BRPI0909672B1 - método de imunoensaio in vitro para detecção da presença de células de câncer de fígado em um indivíduo, método para classificação de células de câncer de fígado presentes em um indivíduo, método in vitro para determinação de administrar ou não um agente anticâncer contendo um anticorpo anti-glipicano 3 a um indivíduo, e método in vitro para determinação de uma dose de um agente anticâncer contendo um anticorpo anti-glipicano 3 no tratamento de câncer de fígado em um indivíduo - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE IMUNOENSAIO IN VITRO PARA DETECÇÃO DA PRESENÇA DE CÉLULAS DE CÂNCER DE FÍGADO EM UM INDIVÍDUO, MÉTODO PARA CLASSIFICAÇÃO DE CÉLULAS DE CÂNCER DE FÍGADO PRESENTES EM UM INDIVÍDUO, MÉTODO IN VITRO PARA DETERMINAÇÃO DE ADMINISTRAR OU NÃO UM AGENTE ANTICÂNCER CONTENDO UM ANTICORPO ANTI-GLIPICANO 3 A UM INDIVÍDUO, E MÉTODO IN VITRO PARA DETERMINAÇÃO DE UMA DOSE DE UM AGENTE ANTICÂNCER CONTENDO UM ANTICORPO ANTI-GLIPICANO 3 NO TRATAMENTO DE CÂNCER DE FÍGADO EM UM INDIVÍDUO".

Campo da Técnica [001] A presente invenção refere-se a um método de imunoen- saio in vitro para detecção da presença de células de câncer de fígado em um indivíduo. Técnica Anterior [002] Uma vez que glipicano 3 é altamente expresso em câncer de fígado com frequência, a análise do perfil de expressão de glipica-no 3 em câncer de fígado é pensada ser provavelmente útil para a identificação funcional de glipicano 3 em câncer de fígado, o tratamento ou diagnóstico de câncer de fígado e a previsão de prognóstico de câncer de fígado. Para a análise de expressão geral de proteínas, imuno-histoquímica, particularmente, técnica de enzima anticorpo, é amplamente usada em diagnóstico patológico. A imuno-histoquímica é um método para detecção, altamente sensitivamente e especificamente, da presença e distribuição de uma substância (antí-geno) in vivo usando reagentes biológicos tais como anticorpos ou enzimas. Exemplos das características da imuno-histoquímica incluem: 1. Seus procedimentos são convenientes; 2. O método é amplamente aplicável de tal maneira que a informação bioquímica obtida pode ser aplicada à informação morfológica; 3. O método provê informação biologicamente e patologicamente importante; e 4. Cuidado diferente dos métodos comuns deve ser tomado porque o método usa reagentes biológicos. Além disso, marcação imuno-histoquímica também tem a vantagem que ele pode ser usado no diagnóstico patológico ou observação morfológica de interesse usando uma ampla faixa de amostras tais como seções congeladas frescas, amostras citológicas e seções de parafina de tecidos fixados.

[003] Dentre os métodos imuno-histoquímicos, imuno-marcação baseada na técnica de enzima anticorpo pode utilizar tecidos embebidos em parafina fixados com formalina usados em diagnóstico patológico comum e é então aplicado a uma faixa muito ampla. No entanto, a menos que cuidado suficiente seja tomado para, por exemplo, possíveis produtos derivados dos próprios tecidos fixados com formalina, não apenas a marcação termina sem sucesso, mas também tais produtos algumas vezes causam alteração de antígenos atribuída à fixação de formalina e inserção ou alteração de penetração ou reatividade de anticorpo, resultando em falso positivo ou falso negativo. Tal falso positivo ou falso negativo pode terminar em interpretação errada de resultados de marcação.

[004] Fixação com formalina usada em pesquisa histológica comum é útil para manutenção da morfologia, mas não é um fixador ideal do ponto de vista de manutenção da afinidade para anticorpos. Desta maneira, álcool ou similar é também usado ao invés de formalina como um fixador. No entanto, um método de fixação não foi ainda estabelecido, o qual seja excelente na manutenção da morfologia e possa preservar a afinidade de cada antígeno para anticorpos. Desta maneira, a fixação com formalina é um método de fixação prático amplamente usado, embora ele tenha um problema na manutenção da afinidade para anticorpos.

[005] Desta maneira, alguns métodos foram propostos para enfraquecimento da influência de fixação com formalina sobre a manutenção de afinidade para anticorpos. Uma primeira estratégia possível é selecionar um anticorpo que reconhece um epítopo não suscetível à fixação com formalina e uso do anticorpo em imuno-marcação. Tal anticorpo que reconhece um epítopo de antígeno não-suscetível à fixação com formalina, selecionado dentre os anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo, pode ser usado em imuno-marcação para então reduzir falso negativo. No entanto, glipicano 3 sofre modificação pós-traducional por protease ou similar após ser expresso sobre a superfície celular e desta maneira tem limitações em epítopos capazes de ligação a anticorpos. Desta maneira, esta abordagem não tem diversidade de epítopo para seleção de um epítopo adequado.

[006] Um segundo método é aumentar a sensibilidade de imuno-marcação para então detectar um antígeno que não pode ser visualizado através de um método comum. O método mais simples é um método que envolve adição de um metal pesado tal como cobre a DAB (tetraidrocloridrato de 3,3'-diaminobenzidino) geralmente usado para desenvolvimento de cor em imuno-marcação. No entanto, este método não pode ser esperado aumentar significantemente a sensibilidade.

Um método tal como método ABC (complexo de avidina-peroxidase biotinilada) ou método LSAB (anticorpo biotinilado com estreptavidina marcada), foi tentado, o qual envolve aumento da sensibilidade através de reação repetida de um anticorpo secundário biotinilado e ABC ou avidina marcada com enzima com seções. No entanto, foi confirmado que conforme o número de reações aumenta, marcação de base não-específica também tende a aumentar. Ainda, método EPOS (marcação de uma etapa de polímero aumentada) usando um polímero de dextrano marcado com enzima ou método CSA (amplificação de sinal catalisada) combinando tiramida biotinilada com método ABC se tor- nou disponível, melhorando drasticamente a sensibilidade de marcação. No entanto, na detecção de antígenos em tecidos fixados com formalina, o uso de tal método convencional tal como método ABC permite diagnóstico de tecidos de tumor como sendo positivo e tecidos normais ou não-normais como sendo negativo, com base no qual os tecidos de tumor podem ser diferenciados de tecidos de não-tumor, enquanto o uso do método altamente sensível provê detecção de até mesmo uma quantidade traço de antígenos em tecidos de não-tumor e pode então falhar em fazer tal diferenciação dependendo dos tipos de antígenos. Além disso, o método altamente sensível usado também tinha o problema de marcação de base aumentada, devido ao fato de ter alta sensibilidade.

[007] Um terceiro método é recuperar a reatividade de um antí-geno cuja reatividade com anticorpos foi reduzida devido à fixação com formalina. Em um método introduzido nos anos 70, que envolve digestão de seções com protease (método de recuperação de epítopo induzida por protease; daqui em diante referido como "método PIER" ou "método de recuperação de epítopo induzida por protease", as seções são digeridas com tripsina, pepsina, ou similar, antes da imuno-marcação. Este método tem problemas tais como descascamento de seções do vidro atribuído à digestão das próprias seções, e resultados de marcação instáveis.

[008] Desta maneira, método de recuperação de epítopo induzida por calor (daqui em diante referido como "método HIER" ou "método de recuperação de epítopo induzida por calor") foi desenvolvido nos anos 90. Aquecimento usando um micro-ondas, ebulição ou uma autoclave permite supostamente que um epítopo se ligue a anticorpos como um resultado de hidrólise do antígeno através do tratamento de alta temperatura. A expressão de glipicano 3 em câncer de fígado foi também detectada até agora através do método HIER (Documentos de Não-patente 1 a 5 e Documento de Patente 1). No entanto, uma vez que anticorpos antiglipicano 3 exibem reatividade cruzada com as células epiteliais de vasos sanguíneos ou sinusoides hepáticos, esta abordagem requer tratamento complicado que reação de bloqueio com um lisato de proteína derivado de célula do fígado normal é realizada previamente para excluir reação cruzada (Documento de Não-patente 4). Desta maneira, o método HIER convencionalmente usado não pode detectar com precisão glipicano 3 em tecidos de câncer de fígado de tal maneira que glipicano 3 originalmente expresso na membrana celular é observado como se esse antígeno fosse citoplasmicamente expresso (Documento de Não-Patente 2). Desta maneira, um método de detecção preciso para a expressão necessita ser desenvolvido como um substituto para o método HIER convencional.

[009] [Documento de Não-Patente 1] Capurro, M., Wanless, I.R., Sherman, M., Deboer, G., Gi, W., Miyoshi, E., Filmus, J., (2003) Gastroenterology 125 (1), 89-97 [0010] [Documento de Não-patente 2] Yamauchi, N., Watanabe, A., Hishinuma, M., Ohashi, K., Midorikawa, Y., Morishita, Y., Niki, T., Shibahara, J., Mori, M., Makuuchi, M., Hippo, Y., Kodama, T., Iwanari, H., Aburatani, H., Fukayama, M., (2005) Mod. Pathol. 18 (12), 1591-8 [0011] [Documento de Não-patente 3] Libbrecht, L., Severi, T., Cassiman, D., Vander Borght, S., Pirenne, J., Nevens, F., Verslype, C., van Pelt, J., Roskams, T., (2006) Am. J. Surg. Pathol. 30 (11), 1405-11 [0012] [Documento de Não-patente 4] Grozdanov, P.N., Yovchev, M.I., Dabeva, M.D., (2006) Lab. Invest. 86 (12), 1272-84 [0013] [Documento de Não-patente 5] Llovet, J.M., Chen, Y., Wurmbach, E., Roayaie, S., Fiel, M.I., Schwartz, M., Thung, S.N., Khit-rov, G., Zhang, W., Villanueva, A., Battiston, C., Mazzaferro, V., Bruix, J., Waxman, S., Friedman, S.L., (2006) Gastroenterology 131 (6), 1758-1767 [Documento de Patente 1] WO2003100429 [Documento de Patente 2] WO2006006693 [Documento de Patente 3] WO2004022739 Descrição da Invenção Problemas a serem Resolvidos pela Invenção [0014] A presente invenção foi realizada à luz de tais circunstância, e um objetivo da presente invenção é prover um método capaz de detectar precisamente o padrão de expressão de glipicano 3 em tecidos de câncer de fígado.

Meios para Resolver os Problemas [0015] Os presentes inventores terminaram a presente invenção através da constatação que tratamento de recuperação de antígeno com base em método de recuperação de epítopo induzida por vapor e tratamento de recuperação de antígeno com base em método de recuperação de epítopo induzida por protease podem ser combinados na detecção de expressão de antígeno de glipicano 3 em tecidos de câncer de fígado para então detectar a diferença no nível de expressão ou padrão de expressão do antígeno de glipicano 3 através do método de marcação imuno-histoquímico. Isto permitiu que amostras, que tinham sido determinadas através do método HIER convencional como expressando altamente glipicano 3, fossem graduadas de acordo com o nível de expressão de glipicano 3.

