BRPI0903337A2

BRPI0903337A2 - espécies helicobacter e cultura das mesmas

Info

Publication number: BRPI0903337A2
Authority: BR
Inventors: Margot Baele; Freddy Haesebrouck
Original assignee: Univ Gent
Priority date: 2008-06-06
Filing date: 2009-05-21
Publication date: 2010-06-15
Also published as: CA2665955A1

Abstract

A presente invenção refere-se ao isolamento e cultura de "Candidatus helicobacter suis" e isolados de "Candidatus helicobacter suis" obteníveis por esses métodos. A presente invenção adicionalmente refere-se ao uso dessas bactérias para a fabricação de preparações de antigeno e vacinas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ESPÉCIES HELICOBACTER E CULTURA DAS MESMAS".

Campo de Invenção

A presente invenção refere-se a métodos e ferramentas paraisolamento e/ou cultura in vitro de espécies Helicobacter, mais particular-mente "Candidatos helicobacter suis". A invenção adicionalmente refere-se àpreparação de antígenos e vacinas a partir das culturas isoladas de "Candi-datus helicobacter suis".

Antecedentes

Infecções por Helicobacter pylori em humanos são a maior cau-sa de úlceras gástricas e duodenais bem como câncer gástrico. H. pylori nãoé somente a espécie Helicobacter capaz de colonizar a mucosa gástricahumana. "Helicobacter heilmannii (nome proposto) foi encontrada em apro-ximadamente 0,96% de biópsias gástricas em humanos (Heilmann & Bor-chard (1991) Gut 32, 137- 140). Este organismo é fortemente associado comgastrite, mas também é associado a ulceração peptídica, adenocarcinomagástrico, e linfoma de tecido linfoide associado com mucosa. Evidência re-cente indica que "H. Heilmannir não é uma espécie única, mas representadiferentes espécies bacterianas com morfologias espirais similares, a maio-ria das quais são provavelmente de origem zoonótica. Classificação em "H.heilmannir tipo 1 e "H. heilmannii'" tipo 2 foi estabelecida com base nas se-qüências de gene rRNA 16S (Solnick et al. (1993) J. Infect. Dis. 168, 379-385). Mais do que 50% das infecções por "H. heilmannir em humanos sãodevido a "H. heilmannii" tipo 1 (Trebesius et al. (2001) J. Clin. Microbiol. 39,1510-1516.). H. heilmannir tipo 1 mostrou-se idêntica a "Candidatus H. suis"(0'Rourke et al. (2004) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 2203-2211), uma bac-téria espiral não cultivada até aqui que coloniza o estômago de mais do que60% de porcos sacrificados. O papel atual de Candidatus H. suis em doençagástrica em porcos é ainda uma forma de debate, mas foi sugerido que estabactéria seja associada com ulceração gástrica de pars oesophagea e comgastrite pilórica crônica. Inoculação em camundongo foi usada para inocularesta bactéria contra mucosa de estômago de porco infectado (Dick et al.(1989J J. Med. Microbiol. 29, 55-62). Hellemans et al. [(2005) Antimicrob.agents chemother. 49, 4530-4535] modificou a existência de modelo de ca-mundongo in vivo de infecção Candidatus H. suis, para avaliar a suscetibili-dade antibiótica deste organismo. Cultura in vitro de Candidatus H. suis ain-da não foi alcançada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada no desenvolvimento de sistemasde cultura que permitem o isolamento e cultura de espécies Helicobacter,mais particularmente de "Candidatus helicobacter suis", que não demonstrouanteriormente ser sustentável como um isolamento in vitro.

Um primeiro aspecto da invenção refere-se ao uso de um siste-ma de cultura, mais particularmente um sistema de cultura compreendendoum componente sólido, isto é, um meio sólido, compreendendo pelo menos7,5% de sangue ou 10% de soro, o meio sólido sendo ajustado a um pH en-tre 5,0 e 6,0, para o isolamento de espécies Helicobacter.

Em uma modalidade específica, o componente sólido compre-ende nutrientes para o crescimento de organismos meticulosos. Mais parti-cularmente esses nutrientes são selecionados do grupo consistindo em Bru-cella, Mueller-Hinton ou meio de infusão Brain Heart. Em modalidades espe-cificas adicionais, o soro presente no componente sólido é soro em umaconcentração de pelo menos 12,5 %. Em outra modalidade específica, osangue presente no componente sólido está presente em uma concentraçãode pelo menos 10 %.

Mais especificamente, a invenção refere-se ao uso de sistemasde cuiiura descritos acima no isolamento de "Candidatus helicobacter suis".

Em um segundo aspecto, a presente invenção prove métodospara o isolamento de espécies Helicobacter, mais particularmente "Candida-tus helicobacter suis", a partir de uma amostra compreendo espécies Heli-cobacter, métodos que compreendem as etapas de cultivar a amostra com-preendendo espécies Helicobacter em um sistema de cultura compreenden-do um meio de cultura tendo um pH entre 5,0 e 6,0, que é suplementadocom pelo menos 10 % de soro ou pelo menos 7,0 % de sangue.Em modalidades específicas desses métodos, o meio de culturausado compreende nutrientes para o crescimento de bactérias meticulosas.

Mais especificamente, os nutrientes para o crescimento de bactérias meticu-losas são selecionados do grupo consistindo em Brucella, Mueller-Hinton ounutriente de infusão de Brain Heart. Adicional ou alternativamente, em moda-lidades específicas, o meio de cultura compreende pelo menos uma subs-tância seletiva que inibi o crescimento de fungos e/ou bactérias Gram-positivas e/ou Gram-negativas, que não a espécie Helicobacter a ser cultiva-da. Em modalidades específicas adicionais, a pelo menos uma substânciaseletiva é selecionada do grupo consistindo em: vancomicina, lactato de tri-metoprima, polimixina B, cefsulodina, colistinaa, amfotericina B, violeta cris-tal, nistatina e nisin.

Em modalidades específicas dos métodos da presente invençãodescrita aqui, o meio de cultura compreendendo pelo menos 10% de sorocompreende entre 12,5 e 25 % de soro. Alternativamente, o meio de culturacompreendendo pelo menos 7,0% de sangue compreende entre 7,5 e 15 %,mais particularmente entre 10 e 15% de sangue.

Opcionalmente, o meio de cultura usado nos métodos da pre-sente invenção adicionalmente compreendem um ou mais fatores de cres-cimento selecionados do grupo consistindo em Vitamina B12, L-glutamina,Adenina, Guanina, Ácido p-aminobenzoico, L-cistina, NAD (Coenzima 1),Cocarboxilase, nitrato férrico, Tiamina e cloridrato de cisteína.

Em uma modalidade específica dos métodos da invenção descri-ta aqui, um sistema de cultura é usado o qual compreende um componentesóiido e um líquido, em que pelo menos o componente sólido compreende omeio de cultura como descrito acima. Em modalidades adicionais, ambos oscomponentes sólido e/ou líquido compreendem nutrientes para o crescimen-to de bactéria meticulosa. Mais especificamente, esses nutrientes são sele-cionados do grupo consistindo em Brucella, Mueller-Hinton ou nutriente deinfusão de Brain Heart.

Em uma modalidade específica adicional dos métodos da inven-ção, o componente sólido e/ou líquido dos sistemas de cultura compreen-dem pelo menos uma substância seletiva que inibe o crescimento de fungose/ou bactérias gram-positivas e/ou gram-negativas que não espécies Helico-bacter a serem cultivadas. Mais particularmente, pelo menos uma substânciaseletiva é selecionada do grupo consistindo em: vancomicina, lactato de tri-metoprima, polimixina B, cefsulodina, colistinaa, amfotericina B, violeta cris-tal, nistatina e nisina.

Modalidades específicas adicionais dos métodos da invençãofazem uso de sistemas de cultura que compreendem um componente sólidoe um líquido, em que o componente sólido compreende entre 12,5 e 25 % desoro ou entre 7,5 e 15%, mais particularmente entre 10 e 15 % de sangue.Modalidades específicas adicionais dos métodos da invenção fazem uso desistemas de cultura que compreendem um componente sólido e um líquidocomo descrito acima, em que o componente sólido e/ou líquido adicional-mente compreende um ou mais fatores de crescimento selecionados do gru-po consistindo em Vitamina B12, L-glutamina, Adenina, Guanina, ácido p-aminobenzoico, L-cistina, NAD (Coenzima 1), Cocarboxilase, Nitrato férrico,Tiamina e Cloridrato de cisteína.

Os métodos da presente invenção são particularmente adequa-dos para o isolamento de "Candidatos helicobacter suis". Na verdade, a pre-sente invenção prove, pela primeira vez, um método para obter um "Candi-datus helicobacter suis" isolado. Este isolado é livre de outras espécies Heli-cobacter, a partir de bactérias não helicobacter e a partir de fungo.

Consequentemente, um terceiro aspecto da presente invençãoprove isolados de espécies Helicobacter, mais particularmente isolados de"Candidatus helicobacter suis". Tais isolamentos que são aqui demonstradospela primeira vez, são obteníveis pelos métodos da presente invenção. Umamodalidade particular deste aspecto da invenção prove a cultura depositadaLMG P-24572 e culturas de Candidatus helicobacter suis obtidos da mesma.

Ainda outro aspecto da presente invenção prove métodos para acultura de isolados de Espécies Helicobacter, tais métodos compreendem aetapa de aplicar o isolado de Helicobacter em um sistema de cultura quecompreende um meio de cultura tendo um pH entre 4,0 e 7,0 que é suple-mentado com pelo menos 10 % de soro ou pelo menos 7,5 % de sangue, eincubando o isolado no mesmo.

Em modalidades específicas dos métodos de acordo com esteaspecto da invenção, o sistema de cultura usado compreende um compo-nente sólido e um líquido, e pelo menos o componente sólido deste sistemade cultura compreende o meio de cultura acima mencionado.

Em modalidades específicas adicionais desses métodos de cul-tura providos na presente invenção, o componente sólido e o líquido com-preendem nutrientes para o crescimento de bactéria meticulosa.

Em modalidades específicas, pelo menos o componente sólidodo sistema de cultura usado nos métodos de cultura da presente invenção, étamponado em um pH entre 4,7 e 7,0.

Ainda outro aspecto da presente invenção prove recipientes decultura que compreendem um meio de cultura sólido para o isolamento e/oucultura de Espécies Helicobacter, o meio sólido compreendendo: nutrientespara o crescimento de organismos meticulosos, sangue em uma concentra-ção entre 7,5 e 15 % ou soro em uma concentração entre 12,5 e 25 %, epelo menos uma substância seletiva que inibe o crescimento de fungos e/oubactérias Gram-positivas e/ou Gram-negativas que não Espécies Helicobac-ter a serem cultivadas, tal recipiente de cultura é caracterizado pelo fato deque o pH do meio sólido compreendido aqui está entre 5,0 e 6,0. Mais espe-cificamente, pelo menos uma substância seletiva é selecionada do grupoconsistindo em vancomicina, lactato de trimetoprima, polimixina B, cefsulodi-na, colistinaa, amfotericina B, violeta cristal, nistatina e nisina. Em modalida-des específicas dos recipientes de cultura da presente invenção, o meio só-lido compreende ágar.

Ainda um aspecto adicional da presente invenção prove vacinasque compreendem uma preparação de antígeno de um de um isolado de"Candidatus helicobacter suis". Na verdade, a presente invenção prove mé-todos para produzir preparações de "Candidatus helicobacter suis", tais mé-todos compreendem o isolamento e opcionalmente a cultura de "Candidatushelicobacter suis" de acordo com os métodos descritos acima e a produçãode uma preparação de antígeno a partir do isolado de "Candidatos helico-bacter suis" obtido.

Adicionalmente, a presente invenção prove vacinas que com-preendem um isolado de "Candidatos helicobacter suis" atenuado vivo, e/ouum isolado de "Candidatos helicobacter suis" totalmente mortos e métodospara preparar tais vacinas que compreendem o isolamento e opcionalmentemétodos de cultura descritos acima.

Em modalidades particulares, a invenção prove vacinas compre-endendo uma preparação de antígeno de isolados de "Candidatos helico-bacter suis" depositados como LMB P-24572.

Ainda outro aspecto da presente invenção prove métodos paravacinar um animal contra uma infecção por "Candidatos helicobacter suis",tais métodos compreendem administrar ao animal uma vacina compreen-dendo uma ou mais de uma preparação de antígeno a partir de um isoladode "Candidatos helicobacter suis", um isolado de "Candidatos helicobactersuis" atenuado vivo, e/ou um isolado de "Candidatos helicobacter suis" to-talmente morto.

Similarmente, a presente invenção visa o uso de um isolado deuma espécie Helicobacter, mais particularmente um isolado de "Candidatoshelicobacter suis", que pode ser isolado e/ou cultivado pelos métodos descri-tos aqui, ou o uso de preparações de antígeno a partir de isolado de "Candi-datos helicobacter suis", para a fabricação de uma vacina para a prevençãoe/ou tratamento de uma infecção por espécies Helicobacter. Mais particu-larmente, o uso de uma preparação de Espécies Helicobacter, o mais parti-cularmente de "Candidatos helicobacter suis" é visado para a fabricação deuma vacina para a prevenção e/ou tratamento de uma infecção por EspéciesHelicobacter, o mais particularmente para imunização contra "Candidatoshelicobacter suis".

Em modalidades particulares, a presente invenção refere-se amétodos de vacinar um animal contra uma infecção por "Candidatos helico-bacter suis" compreendendo administrar ao animal uma vacina que compre-ende uma ou mais de:- uma ou mais preparações de antígeno a partir de isolado de"Candidatos helicobacter suis" depositado como LMG P-24572,

- "Candidatos helicobacter suis" atenuados vivos do isolado de"Candidatos helicobacter suis" depositado como LMG P-24572, e/ou

"Candidatos helicobacter suis" completamente mortos do isoladode "Candidatos helicobacter suis" depositado como LMG P-24572.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção será descrita com referência a certas mo-dalidades, mas a presente invenção não é limitada as mesmas, mas apenaspelas reivindicações.

