BRPI0909876A2 - composição, cosmético e alimento funcional anti-envelhecimento ou antioxidante contendo linhagem de células de caule vegetal derivada de câmbio de panax ginseng - Google Patents

Abstract

composição,cosmético e alimento funcional anti-envelhecimento ou antioxidante contendo linhagem de células de caule vegetal derivada de câmbio de panax ginseng. a invenção refere-se a uma composição anti-envelhecimento ou antioxidante que contém,como ingrediente ativo,uma linhagem de células de caule vegetal derivada do câmbio de panax ginseng, incluindo o ginseng selvagem e o ginseng, ou um extrato, um lisado, e uma cultura do mesmo. a composição tem efeitos colaterais minimizados comparados aos agentes anti-envelhecimento e antioxidantes existentes sendo, portanto, segura para a pele. a composição apresenta um efeito antioxidante de inibir as espécies de oxigênio reativas causadas pela exposição à radiação uv, que é maior causa de envelhecimento da pele, podendo reduzir ou inibir eficazmente os fatores relacionados ao envelhecimento. assim, a composição é útil para prevenir e inibir o envelhecimento.

Description

COMPOSIÇÃO, COSMÉTICO E ALIMENTO FUNCIONAL ANTI-ENVELHECIMENTO OU ANTIOXIDANTE CONTENDO LINHAGEM DE

CÉLULAS DE CAULE VEGETAL DERIVADA DE CÂMBIO DE PANAX GINSENG 5 CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a uma composição anti-envelhecimento ou antioxidante contendo, como um ingrediente ativo, uma ou mais linhagens de células 10 derivadas do câmbio do Panax ginseng, incluindo ginseng selvagem e ginseng, um extrato, um lisado e um cultura do mesmo.

ESTADO DA TÉCNICA 15 Há mais de 300. 000 espéc~es dE2_, v~getais no~~ mundo de hoje, e é sabido que vegetais contêm componentes úteis apresentando várias atividades fisiológicas. Os ~~corp.ponentes~ útei~ sã,o~metab_ólitos~_ secundários~ que~. são~~ 20 produzidos secundariamente durante os processos metabólicos normais e acumulados em locais intracelulares específicos. Esses componentes úteis estão recebendo atenção crescente, porque servem para defender os vegetais dos microorganismos ou animais externos do ponto de vista bioquímico e ecológico. 25 Metabólitos secundários que são produzidos por vegetais, incluem os alcalóides, flavonóides, carotenóides, glicosídeos, terpenóides, etc.

Muitos dos metabólitos secundários apresentam . 30 efeito hidratante, suavizante e tonificante da pele, proteção UV, efeito clareador, remoção da queratina, anti- envelhecimento, antioxidante, redução de rugas, antibacteriano, anti inflamatório e anti-câncer, etc.

Consequentemente, vários produtos cosméticos contendo componentes úteis derivados de vegetais têm sido desenvolvidos. Como exemplos, os produtos cosméticos contendo componentes úteis derivados de vegetais incluem: uma 5 composição cosmética clareadora, contendo mulberrin isolado de Morus alba (Patente coreana No.25582) uma composição cosmética contendo extrato de Alpinia Katsumadai (Patente coreana No. 295875), uma composição cosmética para evitar o envelhecimento da pele contendo extrato de ginseng (Patente 10 coreana no. 3614 33) , e uma composição cosmética para reduzir rugas contendo Ecklonia Cava (Patente coreana No. 2001-25580). Além disso, vários produtos cosméticos foram desenvolvidos, os quais contêm extratos de vários vegetais, incluindo casca de castanha, Xanthii fructus, cabaça, Caesapinia sappan L., 15 Giant knotweed, malva, menta, Alnus juponica, erva, Birch, Pora cocos, Romã, salgueiro branco, feijão mungo, rosa, etc. TaTs componentes- (rteis der'ivados de vegetais são metabóli tos secundários que são extraídos diretamente dos vegetais, porque as vias biossintéticas dos mesmos são complexas.

20 Enquanto isso, a pele é uma barreira primária de defesa do corpo humano cuja função é proteger vários órgãos do corpo das mudanças de temperatura e umidade, e estímulo do ambiente externo, tais como UV e poluentes, tendo 25 papel importante para manter a homeostase in vivo. Entretanto, a luz UV, o estímulo excessivo, físico e químico, do ambiente externo, estresses, deficiência nutricional e outros, deterioram a função normal da pele e aceleram o fenômeno de envelhecimento da pele tais como a perda de firmeza, a . 30 queratinização e a formação de rugas e similares. Para prevenir tal fenômeno e manter a. pele mais saudável e elástica, deve-se usar cosméticos contendo substâncias fisiologicamente ativas, obtidas de vários animais, vegetais e microorganismos, afim de manter a função intrínseca da pele e a ativação das células da pele, diminuindo, assim, efetivamente, o envelhecimento da pele. Entretanto, as matérias primas cosméticas, de acordo com a técnica anterior, têm vários problemas os quais, em sua maior parte, têm 5 efeitos insuficientes ou causam efeitos colaterais à pele.

Consequenternente, os inventores se empenharam em desenvolver composições derivadas de materiais naturais que tiveram seus efeitos colaterais rninirnizados comparados aos agentes anti-envelhecimento e antioxidantes existentes e tiveram excelentes efeitos anti-envelhecimento e antioxidante. Como resultado, os inventores acharam que urna linhagem de célula homogênea derivada do câmbio de Panax ginseng, um lisado, um extrato ou uma cultura do mesmo têm excelentes efeitos inibitórios contra o envelhecimento e oxidação, completando, assim, a presente invenção.

DESCRIÇÃO GERAL DA INVENÇÃO É um objetivo da presente invenção prover urna composição derivada de material natural que tenha seus efeitos colaterais minimizados, quando comparados aos agentes anti-envelhecimento e antioxidante existentes e apresente atividades anti-envelhecimento e antioxidante.

Para atingir esse objetivo, a presente invenção provê uma composição anti-envelhecimento e antioxidante contendo uma ou mais linhagem de células, que é derivada do câmbio de Panax ginseng e tem as seguintes características: um extrato, um lisado e urna cultura do mesmo: (a) está em um estado indiferenciado de forma inata; (b) é uma linhagem de células homogênea; e

(c) é morfologicamente. caracterizada por um número de vacúolos.

A presente invenção também provê uma 5 composição cosmética anti-envelhecimento contendo uma ou mais de ditas células de linhagem, um extrato, um lisado e uma cultura do mesmo.

A presente invenção também provê um alimento funcional anti-envelhecimento ou antioxidante contendo uma ou mais de ditas linhagens de células, um extrato, um lisado e uma cultura do mesmo.

Outras características e realizações da presente invenção ficam mais completamente evidentes a partir ~a~ d:s~r_içi_o ~ d;t;lh~d."a~ a~ segui'r e aas re~ivTndi~Cctções anexas~ ~

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS -= -~ =- -=-· • = - '=- A FIG: 1-· é-- uma- s-érie de- fotcografi-as- most.rando um processo de derivação de uma linhagem de célula de acordo com a presente invenção, e uma linhagem de célula derivada do câmbio de ginseng selvagem.

A FIG.2 é um diagrama mostrando os resultados de tratar os fibroblastos da pele normal humana (NHF) com várias concentrações de um extrato um ginseng selvagem derivado da linhagem de célula de câmbio homogêneo da presente invenção ou um meio de cultura da linhagem de célula e examinar se o extrato ou meio de cultura de linhagem da célula é citotóxico para os fibroblastos. Na FIG.2, umidade, células umedecidas de ginseng, secos: células secas de ginseng, meio: meio cultivado de células de ginseng, El estágio de elicitação-l,E2 estágio de elicitação-2 e G:

estágio de crescimento.

A FIG.3 é um diagrama mostrando os resultados de tratar os fibroblastos da pele normal humana (NHF) com várias concentrações de um extrato um ginseng selvagem derivado da linhagem de célula homogênea de câmbio ou um meio de cultura de linhagem da célula, cultivo dos fibroblastos em O, 5% FBS meio mínimo essencial, e examinar os efeitos do ginseng selvagem do extrato ou meio de cultura da linhagem de célula homogênea derivada do câmbio sobre a proliferação dos fibroblastos. Na FIG.3, umidade, células umedecidas de ginseng, secos: células secas de ginseng, meio: meio cultivado de células de ginseng, E1: estágio de elicitação-1, E2: estágio de elicitação-2 e G: estágio de crescimento.

A FIG. 4 é um ~diagrama~ mostranao os ~resu-lt~ados~ de tratar os fibroblastos da pele normal humana (NHF) com ~ vªrias_ concentrações de um extrato de um ginseng selvagem der:v;d; d-a ~ii~h~g~m- d~ ~élula- d; ;â~bio ~homôgêneo -ou um ~meio de cultura de linhagem- da -cêlulc:r, -tratando os- fib-robJ.as.tos ~ com radiação UV, e examinar se um aumento na expressão MMP-1 causada pela radiação UV é inibida pelo ginseng selvagem derivado do extrato ou meio de cultura da linhagem de célula do câmbio homogêneo. Na FIG.4, umidade, células umedecidas de ginseng, secos: células secas de ginseng, meio: meio cultivado de células de ginseng, E1: estágio de elicitação-1, E2: estágio de elicitação-2 e G: estágio de crescimento e RA: ácido retinóico.

A FIG.5 é um diagrama mostrando os resultados de tratar os fibroblastos da pele normal humana (NHF) com várias concentrações de um extrato um ginseng selvagem derivado da linhagem de célula de câmbio homogêneo ou um meio de cultura de linhagem da célula, tratando os fibroblastos com radiação UV, e examinar se um aumento no oxigênio reativo causado pela radiação UVB é inibido pelo ginseng selvagem derivado do extrato de linhagem de câmbio homogêneo ou meio de cultura. Na FIG.S, umidade, células umedecidas de ginseng, 5 secos: células secas de ginseng, meio: meio cultivado de células de ginseng, E1: estágio de elicitação-1, E2: estágio de elicitação-2 e G: estágio de crescimento e RA: ácido retinóico.