[0016] Especificamente, o presente pedido provê a invenção que segue: [1] um método de imunoensaio in vivo para detecção da presença de células de câncer de fígado em um indivíduo compreendendo as etapas de: (a) provisão de um conjunto de pelo menos duas preparações de tecido identificáveis como seções inseridas em parafina do mesmo indivíduo, as preparações de tecido identificáveis sendo prepa- radas a partir do indivíduo, então inseridas em parafina e presas a um apoio transparente; (b) submissão do conjunto das preparações de tecido a tratamento de desparafinização; (c) submissão de uma das preparações de tecido identificáveis no conjunto tratado na etapa (b) a tratamento de recuperação de antígeno com base no método de recuperação de epítopo induzida por calor, enquanto submetendo a outra preparação de tecido a tratamento de recuperação de antígeno com base no método de recuperação de epítopo induzida por protease; (d) contato de um anticorpo antiglipicano 3 com as preparações sob condições apropriadas para formação de um complexo do anticorpo antiglipicano 3 com glipicano 3 presente nas preparações de tecido tratadas na etapa (c); e (e) detecção da presença do complexo, em que o complexo está presente, o indivíduo é diagnosticado como tendo células de câncer de fígado;

[2] o método de acordo com [1], em que o método de recuperação de epítopo induzida por calor é aquecimento usando um micro-ondas;

[3] o método de acordo com [1], em que o método de recuperação de epítopo induzida por calor é aquecimento usando uma au-toclave;

[4] o método de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que a protease usada no método de recuperação de epítopo induzida por protease é selecionada do grupo consistindo em pepsina, tripsina e protease K;

[5] o método de acordo com qualquer um de [1] a [4], em que reação de detecção para detecção do complexo é reação enzimá-tica;

[6] o método de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que o anticorpo antiglipicano 3 é um anticorpo se ligando a um poli-peptídeo C-terminal de glipicano 3;

[7] Método de acordo com a reivindicação [6], em que o po- lipeptídeo C-terminal de glipicano 3 é um polipeptídeo consistindo em aminoácidos nas posições 359 a 580 descritos na SEQ ID N°: 1 ou um polipeptídeo consistindo em aminoácidos nas posições 375 a 580 no mesmo;

[8] o método de acordo com [6] a [7], em que o anticorpo antiglipicano 3 é anticorpo GC33;

[9] o método de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que o anticorpo antiglipicano 3 é um anticorpo 1G12;

[10] o método de acordo com qualquer um de [1] a [9], em que na etapa [e], a presença do complexo é digitalizada para detecção;

[11] o método de acordo com [10], em que a digitalização é realizada através do cálculo de acordo com a fórmula que segue: onde [0017] IRcp representa um score do nível de expressão de glipica- no 3;

[0018] PR representa um valor numérico determinado através da avaliação da proporção de células a partir das quais o complexo é detectado sob microscópio;

[0019] Si-Cp representa um valor numérico determinado através da avaliação da intensidade de marcação com a qual o complexo é detectado no citoplasma de células no campo visual sob microscópio; e [0020] SP representa um valor numérico determinado através da avaliação da proporção de células que exibem marcação de membra- na completa nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio;

[12] o método de acordo com [10], em que a digitalização é realizada através do cálculo de acordo com a fórmula que segue: em que [0021] IRcm representa o score de localização de uma membrana de glipicano 3;

[0022] PR representa um valor numérico determinado através de avaliação da proporção de células a partir das quais o complexo é detectado sob microscópio;

[0023] SI-Cm representa um valor numérico determinado através da avaliação da intensidade de marcação com a qual o complexo é detectado nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio; e [0024] SP representa um valor numérico determinado através da avaliação da proporção de células que exibem marcação de membrana completa nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio;

[13] um método para classificação de células de câncer de fígado presentes em um indivíduo com base nos scores calculados através de métodos de acordo com [11] e [12];

[14] um método para determinação de administração ou não de um agente anticâncer contendo um anticorpo antiglipicano 3 a um indivíduo com base nos scores calculados por meio dos métodos de acordo com [11] a [12]; e [15] um método para determinação de uma dose de um agente anticâncer contendo um anticorpo antiglipicano 3 no tratamento de câncer de fígado em um indivíduo com base nos scores calculados através de métodos de acordo com [11] e [12].

Breve Descrição dos Desenhos [0025] A figura 1 é um diagrama mostrando cada grau de classificações de SI;

[0026] A figura 2 é um diagrama mostrando cada grau de scores de SP;

[0027] A figura 3 é um diagrama mostrando resultados de preparações de marcação derivadas de modelos transplantados de células HuH-7 e HepG2;

[0028] A figura 4 é um diagrama mostrando resultados de preparações de marcação preparadas a partir de amostras clínicas de câncer de fígado humano;

[0029] A figura 5A é um diagrama mostrando o efeito antitumor de um anticorpo hCG33 sobre modelos de camundongo transplantados com câncer de fígado humano;

[0030] A figura 5B é um diagrama mostrando o efeito antitumor de um anticorpo hCG33 sobre modelos de camundongo transplantados com câncer de fígado humano;

[0031] A figura 5C é um diagrama mostrando o efeito antitumor de um anticorpo hGC33 sobre modelos de camundongo transplantados com câncer de fígado humano; e [0032] A figura 5D é um diagrama mostrando o efeito antitumor de um anticorpo hCG33 sobre modelos de camundongo transplantados com câncer de fígado.

[0033] O presente relatório compreende os teores descritos no relatório do Pedido de Patente Japonês No. 2008-068316 que serve como uma base para a prioridade do presente pedido.

Melhor Modo de Realizar a Invenção Preparações de Tecido [0034] O termo "preparação de tecido" usado aqui refere-se a uma preparação biológica arbitrária obtida de indivíduos, fluidos do corpo (por exemplo, sangue, soro, plasma e fluido espinhal), culturas de tecido, ou seções de tecido, ou similar. Exemplos preferidos da preparação biológica usada incluem preparações derivadas de indivíduo. As preparações derivadas de indivíduo são preferivelmente tecidos obtidos do indivíduo, mais preferivelmente tecidos do fígado do indivíduo. Biópsia, um método conhecido na técnica, é preferivelmente usada como um método para coleta de tecidos do fígado. A biópsia do fígado refere-se a um método que envolve inserção direta de uma agulha longa fina no fígado a partir da superfície da pele para coletar os tecidos do fígado. O sítio de punção com a agulha é geralmente entre as costelas do lado direito do tórax inferior. Antes da operação, a segurança do sítio de punção é confirmada usando um aparelho de exame ultrassônico, e, então, o sítio de punção é desinfetado. Ainda, a região da pele até a superfície do fígado é anestesiada, e punção é realizada usando uma agulha de punção após pequena incisão da pele no sítio de punção.

[0035] Na presente invenção, as preparações de tecido são observadas com uma luz transmitida sob microscópio e então cortadas em fatias finas para tal grau de maneira que a luz usada no microscópio penetre suficientemente as preparações de tecido. Antes do corte em fatias finas, as preparações de tecido são fixadas. Especificamente, as preparações de tecido são solidificadas através da desidratação ou desnaturação de proteínas no tecido/células para então rapidamente matar as células que constituem os tecidos. Os tecidos resultantes têm uma estrutura estabilizada e insolubilizada. Primeiro, as preparações de tecido a serem fixadas são cortadas usando uma ferramenta de corte (por exemplo, bisturi cirúrgico) em fragmentos tendo tamanho e formato adequados para preparação de seções inseridas em parafina. Subsequentemente, os fragmentos são mergulhados em um fixador, um reagente usado para realizar a fixação. O fixador usado é preferi- velmente formalina, mais preferivelmente formalina tamponada neutra. A concentração da formalina tamponada neutra é apropriadamente selecionada de acordo com as características ou propriedades físicas das preparações de tecido. A concentração pode ser mudada apropriadamente entre 1 e 50%, preferivelmente entre 5 e 25%, mais preferivelmente entre 10 e 15%, para uso. O fixador contendo as preparações de tecido banhadas nele é apropriadamente desgaseificado sob uma bomba de vácuo. A fixação é realizada deixando as preparações de tecido no fixador por várias horas sob condições que envolvem pressão normal e temperatura ambiente. O tempo requerido para a fixação pode ser selecionado apropriadamente dentro da faixa de uma hora a 7 dias, preferivelmente duas horas a 3 dias, mais preferivelmente 3 horas a 24 horas, mais preferivelmente ainda 4 horas a 16 horas. As preparações então fixadas são apropriadamente mergulhadas mais em um tampão de fosfato ou similar por várias horas (o tempo pode ser selecionado apropriadamente dentro da faixa de duas horas a 48 horas, preferivelmente 3 horas a 24 horas, mais preferivelmente 4 horas a 16 horas).

[0036] Em seguida, a partir das preparações de tecido fixadas, as seções podem ser preparadas preferivelmente usando método de seção congelada ou método de seção de parafina. Exemplos preferidos do método de seção congelada incluem um método que envolve congelamento dos tecidos através da adição em composto O.C.T. (Miles, Inc.) e corte dos tecidos congelados em fatias finas usando um criosta-to (aparelho de preparação de seção congelada). No método de seção de parafina, as preparações de tecido fixadas são mergulhadas em um agente de inserção que é então solidificado para dar dureza uniforme e apropriada às seções. Parafina pode ser usada preferivelmente como o agente de inserção. As preparações de tecido fixadas são desidratadas usando etanol. Especificamente, as preparações de tecido são desidratadas mergulhando sequencialmente as preparações de tecido em etanol 70%, etanol 80% e etanol 100%. O tempo requerido para o banho e o número de banhos podem ser selecionados apropriadamente dentro das faixas de uma hora a vários dias e uma vez a 3 vezes. Além disso, o banho pode ser realizado em temperatura ambiente ou a 4°C. Para o banho a 4°C, um tempo de banho mais longo (por exemplo, de um dia para o outro) é preferível. Subsequentemente, a fase líquida é substituída por xileno e, então, as preparações de tecido são inseridas em parafina. O tempo requerido para a substituição da fase líquida por xileno pode ser selecionado apropriadamente dentro de faixa de uma hora a várias horas. Neste procedimento, a substituição pode ser realizada em temperatura ambiente ou a 4°C. Para a substituição a 4°C, um tempo de substituição mais longo (por exemplo, da noite para o dia) é preferível. O tempo requerido para a inserção de parafina e o número da mesma podem ser selecionados apropriadamente dentro das faixas de uma hora a várias horas e uma vez a 4 vezes. Neste procedimento, a inserção pode ser realizada em temperatura ambiente ou a 4°C. Para a inserção a 4°C, um tempo de inserção maior (por exemplo, da noite para o dia) é preferível. Além disso, as preparações de tecido podem ser combinadas com parafina preferivelmente através do uso de um aparelho de inserção de parafina (por exemplo, EG1160, Leica Mycrosystems) que processa automaticamente reação de inserção de parafina.

[0037] As preparações de tecido então combinadas com parafina são presas a uma base para preparar um "bloco", que é então cortado usando um micrótomo em fatias finas da espessura desejada selecionada das espessuras de 1 a 20 μιτι. As seções de tecido finas então cortadas são deixadas ficar em lâmina de vidro como um apoio transparente para ligação. Neste caso, lâmina de vidro que é revestida com po-li-L-lisina 0,01% (Sigma-Aldrich Co.) para prevenção de descascamento das seções de tecido e seca pode ser também usada preferivelmente. As seções de tecido presas são secas em ar por um tempo apropriado selecionado entre vários minutos e 1 hora.

[0038] Na presente invenção, um conjunto de duas preparações de tecido então preparadas e presas ao apoio transparente é preparado. Essas preparações de tecido são preferivelmente duas preparações de tecido histologicamente identificáveis. O termo "identificável" significa que duas preparações de tecido comparadas uma com a outra são compostas de células ou tecidos quase idênticos na preparação derivada do indivíduo da qual as preparações de tecido são derivadas. Por exemplo, duas preparações de tecido preparadas como seções adjacentes são as duas preparações de tecido identificáveis. Na presente invenção também, as "duas preparações de tecido identificáveis" referem-se a duas preparações de tecido preparadas como seções adjacentes, a menos que de outra maneira especificado. Ainda, duas preparações de tecido que não são preparadas como seções adjacentes, mas são compostas de células ou tecidos cujas construções são identificáveis entre as duas preparações de tecido, são aplicáveis às "duas preparações de tecido identificáveis". Exemplos preferíveis das duas preparações de tecido que são compostas de células ou tecidos cujas construções são identificáveis entre as duas preparações de tecido incluem: (1) seções contendo células derivadas de células idênticas localizadas em posições idênticas nas coordenadas de plano nas seções de tecido; e (2) seções cuja proporção de tais células presentes em posições idênticas nas coordenadas de plano é pelo menos 50% ou maior, preferivelmente 60% ou maior, mais preferivelmente 70% ou maior, mais preferivelmente ainda 80% ou mais, com mais preferência ainda 90% ou mais, particularmente preferivelmente 95% ou mais.