Os termos "Candidatos helicobacter suis" (ou Candidatus H. suisou H. suis) como usados aqui referem-se a uma bactéria que foi previamenteconhecida como "Helicobacter heilmannir tipo I (Trebesius et al. (2001) J.CHn. Microbiol. 39, 1510-1516). É agora aceito que "H. heilmannir tipo 1 éidêntica a "Candidatus H. suis" (0'Rourke et al. (2004) Int. J. Syst. Evol. Mi-crobiol. 54, 2203-2211 ; De Groote ei al. (1999) Int. J. Syst. Bacteriol. 49,1769-1777), uma bactéria em formato espiral que coloniza o estômago demais de 60% de porcos abatidos. "Candidatus helicobacter suis" é tambémdefinido no nível molecular com a Espécies Helicobacter tendo um gene deseqüência de rRNA 16S com Genbank Accession AF 127028 [SEQ ID N0.7](De Groote et al. (1999) citada acima) e AF506788-92 (0'Rourke et al.(2004) citada acima) e uma seqüência de gene urease como descrita emGenbank Accession AF508013 [SEQ ID NO:8] e AF508014 e (0'Rourke etal. (2004) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 2203-2211).

O termo "isolado" como descrito aqui, é uma cultura pura, ho-mogênea, in vitro de um micro-organismo. Ele pode ser derivado de umapopulação de micro-organismos heterogênea, selvagem de micro-organismos por cultura in vitro dos mesmos.

O termo "recipientes de cultura" como usado no contexto da pre-sente invenção refere-se a um recipiente adequado para cultivar micro-organismos, tais como mas não limitados a placas de petri, frascos de cultu-ra, frascos rotativos, e compartimentos celulares. O termo "preparação deantígeno" como usado no contexto da presente invenção refere-se a umacomposição que compreende pelo menos uma proteína da mesma que pro-voca uma resposta imune (doravante referida como 'antígeno') quando ad-ministrada a um animal.

O termo "vacina" como usado aqui refere-se a uma composiçãotal como uma preparação de antígeno descrita acima, para administração aum animal ou humano com o objetivo de estimular uma resposta imune noanimal ou humano direto contra um organismo que causa a doença, paraproteger o animal ou humano de doenças ou enfermidades causadas por talorganismo. As vacinas podem compreender organismos causadores de do-enças inteiros (morto ou enfraquecido) ou partes de tais organismos, ou mo-léculas sintéticas que correspondem a todos ou partes de tais organismos. Otermo vacina engloba ambas as composições usadas para uso profilático,isto é, para administração ao animal ou humano antes da infecção, com aintenção de prevenir infecção inicial (e/ou recorrente) e composições parauso terapêutico, isto é, para administração ao animal ou humano após infec-ção com a intenção de reduzir ou acabar com a progressão da doença cau-sada pelo organismo.

O processo de vacinação no qual antígenos de uma espécie u-sam para proteger contra doença causada por outra espécie em uso é refe-rido como "vacinação reticulada" ou "vacinação heteróloga".

O termo "material gástrico" como usado aqui refere-se a qual-quer material obtido diretamente ou indiretamente do trato gastrintestinal dehumano ou outro animal. Tais materiais incluem, por exemplo, epitélio gás-irico, mucosa gástrica, e fluidos digestivos.

O termo "meio" como usado aqui refere-se a uma composiçãosólida ou semi-sólida adequada para o crescimento de micro-organismos.

Concentrações são expressas como percentagens vol/vol. Istoaplica-se a meios líquidos, mas também a meios sólidos, antes de sua solidi-ficação (por exemplo, caldo de ágar morno).

O termo "organismos meticulosos" é usado aqui de acordo comseu significado padrão em bacteriologia, isto é, para referir-se a bactériastendo exigências nutricionais complexas [Stedmans Medicai Dictionary].

Um primeiro aspecto da invenção prove métodos in vitro paraisolar e/ou cultivar Espécies Helicobacter, em particular "Candidatus helico-bacter suis". O isolamento in vitro de H. suis ainda não foi descrito. A pre-sente invenção prove métodos que permitem o crescimento seletivo de Es-pécies Helicobacter, mais particularmente "Candidatus helicobacter suis".Condições de crescimento seletivo para "Candidatus helicobacter suis" fo-ram alcançadas pela combinação de altas concentrações de sangue ou soroe a provisão de condições de pH ideais. As condições de pH que são benéfi-cas para o crescimento de Espécies Helicobacter são ao mesmo tempo pre-judiciais para um número de bactérias não Helicobacter e fungos. Aplicandobaixo pH, a contaminação é reduzida, permitindo que "Candidatus helicobac-ter suis" se expanda.

Nos métodos de isolamento da presente invenção, uma amostraque compreende Espécies Helicobacter é cultivada em um meio, o pH doqual é ajustado para um valor entre cerca de 5,0 e cerca de 6,0. Este ajustede pH pode ser realizado pela adição de um ácido concentrado aos nutrien-tes do meio, que proveem suficiente capacidade tamponante, pela presençade aminoácidos que atuam como íons zwiteriônicos. Tampões alternativa-mente biocompatíveis com uma capacidade tamponante elevada em tornode pH 5,0 a 5,5 (tal como acetato, fosfato) são adicionados ao meio de cultu-ra. Foi surpreendentemente encontrado que o isolamento de "Candidatushelicobacter suis" em valores de pH entre 5,0 e 6,0 resultaram em bactériasmóveis espirais, enquanto fora desta região de pH, Candidatus H. suis apa-rece como formas cocoid não móveis. Como explicado após em detalhesnos exemplos, o efeito do pH sobre Candidatus H. suis muda em algumaextensão com a passagem subsequente. Enquanto o isolamento de Candi-datus H. suis for bem sucedido em um pH entre 5,0 e 6,0.

De acordo com uma modalidade, os métodos da presente inven-ção compreendem a aplicação de uma amostra contendo Helicobacter, maisparticularmente Candidatus H. suis para um sistema de cultura, que é umsistema de cultura de dois componentes, que compreende um componentesólido e um líquido (ou semilíquido), desse modo a amostra é provida nocomponente líquido. Tipicamente, o componente sólido compreende ágar, eo componente líquido é um caldo compreendendo pelo menos nutrientes.

Foi observado que em tais sistemas de cultura, o isolado Helicobacter per-manece na fração fluida e pode ser subcultivado transferindo para outrocomponente sólido. Onde um sistema de dois componentes é usado nosmétodos de isolamento da presente invenção, pelo menos o componentesólido tem um pH entre 5,0 e 6,0.

O meio de cultura nos métodos de isolamento da presente in-venção compreende altas concentrações de sangue (entre 7,5 e 25%) ou umcomponente sangüíneo como soro (entre 12,5 e 30%). A menos que de ou-tra maneira indicado concentrações de soro e de sangue são porcentagensde volume (v/v) no meio. Em modalidades particulares, a concentração dosoro no meio está entre 12,5 e 25% incluindo concentrações tais como 12,5,15, 17,5, 20 e 25%. Em outras modalidades particulares, a concentração desangue no meio está entre 7,5 e 25%, mais particularmente entre 8 e 20%,especialmente entre 9 e 15%, incluindo concentrações tais como 9,5, 10 e12,5%. Onde um sistema de cultura de dois componentes é usado, pelo me-nos o componente sólido, mas opcionalmente também o componente líqui-do, do sistema de cultura deve conter a concentração de soro ou sangueespecificada.

O soro presente no meio de cultura usado no contexto da pre-sente invenção pode ser ou fetal, recém-nascido ou soro adulto de diferentesespécies de animal, tal como, mas não limitados a, gado, cavalo, ovelha,cabra, ou porco, mais particularmente soro de cavalo, ou uma combinaçãodos mesmos. Tipicamente, o soro contém inter alia proteínas de ligação deferro tais como albumina e trasferrina, que proveem ferro a Helicobacter.Substitutos de soro ou sangue adequados contendo componentes essenci-ais dos mesmos podem ser usados.

Diferentes tipos de sangue são adequados para os métodos dapresente invenção tais como, mas não limitados a, sangue de gado, ovelha,cabra ou porco. Em modalidades particulares, a concentração de sangue nomeio está entre 7,5 e 15 % incluindo concentrações tais como 10 e 12,5 %de sangue.

De acordo com uma modalidade particular, os meios de culturausados nos métodos de isolamento iniciais da presente invenção adicional-mente compreendem agentes antimicrobianos adicionais que asseguram ocrescimento seletivo de Helicobacter. Tais agentes antimicrobianos incluemagentes antifúngicos, que limitam ou inibem o crescimento de bactérias nãoHelicobacter ou levedura potencialmente presente na amostra. Onde umsistema de dois componentes é usado estes agentes antimicrobianos estãopresentes pelo menos no componente sólido, e opcionalmente também nocomponente fluido ou semifluido.

Em modalidades particulares o meio de cultura da presente in-venção compreende um ou mais antibióticos que inibem o crescimento defungos e/ou bactérias Gram-positivas e/ou Gram-negativas diferentes dasEspécies Helicobacter a serem cultivadas. Exemplos de tais antibióticos sãovancomicina, lactato de trimetoprima, polimixina B, cefsulodina, colistinaa,amfotericina B, violeta cristal, nistatina e nisina. Uma composição de antibió-tico comercialmente disponível que é adequada nos métodos da presenteinvenção é, por exemplo, suplemento Skirrow (Oxoid) resultando em umaconcentração final no meio de 10 mg/ml de vancomicina, 5 mg/l de lactato detrimetoprima e 2500 IU/I de polimixina B. outros compostos antibióticos são,por exemplo, compostos antifúngicos tais como Amfotericina B (fungizona).

Usando os métodos de isolamento descritos acima, isolados apartir de Candidatus H. suis, isto é, culturas que podem ser mantidas e pas-sadas in vitro sem requerer a passagem em um hospedeiro vivo, têm sidoobtidas. Um exemplo de tal um isolado foi depositado como LMG P-24572(ver abaixo).

Uma vez que um isolado de Helicobacter, tal como CandidatusH. suis foi obtido, ele pode ser adicionalmente cultivado usando condiçõesde cultura descritas acima para os métodos de isolamento da presente in-venção. Entretanto, foi observado que a cultura de uma cultura isolada épossível em uma ampla faixa de pH, isto é, entre 4,0 e 7,0. O pH é mais cri-tico no procedimento de isolamento como, em um pH acima de 6,0, dos con-taminantes presentes em amostras de estômago recentemente isoladas (ou-tras bactérias e fungos) irão abandonar o Helicobacter presente na amostra,que é prejudicial ao isolamento. Foi observado, entretanto, que para isoladosde Candidatus H. suis contendo menos contaminantes, crescimento de umpH até 7,0 é possível. Consequentemente, a presente invenção prove méto-dos de cultura para isolados de Helicobacter, mais particularmente Candida-tus H. suis, como descrito acima, em que o pH do meio de cultura está entrecerca de 4,0 e cerca de 7,0, em particular entre (e incluindo) cerca de 4,7 e6,0. Os métodos de cultura da presente invenção são particularmente ade-quados para a cultura do isolado depositado como LMG P-24572 e isoladosderivados do mesmo.

Os antibióticos e antifúngicos descritos acima, são especifica-mente adequados no processo de isolamento em que diferentes bactérias efungos estão presentes em uma amostra. Entretanto uma vez que um isola-do puro é obtido a cultura pode ser alcançada com menos antibióticos ouantifúngicos ou sem os mesmos no meio de cultura.

Em modalidades particulares de ambos os métodos de isola-mento e/ou cultura da presente invenção, o meio de cultura adicionalmentecompreende fatores de crescimento adicionais. Uma mistura comercial defatores de crescimento é, por exemplo, vendida sob o nome de Vitox (O-xoid). Concentrações finais de fatores de crescimento em um meio de cres-cimento (ágar ou caldo) são Vitamina B12 (0,5 mg/l), L-glutamina (50,0 mg/l),adenina (5,0 mg/l), guanina (0,15 mg/l), ácido p-aminobenzoico (0,65 mg/l),L-cistina (5,5 mg/l), NAD Coenzima-1 (1,25 mg/l), cocarboxilase (0,5 mg/l),nitrato férrico (0,1 mg/l), tiamina (0,015 mg/l) e Cloridrato de cisteína (130,0mg/l). Onde um sistema de dois componentes é usado, os fatores de cres-cimento podem estar presentes ou no componente sólido ou no componentelíquido ou em ambos. De acordo com uma modalidade particular, os fatoresde crescimento são adicionados ao componente sólido.

Tipicamente, o meio usado nos métodos de isolamento e/ou cul-tura da presente invenção contém nutrientes para o crescimento de orga-nismos meticulosos. Esses nutrientes são tipicamente providos pela adiçãode meios tais como, mas não limitados a meio Brucella, meio Mueller-Hinton,Infusão por Brain Heart bovino e porcino e meios equivalentes, tais como,mas não limitados a ágar Columbia, ágar de soja Tryptic. Meios Brucella tipi-camente compreendem em um meio 10 g de digestão pancreática de caseí-na, 10 g de digestão peptídica de tecido animal, 1 g de dextrose, 2 g de ex-trato de levedura, 5 g de cloreto de sódio e 0.1 g de bissulfito de sódio. Nes-tas peptonas fornecem nitrogênio orgânico. O extrato de levedura é uma po-tente fonte de Vitaminas B. Dextrose é utilizada como fonte de energia. MeioMueller-Hinton tipicamente compreende em um litro de meio 2 g de infusãopor alimento 17,5 g de hidrolisato de caseína e 1,5 g de amido. Tais meiossão comercialmente disponíveis de companhias tais como Difco e Oxoid.

A presente invenção prove métodos para o isolamento e/ou cul-tura de espécies Helicobacter, que permitem o isolamento e cultura de umisolado de Helicobacter verdadeiro, mais particularmente isolado de "Candi-datos helicobacter suis". É entendido, entretanto, que outros fatores existemque influenciam o enriquecimento de Espécies Helicobacter. Tais fatoresincluem a forma que a amostra compreendendo as espécies Helicobacter éobtida, mais particularmente, a forma em que o estômago e a parede do es-tômago são tratados ao recuperarem-se de um material gástrico para mini-mizar a contaminação com outros organismos.

Consequentemente, modalidades particulares dos métodos deisolamento da presente invenção adicionalmente compreendem uma primei-ra etapa de prover uma amostra de material gástrico compreendendo Espé-cies Helicobacter, sob condições específicas. Em uma modalidade, uma par-te da parede do estômago é incubada em condições acídicas que matam umnúmero considerável de organismos instáveis ácidos. Em uma modalidadeparticular adicional a parede do estômago é processada isolando apenas omuco da superfície do estômago.

Os meios usados nos métodos de isolamento e/ou cultura dapresente invenção, opcionalmente compreendem um ou mais componentesadicionais.Em modalidades particulares dos métodos da presente invençãoo meio de cultura adicionalmente compreende carvão ativo. Onde um siste-ma de dois componentes é usado, o carvão ativo está tipicamente presentepelo menos no componente sólido.

