BRPI0903089B1 - Peptídeos recombinantes e motivos proteicos miméticos a antígenos de leishmania e suas aplicações - Google Patents

Abstract

peptídeos recombinantes e motivos proteicos miméticos a antígenos de leishmania e suas aplicações. a presente invenção refere-se à seleção, caracterização e utilização de peptídeos recombinantes, suas sequências reversas e motivos proteicos que mimetizam regiões antigênicas parciais de proteínas de leíshmania e antígenos de interesse diagnóstico e vacinal para as doenças causadas por parasitos do gênero leishmania. os peptideos objetos desta invenção foram selecionados por "phage display" e são alvos para utilização em imunodiagnósticos e em composições vacinais para o controle dos diferentes tipos de doença provocados pelos parasitos do gênero acima citado por serem especificamente imunorreativos com o soro de indivíduos infectados.

Description

A presente invenção refere-se à seleção, caracterização e utilização de peptídeos recombinantes, suas sequências reversas e motivos proteicos que mimetizam regiões antigênicas parciais de proteínas de Leishmania e antígenos de interesse diagnóstico e vacinai para as doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania. Os peptídeos objetos desta invenção são alvos a serem utilizados em imunodiagnósticos e em composições vacinais para o controle dos diferentes tipos de doença provocados pelos parasitos do gênero acima citado.

Apesar do progresso no diagnóstico e no tratamento, as leishmanioses continuam sendo um problema de saúde pública, particularmente nos países em desenvolvimento. O impacto das leishmanioses na saúde humana foi grosseiramente subestimado por muitos anos, sendo esta doença hoje classificada como uma das principais doenças negligenciadas pela Organização Mundial de Saúde (Zimmermann S. et al., Protist.- 160:151-8, 2009).

O agente causador das Leishmanioses, Leishmania, é um parasito tripanossomatídeo intracelular obrigatório, que tem um ciclo de vida bifásico consistindo de um estágio promastigoto uniflagelado, que reside dentro do trato digestivo do vetor e um estágio amastigoto, que se multiplica dentro dos fagolissomos de macrófafos de células de mamíferos (Wong A. K. C. Biochem. Cell Biol.; 73:235-40, 1984). Existem 30 espécies de Leishmania das quais 10 ocorrem no Velho Mundo e 20 no Novo Mundo. Todas as espécies do Velho Mundo pertencem ao subgênero Leishmania e sete são conhecidas por infectar o homem. Existem também 11 espécies do mesmo subgênero no Novo Mundo, das quais cinco não são encontradas no homem. Parasitos do subgênero Viannia ocorrem somente no Novo Mundo e das nove espécies conhecidas, oito infectam o homem (Shaw J. J. Mem. Inst. Oswaldo Cruz; 89:471-8, 1994).

Parasitos do gênero Leishmania são transmitidos por picadas de mosquitos do gênero Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomya no Novo Mundo (Desjeux P. H., Clin. Dermatol.; 80:271-4, 1996, Grimaldi G. Tesh R. B., Clin. Microbiol. Rev.; 6:230-50, 1993).

Dependendo da espécie do parasito e da condição imunológica do hospedeiro, as manifestações podem variar de lesões cutâneas crônicas à forma letal da infecção (Murray H. W. et al., Lancet, 366:1561-1567, 2005), apresentando o seguinte espectro de manifestações clínicas: a leishmaniose tegumentar que varia da forma cutânea à mucocutânea (LC e LMC), representando o pólo responsivo para a leishmaniose cutânea difusa (LCD) e a leishmaniose visceral (LV) que abrange a forma subclínica e a doença fatal (Oliveira C. I. et al., Drug. Discov. Today: Dis. Models; 1:81-6, 2004).

A Leishmaniose é um problema de saúde pública e afeta 88 países, sendo 72 classificados como países em desenvolvimento, incluindo 13 dos países menos desenvolvidos. Dos casos de LV, 90% ocorrem em apenas cinco países - Bangladesh, índia, Nepal e Brasil; 90% dos casos de LC ocorrem em apenas sete países - Afeganistão, Algeria, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria. A incidência anual das leishmanioses é de 1,5 a 2 milhões de casos, sendo 1-1,5 milhão para leishmaniose cutânea e 500.000 para a forma visceral; tendo a urbanização como um fator crucial para a incidência (WHO.77?e Weekly Epidemiological Record, 77:365-72, 2002 e www.who.int/tdr/diseases/leish).

A leishmaniose brasileira comportava-se como uma antropozoonose rural, mas, após a década de 80, observou-se sua expansão também para as regiões periurbanas de grandes cidades. Mudanças ambientais causadas pelos humanos têm modificado o perfil epidemiológico das leishmanioses em áreas onde é relacionada com a vida selvagem, assim como em áreas onde a transmissão dá-se em áreas rurais periurbanas ou vizinhança urbana e áreas em volta das casas. Em cada área, a transmissão depende da adaptação das espécies de mosquito (potenciais vetores) a estes ambientes e envolve animais domésticos (L. chagasi, causando a forma visceral da leishmaniose, e L. braziliensis, causando a forma cutânea e mucosa) (Tolezano J. E. et al., Rev. Inst. Adolfo Lutz; 40:49-54, 1980; Marzochi M. C. A. J. Bras. Med.; 63:82-104, 1992; Marzochi M. C. A. et al., Cad. Saude Publica; 10:359-75, 1994).

Várias espécies de mamíferos têm sido reportadas como naturalmente infectadas por Leishmania spp., em áreas endêmicas os cães são considerados os maiores reservatórios da Leishmaniose Visceral Humana (Palatinik-de-Souza, C. B. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 65:510-517, 2001 e WHO, Report of the Second WHO Meeting on Emerging Infectious Diseases, 1995).

O diagnóstico da LV não pode ser baseado somente nos sintomas clínicos porque esta compartilha seus sintomas com outras doenças como a malária, febre tifóide e tuberculose, ocorrendo comumente na mesma área das leishmanioses (Goto Y. et al, Infect. Immun.', 74:3939-45, 2006). Para a LV zoonótica, um diagnóstico rápido e seguro é ferramenta necessária em função da grande variabilidade de sintomas clínicos e da presença de cães assintomáticos, porém infectivos (Dye C et al., Epidemiol Infect.' 103:647-56, 1993). O número de pessoas infectadas assintomáticas é mais alto que o número de pessoas infectadas que apresentam sintomas da doença. Por esta razão, é importante saber como pessoas infectadas vão desenvolver a doença e como elas podem ser diagnosticadas antes de mostrarem as manifestações clínicas (Singh S. et al., J. Parasito/.; 81:1000-3, 1995).

A escolha dos antígenos é importante, pois o uso de antígenos totais ou parasitas inteiros, frequentemente resultam em uma baixa especificidade na detecção de anticorpos específicos para a doença (Reed S. G. et al., J Immunol.', 138:1596-601, 1987).

Nos últimos anos, vários antígenos têm sido caracterizados com a finalidade de melhorar o potencial vacinai e o diagnóstico da leishmaniose humana e canina. O desenvolvimento da reação em cadeia de polimerase e imunoensaios baseados em antígenos recombinantes são destinados a melhorar a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico da Leishmaniose Visceral e diminuir a reatividade cruzada mostrada por antígenos totais (Gomes Y. M. et al., Vet. J.\ 175:45-52, 2008).

O medicamento mais comumente usado, desde a década de 50, é o antimoniato N-metil Glucamina (Glucantime®) e permanece como método de escolha para o tratamento inicial, que apresenta resistência em 10% dos casos. Nessa circunstância, utiliza-se a Anfotericina B, que foi recentemente associada a partículas de lipossomos (partículas lipídicas artificiais), reduzindo os efeitos sistêmicos provocados pelo tratamento (Berman J. D. Clin. Infect. Dis.; 24:684-703, 1997 e Lee M. B. et al., Infect. Med.; 16:34-45, 1999).

Na situação atual, a quimioterapia não tem sido suficiente para o controle zoonótico da leishmaniose visceral e a vacinação necessita ser considerada; o entendimento dos mecanismos imunológicos envolvidos na resistência e susceptibilidade a infecção por Leishmania é fundamental para o desenvolvimento de ferramentas imunoprofiláticas (Rosa R. et al., Vaccine; 25:4525-32, 2007).

Nos últimos anos, a clonagem de DNA e a caracterização de antígenos e proteínas recombinantes derivadas de Leishmania têm sido realizadas, levando a um grande avanço nos métodos diagnósticos e na busca de uma vacina eficaz para a profilaxia das leishmanioses. Alguns desses antígenos são descritos abaixo.

Moléculas como Glicosilfosfatidilinositol (GPI), Glicosilfosfolipídios (GIPL), Lipofosfoglicanos (LPG), Fosfoglicanos (FG), Proteofosfoglicanos (PPG), Leishmaniolisina (gp63) e Cisteína Proteases (CPs), são discriminadas como cruciais para a infecção por Leishmania, mas não produzem nenhuma patologia no hospedeiro (Chang K. P. et al., Kinetoplast. Biol. Dis.; 1:1,2002).

