BRPI0905656B1 - ANTICORPO HUMANIZADO a9-INTEGRINA ANTI-HUMANA, FÁRMACO TERAPÊUTICO PARA ARTRITE REMATÓIDE E USO DO ANTICORPO HUMANIZADO a9-INTEGRINA ANTI-HUMANA. - Google Patents

Abstract

anticorpo humanizado alfa9-integrina anti-humana, fármaco terapêutico para artrite reumatóide e uso do anticorpo humanizado alfa9-integrina anti-humana a presente invenção provê um anticorpo alfa9-integrina humanizado anti-humano tendo uma atividade melhorada e/ou propriedade quanto comparado para a um anticorpo humanizado alfa9-integrina anti-humano de um camundongo doador, denominado anticorpo humanizado alfa9-integrina anti-humano contendo uma região variável de cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácido mostrada pela seq id no:11 e uma região variável de cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos mostrado pela seq id no:17, um anticorpo humanizado aalfa9- integrina anti-humana contendo uma região variável de cadeia pesa consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela seq id no:13 e uma região variável de cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela seq id no:17, um anticorpo humanizado alfa9-integrina anti-humano contendo uma região variável de cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela seq id no:15 e uma região variável de cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela seq id no:9, e um meio para a profilaxia ou o tratamento de várias doenças envolvendo a alfa9-integrina humana na patogênese, que utiliza o anticorpo.

Description

“ANTICORPO HUMANIZADO «9-INTEGRINA ANTI-HUMANA, FÁRMACO TERAPÊUTICO PARA ARTRITE REUMATÓIDE E USO DO ANTICORPO HUMANIZADO «9-INTEGRINA ANTI-HUMANA.

Campo da invenção [0001] A presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado a9-integrina anti-humana. Mais particularmente, refere-se a um anticorpo Y9A2 humanizado melhorado tendo uma atividade para se ligar a uma proteína a9-integrina humana para inibir a adesão celular dependente da a9-integrina, e uma atividade e/ou a propriedade melhoradas quando comparadas para um anticorpo Y9A2 do anticorpo a9-integrina anti-humano de camundongo. O anticorpo humanizado é esperado como sendo um fármaco para o diagnóstico, prevenção ou tratamento de doenças autoimunes tais como artrite reumatóide, doenças imune tais como alergias e rejeição de enxerto, e outras várias doenças envolvidas pela a9-integrina em sua patogênese.

Histórico da invenção [0002] A integrina, uma glicoproteína de superfície celular, é uma molécula de adesão que funciona principalmente como um receptor para a adesão celular para matrizes extracelular (colágeno, laminina e do gênero) e os membros da família da imunoglobulina (ICAM-1, VCAM-1 e do gênero) , e media a transdução do sinal a partir das matrizes celulares. Portanto, as células recebem sinais a partir das matrizes extracelulares, e a diferenciação, proliferação, morte celular e do gênero são induzidas. A integrina é um heterodímero consistindo de duas subunidades da cadeia-α e da cadeia-β; existem diferentes cadeias-α e cadeias-β que ocorrem em uma ampla variedade de combinações, e existem 24

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2/43 membros da superfamília das integrinas. As integrinas-nocaute de camundongo são fatais ou são doentes irreversíveis, nas quais as subunidades são faltantes, sugerindo que integrinas individuais são necessárias para a manutenção da vida. Portanto, a integrina que transmite a informação das condições ambientais a células para estimular suas respostas, acreditam-se funcionar em todas as situações do fenômeno biológico, e mediar uma ampla faixa de condições patológicas. [0003] Como tal, a integrina é indispensável para sobrevivência dos organismos, e acredita-se que participe da regra mesmo em estados doentios; alguns casos foram relatados nos quais sua inibição auxilia na melhora das condições patológicas. Por exemplo, um inibidor de aIIb33-integrina específica para plaquetas foram aprovadas como fármaco terapêutico para restenose PCTA conhecida como abciximab (nome comercial: ReoPro; Eli Lilly). Natalizumab (nome comercial: Antegren; Elan Company), um inibidor α4βΐ (VLA4), foi aprovado como um fármaco terapêutico para esclerose múltipla. O inibidor 07^3 Vitaxin (MEDIMMUNE Company) está sob desenvolvimento em estudos clínicos quanto a sua ação inibitória na neovascularização, sua ação inibitória da ativação osteoclasta e do gênero.

[0004] A integrina α9β1 é expressa em macrófagos, células NKT, células dendríticas, e neutrófilos, e reportadamente participa de regras importantes na infiltração e adesão destas células inflamatórias, reabsorção óssea e do gênero. Recentemente, foi relatado que a integrina α9β1 está envolvida na formação osteoclasta, e seu envolvimento na destruição óssea foi sugerido (documento 1 - não patente). Os ligantes dos mesmos conhecidos incluem osteopontina truncada

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3/43 (OPN N-terminal), VCAM-1, Tenascin-C e do gênero. Clinicamente, os níveis significativamente elevados de integrina α9β1 foram observados nos tecidos sinoviais de pacientes com artrite reumatóide (documento 2 - não patente). [0005] Portanto, um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a proteína a9-integrina age para inibir a adesão de célula dependente da a9-integrina, se desenvolvido, seria útil no diagnóstico, prevenção ou tratamento de várias doenças envolvidas pela a9-integrina em sua patogênese.

[0006] Os anticorpos foram relatados por apresentar a ação de função inibitória em uma a9-integrina humana são o anticorpo monoclonal Y9A2 de camundongo (documento 3 - não patente), e 1K11, 24I11, 21C5 e 25B6 (documento 1 - patente) e 28S1 (documento 2 - patente). Os resultados experimentais in vitro demonstraram que estes anticorpos são capazes de suprimir a adesão celular dependente da a9-integrina. Dentre estas, uma vez que Y9A2 inibe a adesão celular em ambas, a osteopontina e Tenascin-C, ele é considerado muito promissor como um candidato para um fármaco de anticorpo contra a α9integrina.

[0007] Deve ser observado, entretanto, que Y9A2 é um anticorpo derivado de camundongo preparado por imunização de um camundongo com um antígeno e, portanto, a administração direta do mesmo para humano é praticamente impossível dos aspectos de segurança (indução de antigenicidade) e eficácia (curta meia-vida). Portanto, uma modificação para converter o anticorpo em uma molécula tendo uma sequência de aminoácidos do anticorpo humano enquanto mantendo a atividade de Y9A2, ou seja, humanização, necessária para ser realizada.

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4/43 [0008] Atualmente, como um método de produção do anticorpo humanizado, um método baseado no método incluindo o enxerto do aminoácido da região determinante da complementaridade (daqui em diante deve ser indicada como CDR) como designado por Winter et al., (documento 4 - não patente) é mais genérico. È também bem conhecido que enxertos simultâneos não apenas de CDR, mas também de aminoácidos não-CDR envolvidos na manutenção estrutural de CDR ou ligação com um antígeno, ou seja, uma região estrutural (algumas vezes sendo indicada como FR) , a partir de um anticorpo exógeno para um doador do aminoácido CDR para um anticorpo humano como sendo receptor de CDR é importante para a reprodução da atividade inerente do anticorpo doador (documentos 4 e 5 não-patentes).

[0009] Entretanto, a produção de um anticorpo humanizado a base de enxertos de CDR incluem problemas severos. Primeiramente, o problema mais comum é que mesmo uma seleção apropriada do aminoácido FR necessário para reprodução da atividade de um anticorpo doador não pode eliminar a dificuldade da obtenção de um anticorpo humanizado tendo afinidade para um antígeno e uma atividade biológica excedendo àquela do anticorpo doador.

[0010] Nos anos recentes, um grande número de anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpo humano foram colocados no mercado como produtos farmacêuticos monoclonais. A dose eficaz de qualquer um destes é extremamente alta e é muito mg por 1 kg do peso corpóreo. Portanto, os anticorpos farmacêuticos são inevitavelmente caros, dificultando e aumentando os custos médicos e do paciente. Os maiores fatores definindo a dose eficaz de um fármaco de anticorpo incluem a afinidade do anticorpo para um antígeno e a

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5/43 quantidade do antígeno presente no corpo. A partir destes aspectos, particularmente, um aperfeiçoamento na afinidade de um anticorpo para um antígeno conduz a uma redução na dose, e é um aperfeiçoamento extremamente útil também resultando na redução das dificuldades econômicas para os custos medidos e de pacientes.

[0011] Para realizar uma afinidade melhorada de um anticorpo para um antígeno, um método incluindo a introdução da substituição do aminoácido dentro de uma região variável do anticorpo é frequentemente adotado. Entretanto, quando anticorpo e o antígeno são diferentes, a sequência e a estrutura estérica do aminoácido CDR, bem como a posição do aminoácido envolvido nas interações antígeno-anticorpo também varia. Portanto, é praticamente impossível definir a posição do aminoácido FR a ser enxertado junto com a CDR sendo aplicável a qualquer anticorpo.

