BRPI0823082B1

BRPI0823082B1 - Composições de derivados de sesquiterpeno para prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes ou obesidade

Info

Publication number: BRPI0823082B1
Application number: BRPI0823082-0A
Authority: BR
Inventors: Tae-Sun Park; Ha-Won Kim
Original assignee: Kwang Dong Pharm. Co., Ltd.
Priority date: 2008-09-11
Filing date: 2008-10-20
Publication date: 2019-02-26
Also published as: US20120129924A1; EP2331089B1; WO2010030054A2; JP2012502094A; CN102143741A; WO2010030054A3; ES2560533T3; MX2011001594A; BRPI0823082A2; BRPI0823082B8; JP5435375B2; US8481592B2; CN102143741B; KR100905419B1; EP2331089A4; EP2331089A2

Abstract

composições de derivados de sesquiterpeno para prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes ou obesidade. a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes e obesidade que compreende um derivado de sesquiterpeno como um ingrediente ativo. os derivados de sesquiterpeno da presente invenção levam à diminuição em peso de gordura corporal, peso de gordura visceral e níveis de colesterol totais, triglicerídeo de plasma e tecido do fígado, níveis de glicose sanguínea e insulina sanguínea em um estado rápido, exibindo finalmente eficácias em prevenção ou tratamento de hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes e obesidade. a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes e obesidade que compreende um derivado de sesquiterpeno como um ingrediente ativo. os derivados de sesquiterpeno da presente invenção levam à diminuição em peso de gordura corporal, peso de gordura visceral e níveis de colesterol totais, triglicerídeo de plasma e tecido do fígado, níveis de glicose sanguínea e insulina sanguínea em um estado rápido, exibindo finalmente eficácias em prevenção ou tratamento de hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes e obesidade.

Description

COMPOSIÇÕES DE DERIVADOS DE SESQUITERPENO PARA PREVENIR OU TRATAR HIPERLIPIDEMIA, FÍGADO GORDO, DIABETES OU OBESIDADE

ANTECEDENTES DO CAMPO DA INVENÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a uma composição para prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes ou obesidade, que compreende um extrato do gênero Cupressus ou um derivado de sesquiterpeno.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

As mudanças em estilo de vida e ambientes de moradia resultam em um aumento patogênico de obesidade de gordura visceral em pessoas modernas. A frequente ocorrência de obesidade visceral, por sua vez, leva a um rápido aumento no desenvolvimento de síndromes metabólicas que são acompanhadas por diabetes, hipertensão, transtornos de metabolismo lipídico, resistência à insulina e similares. Estas doenças acompanhantes aumentam um fator de risco mútuo e são doenças comuns que estão associadas a uma variedade de mudanças metabólicas tal como senescência, condições de estresse, função imune comprometida e similares.

De acordo com a Pesquisa de Nutrição e Saúde Nacional (Health e Nutrition Survey) de 2005, 32% dos coreanos adultos acima de 20 anos de idade sofrem de obesidade (35,2% dos homens e 28,3% das mulheres). Recentemente, a incidência de obesidade na infância também é altiva na Coréia. De acordo com os dados da pesquisa de 2005, 11,3% das crianças do ensino fundamental, 10,7% dos estudantes do ensino médio e 16% dos estudantes do terceiro grau foram diagnosticados com obesidade (índice de massa corporal (BMI) > 25 kg/m²) . Adicionalmente, os acima do peso (BMI > 23 kg/m²) ou 17% dos jovens obesos mostraram síndrome

Petição 870180169243, de 31/12/2018, pág. 6/17

2/47 metabólica.

Então, tal aumento nas pessoas que estão acima do peso e na população obesa contribui para uma elevação na taxa de prevalência de doenças crônicas. Por exemplo, de acordo com os dados da pesquisa de 2005, as taxas de prevalência de hipertensão (30,2% dos homens e 25,6% das mulheres), diabetes (9,0% dos homens e 7,2% das mulheres), e hipercolesterolemia (7,5% dos homens e 8,8 % das mulheres) na população coreana acima dos 3 0 anos de idade foram significativamente superiores que em outros países.

Com base nos dados da pesquisa, a obesidade pode resultar em uma perda socioeconômica estimada de aproximadamente 1,017 trilhões em 2001. Em suma, o Plano de Saúde Coreano (Korean Health Plan) de 2010 foi lançado pelo Ministério da Saúde e Bem Estar como sua política para saúde pública. De acordo com este documento, os principais objetivos foram estabelecidos para lograr uma taxa de obesidade adulta menor que 20% e uma taxa de obesidade juvenil menor que 15%. Como uma estratégia de implantação para alcançar estes objetivos, foi feita uma tentativa para encontrar um método de medição e definição preciso de obesidade.

Os melhores efeitos terapêuticos em obesidade podem ser alcançados somente com uma combinação de terapia de dieta, terapia de exercício e terapia de modificação de comportamento. Entretanto, estes métodos terapêuticos requerem muito tempo e esforço em conjunto com dificuldade na prática. Por estas razões, drogas anti-obesidade ou produtos dietéticos são amplamente usados. Entretanto, orlistato, que é atualmente usado como uma droga anti

3/47 obesidade, sofre de efeitos colaterais adversos tais como esteatórreia (diarréia gordurosa), produção de gás entérico e flatulência. Uma outra droga anti-obesidade, sibutramina, também é conhecida por ter efeitos colaterais adversos tais como dor de cabeça, sede, anorexia, insônia, constipação e similares. Adicionalmente, o orlistato inibe a absorção de vitamina D e E, enquanto que a administração de fentermina e sibutramina resulta em efeitos colaterais adversos tal como palpitações/taxa cardíaca aumentada, vertigem e similares.

Recentemente, os valores e demandas para medicamentos naturais e herbais estão aumentando em vista dos efeitos colaterais adversos de drogas sintéticas e limitações da medicina ocidental no tratamento de doenças crônicas. Para arcar com esta tendência, os presentes inventores triaram uma substância anti-obesidade a partir de uma variedade de plantas voluntárias ou selvagens e, então, focaram na Cupressus funebris.

A Cupressus funebris é uma árvore alta perene que pertence ao gênero Cupressus, que é amplamente distribuído por regiões de temperatura alta abaixo de 2.000 m do centro e do sudoeste da China ao Vietnam. Seu nome específico é Chamaecypris funebris e seu nome comum é cipreste-chorão chinês. Isto pode se desenvolver em solo argiloso ou arenoso muito ácido. Isto requer solo seco e bem drenado, mas não pode crescer bem na sombra. Isto é uma árvore conífera de tamanho médio que cresce até 20 a 35 m de altura, com um tronco de até 2 m de diâmetro. As folhas são como escala com até 5 mm de comprimento em galhos fortes.

Isto tem sido usado no tratamento de coagulação

4/47 sanguínea ou fluxo menstruai excessivo na China (J.A. Duke e E.S. Ayensu, Medicinal Plants of China, pág. 705, Reference Publications, Inc., 1985). Isto tem sido usado na fabricação perfume de de perfume, ingrediente de óleo essencial, sabão e xampu no Vietnam (Luu e Thomas, 2004.

pág. 20a

22, Conifers of Vietnam,

Darwin Initiative) .

Os óleos essenciais provenientes da destilação a vapor da madeira de Cupressus funebris têm sido usados no ingrediente de perfume e existem muitos monoterpenos na folha, mas a madeira contém principalmente sesquiterpenos.

Os sesquiterpenos são uma classe de terpenos que consiste em três unidades de isopreno e tem a fórmula molecular Ci₅H₂4 . Embora os sesquiterpenos compreendam 0, 1, 2 ou 3 anéis, a maioria dos sesquiterpenos em Cupressus funebris são compostos tricíclicos. Existem muitos tipos de sesquiterpenos na madeira de Cupressus funebris tais como tujopseno (29,9%), alfa-cedreno (26.4%), beta-cedreno (9,2%), cedrol (9,6%), widdrol (9,5%), alfa-funebreno (0,7%), beta-funebreno (0,2%), acetato de cedrila (0,1%) (Duquesnoy et al., 2006, Flavour e Fragrance Journal, 21: 453-457; Adams, 1991, Modern Methods of Plant Analysis New Series, vol. 12, pág. 159-173).

