BRPI0905645A2 - vacina de dna contra o vìrus da febre amarela - Google Patents
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Abstract
VACINA DE DNA CONTRA O VìRUS DA FEBRE AMARELA. A presente invenção se refere a vacinas de DNA codificando seqUências virais específicas. As vacinas de DNA contra a Febre Amarela, desenvolvidas de acordo com a invenção, são baseadas na seqüência que codifica a proteína do envelope de VFA (p/YE'E). Além da construção selvagem p/YFE, a seqüência E foi ainda fusionada à seqüência que codifica a Proteína de Associação à Membrana Lisossomal humana (h-LAMP), gerando a construção (pL/YFE>. Os resultados da invenção são considerados bastante promissores uma vez que as duas construções são capazes de induzir resposta de célula T contra os mesmos epitopos induzidos pela vacina 17DD, e a construção pL/YFE foi ainda capaz de induzir anticorpos neutralizantes numa concentração considerada satisfatória, O vetor pL/YFE foi ainda inoculado em camundongos, para posterior desafio intracerebral com VFA. Surpreendentemente, 100% dos camundongos imunizados com pL/YFE sobreviveram ao desafio.
Description
"Vacina de DNA contra o vírus da Febre Amarela"
Campo da Invenção
A presente invenção está direcionada para uma vacina deDNA otimizada, baseada na região que codifica o envelope dovírus da Febre Amarela fusionada a Proteína de Associação àMembrana Lisossomal - LAMP, capaz de processar o antígenocodificado e apresentá-lo ao sistema imune pela via MHC II.
Fundamentos da Invenção
O vírus da Febre Amarela (FA) é considerado o protótipoda família Flaviviridae, representada ainda por vários outrosvírus de importância médica causadores de enfermidades gravescomo a Dengue, Encefalite Japonesa e Febre do Oeste do Nilo(Barrett, 2002). De acordo com a Organização Mundial de Saúde(OMS) mais de 200.000 casos de infecção por FA, incluindo30.000 mortes, ocorrem anualmente em todo o mundo (sendo 90%dos casos disseminados na África). A estratégia mais segurade prevenção da doença continua sendo a vacinação,considerando que não existe ainda nenhuma droga efetivacontra a infecção por FA. Nos últimos 70 anos mais de 400milhões de pessoas foram globalmente vacinadas com a vacinaFA de vírus-atenuado (17DD), considerada bastante segura eeficaz. Apesar do sucesso da vacinação em massa com a 17DD,que é capaz de induzir tanto resposta duradoura poranticorpos neutralizantes como resposta citotóxica porcélulas T (Poland, Calisher et al., 1981; Reinhardt, Jaspertet al., 1998), casos adversos graves (em conseqüência davacinação) vem sendo sistematicamente reportados naliteratura [revisado em (Liu, 2003)]. Em alguns casos avacinação foi diretamente associada com o aumento daseveridade sintomatológica (Monath, Arroyo et al., 2002)podendo até culminar com reações fatais (Vasconcelos, Luna etal., 2001; Lefeuvre, Marianneau et al., 2004). Diante destecenário o desenvolvimento de nova estratégia de vacinação,como vacinas de DNA codificando seqüências virais especificas(Donnelly, Ulmer et al., 1997; Lewis e Babiuk, 1999;Robinson, 1999; Schultz, Pavlovic et al., 2000) é defundamental importância para o desenvolvimento de estratégiasvacinais ainda mais seguras.
0 genoma do VFA é organizado numa molécula positiva deRNA mensageiro, de aproximadamente 10.8Kb, flanqueada pelasestruturas cap 5' e alça 3' terminal não poli-adenilada. 0RNA VFA codifica 3 genes estruturais (Capsideo - C, Membrana-Me Envelope - E) e 7 genes que codificam proteínas não-estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5). Durantea montagem do vírus o domínio carboxi-terminal da proteína Catua como seqüência sinal para a translocação do precursorPreM/M para dentro do lúmen do retículo endoplasmático (RE)da célula hospedeira, permitindo a maturação apropriada dasproteínas M e Ε. A co-expressão das proteínas PreM/M e E dosflavivírus, em células de mamífero, resulta na formação departículas pseudo-virais capazes de induzir resposta humoral(Raviprakash, Kochel et al., 2000; Wu, Li et al., 2006), poisa proteína E é o principal alvo para a produção de anticorposneutralizantes.
A co-expressão das proteínas PreM/M e E, como estratégiavacinai, foi descrita como sendo capaz de induzir a produçãode anticorpos neutralizantes contra os vírus da EncefaliteJaponesa e da Dengue (Konishi, Yamaoka et al., 1998; Konishi,Yamaoka et al., 2000; Konishi, Ajiro et al., 2003).Entretanto, estas vacinas não foram capazes de induzirresposta duradoura com títulos apropriados de anticorposneutralizantes (Lu, Raviprakash et al., 2003). A ineficiênciadestas formulações está provavelmente relacionada aomecanismo de apresentação destes antígenos ao sistema imunedos hospedeiros. A maioria dos antígenos produzidosendogenamente, característicos das vacinas de DNA, sãoseqüestrados e apresentados ao sistema imune do hospedeiropor moléculas MHC I. Para uma resposta imune satisfatória,com alta produção de anticorpos neutralizantes, é crítico queos antígenos sejam apresentados a células do tipo T helperCD4+ por moléculas MHC II. 0 processamento e a apresentaçãoantigênica via MHC II induz a ativação de células T CD4+ queé vital para o funcionamento das vacinas genéticas, como jáfoi demonstrado em estudos de deleção do MHC II (Raviprakash,Marques et al., 2001) e depleção CD4+ em camundongos (Lu,Raviprakash et al., 2003). A ativação de células CD4+ é defundamental importância para a indução dé resposta CD8+,desenvolvimento de células de memória (Marques, Chikhlikar etal., 2003) e expansão clonal de células B antígeno-específicas (De Arruda, Chikhlikar et al., 2004). Para queantígenos produzidos endogenamente sejam dirigidos amoléculas de classe II, ao invés de classe I, é necessárioque estas proteínas sejam fusionadas a peptídeos-sinais queas direcionem para o compartimento lisossomal da célula.
A possibilidade de direcionamento de antígenos,produzidos endogenamente, para o processamento via MHC II foifirmemente reforçada após o descobrimento de uma proteínatrans-membrana do tipo I, denominada de Proteína deAssociação à Membrana Lisossomal - LAMP (Chen, Murphy et al.,1985). LAMP é uma proteína que se liga à membrana externa dolisossomo, através de sua seqüência carboxi-terminal YXX0,presente numa cauda citoplasmática de 11 aminoácidos(Guarnieri, Arterburn et al., 1993; Rohrer, Schweizer et al.,1996; Obermuller, Kiecke et al., 2002). 0 tráficointracelular de LAMP inclui compartimentos multilaminaresespecializados de Células Apresentadoras de Antigenos (APCs)imaturas, chamados MIIC e CIIV, onde ocorre o processamento eformação dos complexos peptídeos antigênicos-MHC II(Kleijmeer, Morkowski et al., 1997; Drake, Lewis et al.,1999; Turley, Inaba et al., 2000). A constatação da co-localização das moléculas LAMP e MHC II permite suautilização como suporte para antígenos quiméricos, contendoas seqüências alvos de LAMP, visando o direcionamento doprocessamento antigênico para o compartimento MHC II. Váriostrabalhos vem demonstrando que os antígenos fusionados aoLAMP (antígeno/LAMP) são capazes de gerar uma maior atividadeproliferativa de linfócitos antígeno-específicos, altostítulos de anticorpos e intensa atividade T- citotóxica emrelação aos antígenos selvagens não fusionados ao LAMP(Rowell, Ruff et al., 1995; Wu, Guarnieri et al., 1995; Ruff,Guarnieri et al., 1997; Raviprakash, Marques et al., 2001;Su, Vieweg et al., 2002; Donnelly, Berry et al., 2003; Anwar,Chandrasekaran et al., 2005).
A vacina 17DD de vírus-atenuado vem sendo produzida nocampus de Manguinhos - FIOCRUZ/RJ desde 1937, ou seja, a pelomenos 70 anos. A imunização em massa com a vacina 17DD, assimcomo o combate sistemático ao vetor transmissor da FebreAmarela (Aedes aegypti), foi e continua sendo estratégias defundamental importância para o controle da doença no pais.
Apesar da eficácia e segurança da vacina 17DD, a mesma não érecomendada para infantes, mulheres grávidas,imunodeficientes e pessoas alérgicas a proteínas do ovo(substrato de produção da vacina 17DD). Estima-se queaproximadamente 5% da população apresente alergia e/ouefeitos colaterais em resposta a vacina, podendo culminar emcasos mais raros de óbito provocado pela vacinação.
Recentemente, diante da morte de macacos em regiõessilvestres onde circula VFA, a população começou a entrar empânico diante de especulações da re-introdução da FebreAmarela urbana no país. Considerando o risco de infecçãopredominante em áreas tropicais, a invasão do ambiente urbanopelo vetor da doença, o aquecimento global e a falta depolíticas apropriadas para o combate do inseto vetor, o riscoda disseminação da doença em regiões urbanas não pode sernegligenciado. O caos causado pela dengue no estado do Rio deJaneiro, que por sinal é transmitida pelo mesmo vetor daFebre Amarela, ilustra o risco de um possível (mais nãoprovável) surto de Febre Amarela urbana no país. Considerandotodos estes fatores, o desenvolvimento de uma estratégiavacinai complementar, e/ou alternativa contra a FebreAmarela, pode complementar/substituir o uso da versão vacinaide vírus atenuado.
Apesar de nenhuma vacina de DNA ter sido ainda aprovadapara uso humano, este tipo de tecnologia vem sendo cada vezmais aprimorado e potencialmente deverá substituir asformulações baseadas em microorganismos vivos. Formulações abase de DNA podem ser facilmente manipuladas e dosadas, nãorequerem nenhuma condição especial de temperatura paraarmazenamento e distribuição e ainda eliminam qualquereventual risco de infecção pelos agentes vivos/atenuados.Este tipo de tecnologia permite ainda a manipulação deimunógenos capazes de estimular o sistema imune com epitopose sinais biológicos específicos, evitando o uso deantígenos/epítopos desnecessários e até potencialmenteperigosos no que se refere a possíveis respostas imunológicascruzadas (principal empecilho para o desenvolvimento de umavacina eficaz contra a Dengue, devido a reação cruzada entreos seus 4 sorotipos). Finalmente, com o avanço tecnológicodas ferramentas de manipulação de microorganismos epurificação de moléculas em larga escala, as vacinas de DNApoderão ser produzidas em maior escala e com um menor custofinal quando comparada as formulações atenuadas/inativadas.
É importante ressaltar que diante dos resultadossignificativamente encorajadores, obtidos pelo nosso grupo,utilizando uma vacina genética baseada na seqüência viral daproteína E fusionada à LAMP, e do melhoramento desta vacinapela otimização dos antígenos para a expressão em humanos,acreditamos na possibilidade do desenvolvimento eimplementação de uma vacina de DNA, ainda mais segura, capazde conferir imunidade contra o vírus da Febre Amarela emhumanos. Este tipo de tecnologia poderá ainda servir desubsídio para o desenvolvimento de outras vacinas virais,principalmente contra outros flavivirus como o vírus daDengue.Sumário da Invenção
A presente invenção, em seu aspecto mais amplo, estádirecionada para uma vacina de DNA otimizada, baseada naregião que codifica o envelope do virus da Febre Amarelafusionada a Proteína de Associação à Membrana Lisossomal -LAMP, capaz de processar o antígeno codificado e apresentá-loao sistema imune pela via MHC II.