[0012] Um outro problema é que, enquanto todo o aminoácido CDR de um anticorpo de camundongo doador é geralmente enxertado em um molde de anticorpo humano na preparação de um anticorpo humanizado com base no enxerto de CDR, uma sequência de aminoácidos de CDR derivado de um anticorpo de camundongo, que é importante para ligação com um antígeno, algumas vezes mostra antigenicidade contra humano, frequentemente causando a produção de um anticorpo antiidiotipo.

[0013] Ou seja, para a produção de um anticorpo humanizado, seleção de um anticorpo receptor apropriado e a seleção de aminoácidos de CDR e aminoácidos FR a serem substituídos são indispensáveis para transmitir uma atividade maior que de um anticorpo doador enquanto evita a produção da

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6/43 antigenicidade no humano e diminuir a estabilidade do anticorpo. Isto requer uma perspicácia considerável e triagem e erro.

Documento	de patente 1: WO	2006/075784;
Documento	de patente 2: WO	2008/007804;
Documento	não-patente 1:	Journal of	Bone	and	Mineral
Research,	2006, 21:1657-1	665;
Documento	não-patente	2: The Journal	of	Clinical
Investigation, 2005, 115:	1060-1067;
Documento	não-patente 3:	Am. J. Respir.	Cell	Mol.	Biol.,

1996, 15:664-672;

Documento não-patente 4: Science, 239, 1534-1536 (1988);

Documento não-patente 5: Proc. Acad. Sci., USA, 86, 1002910033 (1989);

Descrição da invenção

- Problemas a ser resolvido por esta invenção [0014] Um objeto da presente invenção é resolver os vários problemas acima mencionados relacionados aos anticorpos humanizados, e prover um anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado tendo atividade melhorada e/ou propriedade quando comparada a um anticorpo a9-integrina anti-humano de camundongo doador (Y9A2).

- Meios para resolver os problemas [0015] Consequentemente, a presente invenção compreende as invenções a seguir (1) - (15) quando referida as substâncias e métodos médicos ou industrialmente úteis.

(1) Um anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve selecionada como a seguir:

(a) uma região variável de cadeia pesada consistindo da

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7/43 sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:17;

(b) uma região variável de cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:13 e uma região variável de cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:17; e (c) uma região variável de cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:15 e uma região variável de cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:9.

(2) O anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado descrito em (1) acima, onde a região constante de cadeia pesada do anticorpo é Igy1 humana.

(3) O anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado descrito em (1) acima, onde a região constante de cadeia leve do anticorpo é Ig_K humana.

(4) O anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado descrito em (1) acima, onde a região constante de cadeia pesada do anticorpo é Igy1 humana e a região constante de cadeia leve do anticorpo é Ig_K humana.

(5) O anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado descrito em (1) acima, onde a cadeia pesada consiste da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:19 e a cadeia leve consiste da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:25.

(6) O anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado descrito em (1) acima, onde a cadeia pesada consiste da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:21 e a cadeia leve consiste da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID

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NO:25.

(7) O anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado descrito em (1) acima, onde a cadeia pesada consiste da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:23 e a cadeia leve consiste da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:27.

(8) Um polinucleotídeo compreendendo uma sequência codificante da região variável de cadeia pesada do anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado descrito em (1) acima.

(9) Um polinucleotídeo compreendendo uma sequência codificante da região variável de cadeia leve do anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado descrito em (1) acima.

(10) Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo descrito em (8) e/ou o polinucleotídeo descrito em (9) acima.

(11) Uma célula hospedeira incorporando o vetor de expressão descrito em (10) acima.

(12) Um método para produção de um anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado, compreendendo uma etapa de cultivar a célula hospedeira descrita em (11) acima, para permitir a expressão do anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado.

(13) Um fármaco terapêutico para artrite reumatóide, compreendendo o anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado descrito em qualquer um de (1) a (7) acima.

(14) Um método para prevenir ou tratar artrite reumatóide, compreendendo a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo a9-integrina antihumano humanizado descrito em qualquer um de (1) a (7) acima.

(15) O uso do anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado, descrito em qualquer um de (1) a (7) acima, na fabricação de um fármaco para prevenção ou tratamento de artrite

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9/43 reumatóide.

Efeito da invenção [0016] De acordo com a presente invenção, é provido um anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado tendo uma atividade e/ou propriedades melhoradas quando comparado a um anticorpo a9-integrina anti-humano de camundongo doador. O anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado da presente invenção tem uma ação antiinflamatória forte e uma ação supressiva de destruição de osso forte através do bloqueio das interações entre a integrina a9-humana e a pluralidade de ligantes do mesmo, e é útil para a profilaxia ou tratamento de várias doenças envolvendo a a9-integrina humana na patogênese. Além disso, o anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado da presente invenção provê uma melhora superior nas aplicações clínicas tal como a redução da dose, extensão do intervalo, melhora do método de administração (por exemplo, injeção subcutânea) e do gênero, e contribui grandemente para a eficácia e melhora terapêutica das complicações do paciente.

Breve descrição dos desenhos

[0017]	A	figura 1 ilustra	a	sequência de	aminoácido	da
região	VH de	um anticorpo Y9A2	de	camundongo;
[0018]	A	figura 2 ilustra	a	sequência de	aminoácido	da
região	VL de	um anticorpo Y9A2	de	camundongo;
[0019]	A	figura 3 ilustra a	constituição do	oligoDNA para

produção do gene codificante de RY9A2VHv5, que é um exemplo de VH de um anticorpo Y9A2 humanizado;

[0020] A figura 4 ilustra a constituição do oligoDNA para produção do gene codificante de RY9A2VLv01, que é um exemplo de VL de um anticorpo Y9A2 humanizado;

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[0021]	A	figura 5 ilustra	os resultados	de	um ELISA
celular	de	um anticorpo Y9A2	quimérico e	um	anticorpo
RY9A2v501	; e
[0022]	A	figura 6 ilustra	os resultados	de	um ELISA
celular	de	um anticorpo Y9A2	quimérico e	um	anticorpo
RY9A2v801

Forma preferida de realização da invenção

[0023]	A	presente	invenção	é	descrita	em	detalhes a
seguir.
[0024]	A	presente	invenção	demonstrou	uma	perspicácia
considerável	e a consideração	pela	produção	de	um anticorpo

humanizado do anticorpo a9-integrina Y9A2 anti-humano de camundongo, e substitui na produção de três tipos de anticorpos a9-integrina anti-humano humanizado (a seguir também referido como um anticorpo Y9A2 humanizado ou RY9A2) tendo atividades e/ou propriedades significativamente melhoradas quando comparado ao Y9A2.

[0025] Para ser específico, primeiramente, a presente invenção enxertou a sequência de aminoácido CDR e vários aminoácidos FR de uma região variável de cadeia pesada (a seguir também relacionada como VH) e uma região variável de cadeia pesada (a seguir também denominada de VL) de um anticorpo a9-integrina Y9A2 anti-humano de camundongo (daqui em diante também referido como um anticorpo Y9A2 de camundongo) dentro de um anticorpo humano padrão para preparar dois tipos de anticorpos a9-integrina anti-humano humanizado, RY9A2v501 e RY9A2v801, cada um tendo uma atividade equivalente àquela de um anticorpo Y9A2 de camundongo. O CDR foi determinado de acordo com a classificação por Kabat et al. (“Sequences of Proteins of

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Immunological Interest, 4° edição, Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987) . As sequências de aminoácidos de VHs de RY9A2v501 e RY9A2v801 são SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:7, respectivamente. Aqui, a VH de RY9A2v801 é a VH de RY9A2v501, onde o 4 resíduo de aminoácido dos resíduos de aminoácido FR derivado do anticorpo Y9A2 de camundongo são substituídos pelos aminoácidos do anticorpo humano padrão correspondente. A sequência de aminoácidos de VLs e ambos os anticorpos humanizados é mostrada pela SEQ ID NO:9 e é comum a ambos os anticorpos.

[0026] Em seguida, com o auxílio da produção de um anticorpo humanizado tendo maior afinidade a a9-integrina humana do que o anticorpo Y9A2 de camundongo original, embora evite o risco da produção da antigenicidade de um anticorpo humanizado e a preservação diminuída da estabilidade do anticorpo, a presente invenção considerou a substituição das sequências de aminoácidos nas CDRs de VH e VL dos dois tipos de anticorpos humanizados acima-mencionados. Como resultado, os três tipos a seguir dos anticorpos a9-integrina antihumano humanizado foram confirmados para ter atividades e/ou propriedades significativamente melhoradas quando comparado àqueles do anticorpo Y9A2 do camundongo original. (1) Um anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos ilustrada pela SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos ilustrada pela SEQ ID NO:17. (2) Um anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos ilustrada pela SEQ ID NO:13 e uma região variável

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12/43 de cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos ilustrada pela SEQ ID NO:17. (3) Um anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos ilustrada pela SEQ ID NO:15 e uma região variável de cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos ilustrada pela SEQ ID NO:9.

