BRPI0911171B1

BRPI0911171B1 - Microrganismo transgênico e método para produzir ácido glicárico

Info

Publication number: BRPI0911171B1
Application number: BRPI0911171-9A
Authority: BR
Inventors: Tae Seok Moon; Sang-Hwal Yoon; Kristala Lanett Jones Prather
Original assignee: Massachusetts Institute Of Technology
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2023-07-11

Abstract

PRODUÇÃO CELULAR DE ÁCIDO GLUCÁRICO. A presente invenção refere-se á produção de ácido glicurônico e glucárico em células através de expressão recombinante de mioinositol 1- fosfato sntese, mio-onositol oxigenase e uronato desidrogenase. A clonagem e a caracterização de gene que codifica uronato desidrogenase também são apresentadas.

Description

Pedidos Relacionados

[0001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do pedido provisório de número de série No. U.S. 61/042,502, intitulado "Microbial Production of Glucaric Acid," depositada em 4 de abril de 2008, o qual está aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade.

Interesse Governamental

[0002] Este trabalho foi financiado, em parte, pelo Escritório de Pesquisa Naval, sob o número de concessão N000140510656. Consequentemente, o governo possui certos direitos nesta invenção.

Campo da Invenção

[0003] A invenção refere-se à produção de ácido glicurônico e glicárico através de expressão de gene recombinante.

Antecedentes da Invenção

[0004] A manipulação metabólica, abrangendo a aplicação de tecnologia de DNA recombinante, mostrou seu potencial em otimizar as funções celulares com muitos propósitos: produção de proteína recombinante, manipulação de vias para aumento da produtividade, e desenhos de novas vias para geração de novos produtos. Definida como uma sequência de conversões que não é encontrada em espécies hospedeiras, uma nova via foi desenhada e construída em E. coli para a produção de 1,3-propanodiol (C. E. Nakamura e G. M. Whited (2003). Curr. Opin. Biotechnol. 14: 454-459), amorfadieno (Nature Biotech, 21, pp 796802), e 1,2,4-butanotriol (JACS, 125, pp12998-12999). Nestas abordagens, cada etapa foi projetada com base na disponibilidade da enzima, as atividades da enzima recrutada a partir de vários organismos foram identificadas e nas novas vias foram construídas em E. coli através do agrupamento destas etapas enzimáticas. A ideia básica por trás destes exemplos é considerar proteínas incluindo enzimas como partes intercambiáveis e o termo "biologia sintética" foi usado para descrever este conceito (Nature 421, p118; Nature Chemical Biology, 3, pp521-525).

[0005] O ácido D-glicárico é encontrado em frutas, vegetais, e mamíferos e foi estudo para a redução dos níveis de colesterol (Z. Walaszek, et al. (1996). Nutr. Res. 16: 673-681) e quimioterapia para câncer (J. Singh e K. P. Gupta (2003). Biomed. Environ. Sci. 16: 9-16). Em um relato recente (T. Werpy e G. Petersen (2004). "Top Value Added Chemicals From Biomass," Vol. I, PNNL e NREL), o ácido D- glicárico foi identificado como um "Produto químico com alto valor agregado derivado de biomassa" e como um material de partida promissor para produzir novos náilons e poliésteres hiperramificados. O ácido D-glicárico, um composto altamente funcionalizado com quatro carbonos quirais, é produzido atualmente pela oxidação química da D- glicose, um processo não-seletivo e caro que usa ácido nítrico como o oxidante (T. Werpy e G. Petersen (2004). "Top Value Added Chemicals From Biomass," Vol. I, PNNL e NREL). Novos processos catalíticos que usam enzimas podem levar a um rendimento e seletividade mais altos. A abordagem biológica para produzir ácido glicárico poderia ser feita por imitar a via de ácido D-glicurônico existente em mamíferos. Entretanto, esta é uma via ineficiente, que consiste em mais de dez etapas de conversão, começando com D-glicose.

Sumário da Invenção

[0006] São aqui descritas a clonagem e caracterização dos primeiros genes udh que codificam uronato desidrogenase. Também é descrita a construção de uma nova via para a produção de ácido D- glicurônico ou D-glicárico em uma célula, como uma célula de E. coli, através da combinação de "partes biológicas" de organismos diferentes. Uma primeira enzima, mio-inositol 1-fosfato sintase (Ino1/MIPS), produzir mio-inositol a partir de glicose, através da glicose-6-fosfato como um intermediário (Dean-Johnson e Henry 1989). Uma segunda enzima, mio-inositol oxigenase (MIOX), converte o mio-inositol em ácido glicurônico. A co-expressão destas duas enzimas em uma célula, tal como uma célula de E. coli permite a produção de ácido glicurônico a partir de glicose. A uronato desidrogenase pode converter o ácido glicurônico em ácido glicárico (Bateman, Kosuge et al. 1970; Wagner e Hollman 1976). Conforme descrito na presente invenção, a expressão deste terceiro gene com INO1 e MIOX permite a produção de ácido glicárico a partir de glicose. Surpreendentemente, a expressão recombinante de uronato desidrogenase aumentou significativamente o fluxo da via de modo que altas quantidades de ácido glicárico puderam ser obtidas.

[0007] A invenção fornece uma célula que expressa de forma recombinante um gene que codifica uronato desidrogenase e expressa de forma recombinante um gene que codifica mio-inositol oxigenase. Em algumas modalidades o gene que codifica uronato desidrogenase é um gene bacteriano, tal como um gene de Pseudomonas syringae ou um gene de Agrobacterium tumefaciens. Em algumas modalidades o gene que codifica mio-inositol oxigenase é um gene de mamífero, tal como um gene de camundongo. Em algumas modalidades, a célula também expressa, de forma recombinante, um gene que codifica mio- inositol 1-fosfato sintase. O gene que codifica mio-inositol 1-fosfato sintase pode ser, em algumas modalidades, um gene fúngico ou um gene de levedura, tal como um gene de Saccharomyces cerevisiae.

[0008] A célula que expressa de forma recombinante as enzimas descritas acima pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana, tal como uma célula de E. coli. Em algumas modalidades, os genes que codificam mio- inositol oxigenase e/ou mio-inositol 1-fosfato sintase foram modificados por otimização de códon para expressão em bactérias. Em algumas modalidades, a célula é uma célula fúngica, uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula de planta ou uma célula de mamífero.

[0009] Os genes que codificam uronato desidrogenase, mio-inositol oxigenase e/ou mio-inositol 1-fosfato sintase podem ser expressos a partir de plasmídeos ou podem ser integrados ao genoma da célula. Em algumas modalidades, a produção de ácido glicárico é aumentada por manipulação de proteína das enzimas uronato desidrogenase, mio- inositol oxigenase e/ou mio-inositol 1-fosfato sintase na célula ou pela mutação de um componente da via do metabolismo do ácido glicárico na célula. A invenção inclui, em algumas modalidades, um microorganismo geneticamente modificado, que compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico recombinantes que codificam uronato desidrogenase, mio-inositol oxigenase e mio-inositol 1-fosfato sintase.

[00010] A invenção também fornece métodos para a produção de ácido glicurônico e ácido glicárico, que compreende cultivar uma célula associada com a invenção, para produzir ácido glicurônico ou ácido glicárico e recuperar o ácido glicurônico ou glicárico das células. Em algumas modalidades, o método para produzir ácido glicurônico ou glicárico compreende modificar geneticamente uma célula para expressar de forma recombinante pelo menos um de: uronato desidrogenase, mio-inositol oxigenase e mio-inositol 1-fosfato sintase, cultivar uma população das ditas células e coletar ácido glicárico a partir da população de células que foram geneticamente modificadas para produzir ácido glicárico.

[00011] Em algumas modalidades, a célula expressa, de forma recombinante, mio-inositol oxigenase e produz ácido glicurônico. Em algumas modalidades, a célula expressa de forma recombinante mio- inositol oxigenase e mio-inositol 1-fosfato sintase e produz ácido glicurônico. Em algumas modalidades, a célula expressa de forma recombinante mio-inositol oxigenase e uronato desidrogenase e produz ácido glicárico. Em algumas modalidades, a célula expressa de forma recombinante mio-inositol oxigenase, mio-inositol 1-fosfato sintase e uronato desidrogenase e produz ácido glicárico.

[00012] Em algumas modalidades, o gene expresso de forma recombinante que codifica uronato desidrogenase é um gene bacteriano, tal como um gene de Pseudomonas syringae ou um gene de Agrobacterium tumefaciens. Em algumas modalidades o gene expresso de forma recombinante que codifica mio-inositol oxigenase é um gene de mamífero, tal como um gene de camundongo. Em algumas modalidades, o gene expresso de forma recombinante que codifica mio-inositol 1- fosfato sintase é um gene fúngico ou um gene de levedura, tal como um gene de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a célula que expressa de forma recombinante as enzimas descritas acima é uma célula procariótica. Em certas modalidades, a célula é uma célula bacteriana, tal como uma célula de E. coli. Os genes que codificam mio- inositol oxigenase e/ou mio-inositol 1-fosfato sintase podem ser modificados por otimização de códon para expressão em bactérias.

[00013] Em algumas modalidades, a célula que expressa de forma recombinante as enzimas descritas acima é uma célula eucariótica. Em certas modalidades, a célula é uma célula fúngica, uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula de planta ou uma célula de mamífero. Os genes que codificam uronato desidrogenase, mio-inositol oxigenase e/ou mio-inositol 1-fosfato sintase podem ser expressos em plasmídeos ou podem ser integrados ao genoma da célula. A produção de ácido glicárico pode ser aumentada por manipulação de proteína das enzimas uronato desidrogenase, mio-inositol oxigenase e/ou mio- inositol 1-fosfato sintase na célula ou pela mutação de um componente da via do metabolismo do ácido glicárico na célula.

[00014] A invenção também fornece ácido glicárico produzido pelas células e métodos descritos acima. Em algumas modalidades, o ácido glicárico é produzido por uma cultura celular em que as células no interior da cultura celular foram geneticamente modificadas para expressar de forma recombinante pelo menos um de: uronato desidrogenase, mio-inositol oxigenase e mio-inositol 1-fosfato sintase. Em algumas modalidades, o gene que codifica uronato desidrogenase é um gene bacteriano, tal como um gene de Pseudomonas syringae ou um gene de Agrobacterium tumefaciens. Em algumas modalidades o gene que codifica mio-inositol oxigenase é um gene de mamífero, tal como um gene de camundongo. Em algumas modalidades, o gene que codifica mio-inositol 1-fosfato sintase é um gene fúngico ou um gene de levedura, tal como um gene de Saccharomyces cerevisiae.

[00015] Em algumas modalidades, o ácido glicárico é produzido a partir de uma célula procariótica. Em algumas modalidades, a célula procariótica é uma célula bacteriana, tal como uma célula de E. coli. Em algumas modalidades, os genes que codificam mio-inositol oxigenase e/ou mio-inositol 1-fosfato sintase são modificados por otimização de códon para expressão em bactérias. O ácido glicárico pode também ser produzido por uma célula eucariótica. Em certas modalidades, a célula é uma célula fúngica, uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula de planta ou uma célula de mamífero.

[00016] Para a produção de ácido glicárico, os genes que codificam uronato desidrogenase, mio-inositol oxigenase e/ou mio-inositol 1- fosfato sintase podem ser expressos em plasmídeos ou podem ser integrados ao genoma da célula. Em algumas modalidades, a produção de ácido glicárico é aumentada por manipulação de proteína das enzimas uronato desidrogenase, mio-inositol oxigenase e/ou mio- inositol 1-fosfato sintase na célula ou pela mutação de um componente da via do metabolismo do ácido glicárico na célula.

[00017] A invenção inclui, também, moléculas de ácido nucleico isoladas que incluem: (a) uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:23, ou SEQ ID NO:25; (b) uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma sequência de aminoácido que compreende a sequência de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:26; (c) uma molécula de ácido nucleico isolada que é um complemento reverso da sequência de extensão completa de (a) ou (b); e (d) uma molécula de ácido nucleico isolada que tem pelo menos 95% de identidade de nucleotídeos a qualquer um de (a)-(c). Um vetor de expressão recombinante que compreende as moléculas de ácido nucleico discutidas acima, operacionalmente ligadas a um elemento regulatório de transcrição também é abrangido pela invenção. A invenção inclui, também, polipeptídeos de uronato desidrogenase isolados codificados pelas moléculas de ácido nucleico aqui descritas. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de uronato desidrogenase isolado compreende pelo menos 95% de identidade de aminoácidos a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:24 ou SEQ ID NO:26.

[00018] A invenção inclui células que contêm os vetores de expressão recombinantes aqui descritos. Em certas modalidades, a célula é uma célula bacteriana, uma célula fúngica, uma célula de levedura, uma célula de planta, uma célula de inseto ou uma célula animal. A célula que expressa de forma recombinante o gene de uronato desidrogenase pode ser usado para produzir proteína uronato desidrogenase através do cultivo da célula sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo e recuperação do polipeptídeo a partir do meio de cultura ou da célula.

[00019] A invenção inclui, também, anticorpos isolados que se ligam seletivamente aos polipeptídeos de uronato desidrogenase descritos aqui. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam seletivamente a um polipeptídeo que compreende pelo menos 95% de identidade de aminoácidos a SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico que compreende pelo menos 95% de identidade de nucleotídeos com a SEQ ID NO:1. O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um fragmento de ligação de antígeno dos mesmos.

Breve Descrição dos Desenhos

[00020] A figura 1 é um esquema mostrando a via desenhada para a produção de ácido glicárico em E. coli. PTS = sistema de fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato; Ino1 (MIPS) = mio- inositol 1-fosfato sintase de Saccharomyces cerevisiae; fosfatase = SuhB, enzima de E. coli endógena (Matsuhisa et al. J. Bacteriol. (1995) 177:200-205); MIOX = versão de camundongo de mio-inositol oxigenase com otimização de códon; Udh = uronato desidrogenase de Pseudomonas syringae; PEP = fosfoenolpiruvato.

[00021] A figura 2 é um gráfico mostrando a produção de ácido glicurônico em BL21(DE3)(pRSFD-IN-MI). As culturas foram cultivadas em triplicata a 30 °C em meio LB suplementado com 10 g/L de glicose e 0,1 mM de IPTG. Os pontos dos dados são a média e o desvio padrão das três réplicas biológicas. ? = ácido glicurônico (eixo da esquerda); ? = mio-inositol (eixo da esquerda); ? = glicose (eixo da direita). A concentração de glicose é em g/L.

[00022] A figura 3 é um gráfico mostrando a atividade in vitro de Ino1, MIOX, e Udh recombinantes expressos em BL21(DE3) contendo os três genes. As culturas foram cultivadas em triplicata a 30 °C em meio LB suplementado com 10 g/L de glicose e 0,05 mM de IPTG. A atividade de MIOX é apresentada como a atividade líquida para considerar o plano de fundo. Os dados são a média e o desvio padrão das três réplicas biológicas. ? = Ino1; ? = MIOX; ? = Udh.

[00023] A figura 4 é um alinhamento de sequência de DNA do gene MIOX de camundongo e sua versão sintetizada com otimização de códon para expressão em E. coli. O alinhamento da sequência de DNA foi executado com o uso do programa Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA).

[00024] A figura 5 é um esquema indicando o catabolismo dos ácidos glicurônico e glicárico em bactérias. O consumo de ácido glicurônico é evitado por supressão do gene uxaC. A presença de uronato desidrogenase em um organismo com supressão de uxaC permite o crescimento de E. coli em ácido glicurônico.

[00025] A figura 6 é um gráfico representando um teste enzimático de Udh suposto a partir de P. syringae. Os lisados de E. coli contendo a proteína expressa da PSPTO_1053 ORF são capazes de oxidar o ácido glicurônico, com o uso de NAD+ como um cofator.