10 A FIG. 6 é um diagrama mostrando o efeito de um extrato de um ginseng selvagem derivado da linhagem de célula do câmbio homogêneo ou um meio de cultura da linhagem de célula sobre a inibição da produção de MMP quando induzir o MMP-1 através da radiação UV. 15 A FIG. 7 é um ciiagrama ~ mostr2mao~ o~ e~fe-i to ~do-­ ginseng selvagem derivado do extrato de linhagem de célula homogênea de câmbio _ou meio de cultura da presente invenção -- -=-· -- -=- -=-. ..-= ~· --= -= --= -= --=- ..r= = -= . ;;;;;-:: = = ~ na remoção das espécies de oxigênios r;ati vos êausado~s ~péla" 20 radiação UV.

MELHOR MANEIRA DE REALIZAR A INVENÇÃO Definindo de outra forma, todos os termos 25 técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados como normalmente entendido por um dos especializados na técnica. Geralmente as nomenclaturas usadas aqui são bem conhecidas e convencionalmente usadas na técnica.

. 30 A definição dos principais termos usados na descrição detalhada é a seguinte: Como usado aqui, o termo "câmbio" refere-se a um tecido que engrossa o caule e a raiz permitindo que o vegetal cresça volurnetricarnente. Foi registrado que quando o câmbio, um rneristerna onde a maior divisão de célula ativa ocorre, é usada corno explante para a cultura do tecido da planta, é possível a produção rápida e mas si v a das células (patente coreana No. 0533120).

Corno usado aqui, o termo "lisado" refere-se a urna célula lisada obtida pelo rompimento das células através de um método químico, por exemplo, um detergente, ou um método físico. O termo "extrato" de urna linhagem celular refere-se a urna substância obtida pela dissolução de células em um solvente e isolando a substância, e o extrato pode ser concentrado através da destilação ou evaporação. Também, o termo "meio de cultura" da linhagem de célula refere-se a um meio -= celular do qual .-=-:: = = as células têm sido removidas após a -= =·== cultura das mesmas. Além disso, o termo ''culturã" ~da~ rinhagern ~~ ~ de célula, como usado aqui, refere-se a um material contendo um~m~io de cultura e/ou uma linhagem de célula cultivada, em ---=--=--=-= -. ~ -= - ---. = --= que a linhagem de célula cultivada tem a intenç-ão de- incluir~ uma linhagem de célula- que -se difer-encie s-ob -cond-ições- -de -- cultura ou que tenha melhorado a capacidade de produzir e/ou secretar substâncias úteis.

Como usado aqui, o termo "inatarnente indiferenciado" significa que as células não estão presentes em um estado indiferenciado através de um processo de desdiferenciação, mas são originalmente mantidos em um estado de pré-diferenciação.

Em um aspecto, a presente invenção provê uma composição contendo anti-envelhecimento ou antioxidante, como ingrediente ativo, uma ou mais linhagem de células dertvada do câmbio de Panax ginseng, um lisado, um extrato e urna cultura do mesmo. Na presente invenção, Panax ginseng inclui ginseng selvagem e ginseng (Lian M.L. et al., J. Plant Biology, 45: 201, 2002; Han J.Y. et al., J. Plant Biology, 49:26, 2006; Teng W.L. et al., Tis sue and Organ Culture, 68:233, 2002) . Na presente invenção, o ginseng selvagem ou 5 ginseng inclui ginseng cultivado ao ar livre ou ginseng de tecido cultivado (raízes adventícias e linhagem de células não derivada de raiz adventícia.

A linhagem de célula do Panax ginseng derivada de câmbio de acordo com a presente invenção tem as seguintes características: (a) está em um estado inatamente indiferenciado; (b) é uma linhagem de célula homogênea; e (c) é morfologicamente caracterizada por um número de vacúolos. A linhagem de célula Panax ginseng derivada de câmbio de acordo ~ cc:_m ~a ~p~e~ente invenção é adicionalmente caracterizada por: =.-= -=- = (a) estar presente como ~ cél~las ~ londi v"ictuâis ~d(irahfe ~ a~ suspensão da cultura; (b) ter baixa sensibilidade para tensão ~d~ çi§abh~m~!lt~o em um biorreator comparado à linhagem de = -= -=- - célula derivada dos tecidos, exceto o câmbio do Pana~ ginseng, -- e (c) tem maior taxa de -cies-címent-o -do- -que --aquelas- da - linhagem de céiulas derivadas de tecidos exceto o câmbio de Panax ginseng e é cultivado estavelmente.

A linhagem de célula de acordo com a presente invenção é obtida usando um método de isolamento compreendendo os passos de: (a) obter tecidos radiculares armazenado contendo o câmbio de Panax ginseng; (b) aplicar tensão osmótica ao câmbio obtido contendo tecidos radiculares armazenados, e então cultivando câmbio contendo tecidos radiculares armazenado no IAA (ácido indol-3-acético)- ou IBA (ácido indol-3-butírico), contendo meio, portanto induzindo -uma linhagem de célula derivada de câmbio; e (c) coletar a linhagem de célula derivada do câmbio induzido.

No passo (b) do método da invenção, a aplicação da tensão osmótica é realizada afim de induzir a linhagem de célula especificamente em um câmbio. Preferivelmente, é realizada antes de cultivar o tecido em 5 IAA- ou IBA- contendo meio, tais como tecidos gerais (isto é, córtex, xilema, floema e medula) exceto o câmbio que perde a capacidade de se dividir, e portanto tornando-se necróticos quando são tratados com um hormônio cambial de divisão específica tais como IAA ou IBA. Aqui, preferivelmente, o 10 agente osmótico é usado em uma quantidade de O, 5-2M, e a tensão osmótica é aplicada em condição de frio ou em temperatura ambiente por 16-24 horas, e então removido. Entretanto, o escopo da presente invenção não é por isso limitada, devido a concentração, tempo de tratamento e 15 ~t~mperatura do agente osmótico pode variar dependendo do tipo -=- -.=.=- ---=-;;: -= :-- -= a ==-= -~ de vegetal e o estado do tecido. No passo (b), rAA-ou IBA~é preferencialmente contida em uma quantidade de 0,1-5mg/L.

Preferivelmente, o passo (c) --- - · ----~- -~- -·~. --- --~ --- 20 através da proliferação-- da Tinhage·m- de-cé-Iu-la-de-r.i:-vacl-a-de- ----- __ câmbio induzido em um ineio contendo uma ou -mais das 2, 4-D (2, 4- ácido diclorofenoxiacético), picloram e IBA, e então coleta a linhagem de célula derivada de câmbio. Aqui, qualquer um dos 2,4-D, picloram e IBA é preferivelmente 25 contido em uma quantidade de 1-5 mg/L, e mais preferivelmente 2 mg/L.

Na presente invenção, o cultivo da linhagem de célula é preferencialmente obtida através da cultura 30 adicionalmente da linhagem de célula em um meio, o qual, como elicitores, contém 3-5% em peso de açúcar bruto ou açúcar, e/ou um ou mais de met~l jasmonato, chitosana, fenilalanina, ácido benzóico, ABA, ácido salicílico e acetato de sódio. Aqui, o meio preferencialmente contém 3-5% em peso de açúcar bruto ou açúcar; e pelo menos uma substância selecionada do grupo consistindo de metil jasmonato, extrato fúngico, extrato bacteriano, extrato de levedura, chitosana, glucomana, glucano, fenilalanina, ácido benzóico, ácido salicílico, 5 ácido araquidõnico, STS, mevalonalonato N-benzoiglicina, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, ethephon, ácido hipúrico, nitrato de amõnio cérico, sulfato de vanádio, ácido p- aminobenzóico, brassinosteróides, alginato de sódio, e acetato de sódio. 10 Também, na presente invenção, é possível usar uma cultura obtida através do tratamento de linhagem de célula com elicitores, incluindo radiação UV, calor, etileno, um agente antifúngico, um antibiótico, um sal de metal pesado 15 e sal de alta concentração, para aplicar tensões físicas e químicas.

O meio usado na presente invenção é um meio ~- convencional para cultura do tecido vegetal, - - ---· -- - 20 destes incluem, mas nâo-sâo Tim1tados,-me1o-N6--, -me-±-o-SH-,- mei-e-- ~-- - ~.-- MS, meio AA, meio LS, meio B5, meio WPM, meio LP, meio Branco, meio GD, meio DKW, meio OCR, etc.

Na presente invenção, o extrato é 25 preferencialmente obtido usando um sol vente selecionado do grupo consistindo de água destilada, álcool, acetona, DMSO (dimetilsulfóxido), e solventes misturados dos mesmos. Aqui, exemplos de álcool incluem álcoois tendo de 1 a 5 átomos de carbono, tais como metanol e etanol. 30 Na presente invenção, o extrato pode ser obtido pelo fracionamento ·de linhagem de célula sequencialmente com água destilada, metanol e acetona.

Em um exemplo da presente invenção, os fibroblastos que sintetizam o colágeno (componente primário da derrne da pele) foram tratados com dito extrato de linhagem de célula ou meio de cultura e, como resultado, foi 5 descoberto que o extrato de linhagem de célula e o meio de cultura tem um excelente efeito sobre a proliferação de fibroblastos, sugerindo que o extrato de linhagem de célula e o meio de cultura da presente invenção tem o efeito de aumentar a elasticidade da pele. Em outro exemplo da presente 10 invenção, foi descoberto que o extrato de linhagem de célula e o meio de cultura da presente invenção tem efeito de inibir a expressão de MMP-1 que degrada o colágeno da pele para formar rugas na pele, sugerindo que elas têm o efeito de prevenir e reduzir rugas. Em um outro exemplo ainda da 15 presente invenção, foi descoberto que o extrato de linhagem de célula e o meio de cultura da presemte~ÍnvenÇão ~têm-c- o efeito de inibir as espécies de oxigênio reativo induzidas _2el<=:__ radiação uv, sugerindo que elas tenham efeito antioxidante. Pelo fato de ser amplamente conhecido por ---------- ---··- --- 20 aque 1 e s espec i a 1 fs tas-n-a--te cn i e:·a q-ue- a s-·c-omp·o-s·i çõ-es--têm-· atividade antioxidante, tem um efeito anti-envelhecimento, -é óbvio que a composição de acordo com a presente invenção, tem efeito anti-envelhecimento.

25 Em outro exemplo, ainda da presente invenção, para assegurar objetividade, os testes anti-envelhecimento e antioxidante para extrato de linhagem de célula e meio de cultura da presente invenção foi desempenhada por urna ., organização de análises externas . Como resultado, foi 30 descoberto que o extrato de linhagem de célula e o meio de cultura da presente invenção tem um excelente efeito anti- envelhecimento comparado ao RA que é conhecido por ter um excelente efeito anti-envelhecimento e extrato de ginseng selvagem. Além disso, poderia ser visto que o extrato de linhagem de célula e o meio de cultura da presente invenção tem um efeito muito mais antioxidante comparado a um extrato de ginseng selvagem cultivado ao ar livre.