Recuperação de antígeno [0039] No método da presente invenção, a reatividade de um antí-geno cuja reatividade foi reduzida devido à fixação com formalina é recuperada. Na presente invenção, o método de recuperação de epí-topo induzida por protease (método PIER) é aplicado a uma das duas preparações de tecido, enquanto o método de recuperação de epítopo induzida por calor (método HIER) é aplicado à outra preparação. Então, a diferença no grau de marcação entre eles após reação do anticorpo é digitalizada.

[0040] O método de recuperação de epítopo induzida por calor utiliza apropriadamente método de aquecimento usando um método de aquecimento usando um micro-ondas, método de aquecimento usando uma autoclave ou método de aquecimento com base em tratamento com ebulição ou similar. Quando o tratamento com ebulição é realizado em uma alimentação de 780 W para manter a temperatura da solução em aproximadamente 98°C, o tempo requerido para a recuperação incluindo o tratamento é apropriadamente selecionado entre 5 minutos e 60 minutos e é, por exemplo, 10 minutos. O tratamento de recuperação de antígeno pode ser realizado em um tampão de citrato de sódio a 10 mM bem como Target Retrieval Solution comercialmente disponível (DakoCytomation) ou similar. Nos exemplos descritos mais tarde, a Target Retrieval Solution é usada. Qualquer tampão ou solução aquoso é preferivelmente usado contanto que um epítopo no antí-geno reconhecido por um anticorpo antiglipicano 3 adquira afinidade para o anticorpo como um resultado de tratamento de recuperação de maneira que um complexo antígeno-anticorpo descrito mais tarde possa ser detectado.

[0041] A protease usada no método de recuperação de epítopo induzida por protease não é particularmente limitada em seu tipo ou origem, e geralmente protease disponível pode ser selecionada apropriadamente para uso. Exemplos preferidos da protease usada inclu- em pepsina com uma concentração de 0,05% em ácido clorídrico 0,01N, tripsina com uma concentração de 0,1% contendo ainda CaCl2 0,1% em um tampão de Tris (pH 7,6) e protease K com uma concentração de 1 a 50 μg/ml em um tampão de Tris-HCl 10 mM (pH 7,8) contendo EDTA 10 mM e SDS 0,5%. Ainda, quando a protease JK é usada, o pH de sua solução de reação é apropriadamente selecionado entre 6,5 e 9,5 e o reagente SH ou um inibidor de tripsina ou quimio-tripsina pode ser usado apropriadamente. Protease incluída no estojo Histofine Her2 (Mono) (Nichirei Bioscience) descrita nos Exemplos do presente relatório está também incluída em tais exemplos específicos de protease preferível. A recuperação de epítopo induzida por protease é geralmente realizada a 37°C. No entanto, a temperatura de reação pode ser mudada apropriadamente dentro da faixa de 25°C a 50°C. Quando a recuperação de epítopo induzida por protease é realizada a 37°C, o tempo de reação é apropriadamente selecionado entre, por exemplo, 1 minuto e 5 horas e é, por exemplo, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, uma hora, duas horas, 3 horas ou 4 horas. Após o término do tratamento de recuperação, as preparações de tecido então tratadas são lavadas com um tampão de lavagem. PBS (solução salina tamponada com fosfato) é preferivelmente usada como o tampão de lavagem. Ainda, um tampão de Tris-HCl pode ser usado preferivelmente. As condições de lavagem geralmente adotam um método envolvendo realização de lavagem em temperatura ambiente por 5 minutos três vezes. No entanto, o tempo de lavagem e a temperatura podem ser mudados apropriadamente.

Anticorpo antiglipicano 3 [0042] Qualquer anticorpo antiglipicano 3 pode ser usado preferivelmente no método da presente invenção contanto que o anticorpo tenha a atividade de ligação a glipicano 3. Exemplos particularmente preferíveis do anticorpo incluem um anticorpo GC33 (Documento de Patente 2) e um anticorpo 1G12 (Documento de Patente 1) descritos nos Exemplos abaixo. Além disso, em adição a esses anticorpos conhecidos na técnica, o anticorpo antiglipicano 3 preferivelmente usado na presente invenção pode ser obtido através da imunização de animais não-humanos com glipicano 3 como um antígeno de imunização. Métodos para preparação de tais anticorpos antiglipicano 3 são descritos nos Documentos de Patente 1 e 2 e aqueles versados na técnica podem apropriadamente obter o anticorpo antiglipicano 3 desejado com base nos métodos.

[0043] A ligação do anticorpo antiglipicano 3 a glipicano 3 pode ser detectada preferivelmente através de um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica. Por exemplo, ELISA (ensaio imu-noabsorvente ligado à enzima), EIA (imunoensaio de enzima), RIA (radioimunoensaio) ou fluoroimunoensaio pode ser usado. Esses métodos são descritos no livro geral "Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988".

[0044] Exemplos de um método para ensaio da atividade de ligação do anticorpo a células expressando o antígeno incluem métodos descritos nas p. 359-420 em Antibodies A Laboratory Manual (Ed. Har-low, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Especificamente, a atividade de ligação pode ser avaliada preferivelmente de acordo com os princípios de ELISA ou FACS (seleção de célula ativada por fluorescência) com as células como um antígeno. No formato ELISA, a atividade de ligação do anticorpo às células é quantitativamente avaliada comparando os níveis de sinais formados através de reação enzimática. Especificamente, as células forçadas a expressar o antígeno são imobilizadas em uma placa de ELISA, à qual anticorpos de teste são então adicionados. Anticorpos ligados à célula são detectados usando anticorpos marcados com enzima reconhecendo os anticorpos de teste. Alternativamente, em FACS, séries de diluição de an- ticorpos de teste são preparadas, e seus títulos de anticorpo para células forçadas a expressar o antígeno podem ser determinados para então comparar a atividade de ligação entre elas às células.

[0045] O formato FACS pode ensaiar um antígeno expresso na superfície de carreador (por exemplo, placa de ELISA) - células não-ligadas suspensas em um tampão ou similar bem como a ligação do anticorpo ao antígeno. Exemplos de um citômetro de fluxo usado em tal ensaio incluem: FACSCanto® II, FACSAria®, FACSArray®, FACSVantage® SE e FACSCalibur® (todos BD Biosciences); e EPICS ALTRA HyPerSort, Cytomics FC 500, EPICS XL-MCL ADC, EPICSXL ADC e Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos Beckman Coulter). [0046] Um exemplo preferível do método para ensaio da atividade de ligação do anticorpo antiglipicano 3 ao antígeno inclui um método usando anticorpos secundários reconhecendo anticorpos de teste reagidos com células expressando glipicano 3. Especificamente, as células expressando glipicano 3 são reagidas com anticorpos de teste e marcadas com anticorpos secundários marcados com FITC, seguido por ensaio usando FACScalibur (BD Biosciences). A intensidade de fluorescência obtida é analisada usando Software CELL QUEST (BD Biosciences). De acordo com este método, a atividade de ligação do anticorpo ao antígeno pode ser determinada através de: análise, usando software CELL QUEST, da intensidade de fluorescência obtida em ensaio FACScalibur; e comparação do valor médio geométrico (valor Geo-Médio objeto) obtido através deste procedimento, com um valor Geo-Médio controle obtido usando um anticorpo controle como um anticorpo primário. Uma fórmula de cálculo para determinar os valores Geo-Médios (média geométrica) é descrita no Guia do Usuário do SOftwareCELL QUEST (BD biosciences).

Reação de preparações de tecido com anticorpo antiglipicano 3 [0047] A preparação de tecido submetida ao tratamento de recu- peração de antígeno com base no método de recuperação de epítopo induzida por calor e a preparação de tecido submetida ao tratamento de recuperação de antígeno com base no método de recuperação de epítopo induzida por protease são reagidas com o anticorpo antiglipi-cano 3 como um anticorpo primário. Esta reação é realizada sob condições apropriadas para reconhecimento de um epítopo no antígeno pelo anticorpo antiglipicano 3 e formação de um complexo antígeno-anticorpo. A reação é geralmente realizada da noite para o dia a 4°C ou a 37°C por uma hora. No entanto, as condições de reação podem ser mudadas apropriadamente dentro de uma faixa apropriada para reconhecimento de um epítopo no antígeno pelo anticorpo e formação de um complexo antígeno-anticorpo. Por exemplo, a temperatura de reação pode ser mudada dentro da faixa de 4°C a 50°C, e o tempo de reação pode ser mudado entre 1 minuto e 7 dias. Para a reação em temperaturas baixas, um tempo de reação mais longo é preferível. Após o término da reação de anticorpo primário, as preparações de tecido são lavadas com um tampão de lavagem. PBS (solução salina tamponada com fosfato) é preferivelmente usada como o tampão de lavagem. Ainda, um tampão Tris-HCl pode também ser preferivelmente usado. As condições de lavagem geralmente adotam um método envolvendo realização de lavagem em temperatura ambiente por 5 minutos três vezes. No entanto, o tempo e a temperatura de lavagem podem ser mudados apropriadamente.

[0048] Subsequentemente, as preparações de tecido submetidas à reação de anticorpo primário são reagidas com um anticorpo secundário que reconhece o anticorpo primário. Um anticorpo secundário marcado previamente com um material de marcação para visualização do anticorpo secundário é geralmente usado. Exemplos preferíveis do material de marcação incluem: corantes fluorescentes tais com FITC (isotiocianato de fluoresceína), Cy2 (Amersham Biosciences) e Ale- xa488 (Molecular Probes, Inc.); enzimas tais como peroxidase e fosfa-tase alcalina; e ouro coloidal.

[0049] A reação com o anticorpo secundário é realizada sob condições apropriadas para formação de um complexo antígeno-anticorpo pelo anticorpo antiglipicano 3 e o anticorpo secundário reconhecendo o anticorpo antiglipicano 3. A reação é geralmente realizada em temperatura ambiente ou 37°C por 30 minutos a uma hora. No entanto, as condições de reação podem ser mudadas apropriadamente dentro de uma faixa apropriada para formação de um complexo antígeno-anticorpo pelo anticorpo antiglipicano 3 e o anticorpo secundário. Por exemplo, a temperatura de reação pode ser mudada dentro da faixa de 4°C a 50°C, e o tempo de reação pode ser mudado entre 1 minuto e 7 dias. Para a reação em temperaturas baixas, um tempo de reação mais longo é preferível. Após o término da reação de anticorpo secundário, as preparações de tecido são lavadas com um tampão de lavagem. PBS (solução salina tamponada com fosfato) é preferivelmente usada como o tampão de lavagem. Ainda, um tampão Tris-HCl pode ser também preferivelmente usado. As condições de lavagem geralmente adotam um método envolvendo realização de lavagem em temperatura ambiente por 5 minutos três vezes. No entanto, o tempo e a temperatura de lavagem podem ser mudados apropriadamente.

[0050] Em seguida, as preparações de tecido submetidas à reação de anticorpo secundário são reagidas com uma substância para visualização do material de marcação. Quando peroxidase é usada como o material de marcação para o anticorpo secundário, as preparações de tecido são incubadas com uma solução de reação obtida através de mistura, imediatamente antes da incubação, de quantidades iguais de uma solução de peróxido de hidrogênio aquosa 0,02% e uma solução de DAB (diaminobenzidina) ajustada para uma concentração de 0,1% com um tampão de Tris-HCl 0,1M (pH 7,2). Em adição a DAB, substra- tos cromogênicos tais como DAB-Ni e AEC+ (todos DAKO) podem ser apropriadamente selecionados. Durante a incubação, o grau de desenvolvimento de cor é observado sob microscópio em intervalos. No ponto no tempo quando desenvolvimento de cor é confirmado, a reação de visualização é terminada banhando as preparações de tecido em PBS.

