BRPI0905590A2

BRPI0905590A2 - processo industrial de imobilização de um consórcio de microrganismos presentes no kefir biologicus, bem como de seus bioativos, por meio da formação de microcápsulas de alginato de cálcio modificado

Info

Publication number: BRPI0905590A2
Application number: BRPI0905590-8A
Authority: BR
Inventors: Avallone Bueno Luciano; De Fátima Fonseca Marques Maria; Nunes Marques Djalma
Original assignee: Avallone Bueno Luciano
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2009-12-22
Publication date: 2011-08-23

Abstract

PROCESSO INDUSTRIAL DE IMOBILIZAçãO DE UM CONSóRCIO DE MICRORGANISMOS PRESENTES NO KEFIR BIOLOGICUS, BEM COMO DE SEUS BIOATIVOS, POR MEIO DA FORMAçãO DE MICROCáPSULAS DE ALGINATO DE CáLCIO MODIFICADO onde se microencapsula os microorganismos presentes no kefir, assim como seus produtos metabólicos, permitindo a sua conservação sem os cuidados exigidos pelo kefir não processado, bem como viabilizando a sua inclusão em alimentos, cosméticos e medicamentos sem lhes modificar a cor, sabor ou odor e, ao mesmo tempo lhes conferindo os benefícios probiáticos do kefir.

Description

"PROCESSO INDUSTRIAL DE !MOBILIZAÇÃO DE UMCONSÓRCIO DE MICRORGANISMOS PRESENTES NO KEFIRBIOLOGICUS, BEM COMO DE SEUS BIOATIVOS, POR MEIO DAFORMAÇÃO DE MICROCÁPSULAS DE ALGINATO DE CÁLCIOMODIFICADO".

Trata a presente invenção de um processo industrial de

imobilização de um consórcio de microrganismos presentes no KefirBioLogicus, bem como de seus bioativos, por meio deencapsulamento em forma de microcápsulas, esféricas, à base de alginato de cálcio modificado com Kefirano e Pectina. Tal invençãopermite a distribuição dos microrganismos e de seus bioativos sema necessidade de maior manutenção pelo usuário, bem como aaplicação direta das microcápsulas em alimentos, cosméticos edermocosméticos, tornando-os probióticos e/ou com componentesprobióticos.

No início dos anos 70, Todd definiu amicroencapsulação como a tecnologia de empacotamento, comfinas coberturas poliméricas aplicáveis em sólidos, gotículas delíquidos ou material gasoso, formando pequenas partículasdenominadas microcápsulas, que podem liberar seu conteúdo sobvelocidade e condições específicas. Por sua vez, ARSHADY (1993)descreveu as microcápsulas como embalagens extremamentepequenas, compostas por um polímero como material de parede eum material ativo chamado de núcleo. Ainda de acordo comSHAHIDI e HAN (1993), as microcápsulas têm a capacidade demodificar e melhorar a aparência e as propriedades de umasubstância. Esses autores listaram os seguintes motivos para o usoda microencapsulação na indústria alimentícia: (a) reduzir areatividade do material de núcleo com o ambiente; (b) diminuir avelocidade de evaporação ou de transferência do materialencapsulado; (c) promover liberação controlada; (d) mascarar sabore odor desagradáveis; e (e) promover a diluição homogênea domaterial encapsulado em uma formulação alimentícia. Nos últimosanos, tais definições e empregos da microencapsulação têm sidoampliados devido às novas necessidades que a indústria dealimentos demonstra em propriedades cada vez mais complexasnas formulações, que muitas vezes só podem ser conferidas pormeio de tal processo (GOUIN, 2004). Dentro dessas necessidades,o conceito de liberação controlada tem sido cada vez maissolicitado (GOUIN, 2004; SANGUANSRI e AUGUSTIN, 2006;UBBINK e KRUGER, 2006). Há uma tendência mundial que apontapara a necessidade de que os alimentos não sejam mais vistossomente como uma fonte de nutrientes com apelo sensorial, mastambém como fonte de bem-estar e de saúde para a população.Esta mudança de perspectiva requer, indiscutivelmente, mudançasde paradigma no desenvolvimento de novos produtos, aplicando-seos métodos tradicionais, mas também se observando anecessidade do controle da bioacessibilidade de determinadoscomponentes dos alimentos. Esta abordagem se torna cada vezmais relevante conforme se estabelecem as relações entregenética, alimentação e saúde (SANGUANSRI e AUGUSTIN,2006), e a microencapsulação é um meio efetivo de se alcançar taisobjetivos. Os ingredientes ativos adicionados aos alimentos incluemos tradicionais, como: aromas, vitaminas, minerais, e tambémoutros mais recentes, como os microrganismos probióticos(FAVARO-TRINDADE e GROSSO, 2002; KAILASAPATHY, 2006),peptídeos bioativos (ARIMOTO ET AL., 2004) e diversas outrasclasses de bioativos. GOUIN (2004) e DESAI e PARK (2005)chegaram a afirmar que, através de propriedades de liberaçãocontrolada finamente ajustadas, a microencapsulação deixa de sersomente um método de agregação de substâncias a umaformulação alimentícia, e se torna uma fonte de ingredientestotalmente novos como propriedades únicas. Além disso, ainovação na indústria de alimentos já necessita, sem dúvidaalguma, da mudança de foco da observação das propriedadesmacroscópicas para aqueias que surgem na meso e nananoescalas, com o subseqüente controle das estruturashierárquicas nos alimentos e na sua funcionalidade. Por essemotivo, são cada vez mais imprescindíveis os estudos sobre asrelações entre as estruturas nano e supramoleculares, bem comoda funcionalidade nos níveis físico, nutricional e fisiológico(SANGUANSRI e AUGUSTIN, 2006).

Os microrganismos probióticos são, no conceito daOrganização Mundial de Saúde, "organismos vivos que, quandoadministrados em quantidades adequadas, conferem benefício àsaúde do hospedeiro". Probióticos, para outros autores, sãodefinidos como sendo microrganismos que se estabelecem no meiointestinal e oferecem efeitos benéficos ao hospedeiro (humanos ouanimais), substancialmente através da manutenção e da melhoriada microbiota (entre os microrganismos benéficos e os maléficos)do intestino (FULLER 1989; 1991; GOLDIN 1998, GISMONDO ETAL. 1999). A humanidade já se utiliza a centenas de anos dosalimentos probióticos, principalmente aqueles derivados do leite,como é o caso do iogurte, kefir, entre outros. Nos anos recentes,com a maior conscientização da população para os benefícios àsaúde trazidos pelos probióticos, tem havido uma demanda nomercado por este tipo de alimento, predominando no mercadovariantes de leites fermentados por um ou dois tipos demicrorganismos. Vários benefícios à saúde tem sido atribuídos aosprobióticos assim como propriedades antimutagênicas,anticancerígenas, antiinflamatórias, estimulação do sistemaimunológico, redução de colesterol, alívio da intolerância a Iactose eganho nutricional (GILLILAND e SPECK, 1977; KIM e GILLILAND,1983; RASIC e KURMANN, 1983; GURR1 1987; GILLILAND, 1989;SURAWiCS ET AL., 1989; FULLER, 1992; BUCK e GiLLiLAND11994; LANKAPUTHRA AND SHAH1 1995; DALY AND DAVIS1 1998;KLEIN ET AL., 1998; MACFARLANE e CUMMINGS, 1999;MOMBELLI e GISMONDO, 2000). Espécies de Lactobacillusacidophilus, L casei, Bifidobacterium bifidum, B. longum, B. breve,B. infantis e B. Iactis (B. animalis) são as bactérias mais popularesaplicadas em produtos alimentares probióticos (DALY e DAVIS,1998; KLEIN ET AL., 1998; MACFARLANE e CUMMINGS, 1999).Muitas pesquisas envolvendo estudos de viabilidade esobrevivência dos probióticos no trato gastrointestinal e emprodutos alimentares (especialmente em produtos lácteosfermentados) tem revelado que de uma forma geral, a viabilidadediminui drasticamente devido à exposição aos fatores ambientaisprejudiciais assim como ácidos orgânicos, íons hidrogênio, oxigêniomolecular e componentes antibióticos (GILLILAND e SPECK, 1977;HAMILTON-MILLER, 1999. IWANA ET AL., 1993; LANKAPUTHRAe SHAH, 1995; SHAH ETAL., 1995; DAVE e SHAH, 1996; DAVE eSHAH, 1997; KAILASAPATHY e RYBKA, 1997; SHAH eLANKAPUTHRA, 1997; KEBARY ET AL., 1998; BEAL ET AL.,1999; GARDINI ET AL., 1999; HAMILTON-MILLER ET AL., 1999;SCHILLINGER, 1999; VINDEROLA ET AL., 2000; SULTANA ETAL., 2000; MORTAZAVIAN ET AL., 2006). Em complemento, osefeitos benéficos dos microrganismos probióticos aparecem quandoeles, após sobreviverem às condições desfavoráveis, chegam aointestino viáveis e em quantidade suficientemente alta para atuaremno meio (GILLILAND, 1989). Uma quantidade mínima de célulasprobióticas, (UFC/g) no produto no momento de consumo, que énecessária para que os efeitos farmacêuticos benéficos (preventivoou terapêutico) dos probióticos seja representado pelo mínimo doíndice "bio-vaiue" (do ingiês MBV - minimum of bio-value)(MORTAZAVIAN ET AL., 2006). De acordo com a recomendaçãoda "International Dairy Federation (IDF)" este índice deve estar igualou acima de 107 UFC/g (OUWEHAND e SALMINEN, 1998). Emalguns países como Argentina e Brasil este valor deve estar igualou acima de 106 UFC/g no caso de bifidobactérias. Este padrão noJapão tem sido apresentado como sendo acima de 107 UFC/g(ROBINSON, 1987). Outras recomendações têm sido apresentadaspor diferentes pesquisadores, assim como, índice acima de 106UFC/g para todos os probióticos presentes em iogurtes(ROBINSON, 1987; KURMAN e RASIC, 1991) e acima de 107UFC/g no caso de bifidobactérias (HOLCOMB ET AL., 1991). Alémdo índice MBV, há um segundo índice denominado ID ("intakedaily") de cada produto alimentar também determinável por seupotencial ou efetividade probiótica. A quantidade mínima desteíndice tem sido recomendada com aproximadamente 109 célulasviáveis por dia (SHAH ET AL., 1995; KURMAN e RASIC, 1991;MORTAZAVIAN, 2006). Perda de viabilidade dos probioticos emprodutos alimentares (especialmente tipos fermentados) econdições ácidas da bile do trato gastrointestinal tem estimuladopesquisadores a encontrar novos métodos eficientes quemantenham a viabilidade. Microencapsulação, como um dos novose mais eficientes métodos, tem sido alvo de especial consideração6/36

