BRPI0908879B1

BRPI0908879B1 - Método de degradação de planta, coquetel de degradação de plantas, material de planta homogeneizado e coquetel de enzimas

Info

Publication number: BRPI0908879B1
Application number: BRPI0908879-2A
Authority: BR
Inventors: Henry Daniell
Original assignee: University Of Central Florida Research Foundation, Inc.
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2009-03-02
Publication date: 2019-07-09
Also published as: BRPI0908879A2; WO2009108941A3; CN102016041A; EP2260105A4; EP2260105B1; EP2260105A2; CA2716806A1; US20090325240A1; US10676751B2; IN2010MU01835A; WO2009108941A2

Abstract

produção e uso de materiais de degradação de planta são aqui revelados materiais úteis para a degradação de biomassa de material de planta. em modalidades exemplares, o material de planta compreende uma ou mais enzimas que são expressas em plantas e/ ou bactérias. são especificamente aqui exemplificadas enzimas de degradação de plantas expressas em cloroplastos. as enzimas expressas em cloroplasto podem ser fornecidas como coquetéis para uso em conjunto com métodos convencionais de conversão de biomassa em biocombustíveis, por exemplo, etanol celulósico.

Description

MÉTODO DE DEGRADAÇÃO DE PLANTA, COQUETEL DE DEGRADAÇÃO DE PLANTAS, MATERIAL DE PLANTA HOMOGENEIZADO E COQUETEL DE ENZIMAS FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A composição e a diversidade de biomassa para a produção de etanol celulósico exigem múltiplos sistemas enzimáticos, em concentrações muito elevadas, para liberar açúcares constituintes dos quais o etanol celulósico é feito. Todas as enzimas atualmente disponíveis para etanol celulósico são produzidas em sistemas de fermentação caros e são purificadas em um processo muito similar às substâncias biofarmacêuticas como insulina. Portanto, enzimas de grau de reagente para a produção de etanol são extremamente caras. Por exemplo, Bglicosidase, pectoliase e celulase são vendidas atualmente por Novozyme através do catálogo Sigma por U$ 124.000, U$ 412.000 e U$ 40.490 por kg, respectivamente. Essas enzimas são vendidas como formulações para biorrefinarias sem a revelação dos reais componentes enzimáticos. Portanto, o custo real para cada enzima, vendida em quantidades volumosas, não é disponível publicamente. A maioria das estimativas industriais para enzimas para a produção de etanol celulósico está na faixa de U$ 2 a U$ 3 por cerca de 3,78 litros, o que torna o custo do uso em grande escala proibitivo. A capacidade atual de sistemas de fermentação também constitui uma limitação importante. Com o aumento da demanda por enzimas e pela capacidade de produção limitada, o custo da enzima provavelmente aumentará ainda mais.

Uma limitação importante para a conversão dessa biomassa em etanol é o alto custo e as grandes quantidades de enzimas necessárias para a hidrólise. B-glicosidase, pectoliase e celulase são vendidas atualmente por Novozyme

Petição 870180130669, de 14/09/2018, pág. 17/24

2/85 ou outras indústrias através do catálogo de Sigma por U$ 124.000, U$ 412.000 e U$ 40.490 por kg, respectivamente. Portanto, o Departamento de Energia dos Estados Unidos (DOE) há muito identificou o custo das enzimas e seus altos níveis de carga necessários para a maioria das matériasprimas lignocelulósicas como uma das barreiras principais à produção de etanol celulósico. Atualmente, todas as enzimas disponíveis comercialmente são produzidas através de um processo de fermentação. Infelizmente, a construção e a manutenção do processo de produção de fermentação são muito caras, custando 500-900 milhões de dólares em investimentos prévios. Ainda não surgiu uma alternativa viável à tecnologia de fermentação para as enzimas industriais cruciais para a produção em massa, ainda proibitivamente caras. Esse vazio no mercado por um processo alternativo é preenchido diretamente por essa proposta.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 (a) Representação esquemática da região trnl/trnA 16S do cloroplasto. Os transgenes foram inseridos na região espaçadora trnl/trnA no genoma do cloroplasto do tabaco. (b) Representação esquemática dos vetores de transformação do cloroplasto. 0 gene de interesse (GOT) é celD, celO, pelA, pelB, pelO, cutinase, lipY, egll, egl, swol, xyn2, axel ou bgll. Prrn, promotor de óperon de rRNA; aadA, o gene de aminoglicosídeo 3'-adeniltransferase confere resistência à espectinomicina; UTR 5', promotor e região 5' não traduzida do gene psbA; UTR 3', região não traduzida 3' do gene psbk. (c) Avaliação da integração do transgene e homoplasmia por Southern-blot de linhagens transplastômicas pelB, (d) pelD e (e) celD hibridizadas com

3/85 a sonda da sequência flanqueadora (1, não transformadas; 2 a 4, linhagens transplastômicas). (f) Fenótipos de linhagens não transformadas (UT) e transplastômicas desenvolvidas em estufa que mostram crescimento normal.

Figura 2 Análise Western blot e quantificação de linhagens transplastômicas. Western blot de linhagens transplastômicas que expressam (a) PelB ou (b) PelD. UT: não transformadas, folhas maduras colhidas às 10 da manhã, da tarde, 6 da tarde e 10 da tarde; 5 ng, 10 ng e 25 ng: proteína PelA purificada, folhas jovens, maduras e velhas.

(c) Unidades de enzima de PelB e PelD (c) ou CelD (d) de um g ou 100 mg de folha de idades ou momentos de colheita diferentes.

Figura 3 Efeito de substrato, pH, temperatura e cofatores sobre a atividade enzimática de jcpPelB, rPelB, cpPelD, rPelD, rCelD e cpCelD. (a) Efeito de concentrações crescentes de

PGA sobre a atividade de pectato liases. (b)

Efeito do pH sobre atividade de pectato liases na ausência de CaCl₂ e (c) na presença de CaCl₂.

Os tampões foram os seguintes:

mM de tampão fosfato (pH 6-7), tampão de Tris-HCl (pH 8), tampão de glicina/NaOH (pH 9) e tampão CAPS (pH 10,0) com 4 pg de TSP de PelB e PelD de planta e de E. coli. 0 pH ótimo foi determinado a 40°C usando 2,5 mg/ml de PGA como substrato. (d) Efeito da temperatura (30-70°C) sobre a atividade enzimática em pH

8,0 na ausência de CaCl₂ e (e) na presença de CaCl₂. (f)

Otimização do pH para atividade de cpCelD e rCelD usando CMC (2%) a 60°C por 30 minutos. A atividade relativa (%) foi medida com referência à atividade máxima obtida com 25 pg/ml para cpCelD e 10 pg/ml para rCelD. (g) Efeito de

4/85 temperaturas crescentes sobre a atividade relativa de cpCelD e rCelD usando CMC (2%) por 30 minutos em pH 6,0. A atividade relativa (%) foi medida com referência à atividade máxima obtida com 25 pg/ml para cpCelD e 10 pg/ml para rCelD. (h) Aumento da atividade de cpCelD (reação de 25 pg de TSP/ml) usando 10 mM de CaCl₂ e 20 pg/ml de BSA individualmente ou em combinação com 50 mM de acetato de sódio durante a hidrólise enzimática prolongada. A hidrólise foi realizada até 36 horas a 60°C, pH 6,0, na presença de CMC (2%).

Figura 4 Enzimas derivadas de E. coli vs. cloroplasto em diferentes concentrações de proteína de extratos brutos, (a) Cinética enzimática de cpCelD e rCelD usando substrato de carboximetil celulose (2%). A mistura de reação continha concentrações crescentes de cpCelD e rCelD TSP (pg/ml) com 10 mM de CaCl₂ e 50 mM de tampão de acetato de sódio, pH 6,0. A hidrólise enzimática foi realizada por 30 minutos a 60°C. O detalhe da Figura mostra o ponto de saturação da cinética enzimática para quantidade TSP de cpCelD (pg/ml) em direção a CMC (2%). Os tubos de Eppendorf com mistura de reação mostrados no detalhe representam, 1 planta não transformada, 2 e 3 TSP de 10 pg de rCelD e cpCelD. (b) Efeito de cpPelB, cpPelD, rPelB e rPelD sobre a hidrólise de substrato de 5,0 mg/ml de poligalacturonato de sódio. A mistura de reação continha concentrações crescentes de cpPelB, cpPelD, rPelB e rPelD (pg/ml) em 20 mM de tampão de Tris-HCl (pH 8,0). Poligalacturonato de sódio (Sigma) foi medido usando o método de DNS e medido a partir do gráficopadrão de ácido D-galacturônico. A hidrólise enzimática foi realizada por 2 horas a 40°C em um misturador rotatório a

5/85

150 rpm.

Figura 5 Coquetéis de enzimas para papel de filtro, madeira processada e casca de cítricos, (a) A atividade no papel de filtro foi determinada usando uma tira de papel de filtro Whatman N° 1 (ensaio de 50 mg/ml) em pH 5,5 e 50°C. Diferentes combinações de extratos brutos contendo rEgl (100 pg/ml), rBgll (200 pg/ml), rSwol (120 pg/ml), rCelO (100 pg/ml) e cpCelD (100 pg/ml) foram usadas no coquetel. As amostras foram incubadas com 10 mM de CaCl₂, 20 pg de BSA em um misturador rotatório a 150 rpm por 24 horas, (b) A hidrólise da amostra de madeira processada (reação de 200 mg/5 ml) foi feita pela utilização de um coquetel de extratos brutos de cpPelB (250 pg/ml) , cpPelD (250 pg/ml) (em pH 8,0,), cpCelD (200 pg/ml), cpXyn2 (200 pg/ml), rEgl (100 pg/ml), rBgll (200 pg/ml), rSwol (120 pg/ml), rCelO (100 pg/ml), rAxel (100 pg/ml), rPelA (200 pg/ml), rCutinase (50 pg/ml), rLipY (100 pg/ml). A mistura de reação contendo 10 mM de CaCl₂, 20 pg/ml de BSA foi incubada por 36 horas em um misturador rotatório a 150 rpm; pH (5,5-8,0) e temperatura (40°C-50°C) foram ajustados com base nas condições ótimas. A análise do ponto final da liberação de equivalentes de glicose foi determinada usando o método de DNS. (c) A hidrólise de casca de laranja Valência (reação de 200 mg/5 ml) foi feita usando um coquetel de extratos brutos de cpPelB (250 pg/ml) , cpPelD (250 pg/ml) cpCelD (100 pg/ml) e cpXyn2 (100 pg/ml), rEgl (100 pg/ml), rBgll(200 pg/ml), rSwol(120 pg/ml), rCelO (100 pg/ml) e cpCelD (100 pg/ml), rAxe2 (100 pg/ml), rCutinase (50 pg/ml), rLipY (100 pg/ml), rPelA (200 pg/ml). A análise do produto final de açúcar redutor foi determinada usando

6/85 reagente de DNS ³¹ e D-glicose e ácido D-galacturônico como padrões. Ampicilina e canamicina a 100 pg/ml foram adicionadas para evitar qualquer crescimento microbiano durante hidrólise. As amostras foram incubadas com 10 mM de CaCl₂, 20 pg/ml de BSA em um misturador rotatório a 150 rpm por 24 horas; o pH (5,5-8,0) e a temperatura (40°C-50°C) foram ajustados com base em condições ótimas. Em todos os experimentos, ensaios de controle continham substrato sem enzima ou enzima sem substrato. Todos os experimentos e ensaios foram realizados em triplicata.

Figura 6 Geração de cultivares comerciais transplastômicos de tabaco (A) Enraizamento de broto de CelD LAMD (B) plantas transplastômicas de CelD LAMD que crescem na estufa (C) plantas transplastômicas de CelD LAMD que mostram floração normal (D) transformante primário de CelD TN90 (E) Segunda rodada de regeneração para CelD TN90 (F) Enraizamento de PelB TN90 (G-I) Primeira, segunda e terceira rodada de regeneração para PelB LAMD (J) Enraizamento de broto de PelD LAMD (K) plantas transplastômicas PelD LAMD que crescem em estufa (L) planta transplastômica PelD LAMD que mostra floração normal (M) Enraizamento de broto egl LAMD (N) planta transplastômica egl LAMD que cresce em potes.

Figura 7 Confirmação de homoplasmia por southern-blots usando sonda flanqueadora de tabaco (A) CelD LAMD (B) PelB LAMD (C) PelB TN90 (D) PelD LAMD e (E) egl LAMD (UT: Planta não transformada; Números: Linhagens transplastômicas e B: Branco).

Figura 8 Atividade enzimática de pectato liase B e D em cultivares de tabaco Petit Havana, TN90 e LAMD (A) PelB

7/85 (B) PelD. Observação: o material de folha usado para a análise da atividade enzimática para cultivares de tabaco TN90 e LAMD foi colhido de plantas in vitro, enquanto o material de folha para Petit Havana é da estufa. Na medida em que o transgene é controlado por psbA, com a luz e elementos reguladores do desenvolvimento, espera-se que os níveis de expressão em cultivares comerciais sejam maiores quando transferidos para a estufa.

A Figura 9 mostra informação de sequência de alguns exemplos de genes de composto de degradação de plantas.

DESCRIÇÃO GERAL

Algumas modalidades da invenção abordam os problemas principais discutidos acima por produção de todas as enzimas necessárias em plantas ou bactérias ou uma combinação de ambas, aliviando dramaticamente, dessa forma, o custo da fermentação e purificação. De acordo com uma modalidade, a invenção pertence a um método de degradação de uma amostra de biomassa de planta de modo a liberar açúcares fermentáveis nessa amostra. O método envolve a obtenção de um coquetel de degradação de plantas que compreende pelo menos dois extratos celulares, cada extrato celular possuindo um composto ativo de degradação de plantas que foi recombinantemente expresso em células das quais cada um dos referidos extratos celulares é derivado. Os (pelo menos) dois extratos celulares são extratos de planta ou extratos bacterianos, ou uma combinação de ambos. 0 coquetel de degradação de plantas é misturado com a amostra de biomassa para a liberação de açúcares fermentáveis. Em uma modalidade mais específica, o coquetel de degradação de plantas inclui extratos celulares que

8/85 incluem enzimas de degradação de plantas como, por exemplo, celulase, ligninase, beta-glicosidase, hemicelulase, xilanase, alfa-amilase, amiloglicosidase, pectato liase, lipase, alfa-amilase maltogênica, pectoliase, ou compostos que facilitam o acesso dessas enzimas, ou os denominados compostos de degradação de plantas acessórios, que incluem, sem limitação, cutinase ou expansina (por exemplo, swolenina). Os inventores verificaram que esses compostos de degradação de plantas acessórios servem para facilitar a ação de enzimas de degradação de plantas que elevam sinergicamente a quantidade de açúcares fermentáveis produzida para certa amostra de biomassa.

