BRPI0902520A2 - compostos pseudopeptìdicos inibidores da serino protease, composições inibidoras da serino protease e composições farmacêuticas contendo tais compostos - Google Patents
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Abstract
Compostos Pseudopeptidicos Inibidores da Serino Protease, Composições Inibidoras da Serino Protease e Composições Farmacêuticas Contendo Tais Compostos Resumo A presente invenção relata compostos pseudopeptídeos inibidores da serino protease que apresentam um cerne rígido derivado do D-manitol, isomanídeo, capaz de conferir rigidez ao inibidor, e que por sua natureza química também pode atuar em polimerases, como DNA ou RNA polimerases, inibindo-as. Esses compostos inibidores de serino proteases e polimerases são base de composições inibidoras da serino protease, bem como composições farmacêuticas destinadas à elaboração de potenciais medicamentos antivirais, contra vírus da família Flaviviridae sendo relacionada, principalmente, aos vírus da Hepatite C (HCV) e o vírus da Dengue.
Description
Compostos Pseudopeptídicos Inibidores da Serino Protease,Composições Inibidoras da Serino Protease e Composições
Farmacêuticas Contendo Tais Compostos
Campo da Invenção
A presente invenção se refere à pseudopeptídios ativos contra os vírusda família flaviviridae, desenhados como inibidores serino protease epotencialmente inibidores de polimerases caracterizados por possuir, na porçãocentral, uma estrutura do tipo 1,4:3,6-dianidromanitol. As porções laterais sãocaracterizadas por possuir ligações peptidomiméticas provenientes da aberturade diversas oxazolonas. Esses novos compostos ativos contra os vírus dafamília flaviviridae são a base para a preparação de composiçõesfarmacêuticas antivirais capazes de cessar, principalmente, a proliferação devírus do HCV e o vírus da dengue.
Antecedentes da Invenção
A família Flaviviridae compreende mais de 60 viroses, muita das quaissão patogênicas ao ser humano. Dentre estas viroses encontram-se aquelasrelacionadas ao vírus da Hepatite C (HCV), da Febre do Oeste do Nilo (ouFebre do Nilo Ocidental), da febre amarela e da Dengue. No caso das hepatitesvirais, são pelo menos sete os tipos de vírus que já foram caracterizados: A, B,C, D, E, G e TT, que têm em comum o hepatotropismo e podem levar ainflamação e necrose hepática. Hepatite é o termo genérico, com origem gregahepato- (fígado) e -/f/s (inflamação), que designa a inflamação do fígado. Ashepatites virais, particularmente, são causadas por diferentes agentesetiológicos, de distribuição global dentre eles o HCV (Craxi, A.; Laffi, G.;Zignego, A.L. Moi Aspects Med. 2008, 29, 85-95; Manns, M.P.; Foster, G.R.;Rockstroh, J.K.; Zeuzem, S.; Zoulim, F.; Houghton, M. Nat. Rev. Drug Discov.2007, 6, 991-1000).
Em termos estruturais o HCV é um vírus envelopado, possuindo umgenoma RNA, com aproximadamente 9.4Kb. O genoma possui uma únicajanela aberta de leitura que codifica três proteínas estruturais (cerne, E1, E2) esete proteínas não estruturais (p7, NS2 a NS5B). Duas regiões não traduzidas(UTR) presentes em cada extremidade do genoma são importantes para asetapas de tradução e transcrição do genoma RNA. Foi descrita uma grandevariedade na seqüência genômica do HCV. Os diferentes genótipos foramreunidos em seis grupos principais e vários subtipos. Há uma distribuiçãogeográfica diferenciada em relação aos diferentes genótipos. No Brasil, os maisfreqüentes são os genótipos 1, 2 e 3 com incidência de 70; 2,5 e 28 %,respectivamente.
O genoma viral codifica uma única poliproteína longa deaproximadamente 3000 aminoácidos. Esta poliproteína é processadasubseqüentemente por proteases codificadas pelo vírus e pelo hospedeiro,gerando 10 proteínas virais maduras. As proteínas de cápsula ("core") E1 e E2são estruturais e estão envolvidas com a montagem da partícula viral,enquanto as proteínas NS2 a NS5B são chamadas não-estruturais e estãoenvolvidas com a propagação do vírus. Estas proteínas não-estruturais incluema helicase vírus-específica NS3, a protease NS3-NS4A e a RNA polimeraseRNA-dependente NS5B (RdRp, ou replicase).
A atual terapia baseia-se no uso do interferon alfa combinado comribavirina. O tratamento apenas com o IFN-alfa apresenta apenas 10-19% deresposta sustentada. A Ribavirina é um análogo sintético da guanosina que temação direta contra vírus de RNA e DNA, por provável mecanismo de inibição daDNA polimerase vírus-dependente. A Ribavirina sozinha, no entanto, não temqualquer efeito sobre a hepatite C. A combinação do interferon-alfa com aRibavirina melhora a resposta virológica sustentada para 38-43%, comcorrespondente melhora na análise histológica (biópsia) e, possivelmente, nascomplicações em longo prazo da hepatite, contudo não há estudosprospectivos convincentes (Heathcote, E.J. J. Viral Hepat. 2007, 14, Suppl 1,82-8; Koike, K.J. Infect. Chemother. 2006, 12, 227-32; Toniutto, P.; Fabris, C.;Pirisi, M. Expert. Opin. Pharmacother. 2006, 7, 2025-35).
Mesmo com este arsenal terapêutico, a infecção pelo HCV éresponsável por mais de 80% dos transplantes de fígado no mundo, e noBrasil. (Consenso da Sociedade Paulista de Infectologia (SPI) para Manuseio eTerapia da Hepatite C, São Paulo, SP.) Diversos novos compostos têm sidoavaliados para o tratamento das infecções pelo HCV. Esses compostos seencontram em fases iniciais de avaliação, ou seja, estudos in vitro ou pré-clínicos em animais. Porém, a maioria desses compostos ainda não foianalisada em fases de triagem envolvendo seres humanos (estudos clínicos).De forma geral, apenas 1 em cada 1.000 novos compostos chega a seravaliado em etapas que envolvem seres humanos. Entre esses, somente 1 em5 recebe a aprovação pelo Food and Drug Administration, FDA, escritório dealimentos e medicamentos do governo dos Estados Unidos da América.
Vários esforços têm se concentrado na lista de tratamentos que tem semostrado promissores em estudos clínicos envolvendo seres humanos. ATabela 1 abaixo mostra alguns compostos com potencial de inibir a infecçãopelo HCV e as fases clínicas que se encontram,
Tabela 1 - Compostos com potencial de inibição da infecção pelo HCV e suasrespectivas fases clínicas. (Soriano, V.; Madejon, A.; Vispo, E.; Labarga1 P.;Garcia-Samaniego1 J.; Martin-Carbonero, L.; Sheldon, J.; Bottecchia1 M.; Tuma1P.; Barreiro, P. Expert. Op. Emerg. Drugs 2008, 73, 1-19).
<table>table see original document page 4</column></row><table> * Inibidores da RNA polimerase** Inibidores da protease
Os alvos da terapia anti-HCV estão concentrados nas diferentes etapasde replicação do RNA viral, e além desses as novas terapias estãodirecionadas nas etapas de tradução (ribozimas, oligos anti-senso, RNAi),processamento proteolítico (inibidores da protease viral) e de replicação dogenoma RNA (inibidores da RNA polimerase viral).
O Valopicitabine (Idenix Pharmaceuticals), já em fase avançada detestes clínicos, se caracteriza por ser um inibidor RNA-RNA polimerase viral, ea análise envolvendo 79 pacientes mostraram em duas semanas uma reduçãode 90% da carga viral, sendo que a maioria desses pacientes não respondia aotratamento com interferon. O Valopicitabine será empregado como um terceiromedicamento no tratamento, junto com o interferon e a Ribavirina, para seobter uma maior resposta terapêutica. Duas outras drogas, das quais umadeverá ser utilizada como terceira droga no tratamento são os inibidores deprotease: SCH-503034 (Schering-Plough) e o VX-950 (Vertex). Em estudorealizado pela Vertex em 34 voluntários com o VX-950, mostrou que após duassemanas de tratamento a diminuição da carga viral foi 250 vezes maior do queo Interferon Peguilado combinado a Ribavirina na redução da carga viral.
