BRPI0907501B1

BRPI0907501B1 - construto de vetor, método para dirigir a transcrição, método de expressão de uma região de codificação exógena, método de alteração da expressão de um gene e método de produção de uma planta transgênica

Info

Publication number: BRPI0907501B1
Application number: BRPI0907501-1A
Authority: BR
Inventors: Richard Schneeberger; Emilio Margolles-Clark; Tatiana Tatarinova; Yiwen Fang; Nickolai Alexandrov; Leonard Medrano; Roger Pennell; Noah Theiss; Danielle Grizard; Shauna Davis; Dennis Robles; Michael Portereiko
Original assignee: Ceres, Inc
Priority date: 2008-02-01
Filing date: 2009-01-29
Publication date: 2021-02-23
Also published as: BRPI0907501A2; US20180119159A1; US9777285B2; US11572567B2; US20120124701A1; WO2009099899A2; WO2009099899A3; US20200392520A1; US20200392521A1; US10815490B2; US20150007365A1; CN101952435A; US11560569B2; CA2713138A1

Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, CONSTRUTO DE VETOR, PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA, SEMENTE DE UMA PLANTA, MÉTODO PARA DIRIGIR A TRANSCRIÇÃO MEDIANTE COMBINAÇÃO, MÉTODO DE EXPRESSÃO DE UMA REGIÃO DE CODIFICAÇÃO EXÓGENA EM UMA PLANTA, MÉTODO DE ALTERAÇÃO DA EXPRESSÃO DE UM GENE EM UMA PLANTA, PLANTA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA A presente invenção refere-se à sequências promotoras e elementos de controle promotores, construtos de polinucleotídeo compreendendo promotores e elementos de controle e métodos de identificação de promotores, elementos de controle ou fragmentos dos mesmos. A invenção refere-se ainda ao uso dos presentes promotores ou elementos de controle promotores para modular os níveis de transcrito em plantas e plantas contend tais promotores ou elementos de controle promotores.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao pedido provisório U.S. Número de Série 61/025.697, depositado em 1 de Fevereiro de 2008, os conteúdos todos do qual são aqui incor-porados por referência.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA OU TABELA

[0002] O material na listagem de sequência em anexo é aqui incorporado por referência ao presente pedido. O arquivo em anexo, denominado Sequence_Listing_2750-1720WO1.txt, foi criado em 22 de Dezembro de 2008 e tem 56 KB. O arquivo pode ser acessado usando o Microsoft Word em um computador que usa Windows OS.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção refere-se a promotores e elementos de controle promotores que são úteis para modulação de transcrição de um polinucleotídeo desejado. Tais promotores e elementos de controle promotores podem ser incluídos em constru- tos de polinucleotídeo, cassetes de expressão, vetores ou inseridos no cromossomo ou como um elemento exógeno, para modular a transcrição de um polinucleotídeo in vivo ou in vitro. Células hospedeiras, incluindo células de planta e organismos, tais como plantas regeneradas a partir dos mesmos, com traços ou características desejadas usando polinucleotídeos compreendendo o promotor e elementos de controle promotores da presente invenção também são parte da invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] A presente invenção refere-se à sequências promotoras e sequências de elemento de controle promotor, as quais são úteis para a transcrição de polinucleotídeos em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro transformado.

[0005] A introdução de genes em plantas tem resultado no desenvolvimento de plantas tendo fenótipos novos e úteis, tais como resistência a patógeno, níveis maiores de tipos mais saudáveis de óleos, nova produção de componentes saudáveis, tal como síntese de beta-caroteno em arroz. Um gene introduzido é, em geral, um gene quimérico composto da região de codificação que confere o traço desejado e sequências regulatórias. Uma sequência regulatória é o promotor, o qual está localizado 5' à região de codificação. Essa sequência está envolvida na regulação do padrão de expressão de uma região de codificação 3' da mesma. A sequência promotora se liga ao complexo de RNA po- limerase, bem como um ou mais fatores de transcrição que estão envolvidos na produção do transcrito de RNA da região de codificação.

[0006] A região promotora de um gene usado em transformação de planta é, mais frequentemente, derivado de uma fonte diferente da região de codificação. Ela pode ser de um gene diferente da mesma espécie de planta, de uma espécie diferente de planta, de um vírus de planta, uma espécie de alga, uma espécie fúngica ou pode ser um composto de diferentes sequências naturais e/ou sintéticas. Propriedades da sequência promotora geralmente determinam o padrão de expressão para a região de codificação que está operavelmente ligada ao promotor. Promotores com diferentes características de expressão foram des- critos. O promotor pode conferir ampla expressão, como no caso do promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) amplamente usado. O promotor pode conferir expressão tecido- específica, como no caso do promotor de faseolina semente- específico. O promotor pode conferir um padrão para alterações do desenvolvimento na expressão. O promotor pode ser induzido por um composto químico aplicado ou por uma condição ambiental aplicada à planta.

[0007] O promotor que é usado para regular uma região de codificação particular é determinada pelo padrão de expressão desejado para essa região de codificação a qual, em si, é determinada pelo fenótipo resultante desejado na planta. Por exemplo, resistência a herbicida é desejada para todas as plantas, de modo que o promotor 35S é apropriado para expresso de um gene de resistência a herbicida. Um promotor semente- específico é apropriado para alteração do teor de óleo de semente de soja. Um promotor endosperma-específico é apropriado para alteração da composição de amido de semente de milho. Um promotor raiz-específico pode ser importante para aprimoramento da captação de água ou nutrientes em uma planta. Controle de expressão de um gene introduzido pelo promotor é importante porque, algumas vezes, é prejudicial ter a expressão de um gene induzida em tecidos não-alvo. Por exemplo, um gene o qual induz à morte celular pode ser expresso em células de gameta feminino e/ou masculino com relação ao bioconfinamento.

[0008] Um dos objetivos primários da biotecnologia é obter organismos, tais como plantas, mamíferos, levedos e procariotas, tendo características ou traços desejados particulares. Exemplos dessas características ou traços não são limitados e incluem, por exemplo, em plantas, resistência a vírus, resistência a inseto, resistência a herbicida, estabilidade intensificada ou valor nutricional adicional. Avanços recentes em engenharia genética permitiram que os pesquisadores no campo incorporassem sequências de polinucleotídeo em células hospedeiras para obter as qualidades desejadas no organismo de escolha. Essa tecnologia permite que um ou mais polinucleotídeos de uma fonte diferente do organismo de escolha sejam transcritos pelo organismo de escolha. Se desejado, a transcrição e/ou tradução desses novos polinucleotídeos pode ser modulada no organismo para exibir uma característica ou traço desejado. Alternativamente, novos padrões de transcrição e/ou tradução de polinucleotídeos endógenos ao organismo podem ser produzidos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção é dirigida à sequências de polinu- cleotídeo isoladas que compreendem promotores e elementos de controle promotores de plantas, especialmente Arabidopsis tha- liana e outros promotores e elementos de controle promotores funcionais em plantas.

[0010] É um objetivo da presente invenção proporcionar poli- nucleotídeos isolados que são sequências promotoras ou de controle promotoras. Essas sequências promotoras compreendem, por exemplo: (1) um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo de acordo com qualquer uma de SEQ. ID. Nos. 1 - 26 ou os resíduos 601-1000 de SEQ ID NO: 26; (2) um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência a uma sequência de acordo com SEQ. ID. Nos. 1 - 26 ou os resíduos 601-1000 de SEQ ID NO: 26; e (3) um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo a qual se hibridiza a uma sequência de acordo com SEQ. ID. Nos. 1 - 26 ou os resíduos de ácido nucleico 601-1000 de SEQ ID NO: 26 sob uma condição que estabelece uma Tm-5°C.

[0011] Promotor ou sequências de elemento de controle promotor da presente invenção são capazes de modular a transcrição preferencial.

[0012] Em outra modalidade, os presentes elementos de controle promotores são capazes de servir como ou exercer a função, por exemplo, como um promotor central, uma caixa TATA, um sítio de ligação de polimerase, um sítio iniciador, um sítio de ligação de transcrição, um intensificador, uma repetição invertida, uma região de controle de locus e/ou uma região de fixação de matriz/base.

[0013] É ainda outro objetivo da presente invenção proporcionar um polinucleotídeo que inclui pelo menos um primeiro e um segundo elemento de controle promotor. O primeiro elemento de controle promotor é uma sequência de elemento de controle promotor conforme discutido acima e o segundo elemento de controle promotor é heterólogo ao primeiro elemento de controle; em que os primeiro e segundo elementos de controle são operavel- mente ligados. Tais promotores podem modular níveis de transcrito preferencialmente em um tecido em particular ou sob condições particulares.

[0014] Em outra modalidade, o presente polinucleotídeo isolado compreende um promotor ou a elemento de controle promotor conforme descrito acima, em que o promotor ou elemento de con- trole promotor é operavelmente ligado a um polinucleotídeo a ser transcrito.

[0015] Em outra modalidade da presente invenção, o promotor e elementos de controle promotores da presente invenção são ope- ravelmente ligados a um polinucleotídeo heterólogo que é uma sequência regulatória.

[0016] É outro objetivo da presente invenção proporcionar uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo isolado ou vetor conforme descrito acima ou fragmento do mesmo. Células hospedeiras incluem, por exemplo, células bacterianas, de levedo, inseto, mamífero, fungo, algas e plantas. A célula hospedeira compreende um promotor ou elemento de controle promotor exógeno ao genoma. Tal promotor pode modular transcrição em cis- e em trans-.

[0017] Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula de planta capaz de regeneração em uma planta.

[0018] É ainda outra modalidade da presente invenção proporcionar uma planta compreendendo um polinucleotídeo isolado ou vetor descrito acima.

[0019] É outro objetivo da presente invenção proporcionar um método de modulação da transcrição em uma amostra que contém um sistema de transcrição sem célula ou célula hospedeira. Esse método compreende fornecimento de um polinucleotídeo ou vetor de acordo com a presente invenção conforme descrito acima e contato da amostra dos polinucleotídeos ou vetor com condições que permitem a transcrição.

[0020] Em outra modalidade do presente método, os polinucleo- tídeos ou vetor modula, de preferência, dependendo da função do promotor em particular, a transcrição constitutiva, trans- crição estresse-induzida, transcrição luz-induzida, transcrição escuridão-induzida, transcrição em folha, transcrição em raiz, transcrição em caule ou broto, transcrição em silíqua ou frutos, transcrição em caule, transcrição em rizoma, transcrição em nódulo do caule, transcrição em tecido de gameta, transcrição em flor, transcrição específica para broto imaturo e inflorescência, transcrição senescência-induzida, transcrição em germinação e/ou transcrição em estiagem.

[0021] Uma modalidade da invenção é dirigida a uma molécula de ácido nucleico isolada tendo atividade promotora compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo con-sistindo em: a. uma sequência de nucleotídeo de acordo com qualquer uma de SEQ ID NOs. 1-26; b. uma sequência de nucleotídeo com os resíduos de ácido nu- cleico 601-1000 de SEQ ID NO: 26; c. uma sequência de nucleotídeo compreendendo um fragmento funcional de (a) ou (b), em que o referido fragmento tem atividade promotora e em que a referida molécula de ácido nuclei- co isolada não é SEQ ID NO: 5.

[0022] Outra modalidade da invenção é dirigida a uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nu- cleotídeo que mostra pelo menos 80 por cento de identidade de sequência a qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-26 ou os resíduos de ácido nucleico 601-1000 de SEQ ID NO: 26, em que a referida molécula de ácido nucleico compreende uma região regulatória que dirige a transcrição de um polinucleotídeo heterólogo ope- ravelmente ligado e em que a referida molécula de ácido nu- cleico isolada não é SEQ ID NO: 5.

[0023] Em outra modalidade da invenção, a molécula de ácido nucleico isolada mostra pelo menos 85 por cento de identidade de sequência a qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-26 ou os resíduos de ácido nucleico 601-1000 de SEQ ID NO: 26.

[0024] Em outra modalidade da invenção, a molécula de ácido nucleico isolada tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência a qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-26 ou os resíduos de ácido nucleico 601-1000 de SEQ ID NO: 26.

[0025] Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico isolada compreende pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo em um promotor, um intensificador e um íntron.

[0026] Em uma outra modalidade da invenção, a molécula de ácido nucleico isolada consiste em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-4, 6-26 e dos resíduos de ácido nucleico 601-1000 de SEQ ID NO: 26.

[0027] Outra modalidade da invenção é dirigida a um construto de vetor compreendendo: a. uma primeira molécula de ácido nucleico conforme descrito acima; e b. uma molécula de polinucleotídeo passível de transcrição, em que a referida primeira molécula de ácido nucleico e a referida molécula de polinucleotídeo passível de transcrição são heterólogas uma à outra e são operavelmente ligadas.

[0028] Em outra modalidade da invenção, a primeira molécula de ácido nucleico consiste na molécula de ácido nucleico apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-26 ou os resíduos de ácido nucleico 601-1000 de SEQ ID NO: 26.

[0029] Em outra modalidade da invenção, a molécula de polinu- cleotídeo passível de transcrição codifica um polipeptídeo.

[0030] Em outra modalidade da invenção, a molécula de polinu- cleotídeo passível de transcrição é operavelmente ligada à referida primeira molécula de ácido nucleico na orientação senso.

[0031] Em outra modalidade da invenção, a molécula de polinu- cleotídeo passível de transcrição é transcrita em uma molécula de RNA que expressa o polipeptídeo codificado pela molécula de polinucleotídeo passível de transcrição.

[0032] Em outra modalidade da invenção, a molécula de polinu- cleotídeo passível de transcrição é operavelmente ligado à referida primeira molécula de ácido nucleico na orientação an- tissenso.

[0033] Em outra modalidade da invenção, a molécula de polinu- cleotídeo passível de transcrição é transcrita em uma molécula de RNA antissenso.

[0034] Em outra modalidade da invenção, a molécula de polinu- cleotídeo passível de transcrição é transcrita em um RNA de interferência contra um gene endógeno.

[0035] Em outra modalidade da invenção, a molécula de polinu- cleotídeo passível de transcrição codifica um polipeptídeo de interesse agronômico.

[0036] Outra modalidade da invenção é dirigida a uma planta ou célula de planta compreendendo: a. a molécula de ácido nucleico descrita acima que é operavel- mente ligada a um polinucleotídeo heterólogo, ou b. o construto de vetor descrito acima.

[0037] Outra modalidade da invenção é dirigida a uma planta ou célula de planta estavelmente transformada com o construto de vetor descrito acima.

[0038] Outra modalidade da invenção é dirigida a uma semente de uma planta conforme descrito acima.

[0039] Outra modalidade da invenção é dirigida a um método para direcionar a transcrição mediante combinação, em um ambiente adequado para transcrição, de: a. uma primeira molécula de ácido nucleico conforme descrito acima; e b. uma molécula de polinucleotídeo passível de transcrição;em que a referida primeira molécula de ácido nucleico e a referida molécula de polinucleotídeo passível de transcrição são heterólogas uma à outra e operavelmente ligadas.

[0040] Outra modalidade da invenção é dirigida a um método de expressão de uma região de codificação exógena em uma planta compreendendo: a. transformação de uma célula de planta com um vetor conforme descrito acima, b. regeneração de uma planta estavelmente transformada a partir da célula de planta transformada da etapa (a); e c. seleção de plantas contendo uma célula de planta transformada, em que expressão da molécula de polinucleotídeo passível de transcrição resulta em produção de um polipeptídeo codificado pela referida molécula de polinucleotídeo passível de transcrição.

[0041] Outra modalidade da invenção é dirigida a um método para alteração da expressão de um gene em uma planta compreendendo: a. transformação de uma célula de planta com a molécula de ácido nucleico conforme descrito acima que é operavelmente li- gada a um polinucleotídeo heterólogo, e b. regeneração de plantas estavelmente transformadas a partir da referida célula de planta transformada.

[0042] Outra modalidade da invenção é dirigida a uma planta preparada de acordo com o método descrito acima.

[0043] Outra modalidade da invenção é dirigida a uma semente da planta descrita acima.

[0044] Outra modalidade da invenção é dirigida a um método de produção de uma planta transgênica, o referido método compreendendo:a. introdução em uma célula de planta: (i) um polinucleotídeo isolado compreendendo o ácido nucleico conforme descrito acima que é operavelmente ligado a um poli- nucleotídeo heterólogo, ou (ii) o vetor conforme descrito acima; e b. crescimento de uma planta a partir da referida célula de planta.

[0045] Esses e outros objetivos da presente invenção se tornarão claros ou se tornarão evidentes a partir da descrição a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS TABELAS E FIGURAS

[0046] As Tabelas consistem nos Relatórios de Expressão para alguns dos promotores da invenção que fornecem a sequência de nucleotídeo para cada promotor e detalhes quanto à expressão acionada para cada uma das sequências promotoras de ácido nu- cleico, conforme observado em plantas transgênicas. Os resultados são apresentados como resumos da expressão espacial, a qual fornece informação sobre a expressão de modo geral e/ou específica em vários órgãos e tecidos de planta. O padrão de expressão observado também é apresentado, o qual fornece detalhes da expressão durante diferentes gerações ou diferentes estágios de desenvolvimento dentro de uma geração. Informação adicional é fornecida com relação ao organismo fonte do promotor e o vetor e genes marcadores usados para o construto. Os símbolos a seguir são usados consistentemente por toda a Tabela: - T1: Transformante da primeira geração - T2: Transformante da segunda geração - T3: Transformante da terceira geração - (L): Baixo nível de expressão - (M): Nível médio de expressão - (H): Alto nível de expressão

[0047] Cada fileira de cada tabela começa com o cabeçalho dos dados a serem encontrados na seção. O seguinte fornece uma descrição dos dados a serem encontrados em cada seção.