[00026] A figura 7 é um gráfico mostrando as atividades dos genes udh expressos a partir de várias fontes em lisados brutos de E. coli. pTATudh2 = Agrobacterium tumefaciens, pTPPudh = Pseudomonas putida, pTPSudh = Pseudomonas syringae. Barras vazias= sem IPTG, barras preenchidas = com 0,1 mM de IPTG.

[00027] A figura 8 representa um cromatograma de CL-EM de glucarato. A figura 8a demonstra o glucarato separado da mistura de reação enzimática. A figura 8b demonstra um padrão de glucarato. O glucarato foi caracterizado por suas massas (m/z = 209, 210, 419, 420 e 441) e os picos do eluente também corresponderam às massas do padrão de glucarato.

[00028] A figura 9 representa uma análise de SDS-PAGE de Udhs purificado. Os Udhs purificados foram submetidos a eletroforese em um gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio a 12% sob condições desnaturantes. Coluna 1, marcadores de peso molecular; colunas 2 e 3, extrato bruto e Udh de A. tumefaciens purificado de E. coli BL21(DE3) expressando pETATu; colunas 4 e 5, extrato bruto e Udh de P. putida purificado de E. coli BL21(DE3) expressando pETPPu; colunas 6 e 7, extrato bruto e Udh de P. syringae purificado de E. coli BL21(DE3) expressando pETPSu. Os Udhs purificados estão indicados pelos símbolos de seta.

[00029] A figura 10 é um gráfico representando o efeito do pH e da temperatura sobre as atividades de Udhs de udh de A. tumefaciens, P. putida, e P. syringae. A figura 10a mostra as atividades relativas como uma função do pH. A figura 10b mostra as atividades relativas após incubação durante 30 minutos nas temperaturas indicadas. A figura 10c mostra as atividades relativas como uma função da temperatura do teste. Quadrado com linha contínua: Udh de A. tumefaciens. Círculo com linha tracejada: Udh de P. putida. Triângulo com linha pontilhada: Udh de P. syringae.

[00030] A figura 11 apresenta um esquema mostrando os loci dos genes udh nos cromossomos e uma tabela representando os genes adjacentes. Figura 11a: P. syringae pv. cepa tomato DC3000; figura 11b: P. putida KT2440; e figura 11c: A. tumefaciens str. C58. A figura 11d é uma Tabela mostrando as identidades dos genes adjacentes. Estes loci e identidades são referidas com relação às sequências do genoma de NC_004578 (P. syringae pv. cepa tomato DC3000), NC_002947 (P. putida KT2440) e NC_003063 (A. tumefaciens str. C58).

[00031] A figura 12 apresenta um alinhamento de sequência e análise filogenética. A figura 12a representa um alinhamento da uronato desidrogenase de P. syringae pv. cepa tomato DC3000, P. putida KT2440, e A. tumefaciens str. C58. Para o alinhamento, sequências de aminoácido idênticas, conservativas e similares são representadas como blocos pretos, cinza escuro, e cinza claro, respectivamente. Os motivos de sequência primários são indicados como GxxGxxG e YxxxK. A figura 12b representa a análise filogenética dos homólogos de uronato desidrogenase de diversas espécies procarióticas e eucarióticas. A análise filogenética foi realizada com o uso de homólogos de PSPTO_1053 de P. syringae pv. cepa tomato DC3000. As uronato desidrogenases estão indicadas em negrito.

Descrição Detalhada da Invenção

[00032] Aspectos da invenção referem-se a métodos e composições para a produção de ácido glicurônico e glicárico através de expressão de gene recombinante e, células. É aqui descrita a clonagem de um gene que codifica uronato desidrogenase, uma enzima que converte ácido glicurônico em ácido glicárico. São descritas novas vias que foram desenhadas e implementadas para produzir ácido glicurônico e glicárico a partir de glicose através da expressão recombinante de uronato desidrogenase em combinação com mio-inositol 1-fosfato sintase e mio- inositol oxigenase. Esta nova via representa um novo sistema inesperadamente eficaz para produzir ácido glicárico, uma molécula com amplas aplicações, que variam desde a produção de náilons e poliéster até a terapia do câncer.

[00033] As novas vias aqui descritas para a produção de ácido glicurônico e glicárico em células envolvem vários componentes enzimáticos. Uma primeira enzima, mio-inositol 1-fosfato sintase (Ino1/MIPS), codificada pelo gene INO1 de Saccharomyces cerevisiae, produz mio-inositol a partir de glicose, através de glicose-6-fosfato como um intermediário (Dean-Johnson e Henry 1989). A sequência de Saccharomyces cerevisiae, por exemplo, tem o número de acesso ao Genbank NC_001142 (GeneID: 853288). Em leveduras, o mio-inositol é um constituinte dos fosfolipídios da membrana, e seus derivados são importantes para a sinalização celular. O substrato de MIPS, glicose-6- fosfato, está presente em E. coli como o resultado do transporte de glicose pelo sistema PTS (Postma, Lengeler et al. 1993). Uma segunda enzima, mio-inositol oxigenase (MIOX), converte o mio-inositol em ácido glicurônico. Esta enzima está presente principalmente em fontes de mamífero e representa a primeira etapa do catabolismo do mio-inositol (Charalampous e Lyras 1957). A sequência de camundongo, por exemplo, tem o número de acesso ao Genbank NC_000081 (GeneID: 56727). A co-expressão destas duas enzimas em uma célula, tal como uma célula de E. coli permite a produção de ácido glicurônico a partir de glicose.

[00034] A terceira etapa na nova via para a produção de ácido glicárico é a conversão de ácido glicurônico em ácido glicárico, uma etapa que pode ser feita pela uronato desidrogenase (Bateman, Kosuge et al. 1970; Wagner e Hollman 1976). Conforme descrito no exemplo 2, os genes que codificam uronato desidrogenase foram clonados e caracterizados de modo a construir esta via. Conforme apresentado no exemplo 2, a uronato desidrogenase foi clonada a partir de Pseudomonas syringae pv. cepa tomato DC300, Pseudomonas putida KT2440 e Agrobacterium tumefaciens cepa C58. A sequência do gene udh de P. syringae foi depositada no Genbank, número de acesso EU377538. As sequências de DNA e proteína de udh de Pseudomonas syringae pv. cepa tomato DC300A são fornecidas nas SEQ ID NOs:1 e 2, respectivamente. Os genes correspondentes de A. tumefaciens e P. putida foram depositados com os números de acesso BK006462 (DNA: SEQ ID NO:23; proteína: SEQ ID NO:24) e BK006380 (DNA: SEQ ID NO:25; proteína: SEQ ID NO:26), respectivamente. A clonagem da uronato desidrogenase permite a identificação de proteínas uronato desidrogenase em várias espécies, com o uso de métodos padrão de busca de homologia conhecidos na técnica, tal como através de uma busca BLAST.

[00035] Conforme descrito na presente invenção, a co-expressão de mio-inositol 1-fosfato sintase e mio-inositol oxigenase em uma célula leva à produção de ácido glicurônico a partir de glicose. Quando a célula que expressa estas enzimas expressa ainda uronato desidrogenase, isto leva a um nível inesperadamente eficaz de produção de ácido glicárico a partir de glicose através de uma via de três etapas que consiste em: 1) produção de mio-inositol a partir de glicose, 2) conversão de mio-inositol em ácido glicurônico, e 3) conversão de ácido glicurônico em ácido glicárico. Também está abrangida pela invenção uma via de duas etapas que contorna a primeira etapa descrita acima, e consiste nas etapas 2 e 3. Nesta modalidade específica, uma célula que poderia gerar glicose seria usada, evitando a necessidade de fornecer glicose ao meio de crescimento da célula. Em algumas modalidades, esta célula é dotada de um polímero de glicose, tal como amido de milho.

[00036] Aspectos da invenção relacionam-se a células que expressam de forma recombinante pelo menos um de: mio-inositol 1- fosfato sintase, mio-inositol oxigenase e uronato desidrogenase. A invenção abrange qualquer tipo de célula, incluindo células procarióticas e eucarióticas. Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana, tal como uma célula de E. coli. Em outras modalidades, a célula é uma célula fúngica ou uma célula de levedura, tal como uma célula de S. cerevisiae. Em outras modalidades, a célula é uma célula de mamífero, tal como uma célula de camundongo. Deve-se apreciar que algumas células podem expressar pelo menos uma das enzimas associadas com a invenção de forma endógena. Em algumas modalidades, uma célula não expressará nenhuma das enzimas de forma endógena e expressará uma, duas ou três das enzimas de forma recombinante. Em algumas modalidades, uma célula expressará uma das enzimas de forma endógena e a outra enzima ou as outras duas enzimas, de forma recombinante. Em algumas modalidades, uma célula expressará duas das enzimas de forma endógena e a outra enzima ou as outras duas enzimas, de forma recombinante. Em algumas modalidades, uma célula expressará um ou mais dos genes de forma endógena e também expressará o mesmo um ou mais genes de forma recombinante.

[00037] Em algumas modalidades, os genes que codificam mio- inositol 1-fosfato sintase, mio-inositol oxigenase e uronato desidrogenase são expressos em vetores de expressão recombinantes. Para uso na presente invenção, um "vetor" pode ser qualquer um dentre vários ácidos nucleicos dentro dos quais uma sequência ou sequências desejadas podem ser inseridas por restrição e ligação para transporte entre diferentes ambientes genéticos ou para expressão em uma célula hospedeira. Os vetores são tipicamente compostos de DNA, embora vetores de RNA também estejam disponíveis. Os vetores incluem, mas não se limitam a: plasmídeos, fosmídeos, fagomídeos, genomas de vírus e cromossomos artificiais.

[00038] Um vetor de clonagem é um vetor que é capaz de replicar de forma autônoma ou integrada ao genoma de uma célula hospedeira, e que ainda é caracterizado por um ou mais sítios de endonuclease de restrição nos quais o vetor pode ser cortado de uma forma determinável, e dentro do qual uma sequência de DNA desejada pode ser ligada de modo que o novo vetor recombinante retenha sua capacidade de replicar na célula hospedeira. No caso de plasmídeos, a replicação da sequência desejada pode ocorrer muitas vezes conforme o número de cópias do plasmídeo aumenta dentro da bactéria hospedeira ou apenas uma vez por hospedeiro antes do hospedeiro se reproduzir por mitose. No caso de fagos, a replicação pode ocorrer ativamente durante uma fase lítica ou passivamente durante uma fase lisogênica.

[00039] Um vetor de expressão é um no qual uma sequência de DNA desejada pode ser inserida por restrição e ligação de modo que ela seja operacionalmente ligada a sequências regulatórias e pode ser expressa como um transcrito de RNA. Os vetores podem, ainda, conter uma ou mais sequências marcadoras adequadas para uso na identificação de células que foram ou não transformadas ou transfectadas com o vetor. Os marcadores incluem, por exemplo, genes que codificam proteínas que aumentam ou diminuem a resistência ou sensibilidade a antibióticos ou outros compostos, genes que codificam enzimas cujas atividades são detectáveis por testes padrão conhecidos na técnica (por exemplo, ß- galactosidase, luciferase ou fosfatase alcalina), e genes que visivelmente afetam o fenótipo de células, hospedeiros, colônias ou placas transformadas ou transfectadas (por exemplo, proteína verde fluorescente). Os vetores preferenciais são os capazes de replicação autônoma e expressão dos produtos dos genes estruturais presentes nos segmentos de DNA aos quais eles são operacionalmente ligados.

[00040] Para uso na presente invenção, uma sequência codificante e sequências regulatórias são ditas "operacionalmente" ligadas quando elas são covalentemente ligadas de tal forma que a expressão ou transcrição da sequência codificante sob a influência ou controle das sequências regulatórias. Se for desejado que as sequências codificantes sejam traduzidas em uma proteína funcional, duas sequências de DNA são ditas operacionalmente ligadas se a indução de um promotor nas sequências regulatórias 5’ resultar na transcrição da sequência codificante e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) resultar na introdução de uma mutação de mudança de fase (frame-shift), (2) interferir na capacidade da região promotora em direcionar a transcrição das sequências codificantes, ou (3) interferir com a capacidade do transcrito de RNA correspondente a ser traduzido em uma proteína. Desta forma, uma região promotora seria operacionalmente ligada a uma sequência codificante se a região promotora fosse capaz de afetar a transcrição daquela sequência de DNA de modo que o transcrito resultante pudesse ser traduzido na proteína ou polipeptídeo desejado.

[00041] Quando a molécula de ácido nucleico que codifica qualquer uma das enzimas da invenção pleiteada é expressa em uma célula, uma variedade de sequências de controle de transcrição (por exemplo, sequências promotoras/intensificadoras) pode ser usada para direcionar sua expressão. O promotor pode ser um promotor nativo, isto é, o promotor do gene no seu contexto endógeno, que proporciona regulação normal da expressão do gene. Em algumas modalidades, o promotor pode ser constitutivo, isto é, o promotor não é regulado, o que permite a transcrição contínua de seu gene associado. Uma variedade de promotores condicionais pode, também, ser usada, tais como promotores controlados pela presença ou ausência de uma molécula.

[00042] A natureza precisa das sequências regulatórias necessárias para expressão do gene pode variar entre as espécies ou tipos celulares, mas deve, em geral, incluir, conforme necessário, sequências 5’ não-transcritas e 5’ não-traduzidas envolvidas com o início da transcrição e tradução, respectivamente, como uma TATA box, sequência de capeamento, sequência CAAT, e similares. Em particular, estas sequências regulatórias 5’ não-transcritas incluirão uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controle transcricional do gene operacionalmente ligado. As sequências regulatórias podem, também, incluir sequências intensificadoras ou sequências ativadoras à montante, como desejado. Os vetores da invenção podem, opcionalmente, incluir sequências de líder ou de sinal 5'. A escolha e o desenho de um vetor adequado estão dentro da capacidade e julgamento de um versado na técnica.

[00043] Os vetores de expressão contendo todos os elementos necessários para expressão são comercialmente disponíveis e conhecidos pelos versados na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. As células são geneticamente manipuladas pela introdução nas células de DNA heterólogo (RNA). Este DNA heterólogo (RNA) é colocado sob o controle operacional de elementos transcricionais para permitir a expressão do DNA heterólogo na célula hospedeira. A expressão heteróloga de uma nova via para a produção de ácido glicárico é demonstrada na seção dos Exemplo com o uso de E. coli. A nova via de produção de ácido glicárico pode também ser expressa em outras células bacterianas, células de arquea, fungos, células de mamífero, células de planta, etc.

[00044] Em algumas modalidades, dois ou mais dos ácidos nucleicos da invenção podem ser clonados no mesmo vetor de expressão ou plasmídeo. Conforme discutido na seção de Exemplos, em algumas modalidades, o gene de INO1 e o gene de MIOX são clonados no mesmo plasmídeo, tal como no plasmídeo pRSFD.

[00045] Uma molécula de ácido nucleico ou moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das enzimas para produzir ácido glicárico podem ser introduzidas em uma célula ou células com o uso de métodos e técnicas que são padrão na técnica. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas por protocolos padrão, tal como transformação, incluindo transformação química e eletroporação, transdução, bombardeio de partículas, etc. A expressão da(s) molécula(s) de ácido nucleico que codificam as enzimas para produção de ácido glicárico pode, também, ser feita pela integração da molécula de ácido nucleico no genoma. A(s) molécula(s) de ácido nucleico pode(m) ser integrada(s) ao DNA genômico de uma célula com o uso de técnicas-padrão bem conhecidas na técnica.

[00046] Em algumas modalidades, as enzimas associadas com a invenção são expressas de forma recombinante em uma célula bacteriana. As células bacterianas de acordo com a invenção podem ser cultivadas em meios de qualquer tipo (rico ou mínimo) e composição. O Exemplo 1 apresenta uma modalidade na qual um meio rico (meio LB, BD Biosciences; San Jose, CA), que foi suplementado com glicose e induzido com IPTG, foi observado ser ótimo. Conforme seria compreendido pelo versado na técnica, a otimização de rotina permitiria o uso de outros tipos de meio, incluindo meio mínimo como meio mínimo M9. O meio selecionado pode ser suplementado com vários componentes adicionais. De modo similar, outros aspectos do meio e condições de crescimento podem ser otimizados através de experimentação de rotina. Por exemplo, o pH e a temperatura são exemplos não-limitadores de fatores que podem ser otimizados. De acordo com aspectos da invenção, as culturas líquidas usadas para cultivar as células podem ser armazenadas em qualquer um dos frascos de cultura conhecidos e usados na técnica.