5 Consequentemente, foi encontrado, como descrito acima, que o extrato de linhagem de célula teve um efeito anti-envelhecimento e atividade antioxidante. Assim, mesmo na presente invenção, não há exemplo específico mostrando que a composição contendo a linhagem de célula 10 mostra um efeito anti-envelhecimento e atividade antioxidante, ficará óbvio para aqueles especialistas na técnica que a composição contendo a linhagem de célula de acordo com a presente invenção ou um lisado do mesmo possa também mostrar um efeito anti-envelhecimento e atividade antioxidante. 15 Uma composição anti-envelhecimento~ ou antioxidante contém uma ou mais linhagem de célula de acordo com = a presente -·.;;;.;;;;;:r -=- invenção, um extrato, --=-= - ---=- um lisado e uma cultura do mesmo pode ser provida como uma composição farmacêutica -~-- ---- 20 co~te~do uma--ou -mais de-d1 tas --Iinnag-erisae --cél-uJ:·a·,-um-li-s-a-do-1 -- um extrato e uma cultura do mesmo isolado -ou em combinação com pelo menos um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. A linhagem de célula, um lisado, um extrato ou meio de cultura do mesmo pode ser contido em 25 uma composição farmacêutica em uma quantidade farmaceuticamente eficaz dependendo da doença e sua severidade, a idade do paciente, peso, condição de saúde e sexo, a via de administração e o período de tratamento 30 Como usado aqui, o termo "composição farmaceuticamente aceitável" refere-se a composição que é fisiologicamente aceitável e não causa reações alérgicas ou reações similares tais como distúrbio gastrointestinal ou vertigem, quando administrados para humanos. Exemplos de ditos transportador, excipiente ou diluente pode incluir lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, amido, maltitol, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, 5 metilcelulose, polivinilpirrolidona, água, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, estearato de magnésio e óleos minerais.

A composição farmacêutica pode adicionalmente conter enchimentos, agentes anti-agregantes, lubrificantes, agentes molhantes, perfumes, emulsi ficantes e preservantes. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada usando um método bem conhecido na técnica, de modo que possa melhorar a liberação rápida, sustentada ou retardada do ingrediente ativo após sua administração a ~ mamíf~ro~s.- A form~llação pode ser em forma âe p6; grânuro·s, tabletes, emulsões, xaropes, aerossol, cápsulas macias ou duras de gelatina, soluções de injeção estéril, pós estéreis, etc.

Em outro aspecto, -a "presente invenção refere- se a uma composição cosmética anti-envelhecimento contendo, como um ingrediente ativo, uma ou mais de dita linhagem de célula derivada de câmbio Panax ginseng, um lisado, um extrato e uma cultura do mesmo.

Como usado aqui, o termo "produto Cosmético funcional" refere-se a um produto cosmético, a funcionalidade deste tem sido melhorada através da adição de uma ou mais linhagens de células de acordo com a presente invenção, um extrato, um lisado, e um meio de cultura do mesmo. Por exemplo, uma composição cosmética- anti-envelhecimento, contendo uma linhagem de célula da presente invenção, um lisado, um extrato ou um meio de cultura do mesmo podem ser usados para preparar um produto cosmético funcional.

A composição cosmética da presente invenção 5 pode conter ingredientes convencionais para cosméticos, além da linhagem de célula ou seu lisado, extrato ou meio de cultura como um ingrediente ativo. Por exemplo, a composição cosmética pode conter auxiliares convencionais tais como, antioxidantes, estabilizadores, agentes solubilizantes, vitaminas, pigmentos e perfumes, assim como transportadores.

A composição cosmética da presente invenção pode ser preparada em quaisquer formulações que são convencionais na técnica. Preferivelmente, a composição cosmética pode ser preparada em uma formulação selecionada do grupo consistindo de loção para pele, 16Çâ6 ·de ~rei te, ~creme nutritivo, creme para massagem, essência nutritiva, embalagem, maquiagem base, - -= ~..,. base, óleo -=. --= - para o corpo, --== -----=.:... -==-· óleo para o cabelo, xampu, e condicionador.

A composiçãb cosmética da presente invenção, que contém uma ou mais linhagem de célula da presente invenção, um extrato, um lisado e uma cultura do mesmo, tem um efeito antioxidante, e assim tem os efeitos de eliminar radicais livres gerados na pele e proteger sistemas intracelulares antioxidantes. Consequentemente, a composição cosmética da presente invenção pode apresentar os efeitos de prevenção e retardamento do envelhecimento da pele resultante da oxidação causada pela ação, de por exemplo, radicais livres.

Em outro aspecto, a presente invenção refere- se a um alimento funcional contendo anti-envelhecimento e antioxidante, como um ingrediente ativo, uma ou mais linhagem de célula Panax ginseng derivada de câmbio, um lisado, um extrato e uma cultura do mesmo.

Como usado aqui, o termo "alimento funcional" refere-se ao alimento, cuja funcionalidade tem sido melhorada através da adição da linhagem de célula da presente invenção, um lisado, um extrato ou um meio de cultura do mesmo.

EXEMPLOS A seguir, a presente invenção será descri ta com mais detalhes com referência aos exemplos. É para ser entendido, entretanto, que esses exemplos são somente para propósitos ilustrativos e não para serem interpretados para limitar o escopo da presente invenção.

Particularmente, embora os efeitos de anti- envelhecimento da pele de um extrato e meio de cultura da linhagem de célula do Panax ginseng derivado do câmbio foram confirmados nos ~-se-gtiiiites ~e-xemplos;~-~-~ f i-c-a-rá --óbv·i~o- para- -~os-- especialistas na técnica que o uso da linhagem de célula-ou seu lisado pode prover os mesmos resultados corno aqueles obtidos usando o extrato ou meio de cultura da linhagem de célula.

Exemplo 1: Preparação da linhagem de célula derivada do câmbio do ginseng selvagem 1-1: Preparação do material do vegetal "A" da FIG.1(a) apresenta urna caracteristica tipica do ginseng selvagem usado na presente invenção. Afim de usar a raiz principal de ginseng selvagem comprado, a raiz principal foi comprada, e então lavada com água corrente para remover terra ou outros contaminantes da superfície do mesmo, e a superfície da raiz principal foi lavada com detergente líquido. Então a raiz principal foi possibilitada de ficar sob água corrente. O tecido da raiz lavada foi colocada em um 5 frasco esterilizado em uma bancada limpa e desinfetada com etanol 70% por um tempo na faixa de 30 segundos a 1 minuto. Então, foi lavada com água estéril e tratada com uma solução de desinfetante contendo 1-1,5% de hipoclorito de sódio (Junsei, Japão) por aproximadamente 5-15 minutos. Nessa hora, afim de permiti r a solução desinfetante penetrar de forma eficaz ao tecido, várias gotas de TWEEN 20 (monolaurato de polioxietileno sorbitano, Junsei, Japão) foram adicionadas ao tecido. Seguindo este procedimento, o tecido foi lavado 3-5 vezes com água estéril. Afim de evitar o escurecimento do tecido desinfetado, a raiz principal desinfetada foi colocada em antioxidante contendo BIM escurecimento) e cultura de agitação por cerca de 30 minutos a 1 hora. O tecido cultivado foi colocado em filtro de papel estéril para remover a água.

A composição de BIM usada e as concentrações de componentes do mesmo são mostradas na tabela 1 a seguir.

< Tabela 1> Composição de BIM e concentrações dos componentes do mesmo Composição Concentrações Sal McCown WPM 1/4 energia Sacarose 1% (w/v) PVP(polivinil porrolidona) 0,5%(w/v) Ácido ascórbico lOOmg/ f

Ácido cítrico 150mg/ l Ajuste para pH 5,8 Na tabela 1, o sal é adicionado em urna quantidade correspondente do volume total de BIM.

5 Afim de evitar o escurecimento do material tratado acima, este foi colocado em urna vasilha contendo antioxidante CS (solução de corte, Tabela 2} e descascado. Então, o material foi cortado em duas partes iguais, e cada uma das partes foi cortado no tamanho de 0,5-0,7 em (largura} x 0,5-0,7 em (comprimento} x 0,2-0,5 mrn (espessura} de tal modo que cada parte cortada continha urna parte do câmbio tendo capacidade de divisão ativa. "B" da FIG.1(a} apresenta o explante preparado através do corte da raiz principal do ginseng selvagem para o tamanho acima de tal modo que o ex2la~te contém o câmbio.

--------- ~-------------- ------ - --~----- <Tabela 2> (solução de corte} Componente Concentração PVP (poli vinil porrolidona} 0,5%(w/v} Ácido ascórbico 100mg/e Ácido cítrico 150mg/f 1-2: Tratamento do explante contendo câmbio da principal raiz de ginseng selvagem com agente osmótico O explante preparado no exemplo 1-1 foi tratado com tensão osmótica afim de necrotizar tecidos diferenciados (por exemplo, floema, xilerna, medula, etc.} e permitir somente que o câmbio meristema sobreviva. O câmbio contendo explante apagados em um meio precul tura (meio 1 tabela 3)tendo filtro de papel nele estabelecido, e foi colocado em um frasco contendo 1M de solução de sacarose (Duchefa, Netherland) e foi tratado com tensão osmótica em um estado frio por 16-24 horas. Então, o explante foi tratado em solução de sacarose O,lM por 5 minutos para remover a tensão causada por alta concentração de sacarose. O Câmbio contendo explante da qual a tensão osmótica tem sido removida foi colocado em um meio de precul tura (meio 1) tendo filtro de papel nele estabelecido para remover umidade.