Breve Descrição das Figuras e Tabelas
Figura 1: Esquema das regiões de anelamento para aamplificação de PreM/M-E selvagem (p/YFE) e PreM/M-Efusionado a LAMP (pL/YFE). Esquema representado todo o genomado vírus da Febre Amarela, composto de 3 genes estruturais[Capsídeo (C), Membrana (PreM/M) e Envelope (E)] e 7 não-estruturais (NS1-NS5). As setas pretas indicam as regiões deanelamento dos primers (oligonucleotideos) utilizados para aamplificação de PreM/M-E selvagem (região carboxi-terminal docapsídeo X região trans-membrana C-terminal do envelope).Para a amplificação de PreM/M-E, para a fusão com LAMP, oprimer "reverse" utilizado foi desenhado para anelar antes daregião trans-membrana do envelope (seta branca).
Figura 2: Produto de PCR PreM/M-E do vírus FA. Após aamplificação por PCR, utilizando os primers desenhados para aseqüência PreM/M-E selvagem (Tabela 1), foi obtido umfragmento de aproximadamente 2000pb como esperado. 0 referidoproduto de PCR foi migrado em gel de agarose 1% e visualizadoao transluminador de luz ultravioleta. Como marcador de pesomolecular (PM) foi utilizado o Ikb plus ladder (Invitrogen®),sendo indicadas como referência as bandas de 1650 e 2000pares de bases.Figura 3: Produtos de PCR PreM/M-E de VFA para fusão comLAMP e C-LAMP (humano) . Após a amplificação por PCR,utilizando os primers desenhados para as seqüências PreM/M-Epara fusão com LAMP e C-LAMP humano (Tabela 1), foram obtidosum fragmento de aproximadamente 1900pb (PreM/M-E) e outro de125pb (C-LAMP) como esperado. Os referidos produtos de PCRforam migrados em gel de agarose 1% e visualizados aotransluminador de luz ultravioleta. Como marcador de pesomolecular (PM) foi utilizado o Ikb plus ladder (Invitrogen®) ,sendo indicadas como referência as bandas de 100 e 2000 paresde bases.
Figura 4: Digestão de DNA plasmidial para a confirmaçãode clonagem da seqüência PreM/M-E selvagem no vetor pGEMT-Easy. Após a transformação com a ligação pGEMT-Easy + PreM/M-E selvagem, 3 clones bacterianos brancos (triados por IPTG/X-Gal) foram inoculados em meio liquido para posterior extraçãode DNA plasmidial. As minipreps obtidas foram em seguidadigeridas com as enzimas XhoI e NotI para a confirmação daclonagem de PreM/M-E selvagem no vetor pGEMT-Easy. Osprodutos de digestão foram em seguida migrados em gel deagarose 1% e visualizados ao transluminador de luzultravioleta. Como marcador de peso molecular (PM) foiutilizado o Ikb plus ladder (Invitrogen®), sendo indicadascomo referência as bandas de 3000 e 2000 pares de bases.Apenas o clone 2, asterisco, liberou um fragmento do tamanhodo esperado (2000pb).
Figura 5: Digestão de DNA plasmidial para a confirmaçãode clonagem da seqüência PreM/M-E para fusão com LAMP novetor pGEMT-Easy. Após a transformação com a ligação pGEMT-Easy + PreM/M-E para fusão com LAMP, 8 clones bacterianosbrancos (triados por IPTG/X-Gal) foram inoculados em meiolíquido para posterior extração de DNA plasmidial. Asminipreps obtidas foram em seguida digeridas com as enzimasNheI e XhoI para a confirmação da clonagem de PreM/M-E parafusão com LAMP no vetor pGEMT-Easy. Os produtos de digestãoforam em seguida migrados em gel de agarose 1% e visualizadosao transluminador de luz ultravioleta. Como marcador de pesomolecular (PM) foi utilizado o Ikb plus ladder (Invitrogen®) ,sendo indicadas como referência as bandas de 1650 e 2000pares de bases. Os clones 3, 5 e 8 (asteriscos) liberaramfragmentos do tamanho esperado (1900pb).
Figura 6: Digestão de DNA plasmidial para a confirmaçãode clonagem de C-LAMP no vetor pGEMT-Easy. Após atransformação com a ligação pGEMT-Easy + C-LAMP, 3 clonesbacterianos foram inoculados em meio líquido para posteriorextração de DNA plasmidial. As minipreps obtidas foram emseguida digeridas com as enzimas XhoI e XbaI para aconfirmação da clonagem de C-LAMP no vetor pGEMT-Easy. Osprodutos de digestão foram em seguida migrados em gel deagarose 1% e visualizados ao transluminador de luzultravioleta. Como marcador de peso molecular (PM) foiutilizado o Ikb plus ladder (Invitrogen®), sendo indicadascomo referência as bandas de 100 e 3000 pares de bases. Dototal de 3 clones todos liberaram os fragmentos do tamanhoesperado (125pb, asteriscos).
Figura 7: Digestão de DNA plasmidial para a confirmaçãoda clonagem da seqüência PreM/M-E selvagem no vetor p4 3.2.Após a transformação com a ligação p43.2 + PreM/M-E selvagem,3 clones bacterianos foram inoculados em meio liquido paraposterior extração de DNA plasmidial. As minipreps obtidasforam em seguida digeridas com as enzimas XhoI e NotI para aconfirmação da clonagem de PreM/M-E selvagem no vetor p43.2(p/YFE). Os produtos de digestão foram em seguida migrados emgel de agarose 1% e visualizados ao transluminador de luzultravioleta. Como marcador de peso molecular (PM) foiutilizado o Ikb plus ladder (Invitrogen®), sendo indicadascomo referência as bandas de 2000 e 5000 pares de bases.Todos os clones liberaram os fragmentos do tamanho esperado(2000pb, asteriscos).
Figura 8: Digestão de DNA plasmidial para a confirmaçãode clonagem da seqüência p43.2-PreM/M-E para fusão com LAMPno vetor p4 3.2. Após a transformação com a ligação p43.2 +PreM/M-E para fusão com LAMP, 8 clones bacterianos foraminoculados em meio liquido para posterior extração de DNAplasmidial. As minipreps obtidas foram em seguida digeridascom as enzimas NheI e XhoI para a confirmação da clonagem dep43.2-PreM/M-E para fusão com LAMP no vetor p43.2. Osprodutos de digestão foram em seguida migrados em gel deagarose 1% e visualizados ao transluminador de luzultravioleta. Como marcador de peso molecular (PM) foiutilizado o Ikb plus ladder (Invitrogen®), sendo indicadascomo referência as bandas de 2000 e 5000 pares de bases. Dototal de 8 clones 7 liberaram os fragmentos do tamanhoesperado (1900pb, asteriscos).
Figura 9: Digestão de DNA plasmidial para a confirmaçãode clonagem de C-LAMP no vetor p43.2-PreM/M-E para fusão comLAMP. Após a transformação com a ligação p43.2-PreM/M-E + C-LAMP, 7 clones bacterianos foram inoculados em meio líquidopara posterior extração de DNA plasmidial. As miniprepsobtidas foram em seguida digeridas com as enzimas XhoI e XbaIpara a confirmação da clonagem de C-LAMP no vetor p43.2- PreM/M-E/LAMP (pL/YFE). Os produtos de digestão foram emseguida migrados em gel de agarose 1% e visualizados aotransluminador de luz ultravioleta. Como marcador de pesomolecular (PM) foi utilizado o Ikb plus ladder (Invitrogen®) ,sendo indicadas como referência as bandas de 100 e 7000 paresde bases. Do total de 7 clones todos liberaram os fragmentosdo tamanho esperado (125pb, asteriscos).
Figura 10: Células 293 transfectadas com as construçõesp/YFE a pL/YFE. A validação da expressão das proteínascodificadas pelos plasmídeos p/YFE e pL/YFE, assim como alocaliz ação intracelular das mesmas, foi realizada através deensaios de imunofluorescência. Tanto a proteína E como E/LAMPforam detectadas através de anticorpo policlonal, anti-VFA. Aesperada distribuição da proteína viral E selvagem,caracteristicamente associada a membrana reticular, foiconfirmada (A). Em adição, a proteína quimérica E/LAMP(presente nas células 293 transfectadas com pL/YFE)apresentou-se distribuída pela membrana reticular maisprincipalmente associada às membranas lisossomais (comotambém era esperado devido a presença de LAMP).
Figura 11: Digestão de DNA plasmidial, nas condiçõeslivre de endotoxina, para a confirmação da identidade dosvetores (p/YFE e pL/YFE). Após a transformação com asconstruções p/YFE e pL/YFE, colônias isoladas de cada uma dasconstruções foram inoculadas em meio líquido para posteriorextração de DNA plasmidial. As Gigapreps obtidas foram emseguida digeridas. A construção selvagem (p/YFE) foisubmetida a duas provas de digestão. A primeira com asenzimas XhoI e XbaI na qual houve a linearização daconstrução (1) e com as enzimas XhoI e NotI que gerou aliberação do fragmento codificado por p/YFE. A construção comLAMP (pL/YFE) também foi submetida a duas provas de digestão.
A primeira com as enzimas XhoI e XbaI na qual houve aliberação de LAMP (asterisco), e com as enzimas NheI e XbaIque gerou a liberação do fragmento codificado por pL/YFE. Osprodutos de digestão foram migrados em gel de agarose 1% evisualizados ao transluminador de luz ultravioleta. Comomarcador de peso molecular (PM) foi utilizado o Ikb plusladder (Invitrogen®), sendo indicadas como referência asbandas de 1650 e 100 pares de bases.
Figura 12: Comparação das respostas celulares induzidas,em camundongos Balb/C, pela vacina 17DD e as construçõesp/YFE e pL/YFE. Camundongos Balb/C foram imunizados nos dias0 e 21 com: (A) IO4 Unidades Formadoras de Colônia - PFU davacina 17DD, (B) 50ug da vacina pL/YFE ou (C) 50ug da vacinap/YFE. Entre 7-10 dias após a última imunização foramisoladas amostras de esplenócitos dos camundongos paraensaios de ELISP0T - IFN-γ, utilizando uma biblioteca depeptideos sintéticos, 15 aminoácidos cada com "overlapping"de 11 aminoácidos entre os mesmos, cobrindo toda a proteína Ede VFA. Esta figura representa uma média de 2-4 experimentosrealizados com "pools" de 3-5 camundongos cada.
Figura 13: Níveis de anticorpos neutralizantesdetectados em camundongos BALB/c e C57B1/6, após asimunizações com as vacinas 17DD, pL/YFE e p/YFE. Oscamundongos das duas espécies foram imunizados com a vacinaconvencional ou com as vacinas de DNA nos dias 0, 30 e 45 eos respectivos soros imunes foram obtidos nos dias 15, 45 e60. Os soros foram testados individualmente em ensaiosneutralização por redução de placas - PRNT, comparando com umsoro de macaco contendo anticorpos neutralizantes contra VFAem uma concentração conhecida. A construção pL/YFE, apesar deinduzir uma produção de anticorpos neutralizantesaproximadamente 3,5 vezes menor que a vacina 17DD, é capaz deinduzir títulos de anticorpos neutralizantes pelo menos 7vezes maior que os títulos induzidos por p/YFE.
Figura 14: Avaliação de proteção contra VFA, através deensaios de injeção intracerebral em camundongos previamenteimunizados com 17DD e pL/YFE. Os ensaios de proteção foramrealizados utilizando o modelo de imunização/desafio,injetando IO5 PFU do vírus vacinai 17DD (via intracerebral)em camundongos previamente imunizados com a vacina 17DD e coma vacina pL/YFE. Os animais foram imunizados 3 vezes (dias 0,30 e 45) e desafiados 15 dias após a última imunização. Tantoa vacina 17DD como a vacina pL/YFE foram capazes de protegerem 100% os animais desafiados. A tabela 2 complementa asinformações desta figura, no que se refere ao número deanimais desafiados assim como comparando a eficiência dasvacinas de DNA em ambas as espécies.