O HCV tem dois alvos potenciais para desenvolvimento de novas drogasantivirais. Um é a molécula de (NS5) RNA Polimerase RNA dependente queconsegue replicar uma molécula de RNA em outra. Esta é uma atividade únicados vírus de RNA, não se encontrando essa atividade nas células hospedeiras.Dessa forma a RNA Polimerase RNA dependente é um alvo muito específicopara o HCV. Além da replicase viral ainda temos a NS3 (serina protease) que éresponsável pelo processamento da poliproteína viral. Apesar de ser umaserina protease, a NS3 tem uma estrutura molecular muito diferente dasserinas proteases das células humanas, o que possibilita o desenvolvimento deinibidores específicos para esta protease.
O peso molecular do monômero da protease NS3 do HCV é de 70 kDa.Sua estrutura ativa é um dímero e a estrutura terciária do monômero tem umaextensão na porção N-terminal, 2 domínios com 6 "beta-barrels" (conjunto defitas beta-pregueadas) cada, assim como um domínio de troca e uma alfahélice. O sítio ativo da protease está localizado na porção N-terminal.Comparando a seqüência da NS3 de outros flavivírus podemos identificar trêsresíduos conservados (His-57, Asp-81, and Ser-139) que compõem o centrocatalítico desta protease. O centro ativo da protease NS3 contém um sítioestabilizador de um oxiânion tetraédrico, intermediário da reação,"oxyanion/stabilization loop", e uma fita E2 e precedida por uma fita E1. A NS3cliva a poliproteína viral entre os resíduos de aminoácidos Cys/Ser (nos sítios4B/5A e 5A/5B), Cys/Ala (no 4A/4B), ou Thr/Ser (no 3/4A).
A NS3 assume uma estrutura de dois conjuntos de fitas betapregueadas. O primeiro localizado na porção N-terminal contém as fitas A1, B1,C1, D1, E1, e F1. O segundo barril beta é composto pelas fitas A2, B2, C2, D2,E2, e F2.
Vários trabalhos têm sido relatados sobre inibidores de serina protease.
A determinação do modo como a serina protease atua para possibilitar ahidrólise de peptídeos é uma característica importante na pesquisa de eficazesinibidores enzimáticos.
Estudos recentes de nosso grupo mostraram a obtenção de novasséries de compostos pseudopeptídeos derivados do isomanídeo (Esteia MarisFreitas Muri1 Marlito Gomes Júnior, Jerônimo S. Costa, Marcelo Lima Bastos,Ricardo Hernandez-Valdes, Magaly Girão Albuquerque, E.F.F. da Cunha,Ricardo B. Alencastro, O.A.C. Antunes "Compostos inibidores de serinaprotease, processo de obtenção e uso para tratamento de flaviviroses" Pl0401908-3, 04/06/2004. RPI 1762 de 13/10/2004, RPI 1828 de 17/01/2006;Muri, E. M.F.; Gomes Jr., M.; Albuquerque, M.G.; Cunha, E.F.F.; Alencastro,R.B.; Williamson, J.S.; Antunes, O.A.C. Amino Acids 2005, 28, 413-419. Muri,E.M.F.; Gomes Jr., M.; Costa, J.S.; Alencar, F.L. Sales Jr., A.; Bastos, M.L.;Hernandez-Valdes, R.; Albuquerque, M.G.; Cunha, E.F.F.; Alencastro, R.B.;Williamson, J.S.; Antunes, O.A.C. Amino Acids 2004, 27, 153-157). Nessetrabalho foi realizado um estudo de modelagem molecular (docking) de umfragmento de MbBBI (um potente inibidor de NS3-pro) no sítio ativo da enzimaNS3 protease, validando, assim, o modelo proposto para o estudo com osnossos compostos sintetizados. O composto estruturalmente mais simples dasérie dos ésteres apresentou 3 ligações hidrogênio com a enzima. Uma ligaçãoentre o grupo NH da Gly133 e o átomo de oxigênio do anel biciclo corresponde aposição PV do nosso composto. As outras duas ligações correspondem àposição P1, ou seja, a Alanina do composto interagindo com a hidroxila daSer135 e com a Asn152 da enzima.
Recentemente, derivados hexapeptídicos contendo uma funçãoeletrofílica α-ceto-amida têm sido descritos como potentes inibidores da serinaprotease de HCV (Arasappan, A.; Njoroge, F.G.; Chan, T.-Y.; Bennett, F.;Bogen, S.L.; Chen, K.; Gu1 H.; Hong1 L.; Jao1 E.; Liu1 Y.-T.; Lovey, R.G.;Parekh, T.; Pike, R.E.; Pinto, P.; Santhanam, B.; Venkatraman, S.; Vaccaro, H.;Wang, H.; Yang, X.; Zhu, Z.; Mckittrick1 B.; Saksena, A.K.; Girijavallabhan, V.;Pichardo, J.; Butkiewicz1 N.; Ingram, N.; Malcolm, B.; Prongay, A.; Yao, N.;Marten, B.; Madison, V.; Kemp, S.; Levy, O.; Lim-Wilby, M.; Tamura, S.;Ganguly, A.K. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 4180-4184). Ainda dentro daclasse das α-ceto-amidas, o VX-950 e o SCH503034 (Bocepravir), jámencionados anteriormente, encontram-se em desenvolvimento clínico. O VX-950 foi capaz de reduzir a carga viral plasmática de pacientes dosados com750mg a cada 8h, e em alguns pacientes o vírus tornou-se indetectável após14 dias de dosagem (Chen, K.X.; Vibulbhan, B.; Yang, W.; Cheng, K-C.; Liu, R.;Pichardo, J.; Butkiewiez, N.; Njoroge, F.G. Bioorg. Med. Chem. 2008,doi:10.1016/j.bmc.2007.11.002. Perni, R.B.; Almquist, S.J.; Byrn, R.A.;Chandorkar, G.; Chaturvedi, P.R.; Courtney, L.F.; Decker, C.J.; Dinehart, K.;Gates, C.A.; Harbeson, S.L.; Heiser, A.; Kalkeri, G.; Kolaczkowski, E.; Lin, K.;Luong, Y-P.; Rao, B.G.; Taylor1 W.P.; Thomson, J.A.; Tung, R.D.; Wei, Y.;Kwong, A.D.; Lin, C. Antimicrob. Agents Chemother. 2006, 50, 899-909).
Sumário da Invenção
O primeiro objeto da presente invenção refere-se a compostospseudopeptídicos inibidores da serino protease e potencialmente inibidores deRNA e DNA polimerases de fórmula geral (I) e (II):O segundo objeto dessa invenção refere-se a uma composiçãoinibidora da serino protease contendo um composto inibidor da serino proteasede fórmula molecular (I):
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e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, para a produção de ummedicamento usados com inibidores da serino protease e potencialmenteempregado como inibidor da DNA e RNA polimerases, além de excipientesfarmaceuticamente aceitáveis.
O terceiro objeto dessa invenção trata-se de uma composiçãofarmacêutica contendo o composto de fórmula molecular (I):
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assim como seus e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, úteis naprodução de um medicamento usado no tratamento de doenças causadaspelos vírus da família Flaviviridae em mamíferos humanos e não humanos,além de excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
O quarto objeto dessa invenção trata-se de uma composição inibidora daserino protease contendo um composto de fórmula molecular (II):<formula>formula see original document page 9</formula>
assim como seus derivados e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis,usados para a produção de um medicamento usados como inibidores da serinoproteases e potencialmente inibidores da DNA e RNA polimerases, além deexcipientes farmaceuticamente aceitáveis.
O último objeto dessa invenção trata-se de uma composiçãofarmacêutica, contendo o dito composto de fórmula molecular (II),
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assim como seus derivados e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, alémde excipientes farmaceuticamente aceitáveis, voltados para a produção de ummedicamento usado no tratamento de doenças causadas pelos vírus dafamília Flaviviridae em mamíferos humanos e não humanos.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção refere-se aos compostos pseudopeptídicos defórmula geral (I) e (II), desenhados como inibidores da serina protease epotencialmente inibidores da polimerase.
Estes compostos pseudopeptídicos são potencialmente ativos em vírusda família flaviviridae, tais compostos são ativos na inibição da serino proteasee potencialmente inibidores de polimerases do HCV, do vírus da dengue dovírus da febre amarela, do vírus da febre do oeste e do vírus da febre do Nilo.
Os compostos peseudopeptídicos de fórmula geral (I) e (II) da presenteinvenção:
<formula>formula see original document page 10</formula>
Onde:
R1 Benzila, carboxibenzila, carboxi-t-butila, hidrogênio, alquila ou arila;
R2 fenila, p-fluorfenila, p-clorofenila, p-bromofenila, p-trifluormetilfenila, p-metoxifenila, 2-tienil, 3,4-metilenodioxifenil, 3-piridil, 3,4-dimetoxifenil, p-cianofenil, 2-naftil, 4-metilfenil; e,
R3 benzila, carboxibenzila, carboxi-t-butila, hidrogênio, aquila ou arila.