e investigação. Do ponto de vista microbiológico amicroencapsulação pode ser definida como um processo deaprisionamento de microrganismos pelo revestimento destes comhidrocoloide(s) apropriado (s) com objetivo de separá-los do meiocircundante. Este processo resulta numa apropriada liberação dosmicrorganismos no meio intestinal (SULTANA ET AL., 2000;KRASAEKOOPT ET AL., 2003; PICOT e LACROiX1 2003a). Dentreos agentes que causam a liberação se encontram: mudança de pH,tensões mecânicas, aquecimento, atividades enzimática, pressãoosmótica, presença de alguns componentes químicos e tempo deestocagem podem ser mencionados (GOUIN, 2004). Amicroencapsulação dos microrganismos preserva-os da ação dosfatores do meio assim como elevada acidez e baixo pH(WENRONG e GRIFFITHS, 2000), sais biliares (LEE e HEO, 2000),choques térmicos induzidos pelas condições do processo assimcomo congelamento e secagem a frio (SHAH e RARULA, 2000),oxigênio molecular no caso de microrganismos anaeróbicos(SUNOHARA ET AL., 1995), choques térmicos quentes causadospelas condições de processos assim como "spray drying"(STEENSON ET AL., 1987) e agentes químicos antimicrobianos(SULTANA, 2000). Outras vantagens apontadas são o aumento daestabilidade das propriedades sensoriais e/ou sua melhoria(GOMES e MALCATA, 1999) e imobilização dos microrganismospara sua distribuição homogênea em um produto (STEENSON ETAL., 1987; KRASAEKOOPT ET AL., 2003) podem ser tambémcitados. A importância do método de microencapsulação, como umamaneira eficiente para aumentar a viabilidade probiótica justifica aimportância deste pedido.As microcápsulas possuem estruturas características.Cada microcápsula consiste de um recobrimento de hidrocoloides(também denominado cápsula) envolta do(s) microrganismo(s). Porserem as microcápsulas de forma geométrica esférica ou elíptica,são também denominadas micro esferas. As microcápsulas podemapresentar a superfície lisa ou rugosa. Cada microcápsula podeencapsuiar um ou vários tipos de microrganismos. Quando váriosmicrorganismos estão presentes na microcápsula, o líquidointersticial da solução preenche os espaços vazios da microcápsula.Rachaduras superficiais e/ou profundas podem aparecer nasmicrocápsulas. A propagação destas rachaduras leva a formaçãode poros, os quais reduzem consideravelmente a eficiência damicroencapsulação. As microcápsulas podem ser recobertas comuma segunda camada de um composto químico a fim de aumentara eficiência do processo de microencapsulação. A segunda camadaé também denominada revestimento ou suporte ou proteção.Microcápsulas com ou sem a presença de uma segunda camadaprotetora são conhecidas como microcápsulas recobertas oumicrocápsulas não-recobertas, respectivamente. Os constituintesaprisionados dentro do revestimento são conhecidos como núcleo(SULTANA ET AL., 2000; TRUELSTRUP-HANSEN ET AL., 2002;DIMANTOV ET AL., 2003; KRASAEKOOPT ET AL., 2003;CHANDRAMOULI ETAL., 2004).

Vários são os componentes utilizados para o processode microencapsulamento de probióticos, dentre eles estão oAlginato e suas combinações. Alginato é um heteropolissacarídeoextraído de diferentes tipos de algas, com unidades estruturaisconsistindo de ácidos D-manurônico e L-gulurônico. Alginato decálcio tem sido largamente utilizado para o microencapsulamentode ácido lácteo e bactérias probióticas, principalmente na faixa deconcentração de 0,5-4% (SHEU e MARSHALL, 1991; SHEU eMARSHALL, 1993; TRUELSTRUP-HANSEN ET AL., 2002; KIM ETAL., 1996; JANKOWSKI ETAL., 1997; KHALIL e MANSOUR, 1998;KEBARY ETAL., 1998; LEE e HEO, 2000; SHAH e RARULA, 2000;SULTANA ET AL., 2000; TRUELSTRUP-HANSEN, 2002;KRASAEKOOPT ET AL., 2004). O aiginato como ingrediente para aformação das microcápsulas possui algumas vantagens comosegue (KLIEN ET AL., 1983; TANAKA ET AL., 1984; MARTINSENET AL., 1989; PREVOST e DIVIES, 1992; DIMANTOV ET AL.,2003; CHANDRAMOULI ET AL., 2004; GOUIN1 2004): facilmenteforma gel ao redor do microrganismo, não é venenoso para o corpohumano (seguro ou biocompatível), é relativamente barato,condições de processo suaves (assim com temperatura) sãonecessárias para o seu desempenho, pode ser facilmentepreparado (simplicidade e facilidade no manuseio) e se decompõecorretamente no intestino e libera os microrganismosmicroencapsulados. A matriz gel de aiginato envolveapropriadamente as células de bactérias com um diâmetro de 1-3μm e os tamanhos de poros formados na superfície dasmicrocápsulas de aiginato não excedem 7nm (KLIEN ETAL., 1983).Contudo algumas desvantagens são atribuídas as microcápsulas deaiginato. Por exemplo, elas são susceptíveis a ambientes ácidos esua decomposição e perda da estabilidade mecânica no meiocontendo ácido láctico têm sido verificadas (EIKMEIER e REHM,1987; ROY ETAL., 1987; AUDET ETAL., 1988; ELLENTON, 1998).Também, devido ao gel de aiginato ser formado na presença deíons cálcio, sua integridade é deteriorada quando sujeito a íonsmonovalentes ou agentes quelantes, os quais absorvem íons cálcioassim como fosfatos, Iactatos e citratos (ROY ET AL., 1987;SMIDSROD e SKJAK-BRAEK, 1990; ELLENTON, 1998). Outrasdesvantagens incluem dificuldades na aplicação em escalaindustrial devido ao seu alto custo e frágil habilidade de escalonarbem o controle da porosidade na superfície das microesferas(GOUIN, 2004). Este último ponto leva a uma rápida difusão damistura e outros fluidos através da microcápsuias reduzindo assimsua barreira contra fatores ambientais desfavoráveis (GOUIN,2004). Os efeitos mencionados podem ser eficientementecompensados pela utilização de misturas de alginato com outroscompostos poliméricos, com compostos de recobrimentodepositados sobre as microcápsuias e modificação estrutural doalginato pelo uso de vários aditivos (KRASAEKOOPT ET AL.,2003). Mistura de alginato com amido é uma prática comum e háalguns estudos mostrando que a efetividade da microencapsulaçãode diferentes bactérias, especialmente láticas, pode ser melhoradapela aplicação desse método (JANKOWSKI ET AL., 1997;SULTANA ET AL., 2000; SUN e GRIFFITHS, 2000; TRUELSTRUP-HANSEN ET AL., 2002; KRASAEKOOPT ET AL., 2003). Além deboa proteção das células das bactérias, a mistura de alginato-amidoapresenta a vantagem da difusão de micronutrientes e metabólitosatravés das microcápsuias, para dentro e para fora domicrorganismo imobilizado. Como resultado, micro partículaspodem conter microrganismos ativos metabolicamente(JANKOWSKI ET AL., 1997). Alginato-Glicerol aumenta asobrevivência dos microrganismos quando armazenados emtemperatura muito baixas, em torno de -20°C. Isto é atribuído aoefeito criogênico do glicerol (TRUELSTRUP-HANSEN et al., 2002).A utilização de uma camada sobre a microcápsuias de alginato temsido utilizada por aumentar as suas características físico-químicas.Tem sido reportado que um recobrimento com uma camadasemipermeável de quitosana (um polímero catiônico) sobre amicrocápsula de alginato (um polímero aniônico) aumenta aestabilidade físico-química das microcápsulas produzidas. Estaestrutura apresentou tolerância contra efeitos deteriorantes deagentes queiantes ae cálcio e anti-geiificantes. Também do pontode vista estrutural as microcápsulas são mais densas e maisresistentes mecanicamente, dessa forma evitando a quebra e aliberação não desejada dos microrganismos (SMIDSROD e SKJAK-BRAEK1 1990; ZHOU et al., 1998; KRASAEKOOPT et al., 2003). Obaixo peso molecular da quitosana comparado com o alto pesomolecular do alginato faz com que a quitosana se difundarapidamente pela matriz de alginato resultando na formação demicrocápsulas com maior densidade e resistência mecânica.Recobrimento de cloreto de cálcio sobre as microcápsulas dealginato também tem sido investigado (CHANDRAMOULI et al.,2004). A presença de íons cálcio gera microcápsulas mais estáveiscom um efeito protetor maior sobre os microrganismos, e comoconseqüência, uma maior viabilidade dos mesmos.Poliaminoácidos, assim como a Poli-L-Lisina (PLL), são outrospolímeros catiônicos utilizados como recobrimento dasmicrocápsulas de alginato. Semelhantes a quitosana, estespolímeros formam fortes complexos com a matriz de alginato eproporcionando as microcápsulas de alginato as mesmasvantagens apresentadas pela quitosana (SMIDSROD e SKJAK-BRAEK, 1990; CHAMPAGNE ET AL., 1992; LARISCH ET AL.,1994). A geração de multicamadas de PLL sobre as microcápsulasde alginato tem sido investigada: a primeira camada de PLL sobre asuperfície da microcápsula produz uma carga positiva, então umasegunda camada de alginato promove a formação de uma camadanegativa. Este processo pode ser repetido várias vezes. Comoresultado, camadas de alginato e de PLL seriam formadasalternadamente (CHAMPAGNE ET AL., 1992; LARISCH ET AL.,1994; MARX, 1989).