As Proteínas de Superfície de Promastigotos (PSP), também conhecidas como gp63, são glicoproteínas de superfície de membrana que possuem atividade proteolítica, esta proteína é altamente imunogênica, apresentando reatividade cruzada entre as diferentes espécies de Leishmania, embora os anticorpos produzidos por essa molécula não sejam efetores no controle da infecção (Mood S. F. Acta Trop.; 53:185-204, 1993 e Wright E. P. et al., Biochem. Cell Biol.; 525-36, 1989). A expressão diferencial dos genes gp63 resulta em diferentes quantidades da proteína gp63 no desenvolvimento in vitro das formas promastigotas para a forma infecciosa (Ramamoorthy R. et al., J. Biol. Chem.; 267:1888-95, 1992).

Glicoconjugados ligantes de Fucose-Manose (FML) constituem um complexo de proteínas antigênicas de formas promastigostas de L. (L.) donovani que são utilizados em testes sorológicos para diagnóstico, avaliação do prognóstico e controle do calazar humano, além de serem propostos em triagens de doadores de sangue de regiões endêmicas de calazar (Otero A. C. S. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 62:128-131, 2000 e Palatinik de Souza C. B. et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.; 89:390-3, 1995).

O principal componente imunoprotetor da FML é a fração glicoprotéica designada GP36 (Paraguai de Souza E. et al., Vaccine, 19:3014-15, 2001), reconhecido unicamente por soros de pacientes com calazar humano (Palatinik de Souza C. B. et al., Rev. Soc. Bras. Med. Trop.; 29:153-63, 1996). O gene codificante da nucleosídio hidrolase de L. (L.) donovani, que é um componente do antígeno GP36, foi isolado demonstrando que LdNH recombinante é útil no diagnóstico de calazar em cães uma vez que reage preferencialmente com IgG subtipo 1 de imunoglobulina que é aumentado em cães susceptíveis ao calazar e na doença avançada. (Santana D. M. et al., Mol. Biochem. Parasitol.; 120:315-9, 2002).

A clonagem molecular, caracterização e expressão dos antígenos K9 e K26 (Bathia A. et al., Mol. Biochem. Parasito.; 102:249-261, 1999), demonstrou que a K26 (proteína hidrofílica de 247 aminoácidos, contendo 11 repetições de 14 aminoácidos, 64% da proteína total) é um marcador diagnóstico altamente específico para avaliar a infecção no soro de indivíduos com leishmaniose visceral.

O antígeno denominado KMP-11 (principal determinante protéico de membrana de protozoários kinetoplastídeos) parece ser antigênico e mostra uma resposta de anticorpos relativamente forte durante o curso natural das leishmanioses e doença de Chagas. A observação de reação imunológica cruzada em infecções causadas por Leishmania e T.cruzi é particularmente importante, contradizendo estudos que relataram a alta sensibilidade da detecção destes anticorpos em pacientes com leishmaniose. O mapeamento de determinantes antigênicos em KMP-11 utilizando peptídeos sintéticos revelou a existência predominante de epítopos conformacionais nas infecções de Leishmania (Trujillo C. et al., Immunol. Lett.; 70:203-9, 1999).

Um antígeno de Leishmania chagasi - LcKin, com homologia à superfamília de proteínas motoras (kinesinas), denominado K39, foi demonstrado como predominante em amastigotos, e contém um domínio repetitivo extenso altamente relacionado entre as espécies de L. chagasi e L. donovani. Altos títulos de anticorpos foram encontrados para o antígeno rK39, que contem várias repetições de 39 aminoácidos, demonstrando a conservação da região repetitiva entre as espécies mencionadas (Burns J. M. et al., Proc. Natl. Ac. Sei.; 90:775-9, 1993). Com a descoberta deste antígeno, muitos pesquisadores têm testado a sua viabilidade em diferentes testes diagnósticos para a Leishmaniose Visceral, a maioria deles mostrando resultados altamente promissores, na tentativa de utilização de métodos diagnósticos menos invasivos e economicamente viáveis para a população. A detecção de anticorpos IgG para este antígeno tem sido extremamente sensível e específica no diagnóstico da Leishmaniose Visceral, embora seja difícil apontar alguma função protetora para estes anticorpos específicos (Carvalho S. F. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 68:231-324, 2003 e Chang KP et al. Kinetoplasti. Biol. Dis.; 1:1, 2002).

Vários autores apontam a viabilidade de testes diagnósticos utilizando o antígeno rk39 em diferentes metodologias. A especificidade e sensibilidade são na maioria dos casos muito promissoras. Foram testados 228 casos parasitologicamente confirmados utilizando rK39 em ELISA para captura de IgG e teste imunocromatrográfico (“dipstick test”), os resultados apontaram 100% de sensibilidade e especificidade para ambos os casos (Singh S. et al., Clin. Diag. Lab. Immunol.; 9:568-72, 2002); resultados similares foram obtidos mostrando a sensibilidade do antígeno rK39 “strip test” e ELISA de 90% e 89%, respectivamente, enquanto a especificidade foi de 100% e 98% respectivamente (Carvalho S. F. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 68:231-324, 2003). Foi também analisada a eficácia do antígeno rK39 em Testes de

Aglutinação Direta - DAT (100% de sensibilidade e especificidade) e “dipstick test” com 85,7% de sensibilidade e 82% de especificidade (Schallig H. D.; et al., Mymensingh Med. J.; 12:93-7, 2002).

Análises semelhantes foram feitas para os testes de ELISA (Salotra S. et al., Methods Enzymol.; 217:228-57, 2003; Maalej I. A. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 68:312-20, 2003; Sreenivas G. et al., Br. J. Biomed. Sei.; 59:218-22, 2002; Braz R. F. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 67:244-348, 2002; Singh et al„ J. Parasitol.; 81:1000-3, 1995; Qu J. Q. et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.; 88:543-5, 1994; Kumar R. et al., Clin.Diag. Lab. Immunol.; 8:1220-4, 2001; Ozensoy S. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 59:363-9, 1998; Zijlstra E. E. et al.; Clin. Diagn. Lab. Immunol.; 5:717-20, 1998; Medrano F. J. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 59:155-62, 1998; Badaró R et al., J. Infect. Dis.; 173:758-61, 1996).

Muitos autores avaliaram o uso do rK39 utilizando testes imunocromatrográficos (Sarker C.B. et al., Mymensingh Med. J.; 12:93-7, 2003; Carvalho S. F. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 68:231-324, 2003; Boelaert M. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 70:72-7, 2004; Chappuis F. et al., Trop. Med. Int. Health.; 8:277-285, 2003; Veeken H et al. Trop. Med. Int. Health.; 8:164-7, 2003; Qu J. Q. et al., Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi 18:155-8, 2000; Delgado O. et al., Parasite; 8:355-7, 2001; Berm C. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 63:153-7, 2000 e Zijlstra E. E. et al., Trop. Med. Int. Health; 6:108-3, 2001).

Embora o antígeno tenha sido reportado como satisfatório, resultados variam consideravelmente em diferentes áreas endêmicas, por razões que ainda não são claras, pacientes Sudaneses desenvolvem títulos mais baixos de anticorpos anti-rK39 que pacientes indianos, apesar de que o formato do teste possa ser o fator, pois outras marcas de testes imunocromatrográficos funcionam melhor nesta região (Sudar S. et al., Trop. Med. Int. Health; 12:284- 9, 2007 e Titmeijer k. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 12:74-76, 2006).

Um antígeno de L. major, designado LACK (Leishmania homologue of receptor for activated C kinase), foi identificado a partir da busca por antígenos reconhecidos por um clone Th1 protetor derivado do baço de camundongo BALB/c infectado com um extrato solúvel de promastigotos de L. major. A sequência de aminoácidos deduzidas deste antígeno tem homologia substancial com os receptores intracelulares para Kinase C ativada (RACKs) e apresenta alta homologia entre L major e L. chagasi (Mougneau E. et al., Science; 268:245-52, 1995). Tem sido sugerido que a proteína LACK contém um epítopo imunodominante que representa o alvo da resposta imune inicial (Requena J. M. et al., Parasitol. Today; 16:246-50, 2000). O antígeno LACK é uma proteína de 36 KDa bem conservada presente em todas as espécies e estágios de desenvolvimento da Leishmania e é um dos antígenos mais imunogênicos (Mougneau E. et al., Science; 268:245-52, 1995). Este antígeno tem sido usado para avaliar a utilização de vacinas de DNA codificando este e outros antígenos (ex: LmSTH e TSA). A combinação desses antígenos tem conferido proteção durável e completa contra o desenvolvimento de lesões cutâneas (Méndez S. et al., Vaccine; 31:3702-4, 2002).

Alguns dos antígenos anteriormente descritos são objetos de estudo na busca de vacinas, quimioterápicos ou imunodiagnósticos eficazes das Leishmanioses, sendo objetos das patentes abaixo descritas:

A patente FR2844511 demonstrou o uso de peptídeos de 16 aminoácidos e suas variações para tratamento da leishmaniose e indução da resposta imune Th1 em mamíferos, descreve também a utilização de um kit de diagnóstico contendo um desses peptídeos ou seus derivados ligados a moléculas de biotina ou polilisina acoplados a nitrocelulose ou outros polímeros como membranas, látex ou outros materiais.