<Tabela 3> Composição de meio de precul tura (meio 1) -- - ·- - - - - -- - Composição ~ mg/ e Ca (N03) 2 2,35 471,26 - ~-- --=. -=- ~- ---=--·- .. -- ~- --== ----=-= - ---.-.- ~ ~- --=' ~ --- ---·--- -- NH4N03 - - - ---- ----- _5 ----------- 400 - -- Macroelementos MgS04. 7H20 1,5 180,54 K2S04 5,68 990 CaCl2. 2H20 0,65 72,5 KH2P04 1,25 170 Composição ]JM mg/ e Microelementos MnS04. 4H20 131,94 22,3 ZnS04. 7H20 29,91 8,6 Na2M004. 2H20 1,03 0,25

H3B03 100,27 6,2 CuS04. 5H20 1,0 0,25 FeNa-EDTA 100 36,7 Glicina 26,64 2,0 - ~io-Inositol 554,94 100 !Vitamina Ácido nicotínico 4,06 0,5 Piridoxina-HCl 2,43 0,5 Tiamina-HCl 2,96 1,0 1-3: Indução da linhagem de célula do câmbio deriVãâol'romógêneó no ·explant-e"'~'Contendo~· o· câmbio do~ ginserrg selvagem 5 Para induzir -a-ITnnàgem ·de célula h-omogênea~· -------do---câmbio der-iv-ade-Eenào--a--eapa cidade--de--d-i-v-i-.sào-de-cé-J.ula-,- -O explante tratado com tensão osmótica no Exemplo 1-2 foi transferido para o meio de indução de linhagem de célula 10 (meio 2, tabela 4). A composição do meio usado é mostrado na tabela 4. O explante transferido foi cultivado em condição de escuridão a 22 ± 1°C.

<Tabela 4> Meio de composição (meio 2) usado 15 para induzir a linhagem de célula derivado do câmbio homogêneo 20

Componente Concentração e condição Sal Energia completa WPM Sacarose 3%(w/v) IAA(Ácido indol-3-acético) 2mg/ f pH 5,8 Gelrite 0,3%(w/v) Ácido ascórbico lOOmg/ f Ácido cítrico 150mg/ f -~· C~omo moêtrado na tabela 5 a seguir, em explantes transferidos diretamente para o meio de indução de linhagem de célula homogênea sem realizar o tratamento 5~- -osmótico, -uma~ reação~ de~ coloração ~ama_r_ela~ foi mostrada com ---· _____ relação --~-· -·· ao câmbio -~--~-------- em estado inicial ·-·-~---~------·-----. ( 2-3 dias) após a ----------- --------- - transferência, e então com o passar do tempo, o explante - inteiro ficou amarelo. O explante que mostrou a reação de cor amarela com relação ao câmbio foi subcul ti vado em um ótimo 10 meio (meio 3) para isolação e proliferação de uma linhagem de célula derivada do câmbio para induzir e proliferar a linhagem de célula derivada do câmbio, mas o fenômeno de escurecimento tornou-se rigoroso, e qualquer reação exceto reação de escurecimento não foi apresentada mesmo durante o 15 passar do tempo.

Entretanto, após a tensão osmótica ser tratada e removida, foi observado como mostrado na tabela 5 que, no explante inoculado para o meio de indução de linhagem 20 de célula homogênea, uma linhagem de célula homogênea foi especificamente induzida somente em um câmbio sem ser induzida em outros tecidos. Especificamente, foi observado que, no explante transferido que foi tratado com tensão osmótica e do qual a tensão osmótica foi liberada, o câmbio do explante começou mostrar uma luz amarela após 3-7 dias de cultura, e depois de 7-14 dias, uma linhagem celular arredondada foi induzida na porção que mudou para a luz de cor amarela. "C" da FIG.l(a) mostra que a linhagem de célula homogênea tendo capacidade de divisão de câmbio específico foi induzida no explante contendo o câmbio de ginseng selvagem.

Enquanto isso, o explante foi cultivado em um meio contendo 2, 4-D-D, que não foi o meio de linhagem de célula homogêneo de indução e foi usada no cultivo convencional de Panax ginseng, incluindo o ginseng e o ginseng selvagem. Nesse que o explante inteiro começou a ficar amarelo após 7-10 dias de cultura, e por volta de 7-14, as células foram induzidas por toda seção transversal.

<Tabela 5> Comparação da reação entre o explante tratado com tensão osmótica e o explante não tratado com tensão osmótica Tratada Tratada Tratada Tratamento ~ão tratada por 16 por 20 por 24 horas horas horas Uma reação de coloração Foi observado que as amarela progrediu com células foram Aspecto relação ao câmbio em especificamente induzidas respeito ao câmbio em somente no câmbio. Quando o estágio induzido inicial câmbio foi tratado com após a inoculação,tensão osmótica por períodos enquanto essa reação sede tempos variados, espalha pelo explante.resultados similares foram Então, uma severamostrados. Em outras coloração castanha palavras, não houve progrediu pelo explantediferença significante entre '· incluindo o câmbio, e aos períodos de tratamento. indução da linhagem de célula homogênea, específica no câmbio, não foi mais mostrada.

1-4: Proliferação de linhagem de célula homogênea derivada do câmbio de ginseng selvagem 5·~" ~~A ~linhagem -~de~ cé.lula~horno~g_êpea __derivé3.da~çie câmbio tendo a capacidade de se dividir, induzida no Exemplo 1-3 foi possível de se proliferar. O meio usado na proliferação~foi -um ót---±rno meio +tabe~a 7 )~para~prolifera_ção ______da _linhag_ern _de cé1:ula _h_omogênea _ der~vada do câmbio, tendo a 10 capacidade para se dividir, a qual contém urna composição de sal basal (Tabela 6) .

<Tabela 6> Composição de sal basal de ótimo meio para isolação e proliferação de linhagem de célula 15 homogênea derivada do câmbio tendo a capacidade de se dividir Composição mM rng/L Macroelernentos CaCl2. 2H20 2,99 332,02 KH2P04 1,25 170 KN03 18,79 1900

1,5 180,54

20,61 1650

Composição mg/L

0,11 0,025

0,1 0,025

FeNa-EDTA 100 36,7

100,27 6,2 ~icroelementosr------------------------+-------------r----------~ KI 5,0 0,83

100 16,9

·--1-, 03

29,91 8,6

Glicina 26, 64 ---. --- -----· - ·-·"""-===----.. . . . . ~~~--------+--------..._-------+-----

mio-Inositol 554,94 100

Vitaminas Ácido nicotínico 4,06 0,5

Piridoxina-HCl 2,43 0,5

Tiamina-HCl 0,3 0,1

<Tabela 7> Composição de ótimo meio (meio)

.. para isolação e proliferação de linhagem de célula homogênea derivada de câmbio tendo capacidade de se dividir 5

Componente Concentração e Condição Sal Energia completa MS Sacarose 3%(w/v) 2,4-0(2,4-ácido 2mg/L diclorofenoxiacetico) pH 5,8 Gelrite 0,3%(w/v) Ácido ascórbico 100mg/L Ácido cítrico 150mg/L ~- - -- -···-- - Como mostrado no "C" da FIG.1 após a linhagem de célula homogênea ter sido especificamente induzida somente 5 no câmbio usando tratamento de tensâo osmóti-ca e meio -2, ã ---Tinliagem-ae-célula -h-omo-gêne-a-- fo-i---subcu-1-E-iv-aàa--r:H~>- -rne-io--3--como __ mostrado na tabela 7. Como- resultado, a linhagem de célula homogênea derivada de câmbio tendo a capacidade de se dividir continuamente dividida e proliferada, e consequentemente, 10 depois de 10-20 dias de cultivo, a linhagem de célula homogênea derivada do câmbio tendo a capacidade de se dividir seria isolada. A linhagem de célula homogênea derivada do câmbio de ginseng selvagem isolada pode proliferar novamente cultivando-o no mesmo meio. "D" da FIG.1 (a) mostra que a ~15 linhagem de célula homogênea de câmbio específico isolado foi possibilitado de proliferar no meio 3.

1-5: Observação das características de linhagem de células isoladas

A linhagem de célula homogênea de câmbio derivado de ginseng selvagem foi colocada em um frasco contendo meio líquido mostrado na Tabela 8. Portanto, a linhagem de célula foi cultivada em um agitador rotativo a 5 100 rpm no escuro a 25±1°C. Aqui, o intervalo de subcultura foi estabelecido para 2 semanas, de modo que as células cultivadas poderiam sempre manter alta vitalidade na fase de crescimento exponencial. Enquanto isso, o ginseng derivado de calus cotilédone foi também cultivado no meio 4 da Tabela 8, 10 e o calus cultivado foi comparado com a linhagem de célula homogênea derivada de câmbio de ginseng selvagem da presente invenção.

<Tabela 8> Meio de suspensão para Panax Componente Concentração e condição --- - -=..·- ~ ~ ~ ~- Sal Energia completa MS --- -- -- - - -------- - - - - - - ----- Sacarose 3%(w/v) - 2,4-0(2,4-ácido 2mg/L diclorofenoxiacetico) pH 5,8 A quantificação de agregação da célula foi · 20 observada sob um microscópio óptico (microscópio biológico CX31, Olympus, Japão)e, como resultado, pode ser visto que, como mostrado na Tabela 9 abaixo, mais de 90% das células das linhagens de células de acordo com a presente invenção estavam presentes como células individuais durante a cultura 25 de suspensão. Como mostrado na FIG.l (b), poderia ser observado que a linhagem de célula da presente invenção foi morfologicamente caracterizada por um grande número de vacúolos e estava em estado indiferenciado.

<Tabela 9> O tipo de célula agrega as culturas a longo prazo de Panax ginseng ~gregantes Agregantes ~gregantes População Fonte de de células de células de células de células explante grandes moderadas pequenas individuais 90% 7% 2% 1% cotiledon o o 5% 95% Câmbio Agregantes de células grandes, tamanho maior que 1,5x10 3 ,um; --= -.=- --=- =-- = -=- = -= Agregantes de células m-od;radas- ix-10 3/.an;- - - - - - ------- ------ - - - - - -------- Agregantes de células pequenas 4x10 2 ,um<tamanho< 1xl0 3 ,um Enquanto isso, para examinar a possibilidade de aumentar o cultivo, cada um dos calus de ginseng derivado do cotiledon e a linhagem de célula homogênea derivada do câmbio da presente invenção foi cultivada em um biorreator de transporte (Sung-Won Cytec, Coréia) tendo um volume de intervalo de 3 L. O meio usado no cultivo foi o meio líquido mostrado na Tabela 8 e foi mantido no escuro a 25± 1°C.

Como resultado, como mostrado na Tabela 10, o dobr·o de tempo de cultura de célula do ginseng derivado do cotiledon foi de 21 dias no frasco e 28 dias no reator. Em outras palavras, foi visto que, quando cultivado em frasco, a linhagem de célula derivada de câmbio de acordo com a presente invenção mostrou por volta de 3 a 5 vezes maior taxa de crescimento comparadas as linhagens de células derivadas de tecidos exceto o câmbio. Acredita-se que é devido a 5 viabilidade da célula de linhagem de célula heterogênea rapidamente diminuída devido o crescimento da produção em forma de anel no reator, agregação da célula vegetal durante o cultivo, e a sensibilidade de células de paredes duras para cisalhamento da tensão.