[0048] Alguns relatos de promotor descrevem experimentos adicionais e os resultados com o promotor em particular.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0049] A Figura 1 é uma representação esquemática de um vetor pNewbin4-HAP1-GFP que é útil para inserir os promotores da invenção em uma planta. As definições das abreviações usadas no mapa do vetor são como segue: Ori - a origem de replicação usada por um hospedeiro E. coli RB - sequência para a borda direita do T-DNA de pMOG800 BstXI - sítio de clivagem de enzima de restrição usado para clonagem HAP1VP16 - sequência de codificação para uma proteína de fusão dos domínios de ativação HAP1 e VP16 NOS - região terminadora do gene de sintase de nopalina HAP1UAS - a sequência de ativação a montante para HAP1 5ERGFP - o gene de proteína fluorescente verde que foi otimizado para localização no retículo endoplásmico OCS2 - a sequência terminadora do gene de sintase de octopina 2 OCS - a sequência terminadora do gene de sintase de octopina p28716 (a.k.a. 28716 curto) - promotor usado para acionar a expressão do gene PAT (BAR) PAT (BAR) - um gene marcador que confere resistência a herbicida LB - sequência para a borda esquerda do T-DNA de pMOG800 Spec - um gene marcador que confere resistência a espectinomi- cina TrfA - gene de fator de repressão de transcrição RK2-OriV - origem de replicação para Agrobacterium

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0050] As definições e métodos a seguir são fornecidos para definir melhor a presente invenção e orientar aqueles versados na técnica na prática da presente invenção. A menos que de outro modo mencionado, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles versados na técnica relevante.

[0051] A invenção divulgada aqui proporciona promotores capazes de acionar a expressão de um transgene operavelmente ligado. O design, construção e uso desses promotores são um obje- tivo da invenção. As sequências promotoras, SEQ ID NOs: 1 - 26 e resíduos 601-1000 de SEQ ID NO: 26, são capazes de transcrição de moléculas de ácido nucleico operavelmente ligadas em tecidos/órgãos de planta particulares durante estágios de crescimento particulares de uma planta e, portanto, podem regular seletivamente a expressão de transgenes nesses teci- dos/órgãos ou nesses momentos do desenvolvimento de uma planta.

1. Definições

[0052] Quimérico: O termo "quimérico" é usado para descrever polinucleotídeos ou genes ou construtos em que pelo menos dois dos elementos dos polinucleotídeos ou gene ou construtos, tais como o promotor e o polinucleotídeo a ser transcrito e/ou outras sequências regulatórias e/ou sequências enchedoras e/ou complementos das mesmas, são heterólogos um ao outro.

[0053] Promotor de expressão ampla: Promotores referidos aqui como "promotores de expressão ampla" promovem ativamente a transcrição sob a maioria, mas não necessariamente todas, as condições ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação celular. Exemplos de promotores de expressão ampla incluem a região de início de transcrição 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) e o promotor 1' ou 2' derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens e outras regiões de início de transcrição de vários genes de planta, tal como o promotor de ubiquitina-1 de milho, conhecido por aqueles versados na técnica.

[0054] Domínio: Domínios são "impressões digitais" ou assinaturas que podem ser usadas para caracterizar famílias de proteína e/ou partes de proteína. Tais "impressões digitais" ou assinaturas podem compreender (1) a sequência primária conservada, (2) estrutura secundária e/ou (3) conformação tridimensional. Uma análise similar pode ser aplicada aos polinucleo- tídeos. Em geral, cada domínio foi associado a uma sequência primária conservada ou um motivo de sequência. Em geral, esses motivos de sequência primária conservada foram correlacionados com atividades específicas in vitro e/ou in vivo. Um domínio pode ter qualquer comprimento, incluindo a totalidade dos po- linucleotídeos a serem transcritos. Exemplos de domínios incluem, sem limitação, AP2, helicase, homeobox, dedo de zinco, etc.

[0055] Endógeno: O termo "endógeno", dentro do contexto da presente invenção, refere-se à qualquer sequência de polinu- cleotídeo, polipeptídeo ou proteína a qual é uma parte natural de uma célula ou organismo(s) regenerado(s) a partir da referida célula. No contexto de um promotor, o termo "região de codificação endógena" ou "cDNA endógeno" refere-se à região de codificação que está naturalmente ligada operavelmente ao promotor.

[0056] Intensificador/Supressor: Um "intensificador" é um elemento regulatório de DNA que pode aumentar o nível de estado uniforme de um transcrito, usualmente aumentando a taxa de início de transcrição. Intensificadores usualmente exercem seu efeito a despeito da distância, localização a montante ou a jusante ou orientação do intensificador com relação ao sítio de início de transcrição. Em contraste, um "supressor" é um elemento regulatório de DNA correspondente que diminuiu o ní-vel em estado uniforme de um transcrito, novamente afetando, usualmente, a taxa de início de transcrição. A atividade es- sencial dos elementos intensificadores e supressores é se ligar a um fator de proteína. Tal ligação pode ser avaliada, por exemplo, através dos métodos descritos abaixo. A ligação é, tipicamente, de uma maneira que influencia o nível em estado uniforme de um transcrito em uma célula ou em um extrato de transcrição in vitro.

[0057] Exógena: Conforme mencionado aqui, "exógena" é qualquer sequência de polinucleotídeo, polipeptídeo ou proteína, seja quimérica ou não, que é introduzida no genoma de uma célula hospedeira ou organismo regenerado a partir da referida célula hospedeira através de qualquer outro meio que não mediante cruzamento sexual. Exemplos de meios pelos quais isso pode ser realizado são descritos abaixo e incluem transformação mediada por Agrobacterium (de dicotiledôneas - por exemplo, Salomon et al. (1984) EMBO J. 3: 141; Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2: 987; de monocotiledôneas, artigos representativos são aqueles de Escudero et al. (1996) Plant J. 10: 355), Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14: 745, May et al. (1995) Bio/Technology 13: 486), métodos biolísticos (Armaleo et al. (1990) Current Genetics 17: 97), eletroporação, técnicas in planta e similares. Tal planta contendo o ácido nuclei- co exógeno é referida aqui como uma T0 para a planta transgêni- ca primária e T1 para a primeira geração. O termo "exógeno", conforme usado aqui, também se destina a abranger a inserção de um elemento naturalmente encontrado em um local não naturalmente encontrado.

[0058] Sequências heterólogas: "Sequências heterólogas" são aquelas que não são operativamente ligadas ou não são contíguas umas às outras na natureza. Por exemplo, um promotor de milho é considerado heterólogo a uma sequência de região de codificação de Arabidopsis. Também, um promotor de um gene que codifica um fator de crescimento de milho é considerado hete- rólogo a uma sequência que codifica o receptor de milho para o fator de crescimento. Sequências de elemento regulatório, tais como UTRs ou sequências de término na extremidade 3' que não se originam, na natureza, do mesmo gene que a sequência de codificação, são consideradas heterólogas à referida sequência de codificação. Elementos operativamente ligados na natureza e contíguos uns aos outros não são heterólogos uns aos outros. Por outro lado, esses mesmos elementos permanecem operativamente ligados, mas alguns se tornam heterólogos se outra sequência enchedora é colocada entre os mesmos. Assim, o promotor e as sequências de codificação de um gene de milho que expressa um transportador de aminoácido não são heterólogos uns aos outros, mas o promotor e a sequência de codificação de um gene de milho operativamente ligados de uma nova maneira são heterólogos.

[0059] Homólogo: Na presente invenção, um polinucleotídeo "homólogo" refere-se a um polinucleotídeo que compartilha similaridade de sequência com os polinucleotídeos de interesse. Essa similaridade pode estar apenas em um fragmentos da sequência e frequentemente representa um domínio funcional tal como, exemplos incluindo, sem limitação, um domínio de ligação de DNA ou um domínio com atividade de quinase de tirosina. As atividades funcionais de polinucleotídeos homólogos não são necessariamente as mesmas.

[0060] Promotor induzível: Um "promotor induzível", no contexto da presente invenção, refere-se a um promotor, a ativi- dade do qual é influenciada por determinadas condições, tais como luz, temperatura, concentração química, concentração de proteína, condições em um organismo, célula ou organela, etc. Um exemplo típico de um promotor induzível, o qual pode ser utilizado com o polinucleotídeo da presente invenção é PARSK1, o promotor de um gene de Arabidopsis que codifica uma enzima de quinase de serina-treonina e promotor o qual é induzido por desidratação, ácido abscísico e cloreto de sódio (Wang e Goodman (1995) Plant J. 8: 37). Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição através de promotores induzí- veis incluem condições anaeróbicas, temperatura elevada, a presença ou ausência de um nutriente ou outro composto químico ou a presença de luz.

[0061] Expressão errônea: O termo "expressão errônea" refere- se a um aumento ou uma diminuição na transcrição de uma região de codificação em uma sequência de RNA complementar comparado com o tipo silvestre. Esse termo também abrange expressão e/ou tradução de um gene ou região de codificação ou inibição de tal transcrição e/ou tradução durante um período de tempo diferente quando comparado com o tipo silvestre e/ou a partir de uma localização não natural dentro do genoma da planta, incluindo um gene ou região de codificação de uma espécie de planta diferente ou de um organismo não vegetal.

[0062] Modula o nível de transcrição: Conforme usado aqui, a frase "modula a transcrição" descreve a atividade biológica de uma sequência promotora ou elemento de controle promotor. Tal modulação inclui, sem limitação, super- e sub-regulação de início de transcrição, taxa de transcrição e/ou níveis de transcrição.

[0063] Ligação operável: Uma "ligação operável" é uma ligação na qual uma sequência promotora ou elemento de controle promotor é conectado a uma sequência de polinucleotídeo (ou sequências) de uma forma tal a colocar a transcrição da sequência de polinucleotídeo sob a influencia ou controle do promotor ou elemento de controle promotor. Duas sequências de DNA (tal como um polinucleotídeo a ser transcrito e uma sequência promotora ligados à extremidade 5' do polinucleotídeo a ser trans-crito) são ditas como estando operavelmente ligadas se indução de função do promotor resulta na transcrição do mRNA que codifica o polinucleotídeo e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) resulta na introdução de uma mutação com desvio de quadro, (2) interfere com a capacidade da sequência promotora de dirigir a expressão da proteína, RNA antissenso, RNAi ou ribozima ou (3) interfere com a capacidade do modelo (template) de DNA de ser transcrito. Assim, uma sequência promotora estaria operavelmente ligada a uma sequência de polinucleotídeo se o promotor for capaz de realizar a transcrição da sequência de polinucleotídeo.

[0064] Percentual de identidade de sequência: Conforme usado aqui, o termo "identidade de sequência percentual" refere-se ao grau de identidade entre qualquer dada sequência query, por exemplo, SEQ ID NOs: 1-26 e uma sequência em questão. Uma sequência em questão tem, tipicamente, um comprimento que é de cerca de 80 por cento a 250 por cento do comprimento da se-quência query, por exemplo, 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115 ou 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 ou 250 por cento do comprimento da sequência query, uma sequência de ácido nucleico ou aminoá- cido query é alinhada com uma ou mais sequências de ácido nu- cleico ou aminoácido em questão usando o programa de computador ClustalW (versão 1.83, parâmetros default), o qual permite que alinhamentos de sequências de ácido nucleico ou proteína sejam realizados por todo seu comprimento (alinhamento global). Chenna et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31(13): 3497500.

[0065] O ClustalW calcula a melhor combinação entre uma sequência query e uma ou mais sequências em questão e alinha as mesmas de modo que identidades, similaridades e diferenças possam ser determinadas. Gaps de um ou mais resíduos podem ser inseridas em uma sequência query, uma sequência em questão ou ambas, a fim de maximizar alinhamentos de sequência. Para alinhamento aos pares rápido de sequências de ácido nucleico, os seguintes parâmetros default são usados: tamanho de palavra: 2; tamanho de janela: 4; método escoring: percentual; número de diagonais superiores: 4; e penalidade pelo gap: 5. Para um alinhamento de múltiplas sequências de ácido nucleico, os seguintes parâmetros são usados: penalidade por abertura de: 10,0; penalidade por extensão de gap: 5,0; e transições de peso: sim. Para alinhamento rápido aos pares de sequências de proteína, os seguintes parâmetros são usados: tamanho de palavra: 1; tamanho de janela: 5; método escoring: percentual; número de diagonais superiores: 5; penalidade pelo gap: 3. Para múltiplos alinhamentos de sequências de proteína, os seguintes parâmetros são usados: matriz de peso: blosum; penalidade por abertura de gap: 10,0; penalidade por extensão de gap: 0,05; gaps hidrofílicas: ativado; resíduos hidrofílicos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg e Lys; penalidades por gap resí duo-específica: ativado. O resultado é um alinhamento de sequência que reflete a relação entre as sequências. O ClustalW pode ser encontrado, por exemplo, no website Baylor College de Medicine Search Launcher e no website European Bioinformatics Institute na Red de Alcance Mundical.

[0066] Para determinar a identidade percentual de uma sequência de polipeptídeo ou ácido nucleico em questão com relação a uma sequência query, as sequências são alinhadas usando o Clu- stal W, o número de combinações idênticas no alinhamento é dividido pelo comprimento da sequência query e o resultado é multiplicado por 100. O resultado é a identidade percentual da sequência em questão com relação à sequência query. Deve ser notado que o valor de identidade percentual pode ser arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13 e 78,14 são arredondados para 78,1, enquanto que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 e 78,19 são arredondados para 78,2.

[0067] Promotor de planta: Um "promotor de planta" é um promotor capaz de iniciar a transcrição em células de planta e pode modular a transcrição de um polinucleotídeo. Tais promotores não precisam ser originários de planta. Por exemplo, promotores derivados de vírus de planta, tal como o promotor CaMV35S ou de Agrobacterium tumefaciens, tal como os promotores de T-DNA, podem ser promotores de planta. Um exemplo típico de um promotor de planta originário de planta é o promotor de ubiquitina-1 de milho (ubi-1) conhecido por aqueles versados na técnica.

[0068] Tecido de Planta: O termo "tecido de planta" inclui tecidos ou plantas diferenciadas e não diferenciadas incluindo, mas não limitado a, raízes, caules, brotos, rizomas, coti- lédones, epicótilo, hipocótilo, folhas, pólen, sementes, tecido de caule e várias formas de células em cultura, tais como células únicas, protoplasto, embriões e tecido de caule. Um tecido de planta pode estar em plantas ou em uma cultura de órgão, tecido ou célula.

[0069] Transcrição Preferencial: "Transcrição preferencial" é definida como a transcrição que ocorre em um padrão particular de tipos de célula ou momentos de desenvolvimento ou em resposta a estímulos específicos ou combinação dos mesmos. Exemplos não limitativos de transcrição preferencial incluem: altos níveis de transcrito de uma sequência desejada em tecidos da raiz; níveis detectáveis de transcrito de uma sequência desejada em determinados tipos de célula durante embriogênese; e baixos níveis de transcrito de uma sequência desejada sob condições de estiagem. Tal transcrição preferencial pode ser determinada mediante medição de início, taxa e/ou níveis de transcrição.

[0070] Promotor: Um "promotor" é uma sequência de DNA que dirige a transcrição de um polinucleotídeo. Tipicamente, um promotor está localizado na região 5' de um polinucleotídeo a ser transcrito, proximal ao sítio de início de transcrição de tal polinucleotídeo. Mais tipicamente, promotores são definidos como a região a montante do primeiro éxon; mais tipicamente, como uma região a montante do primeiro de múltiplos sítios de início de transcrição; mais tipicamente, como a região a jusante do gene precedente e a montante do primeiro de múltiplos sítios de início de transcrição; mais tipicamente, a região a jusante do sinal poliA e a montante do primeiro de múltiplos sítios de início de transcrição; ainda mais tipicamente, cerca de 3.000 nucleotídeos a montante do ATG do primeiro éxon; ainda mais tipicamente, 2.000 nucleotídeos a montante do primeiro de múltiplos sítios de início de transcrição. Os promotores da invenção compreendem pelo menos um promotor central, conforme definido acima. Frequentemente, promotores são capazes de dirigir a transcrição de genes localizados sobre cada uma das fitas de DNA complementares que estão a 3' do promotor. Falando de modo diferente, muitos promotores exibem bidirecionalidade e podem dirigir a transcrição de um gene a jusante quando presentes em qualquer orientação (isto é, 5' para 3' ou 3' para 5' com relação à região de codificação do gene). Adicionalmente, o promotor pode também incluir pelo menos um element de controle, tal como um elemento a montante. Tais elementos incluem UARs e opcionalmente outras sequências de DNA que afetam a transcrição de um polinucleotídeo, tal como um elemento sintético a montante.

[0071] Elemento de controle promotor: O termo "elemento de controle promotor", conforme usado aqui, descreve elementos que influenciam a atividade do promotor. Elementos de controle promotores incluem determinantes de sequência regulatória transcricional tais como, mas não limitado a, intensificado- res, regiões de fixação de base/matriz, caixas TATA, regiões de controle de locus de início de transcrição, UARs, URRs, outros sítios de ligação de fator de transcrição e repetições invertidas.

[0072] Sequência pública: O termo "sequência pública", conforme usado no contexto do presente pedido, refere-se à qualquer sequência que tenha sido depositada em um banco de dados publicamente acessível antes da data de depósito do presente pedido. Esse termo abrange sequências de aminoácido e nucleo- tídeo. Tais sequências estão publicamente acessíveis, por exemplo, nos bancos de dados BLAST do web site NCBI FTP (aces-sível via a internet). O banco de dados no site NCBI FTP utiliza números "gi" atribuídos pelo NCBI como um identificador único para cada sequência nos bancos de dados, desse modo, proporcionando um banco de dados não redundante para sequências de vários bancos de dados, incluindo GenBank, EMBL, DBBJ (Banco de Dados de DNA do Japão) e PDB (Brookhaven Protein Data Bank).

[0073] Regiões regulatórias: O termo "região regulatória", conforme usado na presente invenção, refere-se à sequências de nucleotídeo que, quando operavelmente ligadas a uma sequência, influenciam o início de transcrição ou tradução ou término de transcrição da referida sequência e a taxa dos referidos processos e/ou estabilidade e/ou mobilidade de um transcrito ou produto polipeptídico. Conforme usado aqui, o termo "operavel- mente ligado" refere-se ao posicionamento de uma região regu- latória e da referida sequência para permitir a referida influência. Regiões regulatórias incluem, sem limitação, sequências promotoras, sequências intensificadoras, elementos de resposta, sítios de reconhecimento de proteína, elementos in- duzíveis, elementos de controle promotores, sequências de ligação de proteína, regiões não traduzidas 5' e 3' (UTRs), sítios de início de transcrição, sequências de término, sequências de poliadenilação e íntrons.