A patente WO9711180 e WO0179276 descrevem composições e métodos para prevenção, tratamento e diagnóstico das leishmanioses e estímulo da resposta imune em pacientes utilizando porções imunogênicas dos antígenos M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-210 e LbelF4A, Lmspla, Lmso9A e MAPS- 1 de Leishmania ou porções destes e suas variações. Para o mesmo fim, a patente WO2007121184 descreve a utilização de polipeptídeos e proteínas de fusão contendo ao menos uma porção imunogênica de um ou mais antígenos de Leishmania e variantes por meio da seleção de regiões protéicas em “tandem”.

A patente CA2503932 demonstra novas proteínas de Leishmania major, as quais compreendem polipeptídeos e polinucleotídeos secretados ou excretados e seus fragmentos funcionais e a utilização destes peptídeos como vacinas e terapêuticos, além da utilização de anticorpos gerados a partir dos mesmos.

A patente WO2007142695 descreve a utilização de um kit de diagnóstico rápido para detecção de formas amastigotas, promastigotas ou proteínas secretadas ou excretadas de Leishmania, que pode ser usado no campo levando ao tratamento mais rápido da leishmaniose cutânea, utilizando anticorpos anti- antígeno TSA (Thiol Specific Antigen).

A patente PI0605889-2 demonstra a utilização de antígeno solúvel no diagnóstico da leishmaniose visceral canina através da reação imunoenzimática de ELISA.

A patente US5965142 descreve composições e métodos para o diagnóstico de Leishmania tropica utilizando um ou mais epítopos da proteína Lt-210, com potencial uso em vários tipos de imunoensaios pra a detecção deste parasito, podendo tais peptídeos serem utilizados também em composições vacinais.

A patente US2007292847 descreve novas sequências de aminoácidos e ácidos nucléicos de Leishmania major (LmPDE - fosfodiesterases) e anticorpos ligantes a estas sequências para formação de complexos no diagnóstico e tratamento das desordens relacionadas com as doenças causadas por este parasito.

A patente WO9633414 descreve um método de prevenção e de diagnóstico sorológico da infecção por Leishmania, por meio de um ou mais polipeptídeos em métodos e kits de diagnóstico para avaliação de amostras individuais de sangue e identificação de indivíduos assintomáticos. Estes polipeptídeos compreendem um epítopo de LcPO (Leishmnia chagasi homolog of eukariotic acid ribossomal P-protein family) e variantes deste que diferem somente em substituições ou modificações conservativas.

A patente WO2005063803 descreve a utilização de compostos e métodos para a detecção de anticorpos em indivíduos suspeitos de infecção por parasitos do gênero Leishmania, principalmente cepas indianas ou correlacionadas e a utilização de um kit de diagnóstico relacionado; demonstrando o isolamento, caracterização e uso da região imunogênica do gene relacionado a kinesina, isolado da cepa de Leishmania donovai MHOM/IN/DD8 e MHOM/IN/KE16/1998 e correlação das sequências dos ácidos nucléicos isolados de cepas indianas e L. chagasi.

A patente US7008774 propõe um imunoensaio para detecção de anticorpos do tipo IgM e IgG e detecção de antígenos circulantes em amostras de indivíduos com leishmaniose visceral, cutânea ou canina. Relata também a utilização de um imunoensaio de imuno-captura para detecção de antígenos liberados pelos parasitos.

A patente ES2133236 descreve a utilização de um antígeno recombinante para diagnóstico sorológico da leishmaniose canina utilizando um gene quimérico que codifica antígenos específicos de L. infantum (LiP2a, LiP2b, LÍPH2A, LiPO); para tal fim, os fragmentos de DNA dos genes destas proteínas foram adicionados sequencialmente na região 5’ do vetor gerando um polipeptídeo com massa molecular de 38K e ponto isoelétrico de 7.37.

A patente WO9639524 descreve métodos e compostos relacionados aos antígenos LbelF4A ou LmelF4A de Leishmania, analisando a resposta imune tanto para a proteína como para o antígeno codificado por vacina de DNA.

A patente DE10156679 demonstra a utilização do antígeno p36-l_ACK na construção de um cassete de expressão para tratamento e composição vacinai para infecções por leishmanias. Da mesma forma, a patente US2004235772 descreve a expressão de DNA utilizando o antígeno p36 LACK para tratamentos de infecções por Leishmania assim como vacina correspondente e a patente WO2005039633 demonstra a expressão de DNA para geração de resposta imune utilizando os antígenos p36-LACK, TSA, Kmp- 11 e o antígeno gp63 de Leishmania infantum ou seus derivados com função correspondente.

A patente WO0181388 relata o uso de poliptídeos, proteínas e ácidos nucléicos que contenham no mínimo uma porção da proteína Lip2a (acidic ribosomal protein from Leishmania infantum) ou variantes desta para gerar resposta imune em indivíduos ou grupos celulares ou serem utilizadas como agentes terapêuticos para Leishmania e como adjuvante para outros parasitos.

A patente WO2007144903 utiliza o antígeno KMP-11 como uma vacina celular híbrida contra leishmanioses, enquanto a patente US2008145385 descreve métodos pra imunizar mamíferos infectados com cepas virulentas de Leishmania pela administração de uma vacina de DNA do antígeno KMP-11 (Kinetoplastid Membrane Protein-11).

A patente US2008026467 apresenta sequências de DNA capazes de codificar PSAs (Promastigote Surface Antigens) de formas promastigotas e amastigotas de Leishmania para serem utilizadas em composições vacinais contra Leishmania.

A patente US2004170636 descreve a produção de uma vacina de DNA que estimula resposta imune contra infecções por Leishmania utilizando o gene A2 de Leishmania donovani. A utilização deste antígeno é também base da patente PI0603490-0 que ressalta a sua utilização em vacinas garantindo a diferenciação de animais naturalmente infectados daqueles vacinados. A patente PI0601225-6 também descreve a utilização de antígenos vacinais de espécies diferentes, visando esta discriminação.

A patente WO2006122382 (BRPI0503187) descreve a obtenção de composições vacinais bloqueadoras da transmissão de leishmaniose em humanos e animais a partir de frações de Leishmania (Ligante de Fucose- Manose - FML de amastigotas ou promastigotas de L. donovani).

A patente WO2006110915 descreve a utilização de uma vacina compreendendo um ou mais antígenos selecionados a partir de um grupo de homólogos de Leishmania chagasi ou proteínas hipotéticas de L. infantum e proteína do grupo K-39 de L. infantum.

A patente WO02072792 demonstra que a utilização das proteínas de Leishmania TSA ou MAPS (Leishmania thiol-specific thiol-specificantioxidant), LelF (L. braziliensis gene homologous to the eukaryotic ribosomal protein elF4A, também chamada de "LbelF4A"), M15 (L. major stress-inducible 1 ou LmSTII) e 6H (L. braziliensis gene homologous to the gene for the eukaryotic 83-kDa heat shock protein, também chamada de "Lbhsp83") quando fusionadas a sequências polinucleotídicas heterólogas são capazes de aumçntar a expressão de polinucleotídeos heterólogos em células eucarióticas. Estes polipeptídeos de fusão de Leishmania isolados ou purificados podem ser utilizados para tratamento ou prevenção de infecções por Leishmania ou outros organismos como M. Tuberculosis.

A patente FR2862313 descreve a construção e isolamento de ácidos nucléicos que codificam uma região imonogênica de formas amastigotas e promastigotas de Leishmania, podendo ser utilizadas em composições vacinais ou para gerar anticorpos e serem utilizados no diagnóstico.

A patente FR2826018 descreve o isolamento do gene codificante da proteína LmPDI, que possuiu duas regiões com sequências idênticas (Cys-Gly- His-Cys) reconhecidas como alvo terapêutico para o desenvolvimento de medicamentos e um novo elemento para composição de vacinas contra Leishmania para humanos e animais.

A tecnologia de “Phage Display” ou exposição de biomoléculas em fagos tem apresentado uma utilização cada vez mais crescente em diversas áreas das ciências desde que descrita no ano de 1985 (Smith G. P. Science 228:1315-17, 1985). Este autor foi o pioneiro a conseguir a expressão da enzima de restrição Eco RI como uma fusão da proteína três (pill) do capsídeo virai.

Bacteriófagos, ou simplesmente fagos, são vírus que infectam uma variedade de bactérias Gram-negativas usando o pilus sexual como receptor. As partículas de fagos filamentosos (linhagens M13, f1 e fd), que infectam E. coli via pilus F consiste de um DNA de fita simples incluso em uma cápsula protéica. Um fago viável expressa aproximadamente 2.700 cópias da proteína gene 8 (g8 ou pVIII, uma proteína de 50 resíduos de aminoácidos) e 3 a 5 cópias do gene III (p3p ou plll) proteína de 406 aminoácidos (Russel M., Mol. Microbiol.; 5:1607-13, 1991).

Em sistemas onde todas as pill ou pVIII são utilizadas, o tamanho da proteína inserida no vetor é limitado, pois grandes proteínas interferem nas funções das proteínas do capsídeo, tornando o fago pouco infectivo. Este sistema “Phage display” foi criado para a exposição de bibliotecas de pequenos peptídeos (no máximo 30 aminoácidos) (Phizicky E.M. Fields S., Microbiol. Rev.; 59:94-123, 1995).