Tabela 1: Oligonucleotideos (primers) utilizados paragerar as construções vacinais p/YFE e pL/YFE. Para o desenhodos nucleotídeos capazes de amplificar as seqüências PreM/M-Eselvagem e PreM/M-E-LAMP foi utilizado o software de domíniopúblico Ape [desenvolvido pelo Dr. M. Wayne Davis -(http://www.biology.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/)].
Tabela 2: Resultados do teste de proteção em camundongosBALB/c e C57B1/6 comparando a vacina 17DD com a vacina de DNApL/YFE. Camundongos imunizados com a vacina 17DD, e com aconstrução de DNA pL/YFE, foram desafiados via intracerebralcom o VFA 17DD. Ambas as linhagens de camundongos foram 100%protegidas com a vacina convencional e com a vacina de DNA.Como controle negativo, os camundongos foram submetidos aosmesmos esquemas de imunização com o vetor p43.2 vazio e PBS.
Tabela 3: Comparação dos níveis de expressão dasproteínas do envelope de Febre Amarela, selvagens eotimizadas, por citometria de fluxo. Células 293 foramtransfectadas com 1 ug de cada DNA vacinai, usandolipofectamina, e coradas com soro de coelho anti-envelope deFebre Amarela. A transfecção das células foi normalizada,usando como controle interno um plasmídeo codificando umaproteína fluorescente, e em relação ao nível de expressão daproteína codificada pela construção codificante da seqüêncianativa do envelope (número 2). O plasmídeo otimizado (número6) apresentou um nível de expressão 6.5 vezes maior que oplasmídeo codificando a seqüência nativa (número 2).
Descrição Detalhada da Invenção
Os presentes inventores desenvolveram e avaliaram aeficiência de expressão e capacidade de indução de respostaimune de duas vacinas genéticas, ambas baseadas na estratégiade co-expressão das proteínas PreM/M e E do VFA (uma selvageme a outra fusionada à LAMP). Ambas as construções, selvagem(p/YFE) e com LAMP (pL/YFE), foram utilizadas paratransfectar células humanas e as respectivas proteínascodificadas pelas mesmas foram detectadas porimunofluorescência. Em seguida, os vetores p/YFE e pL/YFEforam inoculados em camundongos e as respostas imunes,induzidas por cada construção, foram analisadas em termos deresposta celular e humoral. Os resultados foram consideradosexcelentes uma vez que as duas construções são capazes deinduzir resposta de célula T contra os mesmos epitoposinduzidos pela vacina 17DD, e pL/YFE foi ainda capaz deinduzir altos títulos de anticorpos neutralizantes. Estesvetores foram ainda inoculados em camundongos que em seguidaforam desafiados contra VFA, com o objetivo de avaliar seestas construções são capazes de proteger estes animaiscontra a FA. Apesar da construção pL/YFE ter sido capaz degerar um maior título de anticorpos neutralizantes que aconstrução selvagem p/YFE, tanto em Balb/c como em C57B1/6imunizados, ambas as construções conferiram 100% de proteçãoaos camundongos desafiados. Estes resultados são considerados excelentes.
A vacina pL/YFE foi ainda otimizada, gerando aconstrução pL/YFEopt, utilizando o algoritmo genético doprograma LETO 1.0 (Entelechon®) . No processo de otimizaçãoforam levados em consideração fatores como: codon usage,estrutura secundária do RNA mensageiro, presença de motivosrepetitivos de DNA, conteúdo de GC, presença/ausência desítios de restrição, sítios crípticos de "splicing", etc. Asseqüências otimizadas foram enviadas para a síntese comercial(Geneart®) e em seguida subclonadas no vetor 8L, selvagem ecom LAMP. As construções vacinais otimizadas, assim comop/YFE e pL/YFE selvagens, serão inoculadas em camundongosconvencionais e transgênicos (expressando HLAs humanos) eavaliadas quanto à sua imunogenicidade através de ensaios deELISPOT, neutralização viral por redução de placa (PRNT)edesafio contra VFA.
A invenção será, agora, descrita através de exemplos. Osexemplos seguintes são ilustrativos da invenção e representamas modalidades preferidas, aqueles habilitados no estado daarte sabem ou são capazes de encontrar, usando nada mais queexperimentação rotineira, como empregar outros materiais etécnicas apropriadas.
Amplificação por PCR
Os primers desenhados (Tabela 1) para a amplificação dePreM/M-E selvagem, PreM/M-E para fusão com LAMP e domínio C-terminal de LAMP, permitiram a obtenção das respectivasseqüências com os pesos moleculares esperados. A seqüênciaPreM/M-E selvagem foi amplificada através de primers queflanqueiam a região N-terminal de PreM/M (maisespecificamente ao nível da região carboxi-terminal docapsídeo) e a região trans-membrana C-terminal do envelope.
Para a amplificação da seqüência PreM/M-E, visando sua fusãoao domínio C-terminal de LAMP, o primer "forward" utilizadofoi desenhado para anelar com a mesma região do capsídeo. Poroutro lado, o primer "reverse" utilizado foi desenhado paraanelar mais internamente dentro da região que codifica oenvelope. Desta forma, a seqüência PreM/M-E (para a fusão comLAMP) não possui o domínio trans-membrana C-terminal doenvelope, visando a sua substituição pelo domínio C-terminalde LAMP (Figura 1).O produto de PCR PreM/M-E para fusão com LAMP possuiaproximadamente o mesmo tamanho do produto PreM/M-E selvagem,pois a região removida do envelope tem apenas 100 pares debases (pb). Para substituir este domínio trans-membrana C- terminal do envelope, desenhamos primers capazes deamplificar a região C-terminal do LAMP-I humano (C-LAMP). Oprimer "forward" permite a fusão (em fase) de PreM/M-E com C-LAMP, enquanto o primer "reverse" possui o códon determinação da tradução. O produto de PCR da seqüência PreM/M- E selvagem, de aproximadamente 2000 pares de bases (pb), podeser visualizada na Figura 2. Já os produtos de PCR, PreM/M-Epara fusão com LAMP (1900 pb) e C-LAMP (125 pb) , podem seremvisualizados na Figura 3.
Clonagem dos produtos de PCR obtidos no vetor pGEMT-Easy
Uma vez confirmados os tamanhos esperados dos produtosde PCR PreM/M-E selvagem, PreM/M-E para fusão com LAMP e C-LAMP, os mesmos foram clonados no vetor pGEMT-Easy. Parafacilitar a triagem de clones positivos, clones contendoinserto inserido dentro do fragmento LacZ do gene da β-galactosidase, foram selecionados apenas clones brancos decada construção. Da placa contendo as bactérias transformadascom a ligação pGEMT-Easy + PreM/M-E selvagem, foramselecionados 3 clones. Estes clones foram inoculados em meiolíquido de crescimento, para posterior preparação de DNA plasmidial (miniprep) e prova de digestão para confirmação daclonagem. Dos 3 clones escolhidos apenas 1 liberou o insertode 2000pb esperado, relativo a construção PreM/M-E selvagem(Figura 4). Com relação as ligação pGEMT-Easy + PreM/M-E parafusão com LAMP, foram selecionados 8 clones brancos . Estesclones foram também submetidos à extração plasmidial e provade digestão. Dos 8 clones escolhidos 3 liberaram o inserto de1900 esperado, relativos a construção PreM/M-E para fusão comLAMP (Figura 5). Já da ligação pGEMT-Easy + C-LAMP foramselecionados 3 clones, dos quais todos liberaram o insertoapós digestão (Figura 6).
Subclonagens dos fragmentos clonados no pGEMT-easy no vetorp43.2
Para a subclonagem de PreM/M-E no vetor p43.2, estefragmento foi clivado do vetor pGEMT-Easy e inserido no vetorp43.2. Para facilitar a triagem dos clones positivos, 3concentrações diferentes de inserto foram ligadas numaconcentração constante do vetor p43.2 (como controle negativofoi realizada uma ligação na ausência de inserto). Destaforma foi selecionada a placa com maior quantidade de clones,comparando as placas com diferentes concentrações de insertocom o controle negativo, para a seleção de clones. Destaplaca contendo as bactérias transformadas com a ligação p43.2+ PreM/M-E selvagem, foram selecionados 3 clones. Estesclones foram inoculados em meio liquido de crescimento, paraposterior preparação de DNA plasmidial e prova de digestãopara confirmação da clonagem. Dos 3 clones escolhidos todosliberaram o inserto de 2000pb esperado, relativo a construçãop/YFE (Figura 7). Com relação à construção p43.2 + PreM/M-E/LAMP foi necessária a construção de um vetor intermediário,contendo PreM/M-E para a fusão com LAMP, para a posteriorfusão de LAMP. Desta forma, o fragmento PreM/M-E para a fusãocom LAMP foi clivado do vetor pGEMT-Easy e subclonado novetor p43.2, gerando a construção intermediária p43.2-PreM/M-E para a fusão com LAMP. Desta ligação foramselecionados 8 clones, dos quais 7 liberaram o inserto de1900pb esperado após a prova de digestão (Figura 8). Parafusionar LAMP ao fragmento p43.2-PreM/M-E para fusão comLAMP, C-LAMP foi clivado do vetor pGEMT-Easy/C-LAMP epurificado. Em seguida o vetor p43.2-pM/M-E para fusão comLAMP foi clivado com as mesmas enzimas, permitindo a inserçãode LAMP na sua extremidade C-terminal gerando a construçãopL/YFE. Para confirmar a inserção de LAMP no p43.2-PreM/M-Epara fusão com LAMP, foram digeridos 7 clones dos quais todosliberaram o fragmento de 125pb esperado (Figura 9) .Sequenciamento das construções p/YFE e pL/YFE
Para confirmar a identidade e a qualidade das seqüênciassubclonadas no vetor p43.2, os respectivos vetores foramseqüenciados utilizando primers internos desenhados paraanelarem a cada 400pb dos insertos clonados (tanto no sentido"forward" como no sentido "reverse"). As seqüências obtidasforam analisadas através dos programas ApE® e Lasergene®. Naconstrução p/YFE foram encontradas 2 mutações pontuais não-silenciosas, ou sejam que alteram o aminoácido, em um totalde 644 aminoácidos. As alterações foram de uma alanina (A)por uma valina (V) , na posição 250, e de uma serina (S) peloácido aspártico (D) na posição 349. Estas mutações foramainda as únicas encontradas na construção pL/YFE, indicandoque as mutações não ocorreram ao nível de PCR e sim jáestavam presentes no DNA molde utilizado para a amplificação.Considerando que a proteína E possui diversos epítopos paracélulas B (pois apenas a proteína E e NSl são capazes degerar anticorpos neutralizantes), assim como para células T(dados não mostrados, obtidos por colaboradores de nossogrupo), estas mutações foram consideradas sem relevância nonosso estudo de desenvolvimento vacinai.
Detecção das proteínas E e E/LAMP por imunofluorescência
Para avaliar a expressão das proteínas E e E/LAMP,codificadas pelas construções p/YFE e pL/YFE respectivamente,células 293 humanas foram transfectadas com estas vacinas deDNA. Apesar da baixa eficiência de expressão (em torno de40%), ambas as proteínas foram detectadas nos compartimentoscelulares adequados. Como era esperado foi confirmada adistribuição reticular característica do antígeno E selvagem(Figura 10A), assim como a distribuição lisossomalcaracterística da proteína E-LAMP (Figura 10B).
