BRPI0902559A2 - método multiparámetro de alta sensibilidade para análise de evento raro em uma amostra biológica - Google Patents

método multiparámetro de alta sensibilidade para análise de evento raro em uma amostra biológica Download PDF

Info

Publication number
BRPI0902559A2
BRPI0902559A2 BRPI0902559-6A BRPI0902559A BRPI0902559A2 BR PI0902559 A2 BRPI0902559 A2 BR PI0902559A2 BR PI0902559 A BRPI0902559 A BR PI0902559A BR PI0902559 A2 BRPI0902559 A2 BR PI0902559A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
cells
target
suspected
sample
analysis
Prior art date
Application number
BRPI0902559-6A
Other languages
English (en)
Inventor
Carle Connelly Mark
Coumans Frank
Gross Steve
Kelly Mike
Original Assignee
Veridex, Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41611032&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0902559(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Veridex, Llc filed Critical Veridex, Llc
Priority to BR122018015761A priority Critical patent/BR122018015761B8/pt
Publication of BRPI0902559A2 publication Critical patent/BRPI0902559A2/pt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/57585—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds identifiable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

MéTODO MULTIPARáMETRO DE ALTA SENSIBILIDADE PARA ANáLISE DE EVENTO RARO EM UMA AMOSTRA BIOLóGICA Uma amostra de sangue contendo CTCs, ou outras células de interesse, é marcada com marcadores fluorescentes para análise de imagem e rastreada para identificar a presença e posição dentro do cartucho das cé- lulas-alvo ou elementos subcelulares. Uma amostra contendo células-alvo ou elementos subcelulares desejados é então ainda processada, em parte por fotodescoramento da amostra, para que aqueles mesmos alvos possam ser reanalisados com biomarcadores adicionais conjugados aos mesmos ou diferentes fluorocromos usando os mesmos critérios de geração de imagem que foram usados para a análise inicial. A presente invenção tem aplicações com alvos tais como células epiteliais circulantes, células, células tumorais circulantes, células endoteliais circulantes, leucócitos, subconjuntos de linfó- citos, células contendo uma organela ou receptor de interesse, resíduos ce- lulares, células rompidas e seus resíduos, ou qualquer outro elemento for- mado que poderia ser capturado e gerar imagem. A invenção fornece um meio adicional de interrogar alvos individuais de interesse, especialmente quando pareado com análise genética, tal como FISH.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOMULTIPARÂMETRO DE ALTA SENSIBILIDADE PARA ANÁLISE DE E-VENTO RARO EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS
Este pedido de patente é uma continuação em parte do pedidode patente Norte-americana Ser. N0 12/067.532, depositado em 20 de marçode 2008 que reivindica prioridade sobre os Pedidos de Patente ProvisóriaNorte-americana 60/718.676, depositado em 20 de setembro de 2005;60/729,536, depositado em 24 de outubro de 2005; e 60/786,117, deposita-do em março de 2006. Cada um dos pedidos de patente acima mencionadosestá completamente incorporado por referência neste pedido.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Campo da Invenção
A invenção relaciona-se aos campos de oncologia e teste diag-nóstico. A invenção é útil para rastreamento, estadiamento, respostas aotratamento, recorrência ou similar em doenças tais como câncer ou distúr-bios cardiovasculares. Mais especificamente, a presente invenção fornecemétodos que facilitam a análise e a listagem de células raras circulantes iso-ladas de amostras biológicas.
ANTECENDENTES
Métodos para caraterização não só de células tumorais, mastambém de células raras, ou outras entidades biológicas de amostras bioló-gicas foram anteriormente descritos (Patente americana 6.365.362). Estesdois métodos de estadiamento requerem enriquecimento eficiente para as-segurar a aquisição de células-alvo, enquanto elimina uma quantidade subs-tancial de resíduos e outras substâncias interferentes antes da análise, con-siderando exame celular por técnicas de geração de imagem.
O método combina elementos de enriquecimento imunomagnéti-co com análise multiparâmetro por citometria de fluxo, microscopia e imuno-citoquímica de um modo unicamente automatizado. O método de combina-ção é usado para enriquecer e enumerar células epiteliais em amostras desangue, dessa forma fornecendo um instrumento para mensuração de cân-cer.
O método de dois estágios tem aplicações no prognóstico decâncer e sobrevida de pacientes com câncer metastático (WO 04076643).
Com base na presença de células de câncer circulantes morfologicamenteintactas no sangue, este método é capaz de correlacionar a presença decélulas de câncer circulantes de pacientes com câncer de mama metastáticocom tempo de progressão da doença e sobrevida. Mais especificamente, apresença de cinco (5) ou mais células tumorais circulantes por 7,5 mililitrosfornece um valor preditivo no primeiro segmento, dessa forma fornecendoum indicador prognóstico precoce da sobrevida do paciente.
A especificidade do ensaio descrito acima aumenta com o núme-ro de células detectadas e não é suficiente nos casos em que somente pou-cas (geralmente menos de 5 células tumorais circulantes) são detectadas.
Uma solução para este problema é fornecer informação genética detalhadasobre células de câncer suspeitas. Consequentemente, um método que in-corporaria o enriquecimento de uma amostra de sangue com imagem multi-paramétrica de citometria de fluxo e análise genética multiparamétrica emuma célula de câncer individual suspeita forneceria um perfil completo e me-canismo confirmatório para melhorar significativamente procedimentos atu-ais para rastreamento de paciente, avaliando a recorrência da doença, ou asobrevida global. Um ensaio confirmatório na análise de células circulantesraras pela combinação da análise multiparamétrica fenotípica e genotípicade uma célula alvo isolada individualmente foi descrito (ver pedido de paten-te Norte-americana pendente 12/067.532). A confirmação fornece um nívelclinicamente significante de sensibilidade e, por isso, segurança ao clínicode qualquer informação quantitativa adquirida. Estados patológicos relevan-tes são avaliados usando número extremamente pequeno (1, 2, 3, ou 4) decélulas tumorais circulantes (CTCS) e fornecem uma confirmação para de-tecção precoce da doença.