A exposição em fagos filamentosos é baseada na clonagem de fragmentos de DNA codificantes de milhões de variantes de certos ligantes (Benhar I. Biotechnol. Adv.; 19:1-33, 2001), como proteínas, incluindo anticorpos, ou peptídeos. As seqüências de DNA de interesse são inseridas em uma localização no genoma de bacteriófagos filamentosos, de modo que a proteína codificada é expressa na superfície do fago filamentoso como um produto de fusão a uma das proteínas da superfície do fago (Azzay H. M. E. et al. Clin. Biochem.; 35:425-45, 2002).

A conexão entre genótipo e fenótipo, permite o enriquecimento de fagos específicos, como por exemplo, utilizando a seleção em um alvo imobilizado (Benhar I. Biotchno. Adv.; 19:1-33, 2001).

O “Biopanning” ou procedimento de seleção é feito pela incubação da biblioteca de peptídeos expostos em fagos contra o alvo. Na maioria das vezes, o alvo é retido em placas de ELISA, mas também se utiliza “beads”, resinas e membranas. Os fagos não ligantes ao alvo são eliminados por lavagens sucessivas, e os fagos específicos permanecem ligados para posterior eluição. O “pool” de fagos específicos é amplificado para os ciclos posteriores de seleção biológica ou “biopanning” (ciclos de ligação, eluição e amplificação) para o enriquecimento do conjunto de fagos com sequências específicas contra o alvo. Após três ou quatro passagens, os clones individuais são caracterizados por sequenciamento de DNA, “Western Blot” ou ELISA (Smith G. P. Science; 228:1315-17, 1985).

Como alternativa ao “panning” contra um alvo imobilizado em uma superfície, a biblioteca pode reagir com um alvo em solução, dada pela afinidade de captura do complexo alvo-fago em uma matriz de afinidade (“bead”) específica para a proteína alvo. O experimento requer substancialmente menos alvo por experimento que o “panning” em superfície, podendo resultar em uma maior acessibilidade do sítio ligante para os peptídeos expressos nos fagos, assim como evitar a desnaturação parcial do alvo na superfície plástica (Barbas, C. et al., Cold Spr. Har. Lab. Press, NY; 2001).

Oligonucleotídeos sintéticos com um comprimento constante, mas com códons não especificados, randomizados por mutagênese sítio-dirigida, usando deoxinucleotídeos degenerados, são clonados como fusão a uma das proteínas do capsídeo de fagos M13, onde são expressos como proteínas de fusão ligadas ao capsídeo. Peptídeos ligados aos fagos exibem um grande potencial mimético a epítopos lineares, conformacionais ou não protéicos (Smith G. P. Curr. Opin. Biotechnol.; 2:668-73, 1991; Smith G. P. et al., Gene, 128:37-42, 1993).

Bibliotecas de peptídeos fusionadas em fagos têm sido muito utilizadas no estudo das interações entre antígenos e anticorpos (Cortese R. et al., Trends Biotechnol.; 12:262-7, 1994; Birch-Marchin I. et al., J. Virol. Methods; 88:89-104, 2000; Christopher G. et al. Infect. Mmunol.; 67:4679-88, 1999), estes trabalhos demonstram a obtenção de peptídeos específicos pela seleção das bibliotecas de fagos com anticorpos monoclonais e policlonais, epítopos lineares, tanto quanto mimetopos, os que imitam antígenos lineares, descontínuos, conformacionais e até mesmo epítopos não peptídicos de antígenos.

Peptídeos selecionados contra um alvo particular que tem sequência similar têm um papel na identificação do motivo necessário para ligação (Stephen C. W. et al., J. Mol. Biol.; 225:577-83, 1992). Nos casos em que os peptídeos selecionados se assemelham ao peptídeo ligante natural, são denominados mimetopos (Geysen H. M. et al., Mol. Immunol.; 23:709-715, 1986; Salotra Smith G. P. et al., Methods Enzymol.; 217:228-57, 1993). Sequências peptídicas identificadas por “Phage Display” têm sido mostradas como agonistas ou antagonistas de receptores (Doobar J. Winter G. J., Mol. Biol.; 244:361-9, 1994).

Peptídeos que neutralizam imunoglobulinas podem ser empregados como reagentes diagnósticos ou usados como agentes terapêuticos controlando doenças autoimunes (Blank M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei.; 96:5164-68, 1999). Bibliotecas de peptídeos randômicos podem ser usadas para mapear epítopos de anticorpos policlonais e monoclonais, identificando peptídeos ligantes, e desenvolvendo fagos que definem sítios para diferentes enzimas (Mattheus D. J. et al., Science, 260:1113-7, 1993; Ohkubo et al., Comb. Chem. High Throughput Screen.; 4:573-83, 2001).

Fagos que expressam epítopos ou mimetopos podem emergir como uma ferramenta útil para o desenvolvimento de vacinas efetivas ou podem servir como veículos de entrega de vacinas por si próprios (Benhar I. Biotechnol. Adv.; 19:1-33, 2001).

A apresentação de pequenos peptídeos na superfície de partículas virais pode aumentar sua imunogenicidade e consequentemente seu potencial como candidatos a vacinas. A resposta imunogênica a fagos M13 é dependente de células T e não requer adjuvante (Azzay H. M. E. et al., Clin. Biochem.; 35:425-45, 2002).

Até o presente momento, não existem evidências na literatura revelando experimentos utilizando a técnica de “Phage Display” no estudo das interações antígeno-anticorpo com o protozoário Leishmania. Entretanto, vários autores relatam a utilização desta técnica no entendimento de doenças provocadas por vírus, bactérias, protozoários e a interação entre seus antígenos e a resposta imune do hospedeiro, buscando o mapeamento de epítopos ou desenvolvimento de vacinas para: Plamodium falciparum (de la Cruz V. F. et al., J. Biol. Chem.; 263:4318-22, 1988; Willis A. E. et al., Gene, 128:79-83, 1993), Taenia solium (Gazarian K. G. et al., Immunol. Lett.; 42:191-5, 2000), Vírus da Doença Infecciosa da Bursa (Cui X. et al., J. Virol. Methods; 109:75- 83, 2003), Eimeria tenella (Abi-Ghanem D. et al., Vet. Immunol. Immunophatol.; 121:58-67, 2008), Echinococcus granulosus (Read A. J. et al., J. Chromatogr.B; 877:1516-22) e neurocisticercose humana (Hell R. C. R. et al., Clin. Immunol.; 13:129-38, 2009) dentre outros.

Várias patentes demonstram a utilização da tecnologia de “Phage Display” no estudo de doenças parasitárias tais como as patentes: US2007281302 (peptídeos ligantes às bactérias: B. anthracis, B. subitilis e B. cereus e uso destes para detecção de esporos de B. antrhracis); US2007141076 (identificação de fragmentos antigênicos de proteínas de Toxiplasma gondii e seu uso no diagnóstico e como agente imunogênico); CN101015691 (desenvolvimento de uma vacina universal em microesferas contra o tipo B do vírus Infuenza por meio da inserção a região M2 do vírus no bacteriófago T7); WO2006071896 (vacina para a síndrome respiratória aguda grave (SARS), compreendendo epítopos antigênicos do vírus) e US2006094017 (descoberta de mimetopos específicos para a proteína gp120 do vírus HIV e utilização destes como conjugados imunológicos na vacinação contra o vírus e também como ferramentas de diagnóstico).

Dada a viabilidade da tecnologia acima descrita, torna-se importante ressaltar que essa técnica complementa a atual tendência dos projetos genômicos, na qual se gera um grande volume de informação, mas com pouca descrição fenotípica. Com a técnica de apresentação em fagos, podemos agora testar genes de interesse em grande escala, na busca de um conjunto de proteínas que interagem, e que vem sendo chamado de “interatoma”. A busca desses “interatomas” promete expandir os limites criados com os projetos genômicos e permite inferir como esses genes se relacionam, explicando o indivíduo fenotipicamente (Brígido M. M. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento; 26:44-51, 2002).

Metodologias para o uso desta técnica na expressão de polipeptídeos recombinantes e aprimoramento da tecnologia foram descritas nas patentes: KR20070041966 (método para exposição de anticorpos fusionados a proteína plll na superfície de fago recombinante com maior estabilidade e praticabilidade); US2009105090 (uso de proteína plll mutante com inserção de aminoácido para promover uma mudança na conformação do peptídeo); WO9958655 (utilização de bacteriófago que expressa polipeptídeos heterólogos portadores de um sítio de clivagem dentro do peptídeo expresso que possibilita a propagação da proteína de fusão intacta); WO2009024591 (alternativa de exposição em fagos utilizando a proteína pVII e kit de comercialização do mesmo); US7083945 (expressão de proteínas em forma solúvel para interação com ligantes marcados), US2006068421 (vetores de expressão e novos métodos de expressão que permitem a eficiente seleção e seleção de polipeptídeos), US2005202512 (métodos para a seleção de população de polipeptíedeos funcionais), GB2408332 (métodos de ligação específicos para antígenos de superfície celular), US2003104604 (propõe o aumento da eficiência da técnica, por meio de expressão em bactérias), EP1452599 (bibliotecas que expressam fagos com vários peptídeos ou proteínas mutantes capazes de se ligarem a materiais de interesse) e US2006035223 (peptídeos com capacidade de ligação a materiais inorgânicos como sílica, cobalto, ferro ou óxidos) nas quais são propostas metodologias que aperfeiçoam a técnica.