Avaliação da resposta imune induzida em camundongosimunizados com as vacinas p/YFE e pL/YFE
Para os ensaios de imunização os DNA vacinais, p/YFE epL/YFE, foram inicialmente preparados em larga escala livresde endotoxinas. As preparações obtidas foram submetidas aprovas de digestão, com enzimas específicas, a fim decertificar a qualidade/identidade dos vetores. O vetor p/YFEfoi digerido com as enzimas XhoI e XbaI e com as enzimas XhoIe NotI, enquanto o vetor pL/YFE foi digerido com as enzimasXhoI e XbaI e com as enzimas NheI e XbaI. Todas as digestõesliberaram fragmentos de DNA no tamanho esperado (Figura 11).
Em seguida, as construções p/YFE e pL/YFE foram usadas paratestes experimentais de imunização em camundongos.
Os plasmídeos p/YFE e pL/YFE, livres de endotoxinas,foram então inoculados em camundongos BALB/c e C57B1/6,utilizando como controle positivo a vacina 17DD e controlesnegativos solução salina e vetor p43.2 vazio. As respostasimunes, induzidas por cada construção, foram analisadas emtermos de resposta celular (através de ensaios de "Enzime-Linked Immunosorbent SPOT - ELISPOT") e humoral (através deensaios de neutralização viral - PRNT). Os resultados obtidosforam considerados excelentes uma vez que as duas construçõessão capazes de induzir resposta de célula T contra os mesmosepitopos induzidos pela vacina de virus atenuado convencional(Figura 12), e a construção pL/YFE foi ainda capaz de induziranticorpos neutralizantes numa concentração consideradabastante satisfatória. A construção pL/YFE, apesar de induziruma produção de anticorpos neutralizantes aproximadamente 3.5vezes menor que a vacina 17DD, é capaz de induzir títulos deanticorpos neutralizantes pelo menos 7 vezes maior que p/YFE(Figura 13).
0 vetor pL/YFE foi então inoculado 3 vezes(50pg/imunização) em camundongos BALB/c e C57B1/6. Mais umavez a vacina 17DD foi utilizada como controle positivo etanto o vetor p43.2 vazio como solução salina (IX PBS), foramutilizados como controles negativos. Duas semanas após aúltima imunização, os animais foram desafiados contra VFApelo inóculo de IOb Unidades Formadoras de Placas (PFU) davacina 17DD (via intracerebral). Tanto a vacina 17DD como avacina de DNA pL/YFE (E-LAMP) conferiram 100% de proteção aoscamundongos desafiados (Figura 14 e Tabela 2).
Otimização da vacina pL/YFE gerando as construções pL/YFEoptle pL/YFEopt2
Para melhorar a eficiência de expressão do antígeno E emcélulas eucarióticas, já visando experimento em primatas, aseqüência de DNA que codifica a proteína E foi otimizada.
Esta seqüência foi analisada/otimizada com relação acaracterísticas como "codon usage", estrutura secundária doRNA mensageiro (mRNA), distribuição do conteúdo de GC,motivos repetitivos de DNA, sítios de restrição, sítioscrípticos de "Splicing", etc. 0 processo de otimização levaem consideração os diversos parâmetros supracitados, ao mesmotempo, buscando um equilíbrio entre os mesmos.
Foram geradas duas versões otimizadas da vacina pL/YFE,denominadas de pL/YFEoptl e pL/YFEopt2. As construçõesotimizadas foram então utilizadas para transfectar células293 humanas, com o objetivo de se avaliar a eficiência deexpressão dos antígenos E-LAMP otimizados (E-LAMP0pti-2) comrelação ao antígeno E-LAMP selvagem. Através de ensaios deimunofluorescência a expressão de E-LAMP foi considerada pelomenos 20 vezes mais intensa (dados não mostrados). Embora,não tenham sido realizados ensaios quantitativos de "western-blot" para avaliar, com mais precisão, quantas vezes E-LAMPopti são mais expressos com relação a E-LAMP selvagem, épossível afirmar que a expressão desses antígenos E-LAMP0pti ésignificativamente superior à expressão do antígeno selvagem.
Considerando a maior eficiência de expressão de p43.2/E-LAMPopti-2 com relação a p43.2/E-LAMP selvagem, acreditamos quepossivelmente a vacina de DNA otimizada venha a serconsiderada ainda mais eficiente que a vacina selvagempreviamente testada. A maior eficiência de expressãoprovavelmente será acompanhada de um maior título deanticorpos neutralizantes, aumentando o potencial da vacinaotimizada com relação ao número de doses e concentração deDNA em cada dose. Apesar do vetor p43.2 ter sido otimizadopara a expressão em células eucarióticas (através dacombinação de promotores específicos, fatorestranscricionais, seqüências sinais para poli-adenilação,marcas de resistência, etc.), algumas seqüências de DNAcontidas no mesmo (como por exemplo a que codifica para amarca de resistência a ampicilina) não são permitidas pela"Food and Drug Administration-FDA" para uso em humanos. Poroutro lado outros vetores de expressão, como o vetor 8L porexemplo, não apresentam estas seqüências indesejáveis eportanto não são restringidos pela FDA. Desta forma, osantígenos E-LAMPopti-2 foram ainda clonados no vetor 8L gerandoas construções p8L/E-LAMP0pTi-2 que serão avaliadasinicialmente em camundongos, e posteriormente em macacos.EXEMPLO 1: Construção dos vetores de transfecção: p43.2-PreM/M-E (p/YFE) e p4 3.2-PreM/M-E-LAMP (pL/YFE);1.I-Amplificação e purificação dos produtos de PCR
A seqüência PreM/M-E do VFA, incluindo a seqüênciacarboxi-terminal do capsídeo (responsável pela translocaçãode PreM/M para o retículo endoplasmático) foi amplificada porPCR, a partir de um plasmídeo contendo todo o genoma do VFA[clone infeccioso gentilmente cedido pelo Dr. Ricardo Galler(Biomanguinhos-IOC/FIOCRUZ)]. PreM/M-E foi amplificada comdois pares distintos de primers visando a obtenção daseqüência selvagem (estendendo desde o nucleotídeo 392 até onucleotídeo 2452 do genoma da Febre Amarela, com base naseqüência de número de acesso NC 002031 no Genbank - NCBI),assim como de uma seqüência de fusão incorporando LAMP naregião carboxi-terminal (estendendo desde o nucleotídeo 392até o nucleotideo 2323 do genoma da Febre Amarela, com basena seqüência de número de acesso NC 002031 no Genbank -NCBI). A seqüência C-terminal de LAMP foi amplificada apartir de um plasmideo contendo as regiões N-terminal e C-terminal de LAMP-I humano, p43.2 hLAMP/GAG [gentilmentecedido pelo Dr. Ernesto Marques (LaViTE- CPqAM/FIOCRUZ)].
Foram utilizados primers específicos que permitiram aincorporação de: sítios específicos de restrição, códon ATGde iniciação da tradução (em contexto com a seqüência Kozak)e códon de terminação da tradução (ver tabela 1). As reaçõesde PCR foram realizadas em volume final de 50μL contendo: IXtampão Tgo (Roche®); 0.2mM de dNTP (Invitrogen®); 0.6uM decada primer; 1 unidade da enzima Tgo DNA polimerase (Roche®);IOng de DNA molde. As amostras foram amplificadas em umtermociclador Mastercycler gradient (Eppendorf®) programadonas seguintes condições: 1- 94 0C por 2 minutos(desnaturação); 2- [94°C por 1 minuto (desnaturação); 55°Cpor 30 segundos (anelamento); 68°C por 75 segundos (extensão)- 30 ciclos (amplificação)]; 3- 68°C por 10 minutos (extensãoe finalização dos fragmentos incompletos). Os produtos de PCRforam migrados em gel de agarose para posterior purificaçãoutilizando o kit comercial QIAEX II (Qiagen®), de acordo comas recomendações do fabricante.
1.2-Clonagem dos produtos de PCR em vetor de replicação
Os produtos purificados de PCR foram em seguidasubmetidos a tratamento com a enzima Taq DNA polimerase(Invitrogen®), para a adição de adeninas livres em suasextremidades. Esta reação foi realizada em um volume final deΙΟμί contendo: IX tampão Taq polimerase (Invitrogen®); 1.5mMMgCl2; 2mM dATP (Invitrogen®) ; 5 unidades Taq DNA polimerase(Invitrogen®); 5μL do produto de PCR purificado. As amostrasforam incubadas a 12°C, durante 20 minutos, em umtermociclador Mastercycler gradient (Eppendorf®). Apóstratamento com Taq DNA polimerase (Invitrogen®), os produtosadenilados de PCR foram utilizados para clonagem no vetorpGEMT-Easy (Promega®). As reações de ligação foram realizadasutilizando o kit pGEMT-Easy vector system I (Promega®), em umvolume final de IOpL contendo: IX tampão "Rapid Ligation";50ng do vetor pGEMT-Easy; 0.4 unidades de T4 DNA ligase; 2pLdos produtos de PCR tratados. A reação de ligação foirealizada a 4°C, durante aproximadamente 15 horas. Asligações foram em seguida utilizadas para a transformação decélulas competentes, visando a confirmação das clonagens. Astransformações foram realizadas em um volume final de 80pLcontendo: 50pL de células competentes (Escherichia coli TGl);25uL de tampão de transformação (5mM MgCl2; 5mM Tris-HCl pH7.4); 5pL de cada produto de ligação. As reações detransformação foram incubadas durante 30 minutos, no gelo,sendo em seguida submetidas a choque térmico (37°C - 5minutos) e esfriadas novamente no gelo. As células foramsemeadas em placa com meio sólido de cultura Luria-Bertani(LB), contendo ampicilina na concentração de 50pg/mL eIPTG/X-Gal (IOmM de IPTG; 0.Img X-Gal). As placas foramincubadas, durante aproximadamente 15 horas a 37°C, e emseguida incubadas a 4°C durante 1 hora para facilitar adiscriminação entre clones vazios (azuis) e clones contendoinserto (brancos).
1.3-Preparação de DNA plasmidialVisando a confirmação das clonagens foram selecionadascolônias brancas, provenientes de cada ligação, parapreparação de DNA plasmidial e prova de digestão. As colôniasforam inoculadas em 2mL de meio LB liquido, contendoampicilina (50pg/mL), e crescidas durante aproximadamente 15horas a 37°C. Em seguida 1.5 mL de cada cultura foicentrifugado (13.200 RPM - 5 minutos), para a obtenção desedimento bacteriano. A partir destes "pellets" foi realizadaa extração de DNA plasmidial utilizando o kit QIAprep spinminiprep (Qiagen®), de acordo com as recomendações dofabricante. Os DNAs plasmidiais, 50yL cada, foram em seguidautilizados para a confirmação das clonagens através de provasde digestão. As reações de digestão foram realizadas em umvolume final de IOpL contendo: IX tampão de digestão; 1. 5pLde DNA plasmidial. Todas as digestões foram realizadas a37 °C, durante aproximadamente 4 horas. O vetor pGEMT-Easycontendo o fragmento PreM/M-E foi digerido com 0.01 unidadesda enzima XhoI e 0.01 unidades da enzima NotI. 0 vetor pGEMT-Easy contendo a mesma seqüência, porém com sitio de restriçãodiferente que permite a posterior inserção de LAMP, foidigerido com 0.005 unidades da enzima NheI e 0.01 unidades daenzima XhoI. Já o vetor pGEMT-Easy contendo o fragmento C-LAMP foi digerido com 0.01 unidades da enzima XhoI e 0.01unidades da enzima XbaI. A partir dos resultados dasdigestões, verificados em gel de agarose, clones positivos decada construção foram digeridos em larga escala paraposterior purificação dos fragmentos. As reações de digestãoem larga escala foram realizadas em um volume final de 50pLcontendo: IX tampão de digestão; 15pL de DNA plasmidial.Todas as digestões foram realizadas a 37°C, duranteaproximadamente 4 horas. 0 vetor pGEMT-Easy contendo ofragmento PreM/M-E foi digerido com 0.1 unidades da enzimaXhoI e 0.05 unidades da enzima NotI. 0 vetor pGEMT-Easycontendo o fragmento PreM/M-E para fusão com LAMP foidigerido com 0.05 unidades da enzima NheI e 0.1 unidades daenzima XhoI e o vetor pGEMT-Easy contendo o fragmento C-LAMPfoi digerido com 0.1 unidades da enzima XhoI e 0.1 unidadesda enzima XbaI. Em seguida cada fragmento foi purificadoatravés de extração de gel de agarose, utilizando o kit QIAEXII Gel Extraction Kit (Qiagen®).
