BRPI0907565B1 - Composto - Google Patents

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BRPI0907565B1
BRPI0907565B1 BRPI0907565-8A BRPI0907565A BRPI0907565B1 BR PI0907565 B1 BRPI0907565 B1 BR PI0907565B1 BR PI0907565 A BRPI0907565 A BR PI0907565A BR PI0907565 B1 BRPI0907565 B1 BR PI0907565B1
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BR
Brazil
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certain embodiments
fibrosis
mir
modified oligonucleotide
modified
Prior art date
Application number
BRPI0907565-8A
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Inventor
Thomas Thum
Johann Bauersachs
Stefan Engelhardt
Carina Gross
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Julius Maximilians-Universitãt Würzburg
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Publication date
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Abstract

COMPOSTO, MÉTODOS PARA DIAGNOSTICAR FIBROSE, E PARA TRIAR UM COMPOSTO FARMACEUTICAMENTE ATIVO, REGIÃO PROMOTORA DE UM microRNA, E, CÉLULA. A presente invenção diz respeito a uma região promotora de um microRNA, o uso de um microRNA, em particular miR-21, e elementos relacionados para o diagnóstico e para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose. Adicionalmente, a invenção diz respeito a oligonucleotídeos de anti- sentido contra alvos de miR-21. Uma célula deficiente em miR-21, a região promotora e alvos de miR-21 e um organismo silenciado destes também são abrangidos. Finalmente, a invenção é direcionada a um método para diagnosticar a fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose e a um método para triar um composto farmaceuticamente ativo para o tratamento de fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose. A presente invenção diz respeito ainda a composições para o uso no tratamento, melhora, e/ou prevenção de fibrose. Em certas formas de realização, as composições modulam a atividade de um miRNA para o tratamento, melhora, e/ou prevenção de fibrose. Em certas formas de realização, as composições inibem a atividade de miR-21 para o tratamento, melhora, e/(...).

Description

[001] A presente invenção diz respeito ao campo do microRNA (miRNA), em particular miR-21 e seus alvos a jusante para o diagnóstico, prevenção e/ou terapia de fibrose e outras doenças. A presente invenção diz respeito ainda às composições, métodos e usos para o tratamento da fibrose. Tais métodos compreendem modular e inibir a atividade de um miRNA em um indivíduo tendo fibrose.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] MicroRNAs são uma a classe de RNAs não codificadores pequenos que controlam diversos processos biológicos incluindo caminhos da sinalização principal pela regulagem da expressão de mRNAs alvos complementares (Ambros, 2004). A desregulagem de microRNAs em várias entidades de doença é causada pelas alterações no genoma (Mi et al., 2007), a expressão diferencial ou infecções virais em alguns casos mudando a função do microRNA em supressores de tumor ou oncogenes. Os microRNAs foram recentemente implicados na regulagem de diversas funções cardíacas em uma série de estudos genéticos refinados (Care et al., 2007; Yang et al., 2007). Embora estes estudos ajudem a delinear os papéis de microRNA na fisiologia cardíaca, o desenvolvimento e morfogênese, mecanismos moleculares detalhados para microRNAs em caminhos de doença in vivo são deficientemente entendidos. Os antagonistas de microRNA de oligonucleotídeo de filamento único foram mostrados silenciar microRNAs endógenos in vitro e in vivo com efeitos resultantes sobre o mRNA alvo e níveis de proteína e metabolismo (Kruetzfeldt et al., 2005; Esau et al., 2006). Estas verificações apontam para a aplicação de antagonistas de microRNA para a validação in vivo da função do microRNA e, talvez mais importantemente, como uma nova modalidade terapêutica.
SUMÁRIO
[003] A presente invenção diz respeito a uma região promotora de um microRNA, o uso de um microRNA, em particular miR-21, e elementos relacionados para o diagnóstico e para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose. Adicionalmente, a invenção diz respeito a vários oligonucleotídeos de anti-sentido contra alvos de miR-21. Uma célula deficiente em miR-21, a região promotora e alvos de miR-21 e um organismo silenciado destes também são abrangidos. Finalmente, a invenção está direcionada a um método para diagnosticar fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose e a um método para triar um composto farmaceuticamente ativo para o tratamento de fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose.
[004] São aqui fornecidos métodos para tratar fibrose, que compreendem administrar a um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobase complementar a um miRNA.
[005] São aqui fornecidos métodos que compreendem identificar um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose; e administrar ao indivíduo um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo.
[006] São aqui fornecidos métodos que compreendem administrar a um indivíduo em risco de desenvolver fibrose um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobase que é complementa a um miRNA ou um precursor do mesmo, prevenindo deste modo a fibrose. Em certas formas de realização, a fibrose é a fibrose hepática. Em certas formas de realização, a fibrose é a fibrose pulmonar. Em certas formas de realização, a fibrose é a fibrose de pele. Em certas formas de realização, a fibrose é a fibrose relacionada com a idade. Em certas formas de realização, a fibrose é a fibrose cardíaca. Em certas formas de realização, a fibrose é a fibrose renal. Em certas formas de realização, a fibrose é a fibrose esplênica.
[007] São aqui fornecidos métodos que compreendem administrar a um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobase que é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo, em que o indivíduo tem pelo menos um doença ou condição cardíaca.
[008] São aqui fornecidos métodos que compreendem identificar um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose, em que o indivíduo tem pelo menos uma doença ou condição cardíaca; e administrar ao indivíduo um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo.
[009] Em certas formas de realização, a doença ou condição cardíaca é selecionada do grupo que consiste de hipertrofia cardíaca, insuficiência cardíaca hipertensiva, insuficiência cardíaca diastólica, insuficiência cardíaca sistólica, doença de armazenagem relacionada com o coração, cardiomiopatia, pericardite constritiva, doença da artéria coronária, infarto agudo do miocárdio, infarto crônico do miocárdio, insuficiência cardíaca direita, arritmias cardíacas, fibrose relacionada com miocardite, e doença de válvula cardíaca.
[010] Em certas formas de realização a cardiomiopatia é selecionada do grupo que consiste de cardiomiopatia dilatativa, cardiomiopatia hipertrófica com obstrução, cardiomiopatia hipertrófica sem obstrução, cardiomiopatia restritiva, cardiomiopatia ventricular direita arritmogênica, e cardiomiopatia diabética.
[011] Em certas formas de realização a doença de válvula cardíaca é selecionada do grupo que consiste de estenose de válvula mitral, estenose de válvula aórtica, estenose de válvula tricúspide, e estenose de válvula pulmonar.
[012] Em certas formas de realização a doença de válvula cardíaca é selecionada do grupo que consiste de insuficiência de válvula mitral, insuficiência de válvula aórtica, insuficiência de válvula tricúspide, e insuficiência de válvula pulmonar.
[013] Em certas formas de realização os métodos aqui fornecidos compreendem ainda administrar um ou mais agentes farmacêuticos adicionais.
[014] Em certas formas de realização a administração melhora o aumento do peso cardíaco, dilatação ventricular esquerda, ou dano do encurtamento fracionário.
[015] Em certas formas de realização a administração impede o aumento do peso cardíaco, dilatação ventricular esquerda, ou dano do encurtamento fracionário.
[016] Em certas formas de realização a administração melhora a função cardíaca.
[017] Em certas formas de realização a administração compreende a administração intravenosa, administração subcutânea, administração intra-arterial, ou administração intracardíaca.
[018] São aqui fornecidos métodos para tratar fibrose, que compreende administrar a um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobase complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo, em que o indivíduo tem pelo menos uma doença ou condição hepática.
[019] São aqui fornecidos métodos que compreendem identificar um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose, em que o indivíduo tem pelo menos uma doença ou condição hepática; e administrar ao indivíduo um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, a pelo menos uma doença ou condição hepática é a lesão hepática crônica. Em certas formas de realização, a pelo menos uma doença ou condição hepática é a infecção pelo vírus da hepatite. Em certas formas de realização a infecção de hepatite é a infecção pelo vírus da hepatite C. Em certas formas de realização a pelo menos uma doença ou condição hepática é a esteato-hepatite não alcoólica. Em certas formas de realização a administração compreende a administração intravenosa ou administração subcutânea. Em certas formas de realização a pelo menos uma doença ou condição hepática é a cirrose. Em certas formas de realização a administração melhora a função hepática.
[020] São aqui fornecidos métodos para tratar fibrose, que compreende administrar a um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobase complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo, em que o indivíduo tem pelo menos uma doença ou condição pulmonar.
[021] São aqui fornecidos métodos que compreendem identificar um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose, em que o indivíduo tem pelo menos uma doença ou condição pulmonar; e administrar ao indivíduo um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização a pelo menos uma outra doença ou condição pulmonares é a doença pulmonar obstrutiva crônica. Em certas formas de realização a administração compreende a administração pulmonar.
[022] São aqui fornecidos métodos para tratar fibrose, que compreende administrar a um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobase complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo, em que o indivíduo tem pelo menos uma outra doença ou condição.
[023] São aqui fornecidos métodos que compreendem identificar um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose, em que o indivíduo tem pelo menos uma outra doença ou condição; e administrar ao indivíduo um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização a pelo menos uma outra doença ou condição é a hipertensão pulmonar. Em certas formas de realização a pelo menos uma outra doença ou condição é uma doença relacionada com vaso sanguíneo. Em certas formas de realização a doença relacionada com o vaso sanguíneo é selecionada do grupo que consiste de rigidez arterial, mediasclerose, e arteriosclerose. Em certas formas de realização a pelo menos uma outra doença ou condição é a esclerose intestinal. Em certas formas de realização a pelo menos uma outra doença ou condição é a esclerose sistêmica. Em certas formas de realização a pelo menos uma outra doença ou condição é a selecionada do grupo que consiste de fibrose retroperitoneal, fibrose proliferativa, fibrose neoplástica, fibrose sistêmica nefrogênica, fibrose de injeção, fibrose mediastinal, mielofibrose, síndrome da dor pós vasectomia, artrite reumatóide.
[024] Em certas formas de realização, a administração melhora a fibrose. Em certas formas de realização, a administração retarda ainda a progressão da fibrose. Em certas formas de realização a administração para ainda a progressão da fibrose. Em certas formas de realização a administração reduz a fibrose. Em certas formas de realização a administração reduz o teor de colágeno.
[025] São aqui fornecidos métodos para tratar um distúrbio fibroproliferativo que compreende administrar a um indivíduo tendo ou suspeito de ter um distúrbio fibroproliferativo um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo, tratando deste modo o distúrbio fibroproliferativo.
[026] Em certas formas de realização a administração compreende a administração intravenosa, administração subcutânea, administração pulmonar, administração intra-arterial, ou administração intracardíaca.
[027] São aqui fornecidos métodos para inibir a proliferação de fibroblasto que compreende contactar um fibroblasto com um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo, inibindo deste modo a proliferação de fibroblasto.
[028] São aqui fornecidos métodos pára estimular a apoptose de fibroblasto que compreende contactar um fibroblasto com um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar a miR-21 ou um precursor do mesmo, estimulando deste modo a apoptose de fibroblasto.
[029] São aqui fornecidos métodos para aumentar a proteína Sprouty 1 em um fibroblasto que compreende contactar o fibroblasto com um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo, estimulando deste modo a expressão da proteína Sprouty 1.
[030] São aqui fornecidas composições para inibir MicroRNA. Em certas formas de realização, o miRNA é miR-21. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase complementar a uma sequência de nucleobase que é pelo menos 80% idêntica a miR-21 ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização miR-21 tem a sequência de nucleobase apresentada como a SEQ ID NO: 1. Em certas formas de realização o precursor de miR-21 tem a sequência de nucleobase apresentada como a SEQ ID NO: 11.
[031] Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 12 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 13 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 14 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 15 a 24 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 15 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 16 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 17 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 18 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 19 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 20 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 21 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 22 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 23 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização o oligonucleotídeo modificado consiste de 24 nucleosídeos ligados.
[032] Em certas formas de realização a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado não tem mais do que dois desemparelhamentos com a sequência de nucleobase de miR-21 ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado não tem mais do que um desemparelhamento com a sequência de nucleobase de miR-21 ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado não tem nenhum desemparelhamento com a sequência de nucleobase de miR-21 ou um precursor do mesmo.
[033] Em certas formas de realização a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 15 nucleobases contíguas da sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 12. Em certas formas de realização a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 16 nucleobases contíguas da sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 12. Em certas formas de realização a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 17 nucleobases contíguas da sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 12. Em certas formas de realização a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 18 nucleobases contíguas da sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 12. Em certas formas de realização a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 19 nucleobases contíguas da sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 12. Em certas formas de realização a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 20 nucleobases contíguas da sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 12. Em certas formas de realização a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 21 nucleobases contíguas da sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 12. Em certas formas de realização a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 22 nucleobases contíguas da sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 12.
[034] Em certas formas de realização a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado consiste da sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 12.
[035] Em certas formas de realização, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado conjugado a um ligando. Em certas formas de realização tem a estrutura (III) (5’) QxQz1(Qy)nQz2Qz3Qz4Q- (3’) (III) Em que Cada Q é independentemente um nucleosídeo modificado em 2’-O-metila; X é
Figure img0001
Um de A e B é S enquanto o outro é O; y é
Figure img0002
Cada um de z1, z2, z3, e z4 é independentemente x ou y; n = 6 a 17
Figure img0003
Em que: X é N(CO)R7, ou NR7; Cada um de R1, R3 e R9, é independentemente, H, OH, ou - CH2ORb contanto que pelo menos um de R1, R3 e R9 é OH e pelo menos um de R1, R3 e R9 é -CH2ORb; R7 é Rd ou alquila C1-C20 substituído com NRcRd ou NHC(O)Rd; Rc é H ou alquila C1-C6; Rd é um radical de carboidrato; ou um radical de esteróide, que é opcionalmente amarrado a pelo menos um radical de carboidrato; e Rb é
Figure img0004
com um de A e B sendo S enquanto o outro é O.
[036] Em certas formas de realização, Rd é colesterol. Em certas formas de realização, cada um de z1, z2, z3, e z4 é
Figure img0005
com um de A e B sendo S enquanto o outro é O.
[037] Em certas formas de realização, R1 é -CH2ORb. Em certas formas de realização, R9 é OH. Em certas formas de realização, R1 e R9 são trans. Em certas formas de realização, R1 e R3 são trans. Em certas formas de realização, R3 é -CH2ORb. Em certas formas de realização, R1 é OH. Em certas formas de realização, R1 e R3 são trans. Em certas formas de realização, R3 e R9 são trans. Em certas formas de realização, R9 é CH2ORb. Em certas formas de realização, X é NC(O)R7. Em certas formas de realização, R7 é - CH2(CH2)3CH2NHC(O)Rd.
[038] Em certas formas de realização, pelo menos uma ligação internucleosídica é uma ligação internucleosídica modificada. Em certas formas de realização, cada ligação internucleosídica é uma modificado ligação internucleosídica. Em certas formas de realização, pelo menos uma ligação internucleosídica é uma ligação internucleosídica de fosforotioato. Em certas formas de realização, cada ligação internucleosídica é uma ligação internucleosídica de fosforotioato. Em certas formas de realização, pelo menos um nucleosídeo compreende um açúcar modificado. Em certas formas de realização, uma pluralidade de nucleosídeos compreende um açúcar modificado. Em certas formas de realização, cada nucleosídeo compreende um açúcar modificado. Em certas formas de realização, cada nucleosídeo compreende um açúcar de 2’-O-metoxietila. Em certas formas de realização, cada um de uma pluralidade de nucleosídeos compreende um açúcar de 2’-O- metoxietila e cada um de uma pluralidade de nucleosídeos compreende um açúcar de 2’-fluoro. Em certas formas de realização, cada açúcar modificado é independentemente selecionado de um açúcar de 2’-O-metoxietila, um açúcar de 2’-fluoro, um açúcar de 2’-O-metila, ou uma porção de açúcar bicíclico. Em certas formas de realização, pelo menos um nucleosídeo compreende uma nucleobase modificada. Em certas formas de realização, a nucleobase modificada é uma 5-metilcitosina. Em certas formas de realização, pelo menos um nucleosídeo compreende uma citosina, em que a citosina é uma 5- metilcitosina. Em certas formas de realização, cada citosina é uma 5- metilcitosina.
[039] Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é pelo menos 90% complementar à sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 1. Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é pelo menos 95% complementar à sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 1. Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é 100% complementar à sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 1. Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar de tamanho natural com a sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 1. Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é pelo menos 90% complementar à sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 11. Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é pelo menos 95% complementar à sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 11. Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é 100% complementar à sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 11. Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase miR-21 consiste da sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 1. Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase precursora consiste da sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 11.
[040] Em certas formas de realização, o composto que compreende o oligonucleotídeo modificado é preparado como uma composição farmacêutica. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado é preparado como uma composição farmacêutica.
[041] Em certas formas de realização, o composto consiste de um oligonucleotídeo modificado. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado é um oligonucleotídeo modificado de filamento único. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado é um oligonucleotídeo de anti-sentido.
[042] São aqui fornecidas composições para o uso no tratamento, prevenção, e/ou melhora de fibrose. Além disso são aqui fornecidos compostos que compreendem oligonucleotídeos modificados tendo uma sequência de nucleobase complementar a uma miRNA, para o uso no tratamento, prevenção, e/ou melhora de fibrose.
[043] São aqui fornecidos oligonucleotídeos de anti- sentido complementares a miR-21 para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de fibrose.
[044] São aqui fornecidos oligonucleotídeos de anti- sentido complementares a miR-21 para o uso no tratamento e/ou prevenção de fibrose.
[045] É aqui fornecido o uso de miR-21 e/ou um oligonucleotídeo de anti-sentido contra miR-21 para o tratamento de fibrose.
[046] É aqui fornecido o uso de miR-21 e/ou um oligonucleotídeo de anti-sentido contra miR-21 para o diagnóstico de fibrose.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[047] Fig. 1 Desregulagem de miR-21 em doença cardíaca e expressão predominante em fibroblastos cardíacos
[048] (a) Análise da expressão de microRNA pelos microarranjos. O RNA foi isolado do miocárdio ventricular esquerdo de um modelo de murino de insuficiência cardíaca (camundongos β1AR-TG) nos estágios precoce (três meses de idade), moderado (seis meses de idade) e tardio (doze meses) de insuficiência cardíaca. A expressão é apresentada como vezes de regulagem vs. controles do tipo selvagem. miR-21 é marcado em vermelho. Os dados são de 3 a 4 hibridizações independentes por grupo.
[049] (b) Esquerda análise de Northern blot da expressão de miR-21 em estágios diferentes de insuficiência cardíaca em camundongos β1AR-TG. Direita Análise quantitativa dos dados do painel superior.
[050] (c) Esquerda análise de Northern blot da expressão de miR-21 em miocárdio ventricular esquerdo humano não falhando e falhando. Direita Análise quantitativa da forma madura de miR-21 em miocárdio ventricular esquerdo humano não falhando e falhando.
[051] (d) Superior Cardiomiócitos neonatais tingidos com 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e um anticorpo direcionado contra α- actinina depois da transfecção com miR misturado (controle-pré-miR, 50 nM, 72 h), miR-21 sintético (pré-miR-21, 50 nM, 72 h) e um inibidor de miR-21 (anti-miR-21, 50 nM, 72 h). Cardiomiócitos foram cultivados sob condições de controle (ver Métodos suplementares) ou estimulados com FCS (5%) por 48 h. Inferior Análise quantitativa de tamanhos de cardiomiócito individuais (análise de histograma). N > 200 cardiomiócitos foram analisados por grupo.
[052] (e) Superior Geração de camundongos transgênicos que expressam miR-21 sob o controle do promotor alfa-MHC. Intermediário Northern blot de miR-21 maduro em animais do tipo selvagem (WT) e transgênicos (TG). Inferior Áreas cardíacas de seção transversal de camundongos do tipo selvagem e transgênicos em miR-21 tingidos para determinar a morfologia geral (mancha HE) e deposição de colágeno (vermelho Sírio).
[053] (f) expressão de miR-21 em fibroblastos cardíacos e cardiomiócitos. Northern blot (Superior) e análise de PCR em tempo real quantitativa (Inferior). Todas as barras de erro indicam SEM. n = 3 a 6 para a até f.
[054] Fig. 2 Inibição de Sprouty1 através de miR-21 desreprime da sinalização de ERK e realça a sobrevivência de fibroblasto
[055] (a) Corações de camundongos Spry1 LacZ +/- foram tingidos com X-gal. A análise macroscópica (superior) e microscópica (inferior) mostra a detecção de LacZ em fibroblastos cardíacos. As barras pretas curtas representam 100 μm. As barras pretas grandes representa 10 μm
[056] (b, c) Superior Detecção de SPRY1, ERK1/2 e fosfo-ERK1/2 em ventrículos esquerdos humanos falhando (b) e depois da transfecção de cardiomiócitos co-cultivados e fibroblastos com microRNA misturado (Controle negativo Pre-miR® #2, 50 nM, 72h), miR-21 sintético (pré-miR-21, 50 nM, 72 h) ou um inibidor de miR-21 (anti-miR-21, 50 nM, 72 h). Inferior Análise quantitativa de resultados de Western blotting.
[057] (d) Superior Determinação de SPRY1, ERK1/2, fosfo-ERK1/2 depois do silenciamento mediado pelo siRNA de SPRY1 (150 nM, 72 h) ou tratamento com siRNA misturado (150 nM, 72 h) das células cardíacas co-cultivadas. Inferior Análise quantitativa de resultados de Western blotting.
[058] (e) Superior Análise de FACS de fibroblastos cardíacos positivos em anexina V depois do tratamento com microRNA misturado (controle-pré-miR, 100 nM, 72 h), miR-21 sintético (pré-miR-21, 100 nM, 72 h), antagonistas de miR-21 (anti-miR-21, 100 nM, 72 h) ou respectivos controles (100 nM, 72 h). Inferior Análise quantitativa de células positivas em anexina V depois dos respectivos tratamentos.
[059] (f) Superior concentração de FGF2 em sobrenadantes de fibroblastos cardíacos cultivados depois do tratamento com microRNA misturado (controle pré-miR, 100 nM, 72 h), miR-21 sintético (pré-miR-21, 100 nM, 72 h) ou antagonistas de miR-21 (anti-miR-21, 100 nM, 72 h) ou (inferior) depois do silenciamento mediado por siRNA de SPRY1 (150 nM, 72 h) ou tratamento com siRNA misturado (150 nM, 72 h) Todas as barras de erro indicam SEM. n = 36 para a até f.
[060] Fig. 3 Silenciamento terapêutico de miR-21 IN VIVO impede a fibrose cardíaca e a insuficiência cardíaca
[061] (a) Superior Detecção pela fluorescência microscópica de Cy3 e tingimento DAPI em tecido cardíaco ventricular esquerdo depois da injeção de oligonucleotídeo modificado rotulado com Cy3 via a veia jugular. Os controles receberam injeções de PBS. Inferior Camundongos submetidos à constrição aórtica (TAC) ou operação simulada foram injetados com controle (PBS, 200 μl) ou antagomir-21 (200 μl; 80 mg/kg/d) 24h após a operação por três dias consecutivos.