Preferencialmente,
R1 pode ser uma fenila ou metila;
R2 fenila p-substituídos ou heterocíclos; e,
R3 benzila (-Bn), carboxibenzila (-Cbz) ou carboxi-f-butila (-Boc); capazes deconferir rigidez ao inibidor de serino protease e que, por sua natureza, tambémpodem atuar em polimerases, como DNA ou RNA polimerases, inibindo-as.
A tabela 1 abaixo apresenta alguns dos compostos de fórmula geral (I) e(II) obtidos, mostrando os diferentes radicais R1 e R2 efetivamenteempregados em cada composto. Tais compostos serão melhor descritos eexemplificados posteriormente.
Composto R2
<table>table see original document page 10</column></row><table><formula>formula see original document page 11</formula><table>table see original document page 12</column></row><table>
Os ditos compostos de fórmula molecular (I) e (II) e/ou saisfarmaceuticamente, além de excipientes farmaceuticamente aceitáveis, sãousados em composições inibidoras da serino protease e potencialmenteinibidoras de polimerases, tais como DNA e RNA polimerases.
Tal composição farmacêutica apresenta uma concentração que varia nafaixa de 10μΜ a 150μΜ do dito composto de fórmula molecular I e/ou II, assimcomo seus derivados e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis.
Preferencialmente, a concentração dos compostos de fórmula geral (I) e(II) fica compreendida entre 15μΜ a 100μΜ.
Os compostos de fórmula molecular (I) e (II) e/ou seus saisfarmaceuticamente aceitáveis além de excipientes farmaceuticamenteaceitáveis, podem ainda serem empregados em composições farmacêuticaspara a preparação de medicamentos voltados para o tratamento de doençascausadas por vírus da família flaviviridae. Preferencialmente os falvivírus destainvenção são os vírus da hepatite C, o vírus da dengue, o vírus da febreamarela, o vírus da febre do oeste e o vírus da febre do Nilo.
Tal composição farmacêutica apresenta uma concentração que varia nafaixa de 10μΜ a 150μΜ do dito composto de fórmula molecular I e/ou II, assimcomo seus derivados e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis.
Preferencialmente, a concentração dos compostos de fórmula geral (I) e(II) fica compreendida entre 15μΜ a 100μΜ.
Para fins dessa invenção os excipientes são todos aqueles compostosquímicos que tem como objetivo dar forma, volume, estabilidade a composiçãofarmacêutica. Todos os excipientes que aqui serão usados são aqueles dasindústrias farmacêuticas tais como: adjuvantes, edulcorantes, solventes,estabilizantes, antioxidantes, conservantes, tampões, flavorizantes,tensoativos, umectantes, lubrificantes, dispersantes e todos aquelesconhecidos por um técnico na área.
Os tais excipientes podem ser empregados em diferentes formasfarmacêuticas, tais como pós, comprimidos, cápsulas, nanocápsulas,nanoesferas, cristais, ampolas, soluções orais, adesivos transdérmicos,soluções injetáveis musculares ou parenterais, pomadas, cremes, géis,suspensões, emulsões, aerossóis, tinturas, elixires, pastas, pastilhas,supositórios, ungüentos, óvulos, e todas aquelas conhecidas por um técnico daarte.
Tal composição farmacêutica que contem os compostos (I) e/ou (II),assim como seus derivados e sais farmaceuticamente aceitáveis, é empregadapara a produção de um medicamento no tratamento de doenças causadaspelos vírus da família Flaviviridae, compreendendo os vírus dessa família osvírus da hepatite C, da dengue, da febre amarela, da febre do oeste ou febredo Nilo, sendo preferencialmente empregado no tratamento de doençasprovocadas pelo vírus da dengue e da hepatite C. No caso da hepatite C estãocompreendidos os seguintes vírus A, B, C, D, E, G e TT.
Os compostos de fórmula geral (I) foram produzidos a partir doisomanídeo como análogos dos previamente publicados pelo grupo, com aanalogia adicional a pró-nucleosídios, isto é, compostos capazes de inibirpolimerases. Sua analogia estrutural com dipeptídeos rígidos cíclicos o faz umexcelente chassi, cerne rígido, "scaffold". (Bencsik, J.R.; Kercher, T.;0'Sullivan, M.; Josey, J.A. Org Lett. 2003, 5, 2727-2730. Dietrich, E.; Lubell1W.D. J. Org. Chem. 2003, 68, 6988-6996. Além disto, pelo fato de apresentarum eixo C2 de simetria, pode ser homologado, em duas ou em uma posição,mantendo ou não o eixo de simetria, via reação com diferentes amino ácidos ediidroamino ácidos, por exemplo, via acoplamento direto catalisado por EDC,HOBt, e amino ácidos ou via abertura de azalactonas (síntese em paralelo,química combinatória).
A partir dos dados obtidos anteriormente passou-se, então, a etapa desíntese dos inibidores da serina protease previstos.
A primeira etapa na obtenção dos derivados de fórmula geral I consistiuna conversão do isomanídeo (1) no derivado di-tosilado (2) por reação comcloreto de p-toluenosulfonila em piridina por 12h a temperatura ambiente. Otratamento do di-tosilado (2) com azida de sódio em [bmim]BF4 a 120°C por12h forneceu a di-azida (3), com inversão de configuração. Redução da di-azida (3) com paládio sobre carbono em etanol por 12h utilizando uma pressãode 40psi resultou na di-amina (4), que foi o substrato para a formação de novasamidas simétricas derivadas do isomanideo (28-45) (Esquema 1) (Archibald,T.G.; Baum, K. Synth. Comm. 1989, 19, 1493-1498. Hockett1 R.C.; FIetcherJr.,H.G.; Sheffield, E.L.; Goepp Jr., R.M.; Soltzberg. J. Chem. Soe. 1946, 68, 930-935. Kuszmann, J.; Medgyes, G. Carbohyd. Res. 1980, 85, 259-269).
Esquema 1. Síntese dos compostos intermediários para a obtenção da di-amina (4).
<formula>formula see original document page 14</formula>
Diferentes solventes podem ser usados na etapa de substituiçãonucleofílica, tais como, DMF e DMSO. Porém, o [bmim]BF4, líquido iônico,apresenta muitas vantagens em relação aos solventes orgânicosconvencionais, além de ter apresentado um melhor rendimento reacional. Oslíquidos iônicos não possuem pressão de vapor mensurável à temperaturaambiente, e mesmo a temperaturas bastante elevadas degradam apenasacima de 400°C, podendo ser usados em vácuo sem que haja perda desolvente. Devido a esses fatores, além da possibilidade de sua reutilização, oslíquidos iônicos são, hoje em dia, muito empregados no conceito de QuímicaVerde (Andrade, C.K.Z.; Takada, S.C.S.; Alves, L.M.; Rodrigues, J.P.; Suarez,P.A.Z.; Brandão, R.F.; Soares, V.C.D. Synlett 2004, 12, 2135-2138. Lancaster,N.L.; Salter, P.A.; Welton, T.; Young, G.B. J. Org. Chem 2002, 67, 8855-8861).
O líquido iônico, [bmim]BF4 (7) foi sintetizado a partir do N-metil imidazol(5). Este reagiu com o 1-bromobutano formando o derivado (6) que, por trocaiônica com NaBF4, originou (7). O líquido iônico foi purificado por colunacromatográfica em sílica gel tendo como eluente o diclorometano, sendo obtidoem 83% de rendimento como mostrado no esquema 2 (Lancaster, N.L.; Salter,P.A.; Welton, T.; Young, G.B. J. Org. Chem 2002, 67, 8855-61).
Esquema 2. Síntese do liquido iônico [Bmim]+[BF4]"
<formula>formula see original document page 15</formula>
A etapa seguinte consistiu na obtenção das oxazolonas (ou azalactonas)(10-27) a partir da glicina (8) comercialmente disponível. Para a obtenção docomposto (9a), reagiu-se a glicina (8) com cloreto de benzoíla em soluçãoaquosa de NaOH. O produto suficientemente puro foi obtido em 95% derendimento. A /V-acetilglicina (9b) foi obtida pela reação de (8) com anidridoacético em meio aquoso sob refluxo, sendo obtida em 77% de rendimento apósprecipitação e filtração, como observado no esquema 3 (Mesaik, A.M.; Rahat,S.; Khan, K.M.; Zia-Ullah.; Choudhary, M.I.; Murad, S.; Ismail, Z.; Atta-ur-Rahman and Ahmad, A. Bioorg. Med. Chem. 2004, 12, 2049-2057).