1.4-Subclonagens PreM/M-E selvagem e PreM/M-E-LAMP no vetorP43.2
0 vetor p43.2 foi submetido a reações de digestões paracriar sítios de restrição, compatíveis com os sítios dosfragmentos PreM/M-E selvagem e PreM/M-E para a fusão comLAMP. As reações de digestão foram realizadas em duas etapas,primeiro com uma enzima e depois com outra. Para a clonagemde PreM/M-E selvagem (p/YFE) a primeira reação de digestãofoi realizada em um volume final de 50pL contendo: IX tampãode digestão; 15pL da amostra do vetor e 0.05U da enzima NotI(Biolabs®). A digestão foi realizada a 37°C, duranteaproximadamente 4 horas. Depois da digestão verificou-se seocorreu a linearização do vetor através da comparação detamanho entre a amostra digerida e o vetor intacto, ambosmigrados sob as mesmas condições em gel de agarose.
Verificada a linearização, a amostra foi precipitada cometanol e ressuspendida em um volume final de 40μL. A segundareação de digestão foi realizada em um volume final de 50pLcontendo: IX tampão de digestão; 40pL da amostra do vetor e0.1 unidades da enzima XhoI. Já para a clonagem de PreM/M-Epara a fusão com LAMP, o vetor p43.2 foi submetido a umesquema de digestão bastante similar ao do utilizado para aclonagem do fragmento selvagem, sendo que utilizando asenzimas NheI e XhoI. As digestões foram realizadas a 37 °C,durante aproximadamente 6 horas. As reações de ligação deambos os fragmentos, ao vetor p43.2, foram realizadas em umvolume final de IOyL contendo: IX tampão T 4 DNA Ligase (NewEngland Biolabs®); IOOng de vetor p43.2 (clivado comXhoI/NotI ou NheI/XhoI); 0.4 unidades de T4 DNA ligase (NewEngland Biolabs®); 3yL de cada fragmento purificado. Asreações de ligação foram realizadas a 16°C, duranteaproximadamente 20 horas. As ligações foram em seguidautilizadas para a transformação de células competentes,visando a confirmação da clonagem. Os procedimentos detransformação, preparação de DNA plasmidial e digestão foramos mesmos descritos anteriormente. Finalmente para a inserçãodo fragmento C-terminal de LAMP (C-LAMP), no vetor p43.2-PreM/M-E para a fusão com LAMP, tanto o vetor como ofragmento C-LAMP foram digeridos com as enzimas XhoI e XbaI(para a obtenção da construção pL/YFE).1.5-Sequenciamento de DNA
As construções p/YFE e pL/YFE foram submetidas aosequenciamento automático para a certificação daidentidade/qualidade das seqüências clonadas. A reação desequenciamento foi realizada em um volume final de IOyLcontendo: IX tampão "Save money" (200mM Tris-HCl/pH 9.0, 5mMMgCl2); 0.32μΜ de cada primer (de um total de 6 primersinternos); 0. 5μΙ; de solução "Bigdye" (Applied Biosystems®);200ng de DNA. As amostras foram incubadas a 95°C durante 5minutos, em um termociclador Gene AMP PCR System 9700(Applied Biosystems®), para desnaturação. Em seguida estasamostras foram submetidas aos seguintes ciclos de PCR parasequenciamento: 1- 94°C por 2 minutos (desnaturação inicial);2- [94°C por 15 segundos (desnaturação); 50°C por 10 segundos(anelamento); 60°C por 4 minutos (extensão) - 45 ciclos]. Asamostras foram precipitadas em isopropanol 65%, lavadas cometanol 60% e ressuspendidas em 15pL de formamida (AppliedBiosystems®). As amostras foram sequenciadas no NúcleoIntegrado de Tecnologia (NIT) do CPqAM, utilizando osequenciador automático de DNA ABI Prism 3100 (AppliedBiosystem®), de acordo com os padrões previamenteestabelecidos nesta unidade.
EXEMPLO 2: Cultivo, infecção e transfecção de célulaseucarióticas
Células eucarióticas 2 93 foram cultivadas em meio DMEM(Invitrogen®) acrescido de: 10% soro bovino fetal (Gibco®);1% penicilina/estreptomicina (Gibco®); 1% L-glutamina(Sigma®). Estas células foram utilizadas tanto para ensaiosde infecção viral, como para os experimentos de transfecção.
Após atingirem uma confluência de aproximadamente 90%, ascélulas foram infectadas com um extrato viral de VFA naconcentração de 0.36 χ IO6 Unidades Formadoras de Placa - PFUgentilmente cedido pela Dra. Marli Tenório (CPqAM/LaViTE).Para a infecção, as células foram inicialmente incubadas como extrato VFA puro (1 hora /37°C /5% de CO2), sendo acrescidoem seguida meio DMEM completo para a manutenção celular. Ascélulas infectadas permaneceram nas mesmas condições deincubação (37°C/5% de CO2) , durante 48 horas, até apresentaremos efeitos citopatológicos provocados pelo virus. Para osensaios de transfecção, as células 293 foram crescidas nasmesmas condições supracitadas. Em seguida foram incubadas com0.8μg de cada DNA (p/YFE e pL/YFE), utilizando como controlenegativo o p43.2 vazio e como controle positivo o generepórter da β-galactosidase. As reações de transfecção foramrealizadas utilizando o kit Lipofectamine 2000 (Invitrogen®),seguindo as recomendações do fabricante. As célulastransfectadas foram incubadas (48 horas /37°C/5% de CO2) eprocessadas para a avaliação da eficiência de transfecção,pela atividade de expressão do gene repórter. Para a reaçãode coloração do β-gal, as células foram inicialmente lavadasem IX PBS e fixadas em solução 0.2% glutaraldeído/PBS. Emseguida as células fixadas foram incubadas em um volume finalde ImL de uma solução contendo: 20mg de X-Gal; 0.005M deferriciamida de potássio; 0.005M de ferrociamida de potássio;0.002M de MgCl2 em IX PBS, para o desenvolvimento de coloraçãopela atividade de β-gal.
EXEMPLO 3: Transfecção e análise de expressão por imunofluorescência.
Células 293 foram cultivadas em laminulas etransfectadas com as construções vacinais obtidas, utilizandoo kit Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life Technologies®). 0vetor p43.2 vazio foi utilizado como controle negativo. Astransfecções foram realizadas em placas de cultura de 24poços com 2.5yg de cada plasmídeo e ΙΟμΙ de lipofectamina, deacordo com as instruções do fabricante. As células foramincubadas 48 horas e em seguida fixadas em 100% metanol a -20°C durante 5 minutos, bloqueadas em solução 1% BSA/PBS por30 minutos, e incubadas com o anticorpo policlonal anti-FebreAmarela (produzido em camundongos, no biotério do CPqAM) nadiluição de 1:200. Foi utilizado o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado ao fluocromo Alexa 488, produzidoem cabra, na diluição de 1:500 (Molecular Probes, Seattle,USA). Em seguida as laminulas foram montadas em lâminasutilizando o meio "ProLong gold" (Molecular Probes, Seattle,USA) e observada ao microscópio confocal. As imagens foramobtidas ao microscópio confocal Leica SPII-AOBS (LeicaMicrosystem, Hm®), utilizando a objetiva 63 X NA 1.3mergulhada em óleo de imersão. 0 fluocromo Alexa 488 foiexcitado utilizando o laser ArKr no comprimento de onda de488nm e a imagem digital capturada utilizando o softwareLeica, no formato RGB de 24 bit, numa área de 1024 X 1024pixels. Os campos de captura foram escolhidos de acordo com adispersão e morfologia das células.
EXEMPLO 4: Avaliação da resposta imune induzida emcamundongos imunizados com as vacinas p/YFE e pL/YFE4.1-0btenção dos vetores vacinais em larga escala
As construções codificando a proteínas virais E selvagem(p/YFE) e proteína E fusionada a Proteína de Associação aMembrana Lisossomal - LAMP (pL/YFE), foram submetidas àpreparação de DNA plasmidial em larga escala. Alíquotas decada DNA foram utilizadas para transformar célulascompetentes (E.coli TGl). Em seguida, uma colônia isolada decada placa foi escolhida para ser inoculada em 12ml de meioLB líquido, contendo ampicilina (50yg/ml), e crescidas poraproximadamente 8 horas a 370C sob vigorosa agitação. Apóseste tempo, cada cultura foi inoculada em 2.5 litros de meioLB/ampicilina e crescida a 37°C por 16 horas sob vigorosaagitação. Em seguida, a cultura foi centrifugada (8.000 RPM -15 minutos) para a obtenção do sedimento bacteriano. A partirdeste "pellet", foi realizada e extração do DNA plasmidial(em condições livre de endotoxinas) utilizando o kitcomercial Endofree Plasmid Giga Kit (Qiagen®) de acordo comas recomendações do fabricante. Os DNAs plasmidiais foramsubmetidos a provas de digestão em um volume final de IOpLcontendo: IX tampão de digestão, IpL de cada DNA plasmidial eenzimas de restrição especificas. As digestões foramrealizadas a 37°C, durante aproximadamente 4 horas.
4.2-Animais e protocolos de imunização
Para testes de neutralização e proteção, camundongosfêmeas BALB/c e C57B1/6 com 3 semanas de vida foramimunizados nos dias 0, 30 e 45. Um dia antes de cadaimunização foram coletadas amostras de soro de cada animal.
Os camundongos foram imunizados na base da cauda com a vacinado virus atenuado 17DD à IOh PFU/50pl (controle positivo),vacinas de DNA p/YFE e pL/YFE (ambas na concentração de50pg/50pl), assim como com o vetor vazio e PBS (controlesnegativos). Todos os procedimentos foram realizados de acordocom as exigências do Comitê de Ética para Uso de Animais(CEUA), de acordo com o protocolo P-0259-05 aprovado por estacomissão.
4.3-Testes de neutralização em placa
Para a análise dos títulos de anticorpos neutralizantesinduzidos, pelas vacinações com 17DD e com as construçõesp/YFE e pL/YFE, foram realizados ensaios de neutralizaçãoviral por redução de placas (PRNT). Estes ensaios foramrealizados utilizando as amostras de soro dos camundongosBalb/c e C57B1/6 coletadas antes e depois das vacinações. Ostestes de neutralização foram avaliados pela redução daformação de placas do virus da Febre Amarela, cultivados emcélulas Vero. Após a inativação do soro (30 min/56°C),diluições seriadas do soro foram incubadas com 50-100 PFU devirus por 30 min a 37°C, e adicionadas em placas de 6 poçoscontendo células Vero. Após 1 hora de incubação, o inóculofoi removido e adicionado meio semi-sólido contendo agarose.Após uma incubação de 8 dias as placas foram fixadas, e aformação de placas virais foi detectada através de ensaio comimuno-peroxidase. O teste de neutralização por redução deplacas foi definido pela diluição na qual o número de placasfoi reduzido em 50%, PRNT50, quando comparado com o controle.4.4-Ensaios de avaliação de proteção
Camundongos Balb/c e C57B1/6 imunizados 3 vezes com avacina 17DD, ou com as vacinas de DNA, foram utilizados nosensaios de proteção. Os animais foram desafiados através deinóculo intracerebral, contendo 10.000 PFU do virus 17DD, 15dias após a última imunização. Os animais foram monitoradosdurante 21 dias para avaliação de sintomas de neurovirulênciae mortalidade. Os animais morimbundos foram sacrificados pelaexposição a CO2.
