BRPI0902944A2 - vacinas compreendendo linhagens atenuadas, processo de construção de linhagens atenuadas, vetores vacinais e seu uso no tratamento da salmonelose - Google Patents
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Abstract
Vacinas Compreendendo Linhagens Atenuadas, Processo de Construção de Linhagens Atenuadas, Vetores Vacinais e seu Uso no Tratamento da Salmonelose. A presente invenção revela uma nova alternativa para a prevenção de salmonelose, a partir de mutantes capazes de promover imunização do hospedeiro. Em especial tais mutantes são nulos para os genes himA e himD de IHF e foram testados quanto a atenuação da virulência e capacidade de desencadear resposta imune efetiva e protetora contra a salmonelose, em especial a salmonelose murina. Logo, a presente invenção está destinada a um processo de produção desta linhagem de mutantes atenuados, capazes de promover imunização, a vetores vacinais e vacinas para o tratamento de salmonelose e a seu uso no combate a tal infecção.
Description
Relatório Descritivo
Vacinas Compreendendo Linhagens Atenuadas, Processo deConstrução de Linhagens Atenuadas, Vetores Vacinais e seu Usono tratamento da Salmonelose
Campo da Invenção
A presente invenção revela uma nova alternativa para a prevenção desalmonelose, a partir de mutantes capazes de promover imunização dohospedeiro. Em especial tais mutantes são nulos para os genes himA e himDde IHF e foram testados quanto a atenuação da virulência e capacidade dedesencadear resposta efetiva e protetora contra a salmonelose, em especial asalmonelose murina.
Logo, a presente invenção está destinada a um processo de produçãodesta linhagem de mutantes atenuados, capazes de promover imunização, avetores vacinais e vacinas para o tratamento de salmonelose e a seu uso nocombate a tal infecção.
Fundamentos da invenção
Salmonella
O gênero Salmonella sp pertence à família Enterobacteriaceae e éformado por bacilos gram-negativos, anaeróbios facultativos e geralmenteflagelados (Mastroeni e Maskell, 2006). A classificação sorológica dessabactéria fundamenta-se na identificação de antígenos somáticos (O), flagelares(H) e capsulares (Vi), este último quando presente.
Estudos de hibridação de DNA sugerem a existência de duas espéciesde Salmonella: S. enterica e S. bongori. A espécie S. enterica é subdividida em7 subgrupos, sendo que a grande maioria das sorovariedades patogênicaspara o homem está incluída no subgrupo I (Boyd et al. 1996).
As sorovariedades de S. enterica patogênicas podem causar, emmamíferos, infecções com diferentes graus de gravidade, desde gastroenteriteslocalizadas na mucosa intestinal até infecções sistêmicas graves, dependendoda sorovariedade bacteriana e do tipo de hospedeiro envolvido (Salyer et al.2002; Mizuno et al. 2007).
S. enterica Typhi é o agente causador da febre tifóide, uma infecçãosistêmica grave no homem (Salyers e Whitt1 2002, Sales, 2007). S. enterica Choleraesuis causa infecções sistêmicas graves, principalmente em suínos,embora também possa causar infecções em humanos (Salyers e Whitt, 2002,Sales, 2007). Salmonella enterica Dublin é uma sorovariedade associadaprincipalmente a bovinos. Como S. enterica Thyphi em humanos, asorovariedade Dublin é sempre invasiva e pode causar gastrenterites esepticemia nesses animais (Mizuno et al. 2007).
S. enterica I 4,[5],12:i:- (STi)
No Estado de São Paulo, S. enterica é uma das bactérias maisfreqüentemente associadas a casos de diarréias e/ou infecções sistêmicas empacientes humanos (Sales, 2007).
Entre Janeiro de 1991 a Dezembro de 2000, estudo realizado peloInstituto Adolfo Lutz em São Paulo demonstrou que 8,8% dos isoladoshumanos e 1,6% dos isolados de outras fontes (principalmente de alimentos eanimais) de S. enterica foram identificados como S. enterica I 1,4,[5],12:i:-, umasorovariedade atípica (Tavechio et al., 2004). Fernandes et a/.(2006),demonstraram que S. enterica l,4,[5],12:i:- foi a terceira sorovariedade maisfreqüentemente isolada na ultima década, sendo esta predominante emcrianças com idade entre 1 e 4 anos (revisado por Sales, 2007).
Algumas sorovariedades de S. enterica, como Typhimurium (ST),exibem a habilidade de mudar o tipo de flagelina expresso, fenômeno estedenominado de variação de fase flagelar (revisado por Henderson et al., 1999).S. enterica Typhimurium, por exemplo, expressa dois tipos de proteínasflagelares antigênicas, codificadas pelos genes fliC e fljB, que sãodenominadas na nomenclatura sorológica como "i" e "1,2," respectivamente(Sales, 2007). Isso explica a denominação sorológica de S. entericaTyphimurium como l,4,[5],12:i:1,2. A flagelina FIiC é denominada flagelina defase 1 e a flagelina FIjB de fase 2.Embora S. enteríca I 4,[5],12:i:- (STi) apresente característicassorológicas e fisiológicas semelhantes a S. enteríca Typhimurium (I4,[5],12:i:1,2), não apresenta a variação de fase flagelar característica destaúltima. Ikeda et al. (2001) demonstraram que mutantes de S. enterícaTyphimurium expressando somente o antígeno de fase 2 (FIjB) eramatenuados, enquanto os mutantes que expressavam apenas o antígeno de fase1 (FIiC) eram tão virulentos quanto a linhagem selvagem.
Salmonelose e doença
A Salmonelose é uma das doenças infecciosas mais freqüentes tantoem humanos quanto em outros animais (Salehi et al. 2007). A infecção por S.enteríca inicia-se com a ingestão de água ou alimentos contaminados,particularmente alimentos derivados de aves e suínos. Estes microrganismossão patógenos intracelulares facultativos e, uma vez ingeridos, apresentam acapacidade de aderir e invadir células da mucosa intestinal, preferencialmentecélulas M (Jones et al., 1994). Uma vez ultrapassada a mucosa intestinal, S.enteríca invade, persiste e prolifera no interior de vacúolos de células dosistema retículo endotelial podendo assim, alcançar diferentes órgãos e tecidosdo hospedeiro, causando infecção sistêmica (Salyer e Whitt1 2002). Estasinfecções representam, ainda hoje, um grave problema de saúde pública,devido sua alta incidência e gravidade, principalmente em áreassubdesenvolvidas do mundo, onde as condições de higiene e saneamentobásico são ainda precárias (Hofer e Reis, 1994; Boyle et al., 2007).
No Brasil, a salmonelose é um problema muito sério especialmentedevido à qualidade precária do saneamento básico em regiões mais pobres efalta de noções sobre higiene pessoal e com o manuseio de alimentos(Fernandes etal. 2006, Ghilardi et ai, 2006).
A dose infectante média (DI5o) de S. enteríca capaz de produzirinfecções clínicas ou subclínicas em humanos está entre 105-IO10 organismosingeridos. O processo infeccioso é localizado no íleo, cólon e Iinfonodosmesentéricos e comumente manifesta-se dentro de 12-72 horas após aingestão de alimento contaminado, com o aparecimento de diarréia, vômito edores abdominais (Santos et ai, 2001). A maioria dos casos de gastroenteritesocorre em crianças com menos de 10 anos de idade, e os sintomas tendem aser mais severos neste grupo, podendo a infecção tornar-se sistêmica.
