BRPI0822486B1 - Trichoderma atroviride sc1 para controle biológico de doenças fúngicas em plantas - Google Patents

Abstract

trichoderma atroviride scl para controle biológico de doenças fúngicas em plantas uma realização da presente invenção é um trichoderma atroviride scl, cbs n°122089, como agente de biocontrole, isto é, para tratar doenças fúngicas de plantas. a segunda realização da presente invenção é uma composição agrícola compreendendo o trichoderma atroviride scl como princípio ativo em uma quantidade efetiva. as composições da presente invenção podem compreender adicionalmente um segundo agente de biocontrole e/ou um aditivo, um emulsificante, um nutriente vegetal, um agente umectante, um micro-nutriente vegetal ou um substrato, onde o dito substrato é selecionado do grupo consistindo em: um meio de cultura nutriente, um cereal ou um derivado deste, um modificador, um vegetal ou uma parte deste, turfa, madeira ou pedaço de madeira, argila ou cascas.

Description

TRICHODERMA ATROVIRIDE SC1 PARA CONTROLE BIOLÓGICO DE DOENÇAS FÚNGICAS EM PLANTAS

Campo da Invenção

O campo da presente invenção é o do controle biológico de doenças em plantas causadas por fungos patogênicos por um agente de biocontrole, representado por uma nova cepa de Trichoderma atroviride.

Antecedentes da invenção

A substituição ou redução do uso de fungicidas químicos tem sido obtida para utilização de fungicidas de base biológica, uma abordagem recaindo na definição de Controle Biológico tal como proposto por Cook e Baker (1983): Controle Biológico é a redução da quantidade de inoculo ou atividade que produz a doença de um patógeno realizada por um ou através de um ou mais organismos outros que não o homem.

Esta definição ampla inclui o uso de variantes menos virulentas do patógeno, cultivares mais resistentes do hospedeiro, e antagonistas microbianos que interferem com a sobrevivência ou atividades produtoras de doença do patógeno.

Uma avaliação mais complexa das interações ambientais é necessária para o uso de tais Agentes de Biocontrole (BCAs). De fato, as condições ambientais afetam não apenas a sobrevivência dos BCAs, mas também, sua eficácia contra os patógenos (Paulitz, 2000) . Os BCAs que são mais flexíveis em termos de adaptação ao meio ambiente podem ser mais facilmente desenvolvidos em produtos comerciais, na medida em que suas aplicações e mercados alvos podem ser maiores que os de BCAs que requerem condições ambientais específicas.

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A seleção de cepas de Trichoderma antagonistas com tolerância aumentada a condições ambientais desfavoráveis pode aumentar a confiabilidade de programas de biocontrole a base de Trichoderma (Kredics et al., 2000). É importante também se observar que BCAs mais efetivos para uso contra patógenos de plantas são aqueles que apresentam melhor tolerância a estresse que seus patógenos alvo (Kredics et al., 2000; 2004).

Trichoderma é um gênero cosmopolita, que pode colonizar solos, rizosferas e filosferas. Espécies de Trichoderma são frequentemente encontradas em madeira e material vegetal em decomposição. Várias cepas de Trichoderma são produtoras economicamente importantes de enzimas industriais.

Cepas de Trichoderma já foram utilizadas como agentes de biocontrole contra numerosos patógenos de plantas e umas poucas foram desenvolvidas para uso como produtos de biocontrole comerciais (isto é, Trichoderma harzianum, conhecida como Trichodex®) para culturas em campo ou estufa (Elad, 2000; Harman, 2000).

Entretanto, existe uma grande variabilidade em termos de atividade de biocontrole, especificidade, mecanismo de ação, produção de metabólitos e sobrevivência em solo ou em planta entre as espécies de Trichoderma, o que afeta seu uso como BCAs (Benitez et al. , 2004). Além disto, existem ainda várias patologias, tais como as causadas pelo gênero Armillaria em videira para o qual agentes de biocontrole totalmente efetivos não foram nem isolados nem caracterizados.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1. Crescimento radial de Trichoderma atroviride SC1 a diferentes temperaturas. Trichoderma atroviride SC1 foi cultivado em dextrose agar de batata

3/45 (PDA) e incubado a diferentes temperaturas: 10 (O), 15 (·) , 20 () , 25 (Δ) e 30°C (x) . Nenhum crescimento foi observado a -1, 5, 37 ou 40°C. Os pontos são médias de dez replicatas. Os valores seguidos pela mesma letra não são significativamente diferentes (P ú 0,05) de acordo com o teste de Tukey. O período antes do início do crescimento (fase lag) foi de 1 dia a 20, 25 e 30°C, 2 dias a 15°C e 3 dias a 10°C.

Figura 2. Efeito do pH sobre o crescimento radial de Trichoderma atroviride SC1. O crescimento foi conduzido em dextrose agar de batata (PDA) a diferentes níveis de pH. pH 3 (Δ), 4 (□), 5 (A), 6 (+), 7 (·), 8 (0), 9 (x) e 10 () . Os pontos são médias de dez replicatas. Os valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes (P 0,05) de acordo com o teste de Tukey.

Figura 3. Efeito da atividade de água sobre a taxa de crescimento de Trichoderma atroviride SC1. Trichoderma atroviride SC1 foi crescido em dextrose agar de batata modificado com glicerol nos níveis de atividade de água de 0,998 (A), 0,990 () , 0,980 (Δ) , 0,960 (x), 0,940 (·) e 0,910 (o). Os pontos são médias de dez replicatas. Os valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes (P 0,05) de acordo com o teste de Tukey. 0 período antes do início do crescimento (fase lag) foi de 1 dia a 0,998, 0,990 e 0,980, 2 dias a 0,940 e 4 dias a

0,910.

Figura 4. Amplificação múltipla de ech42 e tga3. A amplificação foi conduzida utilizando-se a soda específica ech42 () e a sonda genérica tga3 (o) de DNA puro de

Trichoderma atroviride SC1. As curvas de suas diluições se sobrepõem e apresentam a mesma eficiência, coeficiente de determinação (R²) e inclinação.

Figura 5. Recuperação do DNA de Trichoderma atroviride SC1 por PCR em tempo real. A quantidade de

4/45 ácido nucléico é expressa como número de cópias do genoma aplóide em um grama de solo inoculado com uma quantidade conhecida de conídios. O desvio padrão (%) foi calculado a partir de seis quantificações independentes.

Figura 6. Sobrevivência de Trichoderma atroviride SC1 em folha de morango avaliada como unidades formadoras de colônia (CFU). As folhas foram inoculadas no dia 0 por aspersão de uma suspensão de conídios em água (10⁶ CFU•ml^-1) . Os pontos representam as médias de dez replicatas. Os dados foram transformados por log (x) . As barras de erro representam os desvios padrão das médias.

Figura 7. Sobrevivência de Trichoderma atroviride SC1 em microcosmos de solo estáticos. O fungo foi aplicado a uma taxa de 10⁶ CFU-g^-1 solo no dia 0 a três solos estéreis (a) e não estéreis (b) diferentes: Solo 1 (·) , Solo 2 (□) e Solo 3 (Δ) . Os pontos representam as médias de cinco replicatas e foram transformados por log (x) . As letras diferentes para cada dia indicam valores que são significativamente diferentes (P ú 0,05) de acordo com o teste de Tukey.

Figura 8. Efeito do Trichoderma atroviride SC1 sobre a severidade de infecção com oídio. Plantas de pepino (painel A) e abobrinha (painel B) artificialmente inoculadas com conídios de Podosphaera xanthii e comparação com padrões não tratados, tratados com enxofre e dois biocontroles [Trichoderma harzianum T39 - nome comercial Trichodex® - e T. atroviride F122). As avaliações foram feitas duas semanas após a inoculação classificando-se a severidade (percentagem de tecido vegetal infectado). Foram classificadas cinco replicatas (plantas) pó tratamento. As colunas com a mesma letra não são significativamente diferentes de acordo com com o HSD de Tukey (P 0,05). Para a inoculação artificial, aproximadamente 5 ml de uma suspensão aquosa de conídios

5/45 (10⁷ conídios ml -¹) foram aspergidos em cada planta. As aplicações diárias se iniciaram 12 horas após a inoculação.

Figura 9. Eficácia do Trichoderma atroviride SC1 no crescimento dos três principais agentes causadores da doença ESCA.

(Phaeomoniel1 a chlamydospora: painel A;

Phaeoacremonium aleophilum, painel B;

Fomitiporia mediterrânea, painel C) .

A eficácia de controle foi calculada de acordo com a fórmula: [(C-T)/C]xlOO, onde C é o crescimento do patógeno sem o tratamento e T é o crescimento com o tratamento com Trichoderma atroviride SC1. As inoculações dos agentes causadores de ESCA e T. atroviride SC1 foram realizadas em dextrose agar de batata em placas de Petri. Os gráficos representam a média de cinco replicatas (placas de Petri).

Figura 10. Crescimento de micélio de Armillaria mellea e Armillaria gallica (agentes causadores da podridão da raiz) na presença e na ausência (sem tratamento) de Trichoderma atroviride SC1. O experimento do efeito de

Tríchoderma harzianum T39 - Trichodex® - é apresentado aqui como comparação padrão. O crescimento é expresso como média do diâmetro de cinco replicatas crescidas em peças de madeira em PDA em placas de Petri a 20°C.

Figura 11. Percentagem de plantas de morango infectadas (mortas) com Armillaria mellea e A. gallica (dead) após tratamento do solo. 0 efeito do Trichoderma atroviride SC1 foi comparado com o material não tratado.

Foi utilizado Trichoderma harzianum T39 - Trichodex® - como comparação para A. gallica e o T. atroviride F122 é utilizado como comparação para A. mellea. Os valores são percentagens calculadas em 10 plantas de replicata.

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Sumário da Invenção

Uma realização da presente invenção é um Trichoderma atroviride SCI, CBS n°122089, como agente de biocontrole, isto é, o tratamento de doenças fúngicas de plantas.