[062] (b) Superior Análise de Northern blot da expressão de miR-21 em camundongos não tratados (controle) e tratados com antagomir-2 depois de TAC. Inferior Análise quantitativa da expressão de miR-21 cardíaco.
[063] (c) Superior Análise de Western blot de SPRY1, ERK1/2 e fosfo-ERK1/2 em camundongos depois da operação simulada ou depois de TAC tratados com controle ou antagomir-21. A expressão de G beta foi mostrada como um controle doméstico. Inferior Resultados da análise quantitativa de Western blot.
[064] (d) Seções cardíacas depois do tingimento com vermelho Sirius para a detecção da fibrose miocárdica em camundongos de controle e tratados com antagomir-21.
[065] (f) Análise quantitativa da fibrose miocárdica (esquerda) e peso do coração/ corporal (direita) em camundongos de controle e tratados com antagomir-21.
[066] (g) Superior Análise de transcriptoma Global do genoma de camundongo em tecido cardíaco de camundongos depois da operação simulada ou depois de TAC tratados com controle ou antagomir-21. As caixas vermelhas (verde) mostram genes significantemente (p<0,05) induzidos (reprimidos). Inferior Normalização de genes supra-regulados que codificam proteínas envolvidas na fibrose miocárdica depois de TAC pelo tratamento com antagomir-21.
[067] (h) Análises ecocardiográficas. LVD, diâmetro ventricular esquerdo; FS, encurtamento fracionário.
[068] (i) Mecanismo proposto subjacente Pa desrepressão da sinalização de ERK cardíaco através da inibição mediada por miR-21 de SPRY1. Todas as barras de erro indicam SEM, n = 3 a 6 para a até g.
[069] Fig. 4 Regulagem transcricional de miR-21
[070] (a) Conservação de sequência dentro das regiões promotoras de miR-2 de espécies diferentes em comparação com o promotor de miR-21 humano. As barras indicam grau de conservação.
[071] (b) Atividade de luciferase de promotor de construções de miR-21 humano. O encurtamento progressivo do promotor nativo leva à identificação de uma região de 117 pares de base que é responsável pela expressão de miR-21. n = 3.
[072] (c) Os dados de luciferase do promotor de construções de miR-21 humano depois da deleção/mutação de sítios de ligação de fator de transcrição individual. n = 3.
[073] Fig. 5 Silenciamento do miR-21 ubiquamente expressado induz um fenótipo cardíaco em zebrafish
[074] (a) Vista lateral esquerda de embriões de controle de MO e morfantes de miR-21 a 80 hpf. A, átrio; V, ventrículo; as setas escuras salientam o edema pericárdico.
[075] Direita Superior corações injetados com morfolino de controle (MO-controle) demonstram morfologia cardíaca normal em 80 horas após a fertilização (hpf). Os corações são laçados, as camadas endocardiais e miocardiais são bem desenvolvidas e o ventrículo (V) e o átrio (A) é separado pelo anel atrio-ventricular (AV). Inferior morfantes de miR-21 (M0-1 injetados) desenvolvem edema pericárdico devido à perda da contratibilidade ventricular e demonstram caudas encurtadas, ao passo que o desenvolvimento de outros sistemas de órgão processa-se normalmente.
[076] (b) A inibição da função de miR-21 em dois morfolino-oligonucleotídeos modificados de anti-sentido diferentes (MO-1, n = 496 e MO-2, n = 460) leva a fenótipos idênticos em > 90% dos embriões injetados. Os dados são de 3 injeções independentes por grupo.
[077] (c) Função miocárdica demonstrada como encurtamento fracionário (FS) da câmara ventricular de morfantes MO- controle (n = 6) e miR-21 injetados por dois morfolinos diferentes (MO-1, n = 8 e MO-2, n = 8) em 48, 72, 96 e 120 hpf. FS ventricular de ventrículos de morfante miR-21 severamente diminuiu com o tempo.
[078] Fig. 6 Eficácia de transfecção em cardiomiócitos cultivados
[079] (a) Cardiomiócitos neonatais cultivados foram transfectados com miR-21 rotulado com Cy-3 (50 nM, 72 h, Ambion, USA) e tingidos com DAPI (direita). Para comparação os cardiomiócitos cultivados foram tingidos com DAPI sozinho (esquerda).
[080] (b) Análise de Northern blot da expressão de miR- 21 em cardiomiócitos cultivados depois da transfecção com microRNA misturado (controle-pré-miR, 50 nM, 72 h), um inibidor de miR-21 (anti- miR-21, 50 nM, 72 h), ou miR-21 sintético (pré-miR-21, 50 nM, 72 h).
[081] Todas as barras de erro indicam SEM; n = 3 a 6 para a) e b).
[082] Fig. 7 Sítios de ligação de MicroRNA dentro da 3’UTR do gene Spry1
[083] Superior Mudança na expressão de vários microRNAs com sítios de ligação dentro da 3’UTR do gene Spry1.
[084] Inferior microRNAs com sítios de ligação dentro da 3’UTR analisados pelo microarranjo de microRNA são apresentados em cinza. Cds = sequência codificadora
[085] Fig. 8 Dados de expressão de PCR em tempo real de miR-21
[086] Além da determinação pelo Northern blotting, a expressão de miR-21 foi analisada pela PCR em tempo real em tecido ventricular esquerdo de camundongos depois da operação simulada, simulado+tratamento com antagomir-21, TAC e TAC+tratamento com antagomir-21 (esquerda), assim como em corações de camundongos do tipo selvagem e camundongos transgênicos em miR-21 (direita). n = 4 a 6 por grupo.
[087] Dados não mostrados:
[088] Uma triagem quanto aos alvos de miR-21 teóricos revelou 22 genes alvo potenciais conhecidos, dos quais 8 foram mostrados ser expressados dentro do tecido cardíaco. A combinação de três ferramentas de prognóstico de alvo diferentes identificaram Spry1 (sprouty1) como um candidato altamente provável.
[089] Regulagem transcricional de miR-21
[090] Existe conservação de sequência dentro das regiões promotoras de miR-2 de espécies diferentes em comparação com o promotor de miR-21 humano. A atividade de luciferase do promotor de construções de miR-21 humano depois da deleção/mutação de sítios de ligação de fator de transcrição individual foi mostrada. O encurtamento progressivo do promotor nativo leva à identificação de uma região de 117 pares de base que é responsável pela expressão de miR-21. n = 3.
[091] Eficácia de transfecção em cardiomiócitos cultivados
[092] Os cardiomiócitos neonatais cultivados foram transfectados com miR-21 rotulado com Cy-3 (50 nM, 72 h, Ambion, USA) e tingido com DAPI. Para comparação cardiomiócitos cultivados foram tingidos com apenas com DAPI. O Northern blotting da expressão de miR-21 em cardiomiócitos cultivados depois da transfecção com microRNA misturado (controle-pré-miR, 50 nM, 72 h), um inibidor de miR-21 (anti- miR-21, 50 nM, 72 h), ou miR-21 sintético (pré-miR-21, 50 nM, 72 h) foi analisado.
[093] Sítios de ligação de microRNA dentro da 3’UTR do gene Spry1
[094] Existe uma mudança na expressão de vários microRNAs com sítios de ligação dentro da 3’UTR do gene Spry1. microRNAs com sítios de ligação dentro da 3’UTR foram analisados pelo microarranjo de microRNA.
[095] Dados de expressão da PCR em tempo real de miR- 21
[096] Além da determinação pelo Northern blotting, a expressão de miR-21 foi analisada pela PCR em tempo real em tecido ventricular esquerdo de camundongos depois da operação simulada, tratamento com simulado+antagonista de miR-21, tratamento com TAC e TAC+antagonista de miR-21 assim como em corações de camundongos tipo selvagem e camundongos transgênicos em miR-21.
DESCRIÇÃO DETALHADA Definições
[097] “Fibrose” significa a formação ou desenvolvimento de tecido conectivo fibroso em excesso em um órgão ou tecido. Em certas formas de realização, a fibrose ocorre como um processo reparador ou reativo. Em certas formas de realização, a fibrose ocorre em resposta ao dano ou lesão. O termo “fibrose” deve ser entendido como a formação ou desenvolvimento de tecido conectivo fibroso em excesso em um órgão ou tecido como um processo reparador ou reativo, como oposto a uma formação de tecido fibroso como um constituinte normal de um órgão ou tecido.
[098] Um oligonucleotídeo de anti-sentido deve ser entendido como um oligonucleotídeo que tem uma certa sequência complementar a uma outra sequência, em particular uma sequência complementar a miR-21. Um alvo de miR-21 também pode ser entendido abranger um alvo a jusante de miR-21. É importante mencionar que uma inibição de miR-21, por exemplo, via um oligonucleotídeo com uma sequência pelo menos complementar a miR-21 levará a uma desrepressão ou mesmo uma expressão excessiva de alvos de miR-21, como Sprouty e outros.
[099] “Indivíduo” significa um ser humano ou animal não humano selecionado para tratamento ou terapia.
[0100] “Indivíduo suspeito de ter” significa um indivíduo que exibe um ou mais indicadores clínicos de uma doença ou condição.
[0101] “Indivíduo suspeito de ter fibrose” significa um indivíduo que exibe um ou mais indicadores clínicos de fibrose.
[0102] “Prevenir” ou “prevenção” referem-se a retardar ou evitar o início, desenvolvimento ou progressão de uma condição ou doença por um período de tempo, incluindo semanas, meses, ou anos.
[0103] “Tratamento” ou “tratar” significa a aplicação de um ou mais procedimentos específicos usados para a cura ou melhora de uma doença. Em certas formas de realização, o procedimento específico é a administração de um ou mais agentes farmacêuticos.
[0104] “Melhora” significa uma diminuição da severidade de pelo menos um indicador de uma condição ou doença. Em certas formas de realização, a melhora inclui uma retardo ou diminuição na progressão de um ou mais indicadores de uma condição ou doença. A severidade de indicadores pode ser determinada pelas medidas subjetivas ou objetivas que são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
[0105] “Indivíduo em necessidade deste’ significa um indivíduo identificado como em necessidade de uma terapia ou tratamento.
[0106] “Administrar” significa fornecer um agente ou composição farmacêuticos a um indivíduo, e inclui, mas não é limitado a, administração por um profissional médico e auto-administração.
[0107] “Administração parenteral,” significa administração através de injeção ou infusão.
[0108] A administração parenteral inclui, mas não é limitada a, administração subcutânea, administração intravenosa, administração intramuscular, administração intra-arterial, e administração intracraniana.
[0109] “Administração subcutânea” significa administração exatamente abaixo da pele. “Administração intravenosa” significa administração em uma veia.
[0110] “Administração intra-arterial” significa administração em uma artéria.
[0111] “Administração intracardíaca” significa administração no coração. Em certas formas de realização, a administração intracardíaca ocorre por via de um cateter. Em certas formas de realização, a administração intracardíaca ocorre por via da cirurgia de coração aberto.
[0112] “Administração pulmonar” significa administração aos pulmões.
[0113] “Melhora a função hepática” significa as mudanças na função hepática na direção de parâmetros normais. Em certas formas de realização, a função hepática é avaliada medindo-se moléculas encontradas em um sangue do indivíduo. Por exemplo, em certas formas de realização, a função hepática melhorada é medida por uma redução nos níveis de transaminase hepática sanguínea.
[0114] “Composição farmacêutica” significa uma mistura de substâncias adequadas para administrar a um indivíduo que inclui um agente farmacêutico. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode compreender um oligonucleotídeo modificado e uma solução aquosa estéril.
[0115] “Agente farmacêutico” significa uma substância que fornece um efeito terapêutico quando administrada a um indivíduo.
[0116] “Ingrediente farmacêutico ativo” significa a substância em uma composição farmacêutica que fornece um efeito desejado.
[0117] “Ácido nucléico alvo,” “RNA alvo,” “transcrito de RNA alvo” e “alvo de ácido nucléico” todos significam qualquer ácido nucléico capaz de ser alvejado pelos compostos de anti-sentido.
[0118] “Alvejamento” significa o processo de planejamento e seleção da sequência de nucleobase que hibridizará a um ácido nucléico alvo e induzirá um efeito desejado.
[0119] “Alvejado para” significa tendo uma sequência de nucleobase que permitirá a hibridização a um ácido nucléico alvo para induzir um efeito desejado. Em certas formas de realização, um efeito desejado é a redução de um ácido nucléico alvo.
[0120] “Modulação” significa uma perturbação de função ou atividade. Em certas formas de realização, modulação significa um aumento na expressão do gene. Em certas formas de realização, modulação significa uma diminuição na expressão do gene.
[0121] “Expressão” significa quaisquer funções e etapas pelas quais uma informação codificada do gene é convertida em estruturas presentes e operando em uma célula.
[0122] “sítio alvo 5’” refere-se à nucleobase de um ácido nucléico alvo que é complementar à nucleobase mais a 5’ de um oligonucleotídeo particular.
[0123] “sítio alvo 3’” significa a nucleobase de um ácido nucléico alvo que é complementar à nucleobase mais a 3’ de um oligonucleotídeo particular.
[0124] “Região” significa uma porção de nucleosídeos ligados dentro de um ácido nucléico. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que é complementar a uma região de um ácido nucléico alvo. Por exemplo, em certas de tais formas de realização um oligonucleotídeo modificado é complementar a uma região de uma sequência de haste-alça de miRNA. Em certas de tais formas de realização, um oligonucleotídeo modificado é 100% para uma região de uma sequência de haste-alça de miRNA.
[0125] “Segmento” significa uma menor ou sub-porção de uma região.
[0126] “Sequência de nucleobase” significa a ordem de nucleobases contíguas, em uma orientação de 5’ para 3’, independente de qualquer açúcar, ligação, e/ou modificação de nucleobase.
[0127] “Nucleobases contíguas” significa nucleobases imediatamente adjacentes entre si em um ácido nucléico.
[0128] “Complementaridade de nucleobase” significa a capacidade de duas nucleobases para formar par de modo não covalente via ligação de hidrogênio.
[0129] “Complementar” significa que uma primeira sequência de nucleobase é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica, ao complemento de uma segunda sequência de nucleobase em uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou more nucleobases, ou que as duas sequências hibridizam sob condições de hibridização severas. Em certas formas de realização um oligonucleotídeo modificado que tem uma sequência de nucleobase que é 100% complementar a um miRNA, ou precursor do mesmo, pode não ser 100% complementar ao miRNA, ou precursor do mesmo, no comprimento inteiro do oligonucleotídeo modificado.
[0130] “Complementaridade” significa a capacidade de emparelhar nucleobase entre um primeiro ácido nucléico e um segundo ácido nucléico.
[0131] “Complementaridade de tamanho natural” significa que cada nucleobase de um primeiro ácido nucléico é capaz de formar par com cada nucleobase em uma posição correspondente em um segundo ácido nucléico. Por exemplo, em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado em que cada nucleobase tem complementaridade a uma nucleobase em um miRNA tem complementaridade de tamanho natural para o miRNA.
[0132] “Porcentagem complementar” significa o número de nucleobases complementares em um ácido nucléico dividido pelo comprimento do ácido nucléico. Em certas formas de realização, a complementaridade percentual de um oligonucleotídeo modificado significa o número de nucleobases que são complementares ao ácido nucléico alvo, dividido pelo número de nucleobases do oligonucleotídeo modificado. Em certas formas de realização, a complementaridade percentual de um oligonucleotídeo modificado significa o número de nucleobases que são complementares a um miRNA, dividido pelo número de nucleobases do oligonucleotídeo modificado.
[0133] “Região percentual ligada” significa a porcentagem de uma região complementar a uma região de oligonucleotídeo. A região percentual ligada é calculada dividindo-se o número de nucleobases da região alvo que são complementares ao oligonucleotídeo pelo comprimento da região alvo. Em certas formas de realização, a região percentual ligada é de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%.
[0134] “Identidade percentual” significa o número de nucleobases no primeiro ácido nucléico que são idênticas às nucleobases nas posições correspondentes em um segundo ácido nucléico, dividido pelo número total de nucleobases no primeiro ácido nucléico.
[0135] “Substancialmente idêntica” aqui usado pode significar que uma primeira e segunda sequências de nucleobase são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticas, ou 100% idênticas, em uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais nucleobases.
[0136] “Hibridizar” significa o recozimento de ácidos nucléicos complementares que ocorre através da complementaridade de nucleobase.
[0137] “Desemparelhamento” significa uma nucleobase de um primeiro ácido nucléico que não é capaz de emparelhar com uma nucleobase em uma posição correspondente de um segundo ácido nucléico.
[0138] “Nucleobase não complementares” significa duas nucleobases que não são capazes de emparelhar através da ligação de hidrogênio.
[0139] “Idêntico” significa tendo a mesma sequência de nucleobase.
[0140] “miRNA” ou “miR” significa um RNA não codificador entre 18 e 25 nucleobases no comprimento que hibridiza a e regula a expressão de um RNA codificador. Em certas formas de realização, um miRNA é o produto de clivagem de um pré-miRNA pela enzima Dicer. Os exemplos de miRNAs são encontrados nas bases de dados miRNA conhecidas como miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/).
[0141] “Pré-miRNA” ou “pré-miR” significa um RNA não codificador tendo uma estrutura de grampo de cabelo, que contêm um miRNA. Em certas formas de realização, um pré-miRNA é o produto de clivagem de um pri-miR pela ribonuclease específica de RNA de filamento duplo conhecida como Drosha.
[0142] “Sequência de haste-alça” significa um RNA tendo uma estrutura de grampo de cabelo e contendo uma sequência de miRNA madura. As sequências pré-miRNA e as sequências de haste-alça podem sobrepor-se. Os exemplos de sequências de haste-alça são encontrados na base de dados de miRNA conhecida como miRBase (http://microma.sangerac.uk/).
[0143] “Pri-miRNA” ou “pri-miR” significa um RNA não codificador tendo uma estrutura de grampo de cabelo que é um substrato para a ribonuclease específica de RNA de filamento duplo Drosha.
[0144] “Precursor de miRNA” significa um transcrito que se origina de um DNA genômico e que compreende um RNA não codificador, estruturado que compreende uma ou mais sequências de miRNA. Por exemplo, em certas formas de realização um precursor de miRNA é um pré-miRNA. Em certas formas de realização, um precursor de miRNA é um pri-miRNA.
[0145] “Transcrito monocistrônico” significa um precursor de miRNA contendo uma única sequência de miRNA.
[0146] “Transcrito policistrônico” significa um precursor de miRNA contendo duas ou mais sequências de miRNA.
[0147] “Região de semente” significa nucleotídeos de 2 a 6 ou 2 a 7 da extremidade 5’ de uma sequência de miRNA madura.
[0148] “Composto oligomérico” significa um composto que compreende um polímero de subunidades monoméricas ligadas.
[0149] “Oligonucleotídeo” significa um polímero de nucleosídeos ligados, cada um dos quais pode ser modificado ou não modificado, independente um do outro.
[0150] “Ligação internucleosídica que ocorre naturalmente” significa uma ligação de fosfodiéster de 3’ a 5’ entre nucleosídeos.
[0151] “Açúcar natural” significa um açúcar encontrado no DNA (2’-H) ou RNA (2’-OH). “Nucleobase naturais” significa uma nucleobase que não é modificada em relação à sua forma que ocorre naturalmente.
[0152] “Ligação internucleosídica” significa uma ligação covalente entre nucleosídeos adjacentes.
[0153] “Nucleosídeos ligados” significa nucleosídeos unidos por uma ligação covalente. “Nucleobase” significa uma porção heterocíclica capaz de emparelhar de modo não covalente com uma outra nucleobase.
[0154] “Nucleosídeo” significa uma nucleobase ligada a um açúcar.
[0155] “Nucleotídeo” significa um nucleosídeo tendo um grupo fosfato covalentemente ligado à porção de açúcar de um nucleosídeo.
[0156] “Antagonista de miR” significa um oligonucleotídeo modificado complementar a um miRNA, ou um precursor do mesmo. Por exemplo, “antagonista de miR-X” significa um oligonucleotídeo modificado tendo complementaridade de nucleobase a miR-X. Em certas formas de realização, um antagonista é um antagonista de miR-21.
[0157] “Oligonucleotídeo modificado” significa um oligonucleotídeo tendo uma ou mais modificações em relação a um terminal, açúcar, nucleobase, e/ou ligação internucleosídica que ocorrem naturalmente.
[0158] “Oligonucleotídeo modificado de filamento único” significa um oligonucleotídeo modificado que não é hibridizado a um filamento complementar.
[0159] “Ligação internucleosídica modificada” significa qualquer mudança de uma ligação internucleosídica que ocorre naturalmente.
[0160] “Ligação internucleosídica de fosforotioato” significa uma ligação entre nucleosídeos onde um dos átomos que não ligados em ponte é um átomo de enxofre.
[0161] “Açúcar modificado” significa substituição e/ou qualquer mudança de um açúcar natural.
[0162] “Nucleobase modificada” significa qualquer substituição e/ou mudança de uma nucleobase natural.
[0163] “5-metilcitosina” significa uma citosina modificada com um grupo metila ligado à posição 5’.
[0164] “Açúcar 2’-O-metila” ou “açúcar 2’-OMe” significa um açúcar tendo uma modificação O-metila na posição 2’.
[0165] “Açúcar 2’-O-metoxietila” ou “açúcar 2’-MOE” significa um açúcar tendo uma modificação de O-metoxietila na posição 2’.
[0166] “Açúcar 2’-O-fluoro” ou “açúcar 2’-F” significa um açúcar tendo uma modificação de flúor na posição 2’.
[0167] “Porção de açúcar bicíclica” significa um açúcar modificado pela ligação em ponte de dois átomos de anel não geminais.
[0168] “Nucleosídeo 2’-O-metoxietila” significa um nucleosídeo 2’-modificado tendo uma modificação de açúcar 2’-O- metoxietila.
[0169] “2’-fluoro nucleosídeo” significa um nucleosídeo 2’-modificado tendo uma modificação de açúcar de 2’-fluoro.
[0170] Nucleosídeo “2’-O-metila” significa um nucleosídeo 2’-modificado tendo uma modificação de açúcar de 2’-O-metila.
[0171] “Nucleosídeo bicíclico” significa um nucleosídeo 2’-modificado tendo uma porção de açúcar bicíclico.
[0172] “Motivo” significa um padrão de nucleobase, açúcares, e/ou ligações internucleosídicas modificadas e/ou não modificadas em um oligonucleotídeo.
[0173] Um “oligonucleotídeo totalmente modificado” significa que cada nucleobase, cada açúcar, e/ou cada ligação internucleosídica são modificados.
[0174] Um “oligonucleotídeo uniformemente modificado” significa que cada nucleobase, cada açúcar, e/ou cada ligação internucleosídica tem a mesma modificação por todo o oligonucleotídeo modificado.
[0175] Uma “modificação estabilizante” significa uma modificação a um nucleosídeo que fornece estabilidade realçada a um oligonucleotídeo modificado, na presença de nucleases, em relação àquela fornecida pelo 2’-desoxinucleosídeos ligados pelas ligações internucleosídicas de fosfodiéster. Por exemplo, em certas formas de realização, uma modificação de estabilização é uma modificação de nucleosídeo de estabilização. Em certas formas de realização, uma modificação de estabilização é uma modificação de ligação internucleosídica.