[0074] As sequências de ácido nucleico apresentadas em SEQ ID NOs: 1-26 são exemplos de regiões regulatórias fornecidas aqui. Contudo, uma regiaor regulatória pode ter uma sequência de nucleotídeo que desvia daquela apresentada em SEQ ID NOs: 1-26, ao mesmo tempo em que retém a capacidade de dirigir a expressão de um ácido nucleico operavelmente ligado. Por exemplo, uma região regulatória tendo 80% ou maior (por exemplo, 85% ou maior, 90% ou maior 91% ou maior, 92% ou maior, 93% ou maior, 94% ou maior, 95% ou maior, 96% ou maior, 97% ou maior, 98% ou maior ou 99% ou maior) de identidade de sequência à sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NOs: 1-25 ou 26 pode dirigir a expressão de um ácido nucleico operavelmente ligado.

[0075] Uma região regulatória pode também ser um fragmento de SEQ ID NOs: 1-25 ou 26, ao mesmo tempo em que retém a atividade promotora, isto é, a capacidade de dirigir a expressão de um ácido nucleico operavelmente ligado. Exemplos adicionais de regiões regulatórias são identificados na Listagem de Sequência.

[0076] Regiões regulatórias podem ser classificadas em duas categorias, promotores e outras regiões regulatórias.

[0077] Sequência regulatória: O termo "sequência regulató- ria", conforme usado na presente invenção, refere-se à qualquer sequência de nucleotídeo que influencia o início de transcrição ou tradução ou estabilidade e/ou mobilidade de um transcrito ou produto polipeptídico. Sequências regulatórias incluem, mas não estão limitadas a sequências promotoras, sequências intensificadoras, elementos de resposta, sítios de reconhecimento de proteína, elementos induzíveis, elementos de controle promotores, sequências de ligação de proteína, regiões não traduzidas 5' e 3' (UTRs), sítios de início de transcrição, sequências de término, sequências de poliadenilação, íntrons, determinadas sequências com sequências de codificação de aminoácido, tais como sinais secretórios, sítios de clivagem de protease, etc.

[0078] Uma região 5' não traduzida (5' UTR) de um gene é geralmente definida como um segmento de polinucleotídeo entre o sítio de início de transcrição (TSS) e o sítio de início da sequência de codificação (códon ATG) de um RNA mensageiro ou cDNA. Alternativamente, a 5' UTR pode ser elementos de DNA sinteticamente produzidos ou manipulados. Uma "5'UTR de planta" pode ser uma 5'UTR nativa ou não nativa que é funcional em células de planta. Uma 5' UTR pode ser usada como um elemento 5' regulatório para modulação de expressão de uma molécula de polinucleotídeo passível de transcrição operavelmente ligada. Por exemplo, foi demonstrado que 5' UTRs derivadas de genes de proteína de choque térmico intensificam a expressão gênica em plantas (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 5.659.122 e Patente U.S. N° 5.362.865, todas as quais são incorporadas aqui por referência). Exemplos de 5'UTRs incluem aquelas mostradas em SEQ ID NOs: 1-4, 6-10, 13-26.

[0079] Promotores específicos: No contexto da presente invenção, "promotores específicos" refere-se a um subconjunto de promotores que têm alta preferência pela modulação dos níveis de transcrito em um tecido ou órgão ou célula e/ou um momento específico durante desenvolvimento de um organismo. Por "alta preferência" entenda-se um aumento de pelo menos 3 vezes, de preferência 5 vezes, mais preferivelmente pelo menos 10 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes nos níveis de transcrito sob a condição específica com relação à transcrição sob qualquer outra condição de refe- rência considerada. Exemplos típicos de promotores temporal e/ou tecido ou órgão específicos originários de planta que podem ser usados com os polinucleotídeos da presente invenção são: PTA29, um promotor o qual é capaz de acionar a transcrição gênica especificamente na membrana e apenas durante desenvolvimento de antero (Koltonow et al. (1990) Plant Cell 2: 1201; RCc2 e RCc3, promotores que dirigem a transcrição gênica raiz-específica em arroz (Xu et al. (1995) Plant Mol. Biol. 27: 237; TobRB27, um promotor raiz-específico de tabaco (Yama-moto et al. (1991) Plant Cell 3: 371). Exemplos de promotores tecido-específicos sob controle de desenvolvimento incluem promotores que iniciam a transcrição apenas em determinados tecidos ou órgãos, tais como raiz, óvulo, fruto, sementes ou flores. Outros promotores específicos incluem aqueles de genes que codificam proteínas de armazenamento em semente ou a proteína da membrana do corpo lipídico, oleosina. Uns poucos promotores raiz-específicos são mencionados acima. Vide também "transcrição preferencial".

[0080] Uma região regulatória pode conter motivos regulató- rios conservados. Tal região regulatória pode ser qualquer uma das sequências apresentadas em SEQ ID NOs: 1-26 ou uma região regulatória tendo uma sequência de nucleotídeo que desvia de qualquer uma daquelas apresentadas em SEQ ID NOs: 1-26, ao mesmo tempo em que retém a capacidade de dirigir a expressão de um ácido nucleico operavelmente ligado. Por exemplo, uma região regulatória pode conter um motivo de caixa CAAT ou uma caixa TATA. Uma caixa CAAT é uma sequência de nucleotídeo conservada envolvida no início de transcrição. Uma caixa CAAT funciona como um sítio de reconhecimento e ligação para prote- ínas regulatórias denominadas fatores de transcrição. Uma caixa TATA é outra sequência de nucleotídeo conservada envolvida em início de transcrição. Uma caixa TATA parece ser importante na determinação precisa da posição na qual a transcrição é iniciada.

[0081] Outros motivos regulatórios conservados podem ser identificados usando métodos conhecidos no campo. Por exemplo, uma região regulatória pode ser analisada usando o programa Web Signal Scan do PLACE (PLAnt Cis-acting regulatory DNA Elements) na Red de Alcance Mundical em dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html. Vide, Higo et al., Nucleic Acids Research, 27(1): 297-300 (1999); e Prestridge, CABIOS, 7: 203-206 (1991). Exemplos de motivos regulatórios conservados podem ser encontrados no banco de dados PLACE na Red de Alcance Mundical em dna.affrc.go.jp/PLACE/. Vide, Higo et al., supra.

[0082] Uma região regulatória, tal como qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-26 ou uma região regulatória tendo uma sequência de nucleotídeo que deriva daquela apresentada em SEQ ID NOs: 1-26, ao mesmo tempo em que retém a capacidade de dirigir a expressão de um ácido nucleico operavelmente ligado, pode conter um ou mais motivos regulatórios conservados, os quais podem ser encontrados no banco de dados PLACE. Por exemplo, tal região regulatória pode conter um motivo -300CORE tendo a sequência de consenso TGTAAAG. Vide, Forde et al., Nucleic Acids Res 13: 7327-7339 (1985); Colot et al., EMBO J 6: 3559-3564 (1987); Thomas e Flavell, Plant Cell 2: 1171-1180 (1990); Thompson et al., Plant Mol Biol 15: 755-764 (1990); Vicente- Carbajosa et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 7685-7690 (1997); Mena et al., Plant J 16: 53-62 (1998); Shing, Plant Physiol 118: 1111-1120 (1998). Tal região regulatória pode conter um motivo ABREATCONSENSUS tendo a sequência de consenso YACGTGGC. Vide, Choi et al., J Biol Chem 275: 1723-1730 (2000); Kang et al., Plant Cell 14: 343-357 (2002); Oh et al., Plant Physiology 138: 341-351 (2005); Choi et al., Plant Physiol 139: 1750-1761(2005). Tal região regulatória pode conter um motivo ABREATRD22 tendo a sequência de consenso RYACGTGGYR. Vide, Iwasaki et al., Mol Gen Genet 247: 391-398 (1995); Bray, Trends em Plant Science 2: 48-54 (1997); Busk e Pages, Plant Mol Biol 37: 425-435 (1998). Uma região regulatória pode conter um motivo ABRELATERD1 tendo a sequência de consenso ACGTG. Vide, Simpson et al., Plant J 33: 259-270 (2003); Nakashima et al., Plant Mol Biol 60: 51-68 (2006). Uma região regulatória pode conter um motivo ABREMOTIFAOSOSEM tendo a sequência de consenso TACGTGTC. Vide, Hattori et al., Plant J 7: 913-925 (1995); Hobo et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 15348-15353 (1999). Uma região regulatória pode conter um motivo ABRERAT- CAL tendo a sequência de consenso MACGYGB. Vide, Kaplan et al., Plant Cell 18: 2733-2748 (2006). Uma região regulatória pode conter um motivo ACGTCBOX tendo a sequência de consenso GACGTC. Vide, Foster et al., FASEB J 8: 192-200 (1994); Izawa et al., Plant Cell 6: 1277-1287 (1994); Izawa et al., J Mol Biol 230: 1131-1144 (1993). Uma região regulatória pode conter um motivo ACGTOSGLUB1 tendo a sequência de consenso GTACGTG. Vide, Washida et al., Plant Mol Biol 40: 1-12 (1999); Wu et al., Plant J 23: 415-421 (2000). Uma região regulatória pode conter um motivo ACGTTBOX tendo a sequência de consenso AACGTT. Vide, Foster et al., FASEB J 8: 192-200 (1994). Uma região regulatória pode conter um motivo ACIIPVPAL2 tendo a sequência de consenso CCACCAACCCCC. Vide, Patzlaff et al., Plant Mol Biol 53: 597-608 (2003); Hatton et al., Plant J 7: 859-876 (1995); Gomez-Maldonado et al., Plant J 39: 513-526 (2004). Uma região regulatória pode conter um motivoAGL2ATCONSENSUS tendo a sequência de consenso NNWNCCAWWWW- TRGWWAN. Vide, Huang et al., Plant Cell 8: 81-94 (1996). Uma região regulatória pode conter um motivo AMYBOX2 tendo a sequência de consenso TATCCAT. Vide, Huang et al., Plant Mol Biol 14: 655-668 (1990); Hwang et al., Plant Mol Biol 36: 331341 (1998). Uma região regulatória pode conter um motivo ANAE- RO1CONSENSUS tendo a sequência de consenso AAACAAA. Vide, Mo- hanty et al., Ann Bot (Lond).96: 669-681 (2005). Uma região regulatória pode conter um motivo ARE1 tendo a sequência de consenso RGTGACNNNGC. Vide, Rushmore et al., J Biol Chem 266: 11632-11639 (1991). Uma região regulatória pode conter um motivo ATHB6COREAT tendo a sequência de consenso CAATTATTA. Vide, Himmelbach et al., EMBO J 21: 3029-3038 (2002). Uma região regulatória pode conter um motivo AUXRETGA1GMGH3 tendo a sequência de consenso TGACGTAA. Vide, Liu et al., Plant Cell 6: 645-657 (1994); Liu et al., Plant Physiol 115: 397-407 (1997); Guilfoyle et al., Plant Physiol 118: 341-347 (1998). Uma região regulatória pode conter um motivo BOXIIPCCHS tendo a sequência de consenso ACGTGGC. Vide, Block et al., Proc Natl Acad Sci USA 87: 5387-5391(1990); Terzaghi e Cashmore, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 46: 445-474 (1995); Nakashima et al., Plant Mol Biol 60: 51-68 (2006). Uma região regulató- ria pode conter um motivo BOXLCOREDCPAL tendo a sequência de consenso ACCWWCC. Vide, Meada et al., Plant Mol Biol 59: 739- 752.(2005). Uma região regulatória pode conter um motivo CACG- CAATGMGH3 tendo a sequência de consenso CACGCAAT. Vide, Ulma- sov et al., Plant Cell 7: 1611-1623 (1995). Uma região regula- tória pode conter um motivo CARGATCONSENSUS tendo a sequência de consenso CCWWWWWWGG. Vide, Hepworth et al., EMBO J 21: 4327-4337 (2002); Michaels et al., Plant J 33: 867-874 (2003); Hong et al., Plant Cell 15: 1296-1309 (2003); Folter e An- genent, Trends Plant Sci 11: 224-231 (2006). Uma região regu- latória pode conter um motivo CARGCW8GAT tendo a sequência de consenso CWWWWWWWWG. Vide, Tang e Perry, J Biol Chem 278: 28154-28159 (2003); Folter e Angenent, Trends Plant Sci 11: 224-231 (2006). Uma região regulatória pode conter um motivo CIACADIANLELHC tendo a sequência de consenso CAANNNNATC. Vide, Piechulla et al., Plant Mol Biol 38: 655-662 (1998). Uma região regulatória pode conter um motivo DPBFCOREDCDC3 tendo a sequência de consenso ACACNNG. Vide, Kim et al., Plant J 11: 1237-1251 (1997); Finkelstein e Lynch, Plant Cell 12: 599-609 (2000); Lopez-Molina e Chua, Plant Cell Physiol 41: 541-547 (2000). Uma região regulatória pode conter um motivo DRE2COREZMRAB17 tendo a sequência de consenso ACCGAC. Vide, Busk et al., Plant J 11: 1285-1295 (1997); Dubouzet et al., Plant J 33: 751-763 (2003); Kizis e Pages, Plant J 30 : 679689 (2002). Uma região regulatória pode conter um motivoE2FCONSENSUS tendo a sequência de consenso WTTSSCSS. Vide, Vandepoele et al., Plant Physiol 139: 316-328. (2005). Uma região regulatória pode conter um motivo EMHVCHORD tendo a sequência de consenso TGTAAAGT. Vide, Muller e Knudsen, Plant J 4: 343-355 (1993). Uma região regulatória pode conter um motivo EVENINGAT tendo a sequência de consenso AAAATATCT. Vide, Rawat et al., Plant Mol Biol 57: 629-643 (2005) e Harmer et al., Science 290: 2110-2113 (2000). Uma região regulatória pode conter um motivo GLMHVCHORD tendo a sequência de consenso RTGASTCAT. Vide, Albani et al., Plant Cell 9: 171-184 (1997); Muller M Plant J 4: 343-355 (1993); Onate et al., J Biol Chem 274: 9175-9182 (1999). Uma região regulatória pode conter um motivo GT1 Consensus tendo a sequência de consenso GRWAAW. Vide, Terzaghi e Cashmore, supra.; Villain et al., J Biol Chem 271: 32593-32598 (1996); Le Gourrierec et al., Plant J 18: 663-668 (1999); Buchel et al., Plant Mol Biol 40: 387-396(1999); Zhou, Trends em Plant Science 4: 210-214 (1999). Uma região regulatória pode conter um motivo GT1GMSCAM4 tendo a sequência de consenso GAAAAA. Vide, Park et al., Plant Physiol 135: 2150-2161 (2004). Uma região regulatória pode conter um motivo HDZIP2ATATHB2 tendo a sequência de consenso TAATMATTA. Vide, Ohgishi et al., Plant J 25: 389-398 (2001). Uma região regulatória pode conter um motivo IBOXCORENT tendo a sequência de consenso GATAAGR. Vide, Martinez-Hernandez et al., Plant Physiol 128: 1223-1233 (2002). Uma região regulatória pode conter um motivo INRNTPSADB tendo a sequência de consenso YT- CANTYY. Vide, Nakamura et al., Plant J 29: 1-10 (2002). Uma região regulatória pode conter um motivo FOLHAYATAG tendo a sequência de consenso CCAATGT. Vide, Kamiya et al., Plant J 35: 429-441 (2003). Uma região regulatória pode conter um motivo LRENPCABE tendo a sequência de consenso ACGTGGCA. Vide, Castresana et al., EMBO J 7: 1929-1936 (1988). Uma região re- gulatória pode conter um motivo MARTBOX tendo a sequência de consenso TTWTWTTWTT. Vide, Gasser et al., Intnatl Rev Cyto 119: 57-96 (1989). Uma região regulatória pode conter um moti- vo MYBGAHV tendo a sequência de consenso TAACAAA. Vide, Gubler et al., Plant Cell 7: 1879-1891 (1995); Morita et al., FEBS Lett 423: 81-85 (1998); Gubler et al., Plant J 17: 1-9(1999). Uma região regulatória pode conter um motivo MYBPLANT tendo a sequência de consenso MACCWAMC. Vide, Sablowski et al., EMBO J 13: 128-137 (1994); Tamagnone et al., Plant Cell 10: 135-154 (1998). Uma região regulatória pode conter um motivo NRRBNEXTA tendo a sequência de consenso TAGTGGAT. Vide, Elliott e Shir- sat, Plant Mol Biol 37: 675-687 (1998). Uma região regulatória pode conter um motivo O2F3BE2S1 tendo a sequência de consenso TCCACGTACT. Vide, Vincentz et al., Plant Mol Biol 34: 879-889 (1997). Uma região regulatória pode conter um motivo P1BS tendo a sequência de consenso GNATATNC. Vide, Rubio et al., Genes Dev. 15: 2122-2133.(2001); Shunmann et al., J Exp Bot. 55: 855-865. (2004); Shunmann et al., Plant Physiol 136: 42054214. (2004). Uma região regulatória pode conter um motivo PRECONSCRHSP70A tendo a sequência de consenso SCGAYN- RNNNNNNNNNNNNNNNHD. Vide, von Gromoff et al., Nucleic Acids Res 34: 4767-4779 (2006). Uma região regulatória pode conter um motivo PROXBBNNAPA tendo a sequência de consenso CAAACACC. Vide, Ezcurra et al., Plant Mol Biol 40: 699-709 (1999); Busk e Pages, supra.; Ezcurra et al., Plant J 24: 57-66 (2000). Uma região regulatória pode conter um motivo PYRIMIDINEBOXHVEPB1 tendo a sequência de consenso TTTTTTCC. Vide, Cercos et al., Plant J 19: 107-118 (1999). Uma região regulatória pode conter um motivo RBCSCONSENSUS tendo a sequência de consenso AATCCAA. Vide, Manzara e Gruissem, Photosynth Res 16: 117-139 (1988); Donald e Cashmore, EMBO J 9: 1717-1726 (1990). Uma região re- gulatória pode conter um motivo RAIZMOTIFTAPOX1 tendo a se- quência de consenso ATATT. Vide, Elmayan e Tepfer, Transgenic Res 4: 388-396 (1995). Uma região regulatória pode conter um motivo RYREPEATVFLEB4 tendo a sequência de consenso CATGCATG. Vide, Curaba et al., Plant Physiol 136: 3660-3669. (2004); Nag et al., Plant Mol Biol 59: 821-838 (2005). Uma região regula- tória pode conter um motivo SEF1MOTIF tendo a sequência de consenso ATATTTAWW. Vide, Allen et al., Plant Cell 1: 623-631 (1989); Lessard et al., Plant Mol Biol 16: 397-413 (1991). Uma região regulatória pode conter um motivo SORLREP3AT tendo a sequência de consenso TGTATATAT. Vide, Hudson e Quail, Plant Physiol 133: 1605-1616 (2003). Uma região regulatória pode conter um motivo SURE2STPAT21 tendo a sequência de consenso AATACTAAT. Vide, Grierson et al., Plant J 5: 815-826 (1994). Uma região regulatória pode conter um motivo SV40COREENHAN tendo a sequência de consenso GTGGWWHG. Vide, Weiher et al., Science 219: 626-631 (1983); Green et al., EMBO J 6: 2543-2549 (1987); Donald e Cashmore, EMBO J 9: 1717-1726 (1990). Uma região regulatória pode conter um motivo TATABOX2 tendo a sequência de consenso TATAAAT. Vide, Shirsat et al., Mol Gen Genet 215: 326-331 (1989); Grace et al., Biol Chem 279: 81028110 (2004). Uma região regulatória pode conter um motivo TA- TABOX3 tendo a sequência de consenso TATTAAT. Vide, PLACE (PLAnt Cis-acting regulatory DNA Elements) at dna.affrc.go.jp/PLCAE/signalscan.html). Uma região regulatória pode conter um motivo TATABOX4 tendo a sequência de consenso TATATAA. Vide, Grace et al., J Biol Chem 279: 8102-8110 (2004). Uma região regulatória pode conter um motivo TATABOX5 tendo a sequência de consenso TTATTT. Vide, Tjaden et al., Plant Physiol 108: 1109-1117 (1995). Uma região regulatória pode conter um motivo TATABOXOSPAL tendo a sequência de consenso TATTTAA. Vide, Zhu et al., Plant Cell 14: 795-803 (2002). Uma região regulatória pode conter um motivo TELOBOXA- TEEF1AA1 tendo a sequência de consenso AAACCCTAA. Vide, Tremousayque et al., Plant J 20: 553-561 (1999); Axelos et al., Mol Gen Genet 219: 106-112 (1989); Welchen e Gonzalez, Plant Physiol 139: 88-100 (2005). Uma região regulatória pode conter um motivo TL1ATSAR tendo a sequência de consenso CTGAAGAAGAA. Vide, Wang et al., Science 308: 1036-1040 (2005). Uma região regulatória pode conter um motivo UP2ATMSD tendo a sequência de consenso AAACCCTA. Vide, Tatematsu et al., Plant Physiology 138: 757-766 (2005). Uma região regulatória pode conter um motivo WBBOXPCWRKY1 tendo a sequência de consenso TTTGACY. Vide, Ishiguro e Nakamura, Mol Gen Genet 244: 563-571 (1994); Rushton et al., Plant Mol Biol 29: 691-702 (1995); Rushon et al., EMBO J 15: 5690-5700 (1996); de Pater et al., Nucleic Acids Res 24: 4624-4631 (1996); Eulgem et al., Trends Plant Sci 5: 199-206 (2000). Uma região regulatória pode conter um motivo XYLAT tendo a sequência de consenso ACAAAGAA. Vide, Ko et al., Mol Genet Genomics 276: 517-531 (2006)