A presente invenção utilizou a tecnologia de “Phage Display” para a identificação e seleção de peptídeos específicos e motivos proteicos relacionados aos parasitos de gênero Leishmania, determinando epítopos funcionais de proteínas envolvidas na resposta imune contra o parasito para o uso em plataformas para um diagnóstico mais preciso e composições vacinais preventivas e/ou terapêuticas contra as leishmanioses buscando maior especificidade devido a utilização de sítios específicos dos antígenos.

Os exemplos a seguir mostram uma descrição detalhada dos resultados experimentais obtidos possibilitando a melhor compreensão da presente invenção. Os procedimentos experimentais envolvidos serão detalhados no final desse relatório descritivo. A metodologia empregada para a seleção, caracterização e utilização de peptídeos recombinantes e motivos protéicos que mimetizam regiões antigênicas de Leishmania poderá ser aplicada a outros protozoários.

A invenção poderá ser melhor compreendida por meio da descrição detalhada, em consonância com as Figuras em anexo, onde:

A FIGURA 1 apresenta o ensaio de “dot-blot” realizado para os peptídeos recombinantes selecionados nas eluições específicas frente anticorpos de pacientes portadores de Leishmaniose Visceral (V) e também de Leishmaniose Tegumentar (T) e controles saudáveis (N).

A FIGURA 2 apresenta o ensaio de “dot-blot” competitivo para os clones de maior relevância na seleção específica para Leishmaniose Visceral, os anticorpos de pacientes acometidos pela doença foram pré-incubados com antígeno total de Leishmania chagasi, podendo assim mostrar a que os peptídeos recombinantes e o antígeno natural competem pelos mesmos sítios de ligação nos anticorpos.

Exemplo 1:

Este exemplo se refere à seleção e caracterização dos peptídeos recombinantes miméticos seus motivos protéicos e sequências inversas objetos desta invenção que foram selecionados a partir de anticorpos de pacientes acometidos pela Leishmaniose Visceral e Leishmaniose Tegumentar, independentemente. Foram realizadas seleções abrangentes e específicas para cada uma das patologias acima relacionadas.

A TABELA 1 apresenta a identidade das sequências objetos desta invenção, designadas por Seq. ID N2 1 a Seq. ID N2 56 (seqüências normais) e Seq. ID N2 57 a Seq. ID N2 112 (seqüências invertidas) que referem-se aos experimentos realizados frente a anticorpos de pacientes com Leishmaniose Visceral e as frequências observadas para cada uma destas sequências em cada um dos processos de seleção.

Três tipos de eluição foram utilizados para a seleção destes peptídeos recombinantes, visando uma seleção abrangente (eluição ácida) e duas mais específicas (antígeno recombinante ou antígeno total), todas tendo como alvo ligantes anticorpos do tipo IgG de pacientes acometidos pela Leishmaniose Visceral, sendo tais eluições:A Eluição Ácida (Seleção Tipo 1), representada pelas seqüências Seq. ID N2 1 a Seq. ID N2 24 e seus correspondentes invertidos Seq. ID N2 57 a Seq. ID N2 80; a seleção apresentou um número total de 28 clones, sendo 24 deles distintos entre si, o clone representado pelas seqüências Seq. ID N2 14 - Seq. ID N2 70 apresentou a maior freqüência nesta seleção (10,71%), seguido pelos clones de seqüências representados por Seq. ID N2 3 - Seq. ID N2 59 e Seq. ID N2 19 - Seq. ID N2 75 com representatividade intermediária (7,14%), as demais seqüências foram únicas na população aqui apresentada.

A Eluição Específica frente ao antígeno recombinante rK39 (Seleção Tipo 2), representada pelas seqüências Seq. ID N2 25 a Seq. ID N2 42 e seus correspondentes invertidos Seq. ID N2 81 a Seq. ID N2 98; a seleção apresentou um total de 30 clones, 18 deles distintos entre si, o clone representado pelas sequências Seq. ID N2 34 - Seq. ID N2 90 mostrou a maior frequência na população (20,0%), seguido pelos clones Seq. ID N2 25 - Seq. ID N2 81 (16,67%), Seq. ID N2 31 - Seq. ID N2 87 (10,0%) e Seq. ID N2 28 - Seq. ID N2 84 (6,67%).

A Eluição Específica realizada frente a antígenos totais de Leishmania chagasi (Seleção Tipo 3), tendo como representantes as sequências enumeradas Seq. ID N2 43 a Seq. ID N2 56 com seus correspondentes invertidos designados de Seq. ID N2 100 a Seq. ID N2 112. A população é representada por 29 clones, tendo 15 deles sequências distintas entre si. O clone mais freqüente nesta população é o representado pelas seqüências Seq. ID N2 43 - Seq. ID N2 99 (31,03%), seguido pelos de sequências Seq. ID N2 52 - Seq. ID N2 118 (20,69%) e Seq. ID N2 4 - Seq. ID N2 60 (6,90%). As demais sequências obtidas nesta seleção tiveram uma frequência de 3,45% dos clones.TABELA 1

Peptídeos Peptídeos invertidos correspondentes Freqüência (%) Seleção Tipo 1 - Eluição Ácida - 28 clones

O alinhamento das sequências apresentadas na Seleção Tipo 1 mostrou a existência de 3 motivos particulares repetidos dentre os clones (consensos), podendo representar epítopos que são representados pelas seguintes 5 sequências e suas respectivas sequências invertidas: Seq. ID N2 165 (Seq. ID N2 166), Seq. ID N2 167 (Seq. ID N2 168) e Seq. ID N2 169 (Seq. ID N2 170).

Em virtude da representação conservada em determinadas regiões ao longo dos peptídeos, os motivos podem apontar importantes epítopos contínuos ou descontínuos dos antígenos, como exemplificado na TABELA 2, io que apresenta o alinhamento dos clones e as sequências consenso obtidas nos diferentes tipos de seleções realizadas contra anticorpos de pacientes com Leishmaniose Visceral, onde: A: Eluição Ácida, B: Eluição específica com o antígeno rK39 e C: Eluição específica com antígeno total de L. chagasi. Em destaque, as sequências consenso identificadas entre os clones.

O alinhamento destes consensos com proteínas restritas de Leishmania chagasi em banco do GeneBank (BLAST - Basic Local Alignment Search Tool - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) mostrou homologia parcial com proteínas relevantes de Leishmania tais como K39, GP63, GP46 e o antígeno LACK dentre outras, o que é demonstrado na TABELA 3, que apresenta as sequências consenso e as proteínas a que se relacionam com seus números de acesso, bem como a similaridade dada pelos aminoácidos representativos do alinhamento, sua posição na proteína original e números de “Score” e “EValue” para o alinhamento em questão.

Os experimentos com Eluições Específicas (Seleção Tipo 2 e 3) puderam confirmar a relevância do consenso representado pela sequência Seq. ID N2 167 (Seq. ID N2 168); mesmo com o aumento da especificidade da eluição, estes peptídeos consenso mantiveram uma frequência considerável na população de clones seqüenciados. A presença de motivos protéicos pode ser relacionada com a seleção a favor do ligante, pela indicação de que estes aminoácidos poderiam ser cruciais para o reconhecimento dos peptídeos pelo paratopo.

Apresentam similaridades com a sequência consenso identificada como Seq. ID N2 165 (Seq. ID N2 166) as seqüências de peptídeos seguintes e suas respectivas sequências invertidas: Seq. ID N2 12 (Seq. ID N268), Seq. ID N2 13 (Seq. ID N2 69) e Seq. ID N2 14 (Seq. ID N2 70).

A principal proteína a qual esta sequência consenso se relaciona 5 quando em posição normal é a K39 de Leishmania chagasi relacionada à superfamília Kinesina de proteínas motoras; a proteína recombinante rK39 aponta altos títulos de anticorpos em pacientes com Leishmaniose Visceral, o que pode justificar o sucesso da seleção realizada. O resíduo de aminoácidos aqui apontado encontra-se em região distinta à do antígeno recombinante, podendo apontar um novo epítopo e ser ferramenta útil no desenvolvimento de 5 novas tecnologias de imunodiagnóstico e profilaxia. Outra proteína de relevância relacionada ao consenso em duas posições é a GP46 - glicoproteína de 46 KDa presente na superfície das formas promastigotas da maioria das espécies de Leishmania - que apresenta elevados níveis de RNA mensageiro nas formas promastigotas infecciosas, a presença desta sequência consenso io relacionada a esta proteína pode ser um indício da participação da proteína na resposta imunológica do hospedeiro contra o parasito e possuir também grande valor diagnóstico. Quando invertida, esta sequência consenso relaciona-se com as seguintes proteínas de Leishmania: Proteína gp63, dhfr-ts (Leishmania donovani chagasi), Molécula tipo kinesina de Leishmania major e GP46 - 15 Antígeno de superfície de membrana (Leishmania donovani chagasi).