EXEMPLO 5: Otimização do vetor pL/YFE através do algoritmogenético.
Para melhorar a eficiência de expressão do antigenocodificado pela vacina pL/YFE em células eucarióticas, jávisando experimentos futuros em modelos primatas, a seqüênciade DNA que codifica a proteína preM/M-Env foi otimizadautilizando o algoritmo genético. Esta seqüência foianalisada/otimizada com relação a características como "codonusage", estrutura secundária do RNA mensageiro (mRNA),distribuição do conteúdo de GC, motivos repetitivos de DNA,sítios de restrição, sítios críticos de "Splicing", etc. Aseqüência otimizada foi subclonada no vetor 8L, gerando aconstrução p8L/YFEopt.<table>table see original document page 36</column></row><table>Tabela 2 - Resultados do teste de proteção em camundongosBALB/c e C57B1/6 comparando a vacina 17DD com a vacina de DNApL/YFE.
<table>table see original document page 37</column></row><table>
Tabela 3 - Comparação dos níveis de expressão das proteínasdo envelope de Febre Amarela, selvagens e otimizadas, porcitometria de fluxo.
<table>table see original document page 37</column></row><table>A vacina de vírus-atenuado 17DD é a única formulaçãodisponível para proteger humanos contra a infecção causadapelo Vírus da Febre Amarela (VFA), importante fonte demorbidade e mortalidade nas áreas tropicais do mundo. Apesardo sucesso da vacinação em massa com a vacina 17DD, que écapaz de induzir tanto resposta duradoura por anticorposneutralizantes como resposta citotóxica por células T, casosgraves adversos em conseqüência da vacinação contra a FebreAmarela vem sendo sistematicamente reportados na literatura.
Em alguns casos a vacinação foi diretamente associada com oaumento da severidade sintomatológica, podendo até culminarcom reações fatais. Diante deste cenário o desenvolvimento denova estratégia de vacinação, como vacinas de DNA codificandoseqüências virais específicas, é de fundamental importânciapara o desenvolvimento de estratégias vacinais ainda maisseguras.
A vacina de DNA contra a Febre Amarela, de acordo com apresente invenção, está baseada na seqüência que codifica aproteína do envelope de VFA (p/YFE). Além da construçãoselvagem p/YFE, a seqüência E foi ainda fusionada à seqüênciaque codifica a Proteína de Associação à Membrana Lisossomalhumana (h-LAMP) gerando a construção (pL/YFE). A fusão comLAMP tem como finalidade direcionar o antígeno para a via dedegradação/apresentação antigênica MHCII, pois váriostrabalhos vêm demonstrando que os antígenos fusionados aoLAMP (antígeno/LAMP) são capazes de gerar uma maior atividadeproliferativa de linfócitos antígeno-específicos, altostítulos de anticorpos e intensa atividade T-citotóxica emrelação aos antígenos selvagens não fusionados ao LAMP.A presente invenção tem como finalidade otimizar avacina de DNA contra VFA, p8L/YFEopt, para torná-la capaz deproteger humanos contra a infecção causada por VFA. 0desenvolvimento deste tipo de tecnologia tem como finalidadegerar uma vacina ainda mais segura que a vacina 17DD, quepoderá revolucionar a estratégia de vacinação contra VFA noBrasil e no mundo. Finalmente, as estratégias utilizadas paraa construção desta vacina de DNA poderão ainda servir desubsidio para o desenvolvimento de outras vacinas virais,principalmente contra outros flavivirus como os virusEncefalite Japonesa, Febre do Oeste do Nilo e Dengue.Listagem de Seqüência
<HQ> Fundação Os&aldo Cruz
<120> VAGXKA DE BKA COKTRA O VÍRUS DA FESRE AMARELA<i3o> piim<160> 12
<17ü> Patentln version 3.5
<210> 1<211> 42<212> DNA
<213> vellow fever vírus<400> 1
accgctcgag gccaccatgg gaggattgtc ctcaaggaaa cg
<210> 2<211> 37<212> DNA
<213> Yellow fever vtfus<400> 2
accggcggcc gctcagttca agccgccaaa tagcccc
<210> 3<211> 42<212> DNA
<213> Yellcw fever virus<400> 3
accggctagc gccaccatgg gaggattgtc ctcaaggaaa cg
<210> 4<211> 32<212> DNA
<213> Yellow fever virus<400> 4
accgctcgag gttcaagccg ccaaatagcc cc
<210> 5<211> 32<212> DNA
<213> Yellow fever virus<400> 5
accgctcgag acgctgatcc ccatcgctgt gg
<210> 6<211> 39<212> DNA
<213> Yellow fever virus<400> 6
accgtctaga ctagatagtc tggtagcctg cgtgactcc
<210> 7
<211> 19S3
<212> DNA
<213> Yellow fever virus<400> 7
ctcgaggcca ccatgggagg attgtcctca aggaaacgcc gttcccatga tgttctgact 50
gtgcaattcc taattttggg aatgctgttg atgacgggtg gagtgacctt ggtgcggaaa 120
aacagatggt tgctectaaa tgtgacatet gaggacctcg ggaaaacatt ctctgtgggc 180
acaggcaact gcacaacaaa cattttggaa gccaagtact ggtgcccaga ctcaatggaa 240
taeaactgtc ccaatctcag tecgagagag gagccagatg acattgattg ctggtgctat 300
ggggtggaaa acgttagagt cgcatatggt aagtgtgact cagcaggcag gtctaggagg 350
tcaagaaggg ccattgactt gcctaegeat gaaaaccatg gtttgaagac ccggcaagaa 420
aaatggatga ctggaagaat gggtgaaagg caactccaaa agattgagag atggttcgtg 480
aggaacccct tttttgcagt gacagctctg accattgcct accttgtggg aagcaacatg 540
acgcaacgag tcgtgattgc cctactggtc ttggctgttg gtccggccta ctcagctcac 600
tgcattggaa ttactgacag ggatttcatt gagggggtgc atggaggaac ttgggtttca 660
gctaccctgg agcaagacaa gtgtgtcact gttatggccc ctgacaagcc ttcattggac 720
atctcactag agacagtagc cattgataga cctgctgagg cgaggaaagt gtgttacaat 780
gcagttctca ctcatgtgaa gattaatgac aagtgcccca gcactggaga ggcccaccta 840
gctgaagaga acgaagggga caatgcgtgc aagcgcactt attctgatag aggctggggc 300
aatggctgtg gcctatttgg gaaagggagc attgtggcat gcgccaaatt cacttgtgcc 960
aaatecatga gtttgtttga ggttgatcag accaaaattc agtatgtcat cagagcacaa 1020
ttgcatgtag gggccaagca ggaaaattgg aataccagca ttaagactct caagtttgat 1080
gccctgtcag gctcccagga agtcgagttc attgggtatg gaaaagctac actggaatgc 1140
caggtgcaaa ctgcggtgga ctttggtaac agttacatag ctgagatgga aacagagagc 1200
tggatagtgg acagacagtg ggcccaggac ttgaccctgc catggcagag tggaagtggc 1260
ggggtgtgga gagagatgca tcatcttgtc gaatttgaac ctccgcatgc cgccactatc 1320
agagtactgg ccctgggaaa ccaggaaggc tccttgaaaa cagctcttac tggcgcaatg 1380
agggttacaa aggacacaaa tgacaacaac ctttacaaac tacatggtgg acatgtttct 1440
tgcagagtga aattgtcagc tttgacactc aaggggacat cctacaaaat atgcactgac 1500
aaaatgtttt ttgtcaagaa cccaactgac actggccatg gcactgttgt gatgcaggtg 1560
aaagtgccaa aaggagcccc ctgcaggatt ccagtgatag tagctgatga tettacagcg 1620
gcaatcaata aaggcatttt ggttacagtt aaccccatcg cctcaaccaa tgatgatgaa 1680
gtgctgattg aggtgaaccc accttttgga gacagctaca ttatcgttgg aagaggagat 1740
tcacgtctca cttaccagtg gcacaaagag ggaagctcaa taggaaagtt gttcactcag 1800
accatgaaag gcgtggaacg cctggccgtc atgggagaeg tcgcctggga tttcagctcc 1860
gctggagggt tcttcacttc ggttgggaaa ggaattcata cggtgtttgg ctctgccttt 1920
caggggctat ttggcggctt gaactgatct aga 1953
<210> 8<211> 2067<212> DWA
<213> Yellcw fever vírus<400> 8
gctagegcca ccatgggagg attgtcctca aggaaacgec gtteccatga tgttctgaet 60
gtgcaattcc taattttggg aatgctgttg atgacgggtg gagtgacctt ggtgcggaaa 120
aacagatggt tgetcetaaa tgtgacatct gaggacctcg ggaaaacatt ctctgtgggc ISO
acaggcaact gcacaacaaa cattttggaa gccaagtact ggtgcccaga ctcaatggaa 240
tacaactgfce ccaatctcag tccgagagag gagccagatg acattgattg ctggtgctat JQO
ggggtggaaa acgttagagt cgcatatggt aagtgtgact cagcaggcag gtctaggagg 360
tcaagaaggg ccattgactt gcctacgcat gaaaaccatg gtttgaagac ccggcaagaa 420
aaatggatga ctggaagaat gggtgaaagg caactccaaa agattgagag atggttcgtg 480
aggaacccct tttttgcagt gacagctctg âccattgect accttgtggg aagcaacatg 540
acgcaacgag tcgtgattgc cctactggtc ttggctgttg gtccggccta ctcagctcac 600
tgcattggaa ttactgacag ggatttcatt gagggggtgc atggaggaac ttgggtttca 660
gctaccctgg agcaagacaa gtgtgtcact gttatggccc ctgacaagcc ttcattggac 720
atctcactag agacagtagc cattgataga eetgctgagg cgaggaaagt gtgttacaat 780
gcagttctca ctcatgtgaa gattaatgac aagtgcccca gcactggaga ggcccaccta 840
gctgaagaga acgaagggga caatgegtge aagcgeactt attctgatag aggctggggc 900
aatggctgtg gcctatttgg gaaagggagc attgtggcat gcgccaaatt cacttgtgcc 960
aaatccatga gtttgtttga ggttgatcag aceaaaattc agtatgtcat cagagcacaa 1020
ttgcatgtag gggccaagca ggaaaattgg aataccagca ttaagactct caagtttgat 1080
gccctgtcag gctcccagga agtcgagttc attgggtatg gaaaagctac actggaatgc 1140
caggtgcaaa ctgcggtgga ctttggtaac agttacatag ctgagatgga aacagagagc 1200
tggatagtgg acagacagtg ggcccaggac ttgaccctgc catggcagag tggaagtggc 1260
ggggtgtgga gagagatgca tcatcttgtc gaatttgaac ctccgcatgc cgccactatc 1320
agagtactgg ccctgggaaa ceaggaaggc tccttgaaaa cagctcttac tggcgcaatg 1380
