BRPI0912470A2 - método de produção de material de biopolímero fibrilar orientado, método de produção de uma pseudo-fibra de biopolímero fibrilar a partir de fita, material de biopolímero fibrilar orientado e pseudo-fibra de biopolímero fibrilar ou pluralidade de pseudo-fibras - Google Patents

Abstract

método de produção de material de biopolímero fibrilar orientado, método de produção de uma pseudo-fibra de biopolímero fibrilar a partir de fita, material de biopolímero fibrilar orientado, estrutura de biocompósito, pseudo-fibra de biopolímero fibrilar ou pluralidade de pseudo-fibras e método de produção de um material baseado em colágeno orientado de maneira geral, a presente invenção se refere a materiais e estruturas de biopolímeros e biocompósitos, e aos métodos de produção e de utilização dos mesmos. em algumas realizações, a presente invenção refere-se a materiais e estruturas de biocompósitos à base de colágeno, e aos métodos de sua produção.

Description

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE MATERIAL DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR ORIENTADO, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PSEUDO-FIBRA DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR A PARTIR DE FITA, MATERIAL DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR ORIENTADO E PSEUDO-FIBRA DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR OU PLURALIDADE DE PSEUDO-FIBRAS

CAMPO DA INVENÇÃO

De maneira geral, a presente invenção está relacionada a materiais e estruturas poliméricos e de biocompósito, e métodos de produção e utilização dos mesmos. Em algumas realizações, a presente invenção é dirigida a materiais e estruturas de biocompósito baseadas em colágeno orientado, e métodos de produção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Géis, bandagens, esponjas e fibras de colágeno têm sido utilizados como veículos para células-tronco. Colágeno é uma proteína natural presente em muitos tecidos. Ele confere força tênsil aos tecidos bem como fornece sítios de ligação para que células se liguem, migrem e proliferem. Entretanto, géis de colágeno e colágeno pulverizado não têm força tênsil e tendem a dissipar-se no tecido sob pressão e dessa forma não são apropriados à tarefa de manter as células em posições definidas.

O colágeno pode ser isolado na forma pura de uma variedade de tecidos como uma proteína solúvel que pode ser reconstituída em fibras. Em geral, as fibras perdem a superestrutura que exibem em diferentes tecidos. Isto tem limitado o sucesso de uso de colágeno em muitas aplicações médicas.

Danos teciduais ao coração, músculo estriado, pele, osso e cartilagem, medula espinhal, etc., muitas vezes progridem e causam o esgotamento do tecido circundante normal aumentando a área de dano e prejudicando seriamente a função cecidual. Conceitos atuais sugerem que vários fatores ou células passam ser introduzidos na área danificada pela injeção direta e impedir dano adicional e até restaurar a S área danificada. De fato, testes pré~clínicos bem como clínicos mostraram a função cardíaca melhorada quando células-tronco mesenquimais são injetadas no local de dano tecidual. Entretanto, tais estudas também mostraram que quantidades significantes das células injetadas escapam do 10 tecido e a maioria das células que permanecem rapidamente morrem. Dessa forma, há uma necessidade de dispositivos que permitam a aplicação de vários tipos de células a locais específicos em tecido danificado e mantenham a sua sobrevivência e expansão. Entretanto, as propriedades físicas IS de tecidos diferentes variam surpreendentemente (compare o músculo cardíaco com músculo estriado com pele ou medulas, espinhal;. Dessa forma, veículos de aplicação devem ter força suficiente para permitir que sejam colocados em um tecido específica sem causar alterações na função tecidual devido a 20 fatores físicos deficientemente combinados. Iate requer materiais cujas propriedades físicas são apropriadas para o tecida no qual devem ser utilixados. Além disso, cêluras requerem que fatores e superfícies que apoiem a sua sobravivência, migração e produção de fatores de reparo 25 específicos. Resumidamente, o tratamento de tecidos danificados deve ser melhorado por novos dispositivas que aplicariam e manteriam células-tronco e outras em locais específicos para permitir-lhes sobreviver e produsir fatores que sustentam o tecido em risco.

Ferimentos de tendões e ligamentos estão entre os problemas de sauda mais comuns que afetam a população adulta.

Estima-se que 175.000 reconstruções de Ligamento Cruzado Anterior (LCA) foram realizadas no ano 2000 nos Estados

Unictos a um custo da mais âe 2 bilhões de dólares. Há 90,009 pacientes que requerem repara cirúrgico do manguíta rotadar e 5 milhões de novos casos da cotovelo de tenista a cada ano sooente nas Estados Unidos. Além disso,. 11% doe corredores 5 regulares sofrem de tendincpatia de Aquiles. Sm 2000.

tratamentos para dor de ombro custaram ao govern© dos Estados

Unidos até US$ 7 bi.lhões e o custo total para mjürxa de tendão e ligamento foram estimados em UE-$ 30 bilhões anual mente; ver Chen, J< , Xu. ~7. , Wang A. < .hieng M. , 2u 09.

Scaffolds for tendon and ligament repair; review of the efficacy of commercial products. Expert Rev. Med, Devices, δ. 161-73 ..

Métodos atuais para reparar tendão e 'liga.me.ntos da mão e do pé tiveram, êxito somente limitado. Em alguns casos,.

articulações são imobilizadas durante quatro semanas enquanto o tecido de cicatriz se desenvolve - Este tecido de cicatriz# que tem propriedades mecânicas fracas, deve assumir a. função do tendão/1 iaament© original, mas tem um®, alta taxa de taiha.

Em outros casos, suturas não absorvíveis ancoradas na assa 20 sã© utilizadas. Estas suturas não têm elasticidade apropriada e muitas vezes provocam uma resposta imune, Em outros casos, © reparo não é possível e os procedimentos de. substituição disponíveis têm várias limitações.

A prática atual de clinica e pesquisa utiliza 23 enxertos animais e humanos como o material primário na prática clínica diária para reparar defeitos de ligamento e tendã©. Substitutos biológicos incluem autoenxertos _γ aloenxertos e xenoenxertoe.

Enxertos autóloqos de tendão pstelar e tendões de iarrete são considerados o -'padrão ouro no reparo de tecido e são normaImente preferenciais para evitar a refeição. Entretanto# estes autoenxertos sofrem de diversas desvantagens. Por exemplo# .ant ©enxertos requerem cirurgia adicional. no paciente que pode causar morbidade do sítio doador<· tempo de recuperação aumentado, e/ou poeeível dor* no sitio de coletai mais infecção de sitio de coleta, injúria nervosa a fratura pa.telar, Urna desvantagem adicional no uso 5 do tendão de jarrete para reconstrução de LCA é a falta de cura eficiente de tendão-osso, que afeta a recuperação de pacientes devido à instabilidade da interface tendão-osso,

Aloenxertos são obtidos de tendões, derme e outros tecidos de cadáveres, Xenoenxertos são coletados de tendões animais, su.bmuoosa. de intestino delgado, dorme e pela, e perioãrdío. Aloenxertoa e xenoenxertos são principalmente compostos de colãgeno tipo X cosí propriedades mecânicas similares a tendões humanos. Entretanto, alo- e xenoenxertos podem potênciaImente transmitir doença ou infecção, e podem 15 provocar uma resposta imunogênica desfavorável no hospedeiro.

Enxertos sintáticos exibem resultados em curto praso excelentes, mas o resultado clínico de longo prazo é ruim., com uma taxa de falha de 40 a 78% de fragmentação, desequilíbrio das tensões normais exercidas no osso do novo 20 tecido, fadiga, deformação e desgaste, que pode levar consequentemente a artrite e sinovite.

As técnicas atuais de cultivo celular incluem: a) aplicação de. compósitoe de cêlula-gel na região de estrutura de suporte e b) aplicação de suspensões celulares em 25 estruturas de suporte em uma situação estãtxoa ou dinâmica, Entretanto, há algumas desvantagens nestas técnicas, tais como baixa eficiência da ligação celular à matrie fibrosa, densa ou estrutura de .suporte e força mecânica fraca de eistemas um gel. Estas desvantagens tornam muito difícil 10 cultivar um número significativo da células em enxertos de tecido denso. Dessa forma, as limitações dst tecnologia, atual proibem o uso de células-tronco para melhorar a eficiência de grandes enxertos de tecido para reparo de. tecido. Para enfrentar setas limitações, incisões cia espessura parcial e ultrassonicação foram desenvolvidas para permitir às células cultivadas se infiltrarem no tendão em cultura antes do implante. Sem incisões ou ultrassonicação, células extrínsecas cultivadas na superfície dc tendão têm dificuldade de penetração no tendão< Entretanto, com incisão e ultrassonicação, a força mecânica dos enxertos é reduzida o que limita o potencial de aplicação clínica»

Vários grupos de pesquisa têm tentado projetar neo1 i gamentos tec idue is

Ln vitro para substituições de tendão e

baixa.