Uma importante barreira encontrada por S. enterica no processoinfeccioso, após sua passagem pelo epitélio intestinal, são os macrófagos dasubmucosa. (Sano et al., 2007). Estes detectam e internalizam o patógenobacteriano a fim de eliminá-lo do hospedeiro.
As sorovariedades de S. enterica, capazes de causar infecção sistêmica,invadem os macrófagos, através de macropinocitose, e então ativam mecanismos de virulência que permitem a evasão das funções microbicidas dofagócito, permitindo a sobrevivência e replicação no ambiente intracelular(Alpuche-Aranda, et al., 1994, Sales, 2007). A migração de macrófagosinfectados para outros órgãos do sistema monocítico fagocitário facilita adisseminação da bactéria no hospedeiro.
Salmonella e Vacinas
A busca por uma vacina efetiva contra a febre tifóide compõe umimportante capítulo na historia da Microbiologia. Várias estratégias eformulações vacinais foram testadas tais como bacterinas, vacinas desubunidades e linhagens vivas atenuadas (revisado por Guzman et al., 2006). O antígeno capsular Vi purificado, livre ou conjugado com proteínascarreadoras é imunogênico quando administrado por via intramuscular ousubcutânea e tem se mostrado eficaz em alguns estudos (Guzman et ai, 2006;Strugnell e Wijburg, 2006). Contudo, devido a suas características e modo deadministração, é incapaz de induzir o sistema imune ao nível de mucosa(MALT, do inglês mucosal associated Iymphoid tissue). Desta maneira,esforços foram canalizados no desenvolvimento de vacinas constituídas porlinhagens vivas atenuadas, ideais para induzir resposta imune ao nível doMALT.
A primeira vacina viva atenuada desenvolvida contra a febre tifóide écomposta pela linhagem S. enterica Typhi Ty21a. Esta linhagem foi obtida pormutagênese química da linhagem parental Ty2 (Germanier e Fürer, 1983). Estavacina oral é segura, mas devido a sua grande atenuação, requer várias dosespara induzir imunidade, que freqüentemente é de curta duração (Guzman et aí.,2006; Strugnell e Wijburg, 2006). Não obstante, a linhagem Ty21a compõe aúnica vacina viva atenuada contra a febre tifóide licenciada para uso emhumanos, comercializada com o nome de Vivitof pela Bernabiotech Ltd daSuíça (Strugnell e Wijburg, 2006).
Os resultados alcançados com a linhagem Ty21a levaram vários gruposa construírem novas linhagens vacinais de S. enterica, contendo deleções emgenes alvo específicos que atenuaram a virulência. Adicionalmente, essaslinhagens apresentam uma característica fundamental para vacinas vivas, aestabilidade da atenuação, uma vez que a mesma foi alcançada por deleção deum ou mais genes (revisado por Guzman et ai, 2006). Esses mutantes foramconstruídos inicialmente em S. enterica Typhimurium, devido à disponibilidadedo modelo murino de infecção, sendo as mutações promissoras transferidaspara linhagens de S. enterica Typhi, muitas vezes a própria Ty2 (revisado porGuzman et ai., 2006). Sendo assim, linhagens AaroA, AaroC, AaroD de S.enterica, deficientes na via biossintética dos aminoácidos aromáticos (Tacket etal., 1997), mutantes Acya Acrp, incapazes de expressar adenilato ciclase e oreceptor para cAMP (Tacket et ai., 1997), mutantes phoP-phpQ (Hohmann etal., 1996) entre outros, foram construídos e demonstraram-se imunogênicos,apesar da atenuação da virulência. No entanto, com freqüência, testes emvoluntários humanos indicaram a ocorrência de bacteremia e/ou a necessidadede várias doses para a indução de imunidade (Guzman et ai., 2006; Strugnell eWijburg, 2006). De fato, diversos estudos têm demonstrado o desafio de seajustar o grau de atenuação da linhagem vacinai para, de um lado, nãocomprometer a resposta imune e de outro, ser livre de efeitos colaterais. Destaforma, apesar de todos os esforços, ainda não existe uma formulação vacinaitotalmente efetiva na proteção contra a febre tifóide.
A capacidade de invadir, sobreviver e proliferar no interior demacrófagos, polimorfonucleares e células dendríticas, aliada à disponibilidadede mutantes atenuados fazem de S. enterica um excelente carreador deantígenos a células do sistema imune. Assim, linhagens atenuadas de S.enteríca podem ser manipuladas geneticamente de tal forma a expressarantígenos heterólogos, construindo-se linhagens vacinais multifatoriais.Diferentes antígenos derivados de outras bactérias, vírus, fungos, parasitas emesmo de células de mamífero foram expressos em linhagens vacinais de S.enteríca. Estas linhagens foram capazes de induzir resposta imune protetoranão somente contra a Salmonelose, mas também contra o organismo doadordo antígeno heterólogo (Cheminay e Hensel, 2007; Kwon et ai, 2007; Loessneret ai, 2007; Mahoney et ai, 2007; Atkins et ai, 2006). Uma característica fundamental de tais linhagens é, além da impossibilidade de reversão daatenuação, discutida anteriormente, a capacidade de expressar o antígenoheterólogo de forma estável e em quantidades suficientes para induzir osistema imune.
No início, a clonagem e expressão de antígenos em S. enteríca eramalcançadas através da utilização de plasmídios carregando genes deresistência a antibióticos (Cárdenas e Clements, 1992). Alguns estudosdemonstraram, no entanto, que na ausência de pressões seletivas, taisplasmídios eram instáveis e, portanto, perdidos após poucos ciclos dereplicação in vivo (Cárdenas e Clements, 1992; Dunstan et ai, 2003) ou até mesmo durante o cultivo in vitro (Everest et ai, 1995).
Para resolver tais problemas, estratégias como a utilização depromotores induzidos in vivo no controle de expressão do antígeno (Cheminaye Hensel, 2007; Marshall et ai., 2000), construção de sistemas letaisbalanceados (Curtiss et ai., 1990; Everest et ai, 1995) ou a integração do gene heterólogo no cromossomo de S. enteríca (Hone et ai., 1988; Strugnell et al.,1990; Everest et ai., 1995) foram descritos.
IHF e o nucleóide bacteriano
Bactérias contêm proteínas do tipo histona-like que compõem onucleóide bacteriano juntamente com o DNA cromossômico. Diferente dashistonas de eucariotos, as "histonas" bacterianas parecem não formar com oDNA complexos análogos aos nucleossomas (Thanbichler et al., 2005). Dentrodeste grupo encontram-se 12 proteínas bacterianas que foram descritas comohistone-like ou nucleoid-associated (Mangan et ai, 2006). Dentre as proteínasdessa categoria, as mais bem estudadas são HU1 FIS, IHF1 HNS e DPS (Drlica,1997; Mangan et ai, 2006, Cróinín e Dorman et al, 2007).
A proteína IHF é um heterodímero sendo composta pelas subunidades α(IHF-α) e β (IHF-β), que são polipeptídios termoestáveis presentes na célulabacteriana em quantidades eqüimolares e codificados pelos genes himA ehimD, respectivamente. A expressão de IHF é aumentada na fase estacionáriade crescimento e vários genes importantes para a sobrevivência bacteriananesta fase estão sob o controle positivo do mesmo (Ishihama, 2000). Apesar deapresentar menor afinidade de ligação ao DNA se comparada a outrasproteínas Iigantes de DNA1 IHF desempenha importante função biológica (Ali etai, 2001). IHF impõe ao DNA curvaturas de aproximadamente 180° (Lorenz etai, 1999), sendo essa habilidade capaz de induzir importantes alteraçõestopológicas relevantes à organização do nucleóide (Thanbichler et ai, 2005),funcionando assim como cofator em numerosos processos regulatórios(Goosen e van de Putte, 1995).
