presente invenção encontra, por exemplo, uma aplicação muito útil no tratamento dos efeitos secundários gerados por determinados tratamentos anti-HIV, por exemplo, o envelhecimento precoce, a lipodistrofia que pode ser 20 gerada pelos inibidores de protease ou os inibidores do transcriptase reversa.

Na descrição abaixo, as referências entre parênteses (X) retornam à lista de referências no fim dos exemplos. As referências entre parêntese com o nome do autor e a data 25 retornam igualmente a esta lista de referências.

Técnica anterior

O núcleo das células eucarióticas é delimitado por uma dupla membrana perfurada de poros, o envelope nuclear que controla as trocas moleculares entre os dois compartimentos 30 nuclear e citoplásmico. Este envelope isola parcialmente o

2/138 conteúdo do núcleo, isto é, o material genético e toda a maquinaria enzimática necessária às funções do genoma nuclear.

O envelope nuclear é constituído de 2 membranas concêntricas, a membrana externa, em continuidade com o retículo endoplasmático, e a membrana interna. Esta última é limitada sobre a sua face interna por uma malha fibrilar densa chamada lâmina nuclear. Trata-se de uma rede proteíca essencialmente composta de polímeros de lâminas e proteínas associadas. Nos animais vertebrados, distingue-se duas subclasses de lâminas: as lâminas do tipo A (lâminas A e C) , e do tipo B (lâminas Bl, B2 e B3) que participam da elaboração da lâmina. Esta última é mantida no lugar pela associação com outras proteínas, fixadas à membrana interna do envelope nuclear (para revisão, Gruenbaum e col. 2005 (19)) ·

As lâminas são proteínas na forma de filamento pertencendo à família dos filamentos intermediários (tipo V) que têm uma estrutura comum: um curto segmento globular N-terminal (cabeça) separado de outro segmento globular Cterminal (cauda) por um longo domínio central organizado em várias hélices alfa (rod domain). A cauda globular contém especificamente um sinal de localização nuclear (NLS) permitindo o direcionamento ao núcleo após a síntese. O domínio central permite a associação de duas moléculas de lâmina paralelas e sua organização em filamentos por associação dos dímeros cabeça-cauda. Esta estrutura confere-lhes propriedades mecânicas muito resistentes.

Só a lâmina A e as lâminas B sofrem uma maturação após a síntese de um precursor (para revisão, Gruenbaum e col.

3/138 i 2000 (20) ) . A lâmina C é diretamente sintetizada sob sua forma madura.

O precursor da lâmina A e das lâminas B terminam por uma porção CaaX característica (C é uma cisteína, a um 5 aminoácido com cadeia alifática não carregada e X aminoácido qualquer, aqui uma metionina, para revisão, Lévy e Cau 2003 (29)).

A porção CaaX C-Terminal permite a fixação de um ácido graxo (em geral, um ácido graxo em C15, farnesila) graças 10 uma farnesil-transferase. Esta prenilação (a porção farnesila deriva de uma unidade alifática básica em C5 chamada isopreno) permite as pré-lâminas se inserirem na membrana do retículo endoplasmático após sua síntese no citosol. Elas sofrem a ação de uma endoprotease, a própria 15 inserida na membrana de envelope do retículo e cujo sítio ativo é citosólico. A endoprotease específica da pré-lâmina A é Facel (ou ZMPSTE24, Zinco MetaloProtease homólogo de STE24 de levedura), enquanto Face2 (ou Reel, enzima conversora de ras) é específica das pré-lâminas B. Estas 20 enzimas catalisam a hidrólise da ligação peptídica entre cisteína e o aminoácido seguinte (alifático), encurtando as pré-lâminas de 3 aminoácidos. A extremidade carboxila da cisteína farnesilada é em seguida reconhecida por uma isoprenilcisteína-carbóximetil transferase (ICMT) que fica 25 um grupamento metila por esterificação.

Só a maturação da pré-lâmina A prossegue com uma segunda divagem endoproteolítica por Facel, que libera um farnesil peptídeo de 15 aminoácidos e a lâmina A madura. Esta lâmina A, que não comporta mais o ácido graxo, se 30 torna solúvel, é importado no núcleo graças ao seu sinal de

4/138 < localização nuclear, e se localiza na lâmina nuclear, a mesma bem como o resto do compartimento nuclear, constituindo um verdadeiro esqueleto nuclear (Gruenbaum e col. 2005 (19)). A lâmina B madura em contrapartida possui sempre na extremidade C-terminal sua cisteína farnesilada e metilesterifiçada. Portanto, continua a ser inserida na membrana de envelope do retículo, em seguida na face nucleoplásmica do envelope nuclear, de onde sua localização exclusiva para a lâmina nuclear, sob a membrana interna do 10 envelope nuclear onde é ancorada.

Sob o termo de prenilação entende-se a fixação ao grupo tiol de uma cisteína, seja de uma cadeia farnesila de 15 átomos de carbono, fala-se então de farnesilação, seja de uma cadeia geranil-geranila de 20 átomos de carbono, 15 fala-se então de geranil-geranilação (Reid e col. 2004 (39)), seja ainda de qualquer outro derivado do isopreno.

A farnesilação, catalisada pela farnesil-transferase (FTase) que reconhece a sequência consenso C-terminal (CaaX), fixa preferencialmente um grupamento farnesila 20 sobre o resíduo cisteína da porção.

A geranil-geranilação é a fixação pela geranilgeraniltransferase (GGTase) de um grupamento geranil-geranila sobre o resíduo cisteína da porção.

Estes ácidos graxos são procedentes da via de biossíntese, que a partir da hidróximetil-glutaril-Coenzima A, é utilizado pelas células para fabricar especificamente o colesterol, os esteróides, o heme da hemoglobina e os ubiquinonas (Hampton e col. 1996 (20)).

A família das proteínas preniladas comporta cerca de 30 300 membros no genoma humano, cuja maioria é identificável

5/138 < pela porção C-terminal CaaX (Reid e col. 2004 (39)) . As proteínas das famílias Ras, Rho, Rab (Leung e col. 2006 (28)) determinadas proteínas assegurando uma função de importação para a mitocôndria (HDJ2), determinadas proteínas mitóticas (CENPE, CENPF) são especificamente preniladas (Winter-Vann e Casey 2005 (51)). Em geral, se na porção CaaX X é uma serina, metionina, cisteína, alanina ou um glutamato, o isoprenóide preferencialmente enxertado é farnesila. Se X é uma leucina, o reconhecimento da porção 10 CaaL se fará preferencialmente pela GGTase, que catalisará a transferência de um grupamento geranil-geranila (Basso e col. 2006 (1)). Ê provável que outros grupamentos derivados do isopreno podem também ser fixados sobre esta cisteína, embora isso não seja descrito na literatura.

No homem existem três genes de lâminas. O gene LMNA, situado em Iq21.2-q21.3 (Wydner e col. 1996 (52)), dado por splicing alternativo das lâminas A e C. 0 gene LMNA é composto de 12 exons. O início do éxon 1 codifica a extremidade globular N-terminal comum às lâminas A e C; o 20 fim do éxon 1 e até o início do éxon 7 codificam a parte helicoidal central; por último, os outros éxons codificam a extremidade globular C-terminal (Lévy e Cau 2003 (29)).

De fato, o gene codifica 4 produtos sofridos splicing diferentemente, cujas lâminas Cea pré-lâmina A são as 2 25 principais (Linho e Worman 1993 (31)). A produção diferencial das lâminas A e C se faz pela utilização de um local de splicing alternativo ao nível do éxon 10 do prémensageiro, de modo que a lâmina C é codificada pelos éxons de 1 a 10 e a lâmina A é codificada pelos éxons de 1 a 9, 30 os 90 primeiros pares de bases do éxon 10, e os éxons 11 e

6/138 (lâmina A específicas).

Por consequência, os peptídeos pré-lâmina A e lâmina C são idênticos ao nível dos primeiros 566 aminoácidos, as extremidades C-terminais das lâminas C e da pré-lâmina A contendo em seguida respectivamente 6 e 98 aminoácidos específicos.

As lâminas do tipo B compreendem três proteínas diferentes (Shelton e col. 1981 (43)) : as lâminas Bl, B2 (as duas isoformas mais representadas) e B3. 0 gene LMNB1 é situado em 5q23.3-q31.1 e comportado 11 éxons codificando a lâmina BI (Lin e Worman 1995 (30) ) . O gene LMNB2 está localizado em 19pl3.3 e codifica as lâminas B2 e B3 por um mecanismo de splicing alternativo (Biamonti e col. 1992 (2) ) .

As lâminas do tipo B são expressas constitutivamente em todas as células a partir dos primeiros estados de desenvolvimento, enquanto as lâminas do tipo A estão em geral ausentes nas células-tronco embrionárias (Stewart e col. 1987 (45)) e são expressas em todas as células somáticas diferenciadas. Sua expressão é submetida às regulações de acordo com o tecido e durante a vida (Duque e col. 2006 (9)). Parece que sua expressão não é necessária, pois os camundongos nos quais foram bloqueados especificamente a expressão da lâmina A, mas que exprimem toda a mesma lâmina C e as outras lâminas, não têm fenótipo aparente (Fong e col. 2006 (14)).

As lâminas interagem com um número muito elevado de parceiros protéicos tendo funções muito diversas; portanto são implicadas em um grande número de processos nucleares, incluindo a replicação e a reparação do DNA, o controle da

7/138 transcrição e do splicing, a organização da estrutura cromatínica (para revisão, ver Shumaker e col. 2003 (44), Zastrow e col. 2004 (54), Hutchison e col. 2004 (26), Gruenbaum e col. 2005 (19)). As alterações da estrutura da lâmina são a origem de numerosas patologias hereditárias humanas. Elas são devidas às mutações dos genes codificando as lâminas, ou outras proteínas da lâmina. Agrupou-se estas patologias sob o termo genérico de laminopatias (Broers e col. 2006 (5), Mattout e col. 2006 (33)). Recentemente, as mutações nos genes das enzimas responsáveis pela maturação das lâminas (Facel especificamente), foram identificadas, dando lugar às patologias pertencendo igualmente ao grupo das laminopatias (Navarro e col. 2004 (36) e 2005 (35)).

Até hoje, a única patologia no homem associada às mutações dos genes LMNB1 ou 2 é uma leucodistrofia causada por uma duplicação completa do gene LMNB1 (Padiath e col. 2006 (37)). Uma dúvida subsiste sobre a implicação potencial de variações de sequências encontradas em LMNB2 nos pacientes atingidos com a síndrome de Barraquer-Simon (Hegele e col. 2006 (22)). Contudo, foi demonstrado in vitro por experiências de RNAi (RNA-interferência) (Harborth e col. 2001 (21)), bem como no modelo murino (Vergnes e col. 2004 (50), as lâminas do tipo B são essenciais para o desenvolvimento e a integridade celular. De fato, a deficiência na lâmina BI provoca no camundongo uma letalidade perinatal. Além disso, os núcleos dos fibroblastos embrionários dos mesmos camundongos LMNB1 deficientes mostram as alterações notáveis da morfologia nuclear, próximas das observadas nos pacientes portadores de mutações do gene LMNA. Além disso, foi mostrado

8/138 recentemente que as lâminas B são necessárias à formação do fuso de divisão durante a mitose, o que tende a provar que seu papel é dinâmico e múltiplo durante o ciclo celular, e não unicamente restrito à manutenção da arquitetura do núcleo (Tsai e col. 2006 (48)). Sobre este último papel, um artigo recente constitui a demonstração da função estrutural das lâminas B: as células artificialmente privadas de lâminas BI têm um núcleo flutuante na célula, que gira sobre ela mesma (Liu e col. 2007 (45)). A redundância funcional existente entre as duas lâminas BI e B2 é sem dúvida também o reflexo direto de sua indispensabilidade, exercendo uma forte pressão de seleção e mascarando o efeito de mutações eventuais da sequência dos genes correspondentes.

As alterações funcionais das lâminas A/C, devidas às mutações do gene LMNA, são a origem de pelo menos 15 desordens reagrupando as patologias muito diversas em um espectro clínico indo das formas pouco severas, afetando um só tqcido de maneira isolada, com formas sistêmicas letais em período perinatal.

Numerosas mutações do gene LMNA modificam de maneira notável a montagem das proteínas no envelope nuclear e perturbando o funcionamento. Nas células de diversos tecidos, a morfologia dos núcleos é modificada: apresentam frequentemente hérnias que extrudem do material genético no citoplasma (Goldman e col. 2004 (18)).

As proteínas habitualmente associadas com o envelope nuclear, as lâminas B, determinadas proteínas dos poros nucleares e as proteínas LAP2, estão ausentes da periferia destas hérnias.

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Estas anomalias morfológicas são seguidas de alterações funcionais, que terminam por provocar a morte celular. Entre o conjunto das patologias agrupadas sob a denominação de laminopatias, as únicas ligadas à anormal de uma forma prenilada de proteína são referidas pela presente invenção.

São principalmente a síndrome de Hutchinson-Gilford, ou Progéria (Se Sandre-Giovannoli e col. 2003 (7), Eriksson e col. 2003 (11)), e a dermopatia restritiva (Navarro e col. 2004 (36)). Nestas 2 síndromes, a causa fisiopatológica é uma acumulação e uma persistência nas células dos doentes de pré-lâmina farnesilada não maturada.

A dermopatia restritiva, letal ao redor do período natal, se caracteriza por sinais clínicos que são quase toda a consequência de um défice cutâneo que restringe os movimentos in utero. Esta patologia é muito rara. A pele é rígida e tensa, ela cede em lugares, provocando, por exemplo, as rupturas ao nível das axilas ou do pescoço. Os cílios, as sobrancelhas e pelos cutâneos estão ausentes ou muito dispersos. Uma hidramniose está frequentemente presente, e a diminuição dos movimentos fetais é assinalada a partir do 6^o mês de gravidez. Ao nível do esqueleto, a radiografia revela contraturas de todas as articulações, os pés em machado de gelo, as clavículas finas, displásicas e bipartidas, as costelas em fita, os ossos longos tubulares dos braços e uma desmineralização ao nível do crânio. A transmissão da dermopatia restritiva letal é recessiva autossômica.

As mutações de LMNA e de ZMPSTE24/Facel foram relatadas para esta patologia (Navarro e col. 2004 (36)).

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Nos 2 casos, o mecanismo fisiopatológico é o mesmo: a prélâmina A não pode madurar (mutação nula de Facel ou desaparecimento do local de divagem por mutação da prélâmina A) , e continua farnesilada, e portanto inserida na membrana nuclear. A acumulação e a persistência nas células destes precursores anormais, que impedem provavelmente a interação normal das lâminas B e C com seus parceiros, provocou a morte das células e, a curto prazo, do paciente. Foi demonstrado claramente que é a persistência do grupamento farnesila, e não a ausência da lâmina A madura, como poderia-se pensar antes, que é responsável pela toxicidade celular (Fong e col. 2004 (16)).

Em abril de 2003, a partir de uma verificação dos sintomas comuns à displasia acromandibular e determinadas doenças se traduzindo em um envelhecimento prematuro, os inventores mostraram que a progeria, a forma mais típica e mais grave do envelhecimento precoce, resulta de uma mutação do gene LMNA (De Sandre-Giovannoli e col. 2003 (7)). As crianças atingidas por esta doença, também nomeada síndrome de Hutchinson-Gilford, sofrem de um envelhecimento acelerado, até dez vezes mais rápido do que um indivíduo normal, e tem uma esperança de vida que não excede 13 anos. Na Europa, uma criança em cerca de seis milhões é atingida. Os sintomas são um envelhecimento cutâneo, calvície, redução da dimensão da maxila e os problemas ligados ã velhice, por exemplo, uma rigidez das articulações e os problemas cardiovasculares. Estes últimos, tais como infarto do miocárdio ou ateroesclerose são frequentemente a causa da morte.

A mutação incriminada, situada no éxon 11 do gene

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LMNA, ativa um local críptico de splicing do pré-RNAm, conduzindo a um RNAm deletado de 150 nucleotídeos (De Sandre-Giovannoli e col. 2003 (7), Eriksson e col. 2003 (11)). Este RNAm deletado é traduzido em uma pré-lâmina A anormal, a progerina, que não pode ser maturada em lâmina A normal: a ausência de 50 aminoácidos do éxon 11 comportando o local de reconhecimento da protease bloqueia a 2^a divagem da progerina cuja extremidade C-terminal conserva seu grupamento farnesila. Permanece portanto, a ser inserida na face nucleoplásmica do envelope nuclear, que apresenta as alterações características, hérnias do nucleoplasma no citosol e anomalias da repartição da heterocromatina periférica (Goldman e col. 2004 (18)) . Ainda, a persistência do grupo farnesila, além de necessária para a ancoragem à membrana de envelope do retículo no qual estão localizadas determinadas enzimas responsáveis pela maturação (clivagens, metilação) que é responsável da toxicidade celular da progerina (Fong e col. 2004 (16)).

Estas patologias sistêmicas apresentam a particularidade de estarem associadas ao aparecimento precoce de sinais habitualmente ligados ao envelhecimento. Sua característica fisiopatológica comum é gerar uma lâmina prenilada, com as consequências descritas.

Dois estudos recentes mostraram que uma redução da acumulação intranuclear da pré-lâmina farnesilada, truncada ou não, previne eficazmente o aparecimento do fenótipo celular. A primeira foi realizada sobre o modelo murino progeróide deficiente em protease Facel (Pendas e col. 2002 (38)). Quando são cruzadas com camundongos exprimindo menos

12/138 da metade de lâmina A (ratos Lmna +/-), os efeitos da ausência de Facel são diminuídos (Varela e col. 2005 (49)) . O segundo estudo mostra que o tratamento de células de pacientes HGPS pelo morfolino (oligonucleotídeos antisenso) atacando o local de splicing críptico abole o fenótipo mutante (Scaffidi e Misteli 2005 (43)).

Vários estudos recentes (ver Scaffidi e Mistelli 2006 (42)) mostram a implicação da lâmina A no processo de envelhecimento fisiológico. Em particular, foi demonstrado que durante o envelhecimento fisiológico, a progerina é sintetizada pelas células na ausência de qualquer mutação do gene LMNA devido à utilização com baixo ruído do local críptico de splicing do éxon 11. Esta progerina localiza-se na lâmina, na periferia do núcleo das células. O núcleo de células de pacientes idosos normais pode apresentar hérnias características de uma laminopatia causada por estes acontecimentos de splicing acidental, o que provoca as anomalias das funções celulares e são provavelmente pelo menos em parte responsáveis pelo seu envelhecimento.

Na pele in vivo, a progerina é também sintetizada por uma subpopulação de fibroblastos dérmicos e de queratinócitos, células nas quais se acumule com a idade. A progerina podería, portanto, ser um marcador do envelhecimento cutâneo (McClintock e col. 2007 (34)).

Parece que os mecanismos moleculares idênticos são por um lado, responsáveis pelos sinais de envelhecimento prematuro dos indivíduos atingidos pela progeria e por outro lado, a um nível muito mais fraco, intervem no envelhecimento fisiológico de indivíduos não portadores de mutações.

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Existem na técnica anterior duas abordagens terapêuticas descritas para melhorar o fenótipo celular causado pela produção patológica de progerina. A primeira destas soluções é simplesmente impedir a utilização pelo spliceossoma deste local de splicing críptico no éxon 11, o mascarando por tratamento com um oligonucleotídeo antisenso (Scaffidi e Misteli 2005 (41)), ou com um retrovirus produzindo um siRNA (Huang e col. 2005 (25)). Os resultados são prometedores in vitro, mas trata-se aqui de terapia gênica, e o desenvolvimento de um medicamento ao redor desta abordagem é inevitavelmente longo e complicado, com todos os inconvenientes ligados à vetorização dos OAS para obter um efeito in vivo. Ά segunda solução consiste em inibir a farnesil-transferase, a enzima que catalisa a transferência do grupamento farnesila sobre as pré-lâminas a partir de farnesila-pirofosfato. Quando tais inibidores (FTI) são utilizados, um envelope nuclear normal que é somente parcialmente restaurado sobre as células HGPS (Progeria) em cultura, e a sobrevivência de camundongos RD (KO ZMPSTE24) é melhorada (Glynn e Glover 2005 (17) , Capell e col. 2005 (6), Toth e col. 2005 (47), Fong e col. 2006 (15)) .