Extratos de células de planta incluirão, na maioria dos casos, uma quantidade de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase oxigenase (rubisco) das células de plantas das quais os extratos de células de planta são derivados. Rubisco é a enzima mais prevalente no planeta, sendo responsável por 30-50% da proteína solúvel total no cloroplasto; ela fixa dióxido de carbono, mas a atividade de oxigenase limita severamente a fotossíntese e produtividade do cultivo (Ogren, W.L. (2003) Photosynth. Res. 76, 53-63, 2. Spreitzer, R.J. e Salvucci, M.E. (2002) Annu. Rev. Plant Biol. 53, 449-475). Rubisco consiste em oito subunidades grandes (LSUs) e oito subunidades pequenas (SSUs) . A SSU é importada do citosol, e ambas as subunidades passam por várias modificações pós-tradução antes da montagem em holoenzima funcional (Houtz, R.L. e Portis, A.R. (2003) Arch. Biochem. Bíophys. 414, 150-158).

O uso de transformação genética de plantas geralmente não é considerado uma alternativa viável aos processos

9/85 convencionais de fermentação para a produção de enzimas de degradação de plantas à luz do fato de que as proteínas expressas seriam deletérias à vida e ao crescimento da planta. Os inventores esforçaram-se para criar um método de expressão de enzimas de degradação de plantas de tal forma que não rompa a célula da planta. Os inventores acreditam que a presente invenção seja a primeira demonstração da expressão viável de uma enzima de degradação de plantas em plantas. Os inventores perceberam que a expressão de muitas enzimas de degradação de plantas pode ser expressa em cloroplastos, sem efeitos adversos na planta. Os cloroplastos parecem isolar a célula da planta de danos decorrentes das enzimas. Embora a expressão em cloroplastos seja aqui exemplificada, a menos que especificamente definido, as modalidades da presente invenção não devem ser consideradas como estando limitadas à expressão em cloroplasto de enzimas de degradação de plantas. Algumas modalidades estão relacionadas a uma combinação de extratos de plantas e bacterianos de células criadas geneticamente para expressar recombinantemente um composto de degradação de plantas(s).

O termo expresso recombinantemente, como aqui usado, refere-se à produção de um polipeptídeo a partir de um polinucleotídeo que é heterólogo à célula na qual o polinucleotídeo foi transfectado. A expressão recombinante pode resultar de polinucleotídeos heterólogos que são transformados estavelmente no genoma da célula, ou no genoma da organela da célula, ou que simplesmente estão presentes na célula por meio de um evento de transfecção.

O termo cloroplasto é interpretado de forma ampla

10/85 para cobrir todos os plastídios, incluindo proplastídios, etioplastos, cloroplastos maduros e cromoplastos.

Um sistema de celulase abrangente consiste em endoglucanases, celobiohidrolases e beta-glicosidases. As celobiohidrolases e endoglucanases funcionam sinergicamente para degradar a celulose em celobiose, que é então hidrolisada em glicose pelas beta-glicosidases. A atividade de celobiase, ou beta-glicosidase, é responsável pela formação de glicose a partir de celobiose e tem um papel importante na degradação de celulose por liberação da inibição do produto final (celobiose). As sequências gênicas para a maioria dessas enzimas, de diferentes microorganismos, foram depositadas em bases de dados públicas.

Pectinas, ou substâncias pécticas, são nomes coletivos para uma mistura de polissacarídeos heterogêneos, ramificados e altamente hidratados presentes como um dos componentes principais nas paredes de células de plantas. Esses polissacarídeos compreendem principalmente açúcares neutros, por exemplo, arabinano, galactano, andarabino galactano. Preparações de enzimas pectolíticas ativas possuem as seguintes enzimas: duas alfa-L-ramnohidrolases, poligalacturonase, pectina metilesterase, endo-pectato liase (pectina-transeliminase), pectina liase e um pequeno percentual de xilanase. A sequência de nucleotídeos para enzimas de degradação de pectina, xilanases, celulases, estão disponíveis em bases de dados públicas. Veja o Exemplo 9 dessa especificação para uma discussão sobre sequências.

inventor percebeu que as necessidades de enzima são

11/85 muito diferentes para cada tipo de biomassa usada na produção de etanol celulósico. Consequentemente, certas modalidades da presente invenção estão relacionadas aos coquetéis de enzimas obtidos a partir da expressão em plantas e/ou expressão em bactérias que os inventores desenvolveram como sendo particularmente eficazes para o material de biomassa visado.

As fontes de biomassa que podem ser degradadas para a produção de etanol de acordo com os ensinamentos aqui apresentados incluem, sem limitação, grãos como, por exemplo, milho, trigo, centeio, cevada e os resíduos de grãos obtidos a partir destes (primariamente material residual como, por exemplo, talos, folhas e cascas), beterraba, cana de açúcar, gramas como, por exemplo, capimelefante e Miscanthus, madeiras como, por exemplo, árvores de álamo, eucalipto, salgueiro, liquidâmbar e robínia, entre outras, e resíduos florestais (por exemplo, lascas e serragem de serrarias) . Outras biomassas podem incluir, sem limitação, frutas, incluindo cítricos, e resíduos destes, por exemplo, casca de cítricos.

Ao longo deste documento, tabaco é citado como uma planta exemplar para a expressão de enzimas de degradação de plantas. No entanto, a menos que especificamente definido, as modalidades da invenção não devem ser consideradas como limitadas à expressão em tabaco. Os ensinamentos sobre expressão gênica aqui apresentados podem ser aplicados em uma ampla gama de plantas, que incluem, sem limitação, tabaco; alface, espinafre; girassol; cultivos de leguminosas como, por exemplo, soja, feijão, ervilhas e alfafa; tomate; batata; cenoura; beterraba;

12/85 cultivos de crucíferas; cultivos de fibras como, por exemplo, algodão; cultivos hortícolas como, por exemplo, gérbera e crisântemo; colza; e linhaça.

Em uma modalidade, genes de Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus, Trichoderma reesei e/ou Clostridium thermocellum que codificam classes diferentes de enzimas são isolados usando iniciadores gene-específicos. A fim de expressar classes diferentes de genes em um cloroplasto de interesse, as estratégias seguintes são usadas. O vetor de cloroplasto contém sequências flanqueadoras do genoma do cloroplasto para facilitar a recombinação homóloga. Em uma modalidade, genes estranhos são integrados individualmente na região espaçadora do genoma do cloroplasto. A sequência codificadora de diferentes enzimas pode ser regulada por sequências reguladoras apropriadas. Plasmídeos recombinantes serão bombardeados em tabaco para obter plantas transplastômicas.

Em uma modalidade específica, folhas de tabaco em pó são usadas como fontes de enzima para avaliação comercial de produção de etanol a partir de uma fonte de biomassa. Em uma modalidade mais específica, a fonte de biomassa é um grão como, por exemplo, milho, uma grama ou resíduos de cítricos.

Para cloroplastos que são transformados, percebeu-se que a obtenção de homoplasmia com relação aos cloroplastos transgênicos é desejada. A integração do transgene e homoplasmia são confirmadas por PCR e análise Southernblot, respectivamente. A Expressão dos transgenes é confirmada por análise western blot e quantificada por ELISA. 0 extrato de proteína de plantas transplastômicas de

13/85 tabaco é testado quanto à sua habilidade para degradar biomassa de resíduos de cítricos. Com base nos resultados,

mais classes de	enzimas	são	adicionadas	para aumentar a
degradação da	biomassa	de	planta	em	açúcares para
fermentação em	etanol.	Cada	planta	de	tabaco, criada
geneticamente para produzir	uma enzima,	será capaz de

produzir um milhão de sementes, para facilitar o aumento de escala até 100 acres, se necessário. Material homogeneizado de planta, por exemplo, folhas de tabaco em pó ou extratos de planta, ou enzimas purificadas de material de planta, é usado como a fonte de enzima para a avaliação comercial da produção de etanol a partir de resíduos de cítricos.

Embora os métodos atuais envolvam a colocação de um gene estranho no núcleo da célula de planta, CT transforma o genoma dos aproximadamente 100 cloroplastos que estão dentro de cada tabaco célula de planta. Cada cloroplasto da planta de tabaco contém cerca de 100 cópias do material genético do cloroplasto e, portanto, a quantidade de proteína (nesse caso, proteínas de enzima usadas para degradar a biomassa em açúcar para a produção de etanol) é aumentada exponencialmente. Esta é a razão primária pela qual a produção em volume maciço de enzimas de degradação da parede celular para a produção de etanol celulósico tem o custo tão compensador. Em segundo, o tabaco possui grande volume de biomassa (40 toneladas métricas de folhas por acre) e pode ser colhido várias vezes durante certa estação estivai de crescimento na Flórida. E, como mencionado previamente, é fácil plantar 100 acres a partir de uma única planta de tabaco. Por último, como os cloroplastos são herdados pela mãe, eles não são funcionais no pólen da

14/85 planta de tabaco.

De acordo com uma modalidade, a invenção pertence a um método de degradação de uma amostra de biomassa de planta para a liberação de açúcares fermentáveis. O método inclui a obtenção de um coquetel de degradação de plantas que possui pelo menos um genoma do cloroplasto ou segmento do genoma que possui um gene heterólogo que codifica celulase, ligninase, beta-glicosidase, hemicelulase, xilanase, alfaamilase, amiloglicosidase, pectato liase, cutinase, lipase ou pectoliase, ou uma combinação destas; e em que o referido material de planta possui celulase, ligninase, beta-glicosidase, hemicelulase, xilanase, alfa-amilase, amiloglicosidase, pectato liase, cutinase, lipase, alfaamilase maltogênica, pectoliase ou expansina, ou uma combinação destas, que foi expressa em uma planta da qual o referido material de planta é derivado; e mistura do referido material de degradação de planta com a referida amostra de biomassa. Em uma modalidade mais específica, a enzima ou combinação de enzimas pertence a mais de 0,1 por cento da proteína total no material de planta.

De acordo com outra modalidade, a invenção pertence a um método de produção de um material de degradação de biomassa de planta suficiente para a liberação de açúcares fermentáveis, o método incluindo a produção de pelo menos uma planta que compreende cloroplastos que expressam

celulase,	ligninase, beta-glicosidase, hemicelulase,
xilanase,	alfa-amilase, amiloglicosidase, pectato liase,
cutinase,	lipase, alfa-amilase maltogênica, pectoliase ou
expansina,	ou uma combinação destas; a colheita da referida
planta; e	o processamento da referida planta para produzir

15/85 uma fonte de enzima adequada para mistura e degradação de uma amostra de biomassa. Em uma modalidade específica, a planta é tabaco; alface, espinafre; girassol; cultivos de fibras como, por exemplo, algodão; cultivos hortícolas como, por exemplo, gérbera e crisântemo; cultivos de leguminosas como, por exemplo, soja, feijão, ervilhas, e alfafa; tomate; batata; beterraba; cultivos de crucíferas, incluindo colza; e linhaça. Em uma modalidade mais específica, a planta é tabaco.

Um aspecto da invenção é o fornecimento de uma fonte abundante barata de enzima para a degradação de biomassa. Consequentemente, o material de planta ou bacteriano no qual os compostos de degradação de plantas foram expressos pode ser processado por secagem e pulverização da planta ou uma porção desta. Em outra modalidade, extratos líquidos brutos são produzidos a partir do material de planta e/ou bacteriano. Em modalidades alternativas, o material de degradação de planta pode ser enzimas que foram purificadas total ou parcialmente da planta e/ou bactérias nas quais são expressas. No entanto, o fornecimento do material de degradação de planta como uma forma seca ou como extrato bruto do material de planta e/ou bacteriano evita a necessidade de etapas de purificação demoradas e potencialmente caras. Dessa forma, o material de planta possui uma vida útil mais longa e pode facilmente ser misturado com a amostra de biomassa de planta de acordo com processos convencionais de degradação e fermentação de plantas.

Em uma modalidade específica, o método de produção de a planta envolve a produção de uma primeira planta com

16/85 cloroplastos transformada para expressar uma primeira enzima e uma segunda planta com cloroplastos transformada para expressar uma segunda enzima. O material de planta da

primeira	e da segunda plantas pode ser combinado para
produzir	uma amostra de degradação de planta que inclui
mais de	uma enzima de degradação de plantas. Em uma

modalidade mais específica, a invenção pertence a um método de produção de uma planta que envolve pelo menos dois dos seguintes: produção de uma primeira planta que compreende cloroplastos que expressam celulase, produção de uma segunda planta que compreende cloroplastos que expressam ligninase, produção de uma terceira planta que compreende cloroplastos que expressam beta-glicosidase; produção de uma quarta planta que compreende cloroplastos que expressam hemicelulase; produção de uma quinta planta que compreende cloroplastos que expressam xilanase; produção de uma sexta planta que compreende cloroplastos que expressam alfaamilase; produção de uma sétima planta que compreende cloroplastos que expressam amiloglicosidase; produção de uma oitava planta que compreende cloroplastos que expressam pectato liase; produção de uma nona cloroplastos que expressam cutinase;

planta que compreende cloroplastos planta que compreende produção de uma décima que expressam lipase;

produção de uma décima primeira planta que compreende cloroplastos que expressam alfa-amilase maltogênica, produção de uma décima segunda planta que compreende cloroplastos que expressam pectoliase e/ou uma décima terceira planta que compreende cloroplastos que expressam expansina (por exemplo, swolenina).