[0027] O anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado da presente invenção pode facilmente ser preparado pelos técnicos do assunto com base na informação da sequência da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve do mesmo, descrita aqui, usando um método comumente conhecido da técnica. Especificamente, um segmento de gene de região variável de cadeia pesada tendo uma sequência básica que codifica os aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado da presente invenção é preparado. Então, os genes da região variável são ligados a um gene da região constante em uma classe apropriada do anticorpo humano para preparar um gene do anticorpo humanizado. Em seguida, este gene do anticorpo humanizado é ligado a um vetor de expressão apropriado, e introduzido dentro de uma célula cultivada. Finalmente, esta célula é cultivada, desse modo um anticorpo humanizado pode ser obtido a partir do sobrenadante na cultura.

[0028] Cada um dos segmentos do gene da região variável acima-descritos que codifica os aminoácidos da região variável de cadeia leve e de cadeia pesada do anticorpo humanizado da presente invenção é sintetizado, por exemplo, com base nas sequências básicas das regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada ou as sequências básicas

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13/43 construídas com base nas sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada e através de um método de síntese de gene conhecido da técnica. O referido método de síntese de gene, vários métodos conhecidos dos técnicos no assunto tal como o método de síntese de gene do anticorpo descrito em WO 90/07861 e do gênero pode ser utilizado. Em adição, uma vez que o segmento do gene da região variável do anticorpo da presente invenção é adquirido, outros anticorpos da presente invenção podem também ser adquiridos através da introdução de uma mutação, dentro de um determinado sítio no segmento de gene. O referido método de introdução de mutação, vários métodos óbvios aos técnicos no assunto, tal como mutagênese sítiodirecionada (“Current Protocols in Molecular Biology, Edit. Ausubel et al. (1987), Publicado por John Wiley & Sons Section , 8.1-8.5), pode ser utilizado.

[0029] Em seguida, os segmentos de gene da região variável acima descritos e o gene da região constante do anticorpo humano são ligados para preparar um gene do anticorpo humanizado. Embora qualquer subclasse da região constante (por exemplo, γ1, γ2, γ e γ4 como cadeias pesadas, as cadeias λ e κ das regiões constantes como cadeias leves) pode ser escolhida como região constante do anticorpo humano utilizado, a Igγ1 humana como a região constante de cadeia pesada, e uma IgK humano como região constante de cadeia leve, podem ser preferivelmente utilizadas.

[0030] Subsequente à preparação deste gene do anticorpo humanizado, a introdução do gene do anticorpo humanizado para um vetor de expressão, introdução do vetor de expressão para as células cultivadas, o cultivo das células cultivadas, a

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14/43 purificação do anticorpo e do gênero podem ser realizadas através do uso de vários métodos comumente conhecidos da técnica, ou com referência aos métodos de preparação do anticorpo de osteopontina anti-humano humanizado, descrito em WO 2007/139164 ou WO 2003/027151.

[0031] Quando o vetor de expressão é ligado ao gene do anticorpo humanizado é assim obtido, os vetores de expressão descritos na publicação do pedido de patente internacional WO 94/20632, tal como AG-y1 e AG-K, podem ser utilizados, mas o vetor de expressão não é submetido a limitação, tanto quanto é capaz de expressar o gene do anticorpo humanizado. É preferível utilizar o vetor de expressão já tendo um gene da região constante Ig humano tal como AG-y1 e AG-K, porque se tornaria um vetor de expressão tendo um gene do anticorpo humanizado simplesmente quando o gene da região variável do anticorpo humanizado é inserido no mesmo. Em um vetor de expressão, uma sequência guia pode ser utilizada para promover a secreção e a expressão extracelular de um anticorpo. Como uma sequência guia, uma sequência guia derivada de Y9A2 ou uma sequência guia derivada de outros anticorpos (por exemplo, o anticorpo anti-osteopontina humanizado, descrito em WO2007/139164) podem ser utilizados.

[0032] O vetor de expressão descrito acima é introduzido dentro das células cultivadas por, por exemplo, uso de um sistema de expressão FreeStyle 293 (Invitrogen), um método de fosfato de cálcio e do gênero.

[0033] Como exemplo de células cultivadas, nas quais o vetor de expressão é introduzido, as células cultivadas tal como as células 293, células CHO-DG44 podem ser utilizadas, e elas podem ser cultivadas por um método convencional.

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15/43 [0034] Após o cultivo acima-mencionado, o anticorpo acumulado no sobrenadante da cultura podem ser purificado através dos vários tipos de cromatografias de coluna, por exemplo, cromatografias usando uma coluna da proteína A.

[0035] Como um método para medir a atividade de ligação do anticorpo humanizado obtido a a9-integrina humana, ELISA, FACS e do gênero podem ser utilizados. Quando ELISA é utilizada, por exemplo, as células (por exemplo, célula SW480) expressando a a9-integrina são imobilizadas em uma placa de ELISA, um anticorpo humanizado é adicionado nela para causar uma reação, e um anticorpo secundário tal como um anticorpo IgG humano marcado com uma enzima tal como a peroxidase de rábano silvestre (HRP) é adicionada a esta placa para causar reação. As células foram lavadas, um substrato para desenvolvimento de cor (por exemplo, TMB quando HRP marcou) foi adicionado nesta, e a absorbância foi medida.

[0036] Como um método para avaliação se o anticorpo humanizado obtido tem uma função de atividade inibitória contra a a9-integrina humana, ele pode ser confirmado por um teste de inibição (descrito em “J. Biol. Chem., 274:3632836334, 1999 da adesão da célula dependente da molécula α9integrina humana à molécula de osteopontina humana. Assim, a variante RAA (sequências RGD é alterada para RAA para suprimir a reação com outra integrina; daqui em diante algumas vezes por ser indicada como nOPN-RAA) da OPN no Nterminal (o fragmento N-terminal após a clivagem da osteopontina através da trombina; daqui em diante algumas vezes indicada como nOPN) , que é um dos ligantes de α9, é imobilizada em uma placa e submetido ao bloqueio. Após a

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16/43 adição de vários anticorpos humanizados, as células de expressão α9 são adicionadas e incubadas a 37°C durante 1 hora. As células são fixadas e coradas com violeta cristal e metanol, e lavada. O corante nas células aderidas é extraído com Triton X-100, e a absorbância no comprimento de onda 595 nm são medidas.

[0037] Além disso, como um método para avaliação detalhada se o anticorpo humanizado obtido tem uma função inibitória na atividade contra a a9-integrina humana, um método com base no teste da inibição da migração celular descrito em “Molecular Biology of the cell, 12:3214-3225, 2001, pode ser mencionado. Assim, nOPN-RAA é imobilizado em uma camada superior de um trans-poço e arranjado em uma placa, e então o meio F15 contendo 10% de FCS é adicionado em uma camada inferior. A célula de expressão de α9 e o anticorpo humanizado são simultaneamente adicionado em uma camada superior e incubados a 37°C durante 16 horas. Em seguida, as células que migraram dentro da camada inferior do trans-poço são quantificadas, por exemplo, pelo ensaio do Kit de 24poços de migração celular QCM Chemotaxis (Millipore).

[0038] Os 3 tipos de anticorpos a9-integrina anti-humana humanizada da presente invenção podem facilmente ser adquiridos pela síntese de um DNA que codifica uma sequência de aminoácidos de VH ilustrada pelas SEQ ID NOs:11, 13 ou 15 e um DNA que codifica a sequência de aminoácidos de VL mostrada pelas SEQ ID Nos: 17 ou 9 usando um método comumente conhecido da técnica, ligando eles a uma classe apropriada do gene da região constante do anticorpo humano, preferivelmente, o gene da região constante Igy1 humana para a cadeia pesada e o gene da região constante Igr para a

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17/43 cadeia leve, para construir um gene do anticorpo humanizado, introduzindo o gene do anticorpo humanizado em um vetor de expressão usando vários métodos comumente conhecidos da técnica ou o método descrito em WO02/081522 ou WO03/027151 e do gênero, introduzindo o vetor de expressão para as células cultivadas, cultivando as células, e purificando o anticorpo a partir da cultura obtida. Preferivelmente, os DNAs codificantes das sequências de aminoácidos de VH mostrada pela SEQ ID NOs: 11, 13 e 15 contendo sequências básicas mostrada pelas SEQ ID NO: 12, 14 e 16, respectivamente. Preferivelmente, os DNAs codificantes da sequência de aminoácidos VL ilustrados pelas SEQ ID NO:17 e 9 contêm as sequências básicas mostradas pela SEQ ID NO:18 e 10, respectivamente.