[0176] Um “nucleosídeo de estabilização” significa um nucleosídeo modificado para fornecer estabilidade de nuclease realçada a um oligonucleotídeo, em relação àquela fornecida por um 2’-desoxinucleosídeo. Em uma forma de realização, um nucleosídeo de estabilização é um nucleosídeo 2’-modificado.
[0177] Uma “ligação internucleosídica de estabilização” significa uma ligação internucleosídica que fornece estabilidade de nuclease realçada a um oligonucleotídeo em relação a aquele fornecido por uma ligação internucleosídica de fosfodiéster. Em uma forma de realização, uma ligação internucleosídica de estabilização é uma ligação internucleosídica de fosforotioato. Vista Geral
[0178] Verificou-se que oligonucleotídeos modificados complementares a miR-21 são agentes farmacêuticos para a inibição de miR- 21. Em certas formas de realização, os oligonucleotídeos modificados são administrados a um indivíduo tendo uma doença caracterizada pela supra- regulagem de miR-21. Em certas formas de realização, a doença é o câncer. Em certas formas de realização, a doença é a insuficiência cardíaca. Em certas formas de realização, a doença é a fibrose. A fibrose resulta do desenvolvimento do tecido conectivo fibroso em excesso em um órgão ou tecido em resposta ao dano ou lesão. Deixada sem tratamento, a fibrose pode levar a uma variedade de condições do coração, pulmões, rins, fígado, e pele, entre outros tecidos.
[0179] É aqui verificado que miR-21 derivados de fibroblasto desempenham um papel crítico na fibrose. O realce de níveis de miR-21 promoveram a sobrevivência de fibroblasto, ao passo que a supressão de miR-21 endógeno induziu a morte celular apoptótica. Assim, é aqui identificado um mecanismo pelo qual miR-21 regula a sobrevivência de fibroblasto. A proliferação aberrante de fibroblasto e a sobrevivência pode levar à fibrose. Consequentemente, oligonucleotídeos modificados complementares a miR-21 são agentes farmacêuticos para o tratamento de fibrose. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado complementar a miR-21 é um oligonucleotídeo de anti-sentido complementar a miR-21.
[0180] Foi demonstrado um papel crítico de derivados de fibroblasto miR-21 e SPRY1 no coração (Fig. 3h). Os dados sugerem que a ativação induzida pelo estresse e mediada pelo miRNA da atividade de ERK- MAP cinase pode importantemente regular a fibrose cardíaca. Este estudo representa o primeiro exemplo de uma aplicação terapêutica de microRNA em um modelo de doença. Especificamente a antagonização de miR-21 preveniu a dano estrutural e funcional em um modelo de murino. Foi sugerido um novo ponto de entrada terapêutica para a insuficiência cardíaca e mostram o amplo potencial terapêutico de antagonistas de microRNA.
[0181] Em um aspecto a presente invenção diz respeito ao uso de miR-21, um oligonucleotídeo de anti-sentido contra miR-21 e/ou um alvo de miR-21 para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose.
[0182] A invenção particularmente diz respeito a doenças cardíaco específicas envolvendo a fibrose (= doenças relacionadas com a fibrose), como hipertrofia cardíaca, doença do coração hipertensivo, insuficiência cardíaca diastólica e sistólica, doenças de armazenagem relacionadas com o coração, tais como M. Fabry, cardiomiopatias, por exemplo, cardiomiopatia dilatativa, cardio-miopatia hipertrófica com e sem obstrução, cardiomiopatia restritiva, cardiomiopatia ventricular direita arritmogênica e outras formas de cardiomiopatia, como por exemplo, cardiomiopatia diabética, pericardite constritiva, doença da artéria coronária, infarto coronário, insuficiência cardíaca direita aguda e crônica, arritmias cardíacas devidas à fibrose, fibrose relacionada com miocardite, doenças das válvulas do coração que levam à estenose ou insuficiência de válvula (por exemplo, esclerose), por exemplo, estenose e/ou insuficiência de válvula mitral, estenose de válvula aórtica e/ou insuficiência, estenose e/ou insuficiência de válvula tricúspide, estenose e/ou insuficiência de válvula pulmonar.
[0183] Em um outro aspecto a invenção diz respeito a outras doenças que envolvem a fibrose (= doenças relacionadas com a fibrose), não relacionadas com o sistema cardíaco. Os exemplos não limitantes são fibrose pulmonar, doenças pulmonares obstrutivas crônicas, hipertensão pulmonar, fibrose hepática devida a um ambiente tóxico, hepatite e/ou secundário à insuficiência cardíaca direita, fibrose de pele, por exemplo, desenvolvimento de quelóides depois da lesão, doenças relacionadas com o vaso sanguíneo, tal como rigidez arterial relacionada com a idade ou hipertensão, mediasclerose, arteriosclerose, fibrose relacionada com a idade de órgãos diferentes, esclerose intestinal, por exemplo, durante a doença de Crohn, esclerose sistêmica e síndrome de CREST etc., fibrose renal, fibrose neoplástica e/ou artrite reumatóide.
[0184] Além disso, as doenças e distúrbios relacionados com a fibrose bem conhecidos são, por exemplo, endofibrose miocárdica e miocardiopatia idiopática, cirrose que pode resultar da fibrose do fígado, fibrose pulmonar idiopática do pulmão, doença pulmonar parenquimatosa difusa, fibrose mediastinal, mielofibrose, síndrome da dor pós vasectomia, fibrose retroperitoneal e fibrose sistêmica nefrogênica.
[0185] Todos os aspectos da invenção, em particular os aspectos mencionados nas reivindicações anexas podem ser usados para o diagnóstico, tratamento e/ou prevenção das doenças, distúrbios e condições mencionadas acima, que são dadas como exemplos possíveis. A lista não é limitante.
[0186] Em um forma de realização, a invenção diz respeito às estratégias para modular miR-21. Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito às estratégias para modular, por exemplo, super- expressar e/ou supra-regular alvos de miR-21. As modulações possíveis são dispositivos implantáveis, como vetores virais e formulações lipossômicas, etc, os sistemas de transferência de gene, esponjas e outros.
[0187] Sprouty (SPRY1) é aqui identificado como um alvo de miR-21. Tanto miR-21 quanto SPRY1 são expressados em fibroblastos cardíaco, entre outros tipos de célula. O aumento da expressão de miR-21 em fibroblastos cardíacos induziu uma repressão forte de expressão da proteína de SPRY e aumentou ainda mais a ativação da ERK-MAPcinase. Em uma forma de realização preferida o alvo é selecionado do grupo que consiste de Sprouty1 (SPRY1), em particular SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, Tgfbi, Krit1, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnx1 e Rtn4.
[0188] Em um aspecto a presente invenção diz respeito a um oligonucleotídeo de anti-sentido contra (ou complementar a) SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 4, Sprouty1 (SPRY1), em particular a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, Tgfbi, Krit1, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnx1 e/ou Rtn4 para o diagnóstico, tratamento e/ou prevenção de fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose. Em certos aspectos, um oligonucleotídeo de anti-sentido complementar a um alvo selecionado do grupo que consiste de Sprouty1 (SPRY1), em particular a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, Tgfbi, Krit1, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnx1 e/ou Rtn4, interfere com a capacidade de um microRNA, tal como miR-21, para ligar a um sítio alvo e inibe a expressão do alvo selecionado. Em certos aspectos, um tal oligonucleotídeo de anti-sentido compreende uma ou mais modificações nucleosídicas.
[0189] Em um aspecto a presente invenção diz respeito a uma célula deficiente para miR-21, SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 4, Sprouty1 (SPRY1), em particular a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, Tgfbi, Kriti, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnx1 e/ou Rtn4.
[0190] Em um aspecto a invenção diz respeito a um organismo de mamífero não humano silenciado deficiente quanto a miR-21, SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 4, Sprouty1 -(SPRY1), em particular a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, Tgfbi, Krit1, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnx1 e/ou Rtn4 como um modelo de doença para fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose. Também abrangidos são animais transgênicos, em particular a mamíferos não humanos que superexpressam miR-21.
[0191] Verificou-se que derivados de fibroblasto miR-21 contribuem para a insuficiência cardíaca. A análise de amostras de tecido cardíaco ventricular esquerdo de indivíduos com insuficiência cardíaca em estágio final devida à cardiomiopatia dilatada idiopática revelou expressão de miR-21 aumentada e expressão de proteína SPRY1 reprimida. Adicionalmente, a ERKMAPcinase foi ativada em amostras destes indivíduos, como evidenciado por uma razão fosfor-ERK/ERK aumentada. É aqui verificado que em um modelo de animal de insuficiência cardíaca a administração de um oligonucleotídeo modificado complementar a miR-21 resultou na atenuação significante de fibrose cardíaca. A insuficiência cardíaca é caracterizada, entre outros parâmetros, pela fibrose cardíaca. Consequentemente, oligonucleotídeos modificados complementares a miR-21 são agentes farmacêuticos para o tratamento de fibrose cardíaca.
[0192] Também é aqui verificado que em um modelo de animal de insuficiência cardíaca, a atenuação da fibrose cardíaca é acompanhada pela atenuação dos aumentos do peso cardíaco. Além disso, a avaliação da função cardíaca pela ecocardiografia revelou que a administração de um oligonucleotídeo modificado complementar a miR-21 preveniu a dilatação ventricular esquerda e normalizou parâmetros de encurtamento fracionário. A insuficiência cardíaca pode ser caracterizada, entre outros parâmetros, pelos aumentos do peso cardíaco, dilatação ventricular esquerda, e dano do encurtamento fracionário. Consequentemente, oligonucleotídeos modificados complementares a miR-21 são agentes terapêuticos para o tratamento, melhora, e prevenção da insuficiência cardíaca associada com a fibrose cardíaca.
[0193] Em um aspecto a presente invenção diz respeito a uma região promotora de um microRNA (miRNA) que compreende uma modificação de um sítio de ligação da proteína de elemento de resposta de cálcio/cAMP (CREB) e/ou fator de resposta sérica (SRF) para diagnóstico, prevenção e/ou terapia de fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose.
[0194] Em uma forma de realização, a região promotora, o próprio gene de mirR-21 e/ou a 3’UTR de vários RNAs mensageiros podem conter polimorfismos, mutações, em particular mutações pontuais, deleções, truncagens e/ou inversão. Todas estas emendas à sequência do tipo selvagem levam Pa formação de novo de um novo sítio de ligação de miR-21 ou à deleção de um sítio de ligação de miR-21. Em uma outra forma de realização a modificação da região promotora é selecionada do grupo que consiste de uma mutação pontual, uma truncagem, uma deleção e uma inversão. Além disso, a região promotora pode ser selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO: 4. Aplicações em Diagnóstico
[0195] Em um aspecto a presente invenção diz respeito ao uso de miR-21, um oligonucleotídeo de anti-sentido contra miR-21 e/ou um alvo de miR-21 para o diagnóstico de fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose. Um oligonucleotídeo de anti-sentido deve ser entendido como um oligonucleotídeo que tem uma certa sequência complementar a uma outra sequência, em particular a uma sequência complementar a miR-21. Um alvo de miR-21 também pode ser entendido abranger um alvo a jusante de miR-21. É importante mencionar que uma inibição de miR-21, por exemplo, via um oligonucleotídeo com uma sequência pelo menos complementar a miR-21 levará a uma desrepressão ou mesmo a uma superexpressão de alvos de miR- 21, como Sprouty e outros.
[0196] Em um aspecto a invenção diz respeito a um método para diagnosticar a fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose que compreende as etapas de: (a) fornecer uma amostra de um indivíduo suposto de sofrer de fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose; (b) medir a expressão de miR-21, Sprouty1 (SPRY1), em particular a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, Tgfbi, Krit1, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnx1 e/ou Rtn4; em que um nível elevado de miR-21 e/ou um nível reduzido de Sprouty1 (SPRY1), em particular a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, Tgfbi, Krit1, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnx1 e/ou Rtn4 em comparação a uma amostra de controle indica fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose ou uma predisposição a esta.
[0197] Em um aspecto a presente invenção diz respeito a um método para a triagem de um composto farmaceuticamente ativo para o tratamento e/ou a prevenção de fibrose e/ou doenças relacionadas com a fibrose ou uma predisposição a esta, que compreende as etapas de: (c) Fornecer uma amostra contendo miR-21, Sprouty1 (SPRY1), em particular a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, Tgfbi, Krit1, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnx1 e/ou Rtn4; (d) Contactar uma substância candidata com a amostra; (e) Determinar o efeito da substância candidata sobre a amostra; em que uma alteração de miR-21, Sprouty1 (SPRY1), em particular a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, Tgfbi, Krit1, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnx1 e/ou Rtn4 indica um composto farmaceuticamente ativo. Certas Doenças e Condições
[0198] São aqui fornecidos métodos para tratar um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose. Também são fornecidos métodos para tratar um indivíduo identificado como tendo ou suspeito de ter fibrose. Em certas formas de realização, tais métodos compreendem administrar a um indivíduo um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobase complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, o miRNA é miR-21.
[0199] Além disso, são aqui fornecidos métodos para prevenir fibrose em um indivíduo em risco de desenvolver fibrose. Em certas formas de realização, tais métodos compreendem administrar a um indivíduo em risco de desenvolver fibrose um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobase complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, o miRNA é miR-21.
[0200] Em certas formas de realização, a fibrose é a fibrose hepática. Em certas formas de realização, a fibrose é a fibrose pulmonar. Em certas formas de realização a fibrose é a fibrose de pele. Em certas formas de realização a fibrose é a fibrose cardíaca. Em certas formas de realização a fibrose é a fibrose renal. Em certas formas de realização a fibrose é a fibrose pulmonar. Em certas formas de realização a fibrose é a fibrose relacionada com a idade. Em certas formas de realização a fibrose é a fibrose esplênica.
[0201] Em certas formas de realização, o indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose tem pelo menos uma doença ou condição cardíaca. Em certas formas de realização, um indivíduo identificado como tendo ou suspeito de ter fibrose tem pelo menos uma doença ou condição cardíaca. Em certas formas de realização, tais métodos compreendem administrar a um indivíduo um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobase complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, o miRNA é miR-21.
[0202] Em certas formas de realização, uma doença ou condição cardíaca é a hipertrofia cardíaca. Em certas formas de realização, uma doença ou condição cardíaca é a cardiomiopatia. Em certas formas de realização, a cardiomiopatia é a cardiomiopatia dilatativa, cardiomiopatia hipertrófica com obstrução, cardiomiopatia hipertrófica sem obstrução, cardiomiopatia restritiva, cardiomiopatia ventricular direita arritmogênica, ou cardiomiopatia diabética.
[0203] Em certas formas de realização, uma doença ou condição cardíaca é a doença da artéria coronária. Em certas formas de realização, uma doença ou condição cardíaca é a doença de armazenagem relacionada com o coração, pericardite constritiva, infarto agudo do miocárdio, infarto crônico do miocárdio, arritmia cardíaca, ou fibrose relacionada com miocardite.
[0204] Em certas formas de realização, uma doença ou condição cardíaca é a insuficiência cardíaca. Em certas formas de realização, a insuficiência cardíaca é a insuficiência cardíaca hipertensiva, insuficiência cardíaca diastólica, insuficiência cardíaca sistólica, ou insuficiência cardíaca direita.
[0205] Em certas formas de realização, uma doença ou condição cardíaca é a doença de válvula cardíaca. Em certas formas de realização, a doença de válvula cardíaca é a estenose de válvula mitral, estenose de válvula aórtica, estenose de válvula tricúspide, ou estenose de válvula pulmonar. Em certas formas de realização, a doença de válvula cardíaca é a insuficiência de válvula mitral, insuficiência de válvula aórtica, insuficiência de válvula tricúspide, ou insuficiência de válvula pulmonar.
[0206] São aqui fornecidos métodos para tratar um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose, em que o indivíduo tem uma doença ou condição hepáticas. Em certas formas de realização, um indivíduo identificado como tendo ou suspeito de ter fibrose tem pelo menos uma doença ou condição hepática. Em certas formas de realização, tais métodos compreendem administrar a um indivíduo um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobase complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, o miRNA é miR-21. Em certas formas de realização, uma doença ou condição hepáticas é a lesão hepática crônica. Em certas formas de realização, uma doença ou condição hepáticas é a infecção pelo vírus da hepatite. Em certas formas de realização, uma infecção de hepatite é a infecção pelo vírus da hepatite C. Em certas formas de realização uma doença ou condição hepáticas é a esteato-hepatite não alcoólica. Em certas formas de realização uma doença ou condição hepáticas é a cirrose.
[0207] São aqui fornecidos métodos para o tratamento de um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose, em que o indivíduo tem pelo menos uma doença ou condição pulmonar. Também são aqui fornecidos métodos para o tratamento de um indivíduo identificado como tendo ou suspeito de ter fibrose, em que o indivíduo tem pelo menos uma doença ou condição pulmonar. Em certas formas de realização, tais métodos compreendem administrar a um indivíduo um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobase que é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, o miRNA é miR-21. Em certas formas de realização uma doença ou condição pulmonares é a doença pulmonar obstrutiva crônica.
[0208] São aqui fornecidos métodos para o tratamento de um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose, em que o indivíduo tem pelo menos uma outra doença ou condição. Também são aqui fornecidos métodos para o tratamento de um indivíduo identificado como tendo ou suspeito de ter fibrose, em que o indivíduo tem pelo menos uma outra doença ou condição. Em certas formas de realização, tais métodos compreendem administrar a um indivíduo um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobase que é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, o miRNA é miR-21. Em certas formas de realização uma outra doença ou condição é a hipertensão pulmonar. Em certas formas de realização uma outra doença ou condição é uma doença relacionada com vaso sanguíneo. Em certas de tais formas de realização uma doença relacionada com o vaso sanguíneo é a rigidez arterial, mediasclerose, ou arteriosclerose. Em certas formas de realização uma outra doença ou condição é a esclerose intestinal. Em certas formas de realização uma outra doença ou condição é a esclerose sistêmica. Em certas formas de realização uma outra doença ou condição é a fibrose retroperitoneal, fibrose proliferativa, fibrose neoplástica, fibrose sistêmica nefrogênica, fibrose de injeção, fibrose mediastinal, mielofibrose, síndrome da dor pós vasectomia, ou artrite reumatóide.
[0209] São aqui fornecidos métodos para tratar um indivíduo tendo um distúrbio fibroproliferativo. Em certas formas de realização tais métodos compreendem administrar a um indivíduo tendo ou suspeito de ter um distúrbio fibroproliferativo um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobase que é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, o miRNA é miR-21.
[0210] A invenção adicionalmente diz respeito a tratamentos com base em miRNA-21 para câncer que envolvem alvejar cânceres específicos pela modulação da sinalização de ERK mediada pelo SPRY-1 em células cancerosas. É conhecido que miR-21 é superexpressado em muitos tipos de câncer diferentes incluindo câncer esofágico, adenocarcinoma colônico, câncer de mama, gliomas, glioblastomas, ovariano, câncer hepatocelular, câncer de cabeça e pescoço, leucemia linfocítica crônica, câncer pancreático, apenas para mencionar alguns deles.
[0211] Portanto, a invenção também diz respeito ao diagnóstico, prevenção e/ou terapia dos tipos de câncer mencionados acima. Todas as características mencionadas nas reivindicações podem ser combinadas com a divulgação destes tipos de câncer. Certas Vias de Administração
[0212] Em certas formas de realização, a administração a um indivíduo compreende a administração parenteral. Em certas formas de realização, a administração a um indivíduo compreende a administração intravenosa. Em certas formas de realização, a administração a um indivíduo compreende a administração subcutânea.
[0213] Em certas formas de realização, a administração a um indivíduo compreende a administração intra-arterial. Em certas formas de realização, a administração a um indivíduo compreende a administração intracardíaca. Meios adequados para a administração intracardíaca incluem o uso de um cateter, ou administração durante a cirurgia de coração aberto.
[0214] Em certas formas de realização, a administração inclui a administração pulmonar. Em certas formas de realização, a administração pulmonar compreende a liberação de oligonucleotídeo aerossolizado ao pulmão de um indivíduo pela inalação. A seguir da inalação por um indivíduo de oligonucleotídeo aerossolizado, o oligonucleotídeo é distribuído às células de tecido pulmonar tanto normal quanto inflamado, incluindo macrófagos alveolares, eosinófilos, epitélio, endotélio de vaso sanguíneo, e epitélio bronquiolar. Um dispositivo adequado para a liberação de uma composição farmacêutica que compreende um oligonucleotídeo modificado inclui, mas não é limitado a, um dispositivo nebulizador padrão. As formulações e métodos para modular o tamanho de gotículas usando dispositivos nebulizadores para alvejar porções específicas do trato respiratório e pulmões são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Os dispositivos adequados adicionais incluem inaladores de pó seco ou inaladores de dose medida.
[0215] Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas são administradas para se obter exposições locais ao invés de sistêmicas. Por exemplo, a administração pulmonar libera uma composição farmacêutica aos pulmões, com exposição sistêmica mínima.
[0216] As vias de administração adequadas adicionais incluem, mas não são limitados a, oral, retal, transmucósica, intestinal, enteral, tópica, supositório, intratecal, intraventricular, intraperitoneal, intranasal, intraocular, intramuscular, intramedular, e intratumoral. Certos Resultados Clínicos
[0217] Em certas formas de realização, os métodos aqui fornecem um resultado clinicamente desejável a um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose.
[0218] Em certas formas de realização, um resultado clinicamente desejável é a melhora do aumento do peso cardíaco. Em certas de tais formas de realização, um resultado clinicamente desejável é a melhora da dilatação ventricular esquerda. Em certas formas de realização um resultado clinicamente desejável é a melhora do encurtamento fracionário deteriorado. Em certas formas de realização um resultado clinicamente desejável é a prevenção do aumento do peso cardíaco. Em certas de tais formas de realização, um resultado clinicamente desejável é a prevenção da dilatação ventricular esquerda. Em certas formas de realização um resultado clinicamente desejável é a prevenção do encurtamento fracionário deteriorado.
[0219] Em certas formas de realização um resultado clinicamente desejável é a função cardíaca melhorada.
[0220] Em certas formas de realização um resultado clinicamente desejável é a melhora da fibrose. Em certas formas de realização um resultado clinicamente desejável é a diminuição da progressão de fibrose adicional. Em certas formas de realização um resultado clinicamente desejável é a parada de progressão de fibrose adicional. Em certas formas de realização um resultado clinicamente desejável é uma redução na fibrose. Em certas formas de realização um resultado clinicamente desejável é uma redução no teor de colágeno.
[0221] Em certas formas de realização um resultado terapeuticamente desejável é a função hepática melhorada. A função hepática pode ser avaliada pelos testes de função hepática, que medem, entre outras coisas, os níveis de sangue das transaminases hepáticas. Em certas formas de realização, um indivíduo tendo função hepática anormal tem transaminases hepáticas no sangue elevadas. As Transaminases hepáticas do sangue incluem a alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST). Em certas formas de realização, um indivíduo tendo função hepática anormal tem bilirrubina no sangue elevada. Em certas formas de realização, um indivíduo tem níveis de albumina no sangue anormal. Em certas formas de realização, os métodos aqui fornecidos alteram os níveis de ALT, AST, bilirrubina e/ou albumina no sangue tal que um ou mais destes níveis está mais próximo dos limites normais.