Esquema 3. Síntese dos derivados acilglicina (9a) e (9b)<formula>formula see original document page 16</formula>
Os derivados (9a) e (9b) foram aquecidos com vários aldeídosaromáticos na presença de anidrido acético e acetato de sódio, gerando asoxazolonas (ou azalactonas) (10-27) exclusivamente em Ζ, o isômerotermodinamicamente mais estável (Esquema 4). A Tabela 2 apresenta osrespectivos rendimentos, pontos de fusão e substituintes das oxazolonas(Jendralla, H.; Seuring1 B.; Herchen, J.; Kulitzscher, B.; Wunner, J.; Stiiber, W.;Koschinsky, R. Tetrahedron 1995, 51, 12047-12068. Bautista, F.M.; Campeio,J.M.; Garcia, A.; Luna1 D.; Marinas, J.M.; Romero1 A.A. J. Chem. Soe. PerkinTrans. 2002, 2, 227-234. Meiwes, J.; Schudok, M.; Kretzschmar, G.Tetrahedron: Asymmetry, 1997, 8, 527-536. Lisichkina, L.N.; Ushakova, O.M.;Alekseeva, M.O.; Peregudov, A.S.; Belikov, V.M. Russ. Chem. Buli. 1999, 48,1682-1684. Wong1 H.N.C.; Xu, Z.L.; Chang, H.M.; Lee, C.M. Synthesis, 1992,793-797. Hoshina, H.; Kubo1 K.; Morita1 A.; Sakurai1 T. Tetrahedron, 2000, 56,2941-2951. Slater, G.; Someville, A.W. Tetrahedron, 1966, 22, 35-42. Paul1 S.;Nanda1 P.; Gupta1 R.; Loupy1 A. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 425-427. Kitazawa1M.; Higuchi1 R.; Takahashi1 M. J. Phys. Chem. 1995, 99, 14784-14792.
Esquema 4. Síntese das oxazolonas<formula>formula see original document page 17</formula>
Tabela 2. Substituintes e pontos de fusão das oxazolonas
<table>table see original document page 17</column></row><table><formula>formula see original document page 18</formula>
A última etapa consistiu em uma reação de abertura de anel dasoxazolonas substituídas (10-27) com a di-amina (4). A reação foi realizada comacetato de etila em refluxo. Após o tempo necessário de cada reação, esta foiresfriada a temperatura ambiente e o produto precipitado foi filtrado e seco(Esquema 5)( Girgis1 A.S.; Ellithey, M. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 8527-8532. Chebanov, V.A.; Desenko, S.M.; Kuzmenko, S.A.; Borovskoy,V.A.; Musatov, V.I.; Sadchikova, Y.V. Russ. Chem. Bul.: Int. Ed., 2004, 53,2845-2849.
Esquema 5. Síntese dos derivados pseudopeptídicos<formula>formula see original document page 19</formula>
A síntese dos inibidores da serina protease previstos pela fórmula geralII iniciou-se pela monotosilação do isomanideo (1) com cloreto de p-toluenosulfonila e piridina por 12h resultando no composto monotosilado (46).O grupamento hidroxila de (46) foi protegido com cloreto de benzila em meiobásico obtendo-se o derivado (47). Uma reação de substituição nucleofílica dogrupo tosil pela azida em líquido iônico resultou na formação do composto (48),o qual foi reduzido por hidrogenação catalítica usando Pd/C em etanol a 40psiformando a amina O-benzilada (49) como mostrado no esquema 6 ( Kumar, S.;Ramachandran, U. Tetrahedron, 2005, 6, 4141-4148. Loupy, A.; Monteux, D.Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7023-7026. Chiappe, C.; Pieraccini, D.; Saullo, P. J.Org. Chem. 2003, 68, 6710-6715. Tamion, R.; Marsais, F.; Jubereau, P.;Queguiner, G. Tetrahedron: Asymmetry, 1993, 4, 1879-1890).
Esquema 6. Síntese dos intermediários para obtenção da amina O-benzilada
<formula>formula see original document page 19</formula>
A última etapa consistiu na reação da amina O-benzilada (49) com asoxazolonas (10-18) em refluxo com acetato de etila resultando na formação doscompostos peptidomiméticos (50-58) como mostrado no esquema 7.
Esquema 7. Síntese dos compostos (50-58)<formula>formula see original document page 20</formula>
Além disso, a di-amina (4) é capaz de reagir com qualquer aminoácido(D- ou L-), di- ou tripeptídio, contendo grupos de proteção N-BOC, N-Bn ou N-CBZ, e carboxilas livres, via acoplamento catalisado por EDC e HOBt1 de modoa fornecer os pseudopeptídios correspondentes.
A presente invenção será descrita detalhadamente através dosexemplos apresentados abaixo. É necessário frisar que a invenção não estálimitada a esses exemplos e inclui variações e modificações dentro dos limitesnos quais ela se aplica,
Exemplo 1: Obtenção do 1.4:3.6-Dianidro-2.5-di-0-p-tosil-D-manitol.
A uma solução de isomanideo (13mmol, 2g) e piridina (54mmol, 4,43ml_)em CH2CI2 (6mL) foi adicionado TsCI (41mmol, 7,85g) à 0°C. A misturareacional foi agitada por 12h à temperatura ambiente. Após este tempo, foiadicionado CH2CI2 (200mL) e em seguida, a fase orgânica foi lavada comsolução de HCI 1N (160mL), água (120mL) e solução saturada de NaCI. Apóssecagem com Na2S04 e evaporado o solvente, o resíduo foi purificado porsucessivas recristalizações com metanol ou por coluna cromatográfica emsílica gel, usando uma mistura de hexano e acetato de etila, obtendo o produtocomo um sólido branco em 92% de rendimento; PF: 94°C, aD20 = +96 (c, 0,1)DIVISO.
Exemplo 2: Obtenção do 1,4:3,6-Dianidro-2.5-diazido-2.5-dideoxi-L-iditiol.
O composto di-tosilado (2) (7,7mmol, 3,5g) foi dissolvido no líquidoiônico [Bmim]+BF4" (46mmol, 9,3mL) e em seguida, foi adicionado a NaN3(30mmol, 2g). A mistura ficou agitando a 120°C por 12h. Ao final da reação, obalão foi resfriado à temperatura ambiente, éter etílico foi adicionado e asolução foi lavada com água, seca com Na2SO4. Evaporado o solvente, oproduto pode ser purificado por coluna cromatográfica em sílica gel, usandouma mistura de hexano e acetato de etila, obtendo o produto como um óleoamarelo claro em 78% de rendimento.
Exemplo 3: Obtenção do 1,4:3.6-Dianidro-2,5-diamino-2.5-dideoxi-L-iditiol.
A uma mistura de di-azida (3) (1mmol, 0.25g) em etanol (10mL) foiadicionado 10% de Pd/C 10% (0,127mmol, 0,140g). A mesma foi hidrogenadaa 40 psi por 12h. Após esse tempo a mistura foi filtrada em XAD-4 (amberliteneutro), lavada com etanol e o solvente foi evaporado, obtendo um produtooleoso em rendimento quantitativo.
Exemplo 4: Obtenção do Líquido lônico [Bmim]+BF4" (composto 5).
A uma solução de N-metil imidazol (200mmol, 16mL) em tolueno (25mL),a 0°C, foi adicionado 1-Bromobutano (230mmol, 25mL) lentamente e comagitação. A mistura foi deixada em refluxo (110°C) por 36 h. Foram formadasduas fases: a mais densa (viscosa) e a mais leve. Elas foram separadas. Afase viscosa foi lavada com éter etílico (3 χ 50mL) e acetato de etila (3x50mL).Logo após, foi adicionado CH2Cfe (150mL) e NaBF4 (164mmol, 18g). A misturaficou agitando por 24h à temperatura ambiente. Após este tempo, a mistura foifiltrada 2 vezes, adicionado o carvão ativo e deixada por mais 24h sobagitação. Ao final, a mistura foi filtrada, evaporada e por fim filtrada em aluminaneutra lavando bem com CH2Cl2. O produto foi obtido como um óleo amareloclaro em 83% de rendimento.
Exemplo 5: Obtenção da AZ-Benzoilglicina.
A glicina (8) (133mmol, 10g) foi dissolvida em uma solução de NaOH10% (100mL) e, em seguida, cloreto de benzoíla (186mmol, 21,6mL) foiadicionado lentamente com uma agitação vigorosa. Depois foi adicionado gelopicado HCI concentrado, gota-a-gota, até a mistura ser acidificada (pH 2-3). Amistura foi filtrada em funil de Büchner e o precipitado lavado com água gelada.O produto foi obtido como um sólido branco em 95% de rendimento. PF: 197°C.