Também foi relatado que muitos tipos de plantas pertencentes ao gênero Cupressus tais como Cupressus macnabiana (Laurence G. Cool, Phytochemistry, 58(6):969972(2001)), Cupressus nootkatensis (Erdtman, H. et al. , Acta Chem. Scand., 11: 1157-1161(1957)), Cupressus sempervirens (Seyyed Ahmad Emami et al., Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(2): 103-108(2006)), Cupressus macrocarpa (Srikrishna et al., Synthetic Communications,

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37(17):2855-2860(2007)), Cupressus bakeri (Koon-Sin Ngo et al., J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1, 189- 194(2000)) incluem sesquiterpenos.

Vários derivados de sesquiterpeno tricíclicos podem ser sintetizados por um método sintético orgânico e a maioria dos derivados pode ser sintetizada por método semisintético. Os derivados de sesquiterpeno sintético ou semisintéticos representativos são epóxido de cedreno (C15H24O) , formato de cedrila (Ci₆H₂₆O₂) , metil cedrila éter (Ci₆H₂₈O) , cloveno (C₁₅H₂₄) , neocloveno (Ci₅H₂₄) , 8 (15)-cedren-9-ol (C₁₅H₂₄O) , sativeno (Ci₅H₂₄) , epicedrol (Ci₅H_2SO) , metil cedrila cetona (Ci₇H₂₆O) e cedrenol (Ci₅H₂₄O) .

A patente US7071195 revela um método para tratar obesidade com amina ou derivados de amina que atuam como ligantes para neuropeptídeo Y Y5. A patente n° US702722 revela um derivado de tiazolidinediona para tratar diabetes, hiperlipidemia ou obesidade.

A patente n° US6987131 descreve uma composição para tratar hiperlipidemia que inclui fenilacetilglutamina, fenilacetilisoglutamina ou ácido fenilácetico. A patente n° US6942967 sugere a proteína apobec-1 como uma molécula alvo para tratar arterioesclerose, hiperlipidemia, obesidade e diabetes.

Por todo este pedido, várias publicações e patentes são referenciadas e citações são fornecidas em parênteses. As revelações destas publicações e patentes sem suas totalidades são incorporadas no presente documento a título de referência neste pedido com a finalidade de descrever completamente esta invenção e o estado da técnica ao qual esta invenção é pertinente.

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DESCRIÇÃO DETALHADA DESTA INVENÇÃO

Os presentes inventores realizaram pesquisas intensas para desenvolver um composto natural com eficácias antiobesidade, anti-hiperlipidemia e/ou anti-diabetes. Como um resultado, foi descoberto um extrato de Cupressus funebris ou Chamaecypris funebris pertencente ao gênero Cupressus, um derivado de sesquiterpeno de Cupressus funebris ou Chamaecypris funebris, e um derivado de sesquiterpeno sintético com uma estrutura similar a um derivado do mesmo com eficácias descrito acima.

Consequentemente, um objetivo desta invenção consiste em fornecer uma composição que compreende um derivado de sesquiterpeno como um ingrediente ativo para prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes ou obesidade. Um outro objetivo desta invenção consiste em fornecer um método para preparar um derivado de sesquiterpeno do gênero Cupressus.

Ainda um outro objetivo desta invenção consiste em fornecer um método para prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes ou obesidade.

Outros objetivos e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada junto com as reivindicações e desenhos em anexo.

Em um aspecto desta invenção, é fornecida uma composição para prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes ou obesidade, que compreende um derivado de sesquiterpeno como um ingrediente ativo.

Os derivados de sesquiterpeno são representados pela seguinte fórmula I, II ou III:

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(I) (II)

em que R_x representa hidrogênio, hidróxi, halo, alquil Ci-C₃ ou -CO-R6,· Rg representa hidrogênio ou alquil C1-C3; R₂representa hidrogênio, hidróxi ou alquil C1-C3; R_x e R₂podem estar juntos para formar um epóxido; R₃ representa hidrogênio, hidróxi, alquil Ci_C₃, -0-CO-R₇ ou alcóxi C1-C3; R₇ representa hidrogênio ou alquil C1-C3; R₄ representa hidrogênio, hidróxi ou alcóxi C1-C3; R₅ representa hidrogênio, hidróxi ou alcóxi C1-C3; ----s.UwwL representa uma ligação dupla ou uma ligação simples; quando ——. no anel é uma ligação dupla, R₂ representa hidrogênio, hidróxi ou alquil C1-C3 alquil; e quando -- próximo a R₂ é

8/47 uma ligação dupla, R₂ representa CH₂; quando R₂ é metil, R₃é hidróxi e R₅ é hidrogênio, R₄ não é hidrogênio.

Em outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes ou obesidade, que compreende administrar a um indivíduo de uma composição que compreende um derivado de sesquiterpeno como um ingrediente ativo.

Os presentes inventores realizaram pesquisas intensas para desenvolver um composto natural com eficácias antiobesidade, anti-hiperlipidemia e/ou anti-diabetes. Como um resultado, foi descoberto um extrato de Cupressus funebris ou Chamaecypris funebris pertencente ao gênero Cupressus, um derivado de sesquiterpeno de Cupressus funebris ou Chamaecypris funebris, e um derivado de sesquiterpeno sintético com uma estrutura similar a um derivado do mesmo com eficácias descritas acima.

De acordo com uma modalidade preferencial, em que RI representa hidrogênio, hidróxi ou -CO-R₆;

R₆ representa alquil Ci-C₃; R₂ representa hidróxi ou alquil

Ci~C₃; Ri e R₂ podem estar juntos para formar um epóxido;

R₃ representa hidróxi, alquil Ci-C₃, -0-CO-R₇ ou alcóxi

Cl-C₃; R₇ representa hidrogênio ou alquil

Ci - C₃; R₄ representa hidrogênio ou hidróxi; R₅ representa hidrogênio ou hidróxi;

representa uma simples; quando ligação dupla ou uma ligação no anel é uma ligação dupla, R₂ representa alquil Ci-C₃; quando J--—.próximo a R₂ é uma ligação dupla, R₂ representa CH₂; e quando R₂ is metil, R₃ é hidróxi e R₅ é hidrogênio, R₄ não é hidrogênio.

De acordo com uma modalidade preferencial, em que Ri representa hidrogênio, hidróxi ou -CO-CH₃; R₂ representa

9/47 hidróxi ou -CH₃; Ri e R₂ podem estar juntos para formar um epóxido; R₃ representa hidróxi, -CH₃, -0-CO-CH₃ ou -0-CH₃; R₄ representa hidrogênio ou hidróxi; R₅ representa hidrogênio ou hidróxi; tsssksz: representa uma ligação dupla ou uma ligação simples; quando no anel é uma ligação dupla, R₂ representa CH₃; quando próximo a R₂ é uma ligação dupla, R₂ representa CH₂; e quando R₂ é metil, R₃ é hidróxi e R₅ é hidrogênio, R₄ não é hidrogênio.

Nas fórmulas definidas pelo presente composto, o termo alquil Ci-C₃ é definido no presente documento como sendo ramificada grupo de hidrocarboneto saturado de cadeia linear ou cadeia C₃ a C₃, isto é, alquil inferior que inclui metil, etil, n-propil, isopropil. O termo usado no presente documento halo significa átomos de halogênio, por exemplo, incluindo flúor, cloro, bromo e iodo, de preferência, flúor, cloro ou bromo. O termo alcóxi significa grupos -O alquil. Onde substituídos por grupos de alquil substituídos Ci-C₃, substituintes de alquil substituídos por halo, de preferência cloro ou flúor, com mais preferência, flúor podem ser usados. O termo epóxido significa um composto de éter cíclico que contém um átomo de oxigênio como parte de um anel de três membros com átomos de carbono.

O composto representado pela fórmula I, II ou III exibe eficácias de prevenção ou tratamento em hiperlipidemia, fígado gordo e obesidade. Conforme demonstrados nos exemplos abaixo, os derivados de sesquiterpeno contribuem para diminuir o peso de gordura corporal, peso de gordura visceral, níveis de colesterol totais e nível de triglicerídeo em plasma e fígado,

10/47 exibindo finalmente eficácias na prevenção ou tratamento de hiperlipidemia, fígado gordo e obesidade. Além disso, os derivados de sesquiterpeno contribuem para diminuir significativamente tanto o nível de glicose sanguínea quanto o nível de insulina sanguínea em um estado rápido, exibindo eficácias de aprimoramento em diabetes tipo II ou resistência à insulina e inflamação metabólica estreitamente associada a isto.