O sistema de recombinação λ Red
Em bactérias entéricas, a obtenção de recombinantes utilizandomoléculas lineares de DNA é um evento altamente raro, devido à instabilidadeda molécula de DNA linear, que uma vez no interior da célula é rapidamentedegradada pela atividade de nucleases (ExoV) do sistema de recombinaçãoRecBCD. Para contornar esta dificuldade, sistema baseado no uso damaquinaria de recombinação do bacteriófago λ (o sistema λ Red) foirecentemente proposto.
Datsenko e Wanner (2000) descreveram a construção e o emprego deum sistema baseado em λ Red na construção de linhagens mutantes debactérias entéricas. Este sistema é composto pelo plasmídio pKD46 e porplasmídios assessórios, utilizados na construção de cassetes de recombinaçãopor PCR (Datsenko e Wanner. 2000).Durante a busca de anterioridade, o documento US 2004/101531reivindica a deleção dos genes Cya e Crp de Salmonella. Embora a estratégiada presente invenção tenha sido similar, a deleção ocorreu em outro genechamado ihf que conferiu atenuação da bactéria e conseqüente aplicaçãocomo vetor vacinai.
Portanto, pode-se ver que uma estratégia de imunização baseada nosilenciamento gênico de ihf não foi descrita nem sequer sugerida pelo estadoda técnica.
Breve Descrição da Invenção
O emprego de linhagens bacterianas vivas atenuadas comovacina estáhistoricamente associado à indução de resposta imunológica efetiva epersistente. O vetor vacinai constitui de uma bactéria que expressa antígenos(proteínas) de outras espécies de microorganismos obtidos através do métodode DNA recombinante. Estes organismos apresentados ao sistema imune dapessoa ou animal (organismo alvo) estimulam a produção de anticorpos contraa doença de interesse sem que ela cause sintomas ou danos graves aohospedeiro .
Em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona a construçãode mutantes nulos de S. enterica para os genes (himA ou himD) codificadores de IHF (/ntegration host factor) com o intuito de desenvolver linhagensatenuadas quanto a virulência, mas capazes de causar infecção transitória einduzir o sistema imune de forma efetiva, constituindo-se em potenciaislinhagens vacinais.
É um objeto da presente invenção vetores vacinais compreendendo pelomenos uma sequencia capaz de silenciar pelo menos um gene codificador deIHF em uma bactéria patogênica.
É um adicional objeto da presente invenção um processo de produçãode uma bactéria atenuada compreendendo as etapas de:
a) Acredito que este sistema não possa ser patenteado uma vez que éde domínio público e não foi nosso grupo que o desenvolveu, b) trocaalélica do gene codificador de IHF pelo cassete de recombinaçãocompreendendo um gene acessório; e
c) eliminação do gene acessório presente no cassete de recombinação.É um adicional objeto da presente invenção uma bactéria atenuadacompreendendo pelo menos um gene codificador de IHF silenciado em umabactéria patogênica.
É um adicional objeto da presente invenção uma vacina baseada embactérias atenuadas compreendendo pelo menos um gene codificador de IHFsilenciado em uma bactéria patogênica, capaz de induzir e estimular umaresposta imune no hospedeiro vertebrado.
Estes e outros objetos da presente invenção serão mais bem detalhadosde acordo com as figuras e descrição a seguir.Breve Descrição das Figuras
Figura 1 - Gel de agarose 1% mostrando o Cassete de recombinaçãogerado por PCR utilizando os primers himA-í e himA-r.
Figura 2 - Gel de agarose 1% mostrando o produto de amplificação porPCR do gene cat presente em STi607AhimA:cat, STÍ607AhimDicat1ST662AhimA:cat, ST662AhimD:cat com os iniciadores cmDTf e cmDTr.
Figura 3 - Esquema demonstrando a deleção dos genes himA e himD ea posição dos iniciadores himADTf, himADTr, himDDTf e himDDTr.
Figura 4 - Locus himA de STÍ607 seqüenciado com os iniciadoreshimADTf e himADTr. Em amarelo a região que foi preservada e em cinza aregião removida por troca alélica com o cassete de recombinação. Nãoconfundir o esquema de cores com a deleção de himA. No caso da linhagemselvagem STÍ607, o gene himA está intacto.
Figura 5 - Locus do gene himA de STi607A/7/'m>4 seqüenciado com osiniciadores himADTf e himADTr. Em amarelo a região que foi preservada, emazul a posição do iniciados himAf e em verde do iniciador himAr. A região emvermelho corresponde aos sítios FRT presentes no cassete de recombinação.Notem a ausência da seqüência interna do gene himA, em cinza na Figura 4.Descrição Detalhada da Invenção
Os exemplos a seguir não têm o intuito de limitar o escopo da invenção,mas sim de somente ilustrar uma das inúmeras maneiras de se realizar ainvenção.
Bactéria Patogênica
As bactérias patogênicas de acordo com a presente invenção sãobactérias capazes de provocar doenças e/ou morte em seus hospedeiros.Exemplos de bactérias patogênicas incluem, sem limitações, bactérias gramnegativas, em especial membros das famílias Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Francisellaceae, Legionallales, Pseudomonadaeea ouPasteurellaeeae, incluindo os gêneros Salmonella spp., Shigella spp.,Eseheriehia spp., Yersinia spp., e Vibrio spp. Em especial, bactériaspatogênicas da presente invenção são escolhidas dentre as espécies quepossuem em seu genoma pelo menos um gene codificador de IHF, preferencialmente S. enteriea, sorovar Typhimurium (ST662) e outra a variante |4,[5],12:i.-. (STÍ607).
Gene codificador de IHF
O gene codificador de IHF da presente invenção é uma seqüência deDNA que apresenta homologia de pelo menos 80% com pelo menos uma seqüência escolhida dentre himA ou himD.
Bactéria Atenuada
Para efeitos da presente invenção, entende-se como bactéria atenuadauma bactéria patogênica que possui pelo menos um gene codificador de IHFsilenciado.
Por "silenciamento" entende-se um processo de deleção de determinadaseqüência do genoma de uma bactéria. Em especial, o silenciamento foiproporcionado por um cassete de recombinação.
Cassete de recombinação
O cassete de recombinação de acordo com a presente invenção é umcassete compreendendo pelo menos uma seqüência capaz de silenciar pelomenos um gene codificador de IHF em uma bactéria patogênica.O cassete de recombinação é composto por iniciadores, que possuem 2partes contínuas, sendo a primeira uma seqüência de aproximadamente 40bases homólogas ao gene alvo e a segunda aproximadamente 20 baseshomólogas a uma região presente nos plasmídeos a serem utilizados.
As regiões de homologia com o gene codificador de IHF foramselecionadas com base na seqüência do banco de dados do projeto GenomaS. enterica (NC_003197) (Washington University, St. Louis, USA) e escolhidasde modo que fossem próximas aos códons de iniciação e terminação do gene.
O cassete de recombinação compreende ainda genes acessórios, comogenes de resistência a antibióticos.
Processo de Transformação e Recombinação
O processo de recombinação das bactérias da presente invenção é umprocesso que se baseia no sistema de recombinação λ Red. O sistema derecombinação λ Red do bacteriófago λ inclui 3 genes: γ, β e exo (todos15 presentes no plasmídio pKD46), que codificam respectivamente Gam, Bet eExo. Gam inibe o sistema ExoV do hospedeiro, enquanto Bet e Exo promovema recombinação de fragmentos lineares no DNA alvo (Datsenko et aí. 2000). Osplasmídios assessórios contêm genes de resistência a antibióticos (KmR ouCmR) flanqueados por sítios FRT (FLP recombinase recognition targets),formando o módulo de recombinação. Assim, estes plasmídios são utilizadosna criação do cassete de recombinação.