Contudo, o bloqueio da farnesilação pode induzir a uma geranil-geranilação compensatória (Bishop e col. 2003 (3), Varela e col. 2008 (54 A)).

Por outro lado, tem sido relatado recentemente que os FTI induzem uma parada do ciclo celular bloqueando o proteossoma (Demyanets e col. 2006 (8), Efuet e Keyomarsi 2006 (10) ) . Assim, o tratamento induz sem dúvida a uma acumulação no nucleoplasma de progerina provavelmente

14/138 ubiquitinilada, não degradada pelo proteossoma.

Além disso, os trabalhos recentes relatam que a diminuição da taxa de farnesilação da progerina in vivo é muito baixa, da ordem de 5% (Young e col. 2006 (53)), o que não é suficiente para explicar a restauração da morfologia nuclear observada in vitro.

Finalmente, os FTI são específicos de uma só das vias de prenilação protéica, e não podem ser encarados como inibidores globais das prenilações pós-traducionais.

Além disso, é relatado que a ausência total de uma das enzimas desta via, a mevalonato-quinase, é letal durando a infância (mutação homozigota perda de função do gene codificando esta enzima, síndrome relatada por Hoffmann e col. 2003 (24)).

Tratamentos anti-HIV e efeitos secundários

1. Os pacientes infectados pelo HIV e submetidos a um tratamento antirretroviral apresentam os sinais clínicos e biológicos de um envelhecimento acelerado comparáveis aos apresentados pelos pacientes portadores de uma síndrome progeróide de origem genética.

Os tratamentos antirretrovirais, inibidores da transcriptase reversa, nucleosídicos (NRTI) ou não (NNRTI), inibidores da protease viral (PI) permitiram um alongamento da duração de vida dos pacientes infectados pelo vírus da AIDS nos quais aparecem as consequências do envelhecimento fisiológico (Casau, 2005; Levy e col., 2003).

No entanto, a infecção e os tratamentos antirretrovirais indicam os mesmos sinais clínicos e biológicos que os apresentados pelos pacientes atingidos por uma síndrome de envelhecimento acelerada de origem

15/138 genética (para uma revisão recente destas síndromes, ver Navarro e col., 2006).

Determinadas manifestações parecem diretamente ligadas à infecção viral:

Por exemplo, a helicase mutada na síndrome de Werner (OMIM 277700), uma síndrome de envelhecimento prematura associada a uma predisposição ao câncer e a ateroesclerose, recruta os cofatores protéicos celulares indispensáveis à transativação do LTR de HIV-1 e a replicação do vírus. A mínima disponibilidade da helicase nas células infectadas poderia conduzir ao envelhecimento e à imunossupressão (Sharma e col., 2007).

Por exemplo, as modificações do transporte do colesterol nos macrófagos. A proteína viral Nef inibe as permeases da família ABC responsáveis pelo efluxo do colesterol (Bukrinsky e Sviridov, 2006; Mujawar e col., 2006; Wang e Rader, 2007) . A acumulação do colesterol nos macrófagos os transforma em células espumosas (foam cells) implicadas na constituição das placas de ateroma nas paredes vasculares (Pennings e col., 2006). Os medicamentos antirretrovirais inibem também o efluxo de colesterol dos macrófagos e contribui para a formação da placa de ateroma (Azzam e col., 2006; Dressman e col., 2003; Wang e col., 2007) .

Numerosas manifestações clínicas e biológicas parecem também serem em consequência dos tratamentos antirretrovirais:

Elas reproduzem os sinais observados durante as síndromes progeróides de origem genética, por exemplo, a progeria de Hutchinson-Gilford (OMIM 176670, ver (Hennekam,

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2006), a displasia acromandibular (OMIM 248370) e a forma letal neonatal, a dermopatia restritiva (OMIM 275210) ligadas às mutações no gene LMNA codificando as lâminas A e C ou às mutações na protease ZMPSTE24 (FACE1) responsável pela divagem da pré-lâmina A durante sua maturação em lâmina A:

• A alopecia (Torres e col., 2007; Wiwanitkit, 2004), independente das manifestações infecciosas dermatológicas (Maurer, 2005).

• As anomalias do sistema esquelético, em particular a osteoporose (Brown e Qaqish, 2006; Thomas e Doherty, 2003) as quais foram propostas a correção pela vitamina D e um bifosfonato (Mondy e col., 2005) .

• A fonte muscular (Restrepo e col., 2006; Restrepo e col., 2004; Tehranzadeh e col., 2004a; Tehranzadeh e col., 2004b), em relação com o sistema ubiquitina-proteossoma (Costelli e Baccino, 2003) ou as calpaínas (Bartoli e Richard, 2005; Costelli e col., 2005), dois sistemas proteolíticos inibidos por determinados tratamentos antirretrovirais (ver mais abaixo). As mutações da calpaína 3 muscular são responsáveis por uma forma de distrofia muscular das cinturas (LGMD2A, OMIM 253600; (Richard e col., 1995) cujo miosite com eosinófilos poderia ser um dos primeiros sinais (Krahn e col., 2006).

• Uma cardiomiopatia (Barbaro, 2003; Restrepo e col., 2006) , independente das complicações cardiovasculares (ver abaixo), em relação com a toxicidade mitocondrial dos NRTI (Lewis, 2003) .

• As anomalias cardiovasculares (Mondy e Tebas, 2007) com problemas do metabolismo lipídico (hoje, 2003; Jones e

17/138 col., 2005; Moyle, 2007), ateroma (de Santo Martin e col., 2006; Thomas e Smart, 2007; Van Wijk e col., 2006), lesões das células endoteliais (Chen e col., 2005; Jiang e col., 2006; Zhong e col., 2002) e anomalias da diferenciação das células adiposas (Kim e col., 2006; Roche e col., 2002). A dislipidemia pede ser tratada pelas estatinas (Benesic e col., 2004; Liang e col., 2006; Mallon e col., 2006) ou por um inibidor da absorção intestinal do colesterol (Negredo e col., 2006). Note que a pravastatina que corrige em parte alguns dos parâmetros alterados na síndrome metabólica (Yamagishi e col., 2006) induz um aumento do tecido adiposo subcutâneo sem melhoria notável da colesterolemia (Gharakhanian e col., 2006; Mallon e col., 2006).

• As manifestações clínicas ligadas a uma hipoandrogênia são frequentemente observadas nos homens (Cohan, 2006) e os casos de menopausa precoce nas mulheres seropositivas são objetos de várias publicações (Cohan, 2006; Ferreira e col., 2007).

Os inibidores da protease do vírus (PI) apresentam vários alvos celulares dos quais proteases:

• A inibição do proteossoma (Piccinini e col., 2005) tem consequências muito variadas devido ao papel deste conjunto proteolítico sobre numerosas funções celulares, turn-over das proteínas, controle do ciclo celular, apoptose, transcrição de genes, transdução de sinais, senescência, resposta ao estresse... (Naujokat e col., 2007). Por exemplo, uma das vias de bloqueio pelo PI da diferenciação adipocitária passa pela não produção do fator de regulação da transcrição NFkB que controla a transcrição do gene codificando a metaloprotease (com zinco) MMP9

18/138 implicada na diferenciação adipocitária (Bourlier e col., 2005; Barrou e col., 2007).

• Outro exemplo é a via de sinalização utilizada pela insulina (Rudich e col., 2005; Schutt e col., 2004). Os PI inibem a atividade da enzima de degradação de insulina (Hamel e col., 2006), bloqueiam os canais potássicos responsáveis pela secreção de insulina (Neye e col., 2006), interagem com os transportadores de glicose Glut4 (Hertel e col., 2004) e impedem sua inserção na membrana plasmática (Hruz, 2006; Parker e col., 2005).

• Do mesmo modo os PI bloqueiam a via de sinalização via quinase Akt utilizada pela ativação de receptores com atividade tirosina-quinase (Gupta e col., 2005), cujo do IGF1. IGF1 controla diretamente a atrofia ou hipertrofia muscular (Glass, 2003) .

• Os PI exercem um efeito antiapoptótico por inibição das calpaínas, proteases citosólicas Ca++ dependentes (Ghibelli e col., 2003; Lichtner e col., 2006), e que controlam o equilíbrio apoptose-autofagia pela divagem de ATG5, indispensável à formação do vacúolo autofágico (Yousefi e col., 2006).

• Dois outros sistemas enzimáticos são bloqueados pelos PI: determinados citocromos P450 da subfamília 3A, intestinais ou hepáticos (Granfors e col., 2006), enquanto outros citocromos P450 da subfamília 2A são induzidos (Yeh e col., 2006) ao mesmo tempo que outros transportadores (Dixit e col., 2007; Yeh e col., 2006); a glicuronoconjugação no RE em particular da bilirrubina (Zhang e col., 2005).

• A inibição de várias atividades enzimáticas cujo proteossoma induz a um estresse do retículo endoplasmático, o desencadeamento da UPR (Unfolded Protein Response) e a utilização do mecanismo de sinalização do retículo ao núcleo com o aparecimento de fatores de regulação da transcrição (Zhou e col., 2006). Numerosas publicações demonstram o aumento da quantidade das isoformas de SREBP (Sterol Response Element Binding Protein), que controlam a ativação de genes regulando o metabolismo lipídico, cujo do colesterol (Colgan e col., 2007; Miserez e col., 2002; Nguyen e col., 2000; Williams e col., 2004; Zhou e col., 2006; Zhou e col., 2005). A indução pelos PI da transcrição de SREBP foi também mostrada por um estudo do transcriptoma (ligação, PCR quantitativo) de adipócitos em cursos de diferenciação (Pacenti e col., 2006) e o efeito é aumentado pela ausência de degradação de SREBP pelo sistema ubiquitina-proteossoma.

Os PI induzem a acumulação nuclear de SREBP nos hepatócitos e nos adipócitos e suas consequências sobre o metabolismo lipídico (síntese aumentada de ácidos graxos e de colesterol) (Hui, 2003; Riddle e col., 2001).

• Três artigos da mesma equipe parisiense analisando a diferenciação in vitro de adipócitos mostram sucessivamente que os PI provocam uma síndrome de resistência à insulina, a localização anormal de SREBP no nucleoplasma, em relação com uma anomalia da localização da lâmina A (Caron e col., 2001) ; a inibição da divagem de SREBP (pelas proteases de Golgi S-1P e S-2P, ver (Seidah e col., 2006), e suas consequências sobre a síntese de enzimas do metabolismo lipídico, sobre a maturação anormal da lâmina A, enquanto a maturação da lâmina B não é modificada (Caron e col.,

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2003) ; a semelhança entre o estresse mitocondrial observado durante as lipodistrofias ligadas a uma mutação do gene LMNA e a resultante do tratamento pelos PI (Caron e col., 2007).

Um dos interesses destes trabalhos é sugerir fortemente que alguns PI bloqueiam a protease (FACE1 ou ZMPSTE24) implicada na maturação da pré-lâmina A, dado que foi confirmado por uma equipe americana (Coffinier e col., 2007) . Estes PI ao contrário não têm efeito sobre a atividade da protease FACE2 (ou Reel, Ras converting enzyme 1), responsável pela divagem das pré-lâminas B, mas também da proteína G monomérica Ras, divagem necessária a sua maturação (Wright e Philips, 2006). Um estudo recente de RT-PCR quantitativo mostra que os PI induzem uma diminuição da quantidade dos RNAm codificando a lâmina A sem modificar a quantidade dos RNAm codificando a lâmina C (Miranda e col., 2007).

• Os PI inibem as proteases mitocondriais responsáveis pela divagem dos sinais de direcionamento à mitocôndria, pela renovação das proteínas mitocondriais, pelo controle de certas GTPases mitocondriais (OPA1) implicadas na fusão das mitocôndrias e a apoptose (Mukhopadhyay e col., 2002; Roehl White e Lauring, 2007).

• Independentemente da sua ação sobre as calpaínas (ver mais acima), os PI exercem um efeito antiapoptótico para os linfócitos T bloqueando, via a proteína UCP2, a despolarização da membrana interna induzida por estímulos pró-apoptóticos (Matarrese e col., 2003; Matarrese e col., 2005).

Deve-se portanto, notar que os PI inibem então as

21/138 enzimas diferentes da aspartil-protease específica do vírus da AIDS (Dunn e col., 2002). Entretanto, a literatura não tenha até agora sobre este ponto, os PI poderíam também inibir algumas das aspartil-proteases eucarióticas (ver site Degradome: http://www.uniovi.es/degradome/) como a presenilina, o sinal peptídeo peptidase, ou Ddil (DNA damage inducible protein), capaz de fixar ao mesmo tempo o proteossoma e as proteínas ubiquitiniladas com o propósito da degradação destes últimos (Sirkis et al., 2006).

Os nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa do vírus (NRTI) têm também vários alvos celulares cuja mitocôndria é um dos mais importantes:

• Os não nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa do vírus, menos estudados, parecem ter uma ação mais específica sobre a enzima viral induzindo ao mesmo tempo a apoptose de uma linhagem de células T (Pilon e col., 2002).

• Os NRTI são incorporados no DNA nuclear (Olivero e col., 1999) e seu efeito mutagênico pode provocar um bloqueio do ciclo celular (Olivero e col., 2005) . Foi relatado uma mutação da DNA polimerase gama (Yamanaka e col., 2007), responsável pela replicação e pela reparação do DNA mitocondrial (Hudson e Chinnery, 2006).

• Um pequeno número de publicações mostra que os NRTI inibem a N-glicosilação (no retículo endoplasmático), a Oglicosilação e a modificação das arborizações de açúcar (no Golgi), interferindo com os nucleotídeos transportadores no Golgi dos precursores das arborizações de açúcar (Lizzi e col., 2007). Várias distrofias musculares são ligadas às anomalias genéticas da glicosilação (Muntoni e col., 2004;

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Percival e Froehner, 2007).

• Os NRTI são transportados na matriz mitocondrial por uma família de transportadores especializados nos quais os desóxinucleosídeos difosfatos, que são fosforilados por uma quinase mitocondrial antes de serem incorporados no DNA mitocondrial pela DNA polimerase gama (Palmieri, 2004).

• A genotoxicidade dos NRTI tem por consequência um aumento da taxa de mutações do DNA mitocondrial e uma diminuição do número de suas cópias nas mitocôndrias (Kohler e Lewis, 2007; Olivero, 2007).

• As anomalias do DNA mitocondrial e aquelas do

funcionamento	da	DNA	polimerase	gama	tem	consequências
sobre a síntese	das	13 proteínas da	membrana	interna
constituindo,	com	as	proteínas	codificadas	pelo	genoma

nuclear e importadas, os complexos da cadeia respiratória e a ATP sintase. As perturbações do DNA mitocondrial e sua polimerase provocam, por exemplo, a diminuição da quantidade de citocromo oxidase II (Vidal e col., 2006), a produção de espécies reativas do oxigênio (ROS) (Jiang e col·., 2007) com consequências para os hepatócitos, os adipócitos, os cardiomiócitos e as células endoteliais que participam na lipodistrofia e as complicações cardiovasculares.

• 0 aumento da taxa do ácido láctico plasmático é um dos critérios do disfuncionamento mitocondrial induzido pelos tratamentos antirretrovirais (2007; John e col., 2001) .

• Os NRTI inibem além da atividade da telomerase e induzem um encurtamento dos telômeros (Olivero, 2007; Yamaguchi e col., 2001).

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Em conclusão, os tratamentos antirretrovirais têm um impacto sobre os mecanismos e vias metabólicas agrupados em várias teorias celulares explicando o envelhecimento normal ou acelerado:

• a teoria mitocondrial, • a teoria núcleo e lâmina, aparecida em 2003 com a descoberta que o gene LMNA é responsável pela progeria, • a teoria telomérica, • a teoria regulação da transcrição dos genes em particular, com as proteínas p53, NF-KkB, • a teoria metabólica com implicação de vias de sinalização, algumas eram ativadas pelos receptores de membrana.

• Vários modelos animais de envelhecimento prematuro ou ao contrário de aumento da duração de vida aparecem das sobreposições parciais entre as vias metabólicas utilizadas em cada uma destas teorias e as interrelações, com a escala celular, entre o citosol e em particular os mecanismos de degradação das proteínas (Grillari e col., 2006), a mitocôndria, o núcleo e a membrana plasmática (IrmingerFinger, 2007; Kenyon, 2005; Martin e Loeb, 2004; Quarrie e Riabowol, 2004).

Vários modelos animais de envelhecimento prematuro ou ao contrário de aumento da duração de vida apareceram das sobreposições parciais entre as vias metabólicas utilizadas em cada uma destas teorias e as interrelações, com a escala celular, entre citosol e em particular os mecanismos de degradação das proteínas (Grillari e col., 2006), a mitocôndria, o núcleo e a membrana plasmática (IrmingerFinger, 2007; Kenyon, 2005; Martin e Loeb, 2004; Quarrie e

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Riabowol, 2004).

2. A teoria mitocondrial do envelhecimento (Figura 6 anexada).

As três principais compondo a teoria mitocondrial do envelhecimento são: i) o aumento da produção de espécies reativas do oxigênio (ROS) pelos complexos I e II da cadeia respiratória; ii) as disfunções progressivos dela; e iii) a acumulação de lesões do DNA mitocondrial (Balaban e col., 2005; Meissner, 2007; Wallace, 2005).

O DNA mitocondrial é mais sensível que o DNA nuclear aos efeitos dos ROS que atacam a DNA polimerase gama (Graziewicz e col., 2002; Richter e col., 1988). Dois modelos murinos exprimindo uma DNA polimerase gama defeituosa na sua função proof-reading mostram um envelhecimento acelerado com mutações do DNA mitocondrial (Kujoth e col., 2005; Trifunovic e col., 2004). A toxicidade mitocondrial dos ROS pode ser abolida pela superexpressão da catalase peroxissomal direcionada à mitocôndria em um modelo murino transgênico, cuja duração de vida é aumentada (Schriner e col., 2 005) .

No homem, o envelhecimento é acompanhado de uma baixa das funções mitocondriais, nas quais da cadeia respiratória (Short e col., 2005; Trifunovic e col., 2005), de um aumento de deleções no DNA mitocondrial, particularmente observados durante as doenças neurodegenerativas (Bender e col., 2006; Kraytsberg e col., 2006).

Um mecanismo de sinalização, ainda mal conhecido, da mitocôndria ao núcleo, intervém na proteína p32, em particular durante o envelhecimento ou nas patologias induzidas pelos ROS (Jiang e col., 1999; Storz, 2006). Esta

25/138 proteína, codificada pelo genoma nuclear em seguida importada na matriz mitocondrial, é reexportada para o nucleoplasma (Brokstad e col., 2001) onde controla a transcrição (Chattopadhyay e col., 2004) e o splicing (Petersen-Mahrt e col., 1999) de RNAm. Ela interage por outro lado com o receptor da lâmina B, localizado na face nucleoplásmica do envelope nuclear (Mylonis e col., 2004; Simos e Georgatos, 1994).

O mecanismo de sinalização do núcleo à mitocôndria intervém em cerca de 1500 proteínas codificadas pelo genoma nuclear, que são sintetizadas no citosol em seguida importadas na mitocôndria (Calvo e col., 2006; Truscott e col., 2003) .