[00047] Aspectos da invenção incluem estratégias para otimizar a produção de ácido glicárico a partir de uma célula. Produção otimizada de ácido glicárico refere-se à produção de uma maior quantidade de ácido glicárico após busca por uma estratégia de otimização que poderia ser obtida na ausência de tal estratégia. Uma estratégia é otimizar os níveis de expressão de mio-inositol 1-fosfato sintase, mio- inositol oxigenase e/ou uronato desidrogenase através da varredura de promotores adequados e sítios de ligação de ribossomos. Em algumas modalidades, isto pode incluir a varredura e uso de alto número de cópias de plasmídeos, ou baixo ou médio número de cópia de plasmídeos. A etapa de término de transcrição pode também ser direcionada para regulação da expressão gênica, através da introdução ou eliminação de estruturas, tais como estruturas do tipo "haste-alça".

[00048] Em algumas modalidades, pode ser vantajoso usar uma célula que foi anteriormente otimizada para produção de ácido glicárico. Por exemplo, pode ser ótimo mutar um ou mais componentes da via do metabolismo do ácido glicárico na célula, antes da produção de ácido glicárico, para que a célula não consuma o produto que está sendo produzido. Em algumas modalidades, a triagem por mutações que levam a uma produção intensificada de ácido glicárico pode ser conduzida através de uma triagem por mutagênese aleatória, ou através de triagem de mutações conhecidas. Em algumas modalidades, clonagem do tipo shotgun de fragmentos genômicos poderia ser usada para identificar regiões do genoma que levam a um aumento na produção de ácido glicárico, através de triagem de células ou organismos que possuem estes fragmentos para produção de ácido glicárico aumentada. Em alguns casos, uma ou mais mutações podem ser combinadas na mesma célula ou organismo.

[00049] A otimização da expressão de proteína pode também exigir, em algumas modalidades, que os genes que codificam as enzimas associadas com a invenção sejam modificadas antes de serem introduzidas em uma célula, tal como através de otimização de códon para expressão em uma célula bacteriana. Os usos de códon para uma variedade de organismos pode ser avaliada no sítio da internet da base de dados de uso de códons. Por exemplo, a invenção abrange um gene de MIOX de camundongo que foi sintetizado com otimização de códon para expressão em E. coli.

[00050] Em algumas modalidades, manipulação de proteína pode ser usada para otimizar a expressão ou atividade de uma ou mais das enzimas associadas com a invenção. Em certas modalidades, uma abordagem de manipulação de proteínas poderia incluir determinar a estrutura tridimensional (3D) de uma enzima ou construir um modelo de homologia tridimensional para a enzima com base na estrutura de uma proteína relacionada. Com base em modelos 3D, mutações em uma enzima podem ser construídas e incorporadas em uma célula ou organismo, e poderiam então ser selecionadas para uma produção aumentada de ácido glicárico. Em algumas modalidades, a produção de ácido glicárico em uma célula poderia ser aumentada através de manipulação das enzimas que agem na mesma via que as enzimas associadas com a invenção. Por exemplo, em algumas modalidades pode ser vantajoso aumentar a expressão de uma enzima ou outro fator que age à montante de uma das enzimas associadas com a invenção. Isto pode ser obtido por superexpressar o fator à montante com o uso de qualquer método padrão.

[00051] A invenção então envolve, em um aspecto, polipeptídeos de uronato desidrogenase, genes que codificam estes polipeptídeos, modificações funcionais e variantes dos anteriormente mencionados, assim como usos relacionados a eles. Homólogos e alelos dos ácidos nucleicos de uronato desidrogenase da invenção podem ser identificados por técnicas convencionais. Também são abrangidos pela invenção ácidos nucleicos que hibridizam sob condições estringentes aos ácidos nucleicos de uronato desidrogenase aqui descritos. O termo "condições estringentes" para uso na presente invenção, refere-se a parâmetros com os quais a técnica está familiarizada. Os parâmetros de hibridização dos ácidos nucleicos podem ser encontrados em referências que compilam estes métodos, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque., 1989, ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque. Mais especificamente, condições estringentes, para uso na presente invenção, refere-se, por exemplo, a hibridização a 65°C em um tampão de hibridização (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polivinilpirrolidona, 0,02% albumina sérica bovina, NaH2PO4(pH7) 2,5mM, 0,5% SDS, EDTA 2mM). SSC é cloreto de sódio 0,15M /citrato de sódio 0,015M, pH7; SDS é dodecil sulfato de sódio; e EDTA é ácido etilenodiaminotetracético. Após a hibridização, a membrana para a qual o DNA é transferido é lavada, por exemplo, em SSC 2 x à temperatura ambiente e, então, a SSC 0,1 - 0,5 x/SDS 0,1 x em temperaturas de até 68°C.

[00052] Há outras condições, reagentes, e etc, que resultam em um grau similar de estringência, que podem ser usados. O versado na técnica estará familiarizado com estas condições e, assim, elas não são fornecidas aqui. Será compreendido, entretanto, que o versado na técnica será capaz de manipular as condições de uma forma que permite a clara identificação de homólogos e alelos de ácidos nucleicos de uronato desidrogenase da invenção (por exemplo, pelo uso de condições de baixa estringência). O versado na técnica também está familiarizado com a metodologia para selecionar células e bibliotecas para expressão destas moléculas, que são, então isoladas de forma rotineira, seguido pelo isolamento da molécula de ácido nucleico pertinente e sequenciamento.

[00053] Em geral, homólogos e alelos compartilharão, tipicamente, pelo menos 75% de identidade de nucleotídeos e/ou pelo menos 90% de identidade de aminoácidos às sequências dos ácidos nucleicos e polipeptídeos de uronato desidrogenase, respectivamente, em alguns casos compartilharão pelo menos 90% de identidade de nucleotídeos e/ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos e ainda em outras casos, compartilharão pelo menos 95% de identidade de nucleotídeos e/ou pelo menos 99% de identidade de aminoácidos. A homologia pode ser calculada com o uso de várias ferramentas de programas disponíveis ao público desenvolvidas pelo NCBI (Bethesda, Maryland) que podem ser obtidas através da página da internet do NCBI. Ferramentas exemplificadoras incluem o programa BLAST, também disponível na página da internet do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Alinhamentos em pares e ClustalW (configuração de matriz BLOSUM30) assim como análise hidropática Kyte-Doolittle podem ser obtidos com o uso do software para análise de sequências MacVector (Oxford Molecular Group). Complementos de Watson-Crick dos ácidos nucleicos anteriormente mencionados também estão abrangidos pela invenção.

[00054] Na varredura de genes de uronato desidrogenase, técnicas conhecidas dos versados na técnica, como Southern blots, Northern blots e protocolos de amplificação, como reação em cadeia de polimerase com o uso de iniciadores que hibridizam às sequências apresentadas, podem ser aplicadas.

[00055] A invenção inclui, também, ácidos nucleicos degenerados que incluem códons alternativos aos presentes nos materiais nativos. Por exemplo, resíduos de serina são codificados pelos códons TCA, AGT, TCC, TCG, TCT e AGC. Cada um dos seis códons é equivalente para efeito de codificar um resíduo de serina. Desta forma, ficará claro para um versado na técnica que qualquer uma das trincas de nucleotídeo que codificam serina podem ser empregadas para direcionada o aparelho de síntese de proteínas, in vitro ou in vivo, para incorporar um resíduo de serina em um polipeptídeo de uronato desidrogenase em formação. De modo similar, as trincas de sequência de nucleotídeo que codificam outros resíduos de aminoácido incluem, mas não se limitam a: CCA, CCC, CCG e CCT (códons de prolina); CGA, CGC, CGG, CGT, AGA e AGG (códons de arginina); ACA, ACC, ACG e ACT (códons de treonina); AAC e AAT (códons de asparagina); e ATA, ATC e ATT (códons de isoleucina). Outros resíduos de aminoácido podem ser codificados de modo similar por várias sequências de nucleotídeo. Desta forma, a invenção abrange ácidos nucleicos degenerados que diferem dos ácidos nucleicos isolados biologicamente com relação a sequência de códons devido à degeneração do código genético. A invenção também abrange otimização de códon para se adequar ao uso de códons ótimo de uma célula hospedeira.

[00056] A invenção também fornece moléculas de ácido nucleico modificadas que incluem adições, substituições e deleções de um ou mais nucleotídeos. Em modalidades preferenciais, estas moléculas de ácido nucleico modificadas e/ou os polipeptídeos que codificam, retêm pelo menos uma atividade ou função da molécula de ácido nucleico e/ou polipeptídeos não modificados, tal como atividade enzimática de uronato desidrogenase. Em certas modalidades, as moléculas de ácido nucleico modificadas codificam polipeptídeos modificados, de preferência, polipeptídeos que tem substituições de aminoácido conservativas, conforme descrito no presente documento. As moléculas de ácido nucleico modificadas são relacionadas estruturalmente às moléculas de ácido nucleico não modificadas e, em modalidades preferenciais, são suficientemente relacionadas estruturalmente às moléculas de ácido nucleico não modificadas para que as moléculas de ácido nucleico modificadas e não modificadas hibridizem sob condições estringentes conhecidas de um versado na técnica.

[00057] Por exemplo, moléculas de ácido nucleico modificadas que codificam polipeptídeos que tem alterações de um aminoácido podem ser preparadas. Cada uma destas moléculas de ácido nucleico pode ter uma, duas ou três substituições de nucleotídeo exclusivas das alterações de nucleotídeos que correspondem à degeneração do código genético, conforme descrito na presente invenção. De modo semelhante, moléculas de ácido nucleico modificadas que codificam polipeptídeos que tem duas alterações de aminoácido podem ser preparadas, as quais têm, por exemplo, 2 a 6 alterações de nucleotídeos. Numerosas moléculas de ácido nucleico modificadas como estas serão prontamente visualizadas por um elemento versado na técnica, incluindo, por exemplo, substituições de nucleotídeos em códons que codificam os aminoácidos 2 e 3, 2 e 4, 2 e 5, 2 e 6, e etc. No exemplo anteriormente mencionado, cada combinação de dois aminoácidos está incluída no conjunto de moléculas de ácido nucleico modificadas, assim como todas as substituições de nucleotídeos que codificam as substituições de aminoácido. Moléculas de ácido nucleico adicionais que codificam polipeptídeos que tem substituições adicionais (isto é, 3 ou mais), adições ou deleções (por exemplo, pela introdução de um códon de parada ou um sítio de splice) podem, também, ser preparadas e abrangidas pela invenção, como prontamente visualizado por um versado na técnica. Qualquer um dos ácidos nucleicos ou polipeptídeos anteriormente mencionados pode ser testado por experimentação de rotina para a retenção de relação estrutural ou atividade aos ácidos nucleicos e/ou polipeptídeos aqui apresentados.

[00058] A invenção também fornece polipeptídeos isolados codificados pelos ácidos nucleicos de uronato desidrogenase anteriormente mencionados. Estes polipeptídeos são úteis, por exemplo, sozinhos ou como proteínas de fusão, para converter ácido glicurônico em ácido glicárico in vivo ou in vitro. Os polipeptídeos de uronato desidrogenase podem ser isolados a partir de amostras biológicas incluindo tecido ou homogenatos de célula, e podem também ser expressos de forma recombinante em uma variedade sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos através da construção de um vetor de expressão adequado para o sistema de expressão, introdução do vetor de expressão no sistema de expressão, e isolamento da proteína expressa de forma recombinante. Polipeptídeos podem também ser sintetizados quimicamente com o uso de métodos bem estabelecidos de síntese de peptídeos.

[00059] A invenção inclui variantes dos polipeptídeos de uronato desidrogenase descritos acima. Para uso na presente invenção, uma "variante" de um polipeptídeo de uronato desidrogenase é um polipeptídeo que contém uma ou mais modificações à sequência de aminoácido primária de um polipeptídeo de uronato desidrogenase. Modificações que criam uma variante de uronato desidrogenase podem ser feitas a um polipeptídeo de uronato desidrogenase 1) para reduzir ou eliminar uma atividade de um polipeptídeo de uronato desidrogenase; 2) para intensificar uma propriedade de um polipeptídeo de uronato desidrogenase, tal como a capacidade de converter ácido glicurônico em ácido glicárico ou estabilidade da proteína em um sistema de expressão ou a estabilidade da ligação proteína-proteína; 3) para fornecer uma nova atividade ou propriedade a um polipeptídeo de uronato desidrogenase, tal como uma adição de um epítopo antigênico ou adição de uma porção detectável; ou 4) para fornecer ligação equivalente ou melhor entre uma molécula de uronato desidrogenase e outra molécula (por exemplo, um substrato enzimático). Modificações a um polipeptídeo de uronato desidrogenase são feitas tipicamente ao ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de uronato desidrogenase, e podem incluir deleções, mutações pontuais, truncamentos, substituições de aminoácido e adições de porções de aminoácido ou não aminoácido. Alternativamente, modificações podem ser feitas diretamente ao polipeptídeo, tal como por clivagem, adição de uma molécula ligante, adição de uma porção detectável, tal como biotina, adição de um ácido graxo, e similares. As modificações também abrangem proteínas de fusão que compreendem toda ou uma parte da sequência de aminoácido de uronato desidrogenase. Um elemento versado na técnica estará familiarizado com métodos para prever o efeito sobre a conformação da proteína de uma alteração na sequência da proteína, e pode assim, "desenhar" um polipeptídeo de uronato desidrogenase variante de acordo com métodos conhecidos. Um exemplo deste método é descrito por Dahiyat e Mayo em Science 278:82-87, 1997, pelo qual proteínas podem ser desenhadas de novo. O método pode ser aplicado a uma proteína conhecida para variar apenas uma porção da sequência de polipeptídeo. Pela aplicação dos métodos computacionais de Dahiyat e Mayo, variantes específicas de um polipeptídeo de uronato desidrogenase podem ser propostos e testados para determinar se a variante retém uma conformação desejada.

[00060] Em geral, as variantes incluem polipeptídeos de uronato desidrogenase que são modificadas especificamente para alterar uma característica do polipeptídeo não relacionada com sua atividade fisiológica desejada. Por exemplo, resíduos de cisteína podem ser substituídos ou deletados para evitar ligações dissulfeto indesejadas. De modo similar, determinados aminoácidos podem ser alterados para intensificar a expressão de um polipeptídeo de uronato desidrogenase pela eliminação da proteólise por proteases em um sistema de expressão (por exemplo, resíduos de aminoácido dibásicos em sistemas de expressão de levedura nos quais a atividade da protease KEX2 está presente).

[00061] Mutações de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de uronato desidrogenase, de preferência, preservam a fase de leitura de aminoácido da sequência codificante e, de preferência, não criam regiões no ácido nucleico que provavelmente hibridizarão para formar estruturas secundárias, tais como estruturas em forma de grampo ou estruturas do tipo "loop", que podem ser prejudiciais para a expressão do polipeptídeo variante.