Em modalidades particulares dos métodos da presente inven-ção, o meio de cultura adicionalmente compreende um indicador de pHcompatível que muda de cor em um pH entre 5,5 e 6,0. Por exemplo, o ver-melho de fenol que se torna amarelo abaixo de pH 6,6 e vermelho acima depH 8 poderia ser usado. Tais indicadores são especialmente úteis em placascompreendendo soro. Tipicamente, em um sistema de dois componentes, talum indicador de pH está presente no componente sólido.

Em modalidades particulares, os métodos dos métodos de iso-lamento e/ou cultura da presente invenção compreendem a aplicação deuma amostra compreendendo Espécies Helicobacter em um sistema de doiscomponentes, em que o componente sólido compreende dois componentes,fatores de crescimento e antibióticos, e é ajustado para um valor de pH entre4,7 e 7,0 (ou mais particularmente entre 5,0 e 6,0), enquanto o componentelíquido apenas compreende nutrientes sem o ajuste do pH. Opcionalmente opH do componente líquido é ajustado para um valor de pH entre 4,7 e 7,0(ou mais particularmente entre 5,0 e 6,0) e/ou o componente líquido tambémcompreende fatores de crescimento e antibióticos.

Configurações práticas particulares podem ser consideradas pa-ra realizar os métodos da presente invenção. Tipicamente, isolamento e cul-tura são realizados em frascos de cultura ou placas de petri (placas). Emmodalidades particulares os métodos envolvem um sistema de dois compo-nentes, desse modo o componente sólido cobre o fundo inteiro do recipientede cultura (com uma espessura típica de entre 1mm e 5mm) e o componentelíquido ou semilíquido é espalhado sobre toda ou parte da superfície docomponente sólido.

Em uma modalidade muito particular, o isolamento é alcançadoem um recipiente semelhante a placa de petri com um diâmetro de 10cmcompreendendo entre cerca de 5 a 15 ml de uma ágar sólida com a compo-sição como descrita acima. No topo da ágar entre cerca de 500 a 1000 ul decaldo líquido é adicionado componente líquido.

Em outra modalidade particular, o sistema de dois componentescompreende uma ágar redonda sem nutrientes adicionados, soro, ou outrosaditivos, mas que compreende um tampão a pH 5. no topo desta ágar re-donda, uma ágar de topo é aplicada a qual contém todos os ingredientesnecessários para a cultura de "Candidatos helicobacter suis". Usando estetampão um mínimo de ingredientes é usado, enquanto o pH da ágar de topoé mantido estável pela presença do ágar que permanece no fundo.

Os métodos da presente invenção podem ser usados para o iso-lamento e/ou cultura de espécies Helicobacter, mais particularmente "Candi-datus helicobacter suis". Tipicamente, nos métodos da presente invenção, aamostra de material gástrico é incubada no sistema de cultura por um perío-do entre 1 a 15 dias, dependendo do grau de micro-organismos de contami-nação (fungos e/ou bactérias) e a utilização de nutrientes do meio. Onde ummeio sólido é usado, um sinal de exaustão do meio é tipicamente a aparên-cia de áreas translucentes no meio sólido. Adicional ou alternativamente, amobilidade de espécies Helicobacter no meio líquido pode ser avaliada, des-se modo uma mobilidade reduzida é indicativa de exaustão do meio. Adicio-nal ou alternativamente, o isolado bacteriano pode ser transferido para umaplaca fresca quando o pH do meio de cultura (ou o componente sólido e/oulíquido) aumenta para um valor de pH de 6,0 ou mais.

Tipicamente, os métodos da presente invenção envolvem a in-cubação de amostras compreendendo Espécies Helicobacter ou isolados deEspécies Helicobacter a 37 °C. Foi descoberto que abaixo de 25° ou acimade 40° nenhum crescimento de bactérias Helicobacter ocorre. Geralmenteplacas com Espécies Helicobacter são cultivadas sob condições micro-aeróbicas, isto e, entre 2 e 8 % de oxigênio, mais particularmente cerca de4-5% de O2. Entretanto, Espécies Helicobacter não crescem sob condiçõesanaeróbicas completas.

Uma modalidade particular dos métodos para isolar EspéciesHelicobacter de uma amostra compreende as etapas de: a) aplicar a amos-tra em um sistema de cultura compreendendo um componente sólido e umlíquido,

- em que pelo menos o componente sólido é tamponado a umpH entre 5,0 e 6,0, e

- em que o componente sólido compreende pelo menos 10 % desoro ou pelo menos 7,5 % de sangue, e

- em que o componente sólido e o líquido compreende nutrientespara o crescimento de bactéria meticulosa, e

- em que o componente sólido e/ou líquido compreende pelomenos uma substância seletiva que inibe o crescimento de fungos e/ou bac-térias Gram-positivas e/ou Gram-negativas diferentes de espécies Helico-bacter a serem cultivadas, o método adicionalmente compreende a etapa deb) incubar a amostra neste sistema sob condições micro-aeróbicas.

Usando os métodos acima descritos para o isolamento e culturade Espécies Helicobacter, isolados verdadeiros de espécies Helicobacter,em particular "Candidatos helicobacter suis", podem ser obtidos a partir deamostras de material gástrico. Um isolado de Candidatus helicobacter suisobtido por métodos de acordo com a invenção tem sido depositado em con-formidade com as exigências do Tratado de Budapeste em BCCM/LGM Bac-teria Collection, K.L, Ledeganckstraat 35, B-9000, Gent by Universiteit em 9de abril de 2008. Foi atribuído o número LMG P-24572. Em adição, os méto-dos da presente invenção permitem cultura in vitro em massa. Em particularcultivares podem ser obtidos que podem ser passados, mais particularmentepassados pelo menos 1 vez, mais particularmente pelo menos duas vezes,ou pelo menos 5 a 10 vezes e/ou que podem ser mantidos em cultura (isto é,in vitro) pelo menos 24 horas, mais particularmente pelo menos 2 dias, omais particularmente pelo menos 10 a 25 dias. Foi demonstrado que usandoos métodos da presente invenção, cerca de 1 ml de muco estomacal aplica-do em uma placa bacteriana de 10 cm gera uma cultura entre cerca de 106 a109 bactérias/ml dentro de 3 dias. Sobre culturas de passagem pode ser dilu-ído com um fator de 1 a 5. consequentemente, mesmo com sistemas de pe-quena escala, rendimentos altos podem ser alcançados. Entretanto, em pro-dução de larga escala, os rendimentos podem ser adicionalmente aumenta-dos.

Os métodos da presente invenção pela primeira vez permitem ageração de grandes quantidades de isolados de Espécies Helicobacter ver-dadeiros, em particular "Candidatus helicobacter suis". Isto é importante amedida que ele permite a fabricação de vacinas usando "Candidatus helico-bacter suis" isolado ou preparações de antígeno obtidas a partir do mesmo.

Consequentemente, outro aspecto da invenção refere-se ao usode "Candidatus helicobacter suis", tais como aqueles obteníveis pelos méto-dos descritos aqui para a produção de preparações de antígeno, que sãoúteis como vacinas. Na verdade, a presente invenção permite pela primeiravez, a geração de vacinas com base em isolados de "Candidatus helicobac-ter suis" verdadeiros. Modalidades particulares da invenção referem-se aouso de cultura depositada LMG P-24572 para a produção de preparação deantígeno de Candidatus helicobacter suis.

Preparações de antígeno de isolados de "Candidatus helicobac-ter suis" visadas no contexto da presente invenção incluem ambas as prepa-rações bacterianas de célula completas como preparações de componentesde isolados de "Candidatus helicobacter suis", tal como do isolado LMG P-24572. Tal preparação de antígeno pode compreender bactérias completa-mente mortas (inativas), bactérias atenuadas vivas (enfraquecidas) ou pre-parações bacterianas artificiais e/ou processadas ou combinações dasmesmas. Preparações bacterianas processadas incluem preparações deproteínas bacterianas, que são parcial ou completamente purificadas e/oupré-tratadas. Estas podem ser usadas sozinhas ou em combinação compreparações de antígeno artificiais tais como preparações de proteína quesão em parte ou inteiramente obtidas por métodos sintéticos ou recombinan-tes.

De acordo com uma modalidade particular, as preparações deantígeno providas pela presente invenção compreendem um ou mais antí-genos obtidos a partir de um isolado de "Candidatus helicobacter suis". Maisparticularmente, preparações de antígeno são visadas a compreender um oumais antígenos obtidos do isolado depositado como LMG P-24572. A vanta-gem de trabalhar com preparações de antígeno obtidas de isolados é a pu-reza, que reduz a mudança de contaminação com compostos antigenicos deoutros organismos ou espécies bacterianas, desse modo aumentando o ris-co de efeitos colaterais indesejados da preparação antigênica quando injeta-da em humanos ou outros animais.

De acordo com uma modalidade particular a preparação de antí-geno é um lisato celular de "Candidatos helicobacter suis", isto é, uma mistu-ra obtida sobre lise de células bacterianas. Um exemplo particular de umacélula bacteriana é a fração solúvel de uma cultura bacteriana sonicada, porexemplo, obtida após filtração. Alternativamente ou em adição, bactériaspodem ser fragmentadas em um homogeneizador de alta pressão (por e-xemplo, Avestin model EmulsiFlexCõ).

Opcionalmente, o lisato celular é adicionalmente inativado antesou após sonicação por um dentre uma variedade de métodos conhecidostais como, mas não limitados a, tratamento com formalina, etileneimina bina-ria (BEI), beta propriolactona (BPL), gluteraldehído, irradiação ou aqueci-mento. Geralmente nem todas as proteínas irão provocar uma resposta imu-ne. Alternativamente, a preparação de antígeno de acordo com a presenteinvenção é obtida por fracionamento e/ou purificação de uma ou mais prote-ínas a partir de um lisato ou meio de cultura bacteriano para obter uma com-posição enriquecida ou antígenos purificados. Exemplos de proteínas bacte-rianas purificadas ou isoladas adequadas no contexto da presente invençãosão proteínas de choque aquecidas e/ou proteínas de urease, cagA e vacA.

Consequentemente, outro aspecto da presente invenção provevacinas compreendendo as preparações de antígeno obtidas de isolados de"Candidatus helicobacter suis" como descrito acima. Mais particularmente, ainvenção prove vacinas compreendendo preparações de antígeno obtidas apartir do isolado de Candidatus helicobacter suis depositado como LMG P-24572. As vacinas da presente invenção que compreendem uma preparaçãode antígeno de um isolado de "Candidatus helicobacter suis", podem serusadas para obter uma imunidade terapêutica ou profilática para infecçãopor uma Espécie Helicobacter, mais particularmente por "Candidatos helico-bacter suis".

A vacina da presente invenção opcionalmente contém apenas apreparação de antígeno da invenção. Alternativamente, a vacina pode com-preender, em adição à preparação de antígeno da presente invenção, umadjuvante equivalente. Por exemplo, as preparações de antígeno nas vaci-nas da presente invenção podem ser formuladas em ou com lipossomas,preferivelmente lipossomas neutros ou aniônicos, microesferas, ISCOMs, oupartículas semelhantes a vírus (VLPs), a fim de promover a peneiração daproteína ou do polipeptídio ou para aumentar a resposta imune. Pessoasversadas na técnica têm esses compostos disponíveis sem dificuldade; porexemplo, ver Liposomes: A Practical Approach. RRC New Ed, IRL press(1990).

Adjuvantes outros que não lipossomas podem ser usados. Umgrande número é conhecido para pessoas versadas na técnica. O tipo deadjuvante irá variar, dependendo do tipo de preparação de antígeno e rotade administração usada. De acordo com uma modalidade particular da pre-sente invenção a preparação de antígeno é uma solução de antígeno soni-cada que é administrada intranasalmente com toxina Cólera (CT) ou subcu-taneamente com saponina com adjuvante. Qualquer adjuvante conhecido natécnica pode ser usado na composição da vacina, incluindo adjuvantes ba-seados em óleo tais como Adjuvante Completo de Freund e Adjuvante In-completo de Freund, adjuvantes baseados em micolato (por exemplo, dimi-colato de trehalose), lipopolissacarídio bacteriano (LPS), peptidoglicanos(isto é, mureínas, mucopeptídeos, ou glicoproteínas tais como N- Opaca,dipeptídeo de muramila [MDP], ou análogos de MDP), proteoglicanos (porexemplo, extraído de Klebsiella pneumoniae), preparações de estreptococos(por exemplo, OK432), Biostim™ (por exemplo, 01 K2), o "Iscoms" de EP109 942, EP 180 564 e EP 231 039, hidróxido de alumínio, saponina, dex-trano DEAE, óleos neutros (tais como migliol), óleos vegetais (tais como óleode amendoim), lipossomas, polióis Pluronic®. Adjuvantes incluem, mas nãosão limitados a, o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc.), alum, gel de hidróxidode alumínio, colesterol, emulsões óleo em água, emulsões água em óleo taiscomo, por exemplo, adjuvantes completos e incompletos de Freund, blo-queio de co-polímero (CytRx, Atlanta GA), S-M (Chiron, Emeryville CA), ad-juvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL)ou outras frações de saponina, lipídio de monofosforila A, adjuvante lipídioamina Avridine, enterotoxina instável aquecida de E. coli (recombinante oude outra maneira), toxina cólera, ou dipeptídio de muramila, entre muitosoutros. De acordo com uma modalidade particular, o mutante recombinantede toxina instável aquecida de Escherichia coli é adicionado à preparação deantígeno antes da injeção no animal.

Para administração parenteral, componentes específicos podemser adicionados tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e hidro-xifosfato de alumínio. Um ou mais antígenos da preparação de antígeno po-dem ser absorvidos ou precipitados em um composto de alumínio de acordocom métodos padrão. Outros adjuvantes úteis para administração parenteralincluem em particular polifosfazeno (WO 95/2415), DC-chol (3-beta-[N-(N\N1-dimetilaminometano) carbamoíl) colesterol] (Pat. U.S. No. 5,283,185 eWO 96/14831), QS-21 (WO 88/9336) e RIBI.

Os componentes das vacinas da presente invenção podem serfabricados convencionalmente. Em particular, um polipeptídio, uma misturaou uma molécula de DNA contida na composição de acordo com a invençãoé combinada com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável, porexemplo, água ou uma solução solução salina tal como solução salina tam-ponada por fosfato (PBS). Em geral, o diluente ou o veículo é selecionadocom base no modo e rota de administração e de práticas farmacêuticas pa-drão. Diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis bem como todosque sejam necessários para seus usos nas formulações farmacêuticas sãodescritos em Remington's Pharmaceutical Sciences.