Apresentam similaridade com a seqüência consenso identificada pelas seqüências Seq. ID N2 167 e sua respectiva sequência invertida Seq. ID N2 168, com homologia total ou parcial ao consenso as seguintes seqüências para a Seleção Tipo 1: Seq. ID N2 4 (Seq. ID N2 60), Seq. ID N2 5 (Seq. ID N2 61), 20 Seq. ID N2 6 (Seq. ID N2 62), Seq. ID N2 7 (Seq. ID N2 63), Seq. ID N2 8 (Seq. ID N2 64), Seq. ID N2 9 (Seq. ID N2 65), Seq. ID N2 10 (Seq. ID N2 66), Seq. ID N2 12 (Seq. ID N2 68), Seq. ID N2 20 (Seq. ID N2 76) e Seq. ID N2 23 (Seq. ID N2 79) e Seq. ID N2 29 (Seq. ID N2 85); para a Seleção Tipo 2: Seq. ID N2 31 (Seq. ID N2 87), Seq. ID N2 32 (Seq. ID N2 88), Seq. ID N2 33 (Seq. ID N2 89), 25 Seq. ID N2 34 (Seq. ID N2 90) e Seq. ID N2 35 (Seq. ID N2 90) e Seq. ID No 37 (Seq. ID No 93), Seq. IDNo 38 (Seq. ID No 94) e Seq. ID No 42 (Seq. ID No 98) e para a Seleção Tipo 3: Seq. ID No 43 (Seq. ID No 99),Seq. ID No 44 (Seq. ID No 100) e Seq. ID N248 (Seq. ID N2 104).

Esta seqüência consenso quando em posição normal se relaciona 30 com o antígeno LACK com homologia parcial, este antígeno é uma proteína de 36 KDa bem conservada presente em todas as espécies e estágios de desenvolvimento de Leishmania sendo um dos antígenos mais imunogênicos. A presença desta sequência em muitos dos clones objetos desta invenção leva a designação de um epítopo dentro desta proteína com valor no diagnóstico e profilaxia das doenças tanto no homem como em animais. Quando em posição invertida esta sequência consenso não mostra homologia com as proteínas depositadas em banco de dados.

A sequência consenso identificada pela seqüência Seq. ID Ns 169 (Seq. ID N- 170) tem as seqüências Seq. ID Ns 3 (Seq. ID Ns 59), Seq. ID Ne 22 (Seq. ID N2 78), Seq. ID N2 16 (Seq. ID N2 72), Seq. ID N2 19 (Seq. ID N2 75), Seq. ID N2 18 (Seq. ID N2 74) como representantes portadoras do consenso e não apresentaram homologia nos alinhamentos realizados em bancos de dados.

A TABELA 4 apresenta as sequências identificadas por Seq. ID N2 113 a Seq. ID N2 138 (sequências normais) e Seq. ID N2 139 a Seq. ID N2 164 (seqüências invertidas) que referem-se às seleções realizadas frente a anticorpos de pacientes com Leishmaniose Tegumentar, mostrando também a frequência observada de cada sequência peptídica para cada um dos processos de seleção.

Para anticorpos de pacientes com Leishmaniose Tegumentar foram realizados dois processos de seleção sendo eles:- Eluição Ácida (Seleção Tipo 1) representada pelos clones de seqüências Seq. ID N2 113 a Seq. ID N2 124 e seus correspondentes invertidos Seq. ID N2 139 a Seq. ID N2 150 com um total de 12 clones cada um representando 8,33% da população.- Eluição Específica (Seleção Tipo 2) realizada frente a antígenos totais de Leishmania amazonensis, representados pelas sequências Seq. ID N2 125 a Seq. ID N2 138 e seus correspondentes invertidos Seq. ID N2 151 a Seq. ID N2 164, com um total de 14 novos clones. O clone mais frequente dentre eles é o representado pelas sequências identificadas por Seq. ID N2 119 - Seq. ID N2 145 (16,67%), seguido pelos clones de sequências Seq. ID N2 114 - Seq. ID N2 140, Seq. ID N2 118 - Seq. ID N2 144 e Seq. ID N2 129 - Seq. ID N2 155 (8,33%), Seq. ID N2 124 - Seq. ID Ns 150, Seq. ID N2 125 - Seq. ID N2 151, Seq. ID N2 126 - Seq. ID N2 152 e Seq. ID N2 137 - Seq. ID N2 163 (5,56%) e os demals com 2,78%.

Os clones selecionados na seleção acima descrita, quando alinhados entre si não mostraram definição clara de sequências consenso, como mostrado na TABELA 5 que apresenta o alinhamento entre os clones dos diferentes tipos de eluição frente anticorpos de pacientes com Leishmaniose 5 Tegumentar, onde A: Eluição ácida e B: Eluição Específica. Em contrapartida, observou-se entre as seleções a presença de clones repetidos nos dois diferentes tipos de seleção (Seq. ID Ns 114 - Seq. ID N2 140, Seq. ID N2 118 - Seq. ID N2 Seq. ID N2 144, Seq. ID N2 119 - Seq. ID N2 145, Seq. ID N2 121 - Seq. ID N2 147, Seq. ID N2 122 - Seq. ID N2 148, Seq. ID N2 124 - Seq. ID N2 io 150) por apresentarem alta e comum reatividade aos alvos utilizados nas seleções, além de mostrarem alinhamentos em diversas sequências hipotéticas de várias espécies de Leishmania merecem atenção particular como alvos a serem utilizados no diagnóstico e profilaxia da Leishmaniose Tegumentar.

Exemplo 2:

Este exemplo refere-se à confirmação da reatividade dos peptídeos selecionados a partir das Eluições Específicas para Leishmaniose Visceral objetos desta invenção.

Foram analisados por meio de “dot-blot" os clones obtidos a partir das Seleções Específicas Tipo 2 e 3 mencionadas anteriormente identificados pelas seqüências Seq. ID N2 25 a Seq. ID Ns 56 e suas correspondentes invertidas Seq. ID N281 a Seq. ID N2 112.

Todos os clones representantes de cada uma das sequências foram testados contra soros de pacientes com Leishmaniose Visceral (V), Leishmaniose Tegumentar (T) e Controles Negativos (N). Nenhuma resposta cruzada foi verificada, mostrando que os clones foram positivamente selecionados pelo alvo específico como pode ser visto na FIGURA 1.

Dentre os clones selecionados contra o antígeno recombinante rK39 apresentaram positividade os identificados pelas seguintes sequências e suas correspondentes invertidas: Seq. ID N2 25 (Seq. ID N2 81), Seq. ID N2 26 (Seq. ID N2 82), Seq. ID N2 31 (Seq. ID N2 87), Seq. ID N2 32 (Seq. ID N2 88), Seq. ID N2 34 (Seq. ID N2 90), Seq. ID N2 37 (Seq. ID N2 93), Seq. ID N2 41 (Seq. ID N2 97) e Seq. ID N2 42 (Seq. ID N2 98).

Para os clones selecionados contra antígeno total de Leishmania chagasi as seguintes sequências e suas correspondentes invertidas apresentaram positividade: Seq. ID N2 43 (Seq. ID N2 99), Seq. ID N2 44 (Seq. ID N2 60), Seq. ID N2 50 (Seq. ID N2 106), Seq. ID N2 52 (Seq. ID N2 108), Seq. ID N2 53 (Seq. ID N2 109) e Seq. ID N2 54 (Seq. ID N2 110). A TABELA 6 mostra a positividade dos clones neste ensaio relacionado à presença de região consenso na molécula (indicados por sinal +), o que evidencia que há relação da presença consenso com a reatividade diferencial dos peptídeos recombinantes.

Os clones positivos no ensaio de “dot blot” acima relacionados foram submetidos a um ensaio de “dot-blot” competitivo, no qual os anticorpos do tipo IgG de pacientes com a doença em questão foram incubados com antígeno total de Leishmania chagasi com as seguintes concentrações: 1- controle sem antígeno, 2 - 0,5 μg/mL, 3-1,3 μg/mL, 4 - 4,9 μg/mL, 5 - 14,8 μg/mL, 6 - 44,4 μg/mL, 7 - 133,3 μg/mL e 8 - 400 μg/mL, como mostrado na FIGURA 2. A reação prévia dos anticorpos com o antígeno total, antes de reagirem com os peptídeos recombinantes expressos na superfície de fagos, teve o intuito de bloquear sítios ligantes comuns entre estes diferentes antígenos.

Dentre os clones selecionados contra o antígeno recombinante rK39, tiveram reatividade inibida frente ao antígeno de Leishmania, os identificados pelas sequências abaixo citadas e suas respectivas sequências invertidas: Seq. ID N2 31 (Seq. ID N2 87), Seq. ID N2 32 (Seq. ID N2 88), Seq. ID N2 34 (Seq. ID N2 90) e Seq. ID N2 42 (Seq. ID N2 98).

Para os clones selecionados contra antígeno total de Leishmania chagasi, tiveram reatividade inibida frente ao antígeno de Leishmania, as seguintes sequências e suas sequências invertidas correspondentes: Seq. ID N2 43 (Seq. ID N2 99), Seq. ID N2 4 (Seq. ID N2 60), Seq. ID N2 50 (Seq. ID N2 106) e Seq. ID N2 54 (Seq. ID N2 110).