Enquanto isso, o dobro de tempo de meio de cultura de célula derivada do câmbio de acordo com a presente invenção no reator foi de 3-4 dias, o qual não diferiu daquele do frasco ou era bastante reduzido se comparado com aguele no . frasco. O meio de cultura de célula homogênea d~~i~~da do- c~mbio-~formou área~ de p;q~~-~-10- cre~s~i"mento de anef no biorreator, e o anel na parede interna foi simplesmente eliminado,~ quando~ um _si~pl~s estímulo foi aplicado ao ~ incubador para agitar o meio. Além disso, foi mostrado que a --- ~- linhagem de célula da presente ~invençáoteve-baTxa- agregaç-ão-- --- -- e tinha um grande número de vacúolos, e assim teve baixa sensibilidade para cisalhamento da tensão, de forma que a viabilidade da célula não diminuísse. Em outras palavras, foi visto que a linhagem de célula derivada do câmbio de acordo com a presente invenção teve baixa sensibilidade para cisalhamento da tensão resultando da agitação no biorreator para aumentar o cultivo, e assim poderia ser produzido rapidamente em grandes quantidades no biorreator. Consequentemente, poderia ser visto que a linhagem de célula derivada do câmbio de acordo com a presente invenção tivesse de 5 a 9 taxa de sensibilidade menor para cisalhamento de tensão comparada às linhagens de células derivadas de tecidos exceto o câmbio.

<Tabela 10> Dobrar o tempo de linhagem de célula do câmbio derivado de ginseng selvagem em cultura de suspensão líquida e biorreator Dobrando o tempo (dia) Fonte do frasco biorreator explante cotiledon 21 28 Câmbio 5 3-4 1-6: Tratamento com Eliciador JS:. · rinhagem~ de- célula, ~que ~foL cul"ti vada __ ~em suspensão por 14 dias como descrito no Exemplo 1-5, foi dividida em três grupos para experimentos.

~- -- --Em-- outr-as-pa-la-Vras ,_as~ s~e_ gJ.iinte_ê__linhagens de ~-- --- ~--·----- células foram coletadas e. submetidas aos seguintes testes: (1) a linhagem de célula (estágio de crescimento) cultura de suspensão por 14 dias, (2) uma linhagem de célula (Elicitação 1), obtida pelo cultivo de linhagem de célula em cultura de suspensão por 14 dias em um meio (contendo água estéril, 3- 5 % em peso (g/L) açúcar bruto e 100 pM de metil jasmonato) no escuro por 14 dias, e ( 3) uma linhagem de célula (Elicitação 2), obtida através do cultivo de célula em cultura de suspensão por 14 dias em um meio (contendo 100 ~M de metil jasmonato) no escuro por 14 dias) Exemp1o 2: Preparação do extrato de 1inhagem de cé1u1a de ginseng se1vagem derivado do câmbio

Substâncias ativas foram extraídas da seguinte maneira de três linhagens de células preparadas no Exemplo 1: . 5 (i) Preparação de extrato de DMSO (dimetilsufóxido) (ii) 500g de cada linhagem de célula, do qual o meio tem sido removido, e a linhagem de célula liofilizada, foi dissolvida em 500mL de DMSO com agitação de 50 rpm por 6 horas.

(i i) Após completar a dissolução, a solução de célula foi centrifugada a 3. OOOg por 10 minutos, e o sobrenadante foi coletado, assim obtendo uma substância solúvel em DMSO.

(iii) A substância solúvel em DMSO obtida foi ~ concentrada usando um concentrador a vácuo rotatório. --- - - - - - ----- -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -~- -~~--- (iv) a amostra concentrada foi seca usando um liofilizador, portanto obtendo um extrato de DMSO.

(2) Preparação de extrato de água destilada, extrato de metanol e extrato de acetona.

(i) 500g de cada linhagem de célula, da qual o meio de cultura foi removido, e a linhagem de célula liofilizada, foi dissolvida em 500mL de água destilada com agitação de 50 rpm por 6 horas.

(ii) Após completar a dissolução,- a solução de célula foi centrifugada a 3. OOOg por 10 minutos, e o sobrenadante foi coletado, portanto a substância de água destilada foi obtida.

(iii) Após obter a substância de água solúvel destilada, a substância de água insolúvel destilada remanescente foi dissolvida em 500 mL de metanol com agitação a temperatura ambiente por 6 horas.

(i v) Após completar a dissolução, a solução foi centrifugada a 3. OOOg por 10 minutos, e o sobrenadante foi coletado, portanto uma substância solúvel em metanol foi obtida. (v) após obter uma substância solúvel em metanol, a substância insolúvel em metanol remanescente foi dissolvida em 500mL de acetona com agitação de temperatura ambiente por 6 horas.

(vi) Após completar a dissolução, a solução foi ce~trifuga<:J.2 a 3. OOOg por 10 minutos, e o sobrenadante ~-· foi coletado, portanto a substância solúvel em acetona foi obtida.

(vii) Substâncias solúveis em água destilada, metanol e acetona obtidos como descrito acima foram concentrados usando um evaporador a vácuo giratório.

(viii) As amostras concentradas foram secas usando um liofilizador e dissolvida em água destilada, metanol e acetona, portanto obtendo um extrato de água destilada, um extrato de metanol e extrato de acetona.

(3) Preparação do controle (i) 500g de uma raiz de ginseng selvagem liofilizada foi dissolvida em 500mL de DMSO com agitação de

50rpm por 6 horas.

(ii) Após a dissolução, a solução foi centrifugada a 3. OOOg por 10 minutos, e o sobrenadante foi 5 coletado, obtendo assim uma substância solúvel em DMSO.

(iii) A substância solúvel em água destilada foi concentrada usando um evaporador a vácuo giratório.

(iv) A amostra concentrada foi seca usando um liofilizador, portanto obtendo um extrato de DMSO de ginseng selvagem como controle~ Exemp1o 3: Exame de citotoxidade Para determinar a concentração da amostra a ser usada em testes, um teste de citotoxidade foi desenyolvi~o da s~guinte maneira.

--·-- ------- Células NHF (fibroblasto normal human-6) --· usadas em teste foram isoladas do prepúcio fetal e cultivadas. Um meio usado no cultivo celular foi preparado através da adição de 10% do soro bovino fetal (FBS, Hyclone, Logan, Utah, USA), inativado pelo calor de 56°C por 30 minutos, 100 unidades/mg penicilina, 100mg/mg estreptomicina e 300 mg/mg- glutamina. Para o meio DMEM ( Invi trogen Gibco Li f e tech. Vienna, Austria). As células foram cultivadas no meio acima em 5% C0 2 incubador a 37°C e uma umidade relativa de 95% e subcultura de 3-4 dias de intervalos imediatamente antes das células serem fundidas umas com as outras. As células NHF foram usadas nos experimentos deste Exemplo e os Exemplos 4 e 5 abaixo.

As células NHF (p5) (células de fibroblasto humano normal) foram dispensadas em placas 96-poços em uma densidade de 5.000 células/poços, e depois de 24 horas, foram tratadas com cada um dos extratos de DMSO e meio de cultura 5 da linhagem de célula derivado do câmbio do ginseng selvagem, preparado no Exemplo 2, em várias concentrações (extratos de DMSO molhados e secos de linhagem de célula derivado do câmbio de ginseng selvagem: PPM, e meio de cultura da linhagem de célula; %) • Portanto, as células puderam 10 proliferar. Como controle, células, não tratadas com extrato ou meio de cultura, foram usadas. A seguir, a solução WST-1 foi diluída em 100 vezes e adicionada em cada poço da placa, e depois de 2 horas a absorbância da placa foi medida.

15 Como resultado, como mostrado na Tabela 11 -=·=-·- ~-:0 abaixo e FIG.2, os extratos e meio de cultura não mostraram toxicidade nas faixas de concentração usadas no experimento. _Extratos~ou rn_eio~çie c~ltura uma viabilidade de célula de 80% ou mais foram determinadas para sei não-tóxica. Na Tabela 11, -- -- -- ---- - - - - - - - - - - - - - - ----· - - - - - - - - - - - - - - - - - - ------ 20 "Elici tação 1" indica um extrato de DMSO de linhagem --ae ---- célula do Exemplo 1-6, tratado com 3-5 % em peso (g/L) de açúcar bruto e 100 pM de metil jasmonato, "Elicitação 2" indica um extrato de DMSO de linhagem de célula do Exemplo 1- 6, tratado com 100 pM de metil jasmonato, "Crescimento" 25 indica um extrato DMSO de 14 dias de linhagem de célula em cultura de suspensão (estágio de crescimento) do Exemplo 1-6, e "Meio" indica meio de cultura removida durante a preparação de extratos de linhagem de célula.

30 <Tabela 11> Exame de citotoxicidade de extratos de linhagem de célula homogênea derivada do câmbio de ginseng selvagem ou meio de cultura

Condição da Concentração Estágio % de controle amostra (ppm ou %) Controle 100 100 102 Elicitação 1 10 95 1 98 100 110 Molhado(ppm) Elicitação 2 10 100 1 98 -~ -- --= .=--=-r•--=:- -· 100 108 =.--:· """'""=-' ~=-::: =-":-:'.

Crescimento 10 106 - --== ~ - ·- ---~.:. 1 ~ ~---=-= 105 -~ -----=- - ·-·- -~--~···- --~- s·o ------ -- --~ Trs- ·- -----··-- - -- - - - Elicitação 1 10 105 1 95 50 105 Seco(ppm) Elicitação 2 10 105 1 100 50 110 Crescimento 10 115 1 100

Elicitação 1 5 125

1 135

10 110

Meio(%) Elicitação 2 5 115

1 115

10 98

Crescimento 5 100

1 98

Exemplo 4: Exame do efeito sobre a proliferação de fibroblastos Exame do efeito anti- ~emrelhecim-en t~o

As células de fibroblastos humanas normais (células NHF) cultivadas em 3,5 DMEM meio contendo FBS (Doubecco' s Modified Eagle' s Media) foram dispensadas em uma placa de microti tulação 96-poço em uma densidade de 5. 000 células/poço e sem se alimentar por 24 horas.