As vacinas da presente invenção podem estar em forma sólidaou líquida tal como, comprimidos, cápsulas, pós, soluções, suspensões, ouemulsões.As formas de dosagem unitárias sólidas podem ser do tipo con-vencional. A forma sólida pode ser uma cápsula, tal como um tipo de gelati-na comum que contém as proteínas ou peptídeos da presente invenção eum veículo, por exemplo, lubrificantes e preenchedores inertes tais comolactose, sacarose, ou amido de milho. Em outra modalidade, esses compos-tos são prensados com bases de comprimido convencionais tais como lacto-se, sacarose, ou amido de milho em combinação com aglutinantes comoacácia, amido de milho, ou gelatina, agentes desintegrantes tais como amidode milho, amido de batata, ou ácido algínico, e lubrificantes como ácido es-teárico ou estearato de magnésio.

As vacinas da presente invenção podem também ser adminis-tradas em dosagens injetáveis por solução ou suspensão desses materiaisem um diluente fisiologicamente aceitável com um veículo farmacêutico. Taisveículos incluem líquidos estéreis tais como água e óleo, com ou sem a adi-ção de um tensoativo e outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

Óleos ilustrativos são aqueles de origem do petróleo, animal, vegetal ou sin-tética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, ou óleo mineral. Emgeral, água solução salina, dextrose aquosa e solução de açúcar relaciona-da, e glicóis tais como, propileno glicol, ou polietileno glicol, são veículos lí-quidos preferidos, particularmente para soluções injetáveis.

Para uso como aerossóis, as vacinas da presente invenção quecompreendem a preparação de antígeno em solução ou suspensão podemser embaladas em um recipiente aerossol pressurizado juntamente com pro-pelentes adequados, por exemplo, propelentes de hidrocarboneto semelhan-tes a propano, butano ou isobutano com adjuvantes convencionais. Os ma-teriais da presente invenção também podem ser administrados em uma for-ma não pressurizada tal como em um nebulizador ou atomizador.

A vacina que compreende uma preparação de antígeno de"Candidatus helicobacter suis" pode ser usada para vacinação autológa ouheteróloga. Na vacinação autóloga usando as vacinas da presente invenção,o objetivo é a proteção contra infecção por "Candidatus helicobacter suis".Na vacinação heteróloga o objetivo é obter, por injeção com uma preparaçãode antígeno de "Candidatos helicobacter suis", proteção contra infecção poruma ou mais outras espécies Helicobacter.

Consequentemente, um aspecto adicional da presente invençãoprove métodos para a vacinação de humanos e outros animais usando asvacinas da presente invenção. O objetivo dos esquemas de vacinação comas vacinas obtidas a partir de isolados de "Candidatos helicobacter suis" deacordo com a presente invenção inclui obter proteção completa (imunidadepor esterilização) contra Helicobacter spp., mais particularmente, contra"Candidatos helicobacter suis" em um animal, mas também reduzir a cargabacteriana de Helicobacter spp., mais particularmente de "Candidatos heli-cobacter suis" por pelo menos 25, 40, 60, 80% comparado antes com vaci-nação e/ou comparado a animais que não receberam a vacina da presenteinvenção e são estão sujeitos ao mesmo agente infeccioso. Mais particular-mente, a presente invenção refere-se a vacinas e estratégias de vacinaçãoque asseguram um efeito protetor ou carga bacteriana reduzida por um perí-odo de tempo prolongado, tal como durante pelo menos 4, 6, 10, 12 ou maisdo que 12 semanas.

A administração das vacinas da presente invenção pode ocorrerem uma única dose ou em uma dose repetida uma vez ou várias vezes apósum certo período. A dosagem apropriada varia de acordo com os vários pa-râmetros, por exemplo, o indivíduo tratado (adulto ou criança), o antígeno davacina propriamente dito, o modo e freqüência de administração, a presençaou ausência de adjuvante e, se presente, o tipo de adjuvante e o efeito dese-jado, (por exemplo, proteção ou tratamento) como será determinado porpessoas versadas na técnica. Por exemplo, onde preparações de antígenocompreendendo "Candidatos helicobacter suis" completamente inativadossão usadas, dosagens adequadas incluem, mas não são limitadas a, dosa-gens de 10ug, 50ug, 100 ug, 250 ug, 500ug e 1 mg de preparação de antí-geno. Alternativamente, dosagens podem ser expressas em CFUs, 100ugque correspondem a cerca de 107 CFU. Preparações de antígeno brutas (is-to é, contendo traços de meios de cultura, etc.) requerem altas dosagenspara serem eficazes do que parcialmente purificadas ou preparações purifi-cadas.

Os métodos de vacinação podem incluir administração ao animalou humano de uma ou mais composições antes ou após administração (oral)da vacina que compreende a preparação de antígeno de "Candidatus heli-cobacter suis" de acordo com a presente invenção. Tais componentes inclu-em, compostos que reduzem produção de ácido no estômago (por exemplo,Cimetidina (Tagamet®, GlaxoSmithKline; Genval, Belgium)).

A identificação e quantificação de infecção e/ou carga bacterianaem um animal pode ser feita de várias formas. De forma clássica, ela é feitadeterminando a presença dos agentes infecciosos, ou uma proteína ou se-qüência de DNA da mesma em uma amostra de fluido sangüíneo ou na uri-na ou fezes. Alternativamente, a reação do sistema imune, por exemplo, apresença de anticorpos para agentes infecciosos, pode ser medida. De a-cordo com uma modalidade particular da invenção diagnóstico preciso equantificação de infecção por Heliobacter são obtidos por identificação deDNA de "Candidatus helicobacter suis", por exemplo por PCR como descritona técnica (Fox and Lee (1997) Lab. Anim. Sei. 47, 222-255). Alternativa-mente, um teste de urease quantitativo é usado para quantificar CandidatusH. suis. Breves amostras de tecido da mucosa (aproximadamente 0.5cm2)são imersas em 1,000 pi de CUTest (Temmler Pharma; Marburg, Germany)e incubadas a 37°C por aproximadamente 3 horas (como descrito por Cor-thesy-Theulaz et ai, (1995), Gastroenterology 109, 115-121), após centrifu-gação, o sobrenadante é usado para quantificação espectrofotométrica emuma densidade ideal (OD) de 550 nm. O corte para discriminação entre in-fecção ou não é calculado por cada região do estômago e corresponde àmédia mais duas vezes o desvio padrão (SD) dos valores de absorvênciaobtidos com as espécies de biópsia gástrica a partir de animais de controlede não desafio. Os valores acima deste corte são evidências consideradasde colonização por "Candidatus helicobacter suis".

Como detalhado acima, o uso das vacinas da presente invençãovisa ambos os esquemas de vacinação autológa e heteróloga. De acordocom uma modalidade, métodos são providos para o tratamento e/ou prote-ção de humanos e/ou outros animais contra infecção por uma ou mais dife-rentes Espécies Helicobacter, opcionalmente incluindo "Candidatus helico-bacter suis". Modalidades particulares da presente invenção referem-se aouso das vacinas obtidas a partir de isolados de "Candidatus helicobactersuis" para obter imunidade profilática ou terapêutica para outra Helicobacterspp. Tal como, mas não limitado a, H. pylons, H. bizzozeronii, H. felis e H.salomonii. Outras espécies Helicobacter adequadas são H.bilis, H. fenelliae,H. pametensis, H. nemestrinae, H. nemestrinae, H. pametensis, H. acinony-chis, H. pullorum, H. mustelae, H. hepaticus, H. cinaedi e H. Modalidadesmais particulares da presente invenção referem-se ao uso de vacinas obti-das a partir de isolado de Candidatus helicobacter suis LMG P-24572 paraobter imunidade profilática ou terapêutica para Helicobacter spp., incluindo,mas não limitado a, Candidatus helicobacter suis.

De acordo com uma modalidade particular, a invenção provemétodos de proteção profilática e/ou terapêutica contra infecção por "Candi-datus helicobacter suis", que compreende administrar as vacinas da presen-te invenção obtidas de isolados de "Candidatus helicobacter suis". Mais es-pecificamente, preparações de antígeno são providas para uso em vacina-ção profilática, que assegura proteção contra Helicobacter spp., mais parti-cularmente contra "Candidatus helicobacter suis", cuja proteção é mais doque transiente. Em modalidades particulares, métodos de proteção profiláti-ca e/ou terapêutica contra infecção com "Candidatus helicobacter suis" deacordo com a invenção compreende administrar uma vacina obtida do isola-do de Candidatus helicobacter suis LMG P-24572.

Modalidades particulares da presente invenção também provê-em métodos para imunização terapêutica, quando os organismos já orienta-ram a resposta inume hospedeira para seu benefício.

Os métodos de imunização da presente invenção incluem méto-dos pelos quais a vacina é administrada através de rotas adequadas, taiscomo por mucosa (intranasal), parenteral, ou administração intramuscular,oral, intradérmica, intraperitoneal, intravenosa, transdérmica/transcutânea,ou administração subcutânea. Rotas de vacinação adequadas também com-preendem administrações de combinação (por exemplo, administração o-ral/intramuscular). De acordo com modalidades específicas da invenção aimunização terapêutica é realizada por administração parenteral das prepa-rações de antígeno ou vacinas da invenção. Imunização parenteral podemobilizar células de origem sistêmica que não tem sido iniciada em uma da-da direção por uma infecção por Helicobacter (Guy et al. (1999) Vaccine 17,1130-1135). De acordo com outra modalidade específica da invenção, admi-nistração intramuscular é usada para vacinação eficiente.

Os diferentes aspectos da presente invenção são ilustrados,mas não limitados aos exemplos detalhados abaixo.

EXEMPLOS

Exemplo 1: isolamento e cultura in vitro de "Candidatus helicobacter suis"

Neste exemplo, "Candidatus helicobacter suis" é isolado usandoum sistema de cultura de dois componentes, desse modo o componente só-lido é uma placa de ágar de Brucella (Becton-Dickinson, Erembodegem, Belgium)

Placas de ágar de Brucella foram suplementadas com suple-mento Vitox (Oxoid, Basingstoke, UK), suplemento Skirrow (Oxoid), 20% desoro de feto de bezerro (FCS; QB Perbio Tattenhall, UK), 0,1% de carvãoativado GR (AC; Merck, Darmstadt, Germany), 0,00001% violeta cristal (Clin-Tech Ltd, Essex, UK) and 0,001 % de Nisina (Sigma-AIdrich, St- Louis, Mo,USA). Após autoclave e antes de geleificar a ágar, 0, 0,2, 0,5 e 0,7 ml deuma solução de HCI (min. 37%; Riedel-de Haen, Seelze, Germany) foramadicionados a 500 ml de ágar Brucella, resultando em valores de pH de 7,0,6,3, 5,5 e 5,0, respectivamente. A menos que de outra maneira indicado pla-cas Brucella com soro compreendem 20% de soro.

Neste exemplo o componente líquido do sistema de cultura dedois componentes é caldo Brucella, sem adição de outros suplementos, soroou sem ajuste de pH.

Dia 0

Estômagos de cinco suínos (A a E) foram coletados de matadou-ro (Pore Meat N.V., Zele, Belgium) e armazenados a +4°C até uso adicional.Eles foram abertos na curvatura maior e limpos com água de derivação.Uma metade do estômago foi submetida a tratamento acídico (submersãoem um banho a 1% de HCI por 1 hora). Depois, apenas o muco da superfí-cie foi coletado raspando o estômago com lâminas de vidro. Este muco mu-eus foi coletado para um tubo estéril. Exames microscópicos do muco esto-macal dos porcos mostraram que todos os estômagos eram positivos para"Candidatus helicobacter suis".

O mucos foi levemente liqüefeito com caldo de Brucella compre-endendo 20 % de soro (até um volume de cerca de 5 ml_) e inoculado sobre4 placas de ágar Brucella com soro com valores de pH de 5,0, 5,5, 6,3 e 7. Aamostra foi inoculada sobre o meio da placa, e subseqüentemente três gotasde caldo Brucella (cerca de 150 ul) foram adicionadas no meio da amostrade muco.

Quatro placas por porco em total foram incubadas durante a noi-te em uma atmosfera microaeróbica a 37°C. O ambiente microaeróbico foicriado evacuando 80% da atmosfera animal e introduzindo uma mistura degás de 8% de C02, 8% de H2 e 84% de N2.

Dia 1

O isolamento de bactérias espirais móveis (indicando a presençade espécies Helicobacter) foi bem-sucedido por quatro horas das cinco a-mostras de estômago. Para o estômago D, teve um crescimento insuficientedo dia 1. placas que foram secas foram levemente umedecidas usando cal-do Brucella com soro.

Dia 2

Foi observado que para todos os estômagos, placas em que aágar estava a pH 7 e 6,3 foram contaminados com outras bactérias. O caldodessas placas foi filtrado (usando um filtro de poro de 0,65 um) e passadopor uma nova placa de ágar do mesmo pH.

Apenas algumas das placas com pH 5,5 ou 5,0 foram contami-nadas, em cada caso o caldo foi também filtrado e passado para novas pla-cas. Quando nenhuma contaminação foi verificada, as placas foram adicio-nalmente incubadas. Este foi o caso para as placas a pH 5,0 de amostras deestômago D e E.

Quando o tamanho do poro de filtros de poro de 0,65 um foi tãopequeno para filtrar o meio sem obstruir a filtração foi realizado com filtros de0,8 um- Este foi o caso para as placas contaminadas de pH 7, 6,3 e 5,5 deamostra de estômago E.

Dia 3

Essas placas que foram inoculadas com meio filtrado no dia 2,foram na maioria das vezes negativas, para contaminar crescimento de bactéria.

A placa não contaminada, não filtrada de pH 5,0 do estômago Efoi analisada de forma microscópica e mostrou muitas bactérias "Candidatushelicobacter suis" com uma mobilidade remarcável, o número dos quais foiestimado para ser de cerca de 108 ou 109/ml. A cultura de caldo (cerca de500 ul) foi transferida para um novo meio ágar de pH 5.

Dia 4

A placa original de pH 5,0 do estômago E e sua placa de passa-gem, foram cobertas com contaminantes. O caldo dessas placas foi transfe-rido para uma nova placa de ágar usando filtros de poro de 0,65 um.

Muitas placas de outros estômagos também foram contamina-das e descarregadas.