Como citado acima, os inventores reconheceram que, de

17/85 acordo com certas modalidades, enzimas derivadas de plantas são aumentadas com enzimas de degradação de plantas expressas recombinantemente em bactérias.

Dessa forma, um coquetel de degradação de plantas pode incluir enzimas expressas recombinantemente em plantas e enzimas que são expressas recombinantemente em bactérias, como, por exemplo, sem limitação, E. coli.

De acordo com uma modalidade adicional, a invenção pertence a um material de planta útil para a degradação de uma biomassa de planta, o material incluindo pelo menos um genoma do cloroplasto ou segmento do genoma que possui um gene heterólogo que codifica celulase, ligninase, betaglicosidase, hemicelulase, xilanase, alfa-amilase, amiloglicosidase, pectato liase, cutinase, lipase, alfaamilase maltogênica, pectoliase ou expansina, ou uma compreende celulase, hemicelulase, xilanase, pectato liase, cutinase, pectoliase ou expansina, que o referido material de planta ligninase, alfa-amilase, beta-glicosidase, amiloglicosidase, lipase, alfa-amilase maltogênica, ou uma combinação destas. Em uma modalidade mais específica, o material de planta inclui pelo menos dois dos seguintes: um primeiro genoma do cloroplasto ou segmento do genoma que possui um gene heterólogo que codifica celulase, um segundo genoma do cloroplasto ou segmento do genoma que possui um gene heterólogo que codifica ligninase, um terceiro genoma do cloroplasto ou segmento do genoma que possui um gene heterólogo que codifica beta-glicosidase; um quarto genoma do cloroplasto ou segmento do genoma que possui um gene heterólogo que codifica hemicelulase; um quinto genoma do

18/85

cloroplasto	ou	segmento	do	genoma	que	possui	um	gene
heterólogo	que	codifica	xilanase;	um	sexto genoma do
cloroplasto	ou	segmento	do	genoma	que	possui	um	gene
heterólogo	que	codifica alfa-	amilase;	um	sétimo	genoma do
cloroplasto	ou	segmento	do	genoma	que	possui	um	gene

heterólogo que codifica amiloglicosidase; um oitavo genoma do cloroplasto ou segmento do genoma que possui um gene heterólogo que codifica pectato liase; um nono genoma do cloroplasto ou segmento do genoma da planta que possui um gene heterólogo que codifica cutinase; um décimo genoma do cloroplasto ou segmento do genoma que possui um gene heterólogo que codifica lipase; um décimo primeiro genoma do cloroplasto ou segmento do genoma que codifica alfaamilase maltogênica, um décimo segundo genoma do cloroplasto ou segmento do genoma que possui um gene heterólogo que codifica pectoliase e um décimo terceiro genoma do cloroplasto ou segmento do genoma que possui um gene heterólogo que codifica expansina (por exemplo, swolenina).

De acordo com outra modalidade, a invenção pertence a uma planta que possui uma célula de planta que possui uma quantidade acima da quantidade natural de celulase, ligninase, beta-glicosidase, hemicelulase, xilanase, alfaamilase, amiloglicosidase, pectato liase, cutinase, lipase pectoliase ou expansina, ou uma combinação destas; e em que o referido material de planta compreende uma enzima celulase, xilanase, cutinase, ligninase, beta-glicosidase, hemicelulase, alfa-amilase, amiloglicosidase, pectato liase, lipase, pectoliase ou expansina ativa, ou uma combinação destas. Em uma modalidade mais específica, a

19/85 enzima ou combinação de enzimas representa mais de 0,1 por cento da proteína total da célula. Em uma modalidade ainda mais específica, a enzima ou combinação de enzimas representa mais de 1,0 por cento da proteína total na célula.

Em uma modalidade adicional, a invenção pertence a uma composição derivada de planta que compreende celulase, ligninase, beta-glicosidase, hemicelulase, xilanase, alfaamilase, amiloglicosidase, pectato liase, cutinase, lipase, alfa-amilase maltogênica, pectoliase e/ou swolenina, e uma quantidade de rubisco. Em uma modalidade específica, a proporção de rubisco para enzima varia de 99:1 a 1:99.

Em uma modalidade adicional, a invenção pertence a cultivares comerciais que expressam recombinantemente um ou mais compostos de degradação de plantas. Cultivares comerciais de tabaco como, por exemplo, sem limitação, LAMD e TN90, produzem substancialmente mais material de folha do que cultivares experimentais. No entanto, cultivares comerciais são mais sensíveis à introdução de genes estranhos. Surpreendentemente, o inventor, através de experimentação e erro significativos, foi capaz de transfectar com sucesso células e induzir a expressão de compostos de degradação de plantas em cultivares comerciais.

Exemplos

Exemplo 1: Montagem de construções de expressão em cloroplasto

Para a integração de transgenes, foi usada uma região espaçadora ativa em termos de transcrição entre os genes trnl e trnA (Fig. Ia) . PCR resultou na amplificação de

20/85 vários genes de interesse (GOI), incluindo endoglucanase (celD), exoglucanase (ceio) de DNA genômico de Clostridium thermocellum, lipase (lipY) de DNA genômico de

Mycobacterium tuberculosis, pectato liases (pelA, pelB, pelD) e cutinase de Fusarium solani. Usando um novo método baseado em PCR, as sequências codificadoras de GOI, incluindo endoglucanases (egrll e egrl) , swolenina (swol similar às expansinas), xilanase (xyn2) , acetil xilana esterase (axel) e beta-glicosidase (bgrll) , foram clonadas sem íntrons (que variam de 1-5) de DNA genômico de

Trichoderma ressei. Vetores de transformação do cloroplasto de tabaco foram feitos com cada GOI (Fig. lb) . Todos os vetores de cloroplasto incluíam as sequências flanqueadoras 16S trnl/trnA para recombinação homóloga nas regiões de repetição invertidas do genoma do cloroplasto e o gene aadA que confere resistência à espectinomicina. O gene aadA foi dirigido pelo promotor constitutivo de óperon de rRNA com sítio de ligação de ribossomo GGAGG. 0 GOI foi dirigido pelo promotor psbA e UTR 5' a fim de obter níveis elevados de expressão. A UTR 3' localizada na extremidade 3' do GOI conferia estabilidade ao transcrito.

Exemplo 2: Geração e caracterização de tabaco transplastômico que expressa pectato liases (PelB & PelD) e endoglucanase (CelD)

Plantas transplastômicas de tabaco foram obtidas como descrito previamente ^28,29 . Análise Sou thern-blot foi realizada para confirmar a integração sítio-específica dos cassetes pLD-pelB, pLD-pelD e pLD-celD no genoma do cloroplasto e para determinar homoplasmia. A digestão do DNA total da planta com SmaT de linhagens não transformadas

21/85 e transplastômicas gerou um fragmento de 4,014 kb não transformado (UT) ou um fragmento de 6,410 kb em pelB,

6,377 kb em pelD ou 7,498 kb em celD quando hibridizado com

a sonda	trnl - trriA	marcada com	[³²P] , confirmando a
integração	sítio-específica dos	transgenes	na	região
espaçadora	entre os	genes trnl e	trnA (Fig.	lc-e)	. Além

disso, a ausência de um fragmento de 4,014 kb nas linhagens transplastômicas confirmou que a homoplasmia foi obtida (dentro dos níveis de detecção). Os fenótipos de linhagens transplastômicas pareciam normais quando comparados com plantas não transformadas e eram férteis (produziram flores, sementes, Fig. lf) .

com anticorpos despertados contra

mostraram

PelB

estão imunologicamente relacionados a

PelA³⁰

Portanto, anticorpo

PelA

usado para detectar a expressão de

PelB e PelD, embora sua afinidade fosse variável em linhagens transplastômicas. Todas as linhagens transplastômicas mostraram expressão da proteína PelB ou PelD. Os níveis de expressão não se alteraram significativamente, correspondendo à sua atividade enzimática, dependendo do tempo de colheita, muito embora PelB e PelD sejam regulados pela luz (Fig. 2a,b). Isso pode ser por causa da afinidade variável entre epítopos antigênicos do anticorpo de PelB, PelD e PelA. A concentração da enzima se alterou ligeiramente com a idade da folha e diminuía em folhas mais velhas (Fig. 2a,b).

Exemplo 3: Quantificação de pectato liases (PelB, PelD), e endoglucanase (CelD) em momentos diferentes da colheita e idade da folha

A atividade da enzima variou significativamente,

22/85 dependendo dos estágios do desenvolvimento e do momento da colheita da folha. A atividade enzimática máxima foi observada em folhas maduras de PelB, PelD e CelD, com atividade reduzida em folhas mais velhas (Fig. 2c,d). As folhas maduras colhidas às 6 da tarde mostraram atividade máxima tanto em PelB quanto em PelD, enquanto CelD mostrou atividade máxima às 10 da noite (Fig. 2c,d) . Isso pode ser causado pela estabilidade aumentada da endoglucanase contra proteases em extratos de planta. A atividade de cpCelD não diminuiu significativamente em extratos brutos de plantas armazenados em temperatura ambiente, por mais de trinta dias (dados não mostrados).

A atividade enzimática de CelD foi calculada usando o reagente de DNS ³¹ de acordo com o protocolo de IUPAC ³². A atividade específica de cpCelD usando substrato de CMC 2% era de 493 unidades/mg de proteína solúvel total (TSP) ou 100 mg de tecido de folha, em extratos brutos preparados a partir de folhas maduras colhidas às 10 da tarde. Usando o ensaio de glicose hexoquinase, que é altamente específico para glicose, a atividade específica foi de 4,5 unidades/mg de TSP e 6,28 unidades/mg de TSP, quando avicel 5% e solução sigmacell, respectivamente, eram usados como substrato (em pH 6,0, 60°C). A enzima celulase comercial (Trichoderma reesei, EC 3.2.1.4, Sigma) gerou 4,2 unidades/mg e 3,43 unidades/mg de sólido para o mesmo substrato. As Figuras 2c e 2d mostram que aproximadamente 26 unidades, 32 unidades e 4.930 unidades de PelB, PelD e CelD foram obtidas por grama de peso fresco de folhas maduras colhidas às 6 da tarde ou 10 da tarde. Dessa forma, 2.048, 2.679 e 447.938 unidades de PelB, PelD e CelD podem

23/85 ser colhidas a partir de cada planta de tabaco (cultivar experimental, Petit Havana). Com 8.000 plantas de tabaco desenvolvidas em um acre de terra, 16, 21 e 3.584 milhões de unidades de PelB, PelD ou CelD podem ser obtidas por corte único (Tabela 1) . Com base em três cortes de tabaco em um ano, até 49, 64 e 10.751 milhões de unidades de PelB, PelD ou CelD podem ser colhidas a cada ano. O cultivar comercial gera 40 toneladas métricas biomassa de folhas frescas, em contraste com 2,2 tons no cultivar experimental Petit Havana. Portanto, espera-se que o cultivar comercial gere rendimentos 18 vezes maiores do que o cultivar experimental.

Exemplo 4: Efeito do pH e da temperatura sobre a atividade enzimática de pectato liases (PelB e PelD) e endoglucanase (CelD)

Tanto extratos de planta quanto de E. coli mostraram atividade ótima a 2,5 mg/ml de PGA (Fig. 3a). Portanto, todos os estudos de caracterização de enzima foram realizados nessa concentração de substrato. Estudos de cinética realizados pela utilização de 4 pg de TSP, com

concentrações crescentes de PGA (0-2,5 mg),	sob condições
de ensaio padronizadas,	geraram	valores de	Km	de 0,39 e
1,19 pg/ml em PelB de	cloroplasto (cp) e	E.	coli (r),
respectivamente, enquanto os	valores para	PelD de
cloroplasto e E. coli	foram	de 0,50 e	1,	29 pg/ml,

respectivamente. Os valores de Vmax obtidos foram de 2,75, 3,19, 2,75 e 3,14 unidades/mg para cpPelB, rPelB, cpPelD e rPelD, respectivamente (Fig. 3a).

O extrato bruto (4-5 pg de TSP) de planta ou E. coli foi usado para estudar o efeito do pH e da temperatura

24/85 sobre a atividade das enzimas. A temperatura ótima para a pectato liase de E. coli e cloroplasto derivada sob as condições de ensaio padronizadas foi de 40°C, e o pH ótimo foi de 8,0. As pectato liases derivadas de plantas mostraram um pH ótimo de 6,0 na presença de 1 mM de CaCl₂. Os extratos brutos de E. coli mostraram um pH ótimo de 8,0, independentemente da presença ou ausência de CaCl₂ na reação (Fig. 3b,c). O aumento da temperatura teve um efeito mínimo sobre a atividade de pectato liases derivadas de plantas, enquanto a enzima de E. coli mostrou atividade comparativamente menor em temperaturas mais elevadas (Fig.

d,e) . Essas diferenças nas propriedades da enzima de dois hospedeiros diferentes podem ser causadas por seu enovelamento. Essa possibilidade era apoiada pela observação de que foi possível detectar a enzima de E. coli com anticorpo com tag HIS, mas não a enzima do cloroplasto (dados não mostrados). É sabido que proteínas estranhas formam ligações dissulfeto em cloroplastos 33.35, mas não em E. coli, quando expressas no citoplasma. As enzimas PelB e PelD possuem um número semelhante (12 ou 14) de cisteínas que poderíam formar ligações dissulfeto ³⁰.

A atividade de CpCelD com CMC 2% foi medida em pHs e temperaturas diferentes. A cpCelD mostrou pH ótimo entre pH 5,0 e pH 7,0 (Fig. 3f) , enquanto a enzima de E. coli teve um pH ótimo de 6,5. A temperatura ótima foi entre 50-60°C para E. coli e 50-70°C para enzima de planta (Fig. 3g) . CelD de Clostridium thermocellum é estruturalmente conhecida por ter afinidade por íons CaCl₂ e também fornecia termoestabilidade ³⁶. Embora 10 mM de CaCl₂aumentassem a atividade de CelD em CMC 2% até 2 vezes no

25/85 extrato bruto de E. coli, isso não era evidente na CelD do extrato bruto de cloroplasto durante período inicial de incubação. Isso pode ser causado pela concentração ótima de íon cálcio presente em células de plantas. No entanto, CaCl₂ com 20 pg de BSA gerou uma atividade aumentada em 5 vezes ao final da incubação de 24 horas para extrato bruto de cpCelD (Fig. 3h).