[0222] Em certas formas de realização, uma função hepática do indivíduo é avaliada pelo sistema de classificação Child-Pugh, que define três classes de função hepática. Neste sistema de classificação, pontos são designados às medições em uma de cinco categorias: níveis de bilirrubina, níveis de albumina, tempo de protrombina, ascite, e encefalopatia. Um ponto é designado para cada uma das seguintes características presentes: bilirrubina no sangue menor do que 2,0 mg/dl; albumina no sangue maior do que 3,5 mg/dl; um tempo de protrombina de menos do que 1,7 razão normalizada internacional (INR); ascite é ausente; ou encefalopatia é ausente. Dois pontos são designados para cada uma das seguintes características presentes: bilirrubina no sangue de 2 a 3 mg/dl; bilirrubina no sangue de 3,5 a 2,8 mg/dl; tempo de protrombina de 1,7 a 2,3 INR; a ascite é de branda a moderada; ou encefalopatia é branda. Três pontos são designados para cada uma das seguintes características presentes: bilirrubina de mais do que 3,0 mg/dl; albumina no sangue de menos do que 2,8 mg/dl; tempo de protrombina maior do que 2,3 INR; a ascite é de severa a refratária; ou a encefalopatia é severa. As contagens são somadas e a Classe A é designada para uma contagem de 5 a 6 pontos, a Classe B é designada para uma contagem de 7 a 9 pontos, e a Classe C é designada para uma contagem de 10 a 15 pontos. Em certas formas de realização, os métodos aqui fornecidos resultam em uma melhora na função hepática como medida pelo sistema de classificação de Child-Pugh. Certos Fenótipos Celulares
[0223] São aqui fornecidos métodos para inibir a proliferação de célula de fibroblasto. Também são aqui fornecidos métodos para estimular a apoptose em uma célula de fibroblasto. Além disso, são aqui fornecidos métodos para aumentar a proteína Sprouty 1 em uma célula de fibroblasto. Em certas formas de realização, tais métodos compreendem contactar um fibroblasto com um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado e tendo uma sequência de nucleobase que é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, o miRNA é miR-21.
[0224] Em certas formas de realização, a célula de fibroblasto está in vitro. Em certas formas de realização, a célula de fibroblasto está in vivo. Em certas formas de realização, o contato ocorre in vitro. Em certas formas de realização, o contato ocorre in vivo. Em certas formas de realização, o contato ocorre ex vivo. Certas Terapias Adicionais
[0225] Os tratamentos para a fibrose podem compreender mais do que uma terapia. Como tal, em certas formas de realização são aqui fornecidos métodos para tratar um indivíduo tendo ou suspeito de ter fibrose que compreende administrar pelo menos uma terapia além da administração de um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobase complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo.
[0226] Em certas formas de realização, os métodos aqui fornecidos compreendem administrar um ou mais agentes farmacêuticos adicionais. Em certas formas de realização, os agentes farmacêuticos adicionais incluem, mas não são limitados a, diuréticos (por exemplo esprionolactona, eplerenona, furosemida), ionótropos (por exemplo dobutamina, milrinona), digoxina, vasodilatadores, inibidores da enzima que converte a angiotensina II (ACE) (por exemplo são captopril, enalapril, lisinopril, benazepril, quinapril, fosinopril, e ramipril), bloqueadores do receptor de angiotensina II (ARB) (por exemplo candesartan, irbesartan, olmesartan, losartan, valsartan, telmisartan, eprosartan), bloqueadores do canal de cálcio, dinitrato de isossorbida, hidralazina, nitratos (por exemplo mononitrato de isossorbida, dinitrato de isossorbida), hidralazina, beta- bloqueadores (por exemplo carvedilol, metoprolol), e peptídeos natriuréticos (por exemplo nesiritida).
[0227] Em certas formas de realização, uma terapia adicional pode ser um agente farmacêutico que realça o sistema imune do corpo, incluindo ciclofosfamida em dose baixa, timoestimulina, vitaminas e suplementos nutricionais (por exemplo, antioxidantes, incluindo vitaminas A, C, E, beta-caroteno, zinco, selênio, glutationa, coenzima Q-10 e equinácea), e vacines, por exemplo, o complexo imunoestimulador (ISCOM), que compreende uma formulação de vacina que combina uma apresentação multimérica de antígeno e um adjuvante.
[0228] Em certas de tais formas de realização, a terapia adicional é selecionada para tratar ou melhorar um efeito colateral de uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Tais efeitos colaterais incluem, sem limitação, reações no local da injeção, anormalidades no teste da função hepática, anormalidades na função renal, toxicidade hepática, toxicidade renal, anormalidades do sistema nervoso central, e miopatias. Por exemplo, níveis de aminotransferase aumentados no soro podem indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática. Por exemplo, bilirrubina aumentada pode indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática.
[0229] Em certas formas de realização, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados ao mesmo tempo. Em certas formas de realização, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados em tempos diferentes. Em certas formas de realização, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados juntos em uma formulação única. Em certas formas de realização, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados separadamente. Certas Composições Farmacêuticas
[0230] Em certas formas de realização, um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado complementar a um miRNA, ou precursor do mesmo, aqui descrito é preparado como uma composição farmacêutica para o tratamento de fibrose. Em certas formas de realização, um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobase complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo é preparado como uma composição farmacêutica para a prevenção de fibrose.
[0231] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada na forma de uma unidade de dosagem (por exemplo, tablete, cápsula, bolo, etc.). Em certas formas de realização, tais composições farmacêuticas compreendem um oligonucleotídeo modificado em uma dose selecionada de 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg, 55 mg, 60 mg, 65 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 85 mg, 90 mg, 95 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg, 140 mg, 145 mg, 150 mg, 155 mg, 160 mg, 165 mg, 170 mg, 175 mg, 180 mg, 185 mg, 190 mg, 195 mg, 200 mg, 205 mg, 210 mg, 215 mg, 220 mg, 225 mg, 230 mg, 235 mg, 240 mg, 245 mg, 250 mg, 255 mg, 260 mg, 265 mg, 270 mg, 270 mg, 280 mg, 285 mg, 290 mg, 295 mg, 300 mg, 305 mg, 310 mg, 315 mg, 320 mg, 325 mg, 330 mg, 335 mg, 340 mg, 345 mg, 350 mg, 355 mg, 360 mg, 365 mg, 370 mg, 375 mg, 380 mg, 385 mg, 390 mg, 395 mg, 400 mg, 405 mg, 410 mg, 415 mg, 420 mg, 425 mg, 430 mg, 435 mg, 440 mg, 445 mg, 450 mg, 455 mg, 460 mg, 465 mg, 470 mg, 475 mg, 480 mg, 485 mg, 490 mg, 495 mg, 500 mg, 505 mg, 510 mg, 515 mg, 520 mg, 525 mg, 530 mg, 535 mg, 540 mg, 545 mg, 550 mg, 555 mg, 560 mg, 565 mg, 570 mg, 575 mg, 580 mg, 585 mg, 590 mg, 595 mg, 600 mg, 605 mg, 610 mg, 615 mg, 620 mg, 625 mg, 630 mg, 635 mg, 640 mg, 645 mg, 650 mg, 655 mg, 660 mg, 665 mg, 670 mg, 675 mg, 680 mg, 685 mg, 690 mg, 695 mg, 700 mg, 705 mg, 710 mg, 715 mg, 720 mg, 725 mg, 730 mg, 735 mg, 740 mg, 745 mg, 750 mg, 755 mg, 760 mg, 765 mg, 770 mg, 775 mg, 780 mg, 785 mg, 790 mg, 795 mg, e 800 mg. Em certas de tais formas de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende uma dose de oligonucleotídeo modificado selecionada de 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, e 800 mg.
[0232] Em certas formas de realização, um agente farmacêutico é oligonucleotídeo modificado liofilizado estéril que é reconstituído com um diluente adequado, por exemplo, água estéril para injeção ou solução salina estéril para injeção. O produto reconstituído é administrado como uma injeção subcutânea ou como uma infusão intravenosa depois da diluição em solução salina. O produto medicamentoso liofilizado consiste de um oligonucleotídeo modificado que foi preparado em água para injeção, ou em solução salina para injeção, ajustado ao pH 7,0 a 9,0 com ácido ou base durante a preparação, e depois liofilizado. O oligonucleotídeo modificado liofilizado pode ser 25 a 800 mg de um oligonucleotídeo modificado. É entendido que isto abrange 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, e 800 mg de oligonucleotídeo modificado liofilizado. O produto medicamentoso liofilizado pode ser embalado em um frasco de vidro claro Tipo I de 2 ml (tratado com sulfato de amônio), tampado com um fechamento de borracha de bromobutila e selado com selo de topo de alumínio FLIP-OFF®.
[0233] Em certas formas de realização, as composições da presente invenção podem adicionalmente conter outros componentes auxiliares convencionalmente encontrados em composições farmacêuticas, no seu nível de uso estabelecido na técnica. Assim, por exemplo, as composições podem conter materiais adicionais, compatíveis, farmaceuticamente ativos tais como, por exemplo, antipruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes antiinflamatórios, ou pode conter materiais adicionais úteis na formulação física de várias formas de dosagem das composições da presente invenção, tais como corantes, agentes flavorizantes, conservantes, antioxidantes, opacificadores, agentes espessantes e estabilizantes. Entretanto, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente com as atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes de umectação, emulsificadores, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, flavorizantes e/ou substâncias aromáticas e outros que não interagem deleteriamente com o(s) oligonucleotídeo(s) da formulação.
[0234] Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas da presente invenção compreendem um ou mais oligonucleotídeos modificados e um ou mais excipientes. Em certas de tais formas de realização, os excipientes são selecionados de água, soluções salinas; álcool, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilase, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose e polivinilpirrolidona.
[0235] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é preparada usando técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitado a processos de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágea, levigação, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou tabletagem.
[0236] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é um líquido (por exemplo, uma suspensão, elixir e/ou solução). Em certas de tais formas de realização, uma composição farmacêutica líquida é preparada usando ingredientes conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado a, água, glicóis, óleos, alcoóis, agentes flavorizantes, conservantes, e agentes corantes.
[0237] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é um sólido (por exemplo, um pó, tablete, e/ou cápsula). Em certas de tais formas de realização, uma composição farmacêutica sólida que compreende um ou mais oligonucleotídeos é preparada usando ingredientes conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a, amidos, açúcares, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, e agentes desintegrantes.
[0238] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é formulada como uma preparação de depósito. Certas de tais preparações de depósito são tipicamente de ação mais longa do que as preparações que não de depósito. Em certas formas de realização, tais preparações são administradas pela implantação (por exemplo subcutânea ou intramuscularmente) ou pela injeção intramuscular. Em certas formas de realização, as preparações de depósito são preparadas usando materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados parcamente solúveis, por exemplo, como um sal parcamente solúvel.
[0239] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende um sistema de liberação. Os exemplos de sistemas de liberação incluem, mas não são limitados a, lipossomas e emulsões. Certos sistemas de liberação são úteis para preparar certas composições farmacêuticas incluindo aquelas que compreendem compostos hidrofóbicos. Em certas formas de realização, certos solventes orgânicos tais como sulfóxido de dimetila são usados.
[0240] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende uma ou mais moléculas de liberação específicas de tecido planejadas para liberar o um ou mais agentes farmacêuticos da presente invenção aos tecidos ou tipos de célula específicos. Por exemplo, em certas formas de realização, as composições farmacêuticas incluem lipossomas revestidos com um anticorpo específico de tecido.
[0241] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende um sistema de co-solvente. Certos de tais sistemas de co-solvente compreendem, por exemplo, álcool benzílico, um tensoativo não polar, um polímero orgânico miscível em água, e uma fase aquosa. Em certas formas de realização, tais sistemas de co-solvente são usados para os compostos hidrofóbicos. Um exemplo não limitante de um tal sistema de co-solvente é o sistema de co-solvente VPD, que é uma solução de etanol absoluto que compreende 3% p/v de álcool benzílico, 8% p/v do tensoativo não polar Polisorbate 80® e 65% p/v de polietileno glicol 300. As proporções de tais sistemas de co-solvente podem ser variados consideravelmente sem significantemente alterar as suas características de solubilidade e toxicidade. Além disso, a identidade de componentes de co- solvente pode ser variada: por exemplo, outros tensoativos podem ser usados ao invés de Polisorbate 80®; o tamanho da fração de polietileno glicol pode ser variada; outros polímeros biocompatíveis podem substituir o polietileno glicol, por exemplo, polivinil pirrolidona; e outros açúcares ou polissacarídeos podem substituir no lugar da dextrose.
[0242] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende um sistema de liberação prolongada. Um exemplo não limitante de um tal sistema de liberação prolongada é uma matriz semi-permeável de polímeros hidrofóbicos sólidos. Em certas formas de realização, os sistemas de liberação prolongada podem, dependendo da sua natureza química, liberar agentes farmacêuticos em um período de horas, dias, semanas ou meses.
[0243] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é preparada para a administração oral. Em certas de tais formas de realização, uma composição farmacêutica é formulada pela combinação de um ou mais compostos que compreendem um oligonucleotídeo modificado com um ou mais carregadores farmaceuticamente aceitáveis. Certos de tais carregadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas, suspensões e outros, para a ingestão oral por um indivíduo. Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas para o uso oral são obtidas misturando-se oligonucleotídeo e um ou mais excipientes sólidos. Os excipientes adequados incluem, mas não são limitados a, enchedores, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; celulose preparações tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma de tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil-celulose, carboximetilcelulose sódica, e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Em certas formas de realização, uma tal mistura é opcionalmente moída e auxiliares são opcionalmente adicionados. Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas são formadas para se obter tabletes ou núcleos de drágeas. Em certas formas de realização, agentes desintegrantes (por exemplo, polivinil pirrolidona reticulada, ágar, ou ácido algínico ou um sal deste, tal como alginato de sódio) são adicionados.
[0244] Em certas formas de realização, núcleos de drágeas são fornecidos com revestimentos. Em certas de tais formas de realização, soluções de açúcar concentradas podem ser usadas, que pode opcionalmente conter goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, carbopol gel, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de verniz, e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de tabletes ou drágeas.
[0245] Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas para a administração oral são cápsulas de encaixe feitas de gelatina. Certas de tais cápsulas de encaixe compreendem um ou mais agentes farmacêuticos da presente invenção em mistura com um ou mais enchedores tais como lactose, aglutinantes tais como amidos, e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas para a administração oral são cápsulas moles, seladas fabricadas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. Em certas cápsulas moles, um ou mais agentes farmacêuticos da presente invenção são dissolvidos ou colocados em suspensão em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida, ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, estabilizadores podem ser adicionados.
[0246] Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas são preparadas para a administração bucal. Certas de tais composições farmacêuticas são tabletes ou pastilhas formuladas na maneira convencional.
[0247] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica é preparada para a administração pela injeção (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular, etc.). Em certas de tais formas de realização, uma composição farmacêutica compreende um carregador e é formulada em solução aquosa, tal como água ou tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hanks, solução de Ringer, ou tampão de solução salina fisiológica. Em certas formas de realização, outros ingredientes são incluídos (por exemplo, ingredientes que ajudam na solubilidade ou servem como conservantes). Em certas formas de realização, as suspensões injetáveis são preparadas usando carregadores líquidos apropriados, agentes de suspensão e outros. Certas composições farmacêuticas para injeção são apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de dose múltipla. Certas composições farmacêuticas para injeção são suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Certos solventes adequados para o uso em composições farmacêuticas para injeção incluem, mas não são limitados a, solventes lipofílicos e óleos graxos, tais como óleo de gergelim, ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etila ou triglicerídeos, e lipossomas. As suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetil celulose sódica, sorbitol, ou dextrano. Opcionalmente, tais suspensões podem também conter estabilizantes adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos agentes farmacêuticos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
[0248] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica é preparada para a administração transmucósica. Em certas de tais formas de realização penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são no geral conhecidos na técnica.
[0249] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica é preparada para a administração pela inalação. Certas de tais composições farmacêuticas para a inalação são preparadas na forma de uma pulverização de aerossol em uma embalagem pressurizada ou um nebulizador. Certas de tais composições farmacêuticas compreendem um propelente, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. Em certas formas de realização usando um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada com uma válvula que libere uma quantidade medida. Em certas formas de realização, as cápsulas e cartuchos para o uso em um inalador ou insuflador podem ser formuladas. Certas de tais formulações compreendem uma mistura em pó de um agente farmacêutico da invenção e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.
[0250] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica é preparada para a administração retal, tal como um supositório ou enema de retenção. Certas de tais composições farmacêuticas compreendem ingredientes conhecidos, tais como manteiga de cacau e/ou outros glicerídeos.
[0251] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica é preparada para a administração tópica. Certas de tais composições farmacêuticas compreendem bases umidificadoras suaves, tais como unguentos ou cremes. As bases de unguento adequadas exemplares incluem, mas não são limitados a, vaselina, vaselina mais siliconas voláteis, e lanolina e emulsões de água em óleo. As bases cremosas adequadas exemplares incluem, mas não são limitadas a, creme frio e unguento hidrofílico.
[0252] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende um oligonucleotídeo modificado em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em certas formas de realização, a quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para prevenir, aliviar ou melhorar sintomas de uma doença ou para prolongar a sobrevivência do indivíduo que é tratado. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade daqueles habilitados na técnica.
[0253] Em certas formas de realização, um ou mais oligonucleotídeos modificados da presente invenção são formulados como um pró-medicamento. Em certas formas de realização, na administração in vivo, um pró-medicamento é quimicamente convertido para a forma biológica, farmacêutica ou terapeuticamente mais ativa de um oligonucleotídeo modificado. Em certas formas de realização, os pró-medicamentos são úteis porque eles são mais fáceis de administrar do que a forma ativa correspondente. Por exemplo, em certos casos, um pró-medicamento pode ser mais biodisponível (por exemplo, através da administração oral) do que o é a forma ativa correspondente. em certos casos, um pró-medicamento pode ter solubilidade melhorada comparada com a forma ativa correspondente. Em certas formas de realização, os pró-medicamentos são menos solúveis em água do que a forma ativa correspondente. Em certos casos, tais pró- medicamentos possuem transferência superior através das membranas celulares, onde a solubilidade em água é nociva para a mobilidade. Em certas formas de realização, um pró-medicamento é um éster. Em certas de tais formas de realização, o éster é metabolicamente hidrolisado ao ácido carboxílico na administração. Em certos casos o ácido carboxílico contendo o composto é a forma ativa correspondente. Em certas formas de realização, um pró-medicamento compreende um peptídeo curto (poliaminoácido) ligado a um grupo ácido. Em certas de tais formas de realização, o peptídeo é clivado na administração para formar a forma ativa correspondente.
[0254] Em certas formas de realização, um pró- medicamento é produzido pela modificação de um composto farmaceuticamente ativo tal que o composto ativo será regenerado na administração in vivo. O pró-medicamento pode ser planejado para alterar a estabilidade metabólica ou as características de transporte de um medicamento, para mascarar os efeitos colaterais ou toxicidade, para melhorar o sabor de um medicamento ou para alterar outras características ou propriedades de um medicamento. Em virtude do conhecimento de processos farmacodinâmicos e metabolismo de medicamento in vivo, aqueles de habilidade nesta técnica, uma vez que um composto farmaceuticamente ativo é conhecido, pode planejar pró-medicamentos do composto (ver, por exemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Nova Iorque, páginas 388-392). Certos Compostos
[0255] Em certas formas de realização, os métodos aqui fornecidos compreendem a administração de um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado. Em certas formas de realização, o composto consiste de um oligonucleotídeo modificado.
[0256] Em certas de tais formas de realização, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado hibridizado a um filamento complementar, isto é, um composto compreende um composto oligomérico de filamento duplo. Em certas formas de realização, a hibridização de um oligonucleotídeo modificado para um filamento complementar forma pelo menos uma extremidade abrupta. Em certas de tais formas de realização, a hibridização de um oligonucleotídeo modificado para um filamento complementar forma uma extremidade abrupta em cada terminal do composto oligomérico de filamento duplo. Em certas formas de realização, um terminal de um oligonucleotídeo modificado compreende um ou mais nucleosídeos adicionais ligados em relação ao número de nucleosídeos ligados do filamento complementar. Em certas formas de realização, o um ou mais nucleosídeos adicionais estão no terminal 5’ de um oligonucleotídeo modificado. Em certas formas de realização, o um ou mais nucleosídeos adicionais estão no terminal 3’ de um oligonucleotídeo modificado. Em certas formas de realização, pelo menos uma nucleobase de um nucleosídeo do um ou mais nucleosídeos adicionais é complementar ao RNA alvo. Em certas formas de realização, cada nucleobase de cada um ou mais nucleosídeos adicionais é complementar ao RNA alvo. Em certas formas de realização, um terminal do filamento complementar compreende um ou mais nucleosídeos adicionais ligados em relação ao número de nucleosídeos ligados de um oligonucleotídeo modificado. Em certas formas de realização, o um ou mais nucleosídeos adicionais ligados estão no terminal 3’ do filamento complementar. Em certas formas de realização, o um ou mais nucleosídeos adicionais ligados estão no terminal 5’ do filamento complementar. Em certas formas de realização, dois nucleosídeos adicionais ligados são ligados a um terminal. Em certas formas de realização, um nucleosídeo adicional é ligado a um terminal.
[0257] Em certas formas de realização, um composto compreende um oligonucleotídeo modificado conjugado a uma ou mais porções que realçam a atividade, distribuição celular ou captação celular dos oligonucleotídeos de anti-sentido resultantes. Em certas de tais formas de realização, a porção é uma porção de colesterol ou uma porção de lipídeo. As porções adicionais para a conjugação incluem carboidratos, fosfolipídeos, biotina, fenazina, foliato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, coumarinas, e corantes. Em certas formas de realização, um grupo conjugado é ligado diretamente a um oligonucleotídeo modificado. Em certas formas de realização, um grupo conjugado é ligado a um oligonucleotídeo modificado por uma porção de ligação selecionada de amino, hidroxila, ácido carboxílico, tiol, insaturações (por exemplo, ligações duplas ou triplas), ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanóico (ADO), 4-(N-maleimidometil)-cicloexano-1- carboxilato de succinimidila (SMCC), ácido 6-aminoexanóico (AHEX ou AHA), alquila C1-C10 substituído, alquenila C2-C10 substituído ou não substituído, e alquinila C2-C10 substituída ou não substituída. Em certas de tais formas de realização, um grupo substituinte é selecionado de hidroxila, amino, alcóxi, carbóxi, benzila, fenila, nitro, tiol, tioalcóxi, halogênio, alquila, arila, alquenila e alquinila.
[0258] Em certas de tais formas de realização, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado tendo um ou mais grupos de estabilização que estão ligados a um ou ambos os terminais de um oligonucleotídeo modificado para realçar as propriedades tais como, por exemplo, a estabilidade da nuclease. Incluídos nos grupos de estabilização estão as estruturas de capuz. Estas modificações de terminal protegem um oligonucleotídeo modificado da degradação pela exonuclease, e pode ajudar na liberação e/ou localização dentro de uma célula. O capuz pode estar presente no terminal 5’ (5’-capa), ou no terminal 3’ (3’-capa), ou pode estar presente em ambos os terminais. As estruturas de capuz incluem, por exemplo, capuzes abásicos de desóxi invertidos.