A partir do estômago A, duas placas de passagem de filtro foramnegativas para contaminação por bactérias e foram adicionalmente incuba-das. A partir dos estômagos B B, C e E, uma placa de passagem de filtro foinegativa e adicionalmente incubada.

A partir do estômago D, a placa de pH 5,0 foi ainda negativa pa-ra contaminar crescimento de bactéria e foi adicionalmente incubada.

Dia 5

Todas as placas de passagem de filtro, que foram negativas nodia 4 para "Candidatus helicobacter suis", foram ainda negativas para Heli-cobacter e foram adicionalmente incubadas. Algumas placas mostraram con-taminação de bactérias.

Dia 7O caldo no topo da placa de pH 5,0 a partir do estômago D mos-trou bactéria "Candidatos helicobacter suis" móvel e viável, este número foiestimado como sendo 106/ml. O muco não foi visivelmente contaminado comoutra bactéria. Esta placa foi adicionalmente incubada.

Dia 8

Do estômago D, a placa original de pH 5.0 mostrou crescimentoadicional de bactérias "Candidatos helicobacter suis". O caldo foi transferidopara uma placa de ágar de pH 7. Na placa original, 500 pi de caldo Brucellacom soro foi adicionado.

Dia 11

A passagem da amostra D do dia 8 sobre a placa de pH 7 foinegativa para crescimento Helicobacter. A placa original de pH 5,0 aindamostrou uma cultura viável de "Candidatos helicobacter suis" (estimado 108bactérias/ml). Este crescimento foi transferido para uma placa de pH 5,0, euma quantidade igual de caldo de Brucella com soro foi adicionado. Sobre aplaca original, 500 ul de caldo Brucella com soro foram adicionados.

Dia 13

A passagem sobre a placa pH 5,0 no dia 11 foi bem sucedidapara os isolados originado da amostra D. o caldo continha Helicobacter mó-vel (estimado 108 bactérias/ml). O caldo foi novamente transferido para umaplaca de pH 5,0, enquanto a placa da primeira passagem foi umedecida com1 ml de caldo Brucella com soro. O caldo da placa original da amostra Dtambém continha cultura viável, da qual cerca de 200 ul foi congelada emuma quantidade igual de LYM (% BHI caldo + 3A soro de cavalo + 7,5 %(p/v) glicose) a -70°C. Novamente 500 ul de caldo Brucella com soro foramadicionados antes da incubação.

A partir dos estômagos B e C, passagens de filtro no dia 4 sobreas placas de pH 5, foram levemente positivas para "Candidatos helicobactersuis".

Dia 14

A cultura congelada D do dia 13 foi derretida e aplicada sobreplaca de ágar Brucella com pH 5, e incubada em uma atmosfera microaeró-bica.

Dia 15

A segunda passagem da amostra D (HS1) foi positiva para"Candidatos helicobacter suis" (estimado 108 bactérias/ml). O caldo destaplaca (cerca de 500 ul) bem como o caldo da amostra original D da placa depH 5,0 foi adicionado a um volume igual de caldo Brucella, 3 vol. FCS e 7,5% (p/v) glicose, e congelado a - 70°C.

A primeira passagem continha mais caldo (cerca de 1 ml) e foipassada por duas placas de ágar frescas de pH 5. Quantidades iguais decaldo de Brucella com soro foram adicionadas. A passagem de filtro de Bestava ainda levemente positiva para Helicobacter, enquanto que a passa-gem de filtro de C continha cerca de 106 bactérias/ml. Estas placas foramlevemente umedecidas com caldo Brucella com soro.

Dia 17

A placa original de pH 5,0 de amostra D foi novamente positivapara Helicobacter, mas elas foram menos móveis. Assim como o meio daágar foi provavelmente exaurido, o caldo foi transferido novamente para umaplaca de ágar fresca (pH 5) com meio e a placa original foi descarregada. Asegunda passagem de D estava positiva e o caldo foi novamente transferidopara uma nova placa de ágar, e a placa foi novamente umedecida com caldode Brucella suplementado e adicionalmente incubada.

Das placas de passagem de filtro B eC, o caldo foi transferidopara novas placas de ágar de pH 5. sobre a placa original o caldo Brucellacom soro foi adicionado..

Dia 19

Amostradas foram tomadas de culturas derivadas de estômagoD (isolado HS1), C (isolado HS2) e B (isolado HS3). D NA foi extraído de cé-lulas bacterianas usando Kit de Tecido DNeasy (Qiagen). PCR foi realizadousando iniciadores específicos de Candidatus H. suis- (De Groote et ai,1999 Bacteriology 49, 1769-1777; 2000 J. CHn. Microbiol. 38, 1131-1135).Eletroforese com gel de agarose mostrou um fragmento PCR longo 433 bppara todos os três isolados. DNA de uma cultura de camundongo in vivo"Candidatus helicobacter suis" passado foi usado como um controle positivo.

A placa inoculada no dia 14 com material descongelado de HS1,estava positiva para "Candidatus helicobacter suis". O caldo foi transferidopara duas novas placas (segunda passagem).

A segunda passagem de HS1 foi misturada com uma quantidadeigual de 1 vol. Brucella broth, 3 vol. FCSi 7,5 % (p/v) glicose e congelada a -70°C.

O caldo da terceira passagem de HS1 estava positivo e foi trans-ferido para uma nova placa.

Dia 20

Para HS2 e HS3, o caldo das segundas passagens foi misturadocom uma quantidade igual de 1 vol. Caldo Brucella, 3 vol. FCS, e 7,5 % (p/v)glicose e congelado a -70°C.

Dia 22

Sobre a placa inoculada com material descongelado de HS1,"Candidatus helicobacter suis" não cresceu muito. As passagens do dia 19deste isolado, entretanto, mostraram mais Helicobacter.

A quarta passagem do dia 19 da cultura original não mostroumuitas bactérias. As segundas passagens do dia 17 das culturas derivandode C e D mostraram muitas bactérias "Candidatus helicobacter suis". O cal-do da amostra C (HS2) foi transferido para duas novas placas, e volumesiguais de caldo de Brucella suplementado foram adicionados. O caldo daamostra B (HS3) foi transferido para uma nova placa, e um volume igual decaldo de Brucella suplementado foi adicionado.

Dia 25

Para HS1, a segunda passagem do dia 15 muito pouco Candida-tus H. suis. Todos os caldos foram transferidos para uma placa de ágar fres-ca (pH 5,0) e a placa velha foi descartada.

A terceira passagem do dia 17 e a quarta passagem do dia 19foram negativas e descartadas.

A placa inoculada no dia 14 com material descongelado de HS1,mostrou uma cultura crescida de "Candidatus helicobacter suis" e este caldofoi inoculado em duas novas placas e com caldo de Brucella com soro. Assegundas passagens do dia 19 deste isolado, foram também inoculadas so-bre duas placas cada. Para HS2 e HS3, as segundas passagens do dia 17mostraram menos Helicobacter móvel. As placas mostraram áreas translu-centes e foram provavelmente exauridas. Todos os caldos foram transferidospara uma nova placa e a placa velha foi descartada. As terceiras passagensmostraram boas culturas que foram transferidas para duas novas placas porisolado.

Dia 27 e dias seguintes

A partir das terceira e quarta passagens de HS1, o caldo foicongelado em um volume igual de 1 vol. Caldo Brucella, 3 vol. de FCS e 7,5% (p/v) glicose. O caldo da segunda passagem do dia 22 foi inoculado sobreuma nova placa de ágar. Para HS2 e HS3, as terceira e quarta passagensforam inoculadas sobre uma nova placa de ágar. As culturas foram passa-das continuamente a cada dois ou três dias e as culturas do caldo foramcongeladas regularmente como descrito acima.

O Gene rRNA 16S de isolados HS1, HS2 e HS3 foi amplificadousando iniciadores complementares as bordas conservadas. Iniciadores deconsenso ap-NOT (5'-tcaaactaggaccgagtc-31) [SEQ ID NO:1] e ojMB (5'-taccttgttacttcacccca-3') [SEQ ID NO:2] foram usados, como anteriormentedescrito (Baele et ai, (2001) J. Appl. Microbiol. 91, 488-491). Um amplicomde 1500 bp ampliado nesta reação PCR foi sequenciado usando iniciadorespD (5'-cagcagccgcggtaatac-3') [SEQ ID NO: 3], y* (5-ctcctacgggaggcagcagt-31) [SEQ ID NO:4], 3 (5'-gttgcgctcgttgcgggact-3) [SEQ ID NO: 5] e O* (õ'-aactcaaaggaattgacgg-S1) [SEQ ID NO: 6], como descrito em Coenye et al.(1999) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 49, 405-413). Análise de seqüência foirealizada usando o Analisador Genético ABI Prism™ 3100 (Applied Biosys-tems, Lennik, Belgium) e seqüências foram alinhadas com GenBank usandoBLAST. A seqüência revelou 99% de similaridade com a seqüência de"Candidatos helicobacter suis" em GenBank (AF127028).

Nos estabelecimentos experimentais como descrito acima, iso-lamento primário foi mais bem sucedido em placas contendo meio de baixosvalores de pH (5,0 ou 5,5). Sob essas condições o crescimento de bactériascontaminantes foi diminuído. O isolamento de "Candidatos helicobacter suis"do estômago E foi bem sucedido. No terceiro dia após inoculação, uma cul-tura pura de cerca de 108 ou 109Anl foi vista sob o microscópico. Contami-nantes crescendo sobre o muco foram misturados com o caldo contendoHelicobacter, que foi inevitável, ao transferir o caldo para uma nova placa deágar.

A partir dos estômagos B, C e D, culturas puras de "Candidatashelicobacter suis" foram obtidas. Um PCR específico de espécie amplifican-do um fragmento de rDNA 16S confirmou a identidade da espécie. O se-quenciamento de todo o gene rDNA 16S revelou 99% de similaridade com aseqüência de "Candidatus helicobacter suis" em GenBank.

Para o isolado HS1, originando-se a partir de D, isolamento pri-mário de uma cultura de caldo pura de "Candidatus helicobacter suis" foiobtido após 7 dias de incubação. A transferência do caldo para uma placacom o mesmo meio a pH 7 não resultou em crescimento. A passagem parauma placa de pH 5,0 foi bem sucedida. O caldo mostrando Helicobacter viá-vel e móvel foi dividido em dois volumes iguais e transferido para duas pla-cas de ágar frescas. Suplementação com uma quantidade igual de caldoBrucella (com 20% de FCS) resultou em bom crescimento da bactéria.

Células de "Candidatus helicobacter suis" em caldo podem sercongeladas a -70°C em uma quantidade igual de 1 vol. Caldo de Brucella, 3vol. FCS e 7,5 % (p/v) glicose. Após descongelar um frasco que foi congela-do, Candidatus H. suis foi recrescida de forma bem sucedida no mesmomeio. Para isolados HS2 e HS3, originando-se dos estômagos B e C respec-tivamente, culturas primárias nos meios com pH 5,0 foram levemente con-taminadas com outras bactérias. O caldo foi então trazido para um filtro deporo 0,65 um e inoculado sobre novas placas de ágar de pH 5. Após 11 diasde incubação, estas placas estavam positivas para crescimento de Helico-bacter. Após novos 4 dias de incubação, o caldo continha Helicobacter topassar as cepas. As segunda e terceira culturas de passagem foram obtidasapós 5 e 3 dias de incubação, respectivamente.Exemplo 2: Efeito da temperatura e do ambiente sobre o crescimento de"Candidatos helicobacter suis".

Neste e em todos os experimentos seguintes, a otimização domeio de cultura e condições de crescimento foram avaliadas sobre isoladosHS1, HS2 e HS3 de "Candidatos helicobacter suis". Detalhes sobre o isola-mento dessas cepas são dados no exemplo 1.

Isolados HS1 e HS3 foram inoculados cada um sobre seis pla-cas de ágar Brucella como descrito no exemplo anterior, (isto é, compreen-dendo 20% de FCS e ajustado para pH 5,0). Placas foram cobertas com cal-do de Brucella suplementadas com suplemento Vitox, fungizona, 20% deFCS e 0,7 ml de HCI por 500 ml_ de caldo (resultando em um pH de 5).

Três placas foram incubadas em um ambiente microaeróbicocriado em jarras usando o sistema Campygen™ 2,5 L (Oxoid), a 37°C, 25°Ce 42°C respectivamente.

As outras três placas foram incubadas a 37°C em uma atmosfe-ra suplementada aeróbica, anaeróbica, e 5% de C02 respectivamente.

Após seis dias de incubação, o crescimento foi avaliado por e-xame microscópico do caldo coberto.

Em uma atmosfera suplementada de 5% de CO2 e uma atmosfe-ra aeróbica, nenhum crescimento foi obtido. Em um ambiente anaeróbico,apenas poucas bactérias foram vistas.

Em condições microaeróbicas, bom crescimento foi visto a 37°C,enquanto a 25°C ou 42°C, nenhum crescimento foi obtido.Exemplo 3: Efeito de carvão ativado e fatores de crescimento sobre cresci-mento de "Candidatos helicobacter suis"

Isolados HS1 e HS3 foram inoculados sobre placas de ágar Mu-elIer-Hinton, suplementados com suplemento Vitox, suplemento Skirrow, fun-gizona e 20 % de soro de bezerro fetal, ajustado para pH 5,0.

A essas placas, os seguintes componentes foram adicionados.Um tipo de placas (MH 1), em adição continha suplemento Vitox mas ne-nhum carvão ativado. Outro tipo de placas (MH2) em adição continha carvãoativado mas nenhum suplemen Vitox, enquanto um terceiro tipo de placas(MH3) continha ambos o suplemento Vitox e o carvão ativado.

Após três e sete dias de incubação a 37°C em condições micro-aeróbicas em um circuito fechado, criado por evacuação a 80% da atmosfe-ra normas introduzindo uma mistura de gás de 8% de CO2, 8% de H2 e 84%de N2, o crescimento foi avaliado por exame microscópico do caldo coberto.Os meios MH 1 e MH3 mostraram bom crescimento de isolados HS1 e HS3.Sobre MH2, nenhum crescimento foi visto mesmo dos isolados.

Quando usando meios Mueller Hinton, a omissão de suplementode crescimento Vitox impede crescimento enquanto a presença ou ausênciade carvão ativado não tem ou tem pouco efeito.

Exemplo 4: Efeito de composições de nutriente alternativo sobre crescimentode "Candidatos helicobacter suis".

No presente experimento, ágar Mueller-Hinton ou ágar Brucellafoi recolocado por outro meio para bactéria meticulosa a saber placas deágar de Infusão por Brain Heart Bovino (BHI). Essas placas são suplemen-tadas com suplemento Vitox, suplemento Skirrow, fungizona e 20% de sorode bezerro fetal e foram ajustados para o pH 5 com HCI concentrado.