Não há outras tecnologias disponíveis que possam realizar en-saios múltiplos de alta sensibilidade na mesma amostra com o mesmo mar-cador e fazê-lo em eventos raros. Citometria de fluxo multiparâmetro é co-mumente feita, mas necessita centenas ou milhares de células-alvo ou even-tos para obtenção de informação exata. Entretanto, se um paciente tem so-mente 6 CTCs em 7,5 mL de sangue há poucos eventos ainda para detectarconfiavelmente, para não falar nenhum para realização de análise multipa-râmetro.
A presente invenção estende o protocolo de enriquecimento eanálise descrito na patente Norte-americana 6.365.362 e utilizado no Siste-ma Celltracks® Autoprep® e Sistema Analisador Il Celltracks® (ImmuniconCorporation, Huntingdon Valley, PA) pelo fornecimento de um meio para Ie-var em consideração a interrogação de células raras circulantes com múlti-plos biomarcadores fluorescentes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção aqui descrita compõe-se de um método composto decinco partes que trabalham em conjunto para alcançar o resultado final. Ainvenção compõe-se essencialmente de (1) Rastreamento de um cartuchopara identificar aqueles com células-alvo de interesse e a sua posição dentrodo cartucho; (2) Aspiração do fluido do cartucho para secar ou fixar ativa-mente as células na sua posição na guia de cobertura; (3) Fotodescoramen-to dos sinais fluorescentes para eliminar a fluorescência que foi originalmen-te usada para identificar a célula alvo; (4) Remarcação das células dentro docartucho com um ou mais anticorpos fluorescentes conjugado(s) ou cora-dos(s) para marcar marcadores, receptores, proteínas etc. de interesse emou dentro do alvo de interesse; (5) Re-rastreamento do cartucho e retornoaos alvos de interesse previamente identificados e determinar se as célulassão positivas ou negativas para os marcadores desejados ou proteína.
Uma amostra de sangue contendo CTCs, ou outras células deinteresse, é marcada com marcadores fluorescentes para análise de imageme rastreamento para identificar a presença e posição dentro do cartucho decélulas-alvo ou elementos subcelulares. Uma mostra contendo células-alvoou elementos subcelulares desejados é então ainda processada, em partepor fotodescoramento da amostra, para que aqueles mesmos alvos possamser reanalisados com biomarcadores adicionais conjugados aos mesmos oudiferentes fluorocromos usando os mesmos critérios de geração de imagemque foram usados para a análise inicial. A presente invenção tem aplicaçõescom alvos, tais como células epiteliais circulantes, células tumorais circulan-tes, células endoteliais circulantes, leucócitos, subconjuntos de linfócitos,células contendo uma organela ou receptor de interesse, resíduo celular,células rompidas e seus resíduos, ou qualquer outro elemento formado quepoderia ser capturado e visualizado por imagem.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1: Painel A Confirmação da integridade da amostra e posição doalvo após secagem. Painel B Células são mostradas na mesmaposição antes e após secagem.
Figura 2: Cartucho remarcado após secagem.
Figura 3: Descoramento do sinal fluorescente usando LED's. Painel A:Descoramento de células SKBR marcadas com C11-PE seguidopor remarcação com C11-FITC. Painel B Descoramento de célu-las PC3-9 marcadas com C11-PE seguido por remarcação comC11-FITC.
Figura 4: O Painel A mostra o rastreamento inicial de Células SKBR mar-cadas com C11-PE. O Painel B mostra a amostra após desco-ramento e remarcação com C11-FITC sozinho. O Painel C mos-tra a amostra remarcada com C11-FITC e pART-PE.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Células tumorais circulantes (CTCs) capturadas do sangue fo-ram detectadas e analisadas usando Sistema CelITracks® Autoprep® e Sis-tema Analisador Il CelITracks® (Immunicon Corporation, Huntingdon Valley,PA). Neste procedimento, uma combinação de biomarcadores fluorescentese corantes são usados para identificar células de origem epitelial e para dis-tingui-las de leucócitos contaminantes. A plataforma de análise CelITracks®é limitada a quatro canais ou cores para detectar estes marcadores fluores-centes. Um canal UV detecta 4'-6'Diamidino-2-fenilindol (DAPI), um marca-dor nuclear, para identificar eventos celulares nucleados ou; um canal paraaloficocianina (APC) é usado para detectar CD45-APC que é usado paraidentificar leucócitos; e dois canais para marcador, ficoeritrina (PE) e isotio-cianato de fluoresceína (FITC), são usados para detectar biomarcadoresconjugados a PE ou FITC. Usando um conjunto CelISearch® padrão (VeridexLLC1 Raritan, NJ) o PE é conjugado a citoqueratinas que são usadas paraidentificar células epiteliais e o canal para FITC está disponível para marca-dores adicionais de interesse. O Conjunto de Célula Epitelial (ImmuniconCorporation, Huntingdon Valley, PA) usa a mesma combinação de cores,somente a citoqueratina é conjugada agora a FITC liberando o canal paraPE. A sinalização mais forte do canal para PE leva em conta a detecção dedímeros de biomarcadores conjugados a PE.
