BRPI0903797A2 - método para diagnóstico e monitoramento de alfa-sinucleinopatias pela determinação de nìveis de mirnas em amostras biológicas - Google Patents
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Abstract
MéTODO PARA DIAGNóSTICO E MONITORAMENTO DE ALFA-SINUCLEINOPATIAS PELA DETERMINAçáO DE NìVEIS DE MIRNAS EM AMOSTRAS BIOLóGICAS. A presente invenção revela um método de diagnóstico/prognóstico de alfa-sinucleinopatias como a Doença de Parkinson. O método da invenção compreende a detecção do nível de microRNAs maduros específicos em amostras de fluidos biológicos como o sangue, sendo útil para o diagnóstico, monitoramento de resposta a tratamento químico ou cirúrgico.
Description
Relatório Descritivo de Patente de Invenção
Método para diagnóstico ε monitoramento de alfa-sinucleinopatias peladeterminação de níveis de MlRNAS em amostras biológicas
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a métodos in vitro de diagnóstico e/ouprognóstico. Mais especificamente, a presente invenção proporciona ummétodo para o diagnóstico e/ou prognóstico de alfa-sinucleinopatias, como aDoença de Parkinson. O método da invenção compreende a quantificaçãocomparativa de miRNAs de amostras de indivíduos suspeitos ou acometidos dealfa-sinucleinopatias, proporcionando informação diagnostica/prognostica útilna definição de condutas clínicas.
Antecedentes da Invenção
A Doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa crônicaque acomete homens e mulheres de diferentes raças e classes sociais.Estudos epidemiológicos têm demonstrado que a DP ocorre em 1.81-3.32% dosindivíduos com idade superior a 65 anos. Frente ao aumento da expectativa devida da população mundial torna-se evidente a tendência ao aumento donúmero de pessoas potencialmente acometidas pela DP e a importância doadequado diagnóstico nestes pacientes. Também tem sido demonstrado piorana qualidade de vida dos indivíduos com DP3"5 e de seus cuidadores4.
A Doença de Parkinson é uma alfa-sinucleinopatia caracterizada pelaocorrência de sintomas motores como rigidez muscular, tremor de repouso,bradicinesia e instabilidade postural6. Os sintomas não-motores da DP incluemdisfunções autonômicas, sensoriais e neuropsiquiátricas7.
As características clínicas da DP e a sua progressão são muito variáveispara cada paciente. Existem diferentes propostas para os critérios a seremconsiderados no diagnóstico clínico da DP. Os critérios propostos pelo Bancode Cérebros de Londres6 têm sido utilizados e consistem em três etapas: (1)Na primeira etapa é avaliada a presença de sintomas compatíveis com asíndrome parkinsoniana, na qual é necessária a presença de bradicinesiaassociada a pelo menos uma das seguintes manifestações: rigidez muscular,tremor de repouso, instabilidade postural. (2) Na segunda etapa sãoconsiderados os critérios de exclusão para a DP, ou seja, o indivíduo não podeapresentar: história de acidentes vasculares encefálicos de repetição comprogressão em degraus de sintomas, história de traumas cranianos repetidos,antecedente comprovado de encefalite, crises oculógiras, uso de neurolépticodesde o início dos sintomas da doença, mais que um caso de acometimentofamiliar, remissão prolongada de sintomas, persistência de acometimentounilateral após três anos, paralisia ocular supranuclear, sinais cerebelares,acometimento autonômico precoce e acentuado, demência em fases iniciais dadoença, sinais piramidais, presença de lesões expansivas intra-cranianas(tumores, hidrocefalia à neuroimagem), exposição ao MPTP, má-respostaterapêutica a altas doses de levodopa. (3) Na terceira etapa estão os critériosdenominados como de sustentação para o diagnóstico da DP, sendonecessário três ou mais dos seguintes: início unilateral, acometimentoassimétrico; doença progressiva; assimetria persistente afetandoprincipalmente o lado de início da doença; resposta excelente à levodopa(melhora de 70 a 100%); resposta à levodopa por cinco anos ou mais;discinesia induzida pela terapia com levodopa; evolução clínica igual ousuperior a dez anos.