Placas foram coberta com caldo de BHI, suplementadas com20% de soro de bezerro fetal. Após quatro dias de incubação essas placasde isolados HS1 e HS2, a 37°C em um ambiente microaeróbico, crescimentofoi confirmado por exame microscópico do caldo coberto.Exemplo 5: Efeito do soro em placas sobre crescimento de "Candidatus heli-cobacter suis".

O isolado HS1 foi inoculado sobre a) placas de ágar Mueller-Hinton suplementadas com suplemento Skirrow, fungizona ajustadas a pH5,0 cm HCI concentrado e sobre b) as mesmas placas como em a) compre-endendo em adição 20% de FCS e suplemento vitox.

Placas foram cobertas com suplemento Mueller-Hinton broth,com suplemento Vitox, suplemento Skirrow, fungizona, 20% de FCS e ajus-tadas a pH 5,0 com HCI concentrado.

Após três dias de incubação a 37°C em um ambiente microaeró-bico sobre placas a) ou b), o crescimento foi avaliado por exame microscópi-co do caldo. Formas Coccoid apenas foram observadas em placas sem sorona ágar (a). Bom crescimento de HS1 foi obtido sobre placas compreenden-do a quantidade padrão de 20% de FCS (b).

O isolado HS1 foi em seguida inoculado sobre c) placas de ágarMueller-Hinton suplementadas com suplemento Skirrow, fungizona ajustadaa pH 5,0 com HCI concentrado, e coberta com caldo Mueller-Hinton, suple-mentada com suplemento Vitox, suplemento Skirrow, fungizona, 40% deFCS e ajustada a pH 5,0 com HCI concentrado.

Após quatro dias de incubação a 37°C em um ambiente microa-eróbico sobre placas c), crescimento foi avaliado por exame microscópico docaldo. Novamente, formas coccoid apenas foram observadas.Exemplo 6: Efeito de sangue sobre o crescimento de "Candidatus helicobac-tersuis".

O uso de sangue em vez de soro foi avaliado colocando 20 % deFCS nas placas com 10% de sangue de ovelha ou 10% de sangue de cava-lo. O pH das placas foi ajustado para pH 5,0 com HCI concentrado.

As placas foram cobertas com caldo Mueller-Hinton.Após quatro dias de incubação a 37°C em um ambiente microa-eróbico, crescimento foi avaliado por exame microscópico do caldo coberto.Muito bom crescimento de ambos os isolados foi obtido, independente daorigem do sangue usado, indicando que sangue pode ser adicionado aomeio de cultura, em vez do soro.

Exemplo 7: Efeito da concentração de sangue sobre "Candidatus helicobac-ter suis".

O isolado HS1 foi inoculado sobre placas de ágar Mueller-Hintonsuplementado com suplemento Vitox, Suplemento Skirrow, fungizona e dife-rentes quantidades de sangue de cavalo (2,5%, 5%, 7%, 10% e 15% (p/v)).

O pH das placas foi ajustado para pH 5,0 com HCI concentrado.

Placas foram cobertas com caldo Mueller-Hinton sem suplemen-tos adicionais.

Após três dias de incubação a 37°C em um ambiente microaeró-bico, crescimento foi avaliado por exame microscópico do caldo. Sobre pia-cas com 2,5%, 5% ou 7% de sangue de cavalo, apenas formas coccoid fo-ram vistas. Crescimento de "Candidatus helicobacter suis" foi observado so-bre as placas com 10% ou 15% de sangue de cavalo. Das placas com 10 e15 % de sangue, o caldo foi em seguida subcultivado sobre novas placasagar com concentrações de sangue entre 2,5 e 15 % contendo o mesmomeio, inoculando 1 ml de cultura e adicionando 1 ml de caldo fresco. Placasforam adicionalmente incubadas nas mesmas condições por outros três dias.Novamente culturas viáveis foram apenas observadas sobre placas com10% ou 15% de sangue de cavalo.

Exemplo 8: Efeito do pH sobre crescimento de "Candidatus helicobacter suis".

O isolado HS1 foi inoculado sobre placas de ágar Mueller-Hintonsuplementado com suplemento Vitox, suplemento Skirrow, fungizona e 20%de FCS e ajustado para diferentes valores de pH.

Placas foram cobertas com caldo Mueller-Hinton, suplementadocom suplemento Vitox, Suplemento Skirrow, fungizona e 20% de FCS ajus-tado com HCI concentrado para diferentes valores de pH. As combinaçõesespecíficas de pH de ágar e caldo são mostradas na Tabela 1.

Após três dias de incubação a 37°C em um ambiente microaeró-bico, crescimento foi avaliado por exame microscópico do caldo. O caldo foiem seguida subcultivado sobre novas placas de ágar inoculando 1 ml dacultura e adicionando 1 ml de caldo fresco com o mesmo valor de pH. Cultu-ras primárias e subculturas foram avaliadas após 2 dias de incubação.

As primeiras subculturas foram novamente transferidas para no-vas placas de ágar como descrito acima. O crescimento foi avaliado após 4e 7 dias de incubação, respectivamente. Aa segundas subculturas nos meioscom pH 5,3 e 4,8 foram transferidas para placas de ágar frescas. As primei-ras subculturas sobre os meios pH de 4,75, 4,5, 4,4 e 4 foram também trans-feridas para placas frescas. Crescimento foi avaliado após 3 e 7 dias de in-cubação, respectivamente.

Tabela 1. Crescimento de isolado de HS1 de H. suis após subcultura sobremeios Mueller-Hinton com diferentes valores de pH<table>table see original document page 38</column></row><table>

ND: Não feito; ++++: muito bom crescimento; +++: bom crescimento; ++:crescimento moderado; + crescimento fraco; +/-: muito poucas bactérias; -:sem crescimento.

O isolado usado (HS1) poderia não crescer em meios com umpH abaixo de 4 (pH 3,5 ou 3,7). Culturas primárias foram obtidas em meioscom valores de pH variando de 4 a 7. Subculturas foram bem sucedidas so-bre essas placas, entretanto, subcultura repetida foi apenas bem sucedidaem meios com valores de pH variando de 4,7 a 6. Crescimento de "Candida-tus helicobacter suis" é possível em meios com um pH variando de 4,5 a 6,0com um ideal em valores de pH de 4,7 e 5,5.

Resumindo, "Candidatus helicobacter suis" tem um crescimentoideal a 37°C em condições microaeróbicas sobre um sistema de dois com-ponentes. O componente sólido compreende um meio para micro-organismos meticulosos (tais como ágar Brucella, ágar de Infusão por BrainHeart ou ágar Mueller-Hinton), suplementado com soro ou sangue de bezer-ro fetal, suplementos de crescimento e ajustado a pH 5,0. placas são cober-tas com o componente líquido que é um caldo de um meio de crescimentopara micro-organismos meticulosos (tal como caldo Brucella, caldo de Infu-são por Brain Heart ou caldo Mueller-Hinton) com ou sem suplementos decrescimento, soro ou ajuste de pH.

Exemplo 9: Imunogenicidade de antígenos filtrados sonicados de H. suiscultivado in vitro.

Camundongos SPF BALB/c machos de três semanas de idade(livres de Helicobacter spp.) foram enjaulados em jaulas de topo com filtro deautoclave (5 animais/jaula) alimentados com uma dieta comercial e providoscom água ad libitum por 2-3 semanas antes de iniciar o experimento. Na ho-ra da atribuição, camundongos foram enjaulados em jaulas individuais. Umcultivar de candidatus H. suis foi isolado e cultivado usando o método descri-to no exemplo 1 aqui. Antígeno foi preparado sonicando uma suspensãobacteriana e filtrando-a através de um filtro de poro de 0,22 um. Concentra-ção de proteína foi determinada pelo ensaio Lowry. A preparação de H. suisteve uma concentração de 1,838 mg/ml.

Para cada dose de vacina, 100 ug de proteína foi usada. Paraadministração intranasal (IN) dos antígenos, 5 ug de toxina cólera (Sigma)foram adicionados por dose.

Estômagos de suínos foram coletados do matadouro e homoge-neizados. Esses homogenados de estômago foram usados para infectarcamundongos BALB/c para propagar H. suis in vivo. A passagem em ca-mundongos foi realizada a cada duas semanas com estômagos de camun-dongo de urease completamente positiva homogeneizados em LYM (5 mlLYM/estômago) (LYM usado neste exemplo consiste em 2 volumes de sorode cavalo, 1 volume de caldo de infusão de Brain Heart e 10% de glicose).PCR confirmou a presença de H. suis em cada passagem. A quarta passa-gem do camundongo foi realizada em 10 camundongos BALB/c. A partirdesses camundongos estômagos com urease positiva foram agrupados ehomogeneizados. O homogenado foi congelado a -70°C.

A titulação do estoque congelado foi determinada após descon-gelamento do estoque congelado. Quinze minutos após o descongelamentoa 37°C, diluições seriais de homogenado em LYM foram feitas e inoculadasde forma intragástrica (IG) em camundongos para determinar 100% de nívelde dose de infecção em camundongo.

Grupos de 5 camundongos foram vacinados e inoculados deacordo com a tabela 2.

Tabela 2. Projeto de estudo de experimento de vacinação

<table>table see original document page 40</column></row><table>

IVP = Produto veterinário investigadoSF = Preparação do filtrado sonicadoSC = Injeção subcutânea; IN = Administração intranasalNVNC = Não-vacinado, camundongos não desafiados;NA = Não aplicável

Atividade de Urease no estômago de camundongos é indicativade colonização de bactérias Helicobacter e foi avaliada usando método deCorthésy-Theulaz ei ai. (1995), citado acima. Uma metade do estômago foiimersa em 500 ul de CUTest (Temmler Pharma) e incubada a 37°C por 3 h.Após centrifugação (5min, 100 x g) o sobrenadante foi usado para quantifi-cação de espectrofotometria em OD de 550 nm. O valor de corte foi calcula-do em cada experimento e correspondeu à média + 5 S.D. dos valores deabsorvência obtidos com amostras gástricas de camundongos não imuniza-dos e não desafiados.

DNA de amostras de tecido mucosal foi extraído com o Kit deTecido Dneasy (Qiagen, Hilden, Germany). PCR para detecção específicade H. suis foi realizado como descrito anteriormente (De Groote et ai 2000citado acima)

Os valores de urease médios por tecido estomacal de camun-dongos vacinados foram comparados com esses de camundongos não-vacinados. A porcentagem de PCR de estômagos positivo para H. suis foicomparada entre camundongos não-vacinados / desafiados vs. Controlesvacinados desafiados. Os estômagos de camundongos não desafiados sãoPCR e urease negativa.

Amostras dé sangue para análise sorológica foram tomadas nanecrópsia.

Amostras fecais de camundongos do grupo T01 foram todas po-sitivas no D (Dia) 88-D91. Amostras fecais de camundongos do grupo T10foram todas negativas em D88-D91.

Os resultados de testes de PCR e urease são resumidos na ta-bela 3.

Tabela 3. Resultados do teste de urease e teste de PCR de camundongosvacinados com antígenos H.suis cultivados in vitro e desafiados com H.suis

<table>table see original document page 41</column></row><table>

# Número de amostras positivas de PCR / amostras totais

Os resultados acima mostram que imunização subcutânea e in-tranasal causaram uma diminuição nos valores de atividade de urease mé-dios nos estômagos de todos os animais vacinados. Os níveis de atividadede urease foram inferiores nos animais vacinados intranasalmente. Testesde PCR em amostras de estômago mostraram uma liberação parcial de DNAde H suis no grupo vacinado intranasalmente. Imunização subcutânea decamundongos não mostrou nenhuma redução na detecção de PCR de H.suis. Um efeito de proteção da vacina preparada usando H.suis crescido invitro é alcançado.

Exemplo 10: Redução da colonização de Candidatus helicobacter suis porvacinação de porcos usando antígenos obtidos de isolados de "Candidatushelicobacter suis".

A segurança e eficácia da vacina de "Candidatus helicobactersuis" foi determinada. O antígeno "Candidatus helicobacter suis" foi inativadoe interrompido por sonicação, seguido por filtração estéril e formulação comum adjuvante de emulsão óleo em água. A dose de antígeno foi determinadacom base na quantidade de proteína total presente. Seguinte a desmamada,as porcas foram submetidas à eutanásia e o estômago analisado por umteste de urease quantitativo e PCR para a presença de H.suis. Nove porqui-nhos de uma porca demonstraram PCR positivo para H.suis no estômagoforam excluídos do estudo.

Projeto de Estudo

Porcas foram selecionadas a partir de uma manada livre de in-fecção por "Candidatus helicobacter suis", como determinado por seleção dePCR e urease de estômagos de manada do matadouro. Porquinhos dessasporcas foram atribuídos a um de três grupos: um controle de vacina, um gru-po de vacina "Candidatus helicobacter suis", ou um terceiro grupo (NTX; nãotratado) (tabela 4). O estudo foi um projeto completamente aleatório, e cadaanimai foi a unidade experimental.

Tabela 4. Pro eto de Estudo

<table>table see original document page 42</column></row><table># Injeção intramuscular (IM) no pescoço, alternadamente esquerdo (wk1),direito (wk3), e em seguida esquerdo (wk5).

Todos os porcos foram submetidos a eutanásia com 14 sema-nas de idade.+ NTX = não tratado.

<table>table see original document page 43</column></row><table>

* IVP = Produto Veterinário de Investigação (vacina)

A O adjuvante - uma concentração final de 5% de emulsões óleo em águafoi misturada 1:1 com o antígeno.

Vacinação e Desafio

Porcos foram vacinados por injeção intramuscular no pescoçocom 1, 3, e 5 semanas de idade (tabela 5). Porcos de controle foram vacina-dos ao mesmo tempo com um volume igual de solução salina. Porcos foramobservados por sinais clínicos 1 dia antes e dois dias após a vacinação, edentro de 1 hora após a vacinação. Para o desafio H. suis, homogenados defricção das camadas de célula superiores e mucos do antro de amostrasgástricas que tiveram teste positivo para H. suis (usando teste de urease)foram usados. Para confirmar a viabilidade e dose de homogenato do estô-mago do porco usado como material de desafio, uma alíquota de cada mate-rial de desafio foi administrada para SPF BALB de cinco anos de idade/ccamundongos livres de infecção de H. suis. Camundongos foram sacrifica-dos 2 semanas depois e o conteúdo de estômago peneirado por urease ePCR para a presença de H. suis.