Pata reduzir a taxa de degradação, vários grupos de pesquisa voaram seda e outros materiais sintéticos. Isto

resolveu o problema de degradação enzimãtica, «us gerou outros problemas incluindo reações imune», fibrose e fragmento de uso. Tentativas de eliminar estruturas de suporte de matriz extracelular levaram a uma nova abordagem 5 dos chamados engenharia de tecido funcional ou desenvolvimento de tecido tridimensional, espontâneo como descrito em Calve, S._f Dennis RG, Kosnik PE, Paar K, Grcsn K, Arruda EM. 2004. Engineering of .functional contendon. Tissue Engineering. 10, 755»1. Este método não depende tao

K5 fortemente das propriedades materiais de estruturas artificiais ou biológicas prê-existentes que limitam as propriedades fisiológicas ou mecânicas do tecido recentemente, formado. Preferencialmente, meios tais como géis de colãgeno, géis de fibrina, Matrigel ou géis sintéticos são empregados 15 para orquestrar a formação do tecido r&centemente formado.

Chen et al em Chan X, Zou XH, Yin GL,. Ouyang HW, 2009. tendon tissue engineering with mesenchymal stem cells and biografts an option for large tendon defects? Frontiers in Bioscience,

Si. 23-32 apresentam uma revisão abrangente do presente e 20 outros métodos de. engenharia de tecido de célula~tronco .para reparo de tendão. Entretanto, os problemas (a) e (h) destacados acima são ainda válidos nu caso da engenharia de tecido f unciona 1..

Vários esforços foram feitos para se obter 25 estruturas de coiãgeno reconstituídas com algum grau, de anisotropia orientacional< 0 alinhamento de moléculas e fibrilas por carregamento mecânico, canais microf luídicos ,< alinhamento indusído por fluxo e campo magnético, processamento sletroquímico, fluxo interstitial, campo 20 magnético de alta intensidade, eletrospinning orientado.

deposição de Langmuir-Blodgett e processos de extrusão foram demonstrados nc laboratório de pesquisa. A.s matrixes de colagens produzidas por estes processos pxodusem com sucesso o alinhamento de células diferentes. .Entretanto, não mimetízam matrizes extracelulares naturais (ECMs) e não tem a complexidade espacial natural essencial, por exemplo, diâmetros de fibrila controlados, fibrilas alinhadas, ondulação, periodicidade e distribuição angular. A falta de estruturaseoundâria resul ta na força deficiente na estrutura de suporte sintética e. afeta a aojorevi vencia e o comportamento celular. Bullies et al. (9007) demonstram a importância do ambienta celular em. uma ECM recent emente 10 sintetizada. Algumas alcançaram melhor controle de tamanho de fibrila e demonstram a formação de padrões similares a tecido. Entretanto, há problemas com o tamanho do construto que produzem e o longo processo necessário, A. importância das nano- e microestruturas e sua orientação é especialmente 15 importante para tendões e ligamentos, uma vez que estes tecidos requerem força, elasticidade e um guia para que a células se liguem e migrem para o reparo ocorrer. Por exemnlo, uma revisão recente dedicada à arquitetura celuiar e extracelular do tecido humano não tem discussão sobre 20 orientação ou alinhamento de fibrils em ECM, embora afirme que *a importância da arquitetura de estrutura de suporte na engenharia d® tecidos está sendo cada vez mais percebida, que resultou em uma modificação na tendência nos desenhos de estruturas de suporte, de estruturas de suporte isotrõpieas a 25 estruturas de suporte heterogêneas e anisotrópieas biomiméticaa, com o objetivo sendo mimetizar a organização daa células (tal como alinhamento ou agrupamento) e/ou a ECM do tecido sob consideração. Consultar 30. Singh M., Tech s, Bexkland C, and Detamors MS 2008, Strategies and Applications for Incorporating Physical and Chemical Signal Gradiexits in Tissue Engineering .► Tissue Engineering, Bart B. 14, 4: 34.1366 .

Mais reoentamente, métodos pa.ra depósito de

8/39 colãgeno era arranjos ordenados no substrato de vidro ou plástico parca produzir um filme fino core similar à pais, similar a tendão, alinhamentos trançados e outras estruturas fibrilares foram descritos na Publicação de Pedida de Patente S Norte-americano No. 2009/00^9893 e Pedido de Patente Norteamericana No. de sãrie 11/951.324, as citações inteiras dos quais são aqui incorporadas a titula de referência. De forma importante,, estes depósitos de colãgeno alinhado e ordenado direcionam a orientação do células aplicadas a eles.

Sspeeificamente, células alinham-se e ligam-se nos filmes e migram aa longo do eixo do alinhamento. Tais filmes podem ser tratados com fatores, tais como fatores de crescimento que aumentam a sobrevivência, migração e proliferação celular. Outros biopolímeros podem e têm sido inventadas para aplicar 15 células a tecidos, mas não possuem muitas biocompatibilidades, não sendo perdidos ou incorporados no tecido ou contendo propriedades físicas bastante diferentes do tecido e alteram sua função.

Apesar de esforços substanciais para desenvolver biomateriais para mimetizar tendão, pele e outros tecidos fibrliares baseados em colâgeno, ate agora não hã nenhum método de fabricação industrial para produção destes materiais, Consequentemente, desenvolvimentos significantes adicionais são muito necessários.

DDSÇRT.Ç&O,. RESUMI DA DA XKVENçÃõ

De maneira geral, a presente invenção está relacionada a materiais e estruturas de bioccmpósitos, e aos métodos de criaçã.o e utilização dos mesmas. Em algumas realizações, a presente invenção é dirigida a. materiais e 30 estruturas de bi.ocompôsito baseados em colâgeno orientado, e métodos de criação. Em algumas realizações, são apresentados métodos de formação de filmes baseados em colâgeno onde o colâgeno é ordenado em várias formas (alinhado, enovelado,

entremeado ou combinações dos acima), Os filmes baseados sm colágeno podem ser convertidos ou formados em pseudofibras individuais por ume aplicação sequencial de solvente aquoso a força em uma interface solvente-ar, Em algumas realizações.

tais pseudofibrae podem ser interligadas partí, aumentar sua força bem, como tratadas com vários fatores ou materiais, tais como heparina para aumentar sua capacidade da armazenar fatores de crescimento e/ou aumentar sua hidratação. entre outras propriedades <

1Q Em um aspecto, as realizações da presente invenção apresentam métodos de produção 'material b.i.opeiimdxico fibrilar orientado compreendendo as etapas de: preparação de uma solução ou gel de biopolímero fibrilar de uma fase desejada; escoamento da solução hiopoliméri.ca fibrilar ou gel substanciaImente em regime ou maneira de fluxo laminar; e transformação da solução ou gel de biopolímero fibrilar de um liquido à fase solida para formar um material biopolimérico fibrilar orientado. Em algumas realizações,, a fase desejada da solução ou gel de biopolímero fibrilar é uma fase cristalina liquida, Em algumas realizações, a solução cu gel de biopolímero fibrilar exibem uma força iônica na faixa de 0.001M a 0„5M, e um pH na faixa de 2 a â. Em outras realizações, a força iônica fica compreendida na. faixa de 0.1 M a 0,3 H, e o pH fica compreendido na faixa de 2 a 5. Em.

algumas realizações, a etapa de transformação da solução ou gel de biopolímero fibrilar' ã fase sólida compreende secagem da solução cu gel. Secagem pode ser alcançada por uma variedade de métodos tais como, por exemplo, pelo controle das condições ambientais. tais como, mas não limitadas a condição de umidade. temperatura e eletros tática,, para promover evaporação.

Em algumas realizações. a solução ou gel de biopolímero fibrilar e vertida e depositada sobre um

10/ 3 9 substrato funcionalizado, O substrato pedo ssr funcionalizado com qualquer quant idade de compostos desejados, tal. como compostos que promovam adesão, separação, influenciem na organização fibrilar s similares.

Da particular vantagem, biopolímeros de acordo com as realizações da presente invenção podem ainda sen processados para formar materiais e estruturas de biocompósito. Em uma realização, é provido um material fibrilar orientado que tem a forma de uma ou mais fitas. Em .10 algumas realizações, é provido um material biopolimêrico fibrilar orientado que tem a. forma de uma camada com orientação fibrilar média em qualquer direção paralela ã superfície da camada. Em outras realizações, a camada tem uma orientação fibrilar media na direção perpendicular ã 11 superfície da camada. Em algumas realizações, são providos materiais biopoliméricos fibril.ares que têm a forma de um tubo com orientação fibrilar média paralela ou contendo um ângulo com o eixo de tubo, 0 material biopolimérito fibrilar orientado pode ter um padrão de ondulação único, .ãlternatívamente, o material biopolimérico fibrilar orientado pode ter um padrão de ondulação dupla com um ângulo arbitrário entre as formações de ondulações. Em alguma realização, o material bicpolimérico fibrilar orientado exibe um padrão de ondulação formado por fíbrilas helícoidaís à 25 esquerda e à direita. Em outras realizações, o material biopolímèrico fibrilar orientado tem um padrão de ondulação na. forma de uma divisa de linhas substancialmente paralelas em ângulo» alternos substancialmente iguais.

Em outro aspecto, as realizações da presente

0 invenção apresenta?; métodos de formação de um ou mais materiais biopoliméricos fibrilares. tais como pseudofibras, compreendendo as etapas de; imersão de um material biupoliméxico em uma solução contendo pH substancialmente /39 neutro; e extração do material biopol iméri.co da solução tai que o material cclapse em uma pseudofibra em uma interface ar-líquido. A pseudofibra biopolimérica fibrilar formada pode ser seca, interligada e/ou esterilizada dependendo da 5 aplicação desejada.

Adicionalmente vantajoso, as pseudofibras biopolimêrioas f.ibrilaras da presente invenção podem .ser formadas em materiais e ou estruturas de biocompbsito. Em algumas realizações, é provida uma estrutura de biocompõeito 10 que compreende pelo manos um material bíopolimérico fibrilar orientado e uma. matriz biocompatível biodegradável. Em outras realizações, é provida uma estrutura, de biocompõsito que compreende uma pluralidade de materiais biopoümériccs fibrilares orientados com orientações arbitrárias, ligadas

1.5 por uma matriz biocompatível biodegradável. A matriz biacompatível pode ser compreendida de qualquer material apropriado, tal como, por exemplo, com limitaçãot glicoaminoglicanos, proteoglicanos, vanadato, fosfatou de cálcio., células vivas, fatores de crescimento e suas 20 combinações.

Em algumas realizações, o material biopolimérico fibrilar orientado encontra uso como uma matriz e substrato em aplicações cultura celular e tecidual. Em outras realizações, o material biopolimérico fibrilar orientado é 25 utilizado como uma estrutura, orientadora de células in vivo.

Ainda em outra realização, o material, bíopolimérico fibrilar orientado compreende um veículo de aplicação configurado parra aplicar componentes a um local ou alvo desejado. Em um exemolo, o material, aplica componentes de plasma rico em 30 pl&quetas. Em outra realização, o material é configurado para aplicar células vivas para, reparo e regeneração tecidual. Em outra realização, o material é configurado para aplicar pept Ideas.. fármaaos, fatores de crescimento a pequenas

Em algumas realizações, os materiais biopoliméricos são produzidos por um aplioador de filme líquido que compreende; (i) pelo menos dois membros Laterais longitudinais contendo a forma de trilhos similares à cunha paraleloe em suas bases que ocorrem no mesmo plano que. o substrato; (ii? um membro de cruzamento contendo a forma de uma ponte entre os ditos membros laterais, em que o dito membro de cruzamento tem pelo menos uma face, achatada e está 10 em contato com cada dito trilho em pelo menos um ponto; e (iii) um sistema de engate assegurando fixação firme da ponte em qualquer posição pre-ajustada em relação aos ditos trilhos, em que a dita ponte pode ser movida ao l.ongo de ambos os ditos trilhos para que a face achatada da dita ponte 15 obtenha certo ângulo diedre· constante dentro de 0 a lí) minutos de arco com o plano de substrato e a lacuna entre a dita face achatada e o dito plano de substrato contendo uma largura de 5 a 50 microns<

Em algumas realizações, o material biopoliméríco é 20 produzido pelas etapas dei transporte de uma solução de colágeno para uma primeira placa e uma segunda placa, em que a dita segunda placa e considerada substancialmente paralela à dita primeira placa em uma largura de lacuna de S a 50 microns, e em que a solução de colágeno é capturada entre as 25 ditas primeira e segunda placas; e a dita movimentação da segunda placa paralela à dica primeira placa para gerar força de cisalhamento apropriada na dita solução de colágeno para escoar a solução de colágeno em um fluxo de regime ou maneira subatanulaImente laminar, em que a dita primeira placa sendo 30 mantida estacionária durante a dita etapa movei, e em que a direção de movimentação da segunda placa ê a direção de revestimento. Em algumas realizações. a direção de revestim.sutu· é paralela ã dita direção uniaxial. Em algumas

13/39 zeai ϊ zaçoes - Ό· dita. concent ra.çao da soiução de colágeno c as aproximadamente 20 mg/ml a 100 mg/ml. Sm algumas realizações., a concentração da dita solução de oclágeno e pelo menos 25 aoitivos, que e ca colágeno.

mg/ml, Sm algumas realizações, a solução de colágeno 5 apresenta um estado cristalino líquido asmático, Em algumas realizações, a camada de colágeno é produzida pelo oisalhamento da solução de colágeno líquida concentrada Em algumas realizações, a solução biopalimêrica compreende a solução de colágeno líquida concentrada contendo 10 pela menos um colágeno dos tipos I, XI, III, VI e XI, sem limitação {incluindo colágeno biologicamente ou quimicamente modificado e similares) e opcionalmente contendo um ou mais tais como, por exemplo,, sem limitação, um. aditivo .paz de promover orientação ou adesão do dito Em algumas realizações, o aditivo é ATP.

SREVE DE3CBIÇÃS IXXS .ilESWHOS

Qs objetas precedentes e outros ainda da presente ficarão evidentes ao levar em consideração a descrição detalhada, tomada em conjunto com os anexos, nos quais os caracteres de referência referem-se a partes similares em todas as partes, A FIQWA 1 é um diagrama esquemática que representa seguinte desenhos similares a hierarquia do tendão;

As FIGURAS 2A - 2C mostram uma fotografia SEM mostrando a natureza helicoidal de .fibras da corágeno onduladas em chordae tendinae tirados de uma válvula mitral porcina., e um diagrama de mola helicoidal utilizada por freed e Doerintf em seu modelo matemático, e a curva ds est.ira.mento por estresse da fibra de colágeno helicoidal.

respect ivamente

As FIGURAS 3A - 3F são fotografias de microscópio de forçai atômica (MFA) mostrando vários filmes de colágeno ou materiais formados de acordo com as realizações da presente

invenção;

As FIGURAS 4A - 48 são uma imagem de SEM do tendão de cauda de rato, e uma imagem de MFA de nova matriz de colãgano 1 bovino, respectivamente;

s As FIGURAS 5A ~ SC são fotografias de MFA mostrando vários filmes de eolãgen© ou materiais formados cie acordo coe as realizações da presente invenção;

As FIGURAS SA ~ SB são uma imagem de SEM de uma válvula cardíaca mitral porcina_f e uma imagem de MFA de um 10 tendão como matriz .biopolimãrica da acordo com a presente invenção, respectivamente;

As FIGURAS 7A ~ 78 são fotografias mostrando uma pseudofibra de colágeno única, e um fio de colãgeno, respectivamente, de acordo com as realizações da presente j j J

As FIGURAS SA - 8C ilustram a estrutura de super hélice dupla mostrando orientação à direita e ã esquerda ou ondulação;

A FIGURA 9 representa um diagrama esquemático de 20 uma realização de um sistema, que pode ser utilizado para realizar métodos da invenção imediata;

A FIGURA 10 é uma imagem de MEA de um material hiopolimerico helicoidal, não aninhado com orientação de tranças alinhadas de acordo com algumas realizações da 25 presente invenção;

A FIGURA 11 é uma imagem de MFA de um material biopolimérico de ondulação dupla de acordo com algumas realizações da presente invenção;

As FIGURAS 12A. - 12C são fotografias representando 30 fibroblastos humanos, MSCs, e células musculares, respectivamente, em camadas de colágeno orientadas para formar estruturas de biocompõsito de acordo com as realizações da presente invenção;

A FIGURA 13 ilustra um diagrama esquemátieo de uma realização de um sistema, que pode ssr utilizado para realizar métodos da invenção imediata para formar uma peeudofibra de acordo com as realizações da presente invenção; e

A FXGITRA 14 mostra células cultivadas em uma pseudofibra de colágeno orientada s proliferação s migração da pseudoribra. apõs cinco dias de acordo com as realizações da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA . INVENÇÃO

Deve ser entendido que tanto a descrição geral precedente quanto a. seguinte descrição detalhada são exemplifIsadoras e explicativas somente e não são restritivas das composições, filmes e métodos descritos nc presente pedidov No presente pedido de patente, o uso do singular inclui o plural especificamente salvo disposição em contrário- Além disso, o uso de ou significa *e/ou^tf salvo disposição em contrário. Similarmente, compreenda, compreende, compreendendo, incluir*, incluí e '''incluindo não estão destinados a serem limitantes.. Os termos camada ou filme ou filme fino ou matriz podem .ser utilizados intercambiavelmente em todas as partes da descrição:,

De maneira geral, a presente invenção está .relacionada a materiais e estruturas d® h.tooompésito, e métodos de criação e utilização dos meamos. Em algumas realizações, a presente invenção é dirigida a materiais e estruturas de bíocompósito .baseados em colágeno orientado, e métodos de criação. Em algumas realizações, são apresentados métodos de forma.ção de filmes baseados em colágeno or.de. o colágeno é ordenado em várias formas (alinhado, enovelado, entremeado ou combinações dos acima,. Oc filmas baseados em colágeno podem ser convertidos ou formados em pseudofibras

1$ Z 3 V individuais por uma aplicação sequencial de solvente aquoso e força em uma interface solvente-ar, En*. algumas realizações, tais pseudof ibras podem ser inter ligadas para aumentar sua força bem como tratadas com vários fatores ou materiais, tais 5 como heparina para, aumentar sua capacidade de armazenar fatores de crescimento e/ou aumentar sua hidratarão, entre outras propriedades.

As seguintes definições não restritivas são utilizadas no presente pedido. Biopolímeros fibrilares 0 referem-se a tipos diferentes de colãgeno, laminins., f ibronect ina _s fibrina, seda, outras polipeptideas e suas combánações<

Material biopulimérico fibrilar orientado referese ao material que tem um padrão de repetição. Em particular, 5 pode ser um biopolímero fibrilar cristalino ou biopolímero fibrilar semicristalino. Em algumas realizações₍ o biopolímero ã arbitrada como arlentado se sua superfície tiver um padrão de repetição. Bspec.ia’1 mente, o padrão superficial pode ser determinada por um dos 17 grupos 0 cristalográficos planos. A orientação pode ser avalraça. por qualquer um. de polarimetria Ótica, microscopia polarizada< difração de laser, difração de raios-X, microscopia de sonda atômica, microscopia eletrônica.

'“Solução e gel de biopolímero fibrilar têm fases S diferentes dependendo da concentração, temperatura, pH, força iônica e aditivos. Em algumas realizações» estas fases são as fases cristalinas líquidas com ordem de orientação de longo alcance (por exemplo, isotrôpica, colestérica, esmética, nemática, hexagonal.) . Diferentes rasas cri st a. s. mas xiquxoas :Q parecerão ter texturas distintas quando examinadas sub um microscópio polarizado. A fase diference pode ser reconhecida pela difração e dispersão de luz, pela polarimetria de matriz de Muller, pela variação de densidade, e pela calorimetria

17/33 diferencial. Colágeno, laminins, DNA, muitos polipeptídaas e outro biopalímero fibrilar são bons exemplos de materiais cristalinos líquidas liatrópicos. Pequena quantidade de aditivos inorgânicos (pox' exempla, ortovanadato# pode 7 modificar a transição de fase. Uma. informação abrangente na formação de fase de colãgeno é apresentada em dosser G₍ Anglo A., Helary C. Bouligand Y, Giraud-Guille MM 200 δ; Dense tissue-.like collagen matrices formed in cell-free conditions; Matrix Biology. 25: 3~13; que é incorporado por referência no 0 presente pedido em sua totalidade,

A aplicação de condições de fluxo estáveis (laminares) a uma fase líquida particular resulta na formação de um padrão. Em outras palavras, em algumas realizações, a solução ou ael de biopalímero são escoados de uma maneira 5 laminar ou em regime .laminar. Os exemplos de tais condçoes de fluxo incluem, mas não sâc limitados a; fluxo de Couette, fluxo de Taylor Coust te, fluxo de Po.xseunle plana e axissimétrico.

A modificação de condições ambientais (umidade, 0 temperatura, UV, raios-X, raios e, campo elétrico, magnético# ou parâmetros-chave do biopolímero fibril ar como pH e torça iônica node resultar no processo de automontagem e causar a transição da fase de líquido/gel a uma fase sólida de material orientado. Sm uma realização exemplitrcadora, a 5 transição da fase líquida/gel à fase sólida é realizada por um processo de- secagem, o modelo resultante do biopoi.imero na fase sólida dependa do modelo na fase líquida e do processa de automontagem. Em uma realização, um processo de secagem rápida da solução de eolãgeno resulta na formação de. fierilas • q helicoidais com pequeno diãmetXO {material transparente), e um processa de secagem lento resulta na formação de fibrilas helicoidais com grande diâmetro (material turvo). No caso de uma camada delgada de coiágeno (por exempla, espessura, de

18/3 9 vários microns) a orientação resultante substancialmente depende das propriedades químicas e físicas dc substrate. Em algumas realizações, funcionalização do substrato pode ser utilizada para controlar a orientação,

Uma pseudef ibra. e produzida quando uma fita constante livre de colãgeno orientado é feita para st enrolar langitudinalmente sobre o eixo longo da fita e e mantida estavelmente no lugar por forças eletrostãticas.

Um fio e produzida por uma tecelagem em conjunto com uua pluralidade de pseudafibras, tipicamente três ou mais pseudofibras»

Uma ^>lmatriz biodegradável no presente pedido refere-se a um material que pode decompor-se naturalmente e uer reabsorvido em um ambiente fisiológico. Uma matriz bioccmpativel aqui ê um material blocompatível utilizado para biopolimeros du ligação em conjunto, ê útil rever· resumidamente a estrutura de ligamentos e tendões que foi discutida na literatura» a'nquanta as características do colágeno em nível molecular foram extensivamente estudadas e são bem entendidas, Pá uma compreensão menos clara das características e estrutura no nível de ligamento e tendão.

Algumas realizações da presente invenção descrevem um produto de estrutura fabricada que tem a mesma estrutura de tendões es ligamenco»s encontrados em corpos mamíferos, O método inicia-se com colágenu de classe molecular, tipicamente tipo 1, e o reconstituí utilizando um processa proprietário na estrutura de suporte, O processe cria a estrutura du suporte na ausência do material biológico celular au outro» Um vez que estas componentes adicionais estão ausentes, permitem um quadro mais claro ser obtido da estrutura resultante e sua estrutura geométrica básica. Assim, forneceram-se discernimentos quanto ã forma como estas

1:3/39 partes do corpo mamífero são organizadas e como são criadas, que não foram relatados até agora na literatura.

Na descrição da estrutura de ligamentos e tendões,, hã uma hierarquia organizacional que tem propriedades distintas a cada nível. Dependendo de como cada nível é definido, os pesquisadores identificam seis, sete ou oito níveis. A Tabela .1 a seguir mostra a terminologia tipicamente utilizada para, descrever oito níveis_; (ref; Tissue mechanic por Cowin a Doty, 2007).

Nível 1	Polipeptideo
Nível :2:..	Tr opooo1ágene
Nível 3	Micxofibrila
Nível 4	subfibrila
Nivel 5	fi.br .1.1 a
Nível 5	fibra
Nível 7	fascicule
Nível 8	tendão e ligamento

Tabela 1

Seis dos níveis, isto ê< os níveis 2. 3. 4, 5, 7 e 8, aão mostrados na. FIGURA 1. A seguinte explicação é fornecida, para auxiliar o ensinamento da presente invenção. No NÍVEL 1,- cada uma das cadeias de alfa polipeptideo que compõem a molécula de colãgeno consiste de apxoximadamex^te .1,000 resíduos de amincãoido. Cada cadeia gira em uma hélice da esquerda da aproximadamente 1,2 nm de diâmetro.

No NÍVEL 2, tropocolãgeno ou molécula de oolégeno ten aproximadamente 3 00 nm de comprimento e 1u nm de 20 diâmetro. É composto de três cadeias alfa de polipeptideo.

Estas três hélices a esquerda são torcidas em conjunto em uma mola A direita resultando em uma hélice tripla. Esta hélice tripla é ’'uma super-hélice*’ uma vez que a hélice à direita é compreendida de três hélices & esquerda.

No NÍVEL 3, a microf ibrila é. formada por cinco fitas de moléculas de colãgeno. Cada fita é compreendida de moléculas de colágeno unidas ponta a ponta com uma lacuna discreta entre alas, Estas: fitas estão enroladas era conjunto em uma super-super-hélice da esquerda por forças eletrostátícas para formar a microfibrila de diâmetro 3,5 a 4 nm.

? No NÍVEL 4, a subfibrila tem um diâmetro de 10 a 20 nm e sons is te da vm grupo de m.i.crof ibrila®.

No NÍVEL 5, a fibrils. é formada pelo enrolamentc em conjunto subí ib.ri Ias para construir uma super-super - super hélice à direita com um afastamento de aproximadamente 1,020 10 ntn e um diâmetro de 30 a 800 nm, As lacunas entre as extremidades das moléculas de colâgeno das rnicrofibrilas alinham-se para formar a característica periodicidade banda E·· de 67 nm.

No NÍVEL 6.. a fibra tem um diâmetro de 1 a 20 um e consiste da um grupo de fibrilas, do NÍVEL 7, qs faced nulos são compostos de fibras que são reunidas em estruturas que são organizadas em nm padrão de ondulação que foi descrito como ondulação ondulante, forma de onda ou ziguesague, A. função da dobra é 20 fornecer a elasticidade necessária para ceemos suornstidos a forças elásticas,, tais como ligamentos, tendões, pericardia cardíaco, etc. Esta dobra não ocorre no colãgeno ósseo que é basicamente submetido a forças de compressão. O crescimento celular ocorre no nível de fascicule.

No NÍVEL 8, o ligamento e o tendão são comureendidos de pacote® de fascicules. Não na nenhum acoplamento lateral entre fascicules, portanto podem deslizar' livremente entre si criando uma montages; mecânica de funcionamento suave.

Houve numerosos estudos do comportamento mecânico de tendões e ligamentos, tais como o estude» por A, D. breed e T.C.Doering em Freed AD arai Doehring TC, 2.005; Elastic Model for Crimped Collagen Fibril. J. Biomech, Eng. 127, $57-593.

Observaram que tecidas passivas males são materiais muuticonstrtumtes çus, de um ponto de vista do txanspox’te de carga., são predominantemente compostos de duas substâncias elásticas, colágeno e elastina, imersas çm um gel de 5 proteoglioano. Observam que os fascicules são compreendidos de pacotes de fibrilas e não discutem a forma intermediária da '*fibra’⁷ . Prcgôem que a formação de ondulação seja ligada â proporção de aspecto delicado da fibrila, que se dobra sob as forças de restauração internas da matriz de elastina sempre 10 que um tecido fibroso esteja livre da carga externa. Esta configuração enrugada é conhecida como ondulação, Esta invenção descreve um mecanismo diference -que produz a ondulação, ê em consequência de um método de regeneração de colágeno em oposição a fenômenos de dobramento do cclágeuo 15 ex i s t e n t.e,

Como uma suposição de simplificação, propõem que a fibxila que forma a ondulação seja considerada cc-mo uma mola helicoidal mecânica. Esta suposição combina bem com o comportamenta de estresse/estiramento não linear observado de 20 tecidos de colãgeno ondulado em que a mola exibe comportamento linear sob baixos estresses (região do pé} da curva da estresse/estiramento mostrada na FIGURA 2C até que a espiral fique esticada. Naquele ponto, a espiral começa a tornar·'se mais rígida a um aumento contínuo na inclinação da 25 curva (região do calcanhar} . Após a espiral ser totalmente esticada, o comportamento torna-se linear novamente, mas em ura inclinação muito mais íngreme (região linear}. Esta curva é conhecida como curva ^1XJ devida à sua forma. O modelo matemático que propõem combina bem cosa dados experimentais.

A FXGÜRA 2 A é uma. fotografia de SEM mostrando a natureza helicoidal de fibras de colágeno onduladas em chordas tendinae tomadas de uma válvula mitral porcina. A FIGURA 22 e um diagrama da mola helicoidal utilizada por

Freed e Doering em seu modelo matemático. Mostra como a força central que atua ac longo da linha central de uma hélice é transferida para outras áreas da hélice. Observar que a fotografia de SEM da FIGURA 2A mostra um hélice da esquerda enquanto o diagrama da FIGURA 28 mostra uma hélice à direita. Em nenhum lugar no artigo é observada a diferença entre as f iguras nem é discutido o conceito de lateral idade _# que. ilustra uma falta de compreensão e ensinamento na técnica

m) Embora ba^a muitas referências na literatura à natureza helieoidal de ondulações de tendão e ligamento, nenhuma discussão de lateralidade pode ser encontrada. Freed e Doering são um exemplo específica de como a noção da lateral .idade foi despercebida.

1F Em algumas realizações da presente invenção é descrita a produção de tendão reconstituído bioequivalente similar a. matrixes construídas de soluções de colãgeno moriomêrico purificado. Estas novas matrizes incluem, vantagens tais como, mas não limitadas a qualquer uma ou atais de: a) biocompat.ib.il idade,. b} alta força, mecânica e características de elastie.idade J^w na direção de fibrila, c) sem defeito em uma grande área (2” x 10''),· d) bíomiméticas (isto é,. aproximadas a estrutura de ligamento nativa -- em nano-· até macro-escalaa) ,< e e) biodegradável dependendo do nivel de 2S reticulação, As FTGüRAS 3A a 3F ilustram alguns exemplos de filmes ou membranas de oolágeno de acorda com as realxcações da. presente invenção, As FIGURAS 4 A e 4B ilustram uma comparação entre o tendão de cauda do rato e uma. matriz de colãgeno formada de acorde com as realizações da presente 30 invenção, respectivamente. A estrutura de ondulação complexa e trança alinhada das matrizes pode .incorporar fatores de crescimento com um. gradiente espacial desejado para aumentar a biofuncionaiidade. Fibrcblastos, miohlastos_; neurônios e células-tronco mesenquimaís mostram excelente proliferação, migração e alinhamento nestas matrizes·. As matrizes similares a tendão podam ser formadas em estruturas de fibra ou em estruturas de compósitos mdticamadas. Estas estruturas podem ser repovoadas com células-tronco do paciente e fatores derivados de pIaquetas do paciente para reduzir substancialmente o tempo de cxcatrização e melhorar sua eficiência. Realizações da presente invenção permitem a produção de estruturas de tecido nativos fora do corpo.

Em um aspecto da presente invenção, métodos de produção de um material, camada, e/ou estrutura biopoliméricos aão fornecidos. Em algumas realizações, uma camada do blopolímero fibrilar semicristaiino multidomíniC' em um substrato é formada a. partir de uma solução predominantemente monomélica, que compreende as etapas de: produção de um tluxo de cisalhamentu entre um substrato e pelo menos um meio sólido,, indução de uma orientação molecular e fibrilar de longo prazo na solução, controle de pH inicial e temperatura da solução, controle de pH e temperatura da solução enquanto no fluxo de eisalhamento, e secagem da solução sob pH, temperatura, e/ou taxas de. evaporação da solução controlados. A capada biopol imérica pode ser formada. na orientação desejada. A orientação particular pode ser caracterizada por certos parâmetros e definições dependendo 25 da organização do biopolime.ro, como discutido em detalhes

Em algumas realizações, a faixa de orientação também é controlada. Faixa de orientação é o termo na cristalografia definido como a distância máxima entre 30 domínios locais de mesma orientação de ângulo. Neste caso, a faixa poda ser tão pequena como 10 nm da orientação similar â ceie tanto como 0,5 metros da orientação similar ao tendão.

Realizações do método da presente invenção têm

4 / 3 9 benefícios, tais como orientação molecular· de longo alcance de soluções cristalinas líquidas com baixo pH na carga de oisalhamento e automontagem durante a secagem em pH variável. Em particular, em algumas realizações, o processo de secagem 5 pode ser mantido em pH neutro ajustado a 7,4^0,2. Os inventores encontraram que o controla de pH, temperatura, e/ou taxa de evaporação da solução durante o processo d.e secagem auxilia no processo de automontagem dc colágeno, além da aplicação de fluxo de cisalhamento*

Tipos diferentes biopolímeros fibrilares podam ser utilizados; colágsnos f íbril.ares, f ibronectina, laminins, soda, etc

Sete método permite a produção tanto de domínio uniforme quanto de malti. camadas semícristalinas cem orientações curtas e de longo alcance. As distinções são delineadas na Tabela 2 e mostradas nas FIGURAS SA a 50.

Organização bíopollméríca	Faixa de orientação	Estrutura ;
Similar a tendão	Longa	Uniforme |
Similar a pele	Curt a	Mu.lt idomínio i
Trança alinhada	Longa	uniforme i
Tabela 2

Um exemplo da camada de colágeno preparada pelo método descrito acima é mostrado na FIGURA 6.B, Cada fiforila

0 estende·’se em uma orientação vertical e tem uma forma ondulada que tem um período característico> A periodicidade da fibxilas adjacentes é aproximadamente igual. O ninho de fibrilaa em conjunto para criar um modelo de ondulação é formado por aglomeração de fibrilas adjacentes. (1 padrao de 25 ondulação está na direção horizontal.

A FIGURA §A é uma foto de SEM da estrutura de tendão de uma válvula cardíaca mitral porcina que mostra u padrão de ondulação característico visto em todos os tendões. ,A «rua dentro da caixa tem as mesmas dimensões que o material.

0 formado mostrado na FIGURA SB. Pode ser visto que o pad.rao de ondulação da matriz artificial na FIGURA GB é similar ao padrão de ondulação do tendão real na FIGURA SA.

A morfologia do padrão de ondulação descrito acima é formada, pelo aninhamentc de fibrilas helícoidais de colágeno. A estrutura helicoídal é compreendida, tanto de hélices à direita como à esquerda aninhadas em conjunto para formar uma. estrutura, de super hélice dupla como mostrada com referência às FIGURAS 8A a 8C. Como mostrado nas figuras, as fibrilas sombreadas mais escuras” são à direita, as fibrilas sombreadas mais claras são à esquerda.

Deve-se observar que a ondulação é de fato o grupo de picos das hélices aninhadas. Os picos das hélices escuras formam a ondulação à direita, Gs picos das hélices claras formam a ondulação à. esquerda,

Estas hélices aninhadas funcionam como um arranjo de molas helícoidais. O fato que o arranja ê composto de aproximadamente números iguais de molas à direita e à esquerda não afeta a constante de mola do arranjo. Entretanto quando o arranjo é torcido em vez de estendido, ac molas à direita e à esquerda tendem a se equilibrar uma na outra. Um lado do arranjo entra em tensão, enquanto o outro entra em compressão. As molas â direita e à esquerda engrenam-se e tendem a se equilibrar uma na outra criando uma estabilidade natural.

As FIGURAS 8A - 8C mostram uma super-hélice dupla único em várias visons.

Dependendo da. organização. particular do biopolímero, a definição de «orientação*, terá significados diferentes como ilustrado na Tabela 3 abaixo.

Organização òiqpulímêr.íca	Componente ' .................................................................-ii .....	Definição
Similar s tendão	Fibrila	Eixo da hélice
Si mi1ar a tendão	í!Dgbra-!	Linha que conecte os picos de fibrilas

26/39

		ha1icci dai s aninhadas
Tranças, alinhada	Fíbrila	: - ...... > > Eixo da hélice
Similar à pele	Fibrils	Vetor local

Tabela 3: Definição de Orientação

A diferença·· chave entre formação similar a tendão e trança alinhada mostrada na FIGURA 10 é a densidade de empacotamento das hélices. Nas similares a tendão, as hélices 5 são empacotadas na extremidade, ao passo que na trança alinhada, as hélices são empacotadas de maneira frouxa, A FIGURA 11 ΰ uma imagem de MFA de um material niopolimérico de ondulação dupla de acordo com algumas rea.liza.ções da presente invenção

Com base nesta compreensão mais completa da estrutura da ondulação, a hierarquia de ligamento pode ser modificada tomai mostrado abaixo na Tabela 4 abaixo.

---- /	Descrição	Faèrutura heiícuidai	Couponentea estruturaia
........	polipeptí deu	 esquerda	1 cadela alfa
	tropocolágeno	A direita	3 po1ipept í dsos
	microfibrila		S t ropocolãgenes
4	subfibrila	...................
5	fibrila	À direita, da esquerda	Grupamentos de subfibrilas
6'	n/a (fibra)	n/a	n/a
...... c	fascicule	A direita 4- ã. esquerda	Pares combinados de fibrilas aninhadas
·..............	tendão e ligamento

Tabela 4

Foi verificado que estes filmes orientaram a estrutura fibrilar e têm alguma força mecânica anisotropies a podem ser removidos do substrato antes ou apds tratamento, modificação, neutralização e ou retitulação e similares.

Um exemplo de tal modificação envolve uma reação de troca fônica. Por exemplo, é o tratamento pela imersão do 20 filme de colâgeno em uma solução de ortovanadato ou pirofosfato. Outro exemplo é imergir o colâgeno em uma solução de heparina. Tais modificações alteram as propriedades do filme,, tais como sua capacidade de ser hidratado,, sua capacidade de se ligar a proteínas ©u sua S capacidade de aumentar o comportamento de célula© aplicadas a.

ele.. Alguns' exemplos da capacidade destas matrizes de colágeno de controlar o comportamento celular são mostrados nas FZGÜKAS 12& - 12C. Em geral# as fibras alinhadas fazem que a células se alinhem ao longo de seu eixo. No caso de 10 nervos# enquanto as próprias células não mostram alinhamento aumentado# cs processos de neurico que produzem são aitamente estendidos e alinhados com a fibra. Tais fenômenos da estrutura matriz controlando © comportamento celular estendem-se a várias cêlulas-tronco.

Em alguns aspectos,, é provida um processo de produção da matriz de colâgeno similar a tendão da solução de oolágeno monomérica purificada, Realizações deste processo sã.o apropriadas para materiais cristalinos lí guides lictrópicou, entre outros. De acordo com algumas realizações# a solução de oolágeno molecular em um estado cristalino líquido pode ser depositada em vidro e plástico com precisão ótica por uma cabeça aplicadora da precisão com© mostrada e descrita mais totalmenta na Publicação de Patente Americana lío. 2008/0115724 (e em particular como mostrado na FIGURA 1} #.

a revelação inteira da qual é por meio deste incorporada por referência. Na realização exemplif.Isadora, o substrato de vidro é montado em. um estágio que é transportado por um ac.ionador linear sob uma cabeça. aplicadora estacionária. A cabeça é ajustável para produzir matrizes biopoliméricas de 30 espessura de revestimento diferente. Em um exemplo., um substrato de vidro limpo e uma velocidade de revestimento na faixa de 10 mm/s a 1000 mm/s são utilizados para produzir as estruturas de ondulação desejada. Em experiment.es iniciais,.

soluções de colageno I purificado de quaisquer varias fontes: comerciais foram utilizadas. As -natrizes resultantes podem ser delamínadas do vidro e ter uma variedade de estruturas .in situ como mostrado nas FIGURAS 3A a 3F, Uma estrutura de três S camadas pode ser feita compreendida de duas matrizes de colãgeno em orientação cruzada com uma camada de heparina delgada ligando-as. Esta amostra pode ser ainda interligada pela exposição ã riboflavins de acordo com o procedimento descrito em Wollensak G., Wilsch M., Gpoerl E. , Seiler T.

2G04. Collagen fiber diameter in the rabbit cornea after collagen crosslinking by riboflavin/UVA. Cornea. 23. 5: 503507» Dois tipos de polímeros fur am utilizados, ou seja, dextrana e palletilenoglicol ativado para reticulação, A matriz de colâgeno similar a tendão delgada pode ser espontaneamente convertida em uma pseudofibra como oescrito em mais detalhes abaixo. Avaliação mecânica preliminar da pseudofibra de colãgeno similar a tendão (125çm de dlametrol mostra a força de pelo menos 60 gramas. Este censtruto tem força considerável em ambas as direções até sem retiauiação,

2C Com referência à FIGURA 9, outra realização ao sistema 100 é mostrada. Mesta realização, o sistema 100 pode compreender um prisma 102 feito de um material duro, tal como aço inoxidável e similares. O prisma 102 é precisamence posicionado em um substrato liso 104, (tal como vidro, para formar uma lacuna 112) . Componentes do prisma 102,. em algumas realizações, inclue® um perfil de entrada 108, em algumas realizações tipicamente de forma cilíndrica, uma superfície danar 100 polida a um alto grau de tguaroade combinada lisamente com o perfil de entrada e uma borda aguda 110 que forma a transição na saída de lacuna 112. O método de posicionamento do prisma no substrato para formar uma lacuna exata não é discutido aqui. Em algumas realizações, uma faixa estreita de líquido de solução de colágeno é depositada no substrato para formar uma poça 114. Em certas realizações, lícuido pode, ser de viscosidade suf icientemente alta para formar uma poça independents;. Em algumas realizações < © Dtistsa é considerado fixo e os movimentos de substrato de 5 arraste de esquerda para direita do .liquido na zona de perfil de entrada, fazendo o líquido preencher a .lacuna até que alcance a saída, A lacuna pode estar na faixa de. S a SO microns e st velocidade de revestimento pode variar de 10 a 100 m/s. Enquanto na lacuna estreita., o liquido é submetido a altas forças de cisalhamento cozí duração de tempo suficiente para torná-lo orientado. A borda aguda na saída serve para minimizai' o tamanho do menisco que ©corre naturalmente, que, se for demasiadamente grande, deve causar riscos inaceitáveis no filme terminado, Em realizações alternativas, o prisma, pode ser movido em relação ao substrato,

Em algumas realizações, os biooompõsitos da presente invenção são formados utilizando um aplicador de filme liquido que compreende: (1) pelo menos dois membros laterais longitudinais que têm a forma de trilhos similares à cunha paralelos com suas bases que ocorrem nc mesmo plano que o substrato; (ii? um membro de cruzamento contendo a forma de uma ponte entre os ditos membros laterais, em que o dito membro de cruzamento tem pelo menos uma lace achatada e ssu;í em contato com cada dito trilho em pelo menos um ponto; e íxiíi um sistema de engate assegurando fixação firme da ponte am qualquer posição pré“ajustada em relação aos ditos trilhos, em que a dita ponte pode ser movida a© longo de ambos ©s ditos trilhos para que a face achatada da dita ponte 30 obtenha certo ânquío diedro constante dentro de 10 minutes de arc© com o plano de substrato e a lacuna entre a dita face achatada e o dito plane de substrato contendo una largura de

Outros métodos de criação também são ensinados de acordo com os métodos da presente invenção. Por exemplo, uma realização tubular é fornecida em que a zona de císalhamento tem uma geometria cilíndrica. A geometria cilíndrica pode ser formada por qualquer numero de meios, e em uma realização a geometria cilíndrica é compreendida de um cilindro oco que tem posicionado dentro dele um mandril, cilíndrico solido. A lacuna de cisalhamento é formada pelas diferenças no diâmetro entre o diâmetro interior do cilindro oco e diâmetro exterior sólido do mandril. 0 material biopolimérico é extrusado pela lacuna sob força da alta pressão e assim cria um fluxo, tal como fluxo de Couette, fluxo de Taylor-Couette, fluxo de Poiseuille piano ou axíssimétrico pa.ra formar a estrutura orientada, O controle perfeito da lacuna pode ser alcançado pela produção tanto de cilindro oco como mandril sólido em um ângulo de cone fino. Q deslocamento axial do mandril em relação ao cilindro oco irâ permitir que a lacuna tenha um ajuste perfeito, Na descrição acima» um tubo será formado com a direção média das fibrilas paralelas ao eixo central de componentes de cilindro e mandri l. Com a transmissão oe uma velocidade rotativa diferencial, sobre o eixo central de um componente em relação ao outro enquanto o tubo de colãgeno ã expulso, a direção média, das fibrilas seguira um caminho helicoidal ao longo do tubo e criará um ângulo em relação ao eixo central.

filme biopolimérico discreto ou contínuo produzido como descrito acima pode ser transferido na pseudofibra biopolimérica orientada (colãgeno). Este é um dos objetivos da px'esente invenção u pode ser rormado por utu sistema tal como ilustrado na FIGURA 13. O filme de colãgeno fino (por exemplo, 2-6 um de espessura e 1 de largura) pode ser totalmente ou parcialmente mergulhado em uma solução aorcuriada como mostrado na FIGURA 13 (por exemplo, solução de PBS). 0 filme quando removido do solvente de decompõe como uma pseudofibra na interface solução-ar tal. como mostrado na FIGURA. 7Ά.. A pseudofibra pode ser secada com ou sem tratamento mecânico e térmico. Várias pseudofibras podem ser 5 trançadas para produzir fios que variam e® diâmetro e força.

□s exemplos de tal fio e pseudofibra são mostrados na FIGURA 7B. As realizações da presente invenção permitem o controle cio grau de elasticidade da pseudof ibra final produzindo depósitos de colãgeno em plástico ou vidro que variaram o .0 arranjo de fibrilas de colâgeno. Por exemplo, o cclâgeno depositado sob condições alternativas poda produzir uma torção ou dobra na pseudofitora e fio final produzindo um fio çom tipo J de extensão mecânica, Uma elasticidade ainda maior pode ser o.roduzida pele· depósito de colãgeno em uma estrutura 5 entremeada onus os pacotes de xinras annnaoas suportam elasticidade muito maior.

De vantagem particular, filmes, fibras e paeudofíbras produzidos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para apoiar a ligação,· migração e 20 proliferação de células. Em geral,. esluias podam ser aplicadas às pseudofibras ao sereia colocadas em uma suspensão de células em maios, Altemativamente, meios contendo as células de interesse podem ser aplicados ã pseudofibra suspensa seca e colocaoos para escoar a jusante os suu 25 comprimento, A» células nus meios ligam-se, à pseudo tmra os colãgeno particuiarmente na presença de soro. O processo poue ser repetido para aumentar o numero de células ligadas, Um exemplo do uso da pseudofibra de colãgeno ementado para a aplicação de células-tronco em um tecido é mostrado na FIGURA

0 14,

Tipicamente, as células a serem aplicauas a um tecido especifico serão células-tronco, células nervosas, células musculares, células-tronco pluripotentes induzidas.

cexuias-tronco embrionárias ou cémlâs esperaoaa melhorar o reparo, regeneração ου f.umçãc·.. Aplicação ac tecido pode ser como um adesivo ou pela inserção de uma pseudofibra na porção tecidual injuriada utilizando um cateter ou agulha também conhecida por médicos e pelos técnicos no assunto.

Materiais, tais como colágeno, laminina, fibronectins cu material sintético, quando depositados em um vidro ou plástico, podem servir como um sistema para testar a resposta de células por plaqueamento de células nestes e em seguida observando o comportamento das células, tal como se ná Ixgaçao ou não oaa cuimas, mxgxaçao ou nau, piciiietdyáo ou não, e similares, Além disso, fatores de crescimento ou materiais biológicos, tais como plasma rico em plaquetas, que é uma. fonte rica de fatores estimulantes do comportamento celular, podem ser incorporadas em vários substratos. Um mecanismo que pode ser utilizado é adsorção, O outro è a incorporação de fatores, tais como heparina ou outros glicoaminoglicanos que se ligam eletrastaticamente. Fatores também podem se ligar a cercas regiões do substrato e ter uma afinidade a uma variedade de fatores de crescimento. Similarmente, materiais bioativos, tais como vanadato, agentes anti-inflamatórios de carga negativa ou antiproteases incluindo ácido etilenodiaminotetracétiao ou citrato ligam-se justamente aos substratos de colágeno positivamente carregados. A capacidade de modificar o comportamento celular e a capacidade de células de degradar o material é prontamente testada em cultura celular. Adxcionalmente, tais substratos modificados são úteis em uma variedade de ensaios para avaliar o comportamento celular nos substratos modificados .incluindo células nervosas, células-tronco e células tumorais, entre outras.

De vantagem adicional, realizações da presente invenção fornecem métodos que permitem a rormaçac c.e estruturas de biocompõsito funcionalizadas e/ou modificadas. Em algumas situações, uma. forte aderência a um substrato ê necessária para estudos de cultura celular. Isto pude ser realizado utilizando superfícies funcionalizadas que se ligam ao biopolímero depositado ionicamente ou pela formação de ligação oovalente. Em outros casos onde a remoção do material depositado é desejada, várias superfícies de deposição podam ser utilizadas permitindo pronta liberação do depósito para processamento adicional..

Em algumas realizações, as propriedades funcionais de tais biopolímerus podes- ser modificadas ou melhoradas dependendo da aplicação desejada. Tais modificações incluem interligação doa biopolímeros depositados e esterilização do 'material como depositado no substrato ou apôs manipulações adieiona is, entre ou tros.

Em -algumas -realizações, soluções iniciais de coláqeno são preparadas como se segue. A solução de colâgeno líquido de classe molecular é obtida junto a diversas tontes comerciais, tais como ΒΠ com concentrações tipicamente na faixa de 3 mg/ml. Fontes- de mamíferos de coia.ge.no podam ser cauda de rato, bovina, porcina, humana ou outras. A solução é colocada dentro de um tubo de membrana de diálise com faixa de corte de peso molecular de 12,000 a 14.0-00 Daltons ootiua de Spectrum Labe. 0 tubo é colocado em um recipiente e coberto por todos os lados com polietilenoglicol {PEG} de um peso molecular de 20.200 resfriado a 4®C. Q peso molecular de PEG deve ser maior do que o corte de peso molecular do suoo de diálise. 0 recipiente s seus conteúdos são colocados em um ambiente a 4*C por algum tempo suficiente para o PEG para a remoção do conteúdo de água da solução de colãgeno e aumento da sua concentração. Os tempos irão variar dependendo do volume de colágeno no tubo e da saturação ce rEG no exterior e pode ser tão pouco quanto dez minutos e tanto quanto três

34/3 &

horas. Ο colágeno concentrado então á removido do tubo e colocada em um frasco que. é centrifugado a 4°C para a remoção de qualquer ar capturado.

A solução de oolágeno cambém pode ser preparada a.

partir de uma forma em pó de colágeno. O método típico consiste cm adicionar um ácido, tal como HCI ou ácido acético a 4^ftC ao pó, deixar assentar por dezoito horas a 4⁰C e diluir â concentração final,

Uma concentração aumentada. também pode ser 10 alcançada pela colocação da solução de colágeno em um frasco comerciaImente projetado com uma membrana tipo diãlise montada no fundo e centri fugacão a 4«C até que a concentração desejada seja alcançada. Um exemplo de tal fraseo ê Vivaspin fabricado por Sartorius Stedím. Vários cortes de peso 15 moleculares para membrana estão disponíveis a partir de 10.000 e além, Concentrações finais típicas de colágeno podem variar de 20 mg/ml até 100 mg/ml. Concentrações preferenciais variam de 40 mg/ml a 75 mg/ml e podem diferenciarse dependendo da orientação fibrilar desej&da e da natureza 20 particular do material de colágeno inicial de vários f Q.rneae dores >

Um parâmetro importante que define a fa.se de cristais líquidos IxotrÓpicos é concentração. Os métodos para ajustar a concentração são descritas acima. Dois outras 25 narametros importantes são força fônica e pH. A faixa de pH utilizada parti o colágeno I líquido e laminina é de 2 a 7. A faixa preferencial de ρΗ é de 2 a 5. A faixa de força lônica utilizada é de 0,001M a ().SM. A faixa preferencial de força iônica é de 0,IM a 0>3M.

O processo padrão de transição de fase é o processo de evaporação que pode, ser acompanhado de secagem com lâmina de ar, vácuo, condições de altas e baixas tempsxaturas. Dara uma camada biopolimérica delgada, um tratamento com UV pode

5 / 3 '3 ser eficaz se a solução .biopollmérrca. tiver sida ativada pelo aditivo sensível a UV como, por exemplo,, riboflavina. beste tratamento, UV pode iniciar a reticulação biopolimêrica.

processo de automontagem em muitas biopolímeros fi.brilares depende altamente de força fônica e pH que podem ser regulados por evaporação de amônia, por exempla. $o caso de deposição de b 1 opal í mera em use substrato condutivo/metálico, a força iômca pode ser ajustada pela aplicação d-e um campo elétrico.

Vários materiais poliméricos como, por exempla,, PET tem baixa adesão a colãgeno e laminina, por isso, este tipo du material pede «ar utilizado para uma funcionalisação superficial se a meta for remover o biopollme.ro orientado do substrato. Fita adesiva padrão pode ser utilizada para este p r uu edímento.

A funeionaliração de vidro aminossililado causa uma modificação substancial na estrutura éIu filme fino de colâgeno orientado depositado na superfície de vidra.. Dessa forma, resulta um uma formação de fibrila vertical mustrade na FXGUHA 33 em ysz do modelo entremeado similar à pele mostrado na FXGUEA 3D fabricado sem tratamento em vidra.

Adicionalmente. determinados fatores de crescimento, tais como insulina, fatores de crescimento similares à insulina, VEGF, PDGF e similares, ligam-se a receptores na superfície celular que estimulam processos celulares por domínios de receptor de tirosina quinase dentro das; células. Tipicamente, o domínio quinase fosfar.ilará resíduos tirosina no receptor que põe o receptor em um estado «ativo* . A remoção enzimãtica destes resíduas fosfato par certa» fosfatases intracelulares extingue o estado “ativo* do receptor u sua atividade sobre o camp-ortamento das células, 0 ortovanadato é capas de inibir estas fosfatases e aumentar a fasforilação e a atividade do receptor.