[0039] A cadeia pesada do anticorpo humanizado preferível da presente invenção, que é obtido pela ligação da região variável de cadeia pesada mostrada pela SEQ ID NO:11 e a região constante Igy1 humana, é uma cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:19. A cadeia leve do anticorpo humanizado preferida da presente invenção, é aquela obtida pela ligação da região variável de cadeia leve mostrada pela SEQ ID NO:17 e a região constante IgA' humana, é uma cadeia leve consistindo da sequencia de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:25. Preferivelmente, um DNA codificante da cadeia pesada do anticorpo humanizado consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:19 contêm a sequência básica mostrada pela SEQ ID NO:20. Preferivelmente, um DNA codificante da cadeia leve do anticorpo humanizado consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:25 contêm a sequência básica mostrada

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18/43 pela SEQ ID NO:26. Como o anticorpo anti-a9 integrina humanizado da presente invenção contendo uma cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:19, e uma cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:25, um anticorpo RY9A2v12(M34L)012 mostrado nos exemplos descritos abaixo podem ser mencionados.

[0040] A cadeia pesada do anticorpo humanizado preferível da presente invenção, que é obtido pela ligação da região variável de cadeia pesada mostrada pela SEQ ID NO:13 e a região constante Igy1 humana, é uma cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:21. A cadeia leve do anticorpo humanizado preferida da presente invenção, é aquela obtida pela ligação da região variável de cadeia leve mostrada pela SEQ ID NO:17 e a região constante IgA' humana, é uma cadeia leve consistindo da sequencia de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:25. Preferivelmente, um DNA codificante da cadeia pesada do anticorpo humanizado consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:21 contêm a sequência básica mostrada pela SEQ ID NO:22. Preferivelmente, um DNA codificante da cadeia leve do anticorpo humanizado consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:25 contêm a sequência básica mostrada pela SEQ ID NO:26. Como o anticorpo anti-a9 integrina humanizado da presente invenção contendo uma cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:21, e uma cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:25, um anticorpo RY9A2v12(M34L)012 mostrado nos exemplos descritos abaixo podem ser mencionados.

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19/43 [0041] A cadeia pesada do anticorpo humanizado preferível da presente invenção, que é obtido pela ligação da região variável de cadeia pesada mostrada pela SEQ ID NO:15 e a região constante Igy1 humana, é uma cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:23. A cadeia leve do anticorpo humanizado preferida da presente invenção, é aquela obtida pela ligação da região variável de cadeia leve mostrada pela SEQ ID NO:9 e a região constante Igv humana, é uma cadeia leve consistindo da sequencia de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:27. Preferivelmente, um DNA codificante da cadeia pesada do anticorpo humanizado consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:23 contêm a sequência básica mostrada pela SEQ ID NO:24. Preferivelmente, um DNA codificante da cadeia leve do anticorpo humanizado consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:27 contêm a sequência básica mostrada pela SEQ ID NO:28. Como o anticorpo anti-a9 integrina humanizado da presente invenção contendo uma cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:23, e uma cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:27, um anticorpo RY9A2v05(IAW)01 mostrado nos exemplos descritos abaixo podem ser mencionados.

[0042] O anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado da presente invenção, assim obtido após ser purificado ainda como requerido pode ser preparado como uma preparação farmacêutica de acordo com um método convencional, e utilizado para o tratamento de doenças autoimunes tal como artrite reumatóide e do gênero, doenças imunes tais como alergia, rejeição de transplante e do gênero, e doenças onde

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20/43 a9-integrina é envolvida na patogênese tal como osteoporose, doença pulmonar obstrutiva crônica, câncer e do gênero.

[0043] O anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado da presente invenção pode ser utilizado preferivelmente como um agente terapêutico para artrite reumatóide. Como exemplos de formas de dosagens para estes agentes terapêuticos, uma preparação parenteral tal como uma injeção ou infusão para gotejamento podem ser preparada, e é preferivelmente administrada por administração intravenosa, administração subcutânea e do gênero. Na preparação de uma composição/preparação farmacêutica, veículos e aditivos que corresponde a estas formas de dosagens podem ser utilizados dentro de uma faixa farmaceuticamente aceitável.

[0044] A quantidade de anticorpo a9-integrina anti-humano

humanizado da presei	te	invenção,	adicionada	na	preparação
acima-descrita causa	uma	variação	dependente da severidade do
sintoma do paciente	e	da idade	da	forma	de	dosagem da
preparação utilizada	ou	do título	de	ligação	do	anticorpo e
do gênero; por exemplo,	cerca de	0, 1	mg/kg a	100	mg/kg pode
ser utilizado. [0045] A presente	invenção também	provê	polinucleotídeo

codificante do anticorpo a a9-integrina anti-humano humanizado da presente invenção ou de regiões variáveis de cadeia pesada e/ou de cadeia leve do mesmo, e um vetor de expressão contendo os mesmos. O vetor de expressão da presente invenção não é submetido a limitações, tanto quanto ele é capaz de expressar um gene que codifica o anticorpo humanizado da presente invenção ou a região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve do mesmo em várias células hospedeiras de células procarióticas e/ou de células

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21/43 eucarióticas, e produção destes polipeptídeos. Por exemplo, os vetores de plasmídeo, vetores virais (por exemplo, adenovirus, retrovírus) e do gênero pode ser mencionado.

[0046] O vetor de expressão da presente invenção pode compreender um gene que codifica o anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado da presente invenção, ou a região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve do mesmo, e um promotor funcionalmente ligado ao gene. Como o promotor para expressão do gene que codifica o anticorpo humanizado da presente invenção ou a região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve do mesmo em uma bactéria, quando o hospedeiro é uma bactéria do gênero Escherichia, por exemplo, o promotor Trp, promotor lac, promotor recA, promotor ÀPL, promotor lpp, promotor TAC e do gênero podem ser mencionados. Como o promotor para expressão do gene que codifica o anticorpo humanizado ou uma região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve do mesmo em levedura, por exemplo, o promotor PH05, o promotor PGK, o promotor GAP e o promotor ADH podem ser mencionados; quando o hospedeiro é uma bactéria do gênero Bacillus, o promotor SL01, o promotor SP02, promotor penP e do gênero podem ser mencionados. Quando os hospedeiros é uma célula eucariótica tal como uma célula de mamífero, o promotor β-actina, promotor CAG (Niwa H. et al., Gene, 108, 193-200, 1991), o promotor SV40 derivado, promotor retrovírus, promotor de choque-térmico e do gênero podem ser mencionados.

[0047] Quando uma bactéria, particularmente, Escherichia coli, é utilizado como célula hospedeira, o vetor de expressão da presente invenção pode compreender ainda um códon de inicialização, um códon de interrupção, uma região

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22/43 terminal e uma unidade de replicação. Quando uma levedura, a célula animal ou uma célula de inseto é utilizada como hospedeira, o vetor de expressão da presente invenção, pode compreender um códon de inicialização e um códon de interrupção. Neste caso, uma sequência melhoradora, regiões não-codificantes na extremidade 5' e extremidade 3' de um gene que codifica o anticorpo humanizado da presente invenção ou um região variável de uma cadeia pesada e/ou de cadeia leve do mesmo, uma junção de anelamento, um sítio de poliadenilação, ou uma unidade de replicação e do gênero pode ser contido. Em adição, um marcador de seleção (por exemplo, gene de resistência de tetraciclina, gene de resistência a ampicilina, gene de resistência a kanamicina, gene de resistência a neomicina, gene de dihidrofolato redutase) convencionalmente utilizado de acordo com o objeto pode também ser contido.

[0048] A presente invenção também provê um transformante incorporando um gene que codifica o anticorpo humanizado da presente invenção ou uma região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve do mesmo. O referido transformante pode ser preparado, por exemplo, por transformação de uma célula hospedeira com o vetor de expressão da presente invenção. A célula hospedeira utilizada para preparar um transformante não é submetida à limitação, tanto que ele compete com o vetor de expressão acima-mencionado, e é transformável; várias células tal como células naturais ou linhas artificialmente estabelecidas das células em uso comum no campo técnico da presente invenção (por exemplo, bactéria, do gênero Escherichia, bactéria do gênero Bacillus), levedura (gênero Saccharomyces, do gênero Pichia e do gênero) , células

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23/43 animais ou células de insetos (por exemplo, por exemplo, Sf9) e do gênero podem ser mencionados como exemplo. A transformação pode ser realizada por um método conhecido per se.

[0049] A presente invenção também provê um método de produção do anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado da presente invenção compreendendo a expressão de um gene codificante do anticorpo humanizado ou das regiões variáveis de cadeia pesada e/ou cadeia leve da presente invenção em uma célula hospedeira, denominado, usando o referido transformante. Preferivelmente, a célula hospedeira utilizada para o método incorpora o vetor de expressão da presente invenção, e o vetor de expressão pode separadamente ou simultaneamente conter os polinucleotídeos codificantes das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado.

[0050] Na produção do anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado da presente invenção, o transformante pode ser cultivado no meio de nutriente. O meio nutriente contém, preferivelmente, uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio inorgânico ou a fonte de nitrogênio orgânico requerido para o crescimento do transformante. Como exemplos de fonte de carbono, glicose, desxtrano, amido solúvel, sacarose e do gênero pode ser mencionado; como exemplo de fonte de nitrogênio inorgânico ou fonte de nitrogênio orgânico, são sais de amônio, nitratos, aminoácidos, licor de infusão de milho, peptona, caseína, extrato de carne, bolo de soja, extrato de batata, e do gênero podem ser mencionados. Se desejado, outros nutrientes (por exemplo, sais inorgânicos, por exemplo, cloreto de cálcio, fosfato de

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24/43 dihidrogênio de sódio, cloreto de magnésio), vitaminas, antibióticos (por exemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina, canamicina e do gênero), podem ser contidos.