Uma vez que somente quatro canais ou cores existem atualmen-te no Sistema Analisador Il CelITracks® e três das cores são dedicadas àdetecção de células epiteliais e leucócitos somente um canal permanecedisponível para a análise de biomarcador adicional. Entretanto, há uma ne-cessidade, especialmente na indústria farmacêutica, na detecção de múlti-plos biomarcadores em um alvo capturado e seria preferencial que a detec-ção ocorresse no mesmo alvo. A presente invenção leva em consideração aremoção dos sinais fluorescentes dos biomarcadores e corantes que sãoanexados aos alvos capturados e a remarcação dos mesmos alvos commarcadores adicionais de interesse. Uma etapa de secagem após rastrea-mento inicial do cartucho fixa os alvos de interesse em sua posição originaldentro do cartucho para que, quando o cartucho for remarcado, aquelesmesmos alvos sejam facilmente encontrados e analisados para a presençados biomarcadores adicionais de interesse.
Na primeira etapa do procedimento, um cartucho CelITracks® éprocessado no Sistema CelITracks® Autoprep® e Sistema Analisador Il CelI-Tracks®, onde os alvos capturados são rastreados e a presença de alvosdesejados identificada para a posição dentro do cartucho determinado. Olíquido no cartucho é removido por aspiração e o cartucho é seco ao ar du-rante a noite. A aspiração e secagem ao ar é feita enquanto o cartucho per-manece no MagNest® original. Esta etapa "fixa" os alvos, normalmente célu-la tais como CTC's, no lugar no cartucho, portanto ficam essencialmente i-móveis e afixados na superfície de geração de imagem na posição onde elesforam originalmente detectados. O método preferencial de fixação das célu-las é secagem ao ar do cartucho, entretanto outros métodos de fixação po-dem ser usados e, de fato, podem ser necessários para expor alguns tiposde antígenos ou alcançar reatividade ótima de certos anticorpos com seusantígenos. Esta etapa de secagem ou fixação ativa permite ao cartucho serremovido do MagNest® e permite ao cartucho ser processado com pouco ounenhum movimento ou perda celular. Dessa forma, permitindo um dispositi-vo de geração de imagem tal como, mas não limitado a, Sistema AnalisadorIl Celltracks® para readquirir os alvos durante análise subsequente. A se-gunda etapa no procedimento expõe o cartucho à luz intensa gerada por,mas não limitado a, LEDs a fim de descorar a fluorescência dos corantes emarcadores que foram anexados aos alvos durante o seu processamentoinicial. Fotodescoramento é eficaz quando um fluorocromo é excitado emuma alta faixa. A banda de comprimento de onda que um corante é excitadocom alta eficiência é tipicamente estreita (10 a 50nm). LED1S eficientementegeram a luz em uma banda de comprimento de onda estreita com alta efici-ência e estão disponíveis na emissão próximo de UV a IV. A eficiência doLED é além disso potencializada por uma dissipador de calor. Um homoge-neizador opcional composto de superfícies refletivas ou refrativas pode serusado para melhorar a uniformidade da distribuição de luz na amostra. Como protótipo atual do LED descorador, o fotodescoramento de um corante bri-lhante pode levar até 20 minutos. Entretanto, 10 a 15 minutos são suficientespara sinais de dímeros. Durante a etapa final, a amostra no cartucho é re-marcada com biomarcadores adicionais de interesse conjugados a fluoro-cromos. A solução de marcação é removida e substituída com uma soluçãocorante ácida para núcleos, tal como CeIIFix contendo DAPI, e o cartucho éreanalisado no dispositivo de geração de imagem.
A figura 1A confirma a integridade da amostra após secagem.Depois que a amostra foi seca, a distribuição ferrofluida e a posição dos al-vos permanecem as mesmas como quando o inicialmente rastreado no Sis-tema Analisador Il CelITracks®. A figura 1B mostra que as células permane-cem intactas e na mesma posição antes e depois da secagem.
A figura 2 demonstra a capacidade de remarcação no cartuchoapós secagem. Aqui, células-alvo foram adicionadas no sangue, preparadasusando o conservante CellSave (Immunicon Corporation) e guardadas du-rante a noite. A amostra então foi processada no Sistema CelITracks® Auto-prep® e Sistema Analisador Il CelITracks® usando um conjunto para CTCque marca as células com C11-PE. No rastreamento inicial, o canal FITCpermanece vazio como não havia nenhum marcador conjugado a FITC. De-pois que os cartuchos foram secos e o sinal fluorescente descorado, a a-mostra foi remarcada com C11-FITC no cartucho, então rerrastreada no Sis-tema Analisador Il CelITracks®. A amostra é agora positiva nos canais paraPE e FITC. Embora as amostras fossem inicialmente marcadas com CU-PÊ, permanecem sítios de ligação suficientes para ligação de C11-FITCsubsequente.
As figuras 3A e 3B demonstram a capacidade de descorar o si-nal fluorescente usando diodos emissores de luz (LEDs). As células foramintroduzidas no sangue, conservadas usando o conservante CeIISave, eguardadas durante a noite. A amostra então foi processada no Sistema CelI-Tracks ® Autoprep® usando um conjunto de CTC que marca as células comC11-PE. Cartuchos então foram rastreados no Sistema Analisador Il Cell-tracks®. Após aspiração do líquido e secagem do cartucho, o CeIIFix foi adi-cionado novamente ao cartucho; o cartucho foi removido do MagNest®, eentão exposto à luz dos LEDs por até 20 minutos. O cartucho foi colocadonovamente no MagNest®, o CeIIFix foi aspirado, e as células foram remarca-das com C11-FITC e então DAPI. Esta remarcação é necessária para queas células introduzidas possam ser readquiridas e analisadas no SistemaAnalisador Il Celltracks®. O descoramento foi observado somente para amarcação inicial com C11-PE. Depois que as amostras foram rastreadas noSistema Analisador Il Celltracks®, foram avaliadas para intensidade de mar-cação do brilho usando software que determina a intensidade de fluorescên-cia média (MFI).
A figura 3A mostra o descoramento de células SKBR que semarcam brilhantemente com C11-PE. Após 20 minutos de descoração, aMFI de PE cai de -4000 a perto de 0. A figura 3B mostra o descoramento decélulas PC3-9 que marcam o dímero para C11-PE, típico para CTCs. O MFIde PE cai de uma faixa de 500 a 2000 para 0 após descoramento por 10 a15 minutos.