[0051] Quando fosfatase alcalina é usada como o material de marcação para o anticorpo secundário, as preparações de tecido são incubadas com solução de substrato BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato)/NBT (nitro azul de tetrazólio) (Zymed Laboratories, Inc.) (NBT em uma concentração de 0,4 mM e BCIP em uma concentração de 0,38 mM são dissolvidos em um tampão de carbonato de sódio 50 mM (pH 9,8) contendo MgCl2 10 mM e NaCl 28 mM). Além disso, em adição a BCIP e NBT, Permanent Red, Fast Red ou Fuchsin+ (todos DA-KO) podem ser usados apropriadamente. Antes da incubação, as preparações de tecido podem ser pré-incubadas em temperatura ambiente por 1 minuto a várias horas com um tampão de Tris-HCl 0,1M (pH 9,5) contendo cloreto de levamisol (inibidor para fosfatase alcalina en-dógena; Nacalai Tesque) em uma concentração de 1 mM, cloreto de sódio 0,1 M e cloreto de magnésio 50 mM. Durante a incubação, as preparações de tecido são observadas sob microscópio em intervalos. No ponto de tempo quando os depósitos de formazan púrpura, um produto de reação final, são observados, a reação é terminada através de lavagem das preparações de tecido com água ou adição de TBS contendo álcool de polivinila 2%. Então, as preparações de tecido são lavadas com TBST (TBS contendo Tween 20 0,1%). Quando ouro co-loidal é usado como o marcador para o anticorpo secundário, o ouro coloidal é visualizado através de ligação de prata metálica às partículas de ouro através de aumento da prata. O método de aumento de prata é geralmente conhecido daqueles versados na técnica.

[0052] Quando qualquer um dos corantes fluorescentes tais como FITC (isotiocianato de fluoresceína), Cy2 (Amersham Biosciences) e Alexa488 (Molecular Probes, Inc.) é usado como o material de marcação para o anticorpo secundário, a etapa de reação da substância de visualização é desnecessária. Uma luz emitida por irradiação com uma luz no comprimento de onda de excitação do material fluorescente pode ser detectada apropriadamente através do uso de um microscópio de fluorescência.

Classificação de tecidos de câncer de fígado e previsão de efeito terapêutico [0053] Glipicano 3 é conhecido liberar sua porção N-terminal no soro quando da digestão em tecidos de câncer de fígado (Documento de Patente 3). Desta maneira, quando um anticorpo se ligando a tal peptídeo parcial N-terminal de glipicano 3 liberado no soro quando da digestão é usado no método da presente invenção, este anticorpo não pode se ligar ao polipeptídeo parcial N-terminal que está ainda ancorado na superfície celular após sofrer digestão. Por outro lado, quando um anticorpo se ligando ao peptídeo parcial C-terminal é usado no método da presente invenção, este anticorpo pode se ligar ao polipeptídeo parcial C-terminal que está ainda ancorado na superfície celular após sofrer digestão. Especificamente, o anticorpo antiglipicano 3 usado na presente invenção pode ser selecionado apropriadamente de acordo com os propósitos para então obter ambas a detecção do polipeptídeo parcial de glipicano 3 ancorado na superfície celular, sem importar se sofre ou não digestão, e a detecção do polipeptídeo parcial de glipicano 3 que está ancorado na superfície celular antes de ser digerido e liberado no soro quando da digestão.

[0054] Anticorpos antiglipicano 3 foram verificados ser úteis para o tratamento e prevenção de câncer do fígado (Documento de Patente 3). Atividade de morte celular exibida por tal anticorpo antiglipicano 3 terapêutico é principalmente exercida por atividade citotóxica dependente de anticorpo (atividade ADCC) ou atividade citotóxica dependente de complemento (atividade CDC) que é iniciada pela ligação de células efetoras ou complemento ao domínio Fc do anticorpo antiglipica-no 3 ligado ao polipeptídeo parcial C-terminal ancorado na superfície celular. Desta maneira, quando o efeito terapêutico do anticorpo anti-glipicano 3 sobre câncer de fígado é previsto a partir do ponto de vista de se ou não um epítopo ligado pelo anticorpo antiglipicano 3 está presente em tecidos de câncer de fígado, o anticorpo antiglipicano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial C-terminal pode ser usado preferivelmente no método da presente invenção.

[0055] Foi sugerido que o sítio de digestão de glipicano 3 em tecidos de câncer de fígado é o polipeptídeo ligado entre aminoácidos nas posições 358 e 359 da molécula de glipicano 3 representada pela SEQ ID N°: 1 ou entre aminoácidos nas suas posições 374 e 375 (Documento de Patente 3). Desta maneira, exemplos do anticorpo antiglipi-cano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial C-terminal, preferivelmente usado na presente invenção, incluem anticorpos se ligando a um poli-peptídeo consistindo em aminoácidos nas posições 359 a 580 da molécula de glipicano 3 representada pela SEQ ID N°: 1 ou um polipeptí-deo consistindo em aminoácidos nas suas posições 375 a 580.

[0056] Por outro lado, quando o efeito terapêutico do anticorpo an-tiglipicano 3 terapêutico é previsto a partir do ponto de vista de maturidade da molécula de glipicano 3, o anticorpo antiglipicano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial N-terminal pode ser usado no método da presente invenção. Neste caso, uma molécula de glipicano 3 reconhecida pelo anticorpo antiglipicano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial N-terminal pode ser caracterizada como uma molécula alvo-terapêutica imatura, e células de câncer de fígado expressando tal molécula de glipicano 3 podem ser caracterizadas como células alvo terapêuticas mais imaturas.

[0057] O anticorpo antiglipicano 3 se ligando ao polipeptídeo C-terminal da molécula de glipicano 3 detecta a molécula de glipicano 3, sem importar o grau de maturidade. Por outro lado, o anticorpo antigli-picano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial N-terminal da molécula de glipicano 3 detecta uma molécula de glipicano 3 imatura, mas não detecta uma molécula de glipicano 3 madura. Especificamente, moléculas de glipicano 3 detectadas através do método da presente invenção e células de câncer de fígado expressando tais moléculas de glipicano 3 podem ser classificadas com base no grau de maturidade através do uso de dois anticorpos, isto é, o anticorpo se ligando ao polipeptídeo parcial C-terminal da molécula de glipicano 3 e o anticorpo se ligando ao polipeptídeo parcial N-terminal.

[0058] Daqui em diante, este método de classificação será descrito mais especificamente. Dois anticorpos, isto é, o anticorpo antigli-picano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial C-terminal da molécula de glipicano 3 e o anticorpo antiglipicano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial N-terminal da molécula de glipicano 3, são preparados como anticorpos primários. Duas preparações de tecido são preparadas a partir do mesmo indivíduo, uma das quais é reagida com o anticorpo antiglipicano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial N-terminal da molécula de glipicano 3 como um anticorpo primário e a outra preparação de tecido é reagida com um anticorpo antiglipicano 3 se ligando ao po-lipeptídeo parcial C-terminal da molécula de glipicano 3 como outro anticorpo primário. Uma molécula de glipicano 3 detectada usando o anticorpo antiglipicano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial N-terminal da molécula de glipicano 3 pode ser avaliada como uma molécula mais imatura a partir do ponto de vista do grau de sua maturidade, e células de câncer de fígado expressando tal molécula de glipicano 3 podem ser avaliadas como células mais imaturas. Além disso, uma molécula de glipicano 3 que não pode ser detectada usando o anticorpo antiglipicano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial N-terminal da molécula de glipicano 3, mas é detectada usando o anticorpo antiglipica-no 3 se ligando ao polipeptídeo parcial N-terminal da molécula de gli-picano 3, pode ser avaliada como uma molécula mais madura a partir do ponto de vista de sua maturidade, e células de câncer de fígado expressando tal molécula de glipicano 3 podem ser avaliadas como células mais maduras.

[0059] Quando o anticorpo antiglipicano 3 se ligando ao polipeptí-deo parcial N-terminal da molécula de glipicano 3 e o anticorpo antigli-picano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial C-terminal da molécula de glipicano 3 pertencem a subclasses de anticorpo diferentes umas das outras ou são produzidos de animais de tipos diferentes, ensaio pode ser conduzido usando uma preparação de tecido. Neste caso, um anticorpo secundário que reconhece o anticorpo antiglipicano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial N-terminal e um anticorpo secundário reconhecendo o anticorpo antiglipicano 3 se ligando ao polipeptídeo parcial C-terminal são marcados com enzimas ou fluorescências de tipos diferentes. Como resultado, esses dois anticorpos antiglipicano 3 podem ser usados na detecção de uma preparação de tecido.

Digitalização de reatividade com anticorpo antiglipicano 3 [0060] A presente invenção provê um método para digitalização da diferença no grau e no padrão de detecção sob microscópio de um complexo antígeno-anticorpo formado de glipicano 3 e um anticorpo antiglipicano 3, com base na diferença entre reações de recuperação de antígeno (isto é, método de recuperação de epítopo induzida por calor e método de recuperação de epítopo induzida por protease). [0061] Em um aspecto, a digitalização é realizada de acordo com a fórmula (1) que segue: IRcp=PR+(SI-Cp)+SP onde [0062] IRcp representa um score do nível de expressão de glipica- no 3;

[0063] PR representa um valor numérico determinado através da avaliação da proporção de células das quais o complexo é detectado sob microscópio;

[0064] Si-Cp representa um valor numérico determinado através da avaliação da intensidade de marcação com a qual o complexo é detectado no citoplasma de células no campo visual sob microscópio; e [0065] SP representa um valor numérico determinado através da avaliação da proporção de células que exibem marcação de membrana completa nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio.

[0066] Os scores de PR são calculados de maneira que: (a) no campo visual sob microscópio usando uma lente objetiva com uma amplificação de 4 ou 10, (i) quando a proporção de células a partir das quais o complexo é detectado é zero, o score da amostra é 0, (ii) quando esta proporção é menor do que 20%, o score da amostra é 1, (iii) quando esta proporção é igual a ou maior do que 20% e menor do que 50%, o score da amostra é 2 e (iv) quando esta proporção é igual a ou maior do que 50%, o score da amostra é 3.

[0067] Os scores SI-Cp são calculados de maneira que: (b) nos citoplasmas de células no campo visual sob microscópio, (i) quando a proporção de células a partir das quais o complexo é detectado é zero usando uma lente objetiva com uma am- plificação de 4 ou 10 no microscópio, o score da amostra é 0, (ii) quando resposta positiva, embora obscura, é ligeiramente observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 10 no microscópio, o score da amostra é 1, (iii) quando resposta positiva é ligeiramente observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 2, (iv) quando resposta positiva é suficientemente reconhecível mesmo usado uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 3, e (v) quando resposta positiva forte é claramente reconhecida e observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 4.

[0068] Os scores de SP são calculados de maneira que: (c) na de- tecção do complexo nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio, (i) quando a membrana celular não exibe nenhuma resposta positiva, o score da amostra é 0, (ii) quando menos de 20% das células exibindo resposta positiva exibem marcação de membrana completa, o score da amostra é 1, (iii) quando 20% ou mais e menos do que 50% de células exibindo resposta positiva exibem marcação de membrana completa, o score da amostra é 2, e (iv) quando 50% ou mais das células exibindo resposta positiva exibem marcação de membrana completa, o score da amostra é 3.