[00062] As mutações podem ser feitas por selecionar uma substituição de aminoácido, ou por mutagênese aleatória de um local selecionado em um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Polipeptídeos variantes são, então, expressos e testados para uma ou mais atividades para determinar qual mutação fornece um polipeptídeo variante com as propriedades desejadas. Mutações adicionais que são silenciosas quanto à sequência de aminoácido do polipeptídeo, mas que fornecem códons preferenciais para tradução em um hospedeiro particular podem ser feitas a variantes (ou a polipeptídeos de uronato desidrogenase não-variantes). Os códons preferenciais para tradução de um ácido nucleico em, por exemplo, E. coli, são bem conhecidos dos versados na técnica. Ainda outras mutações podem ser feitas a sequências não codificantes de um gene de uronato desidrogenase ou clone de cDNA para intensificar a expressão do polipeptídeo. A atividade de variantes de polipeptídeos de uronato desidrogenase pode ser testada por clonar o gene que codifica o polipeptídeo de uronato desidrogenase variante em um vetor de expressão bacteriano ou de mamífero, introduzir o vetor em uma célula hospedeira adequada, expressar o polipeptídeo de uronato desidrogenase variante, e testar uma capacidade funcional dos polipeptídeos de uronato desidrogenase, conforme descrito aqui.

[00063] O versado na técnica também compreenderá que substituições de aminoácido conservativas podem ser feitas em polipeptídeos de uronato desidrogenase para fornecer variantes funcionalmente equivalentes dos polipeptídeos anteriormente mencionados, isto é, as variantes retêm as capacidades funcionais dos polipeptídeos de uronato desidrogenase. Para uso na presente invenção, uma "substituição de aminoácido conservativa" refere-se a uma substituição de aminoácido que não altera a carga relativa ou características de tamanho da proteína na qual a substituição de aminoácido é feita. As variantes podem ser preparadas de acordo com métodos para alterar a sequência de polipeptídeo conhecidos de um versado na técnica, tal como encontrados em referências que compilam tais métodos, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque., 1989, ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque. Exemplos de variantes funcionalmente equivalentes dos polipeptídeos de uronato desidrogenase incluem substituições de aminoácido conservativas nas sequências de aminoácido das proteínas aqui apresentadas. Substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições feitas entre aminoácidos dentro dos seguintes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; e (g) E, D.

[00064] Em geral, é preferencial que menos do que todos os aminoácidos sejam alterados quando se prepara polipeptídeos variantes. Quando se sabe que resíduos de aminoácido particulares conferem função, estes aminoácidos não serão trocados, ou alternativamente, serão trocados por substituições de aminoácido conservativas. De preferência, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 resíduos podem ser alterados quando se prepara polipeptídeos variantes. Geralmente é preferencial que o menor número de substituições seja feito. Desta forma, um método para gerar polipeptídeos variantes é substituir todos os outros aminoácidos por um único aminoácido particular e, então, testar a atividade da variante e, então, repetir o processo com um ou mais dos polipeptídeos que tem a melhor atividade.

[00065] Substituições de aminoácido conservativas na sequência de aminoácido de uronato desidrogenase para produzir variantes funcionalmente equivalentes dos polipeptídeos de uronato desidrogenase, são feitas pela alteração de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de uronato desidrogenase. Estas substituições podem ser feitas através de uma variedade de métodos conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, substituições de aminoácido podem ser feitas por mutação direcionada por PCR, mutagênese sítio-dirigida, de acordo com os métodos de Kunkel (Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985), ou por síntese química de um gene que codifica um polipeptídeo de uronato desidrogenase.

[00066] A invenção conforme descrita aqui tem vários usos, alguns dos quais são descritos aqui em outro local Primeiro, a invenção permite o isolamento de molécula de proteína de uronato desidrogenase. Uma variedade de metodologias bem-conhecidas dos versados na técnica pode ser utilizada para se obter moléculas de uronato desidrogenase isoladas. O polipeptídeo pode ser purificado a partir de células que produzem naturalmente o polipeptídeo por meios cromatográficos ou reconhecimento imunológico. Alternativamente, um vetor de expressão pode ser introduzido nas células para gerar a produção do polipeptídeo. Em outro método, transcritos de mRNA podem ser microinjetados ou introduzidos de outro modo nas células para gerar a produção do polipeptídeo codificado. A tradução do mRNA nos extratos livre de células, tal como o sistema de lisado de reticulócito, pode, também, ser usada para produzir o polipeptídeo. Os versados na técnica também podem facilmente seguir métodos conhecidos para isolar polipeptídeos de uronato desidrogenase. Estes incluem, mas não se limitam a, imunocromatografia, HPLC, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica e cromatografia de imunoafinidade.

[00067] A expressão das moléculas da invenção pode ser determinada com o uso de métodos de rotina conhecidos dos versados na técnica. Estes métodos incluem, mas não se limitam a: amplificação direta de RNA, transcrição reversa de RNA em cDNA, RT-PCR em tempo real, amplificação de cDNA, hibridização, e métodos de teste de base imunológica, que incluem, mas não se limitam a imunohistoquímica, teste de captura de anticorpo sanduíche, ELISA, e teste de immunospot ligado à enzima (teste EliSpot). Por exemplo, a determinação da presença do nível de moléculas de ácido nucleico da invenção em um indivíduo ou tecido pode ser executada através de qualquer teste padrão para determinação de ácido nucleico, incluindo a reação em cadeia de polimerase, ou teste com sondas de hibridização marcadas. Estes métodos de hibridização incluem, mas não se limitam a técnicas de microarranjo.

[00068] A invenção também fornece anticorpos contra uronato desidrogenase (Udh). Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a um polipeptídeo que compreende pelo menos 95% de identidade de aminoácidos a SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a um polipeptídeo que é codificado por uma molécula de ácido nucleico que tem pelo menos 95% de identidade de nucleotídeos com SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a um polipeptídeo que compreende pelo menos 95% de identidade de aminoácidos a SEQ ID NO:24. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a um polipeptídeo que é codificado por uma molécula de ácido nucleico que tem pelo menos 95% de identidade de nucleotídeos com SEQ ID NO:23. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a um polipeptídeo que compreende pelo menos 95% de identidade de aminoácidos a SEQ ID NO:26. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a um polipeptídeo que é codificado por uma molécula de ácido nucleico que tem pelo menos 95% de identidade de nucleotídeos com SEQ ID NO:25.

[00069] Os anticorpos da presente invenção são preparados por qualquer um dentre uma variedade de métodos, incluindo administração de uma proteína, fragmentos de uma proteína, células que expressam a proteína ou fragmentos da mesma, e similares a um animal para induzir anticorpos policlonais. A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos de produzir anticorpos monoclonais para Udh. A produção de anticorpos monoclonais é feita de acordo com técnicas bem conhecidas na arte. É bem conhecido na técnica que apenas uma pequena porção de uma molécula de anticorpo, o parátopo, está envolvida na ligação do anticorpo ao seu epítopo (vide, Em geral, Clark, W.R., 1986, The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque; Roitt, I., 1991, Essential Immunology, 7a Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). As regiões pFc' e Fc, por exemplo, são efetoras da cascata do complemento, mas não estão envolvidas na ligação ao antígeno. Um anticorpo a partir do qual a região pFc' foi clivada enzimaticamente, ou que foi produzido sem a região pFc', designado um fragmento F(ab')2, retém ambos os sítios de ligação de antígeno de um anticorpo intacto. De modo similar, um anticorpo a partir do qual a região Fc foi clivada enzimaticamente, ou que foi produzido sem a região Fc, designado um fragmento Fab, retém um dos sítios de ligação de antígeno de uma molécula de anticorpo intacta. Os fragmentos Fab consistem em uma cadeia leve de um anticorpo e uma porção de cadeia pesada de um anticorpo, chamada Fd, covalentemente ligadas. Os fragmentos Fd são o principal determinante da especificidade do anticorpo (um único fragmento Fd pode estar associado a até dez diferentes cadeias leves sem alterar a especificidade do anticorpo) e os fragmentos Fd retêm a capacidade de ligação ao epítopo ao serem isolados.

[00070] Dentro da porção de ligação de antígeno de um anticorpo, conforme é bem conhecido na técnica, há regiões de determinação de complementaridade (CDRs), que interagem diretamente com o epítopo do antígeno, e regiões estruturais (FRs), que mantêm a estrutura terciária do parátopo (vide, em geral, Clark, 1986; Roitt, 1991). No fragmento Fd da cadeia pesada e na cadeia leve de imunoglobulinas IgG, há quatro regiões estruturais (FR1 até FR4) separadas, respectivamente, por três regiões de determinação de complementaridade (CDR1 até CDR3). As CDRs e, em particular, as regiões de CDR3, e, mais particularmente, a CDR3 da cadeia pesada, são grandemente responsáveis pela especificidade do anticorpo.

[00071] Agora está bem estabelecido na técnica que as regiões não- CDR de um anticorpo de mamífero podem ser substituídas por regiões similares de anticorpos não-específicos ou heteroespecíficos, enquanto ainda mantém a especificidade de epítopo do anticorpo original. Isto se manifesta mais claramente no desenvolvimento e uso de anticorpos "humanizados" nos quais CDRs não-humanas são covalentemente ligadas a regiões FR e/ou Fc/pFc' humanas para produzir um anticorpo funcional. Vide, por exemplo, patentes U.S. n° 4.816.567; 5.225.539; 5.585.089; 5.693.762; e 5.859.205. Anticorpos monoclonais totalmente humanos podem, também, ser preparados pela imunização de camundongos transgênicos para grandes porções dos loci da cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana. Após a imunização destes camundongos (por exemplo, camundongos XenoMouse (Abgenix), HuMAb (Medarex/GenPharm)), os anticorpos monoclonais podem ser preparados de acordo com tecnologia de hibridoma padrão. Estes anticorpos monoclonais terão sequências de aminoácido de imunoglobulina humana e, portanto, não provocarão respostas de anticorpos humanos anticamundongo (HAMA) quando administrados a seres humanos. Desta forma, conforme será aparente para um versado na técnica, a presente invenção fornece, adicionalmente, fragmentos F(ab')2, Fab, Fv, e Fd; anticorpos quiméricos nos quais as regiões Fc e/ou FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 da cadeia leve foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não-humanas; anticorpos de fragmento F(ab')2 quimérico nos quais as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não-humanas; anticorpos de fragmento Fab quimérico nos quais as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não-humanas; e anticorpos de fragmento Fd quimérico nos quais as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não-humanas. A presente invenção inclui, também, os chamados anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio e anticorpos de cadeia pesada.

[00072] Deve-se apreciar que os genes que codificam uronato desidrogenase, mio-inositol 1-fosfato sintase e mio-inositol oxigenase podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes. Nas modalidades discutidas na seção de exemplos apresentada aqui, a enzima é codificada por um gene de Saccharomyces cerevisiae (INO1), a enzima mio-inositol oxigenase é codificada por um gene de camundongo (MIOX) e a enzima uronato desidrogenase é codificada por um gene (udh) de Pseudomonas syringae, Pseudomonas putida, ou Agrobacterium tumefaciens. Como um versado na técnica estaria ciente, genes homólogos para estas enzimas existem em muitas espécies e podem ser identificadas por pesquisas de homologia, por exemplo, através de uma busca BLAST de proteínas, disponível na página da internet do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Genes que codificam estas enzimas podem ser amplificados por PCR a partir de DNA de qualquer fonte que contenha a dada enzima, por exemplo, com o uso de iniciadores degenerados, conforme seria compreendido pelo versado na técnica. Em algumas modalidades, o gene que codifica uma dada enzima pode ser sintético. Quaisquer meios de obtenção dos genes que codificam as enzimas discutidas aqui são compatíveis com a construção das vias da presente invenção.

Exemplos Exemplo 1: Produção de Ácido Glicárico: Via Biossintética em Escherichia coli Recombinante

[00073] Uma via sintética foi construída para a produção de ácidos glicurônico e glicárico a partir de glicose em Escherichia coli (Figura 1). A co-expressão de genes que codificam mio-inositol-1-fosfato (Ino 1) em Saccharomyces cerevisiae e mio-inositol oxigenase (MIOX) em camundongo, levaram a produção de ácido glicurônico através do intermediário mio-inositol. Concentrações de ácido glicurônico até 0,3 g/L foram medidas em caldo de cultura. A atividade de MIOX foi limitada pela velocidade, resultando no acúmulo de ambos, mio-inositol e ácido glicurônico, como produtos finais, em concentrações aproximadamente iguais. A inclusão de uma terceira enzima, uronato desidrogenase (Udh) de Pseudomonas syringae facilitou a conversão de ácido glicurônico em ácido glicárico. A atividade dessa enzima recombinante foi mais do que duas ordens de magnitude maior do que aquela de Ino 1 e MIOX e aumentou o fluxo global através da via, tal que concentrações de ácido glicárico em excesso de 1 g/L foram observadas. Isso representa um novo sistema microbiano para a produção biológica de ácido glicárico, uma "química de valor agregado superior" a partir da biomassa.

Materiais e Métodos Cepas, meios de cultura e plasmídeos

[00074] E. coli cepa DH10B [F- mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) F80lacZ ? M15 ?lacX74 recA1 endA1 ara ? 139 ? (ara, leu)7697 galU gal K À- rps L (StrR) nup G] foi usada em todas as manipulações de biologia molecular. DH10B e BL21 Star™ (DE3) [F- ompT hsdSB (rB-mB- ) gal dcm rne131 (DE3)] foram usadas como hospedeiras para a produção de ácidos orgânicos. Células competentes de ambas as cepas foram adquiridas da Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA). As culturas foram propagadas tanto em meio LB quanto em M9. O meio LB (Miller) foi preparado a partir de pó desidratado de acordo com as instruções do fabricante (BD Biosciences, San Jose, CA). M9 foi preparado como descrito (32) e consistiu em 1X sais de M9 (12,8 g/L de Na2HPO4^7H2O, 3 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4Cl), MgSO4 2 mM, CaCl20,1 mM, e 10 g/L (1%) de glicose. Leucina foi adicionada até uma concentração final de 105 µg/mL para DH10B. Canamicina foi adicionada até uma concentração final de 20 µg/mL e ampicilina até uma concentração final de 100 µg/mL, onde desejado para fornecer uma pressão seletiva para a manutenção do plasmídeo.

[00075] Todas as manipulações de biologia molecular foram realizadas de acordo com as práticas padronizadas (32). O gene INO 1 que codifica mio-inositol-1-fosfato sintase (Ino 1, também conhecida como MIPS) foi amplificado por PCR a partir da preparação de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae usando os seguintes iniciadores: adiante - 5’-GAATTCATGACAGAAGATAATATTGCTC-3‘ (SEQ ID NO:3); reverso - 5’-AAGCTTCTACAACAATCTCTCTTCG-3‘ (SEQ ID NO:4). Os sítios de restrição EcoRI e HindIII incluídos nas extremidades 5' dos iniciadores estão sublinhados. Um gene MIOX de camundongo codificando mio-inositol oxigenase foi sintetizado com otimização de códon para expressão em E. coli por DNA 2.0 (Menlo Park, CA), com base no Número de Acesso GenBank AF197127. A otimização da sequência de 858 nucleotídeos (códon 286) foi realizada pelo vendedor, com os resultados resumidos como se segue: 19,2% dos nucleotídeos foram alterados, afetando 153 dos 286 códons (53,5%). Entre os códons otimizados, 144 (94,1%) foram alterados apenas na terceira posição de nucleotídeo. Todos os três nucleotídeos foram trocados em 3 dos códons. O gene sintético foi recebido como plasmídeo pJ2-MIOX. Os sítios de restrição EcoRI e HindIII foram incluídos nas terminações 5' e 3' do gene, respectivamente. Um alinhamento de sequência do gene MIOX do camundongo e sua versão sintetizada com otimização de códon para expressão em E. coli é apresentado na Figura 4. Ambos os genes foram sub-clonados em plasmídeos induzíveis por IPTG pMMB206 (25) e pTrc99A (2) para confirmar a atividade das enzimas expressas. Os plasmídeos resultantes foram designados como pMMB-INO1, pTrc-INO1, pMMB- MIOX e pTrc-MIOX. Para a co-expressão de ambos os genes, o vetor pRSFDuet-1 da Novagen, contendo dois promotores T7 foi usado (Gibbstown, NJ). O gene INO1 foi sub-clonado na primeira posição usando os sítios EcoRI e HindIII, produzindo o plasmídeo pRSFD-IN. Para introduzir o gene de MIOX na segunda posição, o sítio HindIII de pJ2-MIOX foi preenchido na termainação usando a enzima de Klinow antes da digestão com EcoRI. pRSFD-IN foi digerido primeiro com XhoI e preenchido na terminação e depois digerido com MfeI compatível com EcoRI antes da ligação com o fragmento de gene de MIOX. O plasmídeo resultante foi designado como pRSFD-IN-MI. O isolamento do gene udh que codifica uronato desidrogenase de Pseudomonas syringae (Número de Acesso GenBank EU377538) está apresentado no Exemplo 2. O gene udh de Pseudomonas syringae foi sub-clonado em pTrc99A para produzir pT1053 (daqui por diante referido como Trc-udh) como descrito (40). Ensaios enzimáticos para atividade de MIOS (INO1), MIOX e UDH.