[0051] O cultivo do transformante pode ser realizado por um método conhecido per se. As condições de cultivo, por exemplo, a temperatura, pH do meio, e o tempo de cultivo são selecionados como apropriado. Por exemplo, quando o hospedeiro é uma célula animal, um meio MEM (Science, Volume 122, p. 501, 1952), meio DMEM (Virologia, volume 8, página 396, 1959), meio RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc., volume 199, página 519, 1967), meio 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., volume 73, página 1, 1950) contendo cerca de 5 a 20% do soro bovino fetal e do gênero, podem ser utilizados como meio. O pH do meio é preferivelmente, cerca de 6 a 8, cultivo é normalmente realizado a cerca de 30 a 40°C durante cerca de 15 \ 72 horas, e a cultura pode ser aerada ou agitada como necessário. Quando a célula hospedeira é uma célula de inseto, por exemplo, meio de Grace compreendendo soro bovino fetal (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, volume 82, página 8404, 1985) e do gênero pode ser mencionado, e o pH do mesmo é preferivelmente cerca de 5 a 8. O cultivo é normalmente realizado a cerca de 20 a 40°C durante 15 a 100 horas, e a cultura pode ser aerada ou agitada quando necessária. Quando o hospedeiro é uma bactéria, um actinomices, levedura, ou um fungo filamentoso, por exemplo, um meio líquido compreendendo as fontes de nutrientes acimamencionadas é apropriado. Um meio tendo um pH de 5 a 8 é preferível. Quando o hospedeiro é E. coli, o meio LB, o meio M9 (Miller et al., Exp. Mol. Genet. - Cold Spring Harbor laboratory, página 4231, 1972) e do gênero podem ser

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25/43 mencionado como meio preferível. Neste caso, o cultivo pode ser normalmente realizado de 14 a 43°C durante cerca de 3 a 24 horas, enquanto aeração ou agitação da cultura é feita quando necessário. Quando o hospedeiro é uma bactéria do gênero Bacillus, o cultivo pode ser realizado, normalmente, de 30 a 40°C durante cerca de 16 a 96 horas, enquanto a aeração ou a agitação da cultura é feita quando necessária. Quando o hospedeiro é a levedura, o meio mínimo de Burkholder (Bostian, “Proc. Natl. Acad. Sci., USA, volume 77, página 4505, 1980) pode ser mencionado como exemplo do meio, e o pH é desejavelmente 5 a 8. O cultivo é normalmente realizado em cerca de 20 a 35°C durante cerca de 14 a 144 horas, e a cultura pode ser aerada ou agitada quando necessário.

[0052] O anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado da presente invenção pode ser recuperado, preferivelmente, isolado e purificado, a partir de um transformante cultivado como descrito acima. Como exemplo, o método de isolamento e purificação, métodos baseados nas diferenças em solubilidade, tal como, colocados em camadas de sal e precipitação em solvente; métodos baseados nas diferenças em peso molecular, tais como diálise, ultrafiltração, filtragem em gel, e eletroforese em gel de sulfato de poliacrilamida; métodos baseados nas diferenças em mudança elétrica, tal como cromatografia de troca de íons e cromatografia de apatita hidroxila; métodos baseados na afinidade específica, tal como cromatografia por afinidade; métodos baseados na diferença de hidrofobicidade, tal como cromatografia líquida de alto desempenho em fase reversa; métodos baseados em diferenças em ponto isoelétricos, tal como eletroforese em concentração isoelétrica; e do gênero podem ser mencionados.

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26/43 [0053] A presente invenção é explicada em detalhes a seguir com relação aos exemplos, os quais não são construídos como limitativos.

EXEMPLOS [0054] Pode ser utilizado como uma parte de kit comercial disponível ou como reagente, a menos que de outro modo especificado, os experimentos foram realizados de acordo com o protocolo a seguir.

Exemplo 1 [0055] Determinação da sequencia da região variável do anticorpo Y9A2 do camundongo e a produção do anticorpo Y9A2 quimérico.

[0056] Os genes da região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo Y9A2 de camundongo foram determinados, e o gene VH foi ligado ao gene Igyhl humano e o gene VL foi ligado ao gene IgA' humano para resultar no anticorpo quimérico camundongo-humano (daqui em diante também relacionado como anticorpo Y9A2 quimérico). Os procedimentos são como a seguir.

[0057] Primeiramente, o RNA foi extraído a partir do anticorpo Y9A2 de camundongo para produção de hibridoma, os quais foram fornecidos pela University of California, em San Francisco (UCSF), com um reagente TRIzol (Invitrogen). Usando o RNa como um molde, o cDNA foi sintetizado pelo uso de um primer aleatório e transcriptase de fase reversa III superScript (ambos da Invitrogen). Então, o uso deste cDNA como molde, e um primer para uma região guia e um primer para a região J construída por referência à classificação das sequências da região V e da região J, por Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4°

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27/43 edição, Public Health Service, NIH, Washington, DC, 1987), um segmento de gene VH foi amplificado com a DNA-polimerase ExTaq (Takara BIO Inc.). O primer para a região guia acimamencionada e o primer para a região J utilizada aqui são adicionadas com uma sequência de reconhecimento HindIII e uma sequência de reconhecimento BamHI, respectivamente. Quando para VL, um segmento de gene VL foi obtido de maneira similar como VH pelo uso de um primer de conformação da sequência guia e um primer de conformação para a região J.

[0058] Os segmentos de gene VH e VL foram digeridos com HindIII e BamHI (ambos Takara Bio Inc.), e ligado ao AG-y1 e AG-κ (WO 94/20632), respectivamente, os quais são vetores de expressão. O AG-γΙ tem um promotor β-actina, um gene da cadeia γ1 da região constante da imunoglobulina humana, e um gene resistente a neomicina (neo) como um marcador de seleção, e torna-se um plasmídeo expressando a cadeia pesada do anticorpo Y9A2 quimérico para inserção de um gene VH em um anticorpo Y9A2 de camundongo entre uma sequencia de reconhecimento HindIII e uma sequência de reconhecimento BamHI localizado a montante do gene γ1.

[0059] O AG-κ tem um promotor β-actina, um gene da cadeia κ da região constante da imunoglobulina humana, e um gene da dihidrofolato-reductase (dhfr) como um marcador de seleção, e torna-se similarmente, um plasmídeo expressando a cadeia leve do anticorpo Y9A2 quimérico para inserção de um gene VL em um anticorpo Y9A2 de camundongo entre uma sequencia de reconhecimento HindIII e uma sequência de reconhecimento BamHI localizado a montante do gene κ.

[0060] Estes plasmídeos de expressão foram introduzidos dentro da Escherichia coli de acordo com um método

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28/43 convencional para resultar em um clone transformado, a partir do qual o DNA plasmídial foi preparado usando um kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Usando o DNA plasmídial obtido como um molde, e o kit DTCS-Quick Start genomeLab e um sequenciador CEQ2000 automático (ambos da Beckman Coulter), as sequências básicas de VH e VL clonadas foram analisadas. As sequências básicas de VH e VL são mostradas nas SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4, respectivamente. As sequências de aminoácidos de VH e VL, que foram determinadas com base nas sequências obtidas, são mostradas nas Figuras 1 e 2, respectivamente. Em adição, eles foram mostrados nas SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3, respectivamente.

[0061] O clone de Escherichia coli acima-mencionado foi cultivado em grandes quantidades, e o plasmídeo de expressão de cadeia pesada e o plasmídeo de expressão de cadeia leve do anticorpo Y9A2 quimérico foram purificados usando um Kit EndoFree Plasmid Maxi (QIAGEN). Eels foram misturados, e introduzidos dentro da célula usando um Sistema de Expressão FreeStyle 293 (Invitrogen), assim, o anticorpo Y9A2 quimérico foi expresso transitoriamente. A concentração do anticorpo Y9A2 quimérico contido no sobrenadante da cultura obtida foi medido pelo ELISA sanduiche usando um anticorpo IgG Fc antihumano derivado de cabra (CAPPEL) e a proteína A-HRP (ZYMED). Neste caso, uma série de diluições do anticorpo IgG1 humano comercialmente disponível (Biogenesis) foi preparado e utilizado como uma amostra padrão. Então, o anticorpo Y9A2 quimérico no sobrenadante da cultura acima-mencionada foi purificado por afinidade usando uma coluna de proteína A (GE Healthcare) para resultar em um anticorpo Y9A2 quimérico purificado. A concentração do anticorpo Y9A2 quimérico

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29/43 purificado foi calculada quando a concentração foi de 1 mg/mL quando a absorbância do comprimento de onda 280 nm foi de 1, 4 .