A segunda realização da presente invenção uma composição agrícola compreendendo Trichoderma atroviride SCI como o princípio ativo em uma quantidade efetiva. As composições da presente invenção podem compreender adicionalmente um segundo agente de biocontrole e/ou um aditivo, um emulsificante, um nutriente vegetal, um agente umectante, um micro-nutriente vegetal ou um substrato, onde o dito substrato é selecionado do grupo consistindo em: um meio de cultura nutriente, um cereal ou um derivado deste, um modificador, um vegetal ou uma parte deste, turfa, madeira ou um pedaço desta, argila ou casca de árvore.

Uma realização adicional é um método para o tratamento ou prevenção de uma doença de planta causada por um fungo patogênico selecionado do grupo daqueles que causam: doenças em madeira (Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum e Fomitiporia mediterrânea), doenças foliares (the agente causador de oídio Podosphaera xanthii), doenças de frutos e flores (Botrytis cinerea) e doenças radiculares causadas pelo gênero Armillaria (Armillaria mellea e A. gallica).

tratamento pode ser conduzido diretamente na planta ou em um aparte da planta, ou indiretamente pela aplicação de substrato enriquecido com Trichoderma atroviride SCI, CBS n°122089 no solo ou sobre este, próximo à planta. As plantas que se beneficiam deste tratamento são preferivelmente selecionadas do grupo consistindo em: Cucurbitaceae, Rosaceae, Vitaceae, Crucifereae, Compositae, Ubelliferae, Solanaceae e Liliaceae.

Realizações adicionais da presente invenção são substratos compreendendo uma quantidade efetiva do

7/45 microorganismo Trichoderma atroviride SC1 ou tratados com composições compreendendo uma quantidade efetiva da dita cepa. Um substrato preferido é representado por casca de árvore ou arroz cozido.

Uma realização adicional é representada por um método molecular para a detecção específica de Trichoderma atroviride SC1 onde a amplificação paralela do gene da endoquitinase 42 (ech42) GenBank n² de acesso AB041753.1 e de uma sub-unidade do gene da proteína G α (tga3) GenBank n^a de acesso AF452097.1 é obtida com conjuntos de iniciadores adequados e onde em uma amostra compreendendo o dito Trichoderma atroviride SC1 são observados dois nucleotídeos polimórficos nas posições 185 e 196 do gene da endoquitinase 42.

Descrição detalhada da invenção

Um objetivo da presente invenção é o de prover um agente de biocontrole pertencente à espécie Trichoderma atroviride, cepa SC1, para a supressão do desenvolvimento de doenças fúngicas na parte aérea de plantas e em raízes.

De acordo com uma realização preferida, o Trichoderma atroviride, cepa SC1 foi depositada em 27 de novembro de 2 007, sob o Tratado de Budapeste no CBS (Centraalbureeau voor Schimmelcultures) sob o n² CBS 122089.

De acordo com o aspecto principal da presente invenção, o Trichoderma atroviride, cepa SC1 é proposto para suprimir e para prevenir o desenvolvimento de patógenos vegetais, em particular: apodrecimento de frutos e raiz, tais como aqueles causados por Botrytis cinerea e Armillaria spp., oídio, doenças de madeira (doença ESCA) ,

De acordo com uma realização preferida, a invenção provê um método para suprimir ou prevenir o desenvolvimento de doenças fúngicas em plantas caracterizado pela utilização de composições compreendendo uma quantidade

8/45 efetiva de Trichoderma atroviride SC1, em uma quantidade de pelo menos 10²-10³ conídios ml·^-1 ou g ^_1 quando são utilizadas composições sólidas.

Trichoderma atroviride SC1 é um fungo mesófilo como a maioria da Trichoderma spp. (Klein e Eveleingh, 1998). É capaz de utilizar uma ampla variedade de compostos como únicas fontes de carbono e nitrogênio. O crescimento fúngico em meio de cultura é superior com algumas fontes de nitrogênio tais como extrato de levedura, nitrito, triptona, peptona, glutamina e asparagina ou algumas fontes de carbono tais como manose, galactose, sacarose, extrato de malte, celobiose, glicose e trealose.

O T. atroviride SC1 sobrevive em uma faixa de temperatura compreendida entre -1 e 35°C e cresce em uma faixa de temperatura compreendida entre 5 e 30°C. A temperatura ótima para o crescimento é de 2 5°C ± 1°C, embora o crescimento radial do fungo a 2 0°C não seja significativamente diferente do crescimento observado a 25°C. A temperatura máxima para a sobrevivência do T.

atroviride SC1 (30°C) é mais baixa que a temperatura do corpo humano, o que é uma boa indicação de que este fungo não é patogênico a humanos.

Os níveis de tolerância a pH do T. atroviride SC1 recaem na faixa comum para cepas de Trichoderma, isto é, uma faixa de pH compreendida entre 3 e 10. O limite mínimo de tolerância de atividade de água (a_w) do T. atroviride SC1 é de 0,910. O valor preferido da atividade de água é 0,998, o que corresponde aos valores das condições de umidade relativa alta preferidas pela maioria dos fungos patogênicos de plantas (90-100%).

O Trichoderma atroviride SC1 é caracterizado pelas seguintes propriedades:

- é particularmente ativo contra doenças causadas por Armillaria spp. e contra gentes causadores de doença

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ESCA para a qual nenhum pesticida químico efetivo é conhecido. De acordo com a invenção, o termo

Armillaria spp. cobre em particular Armillaria mellea e Armillaria gallica, o termo doença ESCA cobre os patógenos mais importantes causadoras da doença ESCA, em particular Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum e Fomitiporia mediterrânea. A Armillaria spp. Afeta mais de 400 espécies vegetais (culturas e arvores florestais). Os patógenos da doença ESCA afetam videiras.

- é mais efetivo contra oídio (causado por Podosphaera xanthii) que outra cepas de Trichoderma conhecidas, tais como Trichoderma harzianum T39 (nome comercial Trichodex®) ou T. atroviride F122 (Longa, 2007). Oídios são doenças fúngicas causadas por muitas espécies diferentes de fungos da ordem Erysiphales (Spencer, 1978) e causam danos economicamente importantes em particular em uva, maçã, morango, horticultura e floricultura;

- persiste no solo em níveis efetivos por longos períodos (mais de um ano)

- pode ser facilmente dispersado em partes de vegetais ou de madeiras, onde sobrevive como um agente antifúngico por mais de um ano.

Vários testes conduzidos com T. atroviride SC1, os quais serão mais detalhados na parte experimental, permitem que este seja proposto como um agente de biocontrole ótimo para a supressão de doenças fúngicas em plantas.

De acordo com uma realização preferida, a preparação de composições agrícolas de T. atroviride SC1 é conduzida pela inoculação de T. atroviride SC1 (alguns esporos lavados de placas de cultura são usualmente suficientes) em um substrato nutriente comum em suspensão líquida ou em

10/45 substrato sólido para se obter pelo menos 10²-10³ conídios/ml’¹ ou g’¹ de substrato (concentração ativa) .

O meio líquido ou utilizado compreende: caldo batata (PDA) agar nutriente, semi-sólido mais comumente nutriente, dextrose agar de agar extrato de malte, malte agar, caldo LB e similares conhecidos do especialista no assunto, onde os fungos são crescidos sob agitação contínua por pelo menos 48, preferivelmente 72 horas ou até que conídios são produzidos, a uma temperatura ótima de crescimento compreendida entre 20 e 30°C ou preferivelmente de 22 a 26°C ou a cerca de 25°C ± 1°C, por pelo menos 48 h. Nestas condições, os primeiros conídios são produzidos após pelo menos 48 horas.

Um substrato sólido preferido compreende um cereal esterilizado (tal como arroz ou trigo cozido), cereais moídos ou farinha de cereais, ou um substrato rico em carboidrato similar, onde T. atroviride SC1 é inoculado e incubado por pelo menos uma semana a de 2 0 a 3 0°C ou preferivelmente de 22 a 26°C ou cerca de 25°C ± 1°C.

Derivados de cereal tais como farinha ou cereais moídos são também adequados.

tratamento e/ou prevenção da planta é conduzido utilizando-se culturas de T. atroviride SC1 crescidas em meio líquido ou semi-sólido ou em um substrato sólido e aplicando-se tal suspensão de T. atroviride SC1 em partes da planta ou aplicando-se o substrato enriquecido com SC1 no solo próximo à planta necessitando de tal tratamento.

O tratamento pode ser conduzido pela aplicação de composições agrícolas às plantas, sobre folhas das plantas, em ferimentos provocados durante o corte ou poda, ou ao solo de maneira a suprimir o desenvolvimento de doenças fúngicas nas raízes. Os tratamentos são aplicados por aspersão sobre as plantas como um fungicida comum, em um momento que deve ser adaptado à doença específica (isto é,

11/45 antes da infecção, em um estágio fenológico específico das plantas tais como transplante, floração, pós-colheita). Os tratamentos podem ser também por aspersão ou injeção no solo, misturados com o solo em vários substratos e diferentes formulações (isto é, grânulos, misturados com argila ou produtos similares, casca de árvore, vegetais ou outra matéria orgânica ou similar ou derivados). Os tratamentos podem ser aplicados durante o período vegetativo da planta ou durante a dormência. O tratamento pode ser por aspersão após a poda ou aplicado diretamente aos ferimentos da poda de maneira a prevenir infecções. Os tratamentos podem ser aplicados semanalmente ou mais frequentemente, bem como uma vez por ano. O tratamento pode ser aplicado uma vez (isto é, no plantio no solo) o repetido conforme necessário.

Uma alta persistência no solo e a facilidade de dispersão em suportes sólidos tais como casca de árvore torna o presente microorganismo particularmente adequado para tratas plantas e/ou áreas compreendendo plantas, minimizando o número de tratamentos.

Substrato de cultura significa um suporte de cultura orgânico que pode ser líquido, sólido ou semi-sólido (gel) e que pode ser orgânico tal como arroz, casca de árvore ou pedaços de madeira ou substitutos vegetais tais como turfa,

ou inorgânico (isto é,	mineral) tal	como	argila.	Os
substratos podem	conter	um nutriente	ou uma função	de
matriz, ou ambos.	Pedaços de madeira,	casca	de árvore	ou

substratos inorgânicos são preferivelmente pré-tratados com nutriente antes da inoculação com SC1.

um de o crescimento em pedaços de casca com outras cepas de T. atroviride, tais como a cepa 122F.