[00076] A expressão funcional dos genes INO1, MIOX, e udh foi confirmada através de ensaios in vitro de atividade enzimática. Lisados brutos foram preparados pela ressuspensão inicial de péletes celulares de uma cultura de 1-2 mL em 100-200 µL de Tris-Cl 10 mM (pH 8.0) com 1 mg/mL de lisozima. As soluções celulares foram lisadas pela alternância de congelamento em nitrogênio líquido com descongelamento em água a 30 a 40°C por 5 ciclos. As soluções resultantes foram centrifugadas a 14.000 rpm a 4°C por 15 minutos para remover os insolúveis. A concentração total de proteína dos lisados foi determinada usando o método de Bradford (11).

[00077] Ensaios para a atividade de mio-inositol 1-fosfato sintase foram realizados como descrito previamente (1,6). Resumidamente, o substrato de glicose-6-fosfato foi convertido para mio-inositol 1-fosfato em um tampão de reação constituído por Tris-acetato 50 mM (pH 7.5), NAD+ 0,8mM, NH4Cl 14 mM, mercaptoetanol 5 mM e glicose-6-fosfato 5 mM. As reações foram iniciadas com a adição do lisado e incubadas por 1 h a 37°C. As reações foram finalizadas com a adição de 0,4 volumes de ácido tricloroacético 20%. Para quantificar o produto, o fosfato inorgânico foi removido de mio-inositol-1-fosfato pela oxidação com igual volume de Na2SO3 1 M. As reações de controle foram estabelecidas sem glicose-5-fosfato e sem a adição de periodato.

[00078] Ensaios para atividade de mio-inositol oxigenase foram realizados como previamente descrito (4, 30, 31). O tampão de reação consistia em Tris-Cl 50 mM (pH 8.0), L-cisteína 2 mM, Fe(NH4)2(SO4)2 1 mM, e mio-inositol 60 mM. As amostras foram pré-incubadas sem substrato por 10 minutos a 30°C para ativar a enzima MIOX. As reações foram incubadas por 1 h a 30°C e finalizadas depois com a adição de 1/10 de volume de ácido tricloroacético 30%. O ácido glicurônico produzido foi quantificado usando um reagente de orcinol (13). O reagente consistia em 40 mg de orcinol em 10 mL de HCl concentrado contendo 5,4 mg de FeCl3. Um volume da amostra foi misturado com dois volumes de reagente de orcinol e incubado por 30 minutos em água fervente. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, a absorbância a 670 nm foi medida para determinar a concentração de ácido glicurônico. As reações de controle foram estabelecidas sem mio- inositol para explicar os perfis anteriores.

[00079] Ensaios para a atividade de uronato desidrogenase foram realizados pelo monitoramento da geração do cofator NADH a 340 nm como previamente descrito (35, 40). A mistura de reação continha tampão fosfato de sódio 100 mM (pH 8.0), ácido glicurônico 2,5 mM, NAD+ 0,9 mM e lisado bacteriano preparado como descrito acima.

Condições de crescimento para a produção de ácido

[00080] As culturas foram cultivadas em meio LB suplementado com 10 g/L de glicose e induzido com IPTG como indicado nos Resultados. Um inóculo foi preparado em meio LB e 1 ou 2% (v/v) foram usados para inocular frascos com difusor de 250 mL contendo 50 ou 100 mL de meio. As culturas foram incubadas a 30°C e 250 rpm, com amostragem periódica para determinar a densidade celular e a concentração do produto no meio de cultura.

Detecção e quantificação de ácidos orgânicos

[00081] Metabolitos incluindo ácido glicurônico e ácido glicárico foram quantificados por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Para ensaios de ácido glicárico, as amostras foram pré-tratadas como descrito anteriormente (28, 40) para separar o ácido glicárico de outros metabolitos incluindo o ácido glicurônico. Resumidamente, um gel de afinidade de ácido borônico (gel de boronato Affi-gel, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), que tem uma afinidade pelos grupos hidroxila cis adjacentes coplanares presentes no ácido glicárico (28) foi misturado com as amostras e lavado com tampão fosfato de potássio 80 mM - ácido bórico 20 mM (pH 7.0). O ácido glicárico foi eluído com ácido clorídrico 0,1 mM. O eluato foi neutralizado pela adição de NaOH 10 M e analisado depois por HPLC. As análises HPLC foram realizadas com um instrumento Agilent serie 1100 equipado com uma coluna Aminex HPX-87H (300 mm x 7,8 mm, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e o índice de refração e os detectores de diodo sob as seguintes condições: fase móvel, ácido sulfúrico 5 mM em água; taxa de fluxo, 0,5 mL/min; volume de injeção, 50 µL; temperatura 55°C; comprimento de onda UV, 210 nm.

Resultados Verificação das atividades de Ino1 e MIOX recombinantes

[00082] O uso de mio-inositol-1-fosfato sintase (Ino 1) de Saccharomyces cerevisiae para produzir altas concentrações de mio- inositol através da fermentação com E coli foi relatado anteriormente (15). Títulos do produto de até 21 g/L foram obtidos sob alta densidade celular, fermentações em lotes descontínuos funcionando por 54 h. Para confirmar o desempenho de Ino 1 em frascos para agitação, o gene correspondente foi amplificado, inserido no vetor compatível, depois sub-clonado em ambos os plasmídeos com muitas cópias e cópias moderadas para expressão na cepa comum de laboratório DH10B. O plasmídeo pTrc-INO 1 contém o replicon ColE1 modificado que resulta em número de cópias de várias centenas, enquanto que pMMB-INO1 é baseado no replicon RSF1010 com um número de cópias da ordem de 10. Dois plasmídeos foram avaliados para explorar o potencial para co- expressão dos genes INO1 e MIOX em uma única cepa usando vetores compatíveis. A atividade in vitro de 344 nmol/h/mg e 128 nmol/h/mg foi mensurável para culturas que abrigam pTrc-INO1 e pMMB-INO1, respectivamente, e incubadas a 30°C, indicando expressão bem- sucedida da enzima (Tabela 1). Entretanto, apenas a expressão a partir de um plasmídeo com muitas cópias resultou no acúmulo de quantidades mensuráveis de mio-inositol no meio de cultura, 0,37 g/L. A atividade também foi uma acentuada função da temperatura, com nada detectável para culturas cultivadas a 37°C. A produção de mio - inositol também foi testada em meio mínimo M9. Foi postulado que o crescimento em meio mínimo com glicose como a única fonte de carbono poderia aumentar o fluxo de glicose e, consequentemente, aumentar a produção de mio-inositol. Entretanto, apenas metade da quantidade de mio-inositol foi produzida, sugerindo que apesar do fluxo de glicose poder estar de fato maior, a enzima Ino 1 expressa sob essas condições não compete tão eficazmente contra a glicólise do substrato. Experimentos subsequentes foram realizados em meio LB suplementado com glicose.

[00083] MIOX é uma proteína de origem primariamente eucariótica e os homólogos de humano, camundongo, rato e porco já foram bem caracterizados (3, 4, 30, 31). A mio-inositol oxigenase (MIOX) foi expressa funcionalmente em E. coli e purificada para caracterização das propriedades da enzima; entretanto, em nosso conhecimento, MIOX de mamífero não foi usada em um sistema recombinante, célula completa para produzir ácido glicurônico. A versão de camundongo da enzima foi descoberta ter as propriedades mais favoráveis depois da expressão em E. coli (3) e foi escolhida para a investigação. Uma versão sintética do gene foi adquirida de DNA 2.0, com otimização de códon para E. coli. Esse gene também foi sub-clonado em ambos os vetores de muitas cópias e poucas cópias usados para avaliar a atividade de Ino 1 em DH10B. A atividade de MIOX foi inicialmente avaliada a 37°C já que a enzima é de origem de mamífero.

[00084] A enzima MIOX é conhecida por necessitar de Fe2+ e cisteína para ativação in vitro (4). A adição desses compostos ao meio de cultura não aperfeiçoou a expressão da enzima de pTrc-MIOX como medida no ensaio in vitro, mas pelo contrário resultou em uma diminuição da atividade (Tabela 2). O ácido ainda foi medido no meio de cultura, embora em menor concentração. A diminuição observada na atividade enzimática coincidiu com uma diminuição significativa na densidade celular, indicando citotoxicidade desses compostos para o hospedeiro. Como relatado previamente (30,31), a atividade de MIOX é inibida por Fe2+ e cisteína em altas concentrações. Embora as concentrações extracelulares fossem ajustadas em um nível que ativa a enzima no ensaio in vitro, as concentrações intracelulares correspondentes são desconhecidas. Também foi relatado previamente que a inclusão de mio-inositol no meio de cultura aperfeiçoou a expressão solúvel de MIOX em E. coli (3). Esse comportamento também foi observado aqui, registrando uma diminuição aguda na atividade da enzima quando expressa na ausência de suplementação de mio-inositol (Tabela 2). Um aspecto notável de MIOX recombinante é sua aparente instabilidade (3). A alta atividade foi observada em amostras retiradas durante a fase exponencial (6 horas depois da inoculação), mais diminuiu substancialmente na fase estacionária (24 horas depois da inoculação) (Tabela 2). A atividade de fundo do ensaio, como medida nas amostras de controle que contêm o plasmídeo pTrc99A vazio, geralmente aumenta com o tempo. Observe que o fundo alto do ensaio resulta da não especificidade do reagente orcinol, que é conhecido por reagir com outros compostos biológicos embora em menor extensão. Como resultado, o ensaio pode não ser confiável para a quantificação precisa da atividade da enzima. Entretanto, as diferenças observadas entre as amostras com e sem mio-inositol e entre as amostras com mio-inositol em pontos de tempo precoces e tardios são suficientemente grandes para que as tendências sejam consideradas significativas.

[00085] Nem a atividade da enzima in vitro nem a produção de ácido glicurônico in vivo foram observadas em culturas contendo um construto pMMB-MIOX com poucas cópias, sugerindo que os níveis de expressão elevados são necessários para se obter atividade mensurável de MIOX. Como INO 1 é expresso ativamente apenas a 30°C, o desempenho de MIOX in vivo também foi avaliado nessa temperatura no plasmídeo com muitas cópias. Uma quantidade comparável de ácido glicurônico, 0,40 g/L, foi produzida depois de 24 h em cultura, com títulos dobrando para 0,78 g/L depois de 48 h.

Produção de ácido glicurônico

[00086] A produção de ácido glicurônico a partir de glicose requer a co-expressão de ambos INO1 e MIOX na mesma cepa. Os plasmídeos compatíveis pTrc99A e pMMb206 foram ambos investigados, com a expectativa de que uma cepa duplamente transformada contendo pTrc- INO1 e pMMB-MIOX ou pMMB-INO1 e pTrc-MIOX pudesse ser usada para a produção. Entretanto, esses resultados indicaram que atividades razoáveis in vivo, como determinadas pelo acúmulo de cada produto desejado no meio de cultura, foram apenas alcançáveis com a expressão de ambos os genes a partir de plasmídeos com muitas cópias. Para abordar esse problema, foram introduzidas ambas as enzimas no vetor pRSFDuet com muitas cópias, que contém um par de sítios de multiclonagem, cada um atrás de um promotor T7. As atividades da enzima foram confirmadas como descrito previamente e a expressão foi verificada por SDS-PAGE (dados não mostrados). Dessa maneira, uma concentração de IPTG de 0,1 mM foi determinada ser a preferida. A cepa hospedeira também foi traçada de DH10B para BL21 (DE3), para possibilitar a expressão do promotor T7. Foi observado anteriormente que DH10B era incapaz de consumir o ácido glicurônico para o crescimento (dados não mostrados). BL21(DE3) pode metabolizar o ácido glicurônico; entretanto, seu consumo parece estar sujeito a repressão por catabólito (dados não mostrados). Portanto, o cultivo da cepa em um excesso de glicose evita o consumo do produto desejado.

[00087] A cepa BL21(DE3) carregando pRSFD-IN-MI foi capaz de produzir ácido glicurônico a partir de glicose, embora em níveis de apenas ~270 mg/L (Figura 2). O perfil da cultura mostra que o ácido glicurônico estava presente depois de 24 h, sem intermediário detectável e a concentração aumentada em 50% em 4 dias. Entretanto, depois de 48 h, quantidades significativas de mio-inositol apareceram no meio de cultura. Mio-Inositol continuou a se acumular no meio e estava presente em concentrações levemente maiores do que o produto final desejado, ácido glicurônico, no final do experimento. A concentração final de ácido glicurônico, 0,27 g/L, foi menor do que aquela observada com a conversão direta de mio-inositol no sistema DH10B(pTrc-MIOX) acima (0,78 g/L). O acúmulo de mio-inositol sugere que a atividade de MIOX é o fator limitante na produção de altas concentrações de ácido glicurônico. Os ensaios in vitro confirmaram que a atividade de Ino1 era significativamente maior do que no controle só com vetor ao longo do curso do experimento, com atividade de fundo marginal aparecendo apenas depois de 3 dias (dados não mostrados). Em contraste, a atividade de MIOX foi apenas discretamente maior do que o fundo depois de 1 dia e foi subsequentemente indistinguível do fundo. Isso é consistente com os resultados resumidos previamente (Tabela 2) que indicam que a atividade de MIOX diminui agudamente depois de 24 h. Adicionalmente, é provável que a atividade de MIOX nesse sistema seja limitada pela concentração de mio-inositol produzido por Ino 1. Apesar de uma suplementação extracelular de 60 nM (10,8 g/L) de mio-inositol não significar que a concentração intracelular também seja alta, é razoável suspeitar que as concentrações intracelulares de mio-inositol que resultam da atividade de Ino 1 sejam passíveis estarem aquém das expectativas da concentração equivalente.

Produção de ácido glicárico.

[00088] O Exemplo 2 revela a clonagem e caracterização do gene que codifica a atividade de uronato desidrogenase de Pseudomonas syringae pv. cepa tomato DC3000 (40). Foi observado que o gene udh era muito bem-expresso em E. coli, resultando em altas atividades enzimáticas. Para a produção de ácido glicárico, foi utilizado um vetor construído anteriormente que carrega o gene udh em pTrc99A, que é compatível com pRSFD-IN-MI. Ambos os vetores foram introduzidos em BL21(DE3) para construir uma cepa de E. coli que carrega INO1, MIOX e udh. A produtividade desta cepa foi medida sob várias condições de indução diferentes (Tabela 3). Surpreendentemente, até 1 g/L de ácido glicárico foi produzido, embora apenas 0,27 g/L de ácido glicurônico tenha sido observado anteriormente no sistema que carrega os dois primeiros genes. Sob condições de indução idênticas as usadas anteriormente para o ácido glicurônico (Tabela 3, condição A), 0,72 g/L de ácido glicárico foi produzido. Para caracterizar adicionalmente o sistema, as atividades enzimáticas em lisados brutos foram medidas após cada dia de cultura (figura 3). A atividade de Udh foi a maior, mais do que duas ordens de magnitude maior do que a atividade de Ino1, e três ordens de magnitude maior do que a atividade de MIOX. A alta atividade de Udh, então, parece puxar o fluxo de glicose através da via do ácido glicárico, levando a um título relativamente maior de ácido glicárico. Nestas amostras, a atividade de MIOX não parece diminuir ao longo do tempo conforme observado anteriormente; entretanto, a magnitude da atividade permanece muito baixa. Adicionalmente, o primeiro ponto de dados aqui é após um dia, quando a atividade de MIOX foi anteriormente observada estando significativamente reduzida em relação àquela observada durante o crescimento exponencial (Tabela 2). Nenhum ácido glicurônico foi detectado após um tempo de cultura de três dias enquanto que o mio-inositol se acumulou, confirmando que a etapa catalisada pelo MIOX é limitante.