Entre estas proteínas, p53 é implicada no envelhecimento acelerado em um modelo murino (Tyner e col., 2002) e participada nas desregulações no quadro da teoria nuclear (ver abaixo). A proteína p53 controla a respiração mitocondrial (Matoba e col., 2006), exerce efeitos pró- e antioxidantes graças ao controle da transcrição de genes nucleares (Bensaad e Vousden, 2005; Sablina e col., 2005). Ela mantém a estabilidade do DNA mitocondrial interagindo com a DNA polimerase gama (Achanta e col., 2005).

Por último, os mecanismos de fissão (divisão) e fusão das mitocôndrias, nos quais intervém várias GTPases das membranas mitocondriais externas (Drpl, as mitofusinas...) e internas (OPA1) e várias proteínas associadas (Fisl...) modulam a senescência celular: o alongamento da rede mitocondrial por fusão permanente induz uma senescência celular com diminuição da diferença de potencial entre as

26/138 duas faces da membrana interna, aumento da produção de ROS e lesões do DNA. Estas modificações fenotípicas são neutralizadas pela fragmentação da rede mitocondrial (Lee e col., 2007).

3. Os mecanismos das síndromes de envelhecimento acelerado de origem genética no quadro da teoria núcleo e lâmina.

As lâminas são as proteínas constitutivas dos filamentos intermediários localizados exclusivamente no nucleoplasma. O gene LMNA codifica principalmente as lâminas A e C, produzidas por splicing alternativo. Dois outros genes codificam as lâminas Bl e B2.

As lâminas A e B são sintetizadas no citosol sob a forma de um precursor que sofre várias etapas de maturação. As 3 proteínas possuem em sua extremidade C-terminal a caixa CaaX (cisteína, dois aminoácidos alifáticos, um aminoácido indiferente). Esta sequência CaaX permite a farnesilação das lâminas A e B (e cerca de 300 outras proteínas do genoma humano). O resíduo farnesil (isoprenóide de 15 átomos de carbono) é sintetizado com uma etapa intermediária da via de síntese do colesterol (Figura 7 anexada). Uma enzima citosólica, a farnesil-transferase, fixa o resíduo farnesil sobre a cisteína.

A presença do resíduo ácido graxo permite a ancoragem das pré-lâminas A e B no folheto citosólico da membrana de envelope do retículo endoplasmático (RE) . As pré-lâminas A e B são então clivadas por FACE1 (ZMPSTE24) ou FACE2 (Reel) respectivamente e perdem seus três últimos aminoácidos Cterminais aaX. As proteínas sempre ancoradas na membrana do envelope do RE onde sofrem a ação de uma segunda enzima,

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ICMT, que fixa um grupamento metil sobre a cisteína já farnesilada.

A maturação das lâminas B termina nesta etapa. Estas proteínas deslizam no plano da membrana de envelope do RE, em seguida da face citosólica do envelope nuclear, atravessam o poro nuclear e localizam no folheto nucleoplásmico do envelope nuclear onde entram na constituição da lâmina nuclear e onde interagem com várias proteínas, cujo receptor da lâmina B. A ancoragem com o envelope tem por consequência a ausência de lâminas B na matriz nuclear, com o interior do nucleoplasma e a distância do envelope.

A pré-lâmina A farnesilada e carbóximetilada sobre a mesma cisteína C-terminal sofre uma última etapa de maturação por divagem proteolítica dos 15 últimos aminoácidos por FACE1 (e talvez por Reel). A lâmina A perde sua ancoragem ao RE, torna-se solúvel, e é importada no nucleoplasma (como a lâmina C) através do poro nuclear, como todas as proteínas solúveis, graças ao seu sinal de localização nuclear que recruta o complexo de importação necessária (Figura 8 anexada).

No nucleoplasma, a lâmina A (e a lâmina C) se localiza na lâmina nuclear, sob o envelope nuclear, onde interage com numerosas proteínas inseridas no folheto nucleoplásmico do envelope. As lâminas A e C (ao contrário das lâminas B) são também dispersas no resto do nucleoplasma onde entram na constituição da matriz nuclear ou núcleo esqueleto (Figura 6 anexada).

A matriz nuclear controla o funcionamento do genoma nuclear: replicação, reparação do DNA, transcrição dos RNA,

28/138 splicing do RNAm, maturação de outros RNA, e seus constituintes, incluindo as lâminas A e C, interagem com numerosas proteínas importadas no nucleoplasma (p53, SREBP...) como foi mostrado as anomalias observadas durante as laminopatias de origem genética (Broers e col,, 2006; Vlcek e col., 2001; Vlcek e Foisner, 2006). A área nucleoplásmica do envelope nuclear e suas proteínas transmembranares, bem como as lâminas da lâmina contribuem para o armazenamento dos fatores de regulação da transcrição, antes de sua utilização e regulação da expressão dos genes (Heessen e Fornerod, 2007; Shaklai e col., 2007).

As primeiras laminopatias descobertas a partir de 1999 se apresentam como doenças predominando em um dado tecido, músculo esquelético, músculo cardíaco, etc, enquanto as lâminas são das proteínas ubiquistas (Vlcek e Foisner, 2007a; Vlcek e Foisner, 2007b; Worman e Bonne, 2007) . Os lipodistrofias se associam as anomalias do metabolismo dos lípidos e uma insulino resistência com uma perturbação da repartição corporal do tecido adiposo, aproximar da lipodistrofia observada durante os tratamentos antirretrovirais (Capeau e col., 2005).

As laminopatias sistêmicas foram descobertas após 2002: displasia acromandibular (OMIM 248370; (Agarwal e col., 2003; Novelli e col., 2002); progeria de HutchinsonGilford (OMIM 176670; (Sandre-Giovannoli e col., 2003; Eriksson e col., 2003); dermopatia restritiva (OMIM 275210; (Navarro e col., 2005; Navarro e col., 2004). Elas interessam o conjunto dos tecidos do organismo dos pacientes, pele e anexos cutâneos, músculos esqueléticos e

29/138 cardíacos, tecido ósseo e cartilaginoso, tecido adiposo e as suas consequências metabólicas, mas sobretudo elas se acompanham de um envelhecimento acelerado, cujo máximo é atingido com a dermopatia restritiva, letal ao nascimento. Estas três doenças são ligadas, seja a uma mutação no gene LMNA codificando as lâminas A e C, seja o gene FACE1 (ZMPSTE24) codificando a protease do RE que cliva duas vezes a pré-lâmina A. A mutação do gene LMNA tem por consequência fazer desaparecer o local de reconhecimento por FACE1 da pré-lâmina A: a proteína não é clivada, conserva então seu resíduo farnesil, é importada no nucleoplasma por deslizamento ao longo das membranas de envelope como são as lâminas B (Pano e col., 2007). A prélâmina A fames ilada permanece a ser ancorada na face nucleoplásmica do envelope nuclear onde perturba a organização da lâmina e as interações entre a lâmina e as proteínas de membrana do envelope, o que se traduz nas deformações nucleares características (Goldman e col., 2004).

O resto da matriz nuclear é desprovido de lâmina A, com as consequências funcionais múltiplas, por exemplo, a ativação das vias a jusante de p53 (Varela e col., 2005), as anomalias da mitose (Cao e col., 2007; Dechat e col., 2007), a reparação do DNA (Liu e col., 2005; Liu e col., 2006; Liu e col., 2007b)... conduzindo à senescência celular (Kudlow e col., 2007). A análise do transcriptoma de células de pacientes progeria mostrou anomalias da expressão de genes implicados na ateroesclerose (Csoka e col., 2004).

Parece provável que o envelhecimento acelerado

30/138 apresentado pelos pacientes tratados com certos antirretrovirais, em particular os PI que inibem ZMPSTE24 (FACE1), obedecem aos mesmos mecanismos.

A mutação do gene LMNA responsável da progeria desmascara um local críptico de splicing que conduz à síntese de um RNAm deletado de 150 nucleotídeos, codificando a progerina, uma pré-lâmina A deletada de 50 aminoácidos e que conserva seu grupamento farnesil. Esta mesma proteína é produzida durante o envelhecimento fisiológico, na ausência de qualquer mutação do gene LMNA, na sequência de um erro, ligado à idade, da maquinaria de splicing (Scaffidi e Misteli, 2006) . A progerina se acumula nos fibroblastos dérmicos localizados sob a lâmina basal, bem como queratinócitos. Podería representar um marcador da senescência cutânea (McClintock e col., 2007) .

As modificações nucleares (hérnias do nucleoplasma no citosol, efração do envelope, irregularidades do contorno nuclear...) observadas nas células de pacientes atingidos de progeria assemelhando-se além das modificações transitórias induzidas pela proteína viral Vpr que facilitam a entrada, por efração transitória do envelope nuclear e da lâmina, o complexo de pré-integração do vírus da AIDS, complexo muito volumoso para ser importado no nucleoplasma via os poros nucleares (de Noronha e col., 2001). Para uma revisão recente sobre estes mecanismos de importação nuclear (Suzuki e Craigie, 2007).

Foi mostrado por outro lado que várias proteínas da face nucleoplásmica do envelope nuclear, cuja emerina, mutada em uma forma de distrofia muscular de EmeryDreiffus, são indispensáveis à penetração no nucleoplasma

31/138 do vírus da AIDS e a infecção de células que não se dividem (Jacque e Stevenson, 2006).

O termo de laminopatia genética agrupa, portanto as patologias resultando de mutações nos genes codificando as lâminas, particularmente LMNA codificando as lâminas A e C, mas também as provocadas por mutações de proteínas associadas, das quais participam na maturação das lâminas.

As anomalias induzidas pelos PI ao nível da matriz nuclear representam, portanto, uma das laminopatias, adquirida, iatrogênico. Que sejam de origem genética ou adquirida, estas anomalias da matriz nuclear têm por consequências uma instabilidade genômica e o envelhecimento celular (Mehta e col., 2007; Oberdoerffer e Sinclair, 2007).

4. A teoria telomérica do envelhecimento envelhecimento celular é controlado por um relógio medindo o comprimento dos telômeros, que são encurtados a cada mitose, um fenômeno que pode ser contrabalançado pela atividade da subunidade catalítica da telomerase (Gilson e Geli, 2007; Stewart e Weinberg, 2006) .

Antes do aparecimento do PCR quantitativo que permite a medida direta do comprimento de telômeros em particular, nas células sanguíneas mononucleadas (Cawthon, 2002; Gil e Coetzer, 2004; Njajou e col., 2007), a medida da atividade da telomerase (TRAP assay) foi realizada sobre as células de pacientes tratados por antirretrovirais, com resultados variáveis, em particular de acordo com o subtipo de linfócito T analisado (Effros, 2000).

Os NRTI inibem a atividade da telomerase (Oliver©, 2007; Yamaguchi e col., 2001).

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As anomalias da lâmina A provocam uma baixa da atividade da telomerase, conduzindo a um encurtamento acelerado dos telômeros. Estes efeitos são observados nas células de pacientes atingidos de progeria, as células tendo sido ou não transfectadas para superexprimir a subunidade catalítica da telomerase (Wallis e col., 2004). Os resultados comparáveis foram obtidos nos fibroblastos de indivíduos sãos superexprimindo após transfecção a lâmina A, normal, mutada ou deletada como na progeria (Huang e col., 2008). A matriz nuclear e as proteínas do envelope nuclear que estão associadas ao nível da lâmina controlam portanto, diretamente ou indiretamente a atividade da telomerase (Pandita e col., 2007).

5. Determinados fatores de regulação da transcrição, em particular p53 e NF-κΒ, são implicados no fenômeno de envelhecimento ou sua regulação.

Duas famílias de proteínas, p53 (Zafon, 2007) e NF-kB (Hayden e Ghosh, 2004), controlam a transcrição de genes muito numerosos e são implicadas em particular no fenômeno de envelhecimento. Estas proteínas participam também nos mecanismos descritos nas outras teorias do envelhecimento e se ligam entre si.

Ao lado de suas funções bem caracterizadas no controle do ciclo celular, a resposta ao estresse, a oncogênese, a reparação das lesões do DNA (Fuster e col., 2007; Helton e Chen, 2007; Sengupta e Harris, 2005), p53 intervém no envelhecimento celular (ver por exemplo: (Bauer e Helfand, 2006; Ben-Porath e Weinberg, 2005; Papazoglu e Mills, 2007; Sharpless e DePinho, 2002; Tyner e col., 2002). A proteína p53 é implicada também nas anomalias induzidas pelas

33/138 laminopatias (Varela e col., 2005), no funcionamento da helicase cuja mutação é responsável pela síndrome de Werner (Brosh e col., 2001; Sommers e col., 2005), a regulação dos telômeros (Wynford-Thomas, 1996) , o controle da respiração mitocondrial (Matoba e col., 2006) independentemente do papel de p53 no desencadeamento da apoptose pela sua interação com as moléculas apoptógenas da membrana externa (Manfredi, 2003; Mihara e col., 2003; Moll e col., 2005) . p53 regula também a via metabólica insulina-IGFl-klotho (ver abaixo).

NF-κΒ está também na interseção de numerosas vias metabólicas. Sua inativação por RNA interfere nos fibroblastos em cultura os protege da senescência (Hardy e col., 2005). Do mesmo modo o bloqueio induzível da expressão de NF-κΒ nas células epidérmicas do camundongo retarda seu envelhecimento via variações da expressão de numerosos genes analisados por microarranjo (Adler e col., 2007) .

6. A teoria metabólica do envelhecimento via restrição calórica e as vias de sinalização da insulina, do IGF1 e do hormônio klotho ligam a membrana plasmática, o núcleo e a mitocôndria.

A restrição calórica induziu o aumento da duração de vida nos roedores (Bordone e Guarente, 2005) . Ela ativa as sirtuína desacetilases, que atacam por sua vez as histonas (com uma remodelagem da cromatina) (Vijg e Suh, 2006) , de numerosas outras proteínas nucleares (dos fatores de transcrição cujo p53, das proteínas participando da reparação do DNA...) , mas também citosólicas (tubulina) e mitocondriais (Guarente e Picard, 2005; North e Verdin,

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2004; Porcu e Chiarugi, 2005).

A restrição calórica provoca a biogênese das mitocôndrias através da expressão da NO-sintase endotelial, eNOS (Nisoli e Carruba, 2006; Nisoli e col., 2005), com resultado o aumento da produção de ROS (Gredilla e Barja,

2005) .

As vias de sinalização da insulina e do IGF, implicados no envelhecimento (Bartke, 2005; Russell e Kahn, 2007) são inibidas pela restrição calórica (Holzenberger e col., 2004; Masoro, 2004).

A restrição calórica inibe também as vias de sinalização controladas pelo hormônio klotho (Kurosu e col., 2005; Unger, 2006), cujas mutações se acompanham de um envelhecimento prematuro no camundongo (Kuro-o e col., 1997) . Klotho é um regulador da resposta induzida pelo receptor FGF-23 (Kurosu e col., 2006). As mutações de klotho e FGF-23 induzem o mesmo fenótipo de envelhecimento prematuro, das quais sabe-se que é causada por uma hipervitaminose D e que é corrigida pela deleção de um gene aumentando o efeito da vitamina D (Razzaque e Lanske,

2006) . Klotho bloqueia além disso a resposta dos receptores Wnt (Liu e col., 2007a), o que mostra a diversidade das vias metabólicas implicadas no envelhecimento. Por último, a insulina estimula, através da fosfatidil-inositol 3 quinase, a divagem do precursor transmembranário de klotho pelas metaloproteases da família ADAM e a liberação de klotho no meio extracelular (Chen e col., 2007).

A proteína p53 intervém também na regulação destas vias metabólicas (Campisi, 2004; de Oliveira, 2006; Kim e col., 2007; Schmid e col., 2007).

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A proteína p66^shc representa um dos sinais de comunicação entre os receptores da membrana plasmática para a insulina e para o IGF1, o núcleo e a mitocôndria (Martin e Friedman, 2004) . Os camundongos KO p66^shc_/· mostram uma maior resistência ao estresse e um aumento de sua duração de vida (Migliaccio e col., 1999). p66^shc é um alvo de p53, localizado na mitocôndria que controla o metabolismo e a produção de ROS (Migliaccio e col., 2006; Nemoto e col., 2006; Orsini e col., 2004; Trinei e col., 2002). Uma deleção de p66^shc inibe o envelhecimento das células-tronco cardíacas e previne os acidentes cardíacos, dois fenômenos induzidos pelo diabetes (Ligação e col., 2006). p66^shc é também uma enzima redox. Em resposta ao estresse celular, p66^shc é importado na mitocôndria e localizado no espaço intermembranário onde sintetiza H₂O₂ (seja 30% do H₂O₂ celular, o resto sendo produzido pelo peróxissoma) utilizando os elétrons cedidos pelo citocromo C (Giorgio e col., 2005). H₂O₂ poderia representar um sinal intracelular de regulação da duração de vida (Giorgio e col., 2007).

Exposição da invenção

Após longas pesquisas, os inventores mostraram que a associação de um inibidor de hidróximetilglutaril-coenzima A redutase (família das estatinas) e um inibidor da farnesil-pirofosfato sintase (família dos aminobifosfonatos, NBP), ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, é um tratamento eficaz das situações, patológicas ou não, ligadas à acumulação e/ou a persistência nas células de proteínas preniladas, neste sentido, trata-se do conjunto da via de prenilação das proteínas, tanto em C15 quanto em C20 ou nas formas não

36/138 caracterizadas. Os inventores além disso constataram que a associação de um inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase e um inibidor da farnesil-pirofosfato sintase apresenta um efeito aditivo na restauração do fenótipo normal em fibroblastos de pacientes atingidos por progeria e camundongos apresentando um modelo de dermopatia restritiva. 0 efeito da associação é claramente superior ao efeito de um ou outro dos inibidores utilizados individualmente (Varela e col., 2008 (54 bis)).

A utilização da associação sobre as células de pacientes atingidos por progeria conduz a uma inibição da prenilação das proteínas, portanto ao aparecimento de prélâmina A não farnesilada, à melhoria dos sintomas nucleares e à correção parcial das anomalias da reparação do DNA. A inibição da prenilação é também observada em camundongos apresentando um modelo de dermopatia restritiva e restaura em parte a duração de vida dos camundongos (Varela e col., 2008 (54 bis)).

Os tratamentos antirretrovirais atacam várias vias metabólicas e vários compartimentos celulares, o citosol, o nucleoplasma, a mitocôndria.

Os efeitos secundários destes tratamentos reproduzem alguns dos sinais clínicos e biológicos observados nos pacientes atingidos por laminopatias genéticas causados pelas mutações no gene LMNA ou no gene ZMPSTE24. O ponto comum destas mutações é conservar o grupamento farnesil fixado à lâmina A ou à pré-lâmina A. Este grupamento farnesil ancora a lâmina A na face nucleoplásmica do envelope nuclear ao nível da lâmina, enquanto o resto do nucleoplasma é desprovido de lâmina A solúvel.

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Estas duas anomalias de repartição da lâmina A provocam as consequências deletérias ao nível de várias vias metabólicas nucleares (replicação e reparação do DNA, transcrição de genes, encurtamento dos telômeros...) , têm também as consequências deletérias em outros compartimentos celulares, como a mitocôndria. A disfunção geral da célula causa seu envelhecimento acelerado e a redução da sua duração de vida.

Uma família de tratamentos antirretrovirais, os inibidores de protease, inibe ZMPSTE24, bloqueia a maturação da pré-lâmina A e provoca a persistência na célula de pré-lâmina A farnesilada. A figura 9 anexada representa esquematicamente a teoria do envelhecimento desenvolvida pelos inventores do presente e baseada nas anomalias da maturação da pré-lâmina A e suas consequências funcionais.