Exemplo 5: CelD, PelB e PelD de E. coli vs. de cloroplasto

O extrato bruto de E. coli contendo enzima CelD mostrou diminuição da atividade enzimática quando a mistura de reação continha mais de 10 pg de TSP, em que os extratos brutos de plantas contendo CelD liberaram mais açúcar redutor com concentrações crescentes de proteína (Fig. 4a). A atividade de CelD expressa em cloroplasto foi saturada (em CMC 2%) a 150 pg de TSP (Fig. 4a, detalhe) e não houve diminuição da atividade enzimática de CelD do cloroplasto em até 500 pg de TSP, como determinado pelo ensaio do ponto final. Esses resultados mostram que extratos de plantas brutos contendo cpCelD podem ser usados diretamente para degradação de biomassa, sem qualquer necessidade de purificação, enquanto extratos de E. coli provavelmente contêm inibidores de endoglucanase. Similarmente, em concentrações maiores de proteína, rPelB e rPelD expressas por E. coli mostraram atividade de pectato liase reduzida, enquanto cpPelB ou cpPelD continuaram a aumentar a atividade até 600 pg de TSP (Fig. 4b) . Podem existir inibidores de pectato liase em extratos de E. coli, que não estão presentes em extratos brutos de plantas. Esse achado é potencialmente de alto significado prático, pois o uso de extratos brutos elimina a necessidade de purificação de

26/85 enzimas. Grandes quantidades de enzima bruta de planta podem ser utilizadas no coquetel, como mostrado abaixo, sem causar efeitos prejudiciais sobre a atividade enzimática, hidrólise ou rendimento dos produtos finais.

Exemplo 6: Coquetel de enzimas para hidrólise de papel de filtro

Antes da avaliação dos coquetéis de enzimas, a atividade de cada enzima foi testada independentemente com um substrato apropriado. Endoglucanase expressa no cloroplasto ou em E. coli (cpCelD ou rEgl) isoladamente não liberou nenhuma glicose detectável do papel de filtro, mas quando misturadas juntas, foi observada até 19% da hidrólise total (Fig. 5a, barra 1). Isso poderia ser causado por diferentes domínios de ligação de carboidrato de endoglucanases em direção ao papel de filtro. A atividade sinérgica ainda era aumentada em até 47 ou 48% quando as endoglucanases (cpCelD e rEgl) foram misturadas com swolenina (rSwol) ou beta-glicosidase (rBgll, Fig. 5a, barras 2 e 3). A adição de celobiohidrolase (rCelO) a esse coquetel duplicou a hidrólise de papel de filtro, liberando uma quantidade máxima de açúcar redutor (Fig. 5a, barra 4). Esses sinergismo observado era provavelmente causado pelo modo de ação exo da celobiohidrolase ³⁷ pelas extremidades redutoras que eram formadas por cortes aleatórios nas cadeias de celulose por meio das endoglucanases (cpCelD e rEgl) , juntamente com a ação de expansina e betaglicosidase .

Exemplo 7: Coquetel de enzimas para hidrólise de amostra de madeira processada

O coquetel de enzimas que liberou os maiores

27/85 equivalentes de glicose com papel de filtro (exceto rEgl) foi testado em substrato de madeira processada. Após hidrólise por 24 horas, 31% da hidrólise total foram observadas com esse coquetel (Fig. 5b, barra 1). Um coquetel de enzimas de endoxilanase e acetil xilana esterase mostrou 41% de hidrólise total (Fig. 5b, barra 2). Quando esses dois coquetéis foram combinados juntos, a hidrólise aumentou até 88% (Fig. 5b, barra 3) . Quando o substrato de madeira processada primeiro foi tratado com pectato liases, seguido pela adição do coquetel de enzimas na barra 3, a hidrólise global foi aumentada ainda mais, com liberação de até 275 pg de glicose após incubação por 36 horas (Fig. 5b, barra 4). A adição de extratos de enzima de cutinase e lipase (ambos com atividade de lipase) não teve um efeito significativo sobre a liberação de açúcares fermentáveis (dados não mostrados). 0 coquetel de enzimas Novozyme 188 não gerou quaisquer equivalentes de glicose detectáveis a partir da madeira processada, enquanto Celluclast 1.5L gerou 10% mais do que o coquetel de extrato bruto, com unidades equivalentes de enzima com base na hidrólise de CMC.

De acordo com uma modalidade, a invenção pertence a um método para a digestão de uma amostra de biomassa à base de madeira que compreende a obtenção de um material de planta que compreende endoxilanase ou acetil xilana esterase, ou uma combinação destas, que foi expressa em uma planta da qual todo ou uma porção do referido material de planta é derivada; e mistura do referido material de planta com a referida amostra de biomassa à base de madeira. O método dessa modalidade pode ainda incluir a mistura com a amostra

28/85 de biomassa à base de madeira, antes ou simultânea à mistura com o material de planta de endoxilanase e/ou acetil xilana esterase, um material de planta que compreende uma pectato liase que foi expresso em uma planta da qual todo ou uma porção do referido material de planta é derivada. O material de planta pode compreender rubisco.

Outra modalidade pertence a um coquetel de enzimas de degradação de plantas útil na digestão de uma amostra de biomassa à base de madeira que compreende celulase, beta glicosidase, xilanase, alfa-amilase, amiloglicosidase, pectina liase, swolenina ou pectato liase, ou uma combinação destas, expressas em uma planta, opcionalmente com uma quantidade de rubisco.

Exemplo 8: Coquetel de enzimas para hidrólise de resíduos de cítricos coquetel de enzimas de endoglucanase (cpCelD), exoglucanase, swolenina e beta-glicosidase liberou até 24% de hidrólise total com casca de cítricos (Fig. 5c, barra 1) . Quando a casca de cítricos foi tratada com pectato liases (cpPelB, cpPelD e rPelA), a hidrólise foi duplicada (Fig. 5c, barra 2) . Pectato liases contribuirão para até 47% de hidrólise total nesse coquetel, por causa do alto teor de pectina (23%) na casca de cítricos ⁴¹. A adição de endoxilanase, acetil xilana esterase, cutinase e lipase a ambos esses coquetéis liberou até 360 pg/ml de equivalentes de glicose de 100 mg de casca de cítricos moída após um período de incubação de 24 horas (Fig. 5c, barra 3) . Enzimas como cutinase e lipase podem ter hidrolisado corpos oleosos presentes na casca de cítricos, fornecendo maior acesso às endoglucanase, endoxilanase e pectato liases para

29/85 uma hidrólise eficiente da casca de cítricos. O coquetel de enzimas Novozyme 188 gerou 11% mais equivalentes de glicose com casca de cítricos, enquanto Celluclast 1.5L gerou 137% mais do que o coquetel de extrato bruto com unidades de enzima equivalentes com base na hidrólise de CMC.

De acordo com uma modalidade, a invenção pertence a um método para a digestão de uma amostra de biomassa de cítricos que compreende a obtenção de um material de planta que compreende celulase, beta-glicosidase, xilanase, alfaamilase, amiloglicosidase, pectina liase ou pectato liase, ou uma combinação destas, que foi expressa em uma planta da qual todo ou uma porção do referido material de planta é derivada; e mistura do referido material de planta com a referida amostra de biomassa de cítricos.

Outra modalidade pertence a um coquetel de enzimas de degradação de plantas útil na digestão de uma amostra de biomassa de cítricos que compreende celulase, betaglicosidase, xilanase, alfa-amilase, amiloglicosidase, pectina liase, swolenina ou pectato liase, ou uma combinação destas, expressas em uma planta, opcionalmente com uma quantidade de rubisco.

Métodos relacionados aos Exemplos 1-8

Isolamento de genes e construção de vetores de transformação de plastídio

DNA genômico de Clostridium thermocellum e Trichoderma

reesei foi	obtido	de	ATCC	e usado	como modelo	para a
amplificação	de	diferentes genes	•	Foram designados
iniciadores	gene-específicos	usando	um	iniciador	direto
(forward) contendo	um	sítio	NdeT e	um	iniciador	reverso
contendo um	sítio	Xbal	para	clonagem	no	vetor pLD	para os

30/85 genes celO, celO e lipY. A região madura de genes de celulose celD (X04584) e celO (AJ275975) foi amplificada a partir de DNA genômico de Clostridium thermocellum. LipY (NC_000962) foi amplificado a partir do DNA genômico de Mycobacterium tuberculosis. Foram designados iniciadores superpostos para a amplificação de vários éxons de egll (M15665) , egl (AB003694) , swol (AJ245918) , axel (Z69256) , xyn2 (X69574) e bgll (U09580) a partir do DNA genômico de Trichoderma reesei usando um novo método. O cDNA de comprimento total desses genes foi amplificado a partir de éxons diferentes por um novo método baseado em PCR usando o iniciador direto do primeiro éxon e reverso do último éxon contendo um sítio Ndel e sítio XbaT, respectivamente. Os genes de pectato liase peíA, pelB e pelO de Fusarium solani com sítios de restrição similares foram amplificados usando iniciadores gene-específicos de pHILD2A, pHILD2B ³⁰ e pHILD2D ⁴⁵, respectivamente. Uma estratégia similar foi usada para amplificar o gene de cutinase ^4S a partir do clone recombinante de Fusarium solani. Todos os produtos de comprimento total amplificados foram ligados ao vetor pCR Blunt II Topo (Invitrogen) e foram submetidos ao sequenciamento de DNA (Genewiz). Cada gene clonado no vetor Topo foi digerido com NdeT/XbaT e inserido no vetor pLD ^17,47 para fazer um vetor de expressão de tabaco em cloroplasto.

Regeneração de plantas transplastômicas e avaliação da integração do transgene por PCR e Southern-blot

Nicotiana tabacum var. Petite Havana foi desenvolvida assepticamente em meio de ágar de Murashige e Skoog (MS) sem hormônios contendo 30 g/l de sacarose. Folhas jovens

31/85 estéreis de plantas nos estágios de 4-6 folhas foram bombardeadas usando partículas de ouro revestidas com vetor pLD-PelB, pLD-PelD e pLD-CelD, e as plantas transplastômicas foram regeneradas como descrito previamente ^28,29 . o DNA genômico da planta foi isolado usando o mini kit de planta Qiagen DNeasy a partir de folhas. A análise por PCR foi realizada para confirmar a integração do transgene nas regiões de repetição invertidas do genoma do cloroplasto usando dois conjuntos de iniciadores 3P/3M e 5P/2M, respectivamente ¹⁷. A reação de PCR foi realizada como descrito previamente ^17,29. As folhas dos brotos PCR-positivos foram novamente cortadas em pequenos pedaços e transferidas em meio RMOP (meio de regeneração de plantas) contendo 500 mg/1 de espectinomicina para outra rodada de seleção, e subsequentemente movidas para meio MSO (sais MS sem vitaminas e hormônios de crescimento) contendo 500 mg/1 de espectinomicina para outra rodada de seleção para gerar linhagens homoplásmicas. Análise Southern-blot foi realizada para confirmar a homoplasmia de acordo com o protocolo do lab ⁴⁸. Resumidamente, o DNA genômico total de planta (1-2 pg) isolado de folhas foi digerido com SmaT e hibridizado com sonda da sequência flanqueadora de cloroplasto marcada com ³²P a[dCTP] (0,81 kb) contendo os genes trnl-trnA. A hibridização foi realizada pela utilização da solução e do protocolo de hibridização Stratagene QUICK-HYB.

Análise imunoblot

Aproximadamente 100 mg de folhas foram moídos em nitrogênio líquido e usados para análise imunoblot, como

32/85 descrito previamente ⁴⁸. A concentração de proteína foi determinada pelo kit de reagente de ensaio de proteína de Bradford (Bio-Rad). Quantidades iguais de proteína solúvel total foram separadas por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A expressão de proteína transgênica foi detectada usando soro policlonal despertado contra PelA em coelhos.

Preparação enzimática de E. coli (bruta)

E. coli cepa (XL-10 gold) que abriga a expressão em vetores de cloroplasto que expressam rCelD, rEgl (EC 3.2.1.4), rCelO (EC 3.2.1.91), rXyn2 (EC 3.2.1.8), rAxel (EC 3.1.1.72), rBgll (EC 3.2.1.21), rCutinase (EC 3.1.1.74), rLipY (lipase, EC 3.1.1.3), rPelA, rPelB, rPelD (EC 4.2.2.2) ou rSwol foi desenvolvida de um dia para o outro a 37°C. As células foram coletadas a 4°C e sonifiçadas quatro vezes com pulsos de 30 s no tampão adequado (50 mM de tampão de acetato de sódio com pH 5,5 para CelD, Egl, CelO, Swol, Xyn2, Axel, Bgll, 100 mM de Tris-Cl com pH 7,0 para cutinase, lipase, PelA, PelB e PelD) contendo coquetel inibidor de protease (Roche) e azida de sódio (0,02%). O sobrenadante foi coletado após centrifugação a 16.000 x g por 10 minutos e a concentração de proteína foi determinada.

Preparação enzimática a partir de material de folha transplastômica de tabaco

Folhas verdes frescas foram coletadas e moídas em nitrogênio líquido. A proteína solúvel total foi extraída em 50 mM de tampão de acetato de sódio, pH 5,5 para cpCelD, cpXyn2, ou 100 mM Tris-Cl tampão, pH 7,0 para PelD e PelB. Todos os tampões continham coquetel inibidor de protease

33/85 (Roche) e azida de sódio (0,02%). A proteína solúvel total foi filtrada usando um filtro de seringa de 0,22 pm. A concentração de proteína (mg/ml) em TSP foi determinada usando o método de Bradford.