[00089] As três condições de indução testadas resultaram em concentrações de ácido glicárico que situadas na faixa de 0,72 a 1,13 g/L. Em geral, níveis de indução mais elevados, isto é, concentração mais elevada de IPTG, resultaram em um rendimento mais alto de ácido glicárico em relação a glicose, mas concentração do produto inferior (compare, por exemplo, as condições A e B na Tabela 3). Níveis de indução mais elevados também levaram a menos consumo de glicose e uma densidade celular menor, indicando uma sobrecarga metabólica associada com uma maior expressão das três enzimas. Entretanto, no caso de menor taxa de consumo de glicose, uma fração mais elevada de fluxo de glicose foi direcionada em direção à produção de ácido glicárico versus biomassa. Também foi observado que uma aeração menos satisfatória, resultante da duplicação do volume total da cultura de 50 para 100 mL em frascos de 250 mL com divisórias, levou a uma diminuição na titulação de ácido glicárico pela metade, enquanto que o crescimento não foi afetado (dados não mostrados). Esta titulação reduzida é provavelmente atribuída ao fato de que MIOX, a enzima para a etapa limitante, usa oxigênio molecular como um co-substrato (12, 38). Finalmente, a produção de ácido glicárico foi testada em meio mínimo M9; entretanto, uma quantidade desprezível de ácido glicárico foi produzida.

Discussão

[00090] Aqui foi demonstrada a montagem da via biossintética para a produção de ácido glicárico com o uso de enzimas de três fontes distintas: Ino1 de S. cerevisiae, MIOX de camundongo, e Udh de P. syringae. Uma fosfatase endógena também participa na via. O produto do gene suhB de E. coli mostrou possuir atividade de inositol monofosfatase in vitro e é, portanto, um candidato razoável para esta atividade endógena (23). Esta via é atrativa de uma perspectiva de termodinâmica, já que as alterações da energia livre padrão (?G) para todas as três etapas, conforme estimado pela teoria de contribuição de grupos (21, 24) e considerando o oxigênio molecular como o oxidante fundamental, são todas negativas: -14,3 Kcal/mol para a etapa de glicose para mio-inositol; -86,8 Kcal/mol para etapa de mio-inositol para ácido glicurônico; -55,9 Kcal/mol para a etapa de ácido glicurônico para ácido glicárico. Entretanto, conforme Khosla e Keasling indicaram (18), a manipulação metabólica é mais do que simplesmente recrutar várias enzimas. Ela também envolve a otimização global do fluxo metabólico quando perturbações como a introdução de novas vias em um organismo hospedeiro são feitas. Questões sobre o sobrecarregamento metabólico associado com a manutenção de plasmídeos e expressão de genes codificados por plasmídeo são de particular interesse nesse caso (9, 10, 17). No nosso sistema, uma quantidade detectável de ácido glicurônico foi produzida in vivo apenas por plasmídeos em alto número de cópias. A glicose-6-fosfato, o primeiro substrato, não deve ser limitante para o metabolismo central porque meio LB suplementado com glicose em excesso foi usado para o crescimento. Portanto, parece que altos níveis de expressão dos genes recombinantes são necessários para competir com a via rápida e robusta da glicólise e para desviar a glicose-6-fosfato em direção ao ácido glicurônico. O resultado de que apenas pequenas quantidades de mio-inositol e nenhuma quantidade detectável dos ácidos orgânicos foram produzidas no meio M9 implica que quando a glicose é a única fonte de carbono e energia, quase todo o substrato entra no metabolismo celular endógeno. Esta competição pode explicar, também, porque o rendimento de ácido glicárico em relação a glicose durante os dois primeiros dias do processo, quando a concentração de glicose é maior no meio é, geralmente, maior do que a dos dias posteriores quando a concentração é menor (dados não mostrados). O requisito para o mio-inositol atingir alta atividade de MIOX sugere que a baixa produtividade da enzima Ino1 pode, em última análise, ser a limitação em direção a formação dos ácidos orgânicos no meio M9. Alternativamente, MIOX pode ser pouco expressa em meio mínimo. Vale ressaltar que estudos anteriores com Ino1 resultaram em altos níveis de produção de mio-inositol em um meio alternativo quimicamente definido e empregando também um plasmídeo em alto número de cópias para a expressão gênica; entretanto, estes experimentos foram conduzidos em fermentações em batelada alimentada em maior escala durante vários dias (15). Durante o período inicial da batelada antes do início da alimentação com glicose (aproximadamente 10 horas), a concentração de mio-inositol foi menor que 1 g/L. Desta forma, é válido explorar a extensão na qual o cultivo sob condições de batelada alimentada poderia melhorar a produtividade do nosso sistema.

[00091] O número de cópias do plasmídeo não é o único fator relacionado com o nível de expressão que afeta o desempenho do nosso sistema sintético. Conforme mostrado na Tabela 3, aumentar a concentração de indutor para aumentar a expressão resultou em concentração do produto inferior. Concentrações de IPTG abaixo de 0,05 mM não melhoraram a produção de ácido glicárico mesmo que a taxa de consumo de glicose e a taxa de crescimento tivessem aumentado devido à redução da sobrecarga metabólica (dados não mostrados). O crescimento de E. coli é melhor a 37°C do que a 30°C e a atividade da enzima MIOX limitante da taxa deve ser maior a 37°C. Entretanto, a fermentação foi feita a 30°C porque Ino1 só estava funcionalmente expressa nesta temperatura mais baixa. Considerando a incomum instabilidade térmica relatada de Udh (7, 35), uma temperatura menor que 30°C pode ser melhor para sua atividade; entretanto, observamos que a atividade de Udh a 30°C foi muito maior do que a de Ino1 ou de MIOX (figura 3) e selecionamos 30°C como a temperatura da cultura para maximizar a expressão funcional de Ino1.

[00092] Ao considerar as limitações gerais sobre a produtividade deste sistema, a inibição potencial pelos intermediários na via deve ser examinada. Foi relatado que MIOX de rim de porco foi inibida in vitro pelo ácido D-glicárico mas não pelo D-glicuronato e D-glicuronolactona (30, 31). Dado que a atividade de MIOX caiu acentuadamente na fase estacionária mesmo na ausência de ácido D-glicárico (Tabela 2), a baixa atividade de MIOX é mais provavelmente devida a sua instabilidade intrínseca do que à inibição por intermediários (3). Deve-se observar que não superexpressamos o gene suhB ou uma fosfatase homóloga. Entretanto, nenhum mio-inositol-1-fosfato foi detectado entre os produtos da cultura, enquanto que o mio-inositol se acumulou. Portanto, concluiu-se que a atividade de fosfatase não está limitando o fluxo através da via. E. coli contém ainda a via catabólica do D-glucarato (16). De fato, a capacidade de E. coli consumir D-glucarato como a única fonte de carbono para crescimento foi usada para desenvolver uma triagem para identificar a atividade de uronato desidrogenase (40). BL21 (DE3) pode também metabolizar ácido D-glicurônico. Entretanto, o consumo de ambos os ácidos orgânicos parece estar sujeito à repressão por catabólito, que impede a perda indesejável de produtos na presença de glicose (dados não mostrados). O limite teórico da titulação de ácido D-glicárico parece, portanto, ser determinado pela toxicidade dos ácidos e pela cinética de cada etapa. Crescimento de E. coli e consumo de glicose não foram observados sendo afetados pela adição de glucarato de potássio e glicuronato de sódio em concentrações tão altas quanto 10 g/L (dados não mostrados); desta forma, há espaço para um aprimoramento das titulações por focar na melhoria da cinética das etapas limitantes da taxa. Otimização adicional para acentuar o fluxo de glicose para esta via sintética pode envolver o recrutamento de enzimas melhores de diferentes fontes, a manipulação destas enzimas, e regulação negativa das vias de competição. Tabela 1. Atividade de INO1 recombinante expresso a partir de plasmídeos com número de cópias alto (pTrc) e médio (pMMB) em E. coli. As culturas foram cultivadas a 30 °C em meio LB suplementado com 10 g/L de glicose e 0,1 mM ou 1,0 mM de IPTG para pTrc-INO1 e pMMB-INO1, respectivamente. As atividades in vitro foram determinadas a partir dos lisados brutos de amostras retiradas na fase mid-exponencial, enquanto que a atividade in vivo é relatada como a concentração de mio-inositol no meio de cultura após 48 horas. Os dados mostrados são representativos de um único experimento. N/D = não detectável. Tabela 2. Atividade de MIOX recombinante expresso a partir de pTrc- MIOX com alto número de cópias em E. coli sob várias condições de cultura. As culturas foram cultivadas a 37 °C em meio LB e induzidas com 1,0 mM de IPTG. O ácido glicurônico foi medido a 24 hr. Suplementos: MI = mio-inositol (60 mM, 10,8 g/L), Fe = Fe(NH4)2(SO4)2 (1 mM), Cys = L-cisteína (2 mM). N/D = não detectável. N/A = não medido. Tabela 3. Produção de ácido glicárico em BL21(DE3)(pRSFD-IN- MI)(pTrc-udh) após cultura de 3 dias. As culturas foram cultivadas a 30 °C em meio LB suplementado com 10 g/L de glicose e induzidas com IPTG. Os dados são a média e o desvio padrão de três experimentos independentes. OD600 = densidade óptica a 600 nm, Glc = glicose, MI = mio-inositol, Curo = ácido glicurônico, Car = ácido glicárico, Rendimento (%) = 100 x ácido glicárico produzido / glicose consumida (mol/mol). Condição A = 0,1 mM de IPTG na hora 0; Condição B = 0,05 mM de IPTG na hora 0; Condição C = 0,05 mM de IPTG na hora 0 e 0,1 mM de IPTG na hora 17,5. N/D = não detectável. REFERÊNCIAS PARA O EXEMPLO 1 1. Adhikari, J., A. L. Majumder, T. J. Bhaduri, S. 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Exemplo 2: Clonagem e caracterização de uronato desidrogenase de Pseudomonas syringae pv. Cepa tomato DC3000 e Agrobacterium tumefaciens cepa C58

[00093] A uronato desidrogenase foi clonada a partir de Pseudomonas syringae pv. cepa tomato DC3000, Pseudomonas putida KT2440, e Agrobacterium tumefaciens cepa C58. Os genes foram identificados pelo uso de um novo teste de complementação que emprega um mutante de Escherichia coli incapaz de consumir glicuronato como a única fonte de carbono, mas capaz de crescer em glucarato. Uma biblioteca do tipo shotgun de P. syringae foi selecionada na E. coli mutante através de cultivo das células transformadas em meio mínimo contendo ácido glicurônico. As colônias que sobreviveram foram avaliadas para uronato desidrogenase, que é capaz de converter ácido glicurônico em ácido glicárico. Desta forma, uma fase aberta de leitura de 0,8 Kb foi identificada e subsequentemente verificada como udh. As enzimas homólogas foram identificadas em P. putida e A. tumefaciens com base em uma busca por similaridade dos genomas sequenciados. As proteínas recombinantes de cada um dos três organismos expressos em E. coli foram purificadas e caracterizadas. Para todas as três enzimas, o número de turnover, kcat, foi maior para glicuronato como um substrato do que para o galacturonato; entretanto, a constante de Michaelis, Km, foi menor para o galacturonato. Foi observado que a enzima de A. tumefaciens teve a maior constante de taxa (kcat = 1,9 x 102 s-1 em glicuronato), que foi mais de 2 vezes maior do que ambas as enzimas de Pseudomonas. Introdução

[00094] Relatos mostram que o catabolismo de aldoexuronato em bactérias envolve duas diferentes vias, uma que começa com uma etapa de isomerização e a outra com uma etapa de oxidação. Na via de isomerização, o aldoexuronato (glicuronato, galacturonato) é isomerizado a cetoexuronato pela uronato isomerase e posteriormente degradado em piruvato e 3-fosfogliceraldeído. A via de isomerização foi anteriormente relatada ocorrendo em bactérias, incluindo Escherichia coli (7), Erwinia carotovora (18) e Erwinia hrysanthemi (15), Areobacter aerogenes (9, 23), e Serratia marcescens (28). Na via de oxidação, o aldoexuronato é oxidado em aldoexarato pela uronato desidrogenase e catabolizado adicionalmente a piruvato (2, 5, 7, 9, 18, 19, 24). A uronato desidrogenase (Udh), a enzima chave desta via, foi investigada em duas bactérias patógenas de planta, Pseudomonas syringae e Agrobacterium tumefaciens. Até o momento, apenas estudos restritos relacionados às propriedades de Udh foram relatados na literatura (3, 6, 38, 43), e nenhuma sequência foi identificada ainda. A Udh é classificada como uma oxidorredutase ligada a NAD (EC 1.1.1.203), com um peso molecular total de cerca de 60.000. Ela é um homo-dímero composto de duas subunidades com peso molecular de cerca de 30.000, cada (38). A Udh é uma enzima reversível e termicamente instável, com um pH ótimo de cerca de 8.0 (3, 6, 38).

[00095] Em E. coli MG1655 com a via de isomerização para o catabolismo de aldoexuronato, o glicuronato é transportado por um transportador de aldoexuronato codificado por exuT e convertido em fruturonato pela uronato isomerase, codificada por uxaC (22, 30). O fruturonato é transferido para a via de Entner-Doudoroff para ser utilizado como uma fonte de energia através de 2-ceto-3-desóxi-6- fosfogluconato (7, 27, 31, 32). Portanto, E. coli MG1655 com uma deleção de uxaC não pode usar glicuronato como uma fonte de carbono. Nesta mesma cepa, o glucarato é convertido em 5-ceto-4-desóxi-D- glucarato pela D-glucarato desidratase, codificada por gudD, e, então, transferido para glicólise através de piruvato ou 2-fosfoglicerato (27, 33). Recentemente, inúmeras sequências do genoma bacteriano foram publicadas, inclusive aquelas de Udh contendo P. syringae pv. cepa tomato DC3000 e A. tumefaciens cepa C58 (4, 10). Uma biblioteca do tipo shotgun de P. syringae foi construída para identificar o gene que codifica Udh. A varredura para Udh foi conduzida em E. coli MG1655 ?uxaC. Já que a uronato desidrogenase converte o glicuronato em glucarato (figura 5), cepas de E. coli ?uxaC carregando a biblioteca shotgun de P. syringae que podem crescer em um meio mínimo contendo glicuronato como única fonte de carbono podem transportar o gene que codifica Udh. Uma vez que um Udh inicial é identificado a partir de P. syringae, uma busca por homologia BLAST pode levar à identificação das Udhs de outras bactérias.