De acordo com uma modalidade preferencial, os derivados de sesquiterpeno são contidos em extratos ou frações do gênero Cupressus.

gênero Cupressus, uma árvore alta perene, é um dos diversos gêneros da família Cupressaceae que têm o nome comum cipreste. Cerca de 20 espécies pertencem a Cupressus, que são desenvolvidas como árvores decorativas ou crescidas por sua madeira. Elas são nativas em localidades dispersas principalmente em regiões temperadas quentes no hemisfério norte, incluindo Ásia, Europa e América do Norte. Elas são grandes arbustos que crescem até 25 m de altura, especialmente, em formato de pirâmide quando jovens.

A árvore Cupressus útil na presente invenção pode incluir qualquer Cupressus que contém derivados de sesquiterpeno, mas não se limita a, de preferência, Cupressus macnabiana (Laurence G. Cool, Phytochemistry, 58(6): 969-972 (2001)), Cupressus nootkatensis (Erdtman, H. et al., Acta Chem. Scand., 11: 1157-1161 (1957)), Cupressus sempervirens (Seyyed Ahmad Emami et al., Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(2): 103-108 (2006)), Cupressus macrocarpa (Srikrishna et al., Synthetic Communications, 37(17): 2855-2860 (2007)), Cupressus bakeri (Koon-Sin Ngo

11/47 et al. , J. Chem. Soc, Perkin Trans. II 189-194 (2000)) ou

Cupressus funebris e, com máxima preferência, Cupressus funebris.

O extrato de Cupressus sp. que contém derivados de sesquiterpeno como ingredientes ativos pode ser obtido através da extração de Cupressus sp. (de preferência, o xilema de Cupressus sp.) com vários solventes de extração: de preferência, (a) álcool inferior portador de água ou absoluto que contém 1 a 4 átomos de carbono (metanol, etanol, propanol, butanol, n-propanol, iso-propanol e nbutanol etc.), (b) mistura de álcool inferior e água, (c) acetona, (d) acetato de etila, (e) clorofórmio, (f) 1,3butileno glicol, (g) hexano, (h) dietiléter, (i) butilacetato, e (j) água.

A fração do gênero Cupressus que contém derivados de sesquiterpeno se refere a uma forma purificada ou isolada obtida através do isolamento ou purificação adicional de extratos de Cupressus sp. Por exemplo, podería ser observado que qualquer fração obtida com o uso de uma variedade de métodos de purificação adicionais tais como uma ultrafiltração com valor de corte de peso molecular definido e várias cromatografias (designadas para purificação dependente do tamanho, carga, hidrofobicidade e afinidade) está incluída nas presentes frações. Os derivados de sesquiterpeno obtidos a partir das frações usadas na presente invenção podem incluir quaisquer derivados de sesquiterpeno, mas não se limitam a, de preferência, acetato de cedrila, representados pela seguinte fórmula IV, α-cedreno representados pela seguinte fórmula V, β-cedreno representados pela seguinte fórmula

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VI), α-funebreno representados pela seguinte fórmula VII p- funebreno representados pela seguinte fórmula VIII, com mais preferência acetato de cedrila, α-cedreno ou cedreno.

ou e

P-

(VII)

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quimicamente sintetizados.

De acordo com uma modalidade preferencial, os derivados de sesquiterpeno compreendem quaisquer derivados de sesquiterpeno quimicamente sintetizados além dos derivados de sesquiterpeno isolados do gênero Cupressus.

Com mais preferência, os derivados de sesquiterpeno compreendem epóxido de cedreno representados pela seguinte fórmula IX, formato de cedrila representados pela seguinte fórmula X, metil cedrila éter representados pela seguinte fórmula XI), 8(15)-cedren-9-ol representados pela seguinte fórmula XII), epicedrol representados pela seguinte fórmula XIII), metil cedrila cetona representados pela seguinte fórmula XIV) ou cedrenol representados pela seguinte fórmula XV. Com máxima preferência, os derivados de sesquiterpeno compreendem epóxido de cedreno, metil cedrila éter, metil cedrila cetona ou cedrenol.

14/47

all^CHg ^CH3 (XII)

15/47

..ntUCHg

(XIV)

OH (XV)

Ainda em um outro aspecto desta invenção, é fornecida uma composição farmacêutica ou uma composição alimentícia para prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes ou obesidade, que compreende um derivado de sesquiterpeno como um ingrediente ativo.

A composição farmacêutica pode conter um veículo farmaceuticamente aceitável. Nas composições farmacêuticas desta invenção, o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser convencional para formulação, incluindo lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, borracha processável, fosfato de potássio, arginato, gelatina, silicato de potássio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xaropes, metil

16/47 celulose, metilidroxi benzoato, propilidroxi benzoato, talco, estearato de magnésio e óleos minerais, mas não se limitam a estes. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode incluir adicionalmente um lubrificante, um umectante, um adoçante, um agente flavorizante, um emulsificante, um agente de suspensão e um conservante. Os detalhes de veículos farmaceuticamente aceitáveis e formulações adicionais podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995), que é incorporado no presente documento a título de referência.

A composição farmacêutica desta invenção pode ser administrada oral ou parenteralmente e, de preferência, oralmente.

Uma dose adequada da composição farmacêutica da presente invenção pode variar dependendo dos métodos de formulação farmacêutica, métodos de administração, idade do paciente, peso corporal, sexo, gravidade das doenças, dieta, tempo de administração, via de administração, uma taxa de excreção e sensibilidade a uma composição farmacêutica usada. Os médicos de ciência comum na técnica podem determinar uma quantidade eficaz da composição farmacêutica para tratamento desejado. De preferência, a composição farmacêutica da presente invenção é administrada com uma dose diária de 0,001 a 100 mg/kg (peso corporal).

De acordo com as técnicas convencionais conhecidas pelos elementos versados na técnica, a composição farmacêutica pode ser formulada com veículo e/ou portador farmaceuticamente aceitável conforme descrito acima, fornecendo finalmente diversas formas incluindo uma forma

17/47 de dose unitária e uma forma de dose múltipla. Os exemplos não limitantes das formulações incluem, mas não se limitam a, uma solução, uma suspensão ou uma emulsão em óleo ou meio aquoso, um extrato, um elixir, um pó, um grânulo, um tablete e uma cápsula e pode compreender adicionalmente um agente de dispersão ou um estabilizante.

A composição alimentícia pode conter ingredientes adicionais usados em composições alimentícias convencionais bem como extrato de Cupressus sp. A composição alimentícia pode compreender aditivos adicionais para preparar composições alimentícias, por exemplo, proteínas, carboidratos, lipídeos, substâncias nutritivas e flavorizantes. Os exemplos não limitantes de carboidratos naturais incluem, mas não se limitam a, monossacarídeo (por exemplo, glicose e frutose), dissacarídeo (por exemplo, maltose e sacarose), oligossacarídeo, polissacarídeo (por exemplo, dextrina e ciclodextrina) e álcool de açúcar (por exemplo, xilitol, sorbitol e eritritol). Os exemplos não limitantes de flavorizantes incluem, mas não se limitam a, flavorizantes naturais (por exemplo, taumatina e extrato de Stevia} e flavorizantes sintéticos (por exemplo, sacarina e aspartame).

Por exemplo, onde a composição alimentícia desta invenção é fornecida como uma bebida, isto pode compreender adicionalmente ácido cítrico, frutose liquefeita, sacarose, glicose, ácido acético, ácido málico, sucos de fruta, extratos de Eucommia ulmoides, extratos de jujuba e/ou extratos de alcaçuz bem como o extrato de Cupressus sp. como um ingrediente ativo.

As presentes composições que compreendem o extrato do

18/47 gênero Cupressus como um ingrediente ativo levam à diminuição em peso de gordura corporal, peso de gordura visceral e níveis de colesterol totais, nível de triglicerídeos in plasma e fígado, e níveis de glicose sanguínea e insulina sanguínea em um estado rápido, exibindo finalmente as eficácias de prevenção ou tratamento em hiperlipidemia, fígado gordo e obesidade.

O termo usado no presente documento hiperlipidemia se refere a doenças induzidas por níveis elevados de gordura sanguínea associada a anormalidades em metabolismos de gordura para triglicerídeos e colesterol. Mais especificamente, hiperlipidemia se refere a condições com níveis de lipídeo elevados tais como triglicerídeos, colesterol LDL, fosfolipídeos e ácidos graxos e é frequentemente chamada de hipercolesterolemia.

O termo usado no presente documento fígado gordo significa condições com acúmulo excessivo de gorduras no metabolismos de gordura.