Atualmente, o diagnóstico definitivo para DP só é possível com aconfirmação pela necropsia. Os critérios propostos para confirmaçãohistopatológica da DP consistem em redução substancial de células nervosasna substância negra acompanhada de gliose; pelo menos um corpúsculo deLewy na substância negra ou no Iocus ceruleus (devem ser examinadas pelomenos quatro diferentes seções em cada uma dessas áreas antes de concluirque os corpúsculos de Lewy estão ausentes); nenhuma evidência patológicapara outra doença que produza parkinsonismo, por exemplo: paralisiasupranuclear progressiva, degeneração cortico-gânglio-basal, atrofia demúltiplos sistemas8. Ressalta-se, desta forma, a importância da diferenciaçãoentre DP e outras doenças que apresentem parkinsonismo como paralisiasupranuclear progressiva, degeneração cortico-gânglio-basal, atrofia demúltiplos sistemas.
Os sinais e sintomas motores da DP devem-se, primariamente, aalterações funcionais dos núcleos da base. De fato, a progressão dasdificuldades motoras na DP reflete a gradual degeneração dos neurôniosdopaminérgicos nigroestriatais. No entanto, ressalta-se que a partir dosachados descritos por Braak e cols (2002)9 foi destacado o envolvimento dediferentes estruturas cerebrais, além dos núcleos da base, na fisiopatologia daDP o que auxilia a compreender as diferentes manifestações motoras e nãomotoras da DP. Apesar dos avanços na compreensão da fisiopatologia da DP asua etiologia ainda não está completamente estabelecida. Deve-se destacarque o diagnóstico de DP permanece unicamente baseado em critérios clínicose na experiência da avaliação realizada pelo médico neurologista. Ressalta-seque diversos quadros clínicos cursam com a ocorrência tremor o que reforça anecessidade do adequado diagnóstico diferencial. Estudos atuais sugerem queé freqüente a presença de sintomas não motores antecedendo os sintomasmotores e desta forma o diagnóstico de DP10.
Pesquisas em biologia molecular têm estudado e identificado diferentesmicroRNAs (miRNAs)11. As miRNAs são seqüências de aproximadamente 22nucleotídeos de RNA (ácido ribonucléico) não-codificante e tem sido propostoque regulem a expressão do gene através do emparelhamento base-específicocom RNAmensageiro (RNAm) alvo. Até o momento entende-se que a maioriado miRNAs, em espécies animais, atuem através da inibição da efetivatradução do RNAm de genes alvo através de um imperfeito pareamento debase com a região 3'UTR (untranslated region) dos RNAm alvo. Essemecanismo parece estar envolvido com a inibição do início da tradução12. Em2007, foi identificado um miRNA, miR-133b, que é expresso em neurôniosdopaminérgicos. O miR-133b regula a maturação e função de neurôniosdopaminérgicos e foi identificado como deficiente no cérebro de pacientes com DP13.A ocorrência de alterações na expressão de miRNA também foi descritaem células tumorais e tem sido proposto que tais alterações possam contribuirno desenvolvimento do câncer14. Também foi identificado modificação naexpressão de miRNA em líquido cérebro-espinhal relacionados à Doença deAlzheimer15.
Considerado o potencial da quantificação de miRNA para o diagnósticode diversas patologias a necessidade de utilizar tecido para essa dosagemdificulta a utilização desta medida em patologias neurológicas. No entanto, apossibilidade da quantificação de miRNAs em sangue venoso periféricopoderia ser considerado como uma ferramenta útil e de baixo risco secomparado a procedimentos como biopsia cerebral e punção de líquidocérebro-espinhal.
A literatura científica que circunscreve os objetos da invenção, semcontudo antecipá-los ou sequer sugeri-los é apresentada a seguir.