Para a geração do cassete de recombinação, seqüências deaproximadamente 30 pb homólogas ao gene alvo são geradas nasextremidades desse módulo por PCR. Assim, o cassete de recombinação nadamais é do que o módulo flanqueado por seqüências homólogas ao gene alvo.
Para a geração de mutantes, o plasmídio pKD46 é transformado poreletroporação na linhagem hospedeira e os transformantes são submetidos aeletroporação com o cassete de recombinação. A expressão dos genes γ, β eexo irá inibir a degradação da fita linear de DNA e permitir a recombinação docassete a partir do reconhecimento das seqüências FRT. Esta recombinaçãoobedece à homologia de DNA conferida pelas seqüências flanqueadores de talforma que a recombinação irá envolver seqüências homólogas. Osrecombinantes são então selecionados utilizando as marcas de resistênciascarreadas pelo módulo de recombinação. Essas construções permitem umasubseqüente remoção do cassete de resistência pela FLP recombinaseexpressa por um gene plasmídial, no caso o plasmídio pCP20. Desta forma, épossível construir deleções ou inserções de genes em bactérias entéricas,utilizando fragmentos de DNA lineares, gerados por PCR.
Em especial, o processo de transformação da presente invençãocompreende as etapas de:
a) recombinação da bactéria patogênica com um bacteriófago que inibao sistema ExoV do hospedeiro e promova a recombinação defragmentos lineares no DNA alvo;
b) troca alélica do gene codificador de IHF pelo cassete derecombinação compreendendo um gene acessório; e
c) eliminação do gene acessório presente no cassete de recombinação.
Exemplo 1 - Meios de cultura e antibióticos
1.1 -MeioMEM
O meio de cultura para células animais, meio MEM1 foi utilizado segundoformulação fornecida pela NUTRICELL® (Campinas - SP).
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1.3 - Meio Luria Bertani - Agar (LB-ágar).
Para o preparo do meio LB-agar foram adicionados de 1,5 a 2% (w/v) deágar bacteriológico (Difco®) em meio LB. Após o preparo, o meio de cultura foiesterilizado, em autoclave, a 121°C, durante 20 minutos.
1.4 - Meio SOB (Ausubel et ai. 2003).
<table>table see original document page 13</column></row><table><table>table see original document page 14</column></row><table>
Este meio foi esterilizado por autoclavagem conforme descrito acima.
1.6 - Meio Agar Mac Conkey.
<table>table see original document page 14</column></row><table>
Esta solução foi esterilizada por autoclavagem conforme descrito acima.Diluir os sais em água destilada/deionizada esterilizada para 1X:
Adicionar 1 ml de solução MgS04.7H20 1M e 10 mL de solução de glicose20%. Volume final de 1000 mL.
1.8 - Meio mínimo - agar para cultura bacteriana (Ausubel ef. al. 2003)
O meio mínimo-agar foi preparado adicionando-se 2% de agarbacteriológico ao meio mínimo (Ausubel et. al.2003).1.9 - Antibióticos
Os antibióticos ampicilina (100pg/mL), cloranfenicol (25pg/mL),kanamicina (50pg/mL), estreptomicina (50 pg/mL), tetraciclina (50 pg/mL) egentamicina (50 pg/mL), quando requeridos, foram utilizados nasconcentrações descritas em Sambrook e Russell (2001).
Exemplo 2 - Soluções
2.1 - Tampão Salina Fosfatada (PBS) 0,01 M
<formula>formula see original document page 15</formula>
A solução foi a da formulação fornecida pela NUTRICELL® (Campinas-SP).Marcador de peso molecular para ácidos nucléicos
O marcador se peso molecular padrão utilizado foi o GeneRuler™ 1kbDNA Ladder (Fermentas®, São Paulo-SP).
Termociclador e Taq DNA polimerase
As Reações em Cadeia da Polimerase (PCR) foram realizadas notermociclador MJ Research PTC- 200 (Peltier Thermal Cycler, MJ Research,Waltham, MA). Para minimizar a ocorrência de erros foi utilizada enzima TaqDNA polimerase de alta fidelidade (Invitrogem®, São Paulo-SP).Exemplo 3 - Linhagens Bacterianas e Mutaqênese
3.1 - Linhagens bacterianas selecionadas para mutagênese.
Neste estudo foram selecionadas duas linhagens selvagens de S.enterica, uma sorovar Typhimurium (ST662) e outra a variante I 4,[5],12:i.-.(STÍ607), isoladas de pacientes com quadro clínico de salmonelose que deramentrada no Hospital de Clínicas da Faculdade de Medicina da USP de RibeirãoPreto (Sales, 2007).
As amostras selecionadas foram estocadas em glicerol 2,5 M1 segundoprotocolo descrito por Sambrook e Russell (2001).
3.2 - Teste de sensibilidade das linhagens de S. typhimurium aantibióticos.
Foram testadas a susceptibilidade das linhagens selecionadas paraampicilina, kanamicina, cloramphenicol, estreptomicina e tetraciclina. Para isso,foi utilizado o método de microdiluição conforme descrito pelo CLSI (CLSI, 2005).
Neste teste foi possível observar uma Concentração Inibitória Mínima(MIC) inferior a 10pg/mL para os antibióticos ampicilina, cloranfenicol,estreptomicina e tetraciclina e MIC num intervalo de 10-25 pg/mL parakanamicina, para ambas linhagens de S. enterica. Este teste indicou queplasmídios com marcas de resistência a ampicilina e ao cloranfenicol poderiamser utilizados.
3.3 - Sistema utilizado para mutagênese.
A mutagênese dos genes himA e himD foi obtida pelo sistema λ Redconforme descrito por Datsenko e Wanner (2000). Este sistema é constituídodas linhagens e plasmídios demonstrados na Tabela 1.Tabela 1 - Linhagens bacterianas com seus respectivos plasmídiospertencentes ao sistema λ Red.
<table>table see original document page 17</column></row><table>
Extração e purificação de plasmídeos.
Do estoque à -80°C foi retirada uma amostra de cada cepa contendo osplasmídios. A linhagem BW25113/pKD46 foi semeada em meio LB ágarcontendo ampicilina (100Mg/mL); BW25141/pKD3 e BT340/pCP20 foramsemeadas em meio LB ágar contendo ampicilina (lOOpg/mL) e chloramphenicol(25pg/mL); BW25141/pKD4 e BW25141/pKD13 semeadas em meio LB ágarcontendo ampicilina (100pg/mL) e kanamicina (50 pg/mL).
Foram feitas algumas modificações no protocolo sugerido pelofabricante do kit para extração e purificação de plasmídios para a extração depKD46 e pCP20. Para esses plasmídios, a temperatura de incubação utilizadafoi 30° C, uma vez que tais plasmídios contêm origem de replicação termo-sensível. Após a extração, os mesmos foram submetidos à eletroforese em gelde agarose 0,8% (Sambrook e Russell, 2001).
Iniciadores utilizados para gerar os cassetes de recombinação.
Os iniciadores para essa metodologia são compostos de 2 partescontínuas, sendo a primeira uma seqüência de aproximadamente 40 baseshomólogas ao gene alvo e a segunda 20 bases homólogas a uma regiãopresente nos plasmídeos pKD3, pKD4 e pKD13. (Datsenko e Wanner, 2001).