Por esta razão, esta realização representa uma característica distintiva adicional da cepa SC1 de acordo com a presente invenção.

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Conídios de T. atroviride SCI podem ser também coletados (isto é, por um fluxo de ar ou por lavagem de um substrato de cultura) e dispersados em um líquido ou nutriente líquido. Tal suspensão ou composição agrícola, é aplicada diretamente à planta ou ao solo próximo à planta. É preferivelmente aplicada em combinação com nutrientes tais como uma fonte de carbono (isto é, um açúcar) e uma fonte de nitrogênio, tal como aminoácidos, peptídeos, fatores nutrientes ou micro-nutrientes vegetais para uma manutenção melhor do microorganismo in situ.

A composição pode compreender adicionalmente emulsificantes, tais como, lecitina, saponinas, agentes umectantes, tais como Tween 80, ou similar, protetores de UV, antioxidantes com emulsificantes, diluentes, agentes umectantes, adjuvantes de aspersão. Para os propósitos da presente invenção qualquer substrato de cultura seja sólido ou líquido, compreendendo uma quantidade efetiva de 10² -10³ conídios ml^-1 ou g’¹ do T. atroviride SCI é considerado uma composição agrícola.

Suspensões ou composições compreendendo pelo menos 10² -10³ ml^-1 ou g¹ de conídios são aplicadas diretamente na planta ou partes da planta, tais como raízes, folhas, sementes ou fruto, ou indiretamente no solo, preferivelmente nos suportes sólidos acima.

Nas composições agrícolas acima, a cepa SCI pode ser opcionalmente misturada com um segundo agente de biocontrole adicional, suplementos, fertilizantes, minerais, hormônios vegetais, modificadores de crescimento vegetal, pesticidas químicos não tóxicos ao T. atroviride SCI ou ceras para proteger os ferimentos de poda da água de irrigação.

Um dos métodos mais preferidos para tratar o solo com T. atroviride SCI é permitir que esta cepa cresça em um substrato tal como um cereal, (isto é, arroz cozido), ou

13/45 pedaços de casca de árvore ou de madeira ou modificadores vegetais tais como turfa e distribuindo os ditos suportes no solo nas vizinhanças da planta/plantas a serem tratadas.

O crescimento de uma quantidade efetiva de cultura de T. atroviride SC1 (10² -10³ conídios ml ^_1 ou g ^_1) em tal substrato sólido (isto é, pedaços de casca de árvore) é preferivelmente conduzido pelo pré-tratamento deste com um meio microbiológico media (tal como caldo de dextrose de batata, extrato de malte, caldo nutriente ou similar) ou qualquer substância nutriente contendo uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio (tal como extrato de carne, peptona, cereais moídos, extrato de levedura, sacarose ou similar), inoculando-se tal substrato com T. atroviride SC1 e incubando-se na condição descrita acima por pelo menos uma semana ou até a obtenção de colonização.

As composições podem ser também preparadas por retirada de conídios por lavagem das placas infectadas ou substratos de cultura e aspergindo tais suspensões nas partes aéreas da planta antes da infecção com o patógeno, semanalmente, em algum estágio fenológico específico da planta ou após algumas práticas agrícolas tais como poda, corte ou plantio.

Plantas às quais a composição é aplicada com sucesso, são preferivelmente selecionadas do grupo consistindo em: Cucurbitaceae, Rosaceae, Vitaceae, Crucifereae, Compos itae, Ubelliferae, Solanaceae e Liliaceae. Plantas particularmente preferidas são Cucurbitaceae, Rosaceae, Vi taceae.

O tratamento, seja por um substrato sólido inoculado (isto é, casca de árvore ou modificadores vegetais) ou por outros meios tais como aspersão, é conduzido a qualquer tempo do cultivo da planta de maneira a prover controle dos patógenos presentes no solo ou de maneira a prevenir novas infecções.

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Um método preferido para o tratamento de rizosfera com o agente de biocontrole da presente invenção é realizado fazendo-se crescer T. atroviride SC1 em arroz cozido esterilizado (ou um outro cereal) por alguns dias (no mínimo uma semana, usualmente 15 dias) a uma temperatura compreendida dentro da faixa ótima, preferivelmente a cerca de 25°C ± 1°C, até que seja obtida uma dose de inoculo ótima na faixa de 10⁷-10⁸ de conídios/lOOg arroz cozido ou 1 χ 10⁶ cfu g¹ de solo. De acordo com esta realização o agente de biocontrole é aplicado diretamente como uma matriz de arroz enriquecida com o fungo.

De maneira a monitorar o destino e comportamento de um microorganismo liberado no meio ambiente, o que é da maior importância para o controle de BCA, uma abordagem molecular (PCR em tempo real) foi desenvolvida e representa uma realização adicional da presente invenção.

Este método permite o acompanhamento e quantificação do T. atroviride SC1 no meio ambiente, especificamente identificando a cepa liberada, a distinguindo da comunidade microbiana nativa e acompanhando sua população dinâmica no tempo.

De fato, o registro de um agente de biocontrole (BCA) específico como pesticida na Europa requer uma análise de risco focalizada na persistência e multiplicação do BCA no meio ambiente, em adição a uma avaliação de qualquer possível contaminação (resíduos viáveis e não viáveis do BCA) de alimentos.

O teste molecular desenvolvido de acordo com uma realização adicional da presente invenção é baseado no gene da endoquitinase (ech42) do T. atroviride SC1 (Carsolio et al., 1994). Desta forma, os iniciadores de PCR em tempo real e o conjunto sonda TaqMan específica da cepa (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri) foram projetados com base em

15/45 dois nucleotídeos desemparelhados na fita 3' do gene ech42, nas posições 185 e 19 6 de acordo com a numeração da seqüência do GenBank n^s de acesso AB041753.1. Um segundo conjunto de iniciadores e sonda TaqMan foram projetados para o gene tga3, que codifica a sub-unidade α da proteína G (Tabela 1).

PCR utilizando os iniciadores ech42 e tga3 resultou em produtos de amplificação específicos de todo o DNA das cepas de Trichoderma spp., mas não de outros fungos de amostras de solo (isto é, Asperigillus spp. Penicillium spp. Cladosporium spp.) . Os produtos apresentam um pico de fusão único para cada gene, o que indica que os iniciadores amplificaram apenas os produtos de ech42 e tga3.

Ao contrário, quando PCR em tempo real é conduzida na presença de uma sonda ech42 TaqMan contendo os dois pontos de mutação específicos de SC1 da seqüência do gene ech42 (preferivelmente SEQID NO. 3), apenas o T. atroviride SC1 produz um sinal único e não ocorre a hibridização de nenhum produto de amplificação da sonda para o outro fungo (cepa F122 e SB18 incluídos) nas amostras de videira e solo, confirmando a alta especificidade da sonda ech42.

Amplificação dupla da sonda ech42 e tga3 TaqMan para a série de concentrações de T. atroviride SC1 DNA ocorreu no mesmo limite para cada concentração dada. Isto demonstra que é uma cópia única do amplicon ech42 no genoma e uma cópia única do gene Tga3, e que estas duas seqüências apresentam curvas padrão similares de tal forma que representam conjuntos de iniciadores de amplificação adequados, como confirmado pelo fato das reações PCR para cada uma destas duas seqüências prosseguirem com níveis similares de eficiência (Figura 4).

Este método produz um limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) de 5 cópias do genoma por reação PCR. Para amostras de solo, LOD calculado aumentou

16/45 para 35 cópias por mistura reacional, equivalente a 6,2 x

10³ conídios por g de solo, e o LOQ variou de 2 χ 10⁴ a 3 x

10⁴ g de solo^-1. A precisão do método é muito alta nos cinco níveis de concentração de conídios testados como mostrado na Parte Experimental. 0 especialista no assunto partindo das variações alélicas no Ech42 P identificou que no presente método pode facilmente identificar conjuntos de iniciadores alternativos e diferentes sondas ainda compreendendo os dois desemparelhamentos identificados 10 específicos para a cepa SC1. Da mesma forma, diferentes sondas moleculares estão possivelmente ligadas à sonda e/ou ao iniciador.

Os iniciadores e sondas de PCR em tempo real projetados para a detecção e quantificação de T. atroviride 15 SC1 são mostrados na tabela abaixo. Os desemparelhamentos base na sonda ech.42 TaqMan estão em negrito.

Iniciadores e	Produto amplificado (bp)
sondas	Sequência (5’-3’)
Ech42 Fw	Gene da Endoquitinase 42 (ech42) GTTCTGAGGCTGGAAGTTGC SEQ ID NO. 1
Ech42 Rv	ACGCCGTCTACTTCACCAAC SEQ ID NO. 2
Ech42 P	6FAM-TACCCCTTCAATCACCAATTGTTAG-TAMRA SEQ ID NO. 3	112
Tga3 Fw	sub-unidade oc do gene da proteína G (tga3) TGTTGAAGCATTGGGTTTGA SEQ ID NO. 4
Tga3 Rv	TGATTGAGGTGACGTTCTCG SEQ ID NO. 5
Tga3P	HEX-AAGGAGTGAACGAAAGAAGTGGA-TAMRA SEQ ID NO. 6	132

Os exemplos não limitantes a seguir são providos para ilustrar adicionalmente a presente invenção.

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PARTE EXPERIMENTAL

Exemplo 1. Isolamento e Crescimento de Trichoderma atroviride SC1.

A cepa do fungo T. atroviride SC1 foi isolada na Itália do norte a partir de madeira de avelã abatida em cultura pura pelo método do esporo único. Foi mantida em placas de dextrose agar de batata (PDA; Oxoid, Cambridge, UK) a 4°C na Coleção SafeCrop Microorganism (Istituto Agrário di San Michele all'Adige) e depositada na coleção CBS sob o tratado de Budapeste (CBS 122 089) . A cepa foi identificada morfologicamente como Trichoderma atroviride P. Karst. e sua identidade foi confirmada pela análise de seqüência ITS utilizando-se a ferramenta de identificação TrichOKEY, versão 2.0 (www.isth.info).