A última meta é remarcar com um marcador não usado previa-mente no Sistema CelITracks® Autoprep® durante o processamento inicial daamostra. As imagens na Figura 4 demonstram a capacidade de tomar CTCsprocessados no Sistema CelITracks® Autoprep® usando as combinações decorante DAPI, CD45 APC e C11-PE, descorando aqueles sinais, e logo re-marcando as células com DAPI, C11-FITC e p-AKT PE. AKT é uma quinaseimportante na via de sinalização celular de PI3K. A enzima é ativada porfos-forilação, e é conhecida estar constitutivamente ativada em alguns tumores.
A figura 4A mostra o rastreamento inicial de células SKBR captu-radas do sangue e marcadas no Sistema CelITracks® Autoprep® com CU-PÊ. Observa-se o canal para FITC negativo. A figura 4B mostra a amostradepois de descoramento e remarcação com C11-FITC. Observa-se o sinaldo canal para PE negativo. A figura 4C mostra a amostra após descoramen-to e remarcação com C11-FITC e pAKT-PE.
A presente invenção leva em conta a interrogação de CTCs commúltiplos biomarcadores fluorescentes de interesse que normalmente nãoseria possível utilizando um protocolo de processamento único no SistemaCelITracks® Autoprep® e Sistema Analisador Il CelITracks®. Alcança-se istopelo descoramento do sinal fluorescente dos corantes usados durante a cor-rida inicial e remarcando-se no cartucho com biomarcadores fluorescentesadicionais que podem agora ser rerrastreados usando os mesmos canaisfluorescentes.
A presente invenção considera múltiplo redescoramento damesma amostra com subsequente remarcação. A presente invenção aindaconsidera o processo de descoramento e seu uso em ensaios múltiplos deassociação de ligação específica na mesma célula(s). Consequentemente,análise multiparâmetro de células pode ser realizada sem ter necessidadeda adição de canais fluorescentes; mais filtros, mais fontes de luz e aumentoda complexidade do instrumento e software de coleta e análise dos dados.Consequentementer expande-se a capacidade de um analisador fluorescen-te de 4 cores existente para realizar a análise de 'N' parâmetros sem modifi-cações de sistema complexas e caras. Também permite a um usuário identi-ficar cartuchos de interesse, secá-los ou fixá-los, e então guardá-los paraanálise posterior de alto valor.
A invenção fornece para uso do mesmo fluoróforo de alta sensi-bilidade para dois ou mais analitos na mesma célula que não é possível pornenhuma outra tecnologia na técnica. Por exemplo, PE tem alta absorção eo rendimento do quantum de fluorescência que o faz bem ajustado para de-tectar marcadores de alta sensibilidade, tais como IGF-1R e p-AKT. Estesmarcadores estão em uma concentração tão baixa nas células-alvo que se oanticorpo conjugado estiver ligado a FITC em vez de PE, eles não são de-tectáveis. Não há IGF-1R suficiente em uma célula positiva para fornecer umsinal detectável usando FITC devido à sua menor sensibilidade e rendimentode quantum. O mesmo é verdade para p-AKT, entretanto, na presente in-venção uma CTC pode ser identificada usando CK-PE. O sinal de CK-PE édescorado a 0, remarcado com anti-IGF-1R-PE e a situação de IGF-1R damesma célula determinada. O sinal de IGF-1R pode ser ainda desmarcado a0 e remarcado no cartucho novamente usando anti-p-AKT-PE. Este proces-so leva em consideração os três analitos a serem analisados na mesma cé-lula usando o fluorocromo mais sensível disponível.
A invenção também leva em consideração o alto valor adicionalde pesquisa ou informação clínica a ser coletada em amostras, sem ter ne-cessidade de chamar pacientes novamente e coletar amostras adicionais.Se CTCs1 ou outros alvos de interesse, são encontrados, a amostra pode serpreparada usando a presente invenção e as propriedades daquelas CTCsexaminadas e exploradas sem ter necessidade de submeter o paciente aprocedimentos invasivos adicionais. Além disso, se a amostra encontradanão contém o alvo de interesse, testes, procedimentos e reagentes de altovalor adicional não têm que ser consumidos. Este é diferente de outros mé-todos onde os reagentes de teste devem ser adicionados antes que se co-nheça se a amostra de fato contém o alvo de interesse.
A presente invenção, além disso considera a análise por FISHsubsequente nas mesmas células para procurar amplificações, transloca-ções ou quebras gênicas que podem se correlacionar com ou explicar asexpressões observadas. O meio preferencial para análise por FISH subse-quente incorpora o uso de sondas sem repetição (patente Norte-americana12/067.532).
A invenção leva em consideração a análise detalhada de CTCsou outros alvos de interesse uma vez encontrados. Isto pode ser usado du-rante o desenvolvimento de fármaco para identificar se as CTCs de um indi-víduo provavelmente serão suscetíveis à terapia de fármaco destinada aoalvo. Então pode ser usada ainda para explorar ou confirmar estudos de me-canismo de fármaco determinando se os marcadores intracelulares ou ou-tros são regulados para cima, regulados para baixo ou fosforilados em res-posta a terapias como predito a partir de estudos in vitro, dessa forma forne-cendo associação diagnostica. As presentes invenções têm utilidade no for-necimento de um método minimamente invasivo para obter amostras paradeterminação da compatibilidade de um paciente para medicina personali-zada destinada a alvo. Outras aplicações conhecidas na técnica tais como,mas não limitadas a, detecção de estados de ativação de subconjuntos deleucócitos importantes no dano inflamatório, ou hiperinterleucinemias, taiscomo choque séptico. O presente método é também útil como um serviço deutilização somente em pesquisa (RUO), e possivelmente por fim, como umproduto que pode ser direcionado a laboratórios de referência e hospital.
Enquanto algumas das modalidades preferenciais da presenteinvenção foram descritas e especificamente exemplificadas acima, cuja in-tenção não é que a invenção seja limitada a tais modalidades. Várias modifi-cações podem ser feitas na mesma sem partir do espírito da presente inven-ção, o escopo total das melhorias é delineado nas reivindicações seguintes.