agggttacaa aggacacaaa tgacaacaac ctttacaaac tacatggtgg acatgtttct 1440
tgcagagtga aattgtcagc tttgaeactc aaggggacat cctacaaaat atgcactgac 1500
aaaatgtttt ttgtcaagaa cccaactgac actggccatg gcactgttgt gatgcaggtg 1560
aaagtgccaa aaggagecec etgcaggatt ccagtgatag tagctgatga tcttacagcg 1620
gcaatcaata aaggcatttt ggttacagtt aaccccatcg cctcaaccaa tgatgatgaa 1680
gtgctgattg aggtgaaccc accttttgga gacagctaca ttatcgttgg aagaggagat 1740
tcacgtctca cttaccagtg gcacaaagag ggaagctcaa taggaaagtt gttcactcag 1800
accatgaaag gcgtggaacg cctggccgtc atgggagacg tcgcctggga tttcagctcc 1860
gctggagggt tcttcacttc ggttgggaaa ggaattcata cggtgtttgg ctctgccttt 1920
caggggctat ttggcggctt gaacctcgag acgctgatcc ccatcgctgt gggtggtgcc 1980ctggcggggc tggtccteat egtcctcate geetacctcg tcggcaggaa gaggagtcac 2040
gcaggctacc agactatcta gtctaga 2067
<210> 9<211> 2079<212> DNA
<213> YeRow fever vírus<400> 9
gtcgacgcta gcaccatgga actcgagggc ggcctgagca gecggaagcg gcggagccae 60
gacgtgctga ccgtgcagtt cctgatcctg ggcatgctgc tgatgacagg cggcgtgacc 120
ctggtgegga agaaccggtg gctgctgetg aacgfegaeca gcgaggaeet gggcaagacc 180
ttcagcgtgg gcaccggcaa ctgcaccacc aacatcctgg aagccaagta ctggtgcccc 240
gacagcatgg aataeaactg ccccaacctg agccccagag aggaacccga cgacatcgae BOO
tgctggtgct acggcgtgga gaacgtgcgg gtggcctacg gcaagtgcga cagcgccggc 360
agaagccggc ggtccagacg cgctattgat ctceecaccc acgagaacca cggcetgaaa 420
acccggcagg aaaagtggat gaccggccgg atgggcgagc ggeagctgca gaagatcgag 480
cgctggtteg tgeggaaccc cttcttcgcc gtgaccgece tgaeaatcge ctaccfeggtg 540
ggcagcaaca tgacccagcg ggtggtgatc gccctgctgg tgctggccgt gggccctgcc 600
tacagcgccc actgeategg cateaecgae cgggacttca tegagggcgt gcacggcggc 660
acatgggtgt ccgccaccct ggaacaggac aagtgcgtga ccgtgatggc ccccgacaag 720
cccagcctgg aeateagect ggaaaccgtg geeatcgaea gacecgecga ggeccggaaa 780
gtgtgctaca acgccgtgct gacccaegtg aagatcaacg ataaatgtcc ctccacagga 840
gaagctcaec tggccgagga aaacgagggc gacaacgect gcaagcggac ctacagcgae 900
cggggctggg gcaatggctg cggcctgttc ggcaagggca gcatcgtggc ctgcgccaag 960
ttcacctgtg ccaagagcat gagectgttc gaggtggaec agaccaagat ccagtacgtg 1020
atccgggccc agctgcacgt gggcgccaag caggaaaact ggaacaccag catcaagacc 1080
ctgaagttcg acgcectgag cggcagccag gaagtggagt tcatcggcta cggcaaggcc 1140
acactggaat gccaggtgca gaccgccgtg gacttcggca acagctatat cgccgagatg 1200
gaaaccgaga getggatcgt ggaccggcag tgggcccagg acetgaccet gecctggcag 1260
agcggcagcg gcggagtgtg gcgggagatg caccacctgg tggagttcga gcccccccac 1320
gccgccacca tccgggtgct ggccetgggg aaccaggaag gctecctgaa aacagctctc 1380
acaggggcta Igcgggtgae caaggacacc aacgacaaca aectgtaeaa gctgcacggc 1440
gggcacgtga gctgecgggt gaagctgtcc gccctgaccc tgaagggcac cagctacaag 1500
atctgcaccg acaagatgtt cttcgtgaag aaccccaccg acaccggcca cggcaccgtg 1560
gtgatgcagg tgaaggtgcc caaaggcgcc ccttgccgga tccccgtgat cgtggccgac 1620
gacctgacag ccgccatcaa caagggcatc ctggtgaccg tgaaccctat cgccagcacc 1680
aacgacgacg aggtgctgat cgaggtgaac ccccccttcg gcgactccta catcategtg 1740ggcaggggcg acagccggct gaectaccag tggcacaaag agggcagcag catcggcaag 1800
ctgttcaccc agacaatgaa gggcgtggag cggctggccg tgatggggga cgtggcctgg 1860
gacttcagct ctgeeggcgg attettcace tccgtgggca agggcattca caeegtgtte 1920
ggeagcgect tccagggcct gtttggcggc ctgaacgaat tcacgctgat ccccatcgct 1980
gtgggtggtg eeetggeggg gctggtcctc ategtcetca tcgcctacct cgtcggcagg 2040
aagaggagtc acgcaggcta ccagactatc tagggtacc 2079
<210> 10<211> 3208<212> DNA
<213> Yellow fever virus<400> 10
gtcgactagc atggcgeccc gcagcgcccg gcgacceetg ctgctgctae tgetgttgct 50
gctgctcggc ctcatgcatt gtgcgtcagc agcaatgttt atggtgaaaa atggcaacgg 120
gaccgcgtge ataatggcca acttctctgc tgccttctca gtgaactacg aeaceaagag 180
tggccctaag aacatgaccc ttgacctgec atcagatgcc acagtggtgc tcaaccgcag 240
ctcctgtgga aaagagaaca cttctgaccc eagtctcgtg attgcttttg gaagaggaea 300
tacactcact ctcaatttca cgagaaatgc aacacgttac agcgttcagc tcatgagttt 360
tgtttataae ttgtcagaea cacacetttt ccccaatgcg agctccaaag aaatcaagac 420
tgtggaatct ataactgaca tcagggcaga tatagataaa aaatacagat gtgttagtgg 480
cacccaggtc cacatgaaca aegtgaccgt aacgctccat gatgccacca tccaggcgta S40
cctttccaac agcagcttca gcaggggaga gacacgctgt gaacaagaca ggccttcccc 600
aaccacagcg cccectgcgc cacccagccc ctcgccctca cecgtgccca agagcceete 660
tgtggacaag tacaacgtga gcggcaccaa cgggacctgc ctgctggcca gcatggggct 720
gcagctgaac ctcaectatg agaggaagga caacacgacg gtgacaaggc ttctcaacat 780
caaccccaac aagacctcgg ccagcgggag ctgcggcgcc cacctggtga ctctggagct 840
gcacagcgag ggcaccaccg tcctgctett ccagttcggg atgaatgcaa gttctagccg 900
Stttttccta caaggaatcc agttgaatac aattcttcct gacgccagag accctgcctt 960
taaagctgcc aacggctccc tgcgagcgct gcaggccaca gtcggcaatt cctacaagtg 1020
caacgcggag gagcacgtcc gtgtcacgaa ggcgttttca gtcaatatat tcaaagtgtg 1080
ggtccaggct tteaaggtgg aaggtggcca gtttggctct gtggaggagt gtctgctgga 1140
cgagaacagc ctcgagggcg gcctgagcag ccggaagcgg cggagccacg acgtgctgac 1200
cgtgcagttc ctgatcctgg gcatgctgct gatgacaggc ggcgtgaccc tggtgcggaa 1260
gaaccggtgg ctgctgctga acgtgaccag cgaggacctg ggcaagacct tcagcgtggg 1320
caccggcaac tgcaccacca acatcctgga agccaagtac tggtgccccg acagcatgga 1380
atacaactgc cccaacctga gccccagaga ggaacccgac gacatcgact gctggtgcta 1440
cggcgtggag aacgtgcggg tggcctacgg caagtgcgac agcgccggca gaagccggcg 1S00
gtccagacgc gctattgatc tccccaccca cgagaaccac ggcctgaaaa cccggcagga 1560aaagtggatg accggccgga tgggcgagcg gcagctgcag aagatcgagc gctggttcgt 1620
gcggaacccc ttcttcgccg tgaccgccct gacaatcgcc tacctggtgg gcagcaacat 1680
gacccagcgg gtggtgatcg ccctgctggt gctggccgtg ggccctgcct acagcgccca 1740
ctgcatcggc atcaccgacc gggacttcat cgagggcgtg cacggcggca catgggtgtc 1800
cgccaccctg gaacaggaca agtgcgtgac cgtgatggcc cccgacaagc ccagcctgga 1860
catcagcctg gaaaccgtgg ccatcgacag acccgccgag gcccggaaag tgtgctacaa 1920
cgccgtgctg acccacgtga agatcaacga taaatgtccc tceacaggag aagctcacct 1980
ggccgaggaa aacgagggcg acaacgcctg caagcggacc tacagcgacc ggggctgggg 2040
caatggctgc ggectgttcg gcaagggcag catcgtggcc tgcgccaagt tcacctgtgc 2100
caagagcatg agcctgttcg aggtggacca gaccaagatc cagtacgtga tccgggccca 2160
gctgcacgtg ggcgccaagc aggaaaactg gaacaccagc atcaagaccc tgaagttcga 2220
cgccctgagc ggcagccagg aagtggagtt catcggctac ggcaaggcca cactggaatg 2280
ccaggtgcag accgccgtgg acttcggcaa cagctatatc gccgagatgg aaaccgagag 2540
ctggatcgtg gaccggcagt gggcccagga cctgaccctg ccctggcaga gcggcagcgg 2400
cggagtgtgg cgggagatge accacctggt ggagttcgag cccccccacg ccgccaccat 2460
ccgggtgctg gccctgggga accaggaagg ctccctgaaa acagctctca caggggctat 2520
gcgggtgacc aaggacacca acgacaaeaa cctgtacaag etgeacggcg ggcacgtgag 2580
ctgccgggtg aagctgtccg ccctgaccct gaagggcacc agctacaaga tctgcaccga 2640
caagatgttc ttegtgaaga accecaccga caccggccac ggcaccgtgg tgatgcaggt 2700
gaaggtgccc aaaggcgccc cttgccggat ccccgtgatc gtggccgacg acctgacagc 2760
cgccatcaac aagggcatcc tggtgaccgt gaaccctatc gccagcacca acgacgacga 2820
ggtgctgatc gaggtgaacc cccccttcgg cgactcctac atcatcgtgg gcaggggcga 2880
cagccggctg aectaccagt ggcacaaaga gggcagcagc atcggcaagc tgttcaccca 2940
gacaatgaag ggcgtggagc ggctggccgt gatgggggac gtggcctggg acttcagctc 3000
tgccggcgga ttcttcacct ccgtgggcaa gggcattcac accgtgttcg gcagcgcctt 3060
ccagggcctg tttggcggcc tgaacgaatt cacgctgatc cccatcgctg tgggtggtgc 3120
cctggcgggg etggtcctca tcgtcctcat cgcctacctc gtcggcagga agaggagtca 3180
cgcaggctac cagactatct agggtacc 3208
<210> 11<211> 2079<212> DNA
<213> ΥβΠ<»# fever vírus<400> 11
gtcgacgcta gcaccatgga actcgaggga gggctgagca gcagaaaacg acggagccat 60
gatgtgctga ctgtgcagtt tctgatcctt gggatgctgc tgatgacggg aggcgtgaca 120
cttgtgagga agaataggtg gctgctgctc aatgtgactt ccgaggacct ggggaaaacc 180tttagcgtgg gaacgggtaa ctgtaccaca aacatactcg aagctaagta ctggtgccca 240
gattcaatgg agtacaattg tccaaacctg agcccgaggg aagaacctga tgacatagac 300
tgctggtgct acggagtcga aaacgtcaga gtggcttacg gtaagtgcga cagcgcagga 360
cgcagecgtc ggagtaggag agctatagac ctgccgacac acgagaacca cggcttgaaa 420
acacggcagg agaagtggat gacaggcagg atgggagaga gacaactgca aaagatcgag 480
cggtggttcg ttcggaatcc cttcttcgca gttacggcgc tgactatagc ctatttggtg 540
ggctccaaca tgactcagag agtggtgata gcccttctgg ttctggccgt ggggcccgcc 600
tatagcgccc actgcatcgg gattaccgac agggatttca ttgaaggcgt gcacggaggc 660
acctgggtgt ctgceacact cgaacaggat aagtgcgtga cagttatggc acccgacaaa 720