Esta condição é uma causa patológica para várias doenças tais como angina peitoral, infarto do miocárdio, derrame, arterioesclerose e pancreatite.

O termo diabetes usado no presente documento se refere a doenças crônicas ocasionadas por insuficiência de insulina absoluta ou relativa que leva à intolerância à glicose. 0 termo diabetes é usado com a intenção de abranger todos os tipos de diabetes, por exemplo, diabetes tipo I, diabetes tipo II e diabetes hereditárias, a diabetes tipo I é diabetes dependente de insulina ocasionada principalmente por rompimento da célula p, diabetes tipo II é diabetes independente de insulina

19/47 ocasionada por secreção de insulina insuficiente após dieta ou resistência à insulina.

De acordo com uma modalidade preferencial, a presente composição é usada na prevenção ou tratamento de diabetes tipo II e, com mais preferência, diabetes tipo II associada com resistência à insulina.

Ainda em um outro aspecto adicional desta invenção, é fornecido um método para preparar os derivados de sesquiterpeno, que compreende as etapas de: (a) contatar um solvente de extração com o gênero Cupressus para obter um extrato com efeitos anti-obesidade; e (b) fracionar o extrato e selecionar uma fração com efeitos anti-obesidade para isolar o derivado de sesquiterpeno.

presente método será descrito em maiores detalhes da seguinte forma:

(a) Preparação de Extratos do gênero Cupressus

A árvore Cupressus sp. útil na presente invenção pode incluir qualquer árvore Cupressus sp. , de preferência, Cupressus macnabiana, Cupressus nootkatensis, Cupressus sempervirens, Cupressus macrocarpa, Cupressus bakeri ou Cupressus funebris, com mais preferência, Cupressus funebris, e, com máxima preferência, o xilema de Cupressus funebris.

O solvente de extração pode incluir qualquer solvente conhecido por um elemento versado na técnica. De preferência, o solvente de extração é um solvente não polar, com mais preferência, um selecionado do grupo que consiste em diclorometano, hexano, clorofórmio e etiléter, e, com máxima preferência, diclorometano.

De acordo com uma modalidade preferencial, a filtração

20/47 e a concentração de extratos são executadas após a extração.

Os efeitos anti-obesidade do extrato são confirmados através de testes anti-obesidade com o uso de Caenorhabditis elegans (C. elegans) .

(b) Isolamento de Derivados de Sesquiterpeno por Fracionamento de Extratos fracionamento dos extratos da árvore Cupressus sp. pode ser executado de acordo com procedimentos de fracionamento ou purificação convencionais. Com máxima preferência, o fracionamento é executado através da aplicação do extrato da árvore Cupressus sp. em uma coluna de gel de sílica.

De acordo com uma modalidade preferencial, a etapa (b) é executada através da aplicação do extrato da etapa (a) em uma primeira coluna de gel de sílica e da execução de uma eluição sob condições para eluir preferencialmente os componentes com baixa polaridade para obter uma fração que tem atividade anti-obesidade. A eluição pode incluir qualquer solvente conhecido pelo elemento versado na técnica. De preferência, o solvente de extração é o solvente não polar, com mais preferência, um selecionado do grupo que consiste em diclorometano, hexano, clorofórmio e etiléter, e, com máxima preferência, diclorometano e/ou hexano normal. Por exemplo, o fracionamento pode ser executado por gradiente de diclorometano (começando com hexano normal e, então, com gradiente de diclorometano).

Os recursos e vantagens da presente invenção serão resumidos da seguinte forma:

(a) A presente invenção fornece uma composição para

21/47 prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes ou obesidade, que compreende um derivado de sesquiterpeno representada pela fórmula I, II ou III como um ingrediente ativo.

(b) A presente composição pode ser preparada a partir do gênero Cupressus ou quimicamente sintetizada.

(c) As presentes composições que compreendem o extrato do gênero Cupressus ou um derivado de sesquiterpeno como um ingrediente ativo levam à diminuição em peso de gordura corporal, peso de gordura visceral e níveis de colesterol totais, nível de triglicerídeos em plasma e fígado, e níveis de glicose sanguínea e insulina sanguínea em um estado rápido, exibindo finalmente eficácias de prevenção ou tratamento em hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes ou obesidade.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 representa os efeitos de derivados de sesquiterpeno isolados do gênero Cupressus em níveis de gordura corporal de C. elegans. Os números na figura representam teor de gordura colorido por vermelho Nilo. Um baixo teor de gordura foi indicado por +1, enquanto que um alto teor de gordura foi atribuído com +4.

A Figura 2 representa os efeitos de derivados de sesquiterpeno quimicamente sintetizados em níveis de gordura corporal de C. elegans. Os números na figura são teores de gordura coloridos por vermelho Nilo. Um baixo teor de gordura foi indicado por +1, enquanto que um alto teor de gordura foi atribuído com +4. A presente invenção será descrita agora em detalhes adicionais pelos exemplos. Seria óbvio para o elemento versado na técnica que estes

22/47 exemplos se destinam a ser mais concretamente ilustrativos e o escopo da presente invenção conforme apresentado nas reivindicações em anexo não está limitado a isto ou pelos exemplos.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Fracionamento de Extrato de Cupressus sp. e Isolamento de Derivados de Sesquiterpeno xilema de Cupressus funebris pertencente a Cupressus sp. foi inteiramente seco na sombra e, então, moído formando pó por um moedor. 45 L de diclorometano (CH2CI2) foram adicionados a 10 kg do pó para extração a 25°C por 14 dias. 0 processo de extração foi repetido duas vezes. O extrato primário e o extrato secundário foram combinados e filtrados, e o filtrado resultante foi concentrado em um banho de água a 50°C sob vácuo para produzir 140 g de um extrato total. Após a avaliação sobre efeito anti-obesidade do extrato total em Caenorhabãitis elegans, o extrato foi fracionado adicionalmente com o uso de uma coluna de gel de sílica preparadora de massa. Os 14 0 g do extrato total foram fracionados com o uso da coluna com um diâmetro de 6,5 cm e uma altura de 80 cm e embalados com gel de sílica (230 a 400 mesh, Merck, Alemanha). Um total de seis compostos (Composto 1, Composto 2, Composto 3, Composto 4, Composto 5 e Composto 6) foi isolado com o uso de um solvente de desenvolvimento (iniciando com normal hexano e, então, com gradiente de diclorometano de 0,1% a 1%). Os efeitos anti-obesidade dos compostos foram avaliados.

EXEMPLO 2: Análise Estrutural dos Compostos Isolados de Cupressus Funebris

A análise de massa, ^1H-NMR e ¹³C-NMR dos 6 compostos

23/47 mostrou que o Composto 1 é acetato de cedrila, o Composto 2 é (-)-α-cedreno, o Composto 3 é (+)-p-cedreno, o Composto 4 é (+)-cedrol, o Composto 5 é (+)-a-funebreno e o Composto 6 é (+)-p-funebreno. A análise instrumental e as estruturas químicas dos compostos foram mostrados abaixo.

Análise Estrutural de Composto 1

As características físicas do Composto 1 foram pó cristal, um ponto de fusão de 44 a 46 °C, uma fórmula química de Ci₇H₂SO₂ e um peso molecular de 264 através da análise de massa.

A análise ¹H-NMR do Composto 1 foi exec	iutada:	¹H-NMR
(400 MHz em CDC1₃) δ 0,83 (d, J=7,2, 3H) ,	0,97 (s,	3H) ,
l,17(s, 3H), 1,25-1,29(1H), 1,30-1,45(4H),	1,52 (s,	3H) ,
1,61-1,68(1H) , 1,78-1,82 (1H) , 1,85-1,91(1H) ,	1,95(s,	3H) ,
2,00- 2,O3(1H), 2,38-2,42(1H). Além disso, os espectros de ¹³C-NMR para	o Composto 1

foram obtidos: ¹³C-NMR (150 MHz, em CDC1₃) : δ (ppm) 25,8(C1),

37,0(C2),	41,0(C3),	54,0(C3a),	31,2(C4),	33,2(C5),
86,2(C6),	56,9(C7),	43,4(C8),	56,7(C8a),	41,3(C9),
15,5(C10),	25,3(Cll),	170,3(C12),	22,8(C13),	26,9(C14),

28,4(C15).

O Composto 1 foi identificado por ter a fórmula química de Ci₇H₂₈O₂ (acetato de cedrila) através da analise instrumental acima. A estrutura química do Composto 1 é representada pela fórmula abaixo.