T. atroviride SC1 é capaz de utilizar uma ampla faixa de compostos como única fonte de carbono e de nitrogênio. 0 crescimento do fungo no meio foi significativamente superior quando suprido com algumas fontes de nitrogênio tais como extrato de levedura, nitrito, triptona, peptona, glutamina e asparagina ou algumas fontes de carbono tais como manose, galactose, sacarose, extrato de malte, celobiose, glicose e trealose.

Sorbitol, lactose, maltose frutose, arabinose, xilose e NH₄NO₃, KNO3, NH4CI, serina, arginina e glutamina não promoveram o crescimento miscelar.

Foram testados os efeitos das fontes de nitrogênio (NS) , NH4NO3, NH4CI, KNO3, NaN0₃, NaN0₂, serina, arginina, glutamina, asparagina, triptona e peptona (Sigma, St. Louis, MO, EUA), e fontes de carbono (CS), sorbitol, lactose, maltose, frutose, arabinose, xilose, trealose, glicose, celobiose, extrato de malte, sacarose, galactose e manose (Sigma) , no peso de micélio seco de T. atroviride SC1. As NS e CS foram esterilizadas por filtração e adicionadas, a uma taxa de 2 g·!^-1 (NS) e 20 g·!^-1 (CS), a

18/45 meio líquido de Czapek Dox (Oxoid) autoclavado modificado com glicose (10 g-1’¹) (Sigma) ou glicina (1 g«l^_1) (Sigma), quando do teste para NS e CS, respectivamente. Frascos contendo 100 ml de cada meio nutriente foram inoculados com um plugue de agar de uma cultura de sete dias de T. atroviride SC1. Após uma incubação de 13 dias, os micélios foram colhidos através de papel de filtro e secados, e seus pesos secos foram determinados utilizando-se uma balança de umidade AMB110 (Adam Equipment, UK) . Foram inoculadas cinco replicatas para cada tratamento e fator estudado. 0 experimento foi repetido duas vezes.

O T. atroviride SC1 foi capaz de crescer a temperaturas entre 10°C e 30°C. A temperatura ótima para crescimento foi de 25°C. Nesta temperatura, a taxa de crescimento foi significativamente maior (P < 0,05) que nas outras temperaturas (Figura 1). Desta forma, o crescimento ótimo foi obtido a 25°C. Os primeiros conídios foram produzidos no terceiro dia após a inoculação. 0 crescimento radial do fungo a 2 0°C não foi significativamente diferente do crescimento observado a 25°C. 0 T. atroviride SC1 não cresceu a temperaturas de 35°C ou acima. Após trinta dias de incubação a 35°C, o fungo foi considerado morto, porque não era capaz de crescer, mesmo após a temperatura ter sido reduzida para a temperatura ótima de 25°C. Temperaturas de -1 e 5°C também inibiram o crescimento de micélio. Entretanto, após 30 dias a -1°C e 5°C, o fungo foi ainda capaz de crescer quando incubado novamente a 25°C. A fase lag, com pouco ou nenhum crescimento observável, foi maior a 10°C (2 dias) e 15°C (3 dias).

O T. atroviride SC1 é tolerante a uma ampla faixa de níveis de pH (Figura 2), com crescimento ótimo observado em meio ácido (pH 4-6) . O crescimento de micélio do T. atroviride SC1 foi significativamente reduzido (P < 0,05)

19/45 em meio alcalino (pH ^8) e a esporulação foi reduzida em pH 3, bem como a valores de pH de 8 e acima. A fase lag foi a mesma (1 dia) para todos os níveis testados de pH.

As taxas de crescimento foram também influenciadas por alterações na atividade de água (a_w) que é uma medida da condição de energia da água no sistema, a saber, a pressão de vapor da água dividido pelo da água pura na mesma temperatura (Figura 3) . 0 nível de a_w mais alto testado (0,998) foi o nível ótimo para o crescimento do fungo. Quando este parâmetro foi reduzido para abaixo de 0,990, a taxa de crescimento foi significativamente reduzida (P 5 0,05) quando em comparação com a do meio PDA não modificado (a_w = 0,998) . Crescimento limitado foi observado a 0,910. A fase lag foi mais prolongada quando a_w foi reduzida para abaixo de 0,940 (2 dias) e 0,910 (4 dias).

Condições Experimentais

Os efeitos da temperatura, pH e atividade de água (a_w) no T. atroviride SC1 foram testados em culturas crescidas em placas de Petri de 90 mm contendo PDA. Cada placa foi inoculada com um plugue de agar (5 mm de diâmetro) coletado da margem de uma cultura de sete dias. O inoculo foi colocado no centro de cada placa. O crescimento de micélio foi avaliado diariamente. Foram inoculadas dez placas de replicata para cada nível dos parâmetros estudados.

Na temperatura de ensaio, as placas foram incubadas no escuro a -1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 37 e 40°C, com um pH do meio de 5. No ensaio de pH, os níveis de pH dos meios foram ajustados para 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 após autoclavagem por adição de soluções estéreis de HC1 1N ou NaOH 2N. Para testar o efeito da a_w, os meios foram modificados pela adição de quantidades crescentes de

20/45 glicerol de maneira a se obter níveis de a_w de 0,990, 0,980, 0,960, 0,940 e 0,910. O pH dos meios foi ajustado para 4,5 com HC1 1N ou NaOH 2N antes da autoclavagem. Os valores de a_w de todos os meios foram determinados com um instrumento AquaLab série 3 (Decagon, Pullman, Washington EUA) . Para os ensaios de pH e a_w, as placas foram incubadas no escuro a 25°C.

O crescimento radial foi avaliado no terceiro dia de incubação, que é aproximadamente o tempo que o fungo necessita para colonizar completamente uma placa de Petri deste tamanho sob condições ótimas.

Exemplo 2. Detecção e quantificação de T. atroviride SCI.

PCR em tempo real utilizando os iniciadores ech42 e tga3 resultou em produtos de amplificação de todo o DNA das cepas de Trichoderma spp., outros fungos e amostras de solo. Os produtos produziram um pico de fusão único para cada gene, o que indica que os iniciadores amplificaram apenas os produtos ech42 e tga3. Ao contrário, na presença da sonda ech42 TaqMan contendo os dois pontos de mutação específicos de SCI da seqüência do gene ech.42, apenas o T. atroviride SCI produziu um sinal único e não ocorreu hibridização do produto de amplificação da sonda para os outros fungos (cepa F122 e SB18 incluídas), videira e amostras de solo, confirmando a alta especificidade da sonda ech.42 sonda. Um controle interno (reação dupla) , consistindo na sonda tga3, confirmou a precisão do processo pela produção de um sinal nos exames com PCR em tempo real de todas as amostras de Trichoderma spp.

A amplificação dupla das sondas ech.42 e tga3 TaqMan para a série de concentrações de DNA de T. atroviride SCI ocorreu no mesmo limite para cada dada concentração. Isto demonstrou que há uma única cópia do amplicon ech42 no

21/45 genoma e uma única cópia do gene Tga3, e que estas duas seqüências apresentam curvas padrão similares. Nossos resultados mostraram também que as reações PCR para cada uma destas duas seqüências prosseguiram com níveis similares de eficiência (Figura 4).

Este método produz um LOD de 5 cópias do genoma por reação PCR. Para as amostras de solo, o LOD calculado aumentou para 35 cópias por mistura reacional, equivalente a 6,2 x 10³ conídios por g de solo, e LOQ variando de 2 x 10⁴ a 3 x 10⁴ g de solo^-1, o último delineado na série de solos inoculados diferentemente (Tabela 2) . O LOD absoluto varia de 8,5 x 10³ a 1,2 χ 10⁴ cópias por reação PCR (Tabela 2) .

A precisão do método é muito alta nos cinco níveis de concentração de conídio testados (Figura 5) resultando na quantificação de T. atroviride SCI pelo método molecular em quantidades compreendidas entre 10² e 10⁷ conídios g'¹.

Condições experimentais

Iniciadores e sonda de PCR em tempo real: gene da endoqu.i tinas e de T. atroviride SC1 (ech42) (Carsolio et al., 1994) foi amplificado utilizando-se iniciadores consenso baseados em seqüências já presentes no NCBI

GenBank.

seqüência completa obtida foi comparada e alinhada com seqüências da mesma base de dados utilizando-se o programa BLAST (Altschul et al., 1997) e o programa ClustalW (adisponível no European Bioinformatics

Institute, European Molecular Biology Laboratory [http://www.ebi.ac.uk/clustalw/]), respectivamente. Várias diferenças nas seqüências de nucleotídeo foram observadas (em particular, foram observados dois desemparelhamentos de nucleotídeo no primeiro intron de um certo gene) e apenas uma seqüência na base de dados (NCBI GenBank número de acesso AB041753.1 referente a T. harzianum SK-55 isolado no

22/45

Japão) foi idêntica ao nosso isolado. Desta forma, os iniciadores de PCR TaqMan específico Missouri) foram desemparelhamentos em tempo real e da cepa (Sigma desenhados com de nucleotídeos o conjunto de sondas Aldrich, St. Louis, base nestes dois na fira 3' do gene ech42, utilizando-se o programa de computador Express v2.0 (PE Applied Biosystems, Foster City, Califórnia) (Tabela

1). Um segundo conjunto de iniciadores e a sonda TaqMan foram projetados para o gene tga3 gene, que codifica a sub unidade α da proteína G (Tabela 1).