Aplicações e vantagens da microencapsulação demicrorganismos probióticos podem ser discutidas de diferentesângulos. As microencapsulação podem ser utilizadas eficientementepara a preparação de culturas iniciais (starter culture) de bactériascom alta viabilidade. É mostrado que a vida de prateleira deLactobacillus rhamnosus o qual é mantido em temperaturaambiente e alta umidade está em torno de seis meses. Este tempofoi significativamente aumentado para 18 meses quando osmicrorganismos foram microencapsulados e mantidos natemperatura de nitrogênio líquido. As microcápsulas contendo osmicrorganismos podem ser diretamente adicionadas nos produtos econsumidas. Somente 10% de deterioração das microcápsulas foidetectado após serem submetidas às condições simuladas do tratogastrointestinal (MATTILA-SANDHOLM ET AL., 2002). Outro pontovantajoso da microencapsulação de microrganismos probióticosestá relacionado à viabilidade no trato gastrointestinal. Váriosartigos na literatura confirmam a eficiência da microencapsulaçãono aumento da viabilidade dos probióticos quando estes sãosubmetidos às condições ácido - enzimáticas do tratogastrointestinal. Como exemplo, RAO em 1989 demonstrou que amicroencapsulação da B. pseudolongum com ftalato acetato decelulose aumenta sua viabilidade nas condições que simulam otrato gastrointestinal (GROBOILLOT ET AL., 1993). Experimentosde LEE e HEO (2000) mostraram que a alta sobrevivência da B.Iongum microencapsulado com alginato de cálcio em condiçõessimuladas do suco gástrico (pH=1,5) foi consideravelmenteaumentada. Experimentos indicaram que um recobrimento decloreto de cálcio sobre as microcápsulas de alginato de cálciocontendo L acidophilus aumenta a tolerância do microrganismocontra valores ácidos extremos (pH=2) (CHANDRAMOULI ET AL.,2004). Simulação das condições estomacais (pH=1,5) levou a perdanas contagens de células viáveis de B. infantice, no entanto, aperda da viabilidade não excede a 0,67% da contagem inicial decélulas viáveis (SUN e GRIFFITHS, 2000). Pesquisas tem reveladoque amido resistente é um eficiente componente para amicroencapsulação de probióticos, pois tal componente não édissolvido ou decomposto no suco gástrico, em pH neutro e pelaatividade enzimática do pâncreas, mas libera os microrganismosquando a microcápsulas entra em contato com as condiçõesintestinais (ENGLYST ETAL., 1992; SUN e GRIFFITHS, 2002). Umponto importante a ser ressaltado é que alem do tipo de materialdas microcápsulas, o diâmetro das mesmas ou o recobrimentodelas é um fator determinante para manter a viabilidade dosmicrorganismos probioticos. Redução excessiva no diâmetro podeenfraquecer ou mesmo remover a função de proteção dasmicrocápsulas (SULTANA ET AL., 2000). A faixa de diâmetro idealdepende do microrganismo a ser imobilizado.

Outra aplicação para as microcápsulas contendomicroorganismos probióticos é a produção de biomassa emfermentações industriais. Com isso, a microencapsulação demicrorganismos pode incluir as seguintes aplicações: aumento datolerância dos microrganismos frente a fatores tais como infecçãobacteriana (STEESON ETAL., 1987), agentes químicos venenosos,proteção dos microrganismos contra agentes mutagênicos,alcançando assim uma boa produtividade na produção demetabólitos especialmente em altas taxas de agitação (ARNAULDET AL., 1992) e uma produção de biomassa mais densa(CHAMPAGNE ETAL., 1992).

A produção de produtos probióticos é outro campo deaplicação das microcápsulas. As vantagens da microencapsulaçãode probióticos em produtos alimentares probióticos podem serdiscutidas a partir de quatro fatores: 1) aumento da viabilidade dosprobioticos nos produtos até o momento do consumo; 2) realizaçãode um novo método na produção de alimentos; 3) fixação eaumento das propriedades sensoriais dos produtos.