1. De Rijk MC, Launer LJ, Berger K, Breteler MM, Dartigues JF1Baldereschi M, Fratiglioni L, Lobo A, Martinez-Lage J, Trenkwalder C,Hofman A. Prevalence of Parkinson's disease in Europe: A collaborativestudy of population^based cohorts. Neurologic Diseases in the ElderlyResearch Group. Neurology.2000·, 54(11) Suppl 5: S21-3.
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15. Cogswell JP1 Taylor IA1 Waters , Shi Y1 Cannon , Keinar K1Kemppainen J, Brown D1 Chen C1 Prinjha RK1 Richardson JC1 Saunders AM,Roses AD1 Riehards CA. Identification of miRNA changes in Alzheimer 'sdiseae brain and CSF yields putative biomarkers ad insights into diseasepathways. JAIzheimerDis. 2008;14(1):27-41.
A literatura patentária contempla documentos apenas parcialmenterelacionados aos objetos da presente invenção.O pedido internacional de patente WO 2009/009457 "ALZHElMER1SDISEASE-SPECIFIC MICRO-RNA MICROARRAY AND RELATEDMETHODS", depositado pela Fundação de Pesquisa da Universidade deLouisville, revela métodos de diagnóstico e/ou prognóstico de Alzheimer pelamedida da quantidade, em uma amostra biológica, de um ou mais micro-RNAsrelacionados a Alzheimer.
O pedido internacional de patente WO 2008/153692 "MICRORNAEXPRESSION PROFILING OF CEREBROSPINAL FLUID", depositado porTHE BRIGHAM AND WOMEN1S HOSPITAL, INC., revela métodos dediagnóstico nos quais o nível de determinado microRNAs específicos sãodeterminados no fluido cérebro-espinhal de um indivíduo. O método pode serusado para o diagnóstico ou monitoramento de doenças neurológicas,especialmente tumores cerebrais.
O pedido internacional de patente WO 2007/107789 "TREATMENT OFCNS CONDITIONS", depositado por Silentis S.A., revela métodos ecomposições para o tratamento de condições patológicas do sistema nervosocentral, por meio da administração intranasal de uma composição que modula,por RNA interferência, a expressão e/ou atividade de genes envolvidos em taiscondições.
O pedido internacional de patente WO 2009/025852 "METHODS OFUSING miRNA FOR DETECTION OF IN VIVO CELL DEATH", depositado porXenomics, INC. revela métodos não-invasivos para a detecção de mortecelular, através da medida de miRNAs tecido-específicos. O método pode seraplicado na detecção de patologias causadas ou acompanhadas de mortecelular, efeitos citotóxicos induzidos por fatores químicos ou físicos e apresença de anormalidades fetais específicas.
O pedido internacional de patente WO 2009/026416 "SHORT-CONTROLLING NUCLEIC ACIDS USEFUL IN THE TREATMENT ANDDETECTION OF DISEASES", depositado por VDX LLC, revela métodos para autilização de seqüências curtas controladores (scRNAs) para triagem eidentificação de ácidos nucléicos alvo que se liguem a seqüências de scRNAsem loop. Também são revelados métodos para detectar scRNAs e métodospara diagnóstico e tratamento úteis de doenças nas quais scRNAs ou níveisaberrantes dos mesmos são expressos.
O pedido internacional de patente WO 05045034, "RNAINTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF PARKINSON DISEASEUSING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siRNA)", depositado porSIRNA Therapeutics1 INC., revela métodos e reagentes úteis na modulação degenes de Parkinson, por exemplo, a expressão gênica de PARK1 (SNCA),PARK2, PARK7, e/ou PARK5 em uma variedade de aplicações, incluindoterapêutica, diagnostica, validação de alvos e descobertas genômicas.Especificamente, são reveladas moléculas pequenas de ácido nucleico, comosiNA, siRNA, dsRNA, miRNA, e shRNA, como moléculas capazes de mediar aRNA interferência contra a expressão gênica e/ou atividade de SNCA. Asreferidas moléculas são propostas como úteis no diagnóstico e tratamento deDoença de Parkinson e a qualquer outra doença ou condição que responda àmodulação da expressão ou atividade de PARK1 (SNCA), PARK2, PARK7,e/ou PARK5.