A descrição detalhada dos procedimentos experimentais adotados poderá levar a melhor compreensão dos exemplos acima citados.

A purificação de imunoglobulinas foi realizada por imunocromatrografia a partir de um “pool” destes soros, utilizando coluna de proteína A sepharose. A coluna foi equilibrada com 10 volumes de tampão fosfato (0,1 M, pH 8,0). As amostras de soro diluídas em tampão fosfato (vol/vol) foram acrescentadas à resina e incubadas por 30 minutos a temperatura ambiente. Após a incubação, a coluna foi lavada com tampão fosfato, sendo a absorbância a 280 nm monitorada em espectrofotômetro (Ultrospec 1100 pro - Amersham Biosciences) até igualar-se a zero. Cada amostra foi eluída com tampão glicina (0,1 M pH 2,7), sendo coletada frações de 1 mL que foram também monitoradas por leitura espectrofotométrica. As frações com maiores leituras foram agrupadas e o pH neutralizado com NaOH 0,1 M. Assim, foram transferidas para membrana de diálise, concentradas em açúcar comercial (1 h, 4°C) e em seguida dialisadas em 3L de tampão fosfato durante toda a noite em câmara fria a 4°C. A quantificação deu-se por leitura direta em espectrofotômetro a 280 nm.

Para a seleção dos peptídeos recombinantes (peptídeos recombinantes expressos na proteína plll de fagos filamentosos) foi utilizada uma biblioteca comercial de 12 aminoácidos (Ph.D. - 12™ mer - New England Biolabs). Os procedimentos experimentais foram baseados no protocolo disponibilizado pelo fabricante, com adequações para a melhor seleção de clones específicos.

Para os experimentos designados do tipo Eluição Ácida, tanto para os de Leishmaniose Visceral como para os de Leishmaniose Tegumentar, os procedimentos para a seleção de peptídeos recombinantes foram realizados em fase aquosa.

Como substrato para a realização deste processo, foram utilizados 50 μL de proteína G agarose em 50% de solução aquosa (recombinat Protein G Agarose - Invitrogen™), que foram lavados por ressuspensão em microtubo com 1mL de TBS-T (Tris-HCI 50 mM - pH 7.5, NaCI 150 mM - Tween 20 0,1%), o sobrenadante foi retirado cuidadosamente após centrifugação à 4.000 rpm por 30 segundos em centrífuga refrigerada. Em seguida, a resina foi bloqueada por uma hora com tampão de bloqueio (NaHCO3 0,1M, pH 8,6; BSA 5mg/mL; NaN3 0,02%) a 4°C, sendo misturada de 15 em 15 minutos. Após a incubação, a mesma foi lavada por quatro vezes, conforme descrito anteriormente, para então receber a mistura de 300 ng de anticorpo purificado, juntamente com 1,5 x 1011 partículas virais em um volume final de 200 μL de TBS-T 0,1%, previamente incubados à temperatura ambiente por 20 minutos.

A mistura resina - anticorpo - fago foi invertida suavemente por três vezes durante os 15 minutos de incubação a temperatura ambiente e em seguida lavada por mais 10 vezes com um mL de TBS-T 0,1%, preparando-a para a eluição dos fagos ligantes feita com um mL de tampão de eluição (Glicina-HCI 0,2 M, pH 2,2; 1mg/mL de BSA) por 10 minutos à temperatura ambiente. Esta mistura foi centrifugada por 1 minuto a 4.000 rpm, o eluato foi transferido para um novo tubo e imediatamente neutralizado com 150 μL de Tris-HCI (1 M, pH 9,1).

Uma pequena amostra deste eluato (10 μL) foi titulada e o restante foi utilizado para reamplificação, realizada em 20 mL de cultura de E. coli (ER 2738) em fase inicial de crescimento (ODeoo^ 0.3) contendo tetraciclina e incubada por 4,5 horas em agitador com temperatura controlada a 37°C, antes do procedimento de precipitação dos fagos e posterior titulação.

Os fagos reamplificados a partir do primeiro ciclo de seleção foram utilizados em um segundo ciclo (2,0 x 1011 ufc) e assim subseqüentemente por um total de quatro ciclos, sendo que a partir do segundo ciclo a estringência do tampão de lavagem foi aumentada de 0,1% para 0,5%, utilizando-se então, 0,5% de Tween-20 em todas as lavagens. Após o término das seleções os fagos contendo os peptídeos recombinantes foram isolados e sequenciados (os procedimentos serão descritos posteriormente).

Para os experimentos descritos como Eluições Específicas com antígenos de parasitas, tanto para Leishmaniose Visceral como para Leishmaniose Tegumentar os procedimentos foram realizados em fase sólida.

No primeiro ciclo de seleção, um poço de uma placa de microtitulação (Corning Incorporated Costar®) foi sensibilizado com 150μL de anticorpos do tipo IgG de um “pool” de soros de pacientes com Leishmaniose Visceral (purificados por imunocromatrografia, concentrados, dialisados e quantificados por leitura espectrofotométrica direta), numa concentração de 100 μg/mL em tampão carbonato (NaHCOa 0,1 M, pH 8,6). A incubação ocorreu por toda a noite à temperatura de 4°C, sob agitação em ambiente umidificado.

Após o descarte da solução e secagem da placa, esta foi bloqueada com 300 μL de solução de bloqueio (NaHCOa 0.1 M, pH 8,6, 5 mg/mL BSA) por 1 hora a 4°C. A solução foi descartada e a placa lavada por 6 vezes com TBST (TBS - Tris-HCI 50 mM pH 7,5, NaCI 150 mM, água, 0,1% volume/volume de Tween 20) para então acrescentar 4 x 1010 partículas virais (10 μL da biblioteca comercial original) diluídas em 100 μl_ de TBST, sendo a placa mantida sob agitação por uma hora em temperatura ambiente. Os fagos não ligantes aos anticorpos foram retirados e a placa lavada por 10 vezes com TBST para a adição de 100 μL de uma solução 100 μg/mL de anticorpos do tipo IgG de pacientes controle saudáveis purificados para a eluição dos fagos ligantes a esses tipos de anticorpos, chamada então de eluição negativa. Esta mistura foi incubada por uma hora em temperatura ambiente, sob agitação. Os fagos contidos no sobrenadante foram descartados e a placa lavada por mais 10 vezes com TBST. Uma segunda eluição foi realizada, utilizando o antígeno recombianante rK39 na concentração de 100 pg/ml_ em um volume de 100 pL, com incubação de uma hora a temperatura ambiente. Os fagos contidos no sobrenadante, ligantes ao rK39, foram coletados para posterior amplificação e a placa foi novamente lavada por mais 10 vezes para realização da terceira eluição com 100 pL de uma solução (100 pg/mL) de antígeno total de L. chagasi, a incubação foi de uma hora a temperatura ambiente, e os fagos em sobrenadante foram também coletados para posterior amplificação. Os fagos provenientes das eluições com os antígenos foram utilizados nos ciclos posteriores da seleção. Uma pequena alíquota (1 pL) de ambos eluatos foram titulados para mensurar o número de partículas virais por titulação e o restante foi amplificado para serem utilizados nos ciclos posteriores.

A partir do segundo ciclo de seleção, dois poços foram sensibilizados com anticorpos purificados de pacientes positivos para Leishmaniose como anteriormente descrito. Para cada um destes poços foi feita a eluição negativa e específica, um para rK39 (Seleção Específica do Tipo 2) e outro para antígeno total de L.chagasi (Seleção Específica Tipo 3). Todos os procedimentos de bloqueio e lavagem foram semelhantes ao descrito anteriormente, exceto a concentração do tampão de lavagem que passou a ser TBST que passo a 0,5% (TBS (Tris-HCI 50 mM pH 7,5, NaCI 150 mM, água, 0,5% volume/volume de Tween 20) no segundo e demais ciclos.

Desta forma foram realizados um total de quatro ciclos, e então o eluato não amplificado foi titulado e as colônias azuis, foram colocadas individualmente em poços de placas “Deep Well” com 1,2 mL meio de cultura LB (20 μg/mL de tetraciclina) contendo bactérias ER2738 em fase inicial de crescimento. A cultura foi incubada sob agitação vigorosa (250 rpm/min) durante 5 horas. Após este período foram feitas alíquotas para “back-up” e as placas com a cultura restante permaneceram em incubação durante toda a noite para extração de DNA individual dos clones.

Para todos os processos de reamplificação e precipitação dos fagos recombinantes o procedimento foi o seguinte: A cultura foi transferida para um tubo de centrífuga e centrifugada (10 min, 4.000 rpm). As células residuais foram descartadas e o sobrenadante transferido para um novo tubo e re- centrifugado. Foi pipetado 80% do sobrenadante superior para um tubo limpo, onde foi adicionado 20% do volume de PEG-NaCI (20% peso/volume de polietileno glicol-8000; NaCI 2,5 M) e a mistura permaneceu em repouso durante toda a noite a 4°C. No dia seguinte, o produto da precipitação foi centrifugado por 15 min a 10.000 rpm e 4°C. O sobrenadante foi descartado e o tubo foi novamente centrifugado, nas mesmas condições anteriores por mais 5 minutos para que o sobrenadante residual pudesse ser removido. O “pellet” de fagos foi ressuspendido em 1 mL de TBS 1X, que foi transferido para um microtubo e centrifugado (5 min, 10.000 rpm, 5 min) para retirada das células residuais. O sobrenadante foi transferido para novo microtubo, para a adição de PEG-NaCI (1/6 do volume). A mistura foi incubada por 1 hora em gelo e então centrifugada (15 min, 14.000 rpm, 4°C). O sobrenadante foi descartado e o tubo re-centrifugado por mais 5 minutos para retirada do sobrenadante residual. O “pellet” foi ressuspendido em 200 μL de TBS 1X, estando prontos para a titulação.