24/47

Análise Estrutural do Composto 2

As características físicas do Composto 2 foram estado líquido, uma fórmula química de Ci₅H₂₄ e um peso molecular de 204 através da análise de massa.

A análise ¹H-NMR do Composto 2 foi executada: ¹H-NMR (400 MHz em CDC1₃) δ 0,84(d, J=7,2, 3H) , 0,95(s, 3H) , l,02(s, 3H) , 1,33-1,42(3H) , 1,55-1,62 (1H) , 1,63-1,64(1H) ,

1,66-1,67 (3H) , 1,69-1,71(1H) , 1,73-1,76(1H) , 1,78-1,87(2H) ,

2,14- 2,19(1H), 5,22(1H).

Além disso, os espectros de ¹³C-NMR para o Composto foram obtidos: ¹³C-NMR (100 MHz em

CDC1₃) : δ (ppm)

24,8(Cl)

36,1(C2),

41,5(C3),

53,9(C3a)

38,1(C4),

119,2(C5)

140,3(C6)

54,9(C7)

48,1(C8)

59,0(C8a),

40,7(C9)

15,4(C10)

24,7(Cll)

25,6(C12),

27,7(C13).

O Composto 2 foi identificado por ter a fórmula química de

C15H24 ((-)-α-cedreno) através da análise instrumental acima.

A estrutura química do

Composto 2 é representada pela fórmula abaixo.

Análise Estrutural do Composto 3

As características físicas do Composto 3 foram estado líquido, uma fórmula química de C₁₅H₂₄ e um peso molecular de 204 através da análise de massa.

25/47

A análise ¹H-NMR do Composto 3 foi executada: ^^H-NMR (400 MHz in CDC13) δ 0,84 (d, J=7,2, 3H) , 0,94(s, 3H) ,

0,97(s, 3H) , 1,18-1,21(1H) , 1,28-1,34 (1H) , 1,36-1,45(1H) ,

1,47-1,49(1H), 1,51-1,58(2H), 1,66-1,72(1H), 1,75-1,83(2H),

1,85- 1,9O(1H), 2,19(1H),

2,31-2,34(2H), 4,58(1H)

4,59(1H) .

Além disso, os espectros ¹³ C-NMR para o Composto foram obtidos: ¹³C-NMR (150 MHz, em

CDC1₃) : δ (ppm)

25,7(Cl)

37,0(C2),

42,1(C3),

54,4(C3a),

33,7(C4),

151,9 (C6)

60,7(C7),

42,3(C8),

56,4(C8a),

45,1(C9)

15,4(C10)

107,6(Cll),

25,9(C12), 26,6(C13).

O Composto 3 foi identificado por ter a fórmula química de

C₁₅H₂₄ ((+)-β-cedreno) através da análise instrumental acima.

A estrutura química do Composto 3 é representada pela fórmula abaixo.

Análise Estrutural do Composto 4

As características físicas do Composto 4 foram pó cristal, um ponto de fusão de 55 a 59 °C, uma fórmula química de Ci₅H₂6O e um peso molecular de 222 através da análise de massa.

A análise ^-NMR do Composto 4 foi executada: ¹H-NMR (CDC13) δ 0,85(3H), l,00(3H), 1,26(3H), 1,2 7 -1,2 9 (1H) ,

1,32(3H), 1,35-1,43 (4H), 1,51-1,58(3H) , 1,61-1,71(3H) ,

26/47

1,78-1,89(3Η).

Além disso, os espectros ¹³C-NMR para o Composto foram obtidos: ¹³C-NMR (150 MHz, em

CDC1₃) : δ (ppm)

25,4(Cl)

37,0(C2),

41,5(C3),

54,1(C3a),

31,6(C4),

35,4(C5)

75,1(C6),

61,1(C7),

43,4(C8),

56,5(C8a),

42,0(C9)

15,6(CIO)

27,7(C12), 28,9(C13).

O Composto 4 foi identificado por ter a fórmula química de Ci₅H₂6O ( ( + ) -cedrol) através da análise instrumental acima. A estrutura química do Composto 4 é representada pela fórmula abaixo.

Análise Estrutural do Composto 5

As características físicas do Composto 5 foram estado líquido, uma fórmula química de Ci₅H₂4 e um peso molecular de 204 através da análise de massa.

A análise ^-NMR do Composto 5 foi executada: ¹H-NMR (CDC13) δ 0,81- 0,95(6H), l,06(s, 3H), 1,25-1,31(1H), 1,321,46(3H), 1,54-1,61(2H), 1,61-1,64(3H) , 1,74-1,82 (1H) , 1,92-1,99 (1H) , 2,07-2,10 (IH) , 2,15-2,32 (2H) , 5,11(1H).

Além disso, os espectros de ¹³C-NMR para o Composto 5 foram obtidos: ¹³C-NMR (150 MHz, em CDC1₃) : δ (ppm) 21,8(C1), 34,1(C2), 37,2(C3), 55,5(C3a), 36,4(C4), 119,0(C5), 141,8(C6), 58,1(C7), 37,3(C8), 61,2(C8a), 36,6(C9),

27/47

18,l(C10), 18,4(C11), 24,3(C12), 24,3(C13).

O Composto 5 foi identificado por ter a fórmula química de Ci₅H₂₄ ( ( + )-α-Funebreno) através da análise instrumental acima. A estrutura química do Composto 5 é representada pela fórmula abaixo.

Análise

Estrutural do Composto 6

As características físicas do Composto 6 foram estado líquido, uma fórmula química de Ci₅H₂₄ e um peso molecular de 204 através da análise de massa.

(CDC13) análise ¹H-NMR do

0,82- 0,90(6H),

1,35(2H),

1,35-1,41(1H),

1,68(1H),

1,71-1,80(1H),

Composto 6 foi executada:

l,06(S, 3H), 1,18-1,24(1H)

1,41-1,50(1H), 1,12(1H),

NMR

1,241,621,91-1,95(1H) , 2,22-2,38 (2H)

2,55- 2,58(1H), 4,57(1H),

4,58(1H).

Além disso, os espectros de ¹³C-NMR para o Composto foram obtidos: ¹³C-NMR (150 MHz, em

CDC1₃) : δ (ppm)

19,4(Cl)

35,1(C3),

55,6(C3a),

32,5(C4),

152,5(C6)

62,9(C7) ,

37,3(C8),

59,7(C8a),

36,6(C9)

18,3(C10)

106,6(Cll) ,

21,6(C12), 21,6(C13).

Composto 6 foi identificado por ter a fórmula química de c₁₅h₂₄ ((+)-β-Funebreno) através da análise instrumental acima.

A estrutura química do Composto 6 é representada pela fórmula abaixo.

28/47

EXEMPLO 3: Estruturas de Compostos Químicos Sintéticos Similares a Compostos de Sesquiterpeno Isolados de 10 Cupressus Funebris

Os efeitos anti-obesidade do sesquiterpenos sintéticos similares aos 6 compostos isolados de Cupressus Funebris foram avaliados. As estruturas químicas dos compostos sintéticos de sesquiterpeno são avaliadas abaixo. Os 15 compostos sintéticos de sesquiterpeno foram adquiridos junto a empresas, mencionadas abaixo.

Análise Estrutural do Composto 7

Epóxido de cedreno (Ci₅H₂₄) , Zhejiang HuangYan Spice

Co., Ltd. (China)

Análise Estrutural do Composto 8

Formato de cedrila (Ci₆H₂6O₂) , Sigma (EUA)

29/47

Análise Estrutural do Composto 9

Metil cedrila éter (Ci₆H₂₈O) , Zhejiang HuangYan Spice

Co., Ltd. (China)

Análise Estrutural do Composto 10 (-)-Cloveno (Ci₅H₂₄) , Sigma (EUA)

CH

30/47

Análise Estrutural do Composto 11 (+)-8(15)-Cedren-9-ol (C15H24O) , Sigma (EUA)

Análise Estrutural do Composto 12 (+)-sativeno (C15H24), Sigma (EUA)

Análise Estrutural do Composto 13 (-)-epicedrol (CÍ5H26O), Sigma (USA)

31/47

Análise Estrutural do Composto 14

Metil cedrila cetona, Zhejiang HuangYan Spice Co.,

Ltd. (China)

Análise Estrutural do Composto 15

Cedrenol (Ο_Χ5Η₂₄Ο) , Jiangxi Zhangshu Crown Capital

Fragrance Limited (China)