Por outro lado, além dos efeitos indiretos dos inibidores da protease viral sobre a mitocôndria, uma segunda família de medicamentos antirretrovirais, os nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa viral, perturbam diretamente a mitocôndria, uma organela da qual sabe-se que as anomalias de seu funcionamento estão associadas ao envelhecimento.

O objetivo é portanto analisar os mecanismos pelos quais estes dois tipos de tratamento antirretroviral provocam o envelhecimento acelerado dos pacientes infectados pelo vírus da AIDS e verificar que estes mecanismos são comparáveis aos que provocam o envelhecimento acelerado dos pacientes atingidos por laminopatia genética.

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Os inventores do presente deduziram que os efeitos secundários descritos acima dos tratamentos antirretrovirais podem ser minimizados graças a uma composição compreendendo ou um tratamento combinando:

Pelo	menos um	inibidor	da	hidróximetilglutaril-
coenzima A	(HMG-CoA)	redutase	ou	um dos seus sais
fisiologicamente aceitáveis, e
pelo	menos um	inibidor	da	farnesil-pirofosfato

sintase ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis.

A presente invenção refere-se portanto a uma composição anti-HIV compreendendo pelo menos um inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase, pelo menos um inibidor da farnesil-pirofosfato sintase, ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, e um agente anti-HIV.

Esta composição pode ser destinada, por exemplo, ao tratamento das situações, patológicas ou não, ligadas à acumulação e/ou a persistência nas células de proteínas preniladas. Em particular, de acordo com a invenção, esta composição é útil para o tratamento de um paciente infectado pelo HIV.

A presente invenção refere-se igualmente a uma composição de acordo com a invenção na qual o agente antiHIV é um agente antirretroviral ou uma mistura de agentes antirretrovirais.

A presente invenção refere-se igualmente a uma composição de acordo com a invenção, na qual o agente antiHIV é um inibidor de protease ou um inibidor da transcriptase reversa.

A presente invenção refere-se igualmente a uma

39/138 composição de acordo com a invenção, na qual o agente antiHIV é um inibidor de protease escolhido no grupo compreendendo fosamprenavir, lopinavir, ritonavir, amprenavir, atazanavir e indinavir.

A presente invenção refere-se igualmente a uma composição de acordo com a invenção, na qual o agente antiHIV é um inibidor da transcriptase reversa escolhida no grupo compreendendo zidovudina, lamivudina, didanosina e epzicom.

Na composição da presente invenção, o agente anti-HIV pode igualmente ser uma associação de uma ou mais antiproteases do vírus e/ou um ou mais inibidores da transcriptase reversa do vírus e/ou um ou mais inibidores da entrada do vírus nas células e/ou um ou mais inibidores da integrase e/ou ou qualquer outro tratamento possuindo um efeito antiviral, em particular todo tratamento reconhecido pelas instituições regulamentares nacionais e/ou internacionais e pela comunidade científica.

A presente invenção refere-se igualmente a uma composição de acordo com a invenção, na qual utiliza-se os compostos que são ao mesmo tempo inibidores da hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase e inibidores da farnesil-pirofosfato sintase.

Muito particularmente, a composição de acordo com a invenção é destinada ao tratamento de um paciente infectado pelo HIV e desenvolvendo os efeitos secundários ligados à acumulação e/ou a persistência nas células de progerina; ainda mais particularmente, ao tratamento das situações ligadas à acumulação e/ou a persistência nas células de pré-lâmina A farnesilada, sejam ou não truncadas ou

40/138 modificadas .

De acordo com a invenção, qualquer inibidor da farnesil-pirofosfato sintase, ou um de seus sais fisiologicamente aceitáveis, pode ser utilizado na preparação da composição de acordo com a invenção.

Os sais fisiologicamente aceitáveis podem ser, por exemplo, os sais formados com os ácidos clorídrico, bromídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, os ácidos carboxílicos como, por exemplo, os ácidos acético, fórmico, propiônico, benzóico, maleico, fumárico, succínico, tártrico, cítrico, oxálico, glioxílico, aspártico, alcanos sulfônicos, tais como os ácidos metano ou etano sulfônicos, arilsulfônicos, tais como os ácidos benzeno ou paratolueno sulfônicos.

Particularmente o inibidor da farnesil-pirofosfato sintase pode ser um dos membros da família dos polifosfonatos, particularmente os aminobifosfonatos (NBP), ou um de seus sais fisiologicamente aceitáveis.

Os polifosfonatos são moléculas sintéticas muito utilizadas no tratamento da osteoporose e da regeneração óssea.

O termo fosfonato se aplica às moléculas muito semelhantes ao fosfato:

o

II

p.

RO / R

RO

Fosfonato

O

II p< ro/7 or RO

Fosfato radical dos bifosfonatos (BP) e o equivalente de uma

41/138 ligação P-O-P como no ATP, por exemplo, mas onde o oxigênio é substituído por um carbono. Isto confere uma estabilidade particularmente específica a estas moléculas.

Um bifosfonato simples seria um equivalente ao ADP, os grupos fosfatos (03P-) sendo substituídos pelo grupo bifosfonato.

Q---p---- _C---- p--q.

O carbono central, fosfatos, pode ainda ser ao contrário do oxigênio dos implicado em 2 ligações, e está é a natureza dos grupamentos enxertados sobre este carbono que faz a especificidade dos bifosfonatos.

Quando as cadeias laterais (RI e função amina (NH), ou mais geralmente um nitrogênio, fala-se de amino-bifosfonato,

R2) ou ou comportam uma mais átomos de

NBP.

Certamente, outros substituintes podem ser fixados sobre os oxigênios.

ácido pirofosfórico, ou pirofosfato em solução (PPi) é utilizado transportador de reação. Uma das

HO--P. P—OH

HO OH

Ácido pirofosfórico em numerosas reações metabólicas como substratos, e é restituído no fim da vias metabólicas utilizando as moléculas acopladas ao pirofosfato é a da prenilação protéica.

O enxerto de um isopentenil-PP (unidade básica sobre um geranil-PP (CIO) para dar o farnesil-PP, catalisada pela enzima farnesil-pirofosfato sintase libera um ΡΡι.

em C5) reação (FPS),

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É esta etapa que é inibida especificamente pelos NBP.

A esse respeito e a título de exemplo, o aminobifosfonato (inibidor da farnesil-pirofosfato sintase) pode ser escolhido entre:

ácido alendrônico ou sua forma iônica, o alendronate;

- ácido clodrônico ou sua forma iônica, o clodronato;

- ácido étidrônico ou sua forma iônica, o etidronato;

ácido	ibandrônico,	ou	sua	forma	iônica,	o
ibandronato; - ácido medrônico ou sua	forma	. iônica o medronato;
ácido	neridrônico	ou	sua	forma	iônica,	o
neridronato; ácido	olpadrônico	ou	sua	forma	iônica,	o
olpadronato; ácido	pamidrônico	ou	sua	forma	iônica,	o
pamidronato; ácido	risedrônico	ou	sua	forma	iônica,	o

risedronato;

- ácido tiludrônico ou sua forma iônica o tiludronato;

- ácido zoledrônico ou sua forma iônica o zoledronato;

- ácido 4-N,N-dimetilaminometano difosfônico ou sua forma iônica o dimetilaminometanodifosfonato;

- α-amino-(4-hidróxibenzilideno) difosfonato.

Preferencialmente de acordo com a invenção, prefere-se utilizar o ácido zoledrônico (também chamado ácido zolendrônico) ou sua forma iônica, o zoledronato (também chamado zolendronato).

De acordo com a invenção, qualquer inibidor de HMG-CoA redutase, ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis,

43/138 pode ser utilizado na preparação da composição.

Particularmente o inibidor de HMG-CoA redutase pode ser uma molécula da família das estatinas, que seja liposolúvel ou hidrosolúvel, ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis.

As estatinas foram evidenciadas em cogumelos. Elas têm uma atividade inibidora de HMG-CoA redutase, enzima chave da biossíntese do colesterol e os esteróides, que catalisa a redução do hidróximetil-glutarato acoplado à Coenzima A de ácido mevalônico (mevalonato em solução). Esta inibição é assegurada pela sua analogia estrutural com o esqueleto do hidróximetilglutarato. A via metabólica implicada é certamente a da biossíntese do colesterol, mas é também a da síntese dos grupos prenilas, os polímeros da unidade básica com 5 carbonos isopreno utilizados para modificar cerca de 300 proteínas nas células e uni-las a uma cauda lipofílica, permitindo especificamente sua ancoragem nas membranas.

Os principais poliprenos, todos procedentes do piruvato e do HMG-CoA, são geranila (C10), farnesila (C15) e geranil-geranila (C20).

Todas os estatinas são globalmente hepatoseletivas, mas nem todas têm o mesmo modo de entrada nas células. De fato, pravastatina e rosuvastatina são todas 2 hidrófilas, portanto hidrosolúveis, ao contrário de todas as outras que são lipofílicas, portanto podem se difundir livremente através das membranas plasmáticas (bicamadas lipídicas), o que explica sem dúvida sua mais elevada toxicidade. As estatinas hidrosolúveis têm necessidade de um transportador específico para entrar na célula, Organic Anion Transporter

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3, ou OAT3, ou SLC22A8 (Takedaa e col. 2004 (46)).

São muito utilizadas para o tratamento da hipercolesterolemia, e seus efeitos secundários, raros, são bem caracterizados. Estes são especificamente os casos de rabdom-i ól ise (1 a 7% dos casos de acordo com a molécula utilizada, Evans e col. 2002 (12)), cujo sinal anterior, das dores musculares no paciente tratado, provoca a parada imediata do tratamento.

A esse respeito e a título de exemplo, uma estatina pode ser escolhida entre atorvastatina, sinvastatina, pravastatina, rivastatina, mevastatina (ou compactina), fluindostatina, velostatina, fluvastatina, dalvastatina, cerivastatina, pentostatina, rosuvastatina, lovastatina, pitavastatina, ou um de seus sais fisiologicamente aceitáveis.

A lovastatina, pravastatina e sinvastatina são as moléculas derivadas de metabólitos fúngicos, enquanto os outros, (atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, pitavastatina e rosuvastatina) são inteiramente sintéticos. Preferencialmente de acordo com a invenção utiliza-se a pravastatina, uma estatina semi-natural hidrosolúvel.

Naturalmente é possível de acordo com a invenção utilizar um, dois ou vários inibidores da farnesilpirofosfato sintase associados a um, dois ou vários inibidores de HMG-CoA redutase.

De acordo com uma forma específica da invenção, a composição pode ser destinada por sua vez ao tratamento de um paciente infectado pelo HIV e ao tratamento dos efeitos secundários do tratamento anti-HIV, por exemplo, o envelhecimento da pele, a perda de pelos e/ou cabelos, a

45/138 osteoporose e a lipodistrofia.

De acordo com a invenção, o inibidor da farnesilpirofosfato sintase e o inibidor da HMG-CoA redutase está vantajosamente presente na composição com doses fisiologicamente eficazes.

Geralmente, as quantidades a serem administradas podem ser adaptadas em função do paciente, da patologia, do modo de administração, etc. É entendido que as aplicações repetidas podem ser realizadas, eventualmente em combinação com outros ingredientes ativos ou qualquer veículo.

Em geral a dose diária dos inibidores será a dose mínima para obter o efeito desejado.

De acordo com a invenção, o inibidor de hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase, o inibidor da farnesil-pirofosfato sintase, e o agente antiHIV podem ser utilizados na composição, em mistura com um ou mais excipientes ou veículos inertes, isto é, fisiologicamente inativos e não tóxicos. Pode-se citar, por exemplo, os ingredientes habitualmente utilizados nos medicamentos destinados ao tratamento de pacientes infectados pelo HIV e acompanhando o agente anti-HIV.

A composição da presente invenção pode igualmente compreender pelo menos outro ingrediente ativo, particularmente outro ingrediente terapeuticamente ativo, por exemplo, para uma utilização simultânea, separada ou estendida no tempo seguindo a formulação galênica utilizada. Este outro ingrediente pode ser, por exemplo, um ingrediente ativo utilizado, por exemplo, no tratamento de doenças oportunas, que podem se desenvolver em um paciente infectado pelo HIV.

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A composição da presente invenção é ao mesmo tempo uma composição utilizável para tratar um paciente infectado pelo HIV e prevenir e/ou tratar as desordens cutâneas geradas pela utilização do agente anti-HIV. Esta composição pode ser utilizada de uma terapia múltiplo de um paciente infectado pelo HIV. o agente anti-HIV pode ser único ou múltiplo (vários agentes anti-HIV em mistura). No caso de uma terapia múltipla (por exemplo di-, tri ou quadriterapia), a mistura de inibidores pode acompanhar um dos vários agentes anti-HIV.

O agente anti-HIV pode igualmente ser uma associação de uma ou mais antiproteases do vírus e/ou de um ou mais inibidores da transcriptase reversa do vírus e/ou de um ou mais inibidores da entrada do vírus nas células e/ou de um ou mais inibidores da integrase e/ou ou de qualquer outro tratamento possuindo um efeito antiviral, em particular qualquer tratamento reconhecido pelas instituições regulamentares nacionais e/ou internacionais e pela comunidade científica.

A presente invenção refere-se, portanto igualmente a um processo de tratamento de um paciente infectado pelo HIV compreendendo a administração de uma composição de acordo com a invenção. A composição da invenção é como definida acima.

De acordo com a invenção, a administração pode ser realizada de acordo com todas as vias conhecidas do homem da técnica para a administração de uma composição anti-HIVPode-se tratar, por exemplo, de uma administração realizada por via oral ou por injeção.

Como indicado acima, a dose administrada da composição

47/138 da invenção depende das necessidades do paciente e é igualmente determinada considerando o que é fisiologicamente aceitável pelo paciente.

A quantidade de inibidores na composição da presente invenção pode ser tal que permite, a título de exemplo, a administração de uma dose de inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase de 0,01 a 2 mg/kg de peso corporal e uma dose de inibidor de farnesil-pirofosfato sintase de 0,01 a 40 mg/kg de peso corporal.

De acordo com a invenção, a título de exemplo, na composição da invenção, a razão do inibidor da farnesilpirofosfato sintase sobre o inibidor de hidróximetil glutaril coenzima A redutase, ou de um de seus sais fisiologicamente aceitáveis, pode ser compreendida entre 0,01 e 0,2, de maneira preferida de 0,05 a 0,35.

A quantidade de agente anti-HIV na composição da presente invenção é determinada de maneira clássica seguindo os conhecimentos atuais do homem da técnica no tratamento de pacientes infectados por HIV. Pode ser escolhida, por exemplo, entre as classicamente utilizadas nos pacientes infectados pelo HIV.

Os exemplos de concentração de agente anti-HIV para cada um dos exemplos de agente anti-HIV descrito na presente e cada uma das misturas ou associação de agentes anti-HIV descritos na presente, são dados no Dicionário VIDAL (marca registrada), por exemplo, a Edição 2007. As concentrações indicadas neste Dicionário são as autorizadas para o humano.

A presente invenção refere-se igualmente a um processo

48/138 de tratamento dos efeitos secundários de envelhecimento precoce e/ou lipodistrofia gerados em um paciente submetido aos tratamentos anti-HIV, o referido processo compreendendo a administração de uma mistura compreendendo pelo menos um inibidor do hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase e pelo menos um inibidor do farnesil-pirofosfato sintase.

As condições, quantidades e vias de administração podem ser como descritas no presente, por exemplo acima. 0 agente anti-HIV é, por exemplo, um agente anti-HIV ou uma associação, tal como definido acima.

A presente invenção refere-se geralmente a uma aplicação da mistura de inibidores supracitados tanto como um adjuvante de tratamentos tendo um efeito iatrogênico, por exemplo, um envelhecimento antecipado, cujo a aplicaçao adjuvante às terapias anti-HIV comportando pelo menos uma anti-protease que particularmente provoca este efeito iatrogênico. Assim, qualquer tratamento gerando os efeitos secundários citados no presente é referido pela presente invenção.

A presente invenção refere-se igualmente a um processo de tratamento de um paciente infectado pelo HIV compreendendo em uma ordem qualquer as etapas seguintes:

- administração de uma mistura compreendendo pelo menos um inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A (HMGCoA) redutase e pelo menos um inibidor da farnesilpirofosfato sintase, administração de um agente anti-HIV, em que, as administrações são concomitantes, sucessivas ou alternativas.

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De acordo com a invenção, a referida mistura e ο referido agente anti-HIV podem ser co-administrados. Isso junta-se ao processo da invenção definida previamente.

De acordo com a invenção, o agente anti-HIV pode ser tal como definido acima.

De acordo com a invenção, pelo menos uma das administrações pode ser realizada por via oral ou por injeção. As duas administrações podem ser realizadas da mesma maneira ou diferentemente.

Em outros termos, ainda que na presente descrição seja feita referência a uma composição, compreende-se que cada um dos compostos da composição pode ser administrado concomitantemente aos outros compostos (por exemplo só uma em composição ou duas composições ou três composições, cada uma destas composições compreendendo um ou mais dos componentes supracitados, o modo de administração cada um dos compostos ou composição pode ser idêntico ou diferente), ou independentemente um dos outros, por exemplo sucessivamente, por exemplo, administração independente de um inibidor de hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase e administração independente de pelo menos um inibidor da farnesil-pirofosfato sintase e administração independente de um agente anti-HIV, estas administrações sendo realizadas sobre um mesmo paciente, concomitantemente ou sucessivamente ou alternativamente, em uma ordem que é a supracitada ou outra ordem. Estas diferentes administrações podem ser realizadas, independentemente uma da outra ou de maneira ligada (composição ou co-administração) , por um modo de administração idêntico ou diferente (injeção, ingestão, aplicação tópica, etc.), uma ou várias vezes por

50/138 dia, durante um ou mais dias sucessivos ou não.

De acordo com a invenção, a administração da referida mistura de inibidores pode ser realizada por exemplo, com uma dose de inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A 5 (HMG-CoA) redutase de 0,01 a 2 mg/kg de peso corporal e com uma dose de inibidor da farnesil-pirofosfato sintase de 0,01 a 40 mg/kg de peso corporal.

A administração do agente anti-HIV pode ser realizada como indicada acima.

A título de exemplo unicamente, as posologias são descritas no quadro seguinte para a aplicação de um ou outro dos processos da invenção definida acima. Exemplos de quantidades de inibidores e de agente anti-HIV em uma composição conforme a presente invenção podem ser deduzidas 15 deste quadro.

	Posologia 1	Posologia 2	Via	Largo intervalo anti-HIV
Pravastatina	10 a 20 mg/dia	20 a 40 mg/dia	oral	1 a 100 mg/dia
Sinvastatina	10 mg/dia	10 a 40 mg/dia	oral	1 a 100 mg/dia
Alendronato	10 mg/dia	20 a 40 mg/dia	oral	1 a 50 mg/dia
Solendronato	4 mg/3 sem	seja, 0,20 mg/dia	IV	0,01 a 0,50 mg/dia
Pamidronato	15 a 90 mg/dia		IV	1 a 100 mg/dia
Clodronato	1600 mg/dia	em duas vezes	oral	100 mg a 2 g/dia

IV significa por via intravenosa.

De acordo com a invenção, as posologias relativas ao agente anti-HIV utilizáveis para aplicar a presente invenção podem ser as conhecidas do homem da técnica. Pode se tratar, por exemplo, das posologias descritas no Dicionário VIDAL (marca registrada), por exemplo em a Edição 2007. Para cada um dos exemplos de agente anti-HIV descitos acima e cada uma das misturas ou associação de agentes anti-HIV descritos acima, se encontrará igualmente, no Dicionário VIDAL (marca registrada), por exemplo o Edição, a 2007, das posologias utilizáveis para aplicar a presente invenção.