[0083] Estringência: "Estringência", conforme usado aqui, é uma função do comprimento da sonda de molécula de ácido nu- cleico, composição da sonda de molécula de ácido nucleico (teor de G + C), concentração de sal, concentração de solvente orgânico e temperatura de hibridização e/ou condições de lavagem. A estringência é, tipicamente, medida pelo parâmetro Tm, a qual é a temperatura na qual 50% das moléculas de ácido nu- cleico complementares no ensaio de hibridização são hibridiza- das, em termos de um diferencial de temperatura a partir da Tm. Condições de alta estringência são aquelas que proporcionam uma condição de Tm - 5°C a Tm - 10°C. Condições de estringência média ou moderada são aquelas que proporcionam uma Tm - 20°C a Tm - 29°C. Condições de baixa estringência são aquelas que proporcionam uma condição de Tm - 40°C a Tm - 48°C. A relação entre as condições de hibridização e a Tm (em °C) é expressa na equação matemática: Tm = 81.5 -16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G+C) - (600/N) (I) onde N é o número de nucleotídeos da sonda de molécula de ácido nucleico. Essa equação funciona bem para sondas de 14 a 70 nucleotídeos de comprimento que são idênticas à sequência- alvo. A equação abaixo, para a Tm de híbridos de DNA-DNA, é útil para sondas tendo comprimentos na faixa de 50 a mais de 500 nucleotídeos e para condições que incluem um solvente orgânico (formamida): Tm = 81,5+16,6 log {[Na+]/(1+0,7[Na+])}+ 0,41(%G+C)-500/L 0,63(%formamida) (II) onde L representa o número de nucleotídeos na sonda no híbrido (21). A Tm da Equação II é afetada pela natureza do híbrido: para híbridos de DNA-RNA, a Tm é 10-15°C maior do que o calculado; para híbridos de RNA-RNA, a Tm é 20-25°C maior. Em virtude do fato de a Tm diminuir cerca de 1°C para cada 1% de diminuição na homologia quando uma sonda longa é usada (Frischauf et al. (1983) J. Mol Biol, 170: 827-842), as condições de es- tringência podem ser ajustadas para favorecer a detecção de genes idênticos ou membros de famílias relacionadas.

[0084] A Equação II é derivada admitindo que a reação está em equilíbrio. Portanto, hibridizações de acordo com a presente invenção são, mais preferivelmente, realizadas sob condições de excesso de sonda e permitindo um tempo suficiente para obter o equilíbrio. O tempo requerido para atingir o equilíbrio pode ser reduzido usando um tampão de hibridização que inclui um acelerador de hibridização, tal como sulfato de dextrana ou outro polímero de alto volume.

[0085] A estringência pode ser controlada durante a reação de hibridização ou após hibridização ter ocorrido alterando as condições de sal e temperatura das soluções de lavagem. As fórmulas mostradas acima são igualmente válidas quando usadas para computar a estringência de uma solução de lavagem. Es- tringências de solução de lavagem preferidas repousam dentro das faixas estabelecidas acima: alta estringência é 5-8°C abaixo da Tm, estringência média ou moderada é 26-29°C abaixo da Tm e baixa estringência é 45-48°C abaixo da Tm.

[0086] To: O termo "To" refere-se à planta inteira, tecido de caule ou explante, inoculado com o meio de transformação.

[0087] TI : O termo TI refere-se à prole da planta TO, no caso de transformação de uma planta inteira ou da muda regenerada no caso de transformação de tecido de caule ou explante.

[0088] T2: O termo T2 refere-se à prole da planta T1. A prole T2 é o resultado de autofertilização ou polinização cruzada de uma planta T1.

[0089] T3: O termo T3 refere-se à prole da segunda geração da planta que é o resultado direto de um experimento de transformação. A prole T3 é o resultado de autofertilização ou polinização cruzada de uma planta T2.

[0090] TATA para início: "TATA para início" significará a distância, em número de nucleotídeos, entre o motivo primário TATA e o início de transcrição.

[0091] Planta transgênica: Uma "planta transgênica" é uma planta tendo uma ou mais células de planta que contêm pelo menos um polinucleotídeo exógeno introduzido através de métodos de ácido nucleico recombinante.

[0092] Sítio de início de tradução: No contexto da presente invenção, um "sítio de início de tradução" é usualmente um ATG ou AUG em um transcrito, frequentemente o primeiro ATG ou AUG. Uma única proteína de codificação de transcrito, contudo, pode ter múltiplos sítios de início de tradução.

[0093] Sítio de início de transcrição: "Sítio de início de transcrição" é usado na presente invenção para descrever o ponto no qual a transcrição é iniciada. Esse ponto está, tipicamente, localizado cerca de 25 nucleotídeos a jusante de um sítio de ligação TFIID, tal como uma caixa TATA. A transcrição pode se iniciar em um ou mais sítios dentro de um gene e um único polinucleotídeo a ser transcrito pode ter múltiplos sítios de início de transcrição, alguns dos quais podem ser específicos para a transcrição em um tipo de célula ou tecido ou órgão em particular. "+1" é estabelecido com relação ao sítio de início de transcrição e indica o primeiro nucleotídeo em um transcrito.

[0094] Região de ativação a montante (UAR): Uma "Região de ativação a montante" ou "UAR" é um elemento de ácido nucleico dependente da posição ou orientação que dirige primariamente a regulação de nível de transcrito em tecido, órgão, tipo de célula ou ambiental, usualmente afetando a taxa de início de transcrição. Elementos de DNA correspondentes que têm um efeito inibitório de transcrição são denominados aqui uma "Região repressora a montante" ou "URR"s. A atividade essencial desses elementos é se ligar a um fator de proteína. Tal ligação pode ser avaliada através dos métodos descritos abaixo. A ligação é, tipicamente, de uma maneira que influência o nível de estado uniforme de um transcrito em uma célula ou em extrato de transcrição in vitro.

[0095] Região Não Traduzida (UTR): Uma "UTR" é qualquer série contígua de bases de nucleotídeo que é transcrita, mas não é traduzida. Uma 5' UTR repousa entre o sítio inicial do transcrito e o códon de início de tradução e inclui os +1 nucleotí- deos. Uma 3' UTR repousa entre o códon de término de transcrição e o final do transcrito. UTRs podem ter funções particulares, tal como aumento da estabilidade de mensagem do mRNA ou atenuação de tradução. Exemplos de 3' UTRs incluem, mas não estão limitados a sinais de poliadenilação e sequências de término de transcrição.

2. Uso dos promotores da invenção

[0096] Os promotores e elementos de controle promotores da presente invenção são capazes de modular a transcrição. Tais promoteres e elementos de controle promotores podem ser usados em combinação com fragmentos de promotor, elementos de controle ou outras sequências regulatórias nativas ou heterólogas para modular a transcrição e/ou tradução.

[0097] Especificamente, promotores e elementos de controle da invenção podem ser usados para modular a transcrição de um po- linucleotídeo desejado o qual inclui, sem limitação: (i) antissenso; (ii) ribozimas; (iii) sequências de codificação; ou (iv) fragmentoss dos mesmos.

[0098] O promotor também pode modular a transcrição em um ge- noma hospedeiro em cis- ou em trans-.

[0099] Em um organismo, tal como uma planta, os promotores e elementos de controle promotores da presente invenção são úteis para produzir transcrição preferencial a qual resulta em um padrão desejado de níveis de transcrito em uma célula, tecido ou órgão em particular ou sob condições em particular.

4. Identificação e invenção de sequências promotoras da invenção

[0100] Os promotores e elementos de controle promotores da presente invenção são apresentados nos Relatórios de Promotor das Tabelas e foram identificados a partir de Arabidopsis tha- liana e Oryza sativa. Isolamento de bibliotecas genômicas de polinucleotídeos compreendendo as sequências dos promotores e elementos de controle promotores da presente invenção é possível usando técnicas conhecidas. Por exemplo, reação em cadeia de polimerase (PCR) pode amplificar os polinucleotídeos desejados utilizando iniciadores criados a partir de SEQ ID NOs: 1-26 ou resíduos 601-1000 de SEQ ID NO: 26. Bibliotecas de po- linucleotídeo compreendendo sequências genômicas podem ser construídas de acordo com Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2° Ed. (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), por exemplo.

[0101] Outros procedimentos para isolamento de polinucleotí- deos compreendendo as sequências promotoras da invenção incluem, sem limitação, tail-PCR e amplificação 5' rápida de extremidades de cDNA (RACE). Vide, para tail-PCR, por exemplo, Liu et al. (1995) Plant J 8(3): 457-463; Liu et al. (1995) Genomics 25: 674-681; Liu et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21(14): 3333-3334; e Zoe et al. (1999) BioTechniques 27(2): 240-248; para RACE, vide, por exemplo, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, (1990) Academic Press, Inc.

[0102] Além disso, os promotores e elementos de controle promotores descritos nos Relatórios de Promotor nas tabelas (SEQ. ID. Nos. 1 - 26) podem ser quimicamente sintetizados de acordo com técnicas em uso comum. Vide, por exemplo, Beaucage et al. (1981) Tet. Lett. 22: 1859 e Pat. U.S. N° 4.668.777. Tal síntese de oligonucleotídeo química pode ser realizada usando dispositivos comercialmente disponíveis, tais como um sinteti- zador de DNA Biosearch 4600 ou 8600 da Applied Biosycaules, um divisão da Perkin-Elmer Corp., Foster City, Califórnia, EUA; e Expedite da Perceptive Biosycaules, Framingham, Massachusetts, EUA.

[0103] Incluídos na presente invenção são promotores que exibem identidade de sequência de nucleotídeo à SEQ. ID. Nos. 1 - 26 ou os resíduos de ácido nucleico 601-1000 de SEQ ID NO: 26, isto é, que exibe pelo menos 80% de identidade de sequência, pelo menos 85%, pelo menos 90% e pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência comparado com SEQ. ID. Nos. 1 - 26 ou os resíduos 601-1000 de SEQ ID NO: 26. Tal identidade de sequência pode ser calculada pelos algoritmos e programas de computador descritos acima.

[0104] A presente invenção ainda abrange "variantes funcionais" ou "fragmentos funcionais" das sequências divulgadas, particularmente fragmentos de SEQ ID NOs: 1-26 e resíduos 6011000 de SEQ ID NO: 5 que retêm atividade promotora. Variantes funcionais incluem, por exemplo, sequências regulatórias da invenção tendo uma ou mais substituições, deleções ou inser ções de nucleotídeo e em que a variante retém atividade promotora. Variantes funcionais podem ser criadas através de qualquer um de uma série de métodos disponíveis para aqueles versados na técnica, tal como através de mutagênese sítio- dirigida, mutação induzida, identificadas como variantes alé- licas, clivagem através do uso de enzimas de restrição ou similar. Atividade pode, da mesma forma, ser medida através de qualquer variedade de técnicas, incluindo medição de atividade repórter, conforme é descrito na Patente U.S. N° 6.844.484, análise de Northern blot ou técnicas similares. A patente '484 descreve a identificação de variantes funcionais de diferentes promotores.

[0105] Fragmento funcional, isto é, um fragmentos de sequência regulatória, pode ser formado por uma ou mais deleções de um elemento regulatório maior. Por exemplo, em alguns casos, a porção 5' de um promotor até a caixa TATA próximo do sítio de início de transcrição pode ser deletada sem eliminar a atividade promotora, conforme descrito por Opsahl-Sorteberg, H-G. et al., "Identification of a 49-bp fragment of the HvLTP2 promoter directing aleruone cell specific expression" Gene 341: 49-58 (2004). Tais fragmentoss reterão a atividade promotora, particularmente a capacidade de acionar a expressão de sequências de nucleotídeo operavelmente ligadas. A atividade pode ser medida através de análise de Northern blot, medições de atividade repórter quando de uso de fusões transcricionais e similares. Vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual (1989). Fragmentos funcionais podem ser obtidos através de uso de enzimas de restrição para clivar as sequências nucleotídicas de elemento regulatório que ocor- rem naturalmente divulgadas aqui; mediante síntese de uma sequência de nucleotídeo a partir da sequência de DNA que ocorre naturalmente; ou podem ser obtidos mediante o uso de tecnologia de PCR. Vide, particularmente, Mullis et al., Methods En- zymol., 155: 335-350 (1987) e Erlich, ed., PCR Technology (Stockton Press, New York), (1989).

[0106] Por exemplo, uma forma de rotina para remover parte de uma sequência DNA é usar uma exonuclease em combinação com amplificação de DNA para produzir deleções agrupadas unidirecio- nais de clones de DNA filamento duplo. Um kit comercial para essa finalidade é vendido sob a marca comercial Exo-Size® (New England Biolabs, Beverly, Mass.). Resumidamente, esse procedimento requer incubação de exonuclease III com DNA para remover progressivamente nucleotídeos na direção 3' para 5' nas saliências 5', extremidades cegas ou cortes no modelo (template) de DNA. Contudo, a exonuclease III é incapaz de remover os nu- cleotídeos nas saliências 3', 4-base. Digestões sincronizadas de um clone com essa enzima produzem deleções agrupadas unidi- recionais.

5. Testagem de Promotores

[0107] Promotores da invenção, incluindo fragmentos funcionais, são testados quanto à atividade através de clonagem da sequência em um vetor apropriado, transformação das plantas com o construto e ensaio quanto à expressão do gene marcador. Construtos de DNA recombinante são preparados, os quais compreendem as sequências promotoras da invenção inseridas em um vetor adequado para transformação de células de planta. O construto pode ser feito usando técnicas padrões de DNA recom- binante (Sambrook et al. 1989) e pode ser introduzido na espé- cie de interesse através de transformação Agrobacterium- mediada ou através de outro meio de transformação, conforme mencionado acima.

[0108] A parte principal do vetor pode ser qualquer uma daqueles típicas no campo, tais como plasmídeos, vírus, cromossomos artificiais, BACs, YACs e PACs e vetores do tipo descrito por: (a) BAC: Shizuya et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8794-8797; Hamilton et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9975-9979; (b) YAC: Burke et al. (1987) Science 236: 806-812; (c) PAC: Sternberg N. et al. (1990) Proc Natl Acad Sci U S A. 87(1): 103-7; (d) Vetores de Derivação de Bactérias-Levedo: Bradshaw et al. (1995) Nucl Acids Res 23: 4850-4856; (e) Vetores de Fago Lambda: Replacement Vector, por exemplo, Frischauf et al. (1983) J. Mol Biol 170: 827-842; ou Vetor de Inserção, por exemplo, Huynh et al. (1985) Em: Glover NM (ed) DNA Cloning: A practical Approach, Vol. 1 Oxford: IRL Press; Vetores de fusão de gene de T-DNA: Walden et al. (1990) Mol Cell Biol 1: 175-194; e (g) Vetores de plasmídeo: Sambrook et al., infra.