A região utilizada para amplificar a seqüência contida no plasmídio foiselecionada através do programa Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi), baseado na seqüência do plasmídio pKD3(ΑΥ048742) (Datsenko e Wanner1 2001). Desse modo, foram desenhados osiniciadores himA-f. himA-r, himD-f e himD-r, descritos na Tabela 2.
Tabela 2 - seqüência dos iniciadores utilizados para mutagênese
<table>table see original document page 18</column></row><table>
Construção do cassete de recombinação por PCR.
Para a construção do cassete de recombinação foram utilizados osiniciadores descritos anteriormente, para a amplificação de uma região doplasmídeo pKD3. As reações foram realizadas em volume final de 50 μΙ_contendo 20 pmol de cada iniciador, 20 a 30 ng de DNA plasmidial, 1mM decada dNTP, 2U de Taq DNA polimerase e 2 mM de MgCI2 em tampãoapropriado provido com a enzima.
Para a reação de PCR, o DNA plasmidial foi desnaturado poraquecimento a 94° C por 2 minutos, e a amplificação realizada em 35 ciclosconstituída dos seguintes passos: (1) desnaturação a 94° C por 30 segundos;(2) "anelamento" a 56° C por 30 segundos; (3) extensão a 72° C por 1 minuto e30 segundos. Procedeu-se uma extensão final por 5 minutos. O produto daPCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1% (Sambrook e Russell, 2001).
Assim, os primers himA-f, himA-r, himD-f e himD-r foram utilizados paraamplificar uma região de aproximadamente 1,2 Kbp (Figura 1) do plasmídiopKD3. A região amplificada foi utilizada para compor o cassete derecombinação com os genes himA e himD, respectivamente. Por amplificarema mesma região do plasmídio molde ambos os cassetes de recombinaçãopossuem o mesmo tamanho. Desta forma, na Figura 1 está demonstradoapenas o cassete de recombinação gerado por PCR utilizando os primershimA-f e himA-r.Transformação das linhagens de S. enterica Typhimurium com oplasmídeo pKD46.
A transformação das linhagens selecionadas com o plasmídeo pKD46foi realizada por eletroporação, seguindo protocolo descrito em Ausubel et al.(2003). O eletroporador (Eletroporador Bio Rad. Gene Puiser II, Hercules - CA,USA) foi ajustado para 1,5 KV1 25 pF e 200 ohms. Para tal finalidade, foramutilizadas cubetas de 0,1 cm. Após 2 horas de incubação em meio SOC, asamostras submetidas a eletroporação foram plaqueadas em meio LB ágarprovido de ampicilina (100 pg/mL) e incubadas à 30°C durante a noite.
A presença deste plasmídio foi avaliada pela análise do perfil plasmidialpor eletroforese em gel de agarose. Das colônias crescidas foram selecionadastrês de cada linhagem para a continuidade do experimento, sendodenominadas linhagem STi607/pKD46 e linhagem ST662/pKD46. As linhagensselecionadas foram estocadas em glicerol 2,5M segundo protocolo propostopor Sambrook e Russell (2001).
Troca alélica dos genes himA e himD pelo cassete de recombinação.
Para a etapa de recombinação gênica foram utilizadas as linhagensSTi607/pKD46 e ST662/pKD46, como descrito anteriormente, e o cassete derecombinação gerado por PCR.
O preparo das células competentes foi feito partindo-se de um pré-inóculo em tubo de polipropileno de 15 mL contendo 5 mL de meio LB comampicilina (100 pg/mL), que foi incubado durante a noite à 30° C sob agitação(150 rpm). Desta cultura, foi retirado 0,4 mL que foi inoculado em 40 mL demeio LB com o mesmo antibiótico, na mesma concentração e 1mM de L-arabinose (Sigma), usado como indutor da expressão dos genes γ, β, e exo,sendo esta nova cultura crescida à 30° C sob agitação (150 rpm) até atingirD.06oo de 0,7. Os frascos foram resfriados em banho de gelo por 15 minutos eentão as culturas foram centrifugadas por 10 minutos à 5000 g (4o C). Oprecipitado foi ressuspendido em 4 mL de água deionizada esterilizadapreviamente resfriada a 4o C e centrifugado novamente nas mesmascondições. Esta etapa de lavagem foi repetida 3 vezes. O sedimento formadoapós a última lavagem foi ressuspendido em 400 μΙ_ de glicerol 10% gelado(Sambrook e Russell, 2001) e distribuído em alíquotas de 90 μΙ_ em tubos demicrocentrífuga.
Foram selecionados 3 tubos contendo as alíquotas aos quais foramadicionados 10 pL do produto gerado pela PCR; esses foram colocados emgelo por 1 minuto. O eletroporador foi ajustado para 1,5 KV1 25 pF e 200 ohmse as amostras eletroporadas e recolhidas em meio SOC1 onde foram incubadasà 37° C por 2 horas e posteriormente plaqueadas em meio LB-ágar provido decloramphenicol (25pg/mL). As culturas foram incubadas durante a noite à 37°C. Das colônias crescidas, foi selecionada uma de cada linhagem para acontinuidade do experimento, sendo denominadas linhagens STi607/7/'m>4cmR,STi607/7/mDcmR, ST662/7/'/r7/AcmR e ST662ft/mDcmR As colônias selecionadasforam estocadas em glicerol 2,5M segundo protocolo proposto por Sambrook eRussell (2001).
Eliminação do gene cat de resistência ao antibiótico.
Para a eliminação do gene de resistência ao antibiótico, foram utilizadascélulas competentes preparadas das linhagens STÍ607himAxat,STi607himD.cat, ST662himA:cat e ST662himD:cat, como descritoanteriormente, e o plasmídeo pCP20. A eletroporação foi feita conformedescrito anteriormente e os transformantes foram selecionados em placas deLB-agar com ampicilina (100pg/mL). As placas foram incubadas durante a noiteà 30° C. Das colônias crescidas foi selecionada uma de cada amostra, sendodenominadas STi607AhimA, STi607A/7/'mD, ST662AhimA e ST662àhimD.Estas linhagens foram estocadas em glicerol 2,5M como descrito anteriormente(Sambrook e Russell, 2001).
Exemplo 4 - Detecção e caracterização das mutações em himA e himD por PCR.
Detecção do gene cat
O gene cat (chloramphenicol acetyl transferase) nos mutantes de S.enterica foi inicialmente detectado por PCR, antes da eliminação do cassete derecombinação. Foi desenhado um par de iniciadores internos a este gene,tendo-se como base a seqüência do plasmídio pKD3 (AY048742) (Datsenko eWanner, 2001) e constituinte do cassete de recombinação. Estes foramdesenhados com o software Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). Estes iniciadores são mostrados na Tabela 3.
Tabela 3 - Seqüência dos iniciadores utilizados para detecção do gene cat<table>table see original document page 21</column></row><table>
As reações foram realizadas em volume final de 50 μΙ_ contendo 20 pmolde cada iniciador, 20 a 30 ng de DNA genômico de cada transformante, 1mMde cada dNTP1 2U de Taq DNA polimerase e 2 mM de MgCI2 em tampãoapropriado provido com a enzima.
Para a reação de PCR, o DNA genômico foi desnaturado poraquecimento a 94° C por 2 minutos e a amplificação realizada em 35 ciclosconstituída dos seguintes passos: (1) desnaturação a 94° C por 30 segundos;(2) "anelamento" a 55° C por 30 segundos; (3) extensão a 72° C por 1 minuto.Procedeu-se uma extensão final por 5 minutos. O produto da PCR foi analisadopor eletroforese em gel de agarose 1% (Sambrook e Russell, 2001). Observa-se na Figura 2 que as linhagens STÍ607 e ST662 não apresentaramamplificação para esse gene. Todas as linhagens mutantes apresentaram omesmo perfil eletroforético.