Claims (10)

1. Método para aumentar a sensibilidade na análise de eventoraro compreendendo:a. preparação de uma amostra por marcação fluorescente;b. rastreamento da amostra para identificar eventos-alvo;c. aspiração do fluido da amostra para deixar os eventos-alvo namesma posição;d. fotodescoramento dos eventos-alvo;e. remarcação do evento alvo com um marcador secundário fluo-rescentemente marcado;f. rerrastreamento dos eventos-alvo; eg. repetição das etapas c a f para cada marcador fluorescente-mente marcado adicional.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito mar-cador secundário marcado é um anticorpo fluorescente conjugado, coranteou combinação dos mesmos.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito ras-treamento e o dito rerrastreamento é completado com o Sistema CelITracks®Autoprep® e o Sistema Analisador Il CelITracks®.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito even-to alvo é de um grupo composto de epitelial circulante, células, células tumo-rais circulantes, células endoteliais circulantes, leucócitos, subconjuntos delinfócitos, células contendo uma organela ou receptor de interesse, resíduocelular, células rompidas e seus resíduos, ou combinações dos mesmos.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito even-to alvo são células tumorais circulantes.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que uma etapaadicional é definição de genótipo multiparamétrico do dito evento alvo.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a dita defini-ção de genótipo é FISH.
8. Método para confirmação de detecção e enumeração das cé-lulas-alvo suspeitas em uma população de células misturadas, compreen-dendo:a. obtenção de um espécime biológico a partir de um indivíduoteste, o dito espécime compreendendo uma população de células mistura-das suspeitas de conter células-alvo;b. isolamento de uma subpopulação das ditas células-alvo sus-peitas pelo enriquecimento imunomagnético;c. identificação de células-alvo suspeitas por um perfil fenotípicomultiparamétrico;d. preparação de células-alvo suspeitas por um perfil genotípicomultiparamétrico; ee. confirmação das células-alvo suspeitas pelo dito perfil genotí-pico multiparamétrico em que a dita célula alvo suspeita individual contémambos perfis fenotípico e genotípico da dita célula alvo.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o dito perfilfenotípico compreende:a. marcação fluorescente de células-alvo e suspeitas;b. rastreamento das ditas células-alvo e suspeitas;c. aspiração do fluido da amostra;d. fotodescoramento da amostra; ee. rerrastreamento das ditas células-alvo e suspeitas.
10. Método de acordo com a reivindicação 8, pelo qual as célu-las-alvo são selecionadas a partir de um grupo composto de células endote-liais, células epiteliais, células fetais, células bacterianas, células miocardi-ais, células viralmente infectadas e combinações das mesmas.
BRPI0902559-6A 2008-07-29 2009-07-27 método multiparámetro de alta sensibilidade para análise de evento raro em uma amostra biológica BRPI0902559A2 (pt)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR122018015761A BR122018015761B8 (pt) 2008-07-29 2009-07-27 método para confirmação de detecção e enumeração das células-alvo suspeitas em amostra de sangue compreendendo uma população de células misturadas