PCR em tempo real: As reações foram realizadas em um volume final de 2 0 μΐ contendo: tampão IQ Multiplex Power Mix (Bio-Rad, Hercules, Califórnia), 0,3 μΜ de cada um dos iniciadores ech42 e a sonda, 0,4 μΜ da sonda tga3 e 0,6 . μΜ de cada um dos iniciadores tga3. A PCR em tempo real foi conduzida em um termociclador MJ Chromo4 (MJ Research, Waltham, Massachusetts) utilizando o seguinte programa padrão: 2 min 30 s a 95°C para desnaturação inicial, 40 ciclos de 15 s a 95°C e 1 min a 61°C para uma etapa de extensão na qual o sinal de fluorescência foi medido e analisado pelo programa de computador 0pticon2 (MJ Research, Waltham, Massachusetts). Quando as amostras foram analisadas por SYBR Green I Chemistry, foi utilizado o SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem, Foster City, Califórnia), juntamente com 0,3 μΜ do conjunto de iniciador ech42 e 0,3 μΜ do conjunto de iniciador tga3. As condições de amplificação foram então alteradas para: uma partida a quente de 10 min a 95°C, 40 ciclos de 15 s a 95°C e 1 min a 61 °C para extensão, com uma curva de fusão final de 40° a 90°C, durante a qual as amostras foram lentamente aquecidas (0,5°C a cada 10 segundos).

A quantificação das amostras de DNA foi realizada pela interpolação dos valores do ciclo limite (Ct) da amostra com os valores Ct de uma curva de regressão padrão

23/45 de concentrações conhecidas de DNA genômico de T.

atroviride SC1 purificado previamente quantificado utilizando-se o fluorímetro

Qubit (Invitrogen Life

Technologies, Carlsbad, Califórnia). A curva

1:3 do DNA genômico de

SC1 e incluídas em cada corrida de PCR.

As curvas variando de 3,0 a 3,5, como número de cópias haplóide do genoma, que o tamanho do genoma de cópia única de

0,034 pg.

Especificidade: a especificidade testada em cultura (26 de Pavia isolados harzianum considerando-se

Trichoderma é de do método foi isolados de Trichoderma spp. de isolados da CBS, um da ATCC, 13 da dois da SafeCrop, a saber, F122 e utilizados

T39 e T.

Trichoderma de solo

Universidade como biofungicidas comerciais harzianum T22) coletado em um

Itália do norte (coordenadas GIS:

06,983') como T.

gêneros e seis isolados vinhedo comercial de na

N46° 10,897' e OE11°

Sete dos isolados examinados foram identificados atroviride. A especificidade foi testada também em de

Aspergillus,

Aureobasidium,

Coelomycetes, solos.

fungos comumente presentes

Cladosporium,

Penicillium,

Mucor, Gliocladium, Rhizopus,

Geotricum, Plasmopara

Todos os isolados de fungo em solos:

Fusarium,

Acremonium, e Armillaria ou isolados (7) foram crescidos das de em dextrose agar de batata (PDA,

Oxoid,

Basingstoke, United

Kingdom)

O DNA foi extraído diretamente de 50-100 mg de micélio utilizando-se o kit DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN,

Hilden,

Alemanha).

A especificidade do método para T.

atroviride SC1 foi testada por comparação dos produtos de

24/45 amplificação e curvas de fusão obtidos com os testes SYBR Green I com os obtidos utilizando-se as sondas TaqMan específicas para ech42 e tga3.

Dez amostras de solo, quatro de Trentino e seis de outras regiões da Itália (Marche, Valle d'Aosta, EmiliaRomagna e Calabria), foram também incluídas no teste de especificidade. O DNA, se não indicado de outra forma, foi sempre extraído de amostras de solo de 200 mg secadas durante a noite, de acordo com o protocolo prescrito para o kit de isolamento de DNA PowerSoil (Mo Bio, Carlsbad, Califórnia).

DNA de Vi tis vinifera cv. Cabernet foi incluído no teste de especificidade de maneira a controlar a amplificação do DNA de material de raiz presente em solos tratados com T. atroviride SC1. O DNA vegetal foi extraído utilizando-se o DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Itália). Na análise de RT-PCR do DNA genômico de T. atroviride SC1, os DNAs de outros fungos e de videira utilizados como controles foram carregados a aproximadamente 0,2-1 ng, enquanto que 1-5 ng de DNA (a quantidade total extraída de cada 4 mg de amostra de solo) foram carregados em cada reação PCR.

Repetibilidade, precisão e sensibilidade: A repetibilidade do procedimento de PCR em tempo real foi estimada para uma suspensão de DNA puro de T. atroviride SC1 e DNA total extraído de 7,5 g de solo previamente inoculado com o fungo (10⁷ conídios g’¹) e eluído em 4 ml, seguindo as instruções do fabricante do kit de isolamento de DNA PowerSolo Mega Prep (Mo Bio, Carlsbad, Califórnia) . A precisão do método foi estimada utilizando-se solos contendo diferentes concentrações de T. atroviride SC1. Para esta estimativa, bateladas de b 50 g de solo arenoso peneirado estéril foram misturados com 10 ml de suspensões de conídios de T. atroviride SC1 para se obter

25/45 concentrações finais de ΙΟ⁷, ΙΟ⁶, 10⁴ e 10² conídios g¹ de solo. O DNA foi extraído de três amostras independentes para cada concentração de tratamento, após os solos terem sido secados durante uma noite a 60°C (200 mg) e suas respectivas concentrações de conídios terem sido quantificadas em duas corridas de PCR em tempo real independentes.

A precisão do método de quantificação foi calculada por comparação das cópias de genoma estimadas com a concentração de conídios esperada.

Sensibilidade: A sensibilidade do método PCR em tempo real foi definida pelo limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ). O LOD corresponde ao número de cópias mais baixo na amostra para o qual o desvio padrão sob condições de repetibilidade é 33% ou menor. O LOQ corresponde ao número de cópias mais baixo na amostra para o qual o desvio padrão sob condições de repetibilidade é 25% ou menor. O LOD absoluto do método foi calculado como o número de cópias mais baixo que deve estar presente na amostra para assegurar pelo menos 95% de precisão.

26/45

Tabela 1.

Iniciadores e sondas de PCR em tempo real projetados para a de Trichoderma atroviride

Os desemparelhamentos de base na sonda ech42 TaqMan estão em negrito.

Iniciadores e

Produto de sondas

Seqüência (5’-3’) amplificação (bp)

Ech42 Fw

Gene da endoquitinase 42 (ech42)

GTTCTGAGGCTGGAAGTTGC SEQ ID NO. :1

Ech42 Rv

ACGCCGTCTACTTCACCAAC SEQ ID NO. :2

Ech42 P

112

6FAM-TACCCCTTCAATCACCAATTGTTAG-TAMRA

SEQ ID NO. :3

Sub-unidade α do gene da proteína G (tga3)

Tga3 Fw

Tga3 Rv

TGTTGAAGCATTGGGTTTGA SEQ ID NO. :4

TGATTGAGGTGACGTTCTCG SEQ ID NO. :5

Tga3P

HEX-AAGGAGTGAACGAAAGAAGTGGA-TAMRA

132

SEQ ID NO. :6

Tabela 2. Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) determinados utilizando-se o desvio padrão relativo (RSDr) do número de cópias do genoma (CN) 10 determinado a partir de duas séries de diluição de DNA puro de T. atroviride SC1 DNA, duas séries de diluição de DNA total extraído de uma amostra de solo inoculada com loglO⁷ conídios g de solo'¹ e análise do DNA total extraído a partir de uma série de solos inoculados com quantidades 15 decrescentes de conídios. Os LOD e LOQ foram ajustados a 33% e 25% do desvio padrão relativo (RSDr), respectivamente. O LOD absoluto corresponde a um nível de detecção de DNA de 95%.

27/45

DNA	Curva de regressão RSDr	LOD - LOQ	LOD absoluto
Equação	Coefic. de deter.	CN PCR’1	CN g de solo'1	CN PCR’1	CN g de solo'1
SC1 1	Y=O,43O4x'0,1579	0,9874	5-31	-	8	nd
SC1 2	Y=0,369x'°’1359	0,9475	3-17	-	15	nd
SC1 +solo 1	Y=0,881 1x’°·2696	0,9711	38-106	0,7x104-1,9x104	60	1,1x104
SC1+solo2	Y=O,6821x°’2089	0,9459	32-122	0,6x104-2,2x104	35	0,6x104
SC1 em
séries de	Y=313,01x'1’677	0,9929	26-130	0,7x104-3,4x104	48	1,2x104
soloz

^z Curva de regressão RSDr calculaca com base em quatro concentrações de conídios.

Exemplo 3. Métodos para a produção e para tratamento.

T. atroviride SC1 foi crescido com sucesso em vários meios comuns de laboratório tais como dextrose agar de batata, caldo nutriente, extrato de malte agar.

Foi aplicado com um dos três seguintes métodos conhecidos: crescido em caldo de cultura, em arroz ou em casca de árvore/turfa.

Os três métodos produziram 99% de propágulos viáveis de T. atroviride SC1.

O T. atroviride SC1 produzido em arroz ou crescido em casca de árvore sobrevive por pelo menos um ano a 15°C a 98% de UR. T. atroviride SC1 crescido em modificadores vegetais ou casca de árvore

Foram observadas diferenças com outras cepas de T. atroviride, em particular T. atroviride F122 não sobreviveu em casca de árvore ou turfa nas condições mencionadas acima.

28/45

Condições experimentais

A preparação da composição agrícola foi conduzida de acordo com um dos seguintes métodos:

a) Inoculação com micélio ou conídios de T. atroviride SC1 (pelo menos 10² conídios/L) de caldo de cultura (caldo nutriente ou caldo de extrato de malte) e incubação sob agitação contínua, foram conduzidas a uma temperatura entre 20 e 25°C, por pelo menos 48 h. O caldo de cultura filtrado ou não filtrado foi aspergido nas plantas ou incorporado ao solo.

b) Arroz cozido esterilizado (ou cereal equivalente) foi inoculado com conídios ou micélio de T. atroviride SC1 (pelo menos 10² conídíos/100 g) e incubado por 21 dias a 25°C. Para os tratamentos de solo T. atroviride SC1 e arroz foram misturados ao solo para se obter uma dose de inoculo de 1 χ 10⁶ cfu g¹ de solo nos primeiros 3 cm de solo. Para tratamento foliar conídios de T. atroviride SC1 foram coletados do arroz por lavagem com água r e aplicados com ou sem a adição de adjuvantes de aspersão (agentes umectantes, emulsificantes, etc.);

c) T. atroviride SC1 foi crescido em pedaços de casca de árvore previamente tratados ou não com um meio de crescimento microbiológico (caldo nutriente) ou substâncias nutrientes contendo fontes de carbono e de nitrogênio (arroz moído). As casca de árvore foram inoculadas com T. atroviride SC1 (pelo menos 10² conídios/100 g) , incubadas por pelo menos dois dias ou até colonização a 20-25°C. As casca de árvore inoculadas podem ser utilizadas como modificadores a qualquer tempo do cultivo das plantas provendo controle dos patógenos naturais existentes no solo ou para prevenir novas infecções. Modificadores vegetais (turva) foram inoculados sem

29/45 substâncias nutrientes como feito para as casca de árvore.

d)

Exemplo 4. Sobrevivência de T. atroviride SC1 no filoplano de morango.