Não foram encontrados no estado da arte antecedentes que antecipemintegralmente, ou sequer sugiram, mesmo que em combinação, a estratégia dapresente invenção.
Sumário da Invenção
É um dos objetos da presente invenção proporcionar métodos dediagnóstico e/ou prognóstico de alfa-sinucleinopatias, como a Doença deParkinson.
Em um aspecto, sendo, portanto, um dos objetos da invenção, éproporcionado um método que compreende a quantificação comparativa demiRNAs de amostras de indivíduos suspeitos ou acometidos de alfa-sinucleinopatias.
É também um outro objeto da presente invenção proporcionar ummétodo diagnóstico/prognóstico que compreende a quantificação comparativade miRNAs (microRNAs) selecionados de um grupo que compreende: miR 1,miR16-2*, miR22*, miR26a2*, miR29a, miR30a, miR487b, let7c*, miR16,miR100, miR150, miR125-b1*, miR132 e miR191, ou ainda combinações dosmesmos.
Estes e outros da presente invenção serão melhor compreendidos evalorizados a partir da descrição detalhada da invenção e das reivindicaçõesanexas.
Breve Descrição das Figuras
A figura 1 mostra o padrão de expressão de microRNAs com níveisalterados na comparação entre indivíduos controle (Cnt) e diagnosticadosclinicamente como apresentando a Doença de Parkinson (PD) - Grupo I (Lowtemperatura).
A figura 2 mostra o padrão de expressão de microRNAs com níveisalterados na comparação entre indivíduos controle (Cnt) e diagnosticadosclinicamente como apresentando a Doença de Parkinson (PD) - Grupo Il (Hightemperature).
Descrição Detalhada da Invenção
Os detalhes relatados a seguir visam facilitar a reprodução da invenção,devendo, portanto, ser compreendidos como meramente ilustrativos, sem comisso restringir o escopo da invenção.
A presente invenção é baseada no fato de que alguns miRNAs sãoexpressos em diferentes níveis em sangue periférico, quando avaliadopacientes com Doença de Parkinson em relação a indivíduos sem a doença.Esta observação permite considerar a utilização de sangue periférico naavaliação desta patologia. A comparação pode ser feita entre os níveis demiRNA em sangue venoso de um determinado indivíduo em relação acontroles. A comparação pode ser feita de forma direta ou pelo cálculo darazão entre os microRNAs e a determinação da presença da patologia (e suaevolução ou remissão) se a relação exceder limites de 25, 50 ou 75% emrelação aos níveis observados em indivíduos controle, sem a doença.
A invenção é direcionada para o diagnóstico e monitoramento de umaalfa-sinucleinopatia, a Doença de Parkinson, a partir de amostra de sanguevenoso em um determinado indivíduo. O termo diagnóstico se refere àdetecção da doença. O termo monitoramento se refere aos testes realizadosem pacientes com o diagnóstico prévio da referida doença tendo comoproposta medir a progressão da doença ou efeito do tratamento.
Em uma concretização preferencial, o método da invenção compreendea obtenção de uma amostra de sangue venoso periférico de um dado indivíduoe a análise dessa amostra para determinar a concentração ou quantidade deuma série de até quatorze microRNAs em análise. Os resultados obtidos sãocomparados com os obtidos de amostras controle. A amostra controle provémde indivíduos livres da doença. No caso em que o método for utilizado paramonitorar a doença, a amostra "controle" é o resultado do teste obtido dopróprio paciente na medida anterior. Ou seja, o paciente pode ser avaliado paramudanças nos níveis de miRNAs em diferentes momentos e estágios dadoença, assim como previamente e posteriormente a determinada intervençãoterapêutica (medicação ou cirurgia).