O procedimento de titulação foi o seguinte tanto para os eluatos amplificados como para os não amplificados: foram realizadas diluições seriais de 10'1 a 10-4 e de 10'8 a 10’11, respectivamente. A nove μL de cada diluição foram adicionados 200 μL de bactérias ER2738 (ODeoo5, 0,5) incubando a mistura por 5 minutos antes que fosse plaqueada em meio LB (Tetracilina: 20 μg/mL, IPTG: 0,5 mM e X-gal 40 μg/mL), juntamente com 3 mL de Agarose Top (10 g de Bacto-Triptona, 5g de extrato de levedura, 5g de NaCI, 1 g de MgCI2 . 6H2O / litro). As placas foram incubadas a 37°C por toda noite, e as colônias azuis representantes das colônias infectadas por fagos foram contadas para obtenção do número de partículas infectantes (pfus) para entrada nos ciclos posteriores.

Para a extração de DNA dos fagos recombinantes, as colônias provenientes dos ciclos de seleção foram isoladas em placas “deep well” contendo 1 mL de meio de cultura com Bactérias ER2738 (OD6oo> 0,3) e incubadas sob agitação a 37°C por 24 horas. Após o período de cultura as placas foram centrifugadas por 10 minutos a 3.700 rpm a 4°C, e 800 μL do sobrenadante foram transferidos para uma nova placa, onde foi acrescentado 350 μL de PEG-NaCI e incubou-se por 10 minutos a temperatura ambiente. A mistura foi centrifugada por 40 minutos a 3.700 rpm, a 20°C. O sobrenadante foi descartado e a placa foi invertida sobre papel absorvente para retirar o excesso de meio de cultura. O precipitado foi ressuspendido em 100 pL de tampão iodeto (Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, Nal 4 M) e foi adicionado 250 pL de Etanol Absoluto, incubando a mistura por mais 10 minutos a temperatura ambiente antes de submetê-la novamente a centrifugação por 40 minutos a 20°C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 150 pL de Etanol 70%, e centrifugado por mais 15 minutos a 20°C. Todas as centrifugações ocorreram com rotação de 3.700 rpm. O DNA foi solubilizado em 20 pL de água ultrapura estéril e qualificado por eletroforese em gel de Agarose 0,8%, comparando-o com padrão de DNA de fago M13 disponibilizado pelo fabricante da biblioteca.

As amostras isoladas foram submetidas a sequenciamento automático utilizando o Kit Big Dye Terminator (GE Healthcare) e sequenciador automático MegaBace 1000 (GE Healthcare). Na reação de sequenciamento, utilizou-se aproximadamente 3 pL de DNA (dependendo da quantificação média dada por leitura espectrofotométrica), 4pL de premix e 10 pmoles do primer - 96 M13 - (5'-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG -3'- GE Healthcare), que amplifica a região dos aminoácidos codificantes dos peptídeos randômicos fusionados nos fagos M13 recombinantes, sendo o volume da reação completado para 10 pL. A reação ocorreu em termociclador (Mastercicler, Eppendorf) por 35 ciclos, com desnaturação de 30 segundos a 95°C, anelamento dos primers por 30 segundos a 50°C e extensão por 30 segundos a 60°C.

O processamento das sequências foi feito pelo “software” do equipamento (Sequence Analyser, BASE CALLER, Cimarron 3.12, Phred 15). Com posse das sequências de DNA, estas foram traduzidas pelo programa DNA2PRO (http://relic.bio.anl.qov/proqrams.aspx), gerando as sequências de 12 peptídeos esperadas.

Os alinhamentos entre as sequências distintas foram feitos pelo programa ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) para delinear prováveis consensos. Os alinhamentos das sequências com proteínas de Leishmania foram realizados pelo programa BLAST - Basic Local Alignment Search Tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Os fagos mais freqüentes nas populações das seleções específicas (Seleção Tipo 2 e Seleção Tipo 3) para Leishmaniose Visceral e os controles (fago selvagem e antígeno recombinante rK39) foram submetidos a ensaios de dot-blot competitivo com antígeno total de L. chagasi e fago selvagem.

Os 33 clones com sequências distintas foram testados em ensaio de dot- blot contra anticorpos purificados de pacientes com Leishmaniose Visceral, Tegumentar e Controle saudável, juntamente com os seguintes controles: Fago selvagem, Fago irrelevante (selecionado a partir de outra seleção) e antígeno recombinante rK39.

As membranas de nitrocelulose foram sensibilizadas com fagos (5,0x 109 partículas virais diluídas em dois μL de TBS), deixando que secassem por 2 minutos a temperatura ambiente. Cada membrana foi bloqueada com um mL de solução de bloqueio (TBS-M Moliço 5%), incubada sob agitação por duas horas e posteriormente lavada por três vezes com tampão de lavagem (TBST - 0,5% de Tween 20). Foram adicionados a cada membrana, 500 μL do respectivo anticorpo purificado (Visceral, Tegumentar, Negativo) na concentração de 25 pg/mL diluído em bloqueio, e em seguida, incubou-se por uma hora. Após a incubação, as membranas foram novamente lavadas por seis vezes com tampão de lavagem e incubadas com 500 μL de anticorpo secundário anti-lgG marcado com Fosfatase Alcalina diluído em bloqueio e incubadas por uma hora e em seguida, lavadas por mais 6 vezes, reveladas com solução de NBT/BCIP e lavadas com água antes de serem secas para a digitalização das imagens. Todas as incubações foram realizadas a temperatura ambiente e sob agitação lenta.

Os clones com maior reatividade no ensaio anterior foram submetidos a um novo ensaio competitivo (14 clones) juntamente com os controles (Fago Selvagem, Fago Irrelevante, Antígeno total de L.chagasi e antígeno recombinante rK39).

Os antígenos (fagos e controles) foram adicionados sobre as tiras de membrana de nitrocelulose, deixando em repouso para secagem por dois minutos e em seguida foi acrescentado um mL de bloqueio (TBS-M - Moliço 5%) que agiu por duas horas. Durante este período, a solução de anticorpo purificado de pacientes com Leishmaniose Visceral foi incubada com antígeno total de L. chagasi diluído serialmente (de 400 μg/mL a 0,5 pg/mL incluindo controle sem anticorpo). Após o período de bloqueio, as membranas foram lavadas por três vezes com tampão de lavagem (TBS-T - 0,5% de Tween 20) e foi então adicionada a mistura pré-incubada de anticorpos e antígenos, que permaneceram em contato com a membrana por uma hora. As membranas foram lavadas por mais seis vezes com o tampão de lavagem e adicionou-se 500 pL de anticorpo secundário anti- IgG marcado com Fosfatase Alcalina (1:5000 em bloqueio) e incubou-se por uma hora. Foram feitas seis lavagens como as acima descritas e posteriormente, procedeu-se a revelação com um mL de solução reveladora (NBT/BCIP). As membranas foram lavadas com água e secadas para digitalização das imagens. Todas as incubações citadas ocorreram à temperatura ambiente, sob agitação lenta.

Claims (5)

1. Peptídeos recombinantes miméticos a antígenos de Leishmania, seus motivos proteicos e sequências reversas, caracterizados pelo fato de que compreendem as sequências Seq ID N° 1 a Seq ID N° 170.

2. Uso dos peptídeos recombinantes miméticos, seus motivos proteicos e sequências reversas conforme definidos na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é no diagnóstico das leishmanioses, como sondas para detecção “in vitro” da presença de anticorpos circulantes ou outras moléculas ligantes contra parasitos do gênero Leishmania.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a detecção de anticorpos circulantes ou moléculas circulantes é realizada por ensaios imunológicos, como por exemplo testes imunoenzimáticos (tais como ELISA, "Western Blot", imunofluorescência, imunohistoquimica, EIA, e outros), testes por imunoaglutinação, sensores eletroquímicos, “Quantum dots”, IFL (imunoensaio de fluxo lateral) ou outras formas de detecção relacionadas direta ou indiretamente em amostras de fluidos corporais, como saliva, urina e sangue.

4. Uso dos peptídeos recombinantes miméticos, seus motivos proteicos e sequências reversas conforme definidos na reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que é na preparação de composições vacinais, para estimular o sistema imune humano ou animal contra parasitos do gênero Leishmania.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que as sequências identificadas por Seq ID N° 1 a Seq ID N° 112 e Seq ID N° 165 a Seq ID N° 170 são preferencialmente para diagnóstico diferencial da forma Visceral da Leishmaniose e as Seq ID N° 113 a 164 são preferencialmente para diagnóstico diferencial da forma Tegumentar da Leishmaniose.

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