[0069] Em outro aspecto, a digitalização é realizada através de cálculo de acordo com a fórmula (2) que segue: IRCm=PR+(SI-Cm)+SP onde [0070] IRCm representa um score de localização de membrana de glipicano 3; PR representa um valor numérico determinado através de avaliação da proporção de células a partir das quais o complexo é detectado sob microscópio;

[0071] SI-Cm representa um valor numérico determinado através de avaliação da intensidade de marcação com a qual o complexo é detectado nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio; e [0072] SP representa um valor numérico determinado através da avaliação da proporção de células que exibem marcação de membrana completa nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio.

[0073] As classificações de RP são calculadas de maneira que: (a) no campo visual sob microscópio usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4 ou 10, (i) quando a proporção de células a partir das quais o complexo é detectado é zero, a classificação da amostra é 0, (ii) quando esta proporção é menor do que 20%, as classificação da amostra é 1, (iii) quando esta proporção é igual a ou maior do que 20% e menor do que 50%, a classificação da amostra é 2, e (iv) quando esta proporção é igual a ou maior do que 50%, a classificação da amostra é 3.

Os scores de SI-Cm são calculados de maneira que: (b) nas membranas celulares de células no campo visual sob o microscópio, (i) quando a proporção de células a partir das quais o complexo é detectado é zero usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4 ou 10 no microscópio, a classificação da amostra é 0, (ii) quando resposta positiva, embora obscura, é ligeiramente observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 10 no microscópio, a classificação da amostra é 1, (iii) quando resposta positiva obscura para uma lente objetiva com uma ampliação de 4 mas suficientemente reconhecível usando uma lente objetiva com uma ampliação de 10 é observada, a classificação da amostra é 2, (iv) quando resposta positiva é suficientemente reconhecível mesmo usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, a classificação da amostra é 3, (v) quando resposta positiva forte é claramente reconhecida e observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, a classificação da amostra é 4.

[0074] Os scores de SP são calculados de maneira que: (c) na de- tecção do complexo nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio, (i) quando as membranas celulares não exibem nenhuma resposta positiva, a classificação da amostra é 0, (ii) quando menos de 20% de células exibindo resposta positiva exibem marcação de membrana completa, a classificação da amostra é 1, (iii) quando 20% ou mais e menos do que 50% de células exibindo resposta positiva exibem marcação de membrana completa, a classificação da amostra é 2, e (iv) quando 50% ou mais de células exibindo resposta positiva exibem marcação de membrana completa, a classificação da amostra é 3.

[0075] Neste caso, os scores calculados com base nas fórmulas (1) e (2) são determinados para cada preparação de tecido submetida ao método de recuperação de epítopo induzida por calor e a prepara- ção de tecido submetida ao método de recuperação de epítopo induzida por protease. O score calculado com base na fórmula (1) é uma classificação que reflete o nível de expressão de glipicano 3. O score calculado com base na fórmula (2) é uma classificação refletindo a localização de expressão de glipicano 3 na membrana celular. O método de digitalização da presente invenção permite que células de câncer de fígado presentes em um indivíduo sejam classificadas com base no nível de expressão ou padrão de expressão de glipicano 3. Conforme mostrado nos Exemplos abaixo, foi confirmado que a classificação é realizada eficazmente usando preparações de tecido realmente coletadas de pacientes com câncer de fígado. Foi confirmado ainda que a classificação é também realizada eficazmente em modelos animais de câncer de fígado onde HuH-7 ou HepG2, uma cepa de célula de câncer de fígado cujo nível de expressão de glipicano 3 foi determinado, é transplantada.

[0076] Na presente invenção, resultados de administração de um anticorpo antiglipicano 3 terapêutico a modelos animais de câncer de fígado demonstraram ainda que a diferença no nível de expressão e padrão de expressão de glipicano 3 em câncer de fígado classificados através de digitalização de acordo com o método da presente invenção se relaciona com a diferença no efeito terapêutico do anticorpo antiglipicano 3 terapêutico sobre câncer de fígado. Especificamente, foi mostrado que a diferença no efeito terapêutico do anticorpo antigli-picano 3 terapêutico é determinada com base na diferença em scores digitalizados de acordo com a presente invenção. O método de digitalização de acordo com a presente invenção provê previsão do efeito terapêutico de um agente terapêutico para câncer de fígado contendo um anticorpo antiglipicano 3 como um ingrediente ativo sobre câncer de fígado. Além disso, o método digitalizado de acordo com a presente invenção pode determinar a dose requerida do anticorpo antiglipicano 3 terapêutico necessária par obtenção do efeito desejado no tratamento de câncer de fígado usando o anticorpo antiglipicano 3.

Exemplos [0077] Daqui em diante, a presente invenção será descrita mais especificamente com referência a Exemplos. No entanto, a presente invenção não pretende ser limitada a esses Exemplos. (Exemplo 1) [0078] Imuno-marcação de glipicano 3 usando modelos de ca-mundongo onde cepa de célula de câncer de fígado humano expressando glipicano 3 foi subcutaneamente transplantada na região abdominal (1) cepas de célula [0079] As cepas de célula de câncer de fígado usadas eram células HuH-7 (Health Science Research Resources Bank, HSRRB) e células HepG2 (ATCC). HuH-7 foi mantida e subculturada em Meio da Eagle Modificado com da Dulbecco (SIGMA-ALDRICH, CO.) contendo FBS 10% (BIONET). HepG2 foi mantida e subculturada em Meio da Eagle com Meio Essencial Mínimo (SIGMA-ALDRICH CO.) contendo FBS 10%, 1 mmol/L de Piruvato de Sódio MEM (Invitrogen Corp.) e 1 mmol/L de Aminoácido Não-essencial MEM (Invitrogen Corp.). (2) Medição do nível de expressão de GPC3 (2-1) Método de medição [0080] Os níveis de expressão de GPC3 das células HuH-7 e HepG2 foram medidos usando um anticorpo monoclonal GPC anti-humano de camundongo (nome do clone: GC33, descrito no WO2006/006693) e QIFI-Kit (DakoCytomation). O método de medição foi conduzido de acordo com um método descrito nas instruções incluídas nele.

[0081] O anticorpo GC33 usado foi dissolvido em temperatura ambiente e então ajustado para 1 mg/ml com PBS. Um frasco de mIgG2a em um estado liofilizado foi dissolvido em 500 μΐ de "Água Destilada para Injeção Otsuka da Farmacopeia Japonesa" e usado como um controle negativo. 5x105 células de cada linhagem foram suspensas em 98 μl de uma solução de lavagem celular CellWASH (Becton, Dickinson and Company) suplementado com BSA 0,5 p/v% (Sigma-Aldrich Co.) (daqui em diante referido como FACS-PBS). Cada suspensão foi suplementada com 2 μl de GC33 ou 5 μl de mIgG2a e deixada ficar a 4°C por 30 minutos. Então, cada suspensão foi suplementada com 1 ml de FACS-PBS e centrifugada a 5000 rpm a 4°C por 1 minuto para fracionar as células. Essas células foram ressuspensas em 98 μl de FACS-PBS.

[0082] Além disso, os procedimentos que seguem foram também realizados em paralelo com os procedimentos descritos acima: 1 ml de FACS-PBS foi adicionado a 100 μl de microesferas de calibragem e microesferas de ajuste incluíam QIFIKIT, que foram então lavadas através de centrifugação a 5000 rpm a 4°C por 1 minuto. As microesfe-ras foram suspensas em 98 μl de FACS-PBS. As células e as microesferas foram separadamente suplementadas com 2 μl de um anticorpo anticamundongo de cabra marcado com FITC incluído no QIFIKIT e submetidas à reação a 4°C por 45 minutos. Em seguida, cada solução de reação foi suplementada com 1 ml de FACS-PBS e centrifugada a 5000 rpm a 4°C por 1 minuto. As células e as microesferas precipitadas foram separadamente suspensas em 1 ml de FACS-PBS. Um analisador de célula totalmente automático EPICS-XL (Beckman Coulter) foi usado para ajustar o resultado de maneira que dois picos formados através da medição das microesferas de ajuste marcadas foram postos dentro do monitor. O valor de intensidade de fluorescência média (MFI) de cada fluorescência emitida pela amostra de célula contendo o anticorpo GC33 reagido, da amostra de célula contendo o mIgG2a reagido e das microesferas de calibragem foi medido usando o analisador de célula totalmente automático EPICS-XL. Com base em cinco valores MIF e valores de capacidade de ligação de anticorpo (ABC) das microesferas de calibragem, a linha reta ótima foi desenhada usando Microsoft Office Excell 2003 SP2 (Microsoft Corporation). O valor MFI de cada amostra de célula foi concedido a esta linha reta de calibragem para determinar seu valor ABC. Um valor determinado através da subtração do valor ABC da amostra contendo o mIgG2a reagido daquele da amostra contendo o anticorpo GC33 reagido foi usado como o número de sítios de ligação de anticorpo.

Como resultado, o nível de expressão de glipicano 3 em HuH-7 foi 1,25x105 moléculas por célula. O nível de expressão de glipicano 3 em HepG2 foi 9,67x105 moléculas por célula. (3) Preparação de modelos de camundongo onde cepa de célula de câncer de fígado humano foi subcutaneamente transplantada na região abdominal [0083] Células HuH-7 e HepG2 foram separadamente ajustadas para 5x107 células por ml com uma solução contendo quantidades iguais do meio para sua manutenção e subcultura descritas no parágrafo (1) e Matriz Matrigel (BD Biosciences). Um dia antes do transplante de cada cepa de célula em camundongo, 100 μl de um anticorpo antiasialo GM1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 1 frasco dos conteúdos foi dissolvido em 1 ml de água destilada e diluído mais com 4 ml de solução salina) foram intraperitonealmente administrados antes a camundongos SCID machos de 5 semanas de vida (CLEA Japão, Inc.). O anticorpo antiasialo GM1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi preparado dissolvendo 1 frasco dos conteúdos em 1 ml de água destilada e diluindo mais a solução com 4 ml de solução salina. No dia seguinte, 100 μl de cada suspensão celular (isto é, 5x106 células por camundongo) foram subcutaneamente transplantados nas regiões abdominais dos camundongos. (4) Estudo do método para preparação de seções de tecido de tumor [0084] Enxertos de tecido uniformes coletados de modelos transplantados com HepG2 preparados no parágrafo (3) foram quadrissec-tados usando um bisturi cirúrgico. Dentre eles, um fragmento foi fixado com formalina tamponada neutra 10% por 24 horas. A fatia de tecido fixada foi então inserida em parafina usando um aparelho de inserção automático ETP-150C (Sakura Finetek Japão Co., Ltd.) e armazenada a 4°C (método A).

[0085] Em seguida, um fragmento diferente foi fixado a 4°C por 6 horas usando um fixador PLP (NaIO4 em uma concentração de 10 mM, lisina em uma concentração de 75 mM, tampão de fosfato em uma concentração de 37,5 mM, paraformaldeído em uma concentração de 2%) contendo paraformaldeído 4% e então lavado com PBS (solução salina tamponada com fosfato, 10 mM, pH 7,4) a 4°C. Subsequentemente, o fragmento foi desidratado em acetona da noite para o dia a 4°C e em temperatura ambiente por duas horas. O fragmento foi purificado mais com benzoato de metila por uma hora e com xileno por uma hora, então embebido em parafina da mesma maneira que acima e armazenado a 4°C (método B).

[0086] As preparações inseridas em parafina preparadas nos métodos A e B foram cortadas em um micrótomo criostato em fatias finas imediatamente antes de serem aplicadas a marcação imuno-histológica. As fatias foram secas em ar, seguido por tratamento de desparafinização e marcação.

Em seguida, um fragmento diferente foi inserido a 4°C por 6 a 8 horas usando um fixador PLP e então impregnado sequencialmente a 4°C com soluções de PBS tendo concentrações de sacarose com graus (duração: 4 horas com PBS tendo uma concentração de sacarose 10%, 4 horas com PBS tendo uma concentração de sacarose 15% e da noite para o dia com PBS tendo sacarose 20%). Subsequentemen- te, o fragmento foi embebido em composto Tissue-Tek OCT (Sakura Finetechnical Co., Ltd.) e congelado em um banho de gelo se-co/acetona. O bloco congelado foi cortado em um micrótomo criostato em fatias finas, e as seções finas foram secas em ar e então armazenadas a -80°C (método C).