As densidades populacionais de conídios viáveis de T. atroviride SC1 no filoplano de morango se reduziram rapidamente durante a primeira semana após a inoculação. A população fúngica mostrou um declínio contínuo até o 15² dia após a aplicação, após o que uma concentração baixa de CFU foi mantida até o 45 ^a dia quando o experimento foi concluído (Figura 6) . 0 T. atroviride SC1 não causou fitoxicidade nem é patogênico às folhas, flores ou frutos de morango, e sobreviveu por mais de um mês nas folhas de morango.

Condições experimentais

Suspensões de conídios de T. atroviride SC1 foram obtidas por lavagem de culturas de 21 dias crescidas em arroz cozido com Tween 80 0,01% (Sigma) em água destilada estéril (ADE). A suspensão de conídios foi filtrada através de três camadas de tecido estéril de maneira a remover os fragmentos de micélio. A concentração de conídios foi determinada utilizando-se um hemocitômetro Thomas e ajustada para uma concentração de 10⁶ conídios-ml’¹. A concentração de conídios viáveis no inoculo foi determinada por contagem de unidades formadoras de colônia (CFUs) em uma diluição em série em PDA modificado com 2 ml-l¹ de Triton X-100 (Sigma). As colônias foram contadas após incubação das culturas a 25°C por sete dias.

Folhas de 10 plantas de morango mantidas sob condições controladas em estufa (25 ± 2°C, UR = 60 ± 10%) foram aspergidas uniformemente com o inoculo de T. atroviride SC1 utilizando-se um aspersor manual. Uma folha

30/45 randomicamente selecionada foi removida de cada planta a 0, 1, 3, 7, 15, 30 e 45 dias após a inoculação. Um disco de folha (25 mm de diâmetro) foi cortado de cada folha utilizando-se um furador de cortiça estéril. Os discos foram transferidos para tubos Falcon contendo 5 ml de Tween 80 (0,01%), agitados por 4 min e então deixados em repouso por 1 min. Uma série de diluições em SDW foi plaqueada em um meio semi seletivo consistindo em PDA modificado com rosa bengala (100 ppm), estreptomicina (100 ppm) e cloramfenicol (50 ppm) para minimizar a presença de bactérias. As CFUs foram contadas nas diluições apropriadas e os resultados foram expressos como CFU^mm’² de folha. As contagens de CFU das placas de diluição foram convertidas para CFU por mm^-2 de folha. Este experimento foi realizado duas vezes e nenhuma diferença significativa entre os dois experimentos foi observada.

Exemplo 5. Sobrevivência de T. atroviride SCI em solo

T. atroviride SCI foi capaz de sobreviver em pelo menos três tipos diferentes de solos. Após sua introdução nos solos, o T. atroviride SCI sobreviveu até o final do experimento (45 dias) , como indicado por sua recuperação em placas de diluição a partir de solos estéreis e não estéreis como mostrado na Figura 7. As diferentes características do solo também influenciaram a sobrevivência do fungo. Os resultados obtidos para os solos argilo arenosos (2 e 3) com altos níveis de matéria orgânica foram similares entre si, mas diferentes dos resultados obtidos para argila (Solo 1) , que também continha menos matéria orgânica.

A esterilização do solo por autoclave foi associada com a sobrevivência mais prolongada do T. atroviride SCI. Nos solos estéreis, a concentração de fungo aumentou em quase uma ordem de magnitude no terceiro dia, alcançando

31/45 uma concentração máxima de 10⁷ CFU-g’¹ de solo seco no Solo 1 estéril, e um pouco menos nos Solos 2 e 3. Após isto, a concentração de T. atroviride se manteve entre 10⁶ e 10⁷ CFU-g’¹ de solo seco até 45 dias após a inoculação (Figura 7a) em todos os tipos de solo. As concentrações finais de fungo nos solo esterilizados foram significativamente mais altas (P £ 0,05) para os Solos 2 e 3 que para o Solo 1.

Ocorreram diferenças significativas entre os valores de CFU para os tratamentos estéril e não estéril para cada tipo de solo em cada data de avaliação, exceto para o Solo 1 a 30 dias após a inoculação. Os valores de CFU para T. atroviride SC1 aumentaram no solo esterilizado. Os valores de CFU no Solo 2 não estéril foram similares aos do Solo 3 não estéril. No Solo 1 não tratado, ocorreu um pequeno aumento no número de CFUs a um dia após a inoculação, no entanto a concentração de conídios ao final do experimento em todos os tipos de solo foi mais baixa que a do inoculo inicial. A concentração final de conídios (CFU) nos solos não tratados foi significativamente mais alta (P < 0,05) para o Solo 1 que para os Solos 2 e 3. O efeito da esterilização do solo sobre a sobrevivência de T. atroviride SC1 foi mais pronunciado nos Solos 2 e 3 que no Solo 1.

No microcosmo não tratado (não inoculado) utilizado como controle, um nível muito baixo de Trichoderma spp. nativo (1 a 3-IO² CFU g’¹) foi detectado, no entanto nenhuma das CFUs foi identificada como T. atroviride.

Condições experimentais

O ensaio de sobrevivência no solo foi baseado no método descrito por Bennett et al. (2003), com algumas modificações. Três tipos de solo do norte da Itália (região de Trentino) com diferentes características físicas e químicas (Tabela 1) foram utilizados. O solo foi secado

32/45 à temperatura ambiente e peneirado (mesh < 2 mm) . 0 solo peneirado (100 g) foi colocado em garrafas de polipropileno de 500 ml e as amostras foram deixadas não tratadas (não estéreis) à temperatura ambiente ou autoclavadas (121°C por 30 min) duas vezes em dias consecutivos (estéril).

O inóculo foi preparado como descrito acima. O experimento foi realizado sob condições estéreis. Os conídios foram adicionados ao solo de maneira a se obter uma concentração final de 10⁶ conídios-g¹ de solo e misturados com uma espátula estéril. As garrafas foram incubadas à temperatura ambiente. Cinco replicatas foram estabelecidas para cada combinação tipo de solo X tratamento do solo (não estéril e estéril).

Uma sub-amostra de solo (1 g) foi removida assepticamente de cada garrafa utilizando-se uma colher de amostragem estéril (PBI International, Whitstable, UK) e colocada em 10 ml de Tween 80 0,01%, posta sob agitação por 4 min e deixada em repouso por 1 min. Uma série de diluições foi estabelecida e plaqueada no meio semi seletivo como descrito acima. As CFUs foram contadas nas placas de diluição apropriadas após sete dias de incubação a 25°C e expressas como CFU-g'¹ de solo seco. As avaliações de CFU nas amostras de solo foram conduzidas imediatamente após a inoculação e nos dias 1, 5, 10, 20, 30, e 45 após a inoculação. As contagens de CFU das placas de diluição foram expressas como CFU por grama de solo seco (CFU-g^-1) .

Exemplo 6. Sobrevivência de T. atroviride SCI em um solo de vinhedo

A sobrevivência em solo foi verificada também em um vinhedo comercial durante um ano inteiro. O experimento foi repetido duas vezes.

O T. atroviride SCI foi capaz de sobreviver em concentração alta de conídios (10⁸ CFU.g de solo seco^-1) na

33/45 primeira camada de solo (superfície do solo) por um período longo (pelo menos 18 semanas após o tratamento) em ambos os anos. O T. atroviride SC1 migra verticalmente no solo muito rapidamente após o tratamento (uma semana) alcançando uma profundidade de 0,4 m. Então a concentração de CFU manteve valores estáveis durante dois anos até a avaliação na 18² semana. Um gradiente nas densidades populacionais estava presente em ambos os anos a partir da superfície para as camadas profundas de solo. 0 número mais alto de CFU detectado foi de 10⁵ CFU g de solo seco^-1 a 0,1 m de profundidade do solo, cerca de 10⁴ a 0,2 m e 10³ CFU g de solo seco^-1 a 0,3 e 0,4 m. Diferenças significativas na dinâmica populacional entre os dois anos estavam presentes apenas na concentração de CFU na superfície do solo cinco e nove semanas após o tratamento (teste de Tukey; α - 0,05). Em particular após 9 semanas a CFU de T. atroviride SC1 na superfície do solo aumentou ainda mais que a concentração inicial do inoculo (10⁹ CFU g de solo seco¹) , após um decréscimo inicial na 5^a semana. Um ano após a inoculação do solo com T. atroviride SC1 foi detectada a uma concentração de 10²-10³ CFU g de solo seco¹ para ambos os experimentos a uma concentração comparável à natural de Trichoderma spp. em área não tratada. O método de PCR em tempo real confirmou a ausência da cepa antes de sua introdução no solo e a persistência da cepa nas camadas de solo.

A relação linear (y = 0,8472x + 0,1105, R2 = 0,6794) entre os resultados obtidos com os dois métodos (contagem de CFU e método molecular) confirma a eficiência da detecção molecular de T. atroviride SC1.