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/181,399 US9134237B2 (en) 2005-09-20 2008-07-29 High sensitivity multiparameter method for rare event analysis in a biological sample
US12/181,399 2008-07-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0902559A2 true BRPI0902559A2 (pt) 2011-04-05

Family

ID=41611032

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0902559-6A BRPI0902559A2 (pt) 2008-07-29 2009-07-27 método multiparámetro de alta sensibilidade para análise de evento raro em uma amostra biológica
BR122018015761A BR122018015761B8 (pt) 2008-07-29 2009-07-27 método para confirmação de detecção e enumeração das células-alvo suspeitas em amostra de sangue compreendendo uma população de células misturadas

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR122018015761A BR122018015761B8 (pt) 2008-07-29 2009-07-27 método para confirmação de detecção e enumeração das células-alvo suspeitas em amostra de sangue compreendendo uma população de células misturadas

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9134237B2 (pt)
EP (1) EP2169387B1 (pt)
JP (1) JP6109464B2 (pt)
KR (2) KR101764597B1 (pt)
CN (1) CN101672779B (pt)
BR (2) BRPI0902559A2 (pt)
CA (2) CA2674187C (pt)
DK (1) DK2169387T3 (pt)
ES (1) ES2542061T3 (pt)
HU (1) HUE026779T2 (pt)
IL (1) IL199798A (pt)
MX (1) MX2009008060A (pt)
PL (1) PL2169387T3 (pt)
PT (1) PT2169387E (pt)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2623405C (en) 2005-09-20 2014-11-25 Immunivest Corporation Methods and composition to generate unique sequence dna probes labeling of dna probes and the use of these probes
WO2011050103A1 (en) 2009-10-21 2011-04-28 The Scripps Research Institute Method of using non-rare cells to detect rare cells
EP3517630B1 (en) 2010-10-06 2022-01-19 Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats Method for the diagnosis, prognosis and treatment of breast cancer metastasis
US10114020B2 (en) 2010-10-11 2018-10-30 Mbio Diagnostics, Inc. System and device for analyzing a fluidic sample
JP6010034B2 (ja) * 2011-08-30 2016-10-19 オリンパス株式会社 標的粒子の検出方法
WO2013072571A1 (fr) * 2011-11-17 2013-05-23 Institut Gustave Roussy Methode de caracterisation de cellules tumorales circulantes et application au diagnostic
EP2650682A1 (en) 2012-04-09 2013-10-16 Fundació Privada Institut de Recerca Biomèdica Method for the prognosis and treatment of cancer metastasis
EP3467124A1 (en) 2012-06-06 2019-04-10 Fundació Institut de Recerca Biomèdica IRB (Barcelona) Method for the diagnosis, prognosis and treatment of lung cancer metastasis
US10119171B2 (en) 2012-10-12 2018-11-06 Inbiomotion S.L. Method for the diagnosis, prognosis and treatment of prostate cancer metastasis
KR101872965B1 (ko) 2012-10-12 2018-06-29 인바이오모션 에스.엘. Ｃ―ｍａｆ를 이용하는 전립선암 전이의 진단, 예후 및 치료 방법
WO2014070235A1 (en) 2012-10-29 2014-05-08 Mbio Diagnostics, Inc. Biological particle identification system, cartridge and associated methods
US10527624B2 (en) 2014-01-27 2020-01-07 Epic Sciences, Inc. Circulating tumor cell diagnostics for prostate cancer biomarkers
EP3108246B1 (en) 2014-02-21 2019-10-09 Epic Sciences, Inc. Methods for analyzing rare circulating cells
WO2016033103A1 (en) * 2014-08-25 2016-03-03 Creatv Microtech, Inc. Use of circulating cell biomarkers in the blood for detection and diagnosis of diseases and methods of isolating them
KR20170093182A (ko) 2014-12-11 2017-08-14 인바이오모션 에스.엘. 인간 c-maf에 대한 결합 구성원
WO2016115537A2 (en) * 2015-01-15 2016-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and apparatus for in vitro single-cell identification and recovery
GB201507202D0 (en) 2015-04-28 2015-06-10 Stfc Science & Technology Receptor tyosine kinase biomarkers
KR20180100607A (ko) * 2016-01-07 2018-09-11 크리에티브이 마이크로테크, 인크. 순차적인 형광 소광 및 재염색을 이용한 생물학적 시료의 다중-표현형적 서브타이핑
AU2017271385B2 (en) 2016-05-25 2023-10-05 Inbiomotion S.L. Therapeutic treatment of breast cancer based on c-MAF status
US20190234874A1 (en) * 2016-07-19 2019-08-01 Altius Institute For Biomedical Sciences Methods for fluorescence imaging microscopy
MX2020005182A (es) 2017-11-22 2020-08-17 Inbiomotion Sl Tratamiento terapeutico del cancer de mama basado en el estado del c-maf.
CN111330311B (zh) * 2020-02-13 2021-02-23 浙江大学 一种相变诱导靶标富集的方法