Exemplo 2 [0062] Teste de inibição da adesão celular do anticorpo Y92A quimérico.

[0063] Para comparar a atividade do anticorpo Y9A2 quimérico purificado, que foi preparado pelo método descrito na seção acima-mencionada, com aquele do anticorpo Y9A2 de camundongo (CHEMICON INTERNATIONAL) , o teste de inibição da adesão celular, descrito em “J. Biol. Chem., 274: 3632836334, 1999, foram realizados. Para especificar, uma variante (nOPN-RAA) onde a sequencia RGD contida no fragmento Nterminal (nOPN) resultante da clivagem da osteopontina com a trombina foi substituída pelo RAA que foi primeiro imobilizado e bloqueado, e um anticorpo Y9A2 de camundongo ou um anticorpo Y9A2 quimérico purificado foi adicionado. Sucessivamente, a células SW480 expressando a molécula da a9-integrina humana (algumas vezes, a seguir, denominada como SW480/célula ha9) foi adicionada, e a mistura foi incubada a 37°C durante 1h ora. Em seguida, a célula foi fixada e corada com violeta cristal e metanol, e lavada. O corante na célula aderida foi extraído com Triton X-100, e a absorbância em um comprimento de onda 595 nm foi medida.

[0064] Como resultado, como mostrado na Tabela 1, foi descoberto que IC50 do anticorpo Y9A2 de camundongo e que o anticorpo Y9A2 quimérico purificado foram quase os mesmos, e tiveram uma atividade de inibição do SW480/célula ha9 para nOPN-RAA. O IC50 é definido como sendo uma concentração do anticorpo anti-a9 integrina necessária para supressão de 50%

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30/43 do nível de adesão celular que ocorre sem a adição do anticorpo anti-a9 integrina.

Tabela 1 [0065] Resultado do teste de inibição da adesão celular do anticorpo Y9A2 de camundongo e do anticorpo Y9A2 quimérico.

	anticorpo Y9A2 de camundongo	anticorpo Y9A2 quimérico
IC50 (gg/mL)	0, 039	0, 038

Exemplo 3:

Produção do gene do anticorpo Y9A2 humanizado:

[0066] O anticorpo humano molde a ser enxertado com um aminoácido da região determinante da complementaridade (CDR) na VH e VL do anticorpo Y9A2 de camundongo foi selecionado a partir da linha germinativa do anticorpo humano tendo uma sequência de aminoácidos com alta homologia com a região estrutural (FR) da sequência de aminoácidos VH, VL do anticorpo Y9A2 de camundongo. Para ser específico, a VH humana molde selecionada foi uma combinação de DP-88 e JH6 e a VL humana molde selecionada foi uma combinação de DPK-1 e JK4 .

[0067] As FRs das VH e VL do anticorpo humano molde acimamencionadas foram enxertadas com as sequências de aminoácidos necessárias da VH e VL do anticorpo Y9A2 de camundongo para resultar em um anticorpo humanizado. Para ser específico, quando para VH, as sequências de aminoácidos CDR e vários sítios de FR da VH do aminoácido do anticorpo humano molde acima-mencionado foram primeiro substituído pelas sequências de aminoácidos correspondentes na VH do anticorpo Y9A2 de camundongo. As sequências dos aminoácidos de VH de dois tipos dos anticorpos Y9A2 humanizados, ou seja, RY9A2VHv5 e RY9A2VHv8, foram construídas (SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:7,

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31/43 respectivamente), e adicionalmente, as sequências básicas dos DNAs codificantes das sequências de aminoácidos foram construídas (SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:8, respectivamente) . Em RY9A2VHv8, 4 dos resíduos de aminoácidos FR derivados do anticorpo Y9A2 de camundongo em RY9A2VHv5 são substituídos por aqueles do anticorpo humano molde.

[0068] Quando para VL, a sequência de aminoácido CDR da VL do anticorpo humano molde foi substituído pela sequencia do aminoácido da CDR em VL do anticorpo Y9A2 de camundongo, a sequência dos aminoácidos de RY9A2VLv01, que é VL do anticorpo Y9A2 humanizados, foi construído (SEQ ID NO:9) e, adicionalmente, a sequência de base do DNA codificante da sequência de aminoácidos foi construída (SEQ ID NO:10).

[0069] Para produzir os fragmentos de DNA codificantes dos acima mencionados RY9A2VHv5, RY9A2VHv8 e RY9A2VLv01, a síntese total foi realizada por PCR usando um oligo-DNA como um material. Para ser específico, RY9A2VHv5 foi sintetizado por divisão deste dentro de 6 tipos de oligo-DNAs (descrito nas SEQ ID Nos: 29-34) para cobrir a extensão total de VH, como respectivamente mostrado na figura 3 e, usando eles, o PCR foi realizado através dos procedimentos a seguir. Ou seja, quantidades equivalentes de 6 tipos de oligo-DNAs foram misturadas. Usando a mistura como um molde e a DNA-polimerase Pyrobes (Takara Bio), uma etapa de 96°C, 30 segundos, 50°C, 30 segundos e 72°C, 3 minutos, foi repetida por 15 ciclos. Então, usando este produto de PCR (1 pL) como molde, o oligoDNA tem a sequência indicada em negrito na figura 3 (mostrado pelas SEQ ID Nos: 35 e 36) como um primer, e a DNA-polimerase Pyrobest, uma etapa de 96°C, 20 segundos e 72°C, 2 minutos foi repetida por 25 ciclos para amplificar a VH de extensão

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32/43 completa. O RY9A2VHv8 pode também ser geralmente produzido da mesma maneira.

[0070] Para produção de RY9A2VLv01, 15 ciclos de PCR foram realizados da mesma maneira como acima, usando seis olig-DNAs (mostrados pelas SEQ ID Nos:37-42) mostradas na figuras 4, e 25 ciclos de PCR foram realizados da mesma maneira como acima, usando o produto de amplificação como um molde, e o oligo-DNA tendo a sequência indicada em negrito na figura 4 (mostrada pelas SEQ ID Nos: 43 e 44) como um primer, assim, a VL de extensão total foi amplificada.

[0071] Em ambas, VH e VL acima mencionadas, como uma sequência guia do anticorpo, uma mesma sequência do anticorpo monoclonal anti-osteopontina humanizado descrito na publicação WO 2007/139165 foi utilizado. Em adição, ambas as extremidades dos fragmentos de DNA obtidos foram adicionadas com uma sequência de reconhecimento de HindIII e uma sequência de reconhecimento de BamHI para clonagem.

[0072] Os fragmentos de DNA assim obtidos de VH e VL foram digeridos com enzimas de restrição HindIII e BamHI, ligados com os vetores de expressão acima-mencionados AG-y1 e AG-κ, respectivamente, e introduzidos dentro da Escherichia coli de acordo com o método convencional para clonagem. O DNA plasmidial foi preparado a partir do clone de Escherichia coli obtido usando um kit QUIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Usando o DNA plasmidial obtido como um molde, a sequência básica das VH e VL clonadas foi analisada usando um Kit da Genomelab DTCS-Quick Start e um sequenciador CEQ2000 automático (ambos da BECKMAN COULTER), assim, clones tendo as sequências básicas construídas foram obtidos. Estes clones foram cultivados, e os plasmídeos de expressão de cadeia

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33/43 pesada e de cadeia leve foram purificados usando um kit EndoFree Plasmid Maxi (QIAGEN).

[0073] O plasmídeo de expressão de cadeia pesada purificado e o plasmídeo de expressão de cadeia leve foram misturados, e a mistura foi introduzida dentro da célula para expressar transitoriamente o anticorpo usando o Sistema de Expressão FreeStyle 293. Neste caso, um anticorpo Y9A2 humanizado expresso pela combinação de um plasmídeo de expressão de cadeia pesada inserido com RY9A2VHv5 e um plasmídeo de expressão de cadeia leve inserido com RY9A2VLv01 foi denominado, anticorpo RY9A2v501, e um anticorpo Y9A2 humanizado expresso pela combinação de um plasmídeo de expressão de cadeia pesada inserido com RY9A2VHv8 e um plasmídeo de expressão de cadeia leve inserido com RY9A2VLv01 foi denominado, anticorpo RY9A2v801.

[0074] A medida da concentração de cada anticorpo Y9A2 humanizado acumulado no sobrenadante da cultura e aquisição de um anticorpo purificado a partir do sobrenadante da cultura foi realizada pelo mesmo método, como o anticorpo Y9A2 quimérico acima-mencionado.