[0087] O fragmento restante foi embebido a 4°C em composto Tis-sue-Tek OCT e congelado em um banho de gelo seco/acetona. O bloco congelado foi cortado em um micrótomo criostato em uma pluralidade de seções finas, e as seções foram então secas em ar e fixadas através dos diferentes métodos que seguem: uma das seções foi fixada em paraformaldeído 4% a 4°C por 30 minutos (método D); uma seção diferente foi fixada em acetona a 4°C por 10 minutos (método E); e uma seção diferente foi fixada em formalina tamponada neutra em temperatura ambiente por 30 minutos (método F). As seções fixadas através dos métodos D, E e F foram lavadas por 5 minutos três vezes com Tris-Solução salina tamponada (TBS, 50 mM, pH 7,4), então secas em ar e armazenadas a -80°C.

[0088] As seções de tecido então preparadas foram usadas em marcação imuno-histoquímica mostrada abaixo. Um anticorpo GC33 (IgG2a) e um anticorpo 1G12 (BioMosaic, IgG1) foram usados como anticorpos primários em concentrações de 2,5 μg/ml e 1,0 μg/ml, respectivamente. Para a marcação, reagentes incluídos no estojo LSAB-2 (DakoCytomation) foram usados como reagentes necessários para marcação. O método de marcação foi conduzido de acordo com um método descrito nas instruções incluídas no estojo. Recuperação de antígeno não foi realizada porque o tempo de fixação foi curto. Um complexo de antígeno-anticorpo formado durante o curso de tal marcação imuno-histoquímica foi visualizado através de reação de pero-xidase-diaminobenzidina (DAB). Hematoxilina foi usada em contra-marcação. Neste contexto, anticorpos controle usados para os anti- corpos primários eram IgG2 de camundongo para GCC33 e IgG1 para 1G12. Três casos foram avaliados por método, e os resultados são mostrados na Tabela 1.

[Tabela 1] A: fixação 24 horas, nenhum tratamento de recuperação de antígeno B: fixação 24 horas, tratamento de recuperação de antígeno usando autoclave C: fixação 24 horas, tratamento de recuperação de antígeno usando micro-ondas D: fixação 24 horas, tratamento de recuperação de antígeno usando tratamento com protease E: fixação 7 dias, nenhum tratamento de recuperação de antígeno F: fixação 7 dias, tratamento de recuperação de antígeno usando autoclave [0089] A capacidade de marcação na imuno-marcação foi graduada de acordo com os parâmetros que seguem: com relação a graus de PR (taxa de células positivas), no campo visual sob o microscópio usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4 ou 10, (i) quando a proporção de células a partir das quais o complexo foi detectado era igual a ou menor do que 50%, o grau de PR da preparação era determinado como "L", (ii) quando esta proporção de células a partir das quais o complexo foi detectado era igual a ou maior do que 50% e menor do que 70%, o grau de PR da preparação foi determinado como "ML", (iii) quando esta proporção de células a partir das quais o complexo foi detectado era igual a ou maior do que 70% e menor do que 90%, o grau de PR da preparação foi determinado como "MH", e (iv) quando esta proporção de células a partir das quais o complexo foi detectado era igual a ou maior do que 90%, o grau de PR da preparação foi determinado como "H"; com relação a SI (scores de intensidade de marcação), (i) o score de SI de uma preparação que exibia marcação ligeiramente positiva foi determinado "+1", (ii) o score de SI de uma preparação que exibia marcação fracamente positiva foi determinado "+2", (iii) o score de SI de uma preparação que exibia marcação fracamente positiva com marcação moderadamente e/ou fortemente positiva foi determinado como "+3", (iv) o score de SI de uma preparação que exibia marcação moderadamente positiva foi determinado como "+4", e (v) o score de SI de uma preparação que exibia marcação fortemente positiva foi determinado como "+5"; e com relação a SP (capacidade de marcação da membrana celular) no campo visual sob microscópio usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4 ou 10, (i) quando apenas uma porção das membranas celulares de células foi marcada, o score de SP da preparação foi determinado como "I", (ii) quando uma porção das membranas celulares da maioria dessa células foi marcada e as membranas celulares de algumas das células foram circunferencialmente marcadas, o score de SP da preparação foi determinado como "II", e (iii) quando as membranas celulares da maioria dessas células foram circunferencialmente marcadas, o score de SP da preparação foi determinado como "III".

[0090] Uma imagem marcada padrão com cada grau (+1, +2, +4 e +5) dos scores de SI é mostrada na figura 1. A figura 1A mostra a preparação com SI de +1; a figura 1B mostra a preparação com SI de +2; a figura 1C mostra a preparação com SI de +4; e a figura 1D mostra a preparação com SI de +5. Além disso, uma imagem marcada com cada grau (+I, +II e +III) dos scores de SP é mostrada na figura 2. A figura 2A mostra a preparação com SP de I e a figura 2B mostra a preparação com SI de III.

[0091] Os graus de SI e SP das preparações preparadas através de qualquer um dos métodos C a F eram ambos baixos, indicando que uma imagem marcada suficiente não foi obtida. Além disso, as estruturas morfológicas dessas preparações não foram preservadas. Na comparação entre os métodos A e B, as preparações preparadas através do método B tinham graus de SI e SP altos (SI: +3 a +5, SP: II ou III) e também tinham um grau de PR onde 90% ou mais das células foram determinados como sendo positivos (H). Por outro lado, as preparações preparadas através do método A foram determinadas ter SI de +3 a +5 e SP de I ou II e também determinadas ter um grau de PR de L a MH. Em termos da diferença entre o anticorpo GC33 e o anticorpo 1G12, o anticorpo GC33 oferecia uma imagem marcada mais forte em todos os graus do que aquela do anticorpo 1G12. (5) Estudo do tempo de fixação para preparação de seções de tecido de tumor e método de recuperação de antígeno [0092] Enxertos de tecido uniformes coletados dos modelos transplantados com HepG2 preparados no parágrafo (3) foram estudados quanto a tempo de fixação como segue: tempo de fixação usando for-malina tamponada neutra 10% no método A descrito no parágrafo (4) foi ajustado para 24 horas e 7 dias para preparar preparações. Além disso, as preparações preparadas em cada tempo de fixação foram respectivamente recuperadas através de qualquer um dos métodos de recuperação usando uma autoclave, um micro-ondas ou protease descrita abaixo. Cada preparação foi tratada como uma autoclave a 121°C por 10 minutos em uma diluição de 10 vezes de solução de recuperação direcionada, pH 6 (DAKO) para preparar preparações recuperadas com uma autoclave. Além disso, cada preparação foi aquecida a 780 W por 5 minutos quatro vezes na mesma solução para preparar preparações recuperadas com um micro-ondas. Ainda, cada preparação foi reagida em temperatura ambiente por 5 minutos com reagente AR incluído no estojo Histofine Her2 (MONO) (Nichirei Bioscience) para preparar mais preparações.

[0093] As seções de tecido então preparadas foram usadas em marcação imuno-histoquímica mostrado abaixo. Um anticorpo GC33 (IgG2a) e um anticorpo 1G12 (BioMosaic, IgG1) foram usados como anticorpos primários em concentrações de 2,5 μg/ml e 1,0 μg/ml, respectivamente. Para a marcação, reagentes incluídos no estojo LSAB-2 foram usados como reagentes necessários para marcação. O método de marcação foi conduzido de acordo com um método descrito nas instruções incluídas no estojo. Recuperação de antígeno não foi realizada porque o tempo de fixação era curto. Um complexo antígeno-anticorpo formado durante o curso de tal marcação imuno-histoquímica foi visualizado através de reação de peroxidase-diaminobenzidina (DAB). Hematoxilina foi usada em contra-marcação. Neste contexto, anticorpos controle usados para os anticorpos primários eram IgG2 de camundongo para GC33 e IgG1 para 1G12. Três casos foram avaliados por preparação aos quais cada tempo de fixação e cada reação de recuperação foram aplicados, e os resultados são mostrados na Tabela 2. Na comparação entre os métodos de re- cuperação de antígeno, o método de micro-ondas produziu os resultados mostrando graus de SI e SP ligeiramente mais excelentes do que aqueles do método de autoclave. Por outro lado, as preparações submetidas a tratamento de recuperação de antígeno com base no método de protease exibiram capacidade de marcação mais excelente no grau de PR e nos scores e SI e SP do que aqueles das outras preparações submetidas a tratamento de recuperação de antígeno.

[Tabela 2] A: fixação 24 horas, nenhum tratamento de recuperação de antígeno B: fixação 24 horas, tratamento de recuperação de antígeno usando autoclave C: fixação 24 horas, tratamento de recuperação de antíge-no usando micro-ondas D: fixação 24 horas, tratamento de recuperação de antíge-no usando tratamento com protease E: fixação 7 dias, nenhum tratamento de recuperação de antígeno F: fixação 7 dias, tratamento de recuperação de antígeno usando autoclave G: fixação 7 dias, tratamento de recuperação de antígeno usando micro-ondas H: fixação 7 dias, tratamento de recuperação de antígeno usando tratamento com protease (6) Marcação imuno-histoquímica de seções de tecido de tumor (6-1) Preparação e marcação de preparações de tecido [0094] Enxertos de tecido coletados dos modelos transplantados preparados no parágrafo (2) foram banhados em formalina tamponada neutra 10% por 7 dias para fixação. Subsequentemente, preparações em bloco inseridas em parafina das seções de tecido foram preparadas de acordo com um método padrão. As preparações em bloco foram cortadas em fatias finas, e essas seções de tecido foram usadas em marcação imuno-histoquímica mostrado abaixo.

[0095] Um anticorpo GC33 (IgG2a) foi usado como um anticorpo primário. Para a marcação, os reagentes incluídos no estojo Histofine Her2 (MONO) (Nichirei Bioscience) foram usados como reagentes necessários para marcação. O método de marcação foi conduzido de acordo com um método descrito nas instruções incluídas no estojo exceto que o anticorpo GC33 foi usado como um anticorpo primário. Neste contexto, tratamento de recuperação de antígeno foi realizado através de tratamento com protease (tratamento envolvendo reação em temperatura ambiente por 5 minutos usando protease incluída no estojo) ou através de tratamento em autoclave realizado a 121°C por 10 minutos em Target Retrieval Solution diluída 10 vezes (DakoCyto-mation). Um complexo antígeno-anticorpo formado durante o curso de tal marcação imuno-histoquímica foi visualizado através de reação de peroxidase-diaminobenzidina (DAB). Hematoxilina foi usada em con-tra-marcação. Neste contexto, um anticorpo controle usado para o anticorpo primário em IgG2 de camundongo. (6-2) Avaliação de resultados de marcação [0096] A capacidade de marcação na imuno-marcação usando o anticorpo glipicano 3 anti-humano de camundongo foi avaliada de acordo com três parâmetros (taxa de células positivas: PR, intensidade de marcação: SI e padrão de marcação de membrana celular: SP) mostrados abaixo.