1) A microencapsulação pode notadamente melhorar aviabilidade dos microrganismos probióticos devido a seus efeitos deproteção contra fatores do ambiente com alta acidez, baixo pH,presença de oxigênio molecular (para o caso de microrganismosanaeróbicos), agentes nocivos gerados durante o processo(especialmente tratamentos térmicos), enzimas digestivas,bacteriófagos, peróxido de hidrogênio, ácidos graxos de cadeiacurta, compostos aromáticos carbonílicos (MORTAZAVIAN ET AL.,2006). O aumento da viabilidade dos microrganismos probioticosconseqüentemente resultará em um aumento da vida de prateleirado produto. Indubitavelmente, a alta acidez e o baixo pH dosprodutos fermentados são os principais fatores que causam a perdada viabilidade dos microrganismos probióticos, especialmentedurante o acondicionamento refrigerado (SHAH ET AL., 1995;DAVE e SHAH e LANKAPUTHRA, 1997; MORTAZAVIAN ET AL.,2006). O microencapsulamento de L. acidophilus e de bifidobacteriaem matriz de alginato de cálcio não aumenta consideravelmente aviabilidade dos microrganismos após submissão dos mesmos emcondições de acidez extrema (pH=2), no entanto em condiçõesácidas mais amenas (acidez natural de iogurtes) observou umasobrevivência dos microrganismos probióticos por um períodosuperior a de oito semanas em estoque refrigerado. As misturaaiginato-HACS (amido de milho com alta amüase) ou alginato-RS(amido resistente) comparados com alginato de cálcio isolado,melhora a morfologia das microcápsulas formadas no que tange acoerência e a continuidade estrutural e consequentemente, aviabilidade dos microrganismos aumentam (SULTANA ET AL.,2000). Experimentos realizados por KEBARY ET AL. (1998)mostraram que a microencapsulação de bifidobacteria com alginatopoderiam aumentar significantemente sua viabilidade em leitecongelado, enquanto que, utilizando k-carragena não apresentounenhuma alteração. Microencapsulado de B. Iongum em meiolácteo mostrou maior viabilidade comparado com microrganismoslivres durante o mesmo tempo de estocagem (TRUELSTRUP-HANSEN ET AL., 2002). De acordo com as investigaçõesrealizadas por KALIL E MANSUR (1998), o microencapsulamentode Bifidobacterium spp. com alginato de cálcio melhorousignificativamente a viabilidade dos microrganismos em maionesecom pH em torno de 4,4. O tamanho médio das microcápsulas foide 3mm após o processo de microencapsulamento (SUN eGRIFFITHS, 2000). Probióticos microencapsulados com a misturaalginato-amido e tamanho de microcápsulas entre 0,5 a 1,0 mmforam consideravelmente mais viáveis em iogurte durante o períodode estocagem (SULTANA ET AL. 2000). Verificou-se um aumentoda viabilidade de Lactobacilos, em sorvetes lácteos, após omicroencapsulamento com alginato (tamanho de 25 a 62μιτι) foiapresentado (SHEU e MARSHALL, 1993). Os mesmos resultadosforam obtidos no caso de sobremesas geladas e fermentadas. Orecobrimento das microcápsulas de alginato com PLL (PoIi-L-Lisina)aumentou consideravelmente a viabilidade contra condiçõesseveras de processo (SHAH e RARU LA, 2000). Outrospesquisadores indicaram que a sobrevivência de Sifidobacteriumspp. e L. acidophilus aumenta significativamente em sobremesas àbase de fermentados gelados quando alginato com aditivos SPS eTween 80 foram utilizados para a microencapsulação (SULTANAET AL., 2000). A melhora da viabilidade de B. bifidum em iogurteapós a microencapsulamento com alginato de cálcio após trêssemanas estocado sob refrigeração a 4°C está suportada nacontagem de microrganismos viáveis que não ficou abaixo de 107UFC/mL. Além disso, nenhuma propriedade sensorial indesejávelfoi detectada no produto final. Os resultados acima mencionadosforam também obtidos após estoque do produto congelado(SULTANA ET AL., 2000). Tem sido observado que a viabilidade deLactobacillus microencapsulado com alginato de cálcio poderia seraumentado acima de 40% em produtos congelados assim comosorvetes e leite congelado (SHEU e MARSHALL, 1993). Devido àmicroencapsulação de microrganismos probioticos diminuíremconsideravelmente a atividade metabólica dos mesmos, aviabilidade dos microrganismos deveria aumentar devido a menortaxa de produção ácida. Portanto, mostrou-se que o tempo deincubação para iogurte fabricado com L. casei e L. acidophilusacima do ponto final de pH 5, aumentou de 6 horas no caso demicrorganismos livres para 30 horas no caso de microrganismosmicroencapsulados (SULTANA ETAL., 2000). A diminuição na taxade acidificação de bactérias e como resultado a queda nadiminuição do pH neste período leva a um considerável aumento davida de prateleira do produto devido ao aumento na viabilidade dosmicrorganismos dentro do tempo de estocagem (MORTAZAVIANET AL., 2006).

2) Utilizando o processo de microencapsulamento deculturas iniciais de microrganismos probióticos inovações tem sidodesenvolvidas na produção de produtos probióticos lácteos assimcomo iogurte. O microencapsulamento de microrganismosprobióticos pode causar uma taxa desejável de atividade metabólicacelular. Por exemplo, novos métodos contínuos de produção deiogurte com bactérias probioticas tradicionais microencapsuladas(Streptococcus salivarius ssp. thermophilus e Lactobacillusdelbrueckii ssp. bulgaricus), tem sido propostos e apresentam asseguintes vantagens comparados com os métodos tradicionais:produtos com propriedades sensoriais relativamente constantespodem ser obtidos, a viabilidade das bactérias remanescentes émuito maior e a proporção de Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus / Streptococcus thermophilus do estágio inicial ao final doprocesso de fermentação pode ser controlado bem como aspropriedades organolépticas do produto (KRASAEKOOPT ET AL.,2003).

Como desvantagens da produção de produtosfermentados utilizando culturas iniciais microencapsuladaspodemos citar o longo período de incubação e elevados preçosdevido à necessidade de se utilizar altas quantidades de inoculoinicial (devido à inexistência de multiplicação celular durante oprocesso de fermentação) podem ser mencionados. No entanto,segundo LARISCH ET AL (1994) o tempo de incubação deLactococci, microencapsulado com alginato recoberto com PLL1diminui de um fator de 17% comparado com as condições dafermentação de iogurte com microrganismos livres. Contudo, não hámais registro que confirme tal observação.

O microencapsulamento de microrganismos probioticostem sido utilizados para a produção de uma dispersão homogêneados microrganismos dentro do produto. Isto é muito importanteprincipalmente em produtos viscosos e apresentando mais de umafase (polifásicos) assim como maionese (KHALIL e MANSOUR,1998).

O microencapsulamento de microrganismos probioticosajuda a manter ou melhorar as propriedades sensoriais do produtofinal. De maneira geral, produtos fermentados (assim como iogurte)produzidos por microrganismos encapsulados são mais suavescomparados com aqueles produzidos por microrganismos nãoencapsulados devido a menor quantidade de ácidos produzidos(ADHIKARI ET AL., 2000). Conseqüentemente,microencapsulamento de culturas iniciais promovem uma fixação doaroma dos produtos fermentados, pois as células encapsuladas sãorelativamente ou totalmente inativas de metabolismo e nãoinfluenciam no aroma dos produtos, especialmente durante o tempode estocagem. Como exemplo, nenhuma variação significativa naspropriedades sensoriais de iogurtes contendo B. bifidumencapsulados foi observado após três semanas de estocagemrefrigerada a 4°C (KRASAEKOOPT ET AL., 2003).

Embora o microencapsulamento de microrganismosprobioticos possa ser aplicado como um eficiente método paramelhorar as propriedades sensoriais dos produtos probioticos suautilização inoportuna pode levar a uma queda em tais propriedadese na textura do produto final, especialmente defeitos no paladar.Essa sensação está relacionada ao tamanho das microcápsulas(TRUESTRUP-HANSEN ET AL. 2002; CHANDRAMOULI ET AL.,2004).

Bebidas probióticas são alimentos funcionais, isto é,além de fornecerem a nutrição básica, promovem a saúde. Essesalimentos possuem potencial para promover a saúde através demecanismos não previstos através da nutrição convencional,devendo ser salientado que esse efeito restringe-se à promoção dasaúde e não à cura de doenças (SANDERS, 1998). O tratogastrintestinal humano é um microecossistema cinético quepossibilita o desempenho normal das funções fisiológicas dohospedeiro, a menos que microrganismos prejudiciais epotencialmente patogênicos dominem. Manter um equilíbrioapropriado da microbiota pode ser assegurado por umasuplementação sistemática da dieta com probióticos, prebióticos esimbióticos (BIELECKA, BIEDRZYCKA, MAJKOWSKA, 2002). Emvirtude desse fato, nos últimos anos, o conceito de alimentosfuncionais passou a concentrar-se de maneira intensiva nos aditivosalimentares que podem exercer efeito benéfico sobre a composiçãoda microbiota intestinal (ZIEMER, GIBSON, 1998).

Os probióticos eram classicamente definidos comosuplementos alimentares à base de microrganismos vivos, queafetam beneficamente o animal hospedeiro, promovendo o balançode sua microbiota intestinal (FULLER, 1989). Diversas outrasdefinições de probióticos foram publicadas nos últimos anos(SANDERS, 2003). Entretanto, a definição atualmente aceitainternacionalmente é que eles são microrganismos vivos,administrados em quantidades adequadas, que conferem benefíciosà saúde do hospedeiro (FOOD AND AGRICULTUREORGANIZATION OF UNITED NATIONS; WORLD HEALTHORGANIZATION, 2001; SANDERS, 2003).

A influência benéfica dos probióticos sobre a microbiotaintestinal humana inclui fatores como efeitos antagônicos,competição e efeitos imunológicos, resultando em um aumento daresistência a patógenos. Assim, a utilização de culturas bacterianasprobióticas estimula a multiplicação de bactérias benéficas, emdetrimento à proliferação de bactérias potencialmente prejudiciais,reforçando os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro(PUUPPONEN-PIMIA ET AL., 2002).