Detecção das mutações por iniciadores externos aos genes himA e himD
Foram construídos dois pares de iniciadores externos aos genes himA ehimD para a detecção de sua mutagênese (Tabela 4). Esses foramdesenhados com o software Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi), baseado na seqüência de S. entericaTyphimurium LT2 (NC_003197).Tabela 4 - Seqüência dos iniciadores externos aos genes himA e himD.
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Caracterização das mutações por Seqüenciamento de DNA
O seqüenciamento de nucleotídeos foi feito utilizando o Kit ETTerminator e o Seqüenciador MegaBace (GE Healthcare Life Science),seguindo-se a metodologia descrita pela Rede Nacional de Seqüenciamento(BRGENE) para Chromobacterium violaceum (Vasconcelos et al., 2003) eMycoplasma sp (Vasconcelos et al., 2005).
Para montagem dos contigs foi utilizado o programa ChromasPro versão1.34 (http://www.technelysium.com.au/ChromasPro.html). As seqüências forampreparadas, alinhadas e comparadas entre si e com seqüências deTyphimurium depositadas no banco de dados, para verificar a ocorrência demutações.
Transdução com bacteriófago P22.
Este passo foi realizado uma vez que a seleção de recombinates de S.enterica por eletroporação muitas vezes seleciona para linhagens contendoLPS incompletos que são mais facilmente transformáveis, mas são muito maissensíveis ao sistema imune e incapazes de estabelecer uma infecção sistêmicaem camundongos.
As linhagens STi607/j/'mAcaf, ST\607himD:cat, ST662himA:cat eSTQ62himD:cat foram incubadas em 3 mL de meio LB com cloranfenicol (25pg/mL) por 8 horas a 37° C, quando 1 ml de solução contendo o bacteriófagoP22 (5x106 pfu/mL) foi adicionado. O inoculo com P22 foi incubado durante anoite à 37° C e agitação de 150 rpm.
No dia seguinte, a cultura foi centrifugada por 2 vezes a 10000g por 5minutos e o sobrenadante recolhido. Ao sobrenadante foram adicionadas 3gotas de cloroformio. A solução foi armazenada a 4o C.As linhagens STÍ607 e ST662 foram crescidas em meio LB até queatingissem D.O.eoo igual a 0,7 e então em 100 μΙ_ dessa cultura foramadicionados 10 μί de suspensão de P22 de tal forma que a linhagem STÍ607foi incubada com partículas de P22 proveniente de culturas de ST\607himA.catou STi6Q7himD.cat e ST662 incubada com P22 de ST662himA:cat ouST662himD:cat. As culturas foram então incubadas por 20 minutos a 37° C1para a adsorção do bacteriófago e semeadas em LB-agar contendocloranfenicol. Estas novas culturas foram incubadas a 37° C durante a noite.
No dia seguinte algumas colônias foram selecionadas e testadas porPCR usando os iniciadores para detecção do gene cat nas condições descritasanteriormente.
Exemplo 5 - Caracterização dos mutantes himA e himD de S. enterica
Testes Fenotípicos
Para caracterizarmos alguns fenótipos das linhagens mutantesassociados à virulência bacteriana, realizamos uma bateria de ensaios in vitro ecomparamos os fenótipos que poderiam contribuir para virulência in vivo.
Os mutantes derivados de S. enterica 4,[5],12:i:- e Typhimurium foramcomparados com as respectivas linhagens selvagens, utilizadas como padrão.
5.1 - Curva de crescimento in vitro.
As linhagens STI607AhimA1 STi607A/i/'mD, SJ662AhimA e ST662AhimDforam inoculadas em 5 ml_ de meio LB e incubadas à 37° C durante a noite. Nodia seguinte, 1 mL do inoculo foi adicionado à 100 mL de meio LB e a novacultura incubada à 37° C sob agitação (150 rpm), sendo retiradas alíquotas acada hora, durante seis horas. De cada alíquota foi medida a densidade ópticaem comprimento de onda 600nm (D.O.600)
O experimento foi realizado 2 vezes e uma média desses valorescalculada sendo utilizadas no preparo de gráficos para melhor visualização eanálise dos resultados.
Observou-se que a linhagem ST\607àhimA apresenta um crescimentoum pouco mais lento que STÍ607 porém as diferenças foram estatisticamentesignificativas (P £ 0,05). Quando observamos o crescimento de STi607A/7/mDem relação à selvagem, a diferença é notavelmente grande no períodoobservado também com P £ 0,05.
As linhagens ST662àhimA e ST662àhimD apresentam crescimentobastante parecido, porém mais lento quando comparados à linhagem selvagemST662. A diferença encontrada entre o crescimento de ST662àhimA eST662AhimD não foi estatisticamente significante (P > 0,05), porém ambos osmutantes apresentaram significativa diferença em termos de crescimento emrelação à ST662 (P<0,05), para o intervalo de crescimento analisado
Todas as linhagens chegam à fase estacionária de crescimento5.2 - Resistência das linhagens transformantes a Reativos Intermediáriosdo Nitrogênio
A resistência das linhagens mutagenizadas bem como das selvagens aradicais intermediários do nitrogênio foi testada pela capacidade decrescimento destas na presença de nitrito de sódio em meio acidificado (NSA),o qual gera intermediários reativos do nitrogênio, incluindo ácido nitroso e oxidonítrico (Lu et al, 1999).
Para tanto, foram adicionados 20 μΙ de cultura em fase estacionária emdois tubos contendo 2ml de meio LB1 pH 5,0, sendo que um deles continhanitrito de sódio 20mM (Stuehr et al., 1989; Taylor et al., 1927). Os isoladosforam incubados a 37°C sob agitação (200rpm). Amostras dessas culturasforam coletadas nos tempos 0, 3 e 6 horas, e diluições foram plaqueadas emmeio McConkey para determinação da UFC. As colônias foram contadas no diaseguinte, e a razão de sobrevivência de S. enterica determinada nos diferentestempos, comparando-se com a UFC do controle sem nitrito de sódio.
As linhagens STi mutantes e a selvagem apresentaram sensibilidadeigual aos Reativos Intermediários do Nitrogênio (RNI). Após 3 horas de cultivona presença de NSA (Nitrito de Sódio em meio Acidificado) todas as linhagensapresentaram redução próxima de 50% no número de células quandocomparado ao inoculo inicial. Após 6 horas de cultivo, todas as culturaspraticamente não apresentavam células viáveis.No caso das linhagens ST1 observou-se uma diferença significativa(P<0,05) entre ST662AhimD e as demais linhagens ST já em 3 horas decultivo, diferença que persistiu ao longo do experimento. Diferença de menormagnitude também foi observada quando a linhagem mutante ST662AhimA foicomparada com a selvagem ST662.
5.3 - Resistência das linhagens transformantes a Reativos Intermediáriosdo Oxigênio
A resistência à morte pelos intermediários reativos do oxigênio (ROI)está associada com o aumento da virulência em S. enterica Typhimurium (DeGroote et ai, 1995; De Groote et ai, 1996 e Nathan et ai, 1991).
A resistência dos diferentes isolados a ROI foi testada pela capacidadede crescimento das amostras na presença de paraquat (N1N1-DimethyI-M'-bipyridinium dichloride). Esse composto é facilmente reduzido a íons reativosgerando radicais superóxidos que reagem com lipídios não-saturados damembrana.