Exemplo 6: Obtenção da AZ-Acetilglicina.
A uma solução de glicina (8) (66mmol, 5g) em água (40mL), anidridoacético foi adicionado (140mmol, 26mL). A mistura foi agitada vigorosamentedurante 1h sob refluxo brando. Ao final desse tempo, a reação foi resfriada àtemperatura ambiente e deixada durante a noite em geladeira. No dia seguinte,o produto foi filtrado em funil de Büchner e lavado com água gelada. A águamãe foi concentrada e filtrada novamente, obtendo (9b) como um sólido brancoem 77% de rendimento. PF: 205°C.
Processo geral para obtenção das oxazolonas (10-19).
Uma mistura de /V-benzoilglicina (9a) (20mmol), o respectivo aldeído(18mmol) e anidrido acético (58mmol) foram aquecidos sob agitação até adissolução dos reagentes e, logo após, foi adicionado acetato de sódio anidro(8mmol). Ao adicionar o acetato de sódio, formou-se uma mistura pastosa àqual foi necessária nova adição de anidrido acético (58mmol). A misturapermaneceu a 60°C por 3h, depois foi resfriada a temperatura ambiente e águafoi adicionada. O precipitado formado foi filtrado em funil de Büchner e lavadocom muita água gelada. Em seguida o produto foi recristalizado com o solventeadequado.
Exemplo 7: 2-Fenil-4-(Z)-benzilideno-4.5-diidro-1,3-oxazol-5-ona (10).PF: 169-170°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 8: 2-Fenil-4-(Z)-4-fluorobenzilideno-4,5-diidro-1,3-oxazol-5-ona (11)PF: 186°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 9: 2-Fenil-4-(Z)-4-clorobenzilideno-4.5-diidro-1.3-oxazol-5-ona (12)PF: 199-200°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 10: 2-Fenil-4-fZ)-4-bromobenzilideno-4,5-diidro-1,3-oxazol-5-ona (13)PF: 207-208°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 11: 2-Fenil-4-(Z)-4-trifluorometilbenzilideno-4.5-diidro-1.3-oxazol-5-ona (14)
PF: 174-175°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 12: 2-Fenil-4-(Z)-4-metoxibenzilideno-4,5-diidro-1.3-oxazol-5-ona (15)PF: 162°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 13: 2-Fenil-4-(Z)-(2-tiofenil)metilideno-4,5-diidro-1,3-oxazol-5-ona (16)PF: 176-178°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 14: 2-Fenil-4-(Z)-piperonilmetilideno-4.5-diidro-1.3-oxazol-5-ona (17)PF: 200°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 15: 2-Fenil-4-(Z)-(3-piridil)metilideno-4.5-diidro-1,3-oxazol-5-ona (18)PF: 149-1510C. Aspecto: sólido bege.Exemplo 16: 2-Fenil-4-(Z)-3,4-dimetoxibenzilideno-4,5-diidro-1,3-oxazol-5-ona(19)
PF: 155-156°C. Aspecto: sólido amarelo.
Processo geral para obtenção das oxazolonas
Uma mistura de /V-acetilglicina (9b) (20mmol, 2,34g), acetato de sódioanidro (15mmol, 1,2g), anidrido acético (64mmol, 6mL) e o respectivo aldeído(30mmol) foi ligeiramente aquecida até a completa solubilização, quando entãofoi agitada sob refluxo brando por 2h. A solução foi resfriada até atingir atemperatura ambiente e posta na geladeira. Após uma noite, o produto foifiltrado em funil de Büchner, lavado com muita água gelada e em seguidarecristalizado com o solvente adequado.
Exemplo 17: 2-Metil-4-(Z)-benzilideno-4,5-diidro-1,3-oxazol-5-ona (20)PF: 158°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 18: 2-Metil-4-(Z)-4-clorobenzilideno-4.5-diidro-1.3-oxazol-5-ona (21)PF: 149°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 19: 2-Metil-4-(Z)-4-bromobenzilideno-4,5-diidro-1.3-oxazol-5-ona (22)PF: 135°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 20: 2-Metil-4-(Z)-4-trifluorometilbenzilideno-4.5-diidro-1.3-oxazol-5-ona (23)
PF: 119°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 21: 2-Metil-4-(Z)-piperonilmetilideno-4.5-diidro-1,3-oxazol-5-ona (24)PF: 191 °C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 22: 2-Metil-4-(Z)-4-cianobenzilideno-4.5-diidro-1.3-oxazol-5-ona (25)PF: 191-192°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 23: 2-Metil-4-(Z)-2-naftilmetilideno-4.5-diidro-1.3-oxazol-5-ona (26)PF: 225°C. Aspecto: sólido amarelo.
Exemplo 24: 2-Metil-4-(Z)-4-metilbenzilideno-4.5-diidro-1,3-oxazol-5-ona (27)PF: 136°C. Aspecto: sólido laranja.
Processo geral de obtenção dos compostos
A uma solução da di-amina (1mmol, 0,2g) em acetato de etila (25mL), foiadicionada a respectiva oxazolona (10-27) (3mmol). Em geral, a mistura setorna homogênea com aquecimento. A reação foi mantida sob refluxo por 24h.Após ter sido resfriada a temperatura ambiente, houve formação deprecipitado, o qual foi filtrado e lavado com acetato de etila.
Exemplo 25: 1.4:3,6-Dianidro-2,5-dif2-benzamido-(Z)-cinamamido1-2.5-dideoxi-L-iditiol (28)
PF: 169°C. aD20 = + 72 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento: 40%.HRMS calculada para C38H34N4O6, 642,2478; encontrada [M+1]+ 643,3465.Exemplo 26: 1.4:3,6-Dianidro-2.5-dif2-benzamido-(Z)-4-fluorocinamamido1-2.5-dideoxi-L-iditiol (29)
PF: 152-153°C. aD20= + 65 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:37%. HRMS calculada para C38H32F2N4O6, 678,229; encontrada [M+1]+679,3388.
Exemplo 27: 1,4:3,6-Dianidro-2.5-dif2-benzamido-(Z)-4-clorocinamamido1-2.5-dideoxi-L-iditiol (30)
PF: 166-169°C. aD20= + 89 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:35%. HRMS calculada para C38H32CI2N4O6, 710,1699; encontrada [M+1]+711,2859.
Exemplo 28: 1.4:3.6-Dianidro-2,5-dif2-benzamido-(Z)-4-bromocinamamido1-2.5-dideoxi-L-iditiol (31)
PF: 172-174°C. aD20 = + 80 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:40%. HRMS calculada para C38H32Br2N4O6, 798,0689; encontrada [M+1]+801,1971.
Exemplo 29: 1.4:3.6-Dianidro-2.5-dif2-benzamido-(Z)-4-trifluorometilcinamamido1-2.5-dideoxi-L-iditiol (32)
RMN 1H δ ppm (DMSO, 300 MHz): 9,99 (s, 2H); 8,54 (d, 2H. J = 6,6 Hz); 7,97(d, 4H, J = 7,2 Hz); 7,77-7,60 (m, 8H); 7,63-7,56 (m, 2H); 7,50-7,47 (m,4H);7,09 (s, 2H); 4,62 (s, 2H); 4,29-4,21 (m, 2H); 4,02-3,96 (m, 2H); 3,75 (dd, 2H, J= 9,3 Hz, J = 3,0 Hz).
RMN 13C δ ppm (DMSO, 75,4 MHz): 165,7 (-C=O); 165,0 (-C=O); 138,5 (-C);133,3 (-C); 132,3 (-C); 131,6 (-CH); 129,6 (-CH); 128,2 (-CH); 127,7 (-CH);125,7 (-CH); 125,1 (-CH); 112,6 (-C); 110,2 (-C); 86,4 (-CH); 71,1 (-CH2); 56,5 (-C). IV κ cm"1(KBr): 3274, 3065, 1646, 1580, 1519, 1477, 1324, 1281, 1168,1126, 1069, 830, 708.PF: 164-166°C. aD20= + 53 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:40%. HRMS calculada para C40HaaF6N4O6, 778,2226; encontrada [M+1]+779,3478.
Exemplo 30: 1,4:3,6-Dianidro-2,5-dif2-benzamido-(Z)-4-metoxicinamamido1-2,5-dideoxi-L-iditiol (33)
RMN 1H δ ppm (DMSO, 300 MHz): 9,80 (s, 2H); 8,27 (d, 2H, J = 7,2 Hz); 7,99(d, 4H, J = 6,9 Hz); 7,65-7,40(m, 10H); 7,12 (s, 2H); 6,91 (d, 4H, J = 8,7 Hz);4,57 (s, 2H); 4,30-4,20 (m, 2H); 3,96 (dd, 2H, J = 9,3/5,7 Hz); 3,73 (s, 6H, -CH3); 3,80-3,60 (m, 2H).