Outras vantagens poderão ainda aparecer ao homem da técnica com a leitura dos exemplos abaixo, dados a título ilustrativo e ilustrados pelas figuras anexadas.

Breve descrição das figuras

- A Figura 1 ilustra os resultados obtidos em Western

Blot sobre fibroblastos de controle normais tratados com doses crescentes de uma estatina hidrosolúvel (pravastatina P, 20 a 100 μΜ), e de um aminobifosfonato (NBP, zoledronato Z, 20 a 100 μΜ) (Linhas A a I, respectivamente P20/Z20, P20/Z60, P20/Z100, P60/Z20, P60/Z60, P60/Z100, P100/Z20,

P100/Z60, P100/Z100). A linha J é um controle positivo da presença de pré-lâmina A (fibroblastos de pacientes DR), a linha K é o controle negativo, tratado com único solvente (PBS) .

- A Figura 2 ilustra os resultados obtidos com as doses eficazes cada um dos produtos.

- A Figura 3 ilustra o efeito superior obtido durante a administração dos 2 produtos juntos.

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A Figura 4 ilustra a ação da associação dos 2 produtos sobre células idosas.

- A Figura 5 ilustra a multiplicação celular dos fibroblastos por medida do índice mitótico em função das condições de cultura celular. 0 índice mitótico corresponde à relação entre o número de núcleos marcados (entrando em divisão) em relação ao número de núcleos totais do campo observado em função de cada tratamento.

Figura 6: Representação esquemática da teoria mitocondrial do envelhecimento. Os alvos mitocondriais dos tratamentos antirretrovirais. Legenda: NRTI: nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa, PI: inibidor da protease, mtDNA: DNA mitocondrial e ROS: espécie reativa do oxigênio.

Figura 7: Representação esquemática da via de biossíntese dos isoprenóides e seus inibidores.

NBP: aminobifosfonato

FTI: inibidor da farnesil-transferase

GGTI: inibidor da geranil-geranil transferase.

- Figura 8: Representação esquemática da maturação pós-traducional da pré-lâmina A, sua importação nuclear e sua localização no nucleoplasma.

a: pré-lâmina A normal b: maturação da pré-lâmina A deletada na progeria (progerina) ou durante a mutação da protease ZMPSTE24 na dermopatia restritiva. Os inibidores da protease do vírus da AIDS (PI) inibem ZMPSTE24

NPC: poro nuclear

NE: envelope nuclear

HGPS: Síndrome da progeria de Hutchinson-Gildford

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RD: dermopatia restritiva.

- Figura 9: Representação esquemática da teoria do envelhecimento baseada nas anomalias das lâminas e suas consequências funcionais. Legenda: PI: inibidores da protease viral.

- Figura 10: Western blot mostrando que o bloqueio da prenilação da pré-lâmina A necessita da inibição da farnesil-transferase e da geranil-geranil-transferase do tipo I. Detecção da lâmina A/C em células HeLa tratadas por inibidores da farnesil-transferase e/ou da geranil-geranil transferase do tipo I. LA = lâmina A, LC = lâmina C, Pre = pré-lâmina A.

- Figura 11: Análise por espectrometria de massa de proteínas extraídas do envelope nuclear de células não tratadas (a) , células de pacientes progeria tratadas por FTI (2,5 μΜ, b) ou tratadas pela mistura pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada, c).

- Figura 12: Análise por espectrometria de massa de proteínas extraídas do envelope nuclear de fibroblastos não tratados (a) ou tratados pela mistura pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada um, b) provindo de camundongos Zmpste24^_/·.

- Figura 13: A lâmina A (células de controle) e a prélâmina A (células de camundongos Zmpste24^_/·) foram analisadas por espectrometria de massa (MALDI-ToF). a, b: porções do espectro correspondendo aos peptídeos trípticos farnesilados (a) geranilgeranilados (b).

Figura 14: representações de resultados de diferentes experimentações demonstrando o efeito sinérgico da combinação pravastatina + zoledronato sobre a acumulação

54/138 de pré-lâmina A em células de controle e de pacientes progeria: (a) detecção imunocitoquímica da lâmina A/C e da pré-lâmina A em fibroblastos humanos normais, não tratados, tratados por pravastatina e/ou por zoledronato. (b) detecção imunocitoquímica da lâmina A/C e da pré-lâmina A em fibroblastos humanos normais e pacientes progeria tratados pela combinação pravastatina + zoledronato. (c) análise quantitativa do efeito do tratamento pravastatina + zoledronato sobre a morfologia nuclear de células de pacientes progeria, (d) análise quantitativa do efeito do tratamento pravastatina + zoledronato sobre a morfologia nuclear de células de pacientes progeria na presença de farnesol, geranilgeraniol ou os dois compostos. Barras de erro = média ± erro padrão da média. Escala = 10 pm.

- Figura 15: representação de resultados de tratamento por pravastatina + zoledronato mostrando a correção da morfologia nuclear e a indução de uma relocalização parcial das isoformas da lâmina A/C e da lâmina BI da lâmina nuclear no nucleoplasma, em células de pacientes progeria. (A) imunofluorescência e microscopia confocal. As imagens a à c de cada painel são projeções da intensidade média de 27 imagens da célula e mostram os túbulos do retículo nuclear marcados pela calreticulina nas células progeria incubadas com o PBS. Imagens d à 1: cortes confocais isolados de 0,2 pm de espessura. Efeito do tratamento pravastatina + zoledronato (g) e (h). (B) Colocalização da lâmina BI e da calreticulina. Escala = 5 pm.

- Figura 16: representação do efeito da pravastatina e do zoledronato associados ou não sobre a morfologia nuclear de células de camundongos Zmpste24^_/' (a) e de camundongos

55/138 de controle (b) em cultura, na presença de farnesol, geranilgeraniol ou as duas moléculas.

Figura 17; Efeito do tratamento pravastatina + zoledronato sobre as anomalias da reparação das fraturas dupla fita (DSB) do DNA nas células de pacientes progeria. Imunodetecção dos foci da histona H2AX fosforilada detectados 24 h após irradiação, foci correspondendo às fraturas de dupla fita não reparadas (imagens da parte superior). Marcação nuclear do DAPI (imagens da parte inferior). Curvas de baixo: evolução do número de foci de histona H2AX fosforilada em função do tempo após irradiação nas células de controle (quadrado cheio) e nas células progeria (círculo vazio) incubadas com o PBS ou tratadas com pravastatina + zoledronato. Cada curva representa a média ± erro padrão da média de pelo menos 3 experiências.

Figura 18: Efeito do tratamento pravastatina + zoledronato sobre o fenótipo progeróide de camundongos Zmpste24^_/·: (a) fotografias representativas de camundongos de 3 meses de idade Zmpste24^+/+, Zmpste24^_/· e Zmpste24'^/‘ tratados pela combinação pravastatina + zoledronato. Escala = 1 cm. (b) peso de camundongos de 3 meses de idade Zmpste24^+/+ (n = 12) , Zmpste24^_/· (n = 13) e Zmpste24'^z· tratados (n = 15) . (C) curvas de Kaplan-Meier mostrando um aumento significativo da duração de vida dos camundongos Zmpsie24^_/· tratados, (d) Representação tridimensional por microtomografia informatizada da tíbia de camundongos Zmpste24‘^/’ tratados e não tratados (imagem da parte superior). 0 painel de baixo representa o volume ósseo relativo e o número de trabéculas ósseas nos camundongos Zmpste24'^/ não tratados e tratados, (e) Quantificação das

56/138 anomalias nucleares dos hepatócitos de camundongos Zmpste24^+/+, Zmpste24^_/· e Zmpste24^_/· tratado. As setas brancas mostram os núcleos anormais. Escala = 10 pm. (f) expressão relativa dos genes alvos da p53 no fígado e no coração de camundongos Zmpste24^+/+, Zmpste24^_/· e Zmpste24'^/‘ tratados, analisados por RT-PCR quantitativo. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001. As barras de erro representam a média + erro padrão da média.

- Figura 19: Efeito da pravastatina sozinha ou do zoledronato sobre a duração de vida dos camundongos Zmpste24^_/‘: Curvas de Kaplan-Meier pravastina sozinha (a) e zoledronato sozinho (b) sobre camundongos Zmpste24‘^/' tratados (diamante vazio) e não tratados (círculos cheios).

- Figura 20: Efeito de um tratamento pravastatina + zoledronato sobre a duração de vida de camundongos Lmna⁷': Curvas de Kaplan-Meier a partir de camundongos Lmna'⁷' tratados por pravastina + zoledronato (n= 12, diamante vazio), comparado aos camundongos não tratados (círculos cheios, n = 11).

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Efeito aditivo da associação de um inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase hidrosolúvel (uma estatina hidrosolúvel: a pravastatina) e um inibidor da farnesil-pirofosfato sintase (um aminobifosfonato: o zoledronato) sobre culturas de células normais e progeróides

A. PROTOCOLOS

A.l Células e cultura celular

As linhagens de células são os fibroblastos de controle AG 16409 provindo do Instituto Coriell, ou

57/138 fibroblastos procedentes de biópsias de pacientes atingidos por Dermopatia restritiva. São cultivadas a 37°C sob 5% de C0₂ em sala P2.

O meio de cultura completo usual é:

- RPMI (Invitrogen) complementado com

-Soro de vitela fetal 20% (Invitrogen)

- L-Glutamina 200 mm (Invitrogen)

- Mistura de Penicilina/Estreptomicina/Fungizona 1 X (Stock 100 X, Cambrex)

A.2 Colheita das células

A colheita das células é realizada por tripsinação da o seguinte maneira (protocolo para um grande frasco, 75 cm , BD Falcon):

- 0 meio é aspirado;

As células são lavadas com 10 ml de PBS IX (Invitrogen);

- 5 ml de uma solução de Tripsina/EDTA IX (Cambrex) são acrescentados;

- 0 frasco é incubado cerca de 6 min a 37°C, o tempo que as células se descolam;

- A tripsina é inibida por diluição em 15 ml de meio completo;

- As células são separadas por centrifugação 10 min a 1000 rpm a 16°C;

- O sedimento é ressuspenso em 2 ml de PBS IX, e recentrifugado nas mesmas condições.

As células obtidas são congeladas para uma utilização posterior, ou são replicadas a partir deste sedimento lavado.

A.3 Tratamentos

58/138

A solução de pravastatina (estatina hidrosolúvel) utilizada é preparada do seguinte modo:

mg de pravastatina (Sigma Aldrich, P4498) são colocados na água estéril para constituir uma solução base a 10 mM.

As concentrações finais testadas foram de 500 nM, 1, 5, 50 e 100 μΜ, obtidas diluindo a solução base no meio completo.

A solução de zoledronate (NBP) utilizada é preparada do seguinte modo:

Uma solução base de ácido (l-hidróxi-2-imidazol-l-il1-fosfono-etil) fosfônico (0,8 mg/ml, Novartis) é ajustada a uma concentração de 2 mM.

As concentrações finais testadas foram de 500 nM, 1, 5, 50 e 100 μΜ, obtidas diluindo a solução base no meio completo.

A.4 Western blot

A.4.1 Preparação das células

Para uma experiência de Western blot, as células são tratadas do seguinte modo:

Cerca de 7,5 x 10⁵ células são semeadas em um grande frasco e cultivadas nas condições acima até a quase confluência (4 dias).

No final de 4 dias, as células são lavadas com PBS IX, e recolocadas no meio completo suplementado com o tratamento.

As células são incubadas o tempo do tratamento (de 6 a 72h, sequencialmente ou simultaneamente) no incubador a 37°C.

No final do tratamento, as células são tripsinadas

59/138 (protocolo acima)

-80°C Western blot

300 μΐ de tampão de

1%

0,1%

0,5% mm mm mm pastilha para 50 e o sedimento obtido armazenado a até a extracção das proteínas.

A.4.2 Extracção das proteínas para sedimento celular é colocado em lise

Triton X100

SDS

Desoxicolato de sódio

NaCl

EDTA

TrisHCl pH 7,4

Inibidor Protease ml (Roche 11697498001)

Extemporaneamente, acrescenta-se:

Ortovanadato de sódio 1 mm

PMSF 1 mm.

As células são expostas a uma sonicação 2 vezes por 30 s (Brandson Sonifier Cell Disruptor B15).

Os restos celulares são centrifugados durante 10 min a

10.000 rpm em 4°C.

sobrenadante protéico é conservado a -80°C até utilização. A dosagem das proteínas é efetuada com o descongelamento.

A. 4.3 Western blot

Gel

Um gel de acrilamide 8% é classicamente utilizado para detectar as diferentes formas de lâminas A/C.

Acrilamida/bisacrilamida 37/1 8%

TrisHCl pH 8,8 375 mm

SDS

0,1

60/138

APS	0,1%
TEMED	0,01%
Um gel de concentração é moldado	sobre o gel
separative
Acrilamida/bisacrilamida 37,5/1	3%
TrisHCl pH 6,8	3 75 mm
SDS	0,1%
APS	0,1%
TEMED	0,01%

A concentração em proteínas das amostras é dosada, e as alíquotas são ajustados a 50 pg por tubo no tampão de lise em qsp 15 μΐ.

μΐ de tampão de carga é acrescentado a cada amostra.

SDS 4%

TrisHCl pH 6,8 100 mm

Glicerol 20% p-mercaptoetanol 20%

Azul de bromofenol vestígios

As amostras são desnaturadas por aquecimento 5 min a 95°C e depositadas nos poços.

A migração ocorreu a 50, em seguida 100 Volts, em um tampão

Tris-Base	0,3%
Glicina	1,44%
SDS	0,1%
=> Transferência
A membrana de	transferência (Hybon P,	Amersham

Biosciences) é preparada por imersão no etanol, seguida de um banho de 5 min em água estéril, e 10 min no tampão de transferência:

61/138

Tris-Base

Glicina

Etanol mm mm

20%

O gel é umedecido durante 20 min no tampão de transferência, em seguida a camada é montada (système Miniprotéan, Biorad).

A transferência ocorreu em geral durante a noite, em câmara fria, a 10 Volts.

A membrana é enxaguada no PBS IX, conservada na umidade, e utilizada para a detecção.

=> Detecção

A membrana é incubada 1 h em temperatura ambiente em uma solução de saturação:

Caseína 10%

Tween 20 0,1%

PBS

Enxágua-se 2 vezes 10 min no tampão de lavagem (Tween 20 0,1%/PBS IX).

anticorpo primário é diluído no tampão de saturação (detalhes e diluição, ver abaixo imunomarcação).

A membrana é incubada com os anticorpos primários 1 h em temperatura ambiente sob agitação.

No final é enxaguada 3x com o tampão de lavagem, em seguida lavada 3x 15 min com o mesmo tampão.

anticorpo secundário (sistema acoplado à peroxidase, Jackson Immunoresearch) é diluído a l/10000e no tampão de saturação.

A membrana é incubada com esta solução 30 a 45 min em temperatura ambiente sob agitação.

No final, é enxaguada 3x com o tampão de lavagem, em

62/138 seguida lavada 3x 15 min com o mesmo tampão.

A detecção é efetuada com o kit ECL Plus Western Blotting System de Amersham Bioscience, de acordo com as indicações do fornecedor.

Após revelação, a membrana é exposta sobre filme

Biomax MR (Kodak) , o tempo necessário para ter um sinal satisfatório.

A.5 Imunomarcação

A.5.1 Preparação das células

Uma cultura de células é tripsinada, e as células contadas sobre célula de Neubauer.

Os poços de cultura estilo Labtech (Nunc, ref. 177399) são semeados, com razão de 5xl0⁴ células por poço. O meio de cultura completo é suplementado pelo our pelos 15 tratamentos (estatina, NBP, os 2) , e as células cultivadas durante o tempo ad hoc.

No final, o meio de cultura é aspirado, os poços desmontados.

As lâminas são lavadas no PBS IX.

0 As células são fixadas em uma solução de paraformaldeído 4% (em PBS) durante 10 minutos em temperatura ambiente.

Uma lavagem de 10 min no PBS IX é efetuada.

As células são desidratadas por banhos sucessivos de 3 min em soluções de porcentagem etanólica crescente (70, 90, 100%, este último banho sendo repetido).

Após secagem, as lâminas são armazenadas a -80°C até utilização.

A. 5.2 Marcação

Após o descongelamento, as células são incubadas 5 min

63/138

em temperatura ambiente em câmara úmida em 50 μΐ	de	uma
solução de permeabilização:
PBS	1 X
Triton X100	0,5%
RNS	5% (Rabbit	Normal
Serum, Vector S5000)
Inibidor de Protease	1 pastilha	para	50
ml (Roche 11697498001)
3 banhos de pré-incubação	de 15 min cada	um	são
efetuados em 50 μΐ da solução de	incubação:
PBS	1 X
RNS	5%
Inibidor Protease	1 pastilha para	50	ml

(Roche 11697498001)

O anticorpo primário é diluído a l/100^e em 50 μΐ de solução de incubação e posto em contaco com as células durante 1 h em temperatura ambiente em câmara úmida.

Os anticorpos primários utilizados são de 2 tipos:

- camundongo antilâmina A/C (lado N-terminal), clone 4A7, dom de G. Morris (Oswestry, UK)

- Cabra anti pré-lâmina A (15 aa extremidade Cterminal), produto SC6214, Santa Cruz Biotechnology, Inc.

rinçagens em 50 μΐ de PBS IX são efetuadas durante 15 min cada uma. A incubação com o anticorpo secundário ocorre durante 1 h em 50 ml de solução de incubação em temperatura ambiente em câmara úmida. Os anticorpos secundários são de dois tipos:

- de burro anticamundongo, Jackson Immunoresearch, diluição a l/100^e

- de burro anticabra, Jackson Immunoresearch, diluição

64/138 a l/200^e rinçagens em 50 μΐ de PBS IX são efetuadas durante 15 min cada uma. Uma incubação com 100 μΐ de solução DAPI 50 ng/ml (SERVA, ref. 18860) é realizada durante 15 min em temperatura ambiente em câmara úmida. 3 rinçagens no PBS IX são efetuadas em recipientes porta-lâminas durante 5 min cada um. Uma última rinsagem é efetuada durante 5 min em uma solução de Tween20 a 0,1% no PBS.

A. 5.3 Montagem

As células são imersas em uma gota de VectaShield (Vector) , recobertos de uma laminula e observadas sobre um microscópio com fluorescência (Leica DMR, Leica Microsystems), equipado de um sistema de câmara coolSNAP (Princeton).

B. RESULTADOS

B.l. Western blot (Figura 1)

Os fibroblastos de controle normais foram tratados com uma estatina hidrosolúvel (pravastatina P, 20 a 100 μΜ), e com um aminobifosfonato (NBP zoledronato Z, 20 a 100 μΜ) em associação (Linhas A a I, respectivamente P20/Z20, P20/Z60, P20/Z100, P60/Z20, P60/Z60. P60/Z100, P100/Z20,

P100/Z60, P100/Z100). 0 western-blot mostra a aparição de uma banda correspondendo ao tamanho da pré-lâmina A não madura (não truncada) em função do aumento de concentração das duas moléculas, o que confirma que a farnesilação é necessária à maturação da lâmina A. Este resultado mostra que o bloqueio da síntese do farnesil-PP em 2 pontos da via metabólica é mais eficaz que um bloqueio em só um ponto sobre a inibição da farnesilação da pré-lâmina A, pelo menos ex vivo.

65/138

B.2. Dose e duração-resposta em imunihistoquimica (Figura 2)

As curvas dose-resposta e duração-resposta permitiram determinar uma eficácia máxima medindo 2 parâmetros sobre as células de controle por um lado, em seguida sobre as células de pacientes HGPS.