As linhagens bacterianas foram inoculadas em 3 mL de meio LB eincubadas durante a noite a 37°C sob agitação (200rpm). Uma alíquota deIOOpL do inoculo foi semeada em 10 mL de meio LB e a cultura incubada a 37°C sob agitação (200rpm) até atingir D.0.6oo igual a 0,7, quando foram feitasdiluições seriadas até a quantidade de 106 bactérias/mL, que foram inoculadasem placas de meio mínimo (Sambrook e Russell, 2001). A resistência dasbactérias ao peróxido de hidrogênio foi analisada conforme descrito por DeGroote et ai (1996). Brevemente, discos de papel de filtro foram impregnadoscom 30μΙ de paraquat (1,9%) e colocados no centro de placas de meio mínimojá inoculadas com as linhagens bacterianas. As culturas foram incubadasdurante a noite a 37°C e os diâmetros das zonas inibitórias foram medidos emcentímetros e os valores utilizados na confecção de gráficos.
A linhagem STi607A/7/'mD apresentou maior sensibilidade ao paraquatquando comparada com STÍ607. Testes estatísticos demonstraram que taisdiferenças são estatisticamente significantes (P<0,05). STi607A/?/>77/\ nãoapresentou diferença significativa em relação à linhagem selvagem quanto aresistência ao paraquat. No caso de ST662, diferenças estatisticametnesignificativas foram observadas apenas entre a linhagem selvagem e o mutanteAhimD.
5.4 - Determinação da Dose Letal Média (DL5o) por via oral em
Camundongos
Para determinação da DL50 por via oral, as linhagens STÍ607,STi607A/7/'mA STi607A/7/'mD, ST662, ST662àhimA e ST662AhimD foramcultivadas em meio LB-glicose 2% a 37°C, sob agitação (200 rpm), durante anoite. No dia seguinte, 0,2mL dessas culturas foram inoculados em 20mL de meio LB-glicose e incubado a 37°C sob agitação (200rpm) até que atingissemD.O.600 igual a 0,7. As células foram sedimentadas por centrifugação (5000gpor 5 min) e lavadas no mesmo volume de tampão salina-fosfato (PBS, pH7,4).Este passo foi repetido uma segunda vez e o sedimento ressuspenso em PBS(mesmo volume inicial). Diluições seriadas foram preparadas em PBS e usadaspara infectar camundongos BALB/c fêmea de 6 a 8 semanas. As diluiçõesforam plaqueadas em meio McConkey-ágar (Oxoid, Cambridge, UK) para adeterminação da UFC. O inoculo via oral foi feito utilizando agulha de gavagemmodelo IC800 (INSIGHT, Ribeirão Preto-SP, Brasil).
A quantidade de bactérias inoculadas variou de acordo com cada grupo,sendo variáveis, em escala logarítimica de base 10, de 107 à 102 UFC/mL,sendo utilizados cinco camundongos por diluição. Os animais foramacompanhados por 30 dias após o inoculo.
Os valores de DL50 por via oral em camundongos BALB/c, calculadospelo método "Moving Average Interpolatiori' (Welkos e 0'Brien, 1994) para aslinhagens de S. enterica mutantes e selvagens estão descritos na Tabela 5. Asdoses selecionadas para inóculo foram baseadas nos resultados de DL5Oobtidos pela via intraperitonial de inoculo, porém observa-se que os valores deDL50 relacionados à administração bacteriana por via oral são superiores aDL50 por via intraperitoneal (Tabela 6), resultado este já esperado. As dosesletais médias por inoculo via oral para ambos os mutantes não foram atingidascom as CFUs utilizadas no experimento, ficando superiores à 107 para himA e108 para himD.
Tabela 5- DL50 de linhagens de S. enterica inoculadas por via oral emcamundongos BALB/c
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5.5 - Desafio via oral.
A capacidade de desencadear resposta imune contra S. enterica foitestada em dois momentos: No primeiro, os animais foram imunizados comuma única dose de S. enterica e desafiados 28 dias após a mesma, sendo asdoses de imunização dos mutantes para o gene himA iguais a 106, 105 e 104UFC e para himD 1071 106 e 105 UFC. Em um segundo experimento, animaisforam imunizados oralmente com duas doses das linhagens mutantes nos dias0 e 14 e desafiados com a linhagem selvagem no 28° dia após a primeira dose.A dose (CFU) utilizada foi de 107 para os mutantes de himA e 108 para himD,doses estas estabelecidas a partir dos resultados da DL5O- Os animais foramdesafiados com doses de 106 CFU/mL de linhagem ST662 e 107 CFU/mL deSTÍ607.
Para estes experimentos foram utilizados 7 camundongos BALB/cfêmeas com 6 a 8 semanas de idade por grupo. Os animais foramacompanhados por 30 dias após o desafio e avaliados quanto à suasobrevivência
As linhagens STÍ607, STi607AhimA, STi607AAhmD, ST662,ST662AhimA e ST662AhimD foram cultivadas como descrito anteriormente.Observou-se que todos os camundongos imunizados com uma únicadose de 105 ou 106 UFC da linhagem STi607AÂ7^himA sobreviveram quandodesafiados com doses letais (107 CFU/mL) da linhagem selvagem STÍ607, 30dias após a imunização. Quando imunizados com 104 UFC de STÍ607AhimA,66% dos animais sobreviveram ao desafio.
Os resultados obtidos com a linhagem STi607A/7/mD indicaramsobrevivência de 100% dos camundongos imunizados com 107 UFC1 enquantoos grupos imunizados com 106 e 105 UFC apresentaram 33% de sobrevivência,após 30 dias.
Os grupos imunizados com a linhagem ST662AhimA, nas doses 106 e105 CFU1 apresentaram sobrevivência de 66% dos animais. Na dose de 104CFU1 a porcentagem de 33% dos animais sobreviveu, após 30 dias.
Nas imunizações com ST662AhimD, apenas os animais que receberamdoses de 107 CFU sobreviveram ao desafio com linhagem selvagem, à umataxa de 66%, após 30 dias de experimento. Os demais grupos, apesar deterem o tempo de vida prolongado, morreram após 20 dias do desafio. Todosos grupos os animais tratados com placebo, inoculados com PBS, morreramentre o 5o e o 10° dia após serem desafiados com as linhagens selvagens.
5.6 - Determinação da Dose Letal Média (DL50) intraperitonial emcamundongos
Para determinação da DL50 intraperitonial, as amostras STÍ607,STi607A/7/'mA STi607A/7/'mD, ST662, ST662AhimA e ST662AhimD foramcultivadas em meio LB-glicose 2% a 37°C, sob agitação (200 rpm), durante anoite. No dia seguinte, 0,2mL dessas culturas foram inoculados em 20mL demeio LB-glicose e incubado a 37°C sob agitação (200rpm) até que atingissemD.0.6oo igual a 0,7. As células foram sedimentadas por centrifugação (5000gpor 5 min) e lavadas no mesmo volume de tampão salina-fosfato (PBS, pH7,4).
Este passo foi repetido uma segunda vez e o sedimento ressuspenso em PBS(mesmo volume inicial). Diluições seriadas foram preparadas em PBS e usadaspara infectar camundongos BALB/c fêmea de 6 a 8 semanas. As diluiçõesforam plaqueadas em meio McConkey-ágar (Oxoid, Cambridge, UK) para adeterminação da UFC. Os camundongos foram infectados via intraperitonialcom O1ImI das suspensões bacterianas com seringas de 1 ml_ e agulhasapropriadas 0,45mm. Foram inoculadas doses que variaram, em escalalogarítmica de base 10, de 109 à 102 UFC/mL, sendo utilizados trêscamundongos por diluição. Os animais foram acompanhados por 30 dias apóso inoculo.