Após 9 semanas de sua liberação no solo, o T. atroviride SC1 foi encontrado a uma distância de 0,5 e 2 m dos buracos tratados na superfície do solo, a0,lme0,3m de profundidade no solo. A CFU foi significativamente mais

34/45 alta (teste de Tukey; a =0,05) que a população natural de Trichoderma spp. isolada na área não tratada, na superfície do solo, a 0,5 e 2 m dos buracos tratados e a 10 cm de profundidade no solo a 0,5 m de distância dos buracos tratados. A concentração de conídios de SC1 nas outras camadas do solo a 0,5 e 2 m de distância dos buracos tratados não foi significativamente mais alta (teste de Tukey; α =0,05) que a população natural de Trichoderma spp. isolada na área não tratada. A freqüência de ocorrência de T. atroviride SC1 foi alta (respectivamente 100% a 0,5 m dos buracos tratados a todas as profundidades do solo) e se reduziu para 90, 70 e30%a2mde distância dos buracos tratados respectivamente na superfície do solo, a 0,1 e 0,3 m de profundidade do solo.

Dezoito semanas após sua introdução no solo, ainda foi possível recuperar T. atroviride SC1 na superfície do solo tanto a 2 quanto a 4 m de distância dos buracos tratados. Estas concentrações de CFU não foram significativamente diferentes (teste de Tukey; α =0,05) quando em comparação com a concentração de conídios de Trichoderma spp. natural obtido da área não tratada. Mesmo se baixas concentrações foram detectadas após 18 semanas, a freqüência de ocorrência de T. atroviride SC1 foi alta (respectivamente 80e70%a2e4m dos buracos tratados).

T. atroviride SC1 foi encontrado em folhas de vinhas plantadas no solo tratado. O número de CFU de T. atroviride SC1 por mm² de folha foi significativamente mais alto (teste de Tukey; α =0,05) na folhas de plantas no solo tratado que o de Trichoderma spp. natural isolado em plantas nas áreas não tratadas. Ocorreu uma diferença significativa (teste de Tukey; α =0,05) na CFU de T. atroviride SC1 por unidade de superfície (mm²) entre as folhas de cima e de baixo das plantas nas áreas tratadas.

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Dezoito semanas após o plantio nos buracos tratados a concentração de T. atroviride SC1 na rizosfera de videira foi de 10⁷ CFU g de solo seco.

O número de folhas, números de brotações, peso seco de raízes, comprimento de galho e comprimento total das plantas de videira, não demonstraram diferenças significativas entre as videiras plantadas no solo não tratado ou tratado com o T. atroviride SC1 (teste de Tukey; α = 0,05, dados não mostrados), indicando que o fungo não é patogênico à cultura de videiras.

O isolamento de T. atroviride SC1 um ano após a inoculação indica que pode tolerar as baixas temperaturas invernais e flutuações de umidade no solo. A concentração de T. atroviride SC1 no solo um ano após a inoculação similar ao Trichoderma spp. natural indica que pode se estabelecer no solo.

Os mesmos testes foram conduzidos em 2006 com uma cepa diferente, T. atroviride F122,. Esta cepa foi detectada apenas até 18 semanas após a inoculação e não foi detectada um ano após a inoculação. A incapacidade de sobreviver do T. atroviride F122 em condições de crescimento comparáveis um ano após a inoculações demonstra a superioridade do T. atroviride SC1 em relação às outras cepas.

Condições experimentais

Em todos os experimentos, a concentração de T. atroviride SC1 viável foi estimada pela coleta de amostras de 1 g de solo de cada ponto, colocando cada amostra em 10 ml de água estéril e então plaqueando 1 ml desta suspensão, após diluições em série de 10 vezes, em meio semi seletivo. As colônias de fungo foram contadas após sete dias de incubação e os números populacionais foram apresentados em termos de log de CFU g de solo seco'¹.

O peso seco de solo

36/45 foi estimado após a incubação da amostra (ou sub-amostra) a 60°C por 48 h. Os conídios no arroz utilizados como inoculo sempre apresentaram uma viabilidade média próxima a 100%. As colônias de T. atroviride SC1 eram distintas de outras espécies de Trichoderma por sua característica de micélio aéreo (branco no início, então rapidamente se tornando verde amarelado a verde oliva). Para a identificação inequívoca de nosso isolado, a identidade de quase 10% das colônias de cada placa foi morfologicamente identificada como sendo T. atroviride foi confirmada por análise PCR utilizando-se um conjunto de iniciadores e uma sonda Taq-Man baseados em uma mutação de base do gene da endoquitinase (Ech42) que é específica para T. atroviride SC1 (como no exemplo 2).

Os experimentos consistiram em seis pontos de 0,6 x 0,6 m cada, os quais foram localizados entre as plantas de videira em uma linha do vinhedo. Três pontos foram inoculados com T. atroviride SC1 e cada um recebeu 500 g do meio de arroz cozido com os fungos crescidos neste. O inóculo foi misturado na camada superficial do solo (aproximadamente 30 mm de profundidade). A concentração inicial do inóculo fúngico nesta camada foi estimada como sendo 10⁸ CFU g de solo seco¹. Três pontos não inoculados adicionais foram utilizados como controle não tratado. Em cada ponto, o solo foi amostrado por escavação da parte externa de uma lateral do ponto e exposição do perfil do solo. A amostragem foi realizada coletando-se três cones de solo (50 ml, 3 00 mm de diâmetro) a diferentes profundidades (na superfície e a 0,1, 0,2, 0,3 e 0,4 m) e pontos no tempo (na inoculação e 1, 5, 9 e 18 semanas após a inoculação de T. atroviride SC1) . Uma amostragem adicional do solo foi realizada um ano após a inoculação do primeiro experimento.

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Uma sub-amostra de solo (1 g) foi amostra utilizando-se uma colher estéril.

removida de cada

A sub-amostra de solo foi colocada em 10 ml de

Tween

Organics, Geel, Bélgica), agitada por 4 min utilizando-se um vórtice (Heidolph Instruments,

Schwabach,

Alemanha) e deixada em repouso por 1 min.

água destilada estéril foi estabelecida e as suspensões diluídas foram plaqueadas em placas de Petri contendo o meio semi seletivo. Estas placas de Petri foram então incubadas a 25°C e foram realizadas contagens de colônia final nas culturas correspondendo às diluições apropriadas (CFU na faixa de 30-300 colônias por placa) após cinco dias de incubação. Foram feitas três replicatas para cada amostra de solo. Os resultados foram expressos como CFU g de solo seco^-1. As identidades das colônias de T. atroviride SC1 foram confirmadas como descrito no exemplo.

PCR em tempo real foi utilizado para determinar os números de cópias do genoma (CN) de T. atroviride SC1 em todas as amostras de 2006. Para a análise RT-PCR, duas sub-amostras independentes foram coletadas para cada combinação de profundidade e tempo e a extração do DNA e análise de PCR em tempo real de cada amostra foram realizadas como descrito no exemplo 2.

A dispersão de conídios de T. atroviride SC1 foi examinada em 2006. Buracos medindo 0,3 x 0,3 x 0,3 m foram cavados na linha do vinhedo entre as plantas de videira. Dez buracos foram preenchidos com uma mistura do solo cavado e inoculo de T. atroviride (400 g buraco^-1) . A concentração inicial de inoculo fúngico foi de 10⁶ CFU g de solo seco^-1. Os outros dez buracos foram preenchidos de volta com o solo cavado não tratado. Uma planta de videira de um ano de idade (Pinot gr is on Kober 5BB) foi plantada em cada buraco.

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Dois conjuntos de amostras de solo foram coletados. A primeira amostragem foi conduzida nove semanas após a inoculação tanto nos buracos tratados quanto nos não tratados (0 m) e a distâncias horizontais de 0,5 e 2,0 m do buraco. A cada uma destas distâncias, foram coletadas amostras de solo a três profundidades de solo (0, 0,1 e 0,3 m). Uma segunda amostragem foi realizada 18 semanas após a inoculação e, neste momento, foram coletadas amostra de solo apenas na superfície (primeiros 3 0 mm de solo) dos buracos e nas distâncias horizontais de 2,0 e 4,0 m dos locais de inoculação. Foram coletadas amostras e o número de CFU em cada amostra foi determinado como previamente descrito. A dispersão foi avaliada em termos de concentração de T. atroviride SCI (CFU g de solo seco¹) e a freqüência (percentagem de amostras de solo com pelo menos uma CFU).

A migração de T. atroviride SCI do solo para as folhas de videira foi avaliada 10 semanas após a inoculação no solo. Três folhas apicais e três folhas de baixo foram removidas de cada planta (cada planta apresentava uma média de 15 folhas) crescidas nos buracos tratados e não tratados. Cada folha recentemente colhida foi transferida para um tubo Falcon contendo 30 ml de água destilada estéril mais Tween 80 0,01%. Estes tubos foram postos sob agitação por 3 minutes e 1 ml de cada uma das suspensões resultantes foi então transferido para uma placa de Petri contendo o meio semi- seletivo. As CFU foram contadas após sete dias de incubação a 25°C. A área da folha foi calculada utilizando-se um processamento de imagem e programa de análise, Image Tool versão 2.0 (UTHSCSA, San Antonio, TX, EUA). Ao final do experimento, as plantas foram removidas do solo. O solo que não aderiu firmemente às raízes foi cuidadosamente removido com agitação leve e as raízes foram então sacudidas vigorosamente em uma bolsa

39/45 de plástico de maneira a desalojar o solo da rizosfera. A amostragem do solo de rizosfera e a contagem de CFU para estas amostras (sub-amostras de 1 g; três replicatas) foram realizadas como descrito previamente.

De maneira a se avaliar a influência do T. atroviride SC1 no crescimento vegetal, foram tomadas medidas do comprimento total, comprimento de galho e número de folhas e brotações para cada planta nas áreas tratadas e não tratadas na 19^a e 18^a semanas após a inoculação do solo. O peso seco de raiz foi também determinado para cada planta no final do experimento (18^a semana após a inoculação).