Ensaios enzimáticos para pectato liase B e pectato liase D

Pectato liases B e D foram avaliadas espectrofotometricamente por medida do aumento em A₂₃₅30,49,50 _As cinéticas das pectato liases B e D foram estudadas para otimizar a concentração de substrato (0-2,5 mg) sob concentrações idênticas de proteína e cofator. As misturas de reação continham 1 ml de 50 mM de tampão de Tris-HCl (pH 8,0) com 1 mM de CaCl₂ (recém-preparado) , 1 ml de 0,0-2,5 mg/ml de poligalacturonato de sódio (Sigma) e 0,5 ml de solução de enzima adequadamente diluída. As medidas foram realizadas a 40°C. Uma unidade de enzima foi definida como a quantidade de enzima que forma 1 pmol de produto por min com um coeficiente de extinção molar de 4.600 pmol'¹ cm'¹. Os estudos da cinética foram realizados em 50 mM de tampão de Tris-HCl, pH 8,0 a 40°C. Os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) foram calculados usando regressão não linear com o uso do software Graphpad Prism 5.0. As inclinações iniciais de cada concentração de substrato foram calculadas, em que a velocidade (unidades/mg/min) foi definida através da liberação de ácido galacturônico não saturado. A otimização da temperatura para atividade de pectato liase B e D foi realizada em 50 mM de tampão de Tris-HCl, pH 8,0, em diferentes temperaturas que variam de 30°C a 70°C. Em cada caso, o substrato foi pré-incubado na temperatura desejada

34/85 por min. A fim de estudar a estabilidade térmica da enzima, amostras tamponadas de enzima foram incubadas por um período de tempo fixo em diferentes temperaturas.

O pH ótimo da pectato liase B e D foi medido a 40°C usando diferentes tampões com pH variando de 6 a 10, com a mesma potência iônica. A estabilidade do extrato bruto da enzima foi otimizada por incubação da enzima nos diferentes pHs. A influência do cofator CaCl₂ sobre a atividade da pectato liase foi estudada por realização das reações em sua presença e ausência em diferentes pHs e temperaturas.

Ensaio enzimático para CelD e coquetel comercial (Celluclast 1.5L e Novozyme 188)

A atividade enzimática de celulase de cpCelD foi determinada por incubação do extrato bruto em carboxilmetilcelulose 2%, avicel e sigmacell (Sigma) como substrato de acordo com as recomendações IUPAC ³² em 50 mM de tampão de acetato de sódio pH 6,0, e incubada a 60°C por 3 0 minutos para CMC e 2 horas para avicel e sigmacell. As unidades de enzima de coquetéis comerciais Celluclast 1.5L e Novozyme 188 foram determinadas usando CMC 2%, sob condições de ensaio idênticas. A quantidade de açúcar redutor foi determinada usando ácido 3,5-dinitrossalicílico ³¹. D-glicose e ácido D-galacturônico foram usados como padrão para medir a liberação de equivalentes de glicose e moléculas de ácido galacturônico não saturado. CMC (2%) foi usado na determinação do perfil de atividade de pH e temperatura de cpCelD. Uma unidade de enzima foi definida como a quantidade de enzima que liberava 1 μτηοΐ de equivalente de glicose por minuto/ml. O cálculo de unidade de celulase para avicel e sigmacell foi baseado no método

35/85 de glicose hexoquinase de acordo com o protocolo do fabricante (Sigma).

Hidrólise enzimática de papel de filtro, madeira processada e casca de cítricos

Ensaios enzimáticos foram realizados com um componente enzimático ou como coquetel em papel de filtro, madeira processada e casca de laranja e o açúcar redutor liberado foi determinado usando o método de DNS. Casca de laranja preparada a partir da fruta laranja Valência (Citrus sinensis cv Valência) foi seca ao ar de um dia para o outro e moída em nitrogênio líquido. Casca de laranja Valência moída e biomassa de madeira pré-tratada foram lavadas várias vezes em água destilada até que nenhum açúcar redutor fosse detectado por reagente de DNS, bem como pelo método de glicose hexoquinase.

Para digestão enzimática, foram usados 50-200 mg de amostra de madeira processada ou casca de laranja moída. Extratos brutos contendo enzimas de E. coli e de plantas foram usados no coquetel para hidrólise. O açúcar redutor do produto final foi determinado usando o reagente de DNS ³¹e D-glicose como padrão. Ampicilina e canamicina a 100 pg/ml foram adicionadas para evitar qualquer crescimento microbiano durante as longas durações da hidrólise enzimática. Coquetéis de enzimas comerciais Celluclast 1.5L e Novozyme 188 foram testados quanto à hidrólise de casca de cítricos e madeira processada nas mesmas condições de ensaio usadas para os coquetéis de enzimas de extratos brutos. Unidades de enzima de Celluclast 1.5L e Novozyme 188 usadas para os ensaios de hidrólise eram equivalentes às unidades de enzima cpCelD (com base na hidrólise de CMC)

36/85 presentes em coquetéis de extratos brutos. Em todos os experimentos, os ensaios de controle continham substrato sem enzima ou enzima sem substrato. Todos os experimentos e ensaios foram realizados em triplicata.

Os inventores usaram sequências codificadoras de genomas bacterianos ou fúngicos para criar vetores de cloroplasto. Um novo método baseado em PCR foi usado para clonar ORFs sem íntrons de DNA genômico fúngico. O sistema de expressão de E. coli foi usado para avaliar a funcionalidade de cada enzima independentemente ou sua eficácia em coquetéis de enzimas antes de criar linhagens transgênicas; enzimas de origem fúngica eram ativas sem qualquer necessidade de modificações pós-tradução (ligações dissulfeto ou glicosilação). Os fenótipos de linhagens transplastômicas homoplásmicas eram normais e produziram flores e sementes. Com base em três cortes de tabaco em um ano ⁴⁹'⁶⁴, 10.751 milhões de unidades de atividade de pectato liase e endoglucanase podem ser obtidas a cada ano em um cultivar experimental. Esse rendimento poderia ser aumentado 18 vezes quando essas enzimas são produzidas em cultivares comerciais. Com base no Economic Research Service do USDA, o custo de produção de tabaco Burley em 2 004 foi de U$ 3.981 por acre. Como a maioria das enzimas para a hidrólise de biomassa de planta é ativa em temperaturas mais elevadas, é factível colher folhas e secá-las ao sol, como relatado previamente para xilanase derivada de cloroplasto ²⁵. Com base na atividade enzimática observada em extratos brutos de plantas nesse estudo, não há necessidade de purificação. Portanto, excluindo o custo de processamento, as enzimas poderíam ser

37/85 produzidas por apenas U$ 0,008 para PelB, U$ 0,006 para PelD por unidade de enzima (como definido na fonte comercial Megazyme). Isso é 925-1.233 vezes mais barato para pectato liase B e D, quando comparado com os custos comerciais atuais (Megazyme produzida por C. japonicus). Embora essa comparação de custos ou rendimento possa não ser a mesma para todas as enzimas derivadas de cloroplasto, esse conceito fornece uma nova plataforma promissora para coquetéis de enzimas baratos para a produção de açúcares fermentáveis a partir de biomassa lignocelulósica.

Que seja do nosso conhecimento, esse é o primeiro estudo que utiliza coquetéis de enzimas expressas em plantas para hidrólise de biomassa lignocelulósica para a produção de açúcares fermentáveis e comparação direta das propriedades da enzima produzidas por meio de fermentação ou em plantas, usando genes e sequências reguladoras idênticas. A maioria dos estudos sobre hidrólise enzimática em substratos naturais como, por exemplo, madeira prétratada, forragem de milho ou palha de trigo, utilizou enzimas disponíveis comercialmente ^3,42 ou enzimas recombinantes purificadas reforçadas com enzimas comerciais purificadas ^40,43 . a comparação precisa de coquetéis de enzimas de extratos brutos com coquetéis comerciais não é possível, já que suas composições de enzimas não são conhecidas. Portanto, unidades de enzima equivalentes com base na hidrólise de CMC foram usadas como uma base para comparação geral. ACCELLERASE TM 1000 (Genencor) não estava disponível para esse estudo, em função de acordos institucionais necessários. O coquetel de enzimas purificadas Novozyme 188 não gerou equivalentes de glicose

38/85 detectáveis a partir de madeira processada, e 11% mais equivalentes de glicose com casca de cítricos, enquanto Celluclast 1.5L gerou 10% e 137% mais com ambos os substratos de biomassa do que o coquetel de extrato bruto, com unidades de enzima equivalentes com base na hidrólise de CMC. Não é surpreendente que os coquetéis de extrato bruto tenham tido um desempenho igual ou melhor do que os coquetéis de enzimas purificadas, pois esses últimos são produzidos por fermentação submersa de cepas fúngicas selecionadas que secretam várias enzimas, simultaneamente. De acordo com Novozymes, é necessário um design cuidadoso de uma combinação de enzimas de componente único para utilização racional desses coquetéis de enzimas ⁴⁴.

Exemplo 9: Expressão de enzimas de degradação de plantas

Os ensinamentos apresentados nos Exemplos 1-8 podem ser adaptados para a preparação de cassetes de expressão do gene heterólogo, construção de vetores de transformação; transformação de cloroplastos e expressão em cloroplasto de qualquer uma em uma numerosa lista de enzimas que os inventores identificaram que serão úteis na degradação de biomassa de fontes de plantas. Além disso, os Requerentes referem-se às Publicações de Patente U.S. 20070124830 e 20060117412 para técnicas de transformação de cloroplasto e expressão de proteínas.

Uma lista não limitante de enzimas exemplares inclui as seguintes na Tabela I:

Tabela I

GOI (Genes de interesse)

39/85

1. Endoglucanases

a) celD (Clostridium thermocellum)

b) egl (Trichoderma reesei)

c) egll (Trichoderma reesei)

2. Exoglucanase

a) celO (Clostridium thermocellum)

3. Lipase

a) lipY (Mycobacterium tuberculosis)

4. Pectato liases

a) pelA (Fusarium solani)

b) pelB (Fusarium solani)

c) pelO (Fusarium solani)

5. Cutinase

a) cut (Fusarium solani)

6. Swolenina similar ãs expansinas

a) swol (Trichoderma reesei)

7. Xilanase

a) xyn2 (Trichoderma reesei)

8. Acetil xilana esterase

a) axel (Trichoderma reesei)

9. Beta-glicosidase

a) bgll (Trichoderma reesei)

10. Mananase

a) manl (Trichoderma reesei)

11. Arablnofuranosidase

a) abfl (Trichoderma reesei)

12. Lignina peroxidase

a) lipJ (Mycobacterium tuberculosis)

Além da lista acima, as tabelas anexadas II-VII

40/85 apresentam uma lista de diferentes enzimas que podem ser usadas em conjunto com modalidades da invenção. Os N^os EC são designações reconhecidas (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ e NC-IUBMB) que definem cada uma das enzimas com referências cruzadas para sequências de polipeptídeos relevantes e sequências de polinucleotídeos codificadoras. Os N^os de acesso pertencem às identificações de sequências no Genbank (uma letra seguida por cinco dígitos, por exemplo, M12345) ou o formato RefSeq (duas letras seguidas por uma sub-barra e seis dígitos, por exemplo, NT_123456) . Cada uma das sequências e N^os de acesso relacionados estão armazenados na divisão Corenucleotide do sistema de base de dados

GenBank. Um N° de acesso listado nas Tabelas II-VII para um gene específico pode ser facilmente encontrado por inserção do número de acesso no campo de pesquisa do sistema Entrez encontrado em (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery).

Em uma modalidade específica, as sequências dos N^os de acesso listadas especificamente nas tabelas II-VI incluem aquelas em seu estado original ou como revisadas/atualizadas no sistema Genbank em 28 de fevereiro de 2008.

Em outras modalidades, é contemplado que as sequências podem ser revisadas/atualizadas depois de 28 de fevereiro de 2008, mas de outro modo reconhecidas pela técnica como a sequência mais precisa do N° de acesso comparada com a sequência armazenada antes de 28 de fevereiro de 2008. Nessas outras modalidades, sequências revisadas, mas reconhecidas como a sequência verdadeira e que possui uma identidade de sequência de pelo menos 95% para a sequência armazenada na base de dados antes de 28 de

41/85 fevereiro de 2008, devem ser consideradas como a sequência para o N° de acesso relevante.

Os requerentes também incorporam por referência o arquivo de texto ASCII intitulado 10669-034segid depositado com o presente pedido. Esse arquivo de texto contém informação de sequência do N^os de acesso listados nas Tabelas II-VII.

Além disso, nucleotídeos e peptídeos que possuem identidade substancial para as sequências de nucleotídeos e aminoácidos com relação às enzimas de degradação de plantas (por exemplo, aquelas fornecidas nas tabelas II-VII) usadas em conjunto com a presente invenção também podem ser empregados em modalidades preferidas. Aqui, identidade substancial significa que duas sequências, quando otimamente alinhadas como, por exemplo, pelos programas GAP ou BESTFIT (peptídeos) usando ponderações de (gap) padronizadas, ou como medido pelos algoritmos computacionais BLASTX ou BLASTP, compartilham pelo menos 50%, preferivelmente 75% e, principalmente, 95% de identidade de sequência. De preferência, as posições de resíduo que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservadoras. Por exemplo, é provável que a substituição de aminoácidos que possuem propriedades químicas similares como, por exemplo, carga ou polaridade, não afete as propriedades de uma proteína. Exemplos não limitantes incluem glutamina para asparagina ou ácido glutâmico para ácido aspártico.

O termo variante, como aqui usado, refere-se às sequências de nucleotídeos e polipeptídeos em que a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos exibe identidade

42/85 substancial com a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos do Anexo B, preferivelmente 75% de identidade de sequência e, principalmente, 90-95% de identidade de sequência para as sequências da presente invenção: desde que a referida variante possua uma atividade biológica como aqui definida. A variante pode surgir por modificação da sequência de nucleotídeos ou aminoácidos nativa por modificações como, por exemplo, inserção, substituição ou eliminação de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou ela pode ser uma variante de ocorrência natural. O termo variante também inclui sequências homólogas que hibridizam para as sequências da invenção sob condições de hibridização padronizadas ou, preferivelmente, rigorosas, familiares àqueles habilitados na técnica. Exemplos do procedimento de hibridização in situ tipicamente usado são descritos em Tisdall e cols., 1999; Juengel e cols., 2000. Quando for desejada uma variante desse tipo, a sequência de nucleotídeos do DNA nativo será alterada adequadamente. Essa alteração pode ser feita por meio da síntese eletiva do DNA ou por modificação do DNA nativo, por exemplo, por mutagênese sítio-específica ou por cassete. De preferência, quando porções de cDNA ou

DNA genômico exigirem modificações da sequência, será empregada a mutagênese sítio-específica dirigida por iniciador, usando metodologias padronizadas na técnica.