Os valores de (DL50), em camundongos inoculados pela viaintraperitonial, calculados pelo método "Moving Average Interpolatiorí' (Welkose 0'Brien, 1994) são demonstrados na Tabela 6. Observa-se que a DL50 das amostras selvagens ficaram em torno de 103 UFC enquanto das linhagensmutantes para o gene himA em torno de 105 e para os mutantes himD em tornode 106.
Tabela 6 - DL50 em camundongos BALB/c inoculados pela via intraperitonial.
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5.7 - Desafio via inoculação intraperitonial
Igualmente aos estudos realizados por desafio via oral, foramconduzidos experimentos para verificar se camundongos inoculados comdoses não letais das linhagens mutantes adquiriam resistência quandodesafiados com doses letais da linhagem selvagem por via intraperitoneal. Paraisso, as linhagens foram cultivadas e processadas conforme descritoanteriormente. Diluições seriadas foram preparadas em PBS e usadas parainfectar camundongos BALB/c fêmeas de 6 a 8 semanas, conforme descritoanteriormente. Foram injetadas por via intraperitoneal duas doses de 102, 103ou 104 UFC de cada mutante himA e 104, 105 ou 106 dos mutantes himD, comintervalo de 15 dias entre cada dose. Como controle, animais foram injetadoscom PBS. Dez dias após a segunda dose, os animais foram desafiados com104 UFC das linhagens selvagens STÍ607 e ST662, e a sobrevivência foiacompanhada ao longo de 30 dias de experimento. Foram utilizados trêsanimais por tratamento.
Observou-se que 100% dos animais imunizados com doses inferiores àDL50 (103 e 104 células bacterianas) da linhagem STi607A/j/m/\, sobreviveramao desafio com dose letal (3.105 CFU/mL) da linhagem selvagem STÍ607. Osanimais imunizados com a dose de cerca 102 células da linhagem mutante e ocontrole (animais inoculados com tampão PBS), morreram aproximadamenteapós 10 dias de desafiados.
A linhagem STi607A/7//7?D não foi capaz de desencadear uma respostaimune efetiva com as doses ministradas neste experimento. Observou-se que33% dos animais imunizados com as doses mais elevadas (1.104 CFU/mL)sobreviveram ao desafio. Os demais animais morreram no 10° dia do desafioem diante.
Com relação à linhagem ST662, todos os camundongos BALB/cimunizados com as duas doses imediatamente inferiores à DL5O (2,5.104 e2,5.103 CFU/mL) do mutante ST662AhimA sobreviveram ao desafio com doseletal (2.105 CFU/mL) da linhagem selvagem. Grupos imunizados com dosesmais baixas desse mutante apresentaram aproximadamente 33% desobrevivência, enquanto o grupo tratado com placebo não apresentousobreviventes.
Foi possível observar camundongos sobreviventes imunizados com alinhagem ST662AhimD. Após o desafio, todos os animais imunizadospreviamente com doses imediatamente inferiores DL5O (1.105 CFU/mL)sobreviveram, enquanto os imunizados com doses de 104 apresentaram umataxa de sobreviventes de 33%. Os grupos com doses de 103 e PBS nãoapresentaram sobreviventes.
Testes Genotípicos
5.8 - Seqüenciamento de DNA e montagem de contigs.As linhagens selvagens ST662 e STÍ607, assim como as linhagensmutantes foram submetidas ao seqüenciamento das regiões himA e himD nointuito de melhor caracterizar a mutação destes genes. O resultado doseqüenciamento está demonstrado para STÍ607 e STi607Aft/777>4 (Figuras 4 e 5respectivamente). Para melhor visualização, foram destacadas em cores asregiões preservadas e removidas de himA. Na Figura 5 foram destacadas aslocalizações dos inicadores utilizados para gerar o cassete de recobinação. Asdiferenças entre algumas bases das seqüências obtidas e as depositadas embancos de dados foram devido a erros de leitura durante o seqüenciamento.
Além da caracterização molecular das deleções em himA ou himD, aslinhagens mutantes de S. enterica foram caracterizadas quanto a presença dealguns fatores de virulência, para descartar a ocorrência de recombinaçõese/ou deleções em genes importantes patogenicidade.
5.9 - Detecção da presença de genes de virulência em S. enterica
A detecção de alguns genes de virulência de S. enterica cuja PCR jáestá bem estabelecida na literatura foi realizada por esta técnica. A presençados seguintes genes de virulência foi pesquisada: de invasão (invE/A) e demultiplicação in vivo (spvC), este último presente no plasmídio de virulência. Osiniciadores estão descritos na Tabela 5. Foram testadas as linhagens STÍ607,STi607A/7/'m/\, STi607A/7/mD, ST662, ST662àhimA e ST662AhimD.
Tabela 5 - Iniciadores utilizados na detecção de alguns genes responsáveispela patogênicidade de S. enterica.
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Ambos os genes, de invasão (invE/A) e de multiplicação in vivo (spvC),foram identificados tanto nas linhagens selvagens quanto nas linhagensmutantes indicando que após a mutagênese as linhagens não perderammesmos.
Claims (18)
1. Vacina caracterizada por compreender uma linhagem atenuada deuma bactéria patogênica, onde a atenuação corresponde ao silenciamento depelo menos um gene codificador de IHF.
2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela bactériapatogênica ser escolhida do grupo que compreende Enterobacteriaceae,Vibrionaceae, Francisellaceae, Legionallales, PseudomonadaceaPasteurellaceae e combinações dos mesmos.
3. Vacina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela bactériapatogênica ser escolhida dentre Salmonella spp., Shigella spp., Escheriehiaspp., Yersinia spp., Vibrio spp e combinações das mesmas.
4. Vacina, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pela bactériapatogênica ser S. enteriea, sorovar Typhimurium (ST662) e/ou variante I- 4,[5],12:i.-. (STÍ607).
5. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo genecodificador de IHF ser uma sequencia genômica que apresente homologia depelo menos 80% com pelo menos uma seqüência escolhida dentre himA ouhimD.
6. Processo de construção de linhagem atenuada caracterizado porcompreender as etapas de:a) recombinação da bactéria patogênica com um bacteriófago que inibao sistema ExoV do hospedeiro e promova a recombinação defragmentos lineares no DNA alvo;b) troca alélica do gene codificador de IHF pelo cassete derecombinação compreendendo um gene acessório; ec) eliminação do gene acessório presente no cassete de recombinação.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelobacteriófago ser capaz de expressar os genes γ, β e exo.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelocassete de recombinação compreender um iniciador.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado peloiniciador ser composto de uma primeira sequencia homóloga ao genecodificador de IHF e uma segunda sequencia homóloga a uma região presenteno bacteriófago.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelaprimeira sequencia compreender aproximadamente 40 bases.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelasegunda sequencia compreender aproximadamente 20 bases.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo geneacessório ser um gene que confere resistência a antibióticos.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelaeliminação do gene acessório ser realizada por uma enzima.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelaenzima ser uma recombinase.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelarecombinase ser expressa por um gene plasmidial.
16. Vetores vacinais caracterizados por possuir pelo menos um genecodificador de IHF silenciado e ser capaz de estimular uma resposta imunecontra uma infecção por uma bactéria patogênica.
17. Vetores vacinais, de acordo com a reivindicação 16, caracterizadospela resposta imune ser humoral e/ou celular.
18. Vetor vacinai, de acordo com a reivindicação 4, caracterizados porcarrear antígenos, constituído-se linhagens vacinais multifatoriais.
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