Exemplo 7. Atividade de biocontrole in vitro

No bioensaio de cultura dupla,	o T	. atroviride SC1
inibiu eficácia	completamente antagonística	B. de	cinerea e 100%.	A.	mellea com uma

Condições experimentais antagonismo in vitro de T. atroviride SC1 a um patógeno foliar e de fruto (Botrytis cinerea) e um patógeno natural do solo (Armillaria mellea) foi testado utilizandose o método de cultura dupla como se segue: os patógenos (B. cinerea ou A. mellea) foram inoculados a uma distância de 2 cm (A) de T. atroviride SC1 (B) em PDA em placas de Petri (90 mm de diâmetro) . B. cinerea, A. mellea e T. atroviride SC1 foram crescidos separadamente como controles não tratados. Foram feitas pelo menos três replicatas de cada combinação. A eficácia antagonística foi calculada após uma semana de incubação a 20°C, como (AD-AC) x 100/AD, onde AC e AD são os crescimentos radiais do patógeno com e sem T. atroviride SC1, respectivamente.

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Exemplo 8. Biocontrol de oídio

T. atroviride SC1 controla oídio (Podosphaera xanthii) em plantas de horticultura como pepino e abobrinha no mesmo nível de enxofre que é um dos fungicidas químicos mais amplamente utilizados e que, por esta razão, foi incluído como padrão (Figura 8). Em particular é observado que T. atroviride SC1 controla a doença no mesmo nível do enxofre e melhor que duas cepas de Trichoderma utilizadas como padrões. Também em abobrinha a eficácia de biocontrole estava presente (diferença significativa em relação ao não tratado).

Condições experimentais

Plantas com pelo menos cinco folhas bem expandidas de cultivares susceptíveis foram utilizadas. As cultivares utilizadas foram Afrodite ou Xara para abobrinha i e 807 para pepino. As sementes foram plantadas em turfa: mistura de plantio com cascalho vulcânico (1:1) em potes de um litro e crescidas em estufas livres de CPM mantidas a 2 030°C com um foto-período natural. Foram feitas de cinco a seis replicatas (potes) de cada tratamento e planta. 0 inóculo de P. xanthii foi inicialmente coletado em estufas comerciais em plantas de abobrinha e pepino naturalmente infectadas e posteriormente mantido em plantas de pepino e abobrinha pela infecção de plantas com 3 semanas de idade e mantendo-se as plantas infectadas por até um mês em um compartimento separado da estufa. Os conídios foram obtidos por lavagem das folhas com água contendo novos micélios em formação de conídio e imediatamente aspergidos sobre as plantas. A concentração de inóculo foi de aproximadamente 10⁷ conídios ml^-1 e foi aplicado um volume de 5 ml por planta. Uma vez secas, as plantas foram incubadas durante uma noite a 22°C e umidade relativa alta (UR > 95%). Após inoculação artificial as condições

41/45 diurnas foram 20-30°C, com 30-70% de UR e as condições noturanas foram 15-20°C com 85-90% de UR. As plantas foram dispostas em blocos completamente randômicos.

O T. atroviride SC1 foi crescido em caldo nutriente (método (a), exemplo 3) e aspergido com um aspersor manual sobre as folhas. Um controle não tratado, enxofre (Thiovit, Syngenta Crop Protection) e um agente de biocontrole comercial (Trichoderma harzianum T39, Trichodex®, Intrachem Bio) foram também incluídos no experimento. Para cada tratamento foram aspergidos 5 ml da solução por plant. Os experimentos foram repetidos pelo menos duas vezes. O T. atroviride SC1 e o controle foram dispostos em um bloco completamente randômico. Iniciando sete dias após a inoculação, as folhas foram verificadas semanalmente para sintomas de oídio. Quando presente, a severidade da doença foi classificada. A severidade da doença foi determinada como a percentagem de áreas de folha com sintomas em todas as folhas.

Foi utilizada análise de variância (ANOVA) para analisar os dados transformados em arco-seno e normalizados. Esta análise foi realizada utilizando-se o programa Statistica, versão 7 (StatSoft, Tulsa, OK, EUA). As médias foram separadas de acordo com o teste HSD de Tukey (oí = 0,05). O teste de Kursal-Wallis não paramétrico foi utilizado quando as condições para a ANOVA não foram preenchidas.

Exemplo 9. Biocontrole de agentes de doenças de madeira (Doença ESCA).

T. atroviride SC1 controla os três principais patógenos da doença ESCA. A eficácia do controle de Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum e Fomitiporia mediterrânea é muito alta e próxima a 100 % (Figura 9) . Os gráficos representam a média de cinco

42/45 replicatas (placas de Petri). A eficácia de controle dof T. atroviride SCI foi sempre melhor que a do agente de biocontrole utilizado como padrão (Bacillus subtilis F77).

Condições experimentais

Cada um dos três patógenos mencionados acima foi inoculado em PDA em placas de Petri de 3 cm a partir da borda e incubado por uma semana a 25°C. Então o T. atroviride SCI foi inoculado no lado oposto a uma distância de 3 cm da borda. Foram feitas cinco replicatas para cada patógeno e para o controle não tratado. O crescimento de micélio foi medido nos dias 2, 4, 9, 14, 19, 24 e 29 após o tratamento, em particular C é o crescimento no controle não tratado (mm) e T o crescimento no tratado com T. atroviride SCI (mm). A eficácia foi calculada com a seguinte fórmula [(C-T)/CJxlOO (Sivakumar et al. , 2000).

Exemplo 10. Biocontrole do apodrecimento radicular

Armillaria mellea e A. gallica são os principais agentes causadores de podridão da raiz em várias plantas. 0 T. atroviride SCI é efetivo contra estes dois patógenos e é também mais efetivo que T. harzianum T39 como um agente de biocontrole padrão. Reduziu o crescimento dos patógenos e eventualmente os eliminou. Isto fica evidente em experimento em condições controladas contra os dois patógenos crescidos em pedaços de madeira mostrado na Figura 10, onde o crescimento de micélio de Armillaria mellea e Armillaria gallica (agentes causadores de apodrecimento radicular) na presença de Trichoderma atroviride SCI ou em sua ausência foi comparado. O efeito experimental de Trichoderma harzianum T39 - nome comercial Trichodex® - é mostrado aqui para comparação. O crescimento é expresso como média do diâmetro do

43/45 crescimento de cinco replicatas em pedaços de madeira em PDA em placas de Petri a 20°C.

O T. atroviride SC1 é também capaz de prevenir infecções em plantas. De fato, a percentagem de plantas mortas (infectadas) foi avaliada após 6 meses da primeira aplicação, que é quando os sintomas das doenças se tornam visíveis e observou-se que T. atroviride SC1 protegeu plantas de morango contra A. mellea (60% de proteção) e contra A. gallica (100% de proteção). Ao contrário, T. atroviride F122 produziu apenas 20% de proteção e T. harzianum T39 apenas 13% contra a doença (os valores nas Figuras 10 e 11 são percentagens calculadas em 10 plantas de replicata).

No caso de plantas de morango, reduziu significativamente a doença causada por A. mellea e A. gallica mesmo após 6 meses da aplicação.

O T. atroviride F122 foi utilizado como comparação para A. mellea (fig. 11) e foi observado que mostra uma atividade significativamente menor que a cepa SC1.

Condições experimentais

A. mellea e A. gallica foram inoculados em pedaços de madeira colocadas em PDA em placas de Petri em um lado do pedaço de madeira e incubados por uma semana a 25°C. Então foi inoculado T. atroviride SC1 no lado oposto. Cinco replicatas foram feitas para cada patógeno e para o controle não tratado. 0 crescimento de micélio foi medido semanalmente após o tratamento por 6 semanas.

Plantas de morango (Elsanta cv) foram inoculadas colocando-se três pedaços de madeira infectados com A. mellea ou A. gallica próximos à coroa das plantas. As plantas foram tratadas com T. atroviride SC1 crescido pelo método (b) (ver Exemplo 3) e método (c) como descrito no Exemplo 3, foi alternativamente utilizado para o mesmo

44/45 propósito para a proteção destas plantas que necessitam altos níveis de matéria orgânica tal como plantas de mirtilo produzindo os mesmos resultados obtidos com as plantas de morando mostradas na figura 11. As plantas foram mantidas sob condições controladas de estufa.

Referências

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Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição agrícola caracterizada por compreender o Trichoderma atroviride SCI, CBS n°122089 isolado, como princípio ativo e adicionalmente um emulsificante, nutriente vegetal, um agente umectante, um micro-nutriente vegetal ou um substrato.
2. 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma quantidade efetiva de 10² a 10³ conídios ml^-1 ou g^-1.
3. 3. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato do substrato ser selecionado do grupo consistindo em: um meio de cultura nutriente, um cereal ou um derivado deste, um modificador, um vegetal ou uma parte deste, turfa, madeira ou pedaço desta, argila ou casca de árvores.
4. 4. Método para proteger uma planta de uma doença causada por um fungo patogênico de planta caracterizado por tratar pelo menos uma parte da planta ou o solo próximo à dita planta com a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato da dita parte da planta ser uma folha, um fruto, uma semente ou um ferimento.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato da composição ser preparada inoculando o Trichoderma atroviride SCI CBS n°122089 isolado em ou sobre um substrato e permitindo que este cresça a uma temperatura compreendida entre 1 a 30°C até a obtenção de um número de conídios de pelo menos 10² a 10³ ml^-1 ou g^-1.
7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato do dito fungo patogênico de planta ser selecionado do grupo consistindo naqueles causadores de doenças da madeira (Phaeomoniella

   Petição 870180162719, de 13/12/2018, pág. 7/8

   2/2 chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum e Fomitiporia mediterranea), doenças foliares (o agente causador de oídio Podosphaera xanthii), doenças do fruto ou flores (Botrytis cinerea) e doenças radiculares causadas pelo gênero 5 Armillaria genus (Armillaria mellea e A. gallica).
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato da dita planta ser selecionada do grupo consistindo em: Cucurbitaceae, Rosaceae, Vitaceae, Crucifereae, Compositae, Ubelliferae, Solanaceae

   10 e Liliaceae.
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato da dita planta ser selecionada do grupo consistindo em: Cucurbitaceae, Rosaceae ou Vitaceae.

   Petição 870180162719, de 13/12/2018, pág. 8/8