Materiais e Métodos Cepas bacterianas, plasmídeos, e condições de crescimento

[00096] As cepas, plasmídeos, e sequências de iniciadores usados neste estudo estão indicados na Tabela 4. Os meios e reagentes químicos foram adquiridos junto à Sigma (St. Louis, MO, USA) ou BD Biosciences (San Jose, CA, USA). P. syringae pv. cepa tomato DC3000 foi usada como a fonte da biblioteca genômica e foi doada pelo Dr. Frederick Ausubel do Massachusetts General Hospital. P. syringae foi cultivada em meio LB (Luria-Bertani) com 50 µg/mL de rifampicina a 30°C. A Pseudomonas putida KT2440 (ATCC 47054) foi adquirida junto à American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) e cultivada em meio LB a 30°C. As cepas de E. coli foram cultivadas em meio 2YT (16 g de triptona, 10 g de extrato de levedura, e 10 g de cloreto de sódio por litro) a 37°C. Conforme necessário, ampicilina e canamicina foram adicionadas ao meio a 100 e 25 µg/mL, respectivamente. Escherichia coli DH10B (F- mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) F80lacZ?M15 ?lacX74 recA1 endA1 araD139 ?(ara, leu) 7697 galU galK À- rpsL nupG) foi usada como a cepa hospedeira para a biblioteca genômica assim como para subclonagem dos genes selecionados (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA). E. coli MG1655 ?uxaC foi fornecida pelo Dr. F. R. Blattner do projeto genoma de E. coli na Universidade de Wisconsin- Madison. Para o ágar mínimo M9, glicose 22 mM, glicuronato, ou glucarato foram usados como fontes de carbono. Os vetores plasmidiais pTrc99A e pTrc99SE foram usados para a construção da biblioteca genômica e como um vetor de expressão para os genes candidatos, respectivamente (Tabela 4). O plasmídeo pTrc99SE foi doado pelo Prof. Seon-Won Kim na Universidade Nacional de Gyeongsang, Coreia. pBluescript (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) foi usado como um vetor de clonagem geral.

Preparação de DNA genômico, construção e varredura da biblioteca genômica de P. syringae.

[00097] A preparação do DNA genômico e os procedimentos gerais de clonagem foram executados conforme descrito em Sambrook et al. (35). O DNA genômico de A. tumefaciens cepa C58 foi adquirido junto à ATCC (ATCC número 33970D). As enzimas de restrição e T4 ligase foram adquiridas junto a New England Biolabs (Beverly, MA, USA). O DNA genômico de P. syringae foi parcialmente digerido com BfuCI, e, então, aplicado em um gel de agarose a 0,8 %. Fragmentos de 2 a 6 Kb foram purificados a partir do gel, e, então, ligados a pTrc99A com extremidades de BamHI defosforiladas. Após a ligação por 2 dias a 4°C, as misturas de reação foram usadas para transformar E. coli DH10B. Os clones transformantes corretos foram coletados e agrupados a partir das placas de ágar, seguido de armazenamento a -80°C. Os agrupamentos de plasmídeos isolados dos agrupamentos das colônias foram usados para transformar E. coli MG1655 ?uxaC para selecionar para a atividade de Udh. As cepas transformadas foram cultivadas em placas de ágar mínimo M9 com glicuronato 22 mM durante 4 dias a 30°C. Os clones sobreviventes das placas foram selecionados por purificação e sequenciamento dos seus plasmídeos. Os resultados do sequenciamento foram comparados com a sequência do genoma de P. syringae pv. cepa tomato DC3000, conforme relatado no GenBank, número de acesso NC_004578 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Construção de vetores de expressão plasmidiais contendo os genes udh

[00098] A amplificação por PCR foi executada com o uso de Pfu Turbo AD conforme descrito pelo fabricante (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Os três genes candidatos de iolE, iolB, e PSPTO_1053 foram amplificados, cada, a partir do DNA genômico com o uso dos iniciadores listados na Tabela 4. Os produtos de PCR foram ligados por extremidades cegas a pBluescriptII digerido com EcoRV, resultando em pBiolE, pBiolB, pBiolEB e pB1053, que foram sequenciados, cada, para confirmar suas identidades. iolE, iolB, e iolEB foram clivadas, cada, por digestão com EcoRI e SalI, e, então, ligadas a pTrc99A digerida pelas mesmas enzimas ao construto pTiolE, pTiolB, e pTiolEB, respectivamente. PSPTO_1053 de pB1053 foi clivado por digestão com NcoI e SacI, e, então, ligado a pTrc99A digerido pelas mesmas enzimas, resultando em pT1053.

[00099] Os supostos genes udh do DNA genômico de A. tumefaciens, P. putida, e P. syringae foram amplificados com o uso dos pares de iniciadores ATudh2-F/ATudh-R, PPudh-F/PPudh-R e PSudh- F/1053-R, respectivamente (Tabela 4). Os produtos de PCR foram ligados por extremidades cegas a pBluescriptII digerido com EcoRV, resultando nos plasmídeos pBATudh2, pBPPudh e pBPSudh. Para construir os plasmídeos pTATudh2, pTPPudh, e pTPSudh, os genes correspondentes foram cortados com EcoRI e SacI a partir de pBATudh2, pBPPudh, e pBPSudh, respectivamente, e foram inseridos nos mesmos sítios de pTrc99SE.

Purificação de proteína e determinação dos parâmetros de cinética

[000100] Os genes udh do DNA genômico de A. tumefaciens, P. putida, e P. syringae foram amplificados com o uso dos iniciadores ATuEQ-F/R, PPuEQ-F/R, e PSuEQ-F/R listados na Tabela 4. Os produtos de PCR foram digeridos com SacI e HindIII e inseridos nos mesmos sítios de pET21b contendo um marcador de His 6X para construir pETATu, pETPPu, e pETPSu, respectivamente (Tabela 4). Estes plasmídeos foram usados para transformar E. coli BL21 (DE3) para uso para expressão de proteínas. As cepas BL21 de E. coli recombinantes foram cultivadas a t 30°C, 250 rpm durante 6 horas após indução com IPTG. A purificação das proteínas foi executada com o uso do sistema de purificação ProBondTM, conforme descrito pelo fabricante (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, EUA). SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio) foi feita conforme descrito em Sambrook et. al. (35). As atividades das enzimas sobre os substratos das proteínas purificadas foram medidas por monitoramento da geração inicial de NADH a 340 nm e temperatura ambiente. A análise cinética em glicuronato e galacturonato foi executada com o uso de 0 a 10 mM de glicuronato ou galacturonato e 1,2 mM de NAD+ em Tris-HCl 100 mM, pH 8,0. A análise cinética em NAD+ foi feita com o uso de 0 a 2 mM de NAD+ e 10 mM de glicuronato em Tris-HCl 100 mM, pH 8,0. Uma série de testes enzimáticos foi conduzida para estimar a atividade inicial como uma função da concentração inicial do substrato. Estes dados foram usados para ajustar os parâmetros do modelo de cinética de Michaelis- Menten, kcat e Km, por regressão por quadrados mínimos não- linear. As análises de regressão por quadrados mínimos não-linear foram feitas através do método de Gauss-Newton conforme implementado com o uso da função intrínseca do Matlab® nlinfit.

Análises de CL-EM e DC para determinação do glucarato produzido a partir de glicuronato por Udh

[000101] A mistura de reação para produzir glucarato a partir de glicuronato por Udh consistiu em glicuronato 20 mM, NAD+ 21,6 mM, tampão de fosfato de sódio 40 mM, pH 8,0, e lisado bacteriano preparado conforme descrito acima. A reação enzimática foi feita pela adições de lisado bruto ou de proteínas purificadas à mistura de reação e incubação à temperatura ambiente durante 60 minutos e, então, foi parada pela adições de hidróxido de sódio 1M. O glucarato foi separado da mistura de reação com o uso de uma coluna empacotada com gel de afinidade de ácido borônico (Affi-gel boronate gel, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) que é capaz de se ligar aos grupos hidroxila cis coplanares adjacentes do glucarato (29). O glicuronato não pode ser ligar ao gel devido aos seus grupos diol trans. Após carregar a coluna Affi-gel com a mistura de reação, a coluna foi lavada com tampão de fosfato de potássio 80 mM-ácido bórico 20mM (pH 7,0) e, então, o glucarato foi eluído pela adição de HCl 0,1 M. O eluente foi neutralizado pela adição de NaOH 5 M e, então, analisado por CL-EM com o uso de Agilent 1100 série LC/MSD (Agilent Technologies, EUA) equipado com uma coluna Aminex HPX-87H (300x7,8 mm, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA ) e um detector de ionização de elétron-spray. Os espectros de massa foram obtidos em ambos os modos de detecção de íons positivo e negativo. Os espectros mostrados na figura 8 são do modo de detecção de íon negativo. Ácido trifluoroacético 0,1% (v/v), pH 2,0, foi usada como a fase móvel em uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, à temperatura ambiente.

[000102] A estereoquímica do glucarato formado a partir de glicuronato foi confirmada pela comparação do seu espectro de dicroísmo circular (DC) com o de um padrão de glucarato autêntico. O DC foi feito em um espectrômetro de DC Aviv Modelo 202 (Aviv Biomedical, Lakewood, NJ). As misturas de reação continham tampão de ácido glicurônico 20 mM, NAD+ 7 mM, fosfato de potássio 100 mM (pH 8,0), e as enzimas purificadas foram preparadas conforme descrito acima. O glucarato foi separado do glicuronato com o uso de gel de afinidade por ácido borônico conforme descrito acima.

Análise computacional incluindo identificação de sequência e análise por alinhamento

[000103] BiocycTM (http://biocyc.org/) foi usado para identificar as vias metabólicas e metabólitos relevantes. As sequências de DNA para P. syringae, P. putida e A. tumefaciens, foram obtidas a partir de NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nl- m.nih.gov/), com os números de acesso NC_004578, NC_002947 e NC_003063, respectivamente. As pesquisas por homologia e domínios conservados foram realizadas com o uso do algoritmo BLAST do NCBI. O gerenciamento e alinhamento da sequência foram executados com o uso do programa Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As análises de alinhamento e filogenética foram feitas com o uso o módulo AlignX do programa Vector NTI.

Números de acesso ao Genbank para as sequências de udh

[000104] A sequência do gene udh de P. syringae foi depositada no GenBank, número de acesso EU377538 (a sequência de ácido nucleico é SEQ ID NO:1; a sequência de aminoácido é SEQ ID NO:2). Os genes correspondentes de A. tumefaciens e P. putida foram depositados com os números de acesso BK006462 (DNA: SEQ ID NO:23; proteína: SEQ ID NO:24) e BK006380 (DNA: SEQ ID NO:25; proteína: SEQ ID NO:26), respectivamente.

Análise enzimática das atividades de Udh

[000105] Os lisados bacterianos para a análise enzimática foram preparados pelo método de congelamento-descongelamento. Cepas de E. coli carregando os genes udh foram cultivadas de um dia para o outro em meio LB contendo IPTG 0,1 mM (isopropil b-D-1-tiogalactopirano- sídeo). Os péletes foram ressuspensos em 1 mg/mL de solução de lisozima e incubados sobre gelo por 30 min. As suspensões foram congeladas em nitrogênio líquido e, então, descongeladas em banho- maria a 37°C. Esta etapa foi repetida cinco vezes. Os lisados celulares foram centrifugados a 14.000 rpm a 4°C durante 15 minutos, e o sobrenadante foi usado para a análise enzimática. As atividades de Udh sobre glicuronato foram medidas pelo monitoramento da geração de NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo, reduzido) a 340 nm (38). A mistura de reação era compreendida de glicuronato 2,5 mM, NAD+ (nicotinamida adenina dinucleotídeo) 0,9 mM, e tampão de fosfato de sódio 100 mM. A reação foi iniciada pela adição de lisado à mistura de reação à temperatura ambiente, e monitorada. Para a determinação do pH ótimo para a atividade de Udh, a mistura de reação foi ajustada para pH 6,5 a 9,9 pela adição de soluções de HCl ou NaOH. A concentração total de proteína foi determinada com o uso do método de Bradford (Bradford (1976) Anal Biochem 72:248-54). As atividades específicas foram indicadas como unidades por miligramas de proteína total (1U = 1 µmol NADH gerado/min). Os produtos químicos foram adquiridos junto à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Resultados Clonagem do gene udh a partir de Pseudomonas syringae

[000106] A varredura estabelecida para identificar o gene correspondente à atividade de Udh em P. syringae utilizou uma cepa mutante de E. coli MG1655. Uma deleção de uxaC evita o crescimento em glicuronato enquanto que retém a capacidade de crescer em glucarato como única fonte de carbono. Uma vez que Udh catalisa a conversão de glicuronato em glucarato (3, 38), clones de E. coli MG1655?uxaC carregando os genes udh de uma biblioteca genômica de P. syringae deveriam crescer em glicuronato como a única fonte de carbono. E. coli DH10B e pTrc99A foram usadas como a cepa hospedeiro e vetor plasmidial, respectivamente, para a construção inicial da biblioteca genômica de P. syringae. Um agrupamento de plasmídeos da biblioteca foi preparado a partir do agrupamento de clones de E. coli DH10B e, então, usado para transformar a cepa de ?uxaC. Os clones de ?uxaC transformados foram incubados em ágar mínimo M9 contendo glicuronato durante 4 dias a 30°C.

[000107] De dez placas de ágar, 28 clones foram selecionados para varredura adicional, cada um dos quais contendo um fragmento inserido de 2 a 5 kb. Destes, 8 clones com insertos de diferentes tamanhos foram sequenciados para comparação com a sequência do genoma de P. syringae (número de acesso ao Genbank NC_004578). Seis destes clones incluíram iolE, iolB, ou ambos, enquanto que um clone continha a fase aberta de leitura PSPTO_1053 não designada. O clone final incluiu uma quimera das regiões de iolEB e PSPTO_1053. As fases abertas de leitura dos fragmentos da biblioteca foram amplificados por PCR e inseridos nos vetores de expressão pTrc99A, produzindo os plasmídeos pTiolE, pTiolB, pTiolEB e pT1053. Clones contendo estes vetores foram usados para determinar qual gene correspondia à atividade de uronato desidrogenase. E. coli MG1655, o derivado de ?uxaC, e quatro clones de ?uxaC transformados com os genes candidatos foram incubados em ágar mínimo M9 contendo glicuronato como a única fonte de carbono. Cepas selvagens, de ?uxaC (pTiolB), ?uxaC (pTiolEB), e ?uxaC (pT1053) cresceram em água M9- glicuronato, enquanto que as cepas de ?uxaC (pTrc99A) e ?uxaC (pTiolE) não. Portanto, iolB e PSPTO_1053 foram responsáveis pelo crescimento em glicuronato como a única fonte de carbono, identificando-as como genes udh candidatos.

[000108] Para discriminar adicionalmente entre os dois genes candidatos, os plasmídeos pTiolB e pT1053 foram usados para transformar E. coli DH10B para expressar os genes recombinantes. Os clones resultantes foram cultivados em meio LB com IPTG 0,1 mM. A análise da atividade de Udh nos lisados brutos destes dois clones sugeriu que a cepa carregando pT1053 tem atividade de Udh, mas não pTiolB (figura 6). O teste empregou glicuronato como um substrato e monitorou a produção de NADH a 340 nm. Consequentemente, o gene de PSPTO_1053 de 828 bp foi deduzido como codificando uronato desidrogenase. O gene é, daqui em diante, chamado de udh e foi registrada no Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) como número de acesso EU377538 (a sequência de ácido nucleico é SEQ ID NO:1; a sequência de aminoácido é SEQ ID NO:2).

Clonagem e identificação dos genes udh a partir de P. putida e A. tumefaciens

[000109] A sequência de proteína traduzida de udh de P. syringae foi analisada com o uso de BLASTP fornecido pelo NCBI (http://www.n- cbi.nlm.nih.gov/blast/) para identificar supostos homólogos. A atividade de Udh de A. tumefaciens foi estudada anteriormente (5, 6, 43). A tradução da fase aberta de leitura Atu3143 de A. tumefaciens teve a maior identidade de sequência de 47,8% e foi considerada uma candidata para um Udh homólogo. Também foi observado que outra fase aberta de leitura candidata, PP1171 de Pseudomonas putida KT2440, tinha alta similaridade com Udh de P. syringae, com uma identidade de sequência de 75,6%. Atu3143 e PP1171 foram amplificados por PCR a partir de seus respectivos genomas e, junto com udh de P. syringae, foram integrados no vetor plasmidial pTrc99SE para criar os plasmídeos pTATudh2, pTPPudh, e pTPSudh, respectivamente, para comparação entre as atividades relativas das proteínas recombinantes expressas. Os clones de DH10B transformados foram cultivados em LB com ou sem IPTG 0,1 mM antes de preparar os lisados brutos para executar a análise enzimática (figura 7). Estes testes confirmaram uma atividade de consumo de NAD+ na presença de glicuronato como um substrato para as proteínas recombinantes de A. tumefaciens e P. putida, de forma semelhante ao anteriormente obtido com P. syringae. Os dois genes udh de A. tumefaciens e P. putida também foram depositados com os números de acesso BK006462 (DNA: SEQ ID NO:23; proteína: SEQ ID NO:24) e BK006380 (DNA: SEQ ID NO:25; proteína: SEQ ID NO:26), respectivamente.