Em modalidades específicas, uma variante de um polipeptídeo é aquela que possui pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da sequência de comprimento total de uma sequência nativa das enzimas de degradação de plantas

43/85 fornecidas no arquivo ASCII anexado 10669-034SEDID. Esses polipeptídeos variantes incluem, por exemplo, polipeptídeos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados, ou eliminados, no terminal N e/ou C, bem como dentro de um ou mais domínios internos, da sequência de aminoácidos de comprimento total. Fragmentos dos peptídeos também são contemplados. Normalmente, um polipeptídeo variante terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 81% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 82% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 83% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 84% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 86% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 87% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 88% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 89% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 94%

44/85 de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência de aminoácidos e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipeptideo codificado por uma molécula de ácido nucléico mostrada no Anexo B ou um fragmento especificado desta. Normalmente, polipeptídeos variantes possuem pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, frequentemente pelo menos cerca de 20 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 30 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 40 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 50 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 60 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 70 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 80 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 90 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 100 aminoácidos de comprimento, ou mais.

O rigor de reações de hibridização é facilmente determinável por aqueles habilitados na técnica, e geralmente é um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, da temperatura de lavagem e da concentração de sal. Em geral, sondas mais longas exigem temperaturas

45/85 maiores para anelamento adequado, enquanto sondas mais curtas precisam de temperaturas menores. A hibridização geralmente depende da habilidade do DNA desnaturado para reanelar quando fitas complementares estão presentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de identidade desejado entre a sonda e a sequência hibridizável, maior a temperatura relativa que pode ser usada. Como resultado, por conseguinte, temperaturas relativas maiores tenderíam a tornar as condições de reação mais rigorosas, enquanto temperaturas menores tendería, a tornar menos rigorosas. Para detalhes e explicações adicionais sobre o rigor das reações de hibridização, veja Ausubel e cols., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) .

Condições rigorosas ou condições de alto rigor, como aqui definidas, são identificadas como aquelas que: (1) empregam baixa potência iônica e alta temperatura para lavagem, 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de sódio/dodecil sulfato de sódio 0,1% a 50°C; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, formamida 50% (v/v) com albumina sérica bovina 0,1%/ Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona 0,l%/50 mM de tampão de fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42°C; ou (3) empregam formamida 50%, 5X SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, solução de Denhardt 5 vezes, DNA de esperma de salmão sonificado (50 pg/ml), SDS 0,1% e sulfato de dextrana 10% a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2X SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida 50% a 55°C, seguidas

46/85 por uma lavagem de alto rigor que consiste em 0. IX SSC contendo EDTA a 55°C.

Condições de rigor moderado são identificadas como descrito por Sambrook e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nova York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de solução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura, potência iônica e % de SDS) menos rigorosas do que aquelas descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente rigorosas é incubação de um dia para o outro a 37°C em uma solução que compreende: formamida 20%, 5X SSC (150 mM de NaCl, 15 mM citrato trissódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, sulfato de dextrana 10% e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado cisalhado, seguido por lavagem dos filtros em IX SSC em torno de 37-50°C. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão como ajustar a temperatura, potência iônica etc. como necessário para acomodar fatores como, por exemplo, o comprimento da sonda, e semelhantes.

Tipicamente, para condições de hibridização rigorosas, deve ser escolhida uma combinação de temperatura e concentração de sal que seja aproximadamente 12-20°C abaixo

da T_m calculada do híbrido sob estudo. A T_m de um híbrido
entre um polinucleotídeo	que	possui uma	sequência de
nucleotídeos mostrada no	ID.	DE SEQ. N	° : 1, ou o

complemento desta, e um sequência de polinucleotídeos que é pelo menos cerca de 50, preferivelmente cerca de 75, 90, 96 ou 98% idêntica a uma daquelas sequências de nucleotídeos, que pode ser calculada, por exemplo, com o uso da equação de Bolton e McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. A. 48,

47/85

1.390 (1962) :

T_m = 81,5°C - 16,6 (logio [Na⁺] ) + 0,41 (% de G+C)-0,63 (% de formamida)-600/1) em que 1 = o comprimento do híbrido em pares de bases.

Em uma modalidade específica, condições de lavagem rigorosas incluem, por exemplo, 4 X SSC a 65°C, ou formamida 50%, 4 X SSC a 42°C ou 0,5 X SSC, SDS 0,1% a

65°C. Condições de lavagem altamente rigorosas incluem, por exemplo, 0,2 X SSC a 65°C.

Exemplo 10: Otimização de coquetéis de enzimas recombinantes expressas

Tendo sido demonstrado por vários exemplos que enzimas de degradação de plantas podem ser expressas em plantas e bactérias, podem ser produzidos coquetéis de enzimas que são especialmente adaptados para a degradação de uma classe visada de biomassa. Os inventores descobriram que certas combinações de enzimas selecionadas são capazes de hidrolisar materiais de biomassa de forma sinérgica. Por exemplo, foi descoberto que duas ou mais enzimas de uma classe em particular funcionam sinergicamente para degradar material-alvo na biomassa para aumentar o rendimento obtido de açúcares fermentáveis. Com base na composição conhecida de uma amostra de biomassa-alvo, mais de uma enzima em uma classe em particular são incluídas no coquetel de degradação de plantas. Além disso, a quantidade de enzima de uma classe de enzima especifica que sabidamente degrada um composto específico em uma amostra de biomassa está aumentada em relação à outra enzima no coquetel em função da proporção do composto específico/massa da amostra de biomassa. Informações gerais em relação às classes

48/85 exemplares de enzimas são discutidas abaixo no relacionamento como o tipo de substratos sobre os quais atuam. Equipados com os ensinamentos e técnicas aqui discutidos, aqueles habilitados na técnica são capazes de determinar coquetéis adequados para certa biomassa, e métodos pelos quais a sinergia das enzimas nos coquetéis pode ser determinada.

Ensaios enzimáticos

A maioria dos ensaios enzimáticos foi determinada espectrofotometricamente por medida do aumento em A₂₃₅ ^30,47,48 . _As cinéticas enzimáticas foram estudadas para otimizar a concentração de substrato (0-2,5 mg) sob concentrações idênticas de proteína e cofator. As misturas de reação continham tampões, substratos e enzimas-padrão apropriados, quando comercialmente disponíveis. As medidas foram feitas em diferentes temperaturas e pHs. Uma unidade de enzima é definida como a quantidade de enzima que forma 1 pmol de produto por min com coeficiente de extinção molar apropriado. Os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) são calculados usando regressão não linear com utilização do software Graphpad Prism 5.0. As inclinações iniciais de cada concentração de substrato são calculadas, em que a velocidade (unidades/mg/min) é definida através da liberação do produto apropriado. A otimização da temperatura é determinada em tampões adequados com cofatores necessários, substratos em pH ótimo. A fim de estudar a estabilidade térmica de cada enzima, as amostras tamponadas de enzima são incubadas por períodos de tempo fixos em diferentes temperaturas. Similarmente, o pH ótimo de cada enzima é medido em temperaturas ótimas usando

49/85 diferente tampões com pH que varia de 6 a 10, com a mesma potência iônica. A estabilidade do extrato bruto da enzima é otimizada por incubação da enzima nos diferentes pHs. A influência de vários cofatores para a atividade enzimática ótima é estudada realizando-se as reações na presença ou ausência de cada cofator, em diferentes pHs e temperaturas.

Endoglucanase, celobiohidrolase e beta-glicosidase:

A celulose é a fonte biológica renovável mais abundante produzida na biosfera através de processo fotossintético (aproximadamente 100 bilhões de toneladas secas/ano) 49-51. _A biodegradação da celulose por celulases e celulossomas, produzidas por vários microorganismos, representa um fluxo de carbono importante de depósitos fixos de carbono para o C0₂ atmosférico, e estudos demonstraram que o uso de produtos de origem biológica e bioenergia podem obter zero de emissão líquida de dióxido de carbono ⁵²'⁵³ . a celulose é um polímero de condensação linear que consiste em D-anidroglicopiranose unidos juntos por ligações 3-1,4-glicosídicas com um grau de polimerização (DP) de 100 a 20.000. Aproximadamente 30 moléculas individuais de celulose são montadas em unidades maiores conhecidas como fibrilas elementares (protofibrilas), que são compactadas em unidades maiores denominadas microfibrilas, e essas, por sua vez, são montadas em fibras de celulose grandes ^54,55 . a degradação da biomassa envolve a liberação de polissacarídeos de cadeia longa, especificamente celulose e hemicelulose, e a subsequente hidrólise desses polissacarídeos em seus açúcares componentes com cadeia de 5 e 6 carbonos ¹⁵. Um dos desafios tecnológicos mais importantes e difíceis é

50/85 superar a resistência de materiais lignocelulósicos naturais, que devem ser enzimaticamente hidrolisados para a produção de açúcares fermentáveis ²-⁷-⁸-⁵⁶'⁵².

O mecanismo de degradação de celulose envolve três classes de enzimas de celulase. Essas incluem endoglucanases ou 1,4-p-D-glucan-4-glicanohidrolases (EC 3.2.1.4), exoglucanase ou 1,4-3-D-glicano celobiohidrolases (E.C. 3.2.1.91), e β-glicosidase ou β-glicosídeo glicohidrolases (E.C. 3.2.1.21) ^55,58,59. as ações combinadas de endoglucanases e exoglucanases modificam a natureza cristalina da superfície da celulose ao longo do tempo, resultando em mudanças rápidas nas taxas de hidrólise ⁶⁰. O inventor percebeu que a ação simultânea dessa classe de enzima no substrato de celulose degrada completamente as ligações 3-1,4-glicosídicas intramoleculares de cadeias de celulose. Isso resulta na liberação de grandes quantidades de moléculas fermentáveis de glicose.

Endoglucanases (por exemplo, CelD, Egl) : Endoglucanases cortam de forma aleatória em sítios internos amorfos na cadeia polissacarídica de celulose, gerando oligossacarídeos de vários comprimentos e, consequentemente, expõem novas extremidades da cadeia. Exoglucanases (por exemplo, CelO, Cbh2): Exoglucanases ou celobiohidrolases atuam no processamento das extremidades redutoras ou não redutoras das cadeias polissacarídicas da celulose, liberando glicose (glicanohidrolases) ou celobiose (celobiohidrolase) como produtos principais. Celobiohidrolases também podem atuar sobre a estrutura de celulose amorfa e microcristalina que possui extremidades expostas da cadeia de celulose. β-Glicosidases (por

51/85 exemplo, BglA, Bgll): hidrolisam celobiose solúvel, além de moléculas de celodextrinas mais longas em glicose.

CelD,____Egll,____EG1____(endoglucanases)____e____CelO (celobiohidrolase): Substrato: Carboxilmetilcelulose (2%) beta D-glicano (10 mg/ml), celulose microcristalina, Avicel, celulose Sigma (todas 50 mg/ml). São feitas pelo menos duas diluições para cada amostra de enzima investigada em 50 mM de tampão de acetato de sódio contendo 10 mM de CaCl₂ e 20 pg de BSA. No ensaio, uma diluição deve liberar ligeiramente mais e uma ligeiramente menos do que 0,5 mg (quantidade absoluta) de glicose. A amostra é incubada em temperatura apropriada por 30 minutos após adição de 0,5 ml de solução de substrato. Após incubação, 0,5 ml de DNS é adicionado a 0,5 ml da mistura de reação, seguido por fervura por exatamente 5 minutos em um banhomaria em ebulição juntamente com vazios de enzima e padrões de glicose. Após a fervura, 166 μΐ de sal de Rochelle 40% são adicionados e transferidos imediatamente para um banhomaria frio por, no máximo, 30 minutos. 0 tubo é misturado por inversão várias vezes de modo que a solução se separa do fundo do tubo a cada inversão. A mistura é medida a 575 nm em um espectrômetro. A absorbância é traduzida (corrigida, se necessário, por subtração do vazio) em produção de glicose durante a reação usando um gráfico de curva de glicose-padrão. A unidade de enzima é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1,0 pmol por minuto ³².

Bgll (Trichodernia reesei) : Ensaios de betaglicosidase :

Substrato: celobiose, 2-15 mM em tampão de acetato de

52/85 sódio pH 4.8.

São feitas pelo menos duas diluições de cada amostra de enzima investigada. Uma diluição deve liberar ligeiramente mais e uma ligeiramente menos do que 1,0 mg (quantidade absoluta) de glicose na condições de reação. Adicionar 1,0 ml de diluição da enzima em tampão de acetato de sódio pH 4,8 a 1,0 ml de substrato de celobiose. Incubar a 50°C por 30-120 minutos. Interromper o ensaio por fervura em banho-maria por 5 minutos. Determinar a glicose liberada usando o método de glicose hexoquinase (Sigma). Uma unidade de enzima é definida como 1,0 pmol de glicose liberado por minuto da celobiose. Substrato: 2-15 mM de para-nitrofenil D-glicosídeo em tampão de acetato de sódio pH 4,8. Adicionar 0,3 ml de solução de enzima diluída a 0,6 ml de 50 mM de tampão de acetato de sódio e 0,3 ml de paranitrofenil D-glicosídeo. Realizar a reação a 50°C por 10 minutos. Interromper a reação com 1 M de Na₂CO₃. Medir por espectrofotometria o p-nitrofenol liberado a 410 nm usando p-nitrofenol como padrão. Construir a curva de calibração para p-nitrofenol na faixa de concentração de 0,02-0,1 mM. A unidade de enzima é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1,0 pmol de p-nitrofenol por min por pNPG.