Exemplo 4:

Confirmação da atividade de ligação do anticorpo Y9A2 humanizado para a a9-integrina humana:

[0075] O anticorpo RY9A2v501 e do anticorpo Ry9A2v801 expressos pelo método acima-mencionado foram comparados com um anticorpo Y9A2 quimérico (algumas vezes a seguir indicado como anticorpo cY9A2) para atividade de ligação da molécula a9-integrina humana a um método de ELISA Celular. Para ser específico, as células SW480 expressando a molécula da α9integrina humana são imobilizadas em uma placa de ELISA,

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34/43 reagida com o anticorpo cY9A2 acima-mencionado ou o anticorpo RY9A2v501 ou o anticorpo RY9A2v801, e reagido com o anticorpo IgG anti-humana de cabra marcada com HRP (Fc) (American Qaulex) como um anticorpo secundário. O TMB foi adicionado para permitir o desenvolvimento da cor, diluído com a adição de ácido sulfúrico para resfriar rapidamente a reação e a absorbância em comprimento de onda 450 nm foi medida. Como resultado, como mostrado na figura 5 e na figura 6, foi confirmado que o anticorpo RY9A2v501 e o anticorpo RY9A2v801 teve atividade de ligação para a molécula de a9-integrina humana equivalente àquela do anticorpo cY9A2.

Exemplo 5:

Teste de inibição da adesão celular do anticorpo Y9A2 humanizado:

[0076] O anticorpo RY9A2v501 purificado acima-mencionado, o anticorpo RY9A2v801 e o anticorpo Y9A2 de camundongo foram submetidos ao teste de inibição de adesão celular da mesma maneira que no exemplo 2.

[0077] Os resultados são mostrados na tabela 2. O IC50 (gg/mL) foi definido como sendo uma concentração do anticorpo anti-a9 integrina necessária para supressão de 50% do nível de adesão celular que ocorre sem adição do anticorpo anti-a9 integrina. A média do valor de IC50 do anticorpo Y9A2 de camundongo foi de 0,070 gg/mL. A tabela 2 mostrou a atividade específica do anticorpo humanizado quando o valor IC50 do Y9A2 de camundongo é 1. A tabela 2 mostra um valor médio de duas corridas do teste. Como mostrado na tabela 2, foi confirmado que os dois tipos acima-mencionados de anticorpos humanizados, tinham atividade inibitória da adesão celular equivalentes àquela de um anticorpo Y9A2 de camundongo.

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Tabela 2 [0078] Resultados do teste de inibição da adesão celular do anticorpo Y9A2 de camundongo, do anticorpo RY90A2v501 e do anticorpo RY9A2v801.

Anticorpo	Atividade específica
Y9A2	1, 0
RY9A2v501	0, 77
RY9A2v801	0, 82

Exemplo 6:

Produção do anticorpo Y9A2 humanizado melhorado:

[0079] Como mencionado acima, uma vez que dois tipos de anticorpos Y9A2 humanizado (o anticorpo RY9A2v501 e anticorpo RY9A2v801) tendo a atividade de inibição da adesão celular no mesmo nível que o do anticorpo Y9A2 de camundongo original poderia ser adquirido, a presente invenção tem agora tentado melhora ainda mais o anticorpo Y9A2 humanizado pela introdução de mutação baseado nesse anticorpo humanizado.

[0080] Como resultado da perspicácia e consideração importantes pela presente invenção, foi obtido sucesso na produção, de um anticorpo Y9A2 humanizado tendo uma atividade significativamente superior em relação àquela do anticorpo Y9A2 de camundongo, obtendo os três tipos a seguir de anticorpos: o anticorpo RY9A2v12 (M34L)012, o anticorpo RY9A2v11 (M34L)012 e o anticorpo RY9A2v5(IAW)01.

1. Anticorpo RY9A2v12 (M34L)012 [0081] A região variável de cadeia pesada (VH) de RY9A2v12 (M34L)012 tem a sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:11 e a região variável de cadeia leve (VL) têm a sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:17. As sequências básicas de VH e VL do anticorpo RY9A2v12 (M34L)012 são mostradas pela SEQ ID Nos: 12 e 18, respectivamente. A VH do

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36/43 anticorpo RY9A2v12 (M34L)012 é o RY9A2vHv8 acima-mencionado (SEQ ID NO:7) onde um resíduo de metionina (34° resíduo de aminoácido da sequência de aminoácido VH) na CDR1 é substituído por leucina, bem como um resíduo de lisina e um resíduo de ácido aspártico (resíduos 65° e 66° da sequência da sequência de aminoácido VH) na CDR2 são substituídos por glutamina e glicina, respectivamente. A VL do anticorpo RY9A2v12 (M34L)012 é o acima-mencionado RY9A2VLv01 (SEQ ID NO:9) onde um resíduo de lisina (resíduo 24° de aminoácido da

sequência	VL	do aminoácido)	na CDR1 é	substituído	por
arginina.
2. Anticorpo	RY9A2v11 (M34L)12
[0082]	A	VH do anticorpo	RY9A2v11	(M34L)012 tem	a
sequência	de	aminoácido mostrada pela SEQ	ID NO:13, e a	VL

tem a sequência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO:17. As sequências básicas de VH e VL do anticorpo Ry9A2v11 (M34L)012 são mostradas pela SEQ ID Nos: 14 e 18, respectivamente. A VH do anticorpo RY9A2v11 (M34L) 012 é o RY9A2VHv5 acimamencionado (SEQ ID NO:5) onde um resíduo de metionina (resíduo 34° do aminoácido da sequência VH de aminoácido), na CDR1 é substituída a leucina, bem como um resíduo de lisina e um resíduo de ácido aspártico (resíduos 65° e 66° de aminoácidos da sequência VH do aminoácido), na CDR2 são substituídos pela glutamina e glicina, respectivamente. A VL do anticorpo RY9A2v11 (M34L)012 é o RY9A2VLv01 acimamencionado (SEQ ID NO:9) onde uma resídua lisina (resíduo 24° do aminoácido da sequência VL do aminoácido) na CDR1 é substituída por arginina.

3. Anticorpo RY9A2v5 (IAW)01.

[0083] A VH do anticorpo RYA2v5(IAW)01 tem a sequência de

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37/43 aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO;15, e a VL tem a sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:9. As sequências básicas de VH e VL de RY9A2v5 (IAW)01 são mostradas pelas SEQ ID NOs: 16 e 10, respectivamente. A VH do anticorpo RY9A2v5(IAW)01 é o RY9AVHv5 acima-mencionado (SEQ ID NO:5) onde um resíduo de metionina (resíduo 34° de aminoácidos da VH da sequência de aminoácidos) na CDR1 é substituída por isoleucina, bem como um resíduo de ácido aspártico e um resíduo de fenilalanina (resíduos 104° e 105° dos aminoácidos da sequência VH de aminoácidos) na CDR3 são substituídos por alanina e triptofano, respectivamente. A VL do anticorpo RY9A2v5 (IAW)01 é o mesmo que o RY9A2VLv01 (SEQ ID NO:9) acima-mencionado.

[0084] Os fragmentos de DNA de VH e VL dos três tipos acima-mencionados de anticorpo Y9A2 humanizado melhorado foram ligados com os vetores de expressão AG-y1 e AG-κ para resultar em um plasmídeo de expressão da mesma maneira como acima. O plasmídeo foi expresso usando o Sistema de Expressão 293 FreeStyle, e vários anticorpos purificados foram obtidos a partir do sobrenadante da cultura pelo uso de uma coluna de proteína A como acima-mencionado.

Exemplo 7:

Confirmação da atividade de ligação do anticorpo Y9A2 humanizado melhorado à a9-integrina humana:

[0085] Os três tipos de anticorpos Y9A2 humanizados e anticorpos cY9A2 produzidos como mencionado acima, foram confirmados para a atividade de ligação a a9-integrina humana pelo ELISA CELL da mesma maneira que a do exemplo 4. Como resultado, todos os anticorpos Y9A2 humanizados aperfeiçoados poderiam ser confirmados por ter atividade de

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38/43 ligação com a a9-integrina humana, igual a do anticorpo Y9A2 quimérico.

Exemplo 8:

Teste da inibição da adesão celular do anticorpo Y9A2 humanizado aperfeiçoado ao nOPN humano:

[0086] Para comparar a atividade dos três tipos de anticorpos Y9A2 humanizados aperfeiçoados com aquela de um anticorpo Y9A2 de camundongo, o teste da inibição da adesão celular foi realizado da mesma maneira que a do exemplo 2.

[0087] Os resultados são mostrados na tabela 3. O IC50 (gg/mL) é definido por ser uma concentração do anticorpo anti-a9 integrina necessário para supressão de 50% do nível da adesão celular que ocorre sem adição do anticorpo anti-a9 integrina. A média dos valores IC50 do anticorpo Y9A2 do camundongo foi 0,039 gg/mL. A tabela 3 mostra a atividade específica do anticorpo Y9A2 humanizado quando o valor IC50 do Y9A2 de camundongo é 1. Os valores médios de 2 ou 3 corridas dos testes são mostrados na Tabela 3. Foi encontrado que três tipos de anticorpos Y9A2 humanizados aperfeiçoados mostram menos que 4-vezes a atividade inibitória de adesão celular melhorada quando comparado àquele do anticorpo Y9A2 de camundongo.

Tabela 3 [0088] Resultados do teste de inibição da adesão celular do anticorpo Y9A2 humanizado aperfeiçoado.