Purificação e caracterização de Udh recombinante, e análise do produto de reação

[000110] As reações enzimáticas usando lisados de E. coli bruto contendo o gene udh de P. syringae confirmaram a presença de uma atividade que utilizou glicuronato como um substrato, com a velocidade de reação proporcional a concentração de glicuronato para cargas de substrato baixas (dados não mostrados). A atividade também utilizou NAD+ mas não NADP+ como um cofator (dados não mostrados). Estes resultados indicaram que o substrato foi oxidado. Um exame da estrutura do glicuronato sugere dois possíveis pontos de oxidação: a conversão de um álcool em uma cetona, ou a conversão do aldeído em ácido carboxílico, a última reação produzindo glucarato. A diferença nestes dois produtos deve ser evidente a partir de um espectro de massa, já que o primeiro resultaria em uma diferença de massa de -2 em relação ao substrato, enquanto que o último produziria uma diferença de massa de +16. Para confirmar o produto da reação enzimática como glucarato, uma amostra foi analisada por CL-EM. Os espectros do eluente separados da reação enzimática e um padrão glucarato estão de acordo, sugerindo glucarato como o produto da reação de Udh (figura 8).

[000111] Cada um dos três genes udh foram expressos em E. coli com marcadores de His 6X e purificados para determinar os parâmetros cinéticos das enzimas correspondentes. Enzimas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE para confirmar o peso molecular do monômero e estimar a pureza (figura 9). Udh de P. syringae e P. putida tinham peso molecular de aproximadamente 30 KDa, o que é consistente com a tradução do gene clonado e com relatos anteriores (38). O Udh de A. tumefaciens é levemente maior, a 32 KDa.

[000112] As preparações purificadas foram usadas para determinar os parâmetros de cinética, kcat e Km, para cada uma das enzimas. Glicuronato e galacturonato foram usados como substratos, e a concentração do cofator de NAD+ também foi variada para determinar o Km correspondente (Tabela 5). As medições de kcat obtidas pela variação da concentração do cofator estavam dentro de 20% dos valores obtidos com o uso de glicuronato como o substrato (dados não mostrados). Em todos os casos, o kcat foi maior para glicuronato do que para galacturonato. Foi observado que a enzima de A. tumefaciens teve a maior constante de taxa usando glicuronato como substrato (kcat = 1,9 x 102 s-1), que foi mais de 2 vezes maior do que a taxa para as enzimas de Pseudomonas. Entretanto, a constante de Michaelis (afinidade) foi menor para o galacturonato em todos os casos, com a menor Km, 0,04 mM, encontrada para a enzima de P. syringae usando galacturonato como substrato. As constantes de taxa de primeira ordem, kcat/Km, são maiores para o galacturonato como substrato, com a maior diferença entre glicuronato e galacturonato observada para P. syringae.

[000113] As respostas das atividades enzimáticas a alterações no pH e temperaturas também foram investigadas (figura 10). Um pH ótimo de 8,0 foi observado para ambas as enzimas de A. tumefaciens e P. syringae, embora a atividade estivesse relativamente inalterada entre pH~7 e pH~8 para Udh de P. syringae (figura 10a). Este comportamento do pH é consistente com relatos anteriores para Udh de P. syringae (3). A enzima de P. putida exibiu maior atividade em pH~7,0. Em geral, as atividades enzimáticas variaram aproximadamente 10% entre pH~5 e pH~8, com quedas significativas na atividade observadas para valores de pH maiores que 8 para todas as três enzimas.

[000114] O impacto da temperatura foi avaliado de duas maneiras. Primeiro, a estabilidade térmica foi examinada por expor as preparações de enzima a várias temperaturas durante 30 minutos e, então, realizar o teste enzimático sob condições padrão. Foi observado que Udh de A. tumefaciens exibiu uma estabilidade térmica significativamente maior do que qualquer uma das enzimas de Pseudomonas (figura 10b). A atividade permaneceu próximo de 80% do máximo após exposição da preparação de A. tumefaciens a 37 °C, enquanto que as atividades correspondentes para as duas outras enzimas foram abaixo de 20% do máximo. Os perfis de estabilidade para ambas as enzimas de Pseudomonas foram similares entre si. Finalmente, a atividade enzimática foi avaliada por testes conduzidos sob temperaturas crescentes. Estas atividades seguiram uma tendência geral de aumentar a atividade com o aumento da temperatura entre 4 e 42 °C, o que é consistente com uma dependência do tipo Arrhenius da constante da taxa catalítica sobre a temperatura (figura 10c).

[000115] Para a caracterização final dos produtos destas reações, o gel de afinidade ao ácido borônico foi usado para isolar o suposto glucarato produzido a partir de todas as três enzimas em reações in vitro com o uso de proteínas purificadas. As amostras dos três produtos foram, então, submetidas à análise de dicroísmo circular (DC) para examinar a estereoquímica dos compostos. Todos os três espectros estavam em conformidade com um padrão de glucarato, confirmando a identidade do produto como ácido glicárico e a identidade dos três genes como os que codificam uronato desidrogenase (dados não mostrados).

Discussão

[000116] A uronato desidrogenase (Udh) catalisa a primeira etapa de uma via de oxidação para o catabolismo do aldoexuronato em bactérias. Em bactérias, foram relatados apenas estudos limitados de Udh em P. syringae e A. tumefaciens. Além disso, Udh foi ainda mais raramente estudado em eucariotos. Uma sequência de Udh foi relatada na uva do vinho Vitis vinifera, onde ela foi identificada como galacturonato redutase (EC 1.1.1.203; número de acesso BRENDA A1Y2Z0, número de acesso ao Genbank DQ843600). Foi sintetizado este gene com uso de códons otimizado para expressão em E. coli (DNA 2.0, Menlo Park, CA), e expressada a proteína recombinante. Entretanto, nenhuma atividade referente ao Udh foi observada ao usar NAD+ ou NADP+ como um cofator (dados não mostrados). Um alinhamento desta sequência com o Udh de P. syringae identificado no recente trabalho revela apenas 10% de identidade entre eles. Não se pode desconsiderar a possibilidade de que a enzima de V. vinifera poderia não ser funcionalmente expressa em E. coli; entretanto, com base no alinhamento, Concluiu-se que a sequência relatada de V. vinifera não é uronato desidrogenase ou é uma versão muito divergente da enzima.

[000117] Uma biblioteca do tipo shotgun de P. syringae foi introduzida em E. coli ?uxaC para selecionar o gene udh que codifica uronato desidrogenase, e os genes de PSPTO_1053 e iolB foram identificados e selecionados como possíveis candidatos a Udh. Pela análise enzimática, PSPTO_1053 foi identificado como sendo o gene udh que codifica uronato desidrogenase. Em um mutante de deleção de uxaC de E. coli, onde o catabolismo de glicuronato é abolido, o glicuronato foi convertido em glucarato pela uronato desidrogenase e, então, degradado em piruvato ou 2- fosfoglicerato a partir do qual ele pode ser usado como uma fonte de energia (27, 33). Em E. coli ?uxaC, a introdução do gene iolB também permitiu o crescimento em ágar M9 contendo glicuronato como a única fonte de carbono, mas este gene não possuía atividade de Udh. IolB foi anteriormente relatada como uma proteína relacionada ao catabolismo de mio-inositol em Bacillus subtilis e Lactobacillus casei (41, 42). IolB pertence ao operon iol usado para a degradação de mio-inositol em Bacillus subtilis e converte 5- desoxiglicuronato em 2-desoxi-5-ceto-D-gluconato (42). A IolB de P. syringae tem cerca de 48% de homologia à proteína de B. subtilis. O mecanismo preciso do consumo de glicuronato em células que possuem IolB na nossa varredura não está claro. Presumivelmente, esta proteína é capaz de converter glicuronato em um composto análogo que é compatível com o metabolismo de E. coli.

[000118] Os loci do gen udh nos genomas de P. syringae, P. putida, e A. tumefaciens são mostrados na figura 11. Os loci de udh de P. syringae e P. putida possuem cerca de 1.150 e 1.346 kbp, respectivamente, enquanto que o lócus de udh em A. tumefaciens tem cerca de 150 kbp. Em A. tumefaciens, os genes, Atu3140, 3141, 3142, e 3145 adjacentes a udh são kdgD, kduD, kduI, e kdgF, respectivamente, e estão relacionados com a degradação de pectina. A pectina é um heteropolissacarídeo, que consiste em resíduos de D- galacturonato a-1,4-ligados, que é derivada de paredes celulares de plantas. A degradação da pectina e a absorção por bactérias foi bem pesquisada em pectobactéria fitopatogênica incluindo Erwinia chrysanthemi e Erwinia carotovora por Hugouvieux-Cotte-Pattat et al. (12-14). Em E. chrysanthemi, a pectina é degradada por genes do operon kdu ou kdg para usar como uma fonte de energia. Em P. syringae e P. putida, os genes adjacentes a udh são identificados como transportadores de dicarboxilato e porina TRAP (periplasmáticos independentes de ATP tripartidos). Dentre estes genes, a proteína porina (PSPTO_1054, PP_1173) é conhecida por estar relacionada com a absorção de oligogalacturonato derivado da degradação de pectina (34). A uronato desidrogenase em bactérias patogênicas de plantas poderia, portanto, funcionar na utilização de um hexuronato, derivado da pectina da parede da célula de planta hospedeira, que é subsequentemente convertido em hexarato.

[000119] O alinhamento das três uronato desidrogenases de P. syringae, P. putida, e A. tumefaciens e a análise filogenética dos seus homólogos foram feitos (figura 12). As sequências das enzimas mostram dois motivos de sequência primários, YxxxK e GxxGxxG, relacionados aos domínios conservados (figura 12a). O motivo YxxxK está localizado entre Tyr145 e Lys149 de Udh de P. syringae, e é o motivo primário do domínio da 3-alfa/beta hidroxiesteroide desidrogenase (11, 37). O motivo GxxGxxG localizado na Gly18-24 de Udh de P. syringae é similar ás dobras de Rossman, GxxxG ou Gx1-2GxxG, que foram descobertas nos domínios de ligação de NAD+ (20). Na análise filogenética, a uronato desidrogenase mostra homologias com epimerase/desidratase dependente de NAD, epimerase do açúcar de nucleotídeos, 3-beta hidroxiesteroide desidrogenase/isomerase, e desidrogenase/redutases de cadeia curta em archaea e bactérias incluindo proteobactérias, cianobactérias, bactérias verdes sem enxofre, e bactérias Gram-positivas, assim como homologia com epimerase do açúcar de nucleotídeos em alguns eucariotos, incluindo fungos, plantas, e seres humanos (figura 12b). As três uronato desidrogenases pesquisadas neste estudo estão presentes em alfa ne gama-proteobactérias e suas homologias são relativamente próximas a Archaea, Halorubrum lacusprofundi e Natronomonas pharaonis, e o fungo, Aspergillus niger.

[000120] Foram selecionados e sequenciados três uronato desidrogenases de A. tumefaciens, P. putida, e P. syringae, que podem converter eficazmente glicuronato em glucarato. Enquanto essa enzima é importante para o catabolismo de ácidos urônicos em vários tipos de bactérias, ela pode também ser útil no desenvolvimento de vias biossintéticas para a produção de ácidos aldáricos, tais como ácido glicárico. O glucarato é o produto final do metabolismo do açúcar de nucleotídeos e ele é encontrado naturalmente em mamíferos e plantas (21, 39). O glucarato e seus derivados, tais como glucaro-1,4-lactona, foram estudados anteriormente como compostos detoxificantes e anticarcinogênicos naturais (8, 21, 36, 39), assim como um bloco de construção para a síntese de polímeros (16). Ele também foi designado como um produto químico de "alto valor agregado" a ser produzido a partir da biomassa (40). Atualmente, o glucarato é sintetizado a partir de glicose pela oxidação química com o uso de um oxidante forte como ácido nítrico ou óxido nítrico (25). Foi usado o udh de P. syringae identificado neste estudo por produzir corretamente ácido glicárico a partir de uma via sintético em E. coli (26). Referências para o Exemplo 2 1. Amann, E., B. Ochs, and K. J. Abel. 1988. Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli. Gene 69:301-315. 2. Ashwell, A., A. J. Wahba, and J. Hickman. 1958. A new pathway of uronic acid metabolism. Biochim Biophys Acta 30:186-187. 3. Bateman, D. F., T. Kosuge, and W. W. Kilgore. 1970. Purification and properties of uronate dehydrogenase from Pseudomonas syringae. Arch Biochem Biophys 136:97-105. 4. Buell, C. R., V. Joardar, M. Lindeberg, J. Selengut, I. T. Paulsen, M. L. Gwinn, R. J. Dodson, R. T. Deboy, A. S. Durkin, J. F. Kolonay, R. Madupu, S. Daugherty, L. Brinkac, M. J. Beanan, D. H. 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[000121] Os versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de verificar, com o uso de não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção aqui descritas. Estes equivalentes se destinam a estar abrangidos pelas seguintes reivindicações.

[000122] Todas as referências citadas na presente invenção estão aqui incorporadas a título de referência em suas totalidades.

Claims

1. Microrganismo Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, ou Pichia pastoris transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende DNA heterólogo que: expressa de forma recombinante um gene Udh de Pseudomonas syringae, Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas putida, Thermobispora bispora, Polaromonas naphthalenivorans ou Chromohalobacter salixigens que codifica uronato desidrogenase; expressa de forma recombinante um gene MIOX de murino, Arabidopsis thaliana, Cryptococcus neoformans, ou Talaromyces marneffei que codifica mio-inositol oxigenase; e expressa de forma recombinante um gene Ino1 de Saccharomyces cerevisiae, Hc31 de Haemonchus contortus, Gv12 de Gardnerella vaginalis, Ac5 de Aspergillus clavatus, Cg7 de Candida glabrata, Nn17 de Nocardia nova ou Pb19 de Prevotella buccae que codifica mio-inositol 1-fosfato sintase, e em que o microrganismo transgênico produz ácido glicárico.

2. Microrganismo transgênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os genes que codificam uronato desidrogenase, mio-inositol oxigenase e/ou mio-inositol 1- fosfato sintase são expressos em plasmídeos ou são integrados no genoma do microrganismo transgênico.

3. Método para produzir ácido glicárico, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar o microrganismo transgênico como definido na reivindicação 1 ou 2 para produzir ácido glicárico, opcionalmente compreendendo, ainda, recuperar o ácido glicárico das células.

4. Método para produzir ácido glicárico, caracterizado pelo fato de que compreende: modificar geneticamente uma célula de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, ou Pichia pastoris para expressar de forma recombinante: uma Udh uronato desidrogenase de Pseudomonas syringae, Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas putida, Thermobispora bispora, Polaromonas naphthalenivorans ou Chromohalobacter salixigens; um gene MIOX de murino, de Arabidopsis thaliana, Cryptococcus neoformans, ou Talaromyces marneffei que codifica uma mio-inositol oxigenase; e um gene Ino1 de Saccharomyces cerevisiae, Hc31 de Haemonchus contortus, Gv12 de Gardnerella vaginalis, Ac5 de Aspergillus clavatus, Cg7 de Candida glabrata, Nn17 de Nocardia nova ou Pb19 de Prevotella buccae que cofdifica uma mio-inositol 1-fosfato sintase, cultivar uma população das ditas células, e coletar ácido glicárico a partir da população das células que foram geneticamente modificadas para produzir ácido glicárico.