Xilanase

Endo-xilanases: A xilana é um dos componentes principais da fração de hemicelulose das paredes de células de plantas e é responsável por 20-30% de sua massa seca total. Diferentemente da celulose, o xilana é um polímero complexo que consiste em monômeros de xilose ligados em β1,4 substituídos com cadeias laterais. A hidrólise do

53/85 arcabouço do xilana é catalisada por endob-1,4-xilanases (EC 3.2.1.8) e β-D-xilosidases (EC 3.2.1.37) ⁶¹.

Endoxilanases são capazes de hidrolisar as ligações 1,4-β internas do arcabouço do xilana e, dessa forma, produzir vários xilo-oligômeros de comprimento variável. A hidrólise completa do xilana envolve endo-β-Ι,4-xilanase, βxilosidase, e várias enzimas acessórias, por exemplo, a-Larabinofuranosidase, α-glicuronidase, acetilxilana esterase e ácido ferúlico esterase ^62,63 . Para a indústria de biocombustíveis, o inventor percebeu que as xilanases podem ser usadas para auxiliar na conversão de lignocelulose em açúcares fermentáveis (por exemplo, xilose). Além disso, a hidrólise de moléculas de xilana é uma etapa muito importante na hidrólise enzimática de hemicelulose e de materiais lignocelulósicos, pois gera uma maior acessibilidade para que as celulases atuem sobre a celulose exposta.

Ensaio de xilanase ⁶⁴ (Baily 1989) :

Xyn2 (Trichoderma reesei)

Substrato: xilana oat spelt (1%); xilana birch wood (1%, ferver por 5 minutos até dissolvida).

gráfico-padrão de D-xilose (0,01 a 1 mg/ml de xilose) será preparado pela utilização do método de DNS.

Ensaio: A amostra de enzima é diluída em suspensão de xilana 1% com uma reação com volume total de até 2 ml. A seguir, a mistura é incubada por 30-120 minutos a 50°C. Após incubação, 2 ml de reagente de DNS são adicionados à mistura de reação, seguido por fervura por 5 minutos. A liberação de concentração xilose é medida espectrofotometricamente a 540 nm. A unidade de enzima é

54/85 calculada usando a fórmula-padrão ^e4.

Cutinase:

Cutinase do fungo fitopatogênico Fusarium solani pisi é um exemplo de uma pequena éster carboxílico hidrolase que liga propriedades funcionais entre lipases e esterases. A cutina, um poliéster composto por hidróxi e hidróxi epóxi ácidos graxos contendo 16 e 18 átomos de carbono, é o componente estrutural principal da barreira protetora que cobre a superfície das partes aéreas de plantas ^65/66 . As cutinases não apenas degradam polímeros de cutina, mas também uma grande variedade de triacilgliceróis de cadeia curta e longa é rapidamente hidrolisada. A enzima pertence à família de serina hidrolases que contêm a denominada dobra α/β-hidrolase 67,68. A hidrólise de moléculas de cutina, lipase e triacilgliceróis que estão presentes em grande quantidade na casca de resíduos de cítricos dá uma grande acessibilidade para enzimas como pectinases, celulases e xilanases. Portanto, a cutinase é um componente enzimático importante na hidrólise enzimática da casca de cítricos para a produção de biocombustível.

Ensaio de cutinase ^67,69: Substrato: p-nitrofenil butirato e p-nitrofenil palmitato (0,01% ou 10 mM) . A enzima é extraída de plantas transplastômicas em 100 mM de tampão de Tris-HCl (pH 7,0) e Triton X-100 0,03% será adicionado no momento do início do ensaio enzimático. As reações são realizadas por incubação por 10-15 min a 30°C em um tubo contendo 1 ml de substrato (100 mM Tris-HCl, pH 7, Triton X-100 0,03% e p-nitrofenol butirato 0,01% e várias quantidades de amostra de enzima (gelada). A liberação de p-nitrofenol é medida a 405 nm usando p55/85 nitrofenol como padrão. A atividade de fundo é subtraída da leitura de absorção, se necessário. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade que degrada 1 pmol de substrato por minuto sob condições padronizadas.

Mananase:

A mananase é usada na indústria de papel e de polpa, para o branqueamento enzimático de polpa de madeira mole, na indústria de detergente como um reforço para a remoção de manchas, na indústria do café para hidrólise de manana de café para reduzir a viscosidade de extratos de café, na indústria de moagem de óleo para aumentar o fluxo de óleo ou gás, na extração de óleo da carne do coco, na indústria têxtil para o processamento de fibras celulósicas e na indústria de aves para aumentar o valor nutricional de rações para aves ⁷⁰.

Polissacarídeos da parede celular podem ser convertidos em açúcares fermentáveis por meio de hidrólise enzimática usando enzimas como, por exemplo, celulases e hemícelulases, e os açúcares fermentáveis assim obtidos podem ser usados para produzir etanol lignocelulósico. A mananase é uma hemicelulase. A hemicelulose é um grupo complexo de polímeros heterogêneos e representa uma das fontes principais de matéria orgânica renovável. Mananas são um dos principais grupos constituintes de hemicelulose e estão amplamente distribuídas em madeiras duras e madeiras mole, sementes de plantas leguminosas e no feijão. Hemiceluloses constituem até 25-30% do peso seco total da madeira. As hemiceluloses em madeiras mole são principalmente galactoglucomanana, contendo resíduos de

56/85 manose/glicose/galactose em uma proporção de 3:1:1 e glucomanana com resíduos de manose/glicose na proporção de 3:171. Mananases são endohidrolases que clivam aleatoriamente dentro da cadeia principal de 1,4-β-Ό manana de galactomanana, glucomanana, galactoglucomanana e manana. Mananases hidrolisam as ligações β-ϋ-1,4 manopiranosídeo em β-1,4 mananas. Os produtos principais obtidos durante a hidrólise de mananas por β-mananases são manobiose e manotriose. Enzimas adicionais, por exemplo, β-glicosidases e α-galactosidases, são necessárias para remover açúcares da cadeia lateral que estão anexadas em vários pontos em mananas. Uma grande variedade de bactérias, actinomicetos, leveduras e fungos sabidamente produzem mananase. Entre as bactérias, principalmente gram-positivas, incluindo várias espécies de Bacillus e de Clostridia e algumas cepas de bactérias gram-negativas, por exemplo, Vibrio e Bacteroides, também foram relatadas. O grupo de degradação de manana mais proeminente entre fungos pertence aos gêneros Aspergillus, Agaricus, Trichoderma e Sclerotium ⁷⁰.

O procedimento de ensaio para determinação da atividade de mananase envolve a incubação do extrato de enzima bruto com o substrato (galactomanana de goma de alfarroba como substrato). Após a reação enzimática, os açúcares redutores liberados são quantificados, e a atividade enzimática é medida. A goma de alfarroba (0,5%) será dissolvida em tampão de citrato (pH 5,3) e aquecida até ferver; essa mistura é usada como o substrato. O extrato de enzima bruto é incubado com o substrato a 50°C por 5 minutos. Os açúcares redutores liberados na reação enzimática são testados por adição de reagente de ácido

57/85 dinitro salicílico em ebulição por 5 min, resfriamento e medida da absorbância a 54 0 nm ⁷².

Outro método ensaio envolve galactomanana de alfarroba (0,2%) como substrato em tampão de acetato de sódio (pH 5). O extrato de enzima bruto é incubado com o substrato a 40°C por 10 minutos. Os açúcares redutores liberados são medidos pelo método de Nelson-Somogyi, e a atividade enzimática é quantificada ⁷³. Em um ensaio de difusão em gel, placas de gel são preparadas por dissolução de goma de alfarroba 0,05% (p/v) em tampão de citrato fosfato (pH 5,0), juntamente com Phytagar. 0 extrato de enzima bruto é transferido para as placas de gel e incubado por 24 horas. Os géis serão corados pela utilização de vermelho Congo. As zonas clareadas (halos) nas placas indicavam atividade de endo-beta-mananase ⁷⁴.

Arabinofuranosidase 1 (ABF1)

ABF1 demonstrou ter vários usos potenciais. Larabinose é encontrada por muitos tecidos de plantas diferentes em pequenas quantidades, mas colocada estrategicamente como grupos laterais. ABF1 facilita a degradação dessas cadeias laterais e o entrecruzamento dentro da parede celular para funcionar sinergicamente com outras enzimas como, por exemplo, hemicelulases. Isso pode aumentar a disponibilidade de açúcares fermentáveis para a produção de biocombustível a partir de biomassa ou polpa e a produção de papel. Essa enzima pode aumentar a digestibilidade de rações para animais de criação, tem sido usada na clarificação de sucos de fruta e pode ajudar na aromatização de vinhos. Finalmente, ABF1 possui possibilidades como aditivo alimentício para diabéticos em

58/85 função do gosto doce e do efeito inibidor da digestão de sacarose ⁷⁵.

ABF1 foi isolada do fungo T. reesei e expressa em Escherichia coli no plasmídeo pLD. A atividade dessa enzima é testada por meio do uso do substrato p-nitrofenil-a-Larabinofuranosídeo em 0,05 M de tampão de citrato incubado a 50°C por minutos com extratos brutos de enzima de plantas ou

E.

coli. A reação é interrompida com 1 M de

Na₂CO₃, p-nitrofenol resultante é medido por espectrofotômetro a 400 nm e comparado com o padrão positivo (p-nitrofenol ou

ABF, ambos disponíveis comercialmente) para determinar a quantidade. Estudos de pH e temperatura ótimos são realizados com o mesmo substrato e medidos da mesma forma ⁷⁶. Sabidamente, a atividade dessa enzima é inibida por certos íons metálicos como, por exemplo, Cu²⁺' Hg²⁺, detergentes e muitos agentes quelantes e redutores ⁷⁵.

Lignina peroxidase (LipJ)

A enzima lignina peroxidase, comumente conhecida como LipJ, permanece inédita e desejável para o avanço da produção de enzimas para biocombustível por meio de tabaco transplastômico. A expressão de LipJ deve expandir os espectros de fontes de biomassa exploráveis por hidrólise da lignina não comestível e porções ricas em celulose de biomassa como, por exemplo, milho, cana de açúcar e trigo. Fontes previamente excluídas como fontes para biocombustível em função de seu teor elevado de lignina, por exemplo, restos de tábuas de madeira, lascas de madeira, cascas de frutas e vegetais preparados comercialmente, poderíam ser hidrolisadas com LipJ. LipJ

59/85 também avança na produção de biocombustíveis por ablação das estruturas intricadas de lignina dentro de materiais de plantas dando acesso a substratos de biomassa mais valiosos que fornecem produtos comerciais, químicos e farmacêuticos valiosos. Esses produtos ainda possuem rendimento limitado, por causa da natureza protetora da lignina que os circunda dentro das fontes de biomassa.

LipJ foi isolada do DNA genômico de Mycobacterium tuberculosis, expressa em um plasmídeo funcional tanto em cloroplastos quanto em E. coli. Três cultivares de tabaco transplastômico estão expressando esse vetor na rodada primária de seleção e aguardam confirmação de expressão em cloroplasto. Foram planejados ensaios de proteína em E. coli para análise qualitativa e quantitativa da expressão de LipJ, que é otimizada para cloroplasto derivado de LipJ.

Lipase (LipY)

Lipase Y (LipY), de Mycobacterium tuberculosis, é uma enzima hidrossolúvel que catalisa a hidrólise de ligações éster e triacilgliceróis de cadeia longa, o que a torna um candidato ideal para a produção de biocombustível. LipY é uma proteína da membrana para Mycobacterium tuberculosis e estudos já demonstraram que ocorre uma resposta humoral quando LipY é combinada com o soro de pacientes com tuberculose; portanto, LipY tem o benefício adicional de ser uma vacina potencial para tuberculose ⁷⁷.

Um ensaio simples para determinação da atividade do gene clonado é um ensaio em placa que envolve o corante fluorescente rodamina B e um extrato bruto de células lisadas. Se o gene estiver integrado adequadamente e a proteína dobrada corretamente, o ensaio exibirá uma cor

60/85 laranja quando iluminado sob um comprimento de onda de luz específico ⁸⁰. Outro ensaio mede a liberação de pnitrofenol quando p-nitrofenilestearato é incubado em várias concentrações de E. coli ou extrato de célula de planta ⁸¹.

Exemplo 11: Expressão de enzimas de degradação de plantas em cultivares comerciais

Cloroplastos de tabaco foram transformados por bombardeamento com microprojéteis (transformação biolística), como descrito anteriormente. A integração do transgene foi confirmada por análise por PCR usando os iniciadores utilizados em estudos prévios. Análise southern-blot foi realizada para confirmar homoplasmia.

Sementes de tabaco (Nicotiana tabacum var. Petit

Havana/LAMD/TN90) foram germinadas assepticamente em meio

MSO em placas de Petri. As mudas germinadas foram transferidas para caixas púrpuras contendo meio MSO. As folhas no estágio de 3-7 folhas de crescimento de planta foram cortadas e colocadas abaxial viradas para cima em um papel de filtro Whatman em meio RMOP em placas de Petri (100 x 15 mm) para bombardeamento. Microprojéteis de ouro (0,6 pm) foram revestidos com DNA de plasmídeo (vetor de expressão de tabaco em cloroplasto) e a transformação biolística mediada foi realizada com o dispositivo biolístico PDSIOOO/He (Bio-Rad) como publicado. Após bombardeamento, as folhas foram incubadas no escuro por 48 horas para se recuperar do dano. Após 48 horas no escuro, as folhas bombardeadas de Petit Havana (cultivar experimental) ou LAMD e TN90 (cultivar comercial) foram cortadas em pedaços de 5 mm² e colocadas em placas (com o

61/85 lado bombardeado em contato com o meio) contendo RMOP com

500, 150 e 200 mg/1 de espectinomicina, respectivamente, para a primeira rodada de seleção. Após 4-5 semanas, aparecerão brotos resistentes, enquanto células não transformadas morrerão. Os brotos resistentes serão transferidos para novas placas com RMOP-Espectinomicina e submetidos a rodadas subsequentes de seleção. Os supostos brotos transplastômicos foram confirmados por PCR e análise Southern. A expressão de enzimas de degradação da parede celular foi confirmada por seus respectivos ensaios, e para aquelas para as quais houvesse anticorpo disponível, a análise western-blot foi realizada.