Em condições normais, inúmeras espécies de bactériasestão presentes no intestino, a maioria delas anaeróbias estritas.Essa composição torna o intestino capaz de responder a possíveisvariações anatômicas e físico-químicas (LEE ET AL., 1999). Amicrobiota intestinal exerce influência considerável sobre uma sériede reações bioquímicas do hospedeiro. Paralelamente, quando emequilíbrio, impede que microrganismos potencialmente patogênicosnela presentes exerçam seus efeitos patogênicos. Por outro lado, odesequilíbrio dessa microbiota pode resultar na proliferação depatógenos, com conseqüente infecção bacteriana (ZIEMER,GIBSON, 1998).

A microbiota saudável é definida como a microbiotanormal que conserva e promove o bem-estar e a ausência dedoenças, especialmente do trato gastrintestinal. A correção daspropriedades da microbiota autóctone desbalanceada constitui aracionalidade da terapia por probióticos (ISOLAURI, SALMINEN,OUWEHAND, 2004). A influência benéfica dos probióticos sobre amicrobiota intestinal humana inclui fatores como os efeitosantagônicos e a competição contra microrganismos indesejáveis eos efeitos imunológicos (PUUPPONEN-PIMIÃ ET AL., 2002). Dadosexperimentais indicam que diversos probióticos são capazes demodular algumas características da fisiologia digestiva, como aimunidade da mucosa e a permeabilidade intestinal (FIORAMONTI,THEODOROU, BUENO, 2003). A ligação de bactérias probióticasaos receptores da superfície celular dos enterócitos também dáinício às reações em cascata que resultam na síntese de citocinas(KAUR, CHOPRA, SAINI, 2002).

O conhecimento da microbiota intestinal e suasinterações levou ao desenvolvimento de estratégias alimentares,objetivando a manutenção e o estímulo das bactérias normais alipresentes (GIBSON, FULLER, 2000). É possível aumentar onúmero de microrganismos promotores da saúde no tratogastrintestinal (TGI), através da introdução de probióticos pelaalimentação ou com o consumo de suplemento alimentar prebiótico,o qual irá modificar seletivamente a composição da microbiota,fornecendo ao probiótico vantagem competitiva sobre outrasbactérias do ecossistema (CRITTENDEN, 1999).

Três possíveis mecanismos de atuação são atribuídosaos probióticos, sendo o primeiro deles a supressão do número decélulas viáveis através da produção de compostos com atividadeantimicrobiana, a competição por nutrientes e a competição porsítios de adesão. O segundo desses mecanismos seria a alteraçãodo metabolismo microbiano, através do aumento ou da diminuiçãoda atividade enzimática. O terceiro seria o estímulo da imunidadedo hospedeiro, através do aumento dos níveis de anticorpos e oaumento da atividade dos macrófagos. O espectro de atividade dosprobióticos pode ser dividido em efeitos nutricionais, fisiológicos eantimicrobianos (FULLER, 1989).

Os benefícios à saúde do hospedeiro atribuídos àingestão de culturas probióticas que mais se destacam são: controleda microbiota intestinal; estabilização da microbiota intestinal após ouso de antibióticos; promoção da resistência gastrintestinal àcolonização por patógenos; diminuição da população de patógenosatravés da produção de ácidos acético e lático, de bacteriocinas ede outros compostos antimicrobianos; promoção da digestão dalactose em indivíduos intolerantes à lactose; estimulação do sistemaimune; alívio da constipação; aumento da absorção de minerais eprodução de vitaminas. Embora ainda não comprovados, outrosefeitos atribuídos a essas culturas são a diminuição do risco decâncer de cólon e de doença cardiovascular. São sugeridos,também, a diminuição das concentrações plasmáticas de colesterol,efeitos anti-hipertensivos, redução da atividade ulcerativa deHelicobacter pylori, controle da colite induzida por rotavirus e porClostridium difficile, prevenção de infecções urogenitais, além deefeitos inibitórios sobre a mutagenicidade (SHAH, LANKAPUTHRA,1997; CHARTERIS ET AL., 1998; JELEN, LUTZ, 1998;KLAENHAMMER, 2001; KAUR, CHOPRA, SAINI, 2002; TUOHY ETAL., 2003).

Dentre os tipos de probióticos existentes, destaca-se oKefir, nome que se dá tanto aos grãos quanto às bebidasresultantes da fermentação. Kefir é originário do Cáucaso,consistindo de uma colônia contendo bactérias e leveduras, ligadospor uma complexa estrutura de proteínas, lipídios e carboidratos.Há dois tipos de grãos de Kefir: 1) De leite - porque fermenta leitede diversos tipos, produzindo uma bebida semelhante a iogurte ecoalhada; 2) De água - fermenta uma solução com água, açúcar elimão, cujo resultado é uma bebida refrescante gaseificada. Acombinação exata de bactérias e leveduras varia entre esses doistipos de grãos, mas contam com mais de 50 tipos demicroorganismos. Por ser uma colônia com diversos tipos demicroorganismos probióticos, as bebidas obtidas a partir dessesgrãos também são bebidas probióticas.

A partir do estudo da cinética fermentativa desses grãosforam produzidas outras bebidas fermentadas com substratosdiversos, tais como sucos de frutas, água de coco, extrato de soja,aos quais denominamos Kefir BioLogicus.

Os probióticos, assim como o Kefir BioLogicus tem ummanuseio muito trabalhoso, uma vez que são necessários diversoscuidados para a conservação dos microrganismos (consórcio demicrorganismos), como a troca regular do meio de cultura, acolheita (também regular) dos grãos de kefir formados na cultura ea conservação em determinada faixa de temperatura. Além disso,tanto o kefir quanto os microrganismos probióticos não servem, viade regra, para o enriquecimento de alimentos e cosméticos nãoprobióticos, uma vez que seu sabor forte e características como core odor terminam por descaracterizar o alimento "enriquecido",tornando-o indesejável. Uma forma de evitar tal problema é oprocesso de microencapsulação.

Existem várias técnicas que podem ser utilizadas para amicroencapsulação, sendo que a seleção do método é dependenteda aplicação que será dada à microcápsula, do tamanho desejado,do mecanismo de liberação e das propriedades físico-químicas,tanto do material ativo, quanto do agente encapsulante (JACKSONe LEE, 1991). O tamanho das microcápsulas pode variar de algunspoucos nanômetros até vários micrômetros; a forma também ébastante variável em função do método e do agente encapsulanteutilizados para prepará-las.

A escolha do agente encapsulante depende de umasérie de fatores, entre eles a não reatividade com o material a serencapsulado, o processo utilzado para a formação dasmicrocápsulas e o mecanismo de liberação ideal. Muitos materiaispodem ser utilizados como cobertura para as microcápsulas, dentreeles: goma arábica, Agar1 alginato e carragena; os carboidratosamido, amidos modificados, dextrinas e sacarose; as celulosescarboximetilceluloses, acetilcelulose, nitrocelulose; os lipídios,parafina, mono e diagliceróis, óleos e gorduras; os materiaisinorgânicos sulfato de cálcio e silicatos; as proteínas do glúten,caseína, gelatina e albumina (JACKSON e LEE, 1991).

Os mecanismos de liberação dos materiais ativosencapsulados variam de acordo com a natureza do agentemicroencapsulante, sendo que normalmente ocorrem devido amecanismos como: variação de temperatura e de pH, solubilidadedo meio, biodegradação, difusão, ruptura mecânica, permeabilidadeseletiva e gradiente de concentração existentes em relação ao meiode liberação (BAKAN, 1973; BRANNON-PEPPAS, 1993). Caberessaltar que a espessura da cobertura da microcápsula pode sermodificada de forma que a estabilidade e a permeabilidade sejamalteradas (BAKAN, 1973).

Os propósitos gerais da microencapsulação podem seralguns dos que seguem: transformar um líquido em sólido, de modoa facilitar sua manipulação, transporte e adição em formulações;separar materiais reativos; reduzir toxicidade do material ativo;promover liberação controlada do ativo encapsulado; reduzirvolatilidade ou flamabilidade de líquidos; mascarar sabor e odor dedeterminados componentes; aumentar a vida de prateleira; eproteger contra a luz, umidade e calor (JACKSON e LEE, 1991).

Entre os matérias que podem ser encapsulados, paraaplicação na indústria alimentícia, incluem-se ácidos, bases, óleos,vitaminas, sais, gases, aminoácidos, óleos essenciais, corantes,enzimas e microrganismos (DESAI e PARK, 2005).