cctagccttg atatcagttt ggaaaccgtc gcgatagacc gtcctgccga ggccaggaaa 780
gtgtgctaca acgctgtgct gacgcacgtg aagatcaacg ataagtgtcc ctctacaggc 840
gaagcgcacc tggcagagga gaacgagggg gacaacgcct gcaagcgcac ttacagcgac 900
aggggttggg gaaacggctg tggcctgttt ggeaaaggtt ccatcgttgc ttgtgctaag 960
ttcacctgtg ccaaatccat gtcacttttc gaggtggatc agactaagat tcaatacgtg 1020
attcgagcac agctgcacgt gggagcgaaa caagagaact ggaatacctc aatcaagact 1080
ctgaagttcg acgcactgag tggtagccag gaagtcgagt ttatcggcta cgggaaagca 1140
accctggagt gtcaggtgca gacagcagtg gactttggga atagctacat agcagagatg 1200
gaaacagaat cctggatcgt ggaccgtcag tgggctcagg atctgaccct tccttggcaa 1260
agtggatcag gcggtgtgtg gagagagatg catcacttgg ttgaatttga gccaccgcac 1320
gctgctacca ttcgggtcct ggccttgggc aatcaggagg gcagtctgaa aactgccctg 1380
accggagcca tgcgggtgac aaaagatacg aacgacaaca acctctacaa actgcacggc 1440
ggacacgtca gctgcagagt gaaactgtca gcactgacct tgaaggggac tagctacaag 1500
atttgcacag ataagatgtt cttcgtgaag aatcccactg atactgggca cggcactgtg 1560
gtgatgcaag tgaaggtccc aaagggagcc ccttgtcgaa tccctgtgat tgtggctgac 1620
gatctgaccg ctgctatcaa caaaggaatc ctggttaccg tgaatcccat cgcgagtaca 1680
aacgacgacg aagtcctgat cgaggtgaat ccaccctttg gcgacagcta catcattgtc 1740
gggaggggag acagcaggct gacgtatcag tggcacaaag aagggtcctc aatcgggaag 1800
ctgtttaccc agacaatgaa aggcgtggag cgactggccg tgatgggaga cgtggcctgg 1860
gacttctcca gtgccggcgg cttctttacc tccgtgggca agggaatcca taccgtgttt 1920
ggctcagcct ttcagggact gtttggtggt ttgaacgaat tcacgctgat ccccatcgct 1980
gtgggtggtg ccctggcggg gctggtcctc atcgtcctca tcgcctacct cgtcggcagg 2040
aagaggagtc acgcaggcta ccagactatc tagggtacc 2079
<210> 12<211> 3208<212> DNA
<213> YelTos fever vírus<400> 12
gtcgactagc atggcgcccc gcagcgcccg gcgacccctg ctgctgctac tgctgttgct 60
gctgctcggc ctcatgcatt gtgcgtcagc agcaatgttt atggtgaaaa atggcaacgg 120
gaccgcgtgc ataatggcca acttctctgc tgccttctca gtgaactacg acaccaagag 180
tggccctaag aacatgaccc ttgacctgcc atcagatgcc acagtggtgc tcaaccgcag 240
ctcctgtgga aaagagaaca cttctgaccc cagtctcgtg attgcttttg gaagaggaca 300
tacactcact ctcaatttca cgagaaatgc aacacgttac agcgttcagc tcatgagttt 360
tgtttataac ttgtcagaca cacacctttt ccccaatgcg agctccaaag aaatcaagac 420
tgtggaatct ataactgaca tcagggcaga tatagataaa aaatacagat gtgttagtgg 480
cacccaggtc cacatgaaca acgtgaccgt aacgctccat gatgccacca tccaggcgta 540
cctttccaac agcagcttca gcaggggaga gacacgctgt gaacaagaca ggccttcccc 600
aaccacagcg ccccctgcgc cacccagccc ctcgccctca cccgtgccca agagcccctc 660
tgtggacaag tacaacgtga gcggcaccaa cgggacctgc ctgctggcca gcatggggct 720
gcagctgaac ctcacctatg agaggaagga caacacgacg gtgacaaggc ttctcaacat 780
caaccccaac aagacctcgg ccagcgggag ctgcggcgcc cacctggtga ctctggagct 840
gcacagcgag ggcaccaccg tcctgctctt ccagttcggg atgaatgcaa gttctagccg 900
gtttttccta caaggaatcc agttgaatac aattcttcct gacgccagag accctgcctt 960
taaagctgcc aacggctccc tgcgagcgct gcaggccaca gtcggcaatt cctacaagtg 1020
caacgcggag gagcacgtcc gtgtcacgaa ggcgttttca gtcaatatat tcaaagtgtg 1080
ggtccaggct ttcaaggtgg aaggtggcca gtttggctct gtggaggagt gtctgctgga 1140
cgagaacagc ctcgagggag ggctgagcag cagaaaacga cggagccatg atgtgctgac 1200
tgtgcagttt ctgatccttg ggatgctgct gatgacggga ggcgtgacac ttgtgaggaa 1260
gaataggtgg ctgctgctca atgtgacttc cgaggacctg gggaaaacct ttagcgtggg 1320
aacgggtaac tgtaccacaa acatactcga agctaagtac tggtgcccag attcaatgga 1380
gtacaattgt ccaaacctga gcccgaggga agaacctgat gacatagact gctggtgcta 1440
cggagtcgaa aacgtcagag tggcttacgg taagtgcgac agcgcaggac gcagccgtcg 1500
gagtaggaga gctatagacc tgccgacaca cgagaaccac ggcttgaaaa cacggcagga 1560
gaagtggatg acaggcagga tgggagagag acaactgcaa aagatcgagc ggtggttcgt 1620
tcggaatccc ttcttcgcag ttacggcgct gactatagcc tatttggtgg gctccaacat 1680
gactcagaga gtggtgatag cccttctggt tctggccgtg gggcccgcct atagcgccca 1740
ctgcatcggg attaccgaca gggatttcat tgaaggcgtg cacggaggca cctgggtgtc 1800
tgccacactc gaacaggata agtgcgtgac agttatggca cccgacaaac ctagccttga 1860
tatcagtttg gaaaccgtcg cgatagaccg tcctgccgag gccaggaaag tgtgctacaa 1920
cgctgtgctg acgcacgtga agatcaacga taagtgtccc tctacaggcg aagcgcacct 1980
ggcagaggag aacgaggggg acaacgcctg caagcgcact tacagcgaca ggggttgggg 2040
aaacggctgt ggcctgtttg gcaaaggttc catcgttgct tgtgctaagt tcacctgtgc 2100caaatccatg tcacttttcg aggtggatca gactaagatt caatacgtga ttcgagcaca 2160
gctgcacgtg ggagcgaaac aagagaactg gaatacctca atcaagactc tgaagttcga 2220
cgcactgagt ggtagccagg aagtcgagtt tatcggctae gggaaagcaa ccctggagtg 228G
tcaggtgcag acagcagtgg actttgggaa tagctacata gcagagatgg aaacagaatc 2340
ctggatcgtg gaccgtcagt gggctcagga tctgaccctt ccttggeaaa gtggatcagg 2400
cggtgtgtgg agagagatgc atcacttggt tgaatttgag ccaccgcacg ctgctaccat 2460
tcgggtcctg geettgggca atcaggaggg cagtctgaaa aetgccctga ccggagccat 2520
gcgggtgaca aaagatacga acgacaacaa cctctacaaa ctgcacggcg gacacgtcag 2580
ctgcagagtg aaactgtcag cactgacett gaaggggact agctacaaga tttgcacaga 2640
taagatgttc ttcgtgaaga atcccactga tactgggcac ggcactgtgg tgatgcaagt 2700
gaaggtccca aagggagccc cttgtegaat ccctgtgatt gtggctgaeg atctgaccgc 2760
tgctatcaac aaaggaatcc tggttaccgt gaatcccatc gcgagtacaa acgacgacga 2820
agtcctgatc gaggtgaatc caccetttgg cgacagctac atcattgtcg ggaggggaga 2880
cagcaggctg acgtatcagt ggcacaaaga agggtcctca atcgggaagc tgtttaccca 2940
gacaatgaaa ggcgtggagc gactggccgt gatgggagac gtggcctggg acttctceag 3000
tgccggcggc ttctttacct ccgtgggcaa gggaatccat accgtgtttg gctcagcctt 3060
tcagggactg tttggtggtt tgaacgaatt cacgctgatc cccatcgctg tgggtggtgc 3120
cctggcgggg ctggtcctca tcgtcctcat cgcctacctc gtcggcagga agaggagtca 3180
cgcaggctac cagactatct agggtacc 3208
Claims (15)
1. Oligonucleotideos para amplificação de PreM/M-Eselvagem caracterizado por possuir as SEQ ID N0:1 e SEQ IDNO: 2.
2. Oligonucleotideos para amplificação de PreM/M-E parafusão com LAMP caracterizado por possuir as SEQ ID NO: 3 eSEQ ID NO:4.
3. Oligonucleotideos para amplificação do domínio C-terminal de LAMP para fusão à seqüência PreM/M-Ecaracterizado por possuir as SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO: 6.
4. Vacina de DNA caracterizado por possuir total ouparcialmente a SEQ ID NO:7 ou qualquer seqüência com mais de-80% de homologia a esta.
5. Vacina de DNA caracterizado por possuir a total ouparcialmente SEQ ID NO: 8 ou qualquer seqüência com mais de-80% de homologia a esta.
6. Vacina de DNA caracterizado por possuir a total ouparcialmente SEQ ID NO: 9 ou qualquer seqüência com mais de-80% de homologia a esta.
7. Vacina de DNA caracterizado por possuir a total ouparcialmente SEQ ID NO:10 ou qualquer seqüência com mais de-80% de homologia a esta.
8. Vacina de DNA caracterizado por possuir a total ouparcialmente SEQ ID NO:11 ou qualquer seqüência com mais de-80% de homologia a esta.
9. Vacina de DNA caracterizado por possuir a total ouparcialmente SEQ ID NO:12.
10. Antigeno caracterizado por possuir uma ou mais dasseqüências proteicas com mais de 80% de homologia àsseqüências codificadas pelas SEQ ID NOs:7-12 fusionadas aosinal de trafego LAMP.
11. Antigeno caracterizado por possuir uma ou mais dasseqüências genéticas que codificam os mesmos aminoácidoscodificados pelas SEQ ID NOs:7-12 ou qualquer outraseqüência proteica com mais de 80% de homologia a estasseqüências.
12. Antigeno caracterizado por possuir uma ou mais dasmodificações dos códons genéticos naturais do antigeno dafebre amarela usado nas SEQ ID NOs:7-12 das reivindicações 4a 9 que visem estabilizar o RNA mensageiro ou aumentar aexpressão proteica.
13. Antigeno caracterizado por possuir uma ou mais dasseqüências genéticas que codificam total ou parcialmenteantigenos de febre amarela das SEQ ID NOs: 7-12 dasreivindicações 4 a 9 ligados ao LAMP.
14. Antigeno caracterizado por possuir uma ou mais dasseqüências genéticas que codificam total ou parcialmenteantigenos de febre amarela das SEQ ID NOs:7-12 dasreivindicações 4 a 9 que trafegam para o lisossomo ou outrasorganelas relacionadas.
15. Antigeno caracterizado por possuir uma ou mais dasseqüências genéticas que codificam total ou parcialmenteantigenos de febre amarela das SEQ ID NOs:7-12 dasreivindicações 4 a 9 ligadas a porções de qualquer proteínaque naturalmente trafega para o lisossomo ou outrasorganelas celular relacionadas ao lisossomo.
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