Os cultivares comerciais geraram 40 toneladas métricas de biomassa de folhas frescas, em contraste com 2,2 tons no cultivar experimental Petit Havana. Os cultivares comerciais geraram biomassa 18 vezes mais do que o cultivar experimental (Cramer e cols., 1999). LAMD-609 é um híbrido com baixo teor de nicotina produzido por retrocruzamento de uma variedade do tipo Maryland, MD-609, com uma variedade burley que produz baixo teor de nicotina, LA Burley 21 (Collins e cols., 1974); Tennessee 90 (TN 90) é um cultivar comercial usado por Philip Morris (Lancaster Laboratories, PA) . Ambos os cultivares experimentais LAMD e TN 90 foram transformados com genes que codificam enzimas de degradação de biomassa. Embora seja mais desafiador transformar esses tivemos sucesso cultivares do que o cultivar experimental,

na transformação de	ambos os	cultivares	comerciais	com
diversos	genes que	codificam	enzimas de	degradação	de
biomassa	pectato	liases,	celulases,	xilanases	e

endoglucanases. As linhagens transplastômicas de cultivares

62/85 comerciais eram homoplásmicas, férteis, e as atividades das enzimas expressas eram similares às do cultivar experimental, exceto que seu rendimento de biomassa foi bem maior do que Havana. A Tabela 8 mostra enzimas que foram introduzidas com sucesso em plantas, expressas e testadas quanto à atividade em cultivares experimentais e comerciais.

PCR foi feita usando DNA isolado de material de folha de plantas de controle e supostamente transgênicas a fim de distinguir transformantes de cloroplasto verdadeiros de transformantes nucleares ou mutantes. Foram preparadas duas reações de PCR separadas, uma reação verificou a integração de gene marcador selecionável no genoma do cloroplasto e a segunda verificou a integração do cassete de expressão transgênica. A fim de testar a integração do cloroplasto dos transgenes, um iniciador (3M) se destinará ao gene aadA enquanto o outro (3P) se destinará ao genoma nativo do cloroplasto. Nenhum produto de PCR foi obtido com plantas transgênicas nucleares ou mutantes usando esse conjunto de iniciadores. Essa seleção é importante para eliminar mutantes e transformantes nucleares. A fim de realizar a análise por PCR em plantas transgênicas, DNA total de plantas não bombardeadas e transgênicas foi isolado como descrito pelo mini kit de planta DNeasy (Qiagen). A integração do cassete de expressão transgênica foi testada usando o par de iniciadores 5P/2M. O iniciador 5P se destina ao gene aadA e 2M ao trnA e, portanto, o produto de PCR mostrou se o gene de interesse havia sido introduzido no genoma do cloroplasto por meio do processo de recombinação homóloga. Uma estratégia similar foi usada com

63/85 sucesso por PI lab para confirmar a integração no cloroplasto de vários genes estranhos. Os pedaços de folha de brotos PCR-positivos foram ainda selecionados para uma segunda rodada a fim de obter homoplasmia.

Foram feitos Southern-blots para testar homoplasmia. Há vários milhares de cópias do genoma do cloroplasto presentes em cada célula de planta. Quando são inseridos genes estranhos no genoma do cloroplasto, nem todos os cloroplastos irão integrar DNA estranho resultando em heteroplasmia. Para assegurar que somente o genoma transformado exista em plantas transgênicas (homoplasmia), o processo de seleção foi continuado. A fim de confirmar homoplasmia ao final do ciclo de seleção, DNA total de plantas transgênicas foi sondado com as sequências flanqueadoras de cloroplasto marcadas radioativamente (o fragmento trnl-trnA) usadas para recombinação

Caso estejam presentes genomas do tipo homóloga.

selvagem (heteroplasmia), será observado o tamanho do fragmento nativo junto com genomas transformados. A presença de um fragmento grande dentro das sequências flanqueadoras e a ausência do pequeno fragmento nativo devem confirmar homoplasmia.

A Figura 6 mostra a geração de cultivares comerciais transplastômicos de tabaco. (A) Enraizamento de broto de CelD LAMD. (B) plantas transplastômicas de CelD LAMD que crescem na estufa. (C) plantas transplastômicas de CelD LAMD que mostram floração normal. (D) transformante primário de CelD TN90 . (E) Segunda rodada de regeneração para CelD TN90. (F) Enraizamento de PelB TN90. (G-I)

Primeira, segunda e terceira rodadas de regeneração para

64/85

PelB LAMD. (J) Enraizamento de broto de PelD LAMD. (K) plantas transplastômicas PelD LAMD que crescem em estufa.

(L) Planta transplastômica PelD LAMD que mostra floração normal. (M) Enraizamento de broto egl LAMD. (N) Planta transplastômica egl LAMD que cresce em potes.

A Figura 7 mostra confirmação de homoplasmia por southern-blots usando sonda flanqueadora de tabaco. (A) CelD LAMD. (B) PelB LAMD. (C) PelB TN90. (D) PelD LAMD e (E) egl LAMD (UT: Planta não transformada; Números: Linhagens transplastômicas e B: Vazio). A Figura 8 mostra atividade enzimática de pectato liase B e D em cultivares de tabaco Petit Havana, TN90 e LAMD. (A) PelB. (B) PelD. Observação: o material de folha usado para a análise da atividade enzimática para cultivares de tabaco TN90 e LAMD foi colhido de plantas in vitro, enquanto o material de folha para Petit Havana é da estufa. Na medida em que o transgene é controlado por psbA, com a luz e elementos reguladores do desenvolvimento, espera-se que os níveis de expressão em cultivares comerciais sejam maiores quando transferidos para a estufa.

65/85

ω «J ΰ Η Ü (D

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<u oo aJ rH

0)

Λ <CJ

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Saúde da planta	Normal	Normal	Normal
2 2 3 : s 8 « s 5 U U ^Ό d ΓτΊ ^w Φ Λ	£ •H ω	Sim	£ -H ω
i H « s 3 “ o .p -u (D o β 0 “ X Ό ° ^w Μ (D	Sim	£ •H ω
Material congelado (g)	400	250
N° de plantas	Sementes germinadas T0	Sementes germinadas T0	4 clones
Em qual estágio	Sementes colhidas	Sementes colhidas	2^a rodada de seleção
Estado em Southern	Homoplasmia	Homoplasmia	Não verificado
PCRpositivo	Sim, Petit Havana (PH)	Q £ •H ω	Sim (TN90)
Nome do gene	celD

CD (U U a d) £ CD

CD (D U C (D £ a>

66/85

	Normal	rd 0 S	Normal	Normal	Normal	Normal
	Sim	ε Ή ω	ε •H ω	Sim	Sim	Sim
	ε •Η ω	Sim	ε •H ω
			009	340
germinadas ΤΟ	18 plantas	30 plantas	Sementes germinadas ΤΟ	Sementes germinadas TO	σι	σι
colhidas	Enraizamento	Pronta para produção em estufa	Sementes colhidas	Sementes colhidas	Pronta para produção em estufa	\| Pronta para produção em estufa
	Homoplasmia	Homoplasmia	Homoplasmia	Homoplasmia	Homoplasmia	Homoplasmia
	Sim (LAMD)	Sim (TN90)	Sim (PH)	Sim (LAMD)	w cu ε •H ω	Sim (PH)
			pelD		c i—1 Φ α	Egl

67/85

Normal	Normal	Normal	Normal	Folhas finas	Normal	Folhas estão finas	Normal
g •H ω	Em progresso	Sim	g •H ω	Em progresso	Em progresso	Em
	Em progresso	g H ω	Sim	Sim	g Ή ω	Sim

CO	20	3 clones		20	20	15	20
Pronta para produção em estufa	Enraizamento	2^a rodada de seleção	Pronta para produção em estufa	Enraizamento	Pronta para produção em estufa	Enraizamento	Enraizamento
Homoplasmia	Em progresso	Em progresso	Homoplasmia	Homoplasmia	1 Homoplasmia	Em progresso	Heteroplasmia
Q g •H ω	K λ g •H	o σ> 3 H g •rl ω	K g •H ω	Sim (PH)	Sim (PH)	Sim (PH)	K cu g •H ω
	Egll		Xyn2	Swol	Bgll	Cutinase	ceio

68/85

	Normal
progresso	Em progresso
	£ •H ω	Sim	Sim	£ -H ω	Sim

	5 clones
	2^a rodada de seleção	Em meio de seleção RMOP	Em meio de seleção RMOP	Em meio de seleção RMOP	Em meio de seleção RMOP	Em meio de seleção RMOP
	Em progresso	1 1 í 1 1	1 1 1 1 1	1 1 1	1 1 1	1 1 1 1
	Avaliação (LAMD)	Bombardeada em todos os cultivares	Bombardeada em todos os cultivares	Bombardeada em todos os cultivares	Bombardeada em todos os cultivares	Bombardeada em todos os cultivares
		ϊ—1 â	a •H ι—1	lipj	Manl	Abfl

69/85

As revelações dos documentos de patente, publicações e referências citados, incluindo aqueles citados nas Tabelas II-VII, são aqui incorporados em sua totalidade na medida em que não sejam inconsistentes com os ensinamentos aqui apresentados. Deve-se entender que os exemplos e as modalidades aqui descritas têm finalidade apenas ilustrativa, e que várias modificações ou alterações à luz destes serão sugeridas por aqueles habilitados na técnica e devem ser incluídas no espírito e abrangência deste pedido.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de degradação de uma amostra de biomassa de planta de modo a liberar açúcares fermentáveis nessa amostra, o método caracterizado por compreender as etapas

5 de:

i) obter um coquetel de degradação de plantas preparado a partir de material vegetal moído compreendendo proteínas recombinantes expressas em plastídios de pelo menos uma planta transplastômica, as referidas proteínas

10 recombinantes consistindo em swolenina, endoglucanase CelD, endoglucanase CelO, beta-glicosidase, xilanase, acetil xilana esterase, enzimas pectato liase PelA, pectato liase PelB e pectato liase PelD, o referido coquetel compreendendo um tampão e, opcionalmente, um ou mais de um 15 extrato de células bacterianas compreendendo um composto de degradação de planta e uma lipase; e ii) incubar o referido coquetel de degradação de plantas com a referida amostra de biomassa entre 30°C e 50°C em um pH entre 6 a 10 para liberar 100% de açúcares

20 fermentáveis da referida biomassa.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido coquetel compreende ainda pelo menos um extrato celular bacteriano.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1,

25 caracterizado pelo fato de que a referida amostra de biomassa de planta compreende grãos e/ou resíduos de grãos, beterraba, cana de açúcar, gramas, biomassa à base de madeira, frutas e/ou resíduos de frutas, ou uma combinação destes.

3 0 4. Método, de acordo com a reivindicação 3,

Petição 870190011705, de 04/02/2019, pág. 12/15 caracterizado pelo fato de que a referida biomassa de

2/4 planta é milho, trigo, cevada ou cítricos, ou resíduos deles obtidos.

5. Método, de acordo com a reivindicação

3, caracterizado pelo fato de que a referida biomassa de planta é capim-elefante.

6. Método, de acordo com a reivindicação

3, caracterizado pelo fato de que a referida biomassa de planta é cana de açúcar.

7. Método, de acordo com a reivindicação

3, caracterizado pelo fato de que a referida biomassa de planta é beterraba.

8. Método, de acordo com a reivindicação

1, caracterizado pelo fato de que o referido coquetel de degradação de plantas ainda compreende rubisco.

9. Coquetel de degradação de plantas útil para degradação de uma biomassa de planta, o referido coquetel caracterizado por compreender enzima de degradação de plantas expressas recombinantemente em plastídios de células de plantas, em que as referidas enzimas consistem em endonuclease CelD, endonuclease CelO, beta-glicosidase, xilanase, acetil xilana esterase, pectato liase PelA, pectato liase PelB e pectato liase PelD, o referido coquetel compreendendo ainda swolenina, um tampão, e opcionalmente inibidores de protease, a referida swolenina e as referidas enzimas de degradação de plantas no referido coquetel de degradação de plantas atuando sinergicamente para liberar 100% de açúcares fermentáveis produzidos a partir da referida amostra de biomassa.

10. Coquetel, de acordo com a reivindicação 9,

Petição 870190011705, de 04/02/2019, pág. 13/15

3/4 caracterizado pelo fato de que o referido tampão é um tampão de acetato de sódio e/ou um tampão de Tris-HCl.

11. Material de planta homogeneizado, caracterizado por compreender enzimas recombinantemente expressas produzidas em plastídios de plantas superiores, em que as referidas enzimas recombinantemente expressas consistem em endogluconase CelD, endoglucanase CelO, beta-glicosidase, acetil xilana esterase, pectato lisase PelA, pectato liase PelB e pectato liase PelD; o referido material de planta opcionalmente compreendendo rubisco e/ou swolenina, o referido material compreendendo ainda inibidores de protease e azida de sódio.

12. Material de planta homogeneizado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a enzima compreende mais de 0,1 por cento de proteína total no referido material de planta em pó.

13. Material de planta homogeneizado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido material de planta compreende rubisco.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido material de planta está homogeneizado.

15. Material de planta, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a proporção de enzima para rubisco é de 99:1 a 1:99; 50:1 a 1:50; 25:1 a 1:25; 10:1 a 1:10; 5:1 a 1:5; ou 2:1 a 1:2.

16. Coquetel de enzimas de degradação de plantas útil na digestão de uma amostra de biomassa à base de madeira, caracterizado por consistir em extratos de proteínas recombinantes expressas em cloroplastos, as referidas

Petição 870190011705, de 04/02/2019, pág. 14/15
4/4 proteínas recombinantes consistindo em endogluconase CelD, endoglucanase CelO, beta-glicosidase, xilanase, swolenina, acetil xilana esterase, pectato lisase PelA, pectato liase PelB e pectato liase PelD.

17. Coquetel, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido coquetel compreende um coquetel de inibidor de protease e azida de sódio.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido tampão é um tampão de acetato de sódio ou um tampão de Tris-HCl.