Portanto, as células foram tratadas por 48 horas com extrato de DMSO ou meio de cultura de linhagem de célula derivada do câmbio de ginseng selvagem, preparado no Exemplo 2, em O, 5% de meio essencial mínimo de FBS de várias concentrações (extratos molhados e secos de linhagem de célula derivado de câmbio de ginseng selvagem, ppm; e meio de cultura da linhagem de célula: %)

Após as células terem sido cultivadas, a solução WST-1 foi diluída 100 vezes e dispensadas em placas,

e depois de 2 horas, a solução 50,td de O, 2_ MTT (3- [4, 4- dimetiltiazol-2-yl]-2,5-brorno dipenil tetrazolio) foi adicionado para cada poço da placa. Consequenternente, as células foram cultivadas a 37oC por 4 horas, e o forrnazarn 5 produzido foi dissolvido em DMSO (dirnetil sulfoxido) . A absorbância do forrnazan dissolvido foi medido em 570nrn usando um leitor de rnicroplaca. O grupo de teste tratado com extrato de linhagem de célula derivado de câmbio de ginseng selvagem ou meio de cultura foi comparado com o controle não tratado 10 com extrato ou meio de cultura, e os resultados da comparação são mostrados na Tabela 12 abaixo. Na Tabela 12, "10% FBS" indicam células cultivadas em 10% FBS que é urna concentração de meio nutriente para o crescimento máximo em cultura de célula animal, e "Controle" é um grupo de controle negativo ~~lsc-o e ~.tndica célula-s~ cul t-±vadas-~ern O ,~5% 0 -rneio~FBS --eBsenc~al- sem~ adição de extrato de linhagem de célula ou meio de cultura.

20 Efeito· de extrato linhagem de célula homogênea derivado de câmbio de ginseng selvagem ou meio de cultura sobre a proliferação de fibroblastos Condição Concentração(pprn da Estágio % de controle ou %) amostra Controle 100 10% FBS 145 Molhado Elicitação1 100 110 (pprn) 10 105

Elicitação 2 10 110

1 113

100 125

Crescimento 10 115

1 110

50 130

Elicitação 1 10 118 =.:..-:-: ~--'=-- ---=. = -==-=-= - _, =--=:;:...-= - ---== 110~ ~- 1

50 120 ~· ~ ------=. -- ------=-=- -- -· Seco(ppm) Elicitação 2 10 115 -----·- -- ------ --~~~- ~-- -~- ~--- ------ ---- . --

1 112

50 122

Crescimento 10 118

1 110

Meio(%) 10 108

Elicitação 1 5 105

1 105

Elicitação 2 10 108

5 103

Crescimento 5 98 1 102 Como visto na tabela 12 e FIG.3, o extrato de linhagem de célula e o meio de cultura de acordo com a presente invenção teve um efeito sobre a proliferação de fibroblastos, ao contrário, o controle, e particularmente, o extrato de linhagem de célula liofilizada (Seco) teve um excelente efeito sobre a proliferação de fibroblastos.

Além disso, os extratos de linhagem de célula liofilizada (Seco) em vários estágios de crescimento foram comparados um com o outro, o extrato de Elicitação 1 teve o ~melhor- efeito sob.roe a proliferação de fibroblastos, e as _-~ç~lu_l~~- c!q ___ ~§_t_~_gi_<::>__ g_e c~escimento mostraram efeitos similares na proliferação de fibroblastos. Em outras palavras, poderia ser descoberto que devido a síntese de colágeno de fibroblastos (o componente primário da derme da pele), o extrato de linhagem de célula para a presente invenção tem o efeito de aumentar a elasticidade da pele.

Exemplo 5: Exame do efeito de inibição da expressão MMP-1 causada pela radiação UV Exame de efeito anti-envelhec~ento Quando o MMPs for aumentado devido a exposição a radiação UV, o MMPs aumentado degradará o colágeno para formar rugas na pele. Portanto, para examinar se a expressão MMP-1 que aumentou devido a radiação UV é inibido pelo extrato ou meio de cultura da linhagem de célula homogênea derivada do câmbio do ginseng selvagem, o seguinte teste foi realizado.

As células NHF (p6) foram dispostas em urna pl~ca de 12-poço a uma densidade de 75.000 células/poço e sem se alimentar por 24 horas. Portanto, as células foram irradiadas com 40 mJ de UVB e tratadas com concentrações variáveis de cada amostra por 48 horas. Então, um experimento foi realizado usando um kit (Amersham, RPN 2610). Corno controle positivo, foi usado lO pM de ácido retinóico.

<Tabela 13> Efeitos inibitórios de extrato de linhagem de célula homogênea derivado de câmbio de ginseng selvagem ou meio de cultura sobre a expressão MMP-1 causada pel~ ~~dia9ão UV Concentração !Amostra Estágio % de controle - ~- -----==-= ~ ··(pprn"··OU %')~ -=- '· -.---.....= ~ ----- -- - - - +- --~ --··- ----~-- -----· ----- 10_0_ -------- ---- Sem uv Controle uv 230 Ácido 10pM 85 retinóico Elicitação 100 125 1 10 130 Elicitação 100 125 Molhado(ppm) 2 10 135 100 140 Crescimento 10 160

Elicitação 50 120

1 10 140

Elicitação 50 135 Seco(ppm) 2 10 180

50 100 Crescimento 10 165

Elicitação 1/10 60

1 1/20 130

Elicitação 1/10 60 ~eio(%) --=-=---= 2- -==-·· 1/20 ~- ~ - zo-o~- =...:.=-~

1/10 230 ------="'- C:rescimento ---- -- -- 1/20 250 ·-·· -· ~ ... -- --·- -- -- ·-

Como resultado, como mostrado na Tabela 13 e FIG.4, o extrato de linhagem de célula e o meio de cultura de acordo com a presente invenção inibiu eficazmente a expressão 5 de MMP-1 comparada ao controle negativo (controle UV) , sugerindo que eles tivessem os efeitos de evita r e reduzir rugas.

Particularmente, quando as células NHF (p6) foram tratadas com O, 1% de cada meio de cultura de linhagem de célula da Elici tação 1, tratada com açúcar bruto e me til ~10 jasmonato, e a Elicitação 2, tratada somente com metil jasmonato, esses meios de cultura de linhagem de célula mostraram um excelente resultado comparado ao ácido retinóico conhecido por ter efeito potente sobre a redução de ruga.

Exemp1o 6: Medida do efeito inibitório sobre espécies oxigênio reativas causada pe1a radiação UV - Exame de efeito anti-oxidante Para examinar se as espécies de oxigênio reativo que aumentou através da radiação UV é inibido pelo extrato ou meio de cultura de linhagem de célula homogênea derivado do câmbio de ginseng selvagem, células HaCat queratinocite humanas (German Cancer Research Institute, Heidelberg, Germany)foram dispostas em uma placa preta de 96 poços a uma densidade de 30.000 células/poços e tratadas com concentrações variadas de cada amostra por 3 horas. Após três horas a placa foi lavada uma vez com HBS, cada poço foi tratado com 50 pM DCF e incubada a 37°C por 20 minutos. Depois da placa ter sido lavada por duas vezes com HBSS, a absorbância inicial das células foi medida usando um luminado. As células foram irradiadas com 30 mJ de UVB, cultivada a horas, e então medida por absorbância. Na tabela 14 abaixo, "controle" indica um grupo tratado sem -- ~-- --~-~- -- amostra ou UV, e "UVB" indica um grupo-- tratado somente com UVB sem adicionar a amostra.

<Tabela 14> Efeitos inibitórios do extrato ou meio de cultura da linhagem de célula homogênea derivada do câmbio de ginseng selvagem sobre espécies de oxigênio reativo causados pela radiação UV.

Concentração ~ostra Estágio % de controle (ppm ou%) Controle 100 ·- UVB 140 '

Elicitação 1 10 170

100 140 Molhado(ppm) Elicitação2 10 135

100 150 Crescimento 10 170

50 50 Elicitação 1 10 135

50 140 Seco(ppm) Elicitação2 --=- --r = o - : - ·- ··ro -~ ===-= 135 -~~-- ,-~

50 105 ----=- Cre_scirnento - - - - -·

10 145 --- r----- - ---- --- - -- - ---

10 100 Elicitação 1 1 130

10 130 Meio(%) Elicitação2 1 105

10 110 Crescimento 1 120

Como resultado, como mostrado na Tabela 14 e a FIG. 5, nos casos onde a linhagem de célula inventiva da qual o meio de cultura foi removido (molhado) foi usado e onde a linhagem de célula liofilizada inventiva foi usada

(seco), o extrato de linhagem de célula da Elicitação 1 mostrou um excelente efeito antioxidante. o extrato de linhagem de célula da Elicitação 2 e o extrato de linhagem de célula do estágio de crescimento mostrou efeitos .5 antioxidantes similares. Além disso, o grupo tratado com 50 ppm de extrato de linhagem de célula liofilizada da Elicitação 1 mostrou o melhor efeito antioxidante.

Exempl.o 7: Anál.ises de componentes 1O ginsenoside Sabe-se que os componentes da ginsenoside de extratos de ginseng selvagem são eficazes na prevenção do envelhecimento da pele e antioxidaçào. Portanto, para examinar se os efeitos de envelhecimento da pele e efeitos antioxidantes do extrato de linhagem da célula e o meio de cultura de acordo com a presente invenção são atribuídos aos ~~~e~f--e~itos de tais componentes -~~~~enoside, o conteúdo de ginsenoside foi medido. Especificamente, a linhagem de célula homogênea derivada do câmbio~ (fê- g.inseng sel vagern~.preparado no Exemplo 2 e o ginseng selvagem foi liofilizàdo, e 20 mg de linhagem de célula liofilizada foi extraída em 600 ]Jl de metanol por 1 hora. O extrato foi centrifugado e o sobrenadante foi isolado. O conteúdo do ginsenoside no extrato isolado foi medido usando HPLC, e o conteúdo medido foi mostrado em comparação com o padrão Re, Rb1, Rb2 e Rd. Além disso, o meio de cultura da Elicitação 1 foi filtrado usando um filtro de seringa, e o conteúdo de ginsenoside foi então medido usando HPLC. O conteúdo medido foi mostrado em comparação com o padrão Re, Rb1, Rb2 e Rd.