Os microrganismos têm sido microencapsulados ouimobilizados para possibilitar a reutilização dos mesmos naprodução de ácido lático e produtos lácteos fermentados(Tl PAYANG e KOZAKI1 1982; HYNDMAN ET AL., 1993;GROBOILLOT ET AL., 1993), para aumentar a concentração decélulas em reatores, com conseqüente aumento de produtividade(YOO ET AL., 1996), para protegê-los contra a presença deoxigênio (KIM e OLSON, 1989), contra as baixas temperaturas decongelamento (SHEU e MARSHALL, 1993; SHEU ET AL., 1993),contra o efeito bactericida do suco gástrico e outros meios ácidos(RAO ET AL., 1989; MOLDER e VILLA-GARCIA, 1993; DINAKAR eMISTRY, 1994; KHALIL e MANSOUR, 1998; CUI ET AL., 2000;FAVARO-TRINDADE e GROSSO, 2000; SULTANA ET AL., 2000;FAVATO-TRINDADE e GROSSO, 2002; HANSEN ET AL., 2002;DESMOND ET AL., 2002; PICOT e LACROIX, 2004; IYER eKAILASAPATHY, 2005; MUTHUKUMARASAMY ET AL., 2006;CHEN ET AL., 2006; OLIVEIRA ET AL., 2007; OLIVEIRA ET AL.,2007), para retirá-los do produto, interrompendo a acidificação(CHAMPAGNE e CÔTE, 1987), para aumentar a estabilidade emanter a viabilidade da cultura durante a estocagem do produto(KIM ET AL., 1988; CHAMPAGNE ET AL., 1994; HANSEN ET AL.,2002; KAILASAPATHY, 2006; CAPELA ET AL., 2006;MUTUKUMARASAMY e HOLLEY, 2006) e para aumentar a vida útilde Pseudomonas fluorescens-putida (AMIET-CHARPENTIER ETAL., 1998).

Embora a microencapsulação seja uma tecnologia muitoinovadora e limitada apenas pela imaginação, é ainda muito poucoexplorada comercialmente na área de alimentos.

Uma variedade de métodos de imobilização de umacultura altamente concentrada de microrganismos tem sidodesenvolvida com objetivo de aumentar a produtividade noprocesso de fermentação.

Um dos mais utilizados métodos de imobilização é ométodo de aprisionamento de células, onde microrganismos sãoaprisionados em géis em formato de microcápsulas formados dealginato de cálcio, poliacrilamida, carragena, agarose, gelana, oupolitetrafluoroetileno (PTFE) (de acordo com as patentes: U.S. Pat.n° 5, 175,093; 5 288,632; 5 093,253; 4 722,898; 4 828,997; 5070,019; GHOSH, S., 1998).

O método de aprisionamento de células, contudo,apesar de ser simples, tem revelado limitações no que tange aoaumento da concentração de microrganismos por unidade devolume da matriz, devido aos microrganismos somente poderemcrescer sobre a superfície ou espaços intersticiais da matriz.

Por outro lado, o método de microencapsulação temsido aplicado em diferentes caminhos para imobilização de célulasanimais, vegetais, bactéria, algas ou fungos (de acordo com: U.S.Pat. n° 5, 286,495; quatro 806,355; 4 689,293; LIM, F. ET AL.,1980).Como descrito acima, é necessário o desenvolvimentode um método de imobilização de microrganismos mais simples eefetivos.

A fermentação do Kefir BioLogicus é do tipo lacto-alcoólica, com a produção de diversos tipos de ácidos (carbônico,butírico e acético), predominado o ácido lático nos fermentadoslácteos, derivado da lactose do leite. Aminoácidos como valina,leucina, lisina e serina se formam durante a fermentação, maisquantidades apreciáveis de piridoxina, da vitamina B12, do ácidofólico e de biotina. Vários bioativos são responsáveis pela atividadefuncional e probiótica do Kefir BioLogicus: os própriosmicroorganismos (mortos ou vivos), os metabólitos dosmicroorganismos, formados durante a fermentação (antibióticos,incluindo os bactericidas), os produtos da decomposição da matrizdo alimento, tais como os peptídeos (OUWEHAND e SALMINEN1998; FARNWORTH 2002).

O metabolismo secundário do Kefir dá origen aexopolissacarídeos, com estruturas diferenciadas, producidos poruma variedade de bactérias do ácido lático incluindo Iactobacilos eestreptococos - Lactococcus e Leuconostoc (DE VUYST eDEGEEST 1999; RUAS-MADIEDO ET AL. 2002.). Estescarbohidratos da superfície celular conferem característicasprotetoras e adaptantes a seus produtores bacterianos; e uma vezque estão Li itados livremente à membrana da célula, perdem-sefacilmente no ambiente. Em produtos alimentícios, osexopolissacarídeos contribuem, em geral, para as característicasoranolépticas e de estabilidade. Dentre esses polissacarídeos,destaca-se o KEFIRANO, que contém D-glicose e D-galactose emum quociente de 1:1. As reações de hidrólise seguidas por análisede NMR tem sido utilizadas para determinar a estrutura química doKefirano. A estrutura proposta é um hexa ou um hepta-sacarídeoramificado que repete a unidade que de si mesmo se compõe deuma unidade regular de pentasacarídeo à qual um dos resíduos doaçúcar se ligam aleatoriamente (KOOIMAN, 1968; MICHELI ET AL.,1999).

O Kefirano tem sido objeto de vários estudos realizadospela empresa BioLogicus nos últimos anos. Trabalhos científicostêm sido publicados internacionalmente, os quais relatam a grandeimportância do kefirano para a indústria de um modo geral e, maisparticularmente, para a indústria farmacêutica, uma vez que possuiatividade ántibacteriana, antimicótica e antitumoral comprovadas(J.A. PIERMARIA ET AL., 2009; RODRIGUES ET AL.,2005;MAEDA ET AL., 2004). Há também pesquisas que ressaltam apossibilidade de efeitos antiinflamatórios e antialérgicos de viasaéreas inferiores (KWON ET AL., 2009).

Estudos realizados com kefirano demonstraram váriosefeitos benéficos à saúde, dentre os quais a supressão do aumentoda pressão sangüínea (MAEDA ET AL., 2004); a redução doestresse, uma vez que apresentam atividades sobre a produção deβ-interferon, cortisol e noradrenalina (S. KBAYAMA ET AL., 1997);aumento da atividade fagocítica de macrófagos peritoneais epulmonares (C.G. VIDEROLA ET AL., 2005; C.G. VIDEROLA ET.AL. 2006) e aumento de células IGA nestes sítios (C.G. VIDEROLAET AL., 2006); atividade anti-tumoral (J.R. LIU ET AL., 2002; M.MUROFUSHI ET AL., 1983; M. SHIOMI ET AL. 1982); atividadeantimicrobiana (K.L. RODRIGUES ET AL., 2005); efeito preventivosobre diarréias associadas a antibióticos, por favorecer a floraintestinal normal, protegendo-a contra patógenos exógenos emantendo seu balanço (M. ZUBILLAGA ET AL. 2001); aumento daatividade da dipeptidase intestinal (E. URDANETA ET AL., 2007);redução de lipídios sangüíneos, pressão arterial, glicose sangüíneae constipação intestinal (H. MAEDA ET AL., 2004).

O kefirano é um polissacarídeo extracelular produzidodurante a fermentação da colônia do Kefir BioLogicus, constituientre 24 - 25% (m/m) do peso seco dos grãos de Kefir BioLogicus eé uma matriz de material amorfo fibrilar. Esta matriz envolve asbactérias e leveduras nos grãos do kefir BioLogicus e os mantémjuntos oferecendo uma proteção contra microrganisrhos externos àcolônia. Estruturalmente o kefirano é formado por umglucogalactano ramificado, consistindo aproximadamente dequantidades iguais de resíduos de D-glucose e D-Galactose.

Em recente estudo realizado por RODRIGUES ET AL.,(2005), o kefirano inibiu o crescimento de sete cepas bacterianas euma cepa de leveduras patógenas. E demonstrou atividadeantitumoral, ao inibir o crescimento de tumores sólidos, carcinoma eSarcoma, aspecto relatado pela primeira vez por Shiomu (SHIOMUET AL., 1982). Este biofármaco destaca-se também quanto à suaatividade anti-metástase contra carcinoma pulmonar e melanoma, oque já foi descrito em ratos (FURUKAVA, 2001).

Devido ao fato de apresentar propriedades antitumoral,antibacteriana e antifúngica, o Kefirano pode ser usado como umbom agente cicatrizante, antiinflamatório e antimicrobiano para ouso em uma grande variedade de infecções (SALOFF-COSTE,1996).

Um dos agentes responsáveis pelas propriedades dokefirano são as bacteriocinas, toxinas produzidas pelas bactériasbenéficas do kefirano para inibir, como meio de proteção, ocrescimento de outras bactérias similares.

Além das propriedades expostas acima relacionadas aoexopolissacarídeo Kefirano, que é um subproduto do metabolismosecundário do Kefir BioLogicus, uma propriedade muito importantepara a industria de alimentos e de cosmético é a utilização domesmo como aditivo alimentar. Essa característica estáintimamente relacionada às suas propriedades de ser utilizado comestabilizador em alimentos e cosméticos. De acordo com RIMADAE ABRAHAM (2006), o kefirano pode ser utilizado como aditivoalimentar para alimentos fermentados aumentando as propriedadesreológicas do produto. De acordo com PIERMARIA ET AL (2008) oKefirano é considerado um aditivo funcional.