[0097] Especificamente, cada parâmetro foi digitalizado através dos métodos que seguem: [0098] os scores de PR (taxa de células positivas) foram calculados de maneira que: no campo visual sob microscópio usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4 ou 10, (i) quando a proporção de células a partir das quais o complexo é detectado é zero, o score da amostra é 0, (ii) quando esta proporção é menor do que 20%, o score da amostra é 1, (iii) quando a proporção é igual a ou maior do que 20% e menor do que 50%, o score da amostra é 2, e (iv) quando esta proporção é igual a ou maior do que 50%, o score da amostra é 3;

[0099] os scores de SI-Cp (intensidade de marcação citoplásmica) refletindo capacidade de marcação do citoplasma foram calculados como segue: nos citoplasmas de células no campo visual sob microscópio, (i) quando a proporção de células a partir das quais o complexo é detectado é zero usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4 ou 10 no microscópio, o score da amostra é 0, (ii) quando resposta positiva, embora obscura, é ligeiramente observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 10 no microscópio, o score da amostra é 1, (iii) quando resposta positiva é ligeiramente observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 2, (iv) quando resposta positiva é suficientemente reconhecí- vel mesmo usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 3, e (v) quando resposta positiva forte é claramente reconhecida e observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 4;

[00100] os scores de SI-Cm (intensidade de marcação da membrana celular) refletindo capacidade de marcação da membrana celular foram calculados de maneira que: nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio, (i) quando a proporção de células a partir das quais o complexo é detectado é zero usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4 ou 10 no microscópio, o score da amostra é 0, (ii) quando resposta positiva, embora obscura, é ligeiramente observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 10 no microscópio, o score da amostra é 1, (iii) quando resposta positiva obscura para uma lente objetiva com uma ampliação de 4, mas suficientemente reconhecível usando uma lente objetiva com uma ampliação de 10 é observada, o score da amostra é 2, (iv) quando resposta positiva é suficientemente reconhecível mesmo usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 3, (v) quando resposta positiva forte é claramente reconhecida e observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 4; e [00101] os scores de SP (padrão de marcação de membrana celular) foram calculados de maneira que: na detecção do complexo nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio, (i) quando as membranas celulares não exibem nenhuma resposta positiva, o score da amostra é 0, (ii) quando menos de 20% de células exibindo resposta positiva exibem marcação de membrana completa, o score da amostra é 1, (iii) quando 20% ou mais e menos do que 50% de células exibindo resposta positiva exibem marcação de membrana completa, o score da amostra é 2, e (iv) quando 50% ou mais de células exibindo resposta positiva exibem marcação de membrana completa, o score da amostra é 3.

[00102] O score total calculado usando SI-Cm foi indicado em IRCm, e o score total calculado usando SI-Cp foi indicado em IRCp. (6-3) Avaliação de capacidade de marcação [00103] Imagens marcadas das preparações de tecido tratadas em autoclave derivadas de modelos animais transplantados com HuH-7 e HepG2 são mostradas na figura 3. A figura 3A mostra uma imagem marcada de uma preparação obtida através da submissão de uma seção preparada a partir de modelo transplantado com HuH-7 para tratamento de recuperação de epítopo induzida por calor usando uma autoclave; a figura 3B mostra uma imagem marcada de uma preparação obtida submetendo uma seção preparada a partir do molde transplantado com HuH-7 a tratamento de recuperação de epítopo induzida por protease; a figura 3C mostra uma imagem marcada de uma preparação obtida submetendo uma seção preparada a partir do modelo transplantado com HepG2 para tratamento de recuperação de epítopo induzida por calor usando uma autoclave; e a figura 3D mostra uma imagem marcada de uma preparação obtida através da submissão de uma seção preparada a partir do modelo transplantado de HepG2 para tratamento de recuperação de epítopo induzida por protease.

[00104] Além disso, os scores de parâmetros de marcação individuais são mostrados na Tabela 3. Os valores IRCp calculados a partir das preparações de tecido derivadas dos modelos animais transplantados com HuH-7 e HepG2 foram todos 7, e nenhuma diferença nos valores foi observada entre HuH-7 e HepG2. Além disso, seus valores de IRCm foram todos 5, e nenhuma diferença nos valores foi vista entre eles (Tabela 3 e Figura 3).

[Tabela 3] [00105] Por outro lado, os scores de parâmetro de marcação individual das preparações de tecido tratadas com protease dos modelos animais transplantados com HuH-7 e HepG2 são também mostrados na Tabela 3. As preparações de tecido tratadas com protease foram observadas tender a produzir scores de SI-Cm e SI-Cp maiores do que aquelas obtidas a partir das preparações tratadas com autoclave. Em termos dos scores totais calculados a partir dos parâmetros de marcação individuais, os valores de IRCp obtidos a partir das preparações de tecido transplantados com HuH-7 e HepG2 foram 4 e 8, respectivamente. Além disso, os valores IRCm obtidos a partir das preparações de tecido transplantadas com HuH-7 e HepG2 foram 4 e 9, respectivamente (tabela 3 e figura 3). Conforme mostrado na fotografia inferior da figura 3, a marcação da preparação de tecido tratada com protease pode claramente distinguir células expressando nenhum glipicano 3, células expressando moderadamente glipicano 3 e células expressando fortemente glipicano 3. Em contraste, a marcação da preparação de tecido tratada com autoclave não produziu tal performance quantitativa. Ainda, reação não-específica com células inflamatórias ou similar foi frequentemente observada na marcação da preparação de tecido tratada com autoclave.

[00106] Esses resultados demonstraram que recuperação de antí-geno baseada em tratamento com protease, comparado com tratamento com autoclave, é um método refletindo mais precisamente a diferença no nível de expressão de glipicano 3. Além disso, foi mostrado que tratamento com protease é superior a tratamento com autoclave a partir do ponto de vista da capacidade de marcação de membranas celulares em preparações de tecido. (Exemplo 2) [00107] Efeito de recuperação de antígeno da protease em imuno- marcação de GPC3 usando preparação de tecido de carcinoma hepa-tocelular humano (1) Marcação imuno-histoquímica de amostras de carcinoma hepato-celular humano (1-1) Métodos para preparação e preparações de marcação [00108] Amostras de carcinoma hepatocelular humano foram banhadas em formalina tamponada neutra 10% durante o tempo predeterminado ou mais para fixação. Em seguida, preparações em bloco inseridas em parafina foram preparadas de acordo com um método padrão. As preparações em bloco foram cortadas em fatias finas, e essas seções de tecido foram usadas em marcação imuno-histoquímica. A marcação imuno-histoquímica foi realizado através dos mesmos procedimentos que no Exemplo 1. (1-2) Método para avaliação de resultados de marcação [00109] Com base na descrição do item (6-2) do Exemplo 1, a capacidade de marcação na imuno-marcação usando o anticorpo GPC3 anti-humano de camundongo foi avaliada de acordo com três parâmetros (taxa de células positivas: PR, intensidade de marcação: SI e padrão de marcação da membrana celular: SP) mostrados abaixo.

[00110] Especificamente, cada parâmetro foi digitalizado através dos métodos que seguem: [00111] os scores de PR (taxa de células positivas) foram calculados de maneira que: no campo visual sob microscópio usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4 ou 10, (i) quando a proporção de células a partir das quais o complexo é detectado é zero, o score da amostra é 0, (ii) quando esta proporção é menor do que 20%, o score da amostra é 1, (iii) quando a proporção é igual a ou maior do que 20% e menor do que 50%, o score da amostra é 2, e (iv) quando esta proporção é igual a ou maior do que 50%, o score da amostra é 3;

[00112] os scores de SI-Cp (intensidade de marcação citoplásmica) refletindo capacidade de marcação do citoplasma foram calculados como segue: nos citoplasmas de células no campo visual sob microscópio, (i) quando a proporção de células a partir das quais o complexo é detectado é zero usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4 ou 10 no microscópio, o score da amostra é 0, (ii) quando resposta positiva, embora obscura, é ligeiramente observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 10 no microscópio, o score da amostra é 1, (iii) quando resposta positiva é ligeiramente observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 2, (iv) quando resposta positiva é suficientemente reconhecível mesmo usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 3, e (v) quando resposta positiva forte é claramente reconhe- cida e observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 4;

[00113] os scores de SI-Cm (intensidade de marcação da membrana celular) refletindo capacidade de marcação da membrana celular foram calculados de maneira que: nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio, (i) quando a proporção de células a partir das quais o complexo é detectado é zero usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4 ou 10 no microscópio, o score da amostra é 0, (ii) quando resposta positiva, embora obscura, é ligeiramente observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 10 no microscópio, o score da amostra é 1, (iii) quando resposta positiva obscura para uma lente objetiva com uma ampliação de 4, mas suficientemente reconhecível usando uma lente objetiva com uma ampliação de 10, é observada, o score da amostra é 2, (iv) quando resposta positiva é suficientemente reconhecível mesmo usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 3, (v) quando resposta positiva forte é claramente reconhecida e observada usando uma lente objetiva com uma ampliação de 4, o score da amostra é 4; e [00114] os scores de SP (padrão de marcação de membrana celular) foram calculados de maneira que: na detecção do complexo nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio, (i) quando as membranas celulares não exibem nenhuma resposta positiva, o score da amostra é 0, (ii) quando menos de 20% de células exibindo resposta positiva exibem marcação de membrana completa, o score da amostra é 1, (iii) quando 20% ou mais e menos do que 50% de células exibindo resposta positiva exibem marcação de membrana completa, o score da amostra é 2, e (iv) quando 50% ou mais de células exibindo resposta positiva exibem marcação de membrana completa, o score da amostra é 3.

[00115] Além disso, o grau de marcação não-específica (base) (determinado a partir da capacidade de marcação de células inflamatórias ou estromata) foi também avaliado. (1-3) Resultados e conclusão [00116] Imagens marcadas das preparações submetidas a tratamento de recuperação de antígeno são mostradas na figura 4. A figura 4A mostra uma imagem marcada de uma preparação obtida submetendo uma seção preparada a partir da amostra do caso A a tratamento de recuperação de antígeno induzida por calor usando uma autocla-ve; a figura 4B mostra uma imagem marcada de uma preparação obtida submetendo uma seção preparada a partir da amostra do caso A a tratamento de recuperação de epítopo induzida por protease; a figura 4C mostra uma imagem marcada de uma preparação obtida submetendo uma seção preparada a partir da amostra do caso B a tratamento de recuperação de epítopo induzida por calor usando uma autocla-ve; a figura 4D mostra uma imagem marcada de uma preparação obtida submetendo uma seção preparada a partir da amostra do caso B a tratamento de recuperação de epítopo induzida por protease; a figura 4E mostra uma imagem marcada de uma preparação obtida submetendo uma seção preparada a partir da amostra do caso C a tratamento de recuperação de epítopo induzida por calor usando uma autocla-ve; e a figura 4F mostra uma imagem marcada de uma preparação obtida submetendo uma seção preparada a partir da amostra do caso C a tratamento de recuperação de epítopo induzida por protease.

[00117] Conforme mostrado na figura 4 e na tabela 4, as regiões de carcinoma hepatocelular no diagrama tinham um score de PR de 3 (50% ou mais da região foram positivos) em todas as preparações de tecido tratadas com autoclave dos casos A, B e C. Além disso, nenhuma localização na membrana foi vista nos casos A e B como para a intensidade e padrão de marcação de membrana (SI-Cm=0 e SP-Cm=0), enquanto expressão na membrana foi observada no caso C com score de SI-Cm=1 e SP-Cm=2. Neste contexto, todos os casos tenderam a exibir resposta positiva não-específica a células inflamató-rias ou estromata, conforme mostrado na fotografia do caso B na figura 4.

[Tabela 4] [00118] Por outro lado, os scores de PR das preparações de tecido tratadas com protease foram 1 (menos de 20% da região eram positivos) no caso A, 2 (20-50% da região eram positivos) no caso B e 3 (50% ou mais da região eram positivos) no caso C. Além disso, os scores do caso A foram SI-Cm=1 e SP-Cm=1 como a intensidade e o padrão de marcação de membrana. Além disso, os scores do caso B foram Si-Cm=3 e SP-Cm=2. Expressão distinta na membrana foi observada no caso C com scores de SI-Cm=4 e SP-Cm=3. Diferente das preparações de tecido tratadas com autoclave, pouca resposta positiva não-específica foi observada nas preparações de tecido tratadas com protease.