A associação pravastatina (hidrosolúvel)/zoledronato (NBP) mais eficaz foi obtida para uma administração de 1 μΜ de pravastatina durante 24 h, de zoledronato durante 12 h sobre as células sãs. Nenhuma toxicidade foi observada. Sobre as células HGPS (células com anomalias nucleares), utilizando o mesmo protocolo de administração, o número de núcleos deformados reduziu de 75 para 40%. A medida da taxa de pré-lâmina A obtida sobre células sãs foi efetuada. Esta medida mostrou que esta taxa é máxima.

B.3. Efeito do tratamento em imunihistoquimica (Figura

3)

A ação combinada da pravastatina e do zoledronato, tratamento: Pravastatina 100 μΜ durante 12 h, Zoledronato 20 μΜ durante 6 h, mostra uma melhor eficácia, pois a taxa de pré-lâmina A produzida em células sãs tratadas (estimada em 35%) é muito mais elevada em associação do que se as moléculas fossesm acrescentadas sozinhas (respectivamente 25 e 15%). Além disso, a taxa de núcleos deformados (sinal de uma toxicidade sobre as células sãs) é mínima (inferior a 10%) , e inferior a este que está sobre as células tratadas com a pravastatina sozinha (cerca de 12%).

B.4. Ação sobre células idosas em imunihistoquimica (Figura 4)

Em função do número de passagens (número de

66/138 repicagem das células), portanto a idade das células, a proporção de núcleos anormais aumenta. Esta característica é típica das células HGPS não tratadas. Se trata-se as células HGPS com a Pravastatina 1 μΜ durante 24 h e Zoledronato 1 μΜ durante 12 h, esta proporção se mantém, e diminui um pouco (menos de 40% contra mais de 80% nas células tratadas com um placebo).

B.5. Conclusão

A associação pravastatina/zoledronato é eficaz com doses para as quais quase nenhum efeito é observado com as moléculas administradas separadamente.

O efeito fisiológico de bloqueio da via de prenilação é portanto, obtido com doses bem inferiores às utilizadas no tratamento único em artigos publicados sobre culturas de células (Kusuyama e col. 2006 (27), 10 μΜ de pravastatina sozinha sobre progenitores de células vasculares; Flint e col. 1997 (13), 25 μΜ de pravastatina sozinha sobre células de músculo de rato neonatal).

EXEMPLO 2: Efeito de uma composição de acordo com a invenção compreendendo um inibidor de hidróximetilglutarilcoenzima A (HMG-CoA) redutase hidrosolúvel e um inibidor da farnesil-pirofosfato sintase sobre a divisão de fibroblastos humanos idosos e sobre fibroblastos humanos jovens

A. OBJETO DO EXEMPLO

No presente exemplo, a avaliação do efeito in vitro de uma composição de acordo com a invenção compreendendo um inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase hidrosolúvel e de um inibidor da farnesilpirofosfato sintase sobre a taxa de divisão celular (índice

67/138 mitótico) de fibroblastos foi medida. Uma comparação do efeito da composição sobre os fibroblastos humanos idosos em relação aos fibroblastos humanos jovens foi igualmente efetuada. O número de ativos utilizados nesta experiência é de quatro, os produtos tendo sido empregados em combinações dois por dois. Os ativos utilizados são:

A-l: Zolendronato

A-2: Alendronato

Bl: Pravastatina

B2: Sinvastatina

As associaçãos particulares que foram utilizadas neste exemplo são: A1B1, A1B2, A2B1, A2B2.

B. PROTOCOLO

Neste exemplo, dois lotes de fibroblastos, fibroblastos idosos (n° de lote: 9052) e jovens (n° de lote: 7080), foram colocados em cultura em um meio RPMI (Invitrogen) contendo 10% de soro de vitela fetal sem

antibióticos	durando	24 h	após	tripsinação	de	caixas
fornecidas.
Os diferentes ativos	foram	acrescentados	a uma
concentração	de 1 μΜ	final	cada	uma durando	24	h (uma

diluição 1000 de uma solução base em água para os compostos Al, A2 e Bl, ou em etanol 100% para o composto B2, foi efetuada).

índice mitótico foi avaliado por incorporação de bromo-desoxi-uridina (BrdU) durante 45 minutos após 24 h de incubação das células com uma das combinações de ativos. Uma revelação imunohistoquímica permitiu revelar as células em fase de síntese de DNA (célula em pré-divisão) . Uma coloração dos núcleos (do material genético) foi realizada

68/138 por incorporação de di-amino fenil indol (DAPI).

A captura de 6 campos microscópicos (OLYMPUS IX 70) permitiu uma medida do índice mitótico por análise de imagem (OLYMPUS Analysis) . o índice mitótico corresponde à relação do número de núcleos tendo incorporado o BrdU sobre o número de núcleos tendo incorporado o DAPI. Um índice médio é calculado estatisticamente com um desvio padrão compreendido entre 0,005 e 0,061.

Um teste de Student bilateral permitiu medir a significação estatística dos resultados obtidos.

C. RESULTADOS

C. l. Observação visual geral das células

Estes resultados mostram muito baixas capacidades de divisão dos fibroblastos idosos na ausência de qualquer tratamento, previamente ao estudo.

Os fibroblastos jovens mostraram uma capacidade de divisão superior à dos fibroblastos idosos. A capacidade de divisão dos fibroblastos idosos foi inferior a 5%, enquanto a capacidade de divisão dos fibroblastos jovens foi de 15,6%. A diferença de capacidade de divisão entre os fibroblastos idosos não tratados e os fibroblastos jovens não tratados foi, portanto igual a 3.

Durante a realização deste exemplo, nenhuma toxicidade foi observada visualmente após 24 h de incubação dos fibroblastos com as combinações de ativos testados.

Durante a realização deste exemplo, nenhum efeito tóxico do etanol (0,1% final) foi observado após 24 h de incubação.

D. AVALIAÇÃO DO ÍNDICE MITÓTICO (Figura 5)

De uma maneira geral, o número de fibroblastos idosos

69/138 sem nenhum tratamento em fase de síntese de DNA foi extremamente baixo: menos de 5% (ver figura 5, coluna 1).

O índice mitótico não foi também não muito elevado para os fibroblastos jovens: da ordem de 15% (ver figura 5, coluna 6).

Por comparação com os fibroblastos idosos de controle sem nenhum tratamento, os fibroblastos de controle expostos ao etanol (0,1%, 24 h) , não apresentam uma diferença significativa (p = 0,11, n=6) do seu índice mitótico. Os valores foram então reagrupados (Controle, n=12).

Os resultados apresentados na figura 5, coluna 2, mostram sobre o índice mitótico dos fibroblastos idosos um efeito ativador de A1B1 = Zolendronato-Pravastatina em relação ao controle (estimulação de um fator 2 máximo) (p < 0,001, n> 6).

Este exemplo mostra, portanto que a aplicação da combinação Zolendronato-Pravastatina tem um efeito ativador da divisão celular de fibroblastos do indivíduo idoso.

Exemplo 3: Efeito da associação de um inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase hidrosolúvel e de um inibidor da farnesil-pirofosfato sintase sobre um modelo de camundongos apresentando uma síndrome progerôide

Os camundongos KO Zmpste24^_/· utilizados aqui são os descritas no artigo citado de Varela e col. 2005 (49) . Uma prova de eficácia da associação das 2 moléculas (pravastatina e zoledronato) foi relatada em colaboração com um laboratório espanhol (Pr C. Lopez-Otin). A eficácia é obtida com doses combinadas não tendo efeito quando os produtos são utilizados separadamente, demonstrando um

70/138 efeito aditivo.

As 2 moléculas (Ácido zolédrônico (Zometa (marca registrada)) 100 pg/kg/dia e Pravastatina 100 mg/kg/dia) foram diluídas no PBS IX e injetadas por via intraperitoneal, diariamente, sobre camundongos idosos de 1 mês e até seu falecimento. Os controles são camundongos selvagens do mesmo modo levados, tratados ao PBS IX sozinho.

A sobrevivência dos camundongos tratados foi melhorada amplamente, é especificamente máxima para as fêmeas, com um alongamento da duração de vida média de cerca de 80%. Os sintomas clínicos da doença são consideravelmente reduzidos em relação aos indivíduos tratados com PBS sozinhos. Especificamente, foi observado um efeito do tratamento sobre a pele e o recrescimento dos pelos destes camundongos em relação aos camundongos tratados com PBS, que mostravam largas zonas glabres.

EXEMPLO 4: Efeitos da associação de um inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase hidrosolúvel e de um inibidor da farnesil-pirofosfato sintase sobre extratos ex vivo de pele humana

A. Protocolo

No presente exemplo, os testes são realizados sobre uma pele provindo de um doador idoso de cerca de 60 anos. Uma preparação de 21 explantes de pele humana é realizada e colocada em sobrevivência em meio BEM (BIO-ECs Explants Medium).

Os explantes são repartidos em 3 lotes de seis explantes e um lote de controle T0 de 3 explantes, do seguinte modo:

71/138

- TO Controle plastificado: 3 explantes

- T Controle não tratado: 6 explantes

- R Controle positivo: 6 explantes

- P Explantes tratados pela composição da invenção: 6 explantes

A. 1. Tratamento tratamento é realizado em diferentes dias, ao primeiro dia (J0), 2 horas após a preparação dos explantes, em seguida J+l dia, J+2 dias, J+4 dias, J+6 dias, J+8 dias e J10+ dias.

Os produtos são aplicados sobre os explantes do seguinte modo:

- T os explantes não recebem nenhum tratamento,

- R os explantes recebem cada um em JO, J+2 e J+4, lmg do controle positivo (creme com retinol)

- Pl os explantes recebem cada um e a cada tempo de tratamento 2 mg do produto P.

O tratamento é realizado por aplicação tópica da composição da invenção. A composição é em seguida repartida sobre toda a superfície do explante, com a ajuda de uma espátula. A metade do meio de cultura é renovada todos os dois dias e os explantes são entregues em sobrevivência a 37°C em atmosfera úmida enriquecida de 5% de C0₂.

A. 2. Amostra para a histologia

Em J0, os dias 3 explantes do lote TO são amostrados.

Em J+6 dias e J+ll dias, 3 explantes de cada lote são amostrados. As amostras são cortadas em dois, uma metade é fixada no formol e a outra metade é congelada a -80°C, de acordo com o procedimento BIO-1EC P006-PPEH.

B. Estudo histológico

72/138

Após 24 horas de fixação no formol, as amostras são desidratadas, impregnadas e revestidas em parafina. Os cortes de 5pm são realizados para observação morfológica.

B.l. Primeira etapa: estudo morfológico

O estudo morfológico das estruturas epidérmicas e dérmicas é realizado sobre os cortes corados ao tricoma Masson, variante de Goldner.

B.2. Segunda etapa:

B.2.1 Imunomarcação do Kl67:

A imunomarcação das células em mitoses é realizada sobre cortes congelados com o anticorpo policlonal antiKI 67 (Novo Castra) revelado em DAB. As células positivas são contadas sobre todo o comprimento epidérmico e as médias relatadas ao número de células marcadas por cm.

B.2.2 Imunomarcação do colágeno I:

A imunomarcação do colágeno I será realizada sobre cortes congelados com o anticorpo policlonal anticolágeno I revelado em FITC. Os núcleos são contra-coloridos com o iodeto de propídio.

B.2.3 Imunomarcação do colágeno III:

A imunomarcação do colágeno III é realizada sobre cortes congelados com o anticorpo policlonal anticolágeno

III revelado em DAB. Os núcleos são contra-coloridos com o hemalun de Masson.

B.2.4 Imunomarcação do colágeno IV:

A imunomarcação do colágeno IV é realizada sobre cortes congelados com o anticorpo policlonal anticolágeno

IV (Cliniscience) revelado em FITC. Os núcleos são contracoloridos com o iodeto de propídio.

B.2.5 Imunomarcação do colágeno VII:

73/138

A imunomarcação do colágeno VII é realizada sobre cortes congelados com o anticorpo monoclonal anticolágeno VII revelado em FITC. Os núcleos são contra-coloridos com o iodeto de propídio.

B.2.6 Imunomarcação de PECAM1:

A visualização das células endoteliais é realizada graças à imunomarcação de PECAM-1, realizada sobre cortes congelados com o anticorpo monoclonal anti-PECAM-1 revelado em Fast-red.

EXEMPLO 5: Efeito da associação de um inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A (HWIG-CoA) redutase hidrosolúvel e de um inibidor da farnesil-pirofosfato sintase sobre culturas in-vitro de células constitutivas da pele.

Este exemplo é realizado com as mesmas combinações de ativos apresentados no exemplo 2 acima. Estas diferentes combinações de ativos são utilizadas in vitro a fim de avaliar seu efeito sobre os parâmetros fisiológicos intervindo no envelhecimento cutâneo.

As combinações utilizadas no presente exemplo são A1B1, A1B2, A2B1, A2B2, respectivamente. Estas quatro combinações são testadas com várias concentrações, as experiências sendo feitas em triplo (o que representa pelo menos 36 pontos experimentais).

As concentrações das 4 combinações são propostas pelo requerente e não é portanto previsto neste estado de estudo (exceto a título de controle simples) de citotoxicidade in vitro. A experimentação é feita sobre culturas de células de uma linhagem de fibroblastos, tal como foi apresentada no exemplo 1. Este teste é igualmente aplicado nas culturas

74/138 de queratinócitos. Os parâmetros seguintes são examinados para as 4 combinações de ativos nas concentrações indicadas.

- Medida do índice mitótico.

- Medida da remodelagem da matriz extracelular por contracção de redes de colágeno.

- Medida da reparação de DNA genômico após irradiação com UVB (Estresse fotoinduzido se aproximando das condições do banho de sol)

A medida do índice mitótico é realizada após exposição das células aos ativos durante um tempo único, o índice é avaliado por contagem em análise de imagem dos núcleos celulares tendo incorporado um análogo da timidina tornada fluorescente, sobre o número de núcleos totais. Vários campos são analisados. As fotografias são arquivadas para iconografia.

A remodelagem da matriz extracelular induzida pelos fibroblastos expostos aos ativos é avaliada por incorporação destas células em redes de colágeno e quantificando sua capacidade de retrair estas redes. A avaliação da superfície retraída dá um índice de remodelagem. As fotografias são arquivadas para iconografia.

A medida da reparação de DNA genômico é realizada após irradiação das células a uma dose de UV-b minimizando as condições de um golpe de sol. É previsto, inicialmente, avaliar o efeito dos ativos durante a reparação de DNA seguida de uma cinética de 3 tempos. A quantificação é realizada por detecção e análise de imagem dos dímeros de pirimidina ciclobutano induzidos por irradiação UVB com a

75/138 ajuda de uma técnica imunohistoquímica. As fotografias são arquivadas para iconografia.

Exemplo 6: Objetivo principal: Medida do impacto do vírus HIV e as terapias antirretrovirais nos marcadores nucleares, mitocondriais e citosólicos do envelhecimento celular • Objetivos secundários

- Analisar a predominância das alterações das funções nucleares, mitocondriais e citosólicas em pacientes infectados por HIV,

- Medir a incidência de aparecimento destas anomalias,

- Analisar o tipo e a frequência destas anomalias em função da duração de exposição aos antirretrovirais, globalmente, por classe e por moléculas (duração acumulada de exposição),

- Analisar o tipo e a frequência destas anomalias em função da carga viral HIV intracelular,

- Analisar o tipo e a frequência destas anomalias em função da duração de acompanhamento de infecção pelo HIV

A. PLANO EXPERIMENTAL • Escolha do plano experimental

Este estudo observacional compreende 3 grupos de pacientes:

- Grupo A: Pacientes infectados pelo HIV 1 ingênuos de tratamento antirretroviral

Grupo B: Pacientes infectados pelo HIV 1 sob tratamento antirretroviral desde pelo menos 12 meses.

Grupo C: Controles soronegativos para o HIV desemparelhados sobre a idade e o sexo.

B. CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE:

76/138 • Critérios de inclusão:

- idade > 18 anos e < 65 anos:

- assinando um formulário de consentimento

- soropositivo para HIV1 confirmado em Elisa e Western Blott desde pelo menos 5 anos

- soronegativo para o HIV2

- Nunca tendo recebido tratamento antirretroviral ou em primeira linha de tratamento desde pelo menos 12 meses.

• Critérios de não inclusão:

- idade < 18 anos e > 65 anos

- Não assinando o formulário de consentimento

- Soropositivo para o HIV2

Pacientes tratados por estatinas ou aminobifosfonatos

Tratamentos concomitantes não autorizados: testosterona, tratamento de um diabetes insulinodependente

C. DESENROLAR DO ESTUDO • Número de pacientes avaliados:

200 pacientes dos quais:

- Grupo A: n= 50

- Grupo B: n= 100

- Grupo C: n= 50

Os pacientes do grupo A necessitando durante o seu acompanhamento a aplicação de uma terapia antirretroviral tem uma avaliação suplementar durante a instauração do tratamento e são analisados a partir desta data com os pacientes do grupo B.

Os dados medidos durante o período no qual foram colocados no Grupo A permitem medir o papel direto eventual do vírus HIV sobre as funções nucleares e mitocondriais.

77/138

Os pacientes do grupo B necessitando de uma modificação de tratamento antirretroviral durante os estudos, têm uma avaliação clínica e paraclínica idênticas previstas no quadro do acompanhamento durante a mudança de tratamento. Os dados de acompanhamento destes pacientes são considerados para o cálculo da incidência das perturbações das funções nucleares e mitocondriais observadas nos pacientes expostos aos antirretrovirais.

- Duração do estudo:

A duração do estudo é de 36 meses.

Para os pacientes dos Grupos A e B • Histórico da infecção pelo HIV:

- Data de diagnóstico da infecção pelo HIV

- Modo de contaminação

- Estado CDC

Para os estados C: diagnóstico da afecção classificando AIDS

Tratamentos antirretrovirais em curso (Data de introdução, Moléculas administradas) • Exame Clínico:

- Peso, Tamanho, índice de massa corporal

- Volta de tamanho, volta de quadril, cálculo da relação Tamanho/quadril • Balanço sanguíneo:

- Medida da carga viral do HIV (limiar de detecção 40 cópias/ml)

- Dosagem da taxa dos linfócitos CD4 e CD8

- Glicemia, Insulinemia, cálculo do HOMA

- Colesterol Total, LDL, HDL Colesterol

- Triglicerídeos

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- Amostra de 3 tubos EDTA de 7,5 ml para análise das funções nucleares e mitocondriais, medida do DNA pró-viral do HIV e celuloteca • Análise das proteínas nucleares, mitocondriais e citosólicas alvos dos antirretrovirais:

- Western blot e imunomarcações:

- A produção de NFOB e IOB como controles da atividade do proteossoma

- a maturação das lâminas A e B, modelos de proteínas nucleares

- a produção das isoformas de SREBP e sua importação nuclear a N e O-Glicosilação de CD36 purificado e desglicosilado (± 30 kDa de açúcares) (Abeam)

- a importação para a mitocôndria de Hsp70 possuindo um sinal de direcionamento clivado, como medida da atividade de proteases mitocondriais (Abeam)

- as funções respiratórias mitocondriais: produção ROS, estudo das subunidades II e IV da citocromo oxidase (Molecular Probes).

A investigação de uma eventual suscetibilidade aos tratamentos antirretrovirais é realizada genotipando alguns dos alvos, como foi mostrado para a sensibilidade da protease viral ao PI (Baxter e col., 2006) :

- ZMPSTE24 e Reel implicados na maturação das prélâminas A e B1/B2 (em rotina ao laboratório de genética molecular).

- As proteases Sl-P e S2-P permitindo a produção do domínio de SREBP ativo sobre a transcrição dos genes do metabolismo lipídico

79/138

Os transportadores mitocondriais dos desóxinucleosídeos.