EXEMPLO 4: Avaliação sobre Efeitos Anti-Obesidade dos 15 Compostos de Sesquiterpeno em C. elegans

Com o uso de um microscópio dissecante (x50 ampliação), C. elegans no 4^o estágio (L4, o estágio imagético) foi transferido para 3 ml de um meio S suplementado com colesterol (que contém NaCl, K₂HPO₄, KH₂PO₄, colesterol, citrato, metais-traço, CaCl₂ e MgSO₄) , e

32/47

100 pL de E. coli OP50 (OD₆oo = 0,2) cultivados em líquido de um dia para o outro antes de 1 dia de experimento foram adicionados a isto. A amostra de fração de Pterocarpus indicus foi adicionada ao meio líquido que contém C. elegans, seguido por cultivo rotatório em um ambiente escuro a 16 °C e 100 rpm. A amostra insolúvel em água foi dissolvida em DMSO e adicionada aos meios de cultivo. A concentração final de DMSO foi ajustada para abaixo de 1%. 1% de DMSO não exibiu efeitos em adipogênese e crescimento de C. elegans. 24 horas depois a amostra foi adicionada a C. elegans, 30 pL de um corante vermelho Nilo a uma concentração de 10 pg/ml foram adicionados (concentração final de vermelho Nilo foi ajustada para 100 ng/ml) aos meios, seguido por cultivo rotatório contínuo por 2 dias.

A fim de capturar o movimento locomotivo de C. elegan, 20 pl de 0,3% NaN₃ foram pingados em um vidro deslizante ao qual 100 pl de C. elegans cultivados na presença de vermelho Nilo por 2 dias foram adicionados. Sob um microscópio de fluorescência, os adipócitos de C. elegans que emitem fluorescência vermelha em um ambiente escuro onde foram micrografados e comparados com o grupo de controle para determinar assim a quantidade de gordura. Um baixo teor de gordura foi indicado por +1, enquanto que a um alto teor de gordura foi atribuído +4. O C. elegans adulto (estágio L4) imediatamente antes da oviparidade foi usado neste Exemplo. Portanto, os ovos foram incubados após o tratamento da amostra e a maioria dos C. elegans adultos foi exterminada no dia 3 após o tratamento. Um teor de gordura foi examinado em C. elegans que tiveram novas incubação e crescimento.

33/47

O efeito anti-obesidade do extrato total de Cupressus funebris foi examinado em C. elegans. O extrato total em várias concentrações (0, 1, 10 e 100 pg/mL) foi adicionado ao meio líquido que contém C. elegans. Conforme representado nos resultados experimentais, a Tabela 1, o extrato total exibiu efeitos anti-obesidade significativos a uma concentração de 10 μ/mL ou superior.

TABELA 1. Efeito Anti-obesidade do Extrato Total de

Cupressus funebris para C. elegans.

Itens	Teor de Gordura
Concentração de Amostra (pg/mL)	0	1	10	100
Efeito Antiobesidade do Extrato Total	+4	+4	+3	+2

(Um baixo teor de gordura foi indicado por +1, enquanto que a um alto teor de gordura foi atribuído com +4 na Tabela)

Cada um dos seis compostos ((-)-a-cedreno, ( + ) -pcedreno, (+)-cedrol, (+)-a-funebreno e (+)-p-funebreno) extraído do xilema de Cupressus funebris, e nove compostos (epóxido de cedreno, formato de cedrila, metil cedrila éter, (-)-cloveno, (+)-8(15)-cedreno-9-ol, (+)-sativeno, ()-epicedrol, metil cedrila cetona ou cedrenol) que têm a estrutura similar foram colocados em contato com C. elegans em várias concentrações (0, 1, 10, 100 pg/ml), e seu efeito inibitório em adipogênese foi observado no escuro sob um microscópio de fluorescência. Conforme mostrado tanto na

34/47

Tabela 2 quanto na Figura 1, o total de seis derivados de sesquiterpeno extraídos das plantas teve efeito significativamente inibitório em adipogênese em concentrações de 1, 10 ou 100 pg/ml. Dentre eles, (-)-a5 cedreno, (+)-p-cedreno, (+)-α-funebreno e (+)-p-funebreno tiveram efeito notavelmente inibitório em adipogênese mesmo em uma baixa concentração de 1 pg/ml.

TABELA 2. Efeito Anti-obesidade de um Componente de

Cupressus funebris em C. elegans.

Itens	Teor de Gordura
Concentração de Amostra (pg/mL)	0	1	10	100
Acetato de cedrila	+4	+4	+3	+2
(-)-a- cedreno	+4	+2	+2	+2
(+)-p- cedreno	+4	+2	+3	+2
(+)-cedrol	+4	+4	+4	+3
(+)-a- funebreno	+4	+3	+2	+2
(+)-p- funebreno	+4	+1	+1	+2

Além disso, o efeito anti-obesidade de compostos de sesquiterpeno sintéticos para C. elegans é examinado.

Conforme mostrado tanto na Tabela 3 quanto na Figura 2,

35/47 todos os compostos tiveram efeito significativamente inibitório em adipogênese em uma concentração de 1, 10 ou

100 pg/ml. Dentre eles, formato de cedrila, metil cedrila éter, (-)-cloveno, (+)-8(15)-cedreno-9-ol, (+)-sativeno, (5 )-epicedrol, metil cedrila cetona e cedrenol tiveram efeito notavelmente inibitório em adipogênese mesmo em uma baixa concentração de 1 pg/mL.

Portanto, poderia ser demonstrado que um total de 15 derivados de sesquiterpeno pode contribuir para diminuição em peso de gordura corporal e ser usado como um agente anti-obesidade.

TABELA 3. Efeito Anti-obesidade de Derivados

Sintéticos em C. elegans.

Itens	Teor de Gordura
Concentração de Amostra (pg/mL)	0	1	10	100
Epóxido de cedreno	+4	+4	+3	+2
Formato de cedrila	+4	+3	+ 1	+ 1
Metil cedrila éter	+4	+1	+2	+2
(-)-cloveno	+4	+2	+2	+2
( + )-8(15) cedreno-9-ol	+4	+2	+1	+2
(+)-sativeno	+4	+2	+2	+1
(-)- epicedrol	+4	+1	+1	+3
Metil	+4	+3	⁺²	+ 1

36/47

cedrila cetona
cedrenol	+4	+2	+ 1	+1

Todos os 15 derivados de sesquiterpeno usados na presente invenção independentemente de qualquer forma extraída da natureza ou obtida através de síntese são solúveis em gordura, pois elas foram facilmente dissolvidas em solvente orgânico que tem polaridade mais baixa que etanol, mas não água. Dessa forma, isto tem uma vantagem em relação à admissão praticável no intestino delgado para tomar estes compostos de uma maneira oral. Além disso, cada componente em pó e componente líquido pode ser preparado como um produto final de tablete e cápsula macia, permitindo que seja de uma maneira praticável. Os compostos que têm um ponto de ebulição abaixo de 100°C são epóxido de cedreno (ponto de ebulição: 94 a 95°C), e os compostos que têm um ponto de ebulição abaixo de 200°C são (+)-8(15)cedreno-9-ol (ponto de ebulição: 166 a 168°C) e cedrenol (ponto de ebulição: 166 a 169°C). Além disso, todos os outros compostos têm um ponto de ebulição acima de 200°C e, dessa forma, são muito estáveis em temperatura ambiente. As características físicas de cada composto são descritas como na Tabela 4.

TABELA 4. Características Físicas dos Compostos.