<Tabela 15> Comparação do conteúdo de ginsenoside entre linhagem de célula homogênea derivada do câmbio de ginseng selvagem e meio de cultura e ginseng selvagem.

linhagem de célula derivada do câmbio de ginseng Meio deGinseng cultura selvagem ~------------~------------~----------~de linhagem de célula derivada Crescimento Elicitaçãol Elicitação2 de câmbio de ginseng selvagem Ginsenoside (Rb1, Rb2, 0% 3% Rd, Re) Como resultado, como mostrado na Tabela 15, a linhagem de célula da Elicitação 2 mostrou o maior conteúdo de ginsenoside, mas o conteúdo de ginsenoside do extrato de ginseng selvagem, um grupo de controle, foi 167 vezes maior que o conteúdo da linhagem de célula homogênea derivada de câmbio do ginseng selvagem. Além disso, nenhum ginsenoside foi detectado na linhagem de célula derivada do câmbio de ginseng selvagem do estágio de crescimento ou no meio de cultura de linhagem de célula. Isto sugere que os efeitos anti-envelhecimento e antioxidante da pele do extrato de linhagem de célula e o meio de cultura de acordo com a presente invenção não está atribuído ao ginsenosides e que a linhagem de célula isolada de acordo com o método da presente invenção contém ingredientes ativos que diferem daqueles das células de ginseng selvagem.

Exemplo 8: Exame de efeitos inibitórios sobre ·5 a colagenase (MMP-1) produção induzida pela radiação UV (2) Afim de comparar a atividade anti- envelhecimento da linhagem de célula derivada do câmbio de ginseng selvagem inventivo com a atividade anti- 10 envelhecimento de ginseng selvagem cultivado, a seguinte experiência foi realizada por Kyung Hee University Skin Biotechnology Center de acordo com a orientação operacional padrão do centro.

15 Primeiramente, os fibroblastos (MCTT, Coréia) seme-ad.õs- em uma placa de 24-poços em uma densidade de 2xl0 4 células/poço e cultivada por 12 horas para aderir a placa de cultura. Portanto, as células ficaram sem se alimentar em um meio de FBS por 12 horas. As células foram lavadas com tampão ----20-DPBS-e~-irrC:fd-iaôo com 100-- mJ7cm 2a e UV a 365nm. Portanto, as células tratadas com cada um- de 1, 10 e 50 ppfu d~-um ~xtrato de DMSO (Elicitação 1) da linhagem de célula liofilizada do Exemplo 2 (tratada com 3-5wt% (g/L) de açúcar bruto e 100 pM de metil jasmonato) ou com cada de 0,05, 0,1 e 1 % em vol do 25 meio de cultura do Exemplo 2, em meio sem FBS por 24 horas. Além disso, o controle de células positivo foi tratado com 1 pM deRA (ácido retinóico), e o controle adicional de células foi tratado com cada de 1, 10 e 50 ppm de um extrato DMSO de raiz de ginseng selvagem liofilizado do Exemplo 2. Então, 30 cada meio de cultura foi cultivado e centrifugado, e a quantidade de MMP-1 em um sobrenadante foi determinado por um teste ELISA (Amersham). A viabilidade das células foi medida usando a solução WST-1 e corrigido.

Como resultado, como mostrado na FIG.6, o extrato de linhagem de célula de acordo com a presente invenção mostrou as a ti v idades inibitórias de cerca de 55% (1ppm), cerca de 67% (10 ppm) e cerca de 83%, e o meio de 5 cultura de linhagem de célula mostrou atividades inibitórias de MMP-1 de cerca de 49% (0,05 vol%), cerca de 63% (0,1 vol%) e 70% (1 vol%). Além disso, quando as células foram tratadas com 10 ppm ou 50 ppm do extrato de linhagem de célula ou com 0,1 vol% ou 1 vol% de meio de cultura, foi descoberto que o 10 extrato de linhagem de célula e o meio de cultura mostrou excelente efeitos anti-envelhecimento comparado ao controle positivo RA conhecido por ter um excelente efeito anti- envelhecimento.

15 Particularmente, o extrato de linhagem de ~".- célula e -=~~-- =-==- meio de cultura de acordo com a presente invenção mostrou efeitos significativamente excelentes sobre a inibição da expressão MMP-1 comparada ao controle (extrato DMSO liofilizado de raiz de ginseng selvagem cultivada ao ar -·- - --2o-~-:Livrer-:--Especrf1cament:e, a ---ativ.fdade MMP-1-inibitória do extrato de linhagem de céluTa foi melhorado atraYés d~-27-51% relativo aquele de ginseng selvagem cultivado, e a atividade inibitória do extrato de linhagem de célula foi melhorado por 16-27%. 25 Consequentemente, foi encontrado que o extrato de linhagem de célula e o meio de cultura de acordo com a presente invenção mostrou efeitos excelentes anti- envelhecimento comparado ao RA conhecido por ter excelentes 30 resultados anti-envelhecimento e extrato de ginseng selvagem, sugerindo que o extrato de linhagem de célula e o meio de cultura de acordo com a presente invenção são particulàrmente úteis como composições anti-envelhecimento.

Exemp1o 9 : Exame de efei. tos para remoção de espécies de oxigênio reativo induzidos pe1a radiação UV (2) Afim de comparar a atividade anti- ' 5 envelhecimento da linhagem de célula derivada de câmbio de ginseng selvagem com a atividade anti-envelhecimento do ginseng selvagem cultivado ao ar livre, o seguinte experimento foi realizado por Kyung Hee University Skin Biotechnology Center de acordo com orientação operacional 10 padrão do centro.

Primeiro, as células humanas queratinocite HaCaT (German Câncer Research Institute, Heidelberg, Germany) foi cultivada em meio DMEM contendo FBS 10%. As células foram 15 semeadas em placas de 96 poços em uma densidade de 3x10 4 ~céluras/- -poçó por ---rz horas~ para "-aderir à placa ~de cultura. Portanto, as células foram tratadas com cada um de 1, 10 e 50 ppm de extrato de DMSO (Elicitação 1) de linhagem de célula - --lio:fiiizada do Exemplo- 2 -(tratada com 3-5 wt% ( g/L) de açúcar - - - -20- bFu-t-o --e-1-0-0-p-M---de-met-i-l-ja-smonêl.-t:Cf)- OU Cóm Cada um----ae-1, 5 e 10 vol% de meio de cultura do Exemplo 2 em meio DMEM sem FBS por 3 horas. Além disso, as células de controle positivo foram tratadas com 10 nM NAC ( N-acetil-cisteína), e controle adicional de células foi tratado com cada um de 1, 10 e 50 25 ppm de extrato de DMSO de raiz de ginseng selvagem liofilizada do Exemplo 2.

Portanto, as células foram lavadas com tampão HBSS e incubadas com 50 pM F-DA (HBSS) a 37°C por 20 minutos. 30 Assim, as células foram lavadas duas vezes com tampão HBSS, 30°C de HBSS foi adicionado, e as células foram irradiadas com 200 mJ/cm 2 de UV a 365 nm. Portanto, as células foram cultivadas a 37°C por 2 horas e medida por fluorescência (excitação, 485 nm; emissão, 535 nm, Infinite M-200, Tecan),

e a viabilidade celular foi medida usando a solução WST-1 e corrigida. O efeito de cada amostra sobre a remoção de espécies de oxigênio reativo foi comparado com o grupo sem irradiação UV do qual a fluorescência foi tomada como 100.

Como mostrado na FIG. 7, quando o efeito das amostras sobre a remoção de espécies de oxigênio reativo foram comparadas com o controle negativo (grupo irradiado UV), o extrato de ginseng selvagem como o controle mostrado em atividade inibitória de 17-26%, em que o extrato de linhagem de célula e o meio de cultura de acordo com a presente invenção mostrou mais a ti v idades inibitórias aumentadas de 28-36% e 35-58%, respectivamente. Portanto, poderia ser descoberto que o extrato de linhagem de célula e o meio de cultura de acordo com a presente invenção teve mui to mais ~efeTtos~ antiox.:Ldantes"~poténtes do que o extrato de ginseng selvagem derivado.

Exempl.o 10: Preparação de formul.ações --20--- farmacêut±cas Formulação 1: Preparação do tablete 100 mg de extrato de linhagem de célula preparado no Exemplo 2 foi misturado com 100 mg de amido de milho, 100 mg de lactose e 2 mg de estearato de Magnésio, e a mistura foi compressada em um tablete de acordo com o método convencional de tablete.

Formulação 2: Preparação da formulação de cápsula 500 mg de extrato de linhagem de célula preparado no Exemplo 2 foi preenchido numa cápsula macia de gelatina para preparar uma formulação de cápsula.

Formulação 3: Preparação da formulação do xarope 1 g de linhagem de célula preparada no Exemplo 1 foi misturada com 10 g de açúcar isomerizado, 5 g de manitol e uma quantidade adequada de água purificada, e a mistura foi preparada em uma formulação de xarope de 100 mL de acordo com um método convencional.

Formulação 4: Preparação de solução de injeção 200 mg de extrato de linhagem de célula -=--- -= ~~prepa~ra<::io~no~Exemplo' 2~f6i aqiJ.écidÕ e~ dis-solvi-do -em 200 mg de salina fisiológica contendo óleo castor hidrogenado polioxietileno, portanto preparando uma solução de injeção ·contendo ó~ extrato -a.~ uma ~concênt"l:-aÇã; de o' 1%. ~- --------- - --- ------ ----- -------------- Exempl.o -11: Preparação~ de formul.ã.ções Cosméticas Formulação 1: Preparação de loção para pele Componentes %em peso Extrato de linhagem de célula de ginseng selvagem e O, 1 !meio de cultura do mesmo Glicerina 3 Butileno glicol 2

Propileno glicol 2

Polímero carboxivinil 0,1

PEG 12 éter Nonilfenil 0,2

Polisorbato 80 0,4

Etanol 10

Trietanolamina 0,1

[Antisépticos, pigmento, q. s.

Fragrância

!Água purificada to 100

Componentes %em peso =- =---=- =- ~ ~ ·;-- =- - -;:.=-- =- -- ~

. . -=- =- '=- -=- =- =- -=- =- = - =- =- -=-- -=--

Extrato de ___ linhagem de célulª ____ ---~----- ·-- --------- ---- -- - · - - ---~----- -- - ~-· --- --- - --- ---··--- -- -- de ginseng selvagem e meio de0,5 cultura do mesmo

Esqualeno 5

Beeswax 4

Polisorbato 60 1,5

Sequiolato de sorbitam 1,5

Parafina Liguida 0,5

Triglicéride 5 Caprilico/Caprico

Glicerina 3

Butileno glicol 3

Propileno glicol 3

Polímero carboxivinil 0,1

Trietanolamina 0,2

Antisépticos, pigmento, q. s.