A propriedade do kefirano em formar géis também foitema de trabalho cientifico (PIERMARIA ET AL. 2008) indicando apotencialidade deste exopolissacarideo em ser utilizado comocomponente de matrizes para microencapsulamento assim como oAlginato de sódio e outros compostos poliméricos.

Sobre as circunstâncias acima descritas, a presenteinvenção apresenta o desenvolvimento de um método simples eefetivo no que tange a imobilização de um consórcio demicrorganismos presentes no Kefir BioLogicus e de seus produtosbioativos (proteínas, vitaminas, dentre outros) empregandomicrocápsulas à base de alginato de cálcio modificado com pectinae kefirano. Em contraste com as metodologias já existentes, apresente invenção apresenta a formação de microcápsulasformadas de alginato de cálcio modificado com pectina e kefiranoque possui a qualidade de aprisionar uma quantidade grande demicrorganismos tornando-os mais fáceis de manuseio para seremutilizados no processo de fermentação mais eficaz. A mistura dealginato com Pectina e/ou Kefirano resulta na formação demicrocápsulas mais densas e com maior resistência mecânica,possibilitando com isso uma melhora no efeito de proteção aosmicrorganismos probióticos, conseqüentemente, numa maiorviabilidade dos mesmos.

De acordo com a presente invenção, os inventorespreparam microcápsulas à base de alginato de cálcio modificadocom Kefirano e pectina contendo em seu interior um consórcio demicrorganismos presentes no Kefir BioLogicus bem como de seusprodutos bioativos. O consórcio de microorganismos presentes noKefir BioLogicus está composto por quatro grupos, conformedescrição abaixo:1- LactobaciIos:Lactobacillus acidophilusLactobacillus bulgaricusLactobacillus brevisLactobacillus caseiLactobacillus casei ssp. lactosus;Lactobacillus casei ssp. rhamnosusLactobacillus cellobiosisLactobacillus delbrueckiiLactobacillus fermentumLactobacillus fructivoranLactobacillus helveticusLactobacillus hilgardiiLactobacillus johnsoniiLactobacillus kefir;Lactobacillus kefiranofaciensLactobacillus kefirgranumLactobacillus IaetisLactobacillus paraeaseiLactobacillus parakefirLactobacillus plantarumLactobacillus rhamnosusLactobacillus viridescens

2-Lactococcus/Streptococcus:Enteroeoceus duransLactoeoceus Iaetis subsp. eremorisLactoeoceus Iaetis subsp. IaetisLe. Iaetis var. diaeetylaetisLeueonostoe eremorisLeueonostoe kefirLeueonostoe sp.

S. Iaetis

S. sallivarius ssp.thermophilusStreptoeoeeus thermophilus

3-Leveduras:Candida pseudotropiealisC. raneens

Candida kefirC. tenuisK bulgarieusK. fragilisKluyveromyces IaetisKluyveromyces marxianus var. MarxianusTorula kefir

Torulaspora delbrueekiiSaccharomyces boulardiiSaccharomyces earlbergensisSaccharomyees eerevisiaeSaccharomyees IaetisSaccharomyees kefírSaccharomyees eerevisiae

Saccharomyees delbrueekii ou Saccharomyees unisporus

4- Bolores

Geotriehum eandidum

5- Acetobacter:Aeetobaeter aeetiAcetobacter rasensAcetobacter sp.

6- Outras BactériasBacillus sp.Micrococcus sp.Bacillus subtilis

Diante do cenário acima exposto, o processo oraapresentado constitui uma solução rápida e de baixo custo tantopara a conservação do consorcio de microrganismos e de seusbioativos quanto para o enriquecimento de alimentos nãoprobióticos e cosméticos.

A imobilização do consorcio de microorganismos bemcomo de seus produtos metabólicos, conforme realizada nainvenção ora descrita, ocorre da seguinte forma: o consórcio demicrorganismos e de seus produtos metabólicos são adicionados auma solução de Kefirano1 alginato de sódio e de pectina, formandouma nova solução (solução A). A solução A pode ser representadada seguinte forma: (100-X-Y)% Alginato - X% Kefirano - Y%Pectina (em porcentagem em volume). Sendo que a concentraçãoda solução de Alginato de Sódio pode variar de 1 a 5% (em massa),a de Kefirano pode variar de 1 a 3% (em massa) e a de Pectinapode variar de 1 a 4% (em massa).

Esta nova solução é gotejada em uma segunda solução(solução B), esta última de Cloreto de Cálcio de concentração quepode variar de 0,1 a 4,0% (em massa). O gotejamento da solução Ana solução B causa a formação de microcápsulas contendo oconsórcio de microrganismos, bem como os seus produtosmetabólicos.

As microcápsulas constituem uma maneira prática dearmazenar, e aplicar o consórcio de microrganismos·. eles nãonecessitam da manutenção constante do consórcio demicrorganismos do Kefir BioLogicus e podem ser adicionadas aprodutos para torná-los probióticos sem transformar-lhes o sabor,aroma ou cor, superando, assim, as desvantagens de manuseio dosprobióticos e de suas características organolépticas.

A complementar a presente descrição de modo a obteruma melhor compreensão das características do presente invento ede acordo com a preferencial aplicação prática do mesmo,acompanha a descrição um desenho em que de maneira eexemplificativa, mas não Iimitativa representou o seguinte:

A figura 1 mostra que a solução polimérica (solução A,formada pelo consórcio de microrganismos mais o Kefirano, e/ouPectina e o alginato de sódio) é preparada no tanque 1 e mantidaem agitação, para alimentar o tanque 2.

Do tanque 2 a solução é aspirada e dosada pela bombaperistáltica, sendo gotejada para a formação das microcápsulas, notanque Ill/1, que contém a solução de cloreto de cálcio (solução B).Uma vez concluída a produção de uma determinadaquantidade de microcápsulas, conclusão que pode ser por tempo oumesmo por volume, esse tanque será substituído pelo tanque 111/3,que conterá somente a solução de cloreto de cálcio.

As microcápsulas do tanque 111/1, que foi substituído,ficarão em repouso por um tempo entre 5 a 20 minutos,dependendo do substrato em que o consórcio esteja necessáriopara complementar o processo.

Após esse tempo de repouso, as microcápsulas e asolução, serão vertidas em uma peneira, onde haverá a separaçãodas fases líquidas e sólidas, restando a fase líquida no tanque III/2,que irá substituir o tanque recebedor das gotas da bombaperistá Itica.

Por outro lado as microcápsulas recolhidas serãolevadas ao tanque IV, onde, sem serem retirados da peneira,sofrerão a devida lavagem com a água mineral em circuito fechado,concluindo com essa operação um ciclo da produção.

De acordo com a ilustração acima citada, o presenteinvento se refere a um "PROCESSO INDUSTRIAL DE!MOBILIZAÇÃO DE UM CONSÓRCIO DE MICRORGANISMOS,ORIUNDO DO KEFIR BIOLOGICUS, BEM COMO DE SEUSBIOATIVOS OU DE SUAS BIOMOLÉCULAS, ATRAVÉS DAFORMAÇÃO DE MICROCÁPSULAS DE ALGINATO DE CÁLCIOMODIFICADO", ou seja, um processo industrial que permite ofabrico de microcápsulas de um consórcio de microrganismos quenão sofrem as limitações inerentes aos demais alimentosprobióticos: não exigem uma manutenção trabalhosa e nem influemno sabor, aroma ou coloração dos produtos a que são adicionados,conservando, todavia, todos os benefícios inerentes ao consorciode microrganismos (cultura probiótica com cerca de 50 tipos demicrorganismos).

A imobilização do consorcio de microorganismos bemcomo de seus produtos metabólicos, conforme realizada nainvenção ora descrita, ocorre da seguinte forma: o consórcio demicrorganismos e seus produtos metabólicos são adicionados auma solução de Kefirano1 alginato de sódio e de pectina, formandouma nova solução (solução A), esta solução é mantida sob agitaçãoaté o momento do uso (1). A solução A pode ser representada daseguinte forma: (100-X-Y) % Alginato - X% Kefirano - Y% Pectina(em porcentagem em volume). Sendo que a concentração dasolução de Alginato de Sódio pode variar de 1 a 5% (em massa), ade Kefirano pode variar de 1 a 3% (em massa) e a de Pectina podevariar de 1 a 4% (em massa).

No momento do uso (2), a solução A é transferida para otanque 2 onde é aspirada e dosada por uma bomba peristáltica, quea goteja em uma segunda solução (solução B), esta última deCloreto de Cálcio de concentração que pode variar de 0,1 a 4,0%(em massa).