Composto

Origem

Propriedade

Solubilidade

Ponto de Ebulição (°C)

37/47

Acetato de cedrila	Composto natural	Pó cristalizado	Solúvel em gordura	200 a 203
(-)-a-	Composto	Líquido	Solúvel em	261 a 262
cedreno	natural	viscoso	gordura
(+) -p-	Composto	Líquido	Solúvel em	263 a 264
cedreno	natural	viscoso	gordura
( + ) -	Composto	Líquido	Solúvel em	252 a 253
cedrol	natural	viscoso	gordura
( + )-a-	Composto	Líquido	Solúvel em	253 a 254
funebreno	natural	viscoso	gordura
(+)-p-	Composto	Pó	Solúvel em	273 a 274
funebreno	natural	cristalizado	gordura
Epóxido	Composto	Líquido	Solúvel em	94 a 95
de	sintético	viscoso	gordura
cedreno
Formato	Composto	Líquido	Solúvel em	308 a 309
de	sintético	viscoso	gordura
cedrila
Metil	Composto	Líquido	Solúvel em	268 a 269
cedrila	sintético	viscoso	gordura
éter
(-) -	Composto	Líquido	Solúvel em	261 a 263
cloveno	sintético	viscoso	gordura
( + )-	Composto	Pó	Solúvel em	166 a 168
8(15) -	sintético	cristalizado	gordura
cedreno-
9-ol
( + )-	Composto	Líquido	Solúvel em	255 a 257
sativeno	sintético	viscoso	gordura

38/47

(-) -	Composto	Pó	Solúvel em	277 a 278
epicedrol	sintético	cristalizado	gordura
Metil	Composto	Líquido	Solúvel em	272 a 273
cedrila	sintético	viscoso	gordura
cetona
Cedrenol	Composto	Pó	Solúvel em	166 a 169
	sintético	cristalizado	gordura

EXEMPLO 5: Efeitos Reduzidos de 8 Compostos de

Sesquiterpeno em Peso Corporal e Gordura Visceral

Preparação de Dieta e Criação de Animal Experimental

A dieta induzível por obesidade usada no presente experimento foi dieta de alta gordura (HFD: 40% de calorias de gordura, 17g de banha de porco + 3% óleo de milho/100 g dieta) desenvolvida pelos presentes inventores e a composição da dieta que contém compostos de sesquiterpeno foi igual àquela de HFD, porém cada um dos 8 compostos de 10 sesquiterpeno com uma concentração de 0,2% foi incluído na dieta (dieta que contém acetato de cedrila, dieta que contém (-)-α-cedreno, dieta que contém (+)-β-cedreno, dieta que contém epóxido de cedreno, dieta que contém metil cedrila éter, dieta que contém metil cedrila cetona, dieta 15 que contém cedrenol e dieta que contém (+)-cedrol). A composição da dieta é descrita na seguinte Tabela 5 abaixo.

TABELA 5. Composição da Dieta.

Componente	Controle (HFD) (g/kg dieta)	Grupo de Teste (g/kg dieta)
Caseína	200	200
DL-metionina	3	3
Amido de milho	111	109
Sacarose	370	370

39/47

Celulose	50	50
Óleo de milho	30	30
Banha de porco	170	170
Mistura de vitamina	12	12
Mistura mineral	42	42
Bitartrato de colina	2	2
Colesterol	10	10
Tert- but i1idroquinona	0,04	0,04
Composto de sesquiterpeno	-	2
Total (g)	1.000	1.000
Gordura (% de caloria)	39,0	39,0
Calor total, kJ/Kg	19.315	19.315

Camundongos machos C57BL/6J com idade de 6 semanas foram adaptados ao ambiente laboratorial durante uma semana e divididos em controle de HFD e 8 grupos de teste de acordo com projeto de bloco aleatório. E, então, eles foram 5 criados por 6 semanas. A dieta foi suprida com água entre 10 e 11 h toda manhã, e a quantidade de admissão da dieta e peso corporal foi medida todo dia e uma vez em três dias, respectivamente. O peso corporal foi medido em 2 h após a remoção da caixa de alimentação para bloquear a alteração 10 repentina de peso corporal de acordo com a admissão de alimentação, e a eficiência de alimentação foi calculada através da divisão de ganho de peso corporal pela quantidade de quantidade de admissão total da dieta durante

40/47 o período experimental total que é do dia inicial se suprimento de dieta experimental ao dia do sacrifício. Posteriormente, os animais experimentais foram jejuados por mais 12 h, foram anestesiados com dietiléter, e seu sangue e tecidos de gordura fígado e visceral (gordura do epididímo, gordura perirenal, gordura mesentérica e gordura abdominal) foram coletados. E, então, foram lavados com solução salina tamponada com a 0,1 M (pH 7,4), e seus pesos foram medidos. O sangue retirado da aorta abdominal foi centrifugado a 1.000 x g por 15 min para separar o plasma.

Alteração de peso de gordura visceral e corporal

O ganho de peso corporal após a dieta foi admitido durante 8 semanas, foi reduzido significativamente em uma faixa de 25 a 60% no grupo de teste alimentado com 8 compostos de sesquiterpeno em comparação a HFD. Dentre eles, o peso corporal do grupo de teste alimentado com metil cedrila cetona foi em sua maior parte notavelmente reduzido, e o ganho de peso corporal para 8 semanas foi reduzido para cerca de 80% em comparação ao controle. Por outro lado, o ganho de peso corporal alimentado com outros compostos de sesquiterpeno comparado com o controle foi reduzido na seguinte ordem: (-) -ct-cedreno, (+)-p-cedreno, acetato de cedrila, metil cedrila éter, cedrenol, ( + ) cedrol e epóxido de cedreno (P < 0,05) . O peso de gordura visceral total com adição de gordura do epididímo, gordura perirenal, gordura mesentérica e gordura abdominal foi medido após a dieta alimentada durante 8 semanas. Como resultados, o peso de gordura visceral total de todos os grupos de teste alimentados com 8 compostos de sesquiterpeno foi significativamente reduzido para 25 a 55%

41/47 em comparação ao controle (P < 0,05). Dentre eles, o peso de gordura visceral em grupo de teste alimentado com metil cedrila cetona foi em sua maior parte notavelmente ι reduzido, e posteriormente, o efeito de redução de peso de gordura visceral na ordem de (-)-a-cedreno, ( + )-β-cedreno, acetato de cedrila, metil cedrila éter, cedrenol e epóxido de cedreno foi medido (P < 0,05) . O peso de gordura visceral no grupo de teste alimentado com (+)-cedrol foi superior ao controle. Portanto, podería ser observado que todos os 8 compostos de sesquiterpeno em um nível de 2% (em peso, quantidade de dieta aditiva) tiveram excelente efeito na redução de peso corporal, e 7 compostos de sesquiterpeno exceto (+)-cedrol tiveram efeito notável em redução de peso de gordura visceral (Tabela 6).

TABLE 6. Ganho de Peso Corporal e Peso de gordura visceral total em Camundongos Alimentados com a Composição da Presente Invenção.

Grupo	Ganho de Peso Corporal (g/8 semanas)	Peso de Gordura Visceral Total (mg/g de peso corporal)
Controle	16,6 ± 1,1	87,6 ± 5,50
Acetato de cedrila	8,54 ± 0,84*	46,4 + 3,12*
Metil cedril éter	9,31 ± 0,91*	50,8 ± 6,12*
(-)-a-cedreno	6,73 ± 1,02*	40,0 ± 4,31*
(+)-p-cedreno	7,13 + 0,89*	48,0 ± 8,27*
Epóxido de cedreno	12,4 ± 1,36*	65,6 ± 4,43*
Metil cedril	6,51 ± 1,40*	39,4 ± 7,44*
cetona
Cedrenol	9,51 ± 1,47*	57,8 ± 4,02*

42/47

(+)-cedrol

10,9 ± 0,85*

92,4 ± 5,31

* Significativamente diferente do valor para grupo de HFD pelo Teste T do Estudante a P < 0,05.

EXEMPLO 6: Eficácia na Prevenção e Tratamento de 8 Compostos de Sesquiterpeno para Hiperlipidemia Associada à Obesidade, Fígado Gordo e Diabetes Tipo II

A concentração de colesterol, triglicerídeo e glicose de plasma total foi medida duas vezes de acordo com kit de

medição comercialmente	disponível	(sistema	Bio	Clinicai),
respectivamente. A	concentração de	insulina	foi	medida por
ELISA com o uso	de	um kit de	insulina	de	camundongo
(Shibayaki, Japão)	. 0	componente	líquido	do	tecido do

fígado foi extraído de acordo com o método de Folch et al. 0,25 g de tecido do fígado foi misturado com 1 mL de água destilada, e homogeneizado com homogeneizador Politron (IKA-WERKE GmbH & Co. , Ultra-Turrax, Staufen, Alemanha). 0

homogenado foi misturado	com 5	mL	de	solução
clorofórmio:metanol (2:1,	em	volume),	e	centrifugado a
1.000 x g por 10 min.	para	separar	a	fase	inferior.
Novamente, o sobrenadante	foi misturado	com	2 mL	de solução
de clorofórmio:metanol	(2:1,	em volume)	, e	o mesmo

procedimento foi repetido para isolar o componente de lipídeo de tecido do fígado completamente. Três mL de solução de clorofórmio:metanol:CaCl₂ a 0,05% (3:48:47, em volume) foram adicionados à fase inferior resultante, e perfeitamente misturados por 1 min. A mistura foi centrifugada a 1.000 x g por 10 min. A fase inferior final foi completamente seco em gás nitrogênio, e o lipídeo seco foi dissolvido em 1 ml de metanol para usar a análise de componente de lipídeo. A concentração de triglicerídeo em

43/47 extratos de lipídeo de tecidos do fígado foi medida de acordo com o kit de medição comercialmente disponível (sistema Bio Clinicai) igual àquele usado em análise de plasma.