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5578444A (en) 1991-06-27 1996-11-26 Genelabs Technologies, Inc. Sequence-directed DNA-binding molecules compositions and methods
AU2636995A (en) * 1994-05-18 1995-12-05 Research And Development Institute, Inc. Simple, rapid method for the detection, identification and enumeration of specific viable microorganisms
JPH10500310A (ja) * 1994-05-19 1998-01-13 ダコ アクティーゼルスカブ 淋菌及びトラコーマ クラミジアの検出のためのｐｎａ プローブ
CN1153064C (zh) 1996-04-05 2004-06-09 约翰斯·霍普金斯大学 富集稀少细胞的方法
DE19709348C2 (de) * 1996-05-29 1999-07-01 Schubert Walter Dr Md Automatisches Multi-Epitop-Ligand-Kartierungsverfahren
GB9716664D0 (en) * 1997-08-06 1997-10-15 Norwegian Inst Of Fisheries & A method of removing nucleic acid contamination reactions
US20020172987A1 (en) * 1998-02-12 2002-11-21 Terstappen Leon W.M.M. Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
BR9907852A (pt) * 1998-02-12 2000-10-24 Immunivest Corp Processos para detectar e enumerar células raras e cancerosas em uma população celular mista, para diagnosticar câncer de estágio precoce em um paciente de teste, para determinar a probabilidade de recorrência de câncer em um paciente humano anteriormente tratado de câncer, para distinguir um carcinoma confinado ao órgão de um carcinoma com propriedades metastáticas, para acompanhar a situação de remissão em um paciente humano com câncer que passa pelo tratamento de terapia contra o câncer e para aumentar quantidades de células epiteliais circulantes em uma amostra de sangue, partìcula magnética revestida, composição, conjuntos de teste para avaliar uma amostra de paciente quanto a presença de células raras circulantes, quanto a presença de células de tumor circulantes, quanto a presença de células de câncer de mama circulantes, quanto a presença de células de câncer de próstata circulantes, quanto a presença de células de câncer de cólon circulantes, quanto a presença de células de câncer de bexiga circulantes e para monitorar um paciente quanto a recorrência de câncer, e, fração de sangue periférico enriquecido quanto a células neoplásticas circulantes
AU758466B2 (en) 1998-06-02 2003-03-20 Yale University Multiparametric fluorescence in situ hybridization
US6429293B1 (en) * 1998-06-26 2002-08-06 Hsc Research And Development Limited Partnership Sculpin-type antifreeze polypeptides and nucleic acids
US6960449B2 (en) 1999-02-10 2005-11-01 Cell Works Diagnostics, Inc. Class characterization of circulating cancer cells isolated from body fluids and methods of use
WO2001006014A1 (en) 1999-07-19 2001-01-25 American Laboratory Technologies, Inc. Removing repetitive sequences from dna
US6203992B1 (en) 1999-10-15 2001-03-20 Abbott Laboratories Nucleic acid primers and probes for detecting tumor cells
CA2388528A1 (en) * 1999-11-04 2001-05-10 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
CA2435503C (en) 2001-01-19 2011-02-22 Ludwig Institute For Cancer Research Flt4(vegfr-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy
CA2434604C (en) * 2001-02-12 2010-09-28 Immunivest Corporation Cartridge for containing a specimen sample for optical analysis
GB0111324D0 (en) * 2001-05-09 2001-07-04 Unilever Plc Ambient stable beverage
US20030129626A1 (en) 2001-09-24 2003-07-10 Nielsen Kirsten Vang Methods, kits and compositions pertaining to the suppression of detectable probe binding to randomly distributed repeat sequences in genomic nucleic acid
US20030082632A1 (en) * 2001-10-25 2003-05-01 Cytoprint, Inc. Assay method and apparatus
JP2005507997A (ja) 2001-10-26 2005-03-24 イムニベスト・コーポレイション 同一試料についての包括的核酸および形態学的特徴のマルチパラメーター分析
WO2003048378A2 (en) * 2001-12-04 2003-06-12 Euregen Llc Methods and compositions for selectively cleaving dna containing duplex acids in a complex nucleic acid mixture
MXPA04006154A (es) 2001-12-21 2004-11-01 Immunex Corp Celulas madre endoteliales, poblaciones y metodos para el aislamiento y uso de las mismas.
EP1497447A4 (en) 2002-04-12 2006-09-20 Univ Missouri US ECIST MICROARRAYSES FOR DUAL SCREENING OF DNA HYPERMETHYLATION AND GENE INACTIVATION, AND FOR USE IN AN INTEGRATED SYSTEM FOR EVALUATING GENE EXPRESSION, DNA METHYLATION AND ACETYLATION OF HISTONE
JP2005524833A (ja) 2002-05-03 2005-08-18 イムニベスト・コーポレイション 分析細胞イメージング用のデバイスおよび方法
US7648678B2 (en) 2002-12-20 2010-01-19 Dako Denmark A/S Method and system for pretreatment of tissue slides
CA2516795C (en) 2003-02-27 2013-01-15 Immunivest Corporation Circulating tumor cells (ctc's): early assessment of time to progression,_survival and response to therapy in metastatic cancer patients
EP1604040B1 (en) * 2003-03-07 2010-10-13 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process
WO2004083386A2 (en) 2003-03-13 2004-09-30 A.L. Tech Biomedical, Inc. Methods of making repetitive sequences removed probes and use thereof
EP1626732B1 (en) * 2003-05-22 2013-04-03 CHIESI FARMACEUTICI S.p.A. Means for preventing and treating cellular death and their biological applications
CA2539108A1 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Immunivest Corporation Operator independent programmable sample preparation and analysis system
DE102005006237A1 (de) * 2005-02-10 2006-08-24 Henkel Kgaa Verfahren zur Bestimmung von Keimen
EP1722230A3 (en) 2005-04-27 2009-05-27 MPB MelTec Patent- und Beteiligungsgesellschaft mbH Method for detection of a disease-specific combinatorial molecular pattern motif in a tissue sample of a patient's skin
CA2623405C (en) 2005-09-20 2014-11-25 Immunivest Corporation Methods and composition to generate unique sequence dna probes labeling of dna probes and the use of these probes
US7659978B2 (en) * 2006-10-19 2010-02-09 Chemimage Corporation Photobleaching by high power pulses