[0109] Tipicamente, o construto compreende um vetor contendo uma sequência promotora da presente invenção operavelmente ligada a qualquer gene marcador. O promotor foi identificado co-mo um promotor pela expressão do gene marcador. Embora muitos genes marcadores possam ser usados, Proteína Fluorescente Verde (Green Fluorescent Protein - GFP) é preferida. O vetor pode também compreender um gene marcador que confere um fenótipo desejável à células de planta. O marcador pode codificar a resistência a biocida, particularmente resistência a antibiótico, tal como resistência à canamicina, G418, bleomicina, hi- gromicina ou resistência a herbicida, tal como resistência ao chlorosulfuron ou fosfinotricina. Vetores também podem incluir origens de replicação, regiões de fixação de base (SARs), marcadores, sequências homólogas, íntrons, etc.

6. Construção de promotores com elementos de controle 6.1 Combinação de promotores e elementos de controle promotores

[0110] O promotor e elementos de controle promotores da presente invenção, ambos que ocorrem naturalmente e sintéticos, podem ser usados isoladamente ou combinados uns com os outros para produzir a transcrição preferencial desejada. Também, os promotores da invenção podem ser combinados com outras sequências conhecidas para obter outros promotores úteis para modular, por exemplo, transcrição tecido-específica ou transcrição específica a determinadas condições. Tal transcrição preferencial pode ser determinada usando as técnicas ou ensaios descritos acima.

[0111] Promotores podem conter qualquer número de elementos de controle. Por exemplo, um promotor pode conter múltiplos sítios de ligação de transcrição ou outros elementos de controle. Um elemento pode conferir especificidade por um órgão ou tecido; outro elemento pode limitar a transcrição a períodos de tempo específicos, etc. Tipicamente, promotores conterão pelo menos um promotor basal ou central, conforme descrito acima. Qualquer elemento adicional pode ser incluído, conforme desejado. Por exemplo, um fragmento compreendendo um promotor basal ou "central" pode ser fundido a outro fragmentos com qualquer número de elementos de controle adicionais.

[0112] Os seguintes são promotores que são induzidos sob condições de estresse e podem ser combinados com aqueles da presente invenção: ldh1 (estresse por oxigênio; tomate; vide Germain e Ricard (1997) Plant Mol Biol 35: 949-54), GPx e CAT (estresse por oxigênio; camundongo; vide Franco et al. (1999) Free Radic Biol Med 27: 1122-32), ci7 (estresse pelo frio; batata; vide Kirch et al. (1997) Plant Mol Biol. 33: 897-909), Bz2 (metais pesados; milho; vide Marrs e Walbot (1997) Plant Physiol 113: 93-102), HSP32 (hipertermia; rato; vide Raju e Maines (1994) Biochim Biophys Acta 1217: 273-80) e MAPKAPK-2 (choque pelo calor; Drosophila; vide Larochelle e Suter (1995) Gene 163: 209-14).

[0113] Além disso, os exemplos a seguir de promotores são induzidos pela presença ou ausência de luz, os quais podem ser usados em combinação com aqueles da presente invenção: Topoisomerase II (ervilha; vide Reddy et al. (1999) Plant Mol Biol 41: 125-37), sintase de chalcona (soja; vide Wingender et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 315-22) gene mdm2 (tumor humano; vide Saucedo et al. (1998) Cell Growth Differ 9: 119-30), Clock e BMAL1 (rato; vide Namihira et al. (1999) Neurosci Lett 271: 1-4, PHYA (Arabidopsis; vide Canton e Quail (1999) Plant Physiol 121: 1207-16), PRB-1b (tabaco; vide Sessa et al. (1995) Plant Mol Biol 28: 537-47) e Ypr10 (feijão comum; vide Walter et al. (1996) Eur J Biochem 239: 281-93).

[0114] Os promotores e elementos de controle dos seguintes genes podem ser usados em combinação com a presente invenção para conferir especificidade tecidual: MipB (iceplant; Yamada et al. (1995) Plant Cell 7: 1129-42) e SUCS (nódulos da raiz; feijão de folha larga; Kuster et al. (1993) Mol Plant Microbe Interact 6: 507-14) para raízes, OsSUT1 (arroz ; Hirose et al. (1997) Plant Cell Physiol 38: 1389-96) para folhas, Msg (soja; Stomvik et al. (1999) Plant Mol Biol 41: 217-31), para silíquas, cel1 (Arabidopsis; Shani et al. (1997) Plant Mol Biol 34(6): 837-42) e ACT11 (Arabidopsis; Huang et al. (1997) Plant Mol Biol 33: 125-39) para inflorescência.

[0115] Ainda outros promotores são afetados por hormônios ou participam em processos fisiológicos específicos, os quais podem ser usados em combinação com aqueles da presente invenção. Alguns exemplos são o gene de sintase de ACC que é induzido diferentemente por etileno e brassinosteróides (feijão; Yi et al. (1999) Plant Mol Biol 41:443-54), o gene TAPG1 que é ativo durante abscissão (tomate; Kalaitzis et al. (1995) Plant Mol Biol 28: 647-56) e o gene de sintase de 1-aminociclopropano-1- carboxilato (cravo; Jones et al. (1995) Plant Mol Biol 28:50512) e o gene CP-2/catepsina L (rato; Kim e Wright (1997) Biol Reprod 57: 1467-77), ambos ativos durante senescência.

[0116] O espaçamento entre elementos de controle ou a configuração ou elementos de controle pode ser determinada ou otimizada para permitir que as interações proteína- polinucleotídeo ou polinucleotídeos ocorram.

[0117] Por exemplo, se dois fatores de transcrição se ligam a um promotor simultânea ou relativamente próximo no tempo, os sítios de ligação são espaçados para permitir que cada fator se ligue sem impedimento estérico. O espaçamento entre dois de tais elementos de controle de hibridização pode ser tão pequeno quanto um perfil de uma proteína ligada a um elemento de controle. Em alguns casos, dois sítios de ligação de proteína podem ser adjacentes um ao outro quando as proteínas se ligam em diferentes momentos durante o processo de transcrição.

[0118] Ainda, quando dois elementos de controle se hibridi- zam, o espaçamento entre tais elementos será suficiente para permitir que os polinucleotídeo promotores da hairpina ou loop permitam que os dois elementos se liguem. O espaçamento entre dois de tais elementos de controle de hibridização pode ser tão pequeno quanto um loop de t-RNA, tão grande quanto 10 kb.

[0119] Tipicamente, o espaçamento não é menor do que 5 bases; mais tipicamente, não menor do que 8; mais tipicamente, não menor do que 15 bases; mais tipicamente, não menor do que 20 bases; mais tipicamente, não menor do que 25 bases; ainda mais tipicamente, não menor do que 30, 35, 40 ou 50 bases.

[0120] Usualmente, o tamanho do fragmentos não é maior do que 5 kb bases; mais usualmente, não maior do que 2 kb; mais usualmente, não maior do que 1 kb; mais usualmente, não maior do que 800 bases; mais usualmente, não maior do que 500 bases; ainda mais usualmente, não maior do que 250, 200, 150 ou 100 bases. Em algumas modalidades, o ácido nucleico da invenção compreende pelo menos um fragmento de YP0286 (SEQ ID NO: 5), por exemplo, YP2219 (SEQ ID NO: 4), contanto que o referido ácido nucleico não consista de YP0286 (SEQ ID NO: 5).

[0121] Tal espaçamento entre elementos de controle promotores pode ser determinado usando as técnicas e ensaios descritos acima.

6.2 Vetores usados para transformar células/hospedeiros

[0122] Um construto de transformação de planta contendo um promotor da presente invenção pode ser introduzido em plantas através de qualquer método de transformação de planta. Métodos e materiais para transformação de plantas mediante introdução de um construto de expressão de planta no genoma de uma planta na prática da presente invenção podem incluir qualquer um dos métodos bem-conhecidos e demonstrados, incluindo eletroporação (Patente U.S. N° 5.384.253); bombardeamento de microprojétil (Patente U.S. N° 5.015.580; Patente U.S. N° 5.550.318; Patente U.S. N° 5.538.880; Patente U.S. N° 6.160.208; Patente U.S. N° 6.399.861; e Patente U.S. N° 6.403.865); transformação Agrobacterium—.mediada (Patente U.S. N° 5.824.877; Patente U.S. N° 5.591.616; Patente U.S. N° 5.981.840; e Patente U.S. N° 6.384.301); e transformação de protoplasto (Patente U.S. N° 5.508.184).

[0123] Os presentes promotores e/ou elementos de controle promotores podem ser distribuídos a um sistema, tal como uma célula, através de um vetor. Para fins da presente invenção, tal distribuição pode oscilar de simplesmente introdução do promotor ou elemento de controle promotor em si aleatoriamente em uma célula para integração de um vetor de clonagem contendo o presente promotor ou elemento de controle promotor. Assim, um vetor não precisa estar limitado a uma molécula de DNA, tal como um plasmídeo, cosmídeo ou fago bacteriano que tem a capacidade de se reproduzir de modo autônomo em uma célula hospedeira. Todas as outras maneiras de distribuição dos promotores e elementos de controle promotores da invenção são consideradas. Os vários tipos de vetor de T-DNA são um vetor preferido para uso com a presente invenção. Muitos vetores úteis estão comercialmente disponíveis.

[0124] Pode também ser útil fixar uma sequência marcadora ao presente promotor e elemento de controle promotor de forma a determinar a atividade de tais sequências. Sequências marcadoras incluem, tipicamente, genes que conferem resistência a an-tibiótico, tal como resistência à tetraciclina, resistência à higromicina ou resistência à ampicilina ou conferem resistência a herbicida. Marcadores gênicos selecionáveis específicos podem ser usados para conferir resistência a herbicidas, tais como glifosato, glufosinato ou broxinila (Comai et al. (1985) Nature 317: 741-744; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603-618; e Stalker et al. (1988) Science 242: 419-423). Existem outros genes marcadores os quais conferem responsividade a hormônio.

[0125] O promotor ou elemento de controle promotor da presente invenção pode ser operavelmente ligado a um polinucleotídeo a ser transcrito. Dessa maneira, o promotor ou elemento de controle promotor pode modificar a transcrição mediante modulação dos níveis de transcrito desse polinucleotídeo quando inserido em um genoma.

[0126] Contudo, antes de inserção em um genoma, o promotor ou elemento de controle promotor não precisa ser ligado, opera- velmente ou de outro modo, a um polinucleotídeo a ser transcrito. Por exemplo, o promotor ou elemento de controle promotor pode ser inserido isoladamente no genoma em frente a um polinucleotídeo já presente no genoma. Dessa maneira, o promotor ou elemento de controle promotor pode modular a transcrição de um polinucleotídeo que já está presente no genoma. Esse polinucleotídeo pode ser nativo ao genoma ou inserido em um momento anterior.

[0127] Alternativamente, o promotor ou elemento de controle promotor pode ser inserido em um genoma isoladamente para modular a transcrição. Vide, por exemplo, Vaucheret, H et al. (1998) Plant J 16: 651-659. Antes, o promotor ou elemento de controle promotor pode simplesmente ser inserido em um genoma ou mantido extra-cromossomicamente como uma forma para desviar os recursos de transcrição do sistema em si. Essa abordagem pode ser usada para sub-regular os níveis de transcrito de um grupo de polinucleotídeo(s).

[0128] A natureza dos polinucleotídeos a serem transcritos não está limitada. Especificamente, os polinucleotídeos podem incluir sequências que terão atividade como RNA, bem como sequências que resultam em um produto polipeptídico. Essas sequências podem incluir, mas não estão limitadas a, sequências antissenso, sequências de RNAi, sequências de ribozima, spli- ceossomas, sequências de codificação de aminoácido e fragmentos das mesmas. Sequências de codificação específicas podem incluir, mas não estão limitadas a, proteínas endógenas ou fragmentos das mesmas ou proteínas heterólogas, incluindo genes marcadores ou fragmentos dos mesmos.

[0129] Construtos da presente invenção conterão, tipicamente, um promotor operavelmente ligado a uma molécula de ácido nu- cleico passível de transcrição operavelmente ligada a uma molécula de ácido nucleico de término de transcrição 3'. Além disso, construtos podem incluir, mas não estão limitados a moléculas de ácido nucleico regulatórias adicionais da região não traduzida 3' (3' UTR) de genes de planta (por exemplo, uma 3' UTR para aumentar a estabilidade do mRNA, tal como a região de término PI-II de batata ou regiões de término 3' de sintase de octopina ou nopalina). Construtos podem incluir, mas não estão limitados a regiões não traduzidas 5' (5' UTR) de uma molécula de ácido nucleico de mRNA, a qual pode exercer um papel importante em início de tradução e também ser um componente genético em um construto de expressão de planta. Por exemplo, foi demonstrado que moléculas de ácido nucleico líderes 5' não traduzidas derivadas de genes de proteína do choque térmico intensificam a expressão gênica em plantas (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 5.659.122 e Patente U.S. N° 5.362.865, todas as quais são aqui incorporadas por referência). Essas moléculas de ácido nucleico regulatórias a montante e a jusante adicionais podem ser derivadas de uma fonte que é nativa ou heteróloga com relação a outros elementos presentes sobre o construto de promotor.

[0130] Assim, uma modalidade da invenção é um promotor, tal como fornecido em SEQ ID NOs: 1 - 26 ou os resíduos 601-1000 de SEQ ID NO: 26, operavelmente ligado a uma molécula de ácido nucleico passível de transcrição, de modo a dirigir a transcrição da referida molécula de ácido nucleico passível de transcrição em um nível desejado ou em um tecido desejado ou padrão de desenvolvimento quando de introdução do referido construto em uma célula de planta. Em alguns casos, a molécula de ácido nucleico passível de transcrição compreende uma região de codificação de proteína de um gene e o promotor confere transcrição de uma molécula de mRNA antissenso ou outro RNA inibitório similar de forma a inibir a expressão de uma molécula de RNA específica de interesse em uma célula hospedeira- alvo.

[0131] Moléculas de ácido nucleico passíveis de transcrição exemplificativas para incorporação em construtos da presente invenção incluem, por exemplo, moléculas de ácido nucleico ou genes de uma outra espécie que não a espécie gênica de interesse ou mesmo genes que se origem com ou estão presentes na mesma espécie, mas são incorporados em células recipientes através de métodos de engenharia genética ao invés de técnicas clássicas de reprodução ou melhoramento. Gene ou elemento genético exógeno se destina a referir-se a qualquer gene ou molécula de ácido nucleico que é introduzida em uma célula recipiente. O tipo de molécula de ácido nucleico incluída na molécula de ácido nucleico exógena pode incluir uma molécula de ácido nucleico que já está presente na célula de planta, uma molécula de ácido nucleico de outra planta, uma molécula de ácido nucleico de um organismo diferente ou uma molécula de ácido nucleico gerada externamente, tal como uma molécula de ácido nucleico contendo uma mensagem antissenso de um gene ou uma molécula de ácido nucleico que codifica uma versão artificial ou modificada de um gene.

[0132] Os promotores da presente invenção podem ser incorporados em um construto usando genes marcadores conforme descrito e testados em análises transitórias que fornecem uma indicação de expressão gênica em sistemas de planta estáveis. Conforme usado aqui, o termo "gene marcador" refere-se a qualquer molécula de ácido nucleico passível de transcrição cuja expressão pode sofrer triagem ou ser classificada de alguma forma. Métodos de testagem quanto à expressão de gene marcador em ensaios transitórios são conhecidos por aqueles versados na técnica. Expressão transitória de genes marcadores foi reportada usando uma variedade de plantas, tecidos, célula(s) de planta e sistemas de distribuição de DNA. Por exemplo, tipos de análises transitórias podem incluir, mas não estão limitados a distribuição de gene direta via eletroporação ou bombardeamento de partícula de tecidos em qualquer ensaio transitório de planta usando qualquer espécie de planta de interesse. Tais sistemas transitórios incluem, mas não estão limitados a eletroporação de protoplastos a partir de uma variedade de fontes ou bombardeamento de partícula de tecidos de interesse específicos. A presente invenção abrange o uso de qualquer sistema de expressão transitória para avaliar promotores ou fragmentos de promotor operavelmente ligados a qualquer molécula de ácido nucleico passível de transcrição incluindo, mas não limitado a genes repórteres selecionados, genes marcadores ou genes de interesse agronômico. Exemplos de tecidos de planta considerados para teste transitoriamente via um sistema de distribuição apropriado incluem, mas não estão limitados a tecidos de base de folha, caule, cotilédones, raízes, endosper- ma, embriões, floral tissue, pólen e tecido epidérmico.

[0133] Promotores e elementos de controle da presente invenção são úteis para modulação de processos metabólicos ou cata- bólicos. Tais processos incluem, mas não estão limitados a me-tabolismo de produto secundário, síntese de aminoácido, armazenamento de proteína da semente, biomassa aumentada, desenvolvimento de óleo, defesa contra pestes e uso de nitrogênio. Alguns exemplos de genes, transcritos e peptídeos ou polipep- tídeos que participam nesses processos, os quais podem ser modulados pela presente invenção são: decarboxilase de triptofa- no (tdc) e sintase de estrictosidina (str1), sintase de dihi- drodipicolinato (DHDPS) e quinase de aspartato (AK), 2S albumina e alfa-, beta- e gama-zeínas, sintase de ricinoleato e 3- cetoacil-ACP (KAS), proteína inseticida de Bacillus thurin- giensis (Bt), inibidor de tripsina de grão de bico (CpTI), sintetase de asparagina e reductase de nitrito. Alternativamente, construtos de expressão podem ser usados para inibir a expressão desses peptídeos e polipeptídeos mediante incorporação dos promotores nos construtos para uso antissenso, cossu- pressão ou para a produção de mutações dominante negativas.

[0134] Conforme explicado acima, existem vários tipos de elementos regulatórios referentes à regulação de transcrição. Cada um desses elementos regulatórios pode ser combinado com o presente vetor, se desejado. Tradução de mRNA eucariota é, frequentemente, iniciado no códon que codifica a primeira me- tionina. Assim, quando de construção de um polinucleotídeo re- combinante de acordo com a presente invenção para expressão de um produto de proteína, é preferível assegurar que a ligação entre a porção 3', de preferência incluindo a caixa TATA, do promotor e do polinucleotídeo a ser transcrito ou um derivado funcional do mesmo, não contém quaisquer códons intervenientes os quais são capazes de codificar uma metionina.