Métodos de Pós-desafio e ganho

Para determinar infecção, tratos intestinais foram dissecados e asuperfície da mucosa dos pars oesophagea foi examinada de forma micros-cópica. Lesões foram pontuadas em uma escala de 0-5 usando o método deHessing et al. (1992, Tijdschrift voor Diergeneeskunde 117, 445-450). Bre-vemente, pontuações foram registradas: 0 = Mucosa intacta; 1 = hipercera-tose branda (<50% de área de superfície); 2 = hiperceratose severa (> 50%de área de superfície); 3 = hiperceratose e umas poucas pequenas erosões(menos do que 5 e menor do que 2,5 cm); 4 = hiperceratose e erosões ex-tensivas (mais do que 5 erosões e/ou maiores do que 2,5 cm); 5 = hipercera-tose e erosões muito grandes (mais do que 10 erosões ou maiores do que 5cm) e/ou úlceras. Cada estômago foi também pontuado usando escala aná-loga visual de 0-100 mm onde 0= sem lesão e 100= úlcera de perfuração.

Após pontuação, muitos locais da mucosa glandular (aproxima-damente 0,5 cm2) de cada estômago foram amostrados por PCR, TM-PCR,teste de urease quantitativa, e histologia. PCR para detecção específica"Candidatos helicobacter suis" foi realizado como descrito por De Groote etal. (2000, acima). A carga bacteriana foi testada por teste de urease quanti-tativa descrito aqui. Restos do tecido estomacal foram testados usando TM-PCR com Helicobacter genus específico e sondas específicas de H.suis. ODNA proveniente da biópsia do tecido foi extraído de acordo com os direcio-namentos do fabricante usando o Qiagen Blood e Tissue Kit. Três (3) con-juntos de iniciadores e sondas foram usados para avaliar cada amostra. Ini-ciadores/sonda de Helicobacter genus e iniciadores/sonda de Helicobactersuis reconhecendo seqüências apropriadas na região 16S e o Kit de Rea-gente de Controle de biossistemas aplicado reconhecendo a região 18S decélulas eucarióticas. Mistura mestre de PCR TM (Applied Biosystems) foiusada de acordo com o direcionamento do fabricante. O DNA foi adicionadoà mistura mestre em concentrações apropriadas e ensaiado no instrumentoPCR de Tempo Real 7900HT (Applied Biosystems) usando o programa PCRpadrão (mantendo a 50°C por 2 minutos seguido por 95°C por 10 minutosem seguida 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto). O nú-mero de cópia por amostra foi determinado por comparação a uma curvapadrão de plasmídeo contendo as seqüências apropriadas.

Resultados: UreasePontuações de densidade ótica de urease foram determinadaspara as três (3) maiores regiões do estômago: antro, cárdia e fundo, (tabelas6-8). A vacina H. suis reduziram pontuações de urease comparadas comcontroles de solução salina na cárdia e fundo (P=0,0025 e 0,0199, respecti-vãmente). Os estômagos de porcos NTX foram negativos como determinadopor PCR urease.

Tabela 6. Pontuações de urease de antro gástrico da média dos mínimosquadrados

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Pontuações com cartas diferentes são estatística e significativamente dife-rentes umas das outras (P<0,10)

Tabela 7. Pontuações de urease de cárdia gástrico da média dos mínimos

<table>table see original document page 45</column></row><table>Pontuações com cartas diferentes são estatística e significativamente dife-rentes umas das outras (P=0,0025)

Tabela 8. Pontuações de urease de fundo gástrico da média dos mínimos

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Pontuações com cartas diferentes são estatística e significativamente dife-rentes umas das outras (P=0,0199)

Resultados: PCR

Todos os locais regionais gástricos foram positivos para a pre-sença de H.suis como determinado pelo ensaio PCR qualitativo. Todas asbiópsias gástricas NTX foram negativas (tabela 9).

Tabela 9. Pontuação positiva/negativa de PCR para biópsias regionais gás-tricas

<table>table see original document page 46</column></row><table>

PCR quantitativo para biópsias regionais gástricas

O DNA derivado de amostras de biópsia de 0,25 cm2, um totalde 2 por antro por porco, ou um (1) por cárdia ou fundo por porco, foi usadopara detectar o nível de DNA de Helicobacter. Enquanto não houve nenhu-ma diferença significante para TM-PCR para antro, fundo, ou cárdia gástri-cos entre grupos de vacina (tabelas 10-12), existiu uma redução numéricano nível de DNA de Helicobacter detectada no fundo e na cárdia (Tabelas 11 e 12).

Tabela 10. TM-PCR para antro gástrico. <table>table see original document page 47</column></row><table>

Tabela 11. TM-PCR para cárdia gástrico <table>table see original document page 47</column></row><table>Tabela 12. TM-PCR para fundus gástrico

<table>table see original document page 48</column></row><table>

Resultados: pontuações de úlcera gástrica

Porcos vacinados com H. suis tiveram pontuações análogas vi-suais numericamente inferiores comparadas a porcos não-vacinados e ne-nhuma dos porcos vacinados tiveram a pontuação mais severa. Diferençasestatisticamente significativas entre grupos para as pontuações análogasvisuais (tabela 13) ou pontuações Hessing (tabela 14) não foram observa-das, entretanto.

TABELA 13. PONTUACOES DE ULCERA GASTRICA ANALOGAS VISUAIS <table>table see original document page 48</column></row><table>Tabela 14. Pontuações de úlcera gástrica Hessing

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Não houve diferenças estatisticamente significantes entre grupos para pon-tuações maiores que 0.

Resultados: Pontuações histopatolóqicas

Houve reduções numéricas entre os grupos vacinados nas pon-tuações análogas visuais de folículos linfóides de superfície e profundos (ta-belas 15-16). Entretanto, nenhuma diferença estatisticamente significanteentre grupos de vacina foi observada.

Tabela 15. Pontuações análogas visuais histopatológicas de folículo linfoide

<table>table see original document page 49</column></row><table>Tabela 16. Pontuações análogas visuais histopatológicas de folículo linfoidede superfície

<table>table see original document page 50</column></row><table>

Conclusões:

A vacina de Helicobacter suis reduziu a colonização dos estô-magos suínos de H.suis. A vacina de H. suis reduziu pontuações de ureasecomparadas a controle de solução salina em ambos a cárdia e o fundo (P<0,0025 e 0,0199, respectivamente).

Exemplo 11: Redução de colonização de Candidatus helicobacter suis porvacinação de porcos usando antíqenos obtidos de isolados de "Candidatushelicobacter suis".

A segurança e a eficácia da vacina de "Candidatus helicobactersuis" foi determinada. O antígeno de "Candidatus helicobacter suis" foi inati-vado e interrompido por sonicação, seguido por filtração estéril e formulaçãocom um adjuvante de emulsão óleo em água. A dose de antígeno foi deter-minada com base na quantidade de proteína total presente.

Projeto de Estudo

Porcas foram selecionadas como descrito no exemplo anterior.Todas as porcas eram livres de H. suis (tabela 17).

Tabela 17. Projeto de Estudo.___

<table>table see original document page 50</column></row><table>

* Injeção intramuscular (IM) no pescoço, alternadamente esquerdo (dia 14),direito (dia 26), e em seguida esquerdo (dia 39).

Todos os porcos foram submetidos à eutanásia com 16 semanas de idade.Tabela 18. Antígeno e Preparação IVP

<table>table see original document page 51</column></row><table>

* IVP = Produto Veterinário Investigativo (vacina)

A O adjuvante - uma concentração final de 5% de emulsão óleo em água -foi misturado 1:1 com o antígeno

Vacinação e Desafio

Porcos foram vacinados por injeção intramuscular no pescoçocom 14, 26 e 39 dias de idade (tabela 18). Porcos de controle foram vacina-dos no mesmo tempo com um volume igual de solução salina. Porcos foramobservados para sinais clínicos 1 dia antes e dois dias após vacinação, edentro de 1 hora após vacinação. Para o desafio H. suis, homogenados derestos das camadas celulares superiores e muco do antro de amostras gás-tricas que tiveram teste positivo para H. suis (usando teste de urease) foramusados. A viabilidade e dose do homogenado de estômago de porco usadocomo material de desafio foi confirmada como no exemplo anterior.

Métodos pós-desafio e pontuação

Métodos e pontuação foram descritos no exemplo anterior.

Resultados: Urease

As pontuações de densidade ótica de urease foram determina-das para as três (3) maiores regiões do estômago: antro, cárdia, e fundo,(tabelas 19-21). Não houve nenhuma diferença estatisticamente significativanas pontuações de urease de porcos vacinados comparados aos controlesde solução salina, embora tenha havido uma leve redução numérica naspontuações de urease da cárdia.Tabela 19. Pontuações de urease de antro gástrico da média dos mínimosquadrados

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Pontuações com cartas diferentes são estatística e significativamente dife-rentes umas das outras (P<0.10)

Tabela 20. Pontuações de urease de cárdia gástrica da média dos mínimos

<table>table see original document page 52</column></row><table> Pontuações com cartas diferentes são estatística e significativamente dife-rentes umas das outras (P<0.10)Tabela 21. Pontuações de urease de fundo gástrico da média dos mínimosquadrados.

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Pontuações com cartas diferentes são estatística e significativamente dife-rentes umas das outras (P <0.10)

Resultados: PCR

Todos os sítios regionais gástricos foram positivos para a pre-sença de H.suis como determinado pelo ensaio de PCR qualitativo excetopara dois animais em cárdia T01 e um animal em fundo T02. (tabela 22).

Tabela 22. Pontuação positiva/negativa de PCR para biópsia regional gástrica

<table>table see original document page 53</column></row><table>

PCR quantitativo para biópsias regionais gástricas

Houve uma diminuição numérica no nível de DNA de H.suis nofundo gástrico de porcos vacinados (tabela 25). Não houve nenhuma dife-rença estatisticamente significativa para TM-PCR específico de H.suis nabiópsia de antro, fundo ou cárdia gástricos entre grupos de vacina (tabelas23-25).Tabela 23. TM-PCR para antro gástrico

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Tabela 24. TM-PCR para cárdia gástrica

<table>table see original document page 54</column></row><table>Tabela 25. TM-PCR para fundo gástrico

<table>table see original document page 55</column></row><table>

Resultados: Pontuações de úlcera gástrica

Não houve nenhuma diferença estatística entre grupos para as pontuaçõesanálogas visuais (tabela 26) ou para pontuações Hessing (tabela 27).

Tabela 26. Pontuações de úlcera gástrica análogas visuais

<table>table see original document page 55</column></row><table>Tabela 27. Pontuações de úlcera gástrica Hessing

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Não houve nenhuma diferença estatisticamente diferente entre grupos parapontuações maiores do que 0.

Conclusões

A vacina Helicobacter suis resultou em uma redução modesta nacolonização do estômago suíno por H.suis.

Exemplo 12. Redução de lesões gástricas por vacinação de porcos usandovacinas de "Candidatus helicobacter suis".

A eficácia de duas vacina de "Candidatus helicobacter suis"(formulações de antígeno diferentes) para reduzir lesões gástricas foi deter-minada. O antígeno de "Candidatus helicobacter suis" doi interrompido portratamento de alta pressão (Avestin) e hmogeneizado com adjuvante (T02),ou foi inativado e interrompido por sonicação, seguido por filtração estéril eformulação com um adjuvante de emulsão óleo em água (T03). A dose deantígeno foi determinada com base na quantidade de proteína total presente.

Projeto de Estudo

Porcas foram selecionadas de uma manada livre de infecção por"Candidatus helicobacter suis" como determinado pela seleção de urease ePCR e estômagos a partir de manadas de matadouro. Porquinhos dessasporcas foram atribuídos a um de três grupos: um controle de solução salinae dois grupos que recebem vacinas de "Candidatus helicobacter suis" (tabe-la 28). Um grupo adicional de três porcos foi usado como um controle de nãotratamento (NTX). O estudo foi um projeto completamente aleatório, e cadaanimal foi a unidade de experimento. Seguinte a desmamada, as porcas fo-ram submetidas à eutanásia e o estômago analisado por um teste de ureasequantitativo e PCR para a presença de H.suis. Todas as porcas eram livresde H.suis.

Tabela 28. Projeto de Estudo

<table>table see original document page 57</column></row><table>

* Injeção intramuscular (IM) no pescoço, alternadamente esquerdo (8 dias),direito (22 dias), e em seguida esquerdo (36 dias).

Todos os porcos foram submetidos à eutanásia com 14 semanas de idade.

Tabela 29. Antígeno e Preparação IVP

<table>table see original document page 57</column></row><table>

* IVP = Produto Veterinário de Investigação (vacina)

A O adjuvante - uma concentração final de 5% de emulsões óleo em água -foi misturado 1:1 com o antígeno.Vacinação e Desafio

Porcos foram vacinados com injeção intramuscular no pescoçocom 8, 22 e 36 dias de idade (tabela 29). Porcos de controle foram vacina-dos com o mesmo tempo com um volume igual de solução salina. Os porcosforam observados por sinais clínicos 1 dia antes e dois dias após a vacina-ção, e dentro de 1 hora após a vacinação. Para o desafio H. suis, homoge-nados de fricção das camadas de célula superiores e mucos do antro deamostras gástricas que tiveram teste positivo para H. suis (usando teste deurease) foram usados. Viabilidade e dose do homogenado do estômago deporco usado como material de desafio foi confirmada como nos exemplosanteriores.

Em adição, o desafio também continha H.suis crescido in vitro.Para a preparação de material de desafio crescido in vitro, H.suis foi cresci-do em uma placa de ágar Brucella de sangue de ovelha com a 10% suple-mentado com Skirros e Vitox e Anfotericina B a 37°C e 10% de CO2 por 4dias. O organismo foi passado nesta forma para alcançar aproximadamente1 x 108 CFU por placa. Os porcos foram desafiados com esta cultura emuma dose de 1 x 109CFU por porco por dose. Este material foi testado paraviabilidade como descrito acima.