[0259] As estruturas de capuz adequadas incluem um nucleotídeo de 4’,5’-metileno, um nucleotídeo de 1-(beta-Deritrofuranosil), um nucleotídeo de 4’-tio, um nucleotídeo carbocíclico, um nucleotídeo de 1,5-anidroexitol, um L-nucleotídeo, um alfa-nucleotídeo, um nucleotídeo de base modificada, uma ligação de fosforoditioato, um nucleotídeo de treo- pentofuranosila, um nucleotídeo 3’,4’-seco acíclico, um nucleotídeo de 3,4- diidroxibutila acíclico, um nucleotídeo de 3,5-diidroxipentila acíclico, uma porção de nucleotídeo 3’-3’-invertida, uma porção abásica 3’-3’-invertida, uma porção de nucleotídeo 3’-2’-invertida, uma porção abásica 3’-2’- invertida, um 1,4-butanodiol fosfato, um 3’-fosforamidato, um hexilfosfato, um aminohexil fosfato, um 3’-fosfato, um 3’-fosforotioato, um fosforoditioato, uma porção de metilfosfonato ligada em ponte, e uma porção de metilfosfonato não ligada em ponte, fosfato de 5’-amino-alquila, um fosfato de 1,3-diamino-2-propila, fosfato de 3-aminopropila, um fosfato de 6- aminoexila, um fosfato de 1,2-aminododecila, um fosfato de hidroxipropila, uma porção de nucleotídeo 5’-5’-invertida, uma porção abásica 5’-5’- invertida, um 5’-fosforamidato, um 5’-fosforotioato, um 5’-amino, um 5’- fosforamidato ligado em ponte e/ou não ligado em ponte, um fosforotioato, e uma porção 5’-mercapto. Certas Sequências de nucleobase
[0260] São aqui fornecidos métodos para o tratamento ou prevenção de fibrose. Em certas formas de realização, os métodos compreendem a administração de uma composição farmacêutica que compreende um oligonucleotídeo modificado. Em certas formas de realização, os métodos compreendem a administração de um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência que é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, o miRNA é miR-21.
[0261] As sequências de nucleobase de miRNAs maduros e as suas sequência de haste-alça correspondentes aqui descritas são as sequências encontradas na miRBase, uma base de dados pesquisável online de sequências de miRNA e anotação, encontrada em http://microma.sangerac.uk/. As entradas na base de dados de sequência miRBase representam uma porção de grampo de cabelo prognosticável de um transcrito de miRNA (a haste-alça), com informação sobre a localização e sequência da sequência de miRNA madura. As sequências de haste-alça de miRNA na base de dados não são estritamente miRNAs precursores (pré- miRNAs), e podem em alguns casos incluir o pré-miRNA e alguma sequência flanqueadora do transcrito primário presumido. As sequências de nucleobase de miRNA aqui descritas abrangem qualquer versão do miRNA, incluindo as sequências descritas em Release 10.0 da base de dados de sequência miRBase e as sequências descritas em qualquer Release mais antigo da base de dados de sequência miRBase. Uma base de dados de sequência Release pode resultar na re-nomeação de certos miRNAs. Uma base de dados de sequência Release pode resultar em uma variação de uma sequência de miRNA madura. Os compostos da presente invenção abrangem oligonucleotídeos modificados que são complementares a qualquer versão da sequência de nucleobase dos miRNAs aqui descritos.
[0262] É entendido que qualquer sequência de nucleobase aqui apresentada é independente de qualquer modificação para uma porção de açúcar, uma ligação internucleosídica, ou uma nucleobase. É ainda entendido que uma sequência de nucleobase que compreende U’s também abrange a mesma sequência de nucleobase em que ‘U’ é substituído por ‘T’ em uma ou mais posições tendo ‘U.” Ao contrário, é entendido que uma sequência de nucleobase que compreende T’s também, abrangem a mesma sequência de nucleobase em que ‘T; é substituído por ‘U’ em uma ou mais posições tendo ‘T.”
[0263] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que é complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo, significando que a sequência de nucleobase de um oligonucleotídeo modificado é um mínimo de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao complemento de um miRNA ou precursor do mesmo em uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais nucleobases, ou que as duas sequências hibridizam sob condições de hibridização severas. Consequentemente, em certas formas de realização a sequência de nucleobase de um oligonucleotídeo modificado pode ter um ou mais pares de base desemparelhadas com respeito ao seu miRNA alvo ou sequência precursora do miRNA alvo, e é capaz de hibridizar à sua sequência alvo. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que é 100% complementar a um miRNA ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase de um oligonucleotídeo modificado tem tamanho natural complementar a um miRNA.
[0264] Em certas formas de realização, um miR-21 tem a sequência de nucleobase 5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’ (SEQ ID NO: 1). Em certas formas de realização uma sequência de haste-alça de miR-21 tem a sequência de nucleobase 5’-UGUCGGGUAGCUUAUCA GACUGAUGUUGACUGUUGA-AUCUCAUGGCA- ACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA-3’ (SEQ ID NO: 11).
[0265] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência que é complementar à sequência de nucleobase de miR-21 apresentada como SEQ ID NO: 1.
[0266] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência que é complementar à sequência de nucleobase de uma sequência de haste-alça de miRNA apresentada como SEQ ID NO: 11. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que é complementar à região de nucleobases 8 a 29 da SEQ ID NO: 11. Em certas formas de realização um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência que é complementar à região de nucleobases 46 a 66 da SEQ ID NO: 11.
[0267] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que compreende a sequência de nucleobase 5’-UCA-ACAUCAGUCUGAUA- AGCUA-3’ (SEQ ID NO: 12).
[0268] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que consiste da sequência de nucleobase apresentada como a SEQ ID NO: 12.
[0269] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que é complementar a uma sequência de nucleobase de uma sequência de pri-miR que compreende miR-21.
[0270] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que é complementar a uma sequência de nucleobase tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência de nucleobase apresentada na SEQ ID NO: 1. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que é complementar a uma sequência de nucleobase tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, ou pelo menos 98% de identidade com a sequência de nucleobase apresentada na SEQ ID NO: 1.
[0271] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que é complementar a uma sequência de nucleobase tendo pelo menos 80% de identidade a uma sequência de nucleobase de uma sequência de haste-alça de miR-21 apresentada na SEQ ID NO: 11. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase que é complementar a uma sequência de nucleobase tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, ou pelo menos 98% de identidade com uma sequência de nucleobase de uma sequência de haste-alça de miR-21 apresentada na SEQ ID NO: 11.
[0272] Em certas formas de realização, uma sequência de nucleobase de um oligonucleotídeo modificado tem tamanho natural complementar a uma sequência de nucleobase de miRNA aqui listada, ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase tendo um desemparelhamento com respeito à sequência de nucleobase do miRNA maduro, ou um precursor do mesmo. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase tendo dois desemparelhamentos com respeito à sequência de nucleobase do miRNA, ou um precursor do mesmo. Em certas, de tais formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase tendo não mais do que dois desemparelhamentos com respeito à sequência de nucleobase do miRNA maduro, ou um precursor do mesmo. Em certas de tais formas de realização, as nucleobases desemparelhadas são contíguas. Em certas de tais formas de realização, as nucleobases desemparelhadas não são contíguas.
[0273] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de vários nucleosídeos ligados que são iguais ao comprimento do miRNA maduro ao qual os mesmos são complementares.
[0274] Em certas formas de realização, o número de nucleosídeos ligados de um oligonucleotídeo modificado é menor do que o comprimento do miRNA maduro ao qual o mesmo é complementar. Em certas de tais formas de realização, o número de nucleosídeos ligados de um oligonucleotídeo modificado é um menor do que o comprimento do miRNA maduro ao qual o mesmo é complementar. Em certas de tais formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem um nucleosídeo menos no terminal 5’. Em certas de tais formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem um nucleosídeo menos no terminal 3’. Em certas de tais formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem dois nucleosídeos a menos no terminal 5’. Em certas de tais formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tem menos dois nucleosídeos no terminal 3’. Um oligonucleotídeo modificado tendo vários nucleosídeos ligados que são menores do que o comprimento do miRNA, em que cada nucleobase de um oligonucleotídeo modificado é complementar a cada nucleobase em uma posição correspondente em um miRNA, é considerado ser um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobase 100% complementar a uma porção de uma sequência de miRNA.
[0275] Em certas formas de realização, o número de nucleosídeos ligados de um oligonucleotídeo modificado é maior do que o comprimento do miRNA ao qual o mesmo é complementar. Em certas de tais formas de realização, a nucleobase de um nucleosídeo adicional é complementar a uma nucleobase de uma sequência de haste-alça de miRNA. Em certas formas de realização, o número de nucleosídeos ligados de um oligonucleotídeo modificado é um maior do que o comprimento do miRNA ao qual o mesmo é complementar. Em certas de tais formas de realização, o nucleosídeo adicional está no terminal 5’ de um oligonucleotídeo modificado. Em certas de tais formas de realização, o nucleosídeo adicional está no terminal 3’ de um oligonucleotídeo modificado. Em certas formas de realização, o número de nucleosídeos ligados de um oligonucleotídeo modificado é duas vezes maior do que o comprimento do miRNA ao qual o mesmo é complementar. Em certas de tais formas de realização, os dois nucleosídeos adicionais estão no terminal 5’ de um oligonucleotídeo modificado. Em certas de tais formas de realização, os dois nucleosídeos adicionais estão no terminal 3’ de um oligonucleotídeo modificado. Em certas de tais formas de realização, um nucleosídeo adicional está localizado no terminal 5’ e um nucleosídeo adicional está localizado no terminal 3’ de um oligonucleotídeo modificado.
[0276] Em certas formas de realização, uma porção da sequência de nucleobase de um oligonucleotídeo modificado é 100% complementar à sequência de nucleobase do miRNA, mas o oligonucleotídeo modificado não é 100% complementar em relação ao seu comprimento inteiro. Em certas de tais formas de realização, o número de nucleosídeos de um oligonucleotídeo modificado tendo uma porção 100% complementar é maior do que o comprimento do miRNA. Por exemplo, um oligonucleotídeo modificado que consiste de 24 nucleosídeos ligados, onde a nucleobases de nucleosídeos 1 a 23 são cada um complementar a uma posição correspondente de um miRNA que tem 23 nucleobases no comprimento, tem uma porção de 23 nucleosídeos que é 100% complementar à sequência de nucleobase do miRNA e aproximadamente 96% de complementaridade global à sequência de nucleobase do miRNA.
[0277] Em certas formas de realização, a sequência de nucleobase de um oligonucleotídeo modificado é 100% complementar a uma porção da sequência de nucleobase de um miRNA. Por exemplo, um oligonucleotídeo modificado que consiste de 22 nucleosídeos ligados, onde a nucleobases dos nucleosídeos 1 a 22 são cada um complementar a uma posição correspondente de um miRNA que tem 23 nucleobases no comprimento, é 100% complementar a uma porção da sequência de nucleobase de 22 nucleobase de um miRNA. Um tal oligonucleotídeo modificado tem aproximadamente 96% de complementaridade global com a sequência de nucleobase do miRNA inteiro, e tem 100% de complementaridade a uma porção de 22 nucleobases do miRNA.
[0278] Em certas formas de realização, uma porção da sequência de nucleobase de um oligonucleotídeo modificado é 100% complementar a uma porção da sequência de nucleobase de um miRNA, ou um precursor do mesmo. Em certas de tais formas de realização, 15 nucleobases contíguas de um oligonucleotídeo modificado são cada um complementar a 15 nucleobases contíguas de um miRNA, ou um precursor do mesmo. Em certas de tais formas de realização, 16 nucleobases contíguas de um oligonucleotídeo modificado são cada uma complementar a 16 nucleobases contíguas de um miRNA, ou um precursor do mesmo. Em certas de tais formas de realização, 17 nucleobases contíguas de um oligonucleotídeo modificado são cada uma complementar a 17 nucleobases contíguas de um miRNA, ou um precursor do mesmo. Em certas de tais formas de realização, 18 nucleobases contíguas de um oligonucleotídeo modificado são cada uma complementar a 18 nucleobases contíguas de um miRNA, ou um precursor do mesmo. Em certas de tais formas de realização, 19 nucleobases contíguas de um oligonucleotídeo modificado são cada uma complementar a 19 nucleobases contíguas de um miRNA, ou um precursor do mesmo. Em certas de tais formas de realização, 20 nucleobases contíguas de um oligonucleotídeo modificado são cada uma complementar a 20 nucleobases contíguas de um miRNA, ou um precursor do mesmo. Em certas de tais formas de realização, 22 nucleobases contíguas de um oligonucleotídeo modificado são cada uma complementar a 22 nucleobases contíguas de um miRNA, ou um precursor do mesmo. Em certas de tais formas de realização, 23 nucleobases contíguas de um oligonucleotídeo modificado são cada uma complementar a 23 nucleobases contíguas de um miRNA, ou um precursor do mesmo. Em certas de tais formas de realização, 24 nucleobases contíguas de um oligonucleotídeo modificado são cada uma complementar a 24 nucleobases contíguas de um miRNA, ou um precursor do mesmo. Certos Oligonucleotídeos modificados
[0279] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 15 a 25 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 19 a 24 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 21 a 24 nucleosídeos ligados.
[0280] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 12 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 13 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 14 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 15 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 16 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 17 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 18 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 19 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 20 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 21 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 22 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 23 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 24 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 25 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 26 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 27 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 28 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 29 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado consiste de 30 nucleosídeos ligados. Em certas de tais formas de realização, um oligonucleotídeo modificado compreende nucleosídeos ligados selecionada de nucleobases contíguas da SEQ ID NO: 12. Certas Modificações
[0281] Os oligonucleotídeos modificados da presente invenção compreendem uma ou mais modificações para uma nucleobase, açúcar, e/ou ligação internucleosídica. Uma nucleobase, açúcar, e/ou ligação internucleosídica modificados podem ser selecionados em uma forma não modificada por causa das propriedades desejáveis tais como, por exemplo, captação celular realçada, afinidade realçada por outros alvos de oligonucleotídeos ou ácido nucléico e estabilidade aumentada na presença de nucleases.
[0282] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado da presente invenção compreende um ou mais nucleosídeos modificados. Em certas de tais formas de realização, um nucleosídeo modificado é um nucleosídeo de estabilização. Um exemplo de um nucleosídeo de estabilização é um nucleosídeo modificado no açúcar.
[0283] Em certas formas de realização, um nucleosídeo modificado é um nucleosídeo modificado no açúcar. Em certas de tais formas de realização, os nucleosídeos modificados no açúcar podem compreender ainda uma porção de base de heterocíclico natural ou modificado e/ou uma ligação internucleosídica natural ou modificada e podem incluir outras modificações independentes da modificação do açúcar. Em certas formas de realização, um nucleosídeo modificado no açúcar é um nucleosídeo 2’- modificado, em que o anel de açúcar é modificado no carbono 2’ da ribose ou 2’-desóxi-ribose naturais.
[0284] Em certas formas de realização, um nucleosídeo 2’- modificado tem uma porção de açúcar bicíclico. Em certas de tais formas de realização, a porção de açúcar bicíclica é um D açúcar na configuração alfa. Em certas de tais formas de realização, a porção de açúcar bicíclica é um D açúcar na configuração beta. Em certas de tais formas de realização, a porção de açúcar bicíclica é um L açúcar na configuração alfa. Em certas de tais formas de realização, a porção de açúcar bicíclica é um L açúcar na configuração beta.
[0285] Em certas formas de realização, a porção de açúcar bicíclica compreende um grupo ligado em ponte entre os átomos de carbono 2’ e 4’. Em certas de tais formas de realização, o grupo ligado em ponte compreende de 1 a 8 grupos de biradical ligados. Em certas formas de realização, a porção de açúcar bicíclica compreende de 1 a 4 grupos de biradical ligados. Em certas formas de realização, a porção de açúcar bicíclica compreende 2 ou 3 grupos de biradical ligados. Em certas formas de realização, a porção de açúcar bicíclica compreende 2 grupos de biradical ligados. Em certas formas de realização, um grupo de biradical ligado é selecionado de -O-, -S-, -N(R1)-, -C(R1)(R2)-, -C(R1)=C(R1)-, -C(R1)=N-, - C(=NR1)-, -Si(R1)(R2)-, -S(=O)2-, -S(=O)-, -C(=O)- e -C(=S)-; onde cada R1 e R2 é, independentemente, H, hidroxila, alquila C1-C12, alquila C1-C12 substituído, alquenila C2-C12, alquenila C2-C12 substituído, alquinila C2-C12, alquinila C2-C12 substituído, arila C5-C20, arila C5-C20 substituído, um radical heterociclo, um radical heterociclo substituído, heteroarila, heteroarila substituído, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 substituído, halogênio, óxi substituído (-O-), amino, amino substituído, azido, carboxila, carboxila substituído, acila, acila substituído, CN, tiol, tiol substituído, sulfonila (S(=O)2-H), sulfonila substituído, sulfoxila (S(=O)-H) ou sulfoxila substituído; e cada grupo substituinte é, independentemente, halogênio, alquila C1-C12, alquila C1-C12 substituído, alquenila C2-C12, alquenila C2-C12 substituído, alquinila C2-C12, alquinila C2-C12 substituído, amino, amino substituído, acila, acila substituído, aminoalquila C1-C12, aminoalcóxi C1-C12, aminoalquila C1-C12 substituído, aminoalcóxi C1-C12 substituído ou um grupo de proteção.
[0286] Em algumas formas de realização, a porção de açúcar bicíclica é ligada em ponte entre os átomos de carbono 2’ e 4’ com um grupo de biradical selecionado de -O-(CH2)p-, -O-CH2-, -O-CH2CH2-, -O- CH(alquil)-, -NH-(CH2)p-, -N(alquil)-(CH2)p-, -O-CH(alquil)-, - (CH(alquil))- (CH2)p-, -NH-O-(CH2)p-, -N(alquil)-P-(CH2)p-, ou -O-N(alquil)-(CH2)p-, em que p é 1, 2, 3, 4 ou 5 e cada grupo alquila pode ser substituído ainda. Em certas formas de realização, p é 1, 2 ou 3.
[0287] Em certas formas de realização, um nucleosídeo 2’- modificado compreende um grupo 2’-substituinte selecionado de halo, alila, amino, azido, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O-, S-, ou N(Rm)-alquila; O-, S-, ou N(Rm)-alquenila; O-, S- ou N(Rm)-alquinila; O-alquilenil-O-alquila, alquinila, alcarila, aralquila, O-alcarila, O-aralquila, O(CH2)2SCH3, O- (CH2)2-O- N(Rm)(Rn) ou O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H, um grupo de proteção de amino ou alquila C1-C10 substituído ou não substituído. Estes grupos 2’-substituintes podem ser substituídos ainda com um ou mais grupos substituintes independentemente selecionados de hidroxila, amino, alcóxi, carbóxi, benzila, fenila, nitro (NO2), tiol, tioalcóxi (S-alquila), halogênio, alquila, arila, alquenila e alquinila.
[0288] Em certas formas de realização, um nucleosídeo 2’- modificado compreende um grupo 2’-substituinte selecionado de F, NH2, N3, OCF3, O-CH3, O(CH2)3NH2, CH2- CH=CH2, O-CH2-CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2- O-N(Rm)(Rn), - O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, e acetamida N-substituído (O-CH2-C(=O)- N(Rm)(Rn) onde cada Rm e Rn é, independentemente, H, um grupo de proteção de amino ou alquila C1-C10 substituído ou não substituído.
[0289] Em certas formas de realização, um nucleosídeo 2’- modificado compreende um grupo 2’-substituinte selecionado de F, OCF3, O- CH3, OCH2CH2OCH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(CH3)2, - O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, e O-CH2-C(=O)-N(H)CH3.
[0290] Em certas formas de realização, um nucleosídeo 2’- modificado compreende um grupo 2’-substituinte selecionado de F, O-CH3, e OCH2CH2OCH3.
[0291] Em certas formas de realização, um nucleosídeo modificado no açúcar é um nucleosídeo modificado em 4’-tio. Em certas formas de realização, um nucleosídeo modificado no açúcar é um nucleosídeo modificado em 4’-tio-2’-. Um nucleosídeo modificado em 4’-tio tem um β-D- ribonucleosídeo onde o 4’-O é substituído com 4’-S. Um 4’-tio-nucleosídeo 2’-modificado é um 4’-tio-nucleosídeo modificado tendo o 2’-OH substituído com um grupo 2’-substituinte. Os grupos 2’-substituintes adequados incluem 2’-OCH3, 2’-O-(CH2)2-OCH3, e 2’-F.
[0292] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado da presente invenção compreende uma ou mais modificações internucleosídicas. Em certas de tais formas de realização, cada ligação internucleosídica de um oligonucleotídeo modificado é uma ligação internucleosídica modificada. Em certas formas de realização, uma ligação internucleosídica modificada compreende um átomo de fósforo.
[0293] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado da presente invenção compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforotioato. Em certas formas de realização, cada ligação internucleosídica de um oligonucleotídeo modificado é uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[0294] Em certas formas de realização, uma ligação internucleosídica modificada não compreende um átomo de fósforo. Em certas de tais formas de realização, uma ligação internucleosídica é formada por uma ligação internucleosídica de alquila de cadeia curta. Em certas de tais formas de realização, uma ligação internucleosídica é formada por uma ligação internucleosídica de cicloalquila. Em certas de tais formas de realização, uma ligação internucleosídica é formada por um heteroátomo misto e ligação internucleosídica de alquila. Em certas de tais formas de realização, uma ligação internucleosídica é formada por um heteroátomo misto e ligação internucleosídica de cicloalquila. Em certas de tais formas de realização, uma ligação internucleosídica é formada por uma ou mais ligações internucleosídicas heteroatômicas de cadeia curta. Em certas de tais formas de realização, uma ligação internucleosídica é formada por uma ou mais ligações internucleosídicas heterocíclicas. Em certas de tais formas de realização, uma ligação internucleosídica tem uma cadeia principal de amida. Em certas de tais formas de realização, uma ligação internucleosídica tem partes componentes de N, O, S e CH2 mistas.
[0295] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado compreende uma ou mais nucleobases modificadas. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado compreende uma ou mais 5-metilcitosinas. Em certas formas de realização, cada citosina de um oligonucleotídeo modificado compreende uma 5-metilcitosina.
[0296] Em certas formas de realização, uma nucleobase modificada é selecionada de 5-hidroximetil citosina, 7-desazaguanina e 7- deaza-adenina. Em certas formas de realização, uma nucleobase modificada é selecionada de 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina e 2- piridona. Em certas formas de realização, uma nucleobase modificada é selecionada de pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N- 6 e O-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5- propinilcitosina.