Ressalta-se que não é necessário que a amostra controle seja obtida eanalisada no mesmo momento em que esteja sendo realizada a análise daamostra teste. Uma vez que os dados "controle" podem ser pré-estabelecidos,esses níveis poderão fornecer a base para comparação sem a necessidade derepetir uma nova análise do controle para cada teste a ser analisado. Acomparação entre as amostras teste e controle fornece a base para aconclusão quanto ao fato de o indivíduo ser acometido por uma alfa-sinucleinopatia (por exemplo, Doença de Parkinson) em análise no caso dométodo estar sendo utilizado para o diagnóstico ou se a doença estáprogredindo ou regredindo; no caso do método estar sendo utilizado paramonitorar a patologia. De um modo geral, quanto maior diferença entre aamostra teste e a amostra controle, mais intensa a indicação da presença dadoença.
Os microRNAs empregados no método da invenção incluem: miR-1;miR16-2*; miR22*; miR26a2*;miR29a; miR30a; miR487b; Iet7c*; miR16,miRIOO, miR150, miR125-b1*, miR132 e miR191. As designações fornecidasestão associadas a seqüências específicas que podem ser encontradas noregistro de microRNA (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/). OsmicroRNAs referem-se a seqüências encontradas em humanos, ilustrada/os natabela 1.
Tabela 1: Seqüência nucleotídica dos microRNAs maduros, com os quais foidesenvolvido a metodologia para diagnóstico de alfa-sinucleinopatias.
<table>table see original document page 11</column></row><table>Por vezes, há membros da família destes miRNAs que são reconhecidose os quais poderiam ser considerados como equivalentes a seqüênciaespecífica. Apesar das seqüências serem apresentadas como seqüências deRNA1 deve ser compreendido que se referindo à hibridização ou outros ensaiosas seqüências de DNA correspondente podem ser utilizadas da mesma forma.Por exemplo, seqüência de RNA pode ser transcrita ao reverso e amplificadausando a reação em cadeia da polimerase visando facilitar a detecção. Nessescasos será o DNA diretamente quantificado. Também deve ser esclarecido queo complemento da seqüência de DNA transcrita ao reverso pode ser analisadoao invés da seqüência em si. Nesse contexto, o termo complemento se refereao oligonucleotideo que apresenta a exata seqüência complementar.
Para análise dos microRNAs a partir da amostra de sangue é utilizado ométodo de PCR quantitativo, com o emprego de fluoróforos intercalantes comoo SYBR-green (ou equivalente) como descrito no trabalhos de Chen et al de2005 (Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. NucleicAcids Research 33:e179) e de Jiang JM et al de 2005 (Real-time expressionprofiling of microRNA precursors in human câncer cell lines. Nucleic AcidsResearch 33: 5394-5403).
Também podem ser utilizadas sondas marcadas com fluoróforosespecíficos (FAM, HEX, TAMRA ou outros) como descrito em trabalhoscorrelacionando níveis de miRNAs com o câncer (Chen et al. 2009. The role ofmicroRNA expression pattern in human intrahepatic cholangiocarcinoma.Joumal of Hepatology 50: 358-369; Childs et al. 2009. Low-Level Expression ofMicroRNAs let-7d and miR-205 Are Prognostic Markers of Head and NeckSquamous Cell Carcinoma. American Journal of Pathology 174: 736-745; Sunet al. 2008. Curcumin (diferuloylmethane) alters the expression profiles ofmicroRNAs in human pancreatic câncer cells. Molecular Câncer Therapeutics7: 464-473; Szafranska et al. 2008. Analysis of microRNAs in pancreatic fine-needle aspirates can classify benign and malignant tissues. Clinicai Chemistry54: 1716-1724; Tang et al. 2008. Effect of alcohol on miR-212 expression inintestinal epithelial cells and its potential role in alcoholic Iiver disease.Alcoholism-Clinical and Experimental Research 32: 355-364).
O nível de expressão dos microRNAs quantificada, tendo-se como basea metodologia de PCR em tempo real, será realizada em duas etapas. Na 1aetapa, uma série de até 14 oligonucleotídeos (multi-plex) contendo umaseqüência universal fusionada a uma seqüência microRNA específica de seisnucleotídeos será utilizado para a síntese de cDNA a partir do microRNA. Na 2aetapa, as reações de PCR em tempo real serão realizadas utilizando umoligonucleotídeo que é microRNA específico e um oligonucleotídeocomplementar a seqüência universal presente no oligonucleotídeo utilizadopara a síntese dos cDNAs.