[0135] O vetor da presente invenção pode conter componentes adicionais. Por exemplo, uma origem de replicação permite a replicação do vetor em uma célula hospedeira. Adicionalmente, sequências homólogas que flanqueiam uma sequência específica permitem a recombinação específica da sequência específica em um local desejado no genoma-alvo. Sequências de T-DNA também permitem a inserção de uma sequência específica aleatoriamente em um genoma-alvo.

[0136] O vetor pode também ser dotado de uma pluralidade de sítios de restrição para inserção de um polinucleotídeo a ser transcrito, bem como o promotor e/ou elementos de controle promotores da presente invenção. O vetor pode, adicionalmente, conter marcadores gênicos selecionáveis. O vetor pode também conter uma região de início de transcrição e tradução e uma região de término de transcrição e tradução funcionais na célula hospedeira. A região de término pode ser nativa com a região de início de transcrição, mas pode ser nativa com os po- linucleotídeos a serem transcritos ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de término convenientes estão disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de término de sintase de octopina e sintase de nopalina. Vide também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 12611272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; Joshi et al. (1987)Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.

[0137] Onde apropriado, os polinucleotídeos a serem transcritos podem ser otimizados para expressão aumentada em uma determinada célula hospedeira. Por exemplo, os polinucleotídeos podem ser sintetizados usando códons preferidos para transcrição e tradução apropriadas. Vide Patentes U.S. Nos. 5.380.831, 5.436.391; vide também Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498.

[0138] Modificações de sequência adicionais incluem eliminação de sequências que codificam sinais de poliadenilação prejudiciais, sinais de sítio de splicing de éxon, repetições similares a transposon e outras de tais sequências bem caracterizadas como prejudiciais para a expressão. O teor de G-C dos polinucleotídeos pode ser ajustado para níveis médios para um determinado hospedeiro celular, conforme calculado através de referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. A sequência de polinucleotídeo pode ser modificada para evitar estruturas de mRNA secundário de hairpina.

[0139] Uma descrição geral de vetores de expressão e genes repórteres pode ser encontrada em Gruber et al. (1993) "Vectors for Plant Transformation" em Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich et al. Eds. páginas 89-119, CRC Press. Além disso, vetores de expressão de GUS e cassetes de gene de GUS estão disponíveis da Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, Califórnia, enquanto que vetores de expressão de luciferase e cassetes de gene de luciferase estão disponíveis da Promega Corp. (Madison, Wisconsin). Vetores de GFP estão disponíveis da Aurora Biosciences.

6.3 Inserção de polinucleotídeos em uma célula hospedeira

[0140] Os promotores de acordo com a presente invenção podem ser inseridos em uma célula hospedeira. Uma célula hospedeira inclui, mas não está limitado a uma célula de planta, mamífero, inseto, levedo e procariota, de preferência uma célula de planta.

[0141] O método de inserção no genoma da célula hospedeira é escolhido baseado na conveniência. Por exemplo, a inserção no genoma da célula hospedeira pode ser realizada por meio de vetores que se integram no genoma da célula hospedeira ou através de vetores os quais existem independente do genoma da célula hospedeira.

[0142] Os promotores da presente invenção podem existir de modo autônomo ou independente do genoma da célula hospedeira. Vetores desses tipos são conhecidos no campo e incluem, por exemplo, determinados tipos de vetores virais não integrati- vos, plasmídeos de replicação autônoma, cromossomas artificiais e similares.

[0143] Adicionalmente, em alguns casos, expressão transitória de um promotor pode ser desejada.

[0144] As sequências promotoras, elementos de controle promotores ou vetores da presente invenção podem ser transformados em células hospedeiras. Essas transformações podem ser em pro- toplastos ou tecidos intactos ou células isoladas. De preferência, vetores de expressão são introduzidos em tecido intacto. Métodos gerais de cultura de tecidos de planta são fornecidos, por exemplo, por Maki et al. (1993) "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" em Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich et al. Eds. páginas 67-88 CRC Press; e por Phillips et al. (1988) "Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation" em Corn & Corn Improvement, 3a Edição Sprague et al. eds., páginas. 345-387, American Society of Agronomy Inc. et al.

[0145] Métodos de introdução de polinucleotídeos em tecido de planta incluem infecção direta ou co-cultivo de células de planta com Agrobacterium tumefaciens, Horsch et al. (1985) Science, 227: 1229. Descrições de sistema de vetor de Agrobacterium e métodos para transferência gênica Agrobacterium- mediada são fornecidos por Gruber et al. supra.

[0146] Alternativamente, polinucleotídeos são introduzidos em células de planta ou outros tecidos de planta usando um método de transferência direta de gene, tal como distribuição mediada por microprojétil, injeção de DNA, eletroporação e similares; Mais preferivelmente, os polinucleotídeos são introduzidos em tecidos de planta usando a distribuição de microprojétil com o dispositivo biolístico. Vide, por exemplo, Tomes et al., "Di-rect DNA transfer into intact plant cells via microprojectile bombardment" Em: Gamborg e Phillips (Eds.) Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Springer Verlag, Berlin (1995).

[0147] Métodos para transformação de dicotiledôneas são bem- conhecidos por aqueles versados na técnica. A transformação e regeneração de plantas usando esses métodos foram descritas para uma série de safras incluindo, mas não limitado a algodão (Gossypium hirsutum), soja (Glycine max), amendoim (Arachis hypogaea) e membros do gênero Brassica.

[0148] Métodos para transformação de monocotiledôneas são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. A transformação e regeneração de plantas usando esses métodos foram descritas para uma série de safras incluindo, mas não limitado a, cevada (Hordeum vulgarae); milho (Zea mays); aveia (Avena sa- tiva); ouchard grass (Dactylis glomerata); arroz (Oryza sati- va, incluindo variedades indica e japonica); sorgo (Sorghum bicolor); cana-de-açúcar (Saccharum sp); fetusca gigante (Fes- tuca arundinacea); espécies de turfa (por exemplo, espécies: Agrostis stolonifera, Poa pratensis, Stenotaphrum secundatum); trigo (Triticum aestivum), switchgrass (Panicum vigatum) e alfafa (Medicago sativa). É evidente para aqueles versados na técnica que uma série de metodologias de transformação podem ser usadas e modificadas para a produção de plantas transgêni- cas estáveis a partir de qualquer uma das plantas-alvo de interesse.

[0149] Os polinucleotídeos e vetores descritos aqui podem ser usados para transformar uma série de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas e sistemas de células de planta, incluindo espécies de uma das seguintes famílias: Acanthaceae, Alliace- ae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliace- ae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodia- ceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Ta- xaceae, Theaceae ou Vitaceae.

[0150] Espécies adequadas podem incluir membros dos gêneros Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Ber- beris, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helian- thus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Sparti- na, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Tri- ticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis e Zea.

[0151] Espécies adequadas incluem Panicum spp. ou híbridos do mesmo, Sorghum spp. ou híbridos do mesmo, sudangrass, Mis- canthus spp. ou híbridos do mesmo, Saccharum spp. ou híbridos do mesmo, Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (grande caule azul), Pennisetum purpureum (capim-elefante) ou híbridos do mesmo (por exemplo, Pennisetum purpureum x Penni- setum typhoidum), Phalaris arundinacea (junco das Canárias), Cynodon dactylon (capim das Bermudas), Festuca arundinacea (fetusca gigante), Spartina pectinata (capim-praturá), Medica- go sativa (alfafa), Arundo donax (junco gigante) ou híbridos do mesmo, Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale (Triticum - trigo X centeio), Tripsicum dactyloides (gammagrass oriental), Leymus cinereus (centeio silvestre da bacia), Leymus condensatus (centeio silvestre gigante) e bambu.

[0152] Em algumas modalidades, uma espécie adequada pode ser uma espécie de sorgo silvestre, erva daninha ou cultivada tal como, mas não limitado a, Sorghum almum, Sorghum amplum, Sorghum angustum, Sorghum arundinaceum, Sorghum bicolor (tais como bicolor, guiné, caudado, kafir e durra), Sorghum bra- chypodum, Sorghum bulbosum, Sorghum burmahicum, Sorghum con- troversum, Sorghum drummondii, Sorghum ecarinatum, Sorghum exstans, Sorghum grande, Sorghum halepense, Sorghum interjectum, Sorghum intrans, Sorghum laxiflorum, Sorghum leiocladum, Sorghum macrospermum, Sorghum matarankense, Sorghum miliaceum, Sorghum nigrum, Sorghum nitidum, Sorghum plumosum, Sorghum propinquum, Sorghum purpureosearrozum, Sorghum stipoideum, Sorghum sudanensese, Sorghum timorense, Sorghum trichocladum, Sorghum versicolor, Sorghum virgatum, Sorghum vulgare ou híbridos, tais como Sorghum * almum, Sorghum x sudangrass ou Sorghum * drummondii.

[0153] Espécies adequadas também incluem Helianthus annuus (girassol), Carthamus tinctorius (açafrão), Jatropha curcas (jatropha), Ricinus communis (mamona), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linho) e Brassica juncea.

[0154] Espécies adequadas também incluem Beta vulgaris (beterraba sacarínica) e Manihot esculenta (cassava).

[0155] Espécies adequadas também incluem Lycopersicon escu- lentum (tomate), Lactuca sativa (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (bró- colis, couve-flor, couve-de-Bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimenta quente & doce), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cu- curbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spina- cea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abel- moschus esculentus (quiabo) e Solanum melongena (berinjela).

[0156] Espécies adequadas também incluem Papaver somniferum (papoula de ópio), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acu-minate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis la- nata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis panicu- lata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum ( = Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus fors- kohlii e Tanacetum parthenium.

[0157] Espécies adequadas também incluem Parthenium argenta- tum (guayule), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta), Bixa orellana e Alstroemeria spp.

[0158] Espécies adequadas também incluem Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia) e Poinsettia pulcherrima (crisântemo).

[0159] Espécies adequadas também incluem Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (lúpulo), Uniola paniculata (aveia), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (álamo), Pinus spp. (pinho), Abies spp. (pinheiro), Acer spp. (bordo), Hor- deum vulgare (cevada), Poa pratensis (bluegrass), Lolium spp. (ryegrass) e Phleum pratense (tomilho).

[0160] Assim, os métodos e composições podem ser usados sobre uma ampla faixa de espécies de planta, incluindo espécies do gênero dicot Brassica, Carthamus, Glycine, Gossypium, Helian- thus, Jatropha, Parthenium, Populus e Ricinus; e gênero monocot Elaeis, Festuca, Hordeum, Lolium, Oryza, Panicum, Pennise- tum, Phleum, Poa, Saccharum, Secale, Sorghum, Triticosecale, Triticum e Zea. Em algumas modalidades, uma planta é um membro da espécie Panicum virgatum (switchgrass), Sorghum bicolor (sorgo, sudangrass), Miscanthus giganteus (miscanthus), Sac- charum sp. (cana-de-açúcar), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba sacarínica) ou Pennisetum glaucum (painço perolado).

[0161] Em determinadas modalidades, os polinucleotídeos e vetores descritos aqui podem ser usados para transformar uma série de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas e sistemas de células de planta, em que tais plantas são híbridos de diferentes espécies ou variedades de uma espécie específica (por exemplo, Saccharum sp. X Miscanthus sp., Panicum virgatum x Panicum amarum, Panicum virgatum x Panicum amarulum e Pennise- tum purpureum x Pennisetum typhoidum).

[0162] Em outra modalidade da presente invenção, os constru- tos de expressão podem ser usados para expressão gênica em cultura de caule para fins de expressão de genes marcadores que codificam peptídeos ou polipeptídeos que permitem a identificação de plantas transformadas. Aqui, um promotor que está operavelmente ligado a um polinucleotídeo a ser transcrito é transformado nas células de planta e o tecido transformado é, então, colocado sobre meio de indução de caule. Se a transformação é conduzida com discos de folha, por exemplo, o caule se iniciará ao longo das bordas cortadas. Uma vez que o crescimento de caule tenha se iniciado, células de caule podem ser transferidas para meio de indução de broto e caule ou indução de raiz e caule. Expressão gênica ocorrerá nas células de caule que se desenvolvem sobre o meio apropriado: promotores de indução de raiz e caule serão ativados sobre meios de indução de caule e raiz, etc. Exemplos de tais peptídeos ou polipeptí- deos úteis como marcadores de transformação incluem, mas não estão limitados a, barstar, glifosato, acetiltransferase de cloranfenicol (CAT), canamicina, espectinomicina, estreptomi- cina ou outras enzimas de resistência a antibiótico, proteína fluorescente verde (GFP) e D-glucuronidase (GUS), etc. Alguns dos promotores fornecidos em SEQ ID NOs: 1-26 ou resíduos de ácido nucleico 601-1000 de SEQ ID NO: 26 também serão capazes de sustentar a expressão em alguns tecidos ou órgãos após o início ou término de regeneração. Exemplos desses tecidos ou órgãos são embriões somáticos, cotilédone, hipocótilo, epicó- tilo, folha, caules, raízes, flores e semente.

[0163] A integração no genoma da célula hospedeira pode também ser realizada por meio de métodos conhecidos no campo, por exemplo, através das sequências homólogas ou t-DNA discutido acima ou usando o sistema cre-lox (A.C. Vergunst et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 393).

7. Usos dos promotores da invenção 7.1 Usos dos promotores para estudar e realizar triagem de expressão

[0164] Os promotores da presente invenção podem ser usados para entender adicionalmente os mecanismos de desenvolvimento. Por exemplo, promotores que são especificamente induzidos du-rante formação de caule, formação de embrião somático, formação de broto ou formação de raiz podem ser usados para explorar os efeitos de superexpressão, repressão ou expressão ectó- pica de genes alvo para isolamento de fatores de trans- atuação.

[0165] Os vetores da invenção podem ser usados não apenas para expressão de regiões de codificação, mas também podem ser usados em clonagem por contenção de éxon ou procedimentos de contenção de promotor a fim de detectar expressão gênica diferencial em vários tecidos (vide Lindsey et al. (1993) Transge- nic Research 2: 3347; Auch e Reth (1990) Nucleic Acids Research 18: 6743).

[0166] Vetores de contenção, primeiro descritos para uso em bactérias (Casadaban e Cohen (1979) Proc. Nat. Aca. Sci. U.S.A. 76: 4530; Casadaban et al. (1980) J. Bacteriol. 143: 971) permitem seleção de eventos de inserção que repousam dentro de sequências de codificação. Vetores de contenção podem ser introduzidos em células ES pluripotentes em cultura e, então, passados para a linhagem germinativa via quimeras (Gossler et al. 91989) Science 244: 463; Skarnes (1990) Biotechnology 8: 827). Vetores de contenção de promotor ou gene frequentemente contêm um gene repórter, por exemplo, lacZ, care-cendo de seu próprio promotor e/ou sequência aceitadora de splicing a montante. Isto é, sifões de gene promotor contêm um gene repórter com um sítio de splicing, mas nenhum promotor. Se o vetor está em um gene e sofre splicing no produto gênico, então, o gene repórter é expresso.

[0167] Recentemente, o isolamento de genes preferencialmente induzidos se tornou possível com o uso de contenções (traps) de promotor sofisticados (por exemplo, IVET) que são baseados em complementação auxotrófica condicional ou resistência a fármaco. Em uma abordagem de IVET, vários fragmentos de genoma bacteriano são colocados em frente a um gene metabólico necessário acoplado a um gene repórter. Os construtos de DNA são inseridos em uma cepa bacteriana de outro modo carecendo do gene metabólico e as bactérias resultantes são usadas para infectar o organismo hospedeiro. Apenas bactérias expressando o gene metabólico sobrevivem no organismo hospedeiro; consequentemente, construtos inativos podem ser eliminados coletando apenas as bactérias que sobrevivem durante algum período mínimo no hospedeiro. Ao mesmo tempo, construtos amplamente ativos podem ser eliminados mediante triagem apenas de bactérias que não expressam o gene repórter sob condições de laboratório. As bactérias selecionadas através de tal método contêm construtos que são seletivamente induzidos apenas durante infecção do hospedeiro. A abordagem IVET pode ser modificada para uso em plantas a fim de identificar genes induzidos nas células de bactérias ou planta quando de infecção patogênica ou colonização da raiz. Para informação sobre IVET vide os artigos de Mahan et al. (1993) Science 259: 686-688, Mahan et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 669-673, Heithoff et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 934-939 e Wanget al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 10434.

7.2 Uso dos promotores para transcrição de genes de interesse

[0168] Em uma modalidade da invenção, uma molécula de ácido nucleico conforme mostrado em SEQ ID NOs: 1 - 26 ou resíduos de ácido nucleico 601-1000 de SEQ ID NO: 26 é incorporada em um construto de modo que um promotor da presente invenção é operavelmente ligado a uma molécula de ácido nucleico passível de transcrição que é um gene de interesse agronômico. Conforme usado aqui, o termo "gene de interesse agronômico" refere-se a uma molécula de ácido nucleico passível de transcrição que inclui, mas não está limitada a, um gene que confere uma característica desejável associada à morfologia, fisiologia, crescimento e desenvolvimento da planta, rendimento, intensificação nutricional, resistência à doença ou peste ou tolerância ambiental ou a produtos químicos. A expressão de um gene de interesse agronômico é desejável de forma a conferir um traço agronomicamente importante. Um gene de interesse agronômico que confere um traço agronômico benéfico à plantas de safra pode ser, por exemplo, incluindo, mas não limitado a, elementos genéticos compreendendo resistência a herbicida, rendimento aumentado, biomassa aumentada, controle de insetos, resistência à doença fúngica, resistência a vírus, resistência a nematóides, resistência à doença bacteriana, produção de amido, produção de óleos modificados, alta produção de óleo, teor modificado de ácido graxo, alta produção de proteína, amadurecimento de frutos, nutrição animal e humana intensificada, bi- opolímeros, resistência a estresse ambiental, peptídeos farmacêuticos, traços aprimorados de processamento, digestibilidade aprimorada, produção de enzima industrial, aroma aprimorado, fixação de nitrogênio, produção de semente híbrida e produção de biocombustível. Os elementos genéticos, métodos e transgenes descritos nas patentes listadas acima são aqui incorporados por referência.