[0297] Em certas formas de realização, uma nucleobase modificada compreende um heterociclo policíclico. Em certas formas de realização, uma nucleobase modificada compreende um heterociclo tricíclico. Em certas formas de realização, uma nucleobase modificada compreende um derivado de fenoxazina. Em certas formas de realização, a fenoxazina pode ser modificada ainda para formar uma nucleobase conhecida na técnica como um grampo G. Certos Motivos de Oligonucleotídeo
[0298] Os motivos adequados para os oligonucleotídeos modificados da presente invenção incluem, mas não são limitados a, totalmente modificado, uniformemente modificado, posicionalmente modificado, e espaçâmero. Os oligonucleotídeos modificados tendo um motivo totalmente modificado, incluindo um motivo uniformemente modificado, pode ser planejado para alvejar miRNAs maduros. Alternativamente, os oligonucleotídeos modificados tendo um motivo totalmente modificado, incluindo um motivo uniformemente modificado, pode ser planejado para alvejar certos sítios de pri-miRNAs ou pré-miRNAs, para bloquear o processamento de precursores de miRNA em miRNAs maduros. Os oligonucleotídeos modificados tendo um motivo totalmente modificado ou motivo uniformemente modificado são inibidores eficazes da atividade de miRNA.
[0299] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo totalmente modificado compreende uma modificação de açúcar em cada nucleosídeo. Em certas de tais formas de realização, as pluralidades de nucleosídeos são nucleosídeos de 2’-O-metoxietila e os nucleosídeos remanescentes são 2’-fluoro nucleosídeos. Em certas de tais formas de realização, cada um de uma pluralidade de nucleosídeos é um nucleosídeo de 2’-O-metoxietila e cada um de uma pluralidade de nucleosídeos é um nucleosídeo bicíclico. Em certas de tais formas de realização, um oligonucleotídeo totalmente modificado compreende ainda pelo menos uma ligação internucleosídica modificada. Em certas de tais formas de realização, cada ligação internucleosídica de um oligonucleotídeo totalmente modificado no açúcar é uma ligação internucleosídica modificada. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo totalmente modificado no açúcar compreende ainda pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforotioato. Em certas de tais formas de realização, cada ligação internucleosídica de um oligonucleotídeo totalmente modificado no açúcar é uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[0300] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo totalmente modificado é modificado em cada ligação internucleosídica. Em certas de tais formas de realização, cada ligação internucleosídica de um oligonucleotídeo totalmente modificado é uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[0301] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo uniformemente modificado compreende a mesma modificação de açúcar em cada nucleosídeo. Em certas de tais formas de realização, cada nucleosídeo de um oligonucleotídeo modificado compreende uma modificação de açúcar de 2’-O-metoxietila. Em certas formas de realização, cada nucleosídeo de um oligonucleotídeo modificado compreende uma modificação de açúcar de 2’-O-metila. Em certas formas de realização, cada nucleosídeo de um oligonucleotídeo modificado compreende uma modificação de açúcar de 2’-fluoro. Em certas de tais formas de realização, um oligonucleotídeo uniformemente modificado compreende ainda pelo menos uma ligação internucleosídica modificada. Em certas de tais formas de realização, cada ligação internucleosídica de um oligonucleotídeo uniformemente modificado no açúcar é uma ligação internucleosídica modificada. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo uniformemente modificado no açúcar compreende ainda pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforotioato. Em certas de tais formas de realização, cada ligação internucleosídica de um oligonucleotídeo uniformemente modificado no açúcar é uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[0302] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo uniformemente modificado compreende as mesmas modificações de ligação internucleosídica do começo ao fim. Em certas de tais formas de realização, cada ligação internucleosídica de um oligonucleotídeo uniformemente modificado é uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[0303] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado compreende a mesma modificação de açúcar em cada nucleosídeo, e compreende ainda uma ou mais modificações de ligação internucleosídica. Em certas de tais formas de realização, o oligonucleotídeo modificado compreende uma ligação internucleosídica modificada no terminal 5’ e uma ligação internucleosídica modificada no terminal 3’. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado compreende duas ligações internucleosídicas modificadas no terminal 5’ e duas ligações internucleosídicas modificadas no terminal 3’. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado compreende duas ligações internucleosídicas modificadas no terminal 5’ e três ligações internucleosídicas modificadas no terminal 3’. Em certas formas de realização, o oligonucleotídeo modificado compreende duas ligações internucleosídicas modificadas no terminal 5’ e quatro ligações internucleosídicas modificadas no terminal 3’. Em certas de tais formas de realização, a ligação internucleosídica modificada é uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[0304] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado é reapresentada pela seguinte fórmula III: (5’) QxQz1(Qy)nQz2Qz3Qz4Q-L (3’)
[0305] Em certas de tais formas de realização, um composto é reapresentado pela fórmula III. Em certas formas de realização, Q é um nucleosídeo modificado em 2’-O-metila. Em certas formas de realização, x é fosforotioato. Em certas formas de realização, y é fosfodiéster. Em certas formas de realização, cada um de z1, z2, z3, e z4 é, independentemente fosforotioato ou fosfodiéster. Em certas formas de realização, n é 6 a 17. Em certas formas de realização, L é colesterol. Em certas formas de realização, n é 12 a 17.
[0306] Em certas formas de realização, x é
Figure img0006
Um de A e B é S enquanto o outro é O; y é
Figure img0007
Cada um de z1, z2, z3, e z4 é independentemente x ou y; n = 6 a 17 L é
Figure img0008
Em que: X é N(CO)R7, ou NR7; Cada um de R1, R3 e R9, é independentemente, H, OH, ou - CH2ORb contanto que pelo menos um de R1, R3 e R9 seja OH e pelo menos um de R1, R3 e R9 é -CH2ORb; R7 é Rd ou alquila C1-C20 substituído com NRcRd ou NHC(O)Rd; Rc é H ou alquila C1-C6; Rd é um radical de carboidrato; ou um radical de esteróide, que é opcionalmente amarrado a pelo menos um radical de carboidrato; e Rb é
Figure img0009
com um de A e B sendo S enquanto o outro é O.
[0307] Em certas formas de realização, Rd é colesterol. Em certas formas de realização cada um de z1, z2, z3, e z4 é
Figure img0010
com um de A e B sendo S enquanto o outro é O.
[0308] Em certas formas de realização, R1 é -CH2ORb. Em certas formas de realização, R9 é OH. Em certas formas de realização, R1 e R9 são trans. Em certas formas de realização, R9 é OH. Em certas formas de realização, R1 e R3 são trans. Em certas formas de realização, R3 é -CH2ORb. Em certas formas de realização, R1 é OH. Em certas formas de realização, R1 e R3 são trans. Em certas formas de realização, R9 é OH. Em certas formas de realização, R3 e R9 são trans. Em certas formas de realização, R9 é CH2ORb. Em certas formas de realização, R1 é OH. Em certas formas de realização, R1 e R9 são trans. Em certas formas de realização, X é NC(O)R7. Em certas formas de realização, R7 é -CH2(CH2)3CH2NHC(O)Rd.
[0309] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo posicionalmente modificado compreende as regiões de nucleosídeos ligados, onde cada nucleosídeo de cada região compreende a mesma porção de açúcar, e onde cada nucleosídeo de cada região compreende uma porção de açúcar diferente daquela de uma região adjacente.
[0310] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo posicionalmente modificado compreende pelo menos 10 nucleosídeos modificados em 2’-fluoro. Um tal oligonucleotídeo posicionalmente modificado pode ser reapresentado pela seguinte fórmula I: 5’-T1-(Nu1-L1)n1-(Nu2-L2)n2-Nu2-(L3-Nu3)n3-T2-3’, em que: cada Nu1 e Nu3 é, independentemente, um nucleosídeo de estabilização; pelo menos 10 Nu2 são nucleosídeos 2’-fluoro; cada L1, L2 e L3 é, independentemente, uma ligação internucleosídica; cada T1 e T2 é, independentemente, H, um grupo de proteção de hidroxila, um grupo conjugado opcionalmente ligado ou um grupo de encapuzamento; n1 é de 0 a cerca de 3; n2 é de cerca de 14 a cerca de 22; n3 é de 0 a cerca de 3; e contanto que se n1 é 0 então T1 não é H ou um grupo de proteção de hidroxila, e se n3 é 0, então T2 não é H ou um grupo de proteção de hidroxila.
[0311] Em certas de tais formas de realização, n1 e n3 são cada um, independentemente, de 1 a cerca de 3. Em certas formas de realização, n1 e n3 são cada um, independentemente, de 2 a cerca de 3. Em certas formas de realização, n1 é 1 ou 2 e n3 é 2 ou 3. Em certas formas de realização, n1 e n3 são cada um 2. Em certas formas de realização, pelo menos um de n1 e n3 é maior do que zero. Em certas formas de realização, n1 e n3 é cada um maior do que zero. Em certas formas de realização, um de n1 e n3 é maior do que zero. Em certas formas de realização, um de n1 e n3 é maior do que um.
[0312] Em certas formas de realização, n2 é de 16 a 20. Em certas formas de realização, n2 é de 17 a 19. Em certas formas de realização, n2 é 18. Em certas formas de realização, n2 é 19. Em certas formas de realização, n2 é 20.
[0313] Em certas formas de realização, cerca de 2 a cerca de 8 dos nucleosídeos Nu2 são nucleosídeos de estabilização. Em certas formas de realização, de cerca de 2 a cerca de 6 dos nucleosídeos Nu2 são nucleosídeos de estabilização. Em certas formas de realização, de cerca de 3 a cerca de 4 dos nucleosídeos Nu2 são nucleosídeos de estabilização. Em certas formas de realização, 3 dos nucleosídeos Nu2 são nucleosídeos de estabilização.
[0314] Em certas formas de realização, cada um dos nucleosídeos de estabilização Nu2 é separado dos nucleosídeos de estabilização Nu3 de 2 a cerca de 8 nucleosídeos de 2’-fluoro. Em certas formas de realização cada um dos nucleosídeos de estabilização Nu2 é separado do Nu3 nucleosídeos de estabilização de 3 a cerca de 8 nucleosídeos de 2’-fluoro. Em certas formas de realização cada um dos nucleosídeos de estabilização Nu2 é separado dos nucleosídeos de estabilização Nu3 por 5 a cerca de 8 nucleosídeos de 2’-fluoro.
[0315] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado compreende de 2 a cerca de 6 nucleosídeos de estabilização Nu2. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado compreende 3 nucleosídeos de estabilização Nu2.
[0316] Em certas formas de realização, cada um dos nucleosídeos de estabilização Nu2 é ligado junto em uma sequência contígua. Em certas formas de realização, pelo menos dois dos nucleosídeos de estabilização Nu2 são separados por pelo menos um dos nucleosídeos de 2’- fluoro. Em certas formas de realização, cada um dos nucleosídeos de estabilização Nu2 é separado por pelo menos um dos nucleosídeos 2’-fluoro.
[0317] Em certas formas de realização, pelo menos duas sequências contíguas dos nucleosídeos de 2’-fluoro Nu2 são separados por pelo menos um dos nucleosídeos de estabilização em que cada uma das sequências contíguas têm o mesmo número de nucleosídeos 2’-fluoro.
[0318] Em certas formas de realização, T1 e T2 são cada um, independentemente, H ou um grupo de proteção de hidroxila. Em certas formas de realização, pelo menos um de T1 e T2 é 4,4’-dimetoxitritila. Em certas formas de realização, pelo menos um de T1 e T2 é um grupo conjugado opcionalmente ligado. Em certas formas de realização, pelo menos um de T1 e T2 é um grupo de encapuzamento. Em certas formas de realização, o grupo de encapuzamento é um grupo abásico desóxi invertido.
[0319] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo posicionalmente modificado compreende pelo menos uma ligação internucleosídica modificada. Em certas de tais formas de realização, cada ligação internucleosídica de um oligonucleosídeo posicionalmente modificado é uma ligação internucleosídica modificada. Em certas formas de realização, pelo menos uma ligação internucleosídica de um oligonucleotídeo posicionalmente modificado é uma ligação internucleosídica de fosforotioato. Em certas de tais formas de realização, cada ligação internucleosídica de um oligonucleotídeo posicionalmente modificado é uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[0320] Em certas formas de realização, um motivo posicionalmente modificado é reapresentado pelas seguintes fórmulas II, que representam um oligonucleotídeo modificado que consiste de nucleosídeos ligados: T1-(Nu1)n1-(Nu2)n2-(Nu3)n3-(Nu4)n4-(Nu5)n5-T2, em que: Nu1 e Nu5 são, independentemente, nucleosídeos de estabilização 2’; Nu2 e Nu4 são nucleosídeos de 2’-fluoro; Nu3 é um nucleosídeo 2’-modificado; cada um de n1 e n5 é, independentemente, de 0 a 3; a soma de n2 mais n4 está entre 10 e 25; n3 é de 0 a 5; e cada T1 e T2 é, independentemente, H, um grupo de proteção de hidroxila, um grupo conjugado opcionalmente ligado ou um grupo de encapuzamento.
[0321] Em certas formas de realização, a soma de n2 e n4 é 16. Em certas formas de realização, a soma de n2 e n4 é 17. Em certas formas de realização, a soma de n2 e n4 é 18. Em certas formas de realização, n1 é 2; n3 é 2 ou 3; e n5 é 2.
[0322] Em certas formas de realização, Nu1 e Nu5 são, independentemente, nucleosídeo 2’-modificados.
[0323] Em certas formas de realização, Nu1 é O-(CH2)2- OCH3, Nu3 é O-(CH2)2-OCH3, Nu5 O-(CH2)2-OCH3, T1 é H e T2 é H.
[0324] Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado complementar a um miRNA e que consiste de 22 nucleosídeos ligados tem uma Fórmula II selecionada da Tabela A, onde cada ligação internucleosídica é uma ligação internucleosídica de fosforotioato. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo modificado tendo uma Fórmula II selecionada da Tabela A tem a sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 12.
Figure img0011
Figure img0012
[0325] Um oligonucleotídeo modificado tendo um motivo de espaçâmero pode ter uma região interna que consiste de 2’-desoxinucleotídeos ligados, e regiões externas que consistem de nucleosídeos 2’-modificados ligados. Um tal espaçâmero pode ser planejado para evocar a clivagem de RNase H de um precursor de miRNA. A região de 2’-desoxinucleosídeo interna serve como um substrato para RNase H, permitindo a clivagem do precursor de miRNA para o qual um oligonucleotídeo modificado é alvejado. Em certas formas de realização, cada nucleosídeo de cada região externa compreende o mesmo nucleosídeo 2’-modificado. Em certas formas de realização, uma região externa é uniformemente compreendida de um primeiro nucleosídeo 2’- modificado e a outra região externa é uniformemente compreendida de um segundo nucleosídeo 2’-modificado.
[0326] Um oligonucleotídeo modificado tendo um motivo espaçâmero pode ter uma modificação de açúcar em cada nucleosídeo. Em certas formas de realização, a região interna é uniformemente compreendida de um primeiro nucleosídeo 2’-modificado e cada uma das asas é uniformemente compreendida de um segundo nucleosídeo 2’-modificado. Em certas de tais formas de realização, a região interna é uniformemente compreendida de nucleosídeos de 2’-fluoro e cada região externa é uniformemente compreendida de nucleosídeos de 2’-O-metoxietila.
[0327] Em certas formas de realização, cada região externa de um espaçâmero consiste de nucleosídeos de 2’-O-metoxietila ligados. Em certas formas de realização, cada região externa de um espaçâmero consiste de nucleosídeos de 2’-O-metila ligado. Em certas formas de realização, cada região externa de um espaçâmero consiste de nucleosídeos 2’-fluoro. Em certas formas de realização, cada região externa de um espaçâmero consiste de nucleosídeos bicíclicos ligados.
[0328] Em certas formas de realização, cada nucleosídeo de uma região externa de um espaçâmero compreende nucleosídeos de 2’-O- metoxietila e cada nucleosídeo da outra região externa compreende uma modificação 2’ diferente. Em certas de tais formas de realização, cada nucleosídeo de uma região externa de um espaçâmero compreende nucleosídeos de 2’-O-metoxietila e cada nucleosídeo da outra região externa compreende nucleosídeos de 2’-O-metila. Em certas de tais formas de realização, cada nucleosídeo de uma região externa de um espaçâmero compreende nucleosídeos de 2’-O-metoxietila e cada nucleosídeo da outra região externa compreende nucleosídeos 2’-fluoro. Em certas de tais formas de realização, cada nucleosídeo de uma região externa de um espaçâmero compreende nucleosídeos de 2’-O-metila e cada nucleosídeo da outra região externa compreende nucleosídeos de 2’-fluoro. Em certas de tais formas de realização, cada nucleosídeo de uma região externa de um espaçâmero compreende nucleosídeos de 2’- O-metoxietila e cada nucleosídeo da outra região externa compreende nucleosídeos bicíclicos. Em certas de tais formas de realização, cada nucleosídeo de uma região externa de um espaçâmero compreende nucleosídeos de 2’-O-metila e cada nucleosídeo da outra região externa compreende nucleosídeos bicíclicos.
[0329] Em certas formas de realização, nucleosídeos de uma região externa compreendem duas ou mais modificações de açúcar. Em certas formas de realização, nucleosídeos de cada região externa compreendem duas ou mais modificações de açúcar. Em certas formas de realização, pelo menos um nucleosídeo de uma região externa compreende um açúcar de 2’-O- metoxietila e pelo menos um nucleosídeo da mesma região externa compreende um açúcar de 2’-fluoro. Em certas formas de realização, pelo menos um nucleosídeo de uma região externa compreende um açúcar de 2’-O-metoxietila e pelo menos um nucleosídeo da mesma região externa compreende uma porção de açúcar bicíclico. Em certas formas de realização, pelo menos um nucleosídeo de uma região externa compreende um açúcar de 2’-O-metila e pelo menos um nucleosídeo da mesma região externa compreende uma porção de açúcar bicíclico. Em certas formas de realização pelo menos um nucleosídeo de uma região externa compreende um açúcar de 2’-O-metila e pelo menos um nucleosídeo da mesma região externa compreende um açúcar de 2’-fluoro. Em certas formas de realização, pelo menos um nucleosídeo de uma região externa compreende um açúcar de 2’- fluoro e pelo menos um nucleosídeo da mesma região externa compreende uma porção de açúcar bicíclico.
[0330] Em certas formas de realização, cada região externa de um espaçâmero consiste do mesmo número de nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região externa de um espaçâmero consiste de vários nucleosídeos ligados diferentes além daquele da outra região externa.
[0331] Em certas formas de realização, as regiões externas compreendem, independentemente, de 1 a 6 nucleosídeos. Em certas formas de realização, uma região externa compreende 1 nucleosídeo. Em certas formas de realização, uma região externa compreende 2 nucleosídeos. Em certas formas de realização, uma região externa compreende 3 nucleosídeos. Em certas formas de realização, uma região externa compreende 4 nucleosídeos. Em certas formas de realização, uma região externa compreende 5 nucleosídeos. Em certas formas de realização, uma região externa compreende 6 nucleosídeos. Em certas formas de realização, a região interna consiste de 17 a 28 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 17 a 21 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 17 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 18 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 19 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 20 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 21 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 22 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 23 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 24 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 25 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 26 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 27 nucleosídeos ligados. Em certas formas de realização, uma região interna consiste de 28 nucleosídeos ligados. Certos Ensaios de Quantificação
[0332] Os efeitos da inibição de anti-sentido de um miRNA a seguir da administração de oligonucleotídeos modificados podem ser avaliados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Em certas formas de realização, estes métodos devem ser usados para quantificar níveis de miRNA em células ou tecidos in vitro ou in vivo. Em certas formas de realização, mudanças nos níveis de miRNA são medidos pela análise de microarranjo. Em certas formas de realização, as mudanças nos níveis de miRNA são medidos por um de vários ensaios de PCR comercialmente disponíveis, tais como o Ensaio de MicroRNA TaqMan® (Applied Biosystems). Em certas formas de realização, a inibição de anti-sentido de um miRNA é avaliada medindo-se o nível de mRNA e/ou proteína de um alvo de um miRNA. A inibição de anti-sentido de um miRNA no geral resulta no aumento no nível de mRNA e/ou proteína de um alvo do miRNA. Certos Modelos Experimentais
[0333] Em certas formas de realização, a presente invenção fornece métodos de usar e/ou testar oligonucleotídeos modificados da presente invenção em um modelo experimental. Em certas formas de realização, modelos experimentais são utilizados para avaliar a eficácia de oligonucleotídeos modificados da invenção para o tratamento de fibrose. Aqueles tendo habilidade na técnica são capazes de selecionar e modificar os protocolos para tais modelos experimentais para avaliar um agente farmacêutico da invenção.
[0334] Oligonucleotídeos modificados podem ser primeiro testados em células cultivadas. Os tipos de célula adequados incluem aqueles que são relacionados com o tipo de célula para a qual a liberação de um oligonucleotídeo modificado é desejada in vivo. Por exemplo, os tipos de célula adequados para o estudo de oligonucleotídeos modificados para o tratamento de fibrose incluem fibroblastos, cardiomiócitos, e células estreladas.
[0335] Em certas formas de realização, o grau no qual um oligonucleotídeo modificado inibe a atividade de um miRNA é avaliado em células cultivadas. Em certas formas de realização, a inibição da atividade de miRNA pode ser avaliada medindo-se os níveis do miRNA. Alternativamente, o nível de um miRNA alvo prognosticado ou validado pode ser medido. Uma inibição da atividade de miRNA pode resultar no aumento no mRNA e/ou proteína de um miRNA alvo. Além disso, em certas formas de realização, certos resultados fenotípicos podem ser medidos. Por exemplo, resultados fenotípicos adequados incluem a inibição da proliferação celular, a indução da morte de célula, e/ou a indução de apoptose.
[0336] A seguir da identificação in vitro de um oligonucleotídeo modificado que eficazmente inibe a atividade de um miRNA, os oligonucleotídeos modificados são testados ainda em modelos experimentais in vivo.
[0337] Os modelos experimentais adequados para o teste de agentes farmacêuticos para o tratamento de fibrose, incluindo agentes farmacêuticos que compreendem oligonucleotídeos modificados complementares a um miR-122, incluem um modelo de hipertrofia induzido pela sobrecarga de pressão, aqui descrito.
[0338] Um modelo experimental adicional para o teste de agentes farmacêuticos para o tratamento de fibrose inclui, mas não é limitado ao modelo da dieta deficiente em metionina colina (MCD) (ver, por exemplo, Yamaguchi et al., Hepatology, 2008, 47, 625-635). Camundongos db/db espontaneamente desenvolvem obesidade, diabete, e fígados gordurosos. Alimentar tais camundongos com uma dieta MCD induz a esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e fibrose hepática dentro de 4 a 8 semanas. Os oligonucleotídeos modificados tendo nucleobase complementar a um miRNA são testados neste modelo quanto aos seus efeitos sobre a fibrose hepática.