Métodos Pós-desafio e Pontuação

Métodos e pontuação foram descritos nos dois exemplos anteri-ores. Em adição, para exame histopatológico, amostras de tecido de mucosagástrica são fixadas em 10% de formalina tamponada por fosfato, processa-das por métodos de rotina, e embebedadas com parfina. Uma seção de 5um é imunohistoquimicamente tingida com um com um bode policlona anti-corpo anti-H. pylori (Dakocytomation, Denmark A/S: Glostrup, Denmark) co-mo descrito por De Groote et ai. (2000). Uma segunda seção é tingida comHE para pontuação de gastrite. Mudanças Histopatológicas são pontuadaspor 1) linfócitos Difusos - um ganho para a infiltração difusa de linfócitos naprópria mucosae; 2) formação de folículos de linfoide na própria mucosae; 3)formação de folículos de linfoide no epitélio da superfície; 4) Infiltração difusadas células plasmáticas na própria mucosae. A presença de folículos de lin-foide sob o epitélio da superfície e a infiltração de células plasmáticas sãomuito noteworthy e lesões características. Estes foram pontuados pela seve-ridade com a pontuação de 0-3. 1 = suave, 2 = moderado, e 3= severo. Elesforam também pontuados usando uma escala análoga visual (0-100 mm).

Resultados: Urease

Pontuações de densidade ótica de urease foram determinadaspara as três (3) maiores regiões do estômago: antro, cárdia, e fundo, (tabe-las 30-32) Não houve nenhuma diferença estatisticamente significativa naspontuações de urease de porcos vacinados comparados a controles de so-lução salina.

Tabela 30. Pontuações de urease de antro gástrico de média dos mínimosquadrados.

<table>table see original document page 59</column></row><table>

Pontuações com cartas diferentes são estatística e significativamente dife-rentes umas das outras (P <0.10)Tabela 31. Pontuações de urease de cárdia gástrica de média dos mínimosquadrados.

<table>table see original document page 60</column></row><table>

Tabela 32. Pontuações de urease de fundo gástrico de média dos mínimosquadrados.

<table>table see original document page 60</column></row><table>

Resultados: PCR

Porcos vacinados tenderam a ser menos provável de terem Dnade H.sul detectável no fundo do estômago. Esta redução foi numérica, masnão foi estatisticamente significativa, dado o número de porcos no estudo. Aporcentagem de sítios regionais gástricos de porcos desafiados positivospara a presença de H.suis é notada abaixo. Todas as biópsias gástricas NTXforam negativas (tabela 33).Tabela 33. Pontuação positiva/negativa de PCR para biópsias regionais gás-tricas.

<table>table see original document page 61</column></row><table>

PCR quantitativo para restos de mucosa gástrica

Não houve nenhuma diferença estatisticamente significativa para YM-PCRpara restos gástricos entre grupos de vacina (tabelas 34-35) indicando quenão houve nenhuma diferença detectável no nível de DNA de Helicobacternos restos gástricos entre grupos de vacina. A discrepância entre este en-saio e os resultados nas tabelas 13-15 (onde as vacinas reduziram o númerode porcos positivos) pode refletir a diferença relativa sentidas nestes ensaiosou na variabilidade de coleta de amostra entre biópsias pequenas e restosde grandes áreas da mucosa gástrica.

Tabela 34. TM-PCR para resto gástrico (Dna de H. spp)

<table>table see original document page 61</column></row><table>Tabela 35. TM-PCR para resto gástrico (Dna de H. spp)

<table>table see original document page 62</column></row><table>

Resultado: Pontuações de úlcera gástrica

Porcos vacinados de H.suis (Y03) tiveram pontuações análogas visuais nu-mericamente inferiores comparadas aos porcos não-vacinados (tabela 36).Ambas as vacinas (T02 e T03) tenderam a reduzir o número de porcos comlesões gástricas (como medido por pontuações Hessing) (tabela 37), e hou-ve uma redução estatisticamente significante do número de porcos com le-sões gástricas nos porcos T03, isto é, porcos significativamente mais vaci-nados eram livres de lesões gástricas do que porcos não-vacinados.

<table>table see original document page 62</column></row><table>Tabela 37. Pontuações de úlcera gástrica Hessing

<table>table see original document page 63</column></row><table>

Porcos vacinados T03 tiveram estatística e significativamente menos porcos(P<0,1) com pontuações Hessing maiores do que 0.

Resultados: Pontuações Histopatológicas

Porcos vacinados (T03) tenderam a ter menos folículos linfóidesde superfície do que porcos não-vacinados. Não houve, entretanto, nenhu-ma diferença estatisticamente significativa entre grupos de vacina para pon-tuações análogas visuais de folículos linfídes de superfície e profundos nemde outras pontuações histológicas. (tabelas 38-43).

Tabela 38. Folículo linfoide profundo, antro, pontuações análogas visuaislistopatológicas.

<table>table see original document page 63</column></row><table>Tabela 39. Folículo linfoide profundo, cárdia, pontuações análogas visuaishistopal ológicas. <table>table see original document page 64</column></row><table>

Tabela 40. Folículo linfoide profundo, fundus, pontuações análogas visuaishistopato ógicas. <table>table see original document page 64</column></row><table>

Tabela 41. Folículo linfoide de superfície, antro, pontuações análogas visuais

<table>table see original document page 64</column></row><table>Tabela 42. Folículo linfoide de superfície, cárdia, pontuações análogas visuais histopatológicas.

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Tabela 43. Folículo linfoide de superfície, fundo, pontuações análogas visuais hispotologicas.

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Conclusões

A vacina Helicobacter suis sonicada (T03) reduziu significativa-mente o número de porcos com lesões gástricas. Não houve, entretanto,nenhuma redução observada de colonização neste estudo.

As vacinas podem ser para modificar a resposta imune à infec-ção a fim de reduzri o efeito patológico da infecção. Isto consiste com a ob-servação que porcos vacinados também tendem a ter poucos folículos linfói-des de superfície em sua mucosa gástrica seguinte a desafio.Listagem de Seqüência

<1M>

<1È&> ESPÉCIES HELICQBACTER E CULTURA DAS MESMAS

<IÍ0> R5504-8R

<150> US 61/QS9,401

<1S1> 2008-06-06

<160> 10

<1?0> t>at*ntln versão $.3

<210> 1

<2U> 1M

<212> OHA

<2l%> Seqüência Artificial

<400> 1

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<210> 2

<211> 20

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<2ií> Seqüência Artificial

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<400> 2

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<212> ONA

<211> Seqüência Artificial«220>

<223> t6S ^liniciador de seqüência de fMH

<40O> I

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<210> 4

<211> 20

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<213> candidatus Heiicobacter suis<220>

<2 21> mi sc_featu re

<222> Cl)..(1421)

<223> 16$ (jene de RNA ribossonal, seqüência parcial

<400> 7 tgcaagtcga acgatgaagc ctagcttgct aggttgatta gtggcgcacg ggtgagtaat 60

gcatagatga catgccctttr agtttggaat agccactaga aatggtgatt aataccàáat 120

actaccttac gagggaaaga tttatcgcta aaggattggt ctatgtceta ttagcttgtt 180

ggtpaggtaa aggctcacca aggctatgac gggtatccgg cctgagaggg tgagcggaca 240

cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcaçjtaggga atattgctea 300

atgggggaaa ecctgaagca gcaacgccge gtggaggatg aaggttttag gatcgtaaac 360

tccttttgtt agagaagata atgacggtat etaacgaata agcaccggct aactccgtgc 420

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cgtagagatc aagaggaata ctcattgcga aggcgacctg ctggaacatt actgacgctg 660

áttgcacgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccetaaac 720

gatggatgct agttgttggg aggctttgtc tttccagtaa tgcagctaac gccttaagca 780

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áãgcggtgga gcatgtggtt taattcgaag ttacacgaag aaccttacct aggcttgaca 900

ttgaaggaat tccctagaaa taggggagtg tctàgcttgc tagaccctga aaacaggtgc 960

tgcacggctg tçgtcagçtc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1020

ccctttttct ^agttgctaa caggttatgc tgcgcactçt aagaagactg cctgcgtaag 1080caggaggaag gtgaggacga cgtcãagtca teatggccct tacgcctagg getacacacg 1140

tgctacaatg gggtgcacaa agagatgcaa agccgcgagg cagagctaat ctataaaaca 1200

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gcaaatcagc tatgttgcgg tgaataegtt cccgggtctt gtactcaccg cccgteacae 1320

catgggagtt gtgtttgcct taagtcagga tgctaaagca gctactgccc acggcacaca 1380

cagcgactgg ggtgaagtcg taacaaggta acccgggcgg c 1421

<21Ô> $

<211> 1221

<112> DMA

<213> candidatus Helieobacter suis<220>

<221> (aiscfeature

<223> Região de interesse biológico genes de urease UreB (ureB) eUreA (ureA) urase P4 cepa de Candidatus Helicobacter

<220>

<221> COS

<222> (1)>.<540)

<223> ureA seqüência parcial

<22G>

<221> CDS

<222> (5$5).,C1220>

<223> ureB seguência parcial

<4G0> S

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aat gct gac aaa gaa gct ate gaa etc aaa gta aaa aac aca ggc gat 240Am Ala Giy Lys Glu Ala lie Gly Leu Lys vai Lys Asn Tfif Gly aso65 70 75 80

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130 135 140

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aaa gat ggc aag ate cat ggc att ggt aaa gcc ggc aat aaa gac attLys Asp Gly Lys lie His Gly lie Gly Lys Ala Gly Asn Lys Asp lie270 275 280

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722

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Ala Ser Glu Glu Tyr Ala Met Asn Leu Gly Tyr Met Gly Lys Gly Asn365 370 375

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vai Ser Tyr Glu Pro ser Leu vai Glu Gln Leu Glu Ala Gly Ala lie380 385 390 395

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ggc ctt aaa ate cac gaa g 1221Gly Leu Lys lie His Glu400

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<213> Candidatus Helicobacter suis<400> 9

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Arq Ala Lys Ala Lys His Phe Gly Thr vai Asn Cys Gly Cys Asp His165 170 175

Glu Asn Lys

<210> 10<211> 222<212> PRT

<213> Candidatus Helicobacter suis<400> 10

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Glu Leu Asp Leu vai lie Thr Asn Ala Leu ile vai Asp Tyr Thr Gly65 70 75 80

lie Tyr Lys Ala Asp Ile Gly lie Lys Asp Gly Lys lie His Gly Ile85 90 95

Gly Lys Ala Gly Asn Lys Asp Ile Gln Asp Gly vai Cys Asn Arg Leu100 105 110

Cys vai Gly Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Leu ile vai115 120 125

Thr Ala Gly Gly Ile Asp Thr His lie His Phe lie Ser Pro Gln Gln130 135 140

ile Pro Thr Ala Phe Ala ser Gly lie Thr Thr Met Leu Gly Gly Gly145 150 155 160

Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr ile Thr Pro Gly Arg165 170 175

Trp Asn Leu Lys Glu Met Leu Arg Ala Ser Glu Glu Tyr Ala Met Asn180 185 190

Leu Gly Tyr Met Gly Lys Gly Asn vai ser Tyr Glu Pro Ser Leu vai195 200 205

Glu Gln Leu Glu Ala Gly Ala He Gly Leu Lys ile His Glu210 215 220

Claims

1. Método para o isolamento de espécies Helicobacter a partir deuma amostra, compreendendo as etapas de cultivar a amostra em um sis-tema de cultura, o sistema compreendendo um meio de cultura tendo um pHentre 5,0 e 6,0, em que o meio é suplementado com pelo menos 10% desoro ou pelo menos 7,5% de sangue.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o meio decultura compreende nutrientes para o crescimento de bactérias meticulosas.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o meio decultura compreende pelo menos uma substância seletiva que inibe o cresci-mento de fungos e/ou bactérias Gram-positivas e/ou Gram-negativas outrosque não a espécie Helicobacter a ser cultivada.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o meio de-1 cultura compreende entre 12,5% e 25 % de soro.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o meio decultura compreende entre 7,5 e 15 % de sangue.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o sistemade cultura compreende um componente sólido e um líquido, e em que pelomenos o componente sólido compreende o meio de cultura.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o compo-nente sólido compreende entre 12,5% e 25 % de soro.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o compo-nente sólido compreende entre 7,5 e 15 % de sangue.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a espécieHelicobacter é "Candidatas helicobacter suis".

10. Isolado de "Candidatus helicobacter suis", livre de outrasbactérias ou fungos presentes no estômago, obteníveis pelo método comodefinido na reivindicação 1.

11. Isolado de "Candidatus helicobacter suis", de acordo com areivindicação 10, depositado como LGM P-24572.

12. Método para cultivar um isolado de uma espécie Helicobac-ter, compreendendo a etapa de aplicar o isolado em um sistema de cultura,o sistema compreendendo um meio de cultura tendo um pH entre 4,0 e 7,0que é suplementado com pelo menos 10 % de soro ou pelo menos 7,5 % desangue, e incubar o isolado no mesmo.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que o siste-ma de cultura compreende um componente sólido e um líquido, e em quepelo menos o componente sólido compreende o meio de cultura.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o com-ponente sólido e o líquido compreende nutrientes para o crescimento debactérias meticulosas.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que pelo me-nos o componente sólido é tamponado em um pH entre 4,7 e 7,0.

16. Recipiente de cultura compreendendo um meio de culturasólido para o isolamento e/ou cultura de uma espécie Helicobacter, o meiosólido compreendendo sangue em uma concentração entre 7,5 e 15 % ousoro em uma concentração entre 12,5 e 25 %, em que o pH do meio sólidoestá entre 5,0 e 6,0.

17. Recipiente de cultura, de acordo com a reivindicação 16, queadicionalmente compreende nutrientes para o crescimento de organismosmeticulosos.

18. Recipiente de cultura, de acordo com a reivindicação 16, queadicionalmente compreende pelo menos uma substância seletiva que inibe ocrescimento de fungos e/ou bactérias Gram-positivas e/ou Gram-negativasoutros que não a espécie Helicobacter a ser cultivada.

19. Recipiente de cultura de acordo com a reivindicação 16, emque o referido sólido compreende ágar.

20. Vacina compreendendo uma preparação de antíeno de iso-lado de "Candidateis helicobacter suis".

21. Método para produzir uma preparação de antígeno de "Can-didatus helicobacter suis", o método compreendendo o isolamento de "Can-didatus helicobacter suis" como definido na reivindicação 1, e a produção deuma preparação de antígeno do isolado de "Candidatus helicobacter suis"obtido.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, que adicional-mente compreende cultivar o "Candidatus helicobacter suis" como definidoda reivindicação 12.

23. Método de vacinar um animal contra uma infecção "Candida-tus helicobacter suis" compreendendo administrar ao animal uma vacinacompreendendo um ou mais de:- uma ou mais preparações de antígeno de um isolado de "Can-didatus helicobacter suis",- um isolado "Candidatus helicobacter suis" atenuado vivo,- um isolado "Candidatus helicobacter suis" completamente morto.