Para o grupo controle C:

• Exame Clínico:

- Peso, Tamanho, índice de massa corporal

Volta de tamanho, volta de quadril, cálculo da relação tamanho/quadril

- Amostra de 3 tubos EDTA de 7,5 ml para análise das proteínas nucleares, mitocondriais e citosólicos e colocação na DNAteca, celuloteca.

Visitas de acompanhamento

A avaliação compreende:

• Um Exame Clínico:

- Peso, Tamanho, índice de massa corporal

- Volta de tamanho, volta de quadril, cálculo da relação tamanho/quadril • Um Balanço sanguíneo:

- Medidaade cargo viral do HIV (limiar de detecção: 40 cópias/ml)

- Dosagem da taxa dos linfócitos CD4 e CD8

- Glicemia, Insulinemia, cálculo do HOMA

- Colesterol Total, LDL, HDL Colesterol

- Triglicerídeos

- Amostra de 3 tubos EDTA de 7,5 ml para análise das proteínas nucleares, mitocondriais e citosólicos, medida do DNA pró-viral do HIV e colocação na DNAteca, celuloteca • Análise das proteínas nucleares, mitocondriais e citosólicos alvos dos antirretrovirais (ver acima).

Para os pacientes do Grupo A;

Os pacientes necessitando da aplicação de um

80/138 tratamento antirretroviral tem uma avaliação clínica e paraclínica idêntica à prevista no quadro do acompanhamento durante a instauração do tratamento. Os dados de acompanhamento destes pacientes são analisados a contar desta data no grupo dos pacientes tratados (grupo B).

Para os pacientes do Grupo B:

No caso de modificação de tratamento antirretroviral durante os estudos, uma avaliação clínica e paraclínica idêntica à prevista no quadro do acompanhamento é realizada durante a mudança de tratamento. Os dados de acompanhamento destes pacientes são considerados para o cálculo da incidência , das problemas das funções nucleares e mitocondriais observadas nos pacientes expostos ao antirretrovirais.

D. Resultados esperados, perspectivas

Confirmar in vivo em pacientes infectados pelo vírus da AIDS e submetidos aos tratamentos antirretrovirais os resultados obtidos in vitro em culturas celulares: estes tratamentos, em particular os inibidores da protease, induzem um envelhecimento acelerado de acordo com os mesmos mecanismos que as laminopatias genéticas (com produção de pré-lâmina A farnesilada ou de progerina) ou o envelhecimento fisiológico (com produção de progerina).

Confortar a hipótese segundo a qual a combinação de fármacos (estatina e aminobifosfonato) utilizada na progeria poderia ser utilizada para lutar contra o envelhecimento acelerado de pacientes infectados pelo vírus da AIDS e submetidos a um tratamento antirretroviral e permitir a instauração de um ensaio terapêutico.

Exemplo 7: Um tratamento associando uma estatina e um 't

81/138 aminobifosfonato aumenta a duração de vida de um modelo de camundongos reproduzindo uma síndrome humana de envelhecimento prematuro.

Este exemplo é igualmente publicado em Varela e col., 5 Nature Medicine 2008,7,767 (54 bis).

Material e métodos

Camundongos:

A produção dos camundongos Zmpste24^_/· e Lmna'⁷* foi descrita (Pendas e col. 2002 (38); Sullivan e col., 1999 10 (285). A microtomografia informatizada óssea dos camundongos foi realizada com a ajuda do micro-TC SkyScan 1172 System (SkyScan - marca comercial)). Todas as experimentações sobre os camundongos obedecem às regras establecidas pelo Comitê de Experimentação Animal da 15 Universidade de Oviédo (Espanha). A pravastatina (100 mg/kg/dia) e o zoledronato (100 mg/kg/dia) diluídos no PBS são administrados aos camundongos todos os dias. Os camundongos recebendo o tratamento pravastatina-zoledronato ou os camundongos de controle recebendo unicamente o PBS 20 não apresentam nenhum prejuízo aparente nem estresse.

Cultura celular

Os fibroblastos dérmicos de um indivíduo de controle (GM00038) e de pacientes atingidos de progeria e portadores da mutação G608G (AG11498 e AG01972) foram obtidos do 25 Coriell Cell Repository. As células HeLa provindas do American Type Culture Collection. As células são cultivadas no DMEM (Gibco) suplementadas com 10% FBS (Gibco) e 1% antibiótico-antimicótico (Gibco). Os fibroblastos provêm de caudas de camundongos de 12 dias de idade (Varela e col. , 3 0 2005) . A concentração e a duração do tratamento com a estatina e raminobifosfonato são indicadas na legenda das figuras. Durante o tratamento combinado estatina + aminobifosfonato na presença de farnesol e/ou geranilgeraniol, 1 mM de pravastatina e lmM de zoledronato foram acrescentados no meio de cultura com concentrações crescentes de farnesol e/ou de geranilgeraniol. A porcentagem de núcleos anormais é medida 48 h após o início do tratamento.

Imunocitoquímica

Os fibroblastos são cultivados em câmaras Lab Tek (Nalgen Nunc International), lavados em PBS, em seguida fixados em paraformaldeído 4% durante 15 min. As células são desidratadas em banhos de etanol em concentração crescente e permeabilizadas 5 min a 25°C no PBS contendo Triton X-100 (0,5%), 5% de soro (cabra ou coelho). As lâminas são pré-incubadas a 25°C no PBS durante 5 min.

A diluição dos anticorpos primários é de 1:100 para o anticorpo policlonal de cabra anti pré-lâmina A (Sc-6214, Santa Cruz Biotechnologies), 1:40 para o anticorpo antilâmina A/C (4A7 fornecido por G. Morris), 1:200 para o anticorpo de coelho anticalreticulina (Estressegen) e 1:100 para o anticorpo antilâmina Bl (Abeam) . Após lavagem no PBS, as lâminas são incubadas 1 h a 25°C com os anticorpos secundários diluídos na solução de incubação. A diluição dos anticorpos secundários é a seguinte: 1:100 para IgG de burro anticamundongo acoplada ao FITC (Jackson ImmunoResearch), 1:400 para IgG de burro anticabra acoplada ao Alexa 488, 1:800 para IgG de burro anticabra acoplada ao Alexa 568 (Molecular Probes) e 1:100 para IgG de burro anticoelho acoplada ao tetrametilrodamina isotiocianato (Sigma). As células são em seguida lavadas, os núcleos coloridos durante 15 min em 25°C ao DAPI (100 ng/ml, SigmaAldrich), por último lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,5% de Tween 20. As lâminas são montadas no Vectashield (Vector). Imagens numéricas são registradas com um microscópio Leica DMR equipado de uma câmara CoolSnap ou com um microscópio confocal Leica TCS SP5. Os núcleos são observados em células após marcação da lâmina A/C. Mais de 100 núcleos foram analisados em fibroblastos de controle para cada um dos tratamentos. O número de núcleos de células de pacientes atingidos de progeria analisado é de 250 (passagem 8), 198 (passagem 13) e 150 (passagem 20).

Irradiação X e estudo da histona H2AX fosforilada.

As células de pacientes progeria e as células de controle 1BR3 é são irradiadas com um aparelho X Philips. 0 feixe X é produzido por um ânodo de tungstênio submetido a uma tensão de 20 0 kV sob uma intensidade de 2 0 mA com um filtro de cobre de 0,1 mm de diâmetro. A vazão de dose é de 1,243 Gy/min. A histona fosforilada H2AX é detectada com anticorpos reconhecendo especificamente a serina 139 fosforilada (Upstate Biotechnology-Euromedex, Mundolsheim, França) com a diluição 1:800 e os anticorpos anticamundongo conjugados ao FITC (1:100, Sigma-Aldrich) . O número de fraturas dupla fita (DSB) em função da duração da reparação foi ajustado com a fórmula Nt = N0. (1/1 + pt)^a, onde tem α e p são parâmetros ajustáveis e Nt e N0 o número de DSB ao tempo t e ao tempo 0.

Western blot

As células são homogeneizadas no meio seguinte: 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM NaF, 1 mM

84/138 ditiotreitol, 2 mg/ml pepstatina A, na presença dos inibidores de proteases (Complete inhibitor cocktail, Roche) e inibidores de fosfatases (Fosfatase Inhibitor Cocktail I e II, Sigma) . Após eletroforese, as proteínas são transferidas sobre as membranas de nitrocelulose bloqueadas com 5% de pó de leite deslipidizado, com a ajuda do tampão TBS-T (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl e 0,05% Tween-20) , e incubadas 1 h com um anticorpo antilâmina A/C específico (4A7, 1:500), ou antilâmina A específico (C20, Santa Cruz Biotechnology, 1:250) ou um antibeta actina (A5441, Sigma, 1:5000). Os anticorpos são diluídos no TBS-T contendo 3% de pó de leite deslipidizado. Os blots são em seguida incubados com um anticorpo acoplado à peroxidase (cabra anticamundongo ou anticoelho, Jackson ImmunoResearch) no TBS-T contendo 1,5% de pó de leite deslipidizado, em seguida lavados, por último revelados por quimioluminescência (Immobilon Western chemiluminescent HRP substrate, Millipore - marca comercial).

Análise por espectrometria de massa

Os fibroblastos de camundongos de controle e Zmpste24‘ ^/_ bem como as células linfoblastóides de pacientes progeria foram homogeneizados, os núcleos isolados por ultracentrifugação e as proteínas nucleares obtidas como descrito Blobel e Potter, V.R. Nuclei from rat liver: isolation method that combines purity with high yield, Science 154,1662-1665, 1966. As proteínas da lâmina nuclear foram separadas por eletroforese SDS-PAGE, e as bandas contendo a lâmina A, a pré-lâmina A e a progerina foram excisadas. Os fragmentos do gel foram lavados duas vezes com 180 ml de uma mistura amônio bicarbonato/acetonitrila

85/138 (70:30, 25 mM) , secos (15 min, 90°C) e digeridos (1 h, 60°C) com tripsina (12 ng/ml, Promega) no bicarbonato de amônio 25 mM. Em uma experimentação típica, 1 ml de CHCA (ácido a-ciano-4-hidróxicinâmico, Waters) é colocado em um espectrômetro MALDI-ToF. Uma vez seco, 1 ml da solução de peptídeos e 1 ml da matriz (CHCA) são colocados no espectrômetro equipado com uma fonte laser (Voyager-DE STR (marca comercial), Applied Biosystems). Os dados recolhidos à partir de 200 tiros laser produzem espectros analisados com o programa Datar Explorer (versão 4.0.0.0, Applied Biosystems).

PCR quantitativo em tempo real

A taxa de expressão de genes alvos de p53 (Atf3, Gadd45g e Cdknia, qui codifica p21) foi medida com o aparelho ABI PRISM 7900HT Sequence detection System (Applied Biosystems).

Análise estatística

A diferença entre os diferentes grupos de camundongos e de células, tratadas ou não, foi analisada com a ajuda do teste de Student. Os cálculos foram realizados com a ajuda do programa Microsoft Excel. Os dados são expressos em média + erro padrão da média (SEM).

Resultados

As células HeLa são cultivadas em presença de inibidores da farnesil-transferase (FTI-277, Sigma-Aldrich) e/ou da geranil-geranil transferase do tipo I (GGTI-2147, Sigma-Aldrich) nas concentrações indicadas. Só a combinação dos dois inibidores conduz à acumulação nas células de uma quantidade importante de pré-lâmina A não prenilada em relação ao efeito cada um dos inibidores utilizados

86/138 sozinhos .

Estes resultados são mostrados na figura 10 que é uma fotografia de um Western blot obtido mostrando a detecção da lâmina A/C em células HeLa tratadas por inibidores da farnesil-transferase e/ou da geranilgeranil transferase do tipo I. LA = lâmina A, LC = lâmina C, Pre = pré-lâmina A.

Estes resultados confirmam que o bloqueio da prenilação da pré-lâmina A necessita ao mesmo tempo da inibição da farnesil-transferase e da geranil-geraniltransferase do tipo I em conformidade com a presente invenção.

O inibidor da farnesil-transferase (FTI) induz a geranil-geranilação compensatória da progerina (em células de pacientes atingidos de progeria) e em fibroblastos de camundongos Zmpste24'^/

A análise por espectrometria de massa mostra como esperado a presença de peptídeos trípticos da pré-lâmina A farnesilada e carbóximetilada nas células de camundongos Zmpste24^_/·, mas não nas células de camundongos de controle. Estes resultados são mostrados sobre a Figura 13a. O peptídeo farnesilado é desprovido de 3 resíduos SIM o que mostra que Zmpste24 não é indispensável à primeira divagem durante a maturação da pré-lâmina A. Uma diminuição da quantidade de pré-lâmina A farnesilada é observada nas células de camundongos tratadas por FTI. Durante a observação da parte do espectro correspondendo aos peptídeos geranilgeranilados, nenhum peptídeo derivado da pré-lâmina A pôde ser detectado nas células de camundongos Zmpste24^_/· não tratadas. Mas um peptídeo cuja massa é compatível com um fragmento geranilgeranilada da pré-lâmina

87/138

A é detectado após tratamento com o FTI. Estes resultados são mostrados sobre a Figura 13b.

Nas células de pacientes progeria, os peptídeos correspondendo à progerina farnesilada e carbóximetilada são detectados na ausência de qualquer tratamento, como indicado na Figura 11a. O tratamento destas células por FTI-127 provoca o aparecimento de peptídeos cuja massa corresponde aos peptídeos geranilgeranilados da progerina, como isso aparece sobre a Figura 11b.

O conjunto destes dados mostra que o progerina e a pré-lâmina A geranilgeraniladas de maneira alternativa sob o efeito dos FTI e forneu uma explicação com baixa eficácia dos tratamentos por FTI nos modelos murinos de síndrome progeróides.

As células de pacientes progeria e de camundongos Zmpste24^_/· foram utilizadas para avaliar estratégias terapêuticas destinadas a prevenir a prenilação cruzada da pré-lâmina A e da progerina. Fizemos a hipótese que a farnesilação das variantes anormais da lâmina A poderíam ser inibidas por fármacos agindo sobre a via de biossíntese da farnesil-pirofosfato, substrato da farnesil-transferase e precursor da geranilgerani1 pirofosfato, substrato da geranil-geranil transferase do tipo I. Portanto testamos o efeito de dois fármacos, uma estatina e um aminobifosfonato, conhecidos por agir em duas etapas desta via metabólica, sobre células de pacientes progeria. A análise por espectrometria de massa mostra que a associação pravastatina (estatina) zoledronato (aminobifosfonato) provoca o aparecimento de um peptídeo correspondendo à extremidade C-terminal não prenilada da progerina, peptídeo

88/138 não detectável nas células tratadas por FTI, enquanto os peptídeos farnesilados e os peptídeos geranilgeranilados também não são detectados, como isso aparece sobre a Figura 11c. O tratamento estatina + aminobifosfonato inibe efetivamente a prenilação da progerina. A mesma observação foi realizada para a pré-lâmina A, como isso aparece sobre a Figura 12. Seu peptídeo C-terminal, não prenilado, é detectado nas células tratadas pela mistura estatina + aminobifosfonato, que então está ausente das células não tratadas, nas quais encontra-se o peptídeo farnesilado e carbóximetilado. Por último, o tratamento pravastatina + zoledronato não indica a pré-lâmina A geranilgeranilada, ao contrário do FTI.

Legenda da figura 13: A lâmina A (células de controle) e a pré-lâmina A (células de camundongos Zmpste24'^z·) foram analisadas por espectrometria de massa (MALDI-ToF). a, b: porções do espectro correspondendo aos peptídeos trípticos farnesilados (a) e geranilgeranilados (b) . Cada um dos picos é marcado com a massa teórica (entre parênteses) do peptídeo provindo da digestão pela tripsina da lâmina A ou da pré-lâmina A. 0 número de resíduos é marcado em azul. A sequência dos peptídeos e sua massa são marcadas em vermelho. FRNA = farnesilado; CM = carbóximetilado; Ger = geranilgeranilado.

Legenda da figura 11: Análise por espectrometria de massa de proteínas extraídas do envelope nuclear de células não tratadas (a), de células de pacientes progeria tratadas por FTI (2,5 μΜ, b) ou tratadas pela mistura pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada, c) . A porção dos espectros correspondendo às proteínas não modificadas, farnesiladas e

89/138 geranilgeraniladas é mostrada no alto, ao meio e em baixo da figura. Cada pico corresponde ao peptídeo tríptico da progerina e é marcado com a massa monoisotópica medida na experiência e pela massa teórica (entre parênteses). O número de resíduos de aminoácidos é marcado em azul. A sequência dos peptídeos e sua massa são marcadas em vermelho.

A progerina é majoritariamente farnesilada (F) e carbóximetilada (Cm) nas células não tratadas (a, painel do meio) , enquanto sob o efeito dos FTI este pico é muito reduzido e a progerina aparece geranilgeranilada e fosforilada (b, painel de baixo). Após tratamento pravastatina + zoledronato, a progerina não modificada é a forma predominante.

Legenda da figura 12: Análise por espectrometria de massa de proteínas extraídas do envelope nuclear de fibroblastos não tratadas (a), ou tratadas por mistura de pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada um, b) , provindo de camundongos Zmpste24‘/‘. A porção dos espectros correspondendo às proteínas não modificadas, farnesiladas e geranilgeraniladas é mostrada em cima, ao meio e em baixo da figura. Cada pico corresponde ao peptídeo tríptico da progerina e é marcado com a massa monoisotópica medida na experiência e com a massa teórica (entre parênteses). O número de resíduos de aminoácidos é marcado em azul. A sequência peptídeos e sua massa são marcadas em vermelho.

Sobre esta figura, observa-se que a pré-lâmina A é majoritariamente farnesilada (F) e carbóximetilada (Cm) nas células não tratadas (a, painel do meio), então as formas não modificadas ou geranilgeraniladas não são detectadas.

90/138

Após	tratamento por pravastatina +	zoledronato,	os
peptídeos prenilados não deixam de ser	detectáveis	e a
forma	não modificada da pré-lâmina A é	predominante	(b,
painel	de cima).

O tratamento por pravastatina + zoledronato corrige as anomalias nucleares de células de pacientes progeria e de camundongos Zmpste24^_/· em cultura, e restaura em parte os mecanismos de reparação das lesões de DNA induzidas por irradiação X (Figuras 14, 15, 16 e 17).

O tratamento pravastatina + zoledronato provoca o aparecimento da pré-lâmina A no núcleo de células de controle (Fig. 14a), como no núcleo de células de pacientes progeria, mas com uma nítida melhoria da morfologia nuclear nestes últimos (Fig. 14b). A análise quantitativa mostra um aumento das anomalias nucleares nas células de pacientes progeria com o número de passagens, número de anomalias que diminuem sob o efeito do tratamento pravastatina + zoledronato (Fig. 14c). Observadas ao microscópio confocal, as células de paciente progeria contêm agregados de lâmina

A/C, invaginações profundas da face nucleoplásmica do envelope nuclear no nucleoplasma (retículo nuclear) marcadas por anticorpos anticalreticulina (Fig. 15a-f). Estes agregados de lâmina A/C estão ausentes de células de indivíduos de controle (Fig. 14j-i) e desaparecem das células de pacientes progeria sob o efeito do tratamento pravastatina + zoledronato (Fig. 14g-i). A localização da lâmina Bl, um constituinte farnesilado da lâmina nuclear, é modificada sob o efeito do tratamento, o que confirma que o tratamento bloqueia a prenilação das lâminas.