Fragrância

~gua purificada Para 100

Formulação 3: Preparação de creme nutritivo

Componentes %em peso -. - =--= -= = ~ ~ ~ - - . .-= -=- -~

~ ==-- = ~ -- - Ext~rato de linhagem de célula de ginseng selvagem e meio de 2 cultura do mesmo = - =-- ~ = = ~ ~ ~ -~ - ~

- -~

~ ~- ~ ~ ~ ~ ~ ~ = = - ..,_- = - - = ~ " ~

:-; = ~ ~ ~ ~

- ------- -- ---- -- - To--- - - - - - - --~--- --- _B_E;?_~_::;;,_wax_ - - ---- ·- --- ~ - --- -

- --~- ---- - - Polisorbato 60 1,5

PEG 60 Óleo hidrogenado 2 Caster

Sesquiolato sorbitan 0,5

Parafina liguida 10

Esqualeno 5

Triglicéride 5 caprilico/Caprico

Glicerin 5

Butileno glicol 3

Propileno glicol 3

Trietanolamina 0,2

!Anti sépticos, pigmento, q.s.

Fragrância

~gua purificada para 100

Formulação 4: Preparação do creme de massagem

Componentes %em peso

Extrato de linhagem de célula . = ...,-_ '= -:-=- ~ ~ ·~ = = ···- ~ de ginseng sel vage~m, e~meio~àe 5~ ~ -- · = = ~ .= = -

-- --= -= = -=- = = ·= -= = "'" =-- :-= - . • M = =··~T-= = cultura do mesmo

,_ Beeswax 10 -. - .~ ~ ~ ~ ~ - - ~ ~

_.,.. - ~ .~ - ~ ~ ~ .=·- -

= =--- - - ~ - ~ ~ ~ - ~ - ~ ~ ~ ~

- ~ ~ ~ .';0- ~

- Polisorbato 60 -- --- 1 ,-5----~- -~----~~-- ~~--

- - -- - - -- --- -- ~- ---~

- - PEG 60 óleo hidrogenado 2 Caster

Sesquiolato sorbitan 0,8

Parafina Liguida 40

Esqualeno 5

Trigliceride 4 Caprilico/Caprico

Glicerina 5

Butileno glicol 3

Propileno glicol 3 Trietanolamina 0,2 Antisépticos, pigmento, q.s. Fragrância ~gua purificada para 100 Formulação 5: Preparação do pack Componentes %em peso Extrato de linhagem de célula de ginseng selvagem e meio de 5 cultura do mesmo ~ --·.;o..- - =·-,;= ~ = = ·= =--=- =- - ~ ~ ; = --- = ·=- = =-- - -~ - - ::..:-.

~- - - AYcõ;i poli vinil 13 Carboximethilcelulose sódio 0,2 = =- =- " " - " - " . ~ ~ ...... . - ~ - ~ = .... = ~ ~ - " -- ~ = = " ~ ~ ·- " ~ " - = =- = ~ - =- "" - .... -- - - - - - ---- ------· -~ Glicerina - - - ---- ---- - ·- 5--- ---·-- -- - -~·------· - - -- --·- -- ----- - -~-·~-·-· Alantoína 0,1 Etanol 6 PEG 12 éter Nonilfenil 0,3 Polisorbato 60 0,3 !Antisépticos, pigmento, q.s. Fragrância ~gua purificada para 100 5

Exemp~o 12: Preparação de a~imento funciona~: preparação de bebida funciona~ Preparação 1 •5 200 mg de linhagem de célula preparada no Exemplo 1 foi dissolvida em 96 mL de água, ~e então 500 mg de vitamina C como um suplemento, 1 g de cada ácido cítrico e oligossacarídeo como intensificadores de sabor e O, 05 g de 10 benzoato de sódio como preservante lhes foram adicionadas. Portanto, a água purificada foi adicionada, preparando, assim, 100 mL de uma bebida funcional.

Preparação 2 15 ~ ~ ~ ~ ~2~09 ~ ):t!9~ ~de ~ ~extrat-o = àe ~~linhagem_~ de ~-~.,,c:él~uia - ---- 'r --=- '"' = .... = = =- = - preparado no Exemplo 2 foi dissolvida em 96 mL de água, e então em 500 mg de vitamina C como um suplemento, 1 g de cada ácido cítrico ~- ~~ ~oligossaca~rideo ~ como ~ ihterisi'Ficadores de ~ ------- 20 sabor e 0,05 g de benzoato de sóc!i_o~-~c~omo-um--.f>Fes-e~rvanee--que--- - - - - - --·---------- -- - . - ~ ---- -----~-IJ:'ie- -foi adicionado. Portanto, a água purificada ·foi adicionada a mesma, assim preparando 100 mL de uma bebida funcional.

25 Aplicabilidade Industrial Como descrito acima, a composição de acordo com a presente invenção tem efeitos colaterais minimizados comparados aos agentes anti-envelhecimentos existentes e 10 antioxidantes, e portanto seguro para a pele. Além disso, a composição da presente invenção mostra um efeito antioxidante de inibir as espécies de oxigênio reativo causado pela exposição à radiação UV que é a maior causa do envelhecimento da pele, e pode eficazmente reduzir ou inibir fatores relacionados ao envelhecimento. Portanto, a composição da presente invenção é útil para a prevenção e inibição do envelhecimento.

5 Embora a presente invenção tenha sido descrita com detalhes com referência a características específicas, será evidente para aqueles especializados na técnica que esta descrição é somente para uma realização preferida e não se limita ao escopo da presente invenção. 10 Portanto, o escopo substancial da presente invenção será definido pelas reivindicações anexas e equivalentes da mesma.

= -..;;;; = = = = =- = = - = =- =- =-= = =-=- = - ...._ = = = =-- -= = =-= =- = -= = -r --- ---~-- --- - - - ----- -------------- -~------ --------- - --- -·

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES EMENDADAS P 1. Composíção antí-envelhecímento ou antíoxídante contendo uma linhagem, ou mais, de células 5 derivadas de câmbio de Panax ginseng, caracterizada por: um extrato, um lisado e urna cultura da mesma, em que: (a) está em um estado indiferenciado de forma inata; e (b) é uma linhagem de células homogênea.

   10
2. 2. Composíção antí-envelheeímento ou antíoxídante de acordo com a reivindicação 1, earacterízada pelo fato de que a linhagem de células é, adicionalmente, caracterizada por: 15 (a) estar presente como células individuais durante a cultura de suspensão; (b) ter baixa sensibilidade ao teste de cisalhamento em um biorreator comparado às linhagens de células derivadas dos tecidos, exceto o câmbio de Panax 20 ginseng; (C) ter maior taxa de crescimento do que aquelas linhagens de células derivadas dos tecidos, exceto o

   P câmbio de Panax ginseng e ser cultivado de rnaneira estável; e (d) é morfologicamente caracterizada por 25 um número de vacúolos.
3. 3. Composição antí-envelhecímento ou antíoxidante de acordo com a reivindicação 1, caraeterízada pelo fato de que a linhagem de células é obtída usando um 30 método de isolamento compreendendo os seguintes passos: (a) obter um tecido de raiz armazenada contendo o câmbio de Panax Ginseng;

   (b) aplicar teste osmótico ao tecido de + raiz armazenada contendo câmbio obtido, e então cultivar o tecido de raiz armazenada contendo câmbio em um meio contendo

   P IAA (ácido indol-3-acético)- ou IBA (ácido indol-3-butírico), 5 portanto induzindo uma linhagem de células derivada do câmbio; e (C) coletar linhagem de células derivada do câmbio induzido- 10
4. 4. Composíção antí-enveíhecímento ou antíoxídante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cultura é obtida a'través do cultivo adicionalmente da linhagem de células em um meio o quaj- contém 3 a 5% em peso de açúcar bruto ou açúcar; ou pelo 15 menos uma substância selecionada do grupo que consiste de metil jasmonato, extrato fúngico, extrato de bactérias, extrato de levedura, quitosana, glucomanano, glucano, fenilanina, ácido benzóico, ácido salicílico, ácido araquidônico, STS, rnevalonalonato N benzoliglicina, ABA, SNP, 20 IPP, BHT, CCC, ethephon, ácido hipúrico, nitrato céríco, AgNO3, sulfato de vanádio, ácido p-aminobenzóico, brassinosteróides, alginato de sódio e acetato de sódio.
5. 5. Composíção antí-envelhecímento ou 25 antíoxídante de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterízada pelo fato de que o Panax Ginseng é urn ginseng selvagem ou um ginseng.
6. 6. Composíção antí-envelhecimento ou 30 antíoxídante, de acordo com a reivindicação I, caracterízada pelo fato de que o extrato é obtido usando um solvente selecionado do grupo consistindo de água destilada, álcool, acetona, DMSO, dimetilsufóxido, e mistura de solventes dos mesmos.
7. 7. Composíção antí-envelhecímento ou antíoxídante de acordo com a reivindicação 1, caracterízada

   P r 0 pelo fato de que o extrato é obtido através do fracionamento da linhagem de células seqüencialmente com água destilada, 5 metanol e acetona.
8. 8. Composíção cosmétíca antí-envelhecímento contendo uma ou mais linhagem de células, que é derivada de um câmibio de Panax ginseng, caracterizada por: um extrato, um 10 lisado, uma cultura do mesmo, em que: (a) está em um estado indiferenciado de forma inata: e (b) é uma linhagem de células homogênea.
9. 9. Composíção eosmétíca antí-envelhecímento, 15 de acordo com a reivindicação 8, earacterízada pelo fato de que a linhagem de células é adicionalmente caracterizada por: (a) estar presehte como células individuais durante a cultura de suspensão; (b) ter baixa sensibilidade ao teste de 20 cisalhamento em um biorreator comparado as línhagens de células derivadas dos tecidQs, exceto o câmbio de Panax ginseng; e (C) ter maior taxa de crescimento do que aquelas linhagens de células derivadas dos tecidos, exceto o 25 câmbio de Panax ginseng, e ser cultivada de maneira estável.
10. 10. Alímento funcíonal antí-envelhecímento ou antíoxídante contendo uma ou mais linhagens de células, que é derivada de urn cârnbio de Panax ginseng, caracterizado por: um 30 extrato, um lisado e uma cuj-tura do mesrno, em que: (a) está em urn estado indiferenciado de forma inata ; e (b) é uma linhagem de células homogênea.