Na concentração de lipídeo de plasma de camundongo alimentado com a dieta descrita na Tabela 5 para 8 semanas, a concentração de colesterol total foi significativamente reduzida para 46% no grupo de teste alimentado com metil cedrila éter em comparação a HFD conforme mostrado na Tabela 7, e além do metil cedrila éter, a redução de concentração de colesterol total na ordem de in (-)-acedreno, cedrenol, acetato de cedrila, (+)-p-cedreno, metil cedrila cetona, epóxido de cedreno e (+)-cedrol em comparação ao controle foi significativamente medida a uma faixa de 29 a 43%.

A concentração de triglicerídeo de plasma foi significativamente reduzida para 50% no grupo de teste alimentado com (-)-α-cedreno em comparação a HFD e para 30% em grupo de teste alimentado com acetato de cedrila e metil cedrila cetona. Além disso, a concentração de triglicerídeo de plasma no grupo de teste alimentado com (+)-cedrol, (+)p-cedreno e epóxido de cedreno em comparação a HFD foi significativamente reduzida em uma faixa de 18 a 25%. Portanto, pode-se observar que os 8 compostos de sesquiterpeno descritos acima aliviam notavelmente a hiperlípidemia mostrada em obesidade induzível por HFD.

Além disso, a concentração de triglicerídeo de tecido do fígado foi significativamente reduzida para 64% e 63% em grupo de teste alimentado com (-)-α-cedreno e (+)-pcedreno, respectivamente, e todos os grupos de teste

44/47 alimentados com metil cedrila cetona, acetato de cedrila, metil cedrila éter, cedrenol e epóxido de cedreno foram significativamente reduzido a uma faixa de 37 a 56% em comparação a HFD. Portanto, poderia ser demonstrado que 7 compostos de sesquiterpeno exceto (+)-cedrol têm efeito plausível na melhora de fígado gordo mostrado em obesidade induzível por HFD.

Ê bem conhecido na técnica que a diabetes tipo II na qual a glicose de jejum é simultaneamente intensificada dependendo do aumento em concentração de insulina sanguínea foi acompanhada em modelo animal de obesidade dietética ou obesidade humana. Recentemente, o termo metaflamação surgiu em relação à resposta de inflamação gerada por suprimento excessivo de nutrientes ou metabólitos, a obesidade foi considerada como inflamação de baixo nível e crônica, as pesquisas sobre a relação entre a obesidade e o sistema imune foram intensivamente feitas. Em outras palavras, vêm surgindo recentemente algumas definições sobre o fato de que várias complicações de diabetes (por exemplo, diabetes tipo II, resistência à insulina, arterioesclerose, câncer e asma) foram geradas através de interações com sistema imune durante o desenvolvimento da obesidade. Por exemplo, pode-se sugerir que o TLR4 (receptor 4 do tipo Toll) associado resposta imune inata desempenhe um papel importante em resposta à inflamação e trajetória de resistência à insulina com o uso de ácido graxo dietético (particularmente, acido graxo saturado) como um ligante, e também está relacionada à regulação de ingestão de alimento no sistema nervoso central.

De acordo com os resultados neste experimento que

45/47 alimenta acetato de cedrila para camundongos alimentados com HFD por 8 semanas, a concentração de glicose e insulina sanguínea de jejum no grupo de teste em comparação a HFD foi significativamente reduzida para 54% e 49%, respectivamente. Além disso, o índice de resistência à insulina (IRI) em grupo de teste foi notavelmente reduzido para 73% em comparação a HFD. Toda a glicose de jejum (para nível de 29 a 46%), concentração de insulina sanguínea (para nível de 26 a 40%) e índice de resistência à insulina (para nível de 42 a 63%) em grupos de teste alimentados com metil cedrila éter, (-)-a-cedreno, (+)-β-cedreno, metil cedreno cetona, cedrenol e epóxido de cedreno foram notavelmente reduzidas em comparação àqueles no controle. Em grupo de teste alimentado com (+)-cedrol, toda a glicose de jejum, concentração de insulina sanguínea e índice de resistência à insulina foram propensos à diminuição em comparação ao controle, mas a significância estatística não foi mostrada. Portanto, espera-se que estes compostos de sesquiterpeno tenham um efeito no aprimoramento não somente de diabetes tipo II ou resistência à insulina, mas também respostas metabólicas à inflamação estreitamente associadas a isto.

TABELA 7. índice Bioquímico Associado à Obesidade de Sangue e Tecido de Camundongo Alimentado com os Compostos

de Sesquiterpeno.
Grupo	Plasma	Fígado
Colesterol Total (mmol/L)	Triglicerídeo (mmol/L)	Glicose (mmol/L)	Insulina (ng/mL)	IRI^a	Triglicerídeo (pmol/L)
Controle	3,71 ±	1,61 + 0,01	10,3 ±	0,96 ±	1,63	44,3 ± 2,33

	0,11		0,50	0,10	± 0,21
Acetato	2,53 ±	1,12 ± 0,06*	4,67 ±	0,49 ±	0,44	23,8 ± 2,33*
de	0,10*		0,40*	0,07*	±
cedrila					0,06*
Metil	2,01 ±	1,29 ± 0,13*	5,61 +	0,67 ±	0,61	24,4 ± 1,37*
cedrila	0,24*		0,53*	0,07*	±
éter					0,08*
(-)-a-	2,11 ±	0,81 ± 0,15*	6,41 ±	0,67 ±	0,75	16,1 ± 0,60*
cedreno	0,16*		0,57*	0,04*	±
					0,13*
(+)-p-	2,57 ±	1,32 ± 0,11*	6,80 +	0,70 +	0,78	16,6 + 1,28
cedreno	0,19*		0,41*	0,11*	+
					0,11*
Epóxido	2,81 ±	1,32 ± 0,08*	7,34 +	0,71 +	0,94	27,8 ± 2,41
de	0,18*		0,68*	0,04*	±
cedreno					0,14*
Metil	2,60 ±	1,12 + 0,11*	6,88 ±	0,65 +	0,78	19,5 ± 1,30*
cedril	0,31*		0,71*	0,06*	±
cetona					0,10*
Cedrenol	2,42 +	1,20 ± 0,10*	7,24 ±	0,58 ±	0,71	25,0 + 1,81*
	0,22*		0,56	0,07*	+
					0,09*
( + ) -	2,98 ±	1,31 ± 0,10*	9,8 ±	0,86 +	1,45	49,1 + 4,10*
cedrol	0,20*		0,99*	0,07*	±
					0,22*

* Significativamente diferente do valor para grupo HFD pelo Teste T do Estudante a P < 0,05.

^aIRI (índice de resistência à insulina) = IO'³ pmol de insulina x mmol glicose x L’².

47/47

Com a descrição de uma modalidade preferencial da presente invenção, deve ser entendido que variantes e modificações da mesma que se enquadram no espírito da invenção podem se tornar evidentes para aqueles elementos 5 versados nesta técnica, e o escopo desta invenção deve ser determinado pelas reivindicações em anexo e seus equivalentes.

Claims

1. Composição para prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes ou obesidade CARACTERIZADA pelo fato de compreender um derivado de sesquiterpeno selecionado do grupo que consiste em acetato de cedrila representado pela seguinte fórmula IV, α-cedreno representado pela seguinte fórmula V e β-cedreno representado pela seguinte fórmula VI como um ingrediente ativo:

*0-C--CH_a \h₃ (IV)

CHg (y) ^CH3 (VI)

Petição 870180169243, de 31/12/2018, pág. 7/17

2/3

2. Composição para prevenir ou tratar hiperlipidemia, fígado gordo, diabetes ou obesidade CARACTERIZADA pelo fato de compreender um derivado de sesquiterpeno selecionado do grupo que consiste em epóxido de cedreno representado pela seguinte fórmula IX, metil cedrila éter representado pela seguinte fórmula XI, metil cedrila cetona representado pela seguinte fórmula XIV e cedrenol representado pela seguinte fórmula XV como um ingrediente ativo: