BRPI0911221B1

BRPI0911221B1 - Métodos para determinar as proporções relativas de componentes e para proporcionar uma mistura líquida com ph e força iônica predefinidos, procedimento de triagem de alta produtividade, processo e sistema de cromatografia líquida, e, dispositivo de preparação de tampão.

Info

Publication number: BRPI0911221B1
Application number: BRPI0911221-9A
Authority: BR
Inventors: Lennart Björkesten; Enrique Carredano; Gunnar Malmquist; Gustav Rodrigo; Nils Stafström
Original assignee: Ge Healthcare Bio-Sciences Ab
Priority date: 2008-04-21
Filing date: 2009-04-20
Publication date: 2019-05-14
Also published as: CN102016567B; WO2009131524A1; EP2269055A4; EP2269055B1; US9446329B2; BRPI0911221B8; EP2269055A1; ES2374210T3; US20110039712A1; JP5497005B2; JP2011518328A; BRPI0911221A2; ATE533048T1; DK2269055T3; CN102016567A

Abstract

métodos para determinar as proporções relativas de componentes e para proporcionar uma mistura líquida com ph e força iônica predefinidos, procedimento de triagem de alta produtividade, processo 5 e sistema de cromatografia líquida, e, dispositivo de preparação de tampão um método de determinar as proporções relativas de componentes de pelo menos um de cada: um tampão; um ácido ou uma base; um solvente; e opcionalmente um sal, para proporcionar uma mistura líquida com ph e força iônica predefinidos, sendo que as proporções relativas dos componentes são determinadas usando-se a equação de debye-hückel, em que o parâmetro do tamanho do íon a na equação de debye-hückel é determinado como o tamanho médio ponderal do íon de todas as espécies que contribuem para a força iônica da mistura líquida, e sendo que a força iônica de cada espécie é usada como parâmetro de ponderação. o presente método também é aplicável em um método para proporcionar uma mistura líquida. adicionalmente proporciona-se aqui um dispositivo de preparação de tampão.

Description

“MÉTODOS PARA DETERMINAR AS PROPORÇÕES RELATIVAS DE COMPONENTES E PARA PROPORCIONAR UMA MISTURA LÍQUIDA COM PH E FORÇA IÔNICA PREDEFINIDOS, PROCEDIMENTO DE TRIAGEM DE ALTA PRODUTIVIDADE, PROCESSO E SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA, E, DISPOSITIVO DE PREPARAÇÃO DE TAMPÃO”

Campo técnico

A presente invenção refere-se a um método para gerar uma mistura líquida com pH e força iônica controlados, e também a um dispositivo aplicável em um método do tipo referido. A invenção é de interesse geral em qualquer situação onde se requer preparação precisa do tampão.

Fundamentos

A obtenção de líquidos com composição precisamente conhecida é importante em muitos casos, como quando se usa tampões apresentando um pH especificado e opcionalmente também força iônica. Adicionalmente, em muitos casos, a composição do líquido deveria ser não só conhecida precisamente e controlada em cada momento, mas também deveria variar com o tempo de uma maneira precisa e controlada.

Uma aplicação em que a composição de líquidos é de importância capital quando eluição, i.e. a liberação de moléculas-alvos isoladas da matriz de cromatografia, é realizada por eluição de gradiente. Por exemplo, na cromatografia de troca de íon, que é um método frequentemente usado para a separação e purificação de biomoléculas, usa-se por vezes eluição de gradiente, p. ex., para encontrar as condições ótimas de eluição que permitem realizar o projeto de um processo industrial usando eluição em etapas. Como é de conhecimento geral, o eluente que contém um sal inerte e o gradiente é realizado variando-se a concentração deste sal. É de conhecimento geral que uma alteração na concentração salina, i.e. força iônica também afeta o pH, e foi bem documentado que o pH e a força iônica do eluente são os dois

Petição 870190000609, de 03/01/2019, pág. 11/17 uma solução elegante, mas resulta em ocupação de uma dispendiosa infraestrutura de automação durante horas para uma tarefa relativamente simples no laboratório de automação bem equipado. Adicionalmente, exige-se um enorme investimento para que o pequeno laboratório obtenha vantagem da solução TECAN.

Assim, também há uma necessidade de um dispositivo dispensador automático, como uma unidade independente, que pode ser usada como uma estação de trabalho juntamente com soluções de automação, p. ex., para reduzir a carga de trabalho em uma infraestrutura de automação primária. Breve descrição da invenção

Um aspecto da presente invenção consiste em proporcionar um método de controle preciso e exato do pH e da força iônica de uma mistura líquida. Em resumo, isto pode ser obtido proporcionando-se um método de preparar uma mistura líquida, como um tampão, sendo que referido método considera ambos, tamanho e carga, dos íons orgânicos e também inorgânicos.

Um objeto adicional da invenção consiste em proporcionar um método aperfeiçoado de preparação de tampão, sendo que a composição exata é calculada primeiro, e o tampão é preparado subsequentemente em uma única etapa.

Um aspecto específico da invenção consiste em proporcionar as ferramentas para preparação de tampão, sendo que há uma faixa de pH garantida para cada tampão respectivo por meio de cálculo da capacidade do tampão.

Outro aspecto da presente invenção consiste em proporcionar um método de definir a composição de uma mistura líquida em termos de espécie de tampão, concentração de tampão e/ou concentração salina com base em um pH e/ou força iônica desejados, e capacidade do tampão. Assim, partindo de um pH desejado de uma mistura líquida, e opcionalmente também

Petição 870190000609, de 03/01/2019, pág. 12/17 parâmetros mais importantes que controlam a seletividade de separações de proteínas em resinas de troca de íon.

A Patente U.S. n° 5.112.949 (Vukovich) refere-se a um sistema automatizado para realizar uma separação usando um gradiente. Um problema com referidos sistemas manuais e automatizados com gradientes que se alteram gradualmente é que se o gradiente for tomado raso, então demora-se bastante tempo para realizar a eluição, e se o gradiente for tomado íngreme então, ao invés de cada biomolécula de interesse ser eluída, por sua vez a eluição das biomoléculas superpõe-se. Isto leva ao fato de que várias espécies de biomoléculas são recolhidas em cada fração, ao invés de cada espécie de biomolécula ser recolhida por sua própria fração separada.

A US 7.138.051 (De Lamotte) refere-se a um sistema de cromatografia, método e programa [software} para a separação de biomoléculas. Mais especificamente, esta patente refere-se à otimização da separação de biomoléculas eluídas de uma coluna de cromatografia em que a concentração de um componente adicionado a um tampão de eluição é variada de modo a formar uma solução tampão de eluição com concentração gradualmente variável de referido componente adicionado.

Okamoto (Hirokazu Okamoto et al, Pharmaceutical Research. vol. 14, n°. 3, 1997: Theory and Computer Programs for Calculating Solution pH, Bujfer formula, and Bujfer Capacity for Multiple Component System at a Given Força iônica and Temperature [Teoria e programas de computador para calcular pH de solução, fórmula de tampão, e capacidade do tampão para sistema de múltiplos componentes a uma dada força iônica e temperatura]) descreveram programas de computador para calcular pH da solução, fórmula do tampão e capacidade do tampão para uma dada força iônica e temperatura. No entanto, as soluções tampão preparadas por Okamoto et al mostram uma variação do pH que aumentam com o incremento da concentração salina, mesmo a baixas concentrações, como 0,3 M. Assim, os métodos de Okamoto não são suficientes para proporcionar soluções tampão com pH constante que também contêm sal.

A via tradicional de formação de gradiente envolveu a preparação cuidadosa de eluentes compreendendo sais inertes e também tampões com pH predeterminado para efetuar o gradiente de força iônica a pH constante. A otimização da separação das proteínas foi realizada alterando-se a rampa do gradiente de sal inerte e/ou substituindo-se o sistema tampão por um com um pH diferente.

Na técnica anterior precoce, a otimização incluiu a preparação de numerosas soluções tampão com concentrações salinas e pH predeterminados, que precisaram ser meticulosamente tituladas para que as separações fossem reproduzíveis. Obviamente, referidos métodos são demorados e também inconvenientes.

Métodos para o cálculo do pH do tampão a moderadas forças iônicas (até 100 mM) são documentados na literatura e baseiam-se na solução algébrica ou por computador das equações de equilíbrio entre as várias espécies carregadas e não-carregadas na solução tampão.

Para uma espécie básica particular (que pode ser uma base B ou uma base conjugada A') em equilíbrio com uma espécie ácida correspondente (que pode ser um BH ácido conjugado ou um HA ácido, respectivamente) o equilíbrio pode ser escrito tf + espécie básica < = > espécie ácida ⁺ Eq 1.1

A constante de equilíbrio correspondente K_a é definida como

K_a = (H⁴) (espécie básica)/ (espécie ácida⁺ ) Eq 1.2 sendo que o parêntese indica as atividades de cada espécie. Considerando os logaritmos de ambos os ladofs] da Eq. 1.2 e resolução para o pH definido como -log(H⁺) obtém-se pH = pKa + log {(espécie básica)/(espécie ácida)} Eq 1.3 que por vezes é conhecida como a equação de Henderson

Hasselbach. A razão porque as atividades devem ser usadas na Eq 1.2 ao invés das concentrações correspondentes é que, devido principalmente a interações eletrostáticas, os íons envolvidos tendem a se tomar blindados do ambiente. No entanto, embora medições de pH sejam observações diretas da atividade dos prótons, são antes as concentrações e não as atividades correspondentes dos íons do tampão que são observadas, por exemplo, para pesagem, pipetagem ou bombeamento de suas quantidades e volumes. A atividade de cada íon está relacionada com a concentração correspondentes por meio do coeficiente de atividade φ (espécie ) = φ [espécie] Eq 1.4

No estado ideal de diluição infinita, φ toma-se 1 e a atividade de cada íon toma-se igual à concentração correspondente. No entanto, em casos reais, a força iônica é diferente de 0 e os coeficientes de atividade das diferentes espécies tomam-se menores que 1.

Um modelo bem estabelecido para estes desvios foi desenvolvido na assim-chamada teoria de Debye Hückel, conhecida como -log φ = (AZ²1⁰’⁵)/(1+0,33*10⁸ a I⁰’⁵) Eq 1.5 sendo que A é uma constante ou, ao invés, um parâmetro dependente da temperatura -0,51. Usando dados bem conhecidos, o valor de A pode ser calculado precisamente como A=0,4918+0,0007*T + 0,000004*T^A2 sendo que T é a temperatura em graus Celsius. Z é a carga do íon e a capacidade a, os raios dos íons hidratados (em Â), é descrito como a distância média de aproximação dos íons, positivos ou negativos” no documento original de Debye e Hückel.

Em uma tabela apresentada no artigo discutido acima por Kielland, este parâmetro, também conhecido como o parâmetro do tamanho do íon é mostrado como sendo diferente para diferentes espécies iônicas. I é a força iônica

1=½ Z(CjZ²) (inclui todos os íons) Eq 1.6

Cj é a concentração e Zj é a carga de íon presente na solução (em unidades de carga eletrônica).

Inserindo Eq 1.4 em Eq 1.3 obtém-se o pH em termos das concentrações em lugar das atividades:

pH = pK_a + log {q>b[espécie básica]/(p_a[espécie ácida]} = pK_a+ log (pb - log <p_a+ log {[espécie básica]/[espécie ácida]} = pKa’ + log {[espécie básica]/[espécie ácida]} Eq 1.7 sendo que pKa’= pK_a+log (p_b - log (p_a Eq 1.8 é um valor de pK_a aparente que permite o uso dos valores mensuráveis das concentrações das diferentes espécies de tampão. O valor de pKa’ pode ser calculado inserindo-se Eq 1.5 na Eq 1.8 dando pKa’ =pK_a + (AZ_a ²I°’⁵⁾/(1+O,33*1O⁸ aa I⁰’⁵)- (AZb²I⁰’⁵)/(1+0,33*10⁸ a_b I^o’⁵) Eq 1.9 sendo que a introdução dos subscritos a e b foi necessária para especificar os parâmetros correspondentes ao ácido e à base, respectivamente. Assim,

Z_a= Carga da espécie ácida

Z_b = Carga da espécie básica a _a = parâmetro do tamanho do íon da espécie ácida a _b = parâmetro do tamanho do íon da espécie ácida

Aplicada aos cálculos de pH, a teoria de Debye-Hückel resulta na modificação dos valores de pK_a dos tampões (conhecidos como os valores de pKa termodinâmicos) a valores de pKa’ correspondentes dados pela Eq 1.9. A maior parte dos parâmetros na Eq 1.9 são simples de estimar. O parâmetro mais desafiador é a.

Guggenheim & Schindler (ver Guggenheim EA & Schindler TD. (1934) J. Phys. Chem. 33. 533), sugeriram uma aproximação do parâmetro a ajustado a 3 Â para todas as moléculas tampão, levando à fórmula um tanto simplificada pKa’= pK_a + (AZ_a ²1°’⁵⁾/(l+ I^o’⁵) -(AZ_b ²I°’⁵⁾/(l+1⁰’⁵) Eq 1.10

A Eq 1.10 acima é a fórmula para correção da força iônica usualmente encontrada na literatura. Por vezes adiciona-se termos de correção no lado direito desta equação para compensar a perda de precisão a forças iônicas mais elevadas para vários tampões. No entanto, a precisão obtida desta forma é baixa quando a força iônica é tão alta quanto 1M, que se encontra dentro de faixas comumentes usadas em eluição de gradiente, por exemplo, na cromatografia de troca de íon e HIC.

Kielland (Jacob Kielland em Activity Coefficients of Ions in Aqueous Solutions, setembro de 1937) estudou coeficientes de atividade de íons em líquidos e proporciona uma tabela estendida de coeficientes de atividade iônica, considerando o diâmetro dos íons hidratados. Os dados apresentados por Kielland para o parâmetro do tamanho do íon hidratado a\ foi obtido usando quatro diferentes modelos: o modelo de Bonino que considera o raio cristalino e deformabilidade; a bem conhecida equação 108¾ = 1 82zí /1«, que considera mobilidades iônicas; a sua modificação empírica por Brull, e finalmente o método de deficiência de entropia de Ulrich. Usou-se valores médios arredondados de referidos quatro modelos para obter os dados reportados naquele estudo. Os valores de a, apresentados por Kielland apresentam uma variação substancial, de 2,5 até 11, e sugere-se modelos nãogerais para o coeficiente de atividade com base nesta variação dependente da natureza dos íons, i.e. uma equação para íons inorgânicos e uma equação diferente para íons orgânicos.

A US 6.221.250 (Stafstrõm) refere-se a um método de preparar misturas líquidas que usa vantajosamente a aproximação discutida acima do parâmetro a. Mais especificamente, o método descrito de preparar uma mistura compreende os seguintes componentes: (i) uma ou mais espécie tampão; (ii) um ácido ou, altemativamente, uma base; (iii) opcionalmente um sal; e (iv) um solvente. As proporções dos componentes de (i) a (iv) são variadas concomitantemente de tal forma a considerar a interrelação do pH e da força iônica da mistura líquida para se obter em cada momento um pH préselecionado da mistura, e o método baseia-se no uso de uma equação de Guggenheim-Schindler modificada e repetitiva (1.10, abaixo) sendo que se usa fatores de correção específicos para tampão para se atingir pH constante ao longo de um gradiente. Assim, em determinadas situações, uma desvantagem deste método pode ser que, sendo necessário introduzir um novo tampão; toma-se necessário realizar novos cálculos.

Outra aplicação em que é essencial preparar misturas líquidas com pH e força iônica controlados é na triagem de alta produtividade (HTS), que é um método para experimentação científica frequentemente usado na descoberta de drogas, mas também relevante aos campos da biologia e química. Por meio de uma combinação de robótica moderna, processamento de dados e programa de controle, dispositivos de manuseio líquido e detectores sensíveis, a HTS permite ao pesquisador conduzir efetivamente milhões de testes bioquímicos, genéticos e farmacológicos dentro de um curto período. Por meio deste processo é possível identificar rapidamente compostos ativos, anticorpos ou genes que modulam uma via biomolecular particular. Os resultados destes experimentos podem, p. ex., proporcionar pontos de partida para o projeto de drogas e para a compreensão da interação ou o papel de um processo bioquímico particular na biologia. A automação é um elemento importante na utilidade da HTS. Um robô especializado é frequentemente responsável por grande parte do processo ao longo do tempo de vida de uma única placa de ensaio, da criação até a análise final. Usualmente um robô para HTS pode preparar e analisar muitas placas simultaneamente, acelerando ainda mais o processo de coleta de dados. No entanto, para que estes robôs funcionem com precisão, novamente é essencial a preparação de misturas líquidas, como tampões apresentando pH precisamente controlado e também força iônica precisamente controlada.

Uma aplicação na área de HTS que ganha cada vez mais em valor é o desenvolvimento de processo de alta produtividade (HTPD, high throughput process developmenf), onde os papéis do pH e da força iônica são muito importantes porque eles determinam o comportamento de ligação do(s) alvo(s0 e contaminante(s). Por meio do projeto bem sucedido de referidos processos de alta produtividade é possível predizer com precisão as condições para altas taxas de transferência de massa e, correspondentemente, a economia do processo, e também para a eluição ótima e, portanto, a maior taxa de recuperação. No entanto, referido projeto bem sucedido podería exigir, ou pelo menos, ser muito aperfeiçoado através da preparação automática do tampão, permitindo a preparação de numerosas condições, como pH e I em curtos períodos de tempo.

Outra necessidade de preparação de tampão preciso e bem controlado ocorre em microplacas e outros formatos de equipamentos de laboratório. Muitas etapas em ensaios baseados em microplacas e placas de filtração são facilmente paralelizadas por meio do uso, p. ex., de multi-pipetas e blocos de vácuo para o processamento e leitoras de placas para a detecção de resultados. Frequentemente não há necessidade de alto nível de automação, i.e. transportação automatizada de placas. Isto é válido mesmo para muitas “aplicações de produtividade” porque um fator 96 ou 384 no número de experimentos já é obtido pela integração de placa em primeiro lugar. No entanto, há casos que envolvem a preparação tediosa de poços individuais na placa. Embora dedicadas, leitoras de placas de impressão pequena são consideradas garantidas para a detecção e análise de poços individuais, não há solução de impressão pequena, similar e dedicada, de preço razoável para a preparação de tampão em poços individuais em uma microplaca. TECAN é uma empresa que enfrentou o problema escrevendo programa para proporcionar preparação de tampão em microplacas usando sua plataforma de automação de laboratório. À primeira vista isto podería ser percebido como uma desejada força iônica e capacidade do tampão, a presente invenção definirá a espécie apropriada de tampão e também valores apropriados de tampão, e também concentração salina para se obter referido pH e força iônica e capacidade do tampão.

Finalmente, outro aspecto da invenção consiste em usar o presente método de definição de tampão em um dispositivo auto-dispensador para a preparação de tampão inteligente em microplacas e outros equipamentos de laboratório. Isto pode ser obtido introduzindo programa \software\ baseado no modelo discutido acima. Em um aspecto específico, o dispositivo compreende uma interface para automação.

Aspectos e vantagens adicionais da presente invenção depreender-se-ão da descrição detalhada e das reivindicações a seguir. Definições

Um tampão significa aqui um componente ou composto que, em solução líquida, conserva um valor de pH quase constante apesar da adição de quantidades substanciais de ácido e/ou base. O termo “programa de computador” é usado aqui intercambiavelmente com o termo “software”. Breve descrição dos desenhos

A Figura 4 descreve uma Tabela 1 mostrando as diferenças quadráticas médias entre valores de pH experimentais e entre valores de pH calculados e experimentais para três métodos diferentes.

Descrição detalhada da invenção

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de determinar as proporções relativas de componentes de pelo menos um de cada um de:

• um tampão;

• um ácido ou uma base;

• um solvente; e opcionalmente • um sal, para proporcionar uma mistura líquida com pH e força iônica predefinidos, sendo que as proporções relativas de componentes são determinadas usando a equação de Debye-Hückel, sendo que o parâmetro do tamanho do íon a na equação de Debye-Hückel é determinada como o tamanho médio ponderai do íon de todas as espécies que contribuem para a força iônica da mistura líquida, e sendo que a força iônica de cada espécies é usada como parâmetro de ponderação.

Assim, proporciona-se um método geral aplicável a misturas líquidas compreendendo espécies de tampão orgânico e também espécies inorgânicas. Como discutido acima, referidas misturas líquidas tamponadas são amplamente usadas em muitos campos da química e biologia. O presente método permite a predição aperfeiçoada (determinação) de proporções relativas de componentes para se obter uma mistura líquida com pH e força iônica predefinidos, especialmente em altas concentrações de tampão e/ou sal, o que é corroborado pelos resultados experimentais abaixo. Dever-se-ia observar também que o presente método pode ser usado, de maneira oposta, para determinar o pH e força iônica resultantes de uma mistura líquida de uma constituição específica.

Como discutido acima, usa-se amplamente diferentes aproximações da equação de Debye-Hückel para determinar proporções relativas de componentes para soluções tampão etc., mas até aqui todas elas proporcionam baixa precisão e concentrações mais elevadas de tampão e/ou sal. O método proposto supera estes problemas ao determinar o parâmetro do tamanho do íon a como o tamanho médio ponderai do íon de todas as espécies que contribuem para a força iônica da mistura líquida, e sendo que a força iônica de cada espécies é usada como parâmetro de ponderação.

De acordo com uma concretização, o parâmetro do tamanho do íon a para a mistura líquida é calculado como

Yla

I

Eql.ll sendo que li é a força iônica e a_t o parâmetro do tamanho do íon da espécie z, e I a força iônica total definida na Equação 1.6 acima. Então, partindo da referida equação:

>

' 2

Eq. 1.12

O parâmetro do tamanho do íon a^ da espécies i é um valor determinado experimentalmente ou aproximado, e exemplos de valores para alguns tamponantes e sais encontram-se listados na Tabela 2 do exemplo

2. Em toda esta descrição o termo “espécie” abrange quaisquer e todos os íons e moléculas que contribuem para a força iônica da mistura líquida, e mais especificamente um componente, p. ex., um sistema tampão, como um ácido fraco, pode corresponder a duas ou mais espécies com carga diferente, cada um com um valor a, associado. Devido ao fato de que a_t está relacionado com o “tamanho do íon” em um ambiente específico, verificou-se que o valor de <27 de uma espécie específica pode ser diferente para diferentes combinações de componentes, p. ex., tampão, sal etc. Por exemplo, verificou-se que os valores de aj para NaCl são diferentes quando misturados com um tampão de fosfato, em comparação com um tampão de acetato, como é mostrado na Tabela 2 abaixo. No entanto, verificou-se que os valores de a_t são válidos para combinações testadas de componentes sobre uma ampla faixa de pH e forças iônicas com o uso do presente método, resultando em capacidade de predição aperfeiçoada sobre substancialmente as faixas inteiras. A Fig. 5 do exemplo 2 mostra um gráfico de pH calculado versus pH medido para um grande número de amostras de tampão preparadas com base no método acima. A partir deste gráfico fica evidente que o método descrito é capaz de definir proporções relativas relevantes de componentes sobre uma faixa de pH muito ampla.

De acordo com uma concretização verificou-se adicionalmente que o parâmetro do tamanho do íon a na equação de Debye-Hückel pode ser aproximado como a = 0,5 * (massa)^1/3 + envoltório Eq. 1.13 com o que a determinação de a requer menos capacidade de processamento. Nesta equação, o termo “envoltório” é motivado por uma camada adicional, que pode ser considerada uma “camada de hidratação” do íon. Com relação a esta concretização, verificou-se que se “envoltório” foi ajustado como um valor fixo específico, então o termo referido como “constante” na equação de Debye-Hückel equivale a 0,5, como se vê, p. ex., na Tabela 1 apresentada na Figura 4.

Assim, em uma concretização, “envoltório” é fixado em um valor específico para uma espécie iônica carregada positivamente e “envoltório” é fixado em outro valor diferente para uma espécie iônica carregada negativamente. Em uma concretização, “envoltório” situa-se na faixa de 3,8-4,2, como 3,9-4,1 ou 4, para uma espécie iônica carregada positivamente (envoltóriopos=4). Em outra concretização específica, “envoltório” situa-se na faixa de 0-0,2, como 0-0,1 ou 0, para uma espécie iônica carregada negativamente (envoltórioneg=0).

Uma vantagem da presente invenção, em comparação com métodos da técnica anterior, como o Okamoto discutido acima, a presente invenção permite a preparação de misturas líquidas, como tamponantes não só em baixas concentrações salinas, mas também em baixas concentrações salinas, mas também em altas concentrações salinas, como acima de 1M, acima de 2M ou mesmo acima de 5M.

Assim, em uma concretização específica, a presente invenção é um método para proporcionar uma mistura líquida, como um tampão em que a concentração de sal é de até 1M, especificamente na faixa de 1-2M ou mais especificamente acima de 2M.

De acordo com uma concretização, as proporções relativas de componentes são determinadas usando-se um procedimento iterativo.

De acordo com uma concretização específica, mostrada esquematicamente na fig. 1, o procedimento iterativo compreende:

(a) determinar 10 as proporções relativas de componentes em que a força iônica predefinida da mistura líquida é correspondida 20 à espécie de acordo com uma distribuição predefinida entre as espécies;

(b) com base nas proporções relativas de componentes determinadas na etapa precedente, calcular 30 a força iônica de cada espécie na mistura;

(c) determinar 40 um novo conjunto de proporções relativas de componentes; considerando a força iônica calculada em (b), e (d) repetir as etapas (b) e (c) até um critério de convergência predeterminado atingir 50.

O direcionamento da força iônica predefinida da mistura líquida entre as espécies, na etapa (a), é predefinida para se obter um ponto de partida vantajoso para o processo iterativo de forma a se obter rápida convergência e evitar falsa convergência. De acordo com uma concretização a força iônica predefinida da mistura líquida é direcionada à espécie de sal, porque normalmente são contribuintes dominantes para a força iônica total de um tampão compreendendo um componente de sal. Para misturas líquidas, sem qualquer componente de sal, a força iônica predefinida da mistura líquida é direcionada.

Na etapa (b), as proporções relativas de componentes determinadas na etapa precedente, i.e. etapa (a) na primeira iteração e etapa (c) nas iterações subsequentes, são usadas para calcular a força iônica de cada espécie na mistura. Consequentemente, a concentração de cada espécie como definida pelas proporções relativas de componentes é usada para calcular uma distribuição mais correta da força iônica, que é usada subsequentemente para determinar proporções relativas mais corretas de componentes (etapa (c)) e assim por diante até a convergência.

Os critérios de convergência predeterminados podem ser selecionados como sendo quaisquer critérios vantajosos que asseguram que as proporções relativas de componentes são definidas com suficiente precisão, com um esforço computacional razoável. De acordo com uma concretização, os critérios de convergência podem ser selecionados de forma a serem a etapa de iteração quando o desvio entre o último conjunto de proporções relativas de componentes e o conjunto encontrado na etapa imediatamente precedente não excede um nível máximo predefinido, sendo que este último conjunto de proporções relativas de componentes é então conservado como dando a mistura do pH selecionado a uma dada concentração de sal. Em concretização alternativa, os critérios de convergência podem ser selecionados, por exemplo, como um número fixo de iterações, ou outras relações vantajosas. Em uma concretização específica, o procedimento acima é iterado menos de 10 vezes, de preferência, menos de 8 vezes e, mais preferivelmente, de 4 a 6 vezes, como 5 vezes.

De acordo com uma concretização mostra-se esquematicamente na fig. 2 o método de determinar as proporções relativas de componentes de uma mistura líquida pode ser usado em um método para proporcionar uma mistura líquida com pH e força iônica predefmidos 70, compreendendo:

• proporcionar 80 soluções de carga de componentes de pelo menos um de cada de o um tampão;

o um ácido ou uma base;

o um solvente;

e opcionalmente o um sal, • determinar 90 a proporção relativa de cada solução de carga de componentes a ser misturada usando o método acima, • misturar 100 as soluções de carga.

Em concretizações alternativas, uma ou mais soluções de carga de componentes podem ser substituídas por uma fonte de carga de fase sólida de referido componente, com o que a proporção relativa da fase sólida é dissolvida ao se misturar os componentes.

Por meio deste método, é possível preparar uma ampla faixa de soluções tampão ou outras misturas líquidas com alta precisão, em resposta a pH e força iônica predefinidos.

De acordo com uma concretização, o método pode ser usado para preparar misturas líquidas em que a força iônica é gradualmente substituída ao longo do tempo (p. ex., sobre volume) combinando-se concomitantemente proporções variáveis das soluções de carga de componentes, e em que o valor de pH do fluxo líquido pode ser mantido substancialmente igual. Se desejado, é possível preparar misturas líquidas com gradiente de pH ou mesmo combinações de gradientes de pEl e força iônica.

A presente invenção é útil para determinar proporções relativas de componentes para misturas líquidas, como tamponantes que compreendem dois ou mais espécies tampão, frequentemente reconhecidas como líquidos de múltiplas espécies tampão. Assim, em uma concretização, a presente invenção é um método como discutido acima, em que duas ou mais soluções de carga são preparadas, sendo que referidas soluções de carga compreendem diferentes espécies tampão. Em uma concretização alternativa proporciona-se uma solução de carga compreendendo pelo menos duas, como três, quatro ou mais espécies tampão.

Em uma concretização, o presente método de determinar as proporções relativas de componentes pode ser referido como um método para definição de tampão, que define um ou mais dos parâmetros selecionados do grupo que consiste de espécies tampão; concentração de tampão; e concentração de sal requerida para se obter um tampão apresentando um desejado valor de pH e/ou uma desejada força iônica e capacidade do tampão. Em uma concretização, a definição do tampão é obtida em um momento específico do tempo. Em uma concretização alternativa, a presente definição do tampão é obtida em linha num um processo contínuo. O método de definição do tampão pode incluir um ou mais dos elementos discutidos acima no contexto da preparação de uma mistura líquida.

Como discutido acima, a mistura líquida preparada usando o presente método pode ser um tampão, que é útil em várias aplicações, como aplicações de triagem de alta produtividade e na cromatografia. Na cromatografia o líquida preparado de acordo com o presente método é vantajosamente o eluente, que compreenderá correspondentemente uma força iônica gradualmente variável, também conhecida como um gradiente salino. Um gradiente do tipo referido pode ser crescente ou decrescente.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um programa de computador capaz de realizar os cálculos descritos acima.

De acordo com uma concretização específica, proporciona-se um programa de computador para determinar as proporções relativas de componentes de pelo menos um de cada de:

• um tampão;

• um ácido ou uma base;

• um solvente;

• e opcionalmente • um sal, para proporcionar uma mistura líquida com pH e força iônica predefinidos de acordo com o método indicado acima de determinar as proporções relativas de componentes, sendo que as proporções determinadas de misturação de componentes são apresentadas a um usuário para avaliação, e/ou usadas para controlar um dispositivo de mistura líquida.

O programa de computador de acordo com a invenção, que pode ser apresentado em um dispositivo de memória, como um disco ou um pen-drive; ou como parte de um dispositivo de controle, é útil para a preparação automatizada de misturas líquidas, de preferência, fluxos líquidos, apresentando força iônica e pH controlados.

Em uma concretização de uma implementação baseada em computador do método de determinar as proporções relativas de componentes para proporcionar uma mistura líquida com pH e força iônica predefinidos de acordo com o indicado acima, o parâmetro do tamanho do íon a, para cada espécie é armazenado em um banco de dados, tabela ou análogo acessível para uso nos cálculos. Um exemplo de uma tabela do tipo referido é mostrado na tabela 2 com referência ao exemplo 2.

Em uma concretização específica, o programa de computador pode ser operado em modo de projeto, o que significa que o programa calculará a receita (i.e. quantidades de titulante, titulante, água e sal) para se obter uma solução com um dado pH e força iônica (altemativamente, concentração salina em lugar de força iônica). Em uma concretização alternativa, o programa de computador pode ser operado em modo de cálculo de pH, o que significa que o programa calculará o pH e a força iônica obtida quando se mistura determinadas quantidades de componentes tampão.

Em um terceiro aspecto, mostrado esquematicamente na fig. 3, proporciona-se um dispositivo de preparação de tampão 190, compreendendo:

• um dispositivo de mistura líquida 200 compreendendo um orifício de saída de líquido misto 210, e uma pluralidade de orifícios de entrada 220 conectadas a fontes de componente 230 de pelo menos um de cada um de:

o um tampão;

o um ácido ou uma base;

o um solvente;

e opcionalmente o um sal, • uma unidade de controle de misturador 240 disposta de forma a controlar as proporções relativas de componentes supridas através dos orifícios de entrada do dispositivo misturador proporcionando uma mistura líquida com pH e força iônica predefinidos no orifício de saída, sendo que a unidade de controle de misturador encontra-se disposta de forma a determinar as proporções relativas de componentes usando a equação de Debye-Hückel, sendo que o parâmetro do tamanho do íon a na equação de Debye-Hückel é determinada como o tamanho médio ponderai do íon de todas as espécies que contribuem para a força iônica da mistura líquida, sendo que a força iônica de cada espécie é usada como parâmetro de ponderação.

De acordo com uma concretização, o dispositivo de preparação de tampão compreende uma ou mais válvulas controláveis 250, bombas 260 ou análogos para suprir as proporções relativas de componentes associados com o dispositivo misturador. Na concretização descrita, mostra-se esquematicamente uma válvula 250 e uma bomba 260 como integradas no dispositivo de mistura líquida, mas, altemativamente, elas podem ser proporcionadas como componentes separados.

De acordo com uma concretização, o dispositivo de preparação de tampão é integrado como [uma parte] de um sistema de cromatografia líquida. Assim, o dispositivo de preparação de tampão é usado vantajosamente na cromatografia como discutido detalhadamente na acima discutida US 6.221.250, que é incluída aqui por referência.

Em uma concretização específica, o dispositivo de preparação de tampão compreende uma válvula de entrada de múltiplas entradas, como uma válvula de comutação rápida de 4 entradas; meios para titulação de tampão; um display de relações efetivas da misturação do tampão; meios para manter o pH independente da força iônica e da temperatura; meios para verificação automática da capacidade do tampão. A válvula quaternária abrirá um orifício durante um curto período e, então, abrirá o orifício seguinte, e assim por diante. Os diferentes segmentos de volumes de solução de carga serão misturados completamente no misturador para formar o tampão de escol. O tempo de orifício é controlado por um algoritmo para se obter o pH correto.

A titulação do tampão pode ser realizada tanto com ácido/base correspondente ou forte. As relações efetivas de mistura de tampão podem ser apresentadas e/ou controladas por um programa [software], como versão modificada de UNICORN (GE Elealthcare). Um pH estável de soluções preparadas é obtido independente da força iônica e temperatura. Pode haver uma verificação automática da capacidade do tampão. Concentração de tampão e pH possíveis de ajustar no método.

Em outro aspecto adicional proporcion-se um manipulador robótico de líquidos que proporciona um fluxo de líquido em que o pH é mantido substancialmente igual enquanto a força iônica é variada. Um manipulador robótico de líquidos de acordo com esta concretização pode ser usado, p. ex., no controle da composição do tampão em procedimentos de triagem de alta produtividade; no controle de qualidade; na quantificação e normalização do DNA; na PCR etc. Em uma concretização vantajosa, o presente manipulador robótico constitui uma parte de um sistema que permite a preparação totalmente automatizada de tampão em formato de 96 poços para o desenvolvimento do processo de alta produtividade. Em um sistema do tipo referido, o programa de computador de acordo com a invenção proporciona projeto de saída em um formato que é facilmente importado para o dispositivo robótico.

Finalmente, a invenção refere-se também ao uso do método de determinar as proporções relativas de componentes discutidas acima em um dispositivo auto-dispensador para a preparação inteligente de tampão, como em microplacas ou outros formatos, e possivelmente outros equipamentos de laboratório. Uma vantagem do método de acordo com a invenção reside na precisão das predições do pH com valores de força iônica tão altos quanto 1M ou acima. Em uma concretização, o método é especialmente para sistemas de tampão com íons do tampão carregados positivamente. Um dispositivo de preparação de tampão independente de acordo com a invenção pode ser usado em qualquer laboratório envolvido na pesquisa e desenvolvimento químico, biológico, bioquímico, médico para aplicações, como desenvolvimento de processos de alta produtividade, triagem de condições de cristalização, triagem de condições de ligação etc. e, em geral, qualquer aplicação que requer preparação paralelizada de tampão na escala de μΐ-ml. Dependendo do programa incluído, o dispositivo também podería ser facilmente personalizado para outras aplicações que necessitam das mesmas operações unitárias.

Descrição detalhada dos desenhos

A Figura 4 é uma tabela que mostra as diferenças quadráticas médias entre valores de pH experimentais e entre valores de pH calculados e experimentais para três métodos diferentes. Os métodos diferem na correção de tipo ao valor de pK_a para a força iônica: Correção de acordo com Guggenheim & Schindler Eq 1.10 e correção de acordo com este método Eq 1.9 com Eq 1.11. Os números em parênteses dão o número de diferenças maiores que 0,1 unidades de pH. Os valores de diferenças quadráticas médias r.m.s.d. [diferenças do valor médio quadrático] também são dados em unidades de pH. N_Ok é o número de experimentos com capacidade do tampão em ou acima de 0,01 moles de ácido/base forte por unidade de pH (logP > -2). Valores de envoltório em cinza não têm qualquer efeito.

A Figura 2 descreve uma concretização específica da preparação de tampão de acordo com a invenção realizada através de uma válvula comutadora rápida de quatro entradas. A titulação do tampão pode ser realizada tanto com ácido/base correspondente ou forte. As relações efetivas de mistura de tampão são apresentadas pelo software, neste caso uma versão especifícamente modificada do UNICORN (GE Healthcare). Um pH estável de soluções preparadas é obtido independentemente da força iônica e temperatura. Há uma verificação automática da capacidade do tampão. Concentração de tampão e pH é possível de ajustar no método. A válvula quaternária abrirá um orifício durante um curto período e, então, abrirá o orifício seguinte, e assim por diante. Os diferentes segmentos de volumes de solução de carga serão misturados completamente no misturador para formar o tampão de escolha. O tempo de orifício é controlado por um algoritmo para se obter o pH correto. As proporções efetivas usadas durante uma operação são apresentadas como percentual em curvas Cone Q1 até Q4 em Controle de Sistema e também em Avaliação no UNICORN.

Parte experimental

Os exemplos abaixo são dados apenas para fins ilustrativos, e não deveríam ser interpretados como limitando a invenção como definida pelas reivindicações anexas.

Exemplo 1 - Desenvolvimento de software

Materiais/unidades investigadas

Toda a programação foi realizada em um computador pessoal com um processador Pentium 4 e sistema operacional Windows XP.

Métodos

Na primeira parte do trabalho de desenvolvimento usou-se a versão 5 do Borland’s C++ Builder e versão posterior 4.2 do compilador Visual C++.

Critérios para aceitação

No início deste experimento, decidiu-se que o método deveria fornecer o pH correto com uma precisão de 0,2 unidades de pH. Como a especificação do sistema usado de bomba e válvula é de 0,5 %, e uma concentração de carga normal deveria ser de 0,2 M, dada uma capacidade do tampão mínima¹ de 0,01 (ver abaixo) cerca de 0,1 podería corresponder à precisão da proporção e 0,1 à precisão do algoritmo. A capacidade do tampão mínima foi tomada como capacidade do tampão [e] é definida como |dn/dpH|, sendo que dn é a alteração (pequena) de quantidade (em moles) de ácido/base forte dando origem a uma alteração (pequena) dpH no pH. A precisão do algoritmo foi estimada por meio de comparação com medições de pH experimentais de soluções tampão. Erros de pipetagem foram estimados no início da fase experimental e eles foram considerados muito pequenos em comparação com outros erros relacionados com determinação experimental de pH (dados não mostrados). Portanto, o erro experimental foi estimado medindo-se o pH de cada amostra de tampão usando-se dois medidores de pH diferentes, com diferentes tipos de eletrodos, dando origem a dois valores de pH diferentes, indicados aqui pHExp e pHExpl. O erro quadrático médio (r. m. s. e. [erro do valor médio quadrático]) foi calculado para série experimental (conjunto de dados) de acordo com a fórmula a seguir

r. m. s. e. = Sqrt( Σ(ρΗΕχρ - pHExp 1 )²/N_0K) Eq. 2.1 em que a soma é tomada para aqueles valores de pH com uma correspondente capacidade do tampão maior do que 0,01 e em que Nok é o número de referidos casos (apenas resultados para os quais o logaritmo (base 10) da capacidade do tampão (β) é maior do que -2 são levados em consideração). Se o erro quadrático médio r. m. s. e. fosse determinado como sendo maior do que 0,05 unidades de pH, então pelo menos metade do conjunto de dados (correspondendo a um medidor de pH) foi rejeitada, sendo que neste caso o conjunto de dados que foi mais consistente com os valores estabelecidos de constantes de tampão (pKa e temperatura dependência do pKa) encontrados na literatura foi conservado e usado para otimização dos parâmetros de compensação da força iônica. Mesmo a metade consistente do conjunto de dados poderia ser rejeitada caso houvesse outro conjunto de dados que foi consistente com os valores estabelecidos de constantes de tampão da literatura. O valor 0,01 (log -2,0) como um limite inferior para a capacidade do tampão foi derivado experimentalmente porque se observou que abaixo deste limite o erro quadrático médio r. m. s. e. aumentou acima de 0,05 para a maior parte dos sistemas tampão (dados não mostrados). Como uma comparação, o valor correspondente usado na acima discutida US 6.221.250 (Stafstrõm) foi de 0,0063 (log -2,2). Não se encontrou referência na literatura a um “valor normalmente aceito”.

Resultados

O programa “Buffalo” foi escrito em Visual C++ e pode ser operado em Windows para o cálculo preciso do pH do tampão a forças iônicas tão altas quanto 1M.

Estrutura do programa

O programa “Buffalo” pode ser operado em dois modos: modo de projeto e modo CalcjpH. O modo de projeto é usado para o projeto de experimentos e para o cálculo de curva de titulação teóricas que podem ser usadas antes do projeto de experimentos para determinar uma faixa de pH apropriada. O modo Cale_pH é usado para otimização de parâmetros dado um conjunto de medições de pH pareadas. Entradas [inputs] no programa em ambos os modos são o volume de tampão (buff_yol\ a temperatura (77), a concentração de tampão (buff_conc), a concentração salina (salt_conc\ a substância do tampão {buff_choice') e a substância titulante (titrate_choice). Adicionalmente a isto, no modo de projeto o pH desejado (pH) é requerido como input, enquanto que no modo Cale_pH, o pH experimental (pHExp), a replicata experimental (ρΗΕχρΓ), e o número de moles de titulante usado nos experimentos (titrate_mol_exp') são requeridos. Além disso, em ambos os modos, é possível considerar uma mistura de um número (n_buffs = 1, 2 ou

3), de tamponantes buff_choice(l), buff_choice(2), buff_choice(3) em lugar de um tampão que consiste de uma substância tampão simples (o programa foi implementado para um número máximo de três substâncias tampão, mas podería ser facilmente modificado de forma a incluir mais). Sendo este o caso, dever-se-ia proporcionar as concentrações correspondentes de tampão buff_conc(l), buff_conc(2), buff_conc(3).

Tampões monopróticos versus polipróticos

O pH de um tampão monoprótico pode ser predito com a equação de Henderson-Hasselbach (Eq 1.3 ou Eq 1.7).

As concentrações da espécie básica e ácida são determinadas pela concentração de tampão e a concentração de titulante. Dados estes e o pK_a de um tampão monoprótico o pH pode ser derivado (corresponde ao modo Cale_pH), altemativamente, dado um pH desejado e a concentração de tampão, as quantidades de mol de titulante podem ser derivadas (corresponde ao modo de projeto). Surge uma complicação porque muitos tampões são polipróticos, i.e. suas moléculas tampão podem aceitar e fornecer mais de um próton correspondente a mais de um valor de pK_a. O número de espécies em um sistema tampão do tipo referido é sempre maior do que o número de valores de pK_a (nr_of_pKa). Para simplificar a implementação do programa, implementou-se um modelo geral para um tampão tritrópico (uma extensão a ainda mais valores de pK_a deveria ser direta, mas não trivial, e precisa ser implementada). Quatro estados de protonação ou espécies (sl, s2, s3, e s4) são definidas, no entanto o parâmetro nr_of_pKa (que pode ser 1, 2, ou 3) limita os cálculos de tal forma que, para um tampão monoprótico, por exemplo, sl corresponde à espécie ácida, s2 à espécie básica e as concentrações de s3 e s4 são ajustadas em 0.

Diferenças e similaridades entre os dois modos

Os dois modos operam usando-se substancialmente o mesmo método, ou seja para dissolver a quantidade de moles de titulante necessário para obter um dado pH a uma dada concentração de tampão. Antes de realizar isso é necessário dissolver a quantidade de moles de tampão em cada um do possível número de estados de protonação (ou espécies). A diferença entre os modos é que no modo de projeto o procedimento é realizado apenas duas vezes (kmax=2): uma vez para o pH desejado e outra para pH + pH_etapa (ver abaixo) de forma a estimar numericamente a capacidade do tampão. A quantidade de moles de titulante obtida para o pH desejado é então a saída do modo de projeto. No modo Calc_pH, por outro lado, o procedimento é repetido em toda a escala de pH (1-13, kmax=2600), o valor de pH que dá a quantidade de moles de titulante que coincide melhor com a quantidade de moles de titulante usada no experimento é o valor de pH calculado. O pH_etapa (0,005) limita a precisão do pH e cálculos da capacidade do tampão. Verificou-se ser vantajoso usar o mesmo algoritmo em ambos os modos à medida que erros e discrepâncias desnecessárias foram minimizadas desta maneira.

As equações de equilíbrio

O cálculo da quantidade de moles em cada uma das espécies de protonação é equivalente a resolver as equações de equilíbrio de cada uma das espécies com as espécies “vizinhas” com um próton a mais e/ou um próton a menos e com a concentração de átomos de hidrogênio (o pH). Em outras palavras, três equações (correspondendo a três valores de pKa) derivaram-se diretamente daEq 1.7.

xx[i] = 10^A(pH-pKaprime[ij) Eq 3.1 em que cada i corresponde a cada valor de pKa(i) (i=l ,2,3), e xx[i] são as relações entre a concentração da base correspondente e o ácido correspondente, i.e. xx[l] = [s₂]/[si], xx[2] = [s₃]/[s₂], xx[3] = [s₄]/[s₃].

Adicionalmente a estas três equações, surge uma equação devido à conservação de massa [sj + [s₂] + [s₃] + [s₄] = buff_conc Eq 3.2 e a conservação de carga [ET] - [OfT] + Σ spec_chrg(sj) - titrant_charge* [titrant] spec_chrg(start_species)*[start_species] = 0 Eq 3.3

Por espécies de partida compreende-se a espécie da substância tampão antes da misturação, i.e. o estado de protonação do tampão no recipiente ou solução de carga. Este estado de protonação é determinado pela quantidade de contra-íons por molécula tampão porque o objeto macroscópico, recipiente ou solução de carga precisa ser eletricamente neutro. O sinal de menos à frente de [OH^-] deve-se ao sinal de menos da carga dos íons OH, enquanto que o sinal de menos à frente dos dois últimos termos deve-se à carga dos contra-íons do titulante e à start_species [espécie de partida].

Finalmente o equilíbrio de dissociação da água [ΟΗ·][ΗΊ = 10’¹⁴ Eq3.4

As equações de 3.1 a 3.4 implicam que há seis equações com seis incógnitas (os quatro [sj, [OH’] e [ET]) para o caso de 3 valores de pK_a. Da maneira que a solução é implementada aqui assume-se que o pH é conhecido e sobre [H^4-] e até Eq 3.4 ainda [OH’] e, ao invés, é a concentração de titulante que precisa ser dissolvida. As cinco equações remanescentes correspondem a cinco incógnitas (os quatro [sj] e [titrant]).

Cálculo da quantidade de moles do titulante

Uma vez conhecidas as concentrações de cada espécie [s,] em equilíbrio, a concentração de titulante pode ser resolvida usando a Eq 3.3. Há dois casos a considerar, dependendo do tipo do titulante, ácido/base forte e ácido/base correspondente. No entanto, independentemente de qual caso seja, a resolução para a concentração de titulante na Eq 3.3 dá [titrant] = (-[H⁺] + [OH‘] - Σ spec_chrg(sj)*[Si] + spec_chrg(start_species)* [start species] )/proton_etapa Eq 3.10 em que proton_etapa = -titrant_charge (ácido/base forte) Eq 3.11 a ou proton_etapa = spec_charge(start_species) - titrant_charge (ácido/base correspondente) Eq 3.11 b

Em outras palavras, o parâmetro proton_etapa é -1 para HC1 e +1 para NaOH, no caso de um titulante de ácido ou base fraca o proton_etapa do titulante depende da espécie de partida do tampão de acordo com a equação 3.1 lb ou a seguinte equação equivalente proton_etapa = titr_species - start_species Eq 3.12

Este procedimento é repetido tantas vezes quanto há componentes de tampão e o titratejmol final é a soma da quantidade de titulante de cada componente (ver abaixo).

Na maior parte dos casos (pH entre cerca de 3,5 e 10,5), a contribuição de [H] (em baixos valores de pH) ou [ΟΕΓ] (em altos valores de pH) para o balanço de carga é desprezível e pode ser ajustada em zero na Eq 3.10.

Seleção do titulante

O titulante pode ser forte (HC1 ou NaOH). A única diferença entre estes dois é no sentido do número de prótons com que eles podem contribuir. Adicionalmente, o titulante pode ser fraco, sendo que neste caso dever-se-ia proporcionar o estado de protonação do titulante (no recipiente ou solução de carga). Altemativamente, o número de prótons ácidos pode ser dado. A relação entre os dois é titr_species = Nr_of_pKa + 1 - Nr_of_Acidic_Protons Eq 3.13

Ciclo de iteração de força iônica

Como a força iônica é calculada das concentrações de todos os íons, é necessário conhecer estas concentrações antes de computar precisamente a força iônica. No entanto, estas concentrações são, elas próprias, saída da solução das equações de equilíbrio que requerem pKaprimefi] que, por sua vez, são calculadas a partir do pKa (assimchamados valores de pKa termodinâmico a 25°C e força iônica 0), da temperatura e da força iônica. Portanto, é necessário implementar um procedimento iterativo. No primeiro estágio de referido procedimento, a força iônica é ajustada simplesmente igual à concentração de sal. Na segunda etapa de iteração, usa-se a força iônica obtida daquele ciclo etc. Verificou-se que este procedimento converge muito rapidamente. Por exemplo, verificou-se que cinco iterações foram muito mais do que suficiente para se obter precisão desejada (dados não mostrados). O número de iterações foi ajustado portanto em 5, em todos os casos.

Cargas separadas no cálculo da força iônica

Verificou-se que o cálculo da força iônica para íons com mais de uma carga e onde as cargas foram bem separadas (como no caso dos íons citrato com 4 e 5 átomos de carbono entre as cargas) obteve-se uma precisão significantemente melhor se as cargas fossem consideradas como separadas, em lugar de uma carga de ponto simples. Isto levou à introdução de uma variável flag separate_charges, o que foi considerado verdadeiro para citrato e falso para todos os outros tampões considerados.

Ciclo sobre número de componentes tampão, parâmetros do tampão

Para cada espécie de tampão, são exigidos os seguintes parâmetros. A massa da substância tampão (Mbuff), o número de valores de pKa (Nr_of_pKa), os valores de pKa (pKa[i])₅ os valores da dependência da temperatura de cada valor de pKa (dpKadT[i)), a carga da forma mais básica (bc), e o estado de protonação do tampão (start_species) no recipiente ou solução de carga. Altemativamente, o número de prótons ácidos pode ser dado. A relação entre os dois é start_species = Nr_of_pKa + 1 - Nr_of_Acidic_Protons Eq 3.14

Além destes, os parâmetros de correção da força iônica (konst, envoltóriopos e envoltórioneg) são requeridos.

O número total de moles de titulante (titratejmol) é igual à soma dos números de moles de titulante necessários para cada componente tampão para estabelecer equilíbrio no pH desejado e este ciclo é usado para calcular esta soma. Outras somas que são calculadas durante o ciclo são o número de contraíons de cada um dos componentes tampão e também cada contribuição do componente para a força iônica em equilíbrio.

Ciclo sobre diferentes estados de protonação, correção de pKa com relação à temperatura

Para cada estado de protonação calcula-se cada um dos seguintes: a carga (spec_chrg[j]), o quadrado da carga (qsqfj]), o envoltório (envoltóriofj]), constante (konstfjj) e o valor de pKa corrigido para temperatura (pKaT[j]). Este último é calculado de acordo com a fórmula a seguir pKaT = pKa[i] + (TT-25)*dpKadT[i] Eq 3.15 sendo que TT é a temperatura em graus Celsius. A parte aaafi] do parâmetro de tamanho de íons a que só é dependente da massa (nós podemos chamar isto de o raio não-hidratado aaafi]) aaa[i]= konstfi] * (Mbuff)^1/3 Eq 3.16 também é calculada.

Ciclo sobre valores de pKa, cálculo de pKa’

Os coeficientes de atividade (ou, ao invés, seus logaritmos) da espécie ácida e espécie básica correspondendo a cada valor de pK_a são calculados de acordo com a fórmula a seguir.

logfiBase = - A * (qsq [i+1 ]) * rooI/( 1+0.33* (aaa[i+1 ]+envoltório [i+1 ]) * rootl)

Eq3.17 alogfiAcid = -A*(qsq[i])*rootl/(l+0.33*(aaa[i]+envoltório[i])*rootl)

Eq 3.17b

Sendo que rootl é a raiz quadrada da força iônica. O parâmetro a da equação 1 corresponde à quantidade aaa[j]+envoltório[j].

Destes coeficientes de atividade, os pKaprimes são calculados como pKaprimefi] = pKaT + logfiBase - logfiAcid Eq. 3.18

Influência de [H^] e ΓΟΗΊ sobre o balanço de cargas

A valores de pH muito baixos e muito altos, a contribuição de [H^1-] (a valores baixos de pH) ou [OH'] (a valores altos de pH) para o balanço de cargas não é mais desprezível. Portanto, a possibilidade de incluir uma correção para titrate_mol devido a [ET] e [OH] foi implementada na versão 5.07 e mais tarde, particularmente as discrepâncias entre valores calculados e medidos foram observados consistentemente para tampão de fosfato na faixa de pH baixa (abaixo de 2,5). Isto foi implementado de forma que, à quantidade de moles de titulante, foi corrigida ao término do ciclo sobre número de componentes tampão adicionando-se dois termos

-10^Λ- {pH}/(proton_etapa*buff_vol) para neutralizar eletricamente [H^] e +10^Λ {pH-14 }/(proton_etapa*buff_vol) para neutralizar eletricamente [OH'].

Comparação dos valores calculados com os valores experimentais

Um total de 31 sistemas tampão (combinações de titulando e titulante) é reportado aqui. Cerca de 2100 experimentos foram realizados, dos quais 817 foram rejeitados devido aos critérios de rejeição (seção 2.3). Realizou-se titulação com ácido/base forte e também titulação com ácido/base correspondente, e também duas misturas de tampão. A lista de sistemas tampão que não são misturas é reportada na figura 4 Tabela 1. As estatísticas de erros dos resultados da aplicação deste método (programa Buffalo versão 6.00) em comparação com a interpretação da fórmula de Debye-Hückel de acordo com Guggenheim & Schindler (Eq 1.10) e também em comparação com diferenças experimentais também são apresentadas na tabela. Em todos os casos mostrados na tabela a correção devida à contribuição de [H ] e [OH'] (seção 3.13) foi incluída. Apenas nos casos em que pH baixo é considerado, esta correção produz um significativo melhoramento de precisão. Nos casos restantes a diferença é desprezível.

Apresenta-se apenas resultados para os quais o logaritmo (base 10) da capacidade do tampão (β) é maior do que -2 dos dados não-rejeitados. Inclui-se também, como uma estimativa do erro experimental, o erro quadrático médio (r. m. s. e. [erro do valor médio quadrático]) (eq 2.1) de duas medições da mesma mistura de tampão de acordo com dois diferentes medidores de pH.

Misturas de tampões

Considera-se duas misturas. Uma mistura para cromatografia de troca de cátion (pH 2,5 - 7,2 CIEX) e uma mistura para cromatografia de troca de ânion (pH 5,3 -9,5 AIEX).

A mistura de AIEX (AIEX-mix) foi preparada misturando-se 0,1 M Tris e 0,1 M de Bis-Tris. A faixa de pH testada foi de 5,3 - 9,5. O primeiro conjunto de dados consistiu de medições individuais de pH. O erro quadrático médio r. m. s. e. para um segundo conjunto de dados AIEX foi de 0,08 de modo que um de sua série foi rejeitado.

Os resultados para o primeiro conjunto de dados e a série nãorejeitada do segundo foi de 1 de 27 possíveis valores fora de limites de 0,1 (r.m.s.d. [diferença quadrática média] 0,06) para este método em comparação com 10 de 27 possíveis violações para a correção de força iônica graças a Guggenheim & Schindler (r.m.s.d. [diferença quadrática média] 0,10).

A mistura de CIEX (CIEX-mix) foi preparada misturando-se 0,0375M de Na₂HPO4, 0,0125 de formiato de Na e 0,025M de acetato de Na. A faixa de pH testada foi de 2,5 - 7,2. O erro quadrático médio r.m.s.e. experimental foi de 0,02 com 0 de 104 possíveis diferenças (NrOK) maiores que 0,1. O resultado dos cálculos de pH foi de 4 de 104 possíveis valores fora de 0,1 limite para este método (r.m.s.d. [diferença quadrática média] 0,05) em comparação com 36 de 102 possíveis violações para a correção de força iônica graças a Guggenheim & Schindler (0,1).

Exemplo 2 Materiais/unidades investigadas

Como no Exemplo 1.

Métodos

Usou-se a versão 4.2 do compilador visual C++.

Resultados

O programa “Buffalo Plus” foi escrito em Visual C++ e pode ser rodado em Windows para o cálculo preciso do pH do tampão sob forças iônicas e concentrações de tampão tão altas quanto 1M para os sistemas tampão a seguir: fosfato, citrato, acetato e Tris.

Estrutura do programa

Como para o Exemplo 1 com uma adição: O programa também pode ser rodado em um terceiro modo “Optimize parameters [Otimizar parâmetros]” que é usado para otimizar parâmetros simultaneamente (raios das diferentes espécies carregadas de cada sistema tampão) usando o método de Newton Raphson.

Tampões monopróticos vs polipróticos

Como no Exemplo 1.

Diferenças e similaridades entres os modos.

Como para o Exemplo 1, porém os modos Calc_pH e Optimize parameters [Otimizar parâmetros] kmax - 3.

Seleção do titulante

Como no Exemplo 1.

Ciclo de iteração da Força iônica

Como no Exemplo 1.

Ciclo sobre números de componentes tampão, parâmetros do tampão

Como no Exemplo 1.

Ciclo sobre valores de pKa, correção de pKa relativamente à temperatura e cálculo de pKa’

Os coeficientes de atividade (ou, ao invés, seus logaritmos) da espécie ácida e básica correspondendo a cada valor de pKa são calculados de acordo com a fórmula a seguir logfiBase = -A(qsq[i+l])*rootl/(l+0,33*ion_rad*rootl) logfiAcid = -A(qsq[i])*rootl/(l+0,33*ion_rad*rootl) sendo que rootl é a raiz quadrada da força iônica. qsq[i] e qsq[i+l] são o quadrado da carga do ácido e da base respectivamente correspondendo ao valor de pKa.

pKaT = pKa[i]+(TT-25)*dpKadT[i] sendo que TT é a temperatura em graus Celsius e dpKadTfi] é o coeficiente de temperatura para o valor de pKa em consideração pKa[i].

pKaprime[i] = pKaT + logfiBase - logfiAcid

As equações de equilíbrio

Como no Exemplo 1.

Cálculo do parâmetro do tamanho do íon

Isto é calculado como descrito como a média ponderai da força iônica dos raios de cada espécie. A Tabela 2 mostra parâmetro do tamanho do íons ai estabelecidos para espécies in dos sistemas tampão de fosfato, citrato e acetato e parâmetro do tamanho do íons a, associados para NaCl. Na tabela 2, apenas parâmetro do tamanho do íons para espécies carregadas estão listados, e “ion size [tamanho de íon] 2” refere-se à espécie iônica de carga mais baixa. Consequentemente “tamanho do íon 1” poderia referir-se à espécie nãoiônica, porém como a carga de referidas espécies é zero, elas não contribuem para os parâmetro do tamanho do íon a totais como discutido acima. Como acetato é um ácido monoprótico há apenas um único valor a_t listado. Como indicado acima, verificou-se que os parâmetro do tamanho do íons tz, para pelo menos alguns sais, p. ex., NaCl, é dependente dos sistema tampão que é mostrado na tabela 2.

Tabela 2

	Tamanho do íon 2	Tamanho do íon 3	Tamanho do íon 4	Tamanho do íon Na	Tamanho do íon Cl
acetato	18,989			2,42126	0,241586
citrato	3,13131	7,62849	6,37154	1,00106	3,13131
fosfato	1,64846	6,25134	7,91443	1,64026	1,09941

Cálculo das quantidades de moles de titulante

Como no Exemplo 1.

Influência de |ΉΊ e [OH'1 sobre o balanço de cargas

Como no Exemplo 1.

Comparação dos valores calculados com os valores experimentais

A Figura 5 mostra um gráfico de 155 valores de medição de pH valores preditos correspondentes calculados usando Buffalo Plus. Os sistemas tampão investigados incluem fosfato, citrato e acetato.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para determinar as proporções relativas de componentes de pelo menos um de cada um de:

• um tampão;

• um ácido ou uma base;

• um solvente;

e opcionalmente • um sal, para proporcionar uma mistura líquida com pH e força iônica predefinidos, caracterizado pelo fato de que as proporções relativas de componentes são determinadas usando a equação de Debye-Hückel, sendo que o parâmetro do tamanho do íon a na equação de Debye-Hückel é determinado como o tamanho médio ponderal do íon de todas as espécies que contribuem para a força iônica da mistura líquida, e sendo que a força iônica de cada espécie é usada como parâmetro de ponderação.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as proporções relativas de componentes são determinadas usando um procedimento iterativo.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o procedimento iterativo compreende:

(a) determinar as proporções relativas de componentes em que a força iônica predefinida da mistura líquida é direcionada à espécie de acordo com uma distribuição predefinida entre as espécies;

(b) com base nas proporções relativas de componentes determinadas na etapa precedente, calcular a força iônica de cada espécie na mistura;

(c) determinar um novo conjunto de proporções relativas de componentes; considerando a força iônica calculada em (b), e

Petição 870190000609, de 03/01/2019, pág. 13/17 (d) repetir as etapas (b) e (c) até se atingir um critério de convergência predeterminado.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que, na etapa (a), a força iônica predefinida da mistura líquida é direcionada à espécie de sal.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de

1 a 4, caracterizado pelo fato de que o parâmetro do tamanho do íon a da equação de Debye-Hückel é determinado como:

ijAi

I sendo que Ii é a força iônica e ai da espécie i, e I a força iônica total.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o parâmetro do tamanho do íon a na equação de Debye-Hückel é aproximado como a= 0,5 *(massa)^1/3 + envoltório, em que o “envoltório” é fixado em um valor para uma espécie carregada positivamente e fixado em um valor diferente para uma espécie carregada negativamente, e opcionalmente fixado em um valor na faixa de 3,8-4,2, como 4,0, para espécies iônicas carregadas positivamente; e o “envoltório” é fixado em um valor na faixa de 0-0,2, como 0, para espécies iônicas carregadas negativamente.
7. Método para proporcionar uma mistura líquida com pH e força iônica predefinidos, caracterizado pelo fato de que compreende:

• proporcionar soluções de carga de componentes de pelo menos um de cada um de o um tampão;

o um ácido ou uma base;

o um solvente;

e opcionalmente

Petição 870190000609, de 03/01/2019, pág. 14/17 o um sal, • determinar a proporção relativa de cada solução de carga de componentes a ser misturada usando o método como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, • misturar as soluções de carga.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a força iônica é alterada gradualmente combinando-se concomitantemente proporções variáveis das soluções de carga de componentes, e sendo que o valor do pH do fluxo de líquido é mantido substancialmente igual.
9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que duas ou mais soluções de carga de componentes são preparadas, sendo que referidas soluções de carga de componentes compreendem diferentes espécies tampão.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 9, caracterizado pelo fato de que é proporcionada uma solução de carga de componentes compreendendo pelo menos duas espécies tampão.
11. Procedimento de triagem de alta produtividade ou processo de cromatografia líquida, caracterizado pelo fato de que o tampão é preparado como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 10.
13. Dispositivo de preparação de tampão, caracterizado pelo fato de que compreende:

um dispositivo de mistura líquida compreendendo um orifício de saída de líquido misto, e uma pluralidade de orifícios de entrada conectadas a fontes de componentes de pelo menos um de cada um de:

• um tampão;

• um ácido ou uma base;

• um solvente;

e opcionalmente

Petição 870190000609, de 03/01/2019, pág. 15/17 • um sal, uma unidade de controle de misturador disposta de forma a controlar as proporções relativas de componentes fornecidas através das orifícios de entrada do dispositivo misturador proporcionando uma mistura 5 líquida com pH e força iônica predefinidos no orifício de saída, sendo que a unidade de controle de misturador é disposta de forma a determinar as proporções relativas de componentes usando-se a equação de Debye-Hückel, sendo que o parâmetro do tamanho do íon a na equação de Debye-Hückel é determinado como o tamanho médio ponderal do íon de todas as espécies que 10 contribuem para a força iônica da mistura líquida, sendo que a força iônica de cada espécie é usada como parâmetro de ponderação.
14. Dispositivo de preparação de tampão de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma válvula controlável ou bomba controlável para fornecer proporções relativas
15 de pelo menos um dos componentes.

15. Sistema de cromatografia líquida, caracterizado pelo fato de que compreende um dispositivo de preparação de tampão como definido em qualquer uma das reivindicações de 13 a 14.