δ / 3 5

Fatores tais coa» fatores de crescimento ortovanadato pedem ser incorporados nas estruturas de calâgsno para aumentar a estabilidade e estimular respostas celulares. O ortovaxxadato que é ixicozpox'ado sem ligante associado na estruturai real, da matriz de colâgeno assegux*a sua retenção e minimiza a dissolução da matriz servindo como uma ponte iônica que liga moléculas adjacentes. Desta forma, o complexo colágeno/ortovanadata aumenta a inceraçião da matriz celular e aumenta respostas celulares a estimulantes de crescimento tirosina quinase adicionados endogenamente e exogenamente especialmente sobrevivência, migração, proliferação e diferenciação celular. Há. relatas de toxicidade do ortavanadato, entrecanto sua incorporação em firme associação iônica com moléculas de eolãgeno na ausência de um ligante assooxado Ixmita a difusão de ortovanadato, restringe sua exposição sistêmica e limitai suas ações em células entrando ou em contato com o canstroto.

Foram descritos métodos para a preparação de eolãgeno purificado a paxtir de solução em filmas onde o 20 eolãgeno ê ordenado em várias formas (alinhado, en0vela.do, entrelaçado ou combinações dos acima), entre outros aspectos. Tais materiais podem ser convertidas em pseudof ibx'as individuais por uma aplicação sequencial da solvente aquoso e força em uma interface solvente-ar. Tais pseudofibras podem 25 ser inter ligadas para aumentar sua força hem como tratadas com vários fatores, tais como heparína e outros para, aumentar sua. capacidade de armazenar fatores de crescimento e aumentar sua hidxatação. Aplicação ao tratamento de necessidade teeideal é por procedimentos padrão bem conhecidos pelos 30 medicos especialistas.

Entende-se que os exemplos u realizações descritas no presente pedido são somente para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz do mesmo sezão sugeridas aas técnicos na assunto e devem estar incluídas dentro do caráter e alcance deste pedido de patente e âmbito das reiv:indicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados xo presente pedido são aqui õ incorporadas a título de referência para todos eus fins.

SXEMFLQS

Qs seguintes exemplos são fornecidos para fins de ilustração somente, e não são destinados ii limitar o âmbito da presente invenção de modo algum , ü Investigações de cultura celular foram realizadas com fibroblastos e células-tronco mesenquímais (derivadas de tecido adiposo de camundongo e derivada de medula óssea humana). Os seguintes meios de crescimento celular furam utilizados: DMEH de baixa glicose com SFB 10% para fibroblastos, DMEM de alta glicose com SFB 10% para célulastronco derivadas de tecido adiposo, alfa-MEM com SFB 20% para células-tronca mesenquimais humanas (todos os meros foram suplementados com penícílina/estreptomicina e L--glutamina 2 mM) .

Exemplo 1; Cultivo celular em filme de oolâgeno orientada (matriz) com estrutura similar a tendão em um chip de vidro. Fibroblastos e células-tronco mesenquimais (derivadas de tecido adiposo de camundongo e medula óssea derivada de humano) foram utilizados. Células foram cultivadas em 4 a E.OQC células/cm⁴ sobre substratosde colâgeno em chips de vidro colocados em placas de cultura celular de 6 poços, no meio de crescimento sem SFSe permitidas a ligação. Então o meio foi modificado para o melo de crescimento completo (com SFB 10%?, no qual as células • 0 foram mantidas are uma semana. As células alin.ham~seno su.betrato de acordo com seu padrão, ver Figura. A2. Células são observadas até que formem uma tolha monocamada (até uma semana).

Sremplo 2; Cultivo celular era um pseudofIbra de colágeno. Fibxoblastos foram utilizados. Células furam cultivadas em uma pseudofibra de colágeno orientada em uma suspensão celular de alta densidade {10” células/ml?t uma pseudofibr& de 3 em foi colocada em um tubo Falcon de 15 ml com 1 ml da suspensão celular e incubada em um agitador por 30 min a 3?»0 na incubadora de ecu. A pseudofibra cultivada pela célula então foi colocada em uma placa de cultura de 6 poços, com suas extremidades fixadas com chips de vidro. X.igação celular foi verificada após cultivo com microscopia ótica, e migração celular d.a pseudofibra foi manitoraaa com microscopia ótica e de fluorescência, como mostrada na FIGURA .14 s

Exemplo 3 ♦ Faixa de colágeno é mergulhada em uma solução acídica de oxtovanadato contendo um tampão cloreto de sódio, Em consequência de reações de troca iônica, o ortovanadato reticulará as fibxilas de cclégeno e formará matriz de composite calágeno-va.n.aâato, que conserva as características estruturais. A neutralização em soiução oe PBS (Salina Tamponada em Fosfato) e enxágue em égua Dl remove o artovanadato supérfluo.

As descrições px-ecedentes de realizações específicas da presente .invenção taram apresentaaas pra tine de ilustração e descrição. Elas não se nestmam a. ser exaustivas ou a limitar a invenção às formas exatas reveladas, e obviamente muitas modificações e variações são possíveis à luz do ensinamento acima,. As .realizações taram escolhidas e descritas a fim de melhor explicar os principias da. invenção e sua. aplicação prática, para permitir por meio disso que outros técnicos no assunta utilizem mamar a invenção e varias realizações oom várias modificações conforma são ajustadas ao uso particular contemplado, É pretendido que o âmbito da invenção seja definido pelas

Rexvxndxcaçoes anexas? a este e seus eqp,xxvaxentes.

Todas gs patentes, pedido® de patentes, publicações e referências cicadas no presente pedido cão expressaments incorporadas a título de referência na mesma medida como se cada publicação individual ou pedido dn patente fosse especif icamente e individualmente indicado para ser i nc o rporado por re ferência.

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. MÉTODO ' DE PRODUÇÃO DE MATERIAL DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR ORIENTADO, caracterizado por compreender as etapas de: preparação de uma solução ou gel de biopolímero fibrilar de uma fase desejada; escoamento da solução ou gel de biopolímero fibrilar em um regime ou maneira de fluxo substancialmente laminar; e transformação da solução ou gel de biopolímero fibrilar de uma fase líquida a sólida para formar um material

   de biopolímero fibrilar orientado.

   2 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a solução ou gel de biopolímero fibrilar são preparados por meio do ajuste de um ou mais dentre: a concentração, a temperatura, o pH, a força iônica, ou aditivos. 3 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a etapa de escoamento resulta na formação de um padrão particular com ordem de orientação de faixa ampla. 4 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado « *m que a fase é a fase de cristal líquido. 5 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,

   caracterizado em que a etapa de transformação compreende ainda a alteração das condições ambientais durante a transformação, em que as condições ambientais são quaisquer dentre: a umidade ambiente, temperatura, ou condição eletrostática; e a solução ou gel de biopolímero fibrilar apresenta força iônica e pH, que podem ser ajustados por meio de evaporação externa.

   6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que o material fibrilar orientado é removido
2. 2/3 do substrato com baixa aderência e em que o material fibrilar

   orientado tem formato de fita. DE 7. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PSEUDO-FIBRA BIOPOLÍMERO FIBRILAR A PARTIR DE FITA, caracterizado por compreender as etapas de:

   imersão de um material de biopolímero orientado em uma solução; e extração do material de biopolímero orientado da solução de maneira tal que o material se decomponha como uma pseudo-fibra na interface de ar-líquido.

   8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender ainda a secagem e a reticulação da pseudo-fibra de biopolímero fibrilar.

   9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado em que a solução tem um pH neutro.

   10. MATERIAL DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR ORIENTADO, produzido tal como definido na reivindicação 1, caracterizado por ter a forma de camada com orientação fibrilar média em qualquer direção paralela ã superfície da camada.

   11. MATERIAL DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR ORIENTADO, produzido tal como definido na reivindicação 1, caracterizado por ter um padrão de uma única ondulação.

   12. MATERIAL DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR ORIENTADO, produzido tal como definido na reivindicação 1, caracterizado por ter um padrão de ondulação dupla com um ângulo arbitrário entre as formações de friso.

   13. MATERIAL DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR ORIENTADO, produzido tal como definido na reivindicação 1, caracterizado por ter o padrão de ondulação formado por fibrilas helicoidais da esquerda e da direita.

   14. ESTRUTURA DE BIOCOMPÓSITO, caracterizada por compreender: uma pluralidade de materiais de biopolímero fibrilar orientado com orientações arbitrárias e uma matriz
3. 3/3 biocompatível biodegradável que interliga a pluralidade de materiais de biopolímero fibrilar.

   15. MATERIAL DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR ORIENTADO, produzido tal como definido na reivindicação 1, caracterizado
4. 5 por ser configurado para ser utilizado como uma estrutura de suporte guia de células in vivo.

   16. MATERIAL DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR ORIENTADO, produzido tal como definido na reivindicação 1, caracterizado por ser configurado para aplicação de célula vivas para o
5. 10 reparo e a regeneração de tecido.

   17. PSEUDO-FIBRA DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR OU PLURALIDADE DE PSEUDO-FIBRAS, produzidas tal como definido na reivindicação 7, caracterizadas por serem configuradas para aplicação de células do fígado e componentes de plasma rico
6. 15 em plaquetas para o reparo e a regeneração de tecido.
7. 18. MATERIAL DE BIOPOLÍMERO FIBRILAR ORIENTADO, produzido tal como definido na reivindicação 1, caracterizado por ser configurado para aplicação de peptídeos, drogas, fatores do crescimento, e moléculas pequenas.