As reações de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) serão realizadasem equipamento padrão. De forma ilustrativa, considera-se que a PCRapresente etapas das reações que serão compostas de uma desnaturaçãoinicial a 94°C por 5 minutos, seguido por 40 ciclos de 10s a 94°C, 15s a 60°C e10s a 72°C. Após, as amostras serão aquecidas de 60 para 99°C com umaumento de 0,1°C/s para adquirir os dados produzidos pela curva dedesnaturação dos produtos amplificados. qRT-PCRs serão feitos em umvolume final de 20 μL composto de 10 μl de cada amostra de cDNA diluída de50 a 100 vezes em 2 μL de Platinum Taq 10x PCR buffer, 1,2 μL MgCI2 50 mM,0,4 μL dNTPs 5 mM, 0,4 μL do par de oligonucleotídeos a 10 μΜ, 3,95 μL H2O,2,0 μL SYBR green ou sonda marcada, e 0,05 μL Taq DNA polymerase (5U/μΙ-).
Os versados na arte valorizarão imediatamente os importantesbenefícios decorrentes do uso da presente invenção. Variações na forma deconcretizar o conceito inventivo aqui exemplificado devem ser compreendidascomo dentro do espírito da invenção e das reivindicações anexas.
Claims (7)
1. Método para diagnóstico/prognóstico de alfa-sinucleinopatias emdeterminado indivíduo, caracterizado por compreender:a) determinar a concentração, em um material compreendendofluido e/ou tecido biológico, da quantidade ou níveis de umgrupo de microRNAs através de metodologias de PCRquantitativa utilizando fluoróforos intercalantes e/ou sondasfluorescentes;b) comparar a concentração ou quantidade de um ou do conjuntodos microRNAs determinada na etapa "a" com a concentraçãoou quantidade dos mesmos de uma ou mais amostrasbiológicas de indivíduos controle.
2. Método, conforme reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que areferida alfa-sinucleinopatia é a Doença de Parkinson.
3. Método, conforme reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que oreferido fluido biológico è sangue.
4. Método, conforme reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que oreferido material biológico compreende células mononucleares.
5. Método, conforme reivindicação 1, caracterizado pelo fato de queos microRNAs são selecionados de um grupo que compreende:miR 1, miR16-2*, miR22*, miR26a2*, miR29a, miR30a, miR487b,let7c*, miR16, miRIOO, miR150, miR125-b1*, miR132 e miR191, ouainda combinações dos mesmos.
6. Método, conforme reivindicação 1, caracterizado por compreenderamostras de indivíduos submetidos a tratamentos ou modificaçãode tratamentos farmacoterápicos para alfa-sinucleinopatias eDoença de Parkinson, baseadas na quantificação de um ou maismiRNAs.
7. Método para determinar a eficiência de tratamento e/ou progressãode alfa-sinucleinopatias e/ou Doença de Parkinson em umindivíduo, caracterizado por compreender:a. obter uma série de amostras biológicas de um mesmoindivíduo, ao longo de um período de tempo;b. analisar uma série de amostras biológicas para identificar edeterminar a quantidade de um ou mais miRNAscorrelacionados a alfa-sinucleinopatias e Doença deParkinson; onde um ou mais miRNA são selecionados dogrupo que compreende: miR 1, miR16-2*, miR22*,miR26a2*, miR29a, miR30a, miR487b e Iet7c*, miR16,miRIOO, miR150, miR125-b1*, miR132 e miR191, ou aindacombinações dos mesmos; ec. comparar as mudanças mensuráveis de quantidades de umou mais dos miRNAs em cada uma das amostras biológicasproporcionando indicadores para a determinação daeficiência do tratamento e/ou progressão da alfa-sinucleinopatias e/ou Doença de Parkinson.
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2009
- 2009-09-17 BR BRPI0903797A patent/BRPI0903797B8/pt not_active IP Right Cessation
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