RMN 13C δ ppm (DMSO, 75,4 MHz): 165,9 (-C); 165,7 (-C); 159,7 (-C); 133,8 (-C); 131,7 (-CH); 131,2 (-CH); 128,9 (-CH); 128,4 (-CH); 128,0 (-C); 127,9 (-CH);126,7 (-C); 114,1 (-CH); 86,8 (-CH); 71,4 (-CH2); 56,7 (-CH); 55,3 (-CH3).IV ν cm"1 (KBr): 3274, 3061, 2962, 2838, 1650, 1604, 1578, 1512, 1477, 1300,1255, 1177,; 1080, 1028, 829, 707.
PF: 167 -168°C. aD20= + 86 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:46%. HRMS calculada para C40H38N4O8, 702,269; encontrada [M+1]+ 703,3768.
Exemplo 31: 1.4:3.6-Dianidro-2.5-dif2-benzamido-(Z)-2-tiofenilcinamamido1-2.5-dideoxi-L-iditiol (34)
PF: 183-185°C. Aspecto: sólido bege. Rendimento: 40%.
Exemplo 32: 1.4:3,6-Dianidro-2,5-dif2-benzamido-(Z)-3.4-metilenodioxicinamamido1-2.5-dideoxi-L-iditiol (35)
PF: 246-247°C. aD20= + 77 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:70%. HRMS calculada para C40H34N4Oi0, 730,2275; encontrada [M+1]+731,3270.
Exemplo 33: 1.4:3,6-Dianidro-2.5-dir2-benzamido-(Z)-3-piridilcinamamido1-2.5-dideoxi-L-iditiol (36)
PF: 167°C. Aspecto: sólido bege. Rendimento: 45%.
Exemplo 34: 1.4:3,6-Dianidro-2.5-dif2-benzamido-(Z)-3.4-dimetoxicinamamido1-2,5-dideoxi-L-iditiol (37)
PF: 159-160°C. aD20= + 72 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:55%. HRMS calculada para C42H42N4Oi0, 762,2901; encontrada [M+1f763,4067.Exemplo 35: 1 ^:3.6-Dianidro-2,5-dif2-acetamido-(Z)-cinamamido1-2,5-dideoxi-L-iditiol (38)
RMN 1H δ ppm (DMSO, 300 MHz): 9,41 (s, 2H); 8,25 (d, 2H, J = 6,9 Hz); 7,53(d, 4H, J = 7,2 Hz); 7,42-7,20 (m, 6H); 6,88 (s, 2H); 4,57 (s, 2H); 4,23-4,16 (m,2H); 3,96 (dd, 2H, J = 9,3 Hz, J = 5,4 Hz); 3,71 (dd, 2H, J = 9,3 Hz, J = 3,6 Hz);1,98 (s, 6H).
RMN 13C δ ppm (DMSO, 75,4 MHz): 169,2 (-C); 165,3 (-C); 134,1 (-C); 130,1 (-C); 129,2 (-CH); 128,4 (-CH); 128,3 (-CH); 126,5 (-CH); 86,5 (-CH); 71,2 (-CH2);56,4 (-CH); 22,7 (-CH3).
IV VcnT1(KBr): 3480, 3258, 3056, 2975, 2870, 1651, 1537, 1489, 1446, 1373,1287, 1208, 1088, 1042, 932.
PF: 191-192°C. aD20= + 71 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:95%. HRMS calculada para C28H3IN4O6,519,2244; encontrada 519,2244.
Exemplo 36: 1.4:3.6-Dianidro-2,5-dir2-acetamido-(Z)-4-clorocinamamido1-2.5-dideoxi-L-iditiol (39)
PF: 168-170°C. aD20 = + 85 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:96%. HRMS calculada para C28H28N4O6NaCI2, 609,1284; encontrada 609,1282.
Exemplo 37: 1.4:3.6-Dianidro-2.5-dir2-acetamido-(Z)-4-bromocinamamido1-2,5-dideoxi-L-iditiol (40)
PF: 175°C. aD20= + 81 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento: 58%.HRMS calculada para C28H28N4O6NaBr2, 697,0273; encontrada 697,0306.
Exemplo 38: 1.4:3,6-Dianidro-2.5-dif2-acetamido-(Z)-4-trifluorometilcinamamido1-2,5-dideoxi-L-iditiol (41)
PF: 209-210°C. aD20= + 51 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:50%. HRMS calculada para C30H28N4O6NaF6, 677,1811; encontrada 677,1792.
Exemplo 39: 1.4:3,6-Dianidro-2.5-dif2-acetamido-(Z)-3.4-metilenodioxicinamamidol^.S-dideoxi-L-iditiol (42)
PF: 170-173°C. aD20= + 37 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:70%. HRMS calculada para C30H3oN4Oio, 606,1962; encontrada [M+1f607,2885.
Exemplo 40: 1.4:3.6-Dianidro-2.5-di[2-acetamido-(Z)-4-cianocinamamido1-2,5-dideoxi-L-iditiol (43)PF: 204-206°C. aD20= + 106 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:56%. HRMS calculada para C3OH2SN6O6Na1 591,1968; encontrada 591,1971.
Exemplo 41: 1 AS.e-Dianidro^.S-dire-acetamido-fZ^-naftalenacrilamidol^.S-dideoxi-L-iditiol (44)
RMN 1H δ ppm (DMSO, 300 MHz): 9,38 (s, 2H); 8,03 (s, 2H); 7,92-7,84 (m,8H); 7,77 (d, 2H, J= 8,1 Hz); 7,55-7,49 (m, 4H); 7,32 (s, 2H); 4,44 (s, 2H); 3,80(dd, 2H, J = 9,0Hz, J = 4,8 Hz); 3,60 (dd, 2H, J = 9,0 Hz, J = 4,8 Hz); 3,42 (dd,2H, J = 4,8 Hz1 J = 2,7 Hz); 2,01 (s, 6H).
RMN 13C δ ppm (DMSO, 75,4 MHz): 167,4(-C); 167,2 (-C); 132,6 (-C); 132,5 (-C); 132,4 (-C); 131,2 (-C); 129,0 (-CH); 128,0 (-CH); 127,3 (-CH); 127,2 (-CH);126,4 (-CH); 126,1 (-CH); 86,8 (-CH); 72,5 (-CH2); 56,6 (-C); 22,8 (-CH3).
IV ν cm"1 (KBr): 3253, 3054, 2982, 2890, 1650, 2153, 1660, 1634, 1525, 1380,1322, 1275, 1149, 1050, 1015, 811, 746, 716.
PF: 191-193°C. aD20= + 10 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:86%.
Exemplo 42: 1.4:3.6-Dianidro-2.5-dif2-acetamido-(Z)-4-metilcinamamido1-2,5-dideoxi-L-iditiol (45)
PF: 174-175°C. aD20 = + 83 (c, 0,1) DMSO. Aspecto: sólido bege. Rendimento:52%. HRMS calculada para C30H34N4O6Na, 569,2376; encontrada 569,2361.
Exemplo 43: Obtenção do 1,4:3.6-dianidro-mono(4-metillbenzenosulfonato)-D-manitol (46)
A uma solução do isomanideo (1g, 6mmol) e piridina (1,1 OmL) emCH2CI2 (10mL) foi adicionado cloreto de p-toluenosulfonila (1,49g, 7mmol) aO0C. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 12h e após foi diluídacom CH2CI2 (20mL). A solução foi lavada com água, HC11N e solução saturadade cloreto de sódio. Após evaporação do solvente, o sólido foi recristalizadocom uma mistura de metanol/isopropanol fornecendo o produto como um sólidobranco em 40% de rendimento. PF: 103-104°C.
Exemplo 44: Obtenção do 1,4:3.6-dianidro-5-Q-(benzil)-2-(4-metilbenzenosulfonato)-D-manitol (47)
A uma solução de (46) (1 Og1 33mmol), solução aquosa de KOH 50% eTBAB (0,322g, 1mmol) em CH2CI2 (80mL), foi adicionado cloreto de benzila(6,54g, 38mmol). Após agitação por 12h, a mistura foi diluída com água (10mL)e a fase orgânica foi separada. A fase aquosa foi extraída com CH2Cb e secacom Na2SCV O produto foi purificado por coluna cromatográfica em sílica geltendo como eluente uma mistura de hexano e acetato de etila, fornecendo oproduto como um óleo incolor em 75% de rendimento.