Also Published As

Publication number Publication date
US9134237B2 (en) 2015-09-15
US20090029378A1 (en) 2009-01-29
DK2169387T3 (en) 2015-05-26
HK1140820A1 (en) 2010-10-22
CA2674187C (en) 2017-09-12
KR20100012847A (ko) 2010-02-08
BR122018015761B1 (pt) 2019-10-22
ES2542061T3 (es) 2015-07-30
EP2169387B1 (en) 2015-04-22
HUE026779T2 (en) 2016-07-28
BR122018015761B8 (pt) 2021-07-27
KR20170094523A (ko) 2017-08-18
CN101672779B (zh) 2016-01-06
EP2169387A3 (en) 2011-03-09
CA2975186A1 (en) 2010-01-29
JP2010029187A (ja) 2010-02-12
JP6109464B2 (ja) 2017-04-05
IL199798A (en) 2014-08-31
MX2009008060A (es) 2010-07-01
IL199798A0 (en) 2010-05-17
CA2674187A1 (en) 2010-01-29
KR101764597B1 (ko) 2017-08-03
EP2169387A2 (en) 2010-03-31
CN101672779A (zh) 2010-03-17
PT2169387E (pt) 2015-06-03
PL2169387T3 (pl) 2015-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0902559A2 (pt) método multiparámetro de alta sensibilidade para análise de evento raro em uma amostra biológica
RU2646498C2 (ru) Способы детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток и способы диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего
US7901950B2 (en) Method for assessing disease states by profile analysis of isolated circulating endothelial cells
AU2007201809B2 (en) Method and quantification assay for determining c-kit/SCF/pAKT status
KR101604649B1 (ko) 혈액 내 순환 흑색종 세포의 자동화된 계산 및 특징화
JP2015505966A (ja) 循環腫瘍細胞を特定するための装置、システム、及び方法
CN102782498A (zh) 用非稀有细胞检测稀有细胞的方法
ES2660131T3 (es) Análisis de la expresión proteica para identificar compuestos genotóxicos
WO2004077021A2 (en) Standardized evaluation of therapeutic efficacy based on cellular biomarkers
CN109187977A (zh) 一种检测her2抗原不同位点的免疫荧光试剂盒及应用
WO2024183369A1 (zh) Cited4和/或metrn在椎间盘退变程度的鉴别诊断中的应用
CN103063849A (zh) 一种同时检测肿瘤相关成纤维细胞和其表达蛋白的方法
WO2010019227A1 (en) Ex vivo therapeutic screening of living bone marrow cells for multiple myeloma
WO2006020936A2 (en) A method for assessing disease states by profile analysis of isolated circulating endothelial cells
CN110702904A (zh) 特定凝集素在制备用以鉴别肺癌分期的测试工具方面的用途以及装置
HK1140820B (en) A high sensivity multiparameter method for rare event analysis in a biological sample
RU2846787C1 (ru) Способ выявления циркулирующих клеток в крови больных раком легкого с помощью проточной цитометрии с использованием опухолеспецифичных ДНК-аптамеров
US20230176061A1 (en) Methods for diagnosing high-risk cancer using polysialic acid and one or more tissue-specific biomarkers
CN110702903A (zh) 特定凝集素在制备用以鉴别肺癌类型的测试工具方面的用途以及装置
CN110702905A (zh) 特定凝集素在制备用以鉴别肺癌的测试工具方面的用途以及装置
Hashmath et al. Methods of Detecting Cell Proliferation
WO2008089266A2 (en) Production of an assay for indicating a cell tissue condition

Legal Events

Date Code Title Description
B03A Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]
B12B Appeal against refusal [chapter 12.2 patent gazette]
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 11A ANUIDADE.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2594 DE 24-09-2020 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.