[00119] Esses resultados sugerem que método de recuperação de antígeno baseado em tratamento com protease, comparado com tratamento com autoclave, é provavelmente um método refletindo com mais precisão a diferença no nível de expressão de GPC3 em imuno-marcação de GPC3 usando amostras clínicas de carcinoma hepatoce-lular. Além disso, foi mostrado que tratamento com protease é também superior a ele em capacidade de marcação da membrana. Ainda, foi demonstrado que o método de protease produz apenas resposta positiva não-específica mínima e pode então capturar mais precisamente resposta positiva específica para um anticorpo anti-GPC3. (Exemplo 3) [00120] Eficácia de fármaco de anticorpo anti-GPC3 sobre modelos de camundongo transplantados com cepa de célula de câncer de fígado humano expressando GPC3 (1) cepa celular [00121] s células usadas no transplante eram células HuH-7 e células HepG2. As células HuH-7 foram mantidas e subculturadas em Meio da Eagle Modificado com da Dulbeco (SIGMA-ALDRICH CO.) contendo FBS 10% (BIONET). As células HepG2 foram mantidas e subculturadas em meio Eagle Meio Essencial Mínimo (SIGMA- ALDRICH CO.) contendo FBS 10%, 1 mmol/l de Piruvato de Sódio MEM (Invitrogen Corp.) e 1 mmol/l de Aminoácido Não-essencial MEM (Invitrogen Corp.). (2) Preparação de modelos de camundongo transplantados com cepa de célula de câncer de fígado humano [00122] As células dessas linhagens foram separadamente ajustadas para 5x107 células por ml com uma solução contendo quantidades iguais de meio para manutenção e subcultura descritas acima e Matriz Matrigel (BD Biosciences). Um dia antes do transplante de célula, 100 μΐ de um anticorpo antiasialo GM1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; 1 frasco foi dissolvido em 5 ml de PBS) foram intraperitonealmen-te administrados previamente a camundongos SCID (machos de 5 semanas de vida, CLEA Japão, Inc.) e 100 μΐ de cada suspensão celular foram subcutaneamente transplantados para regiões abdominais dos camundongos. Especificamente, 5x106 células foram administradas por camundongo. Os volumes do tumor foram calculados de acordo com a equação que segue, e os modelos foram considerados como sendo estabelecidos no ponto de tempo quando a média de volumes de tumor atingiu 117 a 330 mm3;

Equação 1: Volume do Tumor=Eixo maior x Eixo menor x Eixo me-nor/2. (3) Preparação de anticorpo a ser administrado [00123] No dia da administração, um anticorpo monoclonal GPC3 anti-humano humanizado (nome do clone: hGC33, descrito na Publicação Internacional No. WO2006/006693) foi ajustado como um anticorpo terapêutico para 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml ou 0,05 mg/ml com PBS esterilizado em filtro e usado como uma amostra de administração para um grupo administrado com 5 mg/kg, um grupo administrado com 1 mg/kg ou um grupo administrado com 0,5 mg/kg, respectivamente. (4) Administração de anticorpo [00124] Vinte dias após o transplante nos modelos de camundongo transplantados com célula HuH-7 preparados conforme descrito no parágrafo (2) ou 26 dias após o transplante nos modelos de camun-dongo transplantados com célula HepG2 então preparados, a amostra de administração preparada no parágrafo anterior (3) foi administrada em uma dose de 10 ml/kg a partir das veias da cauda por 3 semanas em uma base de uma vez por semana. PBS esterilizado em filtro (veí- culo) foi administrado como um controle negativo em uma dose de 10 ml/kg das veias da cauda em uma base de uma vez por semana da mesma maneira que acima. Todos os grupos eram compostos de 5 a 6 camundongos por grupo. (5) Avaliação do efeito antitumor [00125] O efeito antitumor do anticorpo hGC33 nos modelos de ca- mundongo transplantados com câncer de fígado humano foi avaliado com base da mudança dependente do tempo nos volumes de tumor (Figura 5A) e nos volumes úmidos de tumores após 1 semana do dia de administração final (Figura 5B). A figura 5A é um diagrama mostrando mudança dependente do tempo em volumes de tumor dos modelos de camundongo transplantados com HepG2. O losango representa mudança dependente do tempo nos volumes de tumor do grupo administrado com veículo; o quadrado representa mudança dependente do tempo nos volumes de tumor do grupo administrado com 1 mg/kg de anticorpo hGC33; e o círculo representa mudança dependente do tempo nos volumes de tumor do grupo administrado com 5 mg/kg de anticorpo hCG33. O ponto de tempo quando o anticorpo hGC33 foi administrado é indicado na seta. No diagrama, o símbolo * representa que o nível de significância P é P<0,05 no teste de diferença significante. Além disso, o símbolo ** representa que o nível de sig-nificância P é P<0,0001 no teste de diferença significante. A figura 5B é um diagrama mostrando mudança dependente do tempo nos volumes de tumor dos modelos de camundongo transplantados com HuH- 7. O losango representa mudança dependente do tempo nos volumes de tumor do grupo administrado com veículo; o quadrado representa mudança dependente do tempo nos volumes de tumor do grupo administrado com 1 mg/kg de anticorpo hGC33; e o ciclo representa mudança dependente do tempo nos volumes de tumor do grupo administrado com 5 mg/kg de anticorpo hGC33. O ponto de tempo quando an- ticorpo hGC33 foi administrado é indicado na seta. No diagrama, o símbolo * representa que o nível de significância P é P<0,05 no teste de diferença significante. Além disso, o símbolo ** representa que o nível de significância P é P<0,0001 no teste de diferença significante. A figura 5C é um diagrama mostrando os volumes úmidos de tumores após 1 semana do dia da administração final nos modelos de camun-dongo transplantados com HepG2. No diagrama, o símbolo * representa que o nível de significância P é P<0,05 no teste de diferença significante. Além disso, o símbolo ** representa que o nível de signifi-cância P é P<0,0001 no teste de diferença significante. A figura 5D é um diagrama mostrando os volumes úmidos de tumores após 1 semana do dia de administração final nos modelos de camundongos transplantados com HuH-7. No diagrama, o símbolo * representa que o nível de significância P é P<0,05 no teste de diferença significante. Além disso, o símbolo ** representa que o nível de significância P é P<0,0001 no teste de diferença significante.

[00126] Pacote pré-clínico SAS (SAS Institute, Inc.) foi usado na análise estatística. Os volumes de tumor obtidos no dia de medição final foram usados para avaliar o teste de diferença significante pelo método de comparação múltipla Dunnett. Como resultado, conforme mostrado nas Figuras 5A e 5B, crescimento de tumor nos grupos administrados com anticorpo hGC33 foi confirmado ser significantemente suprimido, comparado com aquele no grupo administrado com veículo. Além disso, a eficácia de fármaco do anticorpo foi demonstrada ser relativamente forte nos modelos transplantados com célula HepG2 e relativamente fraca nos modelos transplantados com célula HuH-7.

[00127] Desta maneira, o anticorpo foi demonstrado exibir efeito antitumor alto em modelos de camundongo transplantados com célula HepG2 determinados exibir um nível de expressão alto do antígeno e o padrão de expressão de localização de membrana celular como um resultado de análise, através de marcação imuno-histológica, de preparações de tecido preparadas através do método de recuperação de epítopo induzida por protease. Em contraste, o anticorpo foi demonstrado exibir efeito antitumor baixo em modelos de camundongo transplantados com célula HuH-7 determinados a partir dos resultados de análise ter um nível de expressão baixo do antígeno. Tal diferença é uma conclusão que não pode ser amarcada através de análise com base no método de recuperação de epítopo induzida por calor convencional. Foi então mostrado que a eficácia de fármaco do anticorpo GPC3 pode ser determinada eficazmente combinando método de recuperação de epítopo induzida por calor convencional com método de recuperação de epítopo induzida por protease.

[00128] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados aqui são incorporados aqui a título de referência em sua totalidade.

REIVINDICAÇÕES

Claims (15)

1. Método de imunoensaio in vitro para detecção da presença de células de câncer de fígado em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) provisão de um conjunto de pelo menos duas preparações de tecido identificáveis como seções embebidas em parafina do mesmo indivíduo, as preparações de tecido identificáveis sendo preparadas a partir do indivíduo, então embebidas em parafina e ligadas a um apoio transparente; (b) submissão do conjunto das preparações de tecido a tratamento de desparafinização; (c) submissão de uma das preparações de tecido identificáveis no conjunto tratado na etapa (b) a tratamento de recuperação de antígeno com base em método de recuperação de epítopo induzido por calor, enquanto submetendo a outra preparação de tecido a tratamento de recuperação de antígeno com base em método de recuperação de epítopo induzido por protease; (d) contado de um anticorpo anti-glipicano 3 com as preparações sob condições apropriadas para formação de um complexo do anticorpo anti-glipicano 3 com glipicano 3 presente nas preparações de tecido tratadas na etapa (c); e (e) detecção da presença do complexo, em que quando o complexo está presente, o indivíduo é diagnosticado como tendo células de câncer de fígado.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método de recuperação de epítopo induzido por calor é aquecimento usando um micro-ondas, e em que o tempo de aquecimento é apropriadamente selecionado dentre 5 minutos e 60 minutos.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método de recuperação de epítopo induzido por calor é aquecimento usando um autoclave, e em que o tempo de aquecimento é apropriadamente selecionado dentre 5 minutos e 60 minutos.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a protease usada no método de recuperação de epítopo induzido por protease é selecionada dentre o grupo consistindo em pepsina, tripsina e protease K, e em que (i) o pH da sua solução de reação é apropriadamente selecionado dentre 6,5 e 9,5, (ii) a temperatura da reação é adequadamente selecionada dentro do intervalo de 25° C a 50° C, e (iii) o tempo de reação é apropriadamente selecionado dentre 1 minuto e 5 horas.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que reação de detecção para detecção do complexo é reação enzimática.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-glipicano 3 é um anticorpo que se liga a um polipeptídeo C-terminal de glipicano 3.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo C-terminal de glipicano 3 é um polipep- tídeo consistindo em aminoácidos nas posições 359 a 580 descritos na SEQ ID N°: 1 ou um polipeptídeo consistindo em aminoácidos nas posições 375 a 580 na mesma.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-glipicano 3 é um anticorpo GC33.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-glipicano 3 é um anticorpo 1G12.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que na etapa (e) a presença do complexo é digitalizada para detecção.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a digitalização é realizada calculando de acordo com a fórmula que segue: onde IRCp representa um score de nível de expressão de glipica- no 3; PR representa um valor numérico determinado através de classificação da proporção de células das quais o complexo é detectado sob microscópio; SI-Cp representa um valor numérico determinado através de classificação da intensidade de marcação com a qual o complexo é detectado nos citoplasmas de células no campo visual sob microscópio; e SP representa um valor numérico determinado através da classificação da proporção de células que exibem marcação de membrana completa nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a digitalização é realizada através de cálculo de acordo com a fórmula que segue: onde IRCm representa um score de localização de membrana de glipicano 3; PR representa um valor numérico determinado através da classificação da proporção de células das quais o complexo é detectado sob microscópio; SI-Cm representa um valor numérico determinado através da avaliação da intensidade de marcação com a qual o complexo é detectado nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio; e SP representa um valor numérico determinado através da classificação da proporção de células que exibem marcação de membrana completa nas membranas celulares de células no campo visual sob microscópio.

13. Método para classificação de células de câncer de fígado presentes em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que é com base em scores calculados através de métodos como definidos nas reivindicações 11 e 12.

14. Método in vitro para determinação de administrar ou não um agente anticâncer contendo um anticorpo anti-glipicano 3 a um indivíduo, caracterizado pelo fato de que é com base em scores calculados através de métodos como definidos nas reivindicações 11 e 12.

15. Método in vitro para determinação de uma dose de um agente anticâncer contendo um anticorpo anti-glipicano 3 no tratamento de câncer de fígado em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que é com base em scores calculados através dos métodos como definidos nas reivindicações 11 e 12.