Exemplo 45: Obtenção do 1,4:3,6-dianidro-2-azido-2-deoxi-5-Q-(benzil)-D-Glucitol (48)
Uma mistura de (47) (1,86g, 4mmol), [bmim]+[BF4]' previamente seco sobvácuo a 90°C (4,8mL, 23mmol) e NaN3 (0,93g, 14mmol) foi aquecida a 120°Cpor 12h. Adicionou-se água e a fase aquosa foi extraída com éter etílico. Oproduto foi purificado por coluna cromatográfica flash (hexano/acetato de etila),obtendo um óleo amarelo claro em 73% de rendimento.
HRMS calculada para Ci3Hi5N3O3Na1 284,1011; encontrada, 284,1025.oco20 = +92 (c, 0.1) DMSO.
Exemplo 46: Obtenção do 1.4:3.6-dianidro-2-amino-2-deoxi-5-0-(benzil)-D-Glucitol (49)
A uma solução de (48) (0,870g, 3mmol) em etanol (25mL) foi adicionadoPd/C 5% (0,3mmol) e a mistura foi hidrogenada sob 40psi for 5h. Após essetempo a suspensão foi filtrada em XAD-4 e lavada com etanol. Evaporado osolvente obteve-se um óleo incolor em rendimento quantitativo.HRMS calculada para Ci3H17NO3Na, 236,1287; encontrada, 236,1284.
Processo geral para a obtenção dos compostos (50-58)
Uma solução da amina O-benzilada (49) (0,2g, 0,85mmol) e a respectivaoxazolona (10-18) (0,85mmol) em acetato de etila (20mL) foi refluxada por 24-48h. A reação foi monitorada por c.c.f. e após seu término foi deixada resfriar atemperatura ambiente. O sólido formado foi filtrado e lavado com acetato deetila. Alguns produtos necessitaram de recristalização com o solventeapropriado.
Exemplo 47: 1,4:3.6-dianidro-2-í2-benzamido-(Z)-cinamamidol-2-deoxi-5-0-(benzil)-D-Glucitol (50)
PF: 168-169°C. aD20 = +70 (c, 0.1) DMSO. Aspecto: sólido branco.Rendimento: 50%. HRMS calculada para C29H28N2O5Na, 507,1896;encontrada, 507,1878.Exemplo 48: 1,4:3,6-dianidro-2-f2-benzamido-(Z)-4-fluorocinamamido1-2-deoxi-5-Q-(benzil)-D-Glucitol (51)
PF: 202-203°C. aD20 = +55 (c, 0.1) DMSO. Aspecto: sólido branco.Rendimento: 55%. HRMS calculada para C29H27FN2O5Na1 525,1802;encontrada, 525,1784.
Exemplo 49: 1.4:3.6-dianidro-2-r2-benzamido-(Z)-4-clorocinamamido1-2-deoxi-5-0-(benzil)-D-Glucitol (52)
PF: 203-204°C. aD20 = +65 (c, 0.1) DMSO. Aspecto: sólido branco.Rendimento: 60%. HRMS calculada para C29H2TCIN2O5Na, 541,1506;encontrada, 541,1492.
Exemplo 50: 1,4:3,6-dianidro-242-benzamido-(Z)-4-bromocinamamido1-2-deoxi-5-Q-(benzil)-D-Glucitol (53)
PF: 194-195°C. aD20 = +62 (c, 0.1) DMSO. Aspecto: sólido branco.Rendimento: 55%. HRMS calculada para C29H27BrN2O5Na, 585,1001;encontrada, 585,1005.
Exemplo 51: 1.4:3,6-dianidro-2-r2-benzamido-(Z)-4-trifluorometilcinamamido1-2-deoxi-5-Q-(benzil)-D-Glucitol (54)
PF: 183-184°C. ocD20 = +23 (c, 0.1) DMSO. Aspecto: sólido branco.Rendimento: 50%. HRMS calculada para C3OH27F3N2O5Na, 575,1770;encontrada, 575,1771.
Exemplo 52: 1.4:3.6-dianidro-2-r2-benzamido-(Z)-4-metoxicinamamido1-2-deoxi-5-Q-(benzil)-D-Glucitol (55)
PF=: 167-168°C. aD20 = +75 (c, 0.1) DMSO. Aspecto: sólido amarelo.Rendimento: 57%. HRMS calculada para C30H30N2O6Na, 537,2002;encontrada, 537,1998.
Exemplo 53: 1.4:3.6-dianidro-2-r2-benzamido-(Z)-2-tiofenilacrilamido1-2-deoxi-5-Q-(benzil)-D-Glucitol (56)
PF: 157-158°C. aD20 = +60 (c, 0.1) DMSO. Aspecto: sólido branco.Rendimento: 60%. HRMS calculada para C27H26N2O5SNa, 513,1460;encontrada, 513,1437.
Exemplo 54: 1,4:3.6-dianidro-2-f2-benzamido-(Z)-3,4-metilenodioxicinamamido1-2-deoxi-5-Q-(benzil)-D-Glucitol (57)PF: 140-141 °C. aD20 = +53 (c, 0.1) DMSO. Aspecto: sólido branco.Rendimento: 60%. HRMS calculada para C30H28N2O7Na1 551,1794;encontrada, 551,1785.
Exemplo 55: 1,4:3,6-dianidro-2-f2-benzamido-(Z)-3-piridilacrilamido1-2-deoxi-5-Q-(benzil)-D-Glucitol (58)
PF: 161-162°C. aD20 = (c, 0.1) DMSO. Aspecto: sólido branco. Rendimento:62%.
Medida de atividade in vitro das drogas anti-HCV em replicons de HCV
Na etapa de medida da atividade anti-HCV das drogas descritasacima, foi utilizado um replicon subgenômico do RNA do HCV composto dasregiões não traduzidas 5'e 3'do genoma viral (5'UTR e 3'UTR) e os genesnão-estruturais NS3-NS4-NS5 precedido por uma seqüência de ligação aribossomos eucarióticos (IRES) vinda do vírus da encefalomiocardite murina(EMC-IRES). Este replicon ainda possui outro cistron que é composto pelogene da Iuciferase de vaga-lume fusionada a uma seqüência de ubiquitilação, eo gene da resistência ao antibiótico G418. A tradução deste segundo cistronesta sob controle do IRES do própio HCV localizado no final da região 5'UTR.
Este replicon foi nomeado de I389/NS3-3'-LucUbiNeo ET, e possui mutaçõesadaptativas no gene da NS5B que conferem uma maior capacidade replicativaa esses clones em cultura de células estabelecidas de hepatócitos (Lohmann,V., Hoffmann1 S., Herian, U., Penin, F., and Bartenschlager, R. (2003). Viral andcellular determinante of hepatitis C virus RNA replication in cell culture. J. Virol.77, 1-13). Esse sistema é absolutamente seguro para manipulação por não sercapaz de gerar partículas virais.
As células utilizadas neste ensaio são derivadas de uma linhagem deheptocarcinoma humano Huh7 (Nakabayashi, H.; Taketa1 K.; Miyano, K.;Yamane, T.; Sato1 J. Câncer Res. 1982, 42, 3858-3863). As células Huh7 sãocompetentes em manter o replicon por mais de 50 repliques em meio seletivoDEMEM 10% soro fetal bovino contendo 1 mg/mL de G418. Para introduzir oreplicon nas células Huh7 é necessária a transcrição do RNA do replicon invitro. Esta reação é feita utilizando o plasmídeo Iinearizado I389/NS3-3'-LucUbiNeo ET. O plamídeo foi Iinearizado com a enzima de restrição Spe I epurificado em coluna (PCR purifícation Kit, Qiagen). Os RNAs foramsintetizados em tampão contendo 40 mM Tris-HCI (pH 7,9), 10 mM NaCI1 12mM MgCl2, 2 mM espermidina, 10 mM DTT, 3 mM de cada nucleosídeotrifosfatado (Invitrogen), 0,025 U de pirofosfato, 100U de RNasin1 100U de T7RNA polimerase e 2 pg de DNA linearizado, durante 90 minutos a 37 0C. Oproduto final, o RNA do replicon, foi finalmente purificado com extração com oreagente Trizol LS (Invitrogen, USA) e precipitado com a adição.