[0339] Os seguintes exemplos são apresentados de modo a ilustrar mais completamente algumas formas de realização da invenção. Eles de nenhum modo devem ser interpretados, entretanto, como limitando o amplo escopo da invenção. Exemplos Exemplo 1: Um papel para miR-21 na doença cardíaca
[0340] A análise de microarranjo em um modelo de camundongo transgênico de insuficiência cardíaca (super expressão restrita ao coração do receptor ei-adrenérgico (Engelhardt et al., 1999)) revelou desregulagem progressiva da assinatura da expressão de microRNA cardíaco com severidade crescente da doença (Fig. 1 a). Enquanto que a expressão de miR-21 foi modesta em miocárdio normal, este microRNA foi entre os microRNAs regulados mais forte no coração falhando. De fato, em camundongos com insuficiência cardíaca em estágio final, miR-21 foi o único microRNA supra-regulado mais forte (Fig. 1 a). A Análise Quantitativa de Northern blot confirmou a supra-regulagem de miR-21 no camundongo e revelou ainda uma supra-regulagem marcada na insuficiência cardíaca humana (Fig. 1 b, c). A expressão aumentada do precursor de miR-21 como avaliada pela Northern blotting sugeriu um mecanismo transcricional. Assim, o promotor de miR-21 humano foi estudado em mais detalhes. Uma região promotora de miR-21 foi identificada e é altamente conservada em várias espécies (Fig. 4 a). Estudos sobre a expressão de miR-21 humana (Fig. 4 a-c) confirmou a sua regulagem transcricional em dois fatores de transcrição, a proteína do elemento de resposta de cálcio/cAMP (CREB) e fator de resposta sérica (SRF), que são classicamente ativadas durante a resposta ao estresse cardíaco. A deleção de CREB e a mutação dos sítios de ligação de SRF no promotor de miR-21 resultaram na expressão de miR-21 acentuadamente diminuída em resposta à estimulação sérica, indicando um papel maior para estes dois fatores de transcrição na regulagem de miR-21 (Fig. 4 c). Um papel essencial para miR-21 na morfologia e função cardíacas foi detectado por um método com base em morfolino em uma triagem polarizada para silenciar vários microRNAs ubiquamente expressados em zebrafish. O silenciamento de miR-21 levou a um dano dramático da estrutura e função cardíacas (Fig. 5). Mais do que 95% dos animais injetados demonstraram efusões pericárdicas maciças (Fig. 5 a, inserto e b) e função ventricular prejudicada como determinada pela vídeo microscopia (Fig. 5 c).
[0341] Para estudar estas funções essenciais dbe miR-21 no coração de mamífero em mais detalhes, os inventores modularam a expressão de miR-21 em cardiomiócitos isolados. Os inventores transfectaram precursores de miR-21 sintéticos assim como inibidores de miR-21 de anti- sentido, rotineiramente obtendo > 95% de eficiência de transfecção da liberação de oligonucleotídeo (Fig. 6 a). A super expressão de miR-21 levou a um realce robusto de miR-21 maduro, enquanto que a inibição de miR-21 completamente suprimiu a expressão de miR-21 endógena como determinado pela Análise de Northern blot (Fig. 6 b). Entretanto, nem o realce nem a supressão dos níveis de miR-21 em cardiomiócitos significantemente afetaram a morfologia, tamanho ou número de cardiomiócitos de rato primários sob condições de repouso ou sob condições de hipertrofia de cardiomiócito (Fig. 1 d). Camundongos transgênicos em miR-21 específico de cardiomiócito que super expressam miR-21 25 vezes em relação aos parceiros de ninhada do tipo selvagem não demonstraram nenhum fenótipo cardíaco óbvio com estrutura intacta do miocárdio ventricular esquerdo e ausência de fibrose intersticial (Fig. 1 e, fundo). As contrário da expressão de miR-21 substancialmente aumentada no coração falhando, estes dados mostram que a manipulação dos níveis de expressão de miR-21 em cardiomiócitos isolados e modelos de camundongos transgênicos em miR-21 específico de cardiomiócito falha em corroborar uma função significante de miR-21 no coração como indicado pelos efeitos observados em zebrafish e a expressão de miR-21 substancialmente aumentada no coração falhando. Portanto, os inventores em seguida exploraram um papel potencial de miR-21 em um tipo de célula que não de cardiomiócito, por exemplo fibroblastos cardíacos. Usando a hibridização in situ, sinais de miR-21 fracos foram detectados em miocárdio normal, ao passo que em miocárdio falhando o sinal de hibridização foi enormemente realçado. Em alta ampliação, o sinal de hibridização foi restrito primariamente às células intersticiais pequenas, presumivelmente fibroblastos cardíacos. Usando um procedimento de pré- plaqueamento, foram fracionados corações de rato neonatal em uma fração de cardiomiócito e fibroblasto. De fato, os foi detectada a expressão de miR-21 endógeno primariamente em fibroblastos cardíacos (Fig. 1 f). Exemplo 2: miR-21 desreprime a sinalização de ERK de fibroblasto cardíaco
[0342] A expressão de miR-21 é seletivamente aumentada em vários cânceres humanos (Lu et al., 2005; lorio et al., 2005) e foi mostrado contribuir para o crescimento de tumor e se espalha por mecanismos diversos em células diferentes. Visto que miR-21 parece alvejar mRNAs distintos em uma maneira específica do tipo de célula, os inventores decidiram investigar alvos de miR-21 específicos de coração potenciais. Usando um método de bioinformática os inventores triaram várias bases de dados de microRNA para alvos de miR-21 potenciais com sequências de semente que compreendem 3’ UTR e emparelhando nucleotídeos flanqueadores e focalizando esta análise sobre candidatos com expressão cardíaca relatada. Um resumo é representado na Tabela 1 abaixo.
Figure img0013
[0343] Uma triagem quanto aos alvos de miR-21 teóricos revelou 22 genes alvo potenciais conhecidos, dos quais 8 foram anteriormente mostrados serem expressados dentro do tecido cardíaco. A combinação de três ferramentas de prognóstico alvo diferentes identificados Spry1 (sprouty1) como um candidato altamente provável. Sprouty1 (SPRY1), um inibidor conhecido do caminho de Ras/MEK/ERK (Hanafusa et al., 2002, Casci et al., 1999) emergiu como um alvo potencial devido à sua alta contagem e nível de expressão significante no coração (Tabela 1). A 3’UTR do mRNA Spry1 contêm vários sítios de ligação de microRNA prognosticados, dos quais apenas um corresponde a um microRNA altamente supra regulado durante a doença cardíaca (miR-21, ver a Fig. 7). Para determinar o tipo de célula no qual Spry1 é expressado, os inventores utilizaram um alelo de Spry1, em que o gene lacZ substitui parte da sequência codificadora de Spry1. Os ensaios para a expressão de lacZ mostrou tingimento proeminente no coração de camundongo adulto (Fig 2 a). A ampliação mais alta identificou um padrão manchado de expressão de Spry1 que se origina de fibroblastos intersticiais (Fig 2 a, painel inferior). Assim, tanto miR-21 quanto o seu alvo putativo, Spry1, são co-expressados em fibroblastos cardíacos, e não na fração de cardiomiócito. De acordo com estas observações, nenhuma infra-regulagem detectável da expressão de SPRY1 foi encontrada em camundongos transgênicos que super expressam miR-21 em uma maneira específica de cardiomiócito. Além disso, CREB cardíaco, o ativador transcricional da expressão de miR-21 (Fig. 4) está localizado exclusivamente em fibroblastos. Os inventores depois testaram a relevância destas verificações para a doença humana. De fato, a análise de amostras de tecido cardíaco ventricular esquerdo de indivíduos com insuficiência cardíaca em estágio final devida à cardiomiopatia dilatada idiopática demonstrou a expressão de miR-21 aumentada (Fig. 1c) e repressão significante da expressão da proteína SPRY1 (Fig. 2 b). Estas verificações foram acompanhadas pela ativação de ERK- MAPcinase, como evidenciado por uma razão fosfo-ERK/ERK aumentada (Fig. 2 b).
[0344] As funções de MiR-21 foram depois caracterizadas em co-culturas de fibroblastos intersticiais e cardiomiócitos para imitar a composição de tecido cardíaco intacto. Os inventores avaliaram a função de miR-21 pela transfecção de moléculas precursoras de miR-21 sintético ou inibidores. O aumento de miR-21 induziu uma repressão forte da expressão da proteína SPRY1 e aumentou a ativação da ERK-MAPcinase (Fig. 2 c). O silenciamento de Spry1 mediado pelo SiRNA do mesmo modo resultou na ativação da ERK-MAPcinase (Fig. 2 d). Os inventores em seguida avaliaram se a desrepressão mediada pelo miR-21 da sinalização de ERK-MAPcinase de fibroblasto seria suficiente para afetar a sobrevivência de fibroblasto. DE acordo com um papel potencial da sinalização de ERK-MAPcinase na fibrose miocárdica, o realce dos níveis de miR-21 promoveram a sobrevivência do fibroblasto cardíaco, ao passo que a supressão de miR-21 endógeno induziu a morte celular apoptótica (Fig. 2 e). Verificou-se que a regulagem com base em miR-21 da expressão de SPRY1 é crítica para a função secretora de fibroblastos cardíacos, visto que tanto a super expressão de miR-21 assim como o silenciamento mediado pelo siRNA da expressão de SPRY1 significantemente aumentou a secreção do fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGF2) no sobrenadante (Fig. 2 f). Este estudo assim delineou um novo paradigma de sinalização no coração falhando, onde a re-expressão de miR- 21 durante a doença cardíaca aumenta a atividade de ERK-MAPcinase através da inibição de SPRY1. No coração de mamífero, este mecanismo pode regular a sobrevivência de fibroblasto e deste modo criticamente controla o grau de fibrose intersticial e remodelagem cardíaca. Exemplo 3: Silenciamento terapêutico de miR-21 IN VIVO
[0345] Para avaliar a função de miR-21 in vivo, em um cenário normal e na insuficiência cardíaca, a atividade de miR-21 foi inibida usando oligonucleotídeo modificado complementar a miR-21 (antagonista de miR-21). Um modelo de camundongo de hipertrofia induzida pela sobrecarga de pressão foi usado como um modelo para a insuficiência cardíaca humana. Neste modelo uma resposta ao estresse cardíaco reprodutível é obtida através da constrição aórtica transversal (TAC). Este modelo altamente se parece com o coração humano falhando devido ao seu padrão de emparelhamento de mudanças tanto de microRNA quanto de mRNA nos perfis de expressão global (Thum et al. 2007).
[0346] Para determinar a localização de antagomir-21 dentro do coração, um antagomir-21 rotulado com Cy-3 foi injetado intravenosamente via um cateter da veia jugular. Tingimento forte por todo o miocárdio ventricular esquerdo foi observado (Fig. 3 a), indicando que oligonucleotídeos modificados complementares a miR-21 alcançam a distribuição no tecido cardíaco. O antagonista de miR-21 compreendeu de açúcares de 2’-O-metila em cada nucleosídeo, duas ligações internucleosídicas de fosforotioato na extremidade mais a 5’ do oligonucleotídeo, três ligações internucleosídicas de fosforotioato na extremidade mais a 3’ do oligonucleotídeo, e um colesterol ligado através de um ligador de hidroxiprolinol. Os antagonistas de miR-21 tiveram a sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 12. Camundongos não tratados (simulado) ou operados em TAC foram tratados com antagomir-21 ou um oligonucleotídeo de controle nas doses de 80 mg/kg por três dias consecutivos. O tratamento com antagomir-21 fortemente reprimiu a expressão de miR-21 cardíaco elevado por até três semanas como determinado nas análises de Northern blots (Fig. 3 b) e PCR em tempo real (Fig. 8). Este tratamento completamente reverteu a infra-regulagem induzida por TAC de SPRY1 e ERKMAPcinase ativação durante a sobre carga de pressão aos níveis observados em camundongos operados simulados (Fig. 3 c). A fibrose intersticial e peso do coração foram significantemente aumentados três semanas depois de TAC em camundongos não tratados, mas foram fortemente atenuados pelo tratamento com antagomir-21 (Figs. 3 d, e). De fato, o teor de colágeno do miocárdio foi essencialmente normalizado pelo tratamento com antagomir-21. Além disso, onde o peso do coração dobrou três semanas depois de TAC, o tratamento com antagomir-21 preveniu a hipertrofia. Em camundongos operados simulado, o tratamento com antagomir-21 não resulta em mudanças significantes, no peso cardíaco ou fibrose intersticial, indicando que nenhum efeito discernível de antagonismo de miR-21 na cardiotoxicidade de coração normal ou aberto de tratamento com antagomir-21. Depois da operação TAC e tratamento com antagomir-21, a análise de transcriptoma global revelou normalização de vários genes desregulados (Fig. 3 f). Especificamente, genes altamente supra-regulados durante a fibrose cardíaca tal como colágeno 1α1, colágeno 3 α 1, biglicano, fibromodulina ou fator de crescimento de tecido conectivo foram reduzidos depois da inibição específica de miR-21 em 42%, 39%, 44%, 38% e 37%, respectivamente (Fig. 3 f painel inferior). Em outros estudos, a função cardíaca foi avaliada pela ecocardiografia. Os diâmetros diastólicos da extremidade ventricular esquerda aumentaram significantemente três semanas depois de TAC e o encurtamento fracionário foi prejudicado (Fig. 3 g), como é habitualmente observado na insuficiência cardíaca humana. Quando comparado com controles, o tratamento com antagomir-21 impediu a dilatação ventricular esquerda e normalizou os parâmetros de encurtamento fracionário essencialmente aos níveis observados em animais operados simulado (Fig. 3 g). Resultados similares foram obtidos com tratamento com antagomir-21 em um modelo de doença cardíaca induzida com isoproterenol.
[0347] Um experimento adicional foi realizado, em que camundongos foram submetidos à sobrecarga de pressão do ventrículo esquerdo por três semanas antes do tratamento com antagomir-21. Durante este período os animais demonstraram hipertrofia ventricular esquerda significante, fibrose e função cardíaca prejudicada. Depois deste período de tempo de três semanas, os camundongos foram tratados com antagomir-21 e observados quanto a um adicional de três semanas. Ao passo que os animais tratados com controle demonstraram dano progressivo da função ventricular esquerda assim como fibrose intersticial e hipertrofia cardíaca, os animais tratados com antagomir-21 mostraram atenuação significante do dano da função cardíaca assim como regressão da hipertrofia cardíaca e fibrose.
[0348] Estes dados demonstram um papel crítico para os derivados de fibroblasto miR-21 e SPRY1 no coração. A expressão anormal de miR-21 em fibroblastos cardíacos inibe a expressão da proteína SPRY1, resultando no aumento da atividade de ERK-MAP cinase. Por sua vez, isto realça a sobrevivência de fibroblasto cardíaco e deste modo a fibrose intersticial e a remodelagem cardíaca que é característica do coração falhando. Este modelo (resumido na Fig. 3 h) determina um papel primário para a ativação de fibroblasto cardíaco na doença miocárdica. Antagonizar miR-21 no modelo de murino da doença cardíaca impediu o dano estrutural e funcional. Consequentemente, a presente invenção fornece métodos para o tratamento de fibrose, que compreende administrar um oligonucleotídeo modificado complementar a miR-21. A presente invenção fornece ainda métodos para o tratamento de fibrose relacionada com a doença cardíaca, que compreende administrar um oligonucleotídeo modificado complementar a miR-21. Exemplo 4: Regulagem de miR-21 do Caminho de MAPK da Cinase Regulada pelo Sinal Extracelular
[0349] A transformação maligna de células normais para cancerosas requer a aquisição de vários traços oncogênicos tais como divisão celular não controlada, resistência à morte celular programada (apoptose), invasão e angiogênese. As alterações genéticas frequentemente resultam na ativação constitutiva de caminhos da transdução de sinal a jusante comum tais como a cascata da cinase de proteína ativada por mitógeno (MAP) que envolve c-RAF-1, MEK-1, ERK 1/2, p38 e JNK e outros. As cascatas da cinase de proteína ativada por mitógeno (MAPK) são caminhos de sinalização chave envolvidos na regulagem da proliferação, sobrevivência e diferenciação de célula normal. A regulagem aberrante das cascatas de MAPK contribuem para o câncer e outras doenças humanas. Em particular o caminho de MAPK da cinase regulada pelo sinal extracelular (ERK) foi o objeto de pesquisa intensa levando ao desenvolvimento de inibidores farmacológicos para o tratamento de câncer. Em células normais, é bem estabelecido que a ativação da cinase ERK 1/2 é regulada pelas tirosina cinases receptoras tais como receptores de EGF e receptores do fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFRs) via ativação de Ras, que por sua vez ativa a cascata de RAF- 1/MEK-1/ERK 1/2. Porque este caminho de transdução de sinal é hiperativado em muitos cânceres humanos, inibidores das tirosina cinases receptoras, Ras, c-RAF-1 e MEK-1 foram todos desenvolvidos e estão em vários estágios de desenvolvimento. O tratamento de câncer portanto pode ser possível pela administração de uma quantidade eficaz de um inibidor do caminho de RAF-1/MEK-I/P-ERK 1/2.
[0350] Sprouty (SPRY) é uma família de proteínas intracelulares que são reguladores endógenos dos caminhos da tirosina cinase receptora tais como o caminho da Ras/MAP cinase. As espécies mamíferas expressam quatro isoformas de Sprouty, que atuam como inibidores da diferenciação, migração, e proliferação celulares induzidas pelo fator de crescimento. Os inventores identificaram sprouty-1 para inibir a fosforilação de ERK que pode resultar na modulação da formação de tumor. Os inventores sugerem que a supra-regulagem de miR-21 em muitos cânceres humanos inibe sprouty-1 ativando assim ERK para resultar na formação e progressão de tumor realçadas. O antagonismo de miR-21 (por exemplo por um antagomir-21) é portanto capaz de prevenir e/ou atenuar a formação e/ou progressão de tumor. Exemplo 5: Procedimentos Experimentais
[0351] Análise de expressão (arranjo de MicroRNA, Análise de Genechip da Affymetrix, Northern blotting, PCR em tempo real)
[0352] MicroRNA (Castoldi et al., 2007) e perfis de expressão de mRNA global foram gerados a partir de preparações de RNA de miocárdio ventricular esquerdo de murino. Os microRNAs desregulados foram confirmados pela Northern blotting e PCR em tempo real específico de haste-alça. Para ambos os arranjos de oligonucleotídeo e arranjos de microRNA manchado, a análise de dados foi feita com o uso de pacotes R do Bioconductor project (www.bioconductor.org) como anteriormente descrito (Thum et al., 2007). Análise de promotor de miR-21
[0353] 24 horas depois da isolação, as células foram transfectadas com 1 μg de plasmídeo repórter usando um método de transfecção lipossômica estabelecido (Lipofectamine, Invitrogen, USA). Depois de 12 horas o meio foi mudado para meio isento de FCS. 24 horas mais tarde as células foram tratadas com 5% de FCS por 8 horas ao passo que outro grupo foi cultivado sem FCS. A atividade de luciferase foi medida em lisados de célula usando o Kit Dual Luciferase (Promega, Alemanha) de acordo com a recomendação do fabricante. Experimentos de isolação, cultura e transfecção de cardiomiócito
[0354] Cardiomiócitos neonatais foram isolados como descrito anteriormente (Merkle et al., 2007). O tamanho do cardiomiócito foi determinado a partir de imagens digitalmente registradas usando o pacote de software AxioVision LE 4.1 (Carl Zeiss Vision GmbH, Jena, Alemanha). As culturas de cardiomiócito foram transfectadas com precursor e inibidores de miR-21 (Ambion, USA) ou siRNA contra sprouty1 (Promega, Alemanha). Usando condições de cultura apropriadas os inventores também realizaram experimentos com fibroblastos cardíacos e co-culturas de fibroblasto/cardiomiócito. Manutenção de Zebrafish, microinjeção de oligonucleotídeos de anti-sentido de morfolino e determinação da função cardíaca
[0355] Um padrão de morfolino-oligonucleotídeo modificado foi direcionado contra o dre-miR-21 maduro (MO-1 = 5’- GCCA- ACACCAGTCTGATA-AGCTA-3’) e também um Morfolino- oligonucleotídeo modificado multi-bloqueador foi usado para interferir com as etapas múltiplas no processamento e função de miR-21 (MO-2 = 5’- TGTA-ACAGCCA-ACACCAGTOTGATA-AGCTAT-3’). Um oligonucleotídeo de controle padrão (MO-controle) (GENETOOLS, LLC) foi injetado na mesma concentração como um controle negativo. Os morfolinos foram microinjetados em embriões de zebrafish do tipo selvagem de estágio de célula um e a morfologia global e especialmente a função cardíaca foram avaliadas em vários pontos de tempo durante o desenvolvimento. Fotos e filme foram registrados e o encurtamento fracionário ventricular foi medido 48, 72, 80, 96 e 120 horas após a fertilização (hpf) essencialmente como descrito (Rottbauer et al., 2005). Modelos de camundongo de hipertrofia e insuficiência cardíacas
[0356] A constrição aórtica foi realizada pelos métodos de rotina. camundongos transgênicos no receptor adrenérgico Beta1 (linhagem TG4) foram descritos em detalhes anteriormente (Engelhardt et al., 1999). Amostras de coração humano
[0357] Os inventores examinaram tecido cardíaco de indivíduos que passam pelo transplante de coração por causa da insuficiência cardíaca em estágio final devido à cardiomiopatia dilatativa e, por comparação, as amostras de coração de adulto saudável. Imediatamente depois do transplante, pedaços de tecido foram removidos dos ventrículos esquerdo, e o tecido excisado foi subitamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80° C até a análise. Métodos de prognóstico de alvo de microRNA
[0358] As bases de dados de microRNA e as ferramentas de prognóstico de alvo miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/) e Alvoscan (http://www.alvoscan.org/ index.html) foram usados para identificar alvos de microRNA potenciais. Western blotting e análise de fibrose cardíaca
[0359] Os lisados de proteína de corações transplantados ou co-culturas foram preparados como descrito (Buitrago et al., 2005) e expressão de Spry1, ERK1/2, fosfoERK1/2 e G beta detectados como aqui descrito. Para a análise de morfologia e fibrose os corações foram fixados em 4% de formalina e embutido em parafina. As seções de tecido (5 μm) do LV foram tingidas com hematoxilina e eosina ou vermelho de picrosirius. As seções de vermelho de Picrosirius foram examinadas usando um microscópio Nikon ECLIPSE 50i equipado com filtros para fornecer iluminação circularmente polarizada. As imagens de tecido foram obtidas com um lentes objetivas de 20X, registradas em uma câmara digital esfriada (DS-5Mc, Nikon), e analisadas usando o software de análise de imagem SigmaScan Pro 5.0 (SPSS Inc., USA). O teor de colágeno foi calculado como uma porcentagem da área de cada imagem (expressada em pixéis). Camundongos transgênicos em αMHC-miR-21
[0360] Os camundongos transgênicos que super expressam miR-21 foram gerados pela injeção pronuclear de oócitos fertilizados a partir de camundongos FVB/N com uma construção de transgene contendo a sequência de miR-21 madura, flanqueada por 154 pares de base a montante e 136 pares de base a jusante da sequência precursora nativa sob o controle do promotor da cadeia pesada de α-miosina (αMHC) de murino. Tingimento X-gal de miocárdio de camundongos Spry-lacZ
[0361] Os corações foram coletados de camundongos Spry1-lacZ +/- e fixados por 2h em PBS contendo 2% de formaldeído e 0,05% de glutaraldeído. Subsequentemente, os corações foram enxaguados 4 vezes por 30 min em 0,01% de Na-desoxicolato, 0,02% de Nonidet P-40, 2 mM de MgCl2 e 2 mM de EGTA em PBS. Para a detecção da atividade de β-galactosidase os corações foram incubados em solução de enxágue contendo 0,5 mg/ml de X-gal, 10 mM de K3Fe(CN)6, e 10 mM de K4Fe(CN)6 a 37° C. Para a análise de montagem inteira os corações foram transferidos para glicerol a 30% e imagens digitais foram tiradas usando uma Câmara Digital Nikon DXM1200F e o software ACT-1. Para a análise histológica os corações foram desidratados em isopropanol, depurados em xileno e transferidos para parafina. Seções em parafina de 10 μm foram geradas usando protocolos padrão e documentadas. Injeção e detecção de oligonucleotídeos modificados
[0362] Um cateter de veia jugular foi permanentemente inserido em camundongos C57/B16 machos (10 a 12 semanas de idade) antes do procedimento de TAC. 24h após-TAC 80 mg/kg/d de oligonucleotídeo modificado foram injetados diariamente por 3 dias através do cateter da veia jugular. Como um controle positivo quanto a liberação eficaz (oligonucleotídeo modificado rotulado com Cy3) foi injetado a 80 mg/kg de uma vez no cateter e o coração foi removido 3h mais tarde, fixado e tingido com Cy3 observado pela microscopia de fluorescência. Apoptose de fibroblasto e produção de FGF2
[0363] Depois do tratamento com precursores, inibidores ou respectivos controles de miR-21, os fibroblastos positivos em Anexina V foram medidos pela análise FACS (kit Annexin-VFLUOS, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). O ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) foi realizado para quantificar as concentrações de FGF2 em sobrenadantes de fibroblastos cardíacos modulados com miR-21. O ensaio de FGF2 foi realizado usando o kit Quantikine FGF Basic Immunoassay (R&D Systems, Minneapolis, USA) de acordo com as especificações do fabricante. Análise Estatística
[0364] Os dados médios são apresentados como média ± SEM. a análise estatística foi realizada usando os pacotes de software Prism (GraphPad, San Diego, CA) ou StatView (SAS Institute Inc., Cary, USA). ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni e teste t de Student foram usados como apropriado. As diferenças foram consideradas significantes quando P < 0,05 e são indicadas por um asterisco. * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01, *** indica p < 0,005. Isolação de RNA, RT-PCR em Tempo Real e Northern Blotting
[0365] Para a extração de RNA total de tecidos congelados ou culturas de célula o Kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemanha) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. MiRNAs foram isolados pelo TRIZOL (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) ou um Kit de isolação de miRNA (mirVana®, Ambion, USA). A integridade do RNA isolado foi verificada com a eletroforese em gel de agarose desnaturante ou eletroforese capilar (Bioanalyzer 2100; Agilent) como descrito (Thum e Borlak, 2004). Para a PCR em tempo real os inventores utilizaram um Sistema de Detecção pela PCR em tempo real iCycler iQ® (BioRad, Alemanha).