Verificamos que a melhoria da forma dos núcleos pelo

91/138 tratamento pravastatina + zoledronato está ligada ao bloqueio da prenilação da progerina, incubando as células com farnesol e/ou geranilgeraniol. A suplementação das células pelo farnesol e o geranilgeraniol permite as células sintetizar o farnesil pirofosfato e o geranilgeranil pirofosfato e portanto prenilar a progerina mesmo na presença de pravastatina + zoledronato (Fig. 14d). O farnesol aboliu o efeito do tratamento pravastatina + zoledronato, o que é outra prova que o efeito do tratamento passa pela inibição da síntese do farnesil pirofosfato. É necessário notar que o geranilgeraniol bloqueia também o efeito do tratamento, o que prova que a forma geranilgeranilada da progerina é também tóxica para as células (Fig. 14d) . Os mesmos efeitos são observados nas células Zmpste24’^/_ (Fig. 16a) o que sugere que os dados relativos à progerina podem ser estendidos à pré-lâmina A, a proteína acumulada nas células Zmpste24^_/·. Nem farnesol, nem geranilgeraniol produzem efeito sobre os fibroblastos de controle, o que elimina a eventualidade de um artefato induzido por estas moléculas (Fig. 16b).

Por último, o tratamento pravastatina + zoledronato provoca uma redução do número de foci da histona H2AX fosforilada, foci diretamente correlacionados com o número de fraturas dupla fita do DNA não reparados (Fig. 17).

Em conclusão, os dados adquiridos que in vitro mostram que a combinação pravastatina + zoledronato inibe parcialmente a farnesilação e a geranilgeranilação, e provoca as modificações esperadas de localização ao nível da lâmina e a redistribuição no nucleoplasma, da pré-lâmina A e da progerina não preniladas nas células Zmpste24^_/· e de

92/138 pacientes progeria. Além disso, a diminuição da quantidade da progerina farnesilada ao nível da lâmina e sua relocalização no nucleoplasma explica os efeitos benéficos do tratamento sobre as células dos pacientes progeria.

Legenda da figura 14: Efeito sinérgico da combinação pravastatina + zoledronato sobre a acumulação de pré-lâmina A em células de controle e de pacientes progeria.

(a) Detecção imunocitoquímica da lâmina A/C e da prélâmina A em fibroblastos humanos normais, não tratados, tratados por pravastatina (60 μΜ, 12 h) , por zoledronato (60 μΜ, 6 h) sozinhos ou associados. (b) Detecção imunocitoquímica da lâmina A/C e da pré-lâmina A em fibroblastos humanos normais e pacientes progeria tratados durante 24 h pela combinação pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada um) . (C) Análise quantitativa do efeito do tratamento pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada um) sobre a morfologia nuclear de células de pacientes progeria. As células tratadas ou não foram imunomarcadas com um anticorpo antilâmina A/C nas passagens 8 (p8), 13 (pl3) e 20 (p20). As setas brancas mostram os núcleos anormais. (D) Análise quantitativa do efeito do tratamento pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada um) sobre a morfologia nuclear de células de pacientes progeria na presença de farnesol, geranilgeraniol ou os dois compostos. Barras de erro = média ± erro padrão da média. Escala = 10 pm.

Legenda da figura 15: 0 tratamento por pravastatina + zoledronato corrige a morfologia nuclear e induz uma relocalização parcial das isoformas da lâmina A/C e da lâmina BI da lâmina nuclear no nucleoplasma, em células de pacientes progeria.

93/138 (A) A colocalização da lâmina A/C e da calreticulina nestas células progeria tratadas ou não. Imunofluorescência e microscopia confocal (Leica TCS SP5, célula tridimensional de imagens 2048 x 2048 pixels, sem 0,2 pm, média de 3 linhas, acumulação de 3 imagens, zoom x 1,7). As imagens a à c de cada painel são projeções da intensidade média de 27 imagens da célula e mostram os túbulos do retículo nuclear marcados pela calreticulina nas células progeria incubadas com o PBS. Imagens d à 1: cortes confocals isolados de 0,2 pm de espessura. O tratamento pravastatina + zoledronato corrige a forma dos núcleos das células progeria, diminui o número dos túbulos do retículo nuclear (g) e a espessura da lâmina nuclear (h).

(B) Colocalização da lâmina BI e da calreticulina. 0 tratamento pravastatina + zoledronato aumenta o sinal de marcação nucleoplásmica pela lâmina Bl, o que indica que a farnesilação desta proteína é inibida em parte. Escala = 5 pm.

Legenda da figura 16: Os precursores da farnesilpirofosfato e do geranil-geranil pirofosfato abolem o efeito do tratamento pravastatina + zoledronato nas células de camundongos Zmpste24^_/· em cultura.

Quantificação do efeito da pravastatina (1 pM) e do zoledronato (1 pM) associados ou não sobre a morfologia nuclear de células de camundongos Zmpste24^_/· (a) e de camundongos de controle (b) em cultura, na presença de farnesol, geranilgeraniol ou as duas moléculas.

Farnesol, geranilgeraniol sozinhos ou associados abolem o efeito do tratamento pravastatina + zoledronato sobre a morfologia nuclear de células Zmpste24^_/~.

94/138

Legenda da figura 17: O tratamento pravastatina + zoledronato corrige em parte as anomalias da reparação das fraturas de dupla fita (DSB) do DNA nas células de pacientes progeria.

Os fibroblastos de controle e pacientes progeria foram incubados com a mistura pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada um) ou com PBS e irradiados com raios X (2 Gy) . A imunodetecção dos foci da histona H2AX fosforilada detectada 24 h após irradiação, foci correspondendo às fraturas de dupla fita não reparadas (imagens de cima). Marcação nuclear do DAPI (imagens de baixo).

Curvas de baixo: evolução do número de foci de histona H2AX fosforilada em função do tempo após irradiação nas células de controle (quadrado cheio) e nas células progeria (círculo vazio) incubadas com PBS ou tratadas com pravastatina + zoledronato. Cada curva representa a média ± erro padrão da média de pelo menos 3 experiências.

tratamento associando pravastatina + zoledronato melhora o fenótipo progerôide de camundongos Zmpste24^_/' (Figuras 18, 19 e 20):

Os camundongos Zmpste24-/- e os camundongos de controle foram tratados diariamente com a pravastatina, zoledronato ou a combinação dos dois fármacos com uma dose que tinha sido mostrada previamente como sendo desprovida de toxicidade no camundongo. Como já observado para as células de paciente progeria, cada um dos fármacos isoladamente, pravastatina ou zoledronato, não melhora a duração de vida dos camundongos Zmpste24^_/· (Fig. 19). Ao contrário, a combinação dos dois fármacos melhora significativamente o fenótipo progerôide dos camundongos

95/138

Zmpste24'^/‘: o tratamento melhora o ganho de peso, aumenta a quantidade de gordura subcutânea, reduz a importância da cifose e da alopecia e aumenta a duração de vida. O valor médio de sobrevivência passa de 101 para 179 dias e a sobrevivência máxima passa de 151 para 222 dias (P < 0,001, Fig. 18c). Ê necessário observar que todos os sinais fenotípicos corrigidos pelo tratamento nos camundongos são também as características da progeria no homem. 0 tratamento combinado corrige a diminuição da densidade óssea que é uma das características dos camundongos Zmpste24^_/· e de pacientes atingidos de progeria ou de uma síndrome progeróide aparentada. A microtomografia óssea informatizada mostra um aumento da mineralização do osso e da espessura cortical tibial nos camundongos tratados (Fig. 18d). Além disso, a quantificação das anomalias morfológicas nucleares no fígado de camundongos Zmpste24^+/+, Zmpste24^_/· e Zmpste24^_/· tratados mostra que o tratamento pravastatina + zoledronato normaliza a forma dos núcleos de células Zmpste24^_/· (Fig. 18e) . O tratamento corrige além disso o aumento da transcrição dos genes alvos da proteína p53, aumento que tinha sido descrito nas células de camundongos Zmpste24^_/· (Varela e col., 2005 (54 A)) (Fig. 18f). Por último, procuramos se o tratamento pudesse ter um efeito para os camundongos Lmna'^ que não podem acumular a pré-lâmina A. o tratamento pravastatina + zoledronato não tem nenhum efeito sobre a duração de vida destes camundongos (Fig. 20), o que é uma prova suplementar que este tratamento pode agir apenas em camundongos que acumulam a pré-lâmina A farnesilada ao envelope nuclear.

Legenda da figura 18: O tratamento pravastatina +

96/138 zoledronato melhora o fenótipo progeróide de camundongos Zmpste24'^/‘:

(a) As fotografias representativas de camundongos de 3 meses de idade Zmpste24^+/+, Zmpste24'^/’ e Zmpste24'^/' tratados pela combinação pravastatina (100 mg/kg/dia) e zoledronato (100 mg/kg/dia) . Escala = 1 cm. (b) Peso de camundongos de 3 meses de idade Zmpste24^+/+ (n = 12) , Zmpste24’^/‘ (n = 13) e Zmpste24^/· tratados (n = 15) . (c) Curvas de Kaplan-Meier mostrando um aumento significativo da duração de vida dos camundongos Zmpste24^_/· tratado (n = 15) comparada à dos camundongos não tratados (n = 13). (d) Representação tridimensional por microtomografia informatizada da tíbia de camundongos Zmpste24^_/' tratados e não tratados (imagem de cima). O painel da parte inferior representa o volume ósseo relativo (volume do tecido ósseo/volume da tíbia) e o número de trabéculas ósseas nos camundongos Zmpste24'^/‘ não tratados (n = 6) e tratados (n = 5) . (e) Quantificação das anomalias nucleares dos hepatócitos de camundongos Zmpste24^+/+, Zmpste24‘^/· e Zmpste24'^/ tratados. As setas brancas mostram núcleos anormais. Escala = 10 pm. (f) Expressão relativa dos genes alvos da p53 no fígado e no coração de camundongos Zmpste24^+/+, Zmpste24^_/· e Zmpste24’^/' tratados, analisados por RT-PCR quantitativo. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001. As barras de erro representam a média + erro padrão da média.

Legenda da figura 19: Nem pravastatina sozinha, nem zoledronato sozinho aumentam a duração de vida dos camundongos Zmpste24’^z·: Curvas de Kaplan-Meier mostrando que a pravastina sozinha (n = 5) (a) , e o zoledronato sozinho (n = 5) (b) não corrigem a duração de vida dos

97/138 camundongos Zmpste24^_/· tratados (diamante vazio) e não tratados (círculos cheios, n = 11).

Legenda da figura 20: O tratamento pravastatina + zoledronato não corrige a duração de vida de camundongos Lmna'^/':

As curvas de Kaplan-Meier mostrando que duração de vida de camundongos Luma'⁷' tratados por pravastina + zoledronato (n= 12, diamante vazio), comparada à de camundongos não tratados (círculos cheios, n = 11) . O tratamento pravastatina + zoledronato é sem efeito sobre camundongos desprovidos da lâmina A/C.

Resumo/conclusão/perspectivas

Várias síndromes progeróides humanas, cuja progeria de Hutchinson-Gilford, são causadas pela acumulação ao nível do envelope nuclear de uma forma farnesilada de pré-lâmina A deletada (progerina) ou não. A progerina também é produzida durante o envelhecimento fisiológico. Estudos precedentes efetuados com células de pacientes atingidos de progeria mostraram que os inibidores do farnesiltransferase (FTI) melhoram a morfologia dos núcleos, sugerindo que estes inibidores poderíam representar um tratamento para estas síndromes devastadoras. Os inventores mostram aqui que a pré-lâmina A e a progerina sofrem uma prenilação alternativa pela geranilgeraniltransferase quando a farnesiltransferase é inibida, o que poderia explicar a baixa eficácia dos FTI para melhorar fenótipo de modelos murinos destas síndromes progeróides.

Mostram também que a combinação de uma estatina e um aminobifosfonato inibe de maneira eficaz ao mesmo tempo a farnesilação e a geranilgeranilação da pré-lâmina A e a

98/138 progerina, melhora significativamente o fenótipo de envelhecimento de camundongos nos quais foi inativado o gene codificando a metaloprotease Zmpste24 implicada na maturação da pré-lâmina A. A melhoria do fenótipo inclui a 5 curva de crescimento, peso, lipodistrofia, queda dos pelos e as anomalias ósseas.

Além disso, a duração de vida destes camundongos é aumentada de maneira substancial.

Estes dados abrem uma nova abordagem terapia das 10 síndromes progeróides humanas com acumulação de proteínas preniladas ao envelope nuclear.

O tratamento pravastatina + aminobifosfonato está em curso de aplicação em Marselha para os 3 anos seguintes em crianças atingidas de progeria no quadro de um ensaio 15 terapêutico europeu (15 crianças) colocadas sob a responsabilidade do Pr. Nicolas Lévy, financiadas pelo Ministério da Saúde (PHRC 2008) e a Associação Francesa contra Miopatias (AFM) e que recebeu a autorização do AFSSAPS e do CCP Sul Mediterrâneo.

0 mesmo tratamento vai ser em seguida feito em Roma, sob a responsabilidade do Pr. Giuseppe Novelli, aos pacientes atingidos de displasia acromandibular, outra síndrome progeróide com acumulação de pré-lâmina A farnesilada.

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138/138

Loss of A-type lamin expression compromises envelope integrity leading to muscular dystrophy. Biol. 147: 913-920, 1999.

Claims (28)

1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende:

- pelo menos um inibidor da hidróximetilglutarilcoenzima A (HMG-CoA) redutase ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, pelo menos um inibidor da farnesil-pirofosfato sintase ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, e

- pelo menos um agente anti-HIV.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o inibidor de HMG-CoA redutase é uma molécula da família das estatinas ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o inibidor de HMG-CoA redutase é uma estatina hidrosolúvel.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que o inibidor da HMG-CoA redutase é escolhido no grupo compreendendo atorvastatina, sinvastatina, pravastatina, rivastatina, mevastatina (ou compactina), fluindostatina, velostatina, fluvastatina, dalvastatina, cerivastatina, pentostatina, rosuvastatina, lovastatina, pitavastatina e seus sais fisiologicamente aceitáveis.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o inibidor da farnesil-pirofosfato sintase é escolhido no grupo compreendendo uma molécula da família dos aminobif osf onatos (NBP) ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis.

Ί/Ί

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que que o aminobifosfonato pode ser escolhido entre:

ácido alendrônico ou sua forma iônica, o

5 alendronato;

- ácido clodrônico ou sua forma iônica, o clodronato;

- ácido étidrônico ou sua forma iônica, o étidronato;

ácido ibandrônico, ou sua forma iônica, o 10 ibandronato; - ácido médrônico ou sua forma iônica, o médronato; ácido neridrônico ou sua forma iônica, o néridronato ; ácido olpadrônico ou sua forma iônica, o 15 olpadronato; ácido pamidrônico ou sua forma iônica, o pamidronato; ácido risedrônico ou sua forma iônica, o risedronato; ácido tiludrônico ou sua forma iônica, o

20 tiludronato,

- ácido zoledrônico (ou zolendrônico) ou sua forma iônica o zoledronato (ou zolendronato);

- ácido 4-N, N-dimetilaminometano difosfônico ou sua forma iônica o dimetilaminometanodifosfonato;

25 - a-amino-(4-hidróxibenzilideno) difosfonato.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que o inibidor da farnesil-pirofosfato sintase é o ácido zoledrônico ou sua forma iônica, o zoledronato.

30

8. Composição, de acordo com qualquer uma das

3/7 reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que o agente anti-HIV é um agente antirretroviral ou uma mistura de agentes antirretrovirais.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que o agente anti-HIV é um inibidor de protease ou um inibidor da transcriptase reversa.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que o agente anti-HIV é um inibidor de protease escolhido do grupo compreendendo fosamprenavir, lopinavir, ritonavir, amprenavir, atazanavir e indinavir.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que o agente anti-HIV é um inibidor da transcriptase reversa escolhido do grupo compreendendo zidovudina, lamivudina, didanosina e epzicom.

12. Processo de tratamento de um paciente infectado pelo HIV caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma composição de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a administração é realizada por via oral ou por injeção.

14. Processo de tratamento dos efeitos secundários de envelhecimento precoce e/ou lipodistrofia gerados em um paciente por tratamentos anti-HIV, o referido processo caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma mistura compreendendo pelo menos um inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase e pelo

4/7 menos um inibidor da farnesil-pirofosfato sintase.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o inibidor de HMG-CoA redutase é uma molécula da família das estatinas ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o inibidor de HMG-CoA redutase é uma estatina hidrosolúvel.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o inibidor de HMG-CoA redutase é escolhido no grupo compreendendo atorvastatina, sinvastatina, pravastatina, rivastatina, mevastatina (ou compactina), fluindostatina, velostatina, fluvastatina, dalvastatina, cerivastatina, pentostatina, rosuvastatina, lovastatina, pitavastatina e seus sais fisiologicamente aceitáveis.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o inibidor da farnesil-pirofosfato sintase é escolhido

no grupo compreendendo uma molécula da família dos aminobifosfonatos (NBP) ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis. 19. Processo, de acordo com a reivindicação 18,

caracterizado pelo fato de que o aminobifosfonato pode ser escolhido entre:

ácido alendrônico ou sua forma iônica, o alendronato;

- ácido clodrônico ou sua forma iônica, o clodronato;

- ácido étidrônico ou sua forma iônica, o étidronato;

ácido ibandrônico, ou sua forma iônica, o

5/7 ibandronato;

- ácido médrônico ou sua forma iônica, o médronato;

ácido neridrônico ou sua forma iônica, o néridronato; ácido olpadrônico ou sua forma iônica, o olpadronato; ácido pamidrônico ou sua forma iônica, o pamidronato; ácido risedrônico ou sua forma iônica, o risedronato; ácido tiludrônico ou sua forma iônica, o

tiludronato,

- ácido zoledrônico (ou zolendrônico) ou sua forma iônica o zoledronato (ou zolendronato);

- ácido 4-N,N-dimetilaminometano difosfônico ou sua forma iônica o dimetilaminometanodifosfonato;

- α-amino-(4-hidróxibenzilideno) difosfonato.

20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o inibidor da farnesil-pirofosfato sintase é o ácido zoledrônico ou sua forma iônica, o zoledronato.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que aadministração é realizada com uma dose de inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase de 0,01 a 2 mg/kg de peso corporal e com uma dose de inibidor da farnesil-pirofosfato sintase de 0,01 a 40 mg/kg de peso corporal

22. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a administração é realizada

6/7 por via oral ou por injeção.

23. Processo de tratamento de um paciente infectado pelo HIV caracterizado pelo fato de que compreende em uma ordem qualquer as seguintes etapas:

i. administração de uma mistura compreendendo pelo menos um inibidor de hidróximetilglutaril-coenzima A (HMGCoA) redutase e pelo menos um inibidor da farnesilpirofosfato sintase, ii. administração de um agente anti-HIV, em que, as administrações são concomitantes, sucessivas ou alternativas.

24. Processo, de acordo com a reivindicação23, caracterizado pelo fato de que a referida misturae o referido agente anti-HIV são co-administrados.

25. Processo, de acordo com a reivindicação23, caracterizado pelo fato de que o agente anti-HIV éum inibidor de protease ou um inibidor de transcriptase reversa.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente anti HIV é um inibidor de protease escolhido do grupo compreendendo fosamprenavir, lopinavir, ritonavir, amprenavir, atazanavir e indinavir.

27. Processo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente anti HIV é um inibidor da transcriptase reversa escolhido do grupo compreendendo zidovudina, lamivudina, didanosina e epzicom.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das administrações é realizada por via oral ou por injeção.

7/7

29. Processo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a administração é realizada com uma dose de inibidor da hidróximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase de 0,01 a 2 mg/kg de peso corporal e com 5 uma dose de inibidor da farnesil-pirofosfato sintase de 0,01 a 40 mg/kg de peso corporal.