Aproximadamente 4 pg de RNA foram eletroporados em 5. 106 célulasresuspensas em meio citomix (KCI 120mM, K2PO4 10mM, MgCb 5mM,HEPES25mM, CaCI2 0.15mM, EGTA 2mM, 1,9 mM ATP, 4,7mM glutationa) contendo1,25% de DMSO. As células no meio eram colocadas em uma cubeta deeletroporação com intervalo de di-polo de 0,4 cm, as condições de eletro-transferência foram 270 ν e 960pF. Após o pulso elétrico, as células foramtransferidas para 8mL de meio DMEM (10% soro fetal bovino) contendo 1,25%de DMSO. As células foram semeadas em uma placa de 10cm de diâmetro ecultivadas por 24horas. Após esta incubação o meio foi substituído por DMEM(10% soro fetal bovino), e as células contendo o replicon foram selecionadascom adição de 0,5 mg/mL de G418 será adicionado ao meio de cultura. Ascolônias foram finalmente visualizadas após 7 dias em cultura. As colôniasforam retiradas do meio seletivo e semeadas numa garrafa de cultura de25cm2, e mantidas em repiques semanais em meio seletivo.
Os ensaios antivirais foram realizados em meio Eagle s modificado porDulbecco (Gibco-lnvitrogen), na ausência de G418. As células serãosemeadas em placas de 96-poços (3,000 células por poço) e os compostos aserem testados em diferentes concentrações (100μΜ, 20 μΜ, 4 μΜ, 1 μΜ, 0,25μΜ, serão adicionados imediatamente após as células. As células foramcultivadas por 4 dias e após esta incubação, 20μ!_ do corante vital Risazurina(CelITiter-Blue® Cell Viability Assay. PROMEGA, USA) foi adicionado e asmesmas foram incubadas por 18 horas. A viabilidade foi medida comparando-se as unidades de fluorescência lidas nos poços contendo drogas e o do poçocontrole (sem droga). Após a medida da viabilidade, as células foram rompidascom 20 μΙ_ de um tampão de Iise (25mM Tris-fosfato (pH 7,8), 2mM DTT, 2mM1,2-diaminociclohexano-N-N-N'-N'-ácido tetraacético, 10% glicerol, 1% TritonX100) e ensaiadas para a atividade de Luciferase, adicionando-se 100μί dasolução de revelação (Luciferase Assay System, PROMEGA, USA). A emissãode luz foi medida em um luminômetro (Turner-Designs - TD-20/20). Os EC50%dos diferentes compostos frente aos replicons recombinantes foram calculadosutilizando os dados de Luciferase dos poços controle (100% de atividade). Ointerferon alfa (IFN-α) foi utilizado 300Ul/ml até 0.03 Ul/ml como controlepositivo nos ensaios de inibição.
Os resultados das análises de IC5o% para as células e o EC5o% para oreplicon HCV com os diferentes compostos sintetizados estão mostrados naTabela 3.
Tabela 3 - Tabela mostrando os resultados de ICso% e EC50% em μΜ para oreplicon l389/NS3-3'-LucUbiNeo ET em células Huh7.
<table>table see original document page 32</column></row><table>
1- Concentração que inibe 50% do crescimento das células huh7 no ensaio de Risazurina.
2- Concentração que inibe 50% do sinal de luciferase do replicon I389/NS3-3'-LucUbiNeo ETnas células Huh7.
3- Composto não testado.
4- Composto com baixa solubilidade em meio DMEM, não podendo ser testado para atividadeanti-HCV.
Como podemos evidenciar que o composto (56) foi o que apresentouuma atividade anti-HCV mais robusta com EC50% na faixa de 35 μΜ. Ocomposto (35) apresentou uma atividade anti-HCV menor na faixa de 95μΜ.Todas as drogas não apresentaram toxidez mensuráveis pela técnica daRisazurina com as células Huh7 (ICso%> 100 μΜ).A descrição acima da presente invenção bem como os exemplos foramapresentados com o propósito de ilustração e não limitam a invenção à formaaqui revelada e exemplificada. Em conseqüência, variações e modificaçõescompatíveis com os ensinamentos acima, e a habilidade ou conhecimento datécnica relevante, estão dentro do escopo da presente invenção. Asmodalidades acima descritas e exemplificadas têm a intenção de melhorexplicar os modos conhecidos para a prática da invenção e para permitir queos técnicos na área utilizem a invenção em tais, ou outras, modalidades e comvárias modificações necessárias pelas aplicações específicas ou usos dapresente invenção. É a intenção que a presente invenção inclua todas asmodificações e variações da mesma, dentro do escopo descrito no relatório enas reivindicações anexas.
Claims (19)
1.-Compostos pseudopeptídicos inibidores da serino protease caracterizadospor compreenderem as fórmulas gerais (I) e (II)1 <formula>formula see original document page 34</formula> R1 Benzila, carboxibenzila, carboxi-t-butila, hidrogênio, alquila ou arila;R2 fenila, p-fluorfenila, p-clorofenila, p-bromofenila, p-trifluormetilfenila, p-metoxifeníla, 2-tienil, 3,4-metilenodioxifenil, 3-piridil, 3,4-dimetoxifenil, p-cianofenil, 2-naftil, 4-metilfenil; e,R3 benzila, carboxibenzila, carboxi-t-butila, hidrogênio, aquila ou arila.
2.-Compostos de acordo com a reivindicaçãol, caracterizados por R1 podeser uma fenila ou metila;R2 fenila p-substituídos ou heterocíclos; e,R3 benzila (-Bn), carboxibenzila (-Cbz) ou carboxi-f-butila (-Boc).
3.-Compostos de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por R3 serpreferencialmente benzila.
4.-Composição inibidora da serino protease e potencialmente inibidora dapolimeraser caracterizadas por ser consistida do composto de formula geral I <formula>formula see original document page 34</formula>onde R1 pode ser uma fenila ou metila;R2 fenila p-substituídos ou heterocíclos; e,R3 benzila (-Bn), carboxibenzila (-Cbz) ou carboxi-f-butila (-Boc);e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis além de adjuvantesfarmaceuticamente aceitáveis.
5. - Composição acordo com a reivindicação 4 caracterizada por compreenderentre 10μΜ a 150μΜ de um composto de fórmula geral (I).
6. - Composição de acordo com a reivindicação 5 caracterizadas porapresentarem uma concentração preferencial de 10μΜ a 100 μΜ de umcomposto de fórmula geral (I).
7. - Composição farmacêutica caracterizada por compreender o composto defórmula geral (I)<formula>formula see original document page 35</formula>e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, útil na produção de ummedicamento voltado para o tratamento de doenças causadas por vírus dafamília fíaviviridae.
8. - Composição de acordo com a reivindicação 7 caracterizada porcompreender entre 10μΜ a 150μΜ de um composto de fórmula geral (I).
9. - Composição de acordo com a reivindicação 8 caracterizada porapresentarem uma concentração preferencial de 10μΜ a 100 μΜ de umcomposto de fórmula geral (I).
10. - Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada porpreferencialmente ser empregada no preparo de um medicamento para otratamento do vírus da hepatite C.
11. - Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada porpreferencialmente ser empregada no preparo de um medicamento para otratamento do dengue.
12.- Composição inibidora da serino protease e potencialmente inibidora dapolimeraser caracterizadas por ser consistida do composto de formula geral (II) <formula>formula see original document page 36</formula> onde R1 pode ser uma fenila ou metila;R2 fenila p-substituídos ou heterocíclos; e,R3 benzila (-Bn), carboxibenzila (-Cbz) ou carboxi-f-butila (-Boc). e/ou seus saisfarmaceuticamente aceitáveis e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.
13.-Composição acordo com a reivindicação 12 caracterizada porcompreender entre 10μΜ a 150μΜ de um composto de fórmula geral (II).
14.-Composição de acordo com a reivindicação 13 caracterizadas porapresentarem uma concentração preferencial de 10μΜ a 100 μΜ de umcomposto de fórmula geral (II).
15.-Composição farmacêutica caracterizada por compreender o composto defórmula geral (II) <formula>formula see original document page 36</formula>e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, útil na produção de ummedicamento voltado para o tratamento de doenças causadas por vírus dafamília flaviviridae.
16. - Composição de acordo com a reivindicação 15 caracterizada porcompreender entre 10μΜ a 150μΜ de um composto de fórmula geral (I).
17. - Composição de acordo com a reivindicação 16 caracterizada porapresentarem uma concentração preferencial de 10μΜ a 100 μΜ de umcomposto de fórmula geral (II).
18. - Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada porpreferencialmente ser empregada no preparo de um medicamento para otratamento do vírus da hepatite C.
19. - Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada porpreferencialmente ser empregada no preparo de um medicamento para otratamento do dengue.
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|---|---|---|---|---|
| US9540391B2 (en) | 2013-01-17 | 2017-01-10 | Sanofi | Isomannide derivatives as inhibitors of soluble epoxide hydrolase |
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