[0169] Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico passível de transcrição pode obter os fenótipos acima mencionados mediante codificação de uma molécula de RNA que causa inibição objetivada de expressão de um gene endógeno, por exemplo, via mecanismos mediados por RNA inibitório (RNAi), antissenso ou de cossupressão. O RNA também poderia ser uma molécula de RNA catalítica (isto é, uma ribozima) manipulada para clivar um produto de mRNA endógeno desejado. Assim, qualquer molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína ou mRNA que expressa um fenótipo ou alteração de morfologia de interesse pode ser útil para a prática da presente invenção.

7.3 Transcrição Estresse Induzida-Preferencial

[0170] Promotores e elementos de controle que conferem modulação de transcrição sob estresse oxidativo, por estiagem, oxigênio, ferimentos e jasmonato de metila são particularmente úteis para a produção de células ou organismos hospedeiros que são mais resistentes a estresses bióticos e abióticos. Em uma planta, por exemplo, a modulação de genes, transcritos e/ou polipeptídeos em resposta ao estresse oxidativo pode proteger as células contra dano causado por agentes oxidativos, tais como peróxido de hidrogênio e outros radicais livres.

[0171] Indução por estiagem de genes, transcritos e/ou poli- peptídeos é útil para aumentar a viabilidade de uma planta, por exemplo, quando água é um fator limitativo. Em contraste, genes, transcritos e/ou polipeptídeos induzidos durante estresse por oxigênio podem ajudar na tolerância à enchentes de uma planta.

[0172] Os promotores e elementos de controle da presente invenção podem modular estresses similares àqueles descritos, por exemplo, em condições de estresse, tal como VuPLD1 (estresse por estiagem; feijão roxo; vide Pham-Thi et al. (1999) Plant Mol Biol 39:1257-65), decarboxilase de piruvato (estresse por oxigênio; arroz; vide Rivosal et al. (1997) Plant Physiol 114(3): 1021-29), gene carotenóide específico para cromoplasto (estresse oxidativo; Capsicum; vide Bouvier et al. (1998) J Biol Chem 273: 30651-59).

[0173] Promotores e elementos de controle que conferem transcrição preferencial durante cicatrização ou induzidos por jas- monato de metila podem produzir uma resposta de defesa em cé-lulas ou organismos hospedeiros. Em uma planta, por exemplo, modulação preferencial de genes, transcritos e/ou polipeptí- deos sob tais condições é útil para induzir a uma resposta de defesa à cicatrização mecânica, ataque por peste ou patógeno ou tratamento com determinados produtos químicos.

[0174] Promotores e elementos de controle da presente invenção também podem disparar uma resposta similar àquela descrita para cf9 (patógeno viral; tomate; vide O'Donnell et al. (1998) Plant J 14(1): 137-42), inibidor de ativador de fator de crescimento de hepatócito do tipo 1 (HAI-1), o qual intensifica a regeneração tecidual (lesão tecidual; ser humano; Koono et al. (1999) J Histochem Cytochem 47: 673-82), oxidase de amina de cobre (CuAO), induzida durante ontogênese e cicatrização de ferimento (cicatrização; grão de bico; Rea et al. (1998) FEBS Lett 437: 177-82), inibidor de proteinase II (cicatrização; batata; vide Pena-Cortes et al. (1988) Plant 174: 84-89), inibidor de protease II (jasmonato de metila; tomate; vide Farmer e Ryan (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 7713-7716), dois genes de proteína de armazenamento vegetativa, VspA e VspB (ci- catrização, ácido jasmônico e déficit de água; vide Mason e Mullet (1990) Plant Cell 2: 569-579).

[0175] Superregulação e sub-regulação de transcrição são úteis para essas aplicações. Por exemplo, genes, transcritos e/ou polipeptídeos que aumentam a tolerância oxidativa, à enchentes ou estiagem podem requerer superregulação de transcrição.

[0176] Tipicamente, o promotor ou elementos de controle, os quais conferem transcrição preferencial em cicatrização ou sob indução com jasmonato de metila, produzem níveis de transcrito que são estatisticamente significativos quando comparado com tipos de célula, órgãos ou tecidos sob outras condições.

[0177] Para superregulação preferencial de transcrição, o promotor e elementos de controle produzem níveis de transcrito que estão acima da base do ensaio.

7.4 Transcrição Luz Induzida-Preferencial

[0178] Promotores e elementos de controle que conferem transcrição preferencial quando induzidos pela exposição à luz podem ser utilizados para modular o crescimento, metabolismo e desenvolvimento; aumentar a tolerância à estiagem; e diminuir o dano por estresse pela luz para células ou organismos hospedeiros. Em uma planta, por exemplo, modulação de genes, transcritos e/ou polipeptídeos em resposta à luz é útil: (1) para aumentar a taxa fotossintética; (2) para aumentar o armazenamento de determinadas moléculas em folhas ou partes verdes apenas, por exemplo, silagem com alto teor de proteína ou amido; (3) para modular a produção de composições exógenas em tecido verde, por exemplo, determinadas enzimas alimentícias; (4) induzir ao crescimento ou desenvolvimento, tal como desenvolvimento e maturidade de frutos, durante exposição prolongada à luz; (5) para modular células-guarda a fim de controlar o tamanho do estômato em folhas para impedir a perda de água; ou (6) para induzir ao acúmulo de beta-caroteno a fim de ajudar as plantas a se conformar ao estresse induzido pela luz.

[0179] Os promotores e elementos de controle da presente invenção podem também disparar respostas similares àquelas descritas em: insensibilidade 3 ao ácido abscísico (ABI3) (mudas de Arabidopsis crescidas no escuro, vide Rohde et al. (2000) Plant Cell 12: 35-52), sintetase de asparagina (nódulos da raiz de ervilha, vide Tsai e Coruzzi (1990) EMBO J 9: 323-32), gene mdm2 (tumor humano, vide Saucedo et al. (1998) Cell Growth Differ 9: 119-30).

[0180] Superregulação e sub-regulação de transcrição são úteis para essas aplicações. Por exemplo, genes, transcritos e/ou polipeptídeos que aumentam a tolerância à estiagem ou luz podem requerer superregulação de transcrição.

[0181] Tipicamente, o promotor ou elementos de controle, os quais conferem transcrição preferencial em células, tecidos ou órgãos expostos à luz, produzem níveis de transcrito que são estatisticamente significativos quando comparado a células, tecidos ou órgãos sob exposição diminuída à luz (intensidade ou extensão de tempo).

[0182] Para superregulação preferencial de transcrição, o promotor e elementos de controle produzem níveis de transcrito que estão acima da base do ensaio.

7.5 Transcrição Induzida por Escuro-Preferencial

[0183] Promotores e elementos de controle que conferem transcrição preferencial quando induzidos pelo escuro ou intensidade diminuída de luz ou tempo de exposição à luz diminuído podem ser utilizados para sincronizar o crescimento, metabolismo e desenvolvimento, para modular as capacidades de fotossíntese para células ou organismos hospedeiros. Em uma planta, por exemplo, modulação de genes, transcritos e/ou polipeptídeos em resposta ao escuro é útil, por exemplo: (1) para induzir ao crescimento ou desenvolvimento, tal como desenvolvimento e maturidade de frutos, a despeito da falta de luz; (2) para modular genes, transcritos e/ou polipeptídeo ativos a noite ou em dias nublados; ou (3) para preservar a ultra estrutura do plastídeo presente no início de escuridão.

[0184] Os presentes promotores e elementos de controle podem também disparar uma resposta similar àquela descrita na seção acima.

[0185] Superregulação e sub-regulação de transcrição são úteis para essas aplicações. Por exemplo, genes, transcritos e/ou polipeptídeos que aumentam ou diminuem o crescimento e desenvolvimento podem requerer superregulação de transcrição.

[0186] Tipicamente, o promotor ou elementos de controle, os quais conferem transcrição preferencial sob exposição ao escuro ou intensidade de luz diminuída ou tempo de exposição diminuído, produzem níveis de transcrito que são estatisticamente significativos.

[0187] Para superregulação preferencial de transcrição, o promotor e elementos de controle produzem níveis de transcrito que estão acima da base do ensaio.

7.6 Transcrição Folha-Preferencial

[0188] Promotores e elementos de controle que conferem transcrição preferencial em uma folha podem modular o crescimento, metabolismo e desenvolvimento ou modular a utilização de nutriente e energia em células ou organismos hospedeiros. Em uma planta, por exemplo, modulação preferencial de genes, transcritos e/ou polipeptídeo em uma folha, é útil, por exemplo: (1) para modular o tamanho, formato e desenvolvimento da folha; (2) para modular o número de folhas ; ou (3) para modular o uso de energia ou nutriente com relação a outros órgãos e tecidos

[0189] Superregulação e sub-regulação de transcrição são úteis para essas aplicações. Por exemplo, genes, transcritos e/ou polipeptídeos que aumentam crescimento, por exemplo, podem requerer superregulação de transcrição.

[0190] Tipicamente, o promotor ou elementos de controle, os quais conferem transcrição preferencial nas células, tecidos ou órgãos de a folha, produzem níveis de transcrito que são estatisticamente significativos quando comparado com outras células, órgãos ou tecidos.

[0191] Para superregulação preferencial de transcrição, o promotor e elementos de controle produzem níveis de transcrito que estão acima da base do ensaio.

7.7 Transcrição Raiz-Preferencial

[0192] Promotores e elementos de controle que conferem transcrição preferencial em a raiz podem modular o crescimento, metabolismo, desenvolvimento, captação de nutrientes, fixação de nitrogênio ou modular a utilização de nutriente e energia em células ou organismos hospedeiros. Em uma planta, por exemplo, modulação preferencial de genes, transcritos e/ou polipeptídeo na raiz, é útil: (1) para modular o tamanho, formato e desenvolvimento da raiz; (2) para modular o número da raízes ou pelos da raiz; (3) para modular a captação de mineral, fertilizante ou água; (4) para modular o transporte de nutrientes; ou (5) para modular o uso de energia ou nutriente com relação à outras células, órgãos e tecidos.

[0193] Superregulação e sub-regulação de transcrição são úteis para essas aplicações. Por exemplo, genes, transcritos e/ou polipeptídeos que aumentam ou diminuem o crescimento, por exemplo, podem requerer superregulação de transcrição.

[0194] Tipicamente, o promotor ou elementos de controle, os quais conferem transcrição preferencial em células, tecidos ou órgãos de a raiz, produzem níveis de transcrito que são estatisticamente significativos quando comparado com outras células, órgãos ou tecidos.

[0195] Para superregulação preferencial de transcrição, o promotor e elementos de controle produzem níveis de transcrito que estão acima da base do ensaio.

7.8 Transcrição Caule/Broto-Preferencial

[0196] Promotores e elementos de controle que conferem transcrição preferencial em um caule ou broto podem modular o crescimento, metabolismo e desenvolvimento ou modular a utilização de nutriente e energia em células ou organismos hospedeiros. Em uma planta, por exemplo, modulação preferencial de genes, transcritos e/ou polipeptídeo em um caule ou broto, é útil, por exemplo: (1) para modular o tamanho, formato e desenvolvimento de cau- le/broto; ou (2) para modular o uso de energia ou nutriente com relação a outros órgãos e tecidos.

[0197] Superregulação e sub-regulação de transcrição são úteis para essas aplicações. Por exemplo, genes, transcritos e/ou polipeptídeos que aumentam o crescimento, por exemplo, podem requerer superregulação de transcrição.

[0198] Tipicamente, o promotor ou elementos de controle, os quais conferem transcrição preferencial nas células, tecidos ou órgãos de um caule ou broto, produzem níveis de transcrito que são estatisticamente significativos quando comparado a outras células, órgãos ou tecidos.

[0199] Para superregulação preferencial de transcrição, o promotor e elementos de controle produzem níveis de transcrito que estão acima da base do ensaio.

7.9 Transcrição Fruto- e Semente-Preferencial

[0200] Promotores e elementos de controle que conferem transcrição preferencial em a silíqua ou frutos podem modular o crescimento com o tempo, desenvolvimento ou maturidade; ou modular a fertilidade ; ou modular a utilização de energia e nutriente em células ou organismos hospedeiros. Em uma planta, por exemplo, modulação preferencial de genes, transcritos e/ou polipeptídeos em um fruto, é útil: (1) para modular o tamanho, formato, desenvolvimento e maturidade dos frutos; (2) para modular o número de frutos ou sementes; (3) para modular a fragmentação de semente; (4) para modular os componentes de sementes, tais como moléculas de armazenamento, amido, proteína, óleo, vitaminas, componentes antinutricionais, tal como ácido fítico; (5) para modular o vigor ou viabilidade de sementes e/ou mudas; (6) para incorporar composições exógenas em uma semente, tais como proteínas ricas em lisina; (7) para permitir sincronização similar de maturidade de frutos para flores com floração precoce e tardia; ou (8) para modular o uso de energia ou nutriente com relação a outros órgãos e tecidos.

[0201] Superregulação e sub-regulação de transcrição são úteis para essas aplicações. Por exemplo, genes, transcritos e/ou polipeptídeos que aumentam ou diminuem o crescimento, por exemplo, podem requerer superregulação de transcrição.

[0202] Tipicamente, o promotor ou elementos de controle, os quais conferem transcrição preferencial nas células, tecidos ou órgãos da silíquas ou frutos, produzem níveis de transcrito que são estatisticamente significativos quando comparado com outras células, órgãos ou tecidos.

[0203] Para superregulação preferencial de transcrição, o promotor e elementos de controle produzem níveis de transcrito que estão acima da base do ensaio.

7.10 Transcrição Caule-Preferencial

[0204] Promotores e elementos de controle que conferem transcrição preferencial em um caule podem ser úteis para modular a transcrição em células hospedeiras diferenciadas. Em transformação de uma planta, por exemplo, modulação preferencial de genes, transcritos, em caule é útil para modular a transcrição de um gene marcador, o qual pode facilitar a seleção de células que são transformadas com polinucleotídeos exógenos.

[0205] Superregulação e sub-regulação de transcrição são úteis para essas aplicações. Por exemplo, genes, transcritos e/ou polipeptídeos que aumentam a detectabilidade de gene marcador, por exemplo, podem requerer superregulação de transcrição.

[0206] Para superregulação preferencial de transcrição, o promotor e elementos de controle produzem níveis de transcrito que estão acima da base do ensaio.

7.11 Transcrição Flor-Específica

[0207] Promotores e elementos de controle que conferem transcrição preferencial em flores podem modular a pigmentação; ou modular a fertilidade em células ou organismos hospedeiros. Em uma planta, por exemplo, modulação preferencial de genes, transcritos e/ou polipeptídeos em uma flor, é útil: (1) para modular a cor da pétala; ou (2) para modular a fertilidade do pistilo e/ou estame.

[0208] Superregulação e sub-regulação de transcrição são úteis para essas aplicações. Por exemplo, genes, transcritos e/ou polipeptídeos que aumentam ou diminuem a pigmentação, por exemplo, podem requerer superregulação de transcrição

[0209] Tipicamente, o promotor ou elementos de controle, os quais conferem transcrição preferencial em flores, produzem níveis de transcrito que são estatisticamente significativos quando comparado com outras células, órgãos ou tecidos.

[0210] Para superregulação preferencial de transcrição, o promotor e elementos de controle produzem níveis de transcrito que estão acima da base do ensaio.

7.12 Transcrição Broto Imaturo- e Inflorescência-Preferencial

[0211] Promotores e elementos de controle que conferem transcrição preferencial em um broto imaturo ou inflorescência podem modular o crescimento com o tempo, desenvolvimento ou maturidade; ou modular a fertilidade ou viabilidade em células ou organismos hospedeiros. Em uma planta, por exemplo, modulação preferencial de genes, transcritos e/ou polipeptídeo em um broto imaturo e/ou inflorescência, é útil: (1) para modular o desenvolvimento, tamanho e maturidade do embrião; (2) para modular o desenvolvimento, tamanho e composição do endosperma; (3) para modular o número de sementes e frutos; ou (4) para modular o desenvolvimento e viabilidade de semente.

[0212] Superregulação e sub-regulação de transcrição são úteis para essas aplicações. Por exemplo, genes, transcritos e/ou polipeptídeos que aumentam ou diminuem o crescimento, por exemplo, podem requerer superregulação de transcrição.

[0213] Tipicamente, o promotor ou elementos de controle, os quais conferem transcrição preferencial em brotos imaturos e inflorescências, produzem níveis de transcrito que são estatisticamente significativos quando comparado a outros tipos de célula, órgãos ou tecidos.

[0214] Para superregulação preferencial de transcrição, o promotor e elementos de controle produzem níveis de transcrito que estão acima da base do ensaio.

7.13 Transcrição Senescência-Preferencial

[0215] Promotores e elementos de controle que conferem transcrição preferencial durante senescência podem ser usados para modular a degeneração celular, mobilização de nutrientes e re-moção de radicais livres em células ou organismos hospedeiros. Outros tipos de respostas que podem ser moduladas incluem, por exemplo, genes associados à senescência (SAG) que codificam enzimas que se acredita estarem envolvidas em degeneração celular e mobilização de nutrientes (Arabidopsis; vide Hensel et al. (1993) Plant Cell 5: 553-64) e o gene de CP-2/catepsina L (rato; Kim e Wright (1997) Biol Reprod 57: 1467-77), ambos induzidos durante senescência.

[0216] Em uma planta, por exemplo, modulação preferencial de genes, transcritos e/ou polipeptídeos durante senescência é útil para modular o amadurecimento de frutos.

[0217] Superregulação e sub-regulação de transcrição são úteis para essas aplicações. Por exemplo, genes, transcritos e/ou polipeptídeos que aumentam ou diminuem a remoção de radicais livres, por exemplo, podem requerer superregulação de transcrição.

[0218] Tipicamente, um promotor ou elementos de controle os quais conferem transcrição preferencial em células, tecidos ou órgãos durante senescência, produzem níveis de transcrito que são estatisticamente significativos quando comparado a outras condições.

[0219] Para superregulação preferencial de transcrição, o promotor e elementos de controle produzem níveis de transcrito que estão acima da base do ensaio.