Uma vez concluída a produção de uma determinadaquantidade de microcápsulas (3), conclusão que pode ser portempo ou mesmo por volume, esse tanque será substituído pelotanque III/3, que conterá somente a solução de cloreto de cálcio epassará a receber o gotejamento vindo da bomba peristáltica.

As microcápsulas do tanque 111/1, que foi substituído,ficarão em repouso por um tempo entre 5 a 20 minutos,dependendo do substrato em que o consórcio de microrganismosesteja contido, necessário para complementar o processo demicroencapsulação.Após esse tempo de repouso, as microcápsulas e asolução, serão vertidas em uma peneira, onde haverá a separaçãodas fases líquidas e sólidas, restando a fase líquida no tanque 111/2,que irá substituir o tanque recebedor das gotas da bombaperistáltica (4) e repetir o processo para a produção de maismicrocápsulas.

Por outro lado as microcápsulas recolhidas serãolevadas ao tanque IV (5), onde, sem serem retirados da peneira,sofrerão a devida lavagem com a água destilada em circuitofechado, concluindo com essa operação um ciclo da produção dasmicrocápsulas contendo o consórcio de microrganismos.

As microcápsulas formam uma maneira prática dearmazenar, e aplicar o consórcio de microrganismos: eles nãonecessitam da manutenção constante do consórcio demicrorganismos e podem ser adicionadas a produtos para torná-losprobióticos sem transformar-lhes o sabor, aroma ou cor, superando,assim, as desvantagens de manuseio dos probióticos e de suascaracterísticas organolépticas.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Claims

1. "PROCESSO INDUSTRIAL DE !MOBILIZAÇÃO DE UMCONSÓRCIO DE MICRORGANISMOS PRESENTES NO KEFIRBIOLOGICUS, BEM COMO DE SEUS BIOATIVOS, POR MEIO DAFORMAÇÃO DE MICROCÁPSULAS DE ALGINATO DE CÁLCIOMODIFICADO" caracterizada pelo fato de formar microcápsulascontendo os microorganismos presentes no kefir e seus produtosmetabólicos, microcápsulas estas que permitem a sobrevivênciados microorganismos, não depende da manutenção constantecaracterística do kefir e podem ser utilizados para tornar probióticosalimentos, cosméticos e medicamentos sem alteração de sabor,odor ou cor. O processo compreende as seguintes etapas: a)Cultura de um consórcio de microrganismo em diferentes substratosextrato de soja, suco de uva, suco de limão e ameixa, suco deabacaxi, suco de tangerina, suco de maracujá, suco de açaí, sucode maçã, suco de pêra, suco de pêssego, água de coco, caldo decana; b) Após isto, a cultura é adicionada a uma solução formadapor alginato de sódio, e/ou Kefirano e/ou Pectina formando umanova solução (solução A) esta solução é mantida sob agitação até omomento do uso (1); c) No momento do uso (2), a solução A étransferida para o tanque 2 onde é aspirada e dosada por umabomba peristáltica, que a goteja em uma segunda solução (soluçãoB), esta última de Cloreto de Cálcio; d) Uma vez concluída aprodução de uma determinada quantidade de microcápsulas (3),conclusão que pode ser por tempo ou mesmo por volume, essetanque será substituído pelo tanque III/3, que conterá somente asolução de cloreto de cálcio e passará a receber o gotejamentovindo da bomba peristáltica; e) As microcápsulas do tanque 111/1,que foi substituído, ficarão em repouso entre 5 e 20 minutos,necessários para complementar o processo de pelletização; f) Apósesse tempo de repouso, os pellets e a solução, serão vertidos emuma peneira, onde haverá a separação das fases líquidas e sólidas,restando a fase líquida no tanque III/2, que irá substituir o tanquerecebedor das gotas da bomba peristáltica (4) e repetir o processopara a produção de mais pellets; g) Por outro lado os pelletsrecolhidos, serão levados ao tanque IV (5), onde, sem seremretirados da peneira, sofrerão a devida lavagem com a águadestilada em circuito fechado, concluindo com essa operação umciclo da produção dos pellets de kefir.

2. "PROCESSO INDUSTRIAL DE !MOBILIZAÇÃO DE UMCONSÓRCIO DE MICRORGANISMOS PRESENTES NO KEFIRBIOLOGICUS, BEM COMO DE SEUS BIOATIVOS, POR MEIO DAFORMAÇÃO DE MICROCÁPSULAS DE ALGINATO DE CÁLCIOMODIFICADO", conforme reivindicação 1, caracterizada pelo fatodo método da reivindicação 1 aplicado a microencapsulação debactérias e fungos.

3. "PROCESSO INDUSTRIAL DE !MOBILIZAÇÃO DE UMCONSÓRCIO DE MICRORGANISMOS PRESENTES NO KEFIRBIOLOGICUS, BEM COMO DE SEUS BIOATIVOS, POR MEIO DAFORMAÇÃO DE MICROCÁPSULAS DE ALGINATO DE CÁLCIOMODIFICADO", conforme reivindicação 1, caracterizada pelo fatodo método da reivindicação 2 onde se lê fungos se lê leveduras.

4. "PROCESSO INDUSTRIAL DE !MOBILIZAÇÃO DE UMCONSÓRCIO DE MICRORGANISMOS PRESENTES NO KEFIRBIOLOGICUS, BEM COMO DE SEUS BIOATIVOS, POR MEIO DAFORMAÇÃO DE MICROCÁPSULAS DE ALGINATO DE CÁLCIOMODIFICADO", conforme reivindicação 1, caracterizada pelo fatodo produto encapsulado contemplando uma misturasubstancialmente homogênea de: 1- Lactobacilos: Lactobacillusbrevis; Lactobacilluscellobiosis; Lactobacillus aeidophillus;Lactobacillus casei ssp. laetosus; Lactobacillus casei SSP.rhamnosus; Laetobacillus casei; Lactobacillus paracasei SSP.paraeasei;; Lactobacillus helveticus SSP. lactis; Lactobacillusdelbrueckii SSP. lactis; Lactobacillus delbrueckii SSP. bulgaricus;Lactobaciilus lactis; Lactobacillus fructivorans; Lactobacillus rilgardii;Lactobacillus kefir; Lactobacillus kefiranofaciens; Lactobacilluskefirgranum SP. ; Lactobacillus parakefir SP; 2-Lactococcus/Streptococcus: Lc. lactis ssp. lactis; Lc. lactis var.diacetylactis; Lc. lactis ssp. cremoris; S. sallivarius ssp.thermophilus; S. lactis; Enterococcus durans; Leuconostoc cremoris;L. mesenteroides; 3- Leveduras: Kluyveromyces lactis;Kluyveromyces marxianus var. Marxianus; K. bulgaricus; K. fragilis;Candida kefir; C. pseudotropicalis; C. rancens; Saccharomyceslactis; A- Acetobacter: Acetobacters aceti; A. rasens.

5.) "PROCESSO INDUSTRIAL DE !MOBILIZAÇÃO DE UMCONSÓRCIO DE MICRORGANISMOS PRESENTES NO KEFIRBIOLOGICUS, BEM COMO DE SEUS BIOATIVOS, POR MEIO DAFORMAÇÃO DE MICROCÁPSULAS DE ALGINATO DE CÁLCIOMODIFICADO", conforme reivindicação 1, caracterizada pelo fatoda matriz composta por uma mistura de alginato de sódio, kefiranoe\ou pectina aplicada no método da reivindicação 1.

6.) "PROCESSO INDUSTRIAL DE !MOBILIZAÇÃO DE UMCONSÓRCIO DE MICRORGANISMOS PRESENTES NO KEFIRBIOLOGICUS, BEM COMO DE SEUS BIOATIVOS, POR MEIO DAFORMAÇÃO DE MICROCÁPSULAS DE ALGINATO DE CÁLCIOMODIFICADO", conforme reivindicação 1, caracterizada pelo fatodas microcapsulas produzidas pelo método da reinvidicação 1secas em estufas em temperaturas na faixa de 25 a 50°C.

7.) "PROCESSO INDUSTRIAL DE !MOBILIZAÇÃO DE UMCONSÓRCIO DE MICRORGANISMOS PRESENTES NO KEFIRBIOLOGICUS, BEM COMO DE SEUS BIOATIVOS, POR MEIO DAFORMAÇÃO DE MICROCAPSULAS DE ALGINATO DE CÁLCIOMODIFICADO", conforme reivindicação 6, caracterizada pelo fatodas microcapsulas produzidas pelo método da reinvidicação 1congeladas a temperatura de -5°C e posteriormente secas emestufas em temperaturas na faixa de 25 a 50°C.