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Anticorpo	Atividade específica
Y9A2	1, 0
RY9a2v5 (IAW)01	0,29
RY9a2v11 (M34L)012	0, 23
RY9a2v12 (M34L)012	0, 23

Exemplo 9:

Teste de inibição da adesão celular do anticorpo Y9A2 humanizado aperfeiçoado ao VCAM-1 humano e Tenascin C humano: [0089] Os três tipos dos anticorpos Y9A2 humanizados aperfeiçoados foram examinados usando um ligante diferente do nOPN-RAA utilizado para o teste de inibição da adesão celular acima-mencionado. Para ser específico, uma ação inibitória de adesão celular ao VCAM-1/Ig humano (R&D) e a variante Tenascin C-RAA humano, onde a sequência RGD de Tenascin C humano foi substituída por RAA, foi examinada da mesma maneira.

[0090] Valores médios de duas corridas dos testes são mostrados na Tabela 4. Um valor médio dos valores IC50 da atividade inibitória da adesão celular do anticorpo Y9A2 de camundongo ao VCAM-1 humano e Tenascin C-RAA humano foram 0,077 pg/mL e 0,041 pg/mL, respectivamente. A tabela 4 mostra a atividade específica do anticorpo Y9A2 humanizado quando o valor IC50 do anticorpo Y9A2 de camundongo é 1. Foi descoberto que os três tipos de anticorpos Y9A2 humanizados aperfeiçoados mostram uma atividade inibitória pelo menos equivalente àquela do anticorpo Y9A2 de camundongo, apesar de ser submetido a variação dependente do ligante utilizado.

Tabela 4 [0091] Resultados do teste de inibição da adesão celular do anticorpo Y9A2 humanizado aperfeiçoado ao VCAM-1 e Tenascin C.

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Anticorpo	Atividade específica de VCAM-1 humano	Atividade específica de Tenascin C-RAA humano
Y9A2	1, 0	1, 0
RY9a2v5 (IAW)01	1, 0	0, 44
RY9a2v11 (M34L)012	0, 44	0, 35
RY9a2v12 (M34L)012	0, 95	0,26

Exemplo 10:

Teste de inibição da migração celular do anticorpo Y9A2 humanizado melhorado:

[0092] Os três tipos de anticorpos Y9A2 humanizado melhorado foram examinados para uma ação inibitória da atividade de migração da célula SW480/ha9 contra nOPN-RAA. O experimento foi baseado no teste de inibição da migração celular descrita em “Molecular Biology of the cell, 12:32143225, 2001, com algumas mudanças feitas aqui. Para ser preciso, o nOPN-RAA foi imobilizado na camada superior de um trans-poço (Millipore), arranjado em uma placa, e então o meio F15 contendo 10% de FCS foi adicionado à camada inferior. O anticorpo Y9A2 de camundongo ou anticorpo Y9A2 humanizado foi adicionado junto com a célula SW480/ha9 para uma camada superior, e a mistura foi incubada a 37° durante 16 horas. Em seguida, as células que migraram dentro da camada inferior do transpoço foram quantificadas usando um kit de análise de 24 poços para migração celular QCM Chemotaxis (Millipore). A atividade de migração inibida pela adição de uma quantidade excessiva (100 μg/mL) do anticorpo Y9A2 camundongo é definido como uma atividade de migração a9-dependente (100% de inibição), e a taxa inibitória de cada anticorpo são mostradas na tabela 5.

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41/43 [0093] Uma ação inibitória de migração significativa foi descoberta apenas quando o anticorpo o anticorpo Y9A2 de camundongo foi adicionado em 50 gg/mL; entretanto, o anticorpo Y9A2 humanizado melhorado produzido pela presente invenção mostrou uma ação inibitória significante em uma concentração de 5 gg/mL, que é 1/10 no anticorpo Y9A2 de camundongo. O teste de diferença significativa foi realizado pelo teste T-Student em relação a um poço livre de anticorpo. *: P<0,05, **: P<0,01.

Tabela 5 [0094] Resultados do teste de inibição da adesão celular do anticorpo Y9A2 humanizado

Anticorpo	Concentração anticorpo (gg/mL)	Taxa de inibição (%)
Y9A2	5	28
	20	24
	50	99*
RY9a2v5 (IAW)01	5	109**
RY9a2v11 (M34L)012	5	84*
RY9a2v12 (M34L)012	5	86*

[0095] A ação inibitória da migração celular significante é diretamente ligada a uma concentração efetiva clinicamente, onde uma concentração clinicamente efetiva torna-se 1/10 conduz a intervalos extensos de administração (por exemplo, administração uma vez em duas semanas torna-se uma vez em vários meses, etc.) na prática clínica, e uma concentração de sangue mantida em cerca de 5 gg/mL permite o desenvolvimento de uma preparação subcutânea injetável. Uma vez que uma autoinjeção subcutânea é agora permitida em todo o mundo, a conveniência nas doenças crônicas é visivelmente

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42/43 aperfeiçoada, particularmente, para ambos, os pacientes e as instituições médicas. Portanto, o aperfeiçoamento da atividade biológica pela presente invenção contribui grandemente não apenas para a eficácia terapêutica do mesmo, mas também o aperfeiçoamento da anuência do paciente.

Exemplo 11:

Teste de estabilidade térmica do anticorpo Y9A2 humanizado aperfeiçoado:

[0096] Os três tipos de anticorpos Y9A2 humanizados aperfeiçoados e o anticorpo Y9A2 de camundongo foram incubados a 70°C durante 2 horas ou 10 horas, e avaliada quanto à estabilidade térmica usando o teste de inibição de adesão celular descrito no exemplo 8.

[0097] Os valores médios dos 4 experimentos são mostrados na tabela 6. Com a atividade inibitória da adesão celular sem um tratamento térmico como 100%, a taxa residual de atividade de cada anticorpo após o tratamento térmico é mostrada. Apesar do anticorpo Y9A2 de camundongo mostrar uma diminuição na atividade em 2 horas, os três tipos de anticorpos Y9A2 humanizados aperfeiçoados retêm 85% ou mais da atividade mesmo após a incubação durante 10 horas. Portanto, a propriedade de ser extremamente estável aquecer o anticorpo Y9A2 humanizado aperfeiçoado conduz ao desenvolvimento de uma preparação altamente conveniente permitindo a conservação à temperatura ambiente, antes da preparação para desenvolvimento clínico.

Tabela 6 [0098] Resultados da estabilidade térmica do anticorpo Y9A2 humanizado aperfeiçoado.

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Anticorpo	Taxa residual de atividade (%) em 2 horas	Taxa residual de atividade (%) em 10 horas
Y9A2	27	33
RY9a2v5 (IAW)01	89	86
RY9a2v11	92	87
(M34L)012
RY9a2v12	91	89
(M34L)012

Aplicabilidade industrial [0099] O anticorpo a9-integrina anti-humano humanizado aperfeiçoado da presente invenção tem atividade aperfeiçoada e/ou propriedade quando comparado com um anticorpo α9integrina anti-humano de camundongo doador, e uma forte ação antiinflamatória forte e uma forte ação de supressão da destruição do osso por bloqueio das interações entre a α9integrina humano e pluralidade de ligantes dos mesmos, e é útil para a profilaxia ou tratamento de várias doenças envolvendo a a9-integrina humana na patogênese.

[0100] Este pedido é baseado nos pedidos de patente Nos: 2008-004975, depositado no Japão (data de depósito: Janeiro 11, 2008) e 2008-282496 (data de depósito: Outubro 31, 2008), o conteúdo das quais sendo incorporado aqui em sua íntegra.

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo humanizado a9-integrina anti-humana, caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve selecionada a seguir:

   (a) uma região variável de cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:17;

   (b) uma região variável de cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:13 e uma região variável de cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:17; e (c) uma região variável de cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:15 e uma região variável de cadeia leve consistindo da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:9.
2. 2. Anticorpo humanizado a9-integrina anti-humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a região constante de cadeia pesada do anticorpo ser uma Igy1 humana.
3. 3. Anticorpo humanizado a9-integrina anti-humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a região constante de cadeia leve do anticorpo ser uma Ig_K humana.
4. 4. Anticorpo humanizado a9-integrina anti-humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a região constante de cadeia pesada do anticorpo ser uma Igy1 humana e a região constante de cadeia leve do anticorpo ser uma Ig_K humana.
5. 5. Anticorpo humanizado a9-integrina anti-humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a cadeia

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   2/2 pesada consistir da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:19 e a cadeia leve consistir da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO :25.
6. 6. Anticorpo humanizado a9-integrina anti-humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a cadeia pesada consistir da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:21 e a cadeia leve consistir da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:25.
7. 7. Anticorpo humanizado a9-integrina anti-humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a cadeia pesada consistir da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:23 e a cadeia leve consistir da sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO:27.
8. 8. Fármaco terapêutico para artrite reumatóide, caracterizado pelo fato de compreender o anticorpo humanizado a9-integrina anti-humana, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. 9. Uso do anticorpo humanizado a9-integrina anti-humana, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de um fármaco para prevenir ou tratar artrite reumatóide.