7.14 Transcrição Germinação-Preferencial

[0220] Promotores e elementos de controle que conferem transcrição preferencial em uma semente em germinação podem modular o crescimento com o tempo, desenvolvimento ou maturidade; ou modular a viabilidade em células ou organismos hospedeiros. Em uma planta, por exemplo, modulação preferencial de genes, transcritos e/ou polipeptídeo em uma semente em germinação é útil: (1) para modular a emergência dos hipocótilos, cotilédones e radical; ou (2) modular o crescimento e desenvolvimento de broto e raiz primária.

[0221] Superregulação e sub-regulação de transcrição são úteis para essas aplicações. Por exemplo, genes, transcritos e/ou polipeptídeos que aumentam ou diminuem o crescimento, por exemplo, podem requerer superregulação de transcrição.

[0222] Tipicamente, o promotor ou elementos de controle, os quais conferem transcrição preferencial em uma semente em germinação, produzem níveis de transcrito que são estatisticamente significativos quando comparado a outros tipos de célula, órgãos ou tecidos.

[0223] Para superregulação preferencial de transcrição, promotor e elementos de controle produzem níveis de transcrito que estão acima da base do ensaio.

8. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS COM GFP E RESULTADOS PROCEDIMENTOS

[0224] As sequências de polinucleotídeo da presente invenção foram testadas quanto à atividade do promotor usando ensaios com Proteína Fluorescente Verde (Green Fluorescent Protein - GFP) da maneira a seguir.

[0225] Aproximadamente 1-3 kb de sequência genômica que ocorre imediatamente a montante do sítio de início de transcrição ATG do gene de interesse foram isolados usando primers apropriados configurados com sítios de restrição BstXI. Reações de PCR padrão usando esses iniciadores e DNA genômico foram conduzidas. O produto resultante foi isolado, clivado com BstXI e clonado no sítio BstXI de um vetor apropriado, tal como pNewBin4-HAP1-GFP (vide Figura 1).

Transformação Agrobacterium-Meáiaáa de Arabidopsis

[0226] Plantas hospedeiras e transgenes: Plantas Arabidopsis thaliana Wassilewskija (WS) do tipo silvestre são transformadas com plasmídeos Ti contendo sequências de ácido nucleico a serem expressas, conforme anotado nos respectivos exemplos, na orientação senso com relação ao promotor 35S em um plasmídeo Ti. Um vetor de plasmídeo Ti útil para esses construtos, CRS 338, contém o gene marcador selecionável de planta acetil- transferase de fosfinotricina (PAT) para o Ceres construído, o qual confere resistência a herbicida às plantas transformadas.

[0227] Dez eventos independentemente transformados são, tipicamente, selecionados e avaliados com relação a seu fenótipo qualitativo na geração T1.

[0228] Preparo de Mistura de Solo: 24L de solo Sunshine Mix #5 (Sun Gro Horticulture, Ltda., Bellevue, WA) são misturados com 16L de vermiculita Therm-O-Rock (Therm-O-Rock West, Inc., Chandler, AZ) em um misturador de cimento para produzir uma mistura de solo a 60:40. À mistura de solo são adicionados grânulos de 2 Tbsp Marathon a 1% (Hummert, Earth City, MO), 3 Tbsp OSMOCOTE® 14-14-14 (Hummert, Earth City, MO) e fertilizante 1 Tbsp Peters 20-20-20 (J.R. Peters, Inc., Allentown, PA), os quais são primeiro adicionados a 3 galões de água e, então, adicionados ao solo e totalmente misturados. Em geral, vasos de 4 polegadas de diâmetro são enchidos com mistura de solo. Os vasos são, então, cobertos com 8 polegadas quadradas de rede de náilon.

[0229] Plantio: Usando uma seringa de 60 mL, 35 mL da mistura de semente são aspirados. 25 gotas são adicionadas a cada vaso. Domos de propagação claros são colocados por cima dos vasos que são, então, colocados sob uma tela de sombreamento a 55% e subirrigadas mediante a adição de 1 polegada de água.

[0230] Manutenção de Planta: 3 a 4 dias após plantio, as coberturas e tela de sombreamento são removidas. As plantas são aguadas conforme necessário. Após 7 a 10 dias, os vasos são podados para 20 plantas por vaso usando um fórceps. Após 2 semanas, todas as plantas são subirrigadas com fertilizante Peters em uma taxa de 1 Tsp por galão de água. Quando os brotos têm cerca de 5 a 10 cm de comprimento, eles são presos entre o primeiro nódulo e a base do caule para induzir a brotos secundários. Infiltração por imersão é realizada 6 a 7 dias após prender.

[0231] Preparo de Agrobacterium: A 150 mL de YEB fresco é adicionado 0,1 mL de cada um de carbenicilina, espectinomicina e rifampicina (cada uma em uma concentração de estoque de 100 mg/ml). Blocos iniciais de Agrobacterium são obtidos (bloco de 96 poços com culturas de Agrobacterium crescidas até uma OD600 de aproximadamente 1,0) e inoculados em um vaso de cultura por construto mediante transferência de 1 mL da cavidade apropriada no bloco inicial. As culturas são, então, incubadas com agitação a 27°C. As culturas são centrifugadas após atingir uma OD600 de aproximadamente 1,0 (cerca de 24 horas). 200 mL de meio de infiltração são adicionados às pelotas de Agrobacterium resuspensas. Meio de infiltração é preparado mediante a adição de 2,2 g de sais MS, 50 g de sacarose e 5 μL de benzi- laminopurina a 2 mg/ml a 900 ml água.

[0232] Infiltração por Imersão: Os vasos são invertidos e submersos durante 5 minutos, de modo que a parte aérea da planta esteja na suspensão de Agrobacterium. As plantas são deixadas crescer normalmente e as sementes são coletadas.

[0233] Triagem em alto rendimento de plantas transgênicas TI : Semente é uniformemente dispersa em solo saturado de água em vasos e colocada no escuro a 4 °C no refrigerador durante duas noites para promover a germinação uniforme. Os vasos são, en tão, removidos do refrigerador e cobertas com uma tela de som- breamento de 55% durante 4 a 5 dias. Cotilédones são totalmente expandidos nesse estágio. FINALE® (Sanofi Aventis, Paris, França) é pulverizado sobre as plantas (3 ml de FINALE® diluído em 48 oz. água) e repetida a cada 3 a 4 dias, até que restem apenas os transformantes.

Ensaio de GFP

[0234] Tecidos são dissecados a olho nu ou sob ampliação usando um fórceps de grau 5 INOX e colocados sobre uma lâmina com água e cobertos com uma lamínula. Uma tentativa é feita para registrar imagens de padrões de expressão observados nos estágios iniciais e finais de desenvolvimento de tecidos listados abaixo. Tecidos específicos serão precedidos pelas de- signações Alta (H), Média (M) e Baixa (L).

[0235] Maduras T1: Essas são plantas T1 resultante de eventos de transformação independentes. Essas sofrem triagem entre o estágio 6,50 a 6,90 (isto é, a planta está em floração e 5090% das flores que a planta produzirá se desenvolveram), a qual é 4 a 6 semanas de idade. Nesse estágio, a planta madura possui flores, silíquas em todos os estágios de desenvolvimento e folhas totalmente expandidas. As plantas têm a imagem inicialmente formada sob UV com um microscópio Leica Confocal para permitir exame das plantas a um nível global. Se expressão está presente, a imagem é reformada usando microscopia confocal a laser.

[0236] Mudas T2: Prole é coletada de plantas T1 que proporcionam o mesmo padrão de expressão e a prole (T2) é esterilizada e colocada sobre meio solidificado de agar contendo sais M&S. No caso onde não há expressão nas plantas T1, sementes T2 são plantadas de todas as linhagens. As mudas são crescidas em incubadora Percival sob luz contínua a 22°C durante 10 a 12 dias. Cotilédones, raízes, hipocótilos, pecíolos, folhas e a região meristemática do broto de mudas individuais sofreram triagem até que fosse observado que duas mudas tinham o mesmo padrão. Em geral, o mesmo padrão de expressão foi encontrado nas duas primeiras mudas. Contudo, até 6 mudas sofreram triagem antes que "nenhum padrão de expressão" fosse registrado. Todos os construtos sofreram triagem como Mudas T2, mesmo se eles não tivessem um padrão de expressão na geração T1.

[0237] Maduras T2: As plantas maduras T2 sofreram triagem de uma maneira similar às plantas T1. As sementes T2 foram plantadas na estufa, expostas à seleção e pelo menos uma planta sofreu triagem para confirmar o padrão de expressão em T1. Em casos onde houve quaisquer alterações sutis na expressão, múltiplas plantas foram examinadas e as alterações anotadas nas tabelas.

[0238] Mudas T3: Isso foi feito similarmente às mudas T2, exceto que apenas as plantas para as quais tentou-se realizar triagem para confirmar o padrão são plantadas. DADOS DE IMAGEM:

[0239] Imagens foram coletadas através de microscopia confocal a laser de varredura. As imagens são tomadas como seções ópticas 2-D ou imagens 3-D geradas mediante empilhamento das seções 2-D coletadas em série. Todas as imagens são salvas como arquivos TIFF pelo software de formação de imagem, editadas no Adobe Photoshop e rotuladas no Powerpoint como tecidos de expressão específica e especificação de órgão.

RESULTADOS

[0240] O Relatório de Expressão de Promotores das Tabelas apresenta os resultados dos ensaios de GFP, conforme reportado por seu número de construto e número de linhagem correspondente.

[0241] Um ou mais fragmentos do promotor descrito acima são identificados na seção características diversas da SEQ ID relevante na Listagem de Sequência. Esses fragmentos foram testados quanto à atividade do promotor através dos mesmos procedimentos conforme descrito acima e os resultados são resumidos abaixo.

[0242] Nenhuma expressão é observada para o Promotor Ceres YP2581.

[0243] Um ou mais fragmentos do promotor descrito acima são identificados na seção características diversas da SEQ ID re- levante na Listagem de Sequência. Esses fragmentos foram testados quanto à atividade do promotor através dos mesmos procedimentos conforme descrito acima e os resultados são resumidos abaixo.

[0244] Nenhuma expressão é observada para o promotor ceres PD3457.

[0245] Um ou mais fragmentos do promotor descrito acima são identificados na seção características diversas da SEQ ID relevante na Listagem de Sequência. Esses fragmentos foram testados quanto à atividade do promotor através dos mesmos procedimentos conforme descrito acima e os resultados são resumidos abaixo.

[0246] Nenhuma indução é observada para o Promotor Ceres YP2229.

[0247] Um ou mais fragmentos do promotor descrito acima são identificados na seção característica diversa da SEQ ID relevante na Listagem de Sequência. Esses fragmentos foram testados quanto à atividade do promotor através dos mesmos procedimentos conforme descrito acima e os resultados são resumidos abaixo.

[0248] Promotor Ceres PD3464 expresso fracamente em raízes em arroz.

[0249] Um ou mais fragmentos do promotor descrito acima são identificados na seção característica diversas da SEQ ID relevante na Listagem de Sequência. Esses fragmentos foram testados quanto à atividade do promotor através dos mesmos procedimentos conforme descrito acima e os resultados são resumidos abaixo.

[0250] Para o Promotor Ceres PD3739, nenhuma expressão é observada.

[0251] Um ou mais fragmentos do promotor descrito acima são identificados na seção características diversas da SEQ ID relevante na Listagem de Sequência. Esses fragmentos foram testados quanto à atividade do promotor através dos mesmos procedimentos conforme descrito acima e os resultados são resumidos abaixo.

[0252] O Promotor Ceres PD3238 é fracamente expresso em raízes de arroz. Nenhuma expressão é observada para o Promotor Ceres PD3229 e o Promotor Ceres PD3243.

[0253] Um ou mais fragmentos do promotor descrito acima são identificados na seção característica diversa da SEQ ID relevante na Listagem de Sequência. Esses fragmentos foram testados quanto à atividade do promotor através dos mesmos procedi- mentos conforme descrito acima e os resultados são resumidos abaixo.

[0254] Para o Promotor Ceres PD2926, a expressão é fraca comparado com o promotor PD2995 de comprimento total; o promotor permanece ativo em todos os tecidos, exceto o embrião.

[0255] Para o Promotor Ceres PD3048, a expressão é fraca comparado com o promotor PD2995 de comprimento total; o promotor permanece ativo em todos os tecidos.

[0256] Para o Promotor Ceres PD3182, nenhuma expressão é observada.

[0257] Para o Promotor Ceres PD3345, a expressão é muito fraca.

[0258] Para o Promotor Ceres PD3503, nenhuma expressão é observada.

[0259] Para o Promotor Ceres PD3676, a expressão é fraca comparado com o promotor PD2995 de comprimento total; o promotor é expresso em níveis maiores nos tecidos vegetativos do que em tecidos reprodutivos.

[0260] Um ou mais fragmentos do promotor descrito acima são identificados na seção característica diversa da SEQ ID relevante na Listagem de Sequência. Esses fragmentos foram testados quanto à atividade do promotor através dos mesmos procedimentos conforme descrito acima e os resultados são resumidos abaixo.

[0261] Para o Promotor Ceres PD2929, a expressão é muito fraca comparado com o promotor PD2999 de comprimento total; o promotor permanece ativo em todos os tecidos.

[0262] Para o Promotor Ceres PD3183, a expressão é detectada apenas em anteros e estigma.

[0263] Para o Promotor Ceres PD3240, a expressão é muito fraca comparado com o promotor PD2999 de comprimento total; o promotor permanece ativo em todos os tecidos.

[0264] Para o Promotor Ceres PD3266, nenhuma expressão é detectada em arroz.

[0265] Um ou mais fragmentos do promotor descrito acima são identificados na seção características diversas da SEQ ID relevante na Listagem de Sequência. Esses fragmentos foram testados quanto à atividade do promotor através dos mesmos procedimentos conforme descrito acima e os resultados são resumidos abaixo.

[0266] O Promotor Ceres PD3584 é um promotor forte, de ampla expressão; comparável ao promotor PD3141 de comprimento total.

[0267] Um ou mais fragmentos do promotor descrito acima são identificados na seção característica diversa da SEQ ID relevante na Listagem de Sequência. Esses fragmentos foram testados quanto à atividade do promotor através dos mesmos procedimentos conforme descrito acima e os resultados são resumidos abaixo.

[0268] O Promotor Ceres PD3721 é um promotor forte, de expressão vegetativa; comparável ao promotor PD3147 de comprimento total.

[0269] Um ou mais fragmentos do promotor descrito acima são identificados na seção características diversas da SEQ ID relevante na Listagem de Sequência. Esses fragmentos foram testados com relação à atividade do promotor através dos mesmos procedimentos conforme descrito acima e os resultados são resumidos abaixo.

[0270] Para o Promotor Ceres PD3389, expressão é observada nas raízes de mudas de arroz.

[0271] A invenção tendo sido assim descrita, será evidente para aqueles versados na técnica que várias modificações dos materiais e métodos para prática da invenção podem ser feitas. Tais modificações devem ser consideradas dentro do escopo da invenção, conforme definido pelas reivindicações a seguir.

[0272] Cada uma das referências da literatura de patente e periódica citadas aqui é expressamente incorporada aqui por referência na íntegra.

Claims

1. Construto de vetor caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma primeira molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 9 ou um fragmento da mesma tendo a atividade promotora de SEQ ID NO: 9; e b) uma molécula de polinucleotídeo passível de transcrição, em que a dita primeira molécula de ácido nucleico e a dita molécula de polinucleotídeo passível de transcrição são heteró- logas uma à outra e são operavelmente ligadas.

2. Construto de vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita primeira molécula de ácido nucleico compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9.

3. Construto de vetor de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de polinucleo- tídeo passível de transcrição codifica um polipeptídeo.

4. Construto de vetor de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de polinucleotídeo passível de transcrição é operavelmente ligada à dita primeira molécula de ácido nucleico na orientação senso.

5. Construto de vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de polinucleotídeo passível de transcrição é transcrita em uma molécula de RNA que expressa o polipeptídeo codificado pela molécula de poli- nucleotídeo passível de transcrição.

6. Construto de vetor de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita segunda molécula de po- linucleotídeo passível de transcrição é operavelmente ligada à dita primeira molécula de ácido nucleico na orientação antis- senso.

7. Construto de vetor de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de polinucleotídeo passível de transcrição é transcrita em uma molécula de RNA antissenso.

8. Construto de vetor de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de polinucleo- tídeo passível de transcrição é transcrita em um RNA de inter-ferência contra um gene endógeno.

9. Construto de vetor de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de polinucleotídeo passível de transcrição codifica um polipeptídeo de interesse agronômico.

10. Construto de vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido construto de vetor está compreendido em uma planta ou célula de planta.

11. Construto de vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido construto de vetor está compreendido em uma semente.

12. Método para dirigir a transcrição caracterizado pelo fato de que é pela produção do construto de vetor conforme definido na reivindicação 1 compreendendo: a) obter a primeira molécula de ácido nucleico; b) obter a molécula de polinucleotídeo passível de transcri- ção; c) ligar operavelmente a primeira molécula de ácido nucleico com a molécula de polinucleotídeo passível de transcrição; e d) transcrever a molécula de polinucleotídeo passível de transcrição, em que a dita primeira molécula de ácido nucleico e a dita molécula de polinucleotídeo passível de transcrição são heteró- logas uma à outra.

13. Método de expressão de uma região de codificação exógena em uma planta caracterizado pelo fato de que compreende: a) transformação de uma célula de planta com o vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 9; b) regeneração de uma planta estavelmente transformada da célula de planta transformada da etapa (a); e c) seleção de plantas contendo uma célula de planta transformada, em que a expressão da molécula de polinucleotídeo passível de transcrição resulta em produção de um polipeptídeo codificado pela dita molécula de polinucleotídeo passível de transcrição.

14. Método de alteração da expressão de um gene em uma planta caracterizado pelo fato de que compreende: a) transformação de uma célula de planta com o construto de vetor conforme definido na reivindicação 1; e b) regeneração de plantas estavelmente transformadas a partir da dita célula de planta transformada.

15. Método de produção de uma planta transgênica, o dito méto- do caracterizado pelo fato de que compreende: a) introdução, em uma célula de planta, do construto de vetor conforme definido na reivindicação 1; e b) crescimento de uma planta a partir da dita célula de planta.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo heterólogo compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo heterólogo é operavel- mente ligado à dita região regulatória na orientação antissen- so.

18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo heterólogo é transcrito em um RNA de interferência.