[0366] Os inventores usaram estrutura de haste alça específica de alvo e iniciador de transcrição reversa, e depois da transcrição reversa usaram sondas de hibridização TaqMan específicas para quantificar a expressão de miR-21 (Ensaio de MicroRNA de miR-21 TaqMan, Applied Biosystems, Foster City, USA). A molécula de RNA pequena U6B nuclear pequena (RNU6B) foi amplificada como um controle (Controles de Ensaio de MicroRNA TaqMan, Applied Biosystems, Foster City, USA). Todas as amostras de miRNA foram derivadas de isolações que compreendem a mesma concentração de RNA total.
[0367] Para a Análise de Northern blot, 3 μg de RNA total foram carregadas em 15% de acrilamida, 6 M de uréia, e géis de TBE junto com um marcador de DNA apropriado. A seguir da eletroforese, o RNA foi transferido para uma membrana de náilon (QiabraneNylon, Qiagen) usando a transferência semi-seca. As membranas foram depois pré-hibridizadas por 1 h a 65° C em tampão de hibridização (Tampão de Hibridização ULTRAhyb- Oligo, Ambion, USA). Os oligonucleotídeos de LNA (Sondas de detecção de arranjo miRCURY LNA; Exiqon) que foram anteriormente rotulados com T4 cinase (Exiqon) e 32P-ATP foram depois adicionados ao tampão e as membranas foram hibridizadas durante a noite a 42° C. Subsequentemente, a mancha foi lavada três vezes na temperatura ambiente por 3 minutos (em 0,2x SSC), seguido por um tempo a 42° C por 15 minutos. Em seguida as membranas foram expostas em um fosfoformador de imagem. Análises de expressão de microRNA
[0368] Para as análises de expressão de microRNA de microarranjo os inventores separadamente purificaram microRNAs usando o sistema flashPAGE Fractionator (Ambion, USA). O microRNA obtido de 8 μg de RNA total foi rotulado com o corante Cy3 (Molecular Probes, Carlsbad, Calif) pelo uso do Kit de Rotulação de microRNA mirVana (Ambion, USA) de acordo com as recomendações do fabricante. Cada amostra foi hibridizada em um arranjo separado. A hibridização de microarranjo de MicroRNA, purificação de microRNA e enriquecimento, os procedimentos de hibridização de rotulação e microarranjo foram realizados de acordo com os manuais mirVana da Ambion (www.ambion.com/techlib/prot/) ou como descrito 2. A aquisição de dados foi feita com o uso do Software ScanAlyze (Eisen-Lab, Lawrence Berkeley National Lab (LBNL), Berkeley, USA). Alternativamente, 5 μg de RNA total foram rotulados com um ligador de RNA conjugado a Cy3 (Dharmacon, USA) e hibridizado a uma plataforma de microarranjo para definição de perfil de genoma amplo de miRNAs [miChip; sondas de captura imobilizadas no arranjo correspondem a (211 de ser humano, 51 de murino) miRNAs humanos únicos como depositados em miRbase versão 6.1]. As intensidades de sinal de hibridização foram adquiridas usando o escaner Axon (4000B, Molecular Dynamics) com ajustes de fotomultiplicador idênticos. Outras análises foram realizadas usando Genepix 6 (Molecular Dynamics) e softwares Excel. A expressão de MiR-21 foi validada pelas análises de RT-PCR TaqMan específicas e Análise de Northern blot. Análise de transcriptoma global
[0369] Para a análise de transcriptoma, transcrição reversa, síntese de filamento secundário, e remoção do cDNA de filamento duplo foram realizadas de acordo com os protocolos da Affymetrix (Kit de Síntese de cDNA de Um Ciclo, Affymetrix, USA) partindo de 2 μg de RNA total (n = 4 corações de controle depois da cirurgia simulada, n = 4 ventrículos esquerdos depois de TAO e tratamento com placebo; n = 4 ventrículos esquerdos depois de TAC e tratamento com antagonista de miR-21). A síntese de cRNA rotulado com biotina foi realizada com o uso do Kit de Rotulação IVT (Affymetrix, USA). A concentração de cRNA foi determinada e a distribuição de tamanhos de fragmento de cRNA foi checada pela eletroforese em gel. 15 μg de cRNA fragmentado foram usados para a hibridização no genoma de camundongo 430 2,0 GeneChip (Affymetrix, USA). A análise de dados de estudos de arranjo de pacotes R do Bioconductor project (www.bioconductor.org) foi usada. As intensidades de sinal resultantes foram normalizadas pela estabilização de variação. A qualidade de todos os conjuntos de dados foi testada e a análise estatística foi realizada usando o pacote lima (Modelos Lineares para a Análise de Microarranjo) para selecionar quanto aos genes diferentemente expressados. Experimentos de co-cultura cardíaca e procedimentos de transfecção de microRNA/siRNA
[0370] Cardiomiócitos de ratos neonatais foram isolados e cultivados usando como descrito (Merckle et al., 2007). Para a análise da modulação de miR-21 sobre o tamanho dos cardiomiócito, culturas de cardiomiócito puras foram usadas pela adição de etapas de pré-plaqueamento para excluir as contaminações dos não cardiomiócitos principais (por exemplo fibroblastos). Mais do que 95% dos cardiomiócitos cultivados tingiram positivos para actinina, demonstrando alta pureza das culturas de célula. miR misturado (controle pré-negativo #2, Ambion; 50 nmol/L, 72 horas), moléculas precursoras de miR-21 (pré-MiR, Ambion; 50 nmol/L, 72 horas) ou antagonistas de miR-21 (anti-miR, Ambion; 50 nmol/L, 72 horas) foram transfectados por um método com base em lipossoma (Lipofectamine, Invitrogen, USA; ver 6 para detalhes). Os cardiomiócitos foram cultivados com FCS baixo (0,1%, condição de controle) ou 48 h com FCS alto (5,0%) para induzir a hipertrofia de cardiomiócito. Para a determinação do tamanho de célula, a área de superfície de cardiomiócitos neonatais (72 horas depois da transfecção) foi calculada em um formato de placa de 96 reservatórios (densidade de semeadura 40.000 células/reservatório) com o uso do pacote AxioVison Rel 4.4 (Carl Zeiss GmbH, Jena, Alemanha). Os dados são expressados como média ± SEM.
[0371] Para imitar as condições cardíacas in vivo os inventores usaram um sistema de co-cultura de cardiomiócitos e fibroblastos cardíacos ignorando-se a etapa de pré-plaqueamento como descrito acima. Aqui, os inventores estudaram em detalhes a ativação da expressão de Spry-1 e Erk depois da transfecção de miR misturado (50 nmol/L, 72 horas), moléculas precursoras de miR-21 (50 nmol/L, 72 horas) ou antagonistas de miR-21 (50 nmol/L, 72 horas). Em experimentos separados siRNA misturado ou um coquetel de siRNA específico contra Spry1 (três microRNAs diferentes, 16,7 nmol/L cada) foram transfectados para a co-cultura. A eficiência de transfecção foi monitorada pelas medições de PCR em tempo real (Ensaios de MicroRNA TaqMan, Applied Biosystems) e Northern blotting. Ferramentas de prognóstico de alvo de microRNA
[0372] O algoritmo miRanda (Griffiths-Jones et al., 2006) foi usado para escanear quanto aos sítios de ligação de miR-21 potencial em sequências 3’ UTR do genoma humano e de murino. Subsequentemente, a normalização de Karlin-Altschul foi realizada (miRBase Targets versão 4.0; http://microrna.sanger.ac.uk/alvos/v4/). Em detalhes, os inventores usaram a base de dados miRBase (Versão 4, Sanger Institute; USA) e classificaram alvos de miR-21 potenciais pelo uso dos algoritmos “número alto de espécies conservadas; >6”), “valor p baixo; <0,001” e contagem de miRBase alta; >15. Este procedimento revelou 22 genes conhecidos como sendo alvos de miR-21 potenciais, dos quais 8 foram anteriormente mostrados como sendo expressados dentro do tecido de coração com base no seu perfil de expressão GEO (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/geo/) (ver a Tabela 1). 5 genes foram adicionalmente prognosticados como alvos de miR-21 usando a base de dados de miRNA PicTar 9 (Krek et al., 2005) (http://pictar.bio.nyu.edu/). Usando o software de prognóstico de alvo de miRNA Targetscan (Whitehead Institute for Biomedical Research, USA, Release 4.0; Julho de 2007; http://www.alvoscan.org/) os inventores identificaram alvos com sítios conservados com emparelhamentos de semente de 8-mero para miR-21 apenas para dois alvos. Spry1 foi depois estudado em mais detalhes. Western blotting
[0373] Os lisados de proteína de corações transplantados ou fibroblastos/cardiomiócitos cultivados foram preparados como descrito (Buitrago et al., 2005). Os extratos (20 a 50 μg de proteína por linha) foram misturados com tampão de carregamento de amostra e sob condições redutoras separados em géis a 10% de SDS-poliacrilamida. As proteínas foram eletrotransferidas sobre membranas de PVDF (Immun-Blot®, Bio-Rad). As faixas foram detectadas usando um ensaio de quimioluminescência (ECL Plus, Amersham). Os inventores usaram anticorpos primários contra sprouty-1 (Santa Cruz, sc-30048, diluição 1:250-1:500), Erk1/2 (Cell Signaling, #9102, diluição 1:1000); fosfo-Erk1/2 (Cell Signaling, #9101, diluição 1:1000) e G-13 (Santa Cruz Biotechnology, sc-378, diluição 1:1000), assim como anticorpos secundários apropriados (Anti-camundongo-HRP (Cell Signaling, #7076, diluição 1:10000; Anti-coelho-HRP (Cell Signaling, #7074, diluição 1:10000). Modelo TAC in vivo e administração de oligonucleotídeo modificado
[0374] Os inventores usaram camundongos C57BL/6 machos (10 a 12 semanas de idade, 25 g) da Charles River Laboratories (Sulzfeld, Alemanha). A constrição aórtica (TAC) foi criada usando uma sutura 7-0 amarrada duas vezes em torno da aorta e uma agulha de calibre 27. A agulha foi depois suavemente retirada, produzindo uma constrição de cerca de 80% da aorta. Durante as mesmas operações, um cateter de veia jugular foi implantado pelos procedimentos cirúrgicos padrão. As sequências foram: antagomir-21, 5’-oUsoCsoAoAoCoAoUoCoAoGoUo CoUoGoUoAoAoGsoCsoUsoAs-Chol-3’. Todos os nucleotídeos usados na síntese são modificados em 2’-OMe (Subscrito ‘o’). Subscrito ‘s’ representa uma ligação de fosforotioato; “Cy3” indica rótulo de corante Cy3 na extremidade 5’ do oligo; “Chol” representa colesterol ligado através de uma ligação de hidroxiprolinol. O tratamento começou 24 horas após a TAC e os animais receberam injeções de PBS ou antagonista de miR-21 via um cateter de veia jugular implantado (três dias consecutivos, injeções da veia jugular de PBS ou antagonista de miR-21 nas doses de 80 mg por kg de peso corporal em 0,2 ml por injeção. Como um controle positivo para a liberação cardíaca eficaz oligonucleotídeo modificado rotulado com Cy-3 (antagomir-181a) (80 mg/kg) foi injetado no cateter da veia jugular e o coração foi removido 3 h mais tarde, fixado e tingido com Cy3 observado pela microscopia de fluorescência. Análise da Função Cardíaca
[0375] Depois de 3 semanas de TAC, os camundongos foram anestesiados com isoflurano, e as dimensões e função cardíacas foram analisadas pela ecocardiografia de Doppler com onda de pulso de 15-MHz. Depois o coração foi removido, pesado depois da remoção dos átrios e submetidos a análise adicional. Os estudos ecocardiográficos foram realizados sob anestesia leve com respiração espontânea usando isoflurano. Dois ultrassonógrafos independentes experimentados na formação de imagem de roedores e cegos para os grupos experimentais realizaram a ecocardiografia, operando um Toshiba Power Vision 6000 com um transdutor de 15 MHz. As vistas de eixo curto 2D esquerda-paraesternal ao nível dos músculos papilares foram registradas. A colocação de sonda correta foi julgada pelo aspecto redondo da cavidade ventricular esquerda (LV) depois da angulação e movimentos de transdutor craniocaudais. A área diastólica final de LV foi calculada pelas traçagens manuais da borda endocardial seguidas pela planimetria com o pacote de software Nice (Toshiba Medical Systems). As traçagens de modo M transversal simultânea foram registradas com o cursor colocado no centro da cavidade LV. O encurtamento fracionário foi calculado como descrito (Collins et al., 2001). Detecção de fibrose cardíaca
[0376] Os corações de camundongo foram fixados em 4% de formalina tamponada e embutido em parafina. Seções de vermelho de picrosirius de 5 μm foram examinadas usando um microscópio Nikon ECLIPSE 50i equipado com filtros para fornecer iluminação circularmente polarizada (Whittaker et al., 1994). O filtro inferior foi colocado acima do anel de diafragma- iris de campo do microscópio, enquanto que o filtro superior foi construído a partir de uma combinação de uma placa de quarto de onda colocado abaixo de um polarizador linear alinhado tal que o seu eixo de transmissão foi a 45° em relação ao eixo rápido da placa de onda. Estes dois filtros foram cruzados, isto é alinhados de modo que o fundo do campo de vista fosse tão escuro quanto possível. As imagens de tecido foram obtidas com uma lente de objetiva de 20X, registrada em uma câmara digital esfriada (DS-5Mc, Nikon), e analisadas usando o software de análise de imagem SigmaScan Pro 5.0 (SPSS Inc., USA). Precisamente, as imagens originais (circularmente polarizadas), foram resolvidas cada uma nos seus componentes ciano, amarelo, magenta e preto (usando a função automatizada CYMK fornecida pela análise de imagem). O componente preto foi subtraído da imagem polarizada. Antes da subtração o componente preto foi adequadamente ajustado brilhante para garantir a eliminação do espaço intersticial e elementos que não de colágeno mas não das fibras de colágeno mais finas (confirmadas pela inspeção). Depois a imagem subtraída foi submetida a uma separação de cor final nos seus componentes de tonalidade, saturação, valor (HSV) usando a função HSV automatizada fornecida pelo software de imagem. Um histograma da frequência de tonalidade foi obtida a partir da imagem de tonalidade de 8-bit resolvido, que contém 256 cores. As seguintes definições de tonalidade foram usadas: vermelho 29 e 230-256, laranja 10-38, amarelo 39-51, verde 52-128. A faixa de tonalidade 129-229 consiste do espaço intersticial e elementos de tecido não birrefringentes. O número de pixéis dentro da tonalidade nas faixas vermelho, laranja, amarelo e verde foi determinado, e expressado como uma porcentagem do número total de pixéis de colágeno, que por sua vez foi expressado como uma porcentagem do número total de pixéis na imagem. Apoptose de fibroblasto e produção de FGF-2
[0377] Os fibroblastos cardíacos obtidos pela etapa de pré- plaqueamento durante a isolação de cardiomiócito foram cultivados até a sub- confluência. A pureza de célula foi >95% com base no tingimento com o marcador de fibroblasto anti-rato prolil-4-hidroxilase (Acris Antibodies, AF5110-1; dados não mostrados). Depois do tratamento com precursores de miR-21, inibidores ou respectivos controles (ver acima), os fibroblastos positivos em Annexin V foram medidos pela análise de FACS (kit Annexin- VFLUOS, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). O ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) foi realizado para quantificar concentrações de FGF-2 em sobrenadantes de fibroblastos cardíacos modulados por miR-21. A determinação de FGF-2 foi realizada usando o kit Quantikine FGF Basic Immunoassay (R&D Systems, Minneapolis, USA) de acordo com as especificações do fabricante. Referências Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350-355 (2004). Buitrago, M. et al. The transcriptional repressor Nab1 is a specific regulator of pathological cardiac hypertrophy. Nat Med 11, 837-844 (2005). Care, A. et al. MicroRNA-133 controls cardiac hypertrophy. Nat Med 13, 613-618 (2007). Casci, T., Vinos, J. & Freeman, M. Sprouty, an Intracellular Inhibitor of Ras Signaling. Cell 96, 655-665 (1999). Castoldi, M. et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA 12, 913-920 (2006). Collins, K.A. et al. Accuracy of echocardiographic estimates of left ventricular mass in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol 280, H1954- H1962 (2001). Engelhardt, S., Hein, L., Wiesmann, F. & Lohse, M. J. Progressive hypertrophy and heart failure in beta 1-adrenergic receptor transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences 96, 7059-7064 (1999). Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A. & Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research 34, D140-D144 (2006). Hanafusa, H., Torii, S., Yasunaga, T. & Nishida, E. Sproutyl and Sprouty2 provide a control mechanism for the Ras/MAPK signalling pathway. Nat Cell Blot 4, 850-858 (2002). lorio, M. V. et al. MicroRNA Gene Expression Deregulation in Human Breast Cancer. Cancer Res 65, 7065-7070 (2005). Kruetzfeldt J, et al. Silencing of microRNAs in vivo with ‘antagomirs’. Nature 438, 685-689 (2005). Lu, J. et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature 435, 834-838 (2005). Merkle, S. et al. A Role for Caspase-1 in Heart Failure. Circ Res 100, 645-653 (2007). Mi, S. et al. MicroRNA expression signatures accurately discriminate acute lymphoblastic leukemia from acute myeloid leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences 104, 19971-19976 (2007). Rottbauer, W. et al. VEGF-PLC{gamma}1 pathway controls cardiac contractility in the embryonic heart. Genes Dev. 19, 1624-1634 (2005). Thum, T. & Borlak, J. Mechanistic role of cytochrome P450 monooxygenases in oxidized low-density lipoprotein-induced vascular injury: therapy through LOX-1 receptor antagonism? Circ Res 94, e1-13 (2004). Thum, T. et al. MicroRNAs in the Human Heart: A Clue to Fetal Gene Reprogramming in Heart Failure. Circulation 116, 258-267 (2007). Yang, B. et al. The muscle-specific microRNA miR-1 regulates cardiac arrhythmogenic potential by targeting GJA1 and KCNJ2. Nat Med 13, 486-491 (2007).

Claims (13)

1. Composto, caracterizado pelo fato de compreender um oligonucleotídeo modificado que consiste de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que o oligonucleotídeo modificado compreende uma sequência de nucleobase complementar a um miR-21 (SEQ ID NO: 1), para uso no tratamento, prevenção ou diagnose de fibrose em um indivíduo.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fibrose é fibrose hepática, fibrose cardíaca, fibrose renal, fibrose pulmonar, fibrose de pele, fibrose relacionada com a idade, ou fibrose esplênica.
3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem pelo menos uma doença ou condição selecionada de uma doença ou condição cardíaca, doença ou condição hepática, doença ou condição pulmonar, e uma doença ou condição renal.
4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que em combinação com um ou mais agentes farmacêuticos adicionais para administrar ao indivíduo.
5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a administração do composto ao indivíduo: a) melhora o aumento do peso cardíaco, dilatação ventricular esquerda, ou dano do encurtamento fracionário; b) impede o amento do peso cardíaco, dilatação ventricular esquerda, ou dano do encurtamento fracionário; e/ou c) melhora função cardíaca.
6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a administração do composto ao indivíduo: a) melhora a fibrose; b) diminui a progressão adicional da fibrose; c) para a progressão adicional da fibrose; d) reduz a fibrose; e/ou e) reduz teor de colágeno.
7. Composto, caracterizado pelo fato de compreender um oligonucleotídeo modificado consistindo de 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar a miR-21 (SEQ ID NO: 1), para uso em contactar um fibroblasto a: a) inibir proliferação de fibroblasto; b) simular apoptose de fibroblasto; c) aumentar proteína de expressão Sprouty 1.
8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado consiste de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 nucleosídeos ligados e a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, ou pelo menos 22 nucleobases contíguas da sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 12.
9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o composto compreende um oligonucleotídeo modificado conjugado a um ligando, e que o ligando é opcionalmente colesterol.
10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma ligação internucleosídica é uma ligação internucleosídica modificada, ou que cada ligação internucleosídica é uma ligação internucleosídica modificada, e que a ligação internucleosídica modificada é opcionalmente uma ligação de fosforotioato.
11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que cada um de uma pluralidade de nucleosídeos compreende um açúcar modificado, ou cada nucleosídeo compreende um açúcar modificado; em que opcionalmente cada açúcar modificado é independentemente selecionado de um açúcar 2’-O-metoxietila, um açúcar 2’-fluoro, um açúcar 2’-O-metila, ou uma porção de açúcar bicíclico.
12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nucleosídeo compreende uma nucleobase modificada e que a nucleobase modificada é uma 5-metilcitosina.
13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o composto que compreende o oligonucleotídeo modificado é preparado como uma composição farmacêutica.
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